WO2017061354A1 - 遺伝子発現用カセット及びその産生物 - Google Patents

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gene
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正洋 西堀
裕巳 公文
村田　等
山本　健一
木下　理恵
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression cassette capable of stably producing a large amount of a recombinant protein, and further relates to a gene expression method using the gene expression cassette and a product thereof.
  • the present invention relates to a gene expression cassette containing a promoter, an enhancer and the like, and further relates to a method for increasing gene expression using the promoter, enhancer and the like.
  • Patent Documents 1 to 3 In order to increase the gene expression efficiency, various gene expression promoters such as CMV promoter and CAG promoter have been developed (Patent Documents 1 to 3). One of them is a system that optimizes the combination of promoters and enhancers developed by the present inventors and increases gene expression in most mammalian cells (see Patent Document 4, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • genes to be expressed downstream of the promoter The gene can be expressed with high efficiency by using a cassette for gene expression in which an enhancer or a second promoter is linked downstream of a DNA construct containing a poly-A additional sequence.
  • a cassette for gene expression in which an enhancer or a second promoter is linked downstream of a DNA construct containing a poly-A additional sequence.
  • this vector is an effective vector for transient expression of cells, and the vector is further improved in order to produce mammalian cells that stably and highly produce the target protein currently required in the field of pharmaceutical production. There was a need.
  • the target gene is incorporated into the chromosome of the host cell, and gene amplification is used to incorporate multiple copies of the target gene.
  • the most frequently used method is a method using CHO-DG44 cells lacking dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • DHFR-deficient cells require culturing while increasing the concentration of methotrexate (MTX), which is a DHFR inhibitor, in stages.
  • MTX methotrexate
  • HRG Histidine-rich glycoprotein
  • HRG is a plasma protein having a molecular weight of about 80 kDa identified by Heimburger et al. (1972) in 1972. It is a high histidine-containing protein composed of a total of 507 amino acids, of which 66 histidines are present, is mainly synthesized in the liver, and is present in human plasma at a very high concentration of about 100-150 ⁇ g / ml.
  • a method for producing a sufficient amount of HRG by gene recombination technology has been desired.
  • PD-1 Programmed cell death 1
  • EMMPRIN extracellular matrix metalloproteinase inducer
  • NPTN ⁇ neuroplastin ⁇
  • EMB embigin
  • RAGE receptor for advanced glycation end products
  • MCAM melanoma cell adhesion molecule
  • ALCAM Proteins such as activated leukocyte cell adhesion molecule
  • ErbB2 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2
  • An object of the present invention is to provide a gene expression cassette for stably and highly producing a target protein.
  • the inventors of the present application have developed a gene expression cassette having a structure in which a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A addition sequence is sandwiched between a promoter (P) and an enhancer (P ′). Furthermore, the present inventors have found that the target protein can be stably and highly produced by using a gene expression cassette containing a transposon sequence (T) upstream of the promoter (P) and downstream of the enhancer (P ′). .
  • T transposon sequence
  • this invention consists of the following. 1.
  • a gene expression cassette having a structure in which a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A additional sequence is sandwiched between a promoter (P) and an enhancer (P ′), further upstream of the promoter (P) and an enhancer (P ′ A cassette for gene expression comprising a transposon sequence (T) downstream of 2.
  • the enhancer (P ′) linked downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A additional sequence includes any one or more selected from the hTERT enhancer, CMV enhancer and SV40 enhancer, 1 above 8.
  • the target gene is a protein selected from HRG, PD-1, EMMPRIN, NPTN ⁇ , EMB, RAGE, MCAM, ALCAM, ErbB2 and an antibody 9.
  • the gene expression cassette according to any one of 1 to 8 above which comprises a gene encoding a part or the whole. 10.
  • a gene expression plasmid comprising the gene expression cassette described in any one of 1 to 9 above. 11.
  • a gene expression vector comprising the gene expression cassette according to any one of 1 to 9 above.
  • 12. 10. A method for expressing a target gene using the expression cassette according to any one of 1 to 9 above.
  • 13. 10. A protein produced using the gene expression cassette according to any one of 1 to 9 above.
  • a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between transposon sequences (T), whereby high copy number gene expression is efficiently performed on the chromosome. It is possible to insert a cassette. Furthermore, the copy number of the gene expression cassette can be amplified with high efficiency by linking the replication initiation sequence (S) and the nuclear matrix binding sequence (M) ⁇ upstream or downstream of the gene expression cassette or upstream and downstream. It becomes possible.
  • M nuclear matrix binding sequence
  • S replication initiation sequence
  • T transposon sequence
  • FIG. 3 is a diagram showing a gene expression plasmid vector in which a gene expression cassette for transient expression is inserted into a cloning plasmid vector (pIDT-SMART) without a promoter of IDT.
  • B It is a figure which shows an example of the plasmid vector for gene expression of this invention which constructed
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing a configuration of various gene expression cassettes Nos. 1 to 10 specifically constructed in Examples.
  • Example 1 It is a figure which shows the base sequence (sequence number 1) of 5 'side TP (5'TP) upstream of a promoter (P), and the whole sequence (sequence number 2) of 5' side TP region.
  • Example 1 It is a figure which shows the base sequence (sequence number 3) of 3 'side TP (3'TP) downstream of an enhancer (P'), and the whole sequence (sequence number 4) of 3 'side TP region.
  • Example 1 It is a figure which shows a part of whole base sequence of No.4 gene expression vector (part of sequence number 8).
  • FIG. 5 is a view showing a part of the entire base sequence of No.
  • FIG. 5 is a view showing a part of the entire base sequence of No. 4 gene expression vector (part of SEQ ID NO: 8, continued from FIG. 5-2).
  • Example 2 It is a figure which shows a part of whole base sequence of No.1 gene expression vector (part of sequence number 9).
  • Example 2 is a view showing a part of the entire base sequence of No. 1 gene expression vector (part of SEQ ID NO: 9, continued from FIG. 6-1).
  • Example 2 is a view showing the results of measuring the GFP fluorescence intensity of each cell for CHO cells into which No. 1 to 10 gene expression vectors and controls were introduced.
  • FIG. 6 is a view showing the results of measuring the GFP fluorescence intensity of each cell for HEK293T cells into which No. 1 to 10 gene expression vectors and controls were introduced.
  • FIG. 6 is a view showing the results of correcting the GFP fluorescence intensity of each cell with quantified protein values for CHO cells into which No. 1 to 10 gene expression vectors were introduced.
  • FIG. 4 is a view showing the results of correcting the GFP fluorescence intensity of each cell for the HEK293T cells into which each of the gene expression vectors No. 1 to 10 was introduced, with the protein quantitative value.
  • Example 2 It is a figure which shows the structure of the HRG loading construct (No.4-HRG) for producing HRG.
  • Example 3 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence which acts on the form of a neutrophil when adding HRG to the culture system of a neutrophil about the HRG produced using the vector containing the cassette for No.4-HRG gene expression .
  • Example 3-1 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence which acts on the survival rate of a CLP sepsis model mouse about HRG produced using the vector containing the cassette for No.4-HRG gene expression.
  • Example 3-2 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence which acts on the production suppression activity of a reactive oxygen molecular species about HRG produced using the vector containing the cassette for No.4-HRG gene expression.
  • Example 3-3 It shows the amino acid sequence of the human IgG 2 Fc region.
  • Example 4 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of PD-1.
  • Example 4 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of EMMPRIN.
  • Example 5 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of NPTN ⁇ .
  • Example 6 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of EMB.
  • Example 7 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of RAGE.
  • Example 8 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of MCAM.
  • Example 9 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of ALCAM.
  • Example 10 It is a figure which shows the whole base sequence of the extracellular domain of ErbB2.
  • Example 11 It is a figure which shows the whole base sequence of HRG.
  • FIG. 4 is a diagram showing SDS-PAGE results of each Fc fusion protein obtained in Examples 4 to 12.
  • Example 5 It is the result figure which each confirmed the blocking effect with respect to the cancer cell chemotaxis promoting effect by S100A8 / A9 about NPTN-Fc and EMMPRIN-Fc produced in each Example.
  • Example 6 It is a result figure which confirmed the blocking effect with respect to the cancer cell chemotaxis promoting effect by S100A8 / A9 about RAGE-Fc, ALCAM-Fc, MCAM-Fc, and EMB-Fc produced in each Example, respectively.
  • Example 6 It is the result figure which confirmed the blocking effect with respect to the cancer cell chemotaxis promoting effect by S100A8 / A9 about RAGE-Fc, ALCAM-Fc, MCAM-Fc, and EMB-Fc produced in each Example, respectively.
  • the “gene expression cassette” refers to a set of DNAs that allow a target protein to be expressed by genetic recombination, and more specifically, a gene (target gene) encoding the target protein. Furthermore, it refers to a set of DNA including various DNA sequences for allowing the gene to be expressed.
  • target protein means a protein to be expressed and / or produced.
  • the “gene expression cassette” includes at least “promoter (P)”, “DNA construct (X) containing a target gene and polyA addition sequence”, and “enhancer (P ′)”. It contains DNA and is further characterized by containing a “transposon sequence (T)”. Furthermore, “replication initiation sequence (S)” and “nuclear matrix binding sequence (M)” may be included.
  • the “gene expression cassette” of the present invention has a structure in which a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A addition sequence is sandwiched between at least a promoter (P) and an enhancer (P ′). And a transposon sequence (T) downstream of the enhancer (P ′). In addition, a nuclear matrix binding upstream of the promoter (P) and / or downstream of the enhancer (P ′).
  • the sequence (M) and the replication start sequence (S) may be arranged.
  • a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between transposon sequences (T), whereby high copy number gene expression is efficiently performed on the chromosome. It is possible to insert a cassette. Furthermore, the copy number of the gene expression cassette can be amplified with high efficiency by linking the replication initiation sequence (S) and the nuclear matrix binding sequence (M) upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream. It becomes possible.
  • S replication initiation sequence
  • M nuclear matrix binding sequence
  • the “gene expression cassette” of the present invention comprises a promoter (P), a DNA construct containing a target gene and a poly A addition sequence (X), an enhancer (P ′) and a transposon sequence (T), and a replication initiation sequence.
  • P promoter
  • X poly A addition sequence
  • P ′ enhancer
  • T transposon sequence
  • S replication initiation sequence
  • S is at least the order shown in any one of 1) to 4) below.
  • the transposon sequence (T) may include a sequence in which a transposon-identifying sequence is linked two or more times.
  • the target gene includes a gene (DNA) encoding the target protein, and is a gene having a different origin from the host cell.
  • the genes derived from the same may be used.
  • a reporter gene may be included for detection of an expressed gene or diagnosis of a disease.
  • the poly A addition sequence can be a sequence known per se, and its origin is not limited, but a poly A addition sequence derived from a growth hormone gene, for example, a poly A addition derived from a bovine growth hormone gene Examples include sequences, poly A addition sequences derived from human growth hormone genes, poly A addition sequences derived from SV40 virus, poly A addition sequences derived from human and rabbit ⁇ -globin genes, and the like. Inclusion of the poly A addition sequence in the gene expression cassette increases transcription efficiency.
  • the type of the target gene is not limited, and DNA that encodes the target protein to be produced by gene recombination technology or the purpose of expression in vivo for use in the treatment of a specific disease DNA encoding the protein can be used.
  • Examples of the target protein shown in the present specification include proteins that can be used for research and development in the medical field, or for pharmaceuticals, pharmaceuticals, diagnostic agents, or reagents.
  • Such a protein may be a protein known per se or a protein to be found in the future.
  • the protein may be a whole or a part. Furthermore, it may be a protein comprising a complex.
  • proteins include, for example, HRG (histidine rich glycoprotein), PD-1 (Programmed cellMPdeath 1), EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer), NPTN ⁇ (neuroplastin ⁇ ), EMB (embigin), RAGE (receptor for advanced glycation end products ), MCAM (melanoma-cell-adhesion-molecule), ALCAM (activated leukocyte-cell-adhesion-molecule), ErbB2 (Receptor-tyrosine-protein-kinase-erbB-2) and antibodies.
  • the target protein may be an Fc fusion protein (Fc fusion protein) obtained by fusing a protein and an Fc region of an antibody.
  • a full-length cDNA encoding HRG or a cDNA encoding a portion having the activity of HRG, for example, a full-length cDNA encoding the amino acid sequence of mature HRG (SEQ ID NO: 10), or a cDNA encoding the portion is cloned into an expression vector.
  • HRG can be prepared. For example, it can be prepared from the whole or part of the nucleotide specified by GenBank Accession No. NM000412 using a gene recombination technique.
  • the HRG as the active ingredient of the present invention may be the entire mature HRG, or a partial protein or peptide having HRG activity in the mature HRG.
  • HRG functions as a neutrophil activation regulator and can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for diseases caused by neutrophil activation. HRG is also effective for treating diseases caused by neutrophil activation and / or inflammatory diseases accompanied by neutrophil activation.
