KR102655024B1 - 표적 특이적인 외래 유전자의 도입 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는, 동물세포의 TI에 의한 형질 전환에 유용한 핫스폿을 제공한다. 본 개시의 핫스폿은, CHO 세포 게놈의, LOC103164262 부근에 발견되었다. 혹은 본 개시는, 당해 핫스폿에 외래성 DNA를 도입한 형질 전환 세포와, 그 세포를 배양하여 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 개시는, 동물세포의 게놈에, 외래성 DNA를 표적 특이적으로 도입하는 방법, 그것을 이용하여 얻어지는 형질 전환 세포, 및 외래성 DNA가 코딩하는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
사이토카인이나 항체와 같은 폴리펩타이드를, 유전자 재조합 기술에 의해 배양 세포에 발현시켜, 대량으로 생산하는 방법이 공지되어 있다. 이와 같은 폴리펩타이드의 생산 기술은, 일반적으로, 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 가능한 형태로 세포에 도입하여 형질 전환 세포로 하고, 그의 배양물에 축적되는 목적하는 폴리펩타이드를 회수하는 공정을 포함한다. 형질 전환하는 세포로는, 미생물, 곤충, 식물, 혹은 동물의 세포가 널리 이용되고 있다. 그 중에서도 동물세포는, 동물에서 유래하는 폴리펩타이드를 얻기 위해서 적합한 숙주 세포로서 널리 이용되고 있다. 동물세포에 폴리펩타이드를 발현시키는 것에 의해, 폴리펩타이드의 당화나 폴딩 등의 번역 후 수식이, 실제의 생체 중에서 생산되는 환경에 가까워질 것으로 기대된다.
동물세포에 외래성의 DNA를 발현시킬 때에는, 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 짜넣은 발현 벡터로 동물세포를 형질 전환하는 것이 일반적이다. 그러나, 발현 벡터로서 세포에 도입된 외래성의 DNA는, 게놈에 도입한 경우와는 달리 일반적으로는 복제되지 않아, 세포 분열을 통해 계승되지 않기 때문에, 형질이 안정적으로 보유되기 어렵다. 그 때문에, 발현 벡터에 의한 형질 전환은, 실험적인 환경에서 일과성의 발현을 위해서 이용하는 데는 유용하지만, 공업적인 생산에 응용하기에는 과제를 남긴다.
외래성의 DNA를, 동물세포의 게놈 중에 도입함으로써, 발현 벡터 유래의 형질을 안정적으로 보유시키는 것이 가능해진다. 게놈에 도입한 폴리뉴클레오타이드는, 세포 분열을 통해 복제되어 안정적으로 보유될 가능성이 높기 때문이다. 이와 같은 사고에 기초하여, 많은 생체 물질을 동물세포를 플랫폼으로 하여 공업적인 규모로 안정적으로 생산할 수 있게 되었다.
그런데, 게놈으로의 외래성 DNA의 도입에 있어서도, 반드시, 발현 레벨이 높은 형질 전환 세포를 얻을 수 있는 것은 아님을 알게 되었다. 게놈에 도입된 외래성의 DNA는, 도입된 위치에 의존하여, 발현 레벨이 상이한 것이 일반적이어서, 원하는 형질 전환 세포를 반드시 효율적으로 선택할 수 있는 것은 아니었다.
게놈으로의 외래성 DNA의 도입에 있어서의 문제점을 해소할 수 있는 기술의 하나로서, 표적 통합(Target Integration; TI)이 제안되었다(특허문헌 1-3). TI에 있어서는, 외래성 DNA의 도입 및 발현에 적절한 게놈 영역을 미리 동정해 두고, 발현시켜야 할 외래성 DNA가, 동정한 게놈 영역에 부위 특이적으로 통합된다. TI는, 게놈의 부위 특이적인 재조합 기술의 향상에 수반하여 만들어내진 새로운 유전자 재조합 기술이라고 말할 수 있다. TI의 결과, 얻어지는 형질 전환 세포의, 외래성 DNA의 발현 레벨 등의 예측성이 높아져, 필요로 하는 형질을 구비한 형질 전환 세포의 효율적인 취득을 기대할 수 있다. TI에 있어서, 외래성 DNA의 도입에 적절한 게놈 영역은, 종종 핫스폿(Hot Spot)이라고 불린다. 지금까지, 형질 전환의 숙주 세포로서 이용되고 있는 여러 가지 세포에 있어서, 게놈의 폭넓은 영역에 핫스폿이 발견되어 왔다. 그리고, TI를 동물세포에 의한 모노클로날 항체의 산생에 응용하여, 그 생산에 유용한 형질 전환 세포를 얻는 시도도 보고되어 있다(특허문헌 4, 비특허문헌 1-2).
Biotechnol. Prog., 2015, Vol. 31, No. 6, pp 1645-1656
Methods 95 (2016) pp 3-12
본 개시에 있어서는, 표적 통합(TI)에 유용한 새로운 핫스폿의 제공을 과제로 한다.
본 발명자들은, 항체 등의 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 동물세포에 있어서 높은 레벨로 발현시키는 것이 가능한 영역의 탐색을 계속했다. 지금까지 보고된 TI에 의한 형질 전환 세포의 제작에 있어서는, 초기의 발현 레벨을 장기간에 걸쳐서 유지할 수 없어, 배양 중에 곧 발현 레벨이 저하되는 경우가 있었다(PLoS ONE, 2017 12(6): e0179902, Biotechnology Letters, 2018, Volume 40, Issue 8, pp 1209-1218). 이와 같은 형질 전환 세포를 폴리펩타이드의 제조에 이용하면, 발현 산물의 생산량이 불안정해져, 제조 효율을 저하시킬지도 모른다. 혹은, 형질 전환 세포가 공업적인 생산 레벨을 유지할 수 없게 되면, 제조 라인의 재구축이 필요해진다. 본 발명자들은, 배양 중의 폴리펩타이드의 발현 레벨의 저하가, 외래성 폴리뉴클레오타이드의 게놈 도입 위치에 의존하여 일어나고 있을 가능성을 의심했다. 그래서, 외래성 DNA의 발현 레벨의 장기에 걸친 유지를 기대할 수 있는 핫스폿의 탐색을 시도한 결과, 본 발명자들은 신규한 핫스폿을 발견하는 것에 성공하여 본 개시에 이르렀다.
본 개시는, 구체적으로는 이하에 예시적으로 기재하는 태양을 포함한다.
〔1〕 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 방법으로서, 해당 방법이, 상기 외래성 DNA를, CHO 세포의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
〔2〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔1〕에 기재된 방법.
〔3〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔2〕에 기재된 방법.
〔4〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔3〕에 기재된 방법.
〔5〕 상기 외래성 DNA를, 상동 재조합, 재조합 효소를 매개한 유전자 치환(RMCE), 및 게놈 편집으로부터 선택되는 어느 하나의 수법에 의해, 상기 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 〔1〕∼〔4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔6〕 상기 목적으로 하는 폴리펩타이드가, 항원 결합 분자인 〔1〕∼〔5〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔7〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔6〕에 기재된 방법.
〔8〕 CHO 세포 또는 CHO 세포주의 제조 방법으로서, 해당 방법이, 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를, CHO 세포의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
〔9〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔8〕에 기재된 방법.
〔10〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔9〕에 기재된 방법.
〔11〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔10〕에 기재된 방법.
〔12〕 상기 외래성 DNA를, 상동 재조합, 재조합 효소를 매개한 유전자 치환(RMCE), 및 게놈 편집으로부터 선택되는 어느 하나의 수법에 의해, 상기 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 〔8〕∼〔11〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔13〕 상기 목적으로 하는 폴리펩타이드가, 항원 결합 분자인 〔8〕∼〔12〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔14〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔13〕에 기재된 방법.
〔15〕 CHO 세포 또는 CHO 세포주의 제조 방법으로서, 해당 방법이, 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를, CHO 세포의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
〔16〕 상기 DNA 카세트의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔15〕에 기재된 방법.
〔17〕 상기 DNA 카세트의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔16〕에 기재된 방법.
〔18〕 상기 DNA 카세트의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔17〕에 기재된 방법.
〔19〕 상기 외래성 DNA가, 목적으로 하는 항원 결합 분자를 코딩하는 외래성 DNA인 〔15〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔20〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔19〕에 기재된 방법.
〔21〕 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입된 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 포함하는, 단리된 CHO 세포.
〔22〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔21〕에 기재된 CHO 세포.
〔23〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔22〕에 기재된 CHO 세포.
〔24〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔23〕에 기재된 CHO 세포.
〔25〕 상기 외래성 DNA를, 상동 재조합, 재조합 효소를 매개한 유전자 치환(RMCE), 및 게놈 편집으로부터 선택되는 어느 하나의 수법에 의해, 상기 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 〔21〕∼〔24〕 중 어느 하나에 기재된 CHO 세포.
〔26〕 상기 목적으로 하는 폴리펩타이드가, 항원 결합 분자인 〔21〕∼〔25〕 중 어느 하나에 기재된 CHO 세포.
〔27〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔26〕에 기재된 CHO 세포.
