KR102235603B1 - 향상된 이식유전자 발현 및 가공 - Google Patents

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Abstract

발현의 고안정성을 포함하는 발현의 양 및 품질, 적절하다면 발현 산물의 세포 밖으로의 수송에 관해 이점을 나타내는 특히 비-영장류 진핵 숙주 세포에서 관심 대상 DNA를 발현시키기 위한 작제물 및 방법이 개시된다.

Description

향상된 이식유전자 발현 및 가공{ENHANCED TRANSGENE EXPRESSION AND PROCESSING}
본 발명은 세포 대사를 매개하거나 또는 영향을 미치는 대사 경로, 예를 들어, ER 막에 걸친 전위 및/또는 세포질 막에 걸친 분비에 연루되거나 대사 경로 상에서 작용하는 작제물 및 단백질을 제공하는 것뿐만 아니라 세포 대사에 영향을 미치는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어, 매우 다양한 비상동 단백질(이식유전자 발현 산물)의 전위/분비가 변용되는 재조합 포유류 세포의 생성 및 용도에 관한 것이다. 상기 방법, 핵산 작제물은 일반적으로 이식유전자 발현을 개선시키도록 설계된다.
치료적 단백질뿐만 아니라 유전자의 생명공학적 생성 및 세포 요법은 진핵 세포 내로 도입되는 이식유전자의 성공적인 발현에 의존한다. 성공적인 이식유전자 발현은 일반적으로 숙주 염색체 내로 이식유전자의 도입을 필요로 하며, 특히, 통합된 이식유전자 복제물의 수에 의해 그리고 낮은 또는 불안정한 전사 및/또는 높은 클론 가변성을 야기할 수 있는 후성적 효과에 의해 제한된다. 세포 밖의 이식유전자 발현 산물의 실패한 또는 감소된 수송은 또한 치료적 단백질뿐만 아니라 유전자 및 세포 요법의 생성을 제한한다.
본 발명을 설명하기 위해, 특히 실행에 관한 추가적인 상세한 설명을 제공하기 위해 본 명세서에서 사용되는 특허, 특허출원 및 등록번호를 포함하는 간행물 및 기타 매체는 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
포유류 세포에서 이식유전자 발현을 증가 및 안정화시키기 위해, 후성적 조절제는 음성 위치 효과(negative position effect)로부터 이식유전자를 보호하는데 점점 더 사용되고 있다(Bell and Felsenfeld, 1999). 이들 후성적 조절제는 경계 또는 절연 구성요소, 자리조절영역(locus control region: LCR), 안정화 및 항억제인자(stabilizing and antirepressor: STAR) 구성요소, 편재하여 작용하는 염색질 개구부(ubiquitously acting chromatin opening: UCOE) 구성요소 및 앞서 언급한 기질 부착 영역(matrix attachment region: MAR)을 포함한다. 모든 이들 후성적 조절제는 포유류 세포주에서 재조합 단백질 생성을 위해(Zahn-Zabal et al., 2001; Kim et al., 2004) 그리고 유전자 치료를 위해(Agarwal et al., 1998; Allen et al., 1996; Castilla et al., 1998) 사용되었다.
이식유전자 발현 산물은 종종 세포 밖의 가공 및 수송 동안 상이한 병목현상과 맞닥뜨리며: 그의 본래의 단백질을 가공 및 수송하기 위한 기작을 단지 구비한 세포는, 특히 그들이 종종 요망된다면 비정상적으로 고수준에서 생성될 때, 특정 유형의 이식 유전자 발현 산물의 수송에 의해 용이하게 과부화되어 세포 내에서 산물을 응집시키고/시키거나, 예를 들어 기능성 단백질 산물의 적절한 폴딩을 방지할 수 있다.
수송 및 가공 병목현상을 극복하기 위해 상이한 접근이 추구되었다. 예를 들어, 개선된 분비 특성을 지니는 CHO 세포는 막 소포 수송체의 조절제로서 작용하고 이런 이유로 분비 단백질 외포작용(exocytosis)으로서 작용하는 SM 단백질 Munc18c 또는 Sly1의 발현에 의해 유전자 조작되었다(미국 특허 공개 제20090247609호). X-박스-결합 단백질 1(Xbp1), 분비 세포 분화 및 ER 유지 및 팽창을 조절하는 전사 인자, 또는 다양한 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase: PDI)는 ER 스트레스를 감소시키고 단백질 분비를 증가시키기 위해 사용되었다(Mohan et al. 2007). 단백질 분비를 증가시키기 위한 다른 시도는 CHO 세포 내에 샤페론(chaperone) ERp57, 칼넥신, 칼레티쿨린 및 BiP1을 포함하였다(Chung et al., 2004). 저온 충격-유도 단백질, 특히, 저온-유도성 RNA-결합 단백질(CIRP)의 발현은 재조합 γ-인터페론의 수율을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 분비 복합체의 단백질을 과발현시키기 위한 시도가 있었다. 그러나, 예를 들어, 문헌[Lakkaraju et al. (2008)]은 WT 인간 세포에서(예를 들어, 낮은 SRP14 수준을 발현시키도록 유전자 조작되지 않은 세포에서) 외인성 SRP14 발현은 분비된 알칼린 포스파타제 단백질의 분비 효율을 개선시키지 않았다는 것을 보고하였다.
따라서, 효율적이고, 믿을 만한 이식유전자 발현, 예를 들어 재조합 단백질 생성을 위하고, 유전자 요법을 위한 필요가 있다. 또한 이식유전자 발현 산물을 세포 밖으로 성공적으로 수송하기 위한 필요가 있다.
당업계에서 이런 및 다른 필요는 본 발명의 실시형태에 의해 처리된다.
본 발명은 일 실시형태에서,
(a) 5' 및 3' 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부(transposon-specific inverted terminal repeat)(ITR),
(b) 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치되고, 프로모터의 제어 하에 있는 이식유전자 발현 가공(transgene expression processing: TEP) 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및
(c) 선택적으로 또한 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치되고 이식유전자 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 하나의 이식유전자
를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이되, 상기 핵산 분자는 선택적으로 벡터의 부분이다.
재조합 핵산 분자는 적어도 하나의 후성적 조절 구성요소, 특히 적어도 하나의 MAR(기질 부착 영역) 구성요소를 포함할 수 있다.
MAR 구성요소는 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치될 수 있다. 선택적으로 추가 프로모터의 제어 하에 이식유전자, 예컨대 항생물질 내성 유전자 또는 면역글로불린을 암호화하는 유전자는 5' ITR과 3' ITR 사이에, 예컨대 5' ITR과 MAR 사이에 위치될 수 있다.
TEP 단백질 또는 TEP 기능성 RNA는 게놈 내로 핵산 서열의 통합, 이식 유전자 RNA 산물의 가공 또는 번역에 직접적으로 또는 간접적으로 수반되거나, 또는 ER 전위, 분비, 가공, 폴딩, ER-골지-혈장막 수송, 글라이코실화 및/또는 이식유전자 발현 산물과 같은 단백질의 다른 번역 후 변형에 수반된 단백질 또는 기능성 RNA일 수 있다.
TEP 단백질은 단백질 분비 경로의 단백질, DNA 재조합 또는 수복 경로의 단백질, BiP와 같은 샤페론을 포함하는 단백질 가공 또는 대사 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다.
TEP 단백질은 단백질 분비 경로의 다음의 단백질: hSRP14, hSec61α1, hSec61β, hSec61γ, hSRP54, hSRP9, hSRPRα, hSRPβ 및 hCANX 중 하나 이상일 수 있다.
TEP 단백질은 또한 단백질 분비 경로의 다음의 아미노산 서열의 단백질: 서열번호 13을 갖는 hSRP14, 서열번호 15를 갖는 hSec61α1, 서열번호 17을 갖는 hSec61β, 서열번호 19를 갖는 hSec61γ, 서열번호 21을 갖는 hSRP54, 서열번호 23을 갖는 hSRP9, 서열번호 25를 갖는 hSRPRα, 서열번호 27을 갖는 hSRPβ 및 서열번호 29를 갖는 hCANX 중 하나 이상에 대응할 수 있고/있거나 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대응할 수 있다.
TEP 단백질은 다음의 단백질 가공 또는 대사 단백질: hUCP4, hCMPSAT, rST6Gal1, hCOMSC, hT-신타제, hP4HA1, hP4HB, hGILZ, hCyPB, hNRF2, hHK1, hPDI, hPIN1, hSEPW1, hCALR, hDDOST, hHSP40, hATP5A1, hSERCA2, hPDIA4, hHSC70 /HSPA8, hHYOU1, hCMP-SAS, hBeclin-1, hERdj3, CHO-AGE, hWip1, hRTP4, hREEP2, hDPM1 및 hDRiP78 중 하나 이상일 수 있다.
TEP 단백질은 또한 단백질 가공 또는 대사 다음의 아미노산 서열의 단백질의 단백질: 서열번호 31을 갖는 hUCP4, 서열번호 33을 갖는 hCMPSAT, 서열번호 35를 갖는 rST6Gal1, 서열번호 37을 갖는 hCOMSC, 서열번호 39을 갖는 hT-신타제, 서열번호 41을 갖는 hP4HA1, 서열번호 43을 갖는 hP4HB, 서열번호 45를 갖는 hGILZ, 서열번호 47을 갖는 hCyPB, 서열번호 49를 갖는 hNRF2, 서열번호 51을 갖는 hHK1, 서열번호 53을 갖는 hPDI, 서열번호 55를 갖는 hPIN1, 서열번호 57을 갖는 hSEPW1, 서열번호 59을 갖는 hCALR, 서열번호 62를 갖는 hDDOST, 서열번호 64를 갖는 hHSP40, 서열번호 66을 갖는 hATP5A1, 서열번호 68을 갖는 hSERCA2, 서열번호 70을 갖는 hPDIA4, 서열번호 72를 갖는 hHSC70/HSPA8, 서열번호 74를 갖는 hHYOU1, 서열번호 76을 갖는 hCMP-SAS, 서열번호 78을 갖는 hBeclin-1, 서열번호 80을 갖는 hERdj3, 서열번호 82를 갖는 CHO-AGE, 서열번호 84를 갖는 hWip1, 서열번호 86을 갖는 hRTP4, 서열번호 88을 갖는 hREEP2, 서열번호 90을 갖는 hDPM1 및 서열번호 92를 갖는 hDRiP78 중 하나 이상에 대응할 수 있고/있거나 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대응할 수 있다.
TEP 단백질은 서열번호 60과의 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 샤페론, 특히, BiP 단백질, 더 특별하게는, 변형된 초파리 BIP 단백질 유도체(DroBiP)일 수 있다.
MAR 구성요소는 서열번호 1(MAR 1-68), 2(MAR 1_6), 3(MAR X_S29), 4(MAR S4), 5(닭 라이소자임 MAR)로부터 선택될 수 있거나, 또는 바람직하게는 유전자 조작된, 특히 재배열된 상대이고/이거나 서열번호 1 내지 5 중 임의의 하나와 또는 서열번호 6 내지 10 중 임의의 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다.
상기 세포 내에서 TEP 기능성 RNA는 DNA 재조합 또는 수복 경로의 적어도 하나의 단백질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, 사이클린 D1, Ercc, MDC1, Bard1, 리가제 1, Mre11 및/또는 53BP1의 발현을 방해하는 기능성 RNA, 바람직하게는 miRNA 또는 shRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함할/이루어질 수 있다.
TEP 기능성 RNA는 또한 서열번호 93을 갖는 Rad51, 서열번호 94를 갖는 Rad51B, 서열번호 95를 갖는 Rad51C, 서열번호 96을 갖는 Rad51D, 서열번호 99를 갖는 Xrcc2, 서열번호 100을 갖는 Xrcc3, 서열번호 97을 갖는 Rad52, 서열번호 98을 갖는 Rad54, 서열번호 101을 갖는 Brca1, 서열번호 102를 갖는 Brca2, 서열번호 103을 갖는 사이클린 D1, 서열번호 104를 갖는 Ercc1, 서열번호 105를 갖는 MDC1, 서열번호 106을 갖는 Bard1, 서열번호 107을 갖는 리가제 1, 서열번호 108을 갖는 Mre11 및/또는 서열번호 109를 갖는 53BP1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 유전자의 발현을 방해할 수 있다.
재조합 핵산 분자는 적어도 5000, 6000, 7000, 8000, 90000 또는 10000bp 길이일 수 있다.
5' 및 3' ITR은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 또는 바람직하게는 피기백(PiggyBac) 트랜스포존의 5' 및 3' ITR일 수 있다.
재조합 핵산 분자 중 하나의 제1 형질감염 및 이식 유전자를 함유하는 재조합 핵산 분자의 포유류 세포 내로 제2의 후속적 형질감염 시, 이식유전자 통합 및/또는 발현은 상기 제1 형질감염을 받지 않은 세포에 비해 상기 세포에서 증가될 수 있다.
본 명세서에 언급된 TEP 암호 서열 또는 TEP 기능성 RNA는 발현 벡터를 포함하는 벡터의 부분일 수 있다. 벡터는 단일 MAR 구성요소, 2 이상의 MAR 구성요소를 포함할 수 있되, 상기 구성요소(들)는 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치될 수 있다.
예를 들어, 벡터는 2개의 MAR 구성요소를 포함할 수 있다. 제1 MAR 구성요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 상류에 위치될 수 있고, 제2 MAR 구성요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 하류에 위치될 수 있되, 제1 MAR 구성요소는 MAR 1_6 구성요소 및/또는 서열번호 2와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소, 특히 MAR 1-6에 기반한 재배열된 MAR, 더 구체적으로는 서열번호 8과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소(MAR 1_6R2)를 포함할 수 있고, 제2 MAR 구성요소는 MAR 1-68 구성요소 및/또는 서열번호 1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소를 포함할 수 있다.
벡터는 또한 단일 MAR 구성요소를 포함할 수 있다. 단일 MAR 구성요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 하류에 위치될 수 있되, 단일 MAR 구성요소는 MAR 1-68 또는 MAR X-29 구성요소 및/또는 서열번호 1 또는 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소, 특히, MAR 1-68 또는 MAR X-29에 기반한 재배열된 MAR, 특히 서열번호 6, 7 또는 10(MAR 1_68R, 1_68R2 또는 X_29R3) 또는 9와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소일 수 있고, 바람직하게는 MAR X-29 구성요소 및/또는 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소일 수 있다.
TEP 또는 TEP 기능성 RNA는 EF1 알파 프로모터의 제어하에 있을 수 있고, 선택적으로 이후에 BGH 폴리A 신호가 있다.
벡터는 프로모터(들) 및/또는 인핸서(들) 또는 이들의 융합물, 예컨대 GAPDH, SV40p, CMV, CHO EF1 알파, CHO Actb 및/또는 CHO Hspa5, 또는 이들의 유전자 조작된 융합물, 예컨대 CGAPDH를 포함할 수 있다.
벡터의 부분인 프로모터는 서열번호 111을 갖는 GAPDH, 서열번호 114를 갖는 SV40p, 서열번호 113을 갖는 CMVp, 서열번호 112를 갖는 CHO Ef1 알파, 서열번호 115를 갖는 CHO Actb, 서열번호 116을 갖는 CHO Hspa5 및/또는 이들의 융합물, 예컨대 서열번호 11을 갖는 CGAPDH일 수 있거나, 또는 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한:
이식유전자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 제공하는 단계를 포함하는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA를 발현시키기 위한 방법에 관한 것이고, 벡터는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA를 발현시키는 발현 벡터이되, 상기 벡터를 통해 발현된 TEP 또는 TEP 기능성 RNA는 상기 포유류 세포 내 이식 유전자의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%만큼 선택적으로 증가시킨다.
벡터는 단일 MAR X-29 구성요소 및/또는 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하되, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주 초과로 배양한 후에, 상기 벡터를 통해 발현되는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA는 관심 대상 유전자의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%만큼 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 단일 복제물로서 세포의 게놈 내로 통합된 20, 15, 10 또는 5개 이하의 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 포유류 세포에 관한 것이다.
상기 언급한 바와 같이, TEP 단백질은 단백질 분비 경로의 다음의 단백질: hSRP14, hSec61α1, hSec61β, hSec61γ, hSRP54, hSRP9, hSRPRα, hSRPβ 및 hCANX 중 하나 이상일 수 있다.
TEP 단백질은 또한 단백질 분비 경로의 다음의 아미노산 서열의 단백질: 서열번호 13을 갖는 hSRP14, 서열번호 15를 갖는 hSec61α1, 서열번호 17을 갖는 hSec61β, 서열번호 19를 갖는 hSec61γ, 서열번호 21을 갖는 hSRP54, 서열번호 23을 갖는 hSRP9, 서열번호 25를 갖는 hSRPRα, 서열번호 27을 갖는 hSRPβ, 및 서열번호 29를 갖는 hCANX 중 하나 이상에 대응할 수 있고/있거나 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대응할 수 있다.
TEP 단백질은 다음의 단백질 가공 또는 대사 단백질: hUCP4, hCMPSAT, rST6Gal1, hCOMSC, hT-신타제, hP4HA1, hP4HB, hGILZ, hCyPB, hNRF2, hHK1, hPDI, hPIN1, hSEPW1, hCALR, hDDOST, hHSP40, hATP5A1, hSERCA2, hPDIA4, hHSC70 /HSPA8, hHYOU1, hCMP-SAS, hBeclin-1, hERdj3, CHO-AGE, hWip1, hRTP4, hREEP2, hDPM1 및 hDRiP78 중 하나 이상일 수 있다.
TEP 단백질은 또한 단백질 가공 또는 대사 다음의 아미노산 서열의 단백질: 서열번호 31을 갖는 hUCP4, 서열번호 33을 갖는 hCMPSAT, 서열번호 35를 갖는 rST6Gal1, 서열번호 37을 갖는 hCOMSC, 서열번호 39을 갖는 hT-신타제, 서열번호 41을 갖는 hP4HA1, 서열번호 43을 갖는 hP4HB, 서열번호 45를 갖는 hGILZ, 서열번호 47을 갖는 hCyPB, 서열번호 49를 갖는 hNRF2, 서열번호 51을 갖는 hHK1, 서열번호 53을 갖는 hPDI, 서열번호 55를 갖는 hPIN1, 서열번호 57을 갖는 hSEPW1, 서열번호 59을 갖는 hCALR, 서열번호 62를 갖는 hDDOST, 서열번호 64를 갖는 hHSP40, 서열번호 66을 갖는 hATP5A1, 서열번호 68을 갖는 hSERCA2, 서열번호 70을 갖는 hPDIA4, 서열번호 72를 갖는 hHSC70/HSPA8, 서열번호 74를 갖는 hHYOU1, 서열번호 76을 갖는 hCMP-SAS, 서열번호 78을 갖는 hBeclin-1, 서열번호 80을 갖는 hERdj3, 서열번호 82를 갖는 CHO-AGE, 서열번호 84를 갖는 hWip1, 서열번호 86을 갖는 hRTP4, 서열번호 88을 갖는 hREEP2, 서열번호 90을 갖는 hDPM1 및 서열번호 92를 갖는 hDRiP78 중 하나 이상에 대응할 수 있고/있거나 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대응할 수 있다.
TEP 단백질은 서열번호: 60과 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 샤페론, 특히, BiP 단백질, 더 특히, 유전자 조작된 초파리 BIP 단백질 유도체(DroBiP)일 수 있다.
재조합 포유류 세포 내의 TEP 기능성 RNA는 적어도 하나의 재조합 단백질, 바람직하게는 HR 유전자, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, 사이클린 D1, Ercc1, MDC1, Bard1, 리가제 1, Mre11 및/또는 53BP1의 발현을 방해하는 기능성 RNA, 바람직하게는 miRNA 또는 shRNA를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함할/이루어질 수 있다. 핵산은 서열번호 93을 갖는 Rad51, 서열번호 94를 갖는 Rad51B, 서열번호 95를 갖는 Rad51C, 서열번호 96을 갖는 Rad51D, 서열번호 99를 갖는 Xrcc2, 서열번호 100을 갖는 Xrcc3, 서열번호 97을 갖는 Rad52, 서열번호 98을 갖는 Rad54, 서열번호 101을 갖는 Brca1, 서열번호 102를 갖는 Brca2, 서열번호 103을 갖는 사이클린 D1, 서열번호 104를 갖는 Ercc1, 서열번호 105를 갖는 MDC1, 서열번호 106을 갖는 Bard1, 서열번호 107을 갖는 리가제 1, 서열번호 108을 갖는 Mre11 및/또는 서열번호 109를 갖는 53BP1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
재조합 포유류 세포는 1차 줄기 세포, 햄스터, 예를 들어, CHO(중국 햄스터 난소), 세포 또는 인간, 예를 들어, HEK293 세포일 수 있다.
본 발명은 또한
a) 적어도 하나의 TEP 기능성 RNA 및/또는 TEP 단백질을 암호화하거나 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 재조합 핵산 서열,
및
b) 재조합 핵산 분자를 포함하는, 재조합 포유류 세포에 관한 것이되,
상기 재조합 핵산 분자는
(i) 적어도 하나의 관심 대상 이식유전자, 및
(ii) 선택적으로, MAR 구성요소를 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, TEP 단백질은 단백질 분비 경로의 다음의 단백질: hSRP14, hSec61α1, hSec61β, hSec61γ, hSRP54, hSRP9, hSRPRα, hSRPβ 및 hCANX 중 하나 이상일 수 있다.
TEP 단백질은 또한 단백질 분비 경로의 다음의 아미노산 서열의 단백질: 서열번호 13을 갖는 hSRP14, 서열번호 15를 갖는 hSec61α1, 서열번호 17을 갖는 hSec61β, 서열번호 19를 갖는 hSec61γ, 서열번호 21을 갖는 hSRP54, 서열번호 23을 갖는 hSRP9, 서열번호 25를 갖는 hSRPRα, 서열번호 27을 갖는 hSRPβ 및 서열번호 29를 갖는 hCANX 중 하나 이상에 대응할 수 있고/있거나 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대응할 수 있다.
TEP 단백질은 다음의 단백질 가공 또는 대사 단백질: hUCP4, hCMPSAT, rST6Gal1, hCOMSC, hT-신타제, hP4HA1, hP4HB, hGILZ, hCyPB, hNRF2, hHK1, hPDI, hPIN1, hSEPW1, hCALR, hDDOST, hHSP40, hATP5A1, hSERCA2, hPDIA4, hHSC70 /HSPA8, hHYOU1, hCMP-SAS, hBeclin-1, hERdj3, CHO-AGE, hWip1, hRTP4, hREEP2, hDPM1 및 hDRiP78 중 하나 이상일 수 있다.
TEP 단백질은 또한 단백질 가공 또는 대사 다음의 아미노산 서열의 단백질: 서열번호 31을 갖는 hUCP4, 서열번호 33을 갖는 hCMPSAT, 서열번호 35를 갖는 rST6Gal1, 서열번호 37을 갖는 hCOMSC, 서열번호 39을 갖는 hT-신타제, 서열번호 41을 갖는 hP4HA1, 서열번호 43을 갖는 hP4HB, 서열번호 45를 갖는 hGILZ, 서열번호 47을 갖는 hCyPB, 서열번호 49를 갖는 hNRF2, 서열번호 51을 갖는 hHK1, 서열번호 53을 갖는 hPDI, 서열번호 55를 갖는 hPIN1, 서열번호 57을 갖는 hSEPW1, 서열번호 59을 갖는 hCALR, 서열번호 62를 갖는 hDDOST, 서열번호 64를 갖는 hHSP40, 서열번호 66을 갖는 hATP5A1, 서열번호 68을 갖는 hSERCA2, 서열번호 70을 갖는 hPDIA4, 서열번호 72를 갖는 hHSC70/HSPA8, 서열번호 74를 갖는 hHYOU1, 서열번호 76을 갖는 hCMP-SAS, 서열번호 78을 갖는 hBeclin-1, 서열번호 80을 갖는 hERdj3, 서열번호 82를 갖는 CHO-AGE, 서열번호 84를 갖는 hWip1, 서열번호 86을 갖는 hRTP4, 서열번호 88을 갖는 hREEP2, 서열번호 90을 갖는 hDPM1 및 서열번호 92를 갖는 hDRiP78 중 하나 이상에 대응할 수 있고/있거나 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대응할 수 있다.
TEP 단백질은 서열번호 60과 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 샤페론, 특히, BiP 단백질, 더 특별하게는, 합성 초파리 BIP 단백질 유도체(DroBiP)일 수 있다.
기능성 RNA는 일시적으로 형질감염된 siRNA 또는 상기 적어도 하나의 단리된 핵산 서열로부터 전사된 shRNA일 수 있되, siRNA 또는 가공된 shRNA는 NHEJ(비상동성 말단-결합), HR(상동성 재조합), MMEJ(마이크로 상동체(Microhomolgoy) 매개 말단 결합) 재조합 경로의 부분이거나 또는 MDC1(DNA-손상 검사점 1의 매개자)과 같은 DNA 수선 단백질인 적어도 하나의 표적 유전자의 mRNA의 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 연속적 뉴클레오타이드에 대해 완전히 상보성인 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 염기쌍 길이의 안티센스 RNA이다.
하기의 부분일 수 있는 적어도 하나의 표적 유전자는:
- DNA 수선 및 NHEJ는
53BP1(종양 억제유전자 p53-결합 단백질 1)이고,
- HR은
Rad51(DNA 수선 단백질 RAD51), Rad51B(DNA 수선 단백질 RAD51 상동체 2), Rad51C(DNA 수선 단백질 RAD51 상동체 3),
Rad51D(DNA 수선 단백질 RAD51 상동체 4), Rad52(DNA 수선 단백질 RAD52), Rad54(DNA 수선 및 재조합 단백질 RAD54),
Xrcc2(중국 햄스터 세포 2에서 X-선 수선 보완 결함 수선),
Xrcc3(중국 햄스터 세포 3에서 X-선 수선 보완 결함 수선),
Brca1(유방암 1, 조기 개시),
Brca2(유방암 2, 조기 개시),
Bard1(BRCA1 관련 RING 도메인 1)이며,
- MMEJ는
Ercc1(절제 수선 교차-보완(excision repair cross-complementing) 설치류 수선 결함, 상보군 1),
Mre11(감수분열 재조합 11),
리가제1(DNA 리가제 1),이고/이거나
DNA 수선 단백질 MDC1이다.
표적 유전자는 서열번호 93을 갖는 Rad51, 서열번호 94를 갖는 Rad51B, 서열번호 95를 갖는 Rad51C, 서열번호 96을 갖는 Rad51D, 서열번호 99를 갖는 Xrcc2, 서열번호 100을 갖는 Xrcc3, 서열번호 97을 갖는 Rad52, 서열번호 98을 갖는 Rad54, 서열번호 101을 갖는 Brca1, 서열번호 102를 갖는 Brca2, 서열번호 103을 갖는 사이클린 D1, 서열번호 104를 갖는 Ercc1, 서열번호 105를 갖는 MDC1, 서열번호 106을 갖는 Bard1, 서열번호 107을 갖는 리가제 1, 서열번호 108을 갖는 Mre11 및/또는 서열번호 109를 갖는 53BP1와 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산일 수 있다.
적어도 하나의 이식유전자는 치료적 단백질, 예컨대 면역글로불린, 호르몬, 예컨대 에리스로포이에틴 또는 성장인자를 발현시킬 수 있되, 선택적으로 재조합 포유류 세포에서 이식유전자 통합 및/또는 발현은 상기 재조합 핵산 분자(들)를 포함하지 않는 세포에 비해 증가된다.
