JP3565572B2

JP3565572B2 - ヒト化抗体

Info

Publication number: JP3565572B2
Application number: JP22143293A
Authority: JP
Inventors: 和靖中村; 正道小池; 研也設楽; 陳雄花井; 良寿桑名; 護長谷川
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1992-09-07
Filing date: 1993-09-06
Publication date: 2004-09-15
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: JPH06205694A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト化抗体に関する。ヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体に比べて患者体内で抗マウスイムノグロブリン抗体ができないため、副作用が減少し、血中半減期も伸び、さらには抗腫瘍エフェクター効果も増大する。従って、ヒト化抗体はヒト癌の治療等においてマウスモノクローナル抗体より優れた治療効果が得られると期待される。
【０００２】
【従来の技術】
一般にマウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることによりヒト体内に抗マウスイムノグロブリン抗体ができてしまい、投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり〔ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），２，８８１（１９８４）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６５，１３４９（１９８５）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．），８０，９３２（１９８８）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８２，１２４２（１９８５）〕、抗体がはやくクリアランスされ〔ジャーナル・オブ・ニュクレアー・メディシン（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．），２６，１０１１（１９８５）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６５，１３４９（１９８５）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．），８０，９３７（１９８８）〕、その効果を減じてしまうことが知られている〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１３５，１５３０（１９８５）、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４６，６４８９（１９８６）〕。これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してマウス型モノクローナル抗体をヒト型キメラ抗体あるいはＣＤＲ（相補性決定部位；ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＲｅｇｉｏｎ）移植抗体（再形成ヒト抗体）のようなヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域はマウス由来で定常領域はヒト由来である抗体であり〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８１，６８５１（１９８４）〕、ヒトに投与した場合、ヒト抗マウスイムノグロブリン抗体はほとんど惹起されず、血中半減期が６倍のびることが報告されている〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，４２２０（１９８９）〕。ＣＤＲ移植抗体はヒト抗体のＣＤＲのみをヒト以外の動物由来のＣＤＲに置換した抗体であり〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２１，５２２（１９８６）〕、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びることが報告されている〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１４７，１３５２（１９９１）〕。
【０００３】
また、抗体の殺細胞活性に関してもマウス抗体Ｆｃ領域に比べヒト抗体Ｆｃ領域の方がヒト補体やヒトエフェクター細胞を活性化することが報告されている。例えば、ガングリオシドＧＤ_２に対するマウスモノクローナル抗体は、ヒト抗体Ｆｃ領域を持つキメラ抗体に変換するとヒトエフェクター細胞を介した抗腫瘍効果が上昇することが報告されているし〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１４４，１３８２（１９９０）〕、ＣＤＲ移植抗体についても同様の結果が報告されている〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）〕。このような結果は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体はヒト化抗体の方がマウスモノクローナル抗体より好ましいことを示している。
【０００４】
抗体のクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥがあり、さらにＩｇＧはマウスの場合ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３（ヒトではＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４）の４つのサブクラスに分かれる。動物に抗原を投与した場合、作られる抗体はほとんどの場合ＩｇＭかＩｇＧである。ＩｇＧは分子量およそ１６万で２量体構造を持ち、比較的扱いやすい分子である。ＩｇＭは分子量がおよそ９０万という大きな分子であり、Ｊ鎖でつながれた複雑な５量体構造で存在しているため、精製が困難であること、凝集を起こしやすく保存が難しいこと、蛋白分解酵素による部分分解で失活しやすくＦａｂを作製することが難しいこと、抗癌剤や毒素などを化学結合させるなどの化学修飾すると結合活性を失う場合が多いことなどの欠点がある〔モノクローナル抗体：原理と実技（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ著，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８６〕。また、癌に対する治療効果においてＩｇＧクラスのモノクローナル抗体とＩｇＭクラスのモノクローナル抗体のどちらが優れているかについては、バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）らがリンパ球のＴｈｙ−１抗原に対するＩｇＧクラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を用いて詳細に検討している〔モノクローナル抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔ，Ｔ．Ｊ．ＭｃＫｅａｒｎａｎｄＫ．Ｂ．Ｂｅｃｈｔｏｌ編集，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９８０，ｐ．２７５）〕。それによると、Ｔｈｙ−１抗原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するＩｇＧクラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を比べた結果、ｉｎｖｉｔｒｏの補体依存性抗腫瘍効果はＩｇＭモノクローナル抗体が優れていたにもかかわらず、担癌マウスを用いて調べたｉｎｖｉｖｏの抗腫瘍効果では、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体に有意な抗腫瘍効果が認められたのに対し、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体には抗腫瘍効果が認められなかった。さらに、マウスにアイソトープで標識したモノクローナル抗体を投与して血中半減期を調べたところ、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体に比べＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の血中半減期が非常に短いことが明らかになった。このような結果は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体はＩｇＧクラスが好ましいことを示している。
【０００５】
ガングリオシドは動物の細胞膜を構成している糖脂質の１種で、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性側鎖であるスフィンゴシンおよび脂肪酸とから構成される分子である。ガングリオシドの種類と発現量は、細胞種、臓器種、動物種等によって異なることが知られている。さらに細胞が癌化する過程においては、発現しているガングリオシドが量的および質的に変化を起こすことが明らかになった〔キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４５，２４０５（１９８５）〕。例えば、悪性度が高いといわれている神経外胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺小細胞癌およびメラノーマでは、正常細胞にはほとんど認められないガングリオシドＧＤ_２，ＧＤ_３，ＧＭ_２等が発現していることが報告されている〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１５５，１１３３（１９８２）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５７，１２７５２（１９８２）、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４７，２２５（１９８７）、同，４７，１０９８（１９８７）、同，４５，２６４２（１９８５）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８０，５３９２（１９８３）〕。
【０００６】
シアル酸をもつ糖脂質であるガングリオシドの一種であるＧＭ_２は、正常細胞にはごく微量にしか存在しないが、肺小細胞癌、メラノーマ、神経芽細胞腫などの癌細胞では多量に存在し、ＧＭ_２に対するモノクローナル抗体は、これらの癌の治療に有用であると考えられている〔ランセット（Ｌａｎｃｅｔ），４８，６１５４（１９８８）〕。しかし、現在までに報告されているＧＭ_２に対するモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＭクラスであるか、ラットＩｇＭクラス、マウスＩｇＭクラスおよびマウスＩｇＧクラスである〔キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４６，４１１６（１９８６）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７９，７６２９（１９８２）、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４８，６１５４（１９８８）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ），２６４，１２１２２（１９８９）〕。
【０００７】
抗ガングリオシドＧＭ_２モノクローナル抗体についても、ヒト型キメラ抗体あるいはＣＤＲ移植抗体等のヒト化抗体ができれば、これを使用するに際しては、患者体内で抗マウスイムノグロブリン抗体ができず、副作用が減少し、血中半減期も伸び、さらには抗腫瘍エフェクター効果も増大し、マウスモノクローナル抗体より優れた治療効果が得られると期待される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、神経外胚葉系由来の癌等の治療等に有用なガングリオシドＧＭ_２に対するヒト化抗体（以下、抗ＧＭ_２ヒト化抗体と略記する）を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、特願平０３−０７７５１８に出願されているＩｇＧ_３クラスに属するガングリオシドＧＭ_２に対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ７５０，ＫＭ７９６ならびにＩｇＭクラスに属するガングリオシドＧＭ_２に対するラットモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ６０３より抗体重鎖（以下、Ｈ鎖と略記する）可変領域（以下、Ｖ_Ｈと略記する）ｃＤＮＡおよび軽鎖（以下、Ｌ鎖と略記する）可変領域（以下、Ｖ_Ｌと略記する）ｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体Ｈ鎖定常領域（以下、Ｃ_Ｈと略記する）またはヒト抗体Ｌ鎖定常領域（以下、Ｃ_Ｌと略記する）をコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより抗ガングリオシドＧＭ_２ヒト型キメラ抗体を発現させた。そのうち配列番号１に示したアミノ酸配列のうちの１〜１２０番目のアミノ酸配列をＨ鎖可変領域に含み、配列番号２に示したアミノ酸配列のうちの１〜１０７番目のアミノ酸配列をＬ鎖可変領域に含む抗ガングリオシドＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６がガングリオシドＧＭ_２に反応し殺細胞活性を示すことを見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明はガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト化抗体に関する。本発明のヒト化抗体はいずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいがＩｇＧ型のものが好適である。本発明においてヒト化抗体とは、ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体を意味する。このうちヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌとヒトの抗体のＣ_ＨおよびＣ_Ｌとからなるヒト型キメラ抗体を意味し、ＣＤＲ移植抗体とは、ヒトの抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬのＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌにそれぞれ置換した抗体を意味する。
【００１１】
ヒト型キメラ抗体の具体例としては、抗体のＶ_Ｈが配列番号１記載のアミノ酸配列のうちの１〜１２０番目のアミノ酸配列を含み、Ｖ_Ｌが配列番号２記載のアミノ酸配列のうちの１〜１０７番目のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
ＣＤＲ移植抗体の具体例としては、抗体のＶ_ＨのＣＤＲが配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列を含み、Ｖ_ＬのＣＤＲが配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
【００１２】
ヒト化抗体のうちヒト型キメラ抗体は以下のようにして製造することができる。
（１）ヒト以外の動物の抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ＧＭ２モノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを以下のようにして取得する。
【００１３】
マウス抗ＧＭ_２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、例えば、マウス抗ＧＭ_２モノクローナル抗体ＫＭ７９６産生ハイブリドーマ細胞等よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ベクターとしてファージあるいはプラスミドを用いてライブラリーを作成する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の定常領域部分あるいは可変領域部分をプローブとして用い、Ｖ_ＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドを得、組換えファージあるいは組換えプラスミド上のＶ_ＨをコードするｃＤＮＡおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１４】
（２）ヒト型キメラ抗体発現用ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現用ベクターとは、それぞれヒトＣ_ＨおよびＣ_ＬをコードするｃＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒトＣ_ＨおよびＣ_ＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれ挿入することにより構築する。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体定常領域をコードするｃＤＮＡを組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＧＥ１０３〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４〔ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）〕、ｐＫＣＲ〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）〕、ｐＳＧ１βｄ２−４〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）〕等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１０１，１３０７（１９８７）〕、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）〕、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター〔セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）〕とエンハンサー〔セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）〕等があげられる。
【００１５】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
次に、（２）で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現用ベクターのヒト定常領域の上流に、ヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設ける。このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域の５’末端側の塩基配列とヒト以外の動物の可変領域の３’末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて挿入することにより、該合成ＤＮＡを介してヒト抗体定常領域をコードするｃＤＮＡとヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡとが結合挿入されたヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。ここで用いる合成ＤＮＡは、ヒト抗体の定常領域の５’末端側の塩基配列とヒト以外の動物の可変領域の３’末端側の塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いて製造する。
【００１６】
（４）ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターは、例えば、ヒト抗体Ｃ_ＨをコードするｃＤＮＡを、５’末端付近のＡｐａＩ部位より３’末端まで切り出し、動物細胞用発現ベクターに挿入することにより構築する。このヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターに、ヒト以外の動物のＶ_ＨをコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設け、このクローニングサイトに、ヒト抗体Ｃ_Ｈの５’末端からＡｐａＩ部位までの塩基配列とヒト以外の動物の抗体のＶ_Ｈの３’末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて、適当な制限酵素により切り出したヒト以外の動物の抗体のＶ_ＨをコードするｃＤＮＡを挿入することで、発現したときにＶ_Ｈのアミノ酸配列に変化を生じないようなヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを取得する。
【００１７】
（５）ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターは、例えば、ヒト抗体Ｃ_ＬをコードするｃＤＮＡを、５’末端付近に突然変異誘発によりＥｃｏＲＶ部位を導入し、ＥｃｏＲＶ部位より３’末端まで切り出し、プラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４等のプラスミドに挿入することにより構築する。このヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターに、ヒト以外の動物の抗体のＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設け、このクローニングサイトに、ヒト抗体Ｃ_Ｌの５’末端からＥｃｏＲＶ部位までの塩基配列とヒト以外の動物の抗体のＶ_Ｌの３’末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて、適当な制限酵素により切り出したヒト以外の動物の抗体のＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを挿入することで、発現したときにＶ_Ｌのアミノ酸配列に変化を生じないようなヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを取得する。
【００１８】
（６）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの宿主細胞への導入
ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターとヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターとを宿主細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への導入に際しては、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターにスプライシングシグナル（Ｓｐｌｉｃｉｎｇｓｉｇｎａｌ）等を導入することにより、ｍＲＮＡを安定化させることができる〔セル（Ｃｅｌｌ），１７，７３７（１９７９）〕。
【００１９】
宿主細胞への導入法としては、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターをエレクトロポレーション法〔特開平２−２５７８９１、サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）〕等により同時に宿主細胞に導入する方法とヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクター（タンデム発現ベクター）を構築し、これを宿主細胞に導入する方法〔バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，６４（１９９１）〕等があげられる。とくに、タンデム発現ベクターを用いる方法の方が、ヒト型キメラ抗体の発現量が高く、また、Ｈ鎖とＬ鎖の発現量がほぼ一致する等の理由から好ましい。