〔28〕 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에, 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를 포함하는, 단리된 CHO 세포.
〔29〕 상기 DNA 카세트의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔28〕에 기재된 CHO 세포.
〔30〕 상기 DNA 카세트의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔29〕에 기재된 CHO 세포.
〔31〕 상기 DNA 카세트의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔30〕에 기재된 CHO 세포.
〔32〕 상기 외래성 DNA가, 목적으로 하는 항원 결합 분자를 코딩하는 외래성 DNA인 〔28〕∼〔31〕 중 어느 하나에 기재된 CHO 세포.
〔33〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔32〕에 기재된 CHO 세포.
〔34〕 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 도입한 CHO 세포를 이용한, 폴리펩타이드의 제조 방법.
〔35〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔34〕에 기재된 방법.
〔36〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔35〕에 기재된 방법.
〔37〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔36〕에 기재된 방법.
〔38〕 상기 외래성 DNA를, 상동 재조합, 재조합 효소를 매개한 유전자 치환(RMCE), 및 게놈 편집으로부터 선택되는 어느 하나의 수법에 의해, 상기 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 〔37〕에 기재된 방법.
〔39〕 상기 목적으로 하는 폴리펩타이드가, 항원 결합 분자인 〔34〕∼〔38〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔40〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔39〕에 기재된 방법.
〔41〕 이하의 공정을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법:
(1) 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 공정으로서, 상기 외래성 DNA를, CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정;
(2) 외래성 DNA가 도입된 CHO 세포를 배양하는 공정; 및
(3) 목적으로 하는 폴리펩타이드를 회수하는 공정.
〔42〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 〔41〕에 기재된 방법.
〔43〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 〔42〕에 기재된 방법.
〔44〕 상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 〔43〕에 기재된 방법.
〔45〕 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 공정이, 다음의 공정(i)-(ii)를 포함하는 〔41〕에 기재된 방법:
(i) 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를 CHO 세포에 도입하는 공정, 및
(ii) (i)의 DNA 카세트를 표적 부위로서 인식하는 재조합 효소에 의해, 외래성 DNA를, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정.
〔46〕 상기 목적으로 하는 폴리펩타이드가 항원 결합 분자인 〔41〕∼〔45〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔47〕 상기 항원 결합 분자가 항체인 〔46〕에 기재된 방법.
본 개시에 의해, TI에 의해 형질 전환된 동물세포의 취득에 적합한 핫스폿이 발견되었다. 바람직한 태양에 있어서, 본 개시가 제공하는 핫스폿은, 그 영역에 도입된 외래성 DNA가 코딩하는 폴리펩타이드의 발현 레벨을, 장기에 걸쳐서 안정적으로 유지할 수 있다.
도 1은, 핫스폿의 탐색에 이용한 랜딩 패드(landing pad)의 맵을 나타낸다. 형질 전환 세포의 선택 마커인 다이하이드로엽산 리덕타제(DHFR)와, 고발현 세포를 스크리닝하기 위한 마커가 되는 녹색 형광 단백(GFR)을 코딩하는 유전자가 통합되어 있다. 이들 2개의 유전자의 양단에는, 재조합 효소 Cre의 인식 서열(loxP1과 loxP2)이 삽입되어 DNA 카세트를 구성하고 있다.
도 2는, 게놈에 통합된 랜딩 패드의 DNA 카세트와 카세트 교환 반응하기 위한 재조합 플라스미드(Recombination plasmid)의 맵을 나타낸다. 선택 마커 DHFR과, 경쇄(L)와 중쇄(H)를 코딩하는 각 유전자의 양단에 재조합 효소 인식 서열 loxP가 배치되어, DNA 카세트를 구성하고 있다.
도 3은, TI 후에 수립된 항체 발현 세포 클론의, 2주간의 생산 배양의 결과를 나타낸다. 가로축은 수립된 항체 산생 세포 클론의 명칭, 세로축은 배양액 1리터당의 항체 생산 레벨(mg/L)을 나타낸다.
도 4는, 항체 산생 세포 클론 TI-L 및 TI-J의, 동결 용해 후의 항체 생산량의 경시적인 변화를 나타낸다. 가로축은 동결 보존 세포의 용해 후의 시간(일), 세로축은 배양액 1리터당의 항체 생산 레벨(mg/L)을 나타낸다.
도 5는, 도 2의 재조합 플라스미드에 상이한 항체의 유전자를 짜넣어 작성한 다른 항체 산생 세포 클론에 의한 항체 생산 레벨을 나타낸다. 가로축은 생산시킨 항체의 명칭, 세로축은 배양액 1리터당의 항체 생산 레벨(mg/L)을 나타낸다.
도 6은, 항체 생산 레벨이 가장 높았던 항체 산생 세포 클론의 친세포 TI-L(랜딩 패드를 교환 카세트로 치환하기 전의 형질 전환 세포)의 게놈 상에 있어서의 랜딩 패드의 도입 위치를 모식적으로 나타낸다. 도면 중, 「Integration site」로 나타낸 부분이, 본 개시에 있어서 동정된 랜딩 패드의 도입 위치이다. 도입 위치는, CCDC91 유전자의 (5' 말단)으로부터 6651bp 하류이고, Intron1의 상류(5' 말단)로부터는 6454bp 하류에 위치한다. 「Integration site」의 상류(게놈 서열에 있어서의 5' 측)의 5kb와, 하류(게놈 서열에 있어서의 3' 측)의 5kb의 염기 서열을 각각, 서열번호: 1 및 2에 나타냈다.
도 2는, 게놈에 통합된 랜딩 패드의 DNA 카세트와 카세트 교환 반응하기 위한 재조합 플라스미드(Recombination plasmid)의 맵을 나타낸다. 선택 마커 DHFR과, 경쇄(L)와 중쇄(H)를 코딩하는 각 유전자의 양단에 재조합 효소 인식 서열 loxP가 배치되어, DNA 카세트를 구성하고 있다.
도 3은, TI 후에 수립된 항체 발현 세포 클론의, 2주간의 생산 배양의 결과를 나타낸다. 가로축은 수립된 항체 산생 세포 클론의 명칭, 세로축은 배양액 1리터당의 항체 생산 레벨(mg/L)을 나타낸다.
도 4는, 항체 산생 세포 클론 TI-L 및 TI-J의, 동결 용해 후의 항체 생산량의 경시적인 변화를 나타낸다. 가로축은 동결 보존 세포의 용해 후의 시간(일), 세로축은 배양액 1리터당의 항체 생산 레벨(mg/L)을 나타낸다.
도 5는, 도 2의 재조합 플라스미드에 상이한 항체의 유전자를 짜넣어 작성한 다른 항체 산생 세포 클론에 의한 항체 생산 레벨을 나타낸다. 가로축은 생산시킨 항체의 명칭, 세로축은 배양액 1리터당의 항체 생산 레벨(mg/L)을 나타낸다.
도 6은, 항체 생산 레벨이 가장 높았던 항체 산생 세포 클론의 친세포 TI-L(랜딩 패드를 교환 카세트로 치환하기 전의 형질 전환 세포)의 게놈 상에 있어서의 랜딩 패드의 도입 위치를 모식적으로 나타낸다. 도면 중, 「Integration site」로 나타낸 부분이, 본 개시에 있어서 동정된 랜딩 패드의 도입 위치이다. 도입 위치는, CCDC91 유전자의 (5' 말단)으로부터 6651bp 하류이고, Intron1의 상류(5' 말단)로부터는 6454bp 하류에 위치한다. 「Integration site」의 상류(게놈 서열에 있어서의 5' 측)의 5kb와, 하류(게놈 서열에 있어서의 3' 측)의 5kb의 염기 서열을 각각, 서열번호: 1 및 2에 나타냈다.
이하, 본 발명의 실시의 형태에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
이하의 정의 및 상세한 설명은, 본 명세서에 있어서 설명하는 본 개시의 이해를 용이하게 하기 위해서 제공된다.
본 명세서에 있어서, 「항원 결합 분자」는 목적으로 하는 항원에 결합하는 것만으로 제한된다. 항원 결합 분자는, 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 그와 같은 도메인의 예로서, 그것만으로 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체의 경쇄 가변 영역(VL), 단(單)도메인 항체(sdAb), 생체내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인이라고 불리는 모듈(국제 공개 WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(국제 공개 WO2002/032925), ProteinA의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(국제 공개 WO1995/001937), 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복하여 겹쳐 쌓인 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat: AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(국제 공개 WO2002/020565), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙 방향으로 비틀린 배럴 구조의 편측을 지탱하는 4개의 루프 영역인 Anticalin 등(국제 공개 WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 이뮤노글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 루신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복하여 겹쳐 쌓인 마제형 구조의 내부의 병행형 시트 구조의 함몰된 영역(국제 공개 WO2008/016854)을 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 예로서, 당해 항원 결합 도메인만으로 구성되는 분자로 항원 결합 기능을 발휘할 수 있는 항원 결합 분자, 연결되어 있는 다른 펩타이드로부터 유리된 후에 단독으로 항원 결합 기능을 발휘할 수 있는 항원 결합 분자 등을 들 수 있다. 그와 같은 항원 결합 분자의 예로서, 그것만으로 한정되지 않지만, 단도메인 항체, scFv, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 등을 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 예의 하나로서, 분자량 60kDa 이하의 항원 결합 분자를 들 수 있다. 그와 같은 항원 결합 분자의 예로서, 그것만으로 한정되지 않지만, 단도메인 항체, scFv, Fab, Fab'를 들 수 있다. 분자량이 60kDa 이하인 항원 결합 분자는 통상, 단량체로서 혈중에 존재할 때, 신장에 의한 클리어런스가 발생할 가능성이 높다(J Biol Chem. 1988 Oct 15;263(29):15064-70 참조).
