JP5452835B2 - 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法 - Google Patents

形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法 Download PDF

Info

Publication number
JP5452835B2
JP5452835B2 JP2005511621A JP2005511621A JP5452835B2 JP 5452835 B2 JP5452835 B2 JP 5452835B2 JP 2005511621 A JP2005511621 A JP 2005511621A JP 2005511621 A JP2005511621 A JP 2005511621A JP 5452835 B2 JP5452835 B2 JP 5452835B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
igm
chain
gene
cells
hexamer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2005511621A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2005005636A1 (ja
Inventor
礼子 入江
浩行 角田
智之 井川
泰男 関森
政幸 土屋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPWO2005005636A1 publication Critical patent/JPWO2005005636A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5452835B2 publication Critical patent/JP5452835B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854Immunoglobulins
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854Immunoglobulins
    • G01N33/686Anti-idiotype
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

本発明は、遺伝子操作技術を利用するIgMの製造に関する。
多くの高等動物の免疫グロブリンには、5種類の異なったクラスIgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEが存在する。各クラスの免疫グロブリンは、大きさ、電荷、アミノ酸組成、糖含量等の性状が異なっている。これらのクラスの中で、IgMは血漿免疫グロブリン全体の約10%を占めている。IgMは、複雑な抗原性を持つ細胞膜抗原、感染性微生物、あるいは溶解性抗原に対して産生される初期抗体の主成分である。
ヒトIgMは、生体内では、通常、5量体構造を有している。IgMの5量体構造を構成する5つのサブユニットは、IgGに類似した4本鎖構造からなっている。IgMのH鎖であるμ鎖はIgGのH鎖であるγ鎖とアミノ酸配列が異なる以外にも次のような相違を有する。
μ鎖は、定常領域のドメインを、γ鎖よりも一つ余分に持っている。
μ鎖は、オリゴ糖鎖の数がγ鎖と比較して4箇所多い。
IgMは、IgGには見られないJ鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。J鎖は、IgMが抗体産生細胞から分泌される前に、μ鎖の会合を補助すると考えられている。
近年、モノクローナル抗体技術および組換えDNA技術の進歩により、純粋な免疫グロブリンを大量に生産することが可能になった。更に遺伝子組み換え技術は、キメラ抗体やヒト化抗体生産を可能にした。キメラ抗体とは、可変領域を異なる種に由来する可変領域に組み換えた構造を有する抗体である。たとえば、ヒト以外の動物種の可変領域とヒト抗体の定常領域を有する「キメラ抗体」(文献1/Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1984)81:6851)が公知である。更に、他の動物種の相補性決定領域(complementarity determining regions;CDR)をヒトイムノグロブリンに移植したヒト化抗体も公知である(文献2/Nature (1986)321:521)。
実際に、抗腫瘍抗体に関して列挙すると、抗CD20ヒトキメラ抗体であるリツキサン(Rituxan登録商標:IDEC社)や抗HER2/neuヒト化抗体であるハーセプチン(Herceptin登録商標:Genentech社)が臨床試験を終了し、既に承認・販売されている。IgGおよびIgMのエフェクター機能として抗体依存性細胞障害活性(以下、ADCC活性と表記する)や補体依存性細胞障害活性(以下、CDC活性と表記する)が知られている。IgMのCDC活性はIgGと比較して高いことから、CDC活性を主薬効とする抗腫瘍抗体となる可能性が極めて高いと思われる。しかし上述のとおり、IgMはIgGと異なり多量体を形成する。そのため、組換え体IgMを工業的規模で生産することは困難であると考えられていた。
IgM組換え体については、非リンパ球細胞を用いた生産系についていくつかの報告がある。C6グリオーマ細胞、CHO細胞、あるいはHeLa細胞にIgM H鎖、L鎖の遺伝子を導入し、多量体の形成が確認されたが、CHO細胞の産生量は非常に低いことが確認されている(文献3/EMBO J.(1987) 9;2753)(特許文献1/WO89/01975)。さらにCHO細胞において、IgM H鎖、L鎖それぞれを発現ベクターに組み込み、共発現させることにより、IgM産生株が取得されている(文献4/J.Immunol.(1990)145;3011)(文献5/Human Antibodies(1997)8;137)。これらの報告でもCHO細胞が産生する組換えIgMは多量体を形成しているが、5量体および6量体の存在比などについては明確にされていない。
IgMの組み換え体の多量体構造が確認されていない最大の理由は、解析技術が確立されていないことである。すなわち公知のイムノグロブリンの解析方法では、多量体構造を有するIgMを正しく分析することはできなかった。たとえば蛋白質の分離および同定技術として、SDS-PAGEのようなゲル電気泳動が知られている。しかしIgMは分子量約100万を有する巨大分子である。そのため一般的な方法では多量体構造(5量体と6量体)を定量的に解析することは困難である。
報告されているIgMの多量体構造の分析法においては、RI標識したIgMを用いて非還元SDS-PAGEを行なっている(文献6/J.Immunol.(1994)152;1206)。IgMを医薬品として開発するためには、製造過程においてIgMの多量体構造を分析することができる技術が必要である。具体的には、製造細胞の選定、細胞培養のモニタリング、精製、原体製造、製剤製造のあらゆる工程においてIgMの多量体構造の分析が必要である。しかしRIを用いる方法では、これら全ての工程の評価に対応することは現実的ではない。
〔文献1〕Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1984)81:6851
〔文献2〕Nature (1986)321:521
〔文献3〕EMBO J.(1987) 9;2753
〔文献4〕J.Immunol.(1990)145;3011
〔文献5〕Human Antibodies(1997)8;137
〔文献6〕J.Immunol.(1994)152;1206
WO89/01975
本発明は、高いIgM産生能を有する細胞の提供を課題とする。また本発明は、5量体または6量体構造を有するIgMの供給を可能とする技術の提供を課題とする。更に本発明は、IgMの多量体構造あるいは会合体の解析方法の提供を課題とする。
これまでのIgM研究は、多くがミエローマ、ハイブリドーマ、Bリンパ腫細胞株などのリンパ球細胞を使用して行われてきた。B細胞分化の各過程の細胞株にJ鎖遺伝子を導入することにより、J鎖を発現していない細胞が分泌するIgMは6量体を形成し、J鎖を発現している細胞が分泌するIgMは5量体を形成することが確認された(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1995)92:2884)。また、Bリンパ腫細胞株およびHybridomaが分泌するIgMの5量体、6量体成分を分画し、6量体成分が5量体成分と比較してCDC活性が高いことが示された(Eur.J.Immunol., (1990)20:1971)(J.Immunol.(1998)160;5979)。このようにCDC活性とIgMのコンホメーションとの関係は重要であると考えられている。しかし、リンパ球細胞が分泌したIgMの5量体、あるいは6量体成分を大量に取得することは困難である。
取得が困難な蛋白質を大量に入手するための手法として、しばしば遺伝子組み換え技術が利用される。しかしIgMについては、組み換え体においてその多量体構造の構築を可能とする技術が見出されていなかった。そこで本発明者らは、IgMを多量に供給することができる細胞、並びに多量体構造を有するIgMの産生を可能とする技術を確立することを目的として研究を重ねた。
その結果、本発明者らは、H鎖、L鎖、およびJ鎖をコードする遺伝子を適当なベクター上に配置し、それを宿主細胞に形質転換することにより、5量体のIgMが取得できることを見出した。また本発明者は、形質転換細胞がJ鎖の発現を伴わない場合には、IgMが主として6量体を形成することを明らかにした。更に、これらの発現細胞のIgM産生量が極めて高いことを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のIgM産生細胞、IgM産生方法、並びにこれらの細胞あるいは方法によって得ることができるIgM多量体に関する。更に本発明は、IgM多量体構造あるいはIgM会合体の解析方法を提供する。
〔1〕100mg/L以上のIgMを産生できる形質転換細胞。
〔2〕35 pg /cell /day以上のIgMを産生できる形質転換細胞。
〔3〕真核細胞である〔1〕または〔2〕に記載の形質転換細胞。
〔4〕原核細胞である〔1〕または〔2〕に記載の形質転換細胞。
〔5〕哺乳動物細胞である〔3〕に記載の形質転換細胞。
〔6〕株化細胞である〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔7〕非リンパ球系細胞株である〔6〕に記載の形質転換細胞。
〔8〕CHO細胞株である〔7〕に記載の形質転換細胞。
〔9〕同じベクター上に(1)IgM H鎖をコードする塩基配列および(2)IgM L鎖をコードする塩基配列の両方を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子(1)および(2)を含む遺伝子断片。
〔10〕同じベクター上に(1)IgM H鎖をコードする塩基配列、(2)IgM L鎖をコードする塩基配列、および(3)IgM J鎖をコードする塩基配列を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子(1)、(2)、および(3)を含む遺伝子断片。
〔11〕転写調節配列によりIgMの分泌が制御される〔9〕または〔10〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔12〕転写調節配列が、アデノウイルス2型主後期プロモーター、シミアンウイルス40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、およびCAGプロモーターからなる群から選択される〔11〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔13〕転写調節配列が、シミアンウイルス40初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター、およびCAGプロモーターからなる群から選択される〔12〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔14〕〔9〕〜〔13〕のいずれかに記載のベクターあるいは遺伝子断片で形質転換された形質転換細胞。
〔15〕〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の形質転換細胞から選択される、〔14〕に記載の形質転換細胞。
〔16〕発現ベクターまたは遺伝子断片が、J鎖をコードする塩基配列を含んでいる〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔17〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有し、かつ60%以上の含量を持つ5量体IgMを産生する〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔18〕80%以上の含量を持つ5量体IgMを産生する〔17〕に記載の形質転換細胞。
〔19〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ50%以上の含量を持つ6量体IgMを産生する〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔20〕80%以上の含量を持つ6量体IgMを産生する〔19〕に記載の形質転換細胞。
〔21〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有し、かつ産生する5量体と6量体の比(5量体/6量体比)が1.5以上であるIgMを産生する〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔22〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ産生する6量体と5量体の比(6量体/5量体比)が1.5以上であるIgMを産生する〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔23〕IgM H鎖およびIgM L鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターまたは遺伝子断片が、J鎖をコードする塩基配列を含まず、かつ共形質転換によりJ鎖をコードする塩基配列が発現可能に導入されている〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔24〕〔1〕〜〔8〕、並びに〔14〕〜〔23〕のいずれかに記載の細胞を培養し、IgMを採取する工程を含むIgMを製造する方法。
〔25〕〔1〕〜〔8〕、並びに〔14〕〜〔23〕のいずれかに記載の細胞培養物の培養上清からIgMを精製する工程を含む、実質的に純粋なIgMを製造する方法。
〔26〕〔24〕に記載の方法により得られるIgM。
〔27〕〔25〕に記載の方法により得られる実質的に純粋なIgM。
〔28〕ヒト抗体、マウス抗体、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体である〔26〕または〔27〕に記載のIgM。
〔29〕実質的に純粋な5量体あるいは6量体である〔26〕〜〔28〕のいずれかに記載のIgM。
〔30〕CHO細胞が付加する糖鎖を有する実質的に純粋な5量体または6量体IgM。
〔31〕抗糖鎖抗体である〔26〕〜〔30〕のいずれかに記載のIgM。
〔32〕抗ガングリオシド抗体である〔31〕に記載のIgM。
〔33〕抗GM2またはGM3抗体である〔32〕に記載のIgM。
〔34〕配列番号:1に記載の塩基配列、または配列番号:2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔35〕配列番号:3に記載の塩基配列、または配列番号:4に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔36〕〔34〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔37〕〔35〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔38〕〔36〕に記載の蛋白質と〔37〕に記載の蛋白質を構成単位として含むIgM。
〔39〕更にIgM J鎖を含む〔38〕に記載のIgM。
〔40〕5量体である〔39〕に記載のIgM。
〔41〕配列番号:19に記載の塩基配列、または配列番号:20に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔42〕配列番号:21に記載の塩基配列、または配列番号:22に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔43〕〔41〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔44〕〔42〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔45〕〔43〕に記載の蛋白質と〔44〕に記載の蛋白質を構成単位として含むIgM。
〔46〕更にIgM J鎖を含む〔45〕に記載のIgM。
〔47〕5量体である〔46〕に記載のIgM。
〔48〕〔26〕〜〔33〕、〔38〕、および〔45〕のいずれかに記載のIgMを含有する医薬組成物。
〔49〕80%以上の5量体IgMを含有する医薬組成物。
〔50〕50%以上の6量体IgMを含有する医薬組成物。
〔51〕80%以上の6量体IgMを含有する〔50〕に記載の医薬組成物。
〔52〕5量体/6量体比が1.5以上であるIgMを含有する医薬組成物。
〔53〕6量体/5量体比が1.5以上であるIgMを含有する医薬組成物。
〔54〕次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを担体としてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってIgMを分離する工程を含む、IgMの多量体を分析する方法。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
〔55〕条件a)における温度が37℃以上である〔54〕に記載の方法。
〔56〕条件b)における過硫酸アンモニウムの濃度が0.25%以上である〔54〕に記載の方法。
〔57〕ポリアクリルアミドゲルが、前記a)-c)からなる群から選択された少なくとも2つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルである〔54〕に記載の方法。
〔58〕ポリアクリルアミドゲルが、前記a)-c)の全ての条件を満たすポリアクリルアミドゲルである〔54〕に記載の方法。
〔59〕電気泳動用のバッファーがTris-acetate SDS泳動バッファーである〔54〕に記載の方法。
〔60〕IgMの多量体が、IgMの5量体および/または6量体である〔54〕に記載の方法。
〔61〕IgMの会合体を分析することを特徴とする〔54〕に記載の方法。
〔62〕RIを使用しないことを特徴とする〔54〕に記載の分析方法。
〔63〕電気泳動後に分離されたIgMの多量体を定量する工程を含む、〔54〕に記載の方法。
〔64〕次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルからなる、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲル。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
〔65〕次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの工程を含む、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法。
a)アクリルアミドを高温で重合させる工程、
b)アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
c)重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、
本発明は、100mg/L以上のIgMを産生する形質転換細胞を提供する。本発明における形質転換細胞とは、外来性のIgM遺伝子を発現可能に保持した細胞を言う。100mg/L以上のIgMの産生とは、IgM産生細胞がその培養物1L中に、100mg以上のIgMを蓄積しうることを言う。培養物中のIgMの産生量は、ELISAなどによって測定することができる。本発明において、IgMの蓄積量は、通常100mg/L以上、好ましくは120mg/L以上、更に好ましくは150mg〜300mg/Lである。多量体であるために高度な産生量を実現しにくいと考えられていたIgMにおいて、本発明の形質転換細胞の産生量はきわめて高い水準にあると言って良い。
細胞融合法によって樹立されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、高い産生量を期待できるIgGにおいても一般に数mg〜数10mg/Lとされている。つまり本発明の形質転換細胞は、ハイブリドーマの標準的なモノクローナル抗体の産生量をはるかに上回る量のIgMを産生する。
本発明において、IgMとはH鎖の定常領域としてμ鎖の定常領域を有し、かつ5量体または6量体の構造を持つイムノグロブリンを言う。一方、本発明におけるIgMを構成する可変領域の由来は限定されない。したがって、μ鎖由来の可変領域に加えて、IgG由来の可変領域やその部分構造を含むことができる。可変領域の部分構造としては、フレームワークやCDRを示すことができる。なお本発明におけるIgMは、形質転換細胞に導入された外来性のIgM遺伝子の発現産物を言う。