【００２０】
次に、ヒト化抗体のうち、ＣＤＲ移植抗体の製造法を説明する。
まず、ＣＤＲ移植抗体発現ベクターをＷｉｎｔｅｒらの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）〕に従って以下のようにして構築する。
ヒト以外の動物の抗体のＶ_Ｈの３つのＣＤＲのペプチド、例えば、配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするｃＤＮＡの両端にそれぞれヒト抗体のＶ_Ｈの対応するＣＤＲの両端の数個のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するように設計された３つの合成ＤＮＡをプライマーとし、ヒト抗体のＶ_Ｈを有するプラスミドを鋳型としてＤＮＡの合成を行う。ヒト抗体Ｖ_Ｈを有するプラスミドとしては、ヒト抗体ＮＥＷ由来の配列を有するＭ１３プラスミド〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ），２５３，５８５（１９７８）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）〕等があげられる。
【００２１】
得られたＤＮＡを前記したヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築法と同様にしてヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターに挿入することにより、ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築する。
同様に、ヒト以外の動物の抗体のＶ_Ｌの３つのＣＤＲのペプチド、例えば、配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするｃＤＮＡの両端にそれぞれヒト抗体のＶ_Ｌの対応するＣＤＲの両端の数個のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するように設計された３つの合成ＤＮＡをプライマーとし、ヒト抗体のＶ_Ｌを有するプラスミドを鋳型としてＤＮＡの合成を行う。ヒト抗体Ｖ_Ｌを有するプラスミドとしては、ヒトミエローマタンパク質（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓｐｒｏｔｅｉｎ）ＲＥＩ由来の配列を有するＭ１３プラスミド〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ），４５，５１３（１９７４）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）〕等があげられる。
【００２２】
得られたＤＮＡを前記したヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築法と同様にしてヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターに挿入することにより、ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築する。
また、ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターはヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖の対応するＣＤＲにそれぞれ置換したアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡを合成し、前記したヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築法と同様にしてヒト型キメラ抗体Ｈ鎖またはＬ鎖発現用ベクターに挿入することにより構築することもできる。
【００２３】
ＣＤＲ移植抗体発現ベクターは、ヒト型キメラ抗体発現べクターと同様にして宿主細胞に導入することにより、ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換株を得ることができる。
ヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１、以下ＳＰ２／０細胞と略記する）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下ｄｈｆｒと略記する）が欠損したＣＨＯ細胞〔ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６，（１９８０）〕、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２、以下ＹＢ２／０細胞と略記する）等があげられる。
【００２４】
ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８および牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地により選択する。ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株の具体例としては、ガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株であるＫＭ９６６があげられる。ＫＭ９６６は平成４年７月１５日付で、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−３９３１として寄託されている。
【００２５】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト型キメラまたはＣＤＲ移植抗体を生成蓄積させることができる。培養液中のヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体の活性は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ法：抗体実験マニュアル、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８８年）により測定する。形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系を利用して抗体の生産量を上昇させることができる。
【００２６】
ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体は、上記培養液の上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（抗体実験マニュアル、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８８年）。このようにして得られるヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体の具体例としては、ガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６等があげられる。
【００２７】
ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体の反応性はＥＬＩＳＡ法等で測定する。精製した抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）やウエスタンブロッティング法（抗体実験マニュアル、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８８年）等で測定する。ガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体の培養癌細胞株に対する結合活性は、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ法等により測定する。ヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体の培養癌細胞株に対する補体依存性殺細胞活性（ＣＤＣ活性）、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）は、免疫学実験入門（松橋ら、学会出版センター刊、１９８１年）記載の方法により測定する。
【００２８】
本発明のヒト化抗体はヒト癌細胞と特異的に結合し、ヒト癌細胞に対してＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を示すため、ヒト癌の治療等において有用である。
本発明のヒト化抗体は、単独でまたは少なくとも１種以上の製剤上許容される補助剤と共に抗腫瘍組成物として用いることができる。例えば、ヒト化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作成する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
【００２９】
本組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒト化抗体を０．２〜２０ｍｇ／ｋｇ／日投与する。投与は、一日一回（単回投与または連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、３週間に１回静脈注射により行う。
本組成物は、ヒトを含む哺乳動物のメラノーマ、神経芽細胞腫等の腫瘍の治療に効果が期待される。
【００３０】
以下に、本発明の実施例および参考例を示す。
【００３１】
【実施例】
実施例１抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体の製造
１．マウス抗ＧＭ_２モノクローナル抗体ＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０産生ハイブリドーマ細胞およびラット抗ＧＭ_２モノクローナル抗体ＫＭ−６０３産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの取得
インビトロジェン社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＦａｓｔＴｒａｃｋ（商品番号Ｋ１５９３−０２）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、マウス抗ＧＭ_２モノクローナル抗体ＫＭ−７９６産生ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭＢＰ−３３４０）、マウス抗ＧＭ_２モノクローナル抗体ＫＭ−７５０産生ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭＢＰ−３３３９）、およびラット抗ＧＭ_２モノクローナル抗体ＫＭ−６０３産生ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭＢＰ−２６３６）の１×１０^８細胞より、それぞれｍＲＮＡを取得した。
【００３２】
２．モノクローナル抗体ＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記１項で取得したＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０のｍＲＮＡの各５μｇから、ファルマシア社製のｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号２７−９２６０−０１）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、両端にＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したそれぞれのｃＤＮＡの約６μｇを１０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧ型抗体のＨ鎖に対応する約１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１ μｇ回収した。次に、各々の約１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１ μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１ μｇと、ＬａｍｂｄａＺＡＰＩＩベクター〔ＬａｍｂｄａＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏＲＩで切断後、ウシ腸アルカリフォスファターゼ（ＣａｌｆＩｎｔｅｓｔｉｎｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅで）処理したもの：ストラタジーン社製〕１ μｇをＴ４リガーゼ緩衝液１１．５μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃にて２４時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。各々の反応液のうち４μｌを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．９５、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９刊行〕に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用してラムダファージにパッケージングし、これらを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．９５−１０７、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９刊行〕に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ〔バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），５，３７６（１９８７）〕に感染させて、ＫＭ−７９６，ＫＭ−７５０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約４千個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法に従い、ニトロセルロースフィルター上に固定した〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．１１２、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９刊行〕。
【００３３】
３．ＫＭ−６０３のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記１項で取得したＫＭ−６０３のｍＲＮＡの５μｇから、ファルマシア社製のｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号２７−９２６０−０１）を用いて、両端にＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したｃＤＮＡの約６μｇを１０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＭ型抗体のＨ鎖に対応する約２．２ｋｂのｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１ μｇ回収した。次に、約２．２ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１ μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１ μｇと、ＬａｍｂｄａＺＡＰＩＩベクター〔ＬａｍｂｄａＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏＲＩで切断後、ウシ腸アルカリフォスファターゼ（ＣａｌｆＩｎｔｅｓｔｉｎｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理したもの：ストラタジーン社製〕１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液１１．５μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃にて２４時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。これら反応液のうち４μｌを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．９５、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９刊行〕に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用し、ラムダファージにパッケージングし、これを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．９５−１０７、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９刊行〕に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させて、ＫＭ−６０３のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約１万個のファージクローンを取得した。次にファージを常法に従い、ニトロセルロースフィルター上に固定した〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．１１２、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９刊行〕。
【００３４】
４．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
２項で作製したＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーより、常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．１０８、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９年刊行〕に従い、マウス免疫グロブリンの定常領域のｃＤＮＡ〔Ｈ鎖はマウスＣｒ３ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（Ｗｅｌｓら：ＥＭＢＯＪ．，３，２０４１−２０４６，１９８４）、Ｌ鎖はマウスＣｋｃＤＮＡのＨｐａＩ−ＸｈｏＩ断片（Ｈｉｅｔｅｒら：Ｃｅｌｌ，２２，１９７−２０７，１９８０）〕を^３２Ｐで標識したプローブを用いて、プローブに６５℃で強く結合したファージクローンを取得した。次に、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換し、ＫＭ−７９６のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７９６Ｈ１およびＫＭ−７９６のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７９６Ｌ１（図１）、ＫＭ−７５０のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７５０Ｈ１およびＫＭ−７５０のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７５０Ｌ１（図２）を取得した。ｐＫＭ７９６Ｈ１，ｐＫＭ７５０Ｈ１およびｐＫＭ７９６Ｌ１，ｐＫＭ７５０Ｌ１をＥｃｏＲＩを用いて切断したところ、ｐＫＭ７９６Ｈ１およびｐＫＭ７５０Ｈ１には約１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片が、ｐＫＭ７９６Ｌ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１には約０．９ｋｂのｃＤＮＡ断片がそれぞれ挿入されていた。
【００３５】
５．ＫＭ−６０３のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
上記３項で作製したＫＭ−６０３のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーより、常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、２．１０８、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９年刊行〕に従い、マウス免疫グロブリンの定常領域の染色体遺伝子〔マウスＣμ遺伝子を含む約１１．５ｋｂのＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片（Ｋａｔａｏｋａら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，９１９−９２３，１９８０）およびマウスＣｋ遺伝子を含む約３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｓａｋａｎｏら：Ｎａｔｕｒｅ，２８０，２８８，１９７９）〕を^３２Ｐで標識したプローブを用いて、プローブに６５℃で強く結合したファージクローンを取得した。次に、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換し、ＫＭ−６０３のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６０３Ｈ１およびＫＭ−６０３のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６０３Ｌ１を取得した（図３）。ｐＫＭ６０３Ｈ１およびｐＫＭ６０３Ｌ１をＥｃｏＲＩを用いて切断したところ、ｐＫＭ６０３Ｈ１には約２．０ｋｂのｃＤＮＡ断片が、ｐＫＭ６０３Ｌ１には約０．９ｋｂのｃＤＮＡ断片がそれぞれ挿入されていた。
【００３６】
６．Ｈ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域の塩基配列
上記４項および５項で得られたＨ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域の塩基配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いてダイデオキシ法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１３．４２、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８９年刊行〕により決定した。すべて５’端に開始コドンＡＴＧと推定されるメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のｃＤＮＡであった。決定された各々のｃＤＮＡの塩基配列より、ＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０、ＫＭ−６０３のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を決定した。配列番号１にＫＭ−７９６のＨ鎖、配列番号２にＫＭ−７９６とＫＭ−７５０のＬ鎖、配列番号３にＫＭ−７５０のＨ鎖、配列番号４にＫＭ−６０３のＨ鎖、配列番号５にＫＭ−６０３のＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００３７】
７．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターの構築
（１）モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを運ぶベクターｐＡＧＥ１４７の構築
特開平１−６３３９４に記載のプラスミドｐＰＭＯＬ１の２μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＳｍａＩを加え、３０℃で３時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムの濃度が５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを含む約０．６ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
【００３８】
次に、下記２種の合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機〔３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣｏ．，Ｌｔｄ）製〕を用いて合成した。
【００３９】
【化１】