재조합 포유류 세포는 적어도 2개의 TEP 기능성 RNA를 포함할 수 있되, TEP RNA 중 하나 또는 둘 다는 일시적으로 형질감염된 siRNA이거나, 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 상기 단리된 핵산 서열(들)에 의해 발현된다.
재조합 포유류 세포는 MAR 구성요소를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하기:
선택적으로 제1 형질감염에서, 상기 포유류 세포를
(i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 상기 재조합 핵산 분자 중 적어도 하나 및/또는
(ii) 선택적으로 5' 및 3' ITR을 인식하는 트랜스포사제(transposase)를 발현시키는 단리된 핵산 또는 mRNA와 함께 선택적으로, 제2, 후속 형질감염에서 선택적으로 형질감염되는 재조합 핵산 분자의 부분인 적어도 하나의 단리된 TEP 기능성 RNA 및 적어도 하나의 이식유전자
로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 포유류 세포, 특히 햄스터 세포를 형질감염시키는 방법에 관한 것이다.
재조합 포유류 세포는 다음의 hSRP14, hSec61α1, hSec61β, hSec61γ, hSRP54, hSRP9, hSRPRα, hSRPβ 및 hCANX 중 1, 2 또는 3개를 암호화하는 상기 재조합 핵산 분자 중 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4개를 포함하는 하나 이상으로 형질감염될 수 있다.
I은 또한 서열번호 13을 갖는 hSRP14, 서열번호 15를 갖는 hSec61α1, 서열번호 17을 갖는 hSec61β, 서열번호 19를 갖는 hSec61γ, 서열번호 21을 갖는 hSRP54, 서열번호 23을 갖는 hSRP9, 서열번호 25를 갖는 hSRPRα, 서열번호 27을 갖는 hSRPβ, 및 서열번호 29를 갖는 hCANX로 및/또는 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 형질감염될 수 있다.
임의의 재조합 핵산 분자는 벡터의 부분일 수 있되, 벡터는 공동 형질감염될 수 있다.
몇몇 TEP 단백질을 암호화하는 벡터의 공동-형질감염, 바람직하게는 단백질 SRP14, SRP9 및 SRP54를 암호화하는 재조합 핵산 분자의 공동-형질감염은 이러한 공동-형질감염을 받지 않은 세포에 비해 상기 세포에서 이식유전자 통합 및/또는 발현을 증가시킬 수 있다. 핵산 서열을 포함하는 벡터의 공동-형질감염은 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%의 서열번호 12, 서열번호 22, 서열번호 20을 가지고, 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
재조합 포유류 세포를 얻기 위해 상기 TEP 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 안정하게 발현시키는 다수의 상기 포유류 세포가 얻어질 수 있되, 상기 재조합 포유류 세포의 수는 상기 MAR 구성요소의 존재로부터 독립적일 수 있다. 포유류 세포는 두번째 및 선택적으로 세번째로 형질감염될 수 있다.
바람직하게는, 상기 포유류 세포의 적어도 30%, 40% 또는 45%는 재조합 포유류 세포일 수 있고, 상기 이식유전자를 발현시킬 수 있다.
포유류 세포는 선택적으로 5' 및 3' ITR을 인식하는 트랜스포사제를 발현시키는 단리된 핵산 또는 mRNA와 함께, 상기 적어도 하나의 단리된 TEP 기능성 RNA 및 상기 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 벡터 및 선택적으로 상기 적어도 하나의 이식유전자에 측접하는 3' ITR 및 5' ITR로 형질감염될 수 있다.
이식유전자는 치료적 단백질, 예컨대 면역글로불린, 호르몬, 사이토카인 또는 성장인자일 수 있다.
재조합 핵산 분자는 선택적으로 선택 마커를 포함할 수 있되, 적어도 하나의 이식유전자는,
(a) 상기 마커에 대한 선택 없이, 또는
(b) 상기 마커, 예를 들어 배양 배지에 함유된 선택제를 통해, 상기 마커에 대한 선택과 함께, 그리고
(c) 트랜스포사제 없이, 또는
(d) 트랜스포사제의 존재 하에, 발현된다.
TEP 기능성 RNA는 shRNA 또는 miRNA를 암호화하는 재조합 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 적어도 하나의 HR 유전자, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, 사이클린 D1, Ercc1, MDC1, Bard1, 리가제 1, Mre11 및/또는 53BP1의 발현을 방해하는 siRNA를 포함할/이루어질 수 있다.
TEP 기능성 RNA는 또한 서열번호 93을 갖는 Rad51, 서열번호 94를 갖는 Rad51B, 서열번호 95를 갖는 Rad51C, 서열번호 96을 갖는 Rad51D, 서열번호 99를 갖는 Xrcc2, 서열번호 100을 갖는 Xrcc3, 서열번호 97을 갖는 Rad52, 서열번호 98을 갖는 Rad54, 서열번호 101을 갖는 Brca1, 서열번호 102를 갖는 Brca2, 서열번호 103을 갖는 사이클린 D1, 서열번호 104를 갖는 Ercc1, 서열번호 105를 갖는 MDC1, 서열번호 106을 갖는 Bard1, 서열번호 107을 갖는 리가제 1, 서열번호 108을 갖는 Mre11 및/또는 서열번호 109를 갖는 53BP1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 유전자의 발현을 방해할 수 있다.
이식유전자 통합 및/또는 발현은 상기 단리된 핵산 분자 및/또는 상기 단리된 TEP 기능성 RNA 중 상기 적어도 하나로 형질감염되지 않은 세포에 비해 이러한 세포에서 증가될 수 있다.
본 발명은 또한 하나의 용기에서 제1항 내지 제13항에 따른 재조합 핵산 분자 중 임의의 하나를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하고, 제2 선택적 용기에서 양립 가능한 트랜스포사제를 암호화하는 벡터를 포함하며, 추가 용기에서 벡터 또는 벡터들을 사용하는 방법의 설명서를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
키트는 상기 언급되었고, 하나 초과의 벡터가 하나 이상의 용기에서 제공되며, TEP 단백질은 다음의: 샤페론, SRP14, SRP9, SRP54, SR 또는 트랜스로콘(translocon) 중 적어도 둘이다.
키트는 상기 언급되었고, 상기 벡터(들) 내의 TEP 기능성 RNA(들)는 적어도 하나의 HR 유전자, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2 사이클린 D1, Ercc1, MDC1, Bard1, 리가제 1, Mre11 및/또는 53BP1의 발현을 방해하는 miRNA, siRNA 또는 shRNA를 암호화하는 핵산 서열, 및 바람직하게는 추가 용기에서 적어도 하나의 다른 HR 유전자, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, 사이클린 D1, Ercc1, MDC1, Bard1, 리가제 1, Mre11 및/또는 53BP1의 발현을 방해하는 siRNA(들)를 포함한다/이루어진다.
HR 유전자는 서열번호 93을 갖는 Rad51, 서열번호 94를 갖는 Rad51B, 서열번호 95를 갖는 Rad51C, 서열번호 96을 갖는 Rad51D, 서열번호 99를 갖는 Xrcc2, 서열번호 100을 갖는 Xrcc3, 서열번호 97을 갖는 Rad52, 서열번호 98을 갖는 Rad54, 서열번호 101을 갖는 Brca1, 서열번호 102를 갖는 Brca2, 서열번호 103을 갖는 사이클린 D1, 서열번호 104를 갖는 Ercc1, 서열번호 105를 갖는 MDC1, 서열번호 106을 갖는 Bard1, 서열번호 107을 갖는 리가제 1, 서열번호 108을 갖는 Mre 11 및/또는 서열번호 109를 갖는 53BP1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산에 대응할 수 있다.
본 발명은 또한 바람직하게는 이식유전자 통합 및/또는 발현을 증가시키기 위한 본 명세서에 개시된 재조합 핵산 및/또는 본 명세서에 개시된 재조합 포유류 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다:
(a) 프로모터에 의해 상류에 그리고 폴리아데닐화 신호에 의해 하류에 측접된 이식유전자,
(b) 폴리아데닐화 신호의 하류의 단일 MAR 구성요소, 또는
(c) 관심 대상 이식유전자의 상류의 제1 MAR 구성요소 및 상기 이식유전자 통합 부위의 하류의 제2 MAR 구성요소.
단일 또는 제1 및 제2 MAR 구성요소는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 또는 10과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 MAR 구성요소 1_68, 1_6, 1_6R2, 1_68R, 1_68R2, X_29R3 또는 X_29 또는 구성요소로부터 선택될 수 있다.
단일 또는 제1 및 제2 MAR(들)은 재배열된 MAR 구성요소 1_6R2, 1_68R, 1_68R2 또는 X_29R3 또는 서열번호 6, 7, 8 또는 10과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소로부터 선택될 수 있되, 선택적으로, MAR 구성요소(들)는 그들의 비-재배열된 상대에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%만큼 관심 대상 이식유전자의 발현을 증가시킨다.
프로모터는 EF1 알파 프로모터일 수 있고, 폴리아데닐화 신호는 BGH 폴리A 신호이다.
벡터는 프로모터(들) 및/또는 인핸서(들) 또는 이들의 융합물, 예컨대 GAPDH, CGAPD, CSV40p, CMVp, CHO Ef1알파, CHO Actb 또는 CHO Hspa5를 포함할 수 있다.
프로모터는 서열번호 111을 갖는 GAPDH, 서열번호 11을 갖는 CGAPDH, 서열번호 114를 갖는 SV40p, 서열번호 113을 갖는 CMVp, 서열번호 112를 갖는 CHO EF1 알파, 서열번호 115를 갖는 CHO Actb 및/또는 서열번호 116을 갖는 CHO Hspa5 및 구체화된 서열과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
프로모터는 GAPDH 프로모터일 수 있고, CMV 인핸서를 포함한다.
제1 및/또는 제2 MAR, 인핸서, 프로모터, 관심 대상 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호는 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치될 수 있다.
특정 실시형태에서, 발현 벡터는 하기를 포함할 수 있다:
(a) 폴리아데닐화 신호 하류의 단일 MAR 구성요소로서, 상기 단일 MAR 구성요소는 바람직하게는 MAR 1-68 또는 MARX-29 구성요소 및/또는 서열번호 1 또는 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소, 특히 MAR 1-68 또는 MAR X-29에 기반한 재배열된 MAR, 특히, 서열번호 6, 7 또는 10(MAR 1_68R, 1_68R2 또는 X_29R3) 또는 서열번호 9와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고, 바람직하게는 MAR X-29 구성요소이고/이거나 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소인, 폴리아데닐화 신호 하류의 단일 MAR 구성요소, 또는
(b) 관심 대상 이식유전자의 상류의 제1 MAR 구성요소 및 상기 관심 대상 이식유전자의 하류의 제2 MAR 구성요소로서, 바람직하게는 1_6 구성요소를 포함하고/하거나 서열번호 2와, 특히 MAR 1-6에 기반한 재배열된 MAR과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 MAR 구성요소, 특히 서열번호 8과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소(MAR 1_6R2) 및 바람직하게는 MAR 1-68 구성요소를 포함하고/하거나 서열번호 1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 MAR 구성요소.
발현 벡터는 단일 MAR 구성요소를 포함할 수 있고, 단일 MAR 구성요소는 폴리아데닐화 부위의 하류에 위치될 수 있으며 MAR 1-68 또는 MAR X-29이고/이거나 서열번호 1 또는 3과, 특히 MAR 1-68 또는 MAR X-29에 기반한 재배열된 MAR과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있고, 특히 서열번호 6, 7 또는 10(MAR 1_68R, 1_68R2 또는 X_29R3) 또는 9와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 지니는 구성요소이고, 바람직하게는 MAR X-29-유래 구성요소일 수 있고/있거나 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다.
제1 MAR 구성요소는 관심 대상의 이식유전자의 상류에 있을 수 있고, 제2 MAR 구성요소는 상기 관심 대상 이식유전자의 하류에 있을 수 있되, 제1 MAR 구성요소는 MAR 1_6 구성요소를 포함할 수 있고/있거나 서열번호 2와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있고, 제2 MAR 구성요소는 MAR 1_68 구성요소를 포함할 수 있고/있거나 서열번호 1과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 상기 이식유전자를 포함하는 상기 언급된 벡터 중 하나를 포함하는 재조합 포유류 세포를 제공하는 단계 및 이식유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 이식유전자를 발현시키기 위한 방법에 관한 것이되, 상기 MAR 구성요소(들)는 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%만큼 이식유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 벡터는 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있는 단일 MAR X_29 구성요소 및/또는 핵산을 포함할 수 있되, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주 초과의 배양 후에, MAR 구성요소는 관심 대상 이식유전자의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%만큼 증가시킬 수 있다.
도 1. 트랜스포존 벡터 구성을 도시한 도면
PB(피기백) 트랜스포존에 MAR 구성요소를 첨가할지 여부를 시험하는 것은 전위 효율 및 이식유전자 발현에 영향을 미칠 수 있고, 작제물 내 MAR의 위치가 이들 효과에 임의의 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, GFP 및 퓨로마이신 내성(퓨로(퓨로)) 유전자를 함유하는 일련의 트랜스포존 공여체 작제물을 설계하였는데, 이때 MAR 1_68 또는 제어 중성 스페이서 DNA 서열을 플라스미드 내 상이한 위치에 삽입하였다. MAR 또는 스페이서 서열 첨가의 효과에 비해 증가된 트랜스포존 크기의 영향을 구별하기 위해 삽입물이 없는 모 퓨로-GFP 트랜스포존 플라스미드를 전위의 대조군으로서 사용하였다.
도 2 트랜스포존 벡터: 전위 효율을 도시한 도면
다양한 트랜스포존 작제물의 전위 효율을 (A) 형질감염시키고 항생물질 선택이 없이 배양하고서 3주 후에 GFP-발현 세포의 백분율을 평가하고 (B) 퓨로마이신-내성을 계수화함으로써 측정하였다.
도 3 트랜스포존 벡터: 발현 수준을 도시한 도면
발현 수준의 분석은 GFP-양성 세포 단독의 형광을 고려하여 (A) 형질감염 후 퓨로마이신 내성에 대한 분비가 없는 배양 또는 (B) 형질감염 후 퓨로마이신 내성에 대한 분비가 있는 배양의 3주 후 CHO 세포의 GFP 형광 수준을 프로빙함으로써 트랜스포사제 발현 플라스미드가 있거나(+PB) 또는 없이(-PB) 형질감염된 상이한 트랜스포존 벡터에 의해 허용한다.
도 4 이식유전자 게놈 통합에 대한 MAR 및 트랜스포사제의 효과를 도시한 도면
qPCR을 이용하여 통합된 GFP 이식유전자 복제물의 수를 결정하고, 도 1 내지 도 3에 대한 범례에 기재한 바와 같이 생성된 비선택 CHO 세포(A), 또는 퓨로마이신-내성 세포 (B)로부터 단리한 게놈 DNA를 이용하여, 세포 B2M 유전자에 대해 값을 정규화시켰다. 값은 평균 ± SEM(n=3)을 나타낸다. *P<0,05.
도 5 이식유전자 당 이식유전자 발현을 도시한 도면
(A) 퓨로마이신 선택이 없는 게놈 및 (B) 퓨로마이신 선택이 있는 게놈 내에 통합을 위한 벡터의 성향과 독립적인, 벡터의 고유한 발현 가능성의 평가.
도 6 재조합 단백질(이식유전자) 발현에 대한 전위성 및 플라스미드 벡터로부터의 분비 단백질의 발현 효과를 도시한 도면. 전위성 또는 규칙적 플라스미드 벡터를 분비 단백질 SRP9, SRP14, SRP54, SRP 수용체 알파 및 베타 서브유닛(SR), 또는 트랜스로콘(Translocon)을 발현시키도록 구성하였다. 전위성 벡터를 피기백 트랜스포사제 벡터(우측 패널)로 형질감염시킨 반면, 본 명세서에 기재한 바와 같은 인플릭시맙(인플릭시맙) 항체를 발현시키는 세포 클론에서, 비-전위성 플라스미드 벡터를 단독으로 형질감염시켰다(좌측 패널). 선택이 있는(좌측 패널) 또는 선택이 없는(우측 패널) 배양의 3주 후에, 분비된 인플릭시맙 항체의 수준을 세포 배양 상청액으로부터 분석하였다. 알 수 있는 바와 같이, 구체적 생산성, 즉, 이식유전자 발현 가공(TEP) 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 서열을 함유하는 세포의 상대적 발현은 TEP가 없는 모 세포에 비해 트랜스포존 벡터를 이용할 때 각각 0.25 내지 1.5로부터 1 내지 2.5까지 증가되었다.
도 7: 전기천공된 CHO -M 세포 현탁액으로부터의 재조합 단백질 발현을 도시한 도면
(A) 피기백(piggyBac) 트랜스포사제의 존재(+PB) 또는 부재(-PB)에서 X-29-보유 GFP-발현 트랜스포존 벡터와 함께 1회 또는 2회 전기천공된 CHO-M 세포. 선택이 없을 때 수행한 배양의 3주 후에 안정한 GFP-발현 세포의 백분율을 나타낸다.
(B) GFP-양성 세포의 GFP 형광의 평균.
(C) 베바시주맙(Beva), 아달리무맙(Adal) 및 리툭시맙(Ritu) 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA를 GFP 대신 MAR X29-함유 트랜스포존 플라스미드에 도입하였다. 경쇄 및 중쇄 트랜스포존 작제물을 CHO-M 세포에서 피기백 트랜스포사제 발현 벡터와 12일 간격으로 3회 전기천공하였다. 선택이 없이 성장시킨 다클론성 세포 풀의 배양 상청액에서 분비된 면역글로불린의 수준을 나타낸다(열린 막대). 대안적으로, 비선택 다클론성 세포 집단을 자기 마이크로-비드를 이용하여 그들의 표면에서 면역글로불린을 제시하는 세포를 패닝(panning)함으로써 분류하였다: 비분류 집단에 대해 분비된 면역글로불린의 수준을 나타낸다(닫힌 막대).
(D) 면역글로불린-발현 콜로니를 콜로니-피킹(picking) 장치를 이용하여 형질감염 세포 집단으로부터 분류하였고, 각각 3개의 면역글로불린을 발현시키는 2개 클론을 스핀-관 생물반응기 내에서 유가배양으로 성장시켰다. 분비된 면역글로불린의 수준을 나타내고, 패널 (C)에 대해 결정하였다.
도 8 SRP14의 비상동 발현은 트라스투주맙 분비를 개선시키고 , 인플릭시맙 분비를 회복시킨다는 것을 도시한 도면
트라스투주맙(A) 또는 인플릭시맙(B) 면역글로불린을 발현시키는 CHO-K1 HP 및 LP 클론을 가장 높게 얻어진 수준에서 SRP14 발현 벡터 및 단클론성 집단으로 안정하게 재형질감염시키고, 단리시켰다. 유래된 서브클론, 표지된 A 내지 E를 배취 배양 조건에서 세포 성장 및 생성에 대해 평가하였다. 세포 밀도(세포/㎖) 및 IgG 역가(㎍/㎖)를 배양의 7일 내내 각각의 샘플링 일자에 대해 플롯팅하였다. (C) 모 HP 및 LP 클론(-)에 비해 SRP14 발현 벡터(레인 S)로 형질감염 후 트라스투주맙(HP) 및 인플릭시맙(LP) 서브클론의 구체적 생산성 분포. (D) SRP14 mRNA의 상대적 수준을 5개 개개 SRP14-LP A 내지 E 서브클론 및 모 대조군 LP 클론에 대해 결정하고 나서, 그들을 4회 배양 실행으로부터의 특이적 IgG 생산성에 대해 플롯팅하였다. mRNA 및 구체적 생산성 평균 및 표준 편차값을 LP 대조군 클론 이상의 배수적 증가로서 표현한다.
도 9는 SRP14의 비상동 발현이 생성 방법에서 발현이 어려운 면역글로불린의 고수율을 매개한다는 것을 도시한 도면
도 8에서 분석한 바와 같이 SRP14 벡터-형질감염된 트라스투주맙 HP 서브클론 B(A) 및 인플릭시맙 LP 서브클론 E(B)를 유가배양에서 25㎖의 작업 용적으로 125㎖ 통기 진탕 플라스크 용기에서 배양시키고 나서, 살아있는 세포 밀도 및 IgG 역가를 11일 시간 과정 동안 결정하였다.
도 10은 SRP14 발현이 CHO 세포 클론에 의한 경쇄 응집을 없앤다는 것을 도시한 도면
(A) LP-유래 SRP14-LP 서브클론 E 및 HP-유래 SRP14-HP 서브클론 B(레인 S)에 대해, 또는 대조군 GFP 단백질을 발현시키는 CHO 서브클론(레인 G)에 대해 원심분리에 의해 수집한 Tx100-침투 세포의 상청액 및 펠렛을 Tx-100 가용성 및 Tx-100 불용성 표지 패널 각각에 의해 도시한 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 화살촉은 오가공된(misprocessed) 유리 LC 및 응집된(응집) LC를 나타낸다. (B) SRP14-LP 클론 E 및 LP-대조군 클론 E에 의해 생성된 다양한 LC, HC 및 IgG 조립체 중간체의 추적 분석을 수행하였고, 결과를 나타낸다.
도 11 면역글로불린 분비에 대한 SRP , SR 및 트랜스로콘 서브유닛의 조합된 발현의 효과를 도시한 도면
(A) 인플릭시맙 LP 클론 E을 SRP, SR 및 트랜스로콘 전위성 발현 벡터의 다양한 조합으로 재형질감염시켰다. 이어서, 얻어진 세포 풀의 구체적 생산성을 배취(batch) 배양에서 평가하였고, LP-대조군 세포 pcd 값의 a%로서 나타낸다. 박스-플롯은 독립적 배양 실행의 제3일에 결정한 정규화된 구체적 생산성의 중간, 상한 사분위수 및 하한 사분위수를 나타낸다. (B) SRP14-발현 인플릭시맙 생성 세포 서브클론 E를 다양한 SR 및 트랜스로콘 전위성 발현 벡터 조합으로 재형질감염시켰다. 세포 풀의 구체적 생산성을 패널 A에 대해 나타낸다.
도 12 SRP14 -발현 클론으로부터 인플릭시맙 분비의 구조(rescue)를 위한 모델을 도시한 도면
SRP/트랜스로콘 서브유닛 과발현 전(A) 및 후 (B)에 낮은 생산자 클론에 의한 IgG 폴딩 및 분비의 모델. 데이터는 낮은 생성자 클론에 의해 생성된 신합성된 LC가 부적절한 가공 및 폴딩 상태를 나타낸다는 것을 나타낸다. 인플릭시맙 LC의 신호 펩타이드 오가공은 ER 공번역 전위 기작의 포화를 야기할 수 있다(패널 A, 1번). IgG 조립체-부적격 응집 LC 형태 내의 ER에서 그것의 응집(패널 A, 2번)은 ER 스트레스를 유도하고, 자가소화포(autophagosome)-유사 구조의 형성(패널 A, 3번)을 촉발한다. SRP14 및 다른 SRP/트랜스로콘 구성성분 단백질의 과발현은 인플릭시맙 IgG의 가공 및 분비를 완전히 구하였다(패널 B). SRP14 신장은 활성을 막고 그의 mRNA의 번역 동안 LC ER 전위를 가능하게 지연시킨다(패널 B, 1번). 이는 결국 LC의 정확한 가공 및 ER 폴딩 샤페론과의 그의 적절한 상호작용을 돕는다(패널 B, 2번). 따라서 IgG 조립체-적격에서 신합성된 LC의 유지는 완전히-조립된 항체의 고수율 분비를 회복한다(패널 B, 3번).
도 13 발현에 대한 HR 및 NHEJ의 si -RNA 넉다운의 효과를 도시한 도면
비처리 세포(모의), 음성 siRNA(siNeg)로 처리한 세포, 음성 siRNA(siNeg)로 처리한 세포, NHEJ 인자(siKu70+80+DNA-PKcs)에 대한 siRNA 및 항-HR siRNA (siRad51)에서 재조합 사건의 빈도를 나타내는 GFP-양성 세포(본 명세서에서 1.0으로서 나타낸 GFP 대조군 플라스미드로 형질감염된 세포에 대해)의 백분율에서 배수 차이. GFP 레인은 GFP 발현 세포의 양성 대조군을 나타낸다. HR 비분해 및 NHEJ 비분해 - 표지한 레인은 음성 대조군 세포, 즉, 원형 HR 및 NHEJ 리포트 플라스미드로 형질감염된 세포를 나타낸다. HR I-Scel 및 NHEJ I-Scel-표지 레인은 각각 상동성 재조합 또는 비-상동성 말단 결합에 의한 DNA 절단 수선 시 GFP 발현을 회복하는 Scel-절단 수송체 플라스미드로 형질감염된 세포를 나타낸다. 도면은 GFP-양성 세포의 백분율로서 나타낸 바와 같이 dsRed-양성 세포의 백분율에 대해 정규화되고 GFP 대조군 세포의 백분율 이상의 배수 변화로서 표현되며, 1로 설정된 HR 또는 NHEJ를 저해하기 위한 siRNA의 효능을 나타낸다. 3회 실험의 평균, 오차막대(error bar)는 평균의 표준오차를 나타낸다. 비대응 스튜던트 t-검정(unpaired Student's t-test)에 의해 통계학적 유의도를 결정하였다; 유의 수준 p<0.05 (*) 및 p<0.01 (**).
도 14 NHEJ의 siRNA 넉다운에서 MAR의 효과를 도시한 도면
NHEJ 인자에 대해 siRNA로 처리하고 GFP 또는 MAR-GFP 플라스미드로 재형질감염시킨 GFP 발현 및 통합 CHO 세포에서의 배수적 증가를 나타낸다. 평균 GFP 형광, 복제수 및 GFP 복제물 당 형광을 GFP 플라스미드로 형질감염시킨 비처리 세포('모의'로서 표시함)로부터 얻은 결과에 걸쳐 배수적 증가로서 나타낸다. A) 유세포 분석 결과, B) qPCR에 의한 게놈에서 GFP 복제수의 분석, C) 각각의 통합된 GFP 유전자의 평균 형광(발현과 복제수 간의 비로서 각각의 실험에 대해 계산). 3회 이상의 실험의 평균; 비대응 스튜던트 t-검정에 의해 결정한 통계학적 유의도. 별표는 siRNA-처리된 샘플과 대응하는 비처리 대조군 간의 유의한 차이를 나타낸다; 유의 수준: p<0.05 (*), p<0.01 (**); 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 15 HR의 siRNA 넉다운에서 MAR의 효과를 도시한 도면
HR 인자에 대해 siRNA로 처리하고 GFP 또는 MAR-GFP 플라스미드로 재형질감염시킨 GFP 발현 및 통합 CHO 세포에서 배수적 증가. 평균 GFP 형광, 복제수 및 GFP 복제물 당 형광을 GFP 플라스미드로 형질감염시킨 비처리 세포('모의'로서 표시)로부터 얻은 결과에 대해 배수적 증가로서 나타낸다. A) 유세포분석 결과, B) qPCR에 의해 게놈 내 GFP 복제수의 분석, C) 각각의 통합된 GFP 유전자의 평균 형광(발현과 복제수 간의 비로서 각각의 실험에 대해 계산함). 3회 이상의 실험의 평균; 통계학적 유의도를 비대응 스튜던트 t-검정에 의해 결정하였다. 별표는 siRNA-처리 샘플과 대응하는 비처리 대조군 간의 유의한 차이를 나타낸다; 유의 수준: p<0.05 (*), p<0.01 (**); 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 16은 MMEJ의 siRNA 넉다운의 MAR의 효과를 도시한 도면
MMEJ 인자(및 일부 HR 인자)에 대해 siRNA로 처리하고 GFP(A) 또는 MAR-GFP 플라스미드(B)로 재형질감염시킨 GFP 발현 및 통합 CHO 세포를 나타낸다. GFP 복제물 당 평균 GFP 형광, 복제수 및 형광을 GFP 플라스미드로 형질감염시킨 비처리 세포('모의'로서 표시)로부터 얻은 결과에 대해 배수적 증가로서 나타낸다. 도면은 유세포분석기 결과를 나타낸다. 하부에 표시한 실험 수의 평균을 나타낸다. siMDC로 형질감염시키지 않은 세포보다 11.8배 더 높은 비율로 세포를 siMDC1로 형질감염시키고 나서, 심지어 MAR 없이 GFP를 발현시켰다. 또한 MAR, 즉, siBard1 및 siLigl을 함유하는 특정 플라스미드로 특히 양호한 결과를 달성할 수 있었다.