항체
본 명세서에서 용어 「항체」는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
항체 단편
「항체 단편」은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다. 이상과 같이, 항체나 항체 단편은, 항원 결합 분자의 대표적인 예이다.
Fc 영역
본 명세서에서 용어 「Fc 영역」은, 적어도 정상 영역의 일부분을 포함하는 면역 글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하기 위해서 이용된다. 이 용어는, 천연형 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 태양에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226부터, 또는 Pro230부터, 중쇄의 카복실 말단까지 연장된다. 단, Fc 영역의 C 말단의 라이신(Lys447) 또는 글라이신-라이신(Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서는 특별히 달리 특정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호 매기기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991에 기재된, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 불린다)에 따른다.
핵산/폴리뉴클레오타이드
「단리된」 핵산/폴리뉴클레오타이드는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 핵산/폴리뉴클레오타이드 분자를 말한다. 단리된 핵산/폴리뉴클레오타이드는, 그 핵산/폴리뉴클레오타이드 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산/폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 그 핵산/폴리뉴클레오타이드는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다. 본 개시에 있어서, 핵산/폴리뉴클레오타이드가, 인공적으로 구축된 것이나, 혹은 천연에 존재한 것이어도, 숙주 세포(endogeneous) 이외의 환경으로부터 얻은 것인 경우, 그 핵산/폴리뉴클레오타이드는, 당해 숙주 세포에게 있어 외래성이다. 따라서, 예를 들어, 핵산/폴리뉴클레오타이드가, cDNA를 포함하는 경우, 당해 핵산/폴리뉴클레오타이드는, 통상, 숙주 세포에게 있어서는 외래성이다.
본 개시의 외래성 핵산/폴리뉴클레오타이드가, DNA를 포함하는 경우, 특히 「외래성 DNA」(exogeneous DNA)라고 기재한다. 외래성 DNA는, 필요시되는 유전 정보를 보유하고 있는 한, DNA 이외의 성분을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 바이러스 입자를 구성하는 단백질이나 리포솜 등의 DNA 이외의 성분과 복합화한 DNA도, 외래성 DNA이다. 본 개시에 있어서는, 숙주 세포는 Chinese Hamster(차이니즈 햄스터; Cricetulus griseus, 일본명은 몽골 키누 네즈미)이다. 따라서, 그 게놈에 통상은 포함되어 있지 않은 염기 서열 정보를 포함하는 DNA를 「외래성 DNA」라고 할 수 있다.
차이니즈 햄스터의 게놈의 염기 서열 정보는, 예를 들어 GenBank의 참조 서열(Reference Sequence)로서 얻을 수 있다. 어느 DNA의 염기 서열 정보가, 당해 참조 서열에 부분적으로든, 일치하지 않는 염기 서열을 포함하고 있으면, 외래성 DNA인 것을 알 수 있다. 예를 들어, 차이니즈 햄스터 자신의 유전 정보를 포함하면서, 그 일부를 다른 생물종 유래의 유전 정보나 인위적인 정보로 바꿔 조합한 것은, 외래성 DNA에 포함된다. 이와 같이, 외래성 DNA의 대부분은, 인위적으로 구축된 염기 서열 정보를 포함하는 것에 의해, 외래성이 된다. 어느 DNA가 아미노산 서열을 코딩하고 있을 때, DNA의 염기 서열의 변경 후에 원래의 아미노산 서열 정보가 유지되는 경우도, 인위적으로 구축된 DNA이다. 혹은 차이니즈 햄스터의 유전자로부터, 게놈 서열에는 포함되어 있는 인트론이 제거된 DNA(예를 들어 cDNA)도, 통상은 외래성이다.
벡터
본 명세서에서 이용되는 용어 「벡터」는, 그것이 연결된 또 하나의 핵산을 늘릴 수 있는, 핵산 분자를 말한다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어지는 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 「발현 벡터」라고도 칭해진다.
숙주 세포
용어 「숙주 세포」, 「숙주 세포주」, 및 「숙주 세포 배양물」은, 상호 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 말한다. 숙주 세포는 「형질 전환체」 및 「형질 전환 세포」를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 의존하지 않고 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었거나 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
본 개시는, 어느 태양에 있어서, 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성의 DNA를 CHO 세포에 도입하는 방법으로서, 해당 방법이, 상기 외래성 DNA를, CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
CHO 세포(Chinese Hamster Ovary Cell)는, 차이니즈 햄스터의 난소로부터 수립된 섬유 아세포주의 총칭이다. 증식 능력이 우수하여, 접착 배양이나 부유 배양에 의해 인공적인 배지 중에서 배양할 수 있다. CHO 세포를 숙주로 하여, 여러 가지 폴리펩타이드가 유전자 재조합에 의해 제조되고 있다. 예를 들어, DHFR 유전자를 결손한 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)나, CHO-K1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) 등은, 유전자 재조합 기술에 있어서, 숙주 세포로서 널리 이용되고 있다. 이들 CHO 세포의 변이주도, 본 개시에 있어서는 CHO 세포에 포함된다. 그 외에도, CHO 세포에서 유래하는 세포로서, CHO-DG44나 CHO-DXB11주가, 숙주 세포로서 이용되고 있다. 이들 CHO 세포에서 유래하는 공지된 세포주도, 본 개시에 있어서는 CHO 세포에 포함된다.
본 개시를 구성하는 CHO 세포는, ATCC 등의 세포 뱅크나, 상업적으로 유통되고 있는 시판되는 세포주로서 입수할 수 있다. CHO 세포가, 이론상, 단일의 세포로부터 수립된 세포군으로 이루어지는 경우, 특히 「CHO 세포주」라고 한다. 본 개시에 있어서는, 특별히 언급이 없으면, 「CHO 세포」는, CHO 세포주여도 된다.
본 개시에 있어서, 핫스폿으로서 동정된 게놈 영역은, CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정된다. NW_003614838.1은, 홀 게놈 샷건 시퀀스법(whole genome shotgun sequence)에 의해 밝혀진 CHO 세포의 게놈 염기 서열이고, 약 465.6kbp로 이루어져 있다. 따라서, 본 개시에 있어서, 외래성의 DNA를 도입하는 영역은, 당해 약 465.6kbp 내의 임의의 장소여도 된다.
당해 염기 서열 중, 본 개시에 있어서, 바람직한 도입 위치로서, 예를 들어, LOC103164262(coiled-coil domain-containing protein 91; CCDC91) 유전자와 그의 프로모터 상에 존재하는 서열에 의해 특정되는 영역을 들 수 있다. 어느 태양에 있어서, 이 영역은, 당해 유전자와 그의 프로모터 영역을 포함하는 약 159.4kbp로 이루어진다. 혹은 다른 태양에 있어서, 이 영역의, 당해 프로모터를 포함하지 않는 약 121.3kbp의 염기 서열도, 외래성의 DNA의 도입 위치로서 바람직하다. 예를 들어, CCDC91 유전자를 구성하는 염기 서열 중, 제 1 인트론의 상하류 10kbp를 포함하는 약 20kbp의 범위, 혹은 제 1 인트론의 상하류 5kbp를 포함하는 약 10kbp의 범위는, 본 개시에 있어서 외래성의 DNA를 도입하는 영역으로서 바람직하다. 그 예로서, 제 1 인트론의 상하류 각 5kbp의 염기 서열을 각각 서열번호: 1 및 2에 나타낸다. 따라서 각 서열번호와 도입 위치의 관계는, 예를 들어 다음과 같이 나타낼 수 있다.
5'-(서열번호: 1)-[도입 위치(즉 핫스폿)]-(서열번호: 2)-3'
여기에서, 게놈의 염기 서열 상에 CCDC91 유전자를 구성하는 염기 서열을 매핑하면, 게놈 서열로부터 보아 역방향 상보 서열(즉 안티센스 서열)에 위치하고 있다. 그 때문에, CCDC91 유전자의 염기 서열 중, 제 1 인트론은, 서열번호: 2의 5' 말단을 포함하는 영역(서열번호: 2 중의 1-6454위)으로부터 서열번호: 1의 3' 말단을 포함하는 영역(서열번호: 1 중의 3190-5040위)에 걸쳐, 매핑된다. 양자를 연결한 제 1 인트론의 염기 서열을 서열번호: 3에 나타냈다. 따라서, 본 개시의 바람직한 태양에 있어서, 외래성의 DNA의 부위 특이적인 도입 위치는, CHO 세포 게놈 상의 서열번호: 3의 염기 서열(역방향 상보 서열)로 특정되는 영역으로부터 선택할 수 있다.