  • the amino acid sequence of the mature PD-1 extracellular domain (SEQ ID NO: 14), the amino acid sequence of the mature EMMPRIN extracellular domain (SEQ ID NO: 16), the amino acid sequence of the mature NPTN ⁇ extracellular domain (SEQ ID NO: 16) 18), amino acid sequence of mature EMB extracellular domain (SEQ ID NO: 20), amino acid sequence of mature RAGE extracellular domain (SEQ ID NO: 22), amino acid sequence of mature MCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 24), mature type Based on the amino acid sequence of the ALCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 26), the full-length cDNA encoding the amino acid sequence of the mature ErbB2 extracellular domain (SEQ ID NO: 28) or the like, or the cDNA encoding the portion, cloned into an expression vector, Each protein can be prepared. As a method for preparing a target gene when Fc is fused to a protein, a method known per se or any method developed in the future can be applied.
  • PD-1 is a single transmembrane protein that exists on the immune cell side and serves to suppress immune cells.
  • EMMPRIN, NPTN, EMB, RAGE, MCAM, ALCAM, etc. are present in cancer cells and are known as adhesion molecules (single transmembrane protein) belonging to the immunoglobulin superfamily.
  • EMMPRIN is Kanekura T, Chen X.
  • NPTN ⁇ is disclosed in Owczarek S, Berezin V. Neuroplastin: cell adhesion molecule and signaling receptor. Int J Biochem Cell Biol. 2012 Jan; 44 (1): 1-5.
  • Doi: 10.1016 / j.biocel.2011.10.006 EMB is disclosed in Chao F, Zhang J, Zhang Y, Liu H, Yang C, Wang J, Guo Y, Wen X, Zhang K, Huang B, Liu D, Li Y.
  • Embigin, regulated by HOXC8 plays a suppressive role in breast tumorigenesis.
  • RAGE is Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, Herbst R, Coyle AJ. HMGB1 and RAGE and cancer.
  • MCAM is Wang Z, Yan X. CD146, a multi-functional molecule beyond adhesion. Cancer Lett. 2013 Apr 28; 330 (2): 150-62. doi: 10.1016 / j.canlet.2012.11.049.
  • ALCAM is Ofori-Acquah SF, King JA. Activated leukocyte cell adhesion molecule: a new paradox in cancer. Transl Res. 2008 Mar; 151 (3): 122-8. doi: 10.1016 / j.trsl.2007.09.006.
  • ErbB2 present in cancer cells is known as an oncogene, and this overexpression is said to be greatly involved in carcinogenesis and subsequent cancer progression. ErbB2 is disclosed in Appert-Collin A, Hubert P, Cremel G, Bennasroune A. Role of ErbB Receptors in Cancer Cell Migration and Invasion. Front Pharmacol. 2015 Nov 24; 6: 283. Doi: The
  • an Fc fusion protein in which the above-mentioned protein and the Fc region of an antibody are fused, it is preferable to bind a cDNA encoding Fc to a site encoding the C′-terminal side of the protein.
  • Antibodies are composed of polypeptides called heavy chains (H chains) and light chains (L chains).
  • the H chain is composed of a variable region (VH) and a constant region (CH) from the N-terminal side
  • the L chain is composed of a variable region (VL) and a constant region (CL) from the N-terminal side.
  • CH is further composed of CH1, hinge, CH2, and CH3 domains from the N-terminal side. Further, CH2 and CH3 are collectively referred to as an Fc region.
  • the antibody produced by the method of the present invention may be an antibody fragment that is an intact antibody or a small molecule antibody.
  • antibody class examples include immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), and immunoglobulin M (IgM).
  • the antibody that can be produced by the method of the present invention is preferably IgG.
  • IgG subclasses include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • the subclass of the antibody that can be produced by the method of the present invention can be appropriately determined according to the purpose of use, and may be any subclass of antibody.
  • Antibody fragments include functional antibody fragments selected from the group consisting of Fv, Fab, (Fab ′) 2 , Fab ′, Fc fragment, and diabody. For example, it may be an Fc fusion protein obtained by fusing an antibody Fc region with a necessary protein.
  • a transposon is a base sequence that can transpose a position on the genome in a cell. It is also called a moving gene, Transposable element. There are two types: a DNA type in which DNA fragments are transferred directly, and an RNA type that undergoes a process of transcription and reverse transcription. Transposons are also found in microorganisms such as bacteria and yeasts, and these transposable elements are DNAs having a certain base sequence, and a plurality of transposons exist per cell as components of normal chromosomes such as bacteria and yeasts. This factor is also called an insertion sequence (IS) because it exists in the chromosome. Transposons are useful as gene transfer vectors and mutagens, and are applied to various organisms in genetics and molecular biology.
  • the transposon is incorporated into a gene expression cassette.
  • the “transposon sequence (T)” refers to a sequence that identifies the transposon.
  • the transposon sequence (T) may include a sequence in which a transposon-identifying sequence is linked two or more times.
  • the DNA replication reaction begins in a fixed position on the chromosome, the replication start point, and proceeds in both directions.
  • a large number of replication origins are required, and their activities are controlled temporally and spatially. It is considered.
  • various reactions that occur on chromosomes, including DNA replication are closely related to each other, and chromosome homeostasis is maintained.
  • the region where the replication is initiated includes a replication initiation sequence, such as a replication initiation sequence (ROIS) or an autonomous replication sequence (ARS).
  • ROIS replication initiation sequence
  • ARS autonomous replication sequence
  • the nuclear matrix is considered to constitute not only the retention of chromatin in the nucleus but also an important place for various nuclear events such as gene transcription and replication, DNA damage repair, and apoptosis to function.
  • a plasmid containing a replication initiation sequence and a nuclear matrix binding region is considered to efficiently amplify a gene in a cell.
  • the “nuclear matrix binding sequence (M)” refers to a sequence specified as a sequence that binds to the nuclear matrix.
  • the nuclear matrix binding sequence (M) it is more preferable to include the nuclear matrix binding sequence (M) together with the replication initiation sequence (S).
  • the nuclear matrix binding sequence (M) is arranged in the upstream region from the replication initiation sequence (S).
  • Promoter is a specific base sequence on DNA that initiates transcription using DNA as a template, and is placed upstream of the target gene.
  • the promoter that can be used in the “promoter (P)” of the present specification refers to the “first promoter” shown in Patent Document 4, and the “enhancer (P ′)” refers to the “enhancer” and “ Reference can be made to the description of “2 promoters”. Specifically, this will be described below.
  • promoter (P) is not particularly limited, and a promoter known per se can be applied.
  • Non-specific promoters that can promote the expression of the target gene in any cell or tissue and specific or selective promoters such as tissue or organ-specific promoters, tumor-specific promoters, developmental or differentiation-specific promoters can be used.
  • a promoter applicable in the present invention is preferably a promoter that increases the copy number of an infectious plasmid or a proliferative cell-specific promoter.
  • Specific examples include SV40 promoter, CMV promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter, EF1-alpha promoter, ubiquitin promoter, and the like.
  • CMV-i promoter hCMV + intron promoter
  • the animal species from which the ⁇ -actin promoter is derived is not limited, and a mammalian ⁇ -actin promoter such as a human ⁇ -actin promoter or a chicken triactin promoter is used.
  • Artificial hybrid promoters such as the above CMV-i promoter can also be used.
  • the CMV-i promoter can be synthesized based on the descriptions in US Pat. No. 5,168,062 and US Pat. No. 5,858,839.
  • hTERT human telomerase reverse transcriptase
  • PSA prostate specific antigen
  • c-myc GLUT promoters, etc.
  • U6, H1 promoter, etc. are used to express the short hairpin RNA (shRNA), ESCT / cancer stem cell-specific promoter is OCT3 / 4, NANOG promoter, etc., and neural stem cell-specific promoter is Nestin promoter, etc.
  • shRNA short hairpin RNA
  • ESCT / cancer stem cell-specific promoter is OCT3 / 4, NANOG promoter, etc.
  • neural stem cell-specific promoter is Nestin promoter, etc.
  • HSP70, HSP90, and p53 promoters may be linked as cell stress sensing promoters
  • albumin promoters may be linked as hepatocyte-specific promoters
  • TNF-alpha promoters may be linked as radiation sensitive promoters.
  • the “enhancer (P ′)” is not particularly limited as long as it results in an increase in the amount of messenger RNA (mRNA) generated by transcription.
  • An enhancer is a base sequence that has the effect of promoting the action of a promoter, and generally there are many sequences consisting of around 100 bp. Enhancers can promote transcription regardless of sequence orientation.
  • the enhancer (P ′) used in the present invention may include one type of enhancer, but a plurality of two or more identical enhancers may be used, or a plurality of different enhancers may be used in combination. Specifically, the order is not limited.
  • a CMV enhancer for example, a CMV enhancer, SV40 enhancer, hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) enhancer, or the like can be used.
  • An example is a hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer linked in this order.
  • the enhancer (P ′) is arranged downstream of the DNA construct (X) containing the gene of interest and the poly A addition sequence of the present specification, so that gene expression can be expressed more strongly.
  • the sequence may have the same function as the promoter and the same sequence as the promoter.
  • the promoter (P) and the enhancer (P ′) may be the same or different.
  • a specific promoter can be used as the promoter (P), and a non-specific promoter can be used as the enhancer (P ′).
  • P the promoter
  • P ′ the enhancer
  • the combination of the CMV-i promoter and the CMV enhancer allows the insertion of any gene in almost all cells (host cells), and no matter what transfection reagent is used, Protein expression is possible.
  • an enhancer sequence in addition to the enhancer contained in the enhancer (P ′), can be arranged upstream of the promoter (P).
  • a specific cell for example, HEK293 cell line and MCF7 cell line shown in Examples of Patent Document 4
  • a specific gene such as REIC /
  • the expression is further enhanced in the Dkk-3 gene and the CD133 gene.
  • further enhancement of expression is expected depending on specific cells (for example, HepG2 cell line or HeLa cell line).
  • the “gene expression cassette” of the present invention can be incorporated into a gene expression vector.
  • the present invention also includes a vector containing the gene expression cassette of the present invention.
  • the site into which the target gene is inserted may exist as a multicloning site.
  • the target gene can be inserted into the multicloning site (insertion site) using a sequence recognized by a restriction enzyme.
  • a gene expression cassette that does not include the target gene DNA itself and includes a portion into which the DNA is inserted as a multicloning site is also included in the present invention.
  • RU5 ′ may be linked immediately upstream of the DNA encoding the target protein.
  • the term “immediately upstream” means that they are directly linked without intervening elements having other specific functions, but a short sequence may be included as a linker.
  • SV40-ori may be linked to the most upstream of the gene expression cassette. SV40-ori is a binding region of the SV40 gene, and gene expression is increased by subsequently inserting the SV40 gene.
  • Each of the above elements needs to be functionally linked.
  • the term “functionally linked” means that each element exerts its function and is linked so that expression of the target gene is enhanced.
  • vectors for inserting the gene expression cassette of the present invention include plasmids, adenovirus (Ad) vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors, and other virus vectors. And non-viral vectors such as biodegradable polymers.
  • the vector having the gene expression cassette introduced therein can be introduced into cells by a known method such as infection or electroporation. As a gene introduction method, a method known per se or any method developed in the future can be applied. For example, the gene may be introduced using a known transfection reagent.
  • a commercially available vector may be modified to include the expression cassette of the present invention.
  • an enhancer can be incorporated into a downstream region of a gene expression cassette of a commercially available vector such as a pShuttle vector.
  • the present invention further includes a viral vector comprising the above-described target gene expression cassette.
  • viral vectors for example, Ad vector and AAV vector enable specific diagnosis or treatment of diseases such as cancer, but the gene expression cassette of the present invention can stably and continuously express genes. It is desirable to use it depending on the purpose of gene expression.
  • the viral vector can be prepared by inserting the above-described target gene expression cassette onto a viral genome that can be used as a vector.
  • a vector into which a gene expression cassette of the present invention has been inserted is introduced into a cell, and the cell is transfected to express the target gene in the cell and produce the target protein.
  • a eukaryotic cell or a prokaryotic cell system can be used.
  • eukaryotic cells include cells such as established mammalian cell systems, insect cell systems, filamentous fungal cells, and yeast cells.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus bacteria, and the like. Bacterial cells are mentioned.
  • mammalian cells such as HEK293 cells, CHO cells, Hela cells, COS cells, BHK cells, and Vero cells are used.
  • the transformed host cell can be cultured in vitro or in vivo to produce the target protein.
  • Host cells are cultured according to a known method.
  • a known culture medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium.
  • the produced protein can be purified by a known method from a culture solution in the case of a secreted protein or from a cell extract in the case of a non-secreted protein.
  • a cell may be produced by simultaneously transfecting a plurality of vectors containing different target genes. By doing so, a plurality of proteins can be produced at one time.
  • Example 1 Gene Expression Cassette
  • gene expression cassettes for various constructs were constructed. Specifically, by inserting a gene expression cassette capable of producing a protein with the highest efficiency in the transient expression shown in Patent Document 4 into a cloning plasmid vector (pIDT-SMART) without a promoter of IDT, A pCMViR-TSC expression vector was prepared (FIG. 1). pCMViR indicates that the RU5 ′ sequence is inserted downstream of the CMV-i promoter.
