JP5452835B2 - 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法 - Google Patents
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Description
μ鎖は、定常領域のドメインを、γ鎖よりも一つ余分に持っている。
μ鎖は、オリゴ糖鎖の数がγ鎖と比較して4箇所多い。
IgMは、IgGには見られないJ鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。J鎖は、IgMが抗体産生細胞から分泌される前に、μ鎖の会合を補助すると考えられている。
〔文献2〕Nature (1986)321:521
〔文献3〕EMBO J.(1987) 9;2753
〔文献4〕J.Immunol.(1990)145;3011
〔文献5〕Human Antibodies(1997)8;137
〔文献6〕J.Immunol.(1994)152;1206
〔2〕35 pg /cell /day以上のIgMを産生できる形質転換細胞。
〔3〕真核細胞である〔1〕または〔2〕に記載の形質転換細胞。
〔4〕原核細胞である〔1〕または〔2〕に記載の形質転換細胞。
〔5〕哺乳動物細胞である〔3〕に記載の形質転換細胞。
〔6〕株化細胞である〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔7〕非リンパ球系細胞株である〔6〕に記載の形質転換細胞。
〔8〕CHO細胞株である〔7〕に記載の形質転換細胞。
〔9〕同じベクター上に(1)IgM H鎖をコードする塩基配列および(2)IgM L鎖をコードする塩基配列の両方を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子(1)および(2)を含む遺伝子断片。
〔10〕同じベクター上に(1)IgM H鎖をコードする塩基配列、(2)IgM L鎖をコードする塩基配列、および(3)IgM J鎖をコードする塩基配列を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子(1)、(2)、および(3)を含む遺伝子断片。
〔11〕転写調節配列によりIgMの分泌が制御される〔9〕または〔10〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔12〕転写調節配列が、アデノウイルス2型主後期プロモーター、シミアンウイルス40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、およびCAGプロモーターからなる群から選択される〔11〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔13〕転写調節配列が、シミアンウイルス40初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター、およびCAGプロモーターからなる群から選択される〔12〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔14〕〔9〕〜〔13〕のいずれかに記載のベクターあるいは遺伝子断片で形質転換された形質転換細胞。
〔15〕〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の形質転換細胞から選択される、〔14〕に記載の形質転換細胞。
〔16〕発現ベクターまたは遺伝子断片が、J鎖をコードする塩基配列を含んでいる〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔17〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有し、かつ60%以上の含量を持つ5量体IgMを産生する〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔18〕80%以上の含量を持つ5量体IgMを産生する〔17〕に記載の形質転換細胞。
〔19〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ50%以上の含量を持つ6量体IgMを産生する〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔20〕80%以上の含量を持つ6量体IgMを産生する〔19〕に記載の形質転換細胞。
〔21〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有し、かつ産生する5量体と6量体の比(5量体/6量体比)が1.5以上であるIgMを産生する〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔22〕前記ベクターまたは遺伝子断片がIgM J鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ産生する6量体と5量体の比(6量体/5量体比)が1.5以上であるIgMを産生する〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔23〕IgM H鎖およびIgM L鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターまたは遺伝子断片が、J鎖をコードする塩基配列を含まず、かつ共形質転換によりJ鎖をコードする塩基配列が発現可能に導入されている〔14〕または〔15〕に記載の形質転換細胞。
〔24〕〔1〕〜〔8〕、並びに〔14〕〜〔23〕のいずれかに記載の細胞を培養し、IgMを採取する工程を含むIgMを製造する方法。
〔25〕〔1〕〜〔8〕、並びに〔14〕〜〔23〕のいずれかに記載の細胞培養物の培養上清からIgMを精製する工程を含む、実質的に純粋なIgMを製造する方法。
〔26〕〔24〕に記載の方法により得られるIgM。
〔27〕〔25〕に記載の方法により得られる実質的に純粋なIgM。
〔28〕ヒト抗体、マウス抗体、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体である〔26〕または〔27〕に記載のIgM。
〔29〕実質的に純粋な5量体あるいは6量体である〔26〕〜〔28〕のいずれかに記載のIgM。
〔30〕CHO細胞が付加する糖鎖を有する実質的に純粋な5量体または6量体IgM。
〔31〕抗糖鎖抗体である〔26〕〜〔30〕のいずれかに記載のIgM。
〔32〕抗ガングリオシド抗体である〔31〕に記載のIgM。
〔33〕抗GM2またはGM3抗体である〔32〕に記載のIgM。