更に、本発明のIgMを構成する定常領域が由来する動物種も限定されない。つまり本発明のIgMは、IgMタイプのイムノグロブリンを有するあらゆる動物種に由来するIgM定常領域を含む。IgMを体内への投与に用いる場合には、少なくともその定常領域は、投与対象となる種と同じ種に由来することが望ましい。したがって、ヒトへの投与を目的とする場合には、少なくとも定常領域がヒト由来であることが望ましい。ヒト由来の定常領域と、他の動物種、あるいはヒト由来であるが他の個体に由来する可変領域とで構成されるIgMは、キメラ抗体と呼ばれる。
定常領域に加えて、可変領域のフレームワークもヒト由来としたIgMは、ヒトへの投与用のIgMとして更に好ましいIgMである。可変領域のフレームワークの構造を維持し、CDRのみを他の動物種の抗体と組み換えられた抗体は、ヒト化抗体と呼ばれている。
また本発明は35 pg /cell /day以上のIgMを産生する形質転換細胞を提供する。本発明の望ましい形質転換細胞において、1細胞、1日あたりのIgM産生量は、通常35pg以上、好ましくは40pg以上である。細胞あたりのIgMの産生量は、培養物中に蓄積されたIgMの量と、培養物を構成する形質転換細胞の数に基づいて明らかにすることができる。形質転換細胞がクローニングされた細胞である場合には、こうして決定された1細胞あたりのIgM産生量は、当該細胞集団を構成する全ての細胞が等しく有している特性であるとみなすことができる。
IgMは、通常、細胞内での発現とコンフォーメーションの獲得を経て、培養上清中へ分泌される。しかし、細胞の破砕等により、機能的なコンフォーメーションを有するIgMを回収できるのであれば、IgMが細胞内に蓄積されたままであっても良い。また、回収されたIgM分子に何らかの処理により機能的なコンフォーメーションを与えることが可能ならば、必ずしも培養物中でIgMとしての活性を示していなくてもよい。
本発明が提供する高度なIgM産生能を有する形質転換細胞は、μ鎖を構成するH鎖とL鎖の遺伝子を同一のベクター上に発現可能に配置したベクターまたは遺伝子断片を、適当な宿主細胞に形質転換することによって得ることができる。本発明の形質転換細胞を得ることができる宿主細胞とそれを形質転換するための方法について以下に述べる。
まず、目的とするH鎖とL鎖をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。発現ベクターに組み込む遺伝子として、更にJ鎖をコードする遺伝子を組み合せることもできる。これらの遺伝子は、発現制御領域の制御下に発現するよう発現ベクターに組み込まれる。
IgMのH鎖、L鎖あるいはJ鎖をコードする遺伝子(IgM遺伝子)を取得する方法は公知である。以下、「IgM遺伝子」は、IgMを構成するH鎖、L鎖、あるいはJ鎖の遺伝子のいずれかを示す用語として用いる。
まずヒトJ鎖をコードする遺伝子はクローニングされ、その構造が明らかにされている(GenBank Accession No. M12759、Max & Korsmeyer, J.Exp.Med.(1985) 161:832-849)明らかにされた塩基配列情報に基づいて、IgM産生細胞のmRNAを鋳型として、J鎖をコードする遺伝子を取得することができる。
たとえば実施例に記載したJ鎖増幅用プライマーJ-f1およびJ-r1を利用して、J鎖をコードするDNAを増幅することができる。実施例において単離されたJ鎖をコードするcDNAの塩基配列は配列番号:5に、またこの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号:6に示した。
次にH鎖またはL鎖の遺伝子について述べる。一般にイムノグロブリンの遺伝子の取得においては、その可変領域をを含む領域をコードする塩基配列が重要である。イムノグロブリンの定常領域の構造は保存されている。そのため、いったんクローニングされれば、可変領域を組み換えることによって、目的とする抗原結合活性を有するイムノグロブリンを再構成できると考えられている。したがって、通常は、可変領域やCDRの遺伝子を取得し、先にクローニングされた定常領域やフレームワークに移植することによって、イムノグロブリン全体をコードする塩基配列が構築される。IgMを構成するμ鎖のH鎖あるいはL鎖の定常領域の構造は既に明らかにされている。
μ鎖定常領域: Dorai & Gillies, Nucleic Acids Res.(1989) 17:6412
κ鎖定常領域: Hieter et al., Cell (1980) 22:197-207
γ鎖定常領域: Hieter et al., Nature (1981) 294: 536-540
更に本発明におけるIgMは、定常領域を改変したIgMが含まれる。たとえば、IgMを構成するμ鎖のH鎖あるいはL鎖の定常領域を改変して、そのCDC活性を高められる可能性がある。あるいはIgGのFc領域を接合することによって、ADCC活性を有するIgM分子を創出することもできる。
本発明において、可変領域をコードする遺伝子の由来は限定されない。たとえば、IgM産生細胞からPCR法によって可変領域遺伝子を増幅することができる。可変領域遺伝子をPCR法によって増幅することができるプライマーは公知である(Ivanovzki et al., Blood (1998) 91: 2433-2442)。またファージ抗体ライブラリーから可変領域遺伝子を単離することもできる(Clackson et al., Nature (1991) 352:624-628; Marks et al., J.Mol.Biol. (1991)222:581-597)。更に、IgGのようなIgM以外のイムノグロブリンの可変領域遺伝子をIgMの定常領域に接合することもできる。
可変領域遺伝子を取得するためのIgM産生細胞、あるいはIgM以外のクラスのイムノグロブリン産生細胞としては、任意のイムノグロブリン産生細胞を利用することができる。たとえば、ヒトの末梢血から採取されたB細胞から、ヒトIgMあるいはヒトIgGなどの可変領域遺伝子を取得することができる。具体的には、ヒトIgMあるいはヒトIgGを産生するB細胞とミエローマ細胞との融合細胞の作製またはヒトIgMあるいはヒトIgGを産生するB細胞をEpstein-Barrウイルスで形質転換させることにより不死化させ、目的とする抗原に対するIgMを産生する細胞をスクリーニングしてから可変領域遺伝子を取得するのが望ましい。また、目的とする抗原で免疫した免疫動物のB細胞あるいは免疫担当細胞から、IgMあるいはIgGなどの可変領域遺伝子を取得することもできる。
更にIgM産生細胞のmRNAから、IgMをコードする塩基配列の全長を取得することもできる。まず予め構造の明らかにされている定常領域をコードする部分をPCR法によって増幅する。次に5'方向の未知塩基配列を決定するための手法によって、可変領域をコードする部分を取得する。既知塩基配列情報に基づいて、未知塩基配列部分を増幅するための手法が公知である。たとえば5'RACEによって、5'側の未知塩基配列を取得することができる。
あるいは既にクローニングされたIgM遺伝子が入手できる場合には、その遺伝子をそのまま、あるいは必要に応じて増幅して、以下のベクターあるいは遺伝子断片の構築に利用することもできる。
たとえば、ガングリオシドGM3に対するIgM抗体であるL612遺伝子の塩基配列が明らかにされている(Cancer Research 1993;53:5244-5250)。またガングリオシドGM2に対するIgM抗体であるL55遺伝子の塩基配列が公知である(Immunogenetics 1998;48:73-75)。
本発明に用いるIgM遺伝子を改変してIgM抗体変異体とすることができる。本発明において、「抗体変異体」とは、1またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体のH鎖若しくはL鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、そして、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と100%よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
たとえば、IgM H鎖にCys残基を導入された変異体において、5/6量体の構造変換が確認されている(Davis, et. al. EMBO J. (1989) 8, 2519-2526)。あるいは、IgM H鎖の4領域(Cμ1, Cμ2, Cμ3, Cμ4)に欠失、変異を加えて、J鎖の取り込みや5/6量体構造の変化が確認されている。これらの知見に基づいて、目的とする5量体あるいは6量体を構成しうるIgMの変異体をコードする遺伝子を得ることができる。
また、本発明のIgM抗体は糖鎖が改変されたIgM抗体であってもよい。
一方、本発明における発現制御領域としては、たとえば、エンハンサーやプロモーターが利用される。この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、IgMを発現させることができる。
あるいは、これらの遺伝子を含む遺伝子断片によって宿主細胞を形質転換し、本発明の形質転換細胞を得ることができる。たとえば、発現制御領域と構造遺伝子とからなる発現カセットを含む遺伝子断片は、宿主細胞のゲノムに相同組み換えによって導入することができる。遺伝子断片を保持した宿主細胞は、当該構造遺伝子を発現することができる。
本発明の形質転換細胞を得るには、適当な宿主細胞と発現ベクターまたは遺伝子断片の組み合わせを使用することができる。宿主細胞には、原核細胞や真核細胞が利用される。原核細胞としては、大腸菌や枯草菌などを利用することができる。一方真核細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、あるいは酵母細胞等の細胞において、様々な外来性遺伝子の発現システムが実用化されている。
本発明の形質転換細胞を得るための望ましい宿主細胞として、哺乳動物細胞や昆虫細胞を示すことができる。既に述べたように、μ鎖はいくつかの糖鎖結合部位を有している。これらの糖鎖結合部位糖鎖を付加することによって、より天然のIgMに近い構造のIgMを得ることができる。天然の構造を模倣したμ鎖からなるIgMには、IgMとしての高い活性が期待できる。IgMの活性とは、たとえばCDC活性や多量体あるいは会合体の形成能を示すことができる。また、IgMの構造が天然の分子に近いことは、IgMの治療効果、および安全性の向上にも貢献する。天然の構造を有するIgMには、レシーピエント(recipient)の免疫学的な排除機構が作用しにくいことが予測されるためである。
糖鎖を備えた状態でIgMを発現させるためには、真核細胞の利用が有利である。中でも哺乳動物細胞は、好ましい宿主細胞として示すことができる。より具体的には、非リンパ球系の哺乳動物細胞は、培養が容易であり、J鎖を発現していない細胞(Cattaneo & Neuberger, EMBO J. (1987) 6:2753-2758、Davis et al., J.Exp.Med. (1988) 18:1001-1008)が多いため宿主細胞として好ましい。非リンパ球系細胞株として、CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞を示すことができる。これらの動物細胞においては、天然のIgMに近い糖鎖の付加を期待することができる。特にCHO細胞は、高いIgMの発現レベルと、天然に近い糖鎖の付加が期待できるため、宿主細胞として好ましい。
本発明の形質転換細胞は、これらの宿主細胞にIgMのH鎖とL鎖、あるいは更にJ鎖をコードする塩基配列(IgM遺伝子)を導入し発現させることによって得ることができる。これらの宿主細胞に外来性の遺伝子を導入し発現させるための発現ベクターが公知である。
本発明において、宿主細胞として真核細胞を用いる場合には、たとえば次のような宿主ベクター系を利用することができる。
たとえば哺乳動物由来の発現ベクターとして、pCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193-200)、pcDNA3 (インビトロゲン社製)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、およびpCDM8が公知である。動物ウィルス由来の発現ベクターによって哺乳動物細胞を形質転換することもできる。ウイルス由来の発現ベクターとして、pHSV、pMV、あるいはpAdexLcwを示すことができる。その他、レトロウィルス由来の発現ベクターであるpZIPneoも、動物細胞の形質転換に有用である。
更にpBacPAK8が、昆虫細胞用の発現ベクターとして市販されている(「Bac-to-BAC baculovairus expression system」、ギブコBRL社製)。また植物細胞用の発現ベクターとして、例えばpMH1やpMH2を示すことができる。更に酵母用の発現ベクターとして、例えば「Pichia Expression Kit」(インビトロゲン社製)、pNV11、SP-Q01を示すことができる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、IgM遺伝子が発現制御領域の制御下に発現できるように配置する。発現制御領域はエンハンサーやプロモーターを含む。たとえば哺乳動物細胞において有効なプロモーターとして、次のプロモーターを示すことができる。
アデノウイルス2型主後期プロモーター、
シミアンウイルス40初期プロモーター、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、
サイトメガロウイルスプロモーター、
ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター(Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、
ウシ成長ホルモンプロモーター、
βアクチン遺伝子プロモーター、および
CAGプロモーター
SV40プロモーター(Mulliganら, Nature (1979) 277, 108)、
マウス乳癌ウイルス(MMTV)-LTRプロモーター、
これらのプロモーターの中で、好ましいプロモーターを以下に示す。これらのプロモーターは、哺乳動物細胞において高い発現誘導作用が期待できる。
シミアンウイルス40初期プロモーター、
サイトメガロウイルスプロモーター、
ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター、
CAGプロモーター
更に選択マーカーを含む発現ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする。選択マーカーとしては、ネオマイシンやG418に対する薬剤耐性遺伝子が一般に用いられる。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、あるいはpOP13などが挙げられる。
形質転換細胞において、導入された遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数を増幅するための技術が公知である。たとえば、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクターを導入すれば、メトトレキセート(MTX)により遺伝子の発現を増幅することができる。DHFR遺伝子には、としてはpCHOI等を示すことができる。
その他に、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクターで形質転換すれば、遺伝子の一過性の発現を得ることができる。SV40の複製起点を持つベクターとしては、pcD等が公知である。複製開始点としては、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用いることもできる。
発現ベクターは、形質転換細胞における遺伝子コピー数増幅のために、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むこともできる。
真核細胞に加えて原核細胞の発現システムを本発明に利用することもできる。例えば、大腸菌の発現ベクターとしては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また枯草菌由来の発現ベクターとして、pPL608やpKTH50が挙げられる。宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーターを利用する必要がある。このようなプロモーターとして、例えば、lacZプロモーター(Wardら, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araBプロモーター(Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 )、またはT7プロモーターなどを示すことができる。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1(ファルマシア社製)、「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、またはpETなどが挙げられる。pETの場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 )を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
本発明は、上記ベクターまたは遺伝子断片が導入された形質転換細胞を提供する。上記ベクターを導入する宿主細胞は限定されない。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることができる。本発明の形質転換細胞は、例えば、IgMの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞株あるいはヒト細胞株としては、たとえば以下のような哺乳動物細胞株が知られている。
CHO(hamster ovarian cell, J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、
COS (monkey kidney cell, Miyazaki, et al., Gene (1989) 79, 269)、
3T3 (mouse fibroblasts)、
PC12 (human plasmacytoma, Neumann, et al., EMBO J.(1982) 1, 841)、
BHK(baby hamster kidney)、
HeLa(human epitherial cell, Cattaneo, et al. EMBO J.(1987) 6, 2753)、
C6 (human glioma cell, Cattaneo, et al. Eur. J. Biochem.(1983) 135, 285)、
Vero、(monkey kidney cell, cytology(1991)7,165)、および
アフリカツメガエル卵母細胞(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340)などの両生類細胞
この他、Sf9、Sf21、あるいはTn5等の昆虫細胞が知られている。
CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)、あるいはCHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)等を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。これらの細胞株は、寄託機関から入手することができる。以下に代表的な細胞株と、ATCCのAccession Numberを記載した。
CHO CCL-61, CRL-9096 BHK CRL-1632
COS CRL-1650, CRL-1651 HeLa CCL-2
3T3 CRL-1658 Vero CCL-81
発現ベクターは、任意の方法によって宿主細胞に導入することができる。ベクターの導入方法として、たとえば次のような方法を示すことができる。
リン酸カルシウム法、
DEAEデキストラン法、
カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、
エレクトロポーレーション法、
リポフェクション
植物細胞としては、例えば、タバコ属(Nicotiana)由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。また、近年、ウキクサ(Lemnaceae)やトウモロコシ(Zea mays)でのポリペプチド生産が報告されている。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの宿主細胞を上記発現ベクターまたは遺伝子断片により形質転換すれば、IgM産生能を有する形質転換細胞を得ることができる。これらの形質転換細胞から、高いIgM産生能を有する細胞を選択することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
例えば形質転換細胞をクローニングし、各クローンのIgM産生能を評価する。IgM産生能は、適当な培地中で形質転換細胞を培養し、その培養上清中に含まれるIgMを測定することによって知ることができる。目的とする反応性を有する高力価のIgMを産生する細胞を選択するために、目的とする抗原を用いたイムノアッセイを利用することができる。たとえば、抗原を結合させたマイクロプレートを利用するELISA法は抗原特異的なIgMの産生を確認する方法として好ましい。更に、IgMの細胞障害作用を評価するために、補体受容体の解析やIgMが有するCDC作用を評価することもできる。IgMの測定方法や、細胞当たりのIgMの産生量を決定するための具体的な手法は、たとえば実施例(1.6)に示したとおりである。
更に本発明は、5量体または6量体のIgMを産生する形質転換細胞を提供する。本発明者らにより、宿主細胞を形質転換する発現ベクターまたは遺伝子断片に含まれるIgM遺伝子がJ鎖をコードする塩基配列を有する場合には、IgMが5量体として発現されることが明らかにされた。またJ鎖をコードする塩基配列を含まない場合には、IgMは6量体として発現されることが明らかにされた。このように、本発明の知見に基づいて、IgMの多量体構造を制御することが可能となった。