  • transposon sequence T
  • S replication initiation sequence
  • M nuclear matrix binding sequence
  • the gene of interest GFP (Green fluorescent protein), Puro r (Puromycin resistance) and 2A - include (2A self-processing peptide short self-processing peptide), indicated by "GFP-2A-Puro r” It was.
  • BGH polyA was used as the polyA addition sequence, “CMViR promoter” as the promoter (P), and “hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer linked” as the enhancer (P ′).
  • the transposon sequence (T) is indicated by “TP”
  • the replication initiation sequence (S) is indicated by “ROIS” or “ARS”
  • the nuclear matrix binding sequence (M) is indicated by “MIS”.
  • the transposon sequence (T) may contain a plurality of sequences specified by “TP” as shown by Nos. 2, 5, and 9, for example.
  • the base sequence of the 5 ′ TP (5′TP) upstream of the promoter (P) is shown in SEQ ID NO: 1, and the entire sequence of the 5 ′ TP region is shown in SEQ ID NO: 2 (see FIG. 3).
  • the base sequence of the 3 ′ TP (3′TP) downstream of the enhancer (P ′) is shown in SEQ ID NO: 3, and the entire sequence of the 3 ′ TP region is shown in SEQ ID NO: 4 (see FIG. 4).
  • the base sequence of ROIS is shown in SEQ ID NO: 5
  • the base sequence of ARS is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the base sequence of MIS is shown in SEQ ID NO: 7.
  • ARS (SEQ ID NO: 6) TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGATACACATTTACCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAATTCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATA
  • MIS SEQ ID NO: 7
  • Example 2 Evaluation of cassette for gene expression Preparation of expression vectors (each gene expression vector for No. 1 to 10) containing the cassettes for gene expression No. 1 to 10 (Fig. 2) constructed in Example 1 did.
  • a vector containing pCMViR-TSC shown in FIG. 2 was used as a control.
  • FIG. 5 the entire base sequence of the No. 4 gene expression vector, which is the most effective high-efficiency expression plasmid vector in CHO cells, is shown in FIG. 5 (SEQ ID No. 8).
  • FIG. 6 shows the entire base sequence of the No. 1 gene expression vector, which is the most efficient high-efficiency expression plasmid vector in HEK293T cells.
  • the cDNA sequence encoding the target gene GFP-2A-Puro was inserted in the forward direction using EcoRI restriction enzyme site and XbaI restriction enzyme site.
  • Each of the gene expression vectors No. 1 to 10 and the control were introduced into the cells, and the expression level of the GFP fluorescent protein was evaluated by the fluorescence intensity according to the following procedure.
  • the cells were cultured in a well plate to 70% to 80% using FuGENE TM -HD (gene transfer reagent), and each gene expression vector of No. 1 to 10 and the control were treated with a transposase expression vector and DNA amount 1 : Co-transfected with 1.
  • the transposase expression vector carries the transposase gene in the pCMViR-TSC vector, which is a vector for transient expression.
  • TP By co-transfecting with each gene expression vector, the gene expression cassette is excised at the end of the transposon sequence, and efficiently transferred to the TTAA site in the host genome. After the cells transfected by this method were incubated for 24 hours, the GFP fluorescence intensity of the cells was measured using a fluorescence plate reader (FLUOROSKAN ASCENT FL, Thermo scientific). No cells were marked (-).
  • CHO cells and HEK293T cells into which No. 1 to 10 gene expression vectors and controls were introduced were cultured for 48 hours, and then 10 ⁇ g / ml of puromycin (antibiotics) was added to the medium once every 3 days. While exchanging, drug selective culture was performed for 3 weeks.
  • the fluorescence intensity of each cell after 3 weeks of culture was measured with a fluorescence plate reader, and compared with the fluorescence intensity of cells cultured for 24 hours after control and transfection.
  • the fluorescence intensity in CHO cells is shown in FIG. 7, and the fluorescence intensity in HEK293T cells is shown in FIG.
  • each cell that had been subjected to drug selective culture for 3 weeks was collected after measuring the fluorescence intensity, and the fluorescence intensity of the cell was corrected based on the value of protein quantification.
  • Each gene expression vector was compared and examined. As a result, CHO cells showed particularly high values with the No. 4 gene expression vector (FIG. 9), and HEK293T cells showed particularly high values with the No. 1 gene expression vector (FIG. 10).
  • the CHO cell contains the ROIS sequence or ARS sequence together with the MIS sequence upstream and downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and poly A addition sequence, and further contains the transposon sequence (T) upstream and downstream.
  • the gene expression cassette of the present invention was confirmed to be capable of stably producing the target protein for a long period of time.
  • the target protein can be obtained over a long period of time. It was confirmed that stable production was possible.
  • Example 3 Production of human histidine-rich glycoprotein (HRG)
  • HRG histidine-rich glycoprotein
  • No. 4 gene expression cassette which is the most effective high efficiency gene expression cassette in CHO cells shown in Example 1
  • No. 4-HRG expression vector was prepared using DNA consisting of the base sequence specified by No. BC069574 (NCBI)) (see FIG. 11).
  • the culture supernatant containing recombinant human HRG was collected.
  • QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel gel with Ni-NTA bound to Sepharose CL-6B support ) pre-washed with 30 ml of PBS (-) was added to the culture supernatant and rotated at 4 ° C for 2 times. It performs time was bound recombinant human HRG in QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel.
  • HRG produced by the genetic recombination technique of the present invention (hereinafter referred to as “genetical HRG”) and human plasma-derived HRG produced in Example 1 of International Publication WO2013 / 183494 (hereinafter referred to as “plasma-derived HRG”) ),
  • the activity of inducing the neutrophil neutrophil form (neutrophilization activity), the survival rate of CLP sepsis model mice, and the activity of inhibiting the production of reactive oxygen molecular species were confirmed.
  • Example 4 Production of genetically modified PD-1
  • production of PD-1 extracellular domain by genetic recombination is described.
  • a TP sequence is upstream of the promoter
  • an enhancer is downstream of the DNA construct containing the gene to be expressed downstream of the promoter and a poly A addition sequence
  • an MIS sequence, ROIS sequence, and TP sequence are further downstream.
  • a CHO cell that stably and highly produces the target protein was produced, and a protein as a drug candidate was produced with high efficiency using the cell.
  • the structure of the construct used is shown in FIG.
  • the gene to be expressed was inserted as an inserted gene using the No. 4 construct of FIG.
  • Proteins that are drug candidates are all fused with the Fc region of human IgG, which is a part of the antibody, to improve the stability of protein preparations that are generally considered to have low stability in the body and are difficult to obtain. Further improvement and further use of the Fc region of human IgG 2 is considered to be a pharmaceutical product having low complement activity and mitigating inflammatory reactions as side effects.
  • the entire base sequence of the human IgG 2 Fc region is shown in FIG. 15, and the base sequence including the linker and the restriction enzyme recognition site is shown in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the human IgG 2 Fc region is shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • the extracellular domain of genetically modified PD-1 was prepared as follows. DNA encoding the coding region of the PD-1 extracellular domain shown in FIG. 16 as the target gene using the No. 4 gene expression cassette, which is the most effective high-efficiency gene expression cassette in the CHO cells shown in Example 1. A sequence encoding the Fc region of human IgG 2 shown in FIG. 15 is fused to the base sequence shown in (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC074740 (NCBI)), and a polynucleotide (exPD-1- Fc) was produced. A No. 4-exPD-1-Fc expression vector was prepared by replacing HRG in the HRG-loaded construct shown in FIG. 11 with PD-1-Fc. ExPD-1-Fc was transfected by the same method as in Example 3.
  • CHO cells with high production of Fc fusion protein in the logarithmic growth phase are prepared at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml, seeded with 500 ml in a hyperflask (Corning), and CD at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2.
  • -Cultured for 10 days using -CHO Medium (Life Technologies) and the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant was added to a column packed with Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) previously washed with 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) to bind the Fc fusion protein.
  • Non-specifically bound protein was washed with 20 mM sodium phosphate (pH 7.0).
  • the Fc fusion protein was eluted with 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7), and the eluate was neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 9.0).
  • the Fc fusion protein produced in this example is referred to as exPD-1-Fc.
  • the amino acid sequence of the mature PD-1 extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • Amino acid sequence of mature PD-1 extracellular domain (SEQ ID NO: 14) GWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
  • Example 5 Production of gene recombinant EMMPRIN
  • the human IgG 2 shown in FIG. 15 is transferred to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the EMMPRIN extracellular domain shown in FIG. 17 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000172270 (Ensembl)).
  • the sequence encoding the Fc region was fused to prepare a polynucleotide (exEMMPRIN-Fc).
  • Example 4 EMMPRIN extracellular domain + human IgG 2
  • An Fc fusion protein was produced.
  • the Fc fusion protein produced in this example is called exEmmprin-Fc.
  • the amino acid sequence of the EMMPRIN extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • Amino acid sequence of mature EMMPRIN extracellular domain (SEQ ID NO: 16) ASGAAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGRSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSKGSDHL
  • Example 6 Production of Recombinant NPTN ⁇ This example describes the production of NPTN ⁇ extracellular domain by genetic recombination.
  • the base sequence of the DNA encoding the coding region of the NPTN ⁇ extracellular domain shown in FIG. 18 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000156642 (Ensembl)) is changed to the base sequence of FIG. Except that the sequence encoding the Fc region of human IgG 2 shown in Fig. 2 was fused to produce a polynucleotide (exNPTN ⁇ -Fc), and the genetic recombination procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that the NPTN ⁇ extracellular domain was used. + An Fc fusion protein of human IgG 2 was prepared. The Fc fusion protein produced in this example is referred to as exENPTN ⁇ -Fc.
  • the amino acid sequence of the NPTN ⁇ extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • Amino acid sequence of mature NPTN ⁇ extracellular domain (SEQ ID NO: 18) QNAGFVKSPMSETKLTGDAFELYCDVVGSPTPEIQWWYAEVNRAESFRQLWDGARKRRVTVNTAYGSNGVSVLRITRLTLEDSGTYECRASNDPKRNDLRQNPSITWIRAQATISVLQKPRIVTSEEVIIRDSPVLPVTLQCNLTSSSHTLTYSYWTKNGVELSATRKNASNMEYRINKPRAEDSGEYHCVYHFVSAPKANATIEVKAAPDITGHKRSENKNEGQDATMYCKSVGYPHPDWIWRKKENGMPMDIVNTSGRFFIINKENYTELNIVNLQITEDPGEYECNATNAIGSASVVTVLRVRSHL
  • Example 7 Production of genetically modified EMB
  • the human IgG 2 shown in FIG. 15 is transferred to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the EMB extracellular domain shown in FIG. 19 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC059398 (NCBI)).
  • the sequence encoding the Fc region was fused to prepare a polynucleotide (exEMB ⁇ -Fc), and the genetic recombination procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that EMB extracellular domain + human IgG 2
  • An Fc fusion protein was produced.
  • the Fc fusion protein produced in this example is referred to as exEMB-Fc.
  • the amino acid sequence of the EMB extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
  • Amino acid sequence of mature EMB extracellular domain (SEQ ID NO: 20) DGSAPDSPFTSPPLREEIMANNFSLESHNISLTEHSSMPVEKNITLERPSNVNLTCQFTTSGDLNAVNVTWKKDGEQLENNYLVSATGSTLYTQYRFTIINSKQMGTFCFCREEKEKRGPLNFCKNCFPLNWTWC
  • Example 8 Production of genetically modified RAGE
  • the human IgG 2 shown in FIG. 15 is transferred to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the RAGE extracellular domain shown in FIG. 20 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000204305 (Ensembl)).
  • the sequence encoding the Fc region was fused to prepare a polynucleotide (exRAGE-Fc), and the genetic recombination procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that RAGE extracellular domain + human IgG 2
  • An Fc fusion protein was produced.
  • the Fc fusion protein produced in this example is called exRAGE-Fc.
  • the amino acid sequence of the RAGE extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • Amino acid sequence of mature RAGE extracellular domain (SEQ ID NO: 22) QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLA
  • Example 9 Production of genetically modified MCAM
  • the human IgG 2 shown in FIG. 15 is changed to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the MCAM extracellular domain shown in FIG. 21 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC056418 (NCBI)).
  • the sequence encoding the Fc region was fused to prepare a polynucleotide (exMCAM-Fc), and a genetic recombination procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that MCAM extracellular domain + human IgG 2
  • An Fc fusion protein was produced.
  • the Fc fusion protein produced in this example is called exMCAM-Fc.
  • the amino acid sequence of the MCAM extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 24 in the Sequence Listing.
  • Example 10 Production of genetically modified ALCAM
  • the human IgG 2 shown in FIG. 15 is transferred to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the ALCAM extracellular domain shown in FIG. 22 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC137097 (NCBI)).