도 17 HR 단백질의 si -RNA-매개 넉다운의 효과를 도시한 도면
도면은 더 높은 GFP 및 면역글로불린 발현이 Rad51-관련 shRNA를 안정하게 발현시키는 CHO-M 세포로부터 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. CHO-M 세포를 피기백-유래 전위성 Rad51 shRNA 발현 벡터로 형질감염시켰고, 다클론성 세포뿐만 아니라 이의 유래된 세포 클론을 모 CHO-M 세포와 함께 GFP 발현 플라스미드로 재형질감염시켰다. Rad51-shRNA 발현 세포 풀의 그리고 유래된 클론의 모 CHO-M의 GFP 형광을 GFP 및 퓨로마이신 내성 유전자의 안정한 발현을 위한 선택 후 10일에 평가하였다. 가장 형광인 클론 중 둘의 형광 프로파일은 패널 A에서 수평 막대 표지한 1, 2 및 3에 의해 도시한 바와 같이 세포 풀 및 모 세포의 프로파일(A)뿐만 아니라 퓨로마이신 내성의 선택 후 10일에 M1, M2 및 M3 섹터에서 세포의 백분율(B) 다음에 나타낸다. 모 CHO_M 세포 (C)와 비교할 때 shRNA-발현 세포 클론으로부터 더 높고 더 안정한 발현이 얻어질 수 있다는 것을 나타내기 위해 선택 없이 68일의 추가 배양 동안 고도로 발현된 M3 세포의 비율을 따랐다. 대안적으로, 인플릭시맙 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 발현 플라스미드를 대표적인 클론에 형질감염시키고 나서, 항생물질이 없는 추가 배양의 3주 동안 선택 후에 분비된 면역글로불린의 구체적 생산성을 평가하였다.
도 18 두 MAR 작제물에서 FACS 분석에 의해 GFP 형광에 대해 평가한 바와 같이 높은 그리고 매우 높은 생성자 세포의 백분율( % M3/M2)에 대한 다양한 인간 재조합 상류 MAR의 효과를 도시한 도면. (A) MAR 구성요소는 작제물의 명칭에 표시된 바와 같이 MAR X-29(X_29R2(서열번호 9), X_29R3(서열번호 10), MAR 1-42(1_42R2Bis, 1_42R3), MAR 1-6(1_6R2(서열번호 8), 1_6R3) 또는 MAR 1-68(1_68R2(서열번호 7)의 재배열된 유도체였다. (B) 최고의 상류 MAR 구성요소(MAR 1_68R(서열번호 6))에 대해 얻은 전형적인 FACS 프로파일.
도 19 두 MAR 벡터에서 발현의 안정성을 도시한 도면
1_68R2, 1_6R2 및 X_29R3 MAR 유도체를 함유하는 벡터로부터 구성한 다클론성 집단을 선택 없이 배양의 5주 기간에 걸쳐 시험하고 나서, GFP 형광을 이 기간에 걸쳐 매주 평가하였다. M3 하위집단의 백분율을 평가하였다: 상류의 MAR로서 1_6R2 구성요소 및 하류의 MAR로서 비재배열된 MAR 1-68은 두 MAR과 벡터의 최상의 시험 조합이었다. M1 및 M2 하위집단을 또한 나타낸다.
도 20 단일 유전자 구성요소를 함유하는 발현 벡터를 도시한 도면
MAR 1_68 및 X_29를 시험하고 LmnB2 복제자와 조합하여 사용하였다. MAR를 이식유전자 발현 카세트의 하류에 위치시키고 나서, 2개월의 기간에 걸쳐 이식유전자 형질감염 분석에서 평가하였다. 안정하게 형질감염된 세포의 다클론성 집단을 2주 동안 항생물질 내성에 대해 선택하고 나서, 7주 동안 형광-활성화 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter: FACS) 분석을 시험하였다. 고 생성자 M3 세포의 비율을 (A)에 나타내는 한편, 전형적인 FACS 프로파일을 (B)에 나타낸다.
도 21 단일 유전자 구성요소를 함유하는 발현벡터: X-29를 도시한 도면
X_29 벡터의 안정성 분석: 발현 카세트 하류의 단일 X_29를 함유하는 발현 벡터는 안정하고 배양의 14주(27회 계대) 후조차 M2 및 M3 하위 집단의 매우 높은 백분율을 제공한다는 것을 나타낸다.
도 22 항생물질 선택의 24주 후에 안정하게 형질감염시킨 CHO 집단의 비교 분석
발현 카세트(퓨로_CGAPD_GFP_가스트린_X29) 하류의 단일 X_29 MAR을 지니는 벡터는 높은 GFP 발현 세포의 발생률을 증가시키고, 또한 시간에 따른 발현 안정성을 상류의 MAR로서 1_6R2 및 하류의 MAR로서 1_68(퓨로_1_6R2_CGAPD_GFP_가스트린_1_68)의 두 MAR을 지니는 벡터와 비교한다.
본 발명의 내용에서 사용되는 바와 같은 이식유전자는 주어진 성숙 단백질에 대해(또한 본 명세서에서 단백질을 암호화하는 DNA로서 지칭됨), 전구체 단백질에 대해 또는 단백질을 암호화하지 않는 기능성 RNA(비-암호 RNA)에 대해 단리된 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 서열이다. 이식유전자는 이식유전자 산물을 생성하기 위해 단리되고 세포 내로 도입된다. 본 발명에 따른 일부 바람직한 이식유전자는 면역글로불린(Ig) 및 Fc-융합 단백질 및 기타 단백질, 특히 치료적 활성을 지니는 단백질("생물학적 치료제")을 암호화하는 이식유전자이다. 예를 들어, 특정 면역글로불린, 예컨대 인플릭시맙(레미카드(Remicade)) 또는 다른 분비된 단백질, 예컨대 응고 인자 VIII는 대부분 특성규명되지 않은 세포 병목현상 때문에 발현이 현저하게 어렵다. 본 발명의 재조합 핵산 분자, 벡터 및 방법 덕분에, 이들 병목현상은 동정 및/또는 개방될 수 있다. 이들은 일반적으로 생성될 수 있는 치료적 단백질의 양 및/또는 그들의 품질, 예컨대 그들의 가공, 및 글라이코실화와 같은 번역 후 변형의 균질성을 증가시킨다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 이식유전자는 단백질을 암호화하는 DNA와 관련하여, 비전사 측접 영역, 예컨대 RNA 전사 개시 신호, 폴리아데닐화 첨가 부위, 프로모터 또는 인핸서를 포함하지 않을 것이다. 다른 바람직한 이식유전자는 기능성 RNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 따라서, 용어 이식유전자는 형질감염(이는 또한 본 발명의 내용에서 형질도입, 즉, 바이러스 벡터를 통한 도입을 포함함)을 통해 진핵 숙주 세포와 같은 세포 내로 도입되고, 또한 "이식유전자 발현 산물", 예를 들어, "비상동 단백질"로서 본 명세서에서 지칭되는 관심 대상 산물을 암호화하는 DNA 서열을 지칭할 때 본 발명에서 사용된다. 이식유전자는 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 펩타이드 암호 서열에 기능적으로 부착될 수 있는데, 이는 결국 전위 및/또는 소포체 및/또는 세포질 막에 걸친 분비를 매개하고/하거나 용이하게 하고, 분비 전에 또는 분비 동안 제거된다.
짧은 간섭 RNA( siRNA )는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 지니는 특이적 유전자의 발현을 간섭함으로써 RNA 간섭(RNAi)에서 어떤 역할을 하는 이중 가닥 RNA 분자, 일반적으로 20 내지 25개 염기쌍 길이이다. siRNA는 세포 내로 직접 도입될 수 있거나 또는 벡터를 통해 세포 내에서 발현될 수 있다. 본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 단리된 TEP siRNA는 보통 세포 내로 직접, 즉, 세포 내로 도입된 핵산을 통해 발현되는 일 없이 도입되는 이러한 20 내지 25개 염기쌍 길이 siRNA이다.
작은/짧은 헤어핀 RNA( shRNA )는 RNAi를 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 턴(hairpin turn)을 만드는 RNA 서열이다. 세포에서 shRNA의 발현은 전형적으로 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 전달에 의해 수행된다. shRNA를 생성하기 위해, siRNA 서열은 보통 siRNA의 두 가닥 사이에 짧은 루프를 도입하도록 변형된다. 이어서, shRNA를 암호화하는 핵산은 벡터를 통해 세포 내로 전달되고, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 전사되는데, 이는 다이세린(Dicerin)에 의해 그의 보통의 방식으로 기능성 siRNA로 가공될 수 있다.
si/shRNA는 표적 유전자를 발현을 서열-특이적으로 감소시킬 수 있다. shRNA는 표적 유전자의 산물을 암호화하는 mRNA 전사체의 영역에 혼성화될 수 있고, 이에 의해 RNA 간섭을 통해 표적 유전자 발현을 저해한다. 2-기능성 shRNA는 하나 이상의 표적, 예를 들어 암호 영역뿐만 아니라 mRNA의 특정 비번역 영역을 가진다. 세포 게놈 내로 통합은 자손 세포로 전달될 수 있는 장기 지속적 또는 구성적 유전자를 용이하게 한다.
마이크로RNA(miRNA)는 작은 RNA 분자, 예를 들어, 20 내지 24, 특히 22개 뉴클레오타이드 길이이고, mRNA 내의 상보적 서열과 짝짓기를 통해 유전자 발현의 전사 및 번역 후 조절에서 작용한다. 유전자 침묵은 이식유전자 전사 저해, mRNA 분해 또는 mRNA가 번역되는 것의 방지를 통해 일어날 수 있다. miRNA는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 전달에 의해 발현될 수 있다. 대안적으로, miRNA를 저해 또는 모방하는 RNA 분자는 합성되고 세포에서 직접 형질감염될 수 있다.
"이식유전자 발현 가공( TEP ) 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 서열"은 그것의 세포 내로 전달 후에 주어진 TEP 단백질을 발현시키거나 또는 발현을 증가시키는 반면, 비암호 기능성 RNA를 암호화하는 서열은 각각 세포 단백질의 발현을 저해한다. TEP 단백질은 세포 단백질과 동일 또는 유사할 수 있거나, 또는 그들은 별개의 세포 또는 종으로부터의 단백질일 수 있다. 발현이, 예를 들어 기능성 RNA에 의해 저해되는 세포 단백질은 기능성 RNA가 도입되는 세포의 구성성분 단백질이다. TEP 단백질은 또한 다른 세포 단백질의 발현을 보충할 수 있고, 그 결과, 바람직하게는, 이식유전자의 발현을 향상시킨다. 단백질은 재조합에; mRNA 번역 과정에; 폴리펩타이드의 ER 전위, 분비, 가공 또는 폴딩에, ER-골지-혈장막 수송, 글라이코실화 및/또는 다른 번역 후 변형에 연루될 수 있다. 기능성 RNA는, 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 레리어트(lariat)-형태 스플라이싱 RNA, 짧은-일시적 센스 RNA(stRNA), 안티센스 RNA(aRNA), 리보자임 RNA 및 다른 RNA, 특히 넉다운 표적 유전자 발현을 넉다운 시킬 수 있는 것을 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에서, 이들 단백질은 "단백질 분비 경로"에서 또는 "재조합 경로"에 수반될 뿐만 아니라 이하에 기재되는 바와 같은 특정 단백질 가공 또는 대사 단백질을 포함한다.
TEP 기능성 RNA는 상기 기재한 바와 같은 핵산 서열로부터 발현될 수 있을 뿐만 아니라 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 이는, 특히 단리된 TEP siRNA에 대해 그러하다.
용어 "단리된 핵산 분자"는 본 발명과 관련되며, "재조합 핵산 분자", 즉, 이 형태가 천연에서 존재하지 않지만, 자연에서 존재하는 부분으로부터 출발해서 구성된 핵산 분자와 동등하다.
핵산 서열, 예컨대 DNA 또는 RNA는, 예를 들어 2개의 단일 가닥 DNA 가닥 또는 2개의 단일 가닥 RNA 가닥이 안정한 수소 결합, 예컨대 구아닌(G)과 사이토신(C) 사이의 수소 결합을 형성할 수 있다면, 다른 DNA 또는 RNA에 대해 상보적이다. 세포에서, 상보적 염기쌍은, 예를 들어, 세포가 한 세대로부터 다른 세대로 정보를 복제하게 한다. RNA 간섭(RNAi)에서 상보적 염기쌍은 특정 표적 유전자의 침묵 또는 완전한 넉아웃을 허용한다. 본질적으로, siRNA, shRNA 또는 miRNA 서열은 RNA, 특히 숙주 세포의 mRNA에 맞추어 조정되는 단일 RNA 가닥(예를 들어, siRNA에서 안티센스 가닥)을 가짐으로써 표적 유전자의 발현을 특이적으로 감소 또는 넉아웃시킨다. 두 핵산 가닥 간의 상보성 정도는 완전한 상보성(각각의 뉴클레오타이드가 그의 맞은편에 있음)으로부터 부분적 상보성(50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)으로 다를 수 있다. 상보성 정도는 복합체의 안정성을 결정하고, 이에 따라 유전자가 성공적으로, 예를 들어, 넉아웃될 수 있는 방법을 결정한다. 따라서 완전한 또는 적어도 95% 상보성이 바람직하다.
RNAi에서 siRNA의 활성은 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 대한 그의 결합 능력에 크게 의존한다. RISC에 대한 듀플렉스 siRNA의 결합은 이후에 풀어지고 엔도뉴클레아제에 의해 센스 가닥이 절단된다. 이어서, 남아있는 안티센스 가닥-RISC 복합체는 전사 침묵을 개시하기 위해 표적 mRNA에 결합할 수 있다.
본 발명의 내용 내에서, 상기 정의한 바와 같은 이식유전자는 일반적으로, 예를 들어 약제학적 용도를 위해 더 다량으로 생성이 요망되는 단백질을 발현시키는 한편, TEP 단백질/기능성 RNA, 또는 기능성 RNA 그 자체를 암호화하는 서열은 직접적으로 또는 간접적으로 이러한 이식유전자를 발현시키도록 설계된다. "트랜스포존 벡터를 사용하여 발현된 TEP 단백질의 예시적 목록"을 표 A에 열거한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 대다수의 이들 단백질은 당업계에 개시되었고, 표 A는 각각의 단백질뿐만 아니라 그를 암호화하는 핵산 서열에 대한 NCBI 기준 서열 수를 둘 다 개시한다. 마지막 열은 특정의 해당 서열에 대한 서열 식별자를 제공한다. 당업자는 이어서 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 지니는 서열과 마찬가지로 단백질의 변이체가 본 발명의 부분이라는 것을 인식할 것이다.
"예를 들어, 특이적 피기백 트랜스포존 벡터를 이용하여 발현되는 shRNA의 예시적 목록"을 표 B에 열거한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 이러한 shRNA는 표적 유전자가 선택되었을 때 용이하게 구성될 수 있다. 예를 들어, 재조합 경로의 공지된 유전자 중 임의의 하나는 준비된 표적 유전자이다. 그러나, 다른 유전자, 예컨대 표 A에 제시된 단백질에 대한 유전자는 해당 shRNA로부터 생성된 siRNA에 대해 준비된 표적일 수 있다. 표 C는 siRNA의 예(센스 가닥) 및 대응하는 siRNA로부터 생성된 shRNA의 예이다. siRNA의 안티센스 가닥은 궁극적으로 세포 mRNA의 분해를 차단 및/또는 유발하기 위해 사용된다. 이는 일반적으로 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 감소된 수준을 야기한다.
동일성은 전체 및 완전한 서열과 같은 두 줄의 이러한 서열 간의 매칭의 동일성에 의해 결정되는 바와 같은 두 뉴클레오타이드 서열 간의 서열 관련성 정도를 의미한다. 동일성은 용이하게 계산될 수 있다. 두 뉴클레오타이드 서열 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 잘 공지되어 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 문헌[Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math. 48: 1073 (1988)]에 개시된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험한 두 서열 간에 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 이러한 방법은 컴퓨터 프로그램에서 정리된다. 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG(Genetics Computer Group, Madison Wis.) 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1). 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Altschul et al. (1990); Altschul et al. (1997))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 동일성을 결정하기 위해 잘 공지된 스미스 워터만(Smith Waterman) 알고리즘이 또한 사용될 수 있다.
예시로서, 기준 뉴클레오타이드 서열과 적어도, 예를 들어, 95% "동일성"을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열의 각각 100개 뉴클레오타이드 당 5개 까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 뉴클레오타이드를 얻기 위해, 기준 서열 내 뉴클레오타이드의 5%까지는 결실되거나 또는 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있고, 또는 기준 서열 내 총 뉴클레오타이드의 5%까지의 뉴클레오타이드의 수는 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 말단 위치 사이의 어떤 곳에서 생길 수 있고, 기준 서열 내 뉴클레오타이드 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 연속적 기에 배치된다. 본 명세서에 개시된 임의의 서열에 대해 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 85% 또는 약 90% 초과의 서열 동일성(예를 들어, 서열번호에 의해 및/또는 등록번호에 의해)이 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
다른 핵산 서열에 대해 실질적 동일성을 갖는 핵산 서열은 기재된 각각의 방법에 대해 영향이 전혀 없거나 또는 미미한 영향이 있으며 종종 100bp에서 1, 2, 3 또는 4개의 돌연변이에 의해 반영되는 그의 서열 내에 점 돌연변이, 결실 또는 첨가를 갖는 서열을 지칭된다.
본 발명은 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드 변이체 둘 다에 관한 것이다. "변 이체"는 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 상이하지만, 이의 본질적 특성을 보유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 변이체는 전반적으로 밀접하게 유사하고, 다수의 영역에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 동일하다. 변이체는 암호 영역, 비-암호 영역 또는 둘 다에서 변용을 함유할 수 있다. 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 생성하지만 암호화된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변용하지 않는 변용을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 변이체가 특히 바람직하다. 유전자 암호의 축퇴에 기인하는 침묵 치환에 의해 생성된 뉴클레오타이드 변이체가 바람직하다. 게다가, 본 명세서에 개시된 5 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개 아미노산이 임의의 조합에서 치환, 결실 또는 첨가되는 변이체가 또한 바람직하다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드의 대립유전자 변이체를 포함한다. 대립유전자 변이체는 동일한 염색체 자리를 점유하는 유전자의 임의의 둘 이상의 대안의 형태를 정의한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 일어나며, 집단 내의 다형성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵(암호화된 폴리펩타이드에서 변화 없음)일 수 있거나, 또는 변용된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 폴리펩타이드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다. 본 명세서에 개시된 임의의 핵산 분자의 변이체는 본 발명의 부분이다.
프로모터 서열 또는 단지 프로모터는 특이적 핵산 서열의 발현을 위한 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열이다. 프로모터 서열은 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 전사 대조군 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 절단 및 혼성 프로모터를 포함하는 선택의 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 상동성 또는 비상동성인 세포밖 또는 세포내 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 프로모터는 유도성 및 비유도성 프로모터를 포함한다. 핵산 서열은 프로모터의 제어 하에 있고, 프로모터는 상기 핵산에 대한 그의 기능을 발휘한다.
CGAPDH (또한 본 명세서에서 C_ GAPDH 로서 지칭됨)는 인간 GAPDH 프로모터 및 인간 CMV 전초기유전자 인핸서를 포함하는, 인핸서-프로모터 융합이다. 일 실시형태에서, 그것을 생성하기 위해, 인간 GAPDH 프로모터 및 그의 5'UTR은 인간 HEK293 세포 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR이었다. 산물은 인간 CMV 전초기유전자 인핸서의 하류에 위치된다. 대표적 서열에 대해 서열번호 11 참조. 서열번호 11과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열은 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 다른 바람직한 프로모터(들) 및/또는 인핸서(들) 또는 이들의 융합물은 CMV IE 인핸서, 인간 GAPDH 프로모터, 인간 Ef1 알파 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, CHO Actb 프로모터 또는 CHO Hspa5 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 구성요소는 당업계에 잘 공지되어 있고, 샘플 서열은 서열번호 110 내지 116 하에 열거되어 있다. 당업자가 이해할 바와 같이, 이들의 변이체는 또한 본 발명의 부분이고, 또한 서열번호 110 내지 116 중 임의의 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 구성요소이다.
"트랜스포존"은 "잘라 붙이기(cut and paste)" 또는 "복제해서 붙이기(copy and paste)" 메커니즘을 통해 벡터와 염색체 사이에서 효율적으로 자리를 바꾸는 이동 유전자 구성요소이다. 전위 동안, 트랜스포사제(예를 들어, 피기백 트랜스포존 시스템 내 PB 트랜스포사제)는 트랜스포존의 양 말단 상에 위치된 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 서열(ITR)(임의의 트랜스포존 시스템에 대해 5'- 및 3' ITR이 있음)을 인식하고, 내용물을 본래의 부위로부터 이동시키며, 그들을 염색체 부위, 예컨대 TTAA 염색체 부위 내로 통합시킨다. 피기백 트랜스포존 시스템의 강력한 활성은 두 ITR 사이의 관심 대사의 유전자가 표적 게놈 내로 용이하게 이동되게 할 수 있다. 피기백 트랜스포존 시스템은, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 2010/0154070호에서 기재된다.
MAR 구성요소(MAR 작제물, MAR 서열, S/MAR 또는 단지 MAR)은 경계 또는 절연체 구성요소, 예컨대 cHS4, 자리 조절영역(LCR), 안정화 및 항억제인자(STAR) 구성요소, 편재하여 작용하는 염색질 개구부(ubiquitously acting chromatin opening: UCOE) 구성요소 또는 히스톤 변형제, 예컨대 히스톤 데아세틸라제(HDAC)를 또한 포함하는 넓은 그룹의 후성적 조절제 구성요소에 속한다 .
MAR 구성요소는 동정된 MAR에 기반하여 정의될 수 있으며, 그들은 주로 하기에 기반한다: 따라서, MAR S4 작제물은 대다수의 뉴클레오타이드(50%를 더함, 바람직하게는 60%, 70% 또는 80%)가 MAR S4에 기반하는 MAR 구성요소이다. A 및 T 함량이 높은 몇몇 단순한 서열 모티프는 종종 MAR 내에서 발견되었다. 통상적으로 발견되는 다른 모티프는 척추동물 또는 초파리에 대한 A-박스, T-박스, DNA 풀림 모티프, SATB1 결합 부위(H-박스, A/T/C25) 및 공통 토포이성질화 효소 II 부위이다.
MAR은 일반적으로 핵 기질이 부착된 진핵 염색체의 DNA에서 서열로서 특성규명된다. MAR의 특성은 그들의 1차 구조에 의해 단지 부분적으로 정의된다. 예를 들어, AT 풍부 영역과 같은 MAR 구성요소에서 발견되는 전형적인 1차 구조는 3차 구조, 즉 MAR의 기능을 정하는 특정 굽음을 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서, MAR은 종종 그들의 1차 구조뿐만 아니라 그들의 2차, 3차 구조, 예를 들어 굽음 정도 및/또는 물리적 특성, 예컨대 융점에 의해 정해진다.
MAR 구성요소에서 통상적으로 발견되는 바와 같이 AT/TA-다이뉴클레오타이드가 풍부한 구부러진 DNA 영역(본 명세서에서 이후에 "AT-풍부 영역"으로서 지칭됨)은 매우 다수의 A 및 T를, 특히 다이뉴클레오타이드 AT 및 TA의 형태로 포함하는 구부러진 DNA 영역이다. 바람직한 실시형태에서, 이는 100개의 연속적 염기쌍의 신장에 대해 적어도 10%의 다이뉴클레오타이드 TA, 및/또는 적어도 12%의 다이뉴클 레오타이드 AT를 함유하고, 바람직하게는 100개의 연속적 염기쌍의 신장에 대해 적어도 33%의 다이뉴클레오타이드 TA, 및/또는 적어도 33%의 다이뉴클레오타이드 AT(또는 AT-풍부 영역이 더 짧은 길이를 가질 때 각각의 더 짧은 신장에 대해)를 함유하는 한편, 구부러진 2차 구조를 가진다. 그러나, "AT-풍부 영역"은 약 30개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 짧을 수 있지만, 바람직하게는 약 50개 뉴클레오타이드, 약 75개 뉴클레오타이드, 약 100개 뉴클레오타이드, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350 또는 약 400개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 결합 부위는 또한 종종 상대적으로 높은 A 및 T 함량, 예컨대 SATB1 결합 부위(H-박스, A/T/C25) 및 척추동물(RNYNNCNNGYNGKTNYNY) 또는 초파리(GTNWAYATTNATNNR)에 대한 공통 토포이성질화 효소 II 부위를 가진다. 그러나, 결합 부위 영역(모듈), 특히 결합 부위의 클러스터를 포함하는 TFBS 영역은 영역의 굽힘 패턴의 비교에 의해 A 및 T 함량이 높은 MAR 구성요소로부터 AT 및 TA 다이뉴클레오타이드 풍부 영역("AT-풍부 영역")과 용이하게 구별될 수 있다. 예를 들어, 인간 MAR 1_68에 대해, 후자는 약 3.8 또는 약 4.0을 초과하는 평균 만곡도를 가질 수 있는 반면, TFBS 영역은 약 3.5 또는 약 3.3 미만의 평균 만곡도를 가질 수 있다. 동정된 MAR의 영역은 또한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 대안의 수단, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 상대적 융점에 의해 확인될 수 있다. 그러나, 이러한 값은 종 특이적이고, 따라서 종 간에 다를 수 있으며, 예를 들어, 더 낮을 수 있다. 따라서, 각각의 AT 및 TA 다이뉴클레오타이드 풍부 영역은 약 3.2 내지 약 3.4 또는 약 3.4 내지 약 3.6 또는 약 3.6 내지 약 3.8과 같은 더 낮은 만곡도를 가질 수 있고, TFBS 영역은 비례해서 더 낮은 만곡도, 예컨대 약 2.7 미만, 약 2.9 미만, 약 3.1 미만, 약 3.3 미만을 가질 수 있다. SMAR 스캔 II에서, 각각 더 낮은 윈도 크기는 당업자에 의해 선택될 것이다.