〔34〕配列番号:1に記載の塩基配列、または配列番号:2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔35〕配列番号:3に記載の塩基配列、または配列番号:4に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔36〕〔34〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔37〕〔35〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔38〕〔36〕に記載の蛋白質と〔37〕に記載の蛋白質を構成単位として含むIgM。
〔39〕更にIgM J鎖を含む〔38〕に記載のIgM。
〔40〕5量体である〔39〕に記載のIgM。
〔41〕配列番号:19に記載の塩基配列、または配列番号:20に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔42〕配列番号:21に記載の塩基配列、または配列番号:22に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔43〕〔41〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔44〕〔42〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔45〕〔43〕に記載の蛋白質と〔44〕に記載の蛋白質を構成単位として含むIgM。
〔46〕更にIgM J鎖を含む〔45〕に記載のIgM。
〔47〕5量体である〔46〕に記載のIgM。
〔48〕〔26〕〜〔33〕、〔38〕、および〔45〕のいずれかに記載のIgMを含有する医薬組成物。
〔49〕80%以上の5量体IgMを含有する医薬組成物。
〔50〕50%以上の6量体IgMを含有する医薬組成物。
〔51〕80%以上の6量体IgMを含有する〔50〕に記載の医薬組成物。
〔52〕5量体/6量体比が1.5以上であるIgMを含有する医薬組成物。
〔53〕6量体/5量体比が1.5以上であるIgMを含有する医薬組成物。
〔54〕次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを担体としてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってIgMを分離する工程を含む、IgMの多量体を分析する方法。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
〔55〕条件a)における温度が37℃以上である〔54〕に記載の方法。
〔56〕条件b)における過硫酸アンモニウムの濃度が0.25%以上である〔54〕に記載の方法。
〔57〕ポリアクリルアミドゲルが、前記a)-c)からなる群から選択された少なくとも2つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルである〔54〕に記載の方法。
〔58〕ポリアクリルアミドゲルが、前記a)-c)の全ての条件を満たすポリアクリルアミドゲルである〔54〕に記載の方法。
〔59〕電気泳動用のバッファーがTris-acetate SDS泳動バッファーである〔54〕に記載の方法。
〔60〕IgMの多量体が、IgMの5量体および/または6量体である〔54〕に記載の方法。
〔61〕IgMの会合体を分析することを特徴とする〔54〕に記載の方法。
〔62〕RIを使用しないことを特徴とする〔54〕に記載の分析方法。
〔63〕電気泳動後に分離されたIgMの多量体を定量する工程を含む、〔54〕に記載の方法。
〔64〕次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルからなる、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲル。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
〔65〕次のa)-c)からなる群から選択された少なくとも1つの工程を含む、IgMの多量体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法。
a)アクリルアミドを高温で重合させる工程、
b)アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
c)重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、
まずヒトJ鎖をコードする遺伝子はクローニングされ、その構造が明らかにされている(GenBank Accession No. M12759、Max & Korsmeyer, J.Exp.Med.(1985) 161:832-849)明らかにされた塩基配列情報に基づいて、IgM産生細胞のmRNAを鋳型として、J鎖をコードする遺伝子を取得することができる。
たとえば実施例に記載したJ鎖増幅用プライマーJ-f1およびJ-r1を利用して、J鎖をコードするDNAを増幅することができる。実施例において単離されたJ鎖をコードするcDNAの塩基配列は配列番号:5に、またこの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号:6に示した。
μ鎖定常領域: Dorai & Gillies, Nucleic Acids Res.(1989) 17:6412
κ鎖定常領域: Hieter et al., Cell (1980) 22:197-207
γ鎖定常領域: Hieter et al., Nature (1981) 294: 536-540
更に本発明におけるIgMは、定常領域を改変したIgMが含まれる。たとえば、IgMを構成するμ鎖のH鎖あるいはL鎖の定常領域を改変して、そのCDC活性を高められる可能性がある。あるいはIgGのFc領域を接合することによって、ADCC活性を有するIgM分子を創出することもできる。
また、本発明のIgM抗体は糖鎖が改変されたIgM抗体であってもよい。
たとえば哺乳動物由来の発現ベクターとして、pCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193-200)、pcDNA3 (インビトロゲン社製)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、およびpCDM8が公知である。動物ウィルス由来の発現ベクターによって哺乳動物細胞を形質転換することもできる。ウイルス由来の発現ベクターとして、pHSV、pMV、あるいはpAdexLcwを示すことができる。その他、レトロウィルス由来の発現ベクターであるpZIPneoも、動物細胞の形質転換に有用である。
アデノウイルス2型主後期プロモーター、
シミアンウイルス40初期プロモーター、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、
サイトメガロウイルスプロモーター、
ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター(Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、
ウシ成長ホルモンプロモーター、
βアクチン遺伝子プロモーター、および
CAGプロモーター
SV40プロモーター(Mulliganら, Nature (1979) 277, 108)、
マウス乳癌ウイルス(MMTV)-LTRプロモーター、
シミアンウイルス40初期プロモーター、
サイトメガロウイルスプロモーター、
ポリペプチド鎖伸長因子1αプロモーター、
CAGプロモーター
CHO(hamster ovarian cell, J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、
COS (monkey kidney cell, Miyazaki, et al., Gene (1989) 79, 269)、
3T3 (mouse fibroblasts)、
PC12 (human plasmacytoma, Neumann, et al., EMBO J.(1982) 1, 841)、
BHK(baby hamster kidney)、
HeLa(human epitherial cell, Cattaneo, et al. EMBO J.(1987) 6, 2753)、
C6 (human glioma cell, Cattaneo, et al. Eur. J. Biochem.(1983) 135, 285)、
Vero、(monkey kidney cell, cytology(1991)7,165)、および
アフリカツメガエル卵母細胞(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340)などの両生類細胞
CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)、あるいはCHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)等を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。これらの細胞株は、寄託機関から入手することができる。以下に代表的な細胞株と、ATCCのAccession Numberを記載した。
CHO CCL-61, CRL-9096 BHK CRL-1632
COS CRL-1650, CRL-1651 HeLa CCL-2
3T3 CRL-1658 Vero CCL-81
リン酸カルシウム法、
DEAEデキストラン法、
カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、
エレクトロポーレーション法、
リポフェクション
単一のベクターに3つの遺伝子を配置して宿主細胞を形質転換することによって、ベクター間の形質転換効率の違い、あるいは発現レベルの差を防ぐことができる。すなわち、H鎖、L鎖、およびJ鎖の3つの遺伝子を配置された発現ベクターは、本発明の形質転換細胞を得るためのベクターとして好ましい。
in vitroにおける培養方法として、培地中に細胞を分散させて培養する方法や、半透膜を介して細胞と培地を接触させる方法が公知である。in vivoでの培養方法としては、マウスの腹腔内に細胞を接種する方法が知られている。
抗ガングリオシドGM2抗体(L55):
H鎖:配列番号:20(配列番号:19)
L鎖:配列番号:22(配列番号:21)
抗ガングリオシドGM3抗体(L612):
H鎖:配列番号:2(配列番号:1)
L鎖:配列番号:4(配列番号:3)
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度の過硫酸アンモニウムを含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル。
通常、イムノグロブリンなどの蛋白質の電気泳動に利用されるポリアクリルアミドゲルの重合温度は、室温である。これに対して、たとえば37℃以上、好ましくは40℃〜60℃で重合させたポリアクリルアミドゲルは、本発明のIgMの解析方法に有用である。このような高温条件を与えることにより、アクリルアミドを迅速に重合させることができる。
一般にSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは、0.05%程度のAPSを含んでいる。これに対して、たとえば0.25%以上、好ましくは0.1%〜0.5%のAPSを含むポリアクリルアミドゲルは、本発明のIgMの解析方法に有用である。
電気泳動分析用のポリアクリルアミドゲルは、気泡を生じないように均一に調製することが重要である。そのため、ポリアクリルアミドゲルの重合開始剤を添加後、気泡が混入しないように注意しながら重合溶液を十分に攪拌する。これに対して本発明では、HYBRID MIXER(KEYENCE)を用いて、より完全に重合溶液を均一に攪拌し、かつ、気泡の混入を防ぐために脱泡を行い、均一なゲルを作製した。
a)高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
b)高濃度のAPS(Ammonium PerSulfate)を含有するポリアクリルアミドゲル、および
c)重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル。
a)アクリルアミドを高温で重合させる工程、
b)アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
c)重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程。
1)アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、
2)重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、および
3)アクリルアミドを高温で重合させる工程。
〔実施例1〕ガングリオシドGM3に対する組換え型ヒト抗体L612の作製
1.1 抗ガングリオシドGM3ヒト抗体H鎖遺伝子の構築
ガングリオシドGM3に結合するヒト抗体(以下、L612と表記する)のH鎖をコードする遺伝子は、Epstein-Barrウイルスで形質転換されたヒトB細胞(以下、L612発現B細胞と表記する)より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L612のH鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Hoonらにより報告されている(Cancer Research 1993;53:5244-5250)。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix、