  • the sequence encoding the Fc region was fused to prepare a polynucleotide (exALCAM-Fc), and a genetic recombination procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that ALCAM extracellular domain + human IgG 2
  • An Fc fusion protein was produced.
  • the Fc fusion protein produced in this example is called exALCAM-Fc.
  • the amino acid sequence of the ALCAM extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.
  • Amino acid sequence of mature ALCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 26) WYTVNSAYGDTIIIPCRLDVPQNLMFGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFVCMLVTEDNVFEAPTIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWYRNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKADIQMPFTCSVTYYGPSGQKTIHSEQAVFDIYYPTEQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQPEGIRSSNTYTLTDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGDALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESLTLIVEGKPQIKMTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPK
  • Example 11 Production of Recombinant ErbB2
  • the human IgG 2 shown in FIG. 15 is transferred to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the ErbB2 extracellular domain shown in FIG. 23 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000141736 (Ensembl)).
  • the sequence encoding the Fc region was fused to prepare a polynucleotide (exErbB2-Fc), and a genetic recombination procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that ErbB2 extracellular domain + human IgG 2 An Fc fusion protein was produced.
  • the Fc fusion protein produced in this example is referred to as exErbB2-Fc.
  • the amino acid sequence of the ErbB2 extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing.
  • the target gene consists of a base sequence identified by DNA encoding the HRG coding region shown in FIG. 24 (GenBank Accession No. BC069574 (NCBI)).
  • a sequence encoding the Fc region of human IgG 2 shown in FIG. 15 was fused to the base sequence of DNA) to prepare a polynucleotide (HRG-Fc), and genetic recombination was carried out in the same manner as in Example 4 except that it was used. do, to produce a Fc fusion protein of HRG + human IgG 2.
  • the Fc fusion protein produced in this example is referred to as HRG-Fc.
  • the amino acid sequence of HRG is shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing as in Example 3.
  • Example 4 Protein Expression Level Each purified Fc fusion protein produced by the methods of Examples 4 to 12 was separated using SDS-PAGE, and the purity of the Fc fusion protein was confirmed by CBB staining (FIG. 25). Further, the amount of the purified Fc fusion protein was quantified by the Bradford method, and the amount of the purified protein during 500 ml culture was calculated and shown in Table 1.
  • Example 5 Neutrophil neutrophil activation activity by HRG
  • HRG activity was measured for the recombinant human HRG (rHRG) prepared in Example 3 of the present specification, the HRG-Fc prepared in Example 12 and the plasma-derived HRG (hHRG) prepared in Example 3, and each activity was measured. Compared.
  • Isolate neutrophils from blood collected from human cubital vein by a conventional method using a blood cell separation solution Polymorphprep TM : Polymorphoprep (Cosmo Bio), and 2 with PBS (-) It adjusted to x10 ⁇ 6 > / ml.
  • the cell suspension solution 3 ml, 1.5 [mu] l of Hoechst-based dye (10 mg / ml) is a nuclear staining dye, the Calcein-AM (5 mM) 3 ⁇ l of a fluorescent staining dye that is suitable for dyeing live cells added And incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and suspended in 6 ml of Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) to prepare a 1 ⁇ 10 6 / ml neutrophil suspension.
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • FIG. 26 is a photograph showing the shape of each cell when the cell is processed under the conditions of this experimental example.
  • Example 6 Blocking effect of S100A8 / A9 on cell chemotaxis promoting activity
  • NPTN-Fc Example 6
  • EMMPRIN-Fc Example 5
  • RAGE-Fc Example 8
  • Confirmed blocking effect of S100A8 / A9 on the promotion of cancer cell chemotaxis for each protein produced in ALCAM-Fc (Example 10), MCAM-Fc (Example 9) and EMB-Fc (Example 7) did.
  • S100A8 / A9 is known as a protein that promotes the migration and invasiveness of cancer cells.
  • the S100A8 gene is specified by Ensembl Gene ID: ENSG00000143546
  • the S100A9 gene is specified by Ensembl Gene ID: ENSG00000163220. Based on these genetic information, the test of this experimental example was performed using the S100A8 / A9 protein produced by the method shown in Biochemistry and Biophysics Reports 6 (2016) 94-100.
  • the chemotaxis ability of B16-BL6 cells was measured by the Boyden chamber method.
  • the test by the Boyden chamber method in this experimental example was performed using a combination of a chamber equipped with a polycarbonate membrane having a pore diameter of 3 to 12 ⁇ m and a 24-well plate.
  • the lower chamber was filled with 800 ⁇ l of DMEM / F12 medium (containing 0.1% serum) containing S100A8 / A9 at a final concentration of 100 ng / ml.
  • a cell suspension containing 5 ⁇ 10 4 cells / 200 ⁇ l of B16-BL6 cells was added to DMEM / F12 serum-free medium, incubated for 12 hours at 37 ° C., and then passed through the chamber membrane. Cells were counted.
  • NPTN-Fc Example 6
  • EMMPRIN-Fc Example 5
  • RAGE-Fc Example 8
  • ALCAM-Fc Example 10
  • MCAM-Fc Example 9
  • EMB-Fc implemented
  • the promoter (P) According to the gene expression cassette, which contains a transposon sequence (T) upstream of the enhancer (P ′) and downstream of the enhancer (P ′), it is possible to produce a large amount of protein that has been difficult to produce by conventional gene recombination. Can do. Further, in the above, the target protein can be produced more stably and in large quantities more effectively by appropriately arranging a combination of the nuclear matrix binding sequence (M) upstream of the replication initiation sequence (S) together with the transposon sequence (T). can do.
  • M nuclear matrix binding sequence
  • S replication initiation sequence
  • a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between transposon sequences (T), whereby high copy number gene expression is efficiently performed on the chromosome. It is possible to insert a cassette. Furthermore, the copy number of the gene expression cassette can be amplified with high efficiency by linking the replication initiation sequence (S) and the nuclear matrix binding sequence (M) upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream. It becomes possible.
  • S replication initiation sequence
  • M nuclear matrix binding sequence
  • M nuclear matrix binding sequence
  • S replication initiation sequence
  • T transposon sequence
  • the target protein to be expressed can be produced stably and in large quantities by ultrahigh expression.
  • a wide range of applications are possible, including application as a therapeutic protein drug and clinical treatment, testing, and diagnosis.
  • proteins that can be used for research and development in the medical field, and for drugs, pharmaceuticals, diagnostics, or reagents include HRG, PD-1, EMMPRIN, NPTN ⁇ , EMB, RAGE, MCAM, ALCAM, ErbB2, and antibodies It is done.

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Abstract

目的タンパク質を安定かつ高産生するための遺伝子発現用カセットを提供する。目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター（Ｐ）の上流及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセットによる。さらに、上記において、トランスポゾン配列（Ｔ）とともに、複製開始配列（Ｓ）の上流に核マトリックス結合配列（Ｍ）を組み合わせて適宜配置することで、より効果的に目的タンパク質を安定的かつ大量に産生することができる。例えばHRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2や抗体を安定的かつ大量に産生することができる。

Description

遺伝子発現用カセット及びその産生物
　本発明は、組換えタンパク質を大量かつ安定的に産生しうる遺伝子発現用カセットに関し、さらには当該遺伝子発現用カセットを用いた遺伝子の発現方法及びその産生物に関する。具体的には、プロモーター、エンハンサー等を含む遺伝子発現用カセットに関し、さらには当該プロモーター、エンハンサー等を用いて遺伝子の発現を上昇させる方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１５－１９８１６０号及び特願２０１６－０５９２９７号優先権を請求する。
 遺伝子発現効率を上昇させるために、CMVプロモーターやCAGプロモーターなど様々な遺伝子発現プロモーターが開発されている（特許文献１～３）。本発明者らが開発したプロモーター、エンハンサーなどの組み合わせを最適化し、大半の哺乳細胞で遺伝子の発現を上昇させるシステムもその１つである（特許文献４、非特許文献１、２を参照）。
　より高い効率で遺伝子を発現させることができるシステムの開発を試み、様々な遺伝子のプロモーターやエンハンサーの組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行うことにより、プロモーターの下流に発現させようとする遺伝子（以下、「目的遺伝子」ともいう。）及びポリA付加配列を含むDNA構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結した、遺伝子の発現用カセットを用いることで、遺伝子を高効率で発現させ得ることが本発明者らにより見いだされ、報告されている（特許文献４、非特許文献１、２を参照）。しかしこのベクターは、細胞の一過性発現に有効なベクターであり、現在、医薬品生産の現場で求められる目的タンパク質を安定かつ高産生する哺乳動物細胞を作製するためには、さらにベクターを改良する必要があった。
　一般的に、遺伝子組換えの手法による目的タンパク質を安定かつ高産生させる細胞を取得するために、宿主細胞内の染色体に目的遺伝子を組み込み、遺伝子増幅を利用し、目的遺伝子が多コピー組み込まれた細胞を構築する。その方法として最も頻繁に用いられているのが、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）欠損株CHO-DG44細胞を用いた方法である。具体的には、目的遺伝子及びDHFR遺伝子を含むベクターを細胞に導入し、目的遺伝子が多コピー組み込まれた細胞を取得する方法が挙げられる（非特許文献３、４を参照）。しかしながら、係るDHFR欠損細胞を用いた方法は、DHFR阻害剤であるmethotrexate（MTX）の濃度を段階的に増加させながら培養する必要があり、高濃度のMTX耐性のクローンを選択することによりクローンの取得に時間がかかり、他の細胞への汎用性が低いなどの問題点がある。
　上述したごとく、遺伝子発現効率を上昇させるための技術は、様々なプロモーターの開発などにより、改良が進められている。しかし哺乳動物細胞におけるタンパク質の産生系は、大腸菌や酵母など他の宿主と比較して十分なタンパク質を得ることが難しい。バイオテクノロジーの分野では、これらの従来技術を用いても、細胞の種類や遺伝子の種類によって、遺伝子発現がほとんど起こらない、又は発現タンパク質量が極めて少ないといった問題が日常的に発生している。また、この問題は、遺伝子発現を診断や治療に用いる医療の発展において、大きな障壁となっている。
