WO2005035574A1

WO2005035574A1 - IgM高濃度安定化溶液

Info

Publication number: WO2005035574A1
Application number: PCT/JP2004/014935
Authority: WO
Inventors: Tomoyuki Igawa; Yasuo Sekimori
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2005-04-21
Also published as: JP4762717B2; US8920797B2; EP1688432A1; US20070212346A1; EP1688432A4; US20090285802A1; ATE518888T1; JPWO2005035574A1; EP1688432B1

Abstract

　塩化マグネシウムや塩酸アルギニン等の多価カチオン性のイオンを含む化合物を添加物として用いることによって、溶液におけるIgMの会合化を抑制し、IgMの安定な高濃度溶液を調製しうることを見出した。

Description

明細書

IgM高濃度安定ィ匕溶液

技術分野

[0001] 本発明は、 IgM高濃度安定化溶液およびその製造に関する。

背景技術

[0002] 多くの高等動物の免疫グロブリンには、 5種類の異なったクラス IgG、 IgA、 IgM, IgD 、および IgEが存在する。各クラスの免疫グロブリンは、大きさ、電荷、アミノ酸組成、糖含量等の性状が異なっている。これらのクラスの中で、 IgMは血漿免疫グロブリン全体の約 10%を占めている。 IgMは、複雑な抗原性を持つ細胞膜抗原、感染性微生物、あ ¾ ヽは溶解性抗原に対して産生される初期抗体の主成分である。

[0003] ヒ HgMは、通常、 5量体構造を有している。 IgMの 5量体構造を構成する 5つのサブユニットは、 IgGに類似した 4本鎖構造力もなつている。 IgMの H鎖である鎖は IgGの H鎖である γ鎖とアミノ酸配列が異なる以外にも次のような相違を有する。

• μ鎖は、定常領域のドメインを、 γ鎖よりも一つ余分に持っている。

• μ鎖は、オリゴ糖鎖の数が γ鎖と比較して 4箇所多い。

[0004] IgMは、 IgGには見られない J鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。 J鎖は、 IgMが抗体産生細胞力も分泌される前に、 μ鎖の会合を補助すると考えられている。

[0005] 近年、モノクローナル抗体技術および組換え DNA技術の発展により、純粋な免疫グロブリンを大量に生産することが可能になった。更に遺伝子組み換え技術は、キメラ抗体やヒト化抗体生産を可能にした。キメラ抗体とは、可変領域を異なる種に由来する可変領域に組み換えた構造を有する抗体である。たとえば、ヒト以外の動物種の可変領域とヒト抗体の定常領域を有する「キメラ抗体」（非特許文献 1Z

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1984)81:6851)が公知である。更に、他の動物種の相補 '性決定領域 (complementarity determining regions ;CDR)をヒトイムノグロブリンに移植したヒト化抗体も公知である (非特許文献 2ZNature (1986)321:521)。

[0006] 実際に、抗腫瘍抗体に関して列挙すると、抗 CD20ヒトキメラ抗体であるリツキサン (Rituxan:IDEC社)ゃ抗 HER2/neuヒト化抗体であるハーセプチン (Herceptin:Genentech社)が臨床試験を終了し、既に承認'販売されている。 IgGおよび IgMのエフェクター機能として抗体依存性細胞障害活性 (以下、 ADCC活性と表記する)や補体依存性細胞障害活性 (以下、 CDC活性と表記する）が知られてヽる。 IgMの CDC活性は IgGと比較して高ヽことから、 CDC活性を主薬効とする抗腫瘍抗体となる可能性が極めて高いと思われる。しかし上述のとおり、 IgMは IgGと異なり多量体を形成する。そのため、組換え体 IgMを工業的規模で生産することは困難であると考えられていた。

[0007] また、 IgMは、 IgGに比べて極めて不安定であり、また溶解度が低いことから、 IgMの高濃度且つ安定な溶液を作製することは困難である。例えば、 Cytotherapy, 2001, 3(3), 233-242 (非特許文献 5)は、 IgMの- 20°C保存においても溶解時に IgMの沈殿および活性低下が起こったことを報告している。また、同文献には、 IgMは保存時に会合ィ匕および沈殿を起こしやすいことが記載されている。特に、 IgMについては、緩衝液種と pHの最適化のみでは、医薬品としての使用に耐えうる安定性を確保するのは困難であった。