본 개시에 있어서, 어느 염기 서열에 의해 특정되는 영역은, 복수의 염기 서열이 상동(homologous)인 경우를 포함한다. 즉, 대상이 되는 염기 서열 X가, 몇몇의 변이나 개변을 포함하고 있더라도, 전체로서 염기 서열 A와 상동이면, 「염기 서열 A에 의해 특정되는 영역」이다. 복수의 염기 서열이 상동인 경우, 통상, 그들은 정렬(alignment)시킬 수 있다. 상이한 염기 서열 A와 염기 서열 X를 정렬시키는 것에 의해, 염기 서열 A 중의 특정의 위치에 대응하는 위치를 염기 서열 X 상에서 특정할 수 있다. 복수의 염기 서열을 정렬시키기 위한 알고리즘은 공지되어 있다. 예를 들어 BLASTN은, 염기 서열의 정렬을 위한 일반적인 툴의 하나이다. 이들 공지된 알고리즘에 따라, NCBI accession number NW_003614838.1이나, CCDC91 유전자와 그의 프로모터, 혹은 제 1 인트론 등과 상동이라고 간주할 수 있는 염기 서열은, 본 개시에 있어서는, 「각 염기 서열에 의해 특정되는 영역」과 다름없다.
앞서 기재한 바와 같이 CHO 세포에는, 약제 내성이나 영양 요구성 등의 성상이 상이한 몇 가지 세포주가 알려져 있다. 이들 성상의 상위가 게놈의 염기 서열 정보의 변이나 개변으로서 초래되어 있고, 그것이, 본 개시에 의해 특정된 영역에 생겨 있더라도, 영역을 특정할 수 있는 것이면, 「각 염기 서열에 의해 특정되는 영역」이다. 게놈 염기 서열 정보의 변이나 개변에는, 염기 서열 정보의 부가, 결실, 삽입, 및 치환이 포함된다. 혹은, 겉보기상의 세포 형질의 변화를 수반하지 않는, 염기 서열 정보의 변화(다형 등)도 허용할 수 있다. 또한, 염기 서열 정보가 유지되는 한, DNA의 메틸화 등의 DNA 간의 에피지네틱한 수식 상태의 차이도 허용된다.
본 개시에 있어서, 외래성 DNA는, 공지된 상동 재조합 기술이나 게놈 편집 기술에 의해 상기의 영역에 부위 특이적으로 도입할 수 있다. 부위 특이적이란, 게놈을 구성하는 염기 서열 중의, 어느 염기 서열로 특정되는 위치를 도입하기 위한 위치로서 선택하고, 그 장소를 표적으로 하여 목적하는 DNA를 도입하는 것을 말한다. 따라서 「부위 특이적」은, 「표적화」(Targeting)라고 말할 수도 있다. 본 개시에 있어서, 핵산/폴리뉴클레오타이드의 게놈으로의 도입은, 표적 부위에 DNA를 삽입하거나, 혹은 게놈의 일부를 도입해야 할 DNA로 치환하는 것에 의해 달성할 수 있다.
TI에 의한 외래성 DNA의 짜넣기에 이용되는 수법으로서는, 예를 들면, 다음과 같은 방법이 알려져 있다:
Homologous recombination(상동 재조합),
RMCE(recombinase-mediated cassette exchange)(재조합 효소를 매개한 유전자 치환) 및
Gene editing(게놈 편집)
Homologous recombination(상동 재조합)은, 세포가 본래 가지는 DNA 수복 기구를 이용한 수법이다. 게놈 상의 표적 위치와 상동인 염기 서열을 가지는 외래성 DNA를 세포에 도입하여, 표적 위치에 존재하는 DNA와 외래성 DNA를 치환한다. 상동 재조합에 있어서는, 염기 서열을 특이적으로 인식하는 특별한 효소를 인공적으로 이용하지 않기 때문에, 일반적으로 효율은 매우 낮다(약 10-5∼10-7%).
RMCE는 본 발명의 실시예에서 이용한 수법이며, 재조합 효소와 그의 인식 염기 서열을 이용한 유전자 도입 방법이다. 게놈 상의 표적 위치에 미리 재조합 효소의 인식 염기 서열을 도입해 두고, 동일하게 인식 염기 서열을 가지는 외래성 DNA를 세포에 도입함으로써, 표적 위치에 존재하는 DNA와 외래성 DNA를 치환한다. 재조합 효소/인식 서열의 조합은 「Cre/loxP」, 「FLP/FRT」가 대표적이지만, 그 외에도 몇 가지가 존재한다.
Gene editing(게놈 편집)은 게놈 상의 표적 위치를 겨냥하여 절단할 수 있는 게놈 편집 기술을 이용한 유전자 도입 방법이다. 게놈 상의 표적 위치를 겨냥하도록 디자인한 효소를 세포에 도입하고, 표적 위치를 절단함으로써 세포의 DNA 수복을 촉진한다. 이때, 효소와 함께 외래성 DNA를 도입함으로써 외래성 DNA가 절단 부위에 연결되기 쉬워진다. 게놈 편집 기술에 이용되는 효소로서는, CRISPR/Cas, TALEN, ZFN이 대표적이다. 예를 들어, 대표적인 게놈 편집 툴인 CRISPR-Cas9는, 가이드 RNA와 상보적인 염기 서열을 인식하여 2본쇄 DNA(즉 게놈 DNA)를 절단한다. 절단된 2본쇄 DNA가 수복되는 과정에서, 도너 벡터를 공(共)도입해 두면, 벡터에 탑재한 외래성 DNA를 2본쇄 DNA에 도입할 수 있다.
따라서, 상기의 도입 위치의 염기 서열에 따른 가이드 RNA를 이용하는 것에 의해, CRISPR-Cas9를 이용하여, 위치 특이적으로 외래성의 DNA를 도입할 수 있다.
그런데, 본 개시에 있어서, 외래성 DNA의 도입 부위는, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정된다. 더욱이 도입 위치의 특정에 있어서, NCBI accession number NW_003614838.1로 참조되는 염기 서열에 대해서, 상동인 염기 서열 중에서 도입 위치를 동정할 수 있는 것도 이미 기술한 대로이다. 여기에서, 상기의 상동인 염기 서열에 대해서, 외래성 DNA를 도입하기 위한 가이드 RNA를 디자인하려고 할 때에는, 미리 DNA의 도입을 예정하고 있는 CHO 세포의 게놈의 염기 서열을 결정해 둘 수 있다. 가이드 RNA의 염기 서열을, 참조 서열뿐만 아니라, 실제로 도입을 예정하고 있는 특정의 CHO 세포의 게놈 염기 서열을 고려하는 것에 의해, 보다 특이적인 염기 서열의 디자인이 가능해진다.
본 개시의 어느 태양에 있어서, 도너 벡터는 도입해야 할 외래성 DNA에 더하여 선택 마커 등의 임의의 요소를 포함할 수 있다. 선택 마커에는, 항생 물질 내성 유전자나 대사 선택 마커가 포함된다. 게놈 편집 후의 CHO 세포를, 선택 마커에 따른 배양 조건에 두는 것에 의해, 도너 벡터에 탑재한 외래성 DNA가 발현 가능한 상태로 게놈에 도입된 세포를 선택적으로 유지 증식시킬 수 있다. 이상과 같은 공정을 거쳐 선택적으로 유지된 세포군은, CHO 세포의 게놈의 동일한 위치에 공통의 외래성 DNA가 도입된 세포군을 구성한다. 혹은, 얻어지는 세포군의 외래성 DNA의 발현 레벨을 비교하여, 목적으로 하는 발현 레벨을 초과하는 형질 전환 세포를 스크리닝하여 클로닝하면, 외래성 DNA를 본 개시에 있어서 동정된 핫스폿에 통합시킨 형질 전환 세포를 세포주로서 수립할 수도 있다. 본 개시가 제공하는 외래성 DNA의 도입 방법은, CHO 세포 혹은 CHO 세포주의 제조에 유용하다.
즉 본 개시는, CHO 세포 또는 CHO 세포주의 제조 방법으로서, 해당 방법이, 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 영역에 선택적으로 도입하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시의 방법은, 더 부가적으로, 도입된 외래성 DNA의 발현 레벨을 결정하는 공정과, 결정한 발현 레벨을 비교하는 공정을 포함할 수 있다. 발현 레벨의 비교 후, 발현 레벨이 높았던 세포를 선택하여 클로닝하는 것에 의해, 보다 바람직한 형질 전환 세포를 취득할 수 있다. 모든 형질 전환 세포에 있어서의 외래성 DNA의 발현 레벨을 랭킹하여, 예를 들어 상위 20%, 혹은 10%, 바람직하게는 8%, 보다 바람직하게는 5% 이내에 포함되는 형질 전환 세포를 바람직한 형질 전환 세포로서 선택할 수 있다.