　例えば、HRG（Histidine-rich glycoprotein）は、1972年にHeimburger et al (1972)によって同定された分子量約80 kDaの血漿タンパク質である。合計507個のアミノ酸より構成され、そのうちヒスチジンが66存在する高ヒスチジン含有タンパク質であり、主として肝臓で合成され、約100～150μg/mlという非常に高いと考えられる濃度でヒト血漿中に存在する。しかしながら、HRGの臨床的意義を検討するために、遺伝子組換え技術によって充分量のHRGを産生する方法が望まれていた。
　また、PD-1（Programmed cell death 1）、EMMPRIN（extracellular matrix metalloproteinase inducer）、NPTNβ（neuroplastinβ）、EMB（embigin）、RAGE（receptor for advanced glycation end products）、MCAM（melanoma cell adhesion molecule）、ALCAM（activated leukocyte cell adhesion molecule）、ErbB2（Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2）などのタンパク質は、免疫細胞を抑制したり腫瘍細胞に発現したりすることが知られており、これらのタンパク質は医療分野の研究開発や、医薬、医薬品、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質の候補として重要と考えられる。これらのタンパク質について、遺伝子組換え技術によって充分量の各タンパク質を産生する方法が望まれている。
特許第2814433号公報 米国特許第5168062号公報 米国特許第5385839号公報 国際公開第2011/062298号公報
Sakaguchi M. et al., Mol Biotechnol. 56(7), 621-30 (2014) Watanabe M. et al., Oncol Rep. 31(3), 1089-95 (2014) Chasin LA. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 77(7), 4216-20 (1980) Kaufman RJ. et al., Mol Cell Biol. 3(4), 699-711 (1983)
　本発明は、目的タンパク質を安定かつ高産生するための遺伝子発現用カセットを提供することを課題とする。
　本願発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットに、さらにプロモーター（Ｐ）の上流とエンハンサー（Ｐ'）の下流に、各々トランスポゾン配列（Ｔ）を含む遺伝子発現用カセットを用いることで目的タンパク質を安定かつ高産生できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター（Ｐ）の上流及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセット。
２．さらに、プロモーター（Ｐ）の上流及び／又はエンハンサー（Ｐ'）の下流に、複製開始配列（Ｓ）が配置されていることを特徴とする、前項１に記載の遺伝子発現用カセット。
３．プロモーター（Ｐ）、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、エンハンサー（Ｐ'）及びトランスポゾン配列（Ｔ）が含まれ、更に選択的に複製開始配列（Ｓ）を含む遺伝子発現用カセットが、以下の１）～４）のいずれかに示す順序で含まれる、前項１又は２に記載の遺伝子発現用カセット：
１）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
２）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
３）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）；
４）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）。
４．複製開始配列（Ｓ）の上流に核マトリックス結合配列（Ｍ）が配置されていることを特徴とする前項２又は３に記載の遺伝子発現用カセット。
５．トランスポゾン配列（Ｔ）、プロモーター（Ｐ）、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、エンハンサー（Ｐ'）、核マトリックス結合配列（Ｍ）、複製開始配列（Ｓ）及びトランスポゾン配列（Ｔ）を含む、遺伝子発現用カセット。
６．配列（Ｓ）が、ROIS及び／又はARSである前項２～５のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
７．プロモーター（Ｐ）が、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、前項１～６のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
８．目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の下流に連結したエンハンサー（Ｐ'）が、hTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか１種又は複数種を含む、前項１～７のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
９．目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）において、目的遺伝子が、HRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2及び抗体のいずれかから選択されるタンパク質の部分又は全体をコードする遺伝子を含む、前項１～８のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
１０．前項１～９のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用プラスミド。
１１．前項１～９のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用ベクター。
１２．前項１～９のいずれかに記載の発現用カセットを用いて目的遺伝子を発現させる方法。
１３．前項１～９のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを用いて産生されたタンパク質。
　本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット（例えば、特許文献４に示すpCMViR-TSCベクター）をトランスポゾン配列（Ｔ）で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに複製開始配列（Ｓ）、核マトリックス結合配列（Ｍ） を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、もしくは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、プロモーター（Ｐ）の上流にトランスポゾン配列（Ｔ）、プロモーター（Ｐ）の下流に目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の下流にエンハンサー（Ｐ'）、さらにその下流に「核マトリックス結合配列（Ｍ）、複製開始配列（Ｓ）、トランスポゾン配列（Ｔ）を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。本発明の新規な遺伝子発現用ベクターは、薬剤選択後の安定発現細胞株にも関わらず、従来の遺伝子発現用ベクターと比較して数倍から数十倍の高産生を達成したpCMViR-TSCベクターの一過性発現量を更に凌駕する発現量を達成した。
（Ａ）：一過性発現において、最も高効率にタンパク質を産生可能な発現ベクターpCMViR-TSCのコンストラクトの構造を示す図である。IDT社のプロモーターのないクローニング用プラスミドベクター（pIDT-SMART）に、一過性発現用の遺伝子発現用カセットを挿入した遺伝子発現用プラスミドベクターを示す図である。（Ｂ）：（Ａ）のpIDT-SMARTをバックボーンに構築した本発明の遺伝子発現用プラスミドベクターの一例を示す図である。（実施例１） 実施例にて具体的に構築したNo.1～10の各種遺伝子発現用カセットの構成を示す概念図である。（実施例１、２） プロモーター（Ｐ）の上流の5'側TP（5'TP）の塩基配列（配列番号１）及び5'側TP領域の全配列（配列番号２）を示す図である。（実施例１） エンハンサー（Ｐ'）の下流の3'側TP（3'TP）の塩基配列（配列番号３）及び、3'側TP領域の全配列（配列番号４）を示す図である。（実施例１） No.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列の一部（配列番号８の一部）を示す図である。（実施例２） No.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列の一部（配列番号８の一部、図５－１の続き）を示す図である。（実施例２） No.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列の一部（配列番号８の一部、図５－２の続き）を示す図である。（実施例２） No.1遺伝子発現ベクターの全塩基配列の一部（配列番号９の一部）を示す図である。（実施例２） No.1遺伝子発現ベクターの全塩基配列の一部（配列番号９の一部、図６－１の続き）を示す図である。（実施例２） No.1～10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを導入したCHO細胞について、各細胞のGFP蛍光強度を測定した結果を示す図である。（実施例２） No.1～10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを導入したHEK293T細胞について、各細胞のGFP蛍光強度を測定した結果を示す図である。（実施例２） No.1～10の各遺伝子発現ベクターを導入したCHO細胞について、各細胞のGFP蛍光強度を、タンパク質定量値により補正した結果を示す図である。（実施例２） No.1～10の各遺伝子発現ベクターを導入したHEK293T細胞について、各細胞のGFP蛍光強度を、タンパク質定量値により補正した結果を示す図である。（実施例２） HRGを作製するためのHRG搭載コンストラクト（No.4-HRG）の構造を示す図である。（実施例３） No.4-HRG遺伝子発現用カセットを含むベクターを用いて作製したHRGについて、好中球の培養系にHRGを加えたときに好中球の形態に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。（実験例３－１） No.4-HRG遺伝子発現用カセットを含むベクターを用いて作製したHRGについて、CLP敗血症モデルマウスの生存率に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。（実験例３－２） No.4-HRG遺伝子発現用カセットを含むベクターを用いて作製したHRGについて、活性酸素分子種の産生抑制活性に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。（実験例３－３） ヒトIgG2 Fc領域のアミノ酸配列を示す図である。（実施例４） PD-1の細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例４） EMMPRINの細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例５） NPTNβの細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例６） EMBの細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例７） RAGEの細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例８） MCAMの細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例９） ALCAMの細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例１０） ErbB2の細胞外ドメインの全塩基配列を示す図である。（実施例１１） HRGの全塩基配列を示す図である。（実施例１２） 実施例４～１２で得られた各Fc融合タンパク質のSDS-PAGE結果を示す図である。（実験例４） 遺伝子組換えヒトHRG（rHRG）、HRG-Fc及び血漿由来HRG（hHRG）について、好中球の培養系にHRGを加えたときに好中球の形態に及ぼす影響を正球化率（％）により確認した結果を示す図である。（実験例５） 遺伝子組換えヒトHRG（rHRG）、HRG-Fc及び血漿由来HRG（hHRG）について、好中球の培養系にHRGを加えたときに好中球の形態に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。（実験例５） 各実施例で作製した、NPTN-Fc及びEMMPRIN-Fcについて、S100A8/A9によるがん細胞走化能促進作用に対する遮断効果を各々確認した結果図である。（実験例６） 各実施例で作製した、RAGE-Fc、ALCAM-Fc、MCAM-Fc及びEMB-Fcについて、S100A8/A9によるがん細胞走化能促進作用に対する遮断効果を各々確認した結果図である。（実験例６）
　本明細書において「遺伝子発現用カセット」とは、目的タンパク質を遺伝子組換え操作によって発現可能とするためのDNAのセットをいい、より具体的には、目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）を含み、さらに当該遺伝子を発現可能とするための各種DNA配列を含むDNAのセットをいう。本明細書において「目的タンパク質」とは、発現及び／又は産生させようとするタンパク質を意味する。
　本明細書において「遺伝子発現用カセット」には、少なくとも「プロモーター（Ｐ）」、「目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」及び「エンハンサー（Ｐ’）」の機能を有する各DNAを含み、さらに「トランスポゾン配列（Ｔ）」を含むことを特徴とする。さらに、「複製開始配列（Ｓ）」や「核マトリックス結合配列（Ｍ）」を含んでいてもよい。
　本発明の「遺伝子発現用カセット」は、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、少なくともプロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有し、さらにプロモーター（Ｐ」の上流、及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする。さらに、プロモーター（Ｐ）の上流、及び／又はエンハンサー（Ｐ'）の下流に、核マトリックス結合配列（Ｍ）と複製開始配列（Ｓ）が配置されていてもよい。
　本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット（例えば、特許文献４に示すpCMViR-TSCベクター）をトランスポゾン配列（Ｔ）で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに複製開始配列（Ｓ）、核マトリックス結合配列（Ｍ）を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、或いは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、プロモーター（Ｐ）の上流にトランスポゾン配列（Ｔ）、プロモーター（Ｐ）の下流に目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、その下流にエンハンサー（Ｐ'）、さらにその下流に核マトリックス結合配列（Ｍ）、複製開始配列（Ｓ）、トランスポゾン配列（Ｔ）を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。
　本発明の「遺伝子発現用カセット」は、プロモーターを（Ｐ）、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物を（Ｘ）、エンハンサーを（Ｐ'）及びトランスポゾン配列を（Ｔ）、複製開始配列を（Ｓ）としたときに、少なくとも以下の１）～４）のいずれかに示す順序で構成される。ここにおいて、トランスポゾン配列（Ｔ）には、トランスポゾンを特定する配列を２回以上連結したものが含まれていてもよい。
１）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
２）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
３）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）；
４）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）。
　本明細書において、「目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」のうち、目的遺伝子は、目的タンパク質をコードする遺伝子（DNA）を含み、ホスト細胞と由来が異なる遺伝子であってもよいし、由来が同じ遺伝子であってもよい。また、発現遺伝子の検出や疾患の診断のためにレポーター遺伝子が含まれていてもよい。ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）は自体公知の配列を適用することができ、その由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を遺伝子発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。
　本明細書において、目的遺伝子の種類は限定されず、遺伝子組換え技術により産生させようとする目的タンパク質をコードするDNAや、特定の疾患の治療に用いるために生体内で発現させようとする目的タンパク質をコードするDNAを用いることができる。本明細書に示す目的タンパク質として、医療分野の研究開発のためや、医薬、医薬品、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質が挙げられる。係るタンパク質は自体公知のタンパク質又は今後見出されるタンパク質であってもよい。タンパク質は、全体であってもよいし、部分であってもよい。さらに、複合体からなるタンパク質であってもよい。タンパク質の例として、例えばHRG（ヒスチジンリッチ糖タンパク質）、PD-1（Programmed cell death 1）、EMMPRIN（extracellular matrix metalloproteinase inducer）、NPTNβ（neuroplastinβ）、EMB（embigin）、RAGE（receptor for advanced glycation end products）、MCAM（melanoma cell adhesion molecule）、ALCAM（activated leukocyte cell adhesion molecule）、ErbB2（Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2）や抗体が挙げられる。さらに後述するように、目的タンパク質は、タンパク質と抗体のFc領域とを融合させたFc融合タンパク質（Fc fusion protein）等であってもよい。
　例えばHRGをコードする全長cDNA、又はHRGの活性を有する部分をコードするcDNA、例えば、成熟HRGのアミノ酸配列（配列番号１０）をコードする全長cDNA、又は部分をコードするcDNAを、発現ベクターにクローニングし、HRGを調製することができる。例えば、GenBank Accession No.NM000412で特定されるヌクレオチドの全体又は部分から、遺伝子組換え技術を用いて調製することもできる。本発明の有効成分としてのHRGは、成熟HRGの全体であっても良いし、成熟HRGのうちHRG活性を有する部分タンパク質又はペプチドであっても良い。さらに、糖鎖を含むものであってもよいし糖鎖がなくても良い。HRGは好中球活性化調節剤として機能し、好中球活性化に起因する疾患の治療薬の有効成分として、利用することができる。HRGは好中球活性化に起因する疾患及び／又は好中球活性化を伴う炎症性疾患の治療方法にも有効である。