[0008] そこで、緩衝液種と pHの最適化以外で、抗体を安定化させる種々の試みがなされている。例えば、 WO2002/096457 (特許文献 1)においては、酸性成分を含有する抗体高濃度安定製剤が開示され、抗体の安定ィ匕のために MgCl、 CaCl

2 2を添加剤として使用している。しかし、該公報における抗体安定ィ匕は、 IgG製剤に関するものであつて、 IgMへの言及はない。上述したように IgMは IgGと異なり多量体として存在し、本来的に安定な IgGとは異なり会合しやす、ために高濃度化が極めて困難であると!/、う特有の課題がある。

[0009] また、 Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38(8):759- 764 (非特許文献 3)および Journal of

Immunological Methods, 111 (1988) 17- 23 (非特許文献 5)で、 IgMは低塩濃度下で沈殿し、リン酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液の弱アルカリ性緩衝液かつ高塩濃度下で再溶解することが報告されている。 Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38(8):759-764 (非特許文献 3)においては、 pH 5付近では IgMは沈殿しやすく取扱が困難なことが述べられ、弱酸性側の緩衝液にぉ、て IgM溶液に対しては悲観的であることが示唆されており、したがって、 IgMの高濃度溶液を医薬品あるいはその原薬として提供できる可能性については何ら示されていない。また、本文献では、 IgMを高濃度で含有するヒト血清を水で希釈すると euglobulin沈殿として不溶性の凝集体が生じて濁度が上昇するが、 NaCl、 Arginine等の添カ卩により塩濃度を上げると euglobulin沈殿が再溶解することが報告されている。しかし、本文献は euglobulin沈殿の再溶解に関するものであり、 IgMの水溶性会合体の増加抑制に関しては何ら開示されていない。さらに、本文献では患者血清を精製せずに用いており種々の血清タンパク質が存在するため、生じる不溶性の凝集体には IgM以外のタンパク質が含まれる可能性があり、他のタンパク質非存在下での IgM溶液に対する効果にっ、ては示されて、な、。

[0010] Journal of Immunological Methods, 111 (1988) 17-23 (非特許文献 5)では、

euglobulin沈殿の再溶解に 0.1 M Tris- HC1, 1 M NaCl, pH 8の緩衝液が用いられているが、 IgMの回収率は抗体あるいはバッチによって 40 %から〉90 %の範囲であり再現性が低いと記述されている。また、方法の項で 4°Cおよび 20°Cにおいて 5-10 mg/mLの精製抗体を保存したことが記述されてヽるが、結果の項では 20°Cにお!/ヽて数ケ月間、機能低下なく保存できたことのみ記述されており、通常、安定性の確保が困難な 4°Cある!/、はそれ以上の保存温度につ!ヽては何ら記載されてヽな、。したがって、本文献では、 IgMの高濃度溶液を医薬品あるいはその原薬として提供するためには、沈殿再溶解の再現性の困難さと保存安定性の確保の困難さが示されている

[0011] また、 BIOTECHNOLOGY 1993, 11, 512-515 (非特許文献 4)および Journal of

Immunological Methods, 111 (1988) 17- 23 (非特許文献 5)においても、 euglobulin沈殿である抗体の不溶性凝集体の再溶解にっヽて記載されてヽるが、その溶解度は lOmg/mL以下であり、 IgMの溶解度は低い。また、水溶性の会合体の安定ィ匕については何ら記載されていない。

[0012] さらに、 Pharmaceutical Research 1994, 11(5), 624-632 (非特許文献 6)においては、 PVP添カ卩による IgMの安定ィ匕が開示されているが、高濃度の抗体の安定化ではなく、また、 Journal of Immunological Methods 1995, 181(1), 37- 43. (非特許文献 7)においては、トレハロース添カ卩による凍結乾燥製剤が開示されている力抗体の安定性不十分であり、高濃度の抗体の安定ィヒに関する記載はない。非特許文献 1 : Pro Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1984)81:6851)