【００４０】
得られた合成ＤＮＡの２５ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）ずつを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５ｍＭアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと略記する）からなる緩衝液１０μｌに溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼを加え、３７℃で３０分間反応させることにより５’末端をリン酸化した。
上記で得られたプラスミドｐＰＭＯＬ１由来のＣｌａＩ−ＳｍａＩＩ断片（０．６Ｋｂ）０．０５ μｇと５’末端がリン酸化された２種の合成ＤＮＡ（１ピコモルずつ）およびＨｉｎｄＩＩＩリンカー（５’−ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ−３’；宝酒造社製）（１ピコモル）を６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６．６ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭＤＴＴおよび０．１ｍＭＡＴＰからなる緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）２００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収した後、２０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩおよび１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。反応をフェノール−クロロホルム抽出により停止させ、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収した。
【００４１】
一方、プラスミドｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕１μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｇ４１８耐性遺伝子およびアンピシリン（以下、Ａｐという）耐性遺伝子を含む約６．０ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
【００４２】
上記で得られたプラスミドｐＡＧＥ１０７由来ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片（６．０Ｋｂ）０．３μｇとプラスミドｐＰＭＯＬ１由来ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片（０．６３Ｋｂ）０．０１μｇを６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６．６ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭＤＴＴおよび０．１ｍＭＡＴＰからなる緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４に示したプラスミドｐＡＧＥ１４７を得た。
【００４３】
（２）β−グロブリン３’スプライシングシグナル（ＳＰ）を運ぶベクターｐＡＧＥ１４８の構築
構築したヒト型キメラ抗体発現ベクターの抗体定常領域遺伝子の下流にβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを導入するため、β−グロブリン３’スプライシングシグナルを有し、かつヒト型キメラ抗体発現ベクターと同一の遺伝子（ヒト抗体定常領域遺伝子は除く）を有するベクターであるｐＡＧＥ１４８を以下のようにして構築した。
【００４４】
特開平２−２５７８９１に記載のｐＳＥ１ＵＫ１ＳＥｄ１−３の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、２０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約６．６７ｋｂと約１．９８ｋｂのＤＮＡ断片を各々約０．２ μｇ回収した。
【００４５】
次に、（１）で得られたｐＡＧＥ１４７の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．６６ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ μｇ回収した。
【００４６】
次に、上記で得られたｐＳＥ１ＵＫ１ＳＥｄ１−３のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約６．６７ｋｂ）０．１ μｇ、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１．９８ｋｂ）０．１ μｇとｐＡＧＥ１４７のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片（約０．６６ｋｂ）０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え、４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５に示したプラスミドｐＡＧＥ１４８を得た。
【００４７】
（３）ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ７９６Ｈ１またはｐＫＭ７５０Ｈ１の抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを５’末端のＥｃｏＲＩ部位および３’末端付近のＭａｅＩＩＩ部位で切断し、配列番号１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡと共にヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１に連結させた（図６）。
【００４８】
４項で得られたｐＫＭ７９６Ｈ１およびｐＫＭ７５０Ｈ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＭａｅＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４３ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、参考例２で得られたｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約９．０ｋｂのＤＮＡ断片を約１．０ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ７９６Ｈ１またはｐＫＭ７５０Ｈ１のＥｃｏＲＩ−ＭａｅＩＩＩ断片（約０．４３ｋｂ）０．１μｇおよびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約９．０ｋｂ）０．１ μｇおよび配列番号１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡの０．３ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え、４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図６に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１を得た。
【００４９】
次に、プラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ＫＭ−７９６，ＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図７）。
ｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、（２）で得られたｐＡＧＥ１４８の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６ＨＭ１，ｐＫＭ７５０ＨＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇおよびｐＡＧＥ１４８のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図７に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１を得た。
【００５０】
（４）ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ７９６Ｌ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１の抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを５’末端のＥｃｏＲＩ部位および３’末端付近のＡｆｌＩＩＩ部位で切断し、配列番号１３に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡと共にヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣｈｉＩｇＬＡ１に連結させた（図８）。
【００５１】
ｐＫＭ７９６Ｌ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｆｌＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．３９ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、参考例１で得られたｐＣｈｉＩｇＬＡ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．６ｋｂのＤＮＡ断片を約１μｇ回収した。
【００５２】
次に、上記で得られたｐＫＭ７９６Ｌ１，ｐＫＭ７５０Ｌ１のＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片０．１ μｇおよびｐＣｈｉＩｇＬＡ１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１ μｇおよび配列番号１３に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡの０．３ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図８に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＩ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＩ１を得た。
【００５３】
次に、プラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＩ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＩ１へモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを以下の方法により導入した（図９）。
ｐＣｈｉ７９６ＬＩ１またはｐＣｈｉ７５０１ＬＩ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．２ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、参考例２で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．６ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。
【００５４】
次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６ＬＩ１またはｐＫＭ７５０ＬＩ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ μｇおよびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図９に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭ１を得た。
【００５５】
次に、プラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した（図１０）。
ｐＣｈｉ７９６ＬＭ１またはｐＣｈｉ７５０ＬＭ１の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、（２）で得られたｐＡＧＥ１４８の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６ＬＭ１またはｐＫＭ７５０ＬＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇおよびｐＡＧＥ１４８のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１０に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１を得た。
【００５６】
８．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖タンデム発現ベクターの構築
１つのベクター上にヒト型キメラ抗体のＨ鎖をコードするｃＤＮＡとＬ鎖をコードするｃＤＮＡが存在するタンデム発現ベクターを以下のようにして構築した（図１１および図１２）。
７項で得られたｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１の各３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕＩと１０単位のＳａｌＩを加えて、３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約５．９ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、特開平３−２２９７９に記載のｐＡＧＥ１０７の２ μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕＩと１０単位のＳａｌＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．３５ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ μｇ回収した。次に、ｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１またはｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片０．１ μｇとｐＡＧＥ１０７のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１１に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７およびｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７を得た。
【００５７】
次に、ｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７またはｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、２０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＣｌａＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約７．５ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、ｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１またはｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１の３μｇを３０μｌの２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化カリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、２０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＸｈｏＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約９．３ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７またはｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７のＭｌｕＩ−ＣｌａＩ断片０．１ μｇとｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１またはｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１のＭｌｕＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ μｇとを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１２に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＬ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＬ１を得た。
９．ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ６０３Ｈ１の抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを５’末端のＥｃｏＲＩ部位および３’末端付近のＳｔｙＩ部位で切断し、配列番号１４で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡと共にヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１に連結させた（図１３）。
【００５８】
５項で得られたｐＫＭ６０３Ｈ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｔｙＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、参考例２で得られたｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約９．０ｋｂのＤＮＡ断片を約１．０ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６０３Ｈ１のＥｃｏＲＩ−ＳｔｙＩ断片（約０．４ｋｂ）０．１ μｇおよびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約９．０ｋｂ）０．１ μｇおよび配列番号１４で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡの０．３ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１３に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭ１を得た。
【００５９】
次にプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図１４）。
上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＨＭ１の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。
【００６０】
次に、７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、上記で得たｐＣｈｉ６０３ＨＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇおよびｐＡＧＥ１４８のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１４に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭＳ１を得た。
【００６１】
１０．ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ６０３Ｌ１の抗体可変領域ｃＤＮＡの５’末端のＥｃｏＲＩ部位および３’末端付近のＡｆｌＩＩＩ部位で切断し、配列番号１５で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡとともにヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣｈｉＩｇＬＡ１に連結させた（図１５）。
【００６２】
５項で得られたｐＫＭ６０３Ｌ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｆｌＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、参考例１で得られたｐＣｈｉＩｇＬＡ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．６ｋｂのＤＮＡ断片を約１μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６０３Ｌ１のＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片０．１ μｇおよびｐＣｈｉＩｇＬＡ１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１ μｇおよび配列番号１５で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡの０．３ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１５に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＩ１を得た。
【００６３】
次に、プラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＩ１へモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを以下の方法により導入した（図１６）。
上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＩ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．３ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、参考例２で得られたｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．６ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＩ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ μｇおよびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１６に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭ１を得た。
【００６４】
次にプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した（図１７）。
上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＭ１の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３μｇ回収した。次に、７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８の３μｇを３０μｌの３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭＤＴＴおよび０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇおよびｐＡＧＥ１４８のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４ ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図１７に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭＳ１を得た。
【００６５】
１１．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体のＹＢ２／０細胞における発現
ＹＢ２／０細胞へのプラスミドの導入は、Ｍｉｙａｊｉらの方法に従い、エレクトロポレーション法〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３−１４０，１９９０〕にて行った。
【００６６】
８項で得られたｐＣｈｉ７５０ＨＬ１またはｐＣｈｉ７９６ＨＬ１の４μｇを４×１０^６個のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）へ導入後、４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（１０）［ＦＣＳを１０％、７．５％ＮａＨＣＯ_３を１／４０量、２００ｍＭＬ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）］に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μｌずつ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収し、抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体活性を以下に示したＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００６７】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
２ｎｇのＧＭ_２（Ｎ−アセチルＧＭ_２、ベーリンガー・マンハイム社製）またはその他のガングリオシドを５ｎｇのフォスファチジルコリン（シグマ社製）と２．５ｎｇのコレステロール（シグマ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。この溶液２０μｌまたはこの溶液の希釈液２０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、精製したマウスモノクローナル抗体または精製したヒト型キメラ抗体を５０〜１００ μｌ加え、１〜２時間室温で反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体を５０〜１００ μｌ加え、１〜２時間室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２，２’アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６− スルホン酸）二アンモニウムの５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素１μｌ／ｍｌを加えた溶液〕を５０〜１００ μｌ加えて発色させ、ＯＤ_４１５を測定した。
【００６８】
得られたクローンの中で、ＥＬＩＳＡ法で最も高い活性を示したクローンの培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体量は約１．０ μｇ／ｍｌであった。
上記抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性を示したクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、メソトレキセート（以下、ＭＴＸと略記する）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体量は約５．０ μｇ／ｍｌであった。
【００６９】
上記５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体量は約１０μｇ／ｍｌであった。ｐＣｈｉ７５０ＨＬ１およびｐＣｈｉ７９６ＨＬ１から得られた２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンをそれぞれ形質転換株ＫＭ９６６（ＫＭ−７９６由来ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６生産株）およびＫＭ９６７（ＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６７生産株）と命名した。
【００７０】
上記形質転換株ＫＭ９６６およびＫＭ９６７が抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体を発現することをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により以下のようにして確認した。
形質転換株ＫＭ９６６、ＫＭ９６７の各々をＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭ含むＧＩＴ培地（日本製薬社製）に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、１７５ｃｍ^２フラスコ（グライナー社製）に１００ｍｌずつ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収した。該培養液約１．０リットルよりアフィゲルプロテインＡＭＡＰＳ−ＩＩキット（バイオラッド社製）を用いて、精製抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体を各約５ｍｇずつ取得した。この精製抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６およびＫＭ９６７の約２μｇを、公知の方法〔レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７，６８０，（１９７０）〕に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を図１８に示した。図１８に示したように、ＫＭ９６６およびＫＭ９６７ともに還元条件下では抗体Ｈ鎖の分子量は約５０キロダルトン、抗体Ｌ鎖の分子量は約２５キロダルトンであり、正しい分子量のＨ鎖およびＬ鎖の発現が確認された。また、非還元条件下ではヒト型キメラ抗体の分子量はＫＭ９６６，ＫＭ９６７ともに約１５０キロダルトンであり、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖よりなる正しい大きさの抗体の発現が確認された。
【００７１】
１２．ＫＭ−６０３由来抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体のＹＢ２／０細胞における発現
１１項と同様にエレクトロポレーション法で９項で得られたｐＣｈｉ６０３ＨＭＳ１およびｐＣｈｉ６０３ＬＭＳ１の２μｇを４×１０^６個のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）へ導入後、４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（１０）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μｌずつ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収し、抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体活性を前記に示したＥＬＩＳＡ法で測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示したクローンの培養液中の抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体量は約０．１μｇ／ｍｌであった。
【００７２】
上記抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性を示したクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌずつ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、２〜３週間培養して、５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体量は約０．３ μｇ／ｍｌであった。
【００７３】
上記５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌずつ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、２〜３週間培養して、２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体量は約０．５ μｇ／ｍｌであった。
【００７４】
上記２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、１〜２週間培養して、５００ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５００ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体量は約１．０ μｇ／ｍｌであった。この５００ｎＭＭＴＸ耐性クローンを形質転換株ＫＭ９６８と命名した。
【００７５】
上記形質転換株ＫＭ９６８が抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体を発現することをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより以下のようにして確認した。
形質転換株ＫＭ９６８を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎＭ含むＧＩＴ培地（日本製薬社製）に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、１７５ｃｍ^２フラスコ（グライナー社製）に１００ｍｌ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収した。該培養液約３．０リットルよりアフィゲルプロテインＡＭＡＰＳ−ＩＩキット（バイオラッド社製）を用いて、精製抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体を約１ｍｇ取得した。この精製抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６８の約２ μｇを、公知の方法〔レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７，６８０，１９７０〕に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を図１９に示した。図１９に示したように、還元条件下では抗体Ｈ鎖の分子量は約５０キロダルトン、抗体Ｌ鎖の分子量は約２５キロダルトンであり、正しい分子量のＨ鎖およびＬ鎖の発現が確認された。また、非還元条件下ではヒト型キメラ抗体の分子量は約１５０キロダルトンであり、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖よりなる正しい大きさの抗体の発現が確認された。
【００７６】
１３．抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体の反応特異性
ガングリオシドＧＭ_１，Ｎ−アセチルＧＭ_２（ベーリンガー・マンハイム社製），Ｎ−グリコリルＧＭ_２，Ｎ−アセチルＧＭ_３，Ｎ−グリコリルＧＭ_３，ＧＤ_１ａ，ＧＤ_１ｂ（ヤトロン社製），ＧＤ_２，ＧＤ_３（ヤトロン社製），ＧＱ_１ｂ（ヤトロン社製）に対する抗ＧＭ_２キメラ抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果を第１表に示す。なお、ＧＭ_１とＧＤ_１ａはウシ脳より、Ｎ−グリコリルＧＭ_２とＮ− グリコリルＧＭ_３はマウス肝臓より、Ｎ−アセチルＧＭ_３はイヌ赤血球より、ＧＤ_２は培養細胞株ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣＣＣＬ１２７）よりそれぞれ公知の方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６３，１０９１５，１９８８〕に準じて精製した。
【００７７】
第１表に示したように、抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６およびＫＭ９６７はＧＭ_２に特異的に反応することが確認されたが、反応の強さは、ＫＭ９６６の方がＫＭ９６７より大きかった。一方、ＫＭ９６８（ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体）にはＧＭ_２に対する反応性は認められなかった。
【００７８】
【表１】