본 발명에 따른 MAR 구성요소, MAR 작제물, MAR 서열, S/MAR 또는 단지 MAR은 자연적으로 생기는 " SAR " 또는 "MAR"과 상기 기재한 것과 같은 하나 이상의(예컨대 2, 3 또는 4) 특징을 공유하는 뉴클레오타이드 서열이다. 바람직하게는, 이러한 MAR 구성요소, MAR 작제물, MAR 서열, S/MAR 또는 단지 MAR은 상기 MAR에 의해 영향받는 임의의 유전자의 단백질 발현을 용이하게 하는 적어도 하나의 특성을 가진다. MAR 구성요소는 일반적으로 또한 단리된 및/또는 정제된 핵산이 바람직하게는 MAR 활성을 나타내고, 특히 전사 조절, 바람직하게는 향상 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 예를 들어, 발현 안정화 활성 및/또는 다른 활성을 나타내는 특징을 가진다.
용어 MAR 구성요소, MAR 작제물, MAR 서열, S/MAR 또는 단지 MAR은 또한, 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 MAR 작제물이 기반한 자연적으로 발생하는 및/또는 동정된 MAR 이상으로 향상을 구성하는 특성을 갖는 향상된 MAR 작제물을 포함한다. 이러한 특성은 전장 자연적으로 생기는 및/또는 동정된 MAR에 비해 감소된 길이, 유전자 발현/전사 향상, 발현의 안정성 향상, 조직 특이성, 유도성 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 향상된 MAR 구성요소는, 예를 들어, 동정된 MAR 서열의 뉴클레오타이드 수의 약 90% 미만, 바람직하게는 약 80% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 70% 미만, 약 60% 미만, 또는 약 50% 미만을 포함할 수 있다. MAR 구성요소는 상기 작제물에 의해 적절한 세포의 형질전환 시 유전자 발현 및/또는 이식유전자의 전사를 향상시킬 수 있다.
MAR 구성요소는 바람직하게는 관심 대상 유전자가 작동가능하게 연결되거나 또는 연결될 수 있는 프로모터 영역의 상류에 삽입된다. 그러나, 특정 실시형태에서, MAR 구성요소는 관심 대상 유전자/뉴클레오타이드 산 서열의 상류뿐만 아니라 하류 또는 단지 하류에 위치되는 것이 유리하다. 시스 및/또는 트랜스 둘 다에서 다른 다수 MAR 배열은 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
MAR 구성요소와 관련하여 사용될 때 합성은 동정된 MAR 또는 그에 기반한 MAR의 서열/영역 또는 부분적 영역의 간단한 재셔플링, 중복 및/또는 결실 이상으로 설계가 연루된 MAR을 지칭한다. 특히, 합성 MAR/MAR 구성요소는 일반적으로 하나 이상의, 바람직하게는 하나의 동정된 MAR의 영역을 포함하는데, 그러나, 이는 특정 실시형태에서 합성 또는 변형될 수 있을 뿐만 아니라 특이적으로 설계되고, 잘 특성규명된 구성요소, 예컨대 바람직한 실시형태에서 합성적으로 생성된 단일 또는 일련의 TFBS이다. 이들 설계 구성요소는 다수의 실시형태에서 상대적으로 짤고, 특히, 그들은 일반적으로 약 300 이하 bp 길이, 바람직하게는 약 100, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20 또는 약 10 이하의 bp 길이이다. 이들 구성요소는, 특정 실시형태에서, 다합체화될 수 있다. 이러한 합성 MAR 구성요소는 또한 본 발명의 부분이고, 본 설명은 "MAR 구성요소"가 합성 MAR 구성요소에 동일하게 적용되는 것으로 언급되는 어떤 것을 이해할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
동정된 MAR 구성요소의 뉴클레오타이드 서열의 기능적 단편은 또한 그들이 상기 기재한 바와 같은 MAR 구성요소의 기능을 유지하는 한 포함된다.
일부 바람직한 동정된 MAR 구성요소는 이들 및 다른 MAR 구성요소의 서열의 개시내용에 대해 본 출원에 참고문헌으로써 구체적으로 포함되는 WO2005040377호 및 미국 특허 공개 제20070178469호에 개시된 바와 같은 MAR 1_68, MAR X_29, MAR 1_6, MAR S4, MAR S46(그들의 모든 순열을 포함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 닭 라이소자임 MAR은 또한 바람직한 실시형태이다(미국 특허 제7,129,062호 참조, 또한 그것의 MAR 구성요소의 개시내용에 대해 본 명세서에 구체적으로 포함됨).
벡터가 단일 MAR를 포함하는 것으로 언급된다면, 이는 이 벡터에서 동일 또는 상이한 유형 또는 구조 중 하나의 벡터 내에서 하나의 MAR이 있고 다른 MAR이 없다는 것을 의미한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 동일 또는 상이한 유형 또는 구조일 수 있고 관심 대상 유전자의 하류에 모두 위치될 수 있는 다수 MAR이 있다. 이는 단일 MAR 클러스터로 불린다.
폴리펩타이드를 안정하게 발현시키는 다수의 세포와 같은 것이, 예를 들어, 서열의 존재와 "독립적"인 것으로 언급된다면, 서열은 임의의 통계학적으로 유의한 정도로 (예를 들어, 폴리펩타이드를 안정하게 발현시키는 세포의 수에) 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 이식유전자 또는 이식유전자 발현 가공 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화하는 서열은 종종 벡터의 부분이다.
본 발명에 따른 벡터는 다른 핵산, 예컨대 이 벡터에 의해 발현되고, 그것이 연결되고, 일반적으로 그것이 통합되는 이식 유전자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 예를 들어, 플라스미드는 벡터의 유형이며, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스는 다른 유형의 벡터이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 벡터는 형질감염 전에 선형화된다. 발현 벡터는 조절 구성요소를 포함하거나 또는 발현 벡터에 의해 운반되는 핵산 서열의 전사 및/또는 발현을 추가하도록 설계된 그러한 조절 구성요소의 제어 하에 있다. 조절 구성요소는 인핸서 및/또는 프로모터뿐만 아니라, 본 명세서에 기재된 다양한 다른 구성요소(또한 "벡터 설계"를 참조)를 포함한다.
벡터의 벡터 서열은 이식유전자와 같은 임의의 "다른" 핵산뿐만 아니라 MAR 구성요소와 같은 유전자 구성요소를 제외하는 벡터의 DNA 또는 RNA 서열이다.
본 발명에 따른 포유류 세포, 예컨대 재조합 포유류 세포/ 진핵 숙주 세포를 포함하는 진핵생물은 세포 배양 조건 하에 유지될 수 있다. 이 유형의 세포의 비제한적 예는 비-영장류 진핵 숙주 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 및 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10)이다. 영장류 진핵 숙주 세포는, 예를 들어, 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2) 및 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL-1587)을 포함한다. 재조합 진핵 숙주 세포 또는 재조합 포유류 세포는, 예를 들어 이식유전자 서열로, 예를 들어 형질감염에 의해 및/또는 돌연변이에 의해 변형된 세포를 의미한다. 진핵 숙주 세포 또는 재조합 포유류 세포는 상기 세포에 의해 발현된 단백질의 번역 후 변형을 수행할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 진핵(예를 들어, 비-영장류) 숙주 세포의 세포 상대는 완전히 기능성이고, 즉, 예를 들어 돌연변이에 의해 불활성화되지 않았다. 오히려 이식유전자 서열(예를 들어, 영장류)이 그의 세포 상대(예를 들어, 비-영장류)에 더하여 발현된다.
본 발명에 따른 형질감염은, 일반적으로 비-바이러스 벡터(벡터 매개 형질감염)를 통한 또는 다수 양이온 지질을 수반하는 것을 포함하는 화학적 수단을 통한 예컨대, 전기천공법, 리포펙션에 의한 수용 진핵 세포 내로 핵산의 도입이지만, 이들로 제한되지 않는다. 비 벡터 매개 형질감염은 세포 내로 단리된 TEP siRNA의 직접 도입을 포함한다. 일시적으로 형질감염된 세포에서, 예를 들어, siRNA는 단지 일시적으로 남아있다. 본 발명과 관련하여, 이식유전자 발현 가공(TEP) 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 서열을 지니는 적어도 하나의 핵산 분자에 의해 또는 대안적으로 TEP 기능성 RNA(예를 들어, siRNA)에 의해 직접적으로 제1 형질감염 및 이식유전자를 암호화하는 핵산에 의한 제2의 후속적 형질감염에 의할 수 있다. 제1 형질감염과 제2 형질감염은 둘 다 반복될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 제1 형질감염 동안 도입되고, 작용하며, 특히, 재조합 단백질(형질감염된 세포에서 재조합 사건에 수반된 단백질)을 저해한다. 이후에 이식유전자는 제2의 후속 형질감염 동안 도입된다.
전사는 DNA 주형으로부터의 RNA의 합성을 의미한다. "전사적으로 활성인"은, 예를 들어, 전사되고 있는 이식유전자를 지칭한다. 번역은 RNA가 단백질을 생성하는 과정이다.
분비의 향상은 각각의 이식유전자 서열을 포함하지 않는 대조군 세포로부터 얻어진 값에 대해 측정된다. 대조군 값에 대한 임의의 통계학적으로 유의한 향상은 증진으로서 자격을 얻는다.
선택 마커는 산물에 선택제 항생물질(예를 들어, 클로람부실, 암피실린, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 카나마이신, 네오마이신, 퓨로마이신)에 대한 내성 또는 선택 배지(예를 들어, DHFR(다이하이드로폴레이트 환원효소)) 상에서 성장하는 능력을 부여하는 유전자를 함유하는 핵산이다.
샤페론으로서 알려진 단백질의 부류는 다른 단백질의 달리 불안정한 형태이성질체에 결합하고 안정화시키는 단백질로서 정의되며, 제어된 결합 및 방출에 의해 그의 정확한 생체내 운명을 촉진하며, 그것을 올리고머 조립체로 폴딩하고, 특정 아세포 구획으로 수송하거나, 또는 분해에 의해 처리한다. BiP(또한 효모에서 GRP78, Ig 중쇄 결합 단백질 및 Kar2p로서 알려짐)는 소포체(ER) 내에 체류하는 hsp 70 패밀리의 흔한 약 70 kDa 샤페론인데, 이는 특히 분비계에서 수송을 보조하는 역할을 하며, 단백질을 폴딩한다. 단백질 이황화물 이성질화 효소(Protein disulphide isomerase: PDI)는 단백질의 번역 후 가공 동안 이황화 결합 형성의 촉매 작용에 수반된 ER에 체류하는 샤페론 단백질이다.
세포의 대사적 유전자 조작
세포의 대사적 유전자 조작에서, 예를 들어, 발현 세포에서 고유한 과정이 변용된다. 예를 들어, 분비 경로의 특정 단백질은, 예를 들어 과발현된다. 대안적으로, 재조합 사건은 재조합 경로에 영향을 미침으로써 변용된다.
단백질 분비 경로
단백질의 분비는 모두 3가지 계의 유기체에 대해 통상적인 과정이다. 이 복잡한 분비 경로는 세포의 세포질 막에 거쳐 사이토졸로부터의 단백질 전위를 가장 현저하게 필요로 한다. 단백질이 그의 최종 목적지에 도달하는데 다수 단계 및 다양한 인자가 필요로 된다. 포유류 세포에서, 이 분비 경로는 2개의 주요 거대분자 조립체, 즉, 신호 인식 입자(signal recognition particle: SRP) 및 분비 복합체(Sec-복합체 또는 트랜스로콘)을 수반한다. SRP는 9, 14, 19, 54, 68 및 72kDa의 질량을 지니는 6개 단백질 및 7S RNA로 구성되며, 트랜스로콘은 Sec61αβγ, Sec62 및 Sec63으로 구성된 도넛형 입자이다. 일부 이들 단백질의 인간 형태에 대한 등록번호(괄호)는 다음과 같다: hSRP14(등록번호 X73459.1); hSRP9(NM_001130440); hSRP54(NM_003136); hSRPRα(NM_003139); hSRPRβ(NM_021203); hSEC61α1(NM_013336); hSEC61 β(L25085.1); hSEC61 γ(AK311845.1).
단백질 분비에서 제1 단계는 신호 펩타이드에 의존하는데, 이는 막을 거쳐서 그리고 소포체(ER)의 내강 내로 초기 단백질의 전위를 매개하고 폴리펩타이드의 아미노-말단에서 특이적 펩타이드 서열을 포함한다. 이 단계 동안, 리보솜의 선두적 번역으로부터 생기는 신호 펩타이드는 신호 펩타이드, 즉, SRP54를 인식하는 SRP 입자의 서브유닛과 상호작용한다. 신호 펩타이드에 대한 SRP 결합은 번역 저지를 초래하는 초기 폴리펩타이드의 추가적인 신장을 차단한다. 신장 저지를 위해 SRP9 및 -14 단백질이 필요하다(Walter and Blobel 1981). 제2 단계에서, 리보솜-초기 폴리펩타이드-SRP 복합체는 SRP 수용체와 SRP54의 상호작용을 통해 ER 막에 도킹된다(Gilmore, Blobel et al. 1982; Pool, Stumm et al. 2002). SR은 GTP 분해효소 활성을 나타내는 두 단백질, 즉, SRα 및 SRβ를 함유하는 이형이합체 복합체이다(Gilmore, Walter et al. 1982). SRP54와 SR의 상호작용은 GTP의 결합에 의존한다(Connolly, Rapiejko et al. 1991). SR은 리보솜-초기 폴리펩타이드 복합체로부터 SRP의 방출 및 Sec61 복합체(트랜스로콘)을 지니는 리보솜의 출구 부위를 배위한다. 성장하는 초기 폴리펩타이드는 트랜스로콘 통로를 통해 ER로 유입되며, 번역은 그의 정상 속도로 재개된다. 번역이 완료될 때, 트랜스로콘의 세포질 면에 결합된 리보솜이 유지된다. 리보솜에 추가로, 트랜스로콘은 세포질면 상의 리보포린과 그리고 샤페론, 예컨대 칼레티쿨린 및 칼넥신, 및 단백질 이황화물 이성질화효소(PDI) 및 내강면 상의 올리고사카릴 트랜스퍼라제와 가깝게 결합된다. ER의 내강 내로 성장하는 초기 폴리펩타이드의 분출 후에, 신호 펩타이드는 신호 펩티다제로 불리는 효소에 의해 전-단백질로부터 절단되고, 이에 의해 ER 내로 성숙 단백질을 방출시킨다. 번역 후 변형 후에, 정확한 폴딩 및 다합체화, 단백질은 ER을 이탈하며, 골지 장치로 이동하고, 이어서 분비 소포로 이동한다. 혈장막과 분비 소포의 융합은 세포밖 환경에서 소포의 내용물을 방출한다.
현저하게, 분비된 단백질은 세포막에 걸친 그 자체의 전위에 상당히 적합한 특정 신호 서열에 의해 진화되었다. 별개의 신호 펩타이드로서 발견된 다양한 서열은 독특한 방법으로 분비 장치와 상호작용할 수 있다. 신호 서열은 자연에서 우세하게 소수성인데, 이는 초기 펩타이드를 분비 단백질에 보내는데 수반될 수 있는 특징이다. 아미노산의 소수성 신장에 추가로, 다수의 흔한 서열 특징은 대다수의 포유류 분비 신호에 의해 공유된다. 상이한 신호 펩타이드는 그들이 비상동 단백질의 분비를 지시하는 효율이 다르지만, 비상동 재조합 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있는 몇몇 분비 신호 펩타이드(즉, 인터류킨-, 면역글로불린-, 조직적합성 수용체-신호 서열 등의 분비 신호 펩타이드)가 동정되었다. 유사성에도 불구하고, 천연 신호 펩타이드가 본래의 상황 밖에서 제대로 기능하지 않을 수도 있고, 또는 숙주 세포와 관련되거나 또는 분비 과정과 관련된 차이 때문에, 이들 서열은 발현되기 어려운 일부 단백질의 효율적인 분비를 촉진하는데 최적이 아니다. 비상동 단백질의 효율적인 분비를 위한 적절한 신호 서열의 선택은 성숙 단백질의 다른 부분과 절단된 신호 펩타이드 내의 서열의 상호작용에 의해 더 복잡하게 될 수 있다(Johansson, Nilsson et al. 1993).
재조합 경로
DNA 재조합 경로로서도 알려진 재조합 경로는 DNA 손상 수선, 예컨대 이중-가닥 파손 후에 DNA 분자 말단의 결합, 및 염색체와 비-염색체 DNA 분자 간의 DNA 서열의 교환 또는 융합, 예컨대 감수분열에서 염색체의 교차 또는 림프구 세포에서 면역글로불린 유전자의 재배열을 야기하는 세포 경로이다. 3가지 주된 재조합 경로는 상동성 재조합 경로(HR), 비-상동성 말단-결합 경로(NHEJ) 및 미소상동체(microhomology)-매개 말단-결합(MMEJ) 및 대안의 말단-결합(Alt-EJ) 경로이다.
상동성 재조합(HR), 비-상동성 말단-결합(NHEJ) 및 마이크로상동성 매개 말단 결합(MMEJ)의 메커니즘
이식유전자는 이중 가닥 파단에서 숙주 게놈 내로 통합하기 위한 재조합 메커니즘을 사용한다.
이중-가닥 파손(DSB)은 세포사 또는 매우 다양한 유전자 재배열을 잠재적으로 야기하는 생물학적으로 가장 해로운 유형의 게놈 손상이다. 정확한 수선은 유전자 정보의 성공적인 유지 및 증식에 필수적이다.
두 가지의 주된 DSB 수선 메커니즘이 있다: 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 및 상동성 재조합(HR). 마이크로상동성-매개 말단 결합(MMEJ)으로 불리는 세번째 메커니즘은 종종 두 가지 주된 DSB 수선 메커니즘이 실패했을 때 효과를 발휘하기 시작한다. 상동성 재조합은 상동성을 공유하고 세포 주기의 S/G2 기 동안 우세하게 영향을 미치는 DNA 서열 간의 유전자 교환을 위한 과정인 반면, NHEJ는 보통 서열 상동성이 없는 두 파손된 DNA 말단을 함께 단순히 연결하고, 그것은 모든 기의 세포 주기에서 기능하지만 유사분열 세포의 G0-G1 및 초기 S-기 동안 특히 중요성을 가진다(Wong and Capecchi, 1985; Delacote and Lopez, 2008). 척추동물에서, HR, NHEJ 및 MMEJ는 DSB의 특성 및 세포주기의 단계에 의존하여 DSB 수선에 차별적으로 기여한다(Takata et al., 1998).
NHEJ : 기본 메커니즘
개념적으로, NHEJ 과정의 분자 메커니즘은 단순한 것으로 보인다: 1) 효소의 세트가 파손된 DNA 분자를 포획됨, 2) 2개의 DNA 말단을 가져오는 분자 브릿지가 형성됨 및 3) 파손된 분자가 재결찰됨. 이러한 반응을 수행하기 위해, 포유류 세포에서 NHEJ 메커니즘은 2개의 단백질 복합체, 즉, DNA-PKcs(DNA-의존적 단백질 키나제의 촉매적 서브유닛)와 결합된 이형이합체 Ku80/Ku70 및 DNA 리가제 IV와 그의 보인자(co-factor) XRCC4(X-선-보완 중국 햄스터 유전자 4) 및 다수의 단백질 인자, 예컨대 아르테미스(Artemis) 및 XLF(XRCC4-유사 인자; 또는 세르눈노스(Cernunnos))를 수반한다(Delacote et al., 2002). NHEJ는 그것이 보통 서열 상동성이 없는 2개의 파손된 DNA 말단을 함께 단순히 연결하고 그것이 작은 삽입 및 결실을 생성하기 때문에 오류유발 DSB 수선으로서 빈번하게 고려된다(Moore and Haber, 1996; Wilson et al., 1999). NHEJ는 세포 주기 전체적으로 DSB의 수선을 위한 메커니즘을 제공하지만, 유사분열 세포의 G0-G1 및 초기 S-기 동안 특히 중요성을 가진다(Takata et al., 1998; Delacote and Lopez, 2008). NHEJ에 의한 DSB의 수선은 박테리아로부터 포유류까지의 범위의 유기체에서 관찰되는데, 이는 진화 동안 보존되었다는 것을 나타낸다.
DSB 형성 후에, NHEJ 수선 경로에서 중요한 단계는 파손된 DNA 말단의 물리적 병치이다. NHEJ는 포획을 위해 파손된 DNA 분자의 말단 둘 다에 대해 Ku70/80 이형이합체 단백질 복합체의 결합에 의해 개시되고, 말단을 함께 묶고, 다른 NHEJ 중요 인자의 조립체에 대해 스캐폴드를 생성한다. DNA-결합된 Ku 이형이합체 복합체는 PIKK(단백질 키나제의 포스포이노시타이드 3-키나제-유사 패밀리)에 속하는 460kDa 단백질인 DSB에 대해 DNA-PKcs를 동원하고(Gottlieb and Jackson, 1993) 그의 세린/트레오닌 키나제 기능을 활성화한다(Yaneva et al., 1997). 2개의 DNA-PKcs 분자는 DSB에 걸쳐 함께 상호작용하며, 따라서 파손된 DNA 말단 둘 다의 사이에 분자 브릿지를 형성하고, 그들의 분해를 저해한다(DeFazio et al., 2002). 이어서, DSB로부터 생성된 대다수의 말단이 결찰 전에 적절하게 가공되어야 하지만, DNA 말단은 직접 결찰될 수 있다(Nikjoo et al., 1998). 파손의 특성에 따라서, 가공 효소의 상이한 조합의 작용은 갭을 채우고, 손상된 DNA 또는 파손 주위의 2차 구조를 제거함으로써 적격의 돌출부를 생성하는데 필요로 될 수 있다. NHEJ 과정에서 이 단계는 NHEJ 수선과 관련된 뉴클레오타이드의 가끔씩의 상실을 초래하는 것으로 고려된다. 포유류 NHEJ에서 하나의 중요한 말단-가공 효소는 효소의 메탈로-β-락타마제 슈퍼패밀리의 구성원인 아르테미스인데, 이는 대다수의 방사선 감수성 중증 합병성 면역결핍 장애(severe combined immunodeficiency: SCID) 환자에서 돌연변이된 유전자로서 발견되었다(Moshous et al., 2001). 아르테미스는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성과 DNA-함유 ds-ss 전이 및 DNA 헤어핀에 대한 DNA-PKcs-의존적 엔도뉴클레아제 활성을 둘 다 가진다(Ma et al., 2002). 그의 활성은 또한 ATM에 의해 조절된다. 따라서, 아르테미스는 다수 DNA-손상 반응에 연루될 가능성이 있는 것으로 보인다. 그러나, DNA 병변의 서브세트만이 아르테미스에 의해 수선되는 것으로 보이는데, DSB 수선에서의 주된 결함이 아르테미스-결여 세포에서 관찰되지 않았기 때문이다(Wang et al., 2005, Darroudi et al., 2007).
DNA 갭은 수선을 가능하게 하기 위해 채워져야 한다. DSB에 대한 뉴클레오타이드의 첨가는 폴리머라제 μ 및 λ로 제한된다(Lee et al., 2004; Capp et al., 2007). XRCC4와의 상호작용에 의해, 폴리뉴클레오타이드 키나제(PNK)는 또한 DNA 중합 및 결찰을 둘 다 허용하는 DNA 말단에 동원된다(Koch et al., 2004). 최종적으로, NHEJ는 XRCC4, DNA 리가제 IV 및 XLF을 함유하는 복합체에 의해 수행되는 단계인 DNA 말단의 결찰에 의해 완료된다(Grawunder et al., 1997). 다른 리가제는 DNA 리가제 IV를 부분적으로 치환할 수 있는데, NHEJ가 XRCC4 및 리가제 IV 없이 일어날 수 있기 때문이다(Yan et al., 2008). 더 나아가, 연구는 XRCC4 및 리가제 IV가 NHEJ 밖에서 어떤 역할도 하지 않는 반면, 대조적으로, KU는 전사, 세포자멸사, 및 미세환경에 대한 반응과 같은 다른 과정에서 작용한다는 것을 나타내었다(Monferran et al., 2004; Muller et al., 2005; Downs and Jackson, 2004).
NHEJ는 상이한 방법에서 감소 또는 정지될 수 있는데, 이들 중 대다수는 상기 언급한 단백질(예를 들어, 이형이합체 Ku80/Ku70, DNA-PKcs, 그러나 특히 DNA 리가제 IV, XRCC4, 아르테미스 및 XLF(XRCC4-유사 인자; 또는 케르눈노스(Cernunnos)), PIKK(단백질 키나제의 포스포이노시타이드 3-키나제-유사 패밀리)에 직접적으로 영향을 미친다.
HR: 기본 메커니즘
상동성 재조합(HR)은 매우 정확한 수선 메커니즘이다. 상동성 염색분체는 파손된 가닥의 수선을 위한 주형으로서 작용한다. 딸 염색분체가 이용가능할 때 HR은 세포 주기의 S 및 G2기 동안 일어난다. 고전적 HR은 주로 3단계를 특징으로 한다: 1) 파손된 말단의 5'의 절제, 2) 가닥 침범 및 상동성 DNA 듀플렉스와 교환, 및 3) 재조합 중간체의 분해. 가닥 침범을 수행하기 위한 능력에 따라서 상이한 경로는 완전한 DSB 수선을 완료할 수 있으며, 합성-의존적 가닥-어닐링(SDSA) 경로, 고전적 이중-가닥 파손 수선(DSBR)(Szostak et al, 1983), 파손-유도 복제(BIR), 및 대안적으로, 단일-가닥 어닐링(SSA) 경로를 포함한다. 모든 HR 메커니즘은 상호관련되며, 다수의 효소적 단계를 공유한다.
모든 HR 반응의 제1 단계는 MRN 복합체(MRE11, RAD50, NBN(앞에서 NBS1, 네이메헌 파손 증후군 1(Nijmegen breakage syndrome 1)에 대해)) 및 CtIP(CtBP-상호작용 단백질)의 도움으로 뉴클레아제에 의해 5'-말단 파손 DNA 가닥의 절제에 대응한다(Sun et al., 1991; White and Haber, 1990). 3' 단일-가닥 DSB의 얻어진 생성은 상동성 서열을 찾을 수 있다. 상동성 듀플렉스의 침범은 RAD51 재조합효소 단백질로 코팅된 3'ss-DNA로 구성된 뉴클레오필라멘트에 의해 수행된다(Benson et al., 1994). 진핵생물에서 ssDNA에 연결된 DNA 대사 과정에 수반된 이형삼합체 ssDNA-결합 단백질인 복제 단백질 A(RPA)의 동원(Wold, 1997)은 RAD51-필라멘트의 조립에 필요하다(Song and sung, 2000). 이어서, RAD51은 RPA 분자를 대체하고 RAD51 부하를 용이하게 하는(Song and sung, 2000) 고리-유사 구조를 갖는 RAD52와 상호작용한다(Shen et al., 1996). Rad52는 효모에서 재조합 과정에 대해 중요하다(Symington, 2002). 그러나, 척추동물에서, RAD52보다 오히려 BRCA2(유방암 2형 감수성 단백질)는 가닥 침범 및 교환에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Davies and Pellegrini, 2007; Esashi et al., 2007). RAD51/RAD52 상호작용은 RAD54의 결합에 의해 안정화된다. RAD54는 또한 D-루프 형성 후에 재조합 중간체의 성숙에서 어떤 역할을 한다(Bugreev et al., 2007). 다른 한편으로, BRCA1(유방암 1)은 BARD1(BRCA1 관련 RING 도메인 1) 및 BACH1(BTB 및 CNC 상동성 1)과 상호작용하여 각각 리가제 및 헬리카제 DSB 수선 활성을 수행한다(Greenberg et al., 2006). BRCA1은 또한 CDK-의존적 방식으로 CtIP와 상호작용하며, DNA 손상에 반응하여 유비퀴틴화(ubiquitination)를 겪는다(Limbo et al., 2007). 결과로서, BRCA1, CtIP 및 MRN 복합체는 세포 주기의 S 및 G2기에서 DNA의 HR-매개 수선의 활성화에서 어떤 역할을 한다.