　HRGと同様に、例えば成熟型PD-1細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４）、成熟型EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）、成熟型NPTNβ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）、成熟型EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）、成熟型RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）、成熟型MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）、成熟型ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２６）、成熟型ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２８）等をコードする全長cDNA、又は部分をコードするcDNAに基づいて、発現ベクターにクローニングし、各タンパク質を調製することができる。タンパク質にFcを融合させる場合の目的遺伝子の調製方法は、自体公知の方法、または今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。
　PD-1は、免疫細胞側に存在し、免疫細胞の抑制に働く一回膜貫通型タンパク質で、Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci Transl Med. 2016 Mar 2;8(328):328rv4. doi: 10.1126/scitranslmed.aad7118.に開示されている。EMMPRIN, NPTN, EMB, RAGE, MCAM, ALCAM等はがん細胞に存在し、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する接着分子（一回膜貫通型タンパク質）として知られている。EMMPRINは、Kanekura T, Chen X. CD147/basigin promotes progression of malignant melanoma and other cancers. J Dermatol Sci. 2010 Mar;57(3):149-54. doi: 10.1016/j.jdermsci.2009.12.008.に開示され、NPTNβは、Owczarek S, Berezin V. Neuroplastin: cell adhesion molecule and signaling receptor. Int J Biochem Cell Biol. 2012 Jan;44(1):1-5. doi: 10.1016/j.biocel.2011.10.006.に開示され、EMBは、Chao F, Zhang J, Zhang Y, Liu H, Yang C, Wang J, Guo Y, Wen X, Zhang K, Huang B, Liu D, Li Y. Embigin, regulated by HOXC8, plays a suppressive role in breast tumorigenesis. Oncotarget. 2015 Sep 15;6(27):23496-509.に開示され、RAGEは、Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, Herbst R, Coyle AJ. HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer. Annu Rev Immunol. 2010;28:367-88. doi: 10.1146/annurev.immunol.021908.132603.に開示され、MCAMは、Wang Z, Yan X. CD146, a multi-functional molecule beyond adhesion. Cancer Lett. 2013 Apr 28;330(2):150-62. doi: 10.1016/j.canlet.2012.11.049.に開示され、ALCAMは、Ofori-Acquah SF, King JA. Activated leukocyte cell adhesion molecule: a new paradox in cancer. Transl Res. 2008 Mar;151(3):122-8. doi: 10.1016/j.trsl.2007.09.006.に開示される。がん細胞に存在するErbB2は、がん遺伝子として知られており、この過剰発現は発がん、そしてその後のがん進展に大きく関わるといわれている。ErbB2は、Appert-Collin A, Hubert P, Cremel G, Bennasroune A. Role of ErbB Receptors in Cancer Cell Migration and Invasion. Front Pharmacol. 2015 Nov 24;6:283. doi: 10.3389/fphar.2015.00283.に開示される。
　例えば上述するタンパク質と抗体のFc領域とを融合させたFc融合タンパク質を作製する場合には、タンパク質のC'末端側をコードする部位にFcをコードするcDNAを結合させるのが好適である。
　抗体は、重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、H鎖はN末端側より可変領域（VH）、定常領域（CH）、L鎖はN末端側より可変領域（VL）、定常領域（CL）により、それぞれ構成される。CHはさらに、N末端側よりCH1、ヒンジ、CH2、CH3の各ドメインより構成される。また、CH2とCH3を併せてFc領域という。本発明の方法によって作製される抗体は、インタクト型抗体又は低分子抗体である抗体フラグメントであってもよい。抗体のクラスとしては、例えばイムノグロブリンG（IgG）、イムノグロブリンA（IgA）、イムノグロブリンE（IgE）、及びイムノグロブリンM（IgM）が挙げられる。本発明の方法によって産生されうる抗体は、IgGであることが好ましい。IgGのサブクラスとしては、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4が挙げられる。本発明の方法によって産生されうる抗体のサブクラスは、用途目的に応じて適宜決定することができ、いずれのサブクラスの抗体であってもよい。抗体フラグメントとしては、Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、Fcフラグメント、ダイアボディーからなる群より選択されるその機能的抗体フラグメントが挙げられる。例えば、抗体のFc領域と必要なタンパク質を融合させたFc融合タンパク質（Fc fusion protein）であってもよい。
　トランスポゾン（Transposon：TP）とは、細胞内においてゲノム上の位置を転移（transposition）することのできる塩基配列である。動く遺伝子、転置因子（Transposable element）とも呼ばれる。DNA断片が直接転移するDNA型と、転写と逆転写の過程を経るRNA型がある。トランスポゾンは、例えばバクテリアや酵母などの微生物でも発見され、これら転置因子は一定の塩基配列をもったDNAで、バクテリアや酵母などの正常の染色体の構成成分として１細胞あたり複数個存在している。この因子は染色体に組込まれて存在するので挿入配列（insertion sequence：IS）とも呼ばれる。トランスポゾンは遺伝子導入のベクターや変異原として有用であり、遺伝学や分子生物学において様々な生物で応用されている。本明細書においても、トランスポゾンは遺伝子発現用カセットに組み込まれる。本明細書において、「トランスポゾン配列（Ｔ）」とは、上記トランスポゾンを特定する配列をいう。繰り返しになるが、トランスポゾン配列（Ｔ）には、トランスポゾンを特定する配列を２回以上連結したものが含まれていてもよい。
　DNAの複製反応は染色体上の決まった部位、複製開始点から始まり両方向に進行していく。真核生物の長大な染色体DNAを細胞周期の決まった時期に正確に複製するためには非常に多くの複製開始点が必要であり、それらの活性は時間的、空間的に制御されていると考えられている。さらにDNA複製を含めた染色体上で起こる様々な反応は互いに密接に関連し、染色体の恒常性が保持されている。複製開始が行われる領域には、複製開始配列があり、例えば複製開始配列（replication origin initiation sequence：ROIS)や自立複製配列（autonomously replicating sequence：ARS）が挙げられる。
　核マトリックスとは、核内のクロマチンの保持だけでなく、遺伝子の転写や複製、DNA損傷修復、アポトーシスに代表される様々な核内イベントが機能するための重要な場を構成すると考えられる。複製開始配列と核マトリックス結合領域を含むプラスミドは、細胞内で効率よく遺伝子を増幅すると考えられる。本明細書において、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」とは、上記核マトリックスに結合する配列として特定される配列をいう。本発明の遺伝子発現用カセットにおいて、複製開始配列（Ｓ）とともに核マトリックス結合配列（Ｍ）を含むのがより好適である。この場合、複製開始配列（Ｓ）よりも上流域において核マトリックス結合配列（Ｍ）が配置されているのが好適である。
　プロモーターとはDNAを鋳型に転写を開始するDNA上の特定の塩基配列であり、目的遺伝子の上流に配置される。本明細書の「プロモーター（Ｐ）」において使用可能なプロモーターは特許文献４に示す「第１のプロモーター」を参照し、「エンハンサー（Ｐ’）」は特許文献４に示す「エンハンサー」や「第２のプロモーター」の記載を参照することができる。具体的には、以下に説明する。
　本明細書において、「プロモーター（Ｐ）」の配列は特に限定されず、自体公知のプロモーターを適用することができる。あらゆる細胞や組織で目的遺伝子の発現を促進させ得る非特異的プロモーターも組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等の特異的あるいは選択的プロモーターも用いることができる。特に本発明において適用可能なプロモーターとして、感染プラスミドのコピー数を上げるプロモーターや増殖性細胞特異的プロモーターが好適である。具体的には、SV40プロモーター、CMVプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、EF1-alphaプロモーター、ユビキチンプロモーターなどが挙げられる。 さらに具体的には、例えば、CMV-iプロモーター（hCMV＋イントロンプロモーター）等が用いられる。βアクチンプロモーターの由来動物種は限定されず、哺乳類βアクチンプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーターやニワトリアクチンプロモーターが用いられる。また、上記のCMV-iプロモーター等の人工的なハイブリッドプロモーターも用いることもできる。CMV-iプロモーターは米国特許第5168062号明細書や米国特許第5385839号明細書の記載に基づいて合成することができる。また、用途に応じて、 癌・腫瘍特異的プロモーターとしてはhTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、PSA（前立腺特異的抗原）、c-myc、GLUTプロモーターなどが、遺伝子発現を抑制することを目的としたショートヘアピン型RNA(shRNA)を発現させるプロモーターとしてはU6、H1プロモーターなどが、ES細胞・癌幹細胞特異的プロモーターとしてはOCT3/4、NANOGプロモーターなどが、神経幹細胞特異的プロモーターとしてはNestinプロモーターなどが、細胞ストレス感知プロモーターとしてはHSP70、HSP90、p53プロモーターなどが、肝細胞特異的プロモーターとしてはアルブミンプロモーターなどが、放射線感受性プロモーターとしてはTNF-alphaプロモーターなどが連結されていてもよい。
　本明細書において、「エンハンサー（Ｐ’）」とは、転写により生成するメッセンジャーRNA（mRNA）の量を結果的に増加させるものであればよく、特に限定されない。エンハンサーはプロモーターの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には100bp前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。本発明で用いられるエンハンサー（Ｐ’）に含まれるエンハンサーは１種類でもよいが、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。具体的には、その順番は限定されない。例えば、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー等を用いることができる。一例として、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。エンハンサー（Ｐ’）は本明細書の目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の下流に配置され、遺伝子発現がより強力に発現可能となる。例えば、プロモーターと同様の機能を有し、プロモーターと同様の配列であってもよい。プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ’）は同じであっても異なっていてもよい。例えば、プロモーター（Ｐ）として特異的プロモーターを用いて、エンハンサー（Ｐ’）として、非特異的なプロモーターを用いることができる。具体的には、CMV-iプロモーターとCMVエンハンサーの組合せにより、ほぼ全ての細胞（宿主細胞）において、あらゆる遺伝子を挿入した場合に、如何なるトランスフェクション試薬を用いた場合においても、目的遺伝子の強力なタンパク質発現が可能となる。
　本発明において、エンハンサー（Ｐ’）に含まれるエンハンサーの他、エンハンサー配列をプロモーター（Ｐ）の上流に配置することもできる。プロモーター（Ｐ）の上流に１個以上のエンハンサー配列を挿入することにより、特定の細胞（例えば、特許文献４の実施例に示すHEK293細胞株やMCF7細胞株）において、特定の遺伝子、例えば、REIC／Dkk-3遺伝子やCD133遺伝子において、発現がさらに増強される。また、CMVエンハンサーをプロモーター（Ｐ）の上流に、例えば４個挿入することにより、特定の細胞（例えば、HepG2細胞株やHeLa細胞株）によっては、さらに発現の増強が期待される。
　本発明の「遺伝子発現用カセット」は、遺伝子発現ベクターに組込み利用することができる。本発明には、本発明の遺伝子発現用カセットを含むベクターも包含される。
　本発明の遺伝子発現用カセットにおいて、目的遺伝子を挿入する部位は、マルチクローニング部位として存在してもよい。この場合、目的遺伝子をマルチクローニング部位（挿入部位）に制限酵素が認識する配列を利用して挿入することができる。このように目的遺伝子DNA自体が含まれておらず、該DNAを挿入する部分がマルチクローニング部位として含まれる遺伝子発現用カセットも本発明に包含される。
　さらに、特許文献４に示すように、RU5'が目的タンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。さらに、遺伝子発現用カセットの最上流にSV40-oriが連結されていてもよい。SV40-oriはSV40遺伝子の結合領域であり、後にSV40遺伝子を挿入することにより、遺伝子発現が上昇する。上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、目的遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
　本発明の遺伝子発現用カセットを挿入するベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス（Ad）ベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記遺伝子発現用カセットを導入したベクターを、感染、エレクトロポレーション等の公知の方法により細胞に導入することができる。遺伝子の導入方法は自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができ、例えば公知のトランスフェクション試薬を用いて導入してもよい。
　さらに、市販のベクターを改変し、本発明の発現用カセットが含まれるようにしてもよい。例えば、pShuttleベクター等の市販のベクターの遺伝子発現用カセットの下流領域にエンハンサーを組込んで用いることができる。
　本発明は、さらに、上記の目的遺伝子発現用カセットを含むウイルスベクターも含まれる。ウイルスベクターのうち例えばAdベクターやAAVベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とするが、本発明の遺伝子発現用カセットは、安定的持続的に遺伝子を発現させることができるので、遺伝子発現の用途に応じて用いるのが望ましい。該ウイルスベクターは、ベクターとして使用可能なウイルスゲノム上に、上記の目的遺伝子発現用カセットを挿入して作製することができる。
　本発明の遺伝子発現用カセットを挿入したベクターを細胞に導入し、該細胞をトランスフェクトすることにより、該細胞で目的遺伝子を発現させ、目的タンパク質を産生することができる。本発明の遺伝子発現用カセットを導入し目的タンパク質を産生させるためには、真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属細菌等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、HEK293細胞、CHO細胞、Hela細胞、COS細胞、BHK細胞、Vero細胞等の哺乳類細胞が用いられる。形質転換された前記の宿主細胞をin vitro又はin vivoで培養して目的とするタンパク質を産生させることができる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の公知の培養用培地を使用することができる。産生されたタンパク質は、分泌タンパク質の場合は培養液中から、非分泌タンパク質の場合は細胞抽出物中から公知の方法で精製することができる。目的タンパク質を産生させる場合、細胞に別々の目的遺伝子を含む複数のベクターを同時にトランスフェクトさせて産生してもよい。このようにすることにより、一度に複数のタンパク質を産生することができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）遺伝子発現用カセット
　本実施例では、各種コンストラクトの遺伝子発現用カセットを構築した。具体的には、IDT社のプロモーターのないクローニング用プラスミドベクター（pIDT-SMART）に特許文献４に示す一過性発現において最も高効率にタンパク質を産生可能な遺伝子発現用カセットを挿入することにより、pCMViR-TSC発現ベクターを作製した（図１）。pCMViRとは、CMV-iプロモーターの下流にRU5'配列が挿入されていることを示す。
　本発明の遺伝子発現用カセットは、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の上流及び下流にトランスポゾン配列（Ｔ）、複製開始配列（Ｓ）、核マトリックス結合配列（Ｍ）を図２に示すNo.1～No.10の各組み合わせで構築した。
　本実施例において、目的遺伝子は、GFP（Green fluorescent protein）、Puror（Puromycin耐性）及び2A (2A self-processing peptide - 短い自己プロセッシング性ペプチド）を含み、「GFP-2A-Puror」で示した。また、ポリA付加配列は「BGH polyA」、プロモーター（Ｐ）は「CMViRプロモーター」、エンハンサー（Ｐ'）は、「hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーを連結したもの」を用いた。図２において、トランスポゾン配列（Ｔ）は「TP」、複製開始配列（Ｓ）は「ROIS」又は「ARS」、核マトリックス結合配列（Ｍ）は「MIS」で示した。トランスポゾン配列（Ｔ）には、例えばNo.2, 5, 9で示すように、「TP」で特定される配列が複数含まれていてもよい。