【００７９】
１４．抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６およびＫＭ９６７の癌細胞との反応性（蛍光抗体法）
ヒト肺小細胞癌培養細胞株ＱＧ９０〔キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４９，２６８３（１９８９）〕、ＮＣＩ−Ｈ６９（ＡＴＣＣＨＴＢ１１９）、ＮＣＩ−Ｈ１２８（ＡＴＣＣＨＴＢ１２０）、ＳＢＣ−１（ＪＣＲＢ０８１６）、ＳＢＣ−２（ＪＣＲＢ０８１７）、ＳＢＣ−３（ＪＣＲＢ０８１８）、ＳＢＣ−５（ＪＣＲＢ０８１９）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ（ＪＣＲＢ０８１２）、Ｌｕ−１３４−Ａ−Ｈ（ＪＣＲＢ０２３５）、Ｌｕ−１３９（ＲＣＢ４６９）、Ｌｕ−１３０（ＲＣＢ４６５）、Ｌｕ−１３５（ＲＣＢ４６８）、Ｌｕ−１３４−Ｂ（ＲＣＢ４６７）、Ｌｕ−１４０（ＲＣＢ４７０）、ＰＣ−６〔内藤ら、癌と化学療法，５，（ｓｕｐｐｌ．）８９，１９７８〕、ヒト肺扁平上皮癌培養細胞株ＰＣ−１〔内藤ら、癌と化学療法，５，（ｓｕｐｐｌ．）８９，１９７８〕、ＰＣ−１０〔内藤ら、癌と化学療法，５，（ｓｕｐｐｌ．）８９，１９７８〕、Ｃｏｌｏ１６〔Ｍｏｏｒら、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）３５，２６８４，１９７５〕、Ｃａｌｕ−１（ＡＴＣＣＨＴＢ５４）、ＳＫ−ＬＣ−４（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，４４４１，１９８８）、ヒト肺腺癌培養細胞株ＰＣ−７（早田ら、人癌細胞の培養，１３１，１９７５）、ＰＣ−９〔Ｋｉｎｊｏら、ブリティシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ），３９，１５，１９７９〕、ＰＣ−１２（ＡＴＣＣＣＲＬ１７２１）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ（ＪＣＲＢ００８１）、ＨＬＣ−１（ＲＣＢ０８３）、ヒト肺大細胞癌培養細胞株ＰＣ−１３（大屋ら、蛋白質核酸酵素，２３，６９７，１９７８）、Ｌｕ６５（ＪＣＲＢ００７９）、ＣＡＬＵ−６（ＡＴＣＣＨＴＢ５６）、ＳＫ−ＬＣ−６（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，４４４１，１９８８）、ヒト神経芽細胞腫培養細胞株ＹＴ−ｎｕ〔石川ら、アクタ・パソロジー・ジャパン（ＡｃｔａＰａｔｈ．Ｊａｐ．），２７，６９７，１９７７〕、ＮＡＧＡＩ〔石川ら、アクタ・パソロジー・ジャパン（ＡｃｔａＰａｔｈ．Ｊａｐ．），２９，２８９，１９７９〕、ＮＢ−１〔石川ら、アクタ・パソロジー・ジャパン（ＡｃｔａＰａｔｈ．Ｊａｐ．），２７，６９７，１９７７〕、ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣＣＣＬ１２７）、ＧＯＴＯ（ＪＣＲＢ０６１２）、ＮＢ−９（ＲＣＢ４７７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣＨＴＢ１０）、ヒト脳腫瘍（グリオーマ）培養細胞株Ｐ１２２（ＥＭＢＯＪ．，６，２９３９，１９８７）、Ａ１７２（ＡＴＣＣＣＲＬ１６２０）、Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６９０）、Ｕ−１１８ＭＧ（ＡＴＣＣＨＴＢ１５）、ヒト白血病培養細胞株ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０．１）、ＡＴＮ−１、Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）、ＨＰＢ−ＡＬＬ（大屋ら、蛋白質核酸酵素，２３，６９７，１９７８）、ＣＣＲＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）、ＫＯＰＮ−Ｋ（羽井、肺癌，２５，５２４，１９８５）、ＴＹＨ〔原中ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ），３６，３１３，１９８５〕、ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５２）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）、ＴＡＬＬ−１（ＪＣＲＢ００８６）、ＮＡＬＬ−１（大屋ら、蛋白質核酸酵素，２３，６９７，１９７８）、ＣＣＲＦ−ＳＢ（ＪＣＲＢ００３２）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）、ＨＥＬ９２−１−７（ＡＴＣＣＴＩＢ１８０）、ヒト悪性黒色腫培養細胞株Ｃ２４・２２（特願平３−３１４９８１）、ＫＨｍ−３／Ｐ（Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，５９，７７５，１９７７）、Ｇ３６１（ＡＴＣＣＣＲＬ１４２４）のそれぞれ１ｘ１０^６個をＰＢＳに懸濁させ、マイクロチューブ（トレフ社製）にとり遠心分離（３０００ｒｐｍ、２分）して細胞を洗浄後、ＫＭ９６６またはＫＭ９６７を５０μｌ（５０μｇ／ｍｌ）加えて攪拌し、４℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、フルオレッセインイソシアネートで蛍光標識したプロテインＡ（３０倍希釈、ベーリンガーマンハイム山之内社製）２０μｌを加えて攪拌後、４℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、さらにＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳＥｌｉｔｅ（コールター社製）で解析を行った。対照としてヒト型キメラ抗体無添加で上記と同様の操作を行い解析した。その結果を第２表に示した。ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６は肺小細胞癌株の１４例中９例（ＮＣＩ−Ｈ１２８、ＳＢＣ−１、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、Ｌｕ−１３９、Ｌｕ−１３０、Ｌｕ−１３５、Ｌｕ−１３４−Ｂ、Ｌｕ−１４０）、肺扁平上皮癌株の５例中２例（ＰＣ−１０、Ｃａｌｕ−１）、肺腺癌株の５例中２例（ＰＣ−９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）、肺大細胞癌株の４例中２例（ＰＣ−１３、ＳＫ−ＬＣ−６）、神経芽細胞腫株の７例中７例（ＹＴ−ｎｕ、ＮＡＧＡＩ、ＮＢ−１、ＩＭＲ３２、ＧＯＴＯ、ＮＢ−９、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）、脳腫瘍（グリオーマ）株の４例中４例（Ｐ１２２、Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ、Ｕ−１１８ＭＧ）と反応を示した。一方、ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６７はいずれの培養細胞株とも反応しなかった。以上の結果は、ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６が脳腫瘍、末梢神経系腫瘍および肺癌の診断、治療等に有用であることを示している。
【００８０】
【表２】

【００８１】
１５．抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果：補体依存性細胞障害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）
（１）標的細胞の調製
１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した標的細胞ＳＢＣ−３、Ｌｕ−１３５、ＰＣ−１０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ、ＰＣ−１３、ＮＡＧＡＩ、ＧＯＴＯおよびＡ１７２をそれぞれ５ ×１０^６個／ｍｌになるように調製し、Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４を１００ μＣｉ／５ｘ１０^６個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培地で３回洗浄した。次いで４℃で３０分間培地中に放置し、自然解離させ、遠心分離後、培地を加え１ ×１０^６個／ｍｌに調製した。
【００８２】
（２）補体の調製
３人の健常人の血清を混合し、ヒト補体源として用いた。
【００８３】
（３）ＣＤＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレートに抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６および抗ＧＭ_２マウス抗体ＫＭ−６９６（ＦＥＲＭＢＰ−３３３７）を各最終濃度０．５〜５０μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ加え、各々に（１）で調製した標的細胞を５ ×１０^４個／ウェルを添加した。室温で３０分反応させ、遠心分離後、上清を除去し、（２）で得られたヒト血清（最終濃度１５％Ｖ／Ｖ）を１５０ μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。遠心分離後、上清の^５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離^５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、補体溶液の代わりに培地のみを添加し、上記と同様に上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離^５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、補体溶液の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し、上記と同様に上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＣＤＣ活性は、下式により求めた。
【００８４】
【数１】

【００８５】
その結果を図２０〜２３に示した。いずれの細胞に対してもヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６はＣＤＣ活性を示すことが示された。
【００８６】
１６．抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果：抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）
（１）標的細胞の調製
１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した標的細胞ＳＢＣ−３、Ｌｕ−１３５、ＰＣ−１０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ、ＰＣ−１３、ＮＡＧＡＩ、ＧＯＴＯおよびＡ１７２をそれぞれ１ ×１０^６個／ｍｌになるように調製し、Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４を５０μＣｉ／１ｘ１０^６個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培地で３回洗浄した。次いで４℃で３０分間培地中に放置して自然解離させ、遠心分離後、培地を加え２ ×１０^５個／ｍｌに調製した。
【００８７】
（２）エフェクター細胞の調製
ヒト静脈血２５ｍｌを採血し、ヘパリンナトリウム（武田薬品、１０００単位／ｍｌ）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａＡＳ社製）を用いて遠心分離（１５００〜１８００ｇ，３０分）してリンパ球層を分離し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回遠心分離（１５００〜１８００ｇ，１５分）して洗浄後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁（５ ×１０^６個／ｍｌ）し、エフェクター細胞とした。
【００８８】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレートに抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６および抗ＧＭ_２マウス抗体ＫＭ６９６を各最終濃度０．０５〜５ μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ加え、各々に（１）で調製した標的細胞を５０μｌ（１ ×１０^４／ウェル）および（２）で調製したエフェクター細胞を１００ μｌ（５ ×１０^５個／ウェル）添加した（エフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１）。３７℃で４時間反応させ、遠心分離後、上清の^５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離^５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わりに培地のみを添加し、上記と同様に上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離^５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し、上記と同様に上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
【００８９】
【数２】