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-f3またはLMH-r3
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngの完全長L612H鎖遺伝子を含むpBluescript KS+ベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-fxho、LMH-rsal
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間、
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
L612のL鎖をコードする遺伝子はL612発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L612のL鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Hoonらにより報告されている(Cancer Research 1993;53:5244-5250)。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-f1またはLML-r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)
5'末端側遺伝子断片、
3'末端側遺伝子断片、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnot
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
L612発現ベクターを作製するために、pUCAG/L612Hを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で消化して得られる約4.0kbpの断片をpCXND3/L612Lの制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpCXND3/L612IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、およびL612遺伝子を発現する。
L612のJ鎖をコードする遺伝子はL612発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。Total RNAは、上記と同様にしてL612発現B細胞より抽出した。GenBankに登録されているヒト抗体J鎖遺伝子の塩基配列(GenBank番号:M12759)に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(J-f1、J-r1)を設計し、合成した。J-f1(配列番号:15)はセンス方向でヒト抗体J鎖遺伝子Exon3にハイブリダイズし、J-r1(配列番号:16)はアンチセンス方向でヒト抗体J鎖遺伝子Exon4にハイブリダイズする。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドJ-f1またはJ-r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)
5'末端側遺伝子断片、
3'末端側遺伝子断片、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドJ-feco、J-rxba
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
CHO細胞(DG44株)を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について実施例1.6に示す濃度定量法で測定した。L612高発現細胞株を順次拡大培養し、L612安定発現細胞株CA02、CA15、CA19、CA20、およびCA24を得た。
培養上清中のIgM濃度の測定は以下のように行った。Anti-Human IgM(BIOSORCE社製)を1μg/mlになるようにCoating Buffer(0.1M NaHCO3、0.02%NaN3)で希釈し、96ウェルELISA用プレートに100μl/ウェルで加え、4℃で24時間以上反応させ、コーティングを行った。
Rinse Buffer:
PBS(-)、
0.05% Tween20
Diluent Buffer:
50mM Tris、
1mM MgCl2、
0.15M NaCl、
0.05% Tween20、
0.02% NaN3、
1% BSA
2.1 抗ガングリオシドGM2ヒト抗体H鎖遺伝子の構築
ガングリオシドGM2に結合するヒト抗体(以下、L55と表記する)のH鎖をコードする遺伝子は、Epstein-Barrウイルスで形質転換されたヒトB細胞(以下、L55発現B細胞と表記する)より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L55のH鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Nishinakaらにより報告されている(Immunogenetics 1998;48:73-75)。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-f3またはLMH-r3
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngの完全長L55H鎖遺伝子を含むpBluescript KS+ベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH-fxho、LMH-rsal
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、55℃/30秒間、68℃/3分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
L55のL鎖をコードする遺伝子はL55発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅した。L55のL鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Nishinakaらにより報告されている(Immunogenetics 1998;48:73-75)。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-f1またはLML-r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
塩基配列決定の後、5'末端側非翻訳領域配列にハイブリダイズする前方プライマーL55-f(配列番号:23)、3'末端側非翻訳領域配列にハイブリダイズする後方プライマーL55-r(配列番号:24)を設計し、PCRを行った。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドL55-fおよびL55-r