뉴클레오필라멘트의 침범은 대치고리(displacement-loop: D-loop)로 불리는 헤테로듀플렉스의 형성을 초래하고, 침범 가닥에 의한 듀플렉스 중 한 가닥의 대치 및 다른 것과의 짝짓기를 수반한다. 이어서, 몇몇 HR 경로는 DSB를 둘러싸는 서열을 대체하기 위한 주형으로서 상동성 서열을 사용하여 수선을 완료할 수 있다. 사용되는 메커니즘에 따라서, 상동성 주형과 파손된 DNA 분자 사이의 상호간의 교환(교차)은 HR 수선과 관련될 수도 있고 관련되지 않을 수도 있다. 교차는 중요한 유전적 결과, 예컨대 게놈 재배열 또는 이형접합성의 상실을 가질 수 있다.
5개의 Rad51 파라로그가 또한 상동성 재조합에 수반된다: Xrcc2, Xrcc3, Rad51B, Rad51C, Rad51D(Suwaki et al., 2011). Rad51 파라로그는 두 유형의 복합체를 형성한다: BCDX2로 칭해지는 하나는 Rad51B, Rad51C, Rad51D 및 Xrcc2를 포함하고; 다른 하나는 Rad51C 및 Xrcc3(CX3)을 함유한다(Masson et al., 2001). 제1 복합체는 Rad51-DNA 복합체의 형성 및/또는 안정화에 참여하는 것으로 제안되었다(Masson et al., 2001). 제2 복합체의 역할은 홀리데이 접합(Holliday junction)의 분지 이동 및 분해인 것으로 보인다(Liu et al., 2007).
앞서 보고한 바와 같이, NHEJ에 대해 HR이 증가하는 것(미국 특허 공개 제20120231449호, 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)은 이식유전자 발현을 향상시키고/시키거나 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 HR을 감소 또는 중단시키는데 중점을 둔다. HR은 상이한 방법으로 감소 또는 중단될 수 있는데, 이 중 다수는 상기 언급한 단백질에 직접적으로 영향을 미친다(예를 들어, MRN 복합체의 단백질(MRE11, RAD50, NBN(앞에서 NBS1, 네이메헌 파손 증후군 1에 대해)) 및 CtIP(CtBP-상호작용 단백질), RAD51, 복제 단백질 A(RPA), Rad52, BRCA2(유방암 2형 감수성 단백질), RAD54, BRCA1(유방암 1)은 BARD1(BRCA1 관련 RING 도메인 1), BACH1(BTB 및 CNC 상동성 1)과 상호작용한다). 본 발명은 이 목표를 수행하기 위해 siRNA와 같은 RNA의 생성에 중점을 둔다.
마이크로상동체 -매개 말단 결합( MMEJ )
다른 재조합 경로가 실패하거나 또는 활성이 아닐 때, DSB는 마이크로상동성-매개 말단 결합(MMEJ)으로 불리는 다른 오류유발 수선 메커니즘에 의해 수선될 수 있다. 이 경로는 여전히 완전히 특성규명될 필요가 있으며, 이들 두 과정이 동일한 메커니즘에 기반하는지 여부는 불명확하지만, 때때로 또한 대안의 말단-결합(alt-EJ)으로서 지칭된다. 그것을 NHEJ와 구별하는 이 경로의 가장 특징적 특징은 파손된 DNA 가닥의 배열 동안 5 내지 25 bp 마이크로상동체의 사용이다(McVey and Lee, 2008).
MMEJ는 세포 주기의 임의의 시간에 일어날 수 있고, 코어 NHEJ 및 HR 인자, 즉, Ku70, 리가제 IV 및 Rad52 유전자와 독립적이다(Boboila et al., 2010; Yu and McVey, 2010; Lee and Lee, 2007; Ma et al., 2003). 대신에 MMEJ 개시는 단백질의 그 자체의 세트에 의존하며, 가장 중요한 것은 HR의 제1 단계에 또한 연루된 Mre11, Rad50 및 Nbs1(효모에서 Xrs2)을 포함하는 MRN 복합체(효모에서 MRX)의 구성성분이다(Ma et al., 2003). MRN 복합체와 별도로, 다수의 다른 인자는 MMEJ, 예를 들어 CTBP-상호작용 단백질(CtIP; Yun and Hiom, 2009), 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 1(PARP1), 리가제 III/ Xrcc1 복합체, 리가제 I(Audebert et al., 2004), DNA 폴리머라제 θ(Yu and McVey, 2010), 및 ERCC1/XPF 복합체(Ma et al., 2003)에 참여하도록 제안되었다. 그러나, 다수의 더 많은 단백질이 이 과정에 참여한다.
다른 DNA-말단 결합 단백질(예컨대 Ku 또는 Rad51) 없이, DSB는 PARP1에 의해 인식되고, 이어서 MMEJ를 통해 그들의 수선을 개시한다는 것이 시사되었다(McVey and Lee, 2008). HR과 유사하게 수선 과정은 5'에서 3' 말단 절단으로 시작하는데, 이는 파손의 각각의 측면 상에서 상동체의 짧은 영역을 노출시킨다. 이 가공 단계는 MRN 복합체에 의해 수행되고, CtIP에 의해 조절된다(Mladenov and Iliakis, 2011). 함께 상보적 영역(3' ssDNA 단편에 존재) 쌍 그리고 비-상보적 세그먼트(플랩)는 아마도 ERCC1/XPF 복합체에 의해 제거된다(Yu and McVey, 2010). 이어서, 갭(만약에 있다면)은 폴리머라제(예를 들어 DNA 폴리머라제 θ 또는 δ(Yu and McVey, 2010; Lee and Lee, 2007))에 의해 채워지고, 파손은 리가제 I 또는 리가제 III/Xrcc1 복합체에 의해 이어진다.
DNA 말단에서 즉각적인 마이크로상동성 영역이 없을 때(대부분의 경우임), 수선된 분자의 더 원위의 단편은 정확한 DNA 폴리머라제(예를 들어 폴리머라제 θ)를 이용하여 복제될 수 있다. 이어서, 이 중복된 영역은 생성된 접합에서 삽입을 초래하는 DNA 말단의 배열에 참여한다. 마이크로상동성-매개 수선의 이런 더 복잡한 변이체는 합성-의존적 MMEJ(SD-MMEJ)로 칭해졌다(Yu and McVey, 2010).
MMEJ는 대안의 재조합 수선 경로로서 작용하는 것으로 생각되었지만, 이는 B 림프구에서 IgH 부류 전환 재조합의 과정에서 매우 효율적인 것으로 나타났는데(Boboila et al., 2010), 이는 백업 메커니즘보다 많을 수 있다는 것을 시사한다. 또한 일부 DSB, 예를 들어 부적격 돌출부 또는 평활말단불량한 NHEJ 및/또는 HR 표적임)은 MMEJ에 의해 더 효율적일 수 있다는 가능성이 있다(Zhang and Paull, 2005).
표 D는 3가지 경로 각각에서 일부 중요한 유전자를 열거하는데, 이는 따라서 또한 3가지 경로의 각각에 영향을 미치기 위한 중요한 표적이다(또한 미국 특허 공개 제20120231449호 참조, 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함됨). 또한 MDC1 및 MHS2와 같은 DNA 수선 단백질이 표에 포함된다. MDC1은 DNA 손상에 반응하여 S기 내 및 G2/M기 세포주기 검사점을 활성화하기 위해 필요로 된다. 그러나, MDC1은 또한 염색질에서 Rad51을 고정시킴으로써 Rad51-매개 상동성 재조합에서 기능한다.
본 발명의 내용에서 "넉다운"은 표적 유전자의 발현이 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상만큼 감소된다는 것을 전달한다. 완전한 넉다운은 표적 유전자의 검출가능한 발현이 더 이상 없다는 것을 의미한다. 표 D는 또한 특정 넉다운 표적에 의해 얻어진 결과를 나타낸다. 당업자가 인식할 바와 같이, 표적의 핵선 서열의 변이가 있고, 따라서, 유전자의 변이체, 특히 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 나타내는 변이체는 본 발명의 부분이다.
단백질 가공 및 대사 단백질
세포의 대사 유전자 조작을 위해 사용될 수 있는 단백질의 이런 범주는 단백질 분비 경로에도 재조합 경로에도 속하지 않지만, 다르게는 발현 세포에서 고유한 과정에 영향을 미친다.
단백질 가공 또는 대사 단백질은 종종 효소, 예컨대 샤페론(상기 샤페론의 정의), 단백질 이성질화효소, 당 첨가 효소(예를 들어, 시알릴 또는 글라이코실 트랜스퍼라제) 또는 포스파타제이거나, 또는 세포 에너지 수준 또는 미토콘드리아 기능을 제어한다.
표 A는 부표제 "단백질 가공 및 대사 단백질" 하에서 발현된(exp) 및/또는 발현이 "넉다운"(KD)된 단백질의 목록을 제시한다.
벡터 설계
비-바이러스 벡터 중에서, 트랜스포존은 숙주 게놈 내의 다수 자리에서 높은 빈도로 DNA 서열의 단일 복제물을 통합하는 그들의 능력 때문에 특히 매력적이다. 바이러스 벡터와 달리, 일부 트랜스포존은 세포의 유전자에 가깝게 우선적으로 통합되지 않는 것으로 보고되었고, 따라서 그들은 해로운 돌연변이를 도입할 가능성이 더 적다. 게다가, 일반적으로 역위 반복 서열에 측접한 화물 DNA(cargo DNA)를 함유하는 트랜스포존 공여체 플라스미드 및 트랜스포사제-발현 헬퍼 플라스미드 또는 mRNA를 포함하는 트랜스포존은 용이하게 생성되고 조작된다. 몇몇 트랜스포존 시스템은 내인성 트랜스포존 복제물을 간섭하는 일 없이 다양한 세포주에서 DNA를 이동시키기 위해 개발되었다. 예를 들어, 본래 남방은무늬밤나방으로부터 단리된 피기백(PB) 트랜스포존은 화물 DNA를 다양한 포유류 세포 내로 효율적으로 옮긴다.
후성적 조절 구성요소는 플라스미드 벡터 상에서 이식유전자 근처에 위치될 때 원치않는 후성적 효과로부터 화물 DNA를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 기질 부착 영역(matrix attachment region: MAR)으로 불리는 구성요소는 화물 DNA 게놈 통합 및 전사를 증가시키는 한편, 강한 인간 MAR 1-68에 의해 예시되는 바와 같이 이질염색질 침묵을 방지하는 것으로 제안되었다. 그들은 또한 절연체로서 작용할 수 있고, 이에 의해 이웃하는 세포 유전자의 활성화를 방지할 수 있다. 따라서 MAR 구성요소는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 관련하여 고발현 및 지속된 발현을 매개하기 위해 사용되었다.
본 명세서에 나타내는 바와 같이, 적절한 벡터 설계에 의해, 후성적 조절자, 특히 MAR 구성요소의 바람직한 특성은 전위성 벡터의 특성과 조합될 수 있다.
본 발명의 트랜스포존 및 트랜스포존 기반 벡터는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 상이한 분비 경로의 분비 단백질을 발현시키기 위해 세포의 대사적 유전자 조작에서 사용될 수 있다. 그들은 또한 다회의 화물 DNA 도입이 필요할 때 특히 유용하다. 이는 다수 벡터의 형질감염 및/또는 다수 성공적 형질감염 주기가 이용가능한 항생물질 또는 다른 선택 방법을 다 써 버릴 수 있는 경우, 세포 분비 경로의 다수 단백질을 시험할 때 확인되었다. 예를 들어 다수 치료적 단백질 후보가 선별 목적을 위해 발현되어야 할 때, 항생물질 선택에 대한 필요 없이 치료적 단백질을 빠르게 발현시키는 능력에 또한 특정 관심 대상이 있는데, 상당한 양의 단백질이 형질감염의 2 내지 3주에 비선택 세포 집단으로부터 얻어질 수 있기 때문이다. 특히, MAR-함유 트랜스포존 벡터는 따라서 발현 벡터의 현재 입수가능한 병기에 대한 촉망되는 첨가이다.
선택된 실험 접근은 (항생물질 기반 분석에 의존하는 접근과 반대로) (1) 화물 DNA 복제수에 기반한 효과와 (2) 화물 DNA 발현 수준에 기반한 효과 간의 차이를 허용하였다.
MAR 1-68은 피기백 트랜스포존의 IRT 사이의 중앙에 위치될 때 특히 효율적이었는데, 그것이 전위 효율을 감소시키지 않기 때문이다. MAR X-29는 또한 전위 효율 또는 발현을 감소시키는 일 없이 트랜스포존의 가장자리에서 잘 작용한다.
흥미롭게도, 전위된 유전자의 MAR-매개 활성화 정도는 자발적 플라스미드 통합의 활성화 정도에 비교할 때 감소되었다. 더 나아가, 발현 수준은, 예를 들어 이식유전자 복제물에 대해 정규화될 때, 트랜스포사제가 없는 플라스미드의 자발적 통합으로부터 얻어진 것보다 트랜스포존로부터 더 높았다. 이 효과는 작제물의 크기, MAR의 존재 또는 프로모터 강도에 상관없이 관찰되었다. 이는 상대적으로 발현에 관대한 게놈 자리에서 전위가 종종 일어날 수 있는지 여부를 예상하였는데, 예를 들어, 개방 염색질 구조는 트랜스포사제와 전사 인자 둘 다에 대해 더 접근가능할 수 있기 때문이다. 이와 관련하여, 이전의 연구는 이것이 논쟁 대상으로 남아있기는 하지만, 트랜스포존이 유전자 인트로 내에서, 프로모터에서 또는 게놈 자리에서 침묵에 대한 더 낮은 성향을 지니고 우선적으로 통합될 수 있다는 것을 시사하였다. 대안적으로, 자발적 통합 사건에 의해 유발된 바와 같은 동일한 게놈 자리에서 다수의 플라스미드 복제물의 공동통합은 이질염색질의 형성 및 MAR이 마주하는 반복적 서열의 침묵을 야기할 수 있는 반면, 단일-복제물 트랜스포존 통합은 이러한 염색질-매개 침묵에 대한 경향이 더 적을 수 있다. 추가로, 다수의 독립적 게놈 자리에서 트랜스포존의 통합은 적어도 하나의 복제물이 바람직한 게놈 환경에 도착하고 발현되는 것을 가능하게 하는 반면, 플라스미드 통합은 단지 하나의 게놈 자리에서 우세하게 생기는 것이 발견되었다.
화물 DNA 당 가장 높은 발현 수준, 예를 들어, 이식유전자/TER은 강한 프로모터에 결합될 때 MAR-함유 트랜스포존로부터 얻어진다. 고발현 수준이 소수의, 예를 들어 20, 15, 10 또는 5 이하의 전위된 화물 DNA 복제물로부터 얻어질 수 있었다는 것을 발견한 것은 놀라웠다. 그럼에도 불구하고 고생산성이 얻어질 수 있다면, 더 소수의 통합된, 예를 들어, 화물 DNA 복제물이 유리한데, 그것이 자발적 돌연변이유발 사건으로부터 유발되는 것과 같이 이식유전자 중 하나에서 또는 서브세트에서 점 돌연변이 발생 확률을 감소시키기 때문이다. 추가로, 트랜스포사제-매개 통합 사건은 부적격 또는 재배열 이식유전자 복제물을 야기할 수 있는 자발적 플라스미드 통합에 수반된 DNA 수선 및 재조합 메커니즘보다 돌연변이를 덜 유발한다.
피기백(PB) 트랜스포존에 의한 고효율의 게놈 통합은 또한 표적 세포의 양이, 예를 들어, 세포기반 요법 또는 재생의료를 위해 클론 집단을 생성하기 위해, 예를 들어 1차 줄기 세포 내로 치료적 유전자의 비-바이러스 전달을 위해 제한될 때 바람직하다. 이와 관련하여, 이런 이유로 항생물질 선택에 대한 필요를 제거한 소수의 전위된 화물 DNA 복제물로부터의 생리학적 발현 수준 및 전위 사건의 빈번한 발생은 유리한데, 항생물질 내성 유전자의 사용 및/또는 믿을 수 없는, 예를 들어 이식유전자 발현은 안전성 문제를 상승시킬 수 있기 때문이다.
전위 효율에 대한 MAR 봉입의 효과
항생물질 내성이 효율적인 이식유전자 발현을 반드시 반영하지는 않기 때문에, 강한 GAPDH 세포 프로모터 유도체로부터 발현된 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP)이 지표로서 사용되었다. PB 트랜스포존에 MAR 구성요소를 첨가하는 것이 전위 효율 및 이식유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 그리고 작제물 내 MAR의 위치가 이들 효과에 임의의 영향을 가지는지 여부를 평가하기 위해, GFP 및 퓨로마이신 내성(퓨로) 유전자를 함유하는 일련의 트랜스포존 공여체 작제물을 설계하였고, 이때 MAR 1-68 또는 대조군 중성 스페이서 DNA 서열을 플라스미드 내 상이한 위치에 삽입하였다(도 1). MAR 또는 스페이서 서열 첨가의 효과에 비해 증가된 트랜스포존 크기의 영향을 구별하기 위하여 삽입이 없는 모 퓨로-GFP 트랜스포존 플라스미드를 전위의 대조군으로서 사용하였다.
트랜스포사제의 존재에서, MAR이 중앙에 위치될 때, 그러나 MAR이 GFP 암호 서열의 하류에 위치되지도 않고 예상한 바와 같이 전위된 서열 밖에 삽입되지도 않을 때, 비선택 세포로부터의 가장 높은 GFP 발현을 관찰하였다(도 3A). 퓨로마이신 선택의 존재에서, MAR-매개 활성화는 트랜스포사제와 함께 또는 트랜스포사제 없이 감소된 반면, GFP 발현 평균은 10배만큼 증가되었다(도 3B). 이는 퓨로마이신 선택이 전위 사건의 정량화로부터 상기 제안된 바와 같이 가장 높은 발현 수준을 나타내는 대다수의 세포만을 수득하였다는 것을 확인하였다. 추가로 중앙에 위치된 MAR을 함유하는 전위성 벡터는 트랜스포사제 없이 형질감염된 그들의 플라스미드 상대와 비교할 때 유사한 발현 수준을 수득하였다는 것을 추가로 나타내었다.
통합된 트랜스포존의 복제수에 대한 MAR 봉입의 효과
더 높은 GFP 형광 수준은 이식유전자의 증가된 전사로부터 및/또는 더 많은 이식유전자 복제물에 의해 초래될 수 있다. 이는 다양한 유형의 벡터로부터 초래되는 게놈-통합된 이식유전자 복제물의 수를 정량화함으로써 평가되었다. 비선택 집단으로부터 형광 세포의 세포형광 분류 후에 또는 퓨로마이신 내성에 대한 선택 후에 총 게놈 DNA는 세포의 풀링된 집단으로부터 단리되었다. 이식유전자 복제수는 세포의 β2-마이크로글로불린(B2M) 유전자에 대한 GFP 암호 서열의 정량적 폴리머라제 연쇄반응(qPCR) 분석에 의해 결정되었다. 항생물질 선택 없이, 트랜스포사제 또는 세포의 재조합 효소에 의해 통합된 이식유전자의 평균수는 게놈 당 약 1 내지 6개 복제물로 유사하였고, 그들은 MAR 또는 제어서열에 의해 상당하게 영향받지 않았다(도 4A). 그러나, MAR이 트랜스포존 가장자리에 포함되었을 때 가장 낮은 복제수가 얻어졌고, 이는 그것이 이 위치에서 전위를 감소시킨다는 본 발명자들의 더 앞선 결론을 뒷받침한다. 퓨로마이신과 함께 세포를 고도로 발현시키기 위한 선택 후에, 전위된 이식유전자의 수는 유사한 2 내지 7개 복제 범위에 있었다(도 4B). 그러나, 트랜스포사제 없이 통합된 이식유전자 복제물의 수는 6 내지 14개 복제물의 범위로 일반적으로 상당히 더 높았다. 이는 자발적 통합이 보통 단일 게놈 자리에서 다수 플라스미드 복제물의 연쇄동일순서의 통합을 야기하고(결과 미제시) 더 높은 이식유전자 복제수는 침묵 효과를 받은 세포가 항생물질 선택에 의해 제거되었을 때 더 높은 발현 수준을 야기하여야 한다는 사실에 의해 용이하게 설명될 수 있다. 항생물질 선택이 고도로 발현된 세포를 우선적으로 수득한다는 이전의 결과와 함께, 이는 또한 자발적 플라스미드 통합이 전위성 벡터보다 더 가변적 수의 이식유전자 복제물을 초래한다는 것을 나타내었다.
이어서, GFP 발현은 게놈 내에서 통합하기 위한 그들의 성향과 독립적으로 벡터의 고유한 발현 잠재력을 평가하기 위하여 유전자 복제수에 대해 정규화되었다. 전반적으로, 이식유전자 복제물 당 더 낮은 발현이 비선택 세포로부터 또는 트랜스포사제 또는 중앙에 위치된 MAR 없이 형질감염된 항생물질-선택 세포로부터 얻어졌는데, 이는 이식유전자 발현이 후성적 조절 구성요소의 봉입에 의해 그리고 이식유전자 통합 방식에 의해 영향받는다는 것을 나타낸다(도 5). 유전자 복제물 당 발현은 다양한 벡터 및 구성요소의 조합으로부터 평가될 때 일반적으로 트랜스포사제에 의해 증가되었고, 이는 항생물질 선택에 의해 또는 항생물질 선택 없이 관찰되었다. 트랜스포사제의 존재에서 중앙에 위치된 MAR 구성요소를 함유하는 트랜스포존 벡터에 의해 생성된 세포로부터 항생물질 선택 후에 이식유전자 복제물 당 가장 높은 수준의 발현이 얻어졌다. GFP 암호 서열 바로 하류의 MAR의 봉입은 발현의 절대 수준에 대해 더 앞서 언급된 바와 같이 상당하게 이식유전자 발현을 증가시키지 않았다.
최종적으로, 발현에 대한 MAR 1-68의 바람직한 효과가 본 명세서에서 사용되는 강한 인간 GAPDH 프로모터에 대해 특이적일 수 있는지 여부, 또는 그것이 다른 프로모터에 의해 일어나는지 여부를 평가하였다. 따라서, 본 발명자들은 GFP 발현을 구동시키는 인간 GAPDH 프로모터를 더 약한 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터에 의해 대체하였다. 더 약한 프로모터의 사용은 비슷한 수의 GFP-양성 세포 및 통합된 이식유전자를 수득하였는데, 이는 전위 효율이 이식유전자 발현에 의해 변용되지 않는다는 것을 나타낸다(결과 미제시, 도 2A 및 도 4B). 그러나, 발현의 절대 수준은 SV40 프로모터에 의해 더 낮아졌다(미제시 대 도 3B). 추가로, 트랜스포존 복제수에 대해 정규화된 발현은 MAR이 없는 SV40 프로모터의 사용에 의해 4.6배만큼, 그리고 MAR 1-68에 의해 3.1배만큼 감소되었다(결과 미제시). 이는 MAR이 트랜스포사제의 존재에서조차 더 약한 프로모터의 사용으로부처 초래되는 발현을 완전히는 아니지만 부분적으로 방지할 수 있었다는 것을 나타내었다. 전반적으로, 소수의 통합된 복제물은 트랜스포존로부터 높은 이식유전자 발현을 얻는데 충분하고, 이와 관련하여 MAR-68이 강한 프로모터의 상류에 위치될 때 이식유전자 당 가장 높은 발현이 얻어진다는 것을 나타낼 수 있었다.
CHO-M 세포는 이식유전자 MAR X_29-함유 전위성 벡터를 이용하여 1회 또는 2회 전기천공되었다. 전위 효율은 전기천공법 후에 가장 높았다(30% 내지 45%의 세포는 안정한 발현을 나타내었다). 그러나, 이식유전자 발현 수준은 더 낮은 양성 세포를 나타내고, 따라서 더 낮은 전위 효율을 나타내는 화학적 형질감염과 유사하였다. 도 7은 1 내지 8㎍/㎖의 범위에 있는 표제 및 MAR X_29 상류에 삽입된 치료적 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄에 의한 결과가 얻어졌음을 나타낸다. 발현 세포를 분류함으로써 수준을 23 내지 55㎍/㎖까지 추가로 증가시켰다(도 7C).
이식유전자의 발현은 또한 구체적 벡터 설계에 의해, 특히 이식유전자에 대한 특이적 위치에서 특이적 MAR 구성요소(들) 및 바람직하게는 프로모터, 인핸서 또는 이들의 융합물과 해당 MAR 구성요소(들)의 조합의 사용에 의해 트랜스포존의 사용과 종종 독립적으로 실질적으로 증가될 수 있다.
각각의 벡터는 이식유전자 발현 카세트에 측접하는 MAR을 함유할 수 있다. 예를 들어, 벡터는, 예를 들어, 상류의 MAR(하나 이상의) 및 하류의 MAR(하나 이상의), 예를 들어, 이식유전자 발현 카세트 상류에 위치된 하나의 MAR 및 하류에 위치된 하나의 MAR을 함유할 수 있다(도 18A, 도 18B, 도 19). 벡터는 SV40 프로모터의 제어 하에 통합된 퓨로마이신 내성 유전자를 함유할 수 있다. 이식유전자는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 전초기 유전자 인핸서(특히 상기 논의한 바와 같은 CGAPD 융합 프로모터)에 융합된 인간 GAPDH 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
FACS 분석 및 최소 가변성에 의해 GFP 형광에 대해 평가한 바와 같이 가장 높은 백분율의 높은 및 매우 높은 생성자 세포(% M3/M2)가 상류의 MAR로서 1_6R2, 1_68R2 및 X_29R3을 사용하여 얻어질 수 있었다(80% 초과, 80% 및 80% 초과). 따라서, 70% 초과 75% 또는 80% 초과의 높은 및 매우 높은 생성자 세포의 백분율(% M3/M2)은 제대로 본 발명의 범주 내이다. 당업자가 이해할 바와 같이, 이들 MAR의 구체적 서열로부터의 특정 편차는 허용된다. 따라서, 서열번호 6, 7, 8, 9 및 10과 80%, 85%, 90%, 95% 초과의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 함유하는 벡터는 본 발명의 범주 내에 있다(도 18A, 도 18B).
생물반응기 내에서 및/또는 선택 압력 없이 발현의 상실은 종종 관심 대상 단백질의 회수를 제한한다. 상류의 MAR로서 1_68R2, 1_6R2 및 X_29R3 MAR 유도체를 함유하는 벡터를 선택 없이 배양의 5주 기간에 걸쳐 시험하였고, GFP 형광을 이 기간에 걸쳐 매주 평가하였다. M3 하위집단의 백분율을 고려할 때, 상류의 MAR로서 1_6R2 구성요소 및 하류의 MAR로서 재배열되지 않은 MAR 1-68은 적어도 하나의 상류 및 하나의 하류의 2개 MAR를 지니는 벡터에서 가장 잘 시험된 조합이라는 것을 발견하였다(2, 3, 4주 초과 후에 80%보다 훨씬 초과)(도 19 참조).