本発明において、J鎖をコードする塩基配列は、H鎖およびL鎖をコードする塩基配列を保持したベクターと同じベクター上に配置することができる。あるいは、J鎖をコードする塩基配列を保持したベクターを、H鎖およびL鎖をコードする塩基配列を保持したベクターとともに共形質転換(コトランスフェクション;co-transfection)することによって細胞に導入することもできる。更に、H鎖、L鎖、およびJ鎖をコードする塩基配列を、それぞれ別のベクターに配置して、同一の細胞にコトランスフェクションすることもできる。
単一のベクターに3つの遺伝子を配置して宿主細胞を形質転換することによって、ベクター間の形質転換効率の違い、あるいは発現レベルの差を防ぐことができる。すなわち、H鎖、L鎖、およびJ鎖の3つの遺伝子を配置された発現ベクターは、本発明の形質転換細胞を得るためのベクターとして好ましい。
すなわち本発明は、前記ベクターまたは遺伝子断片が、IgMのH鎖、IgMのL鎖、およびIgMのJ鎖をコードする塩基配列を有し、かつ60%以上の含量を持つ5量体IgMを産生する形質転換細胞に関する。本発明において、好ましい形質転換細胞は、80%以上の含量を持つ5量体IgMを産生する。産生されたIgM分子に占める5量体IgMの割合は、たとえば後に述べる方法(実施例4)によって知ることができる。本発明において、全IgM中の5量体と6量体の比(5量体/6量体比)は、たとえば1.5以上、好ましくは5以上、より好ましくは10以上である。
また本発明は、遺伝子断片またはベクターがIgMのH鎖およびL鎖をコードする塩基配列を有し、かつJ鎖をコードする塩基配列を有さず、50%以上の含量を持つ6量体IgMを産生する形質転換細胞に関する。本発明において、好ましい形質転換細胞は、80%以上の含量を持つ6量体IgMを産生する。産生されたIgM分子に占める6量体IgMの割合は、たとえば後に述べる方法(実施例4)によって知ることができる。本発明において、全IgM中の6量体と5量体の比(6量体/5量体比)は、たとえば1.5以上、好ましくは5以上、より好ましくは10以上である。6量体のIgMは5量体に比べてCDC活性が高いことが既に報告されている。したがって、6量体IgMを優先的に製造することができる本発明の方法は、抗体医薬の製造技術として有用である。
生体内に存在するIgMの主成分は、J鎖を介して構成された5量体である。5量体含有量が高い組換えIgMを生産することは、天然分子に近いIgMが得られることを意味し、有用である。また、J鎖を含むことにより、5量体以外の分子(1量体〜4量体および6量体)がほとんど形成されないこと(Wiersma et al., J. Immunol. (1998) 160: 5979-5989、Sorensen et al., Int Immunol.(2000) 12:19-27)から、より純粋な組み換えIgMの生産が可能となる。
上記形質転換細胞を培養し、その培養物からIgMを取得することができる。形質転換細胞を、in vitroまたはin vivoで培養する方法が公知である。例えば動物細胞は、適当な動物細胞培養用の培地で培養される。DMEM、MEM、RPMI1640、あるいはIMDM等の培地が、動物細胞培養用の培地として公知である。これらの培地には、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8が好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、あるいは攪拌を加える。
in vitroにおける培養方法として、培地中に細胞を分散させて培養する方法や、半透膜を介して細胞と培地を接触させる方法が公知である。in vivoでの培養方法としては、マウスの腹腔内に細胞を接種する方法が知られている。
IgM発現ベクターで形質転換されたCHO細胞等の動物細胞は、培養上清中にIgMを分泌する。したがって、培養上清を回収することによって、目的とするIgMを得ることができる。培養上清は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは各種のアフィニティクロマトグラフィーなどの精製技術を利用して、精製IgMとすることができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。本発明は、培養上清から精製された実質的に純粋なIgMの製造方法を提供する。本発明において、実質的に純粋なIgMとは、そのIgM分子が由来する生物種の蛋白質を含まないIgMと定義することができる。たとえば、ヒト由来のIgM遺伝子によって形質転換された細胞から回収されたIgM分子が、ヒト由来のIgM以外の蛋白質を含まないとき、このIgMは実質的に純粋なIgMと言うことができる。本発明における実質的に純粋なIgMは、宿主細胞由来の蛋白、および宿主細胞の培養に使用した培養液の蛋白成分を実質的に含まないことが望ましい。実質的に含まないとは、これらの蛋白質成分が総蛋白質に対して20%以下、たとえば10%以下、好ましくは5%以下、あるいは2%以下、更に好ましくは1%以下であることを言う。
これらの製造方法によって得ることができるIgM抗体、あるいは実質的に純粋なIgM抗体は本発明に含まれる。本発明における好ましいIgM抗体は、50%以上の6量体、60%以上の5量体、好ましくは80%以上の5量体または6量体のIgM分子からなる。本発明において、少なくとも50%以上の6量体または60%以上の5量体で構成されるIgM抗体は、 実質的に純粋な5量体あるいは6量体である。本発明において、より望ましい実質的に純粋な5量体あるいは6量体は、たとえば80%以上の含量を有する。このような実質的に純粋なIgMは、医薬用組成物として有用である。
本発明におけるIgM抗体が由来する種は限定されない。本発明によって、たとえば、ヒト抗体、あるいはマウス抗体を得ることができる。また本発明のIgM抗体は、先に述べたように、定常領域と可変領域の遺伝子の由来が異なるキメラ抗体とすることもできる。キメラ抗体として、ヒト(定常)−ヒト(可変)キメラ抗体、あるいはヒト(定常)−異種動物(可変)キメラ抗体を示すことができる。ヒト−ヒトキメラ抗体をコードする遺伝子は、予めクローニングされたヒト定常領域遺伝子に、任意の可変領域遺伝子を接合して得ることができる。更に本発明は、ヒト化抗体を含む。ヒト化抗体は、ヒト可変領域遺伝子のフレームワークに、異種動物由来のCDRを組み込んだ遺伝子を発現させることによって得ることができる。
本発明のIgM抗体が認識する抗原は限定されない。IgM抗体は、CDC活性を備えた細胞障害性の強い抗体である。さらに、細胞死誘導活性を持つIgM抗体も報告されている(Yonehara et al., J.Exp.Med. (1989) 169:1747-1756)。したがって、IgM抗体は、癌の治療のような細胞障害を治療戦略とする医療技術に有用である。たとえば、様々な糖鎖抗原が腫瘍細胞の細胞表面マーカーとして利用できることが知られている。そのため糖鎖を認識するIgM抗体は、細胞を標的とする抗体医薬として有用である。たとえば、ある種のガングリオシドは腫瘍細胞に対する抗体医薬の標的分子として有用なことが知られている。具体的には、ガングリオシドGM2、GD2、GD3、あるいはGM3に対する抗体の、いくつかの腫瘍細胞に対する障害作用が確認されている。ガングリオシドGM2あるいはガングリオシドGM3に対するIgM抗体は、本発明における好ましいIgMとして示すことができる。これらのIgM抗体を本発明の方法によって製造することもできる。
ガングリオシドGM2あるいはGM3を認識するいくつかの抗体が報告されている。本発明における抗ガングリオシドGM2 IgM抗体、あるいは抗ガングリオシドGM3 IgM抗体の由来は限定されない。既知のIgM抗体の遺伝子を利用することもできるし、新たな抗IgM抗体遺伝子を取得して、本発明に応用することもできる。たとえば、以下の配列番号に記載のアミノ酸配列は、本発明における好ましい抗ガングリオシドGM2抗体、および抗ガングリオシドGM3抗体の可変領域として示すことができる。これらのアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を()内に記載した。
抗ガングリオシドGM2抗体(L55):
H鎖:配列番号:20(配列番号:19)
L鎖:配列番号:22(配列番号:21)
抗ガングリオシドGM3抗体(L612):
H鎖:配列番号:2(配列番号:1)
L鎖:配列番号:4(配列番号:3)
更に本発明は、上記のIgM抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。特に本発明は、5量体あるいは6量体のいずれかを他方に比べて多く含むIgMを提供した。その結果、本発明によって、IgMの5量体あるいは6量体に富む医薬組成物が提供された。すなわち本発明は、5量体/6量体比が、たとえば1.5以上、好ましくは5以上、より好ましくは10以上である医薬組成物を提供する。あるいは本発明は、6量体/5量体比が、たとえば1.5以上、好ましくは5以上、より好ましくは10以上である医薬組成物を提供する。
たとえば、本発明の抗ガングリオシドGM2 IgM抗体または抗ガングリオシドGM3 IgM抗体を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、癌の治療(または癌の予防)を行うことができる。さらに抗ガングリオシドGM2 IgM抗体を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、エイズの治療(またはエイズの予防)を行うこともできる。本発明は、このような治療方法(または予防方法)もまた提供する。
抗ガングリオシドGM2 IgM抗体または抗ガングリオシドGM3 IgM抗体を有効成分として含有する薬剤は、任意の方法によって投与することができる。したがって、経口、非経口投与のいずれでも可能である。好ましい投与方法は、非経口投与である。非経口投与のための具体的な剤型として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などを示すことができる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。さらに癌の疾患局所に直接投与することもできる。
抗ガングリオシドGM2 IgM抗体または抗ガングリオシドGM3 IgM抗体を有効成分として含有する薬剤自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与することもできる。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように調節することができる。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが利用される。補助剤には、具体的には、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム等を利用することができる。医薬組成物には、適当な溶解補助剤を加えることもできる。例えばアルコールや非イオン性界面活性剤は、溶解助剤として好ましい。アルコールとしては、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を示すことができる。また非イオン性界面活性剤としては、例えばポリソルベート80TM、あるいはHCO-50を用いることができる。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
細胞膜に付着、あるいは細胞内に取り込まれたIgM抗体は、補体の存在下で、またはIgM単独で細胞障害作用を有する。本発明のIgM抗体を利用した抗体医薬製剤において、抗体には各種の治療用成分を結合してその治療効果を更に高めることもできる。治療用成分としては、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、放射核種、Pseudomonas解毒素などのトキシン類を挙げることができる。治療用成分との結合体を生産する方法および治療に使用する方法については、米国特許5057313号、米国特許5156840号に記載されている。あるいは、本発明によって得られたIgM抗体を、化学療法剤あるいは同種抗原、他種抗原を認識する抗体製剤と併用することによって、治療効果を高めることもできる。
更に本発明は、次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってIgMを分離する工程を含む、IgMの多量体を分析する方法を提供する。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度の過硫酸アンモニウムを含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル。
IgMは分子量100万程度と非常に高分子量であるため、一般的な方法では多量体構造(5量体と6量体)を定量的に解析することは困難である。報告されているIgMの多量体構造の分析法においては、RI標識したIgMを用いて非還元SDS-PAGEを行なっている(文献6/J.Immunol.(1994)152;1206)。この方法には、RIが必要である。一方、IgMを医薬品として開発するためには、製造過程においてIgMの多量体構造を分析することができる技術が必要である。具体的には、製造細胞の選定、細胞培養のモニタリング、精製、原体製造、製剤製造のあらゆる工程においてIgMの多量体構造の分析が必要である。これらの工程におけるIgMの解析には、RIを必要としない解析方法が求められる。本発明者らは、上記のような条件を利用することによって、IgMの多量体構造を解析しうることを見出し、本発明を完成した。以下に各条件について具体的に述べる。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル:
通常、イムノグロブリンなどの蛋白質の電気泳動に利用されるポリアクリルアミドゲルの重合温度は、室温である。これに対して、たとえば37℃以上、好ましくは40℃〜60℃で重合させたポリアクリルアミドゲルは、本発明のIgMの解析方法に有用である。このような高温条件を与えることにより、アクリルアミドを迅速に重合させることができる。
b)高濃度の過硫酸アンモニウム(Ammonium PerSulfate;APS)を含有するポリアクリルアミドゲル:
一般にSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは、0.05%程度のAPSを含んでいる。これに対して、たとえば0.25%以上、好ましくは0.1%〜0.5%のAPSを含むポリアクリルアミドゲルは、本発明のIgMの解析方法に有用である。
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル:
電気泳動分析用のポリアクリルアミドゲルは、気泡を生じないように均一に調製することが重要である。そのため、ポリアクリルアミドゲルの重合開始剤を添加後、気泡が混入しないように注意しながら重合溶液を十分に攪拌する。これに対して本発明では、HYBRID MIXER(KEYENCE)を用いて、より完全に重合溶液を均一に攪拌し、かつ、気泡の混入を防ぐために脱泡を行い、均一なゲルを作製した。
本発明のIgM解析方法は、上記条件a)-c)のうち、少なくともいずれか一つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを用いることによって実施することができる。IgMを、その多量体構造を維持したまま高い精度で解析するためには、好ましくは上記条件a)-c)のうちの少なくとも2つ以上、より好ましくはa)-c)の全ての条件を満たすポリアクリルアミドゲルを用いることができる。
本発明によるIgMの解析において、電気泳動用の緩衝液は任意の緩衝液を利用することができる。たとえばTris-acetate SDS泳動バッファーは、本発明のIgMの解析方法において好ましい緩衝液である。Tris-acetate SDS泳動バッファーの具体的な組成は、後に述べる実施例に記載されたとおりである。
本発明のIgMの解析方法は、5量体および/または6量体のIgMを解析対象とすることができる。本発明におけるIgMの解析とは、IgM分子が5量体構造を有しているのか、あるいは6量体構造を有しているのかを明らかにすることを言う。5量体とは、2分子のH鎖と2分子のL鎖からなるIgMの構成単位を5つ有するIgMを言う。同様に6量体は、構成単位が6であるIgMを指す。
IgM分子の5量体構造、あるいは6量体構造とは、公知の方法(文献6/J.Immunol.(1994)152;1206)によって確認することができる5量体構造、あるいは6量体構造を言う。更に本発明のIgMの解析方法によれば、5量体または6量体として存在するIgMの量比を明らかにすることもできる。例えば、電気泳動後のゲル中のIgMを直接あるいは膜に転写して可視色素あるいは蛍光色素等で染色できる。更に、染色強度あるいは蛍光強度を測定して目的のIgM構造体を定量することができる。本発明に基くIgMの5量体あるいは6量体の定量方法は、具体的には実施例3および実施例4に記載したような方法に基いて実施することができる。その他、超遠心分離を利用した公知の方法によって、IgMの5量体および6量体の量比を推定することもできる。
本発明のIgMの多量体の分析方法は、IgMの会合体の分析に利用することができる。本発明において、複数のIgM分子が共有結合によって結合した分子を会合体と言う。会合体の形成によってIgMの抗体としての活性は変化する。たとえば、分子が巨大化しているため、IgMの会合体は沈殿を生じやすい。したがって医薬品としてIgMを開発するためには、IgMの会合体の定量的評価が必要である。本発明のIgMの多量体の分析方法は、IgMの5量体と6量体の量比のみならず、IgMの会合体の量比の定量的な評価も可能である。
より具体的には、上記条件でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施し、5量体(または6量体)に相当する分子量を有する位置に蛋白質が泳動され、かつ抗IgM抗体がその蛋白に結合されれば、IgMが5量体(または6量体)として存在していることを明らかにすることができる。蛋白質が精製されたIgMであれば、蛋白質染色によって泳動位置を知ることができる。あるいは未精製のIgMであっても、抗μ鎖抗体を使ったイムノブロット解析によってIgMのバンドを同定することができる。同定されたIgMのバンドの強度を定量的に、あるいは半定量的に評価すれば、IgMの量を決定することができる。電気泳動像から蛋白質の量を決定する方法は公知である。
本発明のIgMの分析方法を利用すれば、IgMの多量体構造を明瞭に識別することができる。したがって、電気泳動後のIgMは、放射性同位元素(RI)を使用しないで検出することができる。本発明において、RIを使用しない分析方法(non-isotopic analysis)とは、電気泳動後のIgMを放射性同位元素以外の手段によって検出する工程を含む分析方法を言う。放射性同位元素以外の手段としては、たとえば蛋白質の染色、あるいはIgMに結合する親和性物質による検出を示すことができる。親和性物質としては、抗IgM抗体、プロテインL、プロテインA、プロテインG、IgM Fcレセプターなどを用いることができる。本発明の分析方法において、これらの親和性物質は予め標識しておくことができる。親和性物質の標識には、酵素、あるいは色素を用いることができる。酵素としては、パーオキシダーゼ(POD)、βガラクトシダーゼ(β-GAL)、あるいはアルカリ性フォスファターゼ(ALP)などが用いられる。色素には、蛍光色素、発光色素、あるいは発色色素などが含まれる。これらの標識は、いずれも非放射性物質である。
また本発明は、次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルからなる、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルに関する。あるいは本発明は、次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルの、IgMの多量体を分析する方法における使用に関する。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度のAPS(Ammonium PerSulfate)を含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル。
これらのポリアクリルアミドゲルは、いずれも本発明のIgM解析方法に有用である。上記の条件a)-c)の少なくとも一つを満たすポリアクリルアミドゲルが、IgMの解析に有用であることは本発明によって始めて明らかにされた。本発明における好ましいポリアクリルアミドゲルは、上記条件のa)-c)の2つ以上、より好ましくはa)-c)の全ての条件を満たす。更に本発明は、次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの工程を含む、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法に関する。
a)アクリルアミドを高温で重合させる工程、
b)アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
c)重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程。
本発明における好ましいポリアクリルアミドゲルの製造方法は、上記工程のa)-c)の2つ以上、より好ましくはa)-c)の全ての工程を含む。すなわち本発明は、次の工程a)-c)を含む、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法を提供する。
1)アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、
2)重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、および