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
塩基配列の決定後、合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnotを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。LML-feco(配列番号:13)は前方プライマーでL55L鎖遺伝子の5'末端にハイブリダイズし、かつEcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またLML-rnot(配列番号:14)は後方プライマーでL55L鎖遺伝子の3'末端にハイブリダイズし、NotI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD-Plus-
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngのL55L鎖遺伝子を含むpGEM-T Easyベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML-feco、LML-rnot
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、55℃/30秒間、68℃/3分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
L55発現ベクターを作製するために、pUCAG/L55Hを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で消化して得られる約4.0kbpの断片をpCXND3/L55Lの制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpCXND3/L55IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、L55遺伝子を発現する。
CHO細胞(DG44株)を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
実施例1.6で示した組換え型L612産生細胞株と同等またはそれ以上の産生量が得られた。この結果より、CHO細胞において高い産生量の組換え型IgM発現細胞株が安定的に作製できることが明らかになった。
3.1 組換え型L612(実施例1)および組換え型L55(実施例2)の多量体形成の解析
組換え型L612(実施例1)および組換え型L55の多量体の解析は、非還元SDS-PAGEを用いて行なった。非還元SDS-PAGE用の電気泳動ゲルは、以下のとおり作成した。HYBRID MIXER(TOMY)専用の容器に30% アクリルアミド(C%=3.33%)を1.80mL、1.50M Tris-HCl pH8.8を3.75mL、ミリQ水を3.39mL、glycerolを2.25mL加え混合し、溶液を50℃に保温した。さらに2.0% agaroseを3.75mL加え、再び50℃に保温した。
電気泳動後のゲルをセミドライ方式のブロッティング装置を用いて、PVDF膜に転写した。転写後、Tween80を0.05%含む5%スキムミルクを用いて2時間、ブロッキングを行なった。Tween80を0.05%含むTris-buffered-saline溶液で洗浄後、一次抗体として3000倍希釈したRabbit anti-Human IgM(DAKO)を用いて1時間反応させた。再び洗浄後、二次抗体として1000倍希釈したAP-Goat Rabbit anti-IgG(H+L) Double staining grade(ZYMED)を用いて1時間反応させた。再び洗浄後、Amplified Alkaline Phosphatase Immuno-Blot Assist Kit(Bio-Rad)を用いて発色させた。
この結果より、IgM産生細胞の培養上清中の、5量体、あるいは6量体の確認ができることが明らかになった。また、J鎖+で発現させた組換え型IgMは主に5量体を形成しており、J鎖−で発現させた組換え型IgMは主に6量体を形成していることが明らかになった。J鎖の有無をコントロールすることで、組換え型IgMの5量体、および6量体を作り分けできることが明らかになった。
4.1 L612発現細胞株における多量体形成比率の分析
実施例3と同様に非還元SDS-PAGEによる電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを回収し、10% methanol, 7% acetic acidでゲルを30分以上洗浄した後、Ruby gel stain溶液(Bio-Rad)を用いて3時間以上染色した。染色後、10% methanol, 7% acetic acidでゲルを60分以上脱色した。脱色後、FluorImager 595 (Molecular Dynamics)を用いて480 nmで励起し、618 nmで各多量体のバンドを検出した(図3)。これより、各レーンのdensitogramを作製し、ピーク面積を求めることで各バンド強度を定量した。得られた会合体(aggregate)、6量体(hexamer)、5量体(pentamer)、および4量体(tetramer)の比率を表3に示した。本発明の方法により、IgMの多量体構造、あるいは会合体を定量的に評価できることが確認された。
5.1 発現プラスミドpL612CA4の構築
ベクターINPEP4 (Patent No. US20010019715)のCMVプロモーターおよびポリAシグナルを除くために制限酵素PvuII部分消化を行い、約5.5 kbの断片を回収し環状化した。このベクターをINPEP4-dCMVと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子を発現する。
CCTGATCATGAAGACGTCGACTAGTCCGGATCCCCGGGAGCTCGAGCGCTCTAGATCTTTAATTAAGG(配列番号:25)
CGCGCCTTAATTAAAGATCTAGAGCGCTCGAGCTCCCGGGGATCCGGACTAGTCGACGTCTTCATGATCAGGCCGG(配列番号:26)