유사하게 설계된 벡터는 또한, 예를 들어, 단지 하류의 MAR(하나 이상), 예를 들어, 이식유전자 발현 카세트 하류에 위치된 하나의 MAR(도 20A, 20B, 21 및 22)를 함유하고 상류의 MAR을 함유하지 않을 수 있다. 벡터는 또한 이 경우에 SV40 프로모터의 제어 하에서 통합된 퓨로마이신 내성 유전자를 함유할 수 있다. 이식유전자는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 전초기 유전자 인핸서에 융합된 인간 GAPDH 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 서열번호 11은 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 서열 동일성을 갖는 다른 것임을 참조한다. MAR로서 X_29를 지니는 이러한 단일 MAR 무리에서 우수한 결과가 달성되었다. 높은 GFP 발현 세포의 백분율(상기와 같이 결정됨) 및 또한 시간에 따른 발현 안정성(상기와 같이 결정)은 MAR이 이식유전자 발현 카세트에 측접한 고성능 벡터, 즉, 상류의 MAR 1_6R2 및 하류의 재배열되지 않은 MAR 1-68을 포함하는 벡터보다 더 양호하다(도 22 참조). 이 발견은 MAR이 이식유전자에 측접할 때 가장 효과적이라는 잘 확립된 추측과 대조적이다(미국 특허 제5,731,178호 참조). 발현의 안정성은 관심 대상 DNA, 예를 들어 이식유전자가 특정 시간 기간 후, 예를 들어 비슷한 속도로(20% 이하, 10% 또는 5% 미만) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주 초과 후조차 그리고 특히 발현 개시의 2주까지 훨씬 더 높게 세포 집단에 의해 발현된다는 것을 의미한다. 종종 안정한 발현은 높은 백분율(예를 들어, 80% 초과) 또는 고도로 발현되는 세포의 하위집단과 관련된다.
세포의 대사 유전자 조작: 분비 단백질
IgG와 같은 비상동 단백질의 분비는 CHO 세포와 같은 배양 세포에서 부적절한 폴리펩타이드 가공 및 낮은 IgG 생성에 의해 작아진다.
스트레스-유도 샤페론 유사 Bip의 발현이 유도되고 샤페론은 ER 내에서 정확하게 국소화되며 IgG 전구체 쇄와 상호작용할 수 있다는 것이 관찰되었다. 그러나, 인플릭시맙에서 발견된 것과 같은 특정 가변 서열을 함유하는 IgG는 그럼에도 불구하고 부정확하게 가공 및 조립되는데, 이는 불량한 분비를 야기한다. 따라서, 이들 세포에서 UPR 반응의 활성화는 상당한 수준의 면역글로불린을 동원함에 있어 비효과적으로 남아있다.
SRP14는 외인성 단백질을 과발현시키는 CHO 세포에서 제한되는 분비 경로의 분자 단계에 연루된 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 이 제한 단계는 또한 높은 발현자 클론을 용이하게 야기하는 발현이 쉬운 트라스투주맙에 대해 또한 일어난다. 이 결론은 인간 SRP14의 발현이 LP 클론의 발현을 용이하게 회복하였지만, 이는 또한 용이하게 발현된 IgG의 분비를 증가시켰다는 발견에 따랐다. SRP14 발현은 LC 및 HC 전구체의 가공 및 이용가능성을 증가시키고, IgG의 유형 둘 다에 대해 비슷한 수준의 분비를 수득한 것이 발견되었다. 전반적으로, SRP14는 IgG와 같은 분비된 단백질이 CHO 세포에서 과발현될 때 일반적으로 제한될 수 있는 것으로 입증되었다.
이 연구에서 관찰된 바와 같은 CHO 세포에서 SRP14의 발현으로부터 얻어진 강한 효과는 예상되지 않았고, SRP14가 생성이 어려운 IgG 생성자 클론에서 LC 신장의 지연을 연장시킨다는 것을 시사하였다(도 12B, 1 지점).
이전의 작업은 번역 리보솜으로부터 나온 신호 펩타이드가 SRP 입자의 SRP54 서브유닛과 처음 상호작용하는 한편, SRP9 및 SRP14와의 결합은 초기 폴리펩타이드의 추가 신장을 차단하여 번역 중단을 야기할 수 있다는 것을 나타내었다(Walter and Blobel 1981). 제2 단계에서, 리보솜-초기 폴리펩타이드-SRP 복합체는 SR 수용체와 그의 상호작용을 통해 ER 막에 도킹한다(Gilmore et al., 1982; Walter et al., 1982). 이어서, SR은 리보솜-초기 폴리펩타이드 복합체로부터의 SRP의 방출 및 성장하는 초기 폴리펩타이드가 ER로 유입되는 트랜스로콘 통로를 지니는 리보솜 부위의 결합을 조정할 수 있다(Lakkaraju et al., 2008). 이어서, 번역-결합된 전위는 신호 펩타이드의 제거 및 적절하게 가공되고 분비된 폴리펩타이드의 합성을 야기하도록 재개될 수 있다.
발현이 어려운 IgG의 적절한 가공은 초기 펩타이드의 바람직하지 않은 구조 때문에 ER에 대한 도킹의 역학이 IgG 가변 도메인과 신호 펩타이드 서열의 특정 조합에 대해 더 느려질 수 있다면, 대단히 긴 번역 정지를 필요로 할 수 있다. 따라서, 외인성 인간 SRP14 구성성분의 발현에 의한 번역 중단 역학의 조절은 결국 전-LC의 적절한 ER 도킹 및 전위를 개선시키고, 따라서 신호 펩타이드의 효율적인 가공을 회복하는 것으로 고려되었다(도 12B, 2 지점). 일치되게, 인간 세포에서 SRP14 수준을 낮추는 것은 폴리솜에서 번역 신장 지연의 결여를 야기하는데, 이는 결정적 길이 이상의 초기 폴리펩타이드의 과발현을 초래할 수 있고, 이후에 SRP는 분비된 단백질을 ER에 대해 더 이상 적절하게 표적화하지 않을 수도 있다. 따라서, CHO 세포 SRP14, 및 가능하게는 또한 SRP54는 비상동 인간 인플릭시맙 단백질의 신호 서열에 대해 감소된 친화도를 가져서 부정확한 ER 도킹 및/또는 적절한 도킹 전의 초기 펩타이드의 신장이 일어나는 것을 야기한다. 이는 ER 게이트에서 생기는 과발현된 IgG 단백질의 '분자잼(molecular jam)'에도 불구하고 정지된 리보솜-SRP 복합체가 ER에 대해 적절하게 조직화된 도킹 부위를 찾을 수 있는 시간 기간 동안의 늘이기를 인간 SRP14의 과발현에 의해 수정한다.
일치되게, 전위에 관하여 ER 능력을 증가시킬 수 있는 SR 및 트랜스로콘의 과발현은 또한 인간 SRP14 과발현이 없을 때 조차 분비의 개선을 야기하였다. 최종적으로, 인간 SRP, 트랜스로콘 및 SR 서브유닛의 조합의 과발현에 의한 분비 경로의 대사 유전자 조작은 단백질 분비 세포 능력의 추가 개선을 야기하여 심지어 더 높은 분비 수준을 수득한다는 것을 입증하였다. 전반적으로, SRP 단백질, 그의 수용체 및 트랜스로콘은 인간 면역글로불린과 같은 분비된 단백질이 CHO 세포에 의해 과발현될 때 일반적으로 제한될 수 있다는 결론이 내려졌다.
상이한 세포 유형에서 분비된 단백질 및 리보솜에 대한 SRP 및 ER 막 구성성분의 대략의 존재비는 거의 알려져 있지 않지만, 생각건대 다량의 재조합 단백질을 발현시키는 세포에서 전위 결합이 일어날 수 있다. 예를 들어, SR 및/또는 트랜스로콘은 분비된 단백질이 비정상적으로 고수준에서 발현될 때 제한될 수 있거나, 또는 SRP14은 다른 SRP 서브유닛에 대해 CHO 세포에서 하위-화학량론적 수준에서 생길 수 있다. 일치되게, SRP9 및 SRP14은 영장류 세포에서 다른 SRP 단백질 이상으로 20배 과량으로 존재하지만, 마우스 세포에서는 그렇지 않고, 정상 인간 세포 내 인간 SRP14의 과발현은 알칼린 포스파타젠의 분비 효율을 증가사키지 않았다. 더 나아가, 인간 SRP14는 그의 설치류 상대보다 더 큰데, 그것이 설치류 SRP14에서 발견되지 않은 그의 C-말단에서 알라닌-풍부 꼬리를 함유하기 때문이다. 따라서, CHO SRP 내 더 큰 인간 SRP14의 혼입은 우세한-긍정적 효과에서 더 높은 활성의 기능성 SRP 키메라 형성을 야기할 수 있다.
SRP14와 같은 사이토졸 SRP 구성성분의 발현이 CHO 세포에서 과발현된 단백질의 효율적인 가공 및 분비를 야기한다는 발견은 재조합 단백질 수율을 개선시키기 위해 사용될 수 있는 병목현상을 시사한다. 이 병목현상은 별개의 그리고 관련없는 IgG의 발현 및 가능하게는 또한 재조합 치료적 단백질의 훨씬 가장 흔한 부류를 구성하는 수많은 다른 단클론성 항체 및 유도체의 발현을 제한한다.
분비 중간체 및 가능한 세포 스트레스 반응의 분석 다음에 이러한 스트레스 반응을 야기하는 상류의 제한 활성의 체계적 검색, 및 이어서, CHO 세포 분비 메커니즘의 유전자 조작에 의한 마무리는 이들 세포의 대사적 제한의 더 양호한 이해 및 그들을 처리하는 방법을 야기하였다.
SRP14의 비상동 발현은 분비 및 LC 가공을 회복한다
IgG의 HP(고 생성자) 및 LP(저 생성자) 클론은 SRP의 SRP14 구성요소를 암호화하는 벡터로 그리고 네오마이신 내성 플라스미드로 공동 형질감염되었다. 네오마이신-내성 풀에서 개개 세포는 희석을 제한하고 후속적으로 진탕 배양 접시 배취에서 성장 및 면역글로불린 분비에 대해 시험함으로써 분리되었다. SRP14-발현 LP-유래 서브클론은 배양 내내 그들의 모 상대보다 상당히 더 많은 양의 항체를 분비하였고, 그들은 HP SRP14-발현 서브클론과 유사한 면역글로불린 역가를 수득하였다(도 8A 및 도 8B, 좌측 패널).
SRP14의 발현은 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않았지만, 유사한 세포 밀도까지 HP 세포 배양물의 성장을 늦추고 연장시키는 것으로 나타났다(도 8A 및 도 8B, 우측 패널). 다양한 서브클론의 배양 상청액을 수집하고 나서 항체 농도에 대해 분석하였다. 도 8C에 나타낸 바와 같이, SRP14 발현은 LP 세포로부터의 분비를 향상시켰는데, 이는 IgG 구체적 생산성의 7배 증가를 야기하였다. 게다가, SRP14의 외인성 발현은 또한 HP 서브클론으로부터의 IgG 분비를 개선시켰는데, 이는 구체적 생산성의 30% 증가를 야기하였다. 흥미롭게도, SRP14를 발현시키는 개개 서브클론은 본질적으로 동일한 평균 속도로 발현이 어려운 IgG와 발현이 쉬운 IgG를 분비하였고, 중앙값 특이성 생산성은 세포 당 그리고 1일 당(pcd) 30 피코그램을 초과한다. 이런 매우 높은 IgG 분비 수준을 6개월 초과의 배양 동안 유지하였는데, 이는 SRP14-발현 세포의 안정한 특성을 나타낸다.
SRP14 발현과 IgG 생산성 간의 관계를 추가로 조사하기 위해, 5개 개개 SRP14-발현 LP 서브클론의 SRP14 mRNA 수준을 상대적 정량적 PCR에 의해 분석하였다. 도 8D에 나타낸 바와 같이, 서브클론은 내인성 CHO 세포 SRP14 mRNA의 50 내지 거의 200배 범위의 수준에서 SRP14를 과발현시켰다. 이는 LP 대조군 세포 클론에 비해 4 내지 6배의 IgG 분비 향상을 수반하였다. 흥미롭게도, 가장 높은 구체적 생산성은 CHO 세포 내인성 SRP14 mRNA(SRP14-LP 서브클론 E, 제시하지 않음)의 대략 100배 이상의 중간 수준에서 SRP14를 과발현시키는 서브클론으로부터 얻어졌다. 이는 내인성 발현 수준보다 100배 증가에 대응하는 SRP14의 역치값까지 SRP14 과발현 및 IgG 구체적 생산성 수준의 상호의존성을 나타내었다. 이는 분비 경로의 다른 구성성분이 결국 매우 고수준의 SRP14를 제한할 수 있고, 경로 구성성분의 균형 잡힌 발현이 최적의 IgG 발현에 필요로 될 수 있다는 것을 시사하였다.
클론의 세포주 평가 동안 얻은 증가된 구체적 생산성이 생성 과정에 적용될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 최상의 HP 및 LP SRP14-발현 서브클론을 유가식 조건에서 진탕 배양 접시 내에서 시험하였다(즉, 도 8의 LP 서브클론 E 및 HP 서브클론 B). SRP14-발현 LP 서브클론은 최대 8x106개 세포/㎖ 및 생성 실행의 마지막에 리터 당 2g 초과를 지니는 SRP14-발현 HP 서브클론보다 유사하게 높은 수의 살아있는 세포 및 면역글로불린 역가를 수득하였다(도 9A 및 도 9B).
이들 두 서브클론에 대한 면역글로불린 합성에 대한 SRP14 과발현의 영향을 다음에 시험하였다. 이는 LP-유래 서브클론에서 인간 SRP14의 발현이 폴딩 및 IgG 조립체에 대해 정상적 가공 및 성숙 LC 적격을 야기한다는 것을 나타내었다(도 10A, LP 레인 S 대 레인 -). 유리 HC의 이동은 영향받지 않았는데, 이는 SRP14 발현이, 발현이 어려운 단백질의 오가공된 LC에 대해 특이적으로 작동되었다는 것을 나타낸다. 현저하게, SRP14 발현은 트리톤 X-불용성 분획에서 응집화된 LC의 축적을 완전히 없앴다(도 9A, 하부 패널). 대조군 GFP 단백질의 발현은 단백질 용해도를 개선시키지도 않았고, LC의 적절한 가공을 회복하지도 않았다(도 10A, LP 세포의 레인 G). SRP14의 발현은 HP 서브클론으로부터 얻은 HC 및 LC 이동 패턴에 대해 효과가 없었고, 대조군과 비교할 때 유리 쇄 및 완전히 조립된 IgG의 양에 대한 효과는 거의 관찰되지 않았다(도 10A, HP 세포의 레인 G).
IgG 폴딩 및 조립체 역학뿐만 아니라 SRP14-발현 인플릭시맙 생성자 서브클론에서 IgG 응집물의 운명을 조사하기 위해 사이클로헥스이미드 기반 추적 분석을 수행하였다. IgG 조립체에 대해 응집된 LC 부적격을 나타내는 모 LP 세포와 대조적으로, SRP14-발현 LP 서브클론은 Tx-100 불용성 LC를 더 이상 축적하지 않았다(도 9B, 하부 패널). 그러나, 또한 유리 HP 세포에 대해 언급한 바와 같이, 유리 LC는 유리 HC에 비해 소량으로 남아있었는데, 이는 그것이 HC-LC 이합체 및 성숙 IgG 내로 빠르게 혼입되고, 그것이 IgG 조립체를 제한할 수 있다는 것을 나타낸다(도 9A 및 도 9B). 종합적으로, 이들 결과는 SRP14가 LP 세포에 의해 LC 가공에서 필수적 역할을 할 수 있고, 추가적인 SRP 단백질 발현이 유사한 수준까지 발현이 어려운 IgG 및 발현이 쉬운 IgG의 분비를 개선시킬 수 있었다는 것을 나타내었다.
ER 전위의 유전자 조작은 재조합 IgG 분비를 개선시킨다
비상동 SRP14의 과발현이 주어진 역치까지 IgG 분비를 증가시켰다는 것을 고려해볼 때, SRP14와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 분비 경로의 다른 구성성분은 SRP14-LP 서브클론에서 제한적이 될 수 있다는 것이 추론되었다. 따라서, 본 발명자들은 분비 경로의 다른 구성성분의 과발현이 또한 단독으로 또는 SRP14와 조합하여 IgG 발현을 개선시킬 수 있는지 여부를 탐구하였다. 이들은 SRP14와 함께 SRP 복합체를 구성하는 인간 SRP9 및 SRP54 단백질, 및 SRP 수용체(SRP receptor: SR)의 서브유닛 및 트랜스로콘의 Sec61α, β 및 γ 서브유닛을 포함하였다.
실험의 제1 세트에서, 최고로 성능의 LP 클론, 즉, 도 1의 LP 클론 E는 단독으로 또는 조합으로 SRP 단백질 또는 트랜스로콘 단백질을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염되었다. 이어서, 얻어진 LP 다클론성 세포 풀은 배취 배양에서 IgG 생성에 대해 평가되었다. SRP 구성성분의 발현 또는 트랜스로콘 단백질의 발현은 이들 재형질감염된 LP 다클론성 세포 풀로부터 면역글로불린 분비를 증가시켰다(도 11A 및 데이터 미제시). SRP14 발현 단독과 비교하여, SRP 단백질 조합의 과발현 또는 트랜스로콘의 과발현은 추가적인 20% 내지 40%까지 형질감염된-LP 다클론성 세포 풀의 구체적 생산성을 개선시켰다(도 11A, 중앙값의 비교). 이들 결과는 3개 SRP 폴리펩타이드 및 그의 수용체(SR)의 발현 또는 SR과 트랜스로콘의 공동 발현으로 이루어진 것과 같은 특정 조합이 SRP14 발현 단독보다 인플릭시맙 분비를 회복하는데 더 강력하였다는 것을 명확히 나타내었다(도 11A).
SRP14-발현 LP 서브클론 E가 SR 및/또는 트랜스로콘 조합의 발현에 의해 추가로 최적화될 수 있는지 여부가 또한 평가되었다. SRP14-LP 서브클론 E의 30 pcd에 비해, 다클론성 세포 풀은 SR 단백질에 의한 형질감염 후에 선택되었고, 트랜스로콘은 발현이 어려운 면역글로불린에 대해 60 pcd 초과로 구체적 생산성을 수득하였다(도 10B). SR 단백질 및 트랜스로콘 발현 벡터는 또한 SRP14-LP 클론 E에 비해 증가된 구체적 생산성을 지니는 클론을 생성하기 위해 사용될 수 있고, 일련의 연속된 형질감염 및 선택 주기에 기반한 접근이 성공적으로 적용될 수 있다는 결론을 내렸다.
세포의 대사적 유전자 조작: TEP 및 TEP 기능성 RNA의 재조합 경로 및 발현의 넉다운
재조합에 영향을 미치기 위해, 중요한 DNA 재조합 유전자는 침묵이 될 수 있다. 넉다운을 위한 표적은 포유류에서 특정 재조합 수복 경로에 대해 중요한 문헌으로부터 공지된 유전자이다(표 D). 대부분의 이들 유전자가 세포 생존 및 발생에 필수적이기 때문에, 그들의 영구적인 침묵은 감소된 세포 생존능력을 야기할 수 있다. 따라서, RNA 간섭(RNAi)을 이용하여 일시적으로 이들 표적 유전자를 침묵시키는 것이 바람직하다.
NHEJ의 제1 단계에 수반된 인자, 즉, Ku 70, Ku80 및 DNA-PKcs(단백질 당 하나의 siRNA 듀플렉스)에 대한 siRNA의 혼합에 의해 처리된 세포에서, NHEJ 사건의 빈도는 비처리 세포에서 상당히 더 낮았다. 대신에 HR은 이들 세포에서 더 효율적이었는데, 이는 감소된 NHEJ 대 HR 비(2.7:1 내지 1.3:1)를 야기하였다. 대조적으로, 본래의 HR 인자 - Rad51에 대해 표적화된 siRNA로 처리한 세포에서, HR-의존적 GFP 재구성은 거의 완전히 없어졌는데, 이는 NHEJ:HR 비를 5:1로 증가시켰다. 이들 결과는 HR 및 NHEJ 리포터 분석이 염색체 밖 형태에서 사용되기에 충분히 민감하다는 것을 나타내는 것으로 보인다. 그들은 또한 이전에 사용된 CHO 돌연변이체 세포주의 신뢰성에 추가로 도전한다(특히, 51D1 세포, 본래 HR-음성 세포로서 공개되었지만, 겉보기에는 이 분석에 따라 HR을 수행할 수 있음 - 데이터 미제시).
MAR의 존재에서 GFP 발현 및 통합의 증가. 병행 실험에서, 상이한 항-HR 또는 항-NHEJ siRNA로 처리한 CHO 세포는 GFP 또는 MAR-GFP 함유 플라스미드로 형질감염되었다. 항생물질 선택의 2주 후에, 세포는 각각 FACS 및 qPCR에 의해 GFP 발현 및 통합에 대해 분석되었다. 시험한 모든 조건에서, MAR의 첨가는 MAR이 없는 플라스미드로 형질감염된 세포에 비해 GFP 발현의 4 내지 5배 증가를 초래하였는데(도 13, 도 14A), 이는 이전의 보고와 비슷하다(Grandjean et al., 2011). 이 증가는 MAR이 없는 벡터를 받은 세포에 비해 MAR-GFP 플라스미드로 형질감염된 세포에서 통합된 GFP 복제수의 대략 3배 증가를 수반하였다(도 13, 도 14B). 또한 가능하게는 통합 부위의 더 바람직한 국소화에 기인하여(예를 들어, 진정염색질이 풍부한 영역에서) 유전자 복제물 당 평균 GFP 형광에서 2배 증가가 있었다(도 13, 도 14C). 따라서, MAR 구성요소가 유전자 발현을 허용하는 게놈 자리에 유전자를 보내는 능력을 갖는다는 가설을 세울 수 있었다. 항HR siRNA와 MAR의 조합(siRNA: RAD51, Rad51C 및 Brca1)은 상기 11의 평규 GFP 발현에서 배수적 변화를 야기한 반면, 단일 항HR-siRNA(si:RNA: Rad51은 9 미만의 배수적 변화를 야기하였다. MAR과 siMMEJ siRNA의 조합과 같은 다른 조합은 단일 siRNA에 비해 개선된 발현을 야기하였다(데이터 미제시). 따라서, 동일 또는 상이한 대사 경로, 특히 재조합 경로에서 표적과 상이한 siRNA의 조합(2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10)은 본 발명의 범주 내이다.
이식유전자 발현 및 통합에 대한 NHEJ 유전자 넉다운의 효과 없음. NHEJ 단백질에 대한 siRNA로 처리는 안정한 이식유전자 발현에 상당히 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 또한 비처리 세포에 비해 게놈에서 GFP 복제수의 상당한 변화가 없었다(-53BP1 siRNA로 처리한 세포는 제외하지만, 단지 MAR이 없을 때, 항비처리 세포 경로에 의한 재조합과 달리 가능하게 효과를 나타냄).
HR 인자가 없을 때 이식유전자 발현 및 통합의 증가. NHEJ 인자의 넉다운과 대조적으로, HR 단백질에 대한 siRNA의 존재는 비처리 세포에 비해 안정한 GFP 발현의 상당한 증가를 종종 야기하였다(Brca2를 제외, 이에 대해 상당한 감소가 있었지만, 또한 단지 MAR이 없음)(도 15A). NHEJ 유전자의 침묵이 있는 경우와 같이, MAR의 존재는 증가된 안정한 GFP 발현 및 통합뿐만 아니라 유전자 복제물 당 발현을 야기하였다. 그러나 이번에는 HR 인자의 침묵은 5 내지 7배만큼 효과를 향상시켰는데(가장 두드러진 것은 Rad51의 넉다운이 7.4배 더 높은 GFP 발현 수준에 도달하는 것임)(도 15A), 이는 HR 단백질이 이식유전자 발현에 p대한 MAR 구성요소의 긍정적 효과에 대응한다는 것을 나타낼 수 있었다. MAR에 없을 때, GFP 발현의 증가는 게놈에서 상승된 GFP 복제수와 관련되었다(결과 미제시). 놀랍게도, 이는 MAR이 존재하는 경우는 아니며, 복제수에서 MAR-매개 증가는 HR 단백질 넉다운에 의해 영향받지 않는다는 것을 나타낸다(Rad51D siRNA를 제외함). 이는 기능성 HR 수선 경로의 부재가 MAR에 의해 촉진된 재조합 사건의 수를 향상시키지 않는다는 것을 시사하는 것으로 보인다. 대신에, 그것의 더 효율적인 발현을 고려하는 더 바람직한 자리에서 MAR 및 이식유전자의 통합을 자극할 수 있다. 이 관점은 또한 항-HR siRNA로 처리한 세포에서 MAR의 존재 하에 개개 GFP 복제물의 상승된 발현에 의해 지지된다(도 14C). 다른 가능성은 게놈 내로 통합된 플라스미드 복제물의 수가 대조군 세포에서 이미 그의 최대값에 있고(여기서 사용되는 플라스미드 DNA의 양에 의함) MAR에 대해 더 유리한 조건에서조차 추가로 증가될 수 없다는 것이다.
이들 결과는 함께 NHEJ의 구성성분의 넉다운이 통합 또는 발현에 대해 효과를 갖지 않기 때문에 NHEJ의 가능성이 없다고 해도, MAR-매개 이식유전자 통합의 과정이 상동성 재조합과 반대되는 경로에 의해 우선적으로 매개된다는 것을 시사한다. 이 대안의 경로는 기능성 HR 경로의 존재에서 덜 활성이지만 HR이 망가진다면 더 중요하게 되는 것으로 가설을 세울 수 있었다.
치료적 단백질의 발현을 증가시키기 위한 항-HR shRNA의 발현
3개의 siRNA 표적화 Rad51을 헤어핀 구조를 형성하는 shRNA 서열로 전환하고 나서, shRNA 암호 서열을 GAPDH 인핸서 및 CMV 프로모터 융합의 제어 하에 피기백 트랜스포존 벡터 다음에 MAR X-29 내로 삽입하였지만, 항생물질 선택 유전자는 없었다. 현탁액-적합 CHO-M 세포를 트랜스포존 공여체 플라스미드 및 트랜스포사제 발현 벡터로 3회 형질감염시키고, 이후에 30개의 개개 세포 클론을 클론픽스(ClonePix) 장치를 이용하여 무작위로 집었다. 모 세포뿐만 아니라 shRNA-발현 세포 풀 및 클론의 풀을 GFP 발현 플라스미드(즉, 퓨로-GFP-MAR X_29 작제물)로 재형질감염시키고, 이후에 GFP-발현 세포의 다클론성 풀의 퓨로마이신 선택을 하였다. GFP 형광 프로파일의 비교는 고도로 형광성인 세포(M2 세포 집단) 또는 매우 고도로 형광성인 세포(M3 세포 집단)에 대해 더 높은 비율의 배지를 모 CHO-M 세포와 비교하여 shRNA 벡터로 형질감염된 세포 풀로부터 얻어졌다는 것을 나타내었다(도 17A).