3)アクリルアミドを高温で重合させる工程。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例1〕ガングリオシドGM3に対する組換え型ヒト抗体L612の作製
1.1 抗ガングリオシドGM3ヒト抗体H鎖遺伝子の構築
ガングリオシドGM3に結合するヒト抗体(以下、L612と表記する)のH鎖をコードする遺伝子は、Epstein-Barrウイルスで形質転換されたヒトB細胞(以下、L612発現B細胞と表記する)より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L612のH鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Hoonらにより報告されている(Cancer Research 1993;53:5244-5250)。
Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社製)を用いて1×107細胞のL612発現B細胞より抽出した。IgM H鎖定常領域の塩基配列に基づいて2本のオリゴヌクレオチド(LMH-f3、LMH-r3)を設計した。LMH-f3(配列番号:7)はセンス方向で、LMH-r3(配列番号:8)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。
1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5'末端側と3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLMH-r3を用い、3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLMH-f3を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix、
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-f3またはLMH-r3
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングした。塩基配列決定の後、5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ApaI(宝酒造社製)及びSacII(宝酒造社製)で消化して得られる約1.1kbpの断片、および3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ApaI(宝酒造社製)及びNotI(宝酒造社製)で消化して得られる約1.1kbpの断片を混合し、pBluescript KS+ベクター(東洋紡社製)へクローニングし、完全長L612H鎖遺伝子を得た。
動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチドLMH-fxho、LMH-rsalを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。LMH-fxho(配列番号:11)は前方プライマーでL612H鎖遺伝子の5'末端にハイブリダイズし、かつXhoI制限酵素認識配列ならびにコザック配列(Kozak, M. J.Mol.Biol. (1987) 196, 947)を持つように、またLMH-rsal(配列番号:12)は後方プライマーでL612H鎖遺伝子の3'末端にハイブリダイズし、SalI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngの完全長L612H鎖遺伝子を含むpBluescript KS+ベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-fxho、LMH-rsal
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間、
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素XhoI(宝酒造社製)および制限酵素SalI(宝酒造社製)で消化した後に、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pUCAGの制限酵素XhoI部位に連結し、クローニングした。本ベクターpUCAGは、pCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193-200)を制限酵素BamHIで消化して得られる2.6kbpの断片をpUC19ベクター(東洋紡社製)の制限酵素BamHI部位に連結し、クローニングしたベクターである。完成したプラスミドをpUCAG/L612Hと命名した。本プラスミドに含まれるL612H鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号:1及び配列番号:2に示す。
1.2 抗ガングリオシドGM3ヒト抗体L鎖遺伝子の構築
L612のL鎖をコードする遺伝子はL612発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L612のL鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Hoonらにより報告されている(Cancer Research 1993;53:5244-5250)。
Total RNAは、実施例1.1と同様にしてL612発現B細胞より抽出した。IgM L鎖定常領域の塩基配列に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(LML-f1、LML-r1)を設計した。LML-f1(配列番号:9)はセンス方向で、LML-r1(配列番号:10)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5'末端側と3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLML-r1を用い、3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLML-f1を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-f1またはLML-r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングした。塩基配列決定の後、5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で消化して得られる約0.7kbpの断片、および3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で消化して得られる約0.9kbpの断片を混合し、合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnotを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。LML-feco(配列番号:13)は前方プライマーでL612L鎖遺伝子の5'末端にハイブリダイズし、かつEcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またLML-rnot(配列番号:14)は後方プライマーでL612L鎖遺伝子の3'末端にハイブリダイズし、NotI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)
5'末端側遺伝子断片、
3'末端側遺伝子断片、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnot
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)および制限酵素NotI(宝酒造社製)で消化した後に、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pCXND3の制限酵素EcoRIおよびNotI切断部位に連結し、クローニングした。
本ベクターpCXND3の構築の流れについて、以下に述べる。DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759参照)の抗体H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素EcoRI/SmaI部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、EcoRI-NotI-BamHI adaptor(宝酒造社製)をクローニングした。このベクターをpCHOIと命名した。
pCHOIのDHFR遺伝子発現部位をpCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193-200)の制限酵素HindIII部位にクローニングしたベクターをpCXND3と命名した。また、L鎖遺伝子断片をpCXND3にクローニングし、完成したプラスミドをpCXND3/L612Lと命名した。本プラスミドに含まれるL612L鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号:3および配列番号:4に示す。
1.3 抗ガングリオシドGM3ヒト抗体の発現ベクターの構築
L612発現ベクターを作製するために、pUCAG/L612Hを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で消化して得られる約4.0kbpの断片をpCXND3/L612Lの制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpCXND3/L612IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、およびL612遺伝子を発現する。
1.4 抗ガングリオシドGM3ヒト抗体J鎖遺伝子および発現ベクターの構築
L612のJ鎖をコードする遺伝子はL612発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。Total RNAは、上記と同様にしてL612発現B細胞より抽出した。GenBankに登録されているヒト抗体J鎖遺伝子の塩基配列(GenBank番号:M12759)に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(J-f1、J-r1)を設計し、合成した。J-f1(配列番号:15)はセンス方向でヒト抗体J鎖遺伝子Exon3にハイブリダイズし、J-r1(配列番号:16)はアンチセンス方向でヒト抗体J鎖遺伝子Exon4にハイブリダイズする。
1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5'末端側と3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドJ-r1を用い、3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドJ-f1を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドJ-f1またはJ-r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングした。
塩基配列決定の後、5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で消化して得られる約0.5kbpの断片、および3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で消化して得られる約1.0kbpの断片を混合し合成オリゴヌクレオチドJ-feco、J-rxbaを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。
J-feco(配列番号:17)は前方プライマーでL612J鎖遺伝子の5'末端にハイブリダイズし、かつEcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またJ-rxba(配列番号:18)は後方プライマーでL612J鎖遺伝子の3'末端にハイブリダイズし、XbaI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)
5'末端側遺伝子断片、
3'末端側遺伝子断片、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドJ-feco、J-rxba
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)および制限酵素XbaI(宝酒造社製)で消化した後に、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pCOSII-Zeoの制限酵素EcoRIおよびXbaI切断部位に連結し、クローニングした。
本ベクターpCOSII-Zeoは、上述のpCHOIのDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位をクローニングしたベクターである。完成したプラスミドをpCOSII-Zeo/J chainと命名した。本プラスミドに含まれるL612J鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号:5および配列番号:6に示す。
1.5 動物細胞を用いた抗ガングリオシドGM3ヒト抗体の発現
CHO細胞(DG44株)を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
J鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。L612発現ベクターpCXND3/L612IgM(25μg)とPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。
室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、HT supplement(Invitrogen社製)を1倍濃度で含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)40mLに懸濁した。同様の培地で50倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、Geneticin(Invitrogen社製)を0.5mg/mLになるように添加して2週間培養した。
Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について実施例1.6に示す濃度定量法で測定した。L612高発現細胞株を順次拡大培養し、L612安定発現細胞株CA02、CA15、CA19、CA20、およびCA24を得た。
また、J鎖を発現する細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。L612発現ベクターpCXND3/L612IgM(25μg)およびJ鎖発現ベクターpCOSII-Zeo/J chain(20μg)とPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。
室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、HT supplement(Invitrogen社製)を1倍濃度で含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)40mLに懸濁した。
同様の培地で50倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、0.5mg/mL濃度のGeneticin(Invitrogen社製)および0.6mg/mL濃度のZeocin(Invitrogen社製)を添加して2週間培養した。Geneticin、Zeocin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について実施例1.6に示す濃度定量法で測定した。L612高発現細胞株を順次拡大培養し、L612安定発現細胞株(CJ15、CJ25、CJ38、CJ45、CJ67)を得た。
1.6 培養上清中のIgM濃度の測定
培養上清中のIgM濃度の測定は以下のように行った。Anti-Human IgM(BIOSORCE社製)を1μg/mlになるようにCoating Buffer(0.1M NaHCO3、0.02%NaN3)で希釈し、96ウェルELISA用プレートに100μl/ウェルで加え、4℃で24時間以上反応させ、コーティングを行った。
さらに、Rinse Bufferで洗浄した後に、200μL/ウェルのDiluent Bufferを加え、室温で1時間以上反応させ、ブロッキングした。Rinse BufferおよびDiluent Bufferの組成はそれぞれ次のとおりである。
Rinse Buffer:
PBS(-)、
0.05% Tween20
Diluent Buffer:
50mM Tris、
1mM MgCl2
0.15M NaCl、
0.05% Tween20、
0.02% NaN3
1% BSA
その後、Diluent Bufferで適当に希釈した培養上清を100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。Rinse Bufferで洗浄した後に、Goat Anti-Human IgM、Alkaline Phosphatase conjugated(BIOSORCE社製)をDiluent Bufferで4000倍に希釈し、100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。最後にRinse Bufferで洗浄した後にアルカリフォスファターゼ基質(SIGMA社製)を加え、吸光光度計Benchmark Plus(BioRad社製)を用いて、測定波長405nm、対照波長655nmの吸光度を測定した。IgM濃度はL612精製品(Hoonら、Cancer Research 1993;53:5244-5250)との比較で算出した。
各種L612安定発現細胞株を75cm2培養フラスコ内で初発細胞密度 2x105cells/mLで培養し、培養上清中のIgM濃度を上記の方法で測定した。結果を表1に示す。IgM産生量は培養3日目で約20mg/L、培養7日目で約50mg/Lであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は5〜19pg/cell/dayであった。IgMはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために、組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難であるとされていたが、今回の結果より、CHO細胞において高い産生量の組換え型IgM発現細胞が作製できることが明らかになった。
Figure 0005452835
〔実施例2〕ガングリオシドGM2に対する組換え型ヒト抗体L55の作製
2.1 抗ガングリオシドGM2ヒト抗体H鎖遺伝子の構築
ガングリオシドGM2に結合するヒト抗体(以下、L55と表記する)のH鎖をコードする遺伝子は、Epstein-Barrウイルスで形質転換されたヒトB細胞(以下、L55発現B細胞と表記する)より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L55のH鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Nishinakaらにより報告されている(Immunogenetics 1998;48:73-75)。
Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社製)を用いて1×107細胞のL55発現B細胞より抽出したIgM H鎖定常領域の塩基配列に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(LMH-f3、LMH-r3)を設計した。LMH-f3(配列番号:7)はセンス方向で、LMH-r3(配列番号:8)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。
1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5'末端側と3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLMH-r3を用い、3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLMH-f3を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-f3またはLMH-r3
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングした。塩基配列決定の後、5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ApaI(宝酒造社製)及びSacII(宝酒造社製)で消化して得られる約1.1kbpの断片、3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ApaI(宝酒造社製)及びNotI(宝酒造社製)で消化して得られる約1.1kbpの断片を混合し、pBluescript KS+ベクター(東洋紡社製)へクローニングし、完全長L55H鎖遺伝子を得た。