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpL612CA4を制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pL612CA4を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)10 mLに加え、同培地で適度に希釈した後96 ウェル培養用プレートに100 μL/well播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内で培養を行った。CO2インキュベーター内で1日間培養後、適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)を100 μL/wellずつ加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定後、適当量 Geneticin(Invitrogen社製) 、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen製)を用いて24 ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、3〜7日おきに拡大培養を行い、L612高産生株を選抜した。
Geneticin選抜で取得したL612高産生株を適当量のMTX (Methotrexate)を含有するCHO-S-SFMII培地 (Invitrogen社製)に懸濁し、96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内でコロニーが形成されるまで培養を行った。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定後、24 ウェル培養用プレートまたは48 ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、3〜7日おきに拡大培養を行い、L612高産生株を選抜した。MTX濃度を段階的に上げながらこの操作を繰り返すことで、遺伝子増幅を誘引させて表4に示すL612高産生株を選抜した。
HPLCシステム:Water社製HPLC system Alliance
2487 Dual Absorbance Detector、2690 Separations Module
Millennium 32 ver. 3.21
使用カラム:GPCカラムSuperose 6 HR 10/30 (Amersham Biosciences製)
標準品:凍結されたL612 IgM精製品を融解後いったん遠心し、その上清を小分注して凍結保存したものをGPC用標準品として使用した。
移動相:D-PBSに、Polyoxyethylene(20)Sorbitan Monolaurateを0.02%、アジ化ナトリウムを0.05%となるように添加して調製した。
HPLC条件:移動相流量0.5 mL/min、測定波長280 nm、試料注入量100 μL
操作は以下のようにして行った。37℃で数分保温して融解したGPC用標準品の波長280 nmにおける吸光度を分光光度計により測定し、その値から波長280 nmにおける吸光度が0.12となるような希釈率を算出した。
求めた希釈率にてGPC標準品を希釈したものを分析して得られたピーク面積と適度に希釈して標準品と同容量注入した未知試料のピーク面積と希釈倍率から未知試料の280 nmにおける吸光度を算出した。得られた吸光度の値とL612の吸光数
L612濃度 (μg/mL) =吸光度 (Abs280) ÷1.4×1000
MTX選抜で得られたL612高産生株を適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地 (Invitrogen社製)に懸濁し、限界希釈法によって1 cell/200 μLになるよう希釈を行った。これを96 ウェル培養用プレートに100 μL/wellずつ播種した。これにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有する哺乳動物由来成分不含培地で培養したDG44株を適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地に1× 105 cells/mLになるように懸濁後、100 μL/wellずつ播種した。CO2インキュベーター(37℃、8% CO2濃度)内に静置し、7日後に適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地を100 μL添加後、CO2インキュベーター(37℃、8% CO2濃度)内に静置した。約2週間後、得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定後、適当量 のMTXを含有する哺乳動物由来成分不含培地を用いて24 ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、3〜7日おきに拡大培養を行い、最終的に5.4のゲルろ過クロマトグラフィ法に従って培養上清中のIgM濃度を測定し、表5に示すL612高産生クローンを樹立した。
HPLCシステム:HITACHI LaChrom HPLC装置 (HITACHI L-7120 pump(A, B)、L-7200 autosampler、L-7420 UV-VIS detector、L-7610 degasser)
データ解析ソフトウェア:D-7000型 Advanced HPLC System Manager (HITACHI)
分析用カラム:TOSHO TSKgel G4000SWXL 7.8mmIDx300 mm (Cat No.08542、Column No. G0151)
標準品:MABON01R306(5.4の標準品と同等の品質を有するもの)を使用した。
移動相:50 mM Phosphate-Buffer, 500 mM KCl, pH 7.4, 0.05% NaN3 (pH7.4)
HPLC条件:0.5 mL/min (20min)→1.0 mL/min、測定波長280 nm、試料注入量100 μL
検量線: 1600、800、100μg /mLの3点で作成した。
作製したL612高産生株を、初発細胞密度2x105 cells/mLにて回分培養法もしくは流加培養法で培養を行い、培養上清中のIgM濃度をゲルろ過クロマトグラフィ法(5.4, 5.6の方法参照)にて測定した。哺乳動物由来成分不含培地を用い、加水分解物として回分培養法では酵母抽出物を、流加培養法では魚肉抽出物を使用した。増殖因子としては、回分培養法でインスリンを、流加培養法ではインスリンとインスリン様増殖因子-Iを用いた。回分培養法においてのL612産生量は、培養6日目で269.9 mg/Lであった(5.4の方法による)。一方流加培養法においてのL612産生量は、培養6日目で347.4 mg/L、培養14日目で1669.1 mg/Lであった(5.6の方法による)。IgMはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難とされていたが、加水分解物の使用と流加培養法を組み合わせて用いることにより、CHO細胞において高い産生量の組換え型IgMの調製が可能であることが明らかとなった。
6.1 発現プラスミドpL612pentaCA4の構築