몇몇 shRNA-발현 클론은 매우 높은 GFP 수준을 매개하였으며, 클론 16 및 클론 26에 예시한 바와 같이 80% 이상의 항생물질 내성 세포가 형질감염 10일 후에 고도로 형광성인 M3 하위 집단에 있었다(도 17A 및 도 17B). 고수준의 GFP 형광을 선택 없이 추가 배양의 35일 후에 이들 두 클론에서 유지하였다(도 17C). 대조적으로, 클론 17은 제10일에 매우 고수준의 GFP를 발현시키지 않았고, GFP 발현은 불안정하게 되는 것으로 나타났다(도 17B 및 도 17C). 클론 8 및 클론 22로부터 중간체 발현 수준 및 안정성을 얻었다. 이들 클론을 또한 발현이 어려운 인플릭시맙 치료 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 전과 같이, 클론 16 및 26 다음에 클론 8 및 22는 가장 고수준의 항체를 생성한 반면, 클론 17은 모 CHO-M 세포로부터 얻은 0.5 내지 1 pcd와 유사한 양의 면역글로불린을 발현시켰다(도 17D, 데이터 미제시). 가장 유의하게 감소된 Rad51 mRNA 수준을 나타내는 세포 클론은 GFP와 인플릭시맙 면역글로불린 둘 다의 고발현을 수득하였는데, 이는 증가된 이식유전자 발현이 재조합 단백질의 감소된 발현으로부터 초래된다는 것을 나타낸다(결과 미제시).
따라서, 인플릭시맙과 같은 분비된 치료적 단백질의 더 높고 더 안정한 생성 수준은 Rad51-표적화 shRNA를 발현시키는 세포로부터 또는 Rad51-표적화 siRNA와 같은 siRNA에 의해 일시적으로 형질감염된 세포로부터 달성될 수 있다.
재료 및 방법
플라스미드 및 DNA 벡터
PB 트랜스포사제 발현 벡터 pCS2+U5V5PBU3은 아프리카발톱개구리(Xenopus laevis) β-글로빈 유전자의 5' 및 3' 미번역 말단 영역(UTR)에 의해 둘러싸인 PB 트랜스포사제 암호 서열을 함유한다. 이 플라스미드는 다음과 같이 구성되었다: pBSSK/SB10(Dr S. Ivics에 의해 기꺼이 제공됨)으로부터의 3' UTR 317 bp 단편을 pCS2+U5(영국 페이즐리에 소재한 인비트로젠/라이프 테크놀로지즈(Invitrogen/Life Technologies)) 내로 삽입하여 pCS2+U5U3을 수득하였다. PB 트랜스포사제 암호 서열(2067 bp, 젠뱅크 등록번호: EF587698)을 ATG:바이오신쎄틱(ATG:biosynthetic)(독일 메르츠하우젠에 소재)에 의해 합성하고 나서, 두 UTR 사이의 pCS2+U5U3 백본에 클로닝시켰다. PB 대조군 벡터는 비변형 pCS2+U5 플라스미드에 대응한다(도 1, 좌측 패널).
이 연구에서 사용되는 상이한 트랜스포존 벡터는 PB 235 bp 3' 및 310 bp 5' 역위 말단 반복부(ITR)를 도입함으로써 생성되었고, ATG:바이오신쎄틱(독일 메르츠하우젠에 소재)에 의해 pBluescript SK-플라스미드(pBSK ITR3'-ITR5', 도 1, 우측 패널) 내로 합성되었다. 이어서, pRc/RSV 플라스미드(인비트로젠/라이프 테크놀로지즈)로부터 SV40 프로모터의 제어 하에서 퓨로마이신 내성 유전자(퓨로(Puro)(등록상표))를 두 ITR 사이에 삽입하였다. 이 연구에서 사용되는 퓨로마이신 내성 및 GFP 유전자인 MAR 1-68 및 MAR X-29 구성요소는 앞서 기재한 바와 같았다. 면역글로불린 발현 벡터 및 SRP9, SRP14, SRP54, SRPR알파, SRPR베타, SEC61A1, SEC61B 및 SEC61G 암호 서열은 르 푸르(Le Fourn) 등(Metab. Eng., Epub 2013 Feb 1)에 의해 기재된 바와 같았다.
GFP, 면역글로불린 또는 분비 단백질은 암호 서열 상류의 인간 CMV 인핸서 및 인간 GAPDH 프로모터 다음에 SV40 폴리아데닐화 신호, 인간 가스트린 종결자 및 SV40 인핸서로 구성된 진핵 발현 카세트를 이용하여 발현시켰다(문헌[Le Fourn et al., 2013] 참조). 발현 카세트 및/또는 MAR 구성요소를 표준 클로닝 방법을 이용하여 ITR 서열 사이에 또는 도 1 및 도면 범례에 도시한 바와 같은 박테리아 벡터 벡본 내에 삽입하였다.
세포 배양 및 형질감염 분석
CHO DG44 세포주를 하이포잔틴/티미딘(HT, 깁코(Gibco)) 및 10% 소태아혈청(FBS, 깁코)로 보충한 DMEM: F12(깁코) 중에서 배양시켰다. 제조업자의 설명서에 따라 PEI(제트프라임(JetPRIME), 폴리플러스 트랜스펙션(Polyplus Transfection))를 이용하여 형질감염을 수행하였다. 300 ng의 PB 트랜스포사제 발현 플라스미드와 300 ng의 트랜스포존 공여체 플라스미드의 최적의 비를 이용하여 역가 실험 또는 공동 형질감염을 위해 PB 트랜스포사제의 pDNA 공급원의 다양한 양(0 내지 1500 ng의 범위)으로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염의 2일 후에, 세포를 실험에 따라서 몇몇 페트리 접시에 옮겼다. 비선택 형질감염 CHO 세포의 분석을 위해, 세포를 3주 동안 항생물질 선택 없이 재플레이팅하고, 형광 세포의 백분율 및 GFP 양성 세포의 형광강도를 CyAn ADP 유세포분석기를 이용하여 FACS 분석에 의해 결정하였다(벡크만 쿨터(Beckman Coulter)). 비선택 세포의 유전자 복제수 분석을 위해, 안정한 GFP 양성 CHO 세포를 FACSAriaII를 이용하여 분류하였다. 항생물질 내성 콜로니-계수 분석을 위해, 50,000개의 형질감염 세포를 100㎜ 플레이트 내에 파종하고 나서, 5㎍/㎖ 퓨로마이신으로 2주 동안 선택하였다. 이어서, 내성 콜로니를 고정시키고 나서, 10분 동안 70% EtOH 0,7% 메틸렌 블루(Methylene Blue) 중에 염색시키고, 직경이 0.5㎜ 초과인 콜로니를 계수화하였다. GFP 발현 연구를 위해, 세포를 2주 동안 선택한 후 상기 기재한 바와 같이 GFP 형광 FACS 분석을 하였다.
CHO-M 세포를 습한 공기에서 37℃, 5% CO2에서 L-글루타민(호주 PAA) 및 HT 보충물(깁코, 인비트로젠 라이프 사이언스)로 보충한 SFM4CHO 하이클론(Hyclone) 무혈청 배지(써모사이언티픽(ThermoScientific)) 중의 현탁 배양물에서 유지하였다. 트랜스포존 공여체 플라스미드를 제조업자(네온 디바이스(Neon devices), 인비트로젠)의 권고에 따라 전기천공법에 의해 이들 세포에 옮겼다. 앞서 기재한 바와 같이 배취 배양물로부터 면역글로불린 분비의 정량화를 수행하였다(문헌[Le Fourn et al., 2013] 참조). 간략하게, 면역글로불린을 발현시키는 세포 집단을 37℃, 5% CO2 습한 인큐베이터에서 7일 동안 50㎖ 미니생물반응기 관(스위스에 소재한 TPP) 내로의 배취 배양에서 평가하였다. 세포 배양 상청액 중의 면역글로불린 농도를 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다.
qPCR 유전자 복제수 분석
제조업자의 프로토콜에 따라 DNeasy 조직 키트(독일 힐덴에 소재한 퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 다음의 전위 분석 후에 CHO 안정 세포 풀로부터 총 DNA를 단리시켰다. 유로겐테크 인코포레이티드(Eurogentec Inc) 및 ABI 프리즘 7700 PCR 기기(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용하여 정량적 PCR에 의해 6 ng의 게놈 DNA를 이용하여 게놈-통합된 이식유전자의 복제수를 평가하였다. GFP-전방: ACATTATGCCGGACAAAGCC 및 GFP-후방: TTGTTTGGTAATGATCAGCAAGTTG 프라이머를 사용하여 GFP 유전자를 정량화하는 한편, 프라이머 B2M-전방: ACCACTCTGAAGGAGCCCA 및 B2M-후방: GGAAGCTCTATCTGTGTCAA를 사용하여 베타-2 마이크로글로불린 유전자를 증폭시켰다. B2M 프라이머에 의해 생성한 앰플리콘에 대해, NCBI BLAST 소프트웨어를 이용하는 본 발명자들의 CHO 게놈 조립에 대한 정렬 후에 CHO 반수체 게놈 당 하나의 히트를 발견하였다. CHO가 거의-이배체 세포이기 때문에, B2M은 게놈 당 2개의 복제물로 존재하는 것으로 평가되었다. GFP 표적 유전자 복제수의 비를 앞서 기재한 바와 같이 B2M 기준 유전자의 복제수에 대해 계산하였다.
면역글로불린-발현 세포의 분류 및 분석
IgG-발현 세포를 자기적으로 분류하기 위해, 형질감염된 CHO-M 세포를 8mM L-글루타민 및 1x HT 보충물(둘 다 깁코사제)로 보충한 SFM4CHO 배지(써모 사이언티픽)에서 3x105개 세포/㎖의 세포 밀도에서 파종하고 나서, 완전 배지로서 지칭하였다. 배양의 4일 후에, 2x106개 세포를 세척하고 나서, PBS 중에 재현탁시키고, 실온에서 30분 동안 회전 휠 상에서 3㎍/㎖의 최종 농도로 바이오티닐화한 인간 IgG(KPL216-1006)와 사전 세척한 MyOne T1 스트렙타비딘-코팅 다이나비즈(Dynabeads)(인비트로젠) 30㎕와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포와 비드 혼합물을 자석 상에 두어서 비-표지 세포로부터 표제 세포를 분리시켰다. 비드를 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline: PBS) 용액으로 4회 세척하였다. 최종 PBS 세척 후에, 비드 및 세포를 사전-가온 완전 배지 500㎕ 중에서 재현탁시키고 나서, 24웰 플레이트에 옮기고, 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 자기-분류된 다클론성 세포를 비드로부터 분리시키고 나서, 세포가 50㎖ TPP 회전관 생물반응기(스위스에 소재한 테크노 플라스틱 프로덕츠 아게(TECHNO PLASTIC PRODUCTS AG)) 내에서 팽창을 위해 충분한 밀도를 가질 때까지 인큐베이션을 계속하였다.
대안적으로, 2개의 클론을 클론픽스(ClonePix) 장치를 이용하여 각각 3개의 IgG를 발현시키는 비-분류 및 비-선택 집단으로부터 단리시켰다. 간략하게, 반고체 배지를 사용하여 단일 세포를 사멸시키고 나서, 다량의 IgG를 분비하는 콜로니를 포매 후 10일에 골라내었다. 이들 세포주를 180rpm에서 오비탈 진탕하면서 37℃ 및 5% CO2에서 유지한 습한 인큐베이터 내에서 펩톤-함유 성장 배지(8mM 글루타민으로 보충한 하이클론 SFM4CHO)에서 3x105개 세포/㎖에서 회전관 생물반응기 내에서 3 내지 4일마다 계대시켰다.
1x 105개 세포/㎖의 세포 밀도에서 파종한 세포로부터 IgG 역가를 결정하고 나서, 다클론성 세포 집단을 평가할 때 50㎖ 회전관 생물반응기 내 5㎖의 완전 배지에서 6일 동안 성장시켰다. 대안적으로, 클론 집단의 진탕 플라스크 배양물을 3x105개 세포/㎖의 밀도에서 SFM4CHO 배지 내로 접종하여 유가배양 생성 과정을 개시하였다. 150rpm에서 진탕하면서(125㎖ 진탕 플라스크 및 회전관) 37℃ 및 5% CO2에서 유지한 습한 인큐베이터에서 125㎖ 진탕 플라스크 내 25㎖의 배양 용적 또는 50㎖ TPP 배양관 내 5㎖에서 유가배양 생성 분석을 수행하였다. 제0일, 제3일 및 제6일 내지 제8일에 화학적으로 정한 농축 공급물(하이클론, 셀 부스트(Cell Boost) 5, 52 g/ℓ)의 초기 배양 용적의 16%를 공급함으로써 10일 동안 생성을 수행하였다. 글루타민 및 글루코스 공급물을 배양 실행동안 적용하지 않았다. 배양물의 생존력 및 살아있는 세포 밀도(VCD)를 GUAVA 기기(밀리포어(Millipore))를 이용하여 매일 측정하였다. 이중 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 배양 배지 내로 분비한 MAb 농도를 결정하였다.
플라스미드 및 상대적 정량적 PCR 분석
이 연구에서 사용한 클로닝 벡터는 셀렉시스(Selexis) 포유류 발현 벡터 SLX플라스미드_082이다. pGL3-대조군 벡터(프로메가(Promega))의 루시퍼라제 서열을 EGFP 암호 서열 상류의 인간 CMV 인핸서 및 인간 GAPDH 프로모터 다음에 SV40 폴리아데닐화 신호, 인간 가스트린 종결자 및 SV40 인핸서로 구성된 진핵 발현 카세트에 의해 대체하였다. 2개의 인간 MAR-유래 유전자 구성요소는 발현 카세트 및 SV40 프로모터로부터 발현된 퓨로마이신 내성 유전자에 측접하는 반면, SLX플라스미드_082는 발현 카세트 상류에 위치된 MAR 구성요소의 유형과 다르다(hMAR 1-68 및 hMAR X-29; Girod et al., 2007) .
트라스투주맙 및 인플릭시맙 중쇄 및 경쇄 cDNA를 EGFP를 대체하기 위해 발현 벡터 중에서 클로닝하였다. 각각의 IgG의 중쇄 발현 카세트와 경쇄 발현 카세트를 둘 다 운반하는 벡터는 하나의 플라스미드 벡터 상에서 함께 중쇄 발현 카세트와 경쇄 발현 카세트를 조합함으로써 제조하였다. 모든 중쇄 및 경쇄의 신호 펩타이드 서열은 동일하며, 경쇄의 불변 부분과 같다. 중쇄의 불변 부분은 몇몇 아미노산 위치에서 상이하다(DEL 대 EEM 변이체).
SRP9, SRP14, SRP54, SRPR알파, SRPR베타, SEC61A1 및 SEC61B cDNA의 PCR 증폭 프라이머 및 젠뱅크 등록번호를 본 명세서의 다른 곳에 열거한다. 분비 단백질을 암호화하는 PCR 산물을 벡터 내에 클로닝하여 EGFP 서열을 대체하였다. 다수 분비 단백질을 공동발현시켰을 때, 피기백 트랜스포존의 역위 말단 서열을 벡터 내로 통합하여 발현 카세트에 함께 묶었고, 얻어진 벡터를 피기백 트랜스포사제 발현 벡터로 공동형질감염시켜 이식유전자 통합을 개선시키고 항생물질 선택에 대한 필요를 제거하였다.
전형적인 PB 트랜스포사제 발현 벡터는 아프리카발톱개구리 β-글로빈 유전자의 5' 및 3' 미번역 말단 영역(UTR)에 의해 둘러싸인 PB 트랜스포사제 암호 서열을 함유하는 pCS2+U5V5PBU3이며 관련 실험에서 사용하였다. 이 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다: pBSSK/SB10으로부터의 3' UTR 317 bp 단편을 pCS2+U5(인비트로젠/라이프 테크놀로지즈, 영국 페이즐리에 소재) 내로 삽입하여 pCS2+U5U3을 수득하였다. PB 트랜스포사제 암호 서열(2067 bp, 젠뱅크 등록 번호: EF587698)을 ATG:바이오신쎄틱(독일 메르츠하우젠에 소재)에 의해 합성하고 나서, 두 UTR 사이의 pCS2+U5U3 백본에 클로닝시켰다. PB 대조군 벡터는 비변형 pCS2+U5 플라스미드에 대응한다.
상이한 트랜스포존 벡터는 PB 235 bp 3' 및 310 bp 5' 역위 말단 반복부(ITR)를 도입함으로써 생성되었고, ATG:바이오신쎄틱(독일 메르츠하우젠에 소재)에 의해 pBluescript SK-플라스미드(pBSK ITR3'-ITR5') 내로 합성되었다. 이어서, pRc/RSV 플라스미드(인비트로젠/라이프 테크놀로지즈)로부터 SV40 프로모터의 제어 하에서 네오마이신 내성 유전자(네오(Neo)(등록상표))를 두 ITR 사이에 삽입하였다. 이 연구에서 사용되는 퓨로마이신 내성 및 GFP 유전자인 MAR 1-68 및 MAR X-29 구성요소는 앞서 기재한 바와 같았다(Girod et al. 2007; Grandjean et al. 2011; Hart and Laemmli 1998). 면역글로불린 발현 벡터 및 SRP9, SRP14, SRP54, SRPR알파, SRPRbeta, SEC61A1 및 SEC61B 암호 서열은 본 명세서에 기재된다. 암호 서열 상류의 인간 CMV 인핸서 및 인간 GAPDH 프로모터 다음에 SV40 폴리아데닐화 신호, 인간 가스트린 종결자 및 SV40 인핸서로 구성되는 진핵 발현 카세트를 이용하여 분비 단백질을 발현시켰다. 발현 카세트 및/또는 MAR 구성요소를 표준 클로닝 방법을 이용하여 ITR 서열 사이에 또는 박테리아 벡터 백본에 삽입하였다.
적절한 3' 및 5' ITR뿐만 아니라 트랜스포사제를 포함하는 피기백 트랜스포존 시스템은, 예를 들어 시스템 바이오사이언스(SYSTEM BIOSCIENCE)로부터 입수가능하다.
상대적 정량적 PCR 분석을 위해, 총 RNA를 1 x 105개 세포로부터 추출하고, 제조업자의 설명서에 따라 패스트레인 셀 cDNA 키트(FastLane Cell cDNA Kit)(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. SRP14 및 GAPDH의 발현을 보충하는 표 S1에 열거한 프라이머를 이용하는 로터 진 큐(Rotor Gene Q)(퀴아젠) 및 라이트사이클러(LightCycler)(등록상표)480 SYBR 그린 I 마스터(로슈(Roche))를 이용하여 qPCR에 의해 정량화하였다. SRP14의 전령 RNA 수준을 로터-진 Q 시리즈 소프트웨어(퀴아젠)를 이용하여 GAPDH에 대해 정규화시켰다.
CHO 세포주의 세포 배양물, 안정한 형질감염 및 서브클로닝
현탁액 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1)를 습한 공기 중에서 37℃, 5% CO2에서 L-글루타민(호주 PAA) 및 HT 보충물(깁코, 인비트로젠 라이프 사이언스)로 보충한 SFM4CHO하이클론 무혈청 배지(써모사이언티픽)에서 유지하였다. CHO-K1 세포를 제조업자의 권고(네온 디바이스, 인비트로젠)에 따라 전기천공법에 의해 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 트라스투주맙 또는 인플릭시맙 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 형질감염시켰다. 2일 후에, 세포를 10㎍/㎖의 퓨로마이신을 함유하는 배지에서 T75 플레이트에 옮기고 나서, 세포를 2주 동안 선택 하에 추가로 배양시켰다. 이어서, 트라스투주맙 및 인플릭시맙 IgG를 발현시키는 안정한 개개 세포 클론을 희석을 제한함으로써 생성하고 나서, 확장시키고 성장 성능 및 IgG 생성 수준에 대해 분석하였다. 가장 높은 IgG 수준을 발현시키는 트라스투주맙 및 인플릭시맙 IgG-생성 세포 클론을 추가 생화학적 실험을 위해 선택하였다. 이어서, 일부 이들 클론을 전기천공법에 의해 SRP14 발현 벡터 및 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드로 공동형질감염시켰다. 이어서, 세포를 상기 기재한 바와 같이 2주 동안 300㎍/㎖의 G418을 함유하는 배지에서 배양시켰다. 안정한 클론을 제한 희석에 의해 단리시키고 나서, SRP14 발현을 Q-PCR 분석에 의해 확인한 후에 생화학적 분석을 위해 배양을 확장시켰다.
배취 및 유가배양
트라스투주맙 및 인플릭시맙을 발현시키는 개개 클론의 성장 및 생성 성능을 5% CO2 습한 인큐베이터 내 37℃에서 7일 동안 50㎖ 미니생물반응기(스위스에 소재한 TPP) 내로 유가 배양에서 평가하였다. 세포 배양의 제3일, 제4일 및 제7일에, 세포 밀도 및 생존력을 구아바 이지사이트(Guava EasyCyte) 유세포 분석 시스템(밀리포어(Millipore))을 이용하여 결정하였다. 세포 배양 상청액 내 IgG 역가를 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 세포 밀도(Cv.㎖-1) 및 IgG 역가값(㎍.㎖-1)을 표시한 공정 시간 샘플링일에 플롯팅하였다. 클론을 발현시키는 트라스투주맙 및 인플릭시맙의 구체적 IgG 생산성을 제3일 내지 제7일(생성기)에 계산한 살아있는 세포의 전체수(integral number of viable cell: IVCD)에 대한 IgG 농도의 기울기로서 결정하고, 세포 및 일 당 pg(pcd)로서 표현하였다.
유가배양 생성 배양물에 대해, 세포를 25㎖의 SFM4CHO 하이클론 무혈청 배지 내 125㎖ 진탕 플라스크 내로 0.3x106개 세포/㎖에서 파종하였다. 배양물을 교반 하에 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 배양물을 상업적 하이클론 공급물(써모사이언티픽)에 기반하여 매일 공급하였다. 세포 밀도 및 IgG 생성을 매일 평가하였다.
단백질 발현 및 응집 분석
프로테아제 저해제 칵테일(로슈 인코포레이티드)의 존재에서 PBS 완충제 중의 1% 트리톤 X-100과 함께 세포를 투과시킴으로써 가용성 세포질 단백질을 추출하였다. 얼음 상에서 30분 인큐베이션 후에, 세포를 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 "가용성 사이토졸 및 ER 단백질" 분획으로서 지칭하였다. 펠렛을 유레아 라엠믈리(Laemmli) 완충제(62.5mM 트리스, 2% SDS, 8M 유레아, 5% 글라이세롤, 브로모페놀 블루 염료) 중에서 초음파처리에 의해 용해시켜, 응집된 소포 불용성 단백질 분획을 수득하였다. 이어서, 가용성 및 불용성 분획을 2-머캅토에탄올을 함유하거나 함유하지 않는 라엠믈리 완충제 중에서 조정하였고, 8분 동안 95℃에서 비등시켰다. 환원 및 비환원 샘플을 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 유전자 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 각각 10% 또는 4 내지 10% 구배 아크릴아마이드 겔 상에서 분리시켰다.
이어서, 단백질을 나이트로셀룰로스 막 상에 블롯팅하였다. TBS-트윈(20mM 트위스, 0.5M NaCl, 0.1% 트윈 20) 중에서 희석시킨 5% 우유 중에서 차단시킨 후에, 다음의 1차 항체를 사용하여 상이한 단백질에 대해 막을 분석하였다: 항-인간 IgG(H+L)-HRP 컨쥬게이트된 당나귀 항체(JK 이뮤노리서치(immunoresearch), #709 035 149, 1:5000), 항-인간 BiP 토끼 다클론성 항체(셀 시그널링(Cell signaling), BiP, C50B12, 1:2000), 항-인간 CHOP 마우스 단클론성 항체(Cell signaling, CHOP, L63F7, 1:500), 항-인간 GAPDH 염소 다클론성 항체. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 각각의 블롯을 HRP 컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 또는 항-마우스 IgG(Cell signaling, 1:20000)로 프로빙하였다. 각각의 항체에 의해 인식되는 구체적 단백질을 ECL 시약 및 ECL 필름(아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences))에 대한 노출을 이용하여 검출하였다.
사이클로헥시마이드-기반 단백질 추적 실험
사이클로헥시마이드-기반 추척 실험을 높은(HP) 및 낮은(LP) IgG-생성자 CHO-K1 클론에 대해 수행하였다. 동일한 수의 세포를 100μM의 사이클로헥시마이드(시그마(Sigma))로 보충한 완전 배양 배지에서 6-웰 플레이트 내로 플레이팅하였다. 다양한 시점에, 세포를 채취하고 나서, PBS, 1% 트리톤 X-100 중에 용해시켰다. 이어서, Tx-가용성 및 불용성 분획을 4 내지 10% 아크릴아마이드 비-환원 SDS-PAGE 상에 재용해시키고 나서, 항-인간 IgG 항체로 면역블롯팅하였다.
차별적 세정제 분획 분석
막 단백질로부터의 사이토졸의 분획을 세포 펠렛의 차별적 세정제 추출에 의해 수행하였다. 세포를 1㎖ PBS 중에서 처음 세척하고 나서, Hp 및 LP 세포의 혈장막을 1%의 트리톤 X-100의 존재 하에 또는 없이 0.01% 디기토닌(시그마)을 함유하는 KHM 완충제(110mM KAc, 20mM HEPES, 2mM MgCl2, pH 7.2) 중에서 10분 동안 투과시켰다. 반투과된 세포를 KHM 완충제 중에서 1회 세척하고 나서, 트립신을 실온에서 10분 동안 50㎍/㎖로 첨가하여 가용성 단백질을 분해시켰다. 1mM PMSF 및 4mM AEBSF의 첨가에 의해 트립신 분해를 중단시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 나서, 가용성 단백질을 부문 2.4에서 기재한 바와 같이 트리톤 X-100 및 프로테아제 저해제의 존재 하에 추출하였다. 2-머캅토에탄올을 함유하는 환원 라엠믈리 완충제를 펠렛 및 상청액 분획에 첨가하였고, 이후에 8% SDS-PAGE를 실시하였다. IgG 및 BiP 단백질을 검출하기 위해 면역블롯팅을 수행하였다.
단백질의 가교 및 웨스턴 블롯팅 분석
인플릭시맙 LP 세포를 PBS 중에서 1회 세척하고 나서, 1mM의 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DSP) 가교링커(써모사이언티픽)와 함께 또는 없이 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 가교-연결을 10분 동안 50mM의 트리스-HCl(pH 7.4)의 첨가에 의해 퀀칭시킨 후에, 1% 트리톤 X-100 함유 PBS 완충제 중에서 단백질 추출하였다. 마이크로퓨지(microfuge) 내 14,000 rpm에서 10분 원심분리시킨 후에, 트리톤 X-100 불용성 분획 또는 전체 단백질 추출물을 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 면역블롯팅하고, 항-BiP 및 항-LC 항체로 프로빙하였다. 동일한 양의 Tx-불용성 분획 단백질을 병행해서 분석하였다.
본 발명의 방법 및 조성물은 다양한 실시형태로 포함될 수 있고, 이중 소수많이 본 명세서에 개시되어 있다는 것을 인식할 것이다. 다른 실시형태가 존재하고 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않는다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 기재된 실시형태는 예시적인 것이며, 제한으로서 해석되어서는 안 된다.