【００９０】
結果を図２４〜２７に示した。いずれの細胞に対してもキメラ抗体ＫＭ９６６はＡＤＣＣ活性を示したが、抗ＧＭ_２マウス抗体ＫＭ−６９６は、ＡＤＣＣ活性を示さないか、または低かった。以上の結果は、ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６の方がマウス抗体ＫＭ−６９６よりもヒトの癌治療上有用なことを示している。
【００９１】
実施例２抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体の製造
１．抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡの構築
（１）抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡの構築
配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列を各々ＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列とするヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡであるｈＫＭ７９６Ｈを以下のようにして構築した。
【００９２】
各ＣＤＲを移植するヒト抗体Ｈ鎖可変領域ＤＮＡとしてはＮＥＷＭ〔バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）〕を選択し、各ＣＤＲ配列に対応する部分を配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換したＤＮＡを構築するため、配列番号２３−２９の塩基配列を有するＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成したＤＮＡの５０ｐｍｏｌｅｓを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５ｍＭＡＴＰよりなる緩衝液２０ｍｌに溶解し、５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３０分間反応させることにより５ ’末端をリン酸化した。各合成ＤＮＡは両端に制限酵素部位が存在するため、リン酸化した各合成ＤＮＡ（配列番号２３−２９）の１０ｐｍｏｌｅｓをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従って配列番号順に順次結合することにより、最終的に図５５に示したＤＮＡ、ｈＫＭ７９６Ｈを得た。ｈＫＭ７９６Ｈがコードするアミノ酸配列を配列番号３６に示した。
【００９３】
（２）抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡの構築
配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列を各々ＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列とするヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡであるｈＫＭ７９６Ｌを以下のようにして構築した。
各ＣＤＲを移植するヒト抗体Ｌ鎖可変領域ＤＮＡとしてはＲＥＩ〔バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）〕を選択し、各ＣＤＲ配列に対応する部分を配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換したＤＮＡを構築するため、配列番号３０−３５の塩基配列を有するＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成したＤＮＡの５０ｐｍｏｌｅｓを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５ｍＭＡＴＰよりなる緩衝液２０ｍｌに溶解し、５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３０分間反応させることにより５ ’末端をリン酸化した。各合成ＤＮＡは両端に制限酵素部位が存在するため、リン酸化した各合成ＤＮＡ（配列番号３０−３５）の１０ｐｍｏｌｅｓをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、配列番号順に順次結合することにより、最終的に図５６に示したＤＮＡ、ｈＫＭ７９６Ｌを得た。ｈＫＭ７９６Ｌがコードするアミノ酸配列を配列番号３７に示した。
【００９４】
２．ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターの構築
（１）ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、実施例２の１項（１）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を実施例１の７項（３）で得られたプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１に連結した（図５７）。
【００９５】
実施例１の７項（３）で得られたｐＣｈｉ７９６ＨＭ１の３ｍｇを３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＡｐａＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＮｏｔＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約９．０ｋｂのＤＮＡ断片を約２ｍｇ回収した。次に、実施例２の１項（１）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．５ｐｍｏｌｅｓと上記のｐＣｈｉ７９６ＨＭ１のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片約０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５７に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭ１を得た。
【００９６】
次に、プラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭ１へｂ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図５８）。
ｐｈＫＭ７９６ＨＭ１の３ｍｇを３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１０分間反応させ、部分消化した。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液にて溶解し、さらに１単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１０分間反応させ、部分消化した。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ｍｇ回収した。次に、実施例１の７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８の３ｍｇを３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂのＤＮＡ断片を約１ｍｇ回収した。
【００９７】
次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ｍｇとｐＡＧＥ１４８のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５８に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１を得た。
【００９８】
（２）ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、実施例２の１項（２）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡのＥｃｏＲＩ−平滑末端断片をヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣｈｉＩｇＬＡ１に連結させた（図５９）。
参考例１で得られたｐＣｈｉＩｇＬＡ１の３ｍｇを３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＥｃｏＲＶを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．６ｋｂのＤＮＡ断片を約１ｍｇ回収した。次に、実施例２の１項（２）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡのＥｃｏＲＩ−平滑末端断片０．５ｐｍｏｌｅｓと上記のｐＣｈｉＩｇＬＡ１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片約０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５９に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＩ１を得た。
【００９９】
次に、プラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＩ１へＰＭＯを以下の方法により導入した（図６０）。
ｐｈＫＭ７９６ＬＩ１の３ｍｇを３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．２ｋｂのＤＮＡ断片を約１ｍｇ回収した。次に、参考例２で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の３ｍｇを３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約０．６ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ｍｇ回収した。
【０１００】
次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＬＩ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ｍｇとｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図６０に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭ１を得た。
次に、プラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭ１へｂ−グロブリン３ ’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した（図６１）。
【０１０１】
ｐｈＫＭ７９６ＬＭ１の３ｍｇを３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ｍｇ回収した。次に、実施例１の７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８の３ｍｇを３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂのＤＮＡ断片を約１ｍｇ回収した。次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＬＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ｍｇとｐＡＧＥ１４８のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図６１に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１を得た。
【０１０２】
３．ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖タンデム発現ベクターの構築
一つのベクター上にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖をコードするｃＤＮＡとＬ鎖をコードするｃＤＮＡが存在するタンデム発現ベクターを以下のようにして構築した（図６２および図６３）。
実施例２の２項（１）で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１の３ｍｇを３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１単位のＳａｌＩを加えて、３７℃で１０分間反応させ、部分消化した。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＭｌｕＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約５．９ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ｍｇ回収した。
【０１０３】
次に、特開平３−２２９７９に記載のｐＡＧＥ１０７の２ｍｇを３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＭｌｕＩと１０単位のＳａｌＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約３．３５ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ｍｇ回収した。次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片０．１ｍｇとｐＡＧＥ１０７のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図６２に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７を得た。
【０１０４】
次に、ｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７の３ｍｇを３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＣｌａＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、２０ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＣｌａＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらにアガロース電気泳動にて分画し、約３．３５ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ｍｇ回収した。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約７．５ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ｍｇ回収した。次に、ｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１の３ｍｇを３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、２０ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＸｈｏＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて、３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約９．３ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ｍｇ回収した。次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７のＭｌｕＩ−ＣｌａＩ断片０．１ｍｇとｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１のＭｌｕＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ｍｇをＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図６３に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＬ１を得た。
【０１０５】
４．抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＹＢ２／０細胞における発現
ＹＢ２／０細胞へのプラスミドの導入は、宮地（Ｍｉｙａｊｉ）らの方法に従い、エレクトロポレーション法〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）〕にて行った。
実施例２の３項で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＬ１の４ｍｇを４ ×１０^６個のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）へ導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）〔ＦＣＳを１０％、７．５％ＮａＨＣＯ_３を１／４量、２００ｍＭＬ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）〕に懸濁し、９６ウエルマイクロタイタープレートに２００ｍｌずつ分注した。ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウエルより培養液を回収し、抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を実施例１の１１項に記載の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により測定した。得られたクローンの中で、ＥＬＩＳＡ法で最も高い活性を示したクローンの培養液中の抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体量は約０．１ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
上記抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体活性を示したクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウエルプレートに２ｍｌ分注し、ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、１〜２週間培養し、５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになったウエルより培養液を回収し、抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体量は約１．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０７】
上記５０ｎＭＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウエルプレートに２ｍｌ分注し、ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、１〜２週間培養し、２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになったウエルより培養液を回収し、抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した２００ｎＭＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ_２ヒト型ＣＤＲ移植抗体量は約５．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０８】
参考例１ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターｐＣｈｉＩｇＬＡ１の構築
１．ＫＭ５０細胞由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー遺伝子の取得
（１）ＫＭ５０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞およびラット腎臓からの染色体ＤＮＡの調製
公知の方法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ９．１６〕に従い、以下のようにして染色体ＤＮＡを調製した。
【０１０９】
ＫＭ５０細胞１．２ ×１０^８個、Ｐ３Ｕ１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９７）２ ×１０^８個、ラット腎臓（−８０ ℃で凍結後、木槌で充分たたいて砕いたもの）１．６ｇのそれぞれを２ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸，１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略記する）からなる緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、この溶液にプロテイネースＫ（シグマ社製）０．８ｍｇとラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略記する）１０ｍｇを加えて３７℃で一晩インキュベートした。次に等量のフェノールで１回、クロロホルムで２回、エーテルで１回抽出し、１０ｍＭトリス−塩酸および１ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．５）に一晩透析を行った。透析チューブよりＤＮＡ溶液を回収し、これにリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加えた。この溶液を６時間、３７℃にてインキュベートし、ＲＮＡを充分分解させた後に、１５ｍｇのＳＤＳと１ｍｇのプロテイネースＫを加え、３７℃で一晩インキュベートした。次に等量のフェノールで２回、クロロホルムで２回、エーテルで２回抽出し、１０ｍＭトリス−塩酸および１ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．５）に一晩透析を行った。透析チューブよりＤＮＡ溶液を回収して、染色体ＤＮＡサンプルとした。ＤＮＡの濃度を２６０ｎｍにおける吸光度で測定した結果、ＫＭ５０細胞１．２ ×１０^８個より１．６ｍｇ、Ｐ３Ｕ１細胞２×１０^８個より１．５ｍｇ、ラット腎臓１．６ｇより１．９ｍｇの染色体ＤＮＡがそれぞれ得られた。
【０１１０】
（２）サザンブロッティングによる、ＫＭ５０細胞中における活性型免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の同定
（１）で得られたＫＭ５０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ラット腎臓の染色体ＤＮＡの各３μｇずつを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液２５μｌに溶解し、１５単位のＸｂａＩ（宝酒造社製、以下、制限酵素は宝酒造社製を使用した）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＸｂａＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた後、サザンらの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），９８，５０３（１９７５）〕に従い、ニトロセルロースフィルターにＤＮＡをトランスファーし、常法〔亀山ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ），２４４，３０１−３０６（１９８９）〕に従って、同文献記載のマウスＪＨプローブでハイブリダイゼーションを行った。ＫＭ５０細胞のＤＮＡにおいてのみ約９．３ｋｂの位置にバンドが認められた。従って、この位置に存在する免疫グロブリンＸｂａＩ断片ＤＮＡが、ＫＭ５０細胞中における活性型免疫グロブリンＨ鎖遺伝子をコードしていると考えられる。
【０１１１】
（３）ＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡライブラリーの作製
（１）で得られたＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡ６０μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液２５０ μｌに溶解し、１５０単位のＸｂａＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＸｂａＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画後、９．３ｋｂの部分をＤＥＡＥペーパー法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ６．２４〕等を用いて、ＫＭ５０細胞の９．３ｋｂＤＮＡサンプルとして約２μｇを回収した。一方ベクターとして用いるラムダ−ＺＡＰ（ストラタジーン社製）は３μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液２００ μｌに溶解し、５０単位のＸｂａＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＸｂａＩ部位で切断した。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡを約３μｇ回収した。このＤＮＡを１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）溶液１００ μｌに溶解し、アリカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加えて、ベクターＤＮＡの制限酵素切断末端の脱リン酸化反応を行った。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡを２μｇ回収した。このＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液１０μｌに溶解しベクターＤＮＡサンプルとした。次にベクターＤＮＡサンプルを０．２μｇと、ＫＭ５０細胞の９．３ｋｂＤＮＡサンプル０．２ μｇとを、Ｔ４リガーゼ緩衝液５μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１７５単位を加えて、３日間、４℃にてインキュベートした。この混合液のうち２μｌを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．９５〕に従い、ストラタジーン社製ギガパックゴールドを使用してラムダファージにパッケージングし、これを大腸菌ＢＢ４に感染させて、２０万個のファージクローンを取得した。次にこのうち１０万個のファージを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．１１２〕に従って、ニトロセルロースフィルター上に固定した。