非特許文献 2 : Nature (1986)321:521)

非特許文献 3 : Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38(8):759- 764

非特許文献 4 : BIOTECHNOLOGY 1993, 11, 512-515

非特許文献 5 Journal of Immunological Methods, 111 (1988), 17-23

非特許文献 6 Pharmaceutical Research 1994, 11(5), 624-632

非特許文献 7 Journal of Immunological Methods 1995, 181, 37-43

非特許文献 8 : Cytotherapy, 2001, 3(3), 233-242

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高濃度の IgM を溶液中にて安定ィ匕させることにある。より詳しくは、本発明は、高濃度の IgMを安定化する方法、高濃度の IgMが安定化された溶液およびその製法を提供することを目的とする。

[0014] 高濃度の IgMが安定ィ匕された溶液の好ま U、態様にぉ、ては、水溶性の会合体増加が抑制されている水溶液を提供する。他の好ましい態様においては、医薬品としての使用に耐えうる安定性を有する IgM高濃度製剤を提供する。

課題を解決するための手段

[0015] 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、塩化マグネシウムや塩酸アルギニン等の多価カチオン性のイオンを含む化合物を添加物として用いること〖こよって、溶液における IgMの会合ィ匕を抑制し、 IgMの安定な高濃度溶液を調製しうることを見出した。

[0016] 即ち、本発明は、高濃度の IgMを安定ィ匕する方法、高濃度の IgMが安定ィ匕された溶液およびその製法に関し、より詳しくは、下記発明を提供するものである。

(1) 高濃度の免疫グロブリンが安定ィ匕された溶液であって、免疫グロブリンが IgMである溶液。

(2) IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、（1)に記載の溶液。 (3) 水性溶液である、（1)に記載の溶液。

(4) 医薬品製剤である、（1)に記載の溶液。

(5) 多価カチオン性イオンを含有する、（1)に記載の溶液。

(6) 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有する、（5)に記載の溶液

(7) 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、 (5)に記載の溶液。

(8) さらに糖類を含有する、（5)に記載の溶液。

(9) pHが 5— 8である、（1)に記載の溶液。

(10) IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（1)に記載の溶液。

(11) IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、（1)に記載の溶液。

(12) (1)から（11)に記載の溶液を凍結又は凍結乾燥して得られる医薬品製剤。

(13) 高濃度の免疫グロブリンを含有する溶液を安定化する方法であって、免疫グロブリンが IgMであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。

(14) 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、（13)に記載の方法。

(15) 溶液が水性溶液である、（13)に記載の方法。

(16) 溶液が医薬品製剤である、（13)に記載の方法。

(17) 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、（13)に記載の方法。

(18) 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、（13)に記載の方法。

(19) さらに糖類を添加する、（13)に記載の方法。

(20) 溶液の pHが 5— 8である、（13)に記載の方法。

(21) 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（13)に記載の方法。

(22) 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、（13)に記載の方法。

(23) (a) (13)から（22)のいずれかの方法を実施する工程、

(b)工程 (a)により安定化された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製剤の安定化方法。

(24) 高濃度の免疫グロブリンが安定化された溶液を製造する方法であって、免疫グロブリンが I_gMであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。

(25) 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、（24)に記載の方法。

(26) 溶液が水性溶液である、 (24)に記載の方法。

(27) 溶液が医薬品製剤である、（24)に記載の方法。

(28) 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、 (24)に記載の方法。

(29) 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、 (24)に記載の方法。

(30) さらに糖類を添加する、（24)に記載の方法。

(31) 溶液の pHが 5— 8である、（24)に記載の方法。

(32) 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（24)に記載の方法。

(33) 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、（24)に記載の方法。

(34) (24)から（33)のヽずれかの方法により製造された溶液。

(35) (a) (24)から（33)のいずれかの方法を実施する工程、

(b)工程 (a)により製造された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製剤の製造方法。

図面の簡単な説明

[図 1]各サンプルにおける 25°C-1ヶ月、及び、 25°C-2ヶ月の会合体含有率から初期状態における会合体含有率を差し引いた値を Δ aggregateとして示す図である。