(표 A)
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(표 B)
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(표 C)
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Figure 112015080265977-pct00016
(표 D)
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SEQUENCE LISTING <110> SELEXIS S.A. <120> ENHANCED TRANSGENE EXPRESSION AND PROCESSING <130> WO/2014/118619 <140> PCT/IB2014/000100 <141> 2014-01-02 <150> US 61/759,802 <151> 2013-02-01 <150> US 61/800,244 <151> 2013-03-15 <150> US 61/806,634 <151> 2013-03-29 <160> 116 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 3616 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_BINDING <222> (1)..(320) <223> MAR 1_68 OF CHROMOSOME 1 <400> 1 gactctagat tataccaacc tcataaaata agagcatata taaaagcaaa tgctcttatc 60 ttgcagatcc ctgaactgag gaggcaagat cagtttggca gttgaagcag ctggaatctg 120 caattcagag aatctaagaa aagacaaccc tgaagagaga gacccagaaa cctagcagga 180 gtttctccaa acattcaagg ctgagggata aatgttacat gcacagggtg agcctccaga 240 ggcttgtcca ttagcaactg ctacagtttc attatctcag ggatcacaga ttgtgctacc 300 tattgcctac catctgaaaa cagttgcttc ctatatttca tccagtttaa tatttattta 360 aaccaagaag gttaatctgg caccagctat tccgttgtga gtggatgtga aagtaccaat 420 tccattctgt tttactatta actatccttt gccttaatat gtatcagtag gtggcttgtt 480 gctaggaaat 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tttatatata tgtgtgtata 720 tatatatttt atatatatgt gtgtatatat atattttata tatatgtgtg tatatatata 780 ttttatatat atgtgtgtat atatatattt tatatatatg tgtgtatata tatattttat 840 atatatgtgt gtatatatat attttatata tatgtgtgta tatatatata ttttatatat 900 atgtgtgtat atatatatat tttatatata tatgtgtgta tatatatata ttttatatat 960 atatgtgtat atatatatat atatatattt tttttttgag acagagtctc gctctgtcgc 1020 ccaggctgga gtgcagtggc gcgatctcag ctcactgcaa cctccacctc ctgggttcaa 1080 gccgttctcc tgcctcagcc tcccgagtag ctgggactac aggcacgtgc caccacgtcc 1140 agctaatagt tttgtatctt tagtagagat ggggtttcac catattggtc aggatggtct 1200 cgatctcttg acctcatgat ccgcccacct cagcctccca aagtgctggg attacaggcg 1260 tgagccacca ctcccagcct aaaatatttt tatgatcttt ggccatattg ttcaatggac 1320 aaaatttagc cttcgaaggc aggccgattt gaggttaata ctacctttac cacttgatag 1380 ctatgtgacc ttggccatgt ggtttcaaca gtctgaacct cattttctct gtgtatgtgt 1440 ggtcctcctt acaagtttgt gaaaaatgtg aagtccttag ccatgatagc ccaatataac 1500 aggctaaatg ataataggtt tatgttcttt tcctttatat tctcagataa 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tatatcatat attatatgta tttatatatt 420 atatatcata taatatatat atttatatta tatatattat atgatatata atattatata 480 atgtattaat atatattaaa cctatattta taattctgga ctcactattt tgtttcattg 540 gtgtctgtgt gtatctaacc ctatgccaat aatgtactat cttaattacc atagctttat 600 agtaagctag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagat ttggccatat 660 tgttcaatgg acaaaattta gccttcgaag gcaggccgat ttgaggttaa tactaccttt 720 accacttgat agctatgtga ccttggccat gtggtttcaa cagtctgaac ctcattttct 780 ctgtgtatgt gtggtcctcc ttacaagttt gtgaaaaatg tgaagtcctt agccatgata 840 gcccaatata acaggctaaa tgataatagg tttatgttct tttcctttat attctcagat 900 aagcactgtc caagtttgag gtgttttgag gtctcgcctg atttggattg tttgagttta 960 tgctattctt tgaattcttt gagctgttct gaagcagtgt atcatgaaca aaaacatccc 1020 cagttcagtc caaacccctg gttacatatc attcttatgc catgttataa ccagtttgag 1080 agtgttccct ctgttattgc atttaagttt cagcctcaca cagaaattca gcagccaatt 1140 tctaagccct aagcataaaa tctggggtgg ggggggggga tggcctgaag agcagcatta 1200 tgaatagcac cattataatt aatgatctct caggaagatt 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MISC_FEATURE <223> CHO_AGE <400> 82 Met Lys Gly Ile Leu Trp Gly Ala Phe Cys Gly Lys Ala Asn Glu Leu 1 5 10 15 Arg Gln Arg Leu Glu Leu Lys Glu Lys Gly Arg His Val Val Leu Glu 20 25 30 Ala Thr Glu Asn Glu Val Glu Gly Lys Gly Gly Met Leu Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Gln Ala Cys Cys Glu Glu Lys Gly Leu Asp Ala Glu Asp Gly Gly 50 55 60 Gly Asp Ser Asn Asp Leu Ser Ser Val Ser Glu Thr Thr Asp Ser Thr 65 70 75 80 Asp Val Lys Asp Ser Ser Glu Thr Ser Leu Thr Leu Pro Pro Arg Ala 85 90 95 Ser Pro Cys Pro Ala Gly Phe Trp Ile Leu Glu Thr Gly Ala Ser Gln 100 105 110 Arg Gln Phe Gln Ala Trp Phe Thr Ala Glu Glu Gly Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Pro Pro Phe Gly Pro Glu Leu Thr Cys Arg Trp Ser Ser Leu Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Asp Ile Leu Ala Leu Gly Ala Gln Pro His Trp Val His 145 150 155 160 Lys Leu Gln Gly Phe Trp Phe Val Glu Val Ile Leu Ser Ala Lys Arg 165 170 175 Leu Gln Asp Met Glu Lys Glu Arg Ala Ser Leu Gln Ala Trp Lys Asp 180 185 190 Arg Val Ala Lys Glu Leu Asp Ser Val Val Ala Phe Trp Leu Gln 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tgggctttgg ggttctggaa 540 ctgtcccaga gccaggatgt tgaagaacat acagtgccat atgatgtcaa ccaagaacat 600 atgcagttgg ttaccaccaa ctcgggttct tcccagctgt ctgacatgga tgcaaataat 660 gttaaatgtg aagaacagtc cactgaagat acctccatgg cagaacaacc taacaaagac 720 atccctgtta cagtcgagca cagtaaaggt atccctgtgg tagatgagca aaatctacca 780 ccggcaaggc cagaggatct gccttccagt cctcaagcct ctgctgcagc tgtggaaaca 840 aaggaagagg tacctgccca agagttgcca gaaggggcgc tggaggttca gatgtcctcg 900 gagcctgagg tctcgtccac tcaggaggac ttgtttgagc agagtagtaa aacagcttct 960 gatggttgtt ctactccttc aagggaggaa ggtgggtgtt ctccggtttc cacacccgcc 1020 accaccctgc aactcctgca gctgtctggt cagaggcccc ttgtccagga cagtctttcc 1080 acgaattcct cagatcttgt tgctccttcc cctgatgctt tccgacctac cccttttatc 1140 gttcctagca gtcccacaga gcaaggaggg agaaaagttg agcccttgga tatgtcagtg 1200 atgcctgaag aaggagggga gactttgcag aagcttcagg atgacgaagc agtggagata 1260 gaaaagcccc atctcccatc tcagccggct gtttccccac aagtgtcaac accagtgtct 1320 cagagcacac ctgtcttcac tccaggctct cttcccatcc cgtcccagcc tgaattttct 1380 catgacattt tcattccatc accaagtttg gaagaaccat caagtgatgg gaagaaaggt 1440 ggcgatttgc acagctcatc tttgactgtg gagtgttcta agacttcaga gagtgaacca 1500 aagaatttca ctgctgatct tgggctctcc ttgacagggg agtcttgcaa actgatgctt 1560 tcttcaagtg agtatagtca atcctcaaag atggagagct tggcttctcc caggagtgag 1620 ggagatggag agaataccca gattgaggac actgaaccgt tgtctccagt caccaattct 1680 aaacttcctg ctgaaagtga tgatgtcctg atgaatccag caccagatga ccaagtagaa 1740 atgaatcaga atgatgacaa agtaaaagag ggtgacacag agaacacagg tgaccatggt 1800 gttttagctg ctggtagtaa aggcagagaa gaaaccgttg ctgaagatgt ttgcattgat 1860 ctcacttgtg attctgggag tcaggcagtt ccgtctcccg ctactcggtc cgaggcactt 1920 tctagtgtct tagatcagga ggaagctatg gaaattaaag aacagcatcc agaggagggg 1980 ttttcgggat ctgaggtaga agaagtcccc gagactccct gtgaaagtca cagagaggag 2040 cccaaggaag aaacgatgga gagtatccca ctgcaccttt ctcttactga aacacagtcc 2100 caggcattgt gtcttcagaa ggaaatgccc aaagaagaat gcccagaggc catggaagtg 2160 gaaccctctg tgattagtgt tgactctccc cagaagctgc cggtactcga ccaggagtca 2220 gagcataagg agccagaggc ctgggaagaa gccgcgtcgg aggactcaag tgtggaggac 2280 tcaagtgtgg ttatcgttga tgtgaaggag ccctcgccaa gagttgtccc ctgcgaacct 2340 ttggagggag cagagaaatg ctcagattcc cactcctggg aggatgtggt gcccgaggtg 2400 gaaccgtgtg ctgcaaatag agtagacact ccggaggaaa agattgtaga atgtgacgga 2460 gatgtgaaag cagagaccac aagaaaggac tctgtagagg aagactcccc acagcctcct 2520 ttgccttcag tgaaagacga gcctcccaga gacgagcctc ccagacccga ccaggagatg 2580 cagcagtccc agcttcaaga gaaagagagc ccagtgacca tagatgcaaa agtggctgat 2640 gccaagcagc tggagtcaga gggagcatcc cagcagcttt cgaaagcccc tgcccgcgac 2700 tcacaaagtt tctgtgaaag ttctagtgaa accccatttc atttcacttt gcctaaagaa 2760 ggtgatatta tcccaccatt gactggtgca accccacctc acattgggca cctaaaattg 2820 gatcgcaaca gacatagtac tccaattggg attggcaact atccagaaag caccatagca 2880 accagtgatg tcatgtctga aagcatggtg gagatcaatg atcctctact tgggagtgaa 2940 aaaggagatt ctgagtctgc cccagaaatg gacggaaaac tgtatctgaa aatgaaactg 3000 gttagtcctg agacagaggc cagtgaagaa tctttgcagt ttagcctgga aaagcctgct 3060 actgctgaga gaaaaaatgg atcaactgct gttgctgagc ctgttgcaaa aaatggatca 3120 actgctgttg ctgagcctgt tgccagtccc cagaagaccg tgcctgtgtt tagctgcagg 3180 caagaggagg tttggagtga ggaccctccc tctgtaccca tcagggcaaa cttgctccat 3240 tttccaagtg ttgaagaaga ggacaaagaa aaactggatg gtaccccaaa gcttaggcag 3300 agtgaacagc ctgtgaggcc cgttgggctg gtcaaggatg ctgctacttc tgaggactct 3360 gcttcttctg ttccccagca gagagcaaca caggggtcat tcagccctca aggagaagtg 3420 atggaaacag acctgctaga aggactgagt gctaaccagg aaaaaccgtg taaggtcttg 3480 atggaaaggc ccacccagag taacatagga atccagacca tggaccattc cctgtgtgct 3540 ccagaaactg tttcagcagc aacccagact gtgaagagtg tatgtgaaca agggaccagt 3600 acagtggacc agaactctgg gaaacaagat gccactgtgc agaccgagag ggggggtgtc 3660 gagaaacagg cccctgtgga cgatacagaa tccctccaca gccagggaga agaagaattt 3720 gaaatgcccc agcctccaca tggccatgtc ttgcatcgtc acatgagaac catccgtgaa 3780 gtccggacac ttgtcacccg tgtcatcaca gatgtttact atgtggatgg gacagaagtg 3840 gaaaggaaag taactgagga gactgaagaa ccaattgtag aatgtcagga atgtgaaaca 3900 gaggtttccc cttcccagac tggaggctct tctggagacc tgggagacat cagttccttc 3960 tcctccaaag catccagctc acaccataca tcaagtggga caagtctctc agccatgcat 4020 agcagtggca gctcaggacg aggagccggg ccactcaaag ggaaaaccag cgggacagaa 4080 cctgcagatt ttgctttacc cagttcccga ggaggcccag gaaaactgag tcctagaaaa 4140 gggatcaatc agacaggggc accagtgtgt gaggaagatg gtgatgcagg ccttggcatc 4200 agacagggag ggaaggctcc tgtcacacct cgtggtcgtg gtcgaagggg ccgcccacct 4260 tctcggacca ctggaacaag agatgcagtt gtgtctggtc cgttgggcat agaagacatt 4320 tcacctagca tgtcaccaga tgacaagtcc ttcacccgaa ttgtgccccg tgtaccagac 4380 tctaccaaac gaattgatac cagttctact gttttgaggc ggagtgattc cccagagatt 4440 ccttttcagg ctgctactgg gtcttctgat ggcttggatg cctcatctcc aggaaatagc 4500 tttgtcgggc tccgtgttgt agccaagtgg tcatccaatg gctattttta ctctgggaaa 4560 atcacacggg atgttggagc tgggaagtat aagctgctct tcgatgatgg gtatgaatgt 4620 gatgtgctgg gcaaagacat tctcctgtgt gaccctatac ccctggacac tgaagtgaca 4680 gccctctcag aagatgagta tttcagtgca ggagtggtca aaggacacag aaaggagtct 4740 ggggagctgt actacagcat tgaaaaagaa ggccaaagga agtggtataa gcggatggca 4800 gtcatcctgt ccttggaaca aggaaacagg ttaagagagc aatatgggct tggcccatat 4860 gaagctgtta cacccctcac aaaggcagca gacatcagcc tagataattt ggtggaagga 4920 aagcggaaac gtcgcagtaa catcagctcc ccagccaccc ccactgcctc cagcagcagc 4980 agcagcagca gcacaacacc cacccgtaaa accacagaga gtccccgtgc ttccacggga 5040 gttccatcag gcaaaaggaa actcatcact tctgaagagg aacggtcccc agctaagcga 5100 ggccgcaagt ctgtcaccgt gaaacctggt acagtggggg caggagaatt tgtgagcccc 5160 tgcgagagtg gagacaacac aggtgaacct tctgtcctgg aagagccaag agggcctttg 5220 cccctcaaca agaccttgtt tctgggctat gcctttctcc ttaccatggc cacaaccaat 5280 gacaagctgg ccagccgctc taaactgcta gatggtccta caggaagcag tgaagaagag 5340 gaggaatttt tagaaattcc tcctttcaac aagcagtata cagaatgcca gcttcgagca 5400 ggagctgggt atatccttga agacttcaat gaagcccagt gtaacacagc ctaccagtgt 5460 ctcctaattg ctgatcagca ttgtcgaacc cggaagtact tcctgtgcct tgccagtgga 5520 attccttgtg tgtctcatgt ctgggtccat gacagctgcc atgccaacca gctccaaaac 5580 taccgtaatt atctgctgcc tgctgggtat agccttgagg agcagcgaat tctggattgg 5640 caacctcgtg aaaacccttt ccagaatctg aaggtactct tggtgtcaga tcaacaacag 5700 aacttcctgg agctctggtc tgagatcctc atgactggag gggcagcctc tgtgaagcag 5760 caccattcaa gtgcccataa caaagacatt gctttagggg tatttgatgt ggtggtgaca 5820 gacccctcat gcccagcctc ggtgctcaag tgtgctgaag ccttgcagct gcctgtggtg 5880 tcacaagagt gggtgatcca gtgcctcatt gttggggaga gaattggatt caagcagcat 5940 ccaaaatata aacatgatta tgtttctcac taa 5973 <210> 110 <211> 384 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> misc_feature <223> CMV IE enhancer <400> 110 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atgg 384 <210> 111 <211> 799 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human GAPDH promoter <400> 111 gagaagttcc ccaactttcc cgcctctcag cctttgaaag aaagaaaggg gagggggcag 60 gccgcgtgca gccgcgagcg gtgctgggct ccggctccaa ttccccatct cagtcgttcc 120 caaagtcctc ctgtttcatc caagcgtgta agggtccccg tccttgactc cctagtgtcc 180 tgctgcccac agtccagtcc tgggaaccag caccgatcac ctcccatcgg gccaatctca 240 gtcccttccc ccctacgtcg gggcccacac gctcggtgcg tgcccagttg aaccaggcgg 300 ctgcggaaaa aaaaaagcgg ggagaaagta gggcccggct actagcggtt ttacgggcgc 360 acgtagctca ggcctcaaga ccttgggctg ggactggctg agcctggcgg gaggcggggt 420 ccgagtcacc gcctgccgcc gcgcccccgg tttctataaa ttgagcccgc agcctcccgc 480 ttcgctctct gctcctcctg ttcgacagtc agccgcatct tcttttgcgt cgccaggtga 540 agacgggcgg agagaaaccc gggaggctag ggacggcctg aaggcggcag gggcgggcgc 600 aggccggatg tgttcgcgcc gctgcggggt gggcccgggc ggcctccgca ttgcaggggc 660 gggcggagga cgtgatgcgg cgcgggctgg gcatggaggc ctggtggggg aggggagggg 720 aggcgtgtgt gtcggccggg gccactaggc gctcactgtt ctctccctcc gcgcagccga 780 gccacatcgc tcagacacc 799 <210> 112 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human Ef1 alpha promoter <400> 112 catgggtgag gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag 60 aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac 120 tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat 180 ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag 240 gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 300 ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420 gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1188 <210> 113 <211> 985 <212> DNA <213> Simian cytomegalovirus <220> <221> misc_feature <223> CMV promoter <400> 113 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat ggtggatctg 60 gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc aattcaatat ggtggatctg 120 gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg gcaccatgcc aattcaatat ggcggacttg 180 gcactgtgcc aactggggag gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt 240 ggccctgtgc caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 300 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc aatatggcta 360 ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat agtattccat atatgggttt 420 tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg ggcggtccca tataccatat atggggcttc 480 ctaataccgc ccatagccac tcccccattg acgtcaatgg tctctatata tggtctttcc 540 tattgacgtc atatgggcgg tcctattgac gtatatggcg cctcccccat tgacgtcaat 600 tacggtaaat ggcccgcctg gctcaatgcc cattgacgtc aataggacca cccaccattg 660 acgtcaatgg gatggctcat tgcccattca tatccgttct cacgccccct attgacgtca 720 atgacggtaa atggcccact tggcagtaca tcaatatcta ttaatagtaa cttggcaagt 780 acattactat tggaaggacg ccagggtaca ttggcagtac tcccattgac gtcaatggcg 840 gtaaatggcc cgcgatggct gccaagtaca tccccattga cgtcaatggg gaggggcaat 900 gacgcaaatg ggcgttccat tgacgtaaat gggcggtagg cgtgcctaat gggaggtcta 960 tataagcaat gctcgtttag ggaac 985 <210> 114 <211> 197 <212> DNA <213> Simian virus 40 <220> <221> misc_feature <223> SV40 promoter <400> 114 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 60 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atcgctgact aatttttttt atttatgcag 120 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 180 gcctaggctt ttgcaaa 197 <210> 115 <211> 999 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <223> CHO Actb promoter <400> 115 gggcggaggc cagtcatgca tgttcgggcc tatggggcca gcacccaacg ccaaaactct 60 ccatcctctt cctcaatctc gctttctctc tctctctctt tttttttttt tttttttttt 120 tttttttttt tttgcaaaag gaggggagag ggggtaaaaa aatgctgcac tgtgcggcta 180 ggccggtgag tgagcggcgc ggagccaatc agcgctcgcc gttccgaaag ttgcctttta 240 tggctcgagt ggccgctgtg gcgtcctata aaacccggcg gcgcaacgcg cagccactgt 300 cgagtccgcg tccacccgcg agcacaggcc tttcgcagct ctttcttcgc cgctccacac 360 ccgccaccag gtaagcaggg acaacaggcc cagccggcca cagccctccc gtgggcagtg 420 accgcgctgc agggtcgcgg gggacactcg gcgcggacac cggggaaggc tggagggtgg 480 tgccgggccg cggagcggac actttcagat ccaactttca gtccagggtg tagacccttt 540 acagccgcat tgccacggtg tagacaccgg tggacccgct ctggctcaga gcacgcggct 600 tgggggaacc cattagggtc gcagtgtggg cgctatgaga gccgatgcag ctttcgggtg 660 ttgaaccgta tctgcccacc ttggggggag gacacaaggt cgggagccaa acgccacgat 720 catgccttgg tggcccatgg gtctttgtct aaaccggttt gcccatttgg cttgccgggc 780 gggcgggcgc ggcgggcccg gctcggccgg gtgggggctg ggttgccact gcgcttgcgc 840 gctctatggc tgggtattgg ggcgcgtgca cgctggggag ggagcccttc ctcttccccc 900 tctcccaagt taaacttgcg cgtgcgtatt gagacttgga gcgcggccac cggggttggg 960 cgagggcggg gccgttgtcc ggaaggggcg gggtcgcag 999 <210> 116 <211> 683 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <223> CHO Hspa5 promoter <400> 116 acccgagggg acttaggagg agaaaaggcc gcatactgct tcggggtaag ggacagaccg 60 gggaaggacc caagtcccac cgcccagagg gaactgacac gcagaccccg cagcagtccc 120 cgggggccgg gtgacgggag gacctggacg gttaccggcg gaaacggtct cgggttgaga 180 ggtcacctga gggacaggca gctgctgaac caataggacc ggcgcacagg gcggatgctg 240 cctctcattg gcggccgttg agagtaacca gtagccaatg agtcagcccg gggggcgtag 300 cggtgacgta agttgcggag gaggccgctt cgaatcggca gcggccagct tggtggcatg 360 gaccaatcag cgtcctccaa cgagaagcgc cttcaccaat cggaggcctc cacgacgggg 420 ctggggggag ggtatataag ccaagtcggc ggcggcgcgc tccacactgg ccaagacaac 480 agtgaccgga ggacctgcct ttgcggctcc gagaggtaag cgccgcggcc tgctcttgcc 540 agacctcctt tgagcctgtc tcgtggctcc tcctgacccg gggggcttct gtcgccctca 600 gatcggaacg ccgccgcgct ccgggactac agcctgttgc tggacttcga gactgcagac 660 ggaccgaccg ctgagcactg gcc 683

Claims (60)

  1. 재조합 핵산 분자로서,
    5' 및 3' 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부(transposon-specific inverted terminal repeat)(ITR),
    상기 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치되고, 프로모터의 제어 하에 있는 이식유전자 발현 가공(transgene expression processing, TEP) 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및
    상기 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치되는 적어도 하나의 기질 부착 영역(matrix attachment region, MAR) 요소(element)를 포함하되,
    상기 TEP 단백질은 단백질 분비 경로의 다음의 단백질:
    서열번호 13의 서열을 갖는 hSRP14, 서열번호 15의 서열을 갖는 hSec61α1, 서열번호 17의 서열을 갖는 hSec61β, 서열번호 19의 서열을 갖는 hSec61γ, 서열번호 21의 서열을 갖는 hSRP54, 서열번호 23의 서열을 갖는 hSRP9, 서열번호 25의 서열을 갖는 hSRPRα, 서열번호 27의 서열을 갖는 hSRPβ, 및 서열번호 29의 서열을 갖는 hCANX 및 상기 명시된 서열들과 80%, 90%, 95% 또는 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단백질에서 하나 이상 선택되며,
    상기 TEP 기능성 RNA는 Rad51, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Cyclin D1, Bard1 또는 Mre11에서 선택되는 재조합 경로의 한 단백질의 발현을 방해하며,
    상기 MAR 요소는 서열번호 1(MAR 1-68), 서열번호 2(MAR 1_6), 서열번호 3(MAR X_S29), 서열번호 4(MAR S4), 서열번호 5(치킨 리소자임 MAR) 또는 서열번호 1 내지 5 중 하나의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 가공된 서열로부터 선택되고,
    상기 핵산 분자를 통하여 발현되는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA와 MAR 요소는 포유류 세포에서 이식유전자의 발현을 10% 이상 증가시킬 수 있으며,
    상기 이식유전자는 면역글로불린 유전자인, 재조합 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치되고, 이식유전자 프로모터의 제어 하에 있는 적어도 하나의 이식유전자를 추가로 포함하며, 상기 이식유전자는 면역글로불린 유전자인, 재조합 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 단일 MAR 요소 또는 둘 이상의 MAR 요소를 포함하며, 상기 요소(들)은 상기 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치되는 것인, 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 두 MAR 요소를 포함하되, 제1 MAR 요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 상류에 위치되고, 제2 MAR 요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 하류에 위치되며, 상기 제1 MAR 요소는 MAR 1_6 요소 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 요소를 포함하고, 상기 제2 MAR 요소는 MAR 1-68 구성요소 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 요소를 포함하는, 벡터.
  6. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 단일 MAR 요소를 포함하되, 상기 단일 MAR 요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 하류에 위치되고, 상기 단일 MAR 요소는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA의 하류에 위치되고, 상기 단일 MAR 요소는 MAR 1-68, MAR X-29 요소 또는 서열번호 1 또는 3의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 요소인, 벡터.
  7. 이식유전자 및 TEP 단백질 또는 TEP 기능성 RNA를 인비트로 발현시키는 방법으로서,
    이식유전자를 포함하는, 신체로부터 분리된 재조합 포유류 세포를 제공하는 단계 및 제3항에 따른 벡터를 이식유전자와 TEP 또는 TEP 기능성 RNA를 발현하는 상기 재조합 포유류 세포에 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 벡터를 통해 발현된 TEP 또는 TEP 기능성 RNA는 상기 포유류 세포 내 이식유전자의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70% 증가시키며,
    상기 이식유전자는 면역글로불린 유전자인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 단일 MAR X-29 요소 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주 초과 배양한 후에, 상기 벡터를 통해 발현되는 TEP 또는 TEP 기능성 RNA는 관심 대상 유전자의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70% 증가시키는, 방법.
  9. 세포 게놈에 통합된 제1항 또는 제2항의 재조합 핵산 분자를 20, 15, 10 또는 5개 이하 포함하는 재조합 포유류 세포.
  10. 재조합 포유류 세포로서,
    a) 상기 포유류 세포의 게놈에 통합된, 제1항에 따른 핵산 분자; 및
    b) 재조합 핵산 분자를 포함하되,
    상기 재조합 핵산 분자는,
    (i) 적어도 하나의 관심 대상 이식유전자 및
    (ii) 서열번호 1(MAR 1-68), 서열번호 2(MAR 1_6), 서열번호 3(MAR X_S29), 서열번호 4(MAR S4), 서열번호 5(치킨 리소자임 MAR) 또는 서열번호 1 내지 5 중 하나의 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 가공된 서열로부터 선택되는 MAR 요소를 포함하는 것인, 재조합 포유류 세포.
  11. 포유류 세포를 인비트로 형질감염시키는 방법으로서,
    제1 형질감염에서 상기 포유류 세포를 제1항 또는 제2항에 따른 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 또는 적어도 넷의 재조합 핵산 분자로 형질감염시키는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 추가적으로
    5' ITR 및 3' ITR을 인식하는 트랜스포사제(transposase)를 발현하는 단리된 핵산 또는 mRNA와 함께, 제2 후속 형질감염에서 형질감염되는 재조합 핵산 분자의 부분인 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋 또는 적어도 넷의 단리된 TEP 기능성 RNA 및 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 방법.
  13. 하나의 용기에 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 벡터를, 제2 용기에 양립가능한 트랜스포사제를 암호화하는 벡터를, 그리고 추가의 용기에 상기 벡터 또는 벡터들을 사용하는 방법의 설명서를 포함하는, 키트.
  14. 이식유전자의 통합, 발현 또는 통합 및 발현을 증가시키기 위하여 제1항에 따른 재조합 핵산 분자, 제10항에 따른 재조합 포유류 세포, 또는 이들 모두를 인비트로 사용하는 방법.
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