　上記において、プロモーター（Ｐ）の上流の5'側TP（5'TP）の塩基配列を配列番号１に示し、5'側TP領域の全配列を配列番号２に示した（図３参照）。そして、エンハンサー（Ｐ'）の下流の3'側TP（3'TP）の塩基配列を配列番号３に示し、3'側TP領域の全配列を配列番号４に示した（図４参照）。また、複製開始配列（Ｓ）のうち、ROISの塩基配列を配列番号５に、ARSの塩基配列を配列番号６に示した。さらに、MISの塩基配列を配列番号７に示した。
5'TP（配列番号１）
CTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCC
3'TP（配列番号３）
TTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATA
ROIS（配列番号５）
AATCTGAGCCAAGTAGAAGACCTTTTCCCCTCCTACCCCTACTTTCTAAGTCACAGAGGCTTTTTGTTCCCCCAGACACTCTTGCAGATTAGTCCAGGCAGAAACAGTTAGATGTCCCCAGTTAACCTCCTATTTGACACCACTGATTACCCCATTGATAGTCACACTTTGGGTTGTAAGTGACTTTTTATTTATTTGTATTTTTGACTGCATTAAGAGGTCTCTAGTTTTTTACCTCTTGTTTCCCAAAACCTAATAAGTAACTAATGCACAGAGCACATTGATTTGTATTTATTCTATTTTTAGACATAATTTATTAGCATGCATGAGCAAATTAAGAAAAACAACAACAAATGAATGCATATATATGTATATGTATGTGTGTACATATACACATATATATATATATTTTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCTTAGAACTGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAGCTCTTCCACTTTTAGTGCATCAATTTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG
ARS（配列番号６）
TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGAGATACACATTTAC
MIS（配列番号７）
TACCACACAGTCTAAGCTGAACCTGGTTGGTTAACTTGAAAAATGCAGAGATGTAGTTACATCAGCAGTGGGAAGACAAGAAGATCAGTTTCAGTGGGAGAAGTCATTGCATTGGGAGGGGTAATTAACAGAGTGGTAGCATATGTGGAATGTGGGCTCTATAGATAAGGACTGGCAGGAATGTTGTGTACCAGGGCTGGGGGGATATAGAGGGTAAGGAAGTCTGGCCTTGAAATCAGGGAACAAAGGACAACAAAACTTAAACGAGCTAAACCTTTGAAGAAGAATTTCTTACTGTAGTCAGCGATCATTATTGTAAACCTATGACAGTTCTTTCAAAATATTTTTCAGACTTGTCAACCGCTGTA
（実施例２）遺伝子発現用カセットの評価
　実施例１で構築したNo.1～10の各種遺伝子発現用カセット（図２）を含む発現ベクター（No.1～10の各遺伝子発現ベクター）を作製した。図２に示すpCMViR-TSCを含むベクターをコントロールとした。No.1～10の内、CHO細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図５（配列番号８）に示した。また、HEK293T細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.1遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図６（配列番号９）に示した。図２に示す各遺伝子発現用カセットは、目的遺伝子であるGFP-2A-PuroをコードするcDNAの配列をEcoRI制限酵素サイトとXbaI制限酵素サイトを用いて正方向に挿入した。
　No.1～10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを細胞に各々導入し、以下の手順に従い、GFP蛍光タンパク質の発現量を蛍光強度で評価した。
　10％ FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞（(Chinese Hamster Ovary cells）及びHEK293T細胞（Human embryonic kidney cells）を6 wellプレートで70％～80％までコンフルエントに培養した。FuGENE（商標）-HD（遺伝子導入試薬）を用いて、No.1～10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを、トランスポゼース発現ベクターとDNA量 1 : 1でコトランスフェクトした。トランスポゼース発現ベクターは、一過性発現用のベクターであるpCMViR-TSC ベクターにトランスポゼース遺伝子を搭載しており、このベクターをNo.1～10の本発明のトランスポゾン配列 (TP) 搭載各遺伝子発現ベクターとコトランスフェクトすることにより、トランスポゾン配列の末端で遺伝子発現用カセットが切り出され、宿主ゲノム中のTTAA部位に効率よく目的遺伝子が挿入される。このような方法でトランスフェクトした細胞を24時間インキュベート後、細胞のGFP蛍光強度を蛍光プレートリーダー (FLUOROSKAN ASCENT FL, Thermo scientific) を用いて測定した。ベクターを導入していない細胞を(-)とした。
　さらに同様にNo.1～10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを導入したCHO細胞及びHEK293T細胞を、48時間培養後から、Puromycin（抗生物質）10μg/mlを添加して、3日に１回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。培養3週間経過後の各細胞の蛍光強度を蛍光プレートリーダーにより測定し、コントロール及びトランスフェクト後、24時間培養した細胞の蛍光強度と比較した。CHO細胞での蛍光強度を図７に示し、HEK293T細胞での蛍光強度を図８に示した。CHO細胞では、培養24時間目のGFP蛍光強度はコントロール及びNo.1～10の各遺伝子発現ベクターのいずれも、(-)と殆ど差を認めなかったが、3週間経過後ではNo.1～10の各遺伝子発現ベクターを各々導入した細胞では、コントロールに比べて、明らかに高いGFP蛍光強度を示した。特に、No.4の遺伝子発現ベクターで高い値を示した（図７）。一方HEK293T細胞では、培養24時間目のGFP発現量はコントロールは高い値を示し、一過性の発現を認めたが、No.1～10の各遺伝子発現ベクターのいずれも、(-)よりやや高い値を示したのみであった。3週間経過後ではNo.1～10の各遺伝子発現ベクターを各々導入した細胞では、コントロールに比べて、高いGFP蛍光強度を示す傾向が認められ、特にNo.1の遺伝子発現ベクターで高い値を示した（図８）。
　次に、3週間薬剤選択培養を行った各細胞を蛍光強度測定後回収し、タンパク質定量を行った値を基に細胞の蛍光強度を補正し、その補正値に基づいてNo.1～10の各遺伝子発現ベクターの比較・検討を行った。その結果、CHO細胞では、特にNo.4の遺伝子発現ベクターで高い値を示し（図９）、HEK293T細胞では、特にNo.1の遺伝子発現ベクターで高い値を示した（図１０）。
　上記の結果、CHO細胞では、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の上流及び下流にMIS配列とともにROIS配列又はARS配列を含み、さらに上流及び下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含む、本発明の遺伝子発現用カセットによれば、長期間、目的のタンパク質を安定的に産生可能であることが確認された。またHEK293T細胞では、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の上流及び下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含む、本発明の遺伝子発現用カセットによれば、長期間、目的のタンパク質を安定的に産生可能であることが確認された。
（実施例３）ヒト・ヒスチジンリッチ糖タンパク質（HRG）の産生
　本実施例では、遺伝子組換えヒトHRGは、以下のように作製した。実施例１に示すCHO細胞において最も有効な高効率遺伝子発現用カセットであるNo.4遺伝子発現用カセットを用い、目的遺伝子として、配列番号１０に示すヒトHRGのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. BC069574 (NCBI)）で特定される塩基配列からなるDNA）を用い、No.4-HRG発現ベクターを作製した（図１１参照） 。具体的には、10％ FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞（(Chinese Hamster Ovary cells）にFuGENE（商標）-HD（遺伝子導入試薬）を用いて、上記No.4-HRG発現ベクター、トランスポゼース発現ベクター、薬剤耐性遺伝子発現ベクターとして実施例１に示すNo.4遺伝子発現ベクターをDNA量 5 : 4：1でコトランスフェクトした。 遺伝子導入し、48時間培養後から、Puromycin（抗生物質）10μg/mlを添加して、3日に１回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。
成熟HRGのアミノ酸配列（配列番号１０）
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
　組換えヒトHRGを含む培養上清を回収した。PBS(-) 30 mlで予め洗浄したQIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲル（Sepharose CL-6B支持体にNi-NTAを結合したゲル）を前記培養上清に加え、4℃で回転インキュベーションを2時間行ない、組換えヒトHRGをQIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲルに結合させた。QIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲルを精製用カラムに移した後、洗浄液１（30 mM Imidazoleを含むPBS(-)（pH7.4）、洗浄液２（1M NaCl +10 mM PB (pH7.4)）、洗浄液３（PBS(-) (pH7.4)）で順次カラムを洗浄した。組換えヒトHRG は、500 mM Imidazoleを含むPBS(-) (pH7.4)で、4℃で溶出を行なった。精製品は、ウエスタンブロットとSDS-PAGE 後のタンパク染色でHRGを確認した。
　上記本発明の遺伝子組換え手法により作製したHRG（以下、「遺伝子組換えHRG」）と国際公開WO2013/183494号公報の実施例１で作製したヒト血漿由来のHRG（以下、「血漿由来HRG」）について、各々好中球の正球状形態を誘導する活性（正球化活性）、CLP敗血症モデルマウスの生存率及び活性酸素分子種の産生抑制活性に及ぼす効果を確認した。
（実験例３－１）好中球の形態
　国際公開WO2013/183494号公報の図５に示すフローチャートに従いHRG:2μM、最終濃度1μM）50μlを好中球浮遊液（5×105 cell/ml）50μlに加えた系での好中球の形態をCalceinで細胞を蛍光標識して蛍光顕微鏡で観察し、各HRGによる正球化活性を好中球の正球化率（％）により確認した。その結果、遺伝子組換えHRG及び血漿由来HRGのいずれも同様の正球化活性を有することが確認された（図１２）。
（実験例３－２）CLP敗血症モデルマウスに及ぼすHRGの効果
　本実験例では、盲腸結紮腹膜炎（cecal ligation and puncture: CLP）敗血症モデルで
カプランマイヤー法による生存率を調べた。マウスの腹腔内より盲腸を取り出して、盲腸根部を縫合糸により結紮し、18ゲージ注射針を用いて盲腸壁層に穿刺してCLP敗血症モデルを作製した。単開腹（sham）マウスをコントロールとした。術後5分、24時間及び48時間目に、遺伝子組換えHRG（HRG：400μg/マウス）を尾静脈内投与した（n=10）。HSA及びPBS(-)をコントロールとした（n=10）。その結果、カプランマイヤー法で解析した結果、遺伝子組換えHRG投与グループは有意に高い累積生存率が確認された（図１３）。
（実験例３－３）活性酸素分子種の産生抑制活性
　単離したヒト好中球を、イソルミノール（最終濃度 50 mM）とHorse radish peroxidase type IV（最終濃度 4 U/ml）を添加してインキュベートし、細胞外放出活性酸素分子種レベルを反応開始15分後に化学発光で測定した。HRG非存在下のレベルを100％とし、0.01～1.0μM濃度のHRG存在下での値を％表示で算出した（図１４）。その結果、遺伝子組換えHRGはヒト血漿から精製したHRGと略等しい活性酸素分子種の産生抑制活性を示した。
（実施例４）遺伝子組換えPD-1の産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるPD-1細胞外ドメインの産生について説明する。本実施例では、プロモーターの上流にTP配列、プロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物の下流にエンハンサー、さらにその下流にMIS配列、ROIS配列、TP配列を連結させた遺伝子発現ベクターを用いて、目的タンパク質を安定かつ高産生するCHO細胞を作製し、その細胞を用いて医薬品候補となるタンパク質を高効率に産生した。使用したコンストラクトの構造を図１（Ｂ）に示した。図２のNo.4のコンストラクトを用い、発現させようとする遺伝子をinserted geneとして挿入した。医薬品候補となるタンパク質は、すべて抗体の一部であるヒトIgGの Fc領域と融合させることにより、一般的に体内での安定性が低く薬効が得にくいと考えられているタンパク質製剤の安定性を向上させ、さらにヒトIgG2のFc領域を用いることで、補体活性が低く、副作用となる炎症反応が緩和される医薬品となると考えられる。ヒトIgG2 Fc領域の全塩基配列は図１５に示し、リンカー及び制限酵素認識部位を含む塩基配列を、配列表の配列番号１１に示した。ヒトIgG2 Fc領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１２に示した。
ヒトIgG2 Fc領域のアミノ酸配列（配列番号１２）
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
　遺伝子組換えPD-1の細胞外ドメインは、以下のように作製した。実施例１に示すCHO細胞において最も有効な高効率遺伝子発現用カセットであるNo.4遺伝子発現用カセットを用い、目的遺伝子として、図１６に示すPD-1細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. BC074740 (NCBI)）で特定される塩基配列からなるDNA）に示す塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exPD-1-Fc）を作製した。図１１に示すHRG搭載コンストラクトのHRGをPD-1-Fcに置き換えたNo.4-exPD-1-Fc発現ベクターを作製した。実施例３と同手法によりexPD-1-Fcをトランスフェクトした。 
　対数増殖期にあるFc融合タンパク質高産生CHO細胞を5×105細胞/mlの濃度に調製し、ハイパーフラスコ（Corning社）へ500 ml幡種し、37℃、5 ％CO2存在下でCD-CHO Medium（Life Technologies社)を用いて10日間培養し、培養上清を回収した。培養上清は、20 mM sodium phosphate（pH7.0）で予め洗浄したProtein G Sepharose 4 Fast Flow （GEヘルスケア社)を充填したカラムへ添加し、Fc融合タンパク質を結合させた。非特異的に結合したタンパク質は、20 mM sodium phosphate（pH7.0）を用いて洗浄した。Fc融合タンパク質は、0.1M Glycine-HCl（pH 2.7）で溶出を行い、溶出液は、1M Tris-HCl（pH 9.0）により中和された。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexPD-1-Fcという。成熟型PD-1細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号１４に示した。
　成熟型PD-1細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４）
GWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
（実施例５）遺伝子組換えEMMPRINの産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるEMMPRIN細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図１７に示すEMMPRIN細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession　No. ENSG00000172270 (Ensembl)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exEMMPRIN-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、EMMPRIN細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexEmmprin-Fcという。EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号１６に示した。
　成熟型EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）
ASGAAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGRSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSKGSDQAIITLRVRSHL
（実施例６）遺伝子組換えNPTNβの産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるNPTNβ細胞外ドメインの産生について説明する。
　本実施例では、目的遺伝子として、図１８に示すNPTNβ細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. ENSG00000156642 (Ensembl)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exNPTNβ-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、NPTNβ細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexENPTNβ-Fcという。NPTNβ細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号１８に示した。
　成熟型NPTNβ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）
QNAGFVKSPMSETKLTGDAFELYCDVVGSPTPEIQWWYAEVNRAESFRQLWDGARKRRVTVNTAYGSNGVSVLRITRLTLEDSGTYECRASNDPKRNDLRQNPSITWIRAQATISVLQKPRIVTSEEVIIRDSPVLPVTLQCNLTSSSHTLTYSYWTKNGVELSATRKNASNMEYRINKPRAEDSGEYHCVYHFVSAPKANATIEVKAAPDITGHKRSENKNEGQDATMYCKSVGYPHPDWIWRKKENGMPMDIVNTSGRFFIINKENYTELNIVNLQITEDPGEYECNATNAIGSASVVTVLRVRSHL