【０１１２】
（４）ＫＭ５０細胞中において活性型となっている（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子を含む組換えＤＮＡの選択
（３）で作製した１０万個のファージライブラリーより、亀山らの方法〔フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ），４４，３０１−３０６（１９８９）〕に従って^３２Ｐで標識したマウスＪＨプローブに、６５℃において強く会合するクローンを２個取得した。常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．１１８−２．１６９〕に従って、ファージＤＮＡを回収したところ、９．３ｋｂのＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡのＸｂａＩ断片が組み込まれていた。
【０１１３】
（５）ＫＭ５０細胞中において活性型となっている（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子の塩基配列
（４）で得られた２個のクローンについて、種々の制限酵素で消化し、制限酵素切断地図を作ったところ、全く同一のＤＮＡ断片（９．３ｋｂ）が挿入されていることが明らかとなった（図２８）。そこで次にこのＤＮＡ断片９．３ｋｂのうち、ラット免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター領域および可変領域をコードしていると考えられる部分について、サンガー法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）、Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ１３ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ〕に従って塩基配列を決定した。配列番号１６の中で、ＡＴＧＣＡＡＡＴ等のオクタマー配列およびＴＴＧＡＡＡＡ等のＴＡＴＡｂｏｘ配列を含む部分は、免疫グロブリンのプロモーター領域と考えられる部分である。
【０１１４】
２．ＫＭ５０細胞中において活性型となっている（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子のプロモーターとエンハンサーを用いた異種タンパク発現ベクターの構築
（１）ｐＫＭＢ１１の構築
１項（５）で得られた９．３ｋｂの免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子断片１μｇを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、０．８ｋｂの免疫グロブリンプロモーターを含むＤＮＡ断片を０．０１μｇ回収した。次にプラスミドｐＢＲ３２２−ＢｇｌＩＩ〔桑名（Ｋｕｗａｎａ）ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ），２１９，３６０（１９８７）〕の１μｇを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＢｇｌＩＩと１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約４．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このようにして得たｐＢＲ３２２ＢｇｌＩＩ由来の約４．２ｋｂのＤＮＡ断片（０．１μｇ）と、免疫グロブリンプロモーターを含むＤＮＡ断片０．０１μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）４１，４５９（１９６９）〕をスコット（Ｓｃｏｔｔ）らの方法〔重定勝：細胞工学２，６１６（１９８３）〕に従って形質転換し、Ａｐ耐性のコロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡを回収し、図２９に示したｐＫＭＢ１１を得た。
【０１１５】
（２）ｐＫＭＤ６の構築
免疫グロブリンプロモーター下流に適当な制限酵素部位を設けるため、（１）において構築したｐＫＭＢ１１のＮｃｏＩ部位からヌクレアーゼＢＡＬ３１を用いて消化を行った。プラスミドｐＫＭＢ１１の１０μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化カリウムからなる緩衝液１００ μｌに溶解し、３０単位のＮｃｏＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＮｃｏＩ部位で切断した。該反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱後、ＤＮＡ断片を全量１００ μｌのＢＡＬ３１緩衝液〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），６００ｍＭ塩化ナトリウム，１２ｍＭ塩化カルシウム，１２ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液〕に溶解し、０．２５単位のＢＡＬ３１〔ベセスダリサーチラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製〕を加え、３７℃で５秒間反応を行った。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡを１μｇ回収した。このＤＮＡ０．１μｇと合成ＤＮＡリンカーＳａｌＩ０．０１ μｇとをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株をスコットらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡを回収し、図３０に示したｐＫＭＤ６を得た。このプラスミドのうち、ＢＡＬ３１にて消化を行った部分について、サンガー法に従って塩基配列を決定したところ免疫グロブリンの開始コドンＡＴＧの上流に向かって３番目の塩基（配列番号１６で３０３番目の塩基）まで除かれていた。
【０１１６】
（３）ｐＥＰＫＭＡ１，ｐＥＰＫＭＢ１，ｐＡＧＥ５０１の構築
免疫グロブリンの本来のプロモーターとエンハンサーは、その位置が離れている。従って異種タンパクを発現させるためのベクターとして、そのプロモーターとエンハンサーを接続したベクターを作っておくことが必要となる。そのために以下の操作を行った。
【０１１７】
１項の（５）で得られた９．３ｋｂの免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子断片１μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＶと１０単位のＸｂａＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＥｃｏＲＶ部位とＸｂａＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約１ｋｂの免疫グロブリンエンハンサー領域を含むＤＮＡ断片を０．１ μｇ回収した。一方（２）で得たプラスミドｐＫＭＤ６の１μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液１００ μｌに溶解し、１０単位のＢｇｌＩＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＢｇｌＩＩ部位で切断した。フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を加え、１６℃で９０分間反応させ、ＢｇｌＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ断片を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約０．８ｋｂの免疫グロブリンプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を０．１ μｇ回収した。次にプラスミドｐＵＣ１８〔メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソッド・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０１，２０（１９８３）〕の０．２ μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩと１０単位のＸｂａＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を０．１ μｇ回収した。このようにして得たｐＰＫＭＤ６由来の０．８ｋｂのＤＮＡ断片（０．１μｇ）と、免疫グロブリンエンハンサー領域を含むＤＮＡ断片０．０２μｇと、ｐＵＣ１８の０．１ μｇとを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡを回収し、図３１に示したｐＥＰＫＭＡ１を得た。
【０１１８】
次に、プラスミドｐＥＰＫＭＡ１の１μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液１００ μｌに溶解し、１０単位のＸｂａＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＸｂａＩ部位で切断した。フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で９０分間反応させ、ＸｂａＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片と合成ＤＮＡリンカーＸｈｏＩ（宝酒造社製）の０．０１μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡを回収し、図３２に示したｐＥＰＫＭＢ１を得た。
【０１１９】
次に、動物細胞用異種遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ１０７〔宮地（Ｍｉｙａｊｉ）ら、サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３，１３３−１４０（１９９０）〕のＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域（Ｐ_ＳＥと略記する）を、ｐＥＰＫＭＢ１の持つＫＭ５０由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー（Ｐ_ＩＨと略記する）に以下に示す方法により変換した。
【０１２０】
プラスミドｐＡＧＥ１０７の１μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＳａｌＩと１０単位のＸｈｏＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＳａｌＩ部位とＸｈｏＩ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約５．９５ｋｂのＧ４１８耐性遺伝子等を含むＤＮＡ断片を０．５ μｇ回収した。次に、プラスミドｐＥＰＫＭＢ１の１μｇを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌに溶解し、１０単位のＳａｌＩと１０単位のＸｈｏＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＳａｌＩ部位とＸｈｏＩ部位で切断した。該反応液をアガローズゲル電気泳動後、約１．７ｋｂの免疫グロブリンプロモーターおよびエンハンサー領域を含むＤＮＡ断片を０．１ μｇ回収した。このようにして得たｐＡＧＥ１０７由来の５．９５ｋｂのＤＮＡ断片（０．１μｇ）と、免疫グロブリンプロモーターおよびエンハンサー領域を含むＤＮＡ断片０．０２μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡを回収し、図３３に示したｐＡＧＥ５０１を得た。
【０１２１】
（４）ｐＡＧＥ１０９の構築
ｐＡＧＥ１０６に２つあるＥｃｏＲＩ切断部位の１つが除去されたプラスミドｐＡＧＥ１０９を以下のように構築した。
【０１２２】
特開平３−２２９７９に記載の動物細胞用異種遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ１０６の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩとＳａｃＩをそれぞれ加え、３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切断したＳＶ４０初期遺伝子プロモーターおよびＧ４１８耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ１０６のＤＮＡ断片（４．３ｋｂ）を約１．５ μｇ回収した。次にこのＤＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩラージ断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＳａｃＩ消化によって生じた３’突出末端と、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出後、エタノールで沈澱させ、２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この混合溶液に更に３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で４時間反応を行った。このようにして得た組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図３４に示したプラスミドｐＡＧＥ１０９を得た。
【０１２３】
（５）ｐＡＧＥ５０２の構築
ｐＡＧＥ１０７のＳＶ４０のプロモーターとエンハンサーを免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターとエンハンサーに変換するために、プラスミドｐＡＧＥ５０２を以下のように構築した。
【０１２４】
特開平３−２２９７９記載のｐＡＧＥ１０７の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＧ４１８耐性遺伝子とＡｐ耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ１０７のＤＮＡ断片（約５．９５ｋｂ）を約１．５ μｇ回収した。
【０１２５】
次に（３）で得られたｐＡＧＥ５０１の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１７５ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＳａｌＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＳａｌＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＸｈｏＩとＳａｌＩで切断したＫＭ５０細胞の免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー遺伝子を含むｐＡＧＥ５０１のＤＮＡ断片（１．８ｋｂ）を約０．２ μｇ回収した。
【０１２６】
次に上記で得られたｐＡＧＥ１０７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片（約５．９５ｋｂ）０．１μｇと、ｐＡＧＥ５０１のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片（約１．８ｋｂ）０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図３５に示したプラスミドｐＡＧＥ５０２を得た。
【０１２７】
（６）ｐＡＧＥ５０３の構築
ｐＡＧＥ５０２に２つあるＥｃｏＲＩ切断部位の１つが除去されたプラスミドｐＡＧＥ５０３を以下のように構築した。
【０１２８】
（４）で得られたｐＡＧＥ１０９の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩと１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＣｌａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したベーターグロビンとＳＶ４０初期遺伝子のポリＡシグナル遺伝子を含むｐＡＧＥ１０９のＤＮＡ断片（約１ｋｂ）を約０．２ μｇ回収した。
【０１２９】
次に（５）で得られたｐＡＧＥ５０２の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩと１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩで切断したＫＭ５０細胞の免疫グロブリンＨ鎖プロモーター、エンハンサー遺伝子、Ａｐ耐性遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ５０２のＤＮＡ断片（約６．１ｋｂ）をＤＥＡＥペーパー法にて約１μｇ回収した。次に上記で得られたｐＡＧＥ１０９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片（約１ｋｂ）０．１ μｇと、ｐＡＧＥ５０２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片（約６．１ｋｂ）０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図３６に示したプラスミドｐＡＧＥ５０３を得た。
【０１３０】
（７）ｐＳＥ１ｄ１の構築
ｐＡＧＥ１０７にｄｈｆｒ遺伝子が導入されたプラスミドｐＳＥ１ｄ１を以下のように構築した。
【０１３１】
特開平３−２２９７９記載のｐＡＧＥ１０７の２μｇを１００ μｌの１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノ−ル−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＧ４１８耐性遺伝子とＡｐ耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ１０７のＤＮＡ断片（約５．６ｋｂ）を約１．５ μｇ回収した。
【０１３２】
次にｐＳＶ２−ｄｈｆｒ〔スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）ら，モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ）１，８５４（１９８１）〕の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＢｇｌＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱を行い、次に全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＢｇｌＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したデハイドロフォレートレダクターゼ（以下ｄｈｆｒと略記する）遺伝子を含むｐＳＶ２−ｄｈｆｒＤＮＡ断片（０．７６ｋｂ）を約０．２ μｇ回収した。
【０１３３】
次に上記で得られたｐＡＧＥ１０７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約５．６ｋｂ）０．１ μｇと、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約０．７６ｋｂ）０．１μｇとを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図３７に示したプラスミドｐＳＥ１ｄ１を得た。
【０１３４】
（８）ｐＳＥ１ｄ２の構築
ｐＳＥ１ｄ１のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が除去されたプラスミドｐＳＥ１ｄ２を以下のように構築した。
【０１３５】
（７）で得られたｐＳＥ１ｄ１の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図３８に示したプラスミドｐＳＥ１ｄ２を得た。
【０１３６】
（９）ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２の構築
ｐＡＧＥ５０３にｄｈｆｒ遺伝子が導入されたプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２を以下のように構築した。
【０１３７】
（６）で得られたｐＡＧＥ５０３の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＣｌａＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＣｌａＩとＭｌｕＩで切断したＫＭ５０免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサーを含むｐＡＧＥ５０３のＤＮＡ断片（約５．４ｋｂ）を約１μｇ回収した。
【０１３８】
次に（８）で得られたｐＳＥ１ｄ２の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＸｈｏＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＸｈｏＩとＭｌｕＩで切断したｄｈｆｒ遺伝子を含むｐＳＥ１ｄ２のＤＮＡ断片（約３．８ｋｂ）を約１μｇ回収した。
【０１３９】
次に上記で得られたｐＡＧＥ５０３のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（約５．４ｋｂ）１ μｇと、ｐＳＥ１ｄ２のＸｈｏＩ−ＭｌｕＩ断片（約３．８ｋｂ）１μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図３９に示したプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２を得た。
【０１４０】
（１０）ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３の構築
ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２のＡｐａＩ切断部位が除去されたプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３を以下のように構築した。
【０１４１】
（９）で得られたｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２の２μｇを１００ μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および６ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＡｐａＩ消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４０に示したプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３を得た。
【０１４２】
（１１）ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４の構築
ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位の間にクローニングサイトを設けるために、配列番号１７で示した合成ＤＮＡを挿入したプラスミドであるｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４を以下のように構築した。
【０１４３】
（１０）で得られたｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したＫＭ５０細胞の免疫グロブリンＨ鎖プロモーター、エンハンサー、Ａｐ耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を含むｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３のＤＮＡ断片（約９．２ｋｂ）を約１μｇ回収した。
【０１４４】
次に上記で得られたｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約９．２ｋｂ）０．１ μｇと、合成ＤＮＡ（配列番号１７）の１０ｎｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４１に示したプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４を得た。