動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチドLMH-fxho、LMH-rsalを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。LMH-fxho(配列番号:11)は前方プライマーでL55H鎖遺伝子の5'末端にハイブリダイズし、かつXhoI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またLMH-rsal(配列番号:12)は後方プライマーでL55H鎖遺伝子の3'末端にハイブリダイズし、SalI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngの完全長L55H鎖遺伝子を含むpBluescript KS+ベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-fxho、LMH-rsal
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、55℃/30秒間、68℃/3分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素XhoI(宝酒造社製)および制限酵素SalI(宝酒造社製)で消化した後に、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pUCAGの制限酵素XhoI部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpUCAG/L55Hと命名した。本プラスミドに含まれるL55H鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号:19および配列番号:20に示す。
2.2 抗ガングリオシドGM2ヒト抗体L鎖遺伝子の構築
L55のL鎖をコードする遺伝子はL55発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L55のL鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Nishinakaらにより報告されている(Immunogenetics 1998;48:73-75)。
Total RNAは、実施例2.1と同様にしてL55発現B細胞より抽出した。IgM L鎖定常領域の塩基配列に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(LML-f1、LML-r1)を設計した。LML-f1(配列番号:9)はセンス方向で、LML-r1(配列番号:10)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5'末端側と3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLML-r1を用い、3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLML-f1を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-f1またはLML-r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングした。
塩基配列決定の後、5'末端側非翻訳領域配列にハイブリダイズする前方プライマーL55-f(配列番号:23)、3'末端側非翻訳領域配列にハイブリダイズする後方プライマーL55-r(配列番号:24)を設計し、PCRを行った。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドL55-fおよびL55-r
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングした。
塩基配列の決定後、合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnotを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。LML-feco(配列番号:13)は前方プライマーでL55L鎖遺伝子の5'末端にハイブリダイズし、かつEcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またLML-rnot(配列番号:14)は後方プライマーでL55L鎖遺伝子の3'末端にハイブリダイズし、NotI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngのL55L鎖遺伝子を含むpGEM-T Easyベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnot
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、55℃/30秒間、68℃/3分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)および制限酵素NotI(宝酒造社製)で消化した後に、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pCXND3の制限酵素EcoRIおよびNotI切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpCXND3/L55Lと命名した。本プラスミドに含まれるL55L鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号:21および配列番号:22に示す。
2.3 抗ガングリオシドGM2ヒト抗体の発現ベクターの構築
L55発現ベクターを作製するために、pUCAG/L55Hを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で消化して得られる約4.0kbpの断片をpCXND3/L55Lの制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpCXND3/L55IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、L55遺伝子を発現する。
2.4 動物細胞を用いた抗ガングリオシドGM2ヒト抗体の発現
CHO細胞(DG44株)を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
J鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。L55発現ベクターpCXND3/L55IgM(25μg)とPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。
室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、HT supplement(Invitrogen社製)を1倍濃度で含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)40mLに懸濁した。同様の培地で50倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、Geneticin(Invitrogen社製)を0.5mg/mLになるように添加して2週間培養した。
Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について実施例1.6に示す濃度定量法で測定した。L55高発現細胞株を順次拡大培養し、L55安定発現細胞株LA24、LA26、LA39、LA66、およびLA74を得た。
また、J鎖を発現する細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。L55発現ベクターpCXND3/L55IgM(25μg)および実施例1.4で作製したJ鎖発現ベクターpCOSII-Zeo/J chain(20μg)とPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。
室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、HT supplement(Invitrogen社製)を1倍濃度で含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)40mLに懸濁した。
同様の培地で50倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、0.5mg/mL濃度のGeneticin(Invitrogen社製)および0.6mg/mL濃度のZeocin(Invitrogen社製)を添加して2週間培養した。Geneticin、Zeocin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について実施例1.6に示す濃度定量法で測定した。L55高発現細胞株を順次拡大培養し、L55安定発現細胞株LJ05、LJ23、LJ32、LJ49、およびLJ61を得た。
各種L55安定発現細胞株を75cm2培養フラスコ内で初発細胞密度 2x105cells/mLで培養し、培養上清中のIgM濃度を実施例1.6で示した方法で測定した。結果を表2に示す。IgM産生量は培養3日目で7〜70mg/L、培養7日目で50〜150mg/Lであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は5〜40pg/cell/dayであった。
実施例1.6で示した組換え型L612産生細胞株と同等またはそれ以上の産生量が得られた。この結果より、CHO細胞において高い産生量の組換え型IgM発現細胞株が安定的に作製できることが明らかになった。
Figure 0005452835
〔実施例3〕
3.1 組換え型L612(実施例1)および組換え型L55(実施例2)の多量体形成の解析
組換え型L612(実施例1)および組換え型L55の多量体の解析は、非還元SDS-PAGEを用いて行なった。非還元SDS-PAGE用の電気泳動ゲルは、以下のとおり作成した。HYBRID MIXER(TOMY)専用の容器に30% アクリルアミド(C%=3.33%)を1.80mL、1.50M Tris-HCl pH8.8を3.75mL、ミリQ水を3.39mL、glycerolを2.25mL加え混合し、溶液を50℃に保温した。さらに2.0% agaroseを3.75mL加え、再び50℃に保温した。
その後室温に1分静置し、TEMEDを12μL、25% ammonium persulfate(APS)50μLを加え、HYBRID MIXER(TOMY)で15秒攪拌、15秒脱泡した。ディスポシリンジで溶液を回収し、溶液をゲルプレートに流し込み、37℃で1時間アクリルアミドの重合反応を行なった。その後室温でagaroseを固め、完成した電気泳動ゲルは4℃で保存した。
電気泳動バッファーは、NuPAGE Tris-Acetate 20×running buffer(Invitrogen)をミリQ水で20倍に希釈して作製した。2×サンプルバッファーは、125mM Tris-HCl pH6.8、4.0% SDS、30% glycerol、0.004% Bromophenol blueを用いた。
実施例1および実施例2で得られた組換え型L612(実施例1、J鎖+、およびJ鎖−)および組換え型L55(実施例2、J鎖+、およびJ鎖−)の培養上清を上記の電気泳動ゲル、電気泳動バッファー、2×サンプルバッファーを用いて定電圧60Vで13時間、電気泳動を行なった。その後、抗μ鎖抗体を一次抗体に用いたWestern-blottingにより検出した。Western-blottingは以下のとおりに行なった。
電気泳動後のゲルをセミドライ方式のブロッティング装置を用いて、PVDF膜に転写した。転写後、Tween80を0.05%含む5%スキムミルクを用いて2時間、ブロッキングを行なった。Tween80を0.05%含むTris-buffered-saline溶液で洗浄後、一次抗体として3000倍希釈したRabbit anti-Human IgM(DAKO)を用いて1時間反応させた。再び洗浄後、二次抗体として1000倍希釈したAP-Goat Rabbit anti-IgG(H+L) Double staining grade(ZYMED)を用いて1時間反応させた。再び洗浄後、Amplified Alkaline Phosphatase Immuno-Blot Assist Kit(Bio-Rad)を用いて発色させた。
その結果、組換え型L612(J鎖+)は、主にL612発現B細胞から得られたL612の5量体に相当するバンドが得られた(図1)。組換え型L612(J鎖−)は、主にL612発現B細胞から得られたL612の6量体に相当するバンドが得られた。電気泳動の各バンドについては5量体、あるいは6量体であることを電子顕微鏡で確認済みである。組換え型L55においても同様の結果が得られた。(図2)
この結果より、IgM産生細胞の培養上清中の、5量体、あるいは6量体の確認ができることが明らかになった。また、J鎖+で発現させた組換え型IgMは主に5量体を形成しており、J鎖−で発現させた組換え型IgMは主に6量体を形成していることが明らかになった。J鎖の有無をコントロールすることで、組換え型IgMの5量体、および6量体を作り分けできることが明らかになった。
〔実施例4〕
4.1 L612発現細胞株における多量体形成比率の分析
実施例3と同様に非還元SDS-PAGEによる電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを回収し、10% methanol, 7% acetic acidでゲルを30分以上洗浄した後、Ruby gel stain溶液(Bio-Rad)を用いて3時間以上染色した。染色後、10% methanol, 7% acetic acidでゲルを60分以上脱色した。脱色後、FluorImager 595 (Molecular Dynamics)を用いて480 nmで励起し、618 nmで各多量体のバンドを検出した(図3)。これより、各レーンのdensitogramを作製し、ピーク面積を求めることで各バンド強度を定量した。得られた会合体(aggregate)、6量体(hexamer)、5量体(pentamer)、および4量体(tetramer)の比率を表3に示した。本発明の方法により、IgMの多量体構造、あるいは会合体を定量的に評価できることが確認された。
Figure 0005452835
〔実施例5〕組換え型ヒト抗体L612高産生株の作製
5.1 発現プラスミドpL612CA4の構築
ベクターINPEP4 (Patent No. US20010019715)のCMVプロモーターおよびポリAシグナルを除くために制限酵素PvuII部分消化を行い、約5.5 kbの断片を回収し環状化した。このベクターをINPEP4-dCMVと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子を発現する。
INPEP4-dCMVにマルチクローニングサイトを導入するために、制限酵素BglII, XhoI, BamHI, SalIなどのサイトを含むアダプター配列(配列番号:25および26をアニーリングして調製した)をINPEP4-dCMVのAscI, FseIサイトにクローニングした。このベクターをINPEP4-dCMV(MCS)と命名した。配列番号:25および26の配列を以下に示す。
CCTGATCATGAAGACGTCGACTAGTCCGGATCCCCGGGAGCTCGAGCGCTCTAGATCTTTAATTAAGG(配列番号:25)
CGCGCCTTAATTAAAGATCTAGAGCGCTCGAGCTCCCGGGGATCCGGACTAGTCGACGTCTTCATGATCAGGCCGG(配列番号:26)
抗体L鎖発現ユニットをサブクローニングするために、pCXND3/L612IgMの約3.0 kbのSalI, PstI部分消化断片をpBluescrip II SK+のSalI, PstIサイトにクローニングした。このベクターをL612CA-L/pBlueと命名した。
抗体L鎖発現ユニットを発現ベクターに導入するために、INPEP4-dCMV(MCS)のXhoI, BglIIサイトにL612CA-L/pBlueの約3.0 kbのSalI, BamHI断片をクローニングした。このベクターをL612CA-L4/dCMVと命名した。
抗体H鎖発現ユニットをサブクローニングするために、pCXND3/L612IgMの約4.1 kbのSalI, PstI断片をpBluescrip II SK+のSalI, PstIサイトにクローニングした。このベクターをL612CA-H/pBlueと命名した。
抗体H鎖発現ユニットを発現ベクターに導入するために、L612CA-L4/dCMVのSalI, BamHIサイトにL612CA-H/pBlueの約4.1 kbのSalI, BamHI断片をクローニングした。このベクターをpL612CA4と命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、L612遺伝子(H鎖、L鎖)を発現する。
5.2 エレクトロポレーション、Geneticin選抜
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpL612CA4を制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pL612CA4を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)10 mLに加え、同培地で適度に希釈した後96 ウェル培養用プレートに100 μL/well播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内で培養を行った。CO2インキュベーター内で1日間培養後、適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)を100 μL/wellずつ加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定後、適当量 Geneticin(Invitrogen社製) 、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen製)を用いて24 ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、3〜7日おきに拡大培養を行い、L612高産生株を選抜した。
5.3 MTX選抜
Geneticin選抜で取得したL612高産生株を適当量のMTX (Methotrexate)を含有するCHO-S-SFMII培地 (Invitrogen社製)に懸濁し、96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内でコロニーが形成されるまで培養を行った。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定後、24 ウェル培養用プレートまたは48 ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、3〜7日おきに拡大培養を行い、L612高産生株を選抜した。MTX濃度を段階的に上げながらこの操作を繰り返すことで、遺伝子増幅を誘引させて表4に示すL612高産生株を選抜した。
Figure 0005452835
5.4 培養上清中のIgM濃度の測定法(1)
HPLCシステム:Water社製HPLC system Alliance
2487 Dual Absorbance Detector、2690 Separations Module
Millennium 32 ver. 3.21
使用カラム:GPCカラムSuperose 6 HR 10/30 (Amersham Biosciences製)
標準品:凍結されたL612 IgM精製品を融解後いったん遠心し、その上清を小分注して凍結保存したものをGPC用標準品として使用した。
移動相:D-PBSに、Polyoxyethylene(20)Sorbitan Monolaurateを0.02%、アジ化ナトリウムを0.05%となるように添加して調製した。
HPLC条件:移動相流量0.5 mL/min、測定波長280 nm、試料注入量100 μL
操作は以下のようにして行った。37℃で数分保温して融解したGPC用標準品の波長280 nmにおける吸光度を分光光度計により測定し、その値から波長280 nmにおける吸光度が0.12となるような希釈率を算出した。
求めた希釈率にてGPC標準品を希釈したものを分析して得られたピーク面積と適度に希釈して標準品と同容量注入した未知試料のピーク面積と希釈倍率から未知試料の280 nmにおける吸光度を算出した。得られた吸光度の値とL612の吸光数
Figure 0005452835
L612濃度 (μg/mL) =吸光度 (Abs280) ÷1.4×1000
5.5 哺乳動物由来成分不含培地でのクローニング
MTX選抜で得られたL612高産生株を適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地 (Invitrogen社製)に懸濁し、限界希釈法によって1 cell/200 μLになるよう希釈を行った。これを96 ウェル培養用プレートに100 μL/wellずつ播種した。これにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有する哺乳動物由来成分不含培地で培養したDG44株を適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地に1× 105 cells/mLになるように懸濁後、100 μL/wellずつ播種した。CO2インキュベーター(37℃、8% CO2濃度)内に静置し、7日後に適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地を100 μL添加後、CO2インキュベーター(37℃、8% CO2濃度)内に静置した。約2週間後、得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定後、適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地を用いて24 ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、3〜7日おきに拡大培養を行い、最終的に5.4のゲルろ過クロマトグラフィ法に従って培養上清中のIgM濃度を測定し、表5に示すL612高産生クローンを樹立した。