（実施例７）遺伝子組換えEMBの産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるEMB細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図１９に示すEMB細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. BC059398 (NCBI)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exEMBβ-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、EMB細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexEMB-Fcという。EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号２０に示した。
　成熟型EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）
DGSAPDSPFTSPPLREEIMANNFSLESHNISLTEHSSMPVEKNITLERPSNVNLTCQFTTSGDLNAVNVTWKKDGEQLENNYLVSATGSTLYTQYRFTIINSKQMGSYSCFFREEKEQRGTFNFKVPELHGKNKPLISYVGDSTVLTCKCQNCFPLNWTWYSSNGSVKVPVGVQMNKYVINGTYANETKLKITQLLEEDGESYWCRALFQLGESEEHIELVVLSYLVP
（実施例８）遺伝子組換えRAGEの産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるRAGE細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図２０に示すRAGE細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. ENSG00000204305 (Ensembl)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exRAGE-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、RAGE細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexRAGE-Fcという。RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号２２に示した。
　成熟型RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）
QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLA
（実施例９）遺伝子組換えMCAMの産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるMCAM細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図２１に示すMCAM細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. BC056418 (NCBI)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exMCAM-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、MCAM細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexMCAM-Fcという。MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号２４に示した。
　成熟型MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）
VPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQGLDLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETGQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVNVAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRG
（実施例１０）遺伝子組換えALCAMの産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるALCAM細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図２２に示すALCAM細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. BC137097 (NCBI)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exALCAM-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、ALCAM細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexALCAM-Fcという。ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号２６に示した。
　成熟型ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２６）
WYTVNSAYGDTIIIPCRLDVPQNLMFGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFVCMLVTEDNVFEAPTIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWYRNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKADIQMPFTCSVTYYGPSGQKTIHSEQAVFDIYYPTEQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQPEGIRSSNTYTLTDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGDALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESLTLIVEGKPQIKMTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPKPAIQWTITGSGSVINQTEESPYINGRYYSKIIISPEENVTLTCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK
（実施例１１）遺伝子組換えErbB2の産生
　本実施例では、遺伝子組換え操作によるErbB2細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図２３に示すErbB2細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. ENSG00000141736 (Ensembl)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（exErbB2-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、ErbB2細胞外ドメイン＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexErbB2-Fcという。ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号２８に示した。
　成熟型ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２８）
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT
（実施例１２）遺伝子組換えHRGの産生
　本実施例では、目的遺伝子として、図２４に示すHRGのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No. BC069574 (NCBI)）で特定される塩基配列からなるDNA）の塩基配列へ図１５に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド（HRG-Fc）を作製し、用いた他は、実施例４と同手法により遺伝子組換え操作を行い、HRG＋ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をHRG-Fcという。HRGのアミノ酸配列は実施例３と同様に配列表の配列番号１０に示した。
（実験例４）タンパク質発現量
　実施例４～１２の方法で作製した各精製Fc融合タンパク質をSDS-PAGEを用いて分離し、CBB染色によってFc融合タンパク質の純度を確認した（図２５）。さらにこの精製Fc融合タンパク質のタンパク質量をBradford法により定量し、500 ml培養時の精製タンパク質量を算出し、表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実験例５）HRGによる好中球の正球化活性
　本実験例では、HRG活性として好中球の正球状形態誘導能（正球化活性）を確認した。本願明細書の実施例３で作製した遺伝子組換えヒトHRG（rHRG）、実施例１２で作製したHRG-Fc及び実施例３で作製した血漿由来HRG（hHRG）についHRG活性を測定し、各々活性を比較した。
　定法によりヒト肘静脈より採血した血液（抗凝固剤：ヘパリン）から分離血球分離溶液 PolymorphprepTM：ポリモルホプレップ（コスモ・バイオ社）を用いて好中球を単離し、PBS(-)で2×106/mlに調整した。細胞懸濁液3 mlに、核染色色素であるHoechst系色素（10mg/ml）を1.5μl、生細胞を染色するのに適した蛍光染色色素であるCalcein-AM（5 mM）を3μl を加え、37℃で15分間インキュベートした。遠心処理後上清を除き、6 mlのHank's Balanced Salt Solution（HBSS）で懸濁し、1×106/mlの好中球懸濁液を調製した。
　好中球懸濁液を96 wellプレートに100μlずつ分注し、rHRG、HRG-Fc及びhHRGをそれぞれ0.01μMから3μMまでの各濃度のHRGを加え、37℃で60分インキュベートした。室温冷却10分後、蛍光顕微鏡下で細胞形態を撮影し、In Cell AnalyzerTM 2000（GEヘルスケア社）で好中球の細胞表面積率を測定し、In Cell Analyzer Workstation softtwareを用いて解析した（n=3）。HRGによる好中球の細胞正球化率（％）図２６に示し、HRGの好中球正球化活性を確認した。100％は細胞が正球状形態（正円形の丸い形態）であることを示す。図２７は、本実験例の条件で細胞を処理したとき各細胞の形状を示す写真図である。
　以上の結果より、本実施例の方法で作製したrHRG及びHRG-Fcは、血漿由来HRG（hHRG）とほぼ同等の好中球正球化活性を有することが確認された。
（実験例６）S100A8/A9による細胞走化能促進作用の遮断効果
　本実験例では、NPTN-Fc（実施例６）、EMMPRIN-Fc（実施例５）、RAGE-Fc（実施例８）、ALCAM-Fc（実施例１０）、MCAM-Fc（実施例９）及びEMB-Fc（実施例７）で作製した各タンパク質について、S100A8/A9によるがん細胞走化能促進作用に対する遮断効果を確認した。
　S100A8/A9は、がん細胞の遊走性や浸潤性を促進するタンパク質として知られている。S100A8/A9のうち、S100A8遺伝子はEnsembl Gene ID：ENSG00000143546で特定され、S100A9遺伝子はEnsembl Gene ID：ENSG00000163220で特定される。これらの遺伝子情報を基に、Biochemistry and Biophysics Reports 6 (2016) 94-100に示す方法で作製したS100A8/A9タンパク質を用いて本実験例の試験を行った。
　本実験例では、B16-BL6細胞（マウス悪性黒色腫細胞株）の走化能をボイデンチャンバー法により測定した。本実験例でのボイデンチャンバー法による試験は、孔径3～12μmのポリカーボネート膜を装着したチャンバーと24 wellプレートを組み合わせたものを用いて行った。最終濃度100 ng/mlのS100A8/A9を含むDMEM/F12培地（0.1%血清含有）を800μlで下側のチャンバーを満たした。その後、上側のチャンバーに、DMEM/F12無血清培地に5×104 cells/200μlのB16-BL6細胞を含む細胞懸濁液を加え、12時間、37℃でインキュベーションした後、チャンバー膜を通過した細胞をカウントした。
　NPTN-Fc（実施例６）、EMMPRIN-Fc（実施例５）、RAGE-Fc（実施例８）、ALCAM-Fc（実施例１０）、MCAM-Fc（実施例９）及びEMB-Fc（実施例７）で作製した各タンパク質を各々最終濃度1000 ng/mlとなるように、S100A8/A9と共存させたDMEM/F12培地（0.1%血清含有）に加え、各試験溶液とした。下側のチャンバーを800μlの各試験溶液で満たし、その後上述のように上側のチャンバーに、DMEM/F12無血清培地に5×104 cells/200μlのB16-BL6細胞を含む細胞懸濁液を加え、12時間、37℃でインキュベーションした。各々についてチャンバー膜を通過した細胞をカウントし、細胞の走化能を測定した。各実施例で作製したタンパク質について、S100A8/A9による細胞走化能促進作用に対する遮断効果を確認した。
　その結果、各実施例で作製したいずれのタンパク質についても、S100A8/A9による細胞走化能促進作用を遮断し、S100A8/A9を含まない場合の走化能と同等又はそれより低い走化能に抑制されることが確認された（図２８、２９）。この結果より、本実施例の方法で作製した各タンパク質について、優れた作用を有することが確認できた。
　以上詳述したように、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター（Ｐ）の上流及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセットによれば、従来遺伝子組換えによる作製が困難であったタンパク質も大量に産生させることができる。さらに、上記において、トランスポゾン配列（Ｔ）とともに、複製開始配列（Ｓ）の上流に核マトリックス結合配列（Ｍ）を組み合わせて適宜配置することで、より効果的に目的タンパク質を安定的かつ大量に産生することができる。
　本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット（例えば、特許文献４に示すpCMViR-TSCベクター）をトランスポゾン配列（Ｔ）で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに複製開始配列（Ｓ）、核マトリックス結合配列（Ｍ）を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、もしくは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、プロモーター（Ｐ）の上流にトランスポゾン配列（Ｔ）、プロモーター（Ｐ）の下流に目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の下流にエンハンサー（Ｐ'）、さらにその下流に核マトリックス結合配列（Ｍ）、複製開始配列（Ｓ）、トランスポゾン配列（Ｔ）を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。本発明の遺伝子発現用ベクターによれば、薬剤選択後の安定発現細胞株にも関わらず、従来の発現ベクターと比較して数倍から数十倍の高発現を達成したpCMViR-TSCベクターの一過性発現量を更に凌駕する発現量を達成した。
　例えば、細胞の種類、遺伝子の種類、トランスフェクション試薬の種類を問わず、遺伝子発現させようとする目的タンパク質を超高発現により、安定かつ大量に産生することができる。バイオテクノロジーの分野での試薬としての適用のみならず、治療用のタンパク質医薬としての適用や臨床での遺伝子を用いた治療・検査・診断のために幅広い応用が可能である。
　医療分野の研究開発のためや、医薬、医薬品、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質として、具体的にはHRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2や抗体が挙げられる。

Claims (13)

  1. 目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター（Ｐ）の上流及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセット。
  2. さらに、プロモーター（Ｐ）の上流及び／又はエンハンサー（Ｐ'）の下流に、複製開始配列（Ｓ）が配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子発現用カセット。
  3. プロモーター（Ｐ）、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、エンハンサー（Ｐ'）及びトランスポゾン配列（Ｔ）が含まれ、更に選択的に複製開始配列（Ｓ）を含む遺伝子発現用カセットが、以下の１）～４）のいずれかに示す順序で含まれる、請求項１又は２に記載の遺伝子発現用カセット：
    １）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
    ２）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
    ３）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）；
    ４）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）。
  4. 複製開始配列（Ｓ）の上流に核マトリックス結合配列（Ｍ）が配置されていることを特徴とする請求項２又は３に記載の遺伝子発現用カセット。
  5. トランスポゾン配列（Ｔ）、プロモーター（Ｐ）、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、エンハンサー（Ｐ'）、核マトリックス結合配列（Ｍ）、複製開始配列（Ｓ）及びトランスポゾン配列（Ｔ）を含む、遺伝子発現用カセット。
  6. 複製開始配列（Ｓ）が、ROIS及び／又はARSである請求項２～５のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
  7. プロモーター（Ｐ）が、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１～６のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
  8. 目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の下流に連結したエンハンサー（Ｐ'）が、hTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか１種又は複数種を含む、請求項１～７のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
  9. 目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）において、目的遺伝子が、HRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2及び抗体のいずれかから選択されるタンパク質の部分又は全体をコードする遺伝子を含む、請求項１～８のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用プラスミド。
  11. 請求項１～９のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用ベクター。
  12. 請求項１～９のいずれかに記載の発現用カセットを用いて目的遺伝子を発現させる方法。
  13. 請求項１～９のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを用いて産生されたタンパク質。
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