[図 2]各サンプルの初期状態、 4°C-3ヶ月における会合体含有率を示す図である。

[図 3]各サンプルの初期状態、 4°C-4ヶ月、 25°C-4ヶ月における会合体含有率を示す図である。

[図 4]各サンプルの初期状態、液体 Z40°C-8日、液体 Z40°C-8日 +4°C-3日、凍結乾燥 Z40°C-8日、凍結乾燥 Z40°C-8日 +4°C-3日、凍結乾燥 Z40°C-8日 +4°C-3日 +再凍結乾燥 Z50°C-8日における SEC会合体含有率％を示す図である。 [図 5]各サンプルの初期状態、凍結乾燥 Z40°C-2ヶ月における SEC会合体含有率％を示す図である。

[図 6]MABON- 01の GPC- MALLS分析により得られたクロマトグラムおよび算出された分子量を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本発明にお、て「IgM」とは H鎖の定常領域として μ鎖の定常領域を有し、かつ 5量体または 6量体の構造を持つィムノグロブリンを言う。一方、本発明における IgMを構成する可変領域の由来は限定されない。したがって、鎖由来の可変領域に加えて、 IgG由来の可変領域やその部分構造を含むことができる。可変領域の部分構造としては、フレームワークや CDRを示すことができる。なお本発明における IgMは、形質転換細胞に導入された外来性の IgM遺伝子の発現産物を言う。

[0019] さらに、本発明の IgMを構成する定常領域が由来する動物種も限定されない。つまり本発明の IgMは、 IgMタイプのィムノグロブリンを有するあらゆる動物種に由来する IgM定常領域を含む。 IgMを体内への投与に用いる場合には、少なくともその定常領域は、投与対象となる種と同じ種に由来することが望ましい。したがって、ヒトへの投与を目的とする場合には、少なくとも定常領域がヒト由来であることが望ましい。ヒト由来の定常領域と、他の動物種、あるいはヒト由来であるが他の個体に由来する可変領域とで構成される IgMは、キメラ抗体と呼ばれる。定常領域に加えて、可変領域のフレームワークもヒト由来とした IgMは、ヒトへの投与用の IgMとして更に好ましい IgMである。可変領域のフレームワークの構造を維持し、 CDRのみを他の動物種の抗体と組み換えられた抗体は、ヒト化抗体と呼ばれてヽる。

[0020] 本発明において「高濃度の免疫グロブリン (IgM)」とは、溶液中の IgMの含有量が lmg/mLより高濃度であることを意味する。本発明の溶液は、 IgMの含量が lmg/mL— 200mg/mLであることが好ましい。本発明によれば、 10mg/mLより高濃度（例えば、 20mg/mL以上、 25mg/mL以上、 40mg/mL以上、 50mg/mL以上）であっても、 IgMの安定ィ匕を図ることができる。

[0021] 本発明にお、て、水溶性会合体の増加を抑制する場合は、多価カチオン性イオンを添加することが好ましい。本発明において使用できる「多価カチオン性イオン」は、 2 価以上のカチオン性イオンであり、例えば、 Mg++、 Ca++、 Zn++、 Fe++、塩基性ァミノ酸等を使用することができる。塩基性アミノ酸としては、例えば、 Arginine, Lysine, L- リジン L-グルタミン酸塩（L- Lysine L- Glutamate)、 L -アルギ-ン L-グルタミン酸塩（ L-Arginine L-Glutamate)等を使用することができる。好ましい多価カチオン性イオンとしては、 Mg++又は Arginineが挙げられる。本発明において使用できる「多価カチォン性イオン」を除くカチオン性イオンとしては、 1価のカチオン性イオンであり、例えば Na+、 K+が挙げられる。

[0022] 溶液に添加されるカチオン性イオンあるいは多価カチオン性イオンの濃度は、通常、 ImM— lOOOmMであり、好ましくは 10mM— 500mMであり、さらに好ましくは 50mM— 200mMである。

[0023] 本発明の溶液は、カチオン性イオンあるいは多価カチオン性イオンにカ卩えて、糖類を含有してもよい。好ましい糖類としては、トレハロース、スクロース、ソルビトールを挙げることができる。

[0024] 本発明にお、て使用できる緩衝液種としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クェン酸緩衝液が挙げられる。