【０１４５】
３．モロニーマウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）（以下、ＭｏＬＴＲと略記する）の調製
ＭｏＬＴＲはプロモーターおよびエンハンサー活性を有することが知られている〔桑名ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）〕。そこで、ＭｏＬＴＲをヒト型キメラ抗体発現用ベクターのプロモーターおよびエンハンサーとして用いるために、ＭｏＬＴＲを有するプラスミドｐＰＭＯＬ３を以下に示す方法により調製した。
【０１４６】
特開平１−６３３９４記載のｐＰＭＯＬ１の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＣｌａＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡ断片を２μｇ回収した。このＤＮＡ断片と合成ＤＮＡリンカーＸｈｏＩ（宝酒造社製）の０．０１μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４２に示したプラスミドｐＰＭＯＬ２を得た。次に、ｐＰＭＯＬ２の３ μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭ塩化ナトリウムおよび６ｍＭ２ −メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＳｍａＩを加えて３７℃４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡ断片を２μｇ回収した。このＤＮＡ断片と合成ＤＮＡリンカーＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）の０．０１μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４３に示したプラスミドｐＰＭＯＬ３を得た。
【０１４７】
４．ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＨ鎖定常領域（Ｃγ１）ｃＤＮＡおよびＬ鎖定常領域（Ｃκ）ｃＤＮＡのクローニング
（１）キメラ抗体産生細胞ＳＰ２−ＰＣＣｈｉｍｅｒａ−１からのｍＲＮＡの取得
インビトロジェン社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＦａｓｔＴｒａｃｋ（商品番号Ｋ１５９３−０２）を用いて、抗フォスフォリルコリン活性を有するキメラ抗体産生細胞でフェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ），２４４，３０１−３０６（１９８９）に記載されているキメラ抗体産生細胞ＳＰ２−ＰＣＣｈｉｍｅｒａ−１の１×１０^８細胞より、ｍＲＮＡを６．２ μｇ取得した。
（２）ＳＰ２−ＰＣＣｈｉｍｅｒａ−１ｃＤＮＡライブラリーの作製とヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域（Ｃγ１）ｃＤＮＡおよびＬ鎖定常領域（Ｃκ）ｃＤＮＡのクローニング
（１）で得られたｍＲＮＡの２μｇから、ファルマシア社製のｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号２７−９２６０−０１）を用いて、ＥｃｏＲＩアダプターを付与した後、カイネーションを行った。得られたｃＤＮＡ溶液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、４μｇのｃＤＮＡを回収した。このｃＤＮＡを２０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約１．８ｋｂと約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ約０．３ μｇ回収した。
【０１４８】
次に、ベクターｐＵＣ１８の５ μｇを１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液１００ μｌに加え、更に５０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で４時間反応させ、ｐＵＣ１８のＤＮＡ中のＥｃｏＲＩ部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８のＤＮＡ断片を約３μｇ回収した。
【０１４９】
次に上記で得られたｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ断片（約２．７ｋｂ）０．１ μｇと、ＳＰ２−ＰＣＣｈｉｍｅｒａ−１細胞より調製した１．８ｋｂおよび１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片各０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で２４時間反応させた。
このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＬＥ３９２株を形質転換した。得られた約３０００個のコロニーをニトロセルロースフィルター上に固定した。亀山らによって単離されたヒト免疫グロブリン定常領域の染色体遺伝子（ＩｇＧ１のＨ鎖の定常領域であるＣγ１と、Ｌ鎖の定常領域であるＣκ）〔亀山ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，２４４，３０１（１９８９）〕を^３２Ｐで標識したプローブに６５℃で強く会合した菌株のうちＣγ１と会合するもの１個（ｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１）、Ｃκと会合するもの１個（ｐＰＣＶＬｈＣＫ１）をそれぞれ得た。
【０１５０】
（３）ヒトＩｇκ鎖定常領域へのＥｃｏＲＶ部位の導入
プロメガ社製のキット（カタログ番号Ｑ６２１０）を用いた部位特異的変異導入法によりヒトＩｇκ鎖定常領域５’末端近傍領域にＥｃｏＲＶ部位を導入した。プラスミドｐＰＣＶＬｈＣＫ１の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断したヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域遺伝子を含むｐＰＣＶＬｈＣＫ１のＤＮＡ断片（約０．８ｋｂ）を約０．２ μｇ回収した。
【０１５１】
次にｐＳＥＬＥＣＴ１（プロメガ社製のキット：カタログ番号Ｑ６２１０）の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩとで切断したｐＳＥＬＥＣＴ１のＤＮＡ断片（約５．７ｋｂ）を約１μｇ回収した。
【０１５２】
次に上記で得られたｐＰＣＶＬｈＣＫ１のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（約０．８ｋｂ）０．１ μｇと、ｐＳＥＬＥＣＴ１のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（約５．７ｋｂ）０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、図４４に示したプラスミドｐｃｈＣＫＡ７を得た。
【０１５３】
次にｐｃｈＣＫＡ７を用いて、配列番号１８の合成ＤＮＡを変異導入プライマーとして使用して、ヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域のＮ末端から１２ベース目より１４ベース目までのＡＣＣ配列をＧＡＴに変換することにより、その部位にＥｃｏＲＶ部位を導入したプラスミドｐｃｈＣＫＢ１を構築した（図４５）。
次に、ｐｃｈＣＫＢ１のＥｃｏＲＶ部位をＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に変換するために、以下の操作を行った。
【０１５４】
プラスミドｐｃｈＣＫＢ１の２μｇを１０μｌの１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌのＤＮＡポリメラ−ゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、３７℃で３０分間反応させ、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物を該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、更に０．１ μｇのＨｉｎｄＩＩＩリンカー（宝酒造社製）を加えて２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加えて４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４６に示したプラスミドｐｃｈＣＫＣ１を得た。
【０１５５】
５．ヒト型キメラ抗体発現用ベクターの構築
（１）ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築するために用いるベクター（ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクター）の構築
２項（１１）で得たｐＩｇ１ＳＥＩｄ４の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＶとＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＶとＡｐａＩで切断した９．２ｋｂのｐＩｇ１ＳＥＩｄ４のＤＮＡ断片（約９．２ｋｂ）を約１．５ μｇ回収した。
【０１５６】
次に４項（２）で得たｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および６ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＡｐａＩと１０単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＡｐａＩとＳｍａＩで切断したヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域遺伝子を含むｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１のＤＮＡ断片（約１ｋｂ）を約０．２ μｇ回収した。
【０１５７】
次に上記で得られたｐＩｇ１ＳＥＩｄ４のＥｃｏＲＶ−ＡｐａＩ断片（約９．２ｋｂ）０．１ μｇと、ｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１のＡｐａＩ− ＳｍａＩ断片（約１ｋｂ）０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４７に示すヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターｐＣｈｉＩｇＨＢ２を得た。
【０１５８】
（２）ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築するために用いるベクター（ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクター）の構築
２項（１１）で得られたｐＩｇ１ＳＥＩｄ４の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＶと１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＩｇ１ＳＥＩｄ４のＤＮＡ断片（約９．２ｋｂ）を約１．５ μｇ回収した。
【０１５９】
次に４項（３）で得られたｐｃｋＣＫＣ１の２μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＶと１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で１時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで切断したヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域遺伝子を含むｐＰＣＶＬｈＣＫ１のＤＮＡ断片（約０．６ｋｂ）を約０．２ μｇ回収した。
【０１６０】
次に上記で得られたｐＩｇ１ＳＥＩｄ４のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約９．２ｋｂ）０．１ μｇと、ｐｃｈＣＫＣ１のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約０．６ｋｂ）０．１ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図４８に示したヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクタｐＣｈｉＩｇＬＡ１を得た。
【０１６１】
参考例２ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の構築
１．マウス抗ＧＤ_３モノクローナル抗体ＫＭ−６４１産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの取得
インビトロジェン社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＦａｓｔＴｒａｃｋ（商品番号Ｋ１５９３−０２）を用いて、参考例１で得られるマウス抗ＧＤ_３モノクローナル抗体ＫＭ−６４１産生ハイブリドーマ細胞の１×１０^８細胞より、ｍＲＮＡを３４μｇ取得した。
２．ＫＭ−６４１のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
１項で取得したｍＲＮＡの３μｇから、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）を用い、５’末端にＥｃｏＲＩアダプター、３’末端にＸｈｏＩアダプターを有するｃＤＮＡをそれぞれ合成した。このｃＤＮＡ約６μｇを１０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｈ鎖に対応する約１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１ μｇ回収した。次に、約１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１ μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１ μｇと、ベクターとして用いるＵｎｉ−ＺＡＰＸＲ（ストラタジーン社製、ＬａｍｂｄａＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断後、ＣａｌｆＩｎｔｅｓｔｉｎｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅで処理したもの）１ μｇをＴ４リガーゼ緩衝液１１．５μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃にて１晩インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。この反応液のうち４μｌを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．９５〕に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用し、ラムダファージにパッケージングし、これを常法〔Ｍａｎｉａｔｉｓら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．９５−１０７〕に従って、大腸菌株ＰＬＫ−Ｆに感染させて、Ｈ鎖のｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖のｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約１万個のファージクローンを取得した。次に常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．１１２〕に従い、ファージをニトロセルロースフィルター上に固定した。
【０１６２】
３．モノクローナル抗体ＫＭ−６４１のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
２項で作製したＨ鎖のｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖のｃＤＮＡライブリーより、常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ２．１０８〕に従い、マウス免疫グロブリン定常領域の染色体遺伝子であるマウスＣγ１遺伝子を含む約６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片〔Ｒｏｅｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，４７４（１９８１）〕およびマウスＣκ遺伝子を含む約３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ２８０，２８８（１９７９）を^３２Ｐで標識したプローブを用いて、プローブに６５℃で強く会合したファージクローンをそれぞれ１個ずつ取得した。次に、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換し、ＫＭ−６４１のＨ鎖のｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３およびＫＭ−６４１Ｌ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６４１ＬＡ２をそれぞれ取得した。ｐＫＭ６４１ＨＡ３およびｐＫＭ６４１ＬＡ２をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩを用いて切断したところ、それぞれ約１．６ｋｂおよび約０．９ｋｂのｃＤＮＡ断片が挿入されていた（図４９）。
【０１６３】
４．ＫＭ−６４１のＨ鎖ｃＤＮＡ（ｐＫＭ６４１ＨＡ３）およびＫＭ−６４１のＬ鎖ｃＤＮＡ（ｐＫＭ６４１ＬＡ２）の免疫グロブリン可変領域の塩基配列
３項で得られたｐＫＭ６４１ＨＡ３およびｐＫＭ６４１ＬＡ２の免疫グロブリン可変領域の塩基配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いてダイデオキシ法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、１９８９年、ｐ１３．４２〕により決定した。その結果を配列番号１９および配列番号２０に示した。ｐＫＭ６４１ＬＡ２は、５’端付近に開始コドンＡＴＧと推定されるメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のｃＤＮＡであった。ｐＫＭ６４１ＨＡ３は、５’端付近に開始コドンと推定されるメチオニンが存在せず、リーダー配列が一部欠損していた。
５．ＫＭ−６４１由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
プラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３の可変領域遺伝子の５’末端付近のＡｌｕＩ部位および可変領域遺伝子の３’末端付近のＳｔｙＩ部位で切断して得られるＨ鎖可変領域遺伝子を配列番号２１および２２に示す合成ＤＮＡを用いて参考例１で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターと連結させることにより、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図５０）。
【０１６４】
まず、ｐＫＭ６４１ＨＡ３の免疫グロブリンＨ鎖可変領域の３’末端から３’末端付近にあるＳｔｙＩ切断部位までの塩基配列と、ｐＡＧＥ２８の免疫グロブリンＨ鎖定常領域の５’末端から５’末端付近にあるＡｐａＩ切断部位までの塩基配列とからなり、ＳｔｙＩ切断部位とＡｐａＩ切断部位を両端に有する配列番号２２に示したＤＮＡ（図５０参照）をＤＮＡ合成機で合成した。次に、この合成ＤＮＡを以下に示す方法で、プラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３に導入した。
【０１６５】
ｐＫＭ６４１ＨＡ３の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｔｙＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４１ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、ｐＡＧＥ２８〔水上ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７−１３１０（１９８７）〕の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、２．４５ｋｂのＤＮＡ断片を約２μｇ回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６４１ＨＡ３のＥｃｏＲＩ−ＳｔｙＩ断片（約０．４１ｋｂ）０．１μｇおよびｐＡＧＥ２８のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約２．４５ｋｂ）０．１μｇおよび配列番号２２に示す合成ＤＮＡの０．３ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５１に示したプラスミドｐＫＭ６４１ＨＥ１を得た。
【０１６６】
ｐＫＭ６４１ＨＥ１はリーダー配列が欠損しているため、それを補填するために配列番号２１に示した合成ＤＮＡを用いて以下の操作を行った。
ｐＫＭ６４１ＨＥ１の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４２ｋｂのＤＮＡ断片を約０．４ μｇ回収した。ｐＫＭ６４１ＨＥ１のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約０．４２ｋｂ）０．４μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＡｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。
【０１６７】
次に、上記で得られたｐＫＭ６４１ＨＥ１のＡｌｕＩ−ＡｐａＩ断片（約０．４ｋｂ）０．１ μｇおよびｐＡＧＥ２８のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約２．４５ｋｂ）０．１μｇおよび配列番号２１に示す合成ＤＮＡの０．３ μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５２に示したプラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１を得た。
【０１６８】
次に、ｐＫＭ６４１ＨＦ１の免疫グロブリンＨ鎖可変領域をヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターｐＣｈｉＩｇＨＢ２に導入するために以下の操作を行った。
ｐＫＭ６４１ＨＦ１の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロ−スゲル電気泳動にて分画し、０．４４ｋｂのＤＮＡ断片を約０．５ μｇ回収した。次に、ｐＣｈｉＩｇＨＢ２の３μｇを３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），７ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、約３ μｇのＤＮＡを回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６４１ＨＦ１のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約０．４４ｋｂ）０．１μｇおよびｐＣｈｉＩｇＨＢ２のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約１０．１ｋｂ）０．１μｇを全量２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５３に示したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡ１を得た。
【０１６９】
次に、以下に示す方法で、ｐＣｈｉ６４１ＨＡ１のＫＭ５０由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー領域をＭｏＬＴＲに変換した。
ｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の３μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．８ｋｂのＤＮＡ断片を約０．２ μｇ回収した。実施例１の２で得られたｐＰＭＯＬ３の３ μｇを３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＭｏＬＴＲを含む０．６３ｋｂのＤＮＡ断片を約０．３ μｇ回収した。次に、ｐＣｈｉ６４１ＨＡ１のＥｃｏＲＩ− ＸｈｏＩ断片０．１ μｇおよびｐＰＭＯＬ３のＥｃｏＲＩ− ＸｈｏＩ断片０．１ μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、図５４に示したＫＭ−６４１由来ヒト型キメラＨ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１を得た。
【０１７０】
【発明の効果】
本発明により、ガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト化抗体が提供される。
【０１７１】
【配列表】