Figure 0005452835
5.6 培養上清中のIgM濃度の測定法(2)
HPLCシステム:HITACHI LaChrom HPLC装置 (HITACHI L-7120 pump(A, B)、L-7200 autosampler、L-7420 UV-VIS detector、L-7610 degasser)
データ解析ソフトウェア:D-7000型 Advanced HPLC System Manager (HITACHI)
分析用カラム:TOSHO TSKgel G4000SWXL 7.8mmIDx300 mm (Cat No.08542、Column No. G0151)
標準品:MABON01R306(5.4の標準品と同等の品質を有するもの)を使用した。
移動相:50 mM Phosphate-Buffer, 500 mM KCl, pH 7.4, 0.05% NaN3 (pH7.4)
HPLC条件:0.5 mL/min (20min)→1.0 mL/min、測定波長280 nm、試料注入量100 μL
検量線: 1600、800、100μg /mLの3点で作成した。
5.7 哺乳動物由来成分不含培地でのL612高産生株の回分培養と流加培養
作製したL612高産生株を、初発細胞密度2x105 cells/mLにて回分培養法もしくは流加培養法で培養を行い、培養上清中のIgM濃度をゲルろ過クロマトグラフィ法(5.4, 5.6の方法参照)にて測定した。哺乳動物由来成分不含培地を用い、加水分解物として回分培養法では酵母抽出物を、流加培養法では魚肉抽出物を使用した。増殖因子としては、回分培養法でインスリンを、流加培養法ではインスリンとインスリン様増殖因子-Iを用いた。回分培養法においてのL612産生量は、培養6日目で269.9 mg/Lであった(5.4の方法による)。一方流加培養法においてのL612産生量は、培養6日目で347.4 mg/L、培養14日目で1669.1 mg/Lであった(5.6の方法による)。IgMはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難とされていたが、加水分解物の使用と流加培養法を組み合わせて用いることにより、CHO細胞において高い産生量の組換え型IgMの調製が可能であることが明らかとなった。
〔実施例6〕単一の発現ベクターによる5量体L612産生株の作製
6.1 発現プラスミドpL612pentaCA4の構築
INPEP4-dCMV(MCS)のXhoI, BglIIサイトに、L612CA-H/pBlueから約4.1 kbのSalI-BamHIの抗体H鎖発現ユニットをクローニングしてL612CA-H3/dCMVを作製した。L612CA-H3/dCMVのBamHI, SalIサイトに、L612CA-L/pBlueから約3.0 kbのBamHI-SalIの抗体L鎖発現ユニットをクローニングしてpL612CA3を作製した。
抗体J鎖発現ユニットを構築するため、pCOSII-Zeo/J chainを鋳型とする配列番号27:GAGGAATTCCACCATGAAGAACCおよび配列番号28:GAGGCGGCCGCTTAGTCAGGATAGCAGをプライマーとしたPCR反応により抗体J鎖遺伝子を増幅し、pCR-Blunt II-TOPO (インビトロジェン社製)にクローニングした。SV40のポリAシグナルはpSV2-dhfr (Subramaniら、Mol. Cell. Biol. 1981; 1: 854-864) を鋳型とする配列番号29:AAAAGCGGCCGCGATCATAATCAGCCATACCAおよび配列番号30:AAAACTCGAGAAGCTTAGACATGATAAGATACATTGをプライマーとしたPCR反応により増幅し、pT7-Blue (Novagen社製) にクローニングした。
pCXND3のCAGプロモーターとして約1.7 kbのSpeI-EcoRI断片、クローニングしたJ鎖遺伝子の約0.5 kbのEcoRI-NotI断片、クローニングしたSV40 ポリAシグナルの約0.3 kbのNotI-XhoI断片をpCR-Blunt II-TOPOのSpeI-XhoI サイトの間で組み合わせた。このベクターをpCRCAGproJpAと命名した。
pCRCAGproJpAのXhoI サイトを、平滑化してBamHI linker (pCCCGGATCCGGG(配列番号:31)、タカラバイオ社製)を付加することによってBamHIサイトに変換し、約2.5 kbのBamHI断片として抗体J鎖発現ユニットをpL612CA3のBamHIサイトにクローニングした。得られたプラスミドをpL612pentaCA4と命名した。
本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、L612遺伝子 (H鎖、L鎖、J鎖) を発現する。
6.2 エレクトロポレーション、Geneticin選抜
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpL612pentaCA4を制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pL612pentaCA4を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)10 mLに加え、同培地で適度に希釈した後96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内で1日間培養し、適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)を等量加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定することにより高産生株を選抜し、3〜7日おきに順次拡大培養を行うことによりL612産生株CA4-119ならびにCA4-139を得た。
6.3 多量体形成の解析
Geneticin選抜で得られた細胞株をS100 spinner flaskにて初発細胞密度2x105 cells/mLで3日間培養した培養上清を用い、実施例3に示す方法に従い非還元SDS-PAGEを行い、抗ヒトμ鎖抗体を一次抗体に用いたWestern-blottingを行った。その結果pL612pentaCA4導入株では、主としてL612発現B細胞から得られたL612の5量体に相当するバンドが得られ、6量体に相当するバンドは検出されなかった(図4)。J鎖発現単位をH鎖ならびにL鎖発現単位とともに単一の発現ベクター上に載せ、H鎖ならびにL鎖発現に対するJ鎖の発現レベルを適切に制御することによって、5量体L612を主として生成させることが可能であることが明らかとなった。
〔実施例7〕組換え型L612のCDC活性
51Cr-クロム酸ナトリウムにて放射性標識した標的細胞であるM1メラノーマ細胞1×104個/50μL/wellにHAVBにて適宜希釈した抗体溶液を50μL/well添加し、組換え型L612(J鎖−;CA19)あるいは組換え型L612(J鎖+;CJ45)がそれぞれ抗体の最終濃度0.16, 0.8, 4, 20, 100 μg/mLとなるようにして氷上にて60分間静置した。続いて、各ウェルに補体源としてヒト由来血漿100% ないし全血を100μLずつ添加し、5%炭酸ガスインキュベーター中に37℃で90分間静置した。遠心(1000 rpm, 5分間, 4℃)後、各ウェルより上清を100μLずつ回収し、γカウンター(COBRA II AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)にて遊離された放射活性を測定した(図5)。CDC活性即ち細胞傷害活性(%)は(A-C)/(B-C)×100により計算した。Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)、Bは標的細胞浮遊液を50μL、10% NP-40水溶液(Nonidet登録商標 P-40, Code No.252-23, ナカライテスク株式会社)を20μL、HAVBを130μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞浮遊液を50μL、HAVBを150μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。試験はtriplicateにて行い、特異的クロム遊離率について平均値及び標準誤差を算出した。いずれの条件でも、組換え型L612(CA19)は、L612よりも強いCDC活性を誘導し、50% Lysisを誘導する濃度の比は、5.8ないし5.9倍であった。また、血球の共存によって、CDC活性の顕著な減弱は見られなかった。
〔実施例8〕 6量体IgMを優先的に産生する細胞株の作製(1)
8.1 発現プラスミドp L612CA3の構築
INPEP4-dCMV(MCS)のXhoI, BglIIサイトに、L612CA-H/pBlueから約4.1 kbのSalI-BamHIの抗体H鎖発現ユニットをクローニングしてL612CA-H3/dCMVを作製した。L612CA-H3/dCMVのBamHI, SalIサイトに、L612CA-L/pBlueから約3.0 kbのBamHI-SalIの抗体L鎖発現ユニットをクローニングしてpL612CA3を作製した。
8.2 エレクトロポレーション、Geneticin選抜
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpL612CA3を制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pL612CA3を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)10 mLに加え、同培地で適度に希釈した後96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内で1日間培養し、適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)を等量加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定することにより高産生株を選抜し、3〜7日おきに順次拡大培養を行うことによりL612産生株CA3-1016を得た。
8.3 MTX選抜
Geneticin選抜で取得したL612産生株CA3-1016を適当量のMTX (Methotrexate)を含有するCHO-S-SFMII培地 (Invitrogen社製)に懸濁し、96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内でコロニーが形成されるまで培養を行った。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定することにより高産生株を選抜し、3〜7日おきに順次拡大培養を行うことによりL612産生株CA3-1016-50-11を得た。
8.4 哺乳動物由来成分不含培地でのL612高産生株の回分培養
作製したL612産生株CA3-1016-50-11を、初発細胞密度2〜3x105 cells/mLにて回分培養法で培養を行い、培養上清中のIgM濃度を実施例5の5.4に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定した。哺乳動物由来成分不含培地を用い、加水分解物として酵母抽出物を使用した。増殖因子としてはインスリンを用いた。回分培養法でのL612産生量は、培養3日目で56.0 mg/Lであった。
8.5 精製方法
回分培養から得られた培養上清を、150 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で平衡化した陰イオン交換樹脂充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)でL612を溶出した。この溶出画分を10 mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)で平衡化したハイドロキシアパタイト充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)でL612を溶出した。これら2種のカラムクロマトグラフィーでの不純物分離精製を行った後、得られたL612画分を、移動相として300 mM NaCl含有20 mM 酢酸(pH6.0)を使用したゲルろ過にて会合体の分離除去を行った。ゲルろ過で得られた目的画分を0.2μmのメンブレンフィルターでろ過を行い精製L612画分とした。
〔実施例9〕 6量体IgMを優先的に産生する細胞株の作製(2)
9.1 エレクトロポレーション、Geneticin選抜
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpCXND3/L612IgMを制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pCXND3/L612IgMを混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製、HT不含)80 mLに加え、同培地で適度に希釈した後96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) にプレートを入れコロニーが形成されるまで培養した。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定することにより高産生株を選抜し、3〜7日おきに順次拡大培養を行うことによりL612産生株 DG44(HT-)-30を得た。
9.2 哺乳動物由来成分不含培地でのL612高産生株の連続回分培養
作製したL612産生株DG44(HT-)-30を、初発細胞密度2〜3x105 cells/mLにて連続回分培養法で培養を行い、培養上清中のIgM濃度を実施例5の5.4に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定した。CHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製、HT不含)を用い、加水分解物として酵母抽出物を使用した。増殖因子としてはインスリンを用いた。3日毎の4回の連続した回分培養においてのL612産生量は、各々28.7 mg/L, 32.0 mg/L, 25.7 mg/L, 22.2 mg/Lであった。
9.3 精製方法
4回の回分培養から得られた培養上清を、それぞれ150 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で平衡化した陰イオン交換樹脂充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)でL612を溶出した。この溶出画分を10 mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)で平衡化したハイドロキシアパタイト充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)でL612を溶出した。これら2種のカラムクロマトグラフィーでの不純物分離精製を行った後、得られたL612画分を、移動相として300 mM NaCl含有20 mM 酢酸(pH6.0)を使用したゲルろ過にて会合体の分離除去を行った。4回の各精製でのL612回収率はそれぞれ実施例5の5.4に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定し、83.7%、45.6%、63.6%、75.6%であった。4回分のゲルろ過での目的画分を混合し、0.2μmのメンブレンフィルターでろ過を行い精製L612画分とした。
実施例10 6量体IgMを優先的に産生する細胞株における多量体形成比率の分析
実施例8および実施例9で得られたそれぞれの精製L612画分について、実施例4に記載の方法と同様の方法でIgMの多量体形成比率を分析した。但し、電気泳動時のゲルの組成、および電気泳動バッファーを以下のとおり変更して実施した。
SDS-PAGE用の電気泳動ゲルは、HYBRID MIXER(TOMY)専用の容器に30% acrylamide (acrylamide:N,N’-methylenebisacrylamide = 29:1)を1.85 mL、1.50M Tris-Acetate pH 7.0を3.75 mL、ミリQ水を3.34 mL、glycerolを2.25 mL混合し、溶液を50℃で保温した。さらに2.0% agaroseを3.75 mL加え、再び50℃で保温した。
その後室温に1分放置し、TEMEDを12μL、25% ammonium persulfate(APS) 50μLを加え、HYBRID MIXER(TOMY)で15秒攪拌、15秒脱泡した。ディスポシリンジで溶液を回収し、溶液をゲルプレートに流し込み、37℃で1時間アクリルアミドの重合反応を行った。その後室温でagaroseを固め、完成した電気泳動ゲルは4℃で保存した。
電気泳動バッファーは、Tris(hydroxymethyl)aminomethaneを6.06g、Tricineを8.96g、およびSDSを1gをミリQ水で1000 mLにメスアップすることにより調製した。
会合体(aggregate)、6量体(hexamer)、5量体(pentamer)、および4量体(tetramer)の比率を表6に示した。
Figure 0005452835
本発明は、IgMの生産能力の高い細胞を提供する。本発明に基づいて構築された、IgM産生細胞は、たとえば細胞融合法によって樹立されたIgM産生細胞と比較して、高いIgM産生能力を有する。IgMはIgGと異なり、5量体あるいは6量体といった多量体構造を有する。そのため、細胞あたりの産生量を高めることは、一般にIgGよりも難しい。つまり、IgMの産生能力を高められた本発明によるIgM産生細胞、あるいはこの細胞を利用したIgMの産生方法は、きわめて困難な課題を解決した成果であると言うことができる。
また本発明は、5量体のIgM、および6量体のIgMの産生方法を提供する。IgM分子には、5量体および6量体の構造が存在することはすでに知られていた。しかし、いずれかの構造を有するIgMを優先的に製造するための方法は知られていなかった。本発明は、形質転換に利用するIgM遺伝子におけるJ鎖の有無によって、5量体あるいは6量体のいずれかの構造を有するIgMを優先的に産生させることに成功した。
このようにして産生した6量体のIgMは、産生した5量体のIgMと比較して細胞障害作用が強いことが確認された。本発明は、6量体構造の組換えヒトIgMを産生し、ヒト補体を用いて組換えヒトIgMの強い細胞障害作用を示した初めての知見である。このようなことから、本発明の方法は6量体構造のIgMを優先的に製造し、IgMの細胞障害作用を利用した抗体医薬を得る方法として理想的である。
更に本発明は、5量体および6量体のIgMを解析することができる方法を提供した。公知の方法では、IgMの多量体構造を識別することが難しかった。本発明の解析方法によれば、IgMの多量体構造を正しく識別することができる。本発明のIgMの解析方法の利用によって、ある製造方法によって得られたIgMに占める5量体あるいは6量体の割合を正しく知ることができる。いずれの構造を有するIgMがどの程度含まれているのかを明らかにすることは、IgMの製造技術の評価において重要である。しかも本発明の解析方法は、RIを必要としない。RIが不要な解析方法は、医薬品のあらゆる製造工程の評価に有用である。
図1は、組換え型L612の培養上清のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。左(J鎖+)はJ鎖発現形質転換細胞の、右(J鎖−)はJ鎖遺伝子を導入していない形質転換細胞の培養上清の解析結果を示す。各レーンはそれぞれ次の試料の結果に対応している。marker:分子量マーカー bulk: L612精製品 左の写真(J鎖+)のCJ15、CJ25、CJ38、CJ45、およびCJ67は、それぞれ実施例1.5で得たL612安定発現細胞株の培養上清の結果を示す。 右の写真(J鎖−)のCA02、CA15、CA19、CA20、およびCA24は、それぞれ実施例1.5で得たL612安定発現細胞株の培養上清の結果を示す。 図2は、組換え型L55の培養上清のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。左(J鎖+)はJ鎖遺伝子を導入していない形質転換細胞の、右(J鎖−)はJ鎖発現形質転換細胞の培養上清の解析結果を示す。各レーンはそれぞれ次の試料の結果に対応している。St: L55精製品 左の写真(J鎖+)の05、23、32、49、および61は、それぞれ実施例2.3で得たL55安定発現細胞株LJ05、LJ23、LJ32、LJ49、およびLJ61の培養上清の結果を示す。 右の写真(J鎖−)の24、26、39、66、および74は、それぞれ実施例2.4で得たL55安定発現細胞株LA24、LA26、LA39、LA66、およびLA74の培養上清の結果を示す。 図3は、組換え型L612の培養上清中の各多量体を検出した結果を示す写真である。各レーンはそれぞれ次の試料の結果に対応している。L612: L612精製品の結果を示す。CA19: 実施例1.5で得たL612安定発現細胞株CA19の培養上清の結果を示す。CJ45: 実施例1.5で得たL612安定発現細胞株CJ45の培養上清の結果を示す。 図4は、pL612pentaCA4導入株における多量体形成を解析した結果を示す写真である。 図5は、組換え型L612の細胞障害活性を測定した結果を示す図である。上図は、補体原として全血を加えた場合を示し、下図はヒト由来血漿100%を加えた場合を示す。縦軸は標的細胞から特異的に放出された51Crの割合(%)を示す。横軸は抗体の濃度(μg/mL)を示す。