INPEP4-dCMV(MCS)のXhoI, BglIIサイトに、L612CA-H/pBlueから約4.1 kbのSalI-BamHIの抗体H鎖発現ユニットをクローニングしてL612CA-H3/dCMVを作製した。L612CA-H3/dCMVのBamHI, SalIサイトに、L612CA-L/pBlueから約3.0 kbのBamHI-SalIの抗体L鎖発現ユニットをクローニングしてpL612CA3を作製した。
本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、L612遺伝子 (H鎖、L鎖、J鎖) を発現する。
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpL612pentaCA4を制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pL612pentaCA4を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
Geneticin選抜で得られた細胞株をS100 spinner flaskにて初発細胞密度2x105 cells/mLで3日間培養した培養上清を用い、実施例3に示す方法に従い非還元SDS-PAGEを行い、抗ヒトμ鎖抗体を一次抗体に用いたWestern-blottingを行った。その結果pL612pentaCA4導入株では、主としてL612発現B細胞から得られたL612の5量体に相当するバンドが得られ、6量体に相当するバンドは検出されなかった(図4)。J鎖発現単位をH鎖ならびにL鎖発現単位とともに単一の発現ベクター上に載せ、H鎖ならびにL鎖発現に対するJ鎖の発現レベルを適切に制御することによって、5量体L612を主として生成させることが可能であることが明らかとなった。
51Cr-クロム酸ナトリウムにて放射性標識した標的細胞であるM1メラノーマ細胞1×104個/50μL/wellにHAVBにて適宜希釈した抗体溶液を50μL/well添加し、組換え型L612(J鎖−;CA19)あるいは組換え型L612(J鎖+;CJ45)がそれぞれ抗体の最終濃度0.16, 0.8, 4, 20, 100 μg/mLとなるようにして氷上にて60分間静置した。続いて、各ウェルに補体源としてヒト由来血漿100% ないし全血を100μLずつ添加し、5%炭酸ガスインキュベーター中に37℃で90分間静置した。遠心(1000 rpm, 5分間, 4℃)後、各ウェルより上清を100μLずつ回収し、γカウンター(COBRA II AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)にて遊離された放射活性を測定した(図5)。CDC活性即ち細胞傷害活性(%)は(A-C)/(B-C)×100により計算した。Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)、Bは標的細胞浮遊液を50μL、10% NP-40水溶液(Nonidet登録商標 P-40, Code No.252-23, ナカライテスク株式会社)を20μL、HAVBを130μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞浮遊液を50μL、HAVBを150μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。試験はtriplicateにて行い、特異的クロム遊離率について平均値及び標準誤差を算出した。いずれの条件でも、組換え型L612(CA19)は、L612よりも強いCDC活性を誘導し、50% Lysisを誘導する濃度の比は、5.8ないし5.9倍であった。また、血球の共存によって、CDC活性の顕著な減弱は見られなかった。
8.1 発現プラスミドp L612CA3の構築
INPEP4-dCMV(MCS)のXhoI, BglIIサイトに、L612CA-H/pBlueから約4.1 kbのSalI-BamHIの抗体H鎖発現ユニットをクローニングしてL612CA-H3/dCMVを作製した。L612CA-H3/dCMVのBamHI, SalIサイトに、L612CA-L/pBlueから約3.0 kbのBamHI-SalIの抗体L鎖発現ユニットをクローニングしてpL612CA3を作製した。
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpL612CA3を制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pL612CA3を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)10 mLに加え、同培地で適度に希釈した後96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内で1日間培養し、適当量のGeneticin(Invitrogen社製)、ならびにHT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)を等量加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定することにより高産生株を選抜し、3〜7日おきに順次拡大培養を行うことによりL612産生株CA3-1016を得た。
Geneticin選抜で取得したL612産生株CA3-1016を適当量のMTX (Methotrexate)を含有するCHO-S-SFMII培地 (Invitrogen社製)に懸濁し、96 ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、CO2インキュベーター (37℃、8% CO2濃度) 内でコロニーが形成されるまで培養を行った。得られた単一コロニーについて実施例1の1.6に記載の方法に従って培養上清中のIgM濃度を測定することにより高産生株を選抜し、3〜7日おきに順次拡大培養を行うことによりL612産生株CA3-1016-50-11を得た。
作製したL612産生株CA3-1016-50-11を、初発細胞密度2〜3x105 cells/mLにて回分培養法で培養を行い、培養上清中のIgM濃度を実施例5の5.4に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定した。哺乳動物由来成分不含培地を用い、加水分解物として酵母抽出物を使用した。増殖因子としてはインスリンを用いた。回分培養法でのL612産生量は、培養3日目で56.0 mg/Lであった。
回分培養から得られた培養上清を、150 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で平衡化した陰イオン交換樹脂充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)でL612を溶出した。この溶出画分を10 mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)で平衡化したハイドロキシアパタイト充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)でL612を溶出した。これら2種のカラムクロマトグラフィーでの不純物分離精製を行った後、得られたL612画分を、移動相として300 mM NaCl含有20 mM 酢酸(pH6.0)を使用したゲルろ過にて会合体の分離除去を行った。ゲルろ過で得られた目的画分を0.2μmのメンブレンフィルターでろ過を行い精製L612画分とした。