외래성 DNA로서 시그널을 생성하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 이용한 경우, 시그널 강도를 지표로 하여 그 발현 레벨을 비교하여, 형질 전환 세포를 스크리닝할 수 있다. 시그널을 생성하는 폴리펩타이드에는, 녹색 형광 단백질(GFP)이나 그의 유도체가 포함된다. 혹은, 외래성 DNA로서, 선택 마커를 이용할 수도 있다. 선택 마커를 이용한 경우에는, 마커에 따른 배양 조건에서 CHO 세포를 배양하여, 본 개시에 의해 동정된 핫스폿에 외래성 DNA가 도입된 CHO 세포를 선택할 수도 있다. 도너 벡터로부터 게놈에 통합되는 선택 마커나 시그널 생성 폴리펩타이드 등을 코딩하는 핵산/폴리뉴클레오타이드는 연결되어, DNA 카세트를 구성할 수도 있다.
본 개시에 있어서, 「Landing pad」란 상기 「DNA 카세트」를 포함하는 DNA이며, 게놈에 외래성 DNA를 도입하는 점에서 「DNA 카세트」와는 동의이다.
본 개시에 따라 게놈의 핫스폿에 도너 벡터의 DNA 카세트를 도입할 때, DNA 카세트에는, 더 부가적으로, 재조합 효소의 인식 서열을 부가할 수 있다. 재조합 효소로서는 Cre 리콤비나제나 FLP 리콤비나제가 알려져 있다. 이들 재조합 효소는, 각각의 인식 서열인 loxP나 FRT를 인식한다. 따라서, DNA 카세트의 양단에 이들 인식 서열을 부가해 두면, DNA 카세트에 의해 도입된 외래성 핵산/폴리뉴클레오타이드를, 재조합 반응에 의해 용이하게, 또한 선택적으로 다른 DNA로 치환할 수 있다. 일단 게놈에 도입된 외래성 DNA를, 상이한 DNA 카세트와 바꿔 조합하는(치환하는) 것을, 교환 반응이라고 한다. 그리고, 교환 반응에 관계하는 재조합 효소가 선택적으로 인식하는 염기 서열은, 재조합 표적 서열(recombination targeting sequences)이라고 할 수 있다.
일단 수립된 본 개시에 기초하는 형질 전환 세포는, 핫스폿에 짜넣어진 외래성 DNA를, 임의의 외래성 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA로 치환하는 것에 의해, 임의의 폴리펩타이드의 발현이 가능해진다. 그리고, DNA 카세트가 핫스폿에 도입되고, 또한 외래성 DNA를 높은 레벨로 발현할 수 있는 형질 전환 세포에 있어서는, DNA 카세트의 외래성 DNA를 다른 외래성 DNA로 치환한 후도, 치환 전의 외래성 DNA와 동등한 높은 발현 레벨을 기대할 수 있다. 즉, 본 개시에 따라 수립된 형질 전환 세포는, 임의의 폴리펩타이드의 생산에 응용할 수 있으므로, 친세포(Master cell; 마스터 셀)로서 유용하다. 즉 본 개시는, CHO 세포 또는 CHO 세포주의 제조 방법으로서, 해당 방법이, 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를, CHO 세포의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
또한 본 개시는, 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 영역에 도입된 외래성 DNA를 포함하는, 단리된 CHO 세포에 관한 것이다. 본 개시의 CHO 세포는, 바람직한 태양에 있어서, 외래성 DNA가, 임의의 DNA를 도입하기 위한 재조합 표적 부위를 포함할 수 있다. 즉 본 개시는, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에, 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를 포함하는, 단리된 CHO 세포에 관한 것이다. CHO 세포가 보유하고 있는 게놈 중의 특정의 영역에 외래성 DNA가 짜넣어져 있는 것은, 예를 들어 당해 영역을 구성하는 염기 서열에 특이적인 염기 서열을 포함하는 프라이머로 게놈 DNA를 주형으로서 증폭하는 것에 의해 확인할 수 있다. 증폭의 결과, 목적으로 하는 길이의 염기 서열 길이를 가지는 산물을 확인할 수 있으면, CHO 세포가, 목적으로 하고 있는 영역에 외래성 DNA가 통합된 것임을 알 수 있다.
본 개시에 있어서, 「단리된」은, 그 자연 환경의 적어도 몇몇 성분으로부터 분리된 세포 또는 세포 집단, 예를 들면 실질적으로 균질한 세포 집단을 말한다. 「실질적으로 균질」이란, 세포 집단에서 차지하는 본 개시의 특징을 구비한 세포수의 빈도가, 1/20 이상, 바람직하게는 1/10 이상, 보다 바람직하게는 1/5 이상, 더 바람직하게는 1/3 이상, 더 바람직하게는 1/2 이상, 가장 바람직하게는 1/1인 것을 말한다. 여기에서, 본 개시의 특징을 구비한 세포란, 통상, 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 영역에 도입된 외래성 DNA를 포함하는 것에 의해 정의된다.
DNA 카세트로서 핫스폿에 짜넣어진 외래성 DNA는, 그 후, 임의의 폴리펩타이드의 생산을 위해서, 임의의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA에 의해 치환한다. 본 개시에 있어서, 생산을 목적으로 하는 폴리펩타이드는 임의이다. 예를 들어, 종래 CHO 세포의 배양에 의해 생산하고 있던 여러 가지 폴리펩타이드를, 본 개시에 응용할 수 있다. 따라서, 본 개시는, 어느 태양에 있어서, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 도입한 CHO 세포를 이용한, 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 본 개시에 있어서, 폴리펩타이드의 제조 방법은, 바람직하게는 다음의 공정을 포함할 수 있다:
(1) 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 공정으로서, 상기 외래성 DNA를, CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 공정;
(2) (1)에서 외래성 DNA를 도입한 CHO 세포를 배양하는 공정; 및
(3) 목적으로 하는 폴리펩타이드를 회수하는 공정.
본 개시에 있어서, CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 부위 특이적으로 도입하는 공정은, 게놈의 염기 서열 특이적인 재조합 반응에 기초하고 있다. 염기 서열 특이적인 재조합 반응은, 바람직한 태양에 있어서, 게놈의 염기 서열로부터 선택한 표적 부위에 목적으로 하는 외래성 DNA를 부위 특이적으로 도입하는 것을 의미한다. 본 개시에 있어서, 게놈으로의 부위 특이적인 외래성 DNA의 도입이란, 외래성 DNA의 게놈 중으로의 삽입을 포함한다. 혹은, 게놈을 구성하는 염기 서열의 일부를, 외래성 DNA로 치환함으로써, 목적으로 하는 DNA를 목적으로 하는 위치에 도입할 수도 있다.
본 개시에 있어서는, 일단 부위 특이적으로 도입한 외래성 DNA를, 또 다른 DNA와 치환할 수도 있다. 치환용의 재조합 효소 인식 서열이 핫스폿에 도입된 세포는, 본 개시에 있어서의 친세포(마스터 셀)로서 유용하다.
친세포(마스터 셀), 혹은 그 게놈 중의 외래성 DNA를, 생산을 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA로 치환한 형질 전환 세포는, 필요에 따라서, 게놈의 염기 서열을 해석하여, 원래의 게놈 서열과의 조합(照合)에 의해, 외래성 DNA의 통합 위치나 방향을 확인할 수 있다. 예를 들어, 표적(도입 위치)으로서 선택한 게놈 영역을 구성하는 염기 서열에 특이적인 프라이머에 의해 게놈 DNA를 PCR로 증폭하면, 외래성 핵산/폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 증폭하여, 그 존재를 검출할 수 있다. 혹은, 증폭 산물의 염기 서열을 결정하여, 목적으로 하는 외래성 핵산/폴리뉴클레오타이드의 도입을 확인할 수도 있다.
친세포(마스터 셀), 혹은 그 게놈 중의 외래성 DNA를, 생산을 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA로 치환한 형질 전환 세포는, 확대 배양 후에 소분하여 분주하고, 동결 보존해 둘 수 있다. 또한, 동결 보존 후에 융해한 형질 전환 세포의 외래성 DNA의 발현 레벨이나, 그 안정성을 평가하여, 제조에 유리한 형질 전환 세포를 더 선택할 수도 있다. 혹은 본 개시에 따라 얻어진 형질 전환 세포를, 폴리펩타이드의 제조 조건에 순화(adaptation)시켜, 제조에 유리한 세포를 얻을 수도 있다.
본 개시에 기초하는 제조 방법에 응용할 수 있는 폴리펩타이드의 예로서, 사이토카인, 펩타이드 호르몬, 성장 인자, 그들의 수용체, 항체로 대표되는 항원 결합 분자나 효소 등을 들 수 있다. 이들 폴리펩타이드는, 필요에 따라서, 전장이나 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 게놈에 도입하여 발현시킬 수 있다. 혹은, 임의의 폴리펩타이드와 융합시킬 수도 있다. 부분적인 개변이나, 복수의 단편을 인위적으로 결합시킨 분자로서 발현시킬 수도 있다.