Claims (2)

  1. (a)IgM H鎖およびIgM L鎖をCAGプロモーターの制御下にコードする遺伝子を含む発 現ベクターが、発現可能に導入されており、IgMを産生できるCHO細胞株由来の形質転換細 胞であって、前記ベクターがIgM J鎖をコードする塩基配列をさらに有し、かつ60%以上 の含量を持つ5量体IgMを産生する形質転換細胞であって、産生する5量体と6量体の比 (5量体/6量体比)が1.5以上であるIgMを産生する形質転換細胞、または
    (b)IgM H鎖およびIgM L鎖をCAGプロモーターの制御下にコードする遺伝子を含む発 現ベクターが、発現可能に導入されており、IgMを産生できるCHO細胞株由来の形質転換細 胞であって、前記ベクターがIgM J鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ50%以上の含 量を持つ6量体IgMを産生する形質転換細胞であって、産生する6量体と5量体の比(6 量体/5量体比)が1.5以上であるIgMを産生する形質転換細胞
    を培養し、IgMを採取する工程を含む、それぞれ、
    (A)5量体と6量体の比(5量体/6量体比)を1.5以上で、60%以上の含量を持 つ5量体IgMを、または
    (B)6量体と5量体の比(6量体/5量体比)を1.5以上で、50%以上の含量を持 つ6量体IgMを製造する方法。
  2. 請求項1の(a)または(b)の細胞培養物の培養上清からIgMを精製する工程を含む、実質的に純粋なそれぞれ、(A)5量体と6量体の比(5量体/6量体比)を1.5 以上で、60%以上の含量を持つ5量体IgMを、または(B)6量体と5量体の比(6量体 /5量体比)を1.5以上で、50%以上の含量を持つ6量体IgMを製造する方法。
JP2005511621A 2003-07-15 2004-07-15 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法 Expired - Lifetime JP5452835B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48733303P 2003-07-15 2003-07-15
US60/487,333 2003-07-15
PCT/JP2004/010444 WO2005005636A1 (ja) 2003-07-15 2004-07-15 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2005005636A1 JPWO2005005636A1 (ja) 2006-08-24
JP5452835B2 true JP5452835B2 (ja) 2014-03-26