9.1 エレクトロポレーション、Geneticin選抜
CHO細胞DG44株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドpCXND3/L612IgMを制限酵素 PvuIで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しTEに溶解した。HT supplement (Invitrogen社製)を1倍濃度で含有するCHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製)で培養した細胞と精製したPvuI消化pCXND3/L612IgMを混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
作製したL612産生株DG44(HT-)-30を、初発細胞密度2〜3x105 cells/mLにて連続回分培養法で培養を行い、培養上清中のIgM濃度を実施例5の5.4に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定した。CHO-S-SFMII培地(Invitrogen社製、HT不含)を用い、加水分解物として酵母抽出物を使用した。増殖因子としてはインスリンを用いた。3日毎の4回の連続した回分培養においてのL612産生量は、各々28.7 mg/L, 32.0 mg/L, 25.7 mg/L, 22.2 mg/Lであった。
4回の回分培養から得られた培養上清を、それぞれ150 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で平衡化した陰イオン交換樹脂充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM NaCl含有20 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)でL612を溶出した。この溶出画分を10 mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)で平衡化したハイドロキシアパタイト充填カラムに負荷してL612を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、350 mM りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)でL612を溶出した。これら2種のカラムクロマトグラフィーでの不純物分離精製を行った後、得られたL612画分を、移動相として300 mM NaCl含有20 mM 酢酸(pH6.0)を使用したゲルろ過にて会合体の分離除去を行った。4回の各精製でのL612回収率はそれぞれ実施例5の5.4に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定し、83.7%、45.6%、63.6%、75.6%であった。4回分のゲルろ過での目的画分を混合し、0.2μmのメンブレンフィルターでろ過を行い精製L612画分とした。
実施例8および実施例9で得られたそれぞれの精製L612画分について、実施例4に記載の方法と同様の方法でIgMの多量体形成比率を分析した。但し、電気泳動時のゲルの組成、および電気泳動バッファーを以下のとおり変更して実施した。
その後室温に1分放置し、TEMEDを12μL、25% ammonium persulfate(APS) 50μLを加え、HYBRID MIXER(TOMY)で15秒攪拌、15秒脱泡した。ディスポシリンジで溶液を回収し、溶液をゲルプレートに流し込み、37℃で1時間アクリルアミドの重合反応を行った。その後室温でagaroseを固め、完成した電気泳動ゲルは4℃で保存した。
電気泳動バッファーは、Tris(hydroxymethyl)aminomethaneを6.06g、Tricineを8.96g、およびSDSを1gをミリQ水で1000 mLにメスアップすることにより調製した。
会合体(aggregate)、6量体(hexamer)、5量体(pentamer)、および4量体(tetramer)の比率を表6に示した。
このようにして産生した6量体のIgMは、産生した5量体のIgMと比較して細胞障害作用が強いことが確認された。本発明は、6量体構造の組換えヒトIgMを産生し、ヒト補体を用いて組換えヒトIgMの強い細胞障害作用を示した初めての知見である。このようなことから、本発明の方法は6量体構造のIgMを優先的に製造し、IgMの細胞障害作用を利用した抗体医薬を得る方法として理想的である。
Claims (2)
- (a)IgM H鎖およびIgM L鎖をCAGプロモーターの制御下にコードする遺伝子を含む発 現ベクターが、発現可能に導入されており、IgMを産生できるCHO細胞株由来の形質転換細 胞であって、前記ベクターがIgM J鎖をコードする塩基配列をさらに有し、かつ60%以上 の含量を持つ5量体IgMを産生する形質転換細胞であって、産生する5量体と6量体の比 (5量体/6量体比)が1.5以上であるIgMを産生する形質転換細胞、または
(b)IgM H鎖およびIgM L鎖をCAGプロモーターの制御下にコードする遺伝子を含む発 現ベクターが、発現可能に導入されており、IgMを産生できるCHO細胞株由来の形質転換細 胞であって、前記ベクターがIgM J鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ50%以上の含 量を持つ6量体IgMを産生する形質転換細胞であって、産生する6量体と5量体の比(6 量体/5量体比)が1.5以上であるIgMを産生する形質転換細胞
を培養し、IgMを採取する工程を含む、それぞれ、
(A)5量体と6量体の比(5量体/6量体比)を1.5以上で、60%以上の含量を持 つ5量体IgMを、または
(B)6量体と5量体の比(6量体/5量体比)を1.5以上で、50%以上の含量を持 つ6量体IgMを製造する方法。 - 請求項1の(a)または(b)の細胞の培養物の培養上清からIgMを精製する工程を含む、実質的に純粋なそれぞれ、(A)5量体と6量体の比(5量体/6量体比)を1.5 以上で、60%以上の含量を持つ5量体IgMを、または(B)6量体と5量体の比(6量体 /5量体比)を1.5以上で、50%以上の含量を持つ6量体IgMを製造する方法。
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