목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 도입한 CHO 세포는, CHO 세포에 적합한 조건에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 기초 배지(동물세포 배양용 기초 배지)에서 배양하기 위한 조건이 널리 알려져 있다. 예를 들어, 동물세포의 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, F10 배지, F12 배지 등이 공지되어 있다. 배지에는 동물 혈청을 가할 수도 있고, 가능한 경우에는 무혈청 배양을 채용할 수도 있다. CHO 세포의 배양 조건은, 구체적으로는, 기상의 CO2 농도가 0-40%, 바람직하게는, 2-10%인 분위기하, 30-39℃, 바람직하게는, 37℃ 정도에서, 1-14일간 배양하는 것이 일반적이다. 혹은 목적으로 하는 폴리펩타이드의 산생이 계속되고 있는 한, 더 장기에 걸쳐 배양을 계속할 수도 있다. 배양 기간 중에는, 필요에 따라서 배지의 일부, 혹은 전량을 새로운 배지로 치환하여 배지를 회수할 수 있다
또한, 동물세포 배양용의 각종 배양 장치로서는, 예를 들면 발효조형 탱크 배양 장치, 에어 리프트형 배양 장치, 컬쳐 플라스크형 배양 장치, 스피너 플라스크형 배양 장치, 마이크로캐리어형 배양 장치, 유동층형 배양 장치, 홀로(hollow) 파이버형 배양 장치, 롤러 보틀형 배양 장치, 충전조형 배양 장치 등을 이용하여 배양할 수 있다.
목적으로 하는 폴리펩타이드가 배양물 중에 분비되어 있으면, 배양 상청을 분취하는 것에 의해 폴리펩타이드를 회수할 수 있다. 폴리펩타이드는, 실질적으로 순수하고 균일한 상태로 정제할 수 있다. 폴리펩타이드의 단리 및 정제는, 통상의 정제 공정에 사용되고 있는 단리/정제 방법을 응용할 수 있다. 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 및 재결정 등이 적절히 선택, 조합되어 항체가 적합하게 분리, 및 정제될 수 있다. 크로마토그래피로서는, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는, 액체 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC 및 FPLC를 이용하여 행해진다. 항체와 같은 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는, 프로테인 A 컬럼이나 프로테인 G 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수도 있다. 프로테인 A 컬럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Pharmacia제) 등을 들 수 있다.
실시예
이하는, 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 전술한 일반적인 기재에 비추어, 여러 가지의 다른 태양이 실시될 수 있는 것이 이해될 것이다.
전술한 발명은, 명확한 이해를 도울 목적하에, 실례 및 예시를 이용하여 상세하게 기재했지만, 본 명세서에 있어서의 기재 및 예시는, 본 발명의 범위를 한정하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 인용한 모든 특허문헌 및 과학문헌의 개시는, 그 전체에 걸쳐서, 참조에 의해 명시적으로 본 명세서에 원용된다.
〔실시예 1〕 Landing pad 플라스미드의 제작
카세트 교환 반응 시에 목적 유전자를 도입하기 위한 표적 위치로서 기능하는 DNA 카세트를 포함하는 「Landing pad」를 작성하여, 플라스미드에 통합시켰다(도 1). 이 Landing pad 플라스미드에는, CHO 세포 게놈 상의 유전자 고발현 영역을 특정하기 위한 마커 유전자로서 녹색 형광 단백(GFP) 유전자가 탑재되어 있다. 또한, Landing pad 플라스미드 도입 후의 선발 마커로서 다이하이드로엽산 리덕타제(DHFR) 유전자를 갖는다. DHFR 유전자 및 GFP 유전자의 2유전자의 양단에는 재조합 효소 Cre에 의해 인식되는 DNA 서열(loxP1 및 loxP2)이 삽입되어 있다. 이 2종의 loxP 사이에 존재하는 DHFR 유전자 및 GFP 유전자는 카세트 교환 반응 시에 제거되고, 재조합 플라스미드에 탑재된 제조해야 할 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자로 치환된다. 이하의 실시예에 있어서는, 항체 유전자로 치환하여, 항체의 생산을 시도했다.
〔실시예 2〕 재조합 플라스미드의 제작
CHO 세포 게놈 상에 삽입된 Landing pad의 DNA 카세트와 카세트 교환 반응시키기 위한 「재조합 플라스미드」를 작성했다(도 2). 재조합 플라스미드에는 DHFR 유전자, 중쇄·경쇄로 이루어지는 항체 유전자가 탑재되어 있고, 이들의 양단에는 loxP가 삽입되어 있다. 또한, 평가 항체로서는 1종류의 IgG1 항체(mAb-A) 및 2종류의 IgG2 항체(mAb-B, C)를 이용했다. 각 항체는 다음과 같이 각각 상이한 항원을 인식한다.
mAb-A : GYM329 / Anti latent myostatin antibody / IgG1
mAb-B : CIM331 / Anti IL-31 receptor antibody / IgG2 (WO2010/064697)
mAb-C : SA237 / Anti IL-6 receptor antibody / IgG2 (WO2016/027859)
한편, 도 2는 1조의 중쇄·경쇄로 이루어지는 항체 유전자를 탑재한 재조합 플라스미드를 이용하고 있지만, 이중특이성 항체의 경우에는 2조의 중쇄·경쇄로 이루어지는 항체 유전자를 탑재하는 등, 재조합 플라스미드의 구성은, 발현시키는 항체의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있다.
〔실시예 3〕 Targeted integration(TI) 숙주 세포의 제작
숙주 세포(CHO-DXB11)로의 Landing pad 플라스미드의 트랜스펙션은 LONZA사의 Nucleofector 2b(Nucleofector는 Lonza Cologne GmbH의 등록상표)를 이용하여 실시했다. 트랜스펙션 시에 사용하는 Landing pad 플라스미드는 제한 효소 EcoRV 및 SalI에 의해 직쇄화한 것을 사용했다. 트랜스펙션 실시 4시간 후에, 히포크산·티미딘 불포함 배지로 교환하고, 세포의 진탕 배양을 개시했다. 약 2주간 후에 소니사의 셀 소터 SH800을 이용하여 싱글 셀 소팅을 실시했다. 소팅 시에는, GFP 형광 강도가 높은 상위 2% 이내의 세포 집단을 소팅했다. GFP의 여기에는 488nm 반도체 레이저를 사용했다. 싱글 셀 소팅한 세포를 확대 배양해가서, 각 세포 클론으로부터 게놈 DNA를 추출했다. 회수한 게놈 DNA를 이용하여, 각 세포 클론에 도입된 GFP 유전자의 카피수를 Bio-Rad사의 QX200 Droplet Digital PCR 시스템(Droplet Digital은 Bio-Rad Laboratories, Inc.의 등록상표)에 의해 측정했다. GFP 유전자의 카피수를, 그 세포가 가지는 Landing pad 카피수로 하고, 1 또는 2카피의 Landing pad가 도입된 세포 클론을 선발했다. 취득한 각 세포 클론은 TI 숙주 세포 후보로서 이후의 실험에 사용했다.
〔실시예 4〕 카세트 교환 반응에 의한 TI 숙주 세포로의 항체 유전자의 도입 및 평가
실시예 3에서 수립한 TI 숙주 세포 후보를 이용하여 항체 유전자의 도입 및 평가를 행했다. Nucleofector 2b를 이용하여 mAb-A의 항체 유전자(H쇄 및 L쇄 각각 1카피)를 탑재한 재조합 플라스미드 및 Cre 발현 플라스미드를 각 TI 숙주 세포에 공도입하여, 카세트 교환 반응을 실시했다. 카세트 교환 반응에 의해, TI 숙주 세포 게놈에 도입되어 있던 DNA 카세트는, mAb-A의 항체 유전자를 포함하는 DNA 카세트에 의해 치환된다. 트랜스펙션 실시 4시간 후에 배지 교환을 행하고, 약 2주간 후에 GFP 형광을 갖지 않는 세포를 분획 취득하여, 각 TI 숙주 유래의 항체 발현 세포를 수립했다. 이때, 몇몇의 TI 숙주 세포로부터는 카세트 교환 반응 후에 생존 세포를 얻을 수 없었다. 수립한 항체 발현 세포 클론을 이용하여 2주간의 생산 배양을 행하여, 항체 산생능을 평가했다. 그 결과, 3종류의 TI 숙주 유래(TI-J, L 및 M)의 항체 발현 세포 클론이 생산 배양 14일째에 있어서 1000mg/L 이상의 항체 산생량을 나타냈다(도 3).
〔실시예 5〕 TI 숙주 유래의 항체 발현 세포를 이용한 산생능의 장기 안정성 평가
mAb-A의 항체 유전자(H쇄 및 L쇄 각각 2카피)를 탑재한 재조합 플라스미드를 새롭게 작성하여, 2종류의 TI 숙주 세포(TI-J 및 L)에 대해서, 실시예 4와 마찬가지로 카세트 교환 반응을 실시했다. 얻어진 항체 발현 세포 클론을 동결 보존하고, 융해 후부터 약 140일간의 장기 계대 배양을 행했다. 이 기간에 있어서, 약 30일 간격으로 생산 배양을 실시하여, 세포 융해 후의 항체 산생능의 변화를 평가했다. 그 결과, TI-J 및 TI-L 세포 유래의 각 항체 발현 클론은 140일의 장기간에 걸쳐 높은 항체 산생능을 유지하고 있고, 140일간의 평균치는 각각 약 2400 및 4200mg/L였다(도 4).