Family

ID=34062150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005511621A Expired - Lifetime JP5452835B2 (ja) 2003-07-15 2004-07-15 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7709615B2 (ja)
EP (2) EP1652925B1 (ja)
JP (1) JP5452835B2 (ja)
AT (1) ATE490787T1 (ja)
AU (1) AU2004256354B2 (ja)
CA (1) CA2532966C (ja)
DE (1) DE602004030451D1 (ja)
TW (1) TW200510532A (ja)
WO (1) WO2005005636A1 (ja)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200510532A (en) * 2003-07-15 2005-03-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd IgM production by transformed cell and method of quantifying the same
EP1688432B1 (en) * 2003-10-09 2011-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Igm high concentration stabilized solution
WO2005035573A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha タンパク質溶液の安定化方法
EP1835022B1 (en) * 2005-01-05 2015-02-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell culture method and utilization of the same
JP2008547035A (ja) * 2005-06-27 2008-12-25 インヴィトロジェン コーポレーション ネイティブゲル電気泳動用の液体状タンパク質マーカー
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP1977763A4 (en) 2005-12-28 2010-06-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd STABILIZER PREPARATION CONTAINING ANTIBODIES
PT1981540E (pt) * 2006-01-30 2013-05-07 Grifols Therapeutics Inc Método de tratamento e profilaxia de doenças relacionadas com a deposição de amilóides utilizando igm
AU2007255753B2 (en) 2006-06-08 2013-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive or remedy for inflammatory disease
HU0700534D0 (en) 2006-11-24 2007-10-29 Mezoegazdasagi Biotechnologiai Transgenic animal with enhanced immune response and method for the preparation thereof
BRPI0818674B1 (pt) 2007-10-15 2023-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos para produção de um anticorpo inteiro ou de um fragmento do mesmo e para preparação de fármacos, bem como vetor recombinante
BRPI0821145B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um anticorpo anti-nr10 como agente preventivo ou terapêutico para prurido
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
KR20110025859A (ko) 2008-06-30 2011-03-11 모르포테크, 인크. 항-gd2 항체 및 이와 관련된 방법 및 용도
CA2741664C (en) * 2008-10-31 2014-12-23 Japan Science And Technology Agency Method for selective control of helper t cell function
TWI609698B (zh) 2010-01-20 2018-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 穩定化的含抗體溶液製劑
US9574005B2 (en) 2011-07-19 2017-02-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stable Protein-containing preparation containing argininamide or analogous compound thereof
CN103889555B (zh) 2011-09-01 2018-10-26 中外制药株式会社 通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法
ES2870717T3 (es) * 2012-04-17 2021-10-27 Mayo Found Medical Education & Res Anticuerpos humanos y secuencias de unión específicas del mismo para su uso en accidente cerebrovascular e isquemia y condiciones isquémicas
CA2888652C (en) * 2012-11-30 2020-09-22 Katinger Gmbh Recombinant human igm-antibody effective against cancer cells
WO2014093786A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 Abbvie, Inc. Methods for increasing the efficiency of hybridoma generation
CA3233584A1 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for purifying antibody having low isoelectric point
KR20230155600A (ko) 2014-04-03 2023-11-10 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 변형된 j-사슬
US20170362304A1 (en) 2014-08-20 2017-12-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring viscosity of protein solution
KR102435324B1 (ko) 2015-01-20 2022-08-23 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 종양 괴사 인자(tnf) 수퍼패밀리 수용체 결합 분자 및 그의 용도
ES2874558T3 (es) 2015-03-04 2021-11-05 Igm Biosciences Inc Moléculas de unión a CD20 y usos de las mismas
AU2016238246B2 (en) * 2015-03-25 2021-05-13 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent hepatitis B virus antigen binding molecules and uses thereof
WO2017059387A1 (en) 2015-09-30 2017-04-06 Igm Biosciences, Inc. Binding molecules with modified j-chain
AU2016329197B2 (en) 2015-09-30 2021-01-21 Igm Biosciences, Inc. Binding molecules with modified J-chain
US10572893B2 (en) 2016-06-16 2020-02-25 International Business Machines Corporation Discovering and interacting with proximate automobiles
TWI840360B (zh) 2018-05-21 2024-05-01 日商中外製藥股份有限公司 密封於玻璃容器之凍結乾燥的製劑、套組、製造凍結乾燥製劑的方法、防止或減低凍結乾燥製劑的玻璃容器成霧的方法、及容器內面經過硫酸銨處理或vist處理之玻璃容器
CN115636141A (zh) 2018-05-28 2023-01-24 中外制药株式会社 填充喷嘴
AU2020322031A1 (en) * 2019-07-31 2022-03-10 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Multivalent DNA antibody constructs and use thereof
MX2022013334A (es) * 2020-04-22 2022-12-06 Igm Biosciences Inc Moleculas de union multimerica de agonistas de pd-1.
EP4297786A1 (en) * 2021-02-23 2024-01-03 Pandion Operations, Inc. Pd-1 antibodies, polypeptides and uses thereof
WO2023064856A1 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology In vivo interacting protein domains and methods of use thereof

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5156840A (en) 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
EP0303088B1 (en) 1987-08-10 1992-11-11 Miles Inc. Purified igm
US5157113A (en) * 1987-08-10 1992-10-20 Miles Inc. Removal of nucleic acids from monoclonal antibody preparations
GB8719963D0 (en) * 1987-08-24 1987-09-30 Cattaneo A Recombinant dna products
US6238891B1 (en) * 1987-11-18 2001-05-29 Cetus Oncology Corporation Method of increasing product expression through solute stress
CA1312030C (en) 1987-11-18 1992-12-29 Brian Maiorella Method to increase antibody titer
JP2501116B2 (ja) 1988-03-05 1996-05-29 日本電信電話株式会社 巡回制御形回線交換方法
DE3825429C2 (de) 1988-07-27 1994-02-10 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren polyklonalen Immunglobulin-Präparates mit hohem IgM-Gehalt
GB9010944D0 (en) 1990-05-16 1990-07-04 Central Blood Lab Authority Chemical compounds
US5419904A (en) * 1990-11-05 1995-05-30 The Regents Of The University Of California Human B-lymphoblastoid cell line secreting anti-ganglioside antibody
JPH05192181A (ja) * 1990-12-18 1993-08-03 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd ヒトモノクローナル抗体
EP0492409A1 (en) * 1990-12-18 1992-07-01 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Human monoclonal antibody
JPH0565233A (ja) 1991-03-08 1993-03-19 Mitsui Toatsu Chem Inc モノクローナル抗体含有凍結乾燥製剤
DK0503648T3 (da) * 1991-03-12 2000-10-30 Biogen Inc CD2-bindingsdomæne af lymfocytfunktion-associeret antigen 3
DK0628639T3 (da) 1991-04-25 2000-01-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Rekonstitueret humant antistof mod human interleukin-6-receptor
JPH04360696A (ja) * 1991-06-06 1992-12-14 Sumitomo Chem Co Ltd 新規なヒトbリンパ細胞株を宿主として産生された組み換えヒト抗体
GB9122820D0 (en) 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
JP3565572B2 (ja) 1992-09-07 2004-09-15 協和醗酵工業株式会社 ヒト化抗体
AU669379B2 (en) * 1992-09-07 1996-06-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Humanized antibodies
JPH06178689A (ja) * 1992-12-11 1994-06-28 Mitsui Toatsu Chem Inc I型緑膿菌を抗原とするヒト抗体をコードする遺伝子
JPH06189781A (ja) 1992-12-25 1994-07-12 Mitsui Toatsu Chem Inc 培養液中の生理活性タンパク質の安定化方法
JPH09127112A (ja) 1995-10-30 1997-05-16 Dainabotsuto Kk 修飾IgM免疫学的測定試薬
JPH09127114A (ja) 1995-11-01 1997-05-16 Dainabotsuto Kk 免疫学的測定用安定化IgM試薬
NZ333915A (en) 1996-08-16 2000-11-24 Harvard College Soluble monovalent and multivalent MHC class II fusion proteins
EP0835880A1 (de) * 1996-10-14 1998-04-15 Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst Srk Verfahren zur Herstellung eines IgM Präparates für die intravenöse Applikation
JPH10324699A (ja) * 1997-03-21 1998-12-08 Sankyo Co Ltd 抗ヒトFasヒト化抗体
MY131805A (en) 1997-09-18 2007-09-28 Biogen Idec Inc Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis.
EP1047457A2 (en) * 1998-01-16 2000-11-02 MCA Development B.V. USE OF RADIOLABELED MONOCLONAL IgM IN THERAPY FOR CANCER AND AUTOIMMUNE DISEASE
AU2444899A (en) 1998-01-22 1999-08-09 Astrazeneca Ab Pharmaceutical formulation comprising an antibody and a citrate buffer
CA2321262A1 (en) 1998-02-19 1999-08-26 President And Fellows Of Harvard College Monovalent, multivalent, and multimeric mhc binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
JP2000154149A (ja) * 1998-09-18 2000-06-06 Sankyo Co Ltd 抗ヒトFasヒト化抗体含有抗リウマチ剤
BR9915548A (pt) * 1998-10-16 2001-08-14 Biogen Inc Proteìnas de fusão de interferon-beta e usos
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
AU4314900A (en) * 1999-04-28 2000-11-17 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Parenteral medicinal composition containing humanized monoclonal antibody fragment and method for stabilizing the same
AU7449200A (en) 1999-09-30 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Derivatives of antibody against ganglioside gm2
AU1052701A (en) * 1999-11-05 2001-06-06 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Transgenic non-human mammals for monitoring change in calcium ion concentration in cells
DK2857516T3 (en) * 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
US6586785B2 (en) 2000-06-29 2003-07-01 California Institute Of Technology Aerosol silicon nanoparticles for use in semiconductor device fabrication
EP1308509A4 (en) * 2000-08-01 2004-05-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk NEW, PHYSIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDE AND ITS APPLICATIONS
GB0113179D0 (en) * 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
JP2003128576A (ja) * 2001-10-25 2003-05-08 Taisho Pharmaceut Co Ltd エンドトキシン誘発性疾患治療薬
WO2003046162A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Process for the production of polypeptides in mammalian cell cultures
DE10328295B4 (de) 2003-06-23 2007-11-22 Endress + Hauser Gmbh + Co. Kg Verfahren und entsprechende Vorrichtung zum Schweißen von Bauteilen eines Feldgerätes
WO2005003557A1 (en) 2003-06-25 2005-01-13 Design Net Engineering, Llc Laser propulsion thruster
TW200510532A (en) * 2003-07-15 2005-03-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd IgM production by transformed cell and method of quantifying the same
EP1688432B1 (en) 2003-10-09 2011-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Igm high concentration stabilized solution
WO2005035573A1 (ja) 2003-10-09 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha タンパク質溶液の安定化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2532966C (en) 2012-12-04
TWI342336B (ja) 2011-05-21
EP1652925B1 (en) 2010-12-08
DE602004030451D1 (de) 2011-01-20
AU2004256354B2 (en) 2011-07-07
ATE490787T1 (de) 2010-12-15
CA2532966A1 (en) 2005-01-20
US8257703B2 (en) 2012-09-04
TW200510532A (en) 2005-03-16
AU2004256354A1 (en) 2005-01-20
EP2204190A1 (en) 2010-07-07
JPWO2005005636A1 (ja) 2006-08-24
EP1652925A1 (en) 2006-05-03
US20070154469A1 (en) 2007-07-05
US7709615B2 (en) 2010-05-04
EP1652925A4 (en) 2007-07-04
WO2005005636A1 (ja) 2005-01-20
US20100172899A1 (en) 2010-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5452835B2 (ja) 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法
US20210277100A1 (en) TGFBeta Antibodies, Methods and Uses
KR20200035291A (ko) 인터류킨-21 뮤테인 및 치료 방법
TW201831516A (zh) 抗gpc3抗體
CN110035773A (zh) 新型抗ctla4抗体
AU2015313268B2 (en) Cancer-cell-specific antibody, anticancer agent, and cancer testing method
JP4767016B2 (ja) 細胞死誘導剤
CN113646335A (zh) 使用对b细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法
WO2017030156A1 (ja) 非天然アミノ酸導入抗体
TW202045711A (zh) 生物製品製造中基於生物量之自動灌注控制
CA3124800A1 (en) Monoclonal antibodies that bind specifically to human trbv9
CN113045661B (zh) 新型抗cd4抗体
AU2020204492A1 (en) Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9
CN114450397A (zh) 用于改善免疫疗法的细胞及其用途
CN116284389A (zh) 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途
AU2016230182B2 (en) Anti-human membrane-type ADAM28 antibody
EP4161650A1 (en) Anti-abcg2 antibodies and uses thereof
EP3473718A1 (en) Anti-adam28 antibody for treating cancer
CN111971303B (zh) 抗cd27抗体及其用途
TW202423984A (zh) 抗cd122抗體及其用途
TW202405013A (zh) 一種抗原結合蛋白及其應用
JP2022060048A (ja) 抗体及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20070621

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070712

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070712

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20070622

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100517

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100715

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100915

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101112

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20101206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110307

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110422

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20110422

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20110519

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20110715

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20131203

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140106

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5452835

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term