【０１７２】

【０１７３】

【０１７４】

【０１７５】

【０１７６】

【０１７７】

【０１７８】

【０１７９】

【０１８０】

【０１８１】

【０１８２】

【０１８３】

【０１８４】

【０１８５】

【０１８６】

【０１８７】

【０１８８】

【０１８９】

【０１９０】

【０１９１】

【０１９２】

【０１９３】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】

【０１９７】

【０１９８】

【０１９９】

【０２００】

【０２０１】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】

【０２０５】

【０２０６】

【図面の簡単な説明】
【図１】はプラスミドｐＫＭ７９６Ｈ１およびｐＫＭ７９６Ｌ１を示した図である。
【図２】はプラスミドｐＫＭ７５０Ｈ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１を示した図である。
【図３】はプラスミドｐＫＭ６０３Ｈ１およびｐＫＭ６０３Ｌ１を示した図である。
【図４】はプラスミドｐＡＧＥ１４７の造成工程を示した図である。
【図５】はプラスミドｐＡＧＥ１４８の造成工程を示した図である。
【図６】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１の造成工程を示した図である。
【図７】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１の造成工程を示した図である。
【図８】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＩ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＩ１の造成工程を示した図である。
【図９】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭ１の造成工程を示した図である。
【図１０】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１の造成工程を示した図である。
【図１１】はプラスミドｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７およびｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７の造成工程を示した図である。
【図１２】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＬ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＬ１の造成工程を示した図である。
【図１３】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭ１の造成工程を示した図である。
【図１４】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭＳ１の造成工程を示した図である。
【図１５】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＩ１の造成工程を示した図である。
【図１６】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭ１の造成工程を示した図である。
【図１７】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭＳ１の造成工程を示した図である。
【図１８】は精製した抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６およびＫＭ９６７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が還元条件、右側が非還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンの左側より、低分子マーカー、ＫＭ９６７、ＫＭ９６６（還元条件）、ＫＭ９６７、ＫＭ９６６（非還元条件）の泳動パターンをぞれぞれ示した。
【図１９】は精製した抗ＧＭ_２ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が還元条件、右側が非還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンの左側より、高分子量マーカー、低分子マーカー、ヒトＩｇＧスタンダード、ＫＭ９６８（還元条件）、低分子マーカー、ヒトＩｇＧスタンダード、ＫＭ９６８（非還元条件）の泳動パターンをぞれぞれ示した。
【図２０】はヒト肺小細胞癌株ＳＢＣ−３およびＬＵ−１３５に対するＫＭ９６６のＣＤＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＣＤＣ活性をそれぞれ示す。
【図２１】はヒト肺扁平上皮癌株ＰＣ−１０およびヒト肺腺癌株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳに対するＫＭ９６６のＣＤＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＣＤＣ活性をそれぞれ示す。
【図２２】はヒト肺大細胞癌株ＰＣ−１３およびヒト神経芽細胞腫株ＮＡＧＡＩに対するＫＭ９６６のＣＤＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＣＤＣ活性をそれぞれ示す。
【図２３】はヒト神経芽細胞腫ＧＯＴＯおよびヒト脳腫瘍株Ａ１７２に対するＫＭ９６６のＣＤＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＣＤＣ活性をそれぞれ示す。
【図２４】はヒト肺小細胞癌株ＳＢＣ−３およびＬＵ−１３５に対するＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２５】はヒト肺扁平上皮癌株ＰＣ−１０およびヒト肺腺癌株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳに対するＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２６】はヒト肺大細胞癌株ＰＣ−１３およびヒト神経芽細胞腫株ＮＡＧＡＩに対するＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２７】はヒト神経芽細胞腫ＧＯＴＯおよびヒト脳腫瘍株Ａ１７２に対するＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２８】は９．３ｋｂのＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡのＸｂａＩ断片の制限酵素切断地図を示した図である。
【図２９】はプラスミドｐＫＭＢ１１の造成工程を示した図である。
【図３０】はプラスミドｐＫＭＤ６の造成工程を示した図である。
【図３１】はプラスミドｐＥＰＫＭＡ１の造成工程を示した図である。
【図３２】はプラスミドｐＥＰＫＭＢ１の造成工程を示した図である。
【図３３】はプラスミドｐＡＧＥ５０１の造成工程を示した図である。
【図３４】はプラスミドｐＡＧＥ１０９の造成工程を示した図である。
【図３５】はプラスミドｐＡＧＥ５０２の造成工程を示した図である。
【図３６】はプラスミドｐＡＧＥ５０３の造成工程を示した図である。
【図３７】はプラスミドｐＳＥｄ１の造成工程を示した図である。
【図３８】はプラスミドｐＳＥ１Ｄ２の造成工程を示した図である。
【図３９】はプラスミドｐＩＧ１ＳＥ１ｄ２の造成工程を示した図である。
【図４０】はプラスミドｐＩＧ１ＳＥ１ｄ３の造成工程を示した図である。
【図４１】はプラスミドｐＩＧ１ＳＥ１ｄ４の造成工程を示した図である。
【図４２】はプラスミドｐＰＭＯＬ２の造成工程を示した図である。
【図４３】はプラスミドｐＰＭＯＬ３の造成工程を示した図である。
【図４４】はプラスミドｐｃｈＣＫＡ７の造成工程を示した図である。
【図４５】はプラスミドｐｃｈＣＫＢ１の造成工程を示した図である。
【図４６】はプラスミドｐｃｋＣＫＣ１の造成工程を示した図である。
【図４７】はプラスミドｐＣｈｉＩｇＨＢ２の造成工程を示した図である。
【図４８】はプラスミドｐＣｈｉＩｇＬＡ１の造成工程を示した図である。
【図４９】はプラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３およびｐＫＭ６４１ＬＡ２を示した図である。
【図５０】はプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の造成工程を示した図である。
【図５１】はプラスミドｐＫＭ６４１ＨＥ１の造成工程を示した図である。
【図５２】はプラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１の造成工程を示した図である。
【図５３】はプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の造成工程を示した図である。
【図５４】はプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の造成工程を示した図である。
【図５５】はＤＮＡ、ｈＫＭ７９６Ｈの造成工程を示した図である。
【図５６】はＤＮＡ、ｈＫＭ７９６Ｌの造成工程を示した図である。
【図５７】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭ１の造成工程を示した図である。
【図５８】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１の造成工程を示した図である。
【図５９】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＩ１の造成工程を示した図である。
【図６０】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭ１の造成工程を示した図である。
【図６１】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１の造成工程を示した図である。
【図６２】はプラスミドｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７の造成工程を示した図である。
【図６３】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＬ１の造成工程を示した図である。

Claims

抗体のＨ鎖可変領域が配列番号１記載のアミノ酸配列のうちの１〜１２０番目のアミノ酸配列を含み、抗体のＬ鎖可変領域が配列番号２記載のアミノ酸配列のうちの１〜１０７番目のアミノ酸配列を含むガングリオシドＧＭ_２に反応するヒト型キメラ抗体。
形質転換体FERM BP-3931が生産するヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６。
請求項１または２に記載のヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株。
請求項１または２に記載のヒト型キメラ抗体を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
配列番号１記載の１〜１２０番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
配列番号２記載の１〜１０７番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
請求項５および／または６記載のＤＮＡを含む、ＤＮＡ発現用ベクター。