〔실시예 6〕 상이한 항체 유전자를 이용한 TI 숙주 세포의 산생능 평가
mAb-A, B 및 C의 3개의 항체 유전자(H쇄 및 L쇄 각각 2카피)를 각각 탑재한 재조합 플라스미드를 새롭게 작성하여, 생산 배양에서 가장 높은 항체 산생능을 가진 세포 클론의 친세포인 TI-L 세포에 대해서, 실시예 4와 마찬가지로 카세트 교환 반응을 실시했다. 그 후, GFP 형광을 갖지 않는 세포를 분획 취득하여, TI 숙주 유래의 3종류의 항체 발현 세포를 수립했다. 2주간의 생산 배양의 결과, mAb-A, B 및 C의 상이한 3항체에 있어서도, TI-L 세포 유래의 항체 발현 세포는 높은 산생능을 갖고 있었다(도 5).
〔실시예 7〕 Landing pad의 도입 사이트의 동정
생산 배양에서 가장 높은 항체 산생능을 가진 세포 클론의 친세포인 TI-L 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다. Pacific Biosciences사의 PacBio Sequel 시스템 및 Illumina사의 HiSeq 시퀀스 시스템의 2개의 차세대 시퀀서를 이용하여 TI 숙주 세포의 전체 게놈 시퀀스를 행했다. 우선, PacBio Sequel 시스템으로부터 얻어진 전체 리드 데이터로부터 Landing pad의 DNA 서열을 갖는 8개의 롱 리드를 추출하고, 이들을 공공(公共)의 Nucleotide Database상의 CHO 세포 게놈 서열(CHO-K1[ATCC]_RefSeq_2014)에 대해서 Blast 검색했다. 검색 결과로부터 가장 상동성이 높은 게놈 영역을 Landing pad 플라스미드의 도입 사이트로서 동정하여, Landing pad를 포함하는 도입 사이트의 이론 게놈 구조를 설계했다. 설계한 이론 게놈 구조에 대해서, HiSeq 시퀀스 시스템으로부터 얻어진 전체 리드 데이터를 매핑 처리한 결과, 설계한 게놈 구조에 이론대로 매핑되어 있는 것을 확인했다. 동정의 결과, Landing pad는 CHOK1 RefSeq scaffold(2019년 1월 현재)에 등록되어 있는 NW_003614838.1 상의 CCDC91(coiled-coil domain-containing protein 91) 유전자(Gene symbol: LOC103164262)의 1번째 인트론(서열번호: 3) 상에 삽입되어 있었다(도 6). 한편 실제로는, CCDC91 유전자는, NW_003614838.1의 안티센스 서열 상에 매핑된다. 그 때문에, 서열번호: 3의 염기 서열도, NW_003614838.1의 안티센스 서열 상에 매핑된다. 또한, CCDC91 유전자의 약 32kbp 상류에는, Mouse 게놈 서열(GRCm38.p6) 중의 CCDC91 유전자의 프로모터와 상동성이 높은 영역이 존재했다. 동정한 도입 사이트를 중심으로 하여, 게놈 서열 상의, 5' 측과 3' 측에 위치하는 5kb의 염기 서열은, 각각 서열번호: 1 및 2와 같다. 따라서, 각 염기 서열과 Landing pad의 위치 관계는, 다음과 같다. 5'-(서열번호: 1)-[Landing pad]-(서열번호: 2)-3'
본 개시에 의해 제공되는 핫스폿은, 동물세포에 외래성 DNA를 산생시키기 위한 TI에 의한 형질 전환 세포의 제작에 유용하다. 예를 들어 본 개시의 핫스폿에 항체를 코딩하는 DNA를 도입한 경우, 항체의 산생에 유용한 형질 전환 세포를 높은 확률로 얻을 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> METHOD FOR TARGET-SPECIFIC INTRODUCTION OF EXOGENOUS GENES
<130> C1-A1903P
<150> JP 2019-070329
<151> 2019-04-02
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5040
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<222> (537)..(614)
<223> Exon 3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3147)..(3189)
<223> Exon 2
<400> 1
tgagcatcca aacaaaccct ctgaggtaca gcgtcttacg acacctttac atggggacat 60
gacgtctctc ccttgctctt gtgagaagat gagcactgga tgtggatgcc tgggcctctg 120
cagggagaca ccaagccctt aaggcgtatg cccgggaatg gtggagctgg gcaattatga 180
cagtggctcc ttgttcacct ttctgagaaa cattcacact gacctcagga gtatcaggag 240
tataagccaa ggtagatgtg aacgacatat gttgtactta aggctcattc agagtccctt 300
atacaaccag cctccagctg gcacagaatg ggaaaaaagg aaatttggat tcagactgtt 360
ctaggtctct acatttttca gatcaaaaaa ccaacaaact taaacaaaaa aaaaatgaga 420
actgggtttt acaaacaaac aaacaaaatc actttagata caggaaagaa agaatcctgt 480
aaccaggacg caatacctgt aggaaaggtg gcccagggga cagcagggga cattgcttgg 540
tttccactgt gttcaccatc aaaggtctct gcggcctgta agacaaggca agaccatttg 600
aaaagaccta aagagctgta ggttttatca gtagtcatgc gcctagcccc acaggcatgc 660
ttctgcgatg agccactcac tcacattctc tctgaacacc caccccactg ccatctacag 720
tgccagatcc cagttcccag gtaaatgact tccttcctta tcccaacaac ctcacgtcaa 780
tgaaatgttt atttcgtgtg tctttcattg taatttaact catcatattt gtccatcggt 840
gtaaaaattc ccttaacaat agacttgagc aaatctttta tttgaaaagg tcatttagat 900
tagcatgaga tttagggact aatctgaaag agcaggtgag cctgtcttct tgaacaatct 960
ggtctctctg gtaccaaact gtagagaatt acaaaagcca gcattttcag tgaatgggct 1020
ctcctgtttg gtggcagcta cttaggacaa ggcttacaga gagcacaaag ttttcagtct 1080
ctcaggtagc tgttaaagtg agattagtat tatgattagt attagagagt taaagtgaga 1140
tcagagatat aatgtcataa ttctaattcc tcttctgcac tgagttgcca gacaactcag 1200
aagccagagg acatgggctg cagaggacag aagatgaggc tgcactgtcc acgcgctgtg 1260
aaagtgagta tattggactg aacacaggac gaagaccttc tgctcctcca tagcagaact 1320
gaagagcaag aacgcctgct gaacacagtc aaaccacatc aggaaatgag tgctagccct 1380
cctgttgaga ggactgacac actgaagtga cactgaattc agttgtcact tgtgaaagca 1440
gctgcggctt ttctatggct ctgccatggt tgagctgcga gaagatgctt gtgtgggacc 1500
cttaaataac agcttccagg caccaaggca acatctggtc ctcaatatcc atggaatctt 1560
aacaaagttt tgaatgctcc atttaacacg aatgagactc caaacataaa ctattagata 1620
aaagcatgga acactcaaat gagtttttta aaaagcagtt tgggatgaaa catggaatgc 1680
atgcacatct acactgacag cctgcacaca gaaaacccac atgtctacac tggctgccca 1740
cacacagaaa acctatatgt ctatactgga tgtctgcaca tggagaacat gtgtctatag 1800
catttccctg cacatgaaga acatgtctac acagcatgtg tgtctatagt agttgcctgc 1860
acatggagaa catgtgtgtc tatagtagtt gcctgcacat ggagaacatg tgtgtctata 1920
gtagttgcct gcacatggac aacatgtgtg tctataatac ttaactgcac atggacagca 1980
tgtgtgtcta tagtggttgc ccgcacatgg agaacatgtg tgtctacagc agttgctgcc 2040
tgtacctgaa gaacacacgt gtgtgcaccg actgcccgca cactggcagc tatgataaca 2100
aatgacctgc tgctgaaaac ggccactgtt ctgccttgaa aatgccccca cttctccatc 2160
gacagtaatt gcacccctaa cttttacagc tctcttttta ccaaatccaa actaggtgaa 2220
caactaaaaa acaagaagaa gaaagttctg agctcacaca gtgggtggtt ccaagtcttg 2280
agccctggca tttgactctt aatccagaga ttttcctgca agactatact ggctccgcaa 2340
aaataactgg tttataaaat attccaataa aacgagcaca cattgaaaag ctcacaatgc 2400
ctgcttacaa atgtcccacc aaaccctgag agagcggtgt ggaactgcag caatgatcat 2460
tgccaccagc tggacgtctg cgtgtgtcac acacaaaaac cacggggggg gggggggggg 2520
gggggggggg ggaggggggg gggggggcgc ctgacacgtt ctaacagatg tgtccccatc 2580
ctctagtgac agtctgagct cttcctgatg cctcaccagc cacattaatt accctgattt 2640
aaatccttcc tatggcaaga gcaaagcgtc aataacaacc catccctgag tctctccatt 2700
tcccttgact tcgatctctg tttcagaatt acatcaaagc gactaagaat agaacatgag 2760
ggtaggagca accactcagt cagtaaactg tctgccttgc aagcacagaa ccagagtttc 2820
ttccccaaga cgcactctta acagatctgg gcacggtggc gtgcatttgt aatcccagtg 2880
ctaggaaaga tgatccctga ggcttgctag ccagactgca cagtctactt gacaagctcc 2940
aggccagtga aagaccctgt ccaaaagaaa aatgaacggg accaagtaag agacctaagt 3000
ggttgtcctc tgggatctag acgctcatgc acacggagca gcagcagaca cacactcggt 3060
gaataacaga tcaaggaaac agtgaaagta aacacatttt tgtaatagtt tattgttacc 3120
caaagttaaa aacagatgac acttacctcg aagccaccaa agtcgtcatc gtccatcttc 3180
aagcagcacc tgaaacacag aacaactgag atgagacaag ccacctgcat ccaagcacgc 3240
ctgtgactta aaggaatata cactctgagc tgtaaattaa agctgtttca tttgggttat 3300
gaagggcttt cttaaactgt attgtgcatt ttttatcact taaaaaaaaa cagctagtaa 3360
ttggttattt ttttactttc tggcaaaatt agcaatttct ggaacttttt cagtaaccat 3420
gtattttgcc attttctgtt gagactccag gagtggaaaa aatattcttt tacattttaa 3480
tttgcttttc ccaaagtggc gctaggcccc atcagtaatg cttcctgctt tccgaatcta 3540
ctcctcagct gcctggcagc atcagcacaa actccagtta agaacaggac tgtggttgag 3600
tttttggaaa tctgtccccc accacaaagg ttcttccctc ggtttcatgg ccgggctgag 3660
ttagattctc aaagttgatc agcatttttg aacggtggcc acgacttctg gagcatttga 3720
tatgtgtatt tttagccgaa actgctttgc acttctggaa aaatgtggag caagttactg 3780
agccgatcaa ggtaaatcaa gtcgtgtgtt cacgagatga ggcagaaaac atgagaggac 3840
ccaggatcct tcacacctca ctctcaaggt gggagagaga gcaccgtacc acacgggctg 3900
tgcctctccc taaacacgtt acgggagggt caagggtcaa tcaagcctta gcgccgaggc 3960
ttcagaacta aagcagcggc tttggctcac agcagaaagg aaggaaaatg cccgaaaaaa 4020
ggctggggag taatcgtcac ctatgctccc taagagtgag aacaggaaaa cagaagtgaa 4080
gcccagcagg cctcgctcca gggagccaga agccatgctc aggtccctga ggaacaccta 4140
ccaacaactc catcaaaaga attccacact ccagaactca acagcaaaca aatacactaa 4200
tcacagacag ctttcatgag gccaaccaga ctcattttca caaaaagtat aaagaatgcg 4260
tgtggacaga agcatgataa ttttataagt ggcgctgagt tgctagaatt gctaacacag 4320
aaaggacaga ggcggcactg ccacggtttg gtcacagcct cacagtctga tgacatttct 4380
ccaaaaacgt atttcttttt ataaatttag aaattaaagc tcagctagcc atcggtagga 4440
agcacctaga aaatatgaac cagactgcta agaacaacgc tcggtggcgg gtagtctgaa 4500
atgtcatcac gttattcgcg tctcaactga ggacaactct cctctgatga catccgtcag 4560
gaagaaacta tgggagaaga agatgtgcac cctaaggatt accagggaaa ctgtagacac 4620
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tttatttaaa agtaaataaa tgtgccctgt atatcttaag atatgatgcc tcagaaatgc 5040
<210> 2
<211> 6651
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<222> (6455)..(6651)
<223> Exon 1
<400> 2
tgtgttaaag acatagcctt tctgaaaata atttagattc aaaccctatg acagtttcct 60
tttgaaaatt aagagaagaa agaaaacgga tgtttttttt tttgctgctg attgtgtgtg 120
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cacttgggag gcagagagag ggaatcctgg gtcaaaatgg ccagctagac tagtctgcac 480
tgtccagctc tggcttcagc aggaaagcct gcctcaaaaa tcagtgatca aaaatcatgc 540
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acaaatacac aaacatacaa aaaggtcatt gatttacaac acacaaaagt taaaaagcaa 660
tttttaagaa ggaaacatca gaggttcttc atggactctg tcacttgaat acactcaacc 720
cttggttctt tctaagccat aatgtgttaa gtcgctgtga aacgtgtctg cagtttgtgt 780
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tagtatctaa gctcaacaat ctcaggaccc cttgcatgta aattaaccta tcctgttgct 960
ttattatgtt aattccctat tctgccatcc tcagtattta aaacactgac agtactttta 1020
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gggagaaaac tgcctagtgt gggaaaataa ttgagggggg atctatggtt gggaatatca 1260
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<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
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ggtctctact ttgtttcact ttttatctaa ttcaactcag gtgagttgaa acctttgcca 6300
cagtagcagc agagccaaca gcatctgggt tctagcaggt tagggaaggg ataaattcta 6360
gttttctact ggaaaacaaa cgactggaag tgattgtaag gtcagatgtg tgtgcgtcag 6420
ggtttagttc agtggttttg gttctctaac acactcattc agtctatttt agaaacacca 6480
gtcatctggc gtaagaaaag gtatgccatt tcatgacata aatcatctca agctttaaaa 6540
aatagtaatg ggaggggtgg aggatggtct gatggttagc gcactggctg ctcttgcaga 6600
ggtccagatt cggttcctag cacccacacg ggggctcaca actgcctgta cctccagttc 6660
ctaatgatct acaccctctt ctggcttcca caagcactgc acaaacttgg tgcacaaaca 6720
tgcacacaga taaaactcac acacacccac ataaacagta aaaagtaaat aaaataataa 6780
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aggcagaacc agcaagtgga tactataagg acttagtttt tagatttttt tttttcgtgt 6900
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc gcgcgcgcac 6960
atgttcatgt cacaacaaga atgtgtaggt ccgtggaaac gttacaggag ctggttctct 7020
ccttccacta tgcaggttcc agggatcaaa cttagcagca agcaccaacc cccaaaactt 7080
ttcaatgtaa ccaatttaaa aatacaatgg aggcacatgg aagcacatgc acacctgcag 7140
atacacactt atgaacacac aagcacatag tatttgaaaa gaaaaaagaa aagcatccac 7200
ttgtggacta atgagcatga tcagaaaaat cacctatgct gtagttaaag tccccaaagg 7260
agaaggcatt gagattgcaa tgaagtaaat attgaaaaga agatggccaa aaacatctca 7320
ggattgatta gcaacaaacg acaagccaag caaagagaga caacccagca aaataaacac 7380
tggatgctct catcacccca atatgacatc aataaaacac aatccaaaga acccaaacgg 7440
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ttccaaagga gctaaactcc attac 8305
Claims (15)
- 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 방법으로서, 해당 방법이, 상기 외래성 DNA를, CHO 세포의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
- NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 도입한 CHO 세포를 이용한, 폴리펩타이드의 제조 방법.
- 이하의 공정을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법:
(1) 목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 공정으로서, 상기 외래성 DNA를, CHO 세포의 게놈의 NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정;
(2) 외래성 DNA가 도입된 CHO 세포를 배양하는 공정; 및
(3) 목적으로 하는 폴리펩타이드를 회수하는 공정. - 제 3 항에 있어서,
목적으로 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래성 DNA를 CHO 세포에 도입하는 공정이, 다음의 공정(i)-(ii)를 포함하는 방법:
(i) 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를 CHO 세포에 도입하는 공정, 및
(ii) (i)의 DNA 카세트를 표적 부위로서 인식하는 재조합 효소에 의해, 외래성 DNA를, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에 도입하는 공정. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 외래성 DNA의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 방법. - 제 6 항에 있어서,
상기 외래성 DNA의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목적으로 하는 폴리펩타이드가 항원 결합 분자인 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 항원 결합 분자가 항체인 방법. - NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역에, 외래성 DNA를 교환 반응에 의해 도입하기 위한 DNA 카세트를 포함하는, 단리된 CHO 세포.
- 제 10 항에 있어서,
상기 DNA 카세트의 도입 부위가, NCBI accession number NW_003614838.1에 의해 특정되는 게놈 영역 중의 coiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91) 유전자 및 그의 프로모터 영역을 포함하는 영역으로부터 선택되는 CHO 세포. - 제 11 항에 있어서,
상기 DNA 카세트의 도입 부위가, CCDC91 유전자 영역으로부터 선택되는 CHO 세포. - 제 12 항에 있어서,
상기 DNA 카세트의 도입 부위가, CCDC91 유전자의 제 1 인트론 중인 CHO 세포. - 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 외래성 DNA가, 목적으로 하는 항원 결합 분자를 코딩하는 외래성 DNA인 CHO 세포. - 제 14 항에 있어서,
상기 항원 결합 분자가 항체인 CHO 세포.
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