[0025] 本発明における「安定化」とは、保存中に生じる水溶性の IgM会合体の増加を抑制すること、及び Z又は、保存中に生じる不溶性の IgM会合体 (沈殿物）の増加を抑制すること及び Z又は、水溶性の IgMの機能を保持していることをいい、好ましくは、保存中に生じる水溶性の IgM会合体の増加を抑制することを、う。

[0026] 本発明における「水溶性の会合体」とは、 IgMの 2量体、 3量体などの多量体で水溶性のものをいう。水溶性の会合体は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーで検出することができる。 IgM高濃度溶液の安定化は、例えば、次の式により求まる会合体増加抑制率により測定することができる。

会合体増加抑制率 =(A-B)/AX 100

A：多価カチオン性イオンを添加しな、IgM高濃度溶液 (コントロール)の会合体増加率

B：多価カチオン性イオンを添加した IgM高濃度溶液 (被験試料)の会合体増加率 [0027] 本発明の溶液は、高濃度の IgMを含有する溶液に多価カチオン性イオンを添加してから 1ヶ月後の会合体増加抑制率力好ましくは 10%以上、より好ましくは 30%以上、さらに好ましくは 50%以上、更に好ましくは 80%以上のものである。

[0028] 本発明の溶液は、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を含有しない溶液であることが好ましい。さらに好ましくは、 IgM以外のタンパク質であって、安定化剤としての効果を示し得る量以上のタンパク質を含有しな、溶液である。本願の溶液が医薬品製剤である場合は、 IgM以外のヒト由来のタンパク質であって、医薬品の原薬及び Z又は医薬品として許容される量以上のタンパク質を含有しない溶液であることが好ましい。

[0029] 本発明の医薬品製剤の剤形に特に限定はなぐ任意の剤形とすることが可能である。剤形としては、例えば、溶液製剤、凍結乾燥製剤を挙げることができる。また、溶液製剤としては、冷所保存製剤、常温保存製剤、凍結製剤などが挙げられる。また、本発明の医薬品製剤の投与ルートにも限定はなぐ任意の投与ルートを用いることが可能である。したがって、医薬品製剤の使用目的に応じて、経口、非経口投与のいずれでもありうる。

[0030] 非経口投与のための具体的な剤型として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などを示すことができる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することがでさる。

[0031] 本発明の方法により、安定ィ匕した IgMは、それ自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与することもできる。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、べヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように調節することができる。

[0032] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液などが利用される。補助剤には、具体的には、例えば、スクロース、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウム等を利用することができる。医薬組成物には、適当な溶解補助剤を加えることもできる。例えばアルコールや非イオン性界面活性剤は、溶解補助剤として好ましい。ァルコールとしては、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を示すことができる。また非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート 80、ポリソルベート 20、ポロキサマー 188、あるいは HCO- 50などを用いることができる。また、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の陽イオン性界面活性剤も使用できる。

[0033] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジルアルコール、フエノール、酸ィ匕防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なバイアルある、はアンプルに充填される。

[0034] 本発明の溶液を医薬品製剤とする場合は、 pH5— 8であることが好ましぐ特に好ましくは pH5— 7である。

[0035] 医薬品製剤は、対象疾患、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり 0.001— 100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。し力しながら、本発明の医薬品製剤はこれらの投与量に制限されるものではない。その他、本発明の溶液製剤等の調製に関しては、 WO2002/096457 を参照のこと。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0036] 以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1] 以下の実施例では、 IgMとして、参考例 1で作製した組換え型抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体（以下、「MABON- 01」という）を使用した。 MABON- 01溶液を濃縮し、約 9 mg/mLの高濃度溶液を調製した。これを透析膜 SLIDE-A- LYZER Dialysis Cassette 10000MWCO (PIERCE)により透析を行い、以下の 1.一 6.の緩衝液に透析し、緩衝液置換を行った。

1. 20mM酢酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.0 I酢酸塩 pH5.01.

2. 20mM酢酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.5 I酢酸塩 pH5.52.

3. 20mM酢酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH6.0 I酢酸塩 pH6.03.

4. 20mMクェン酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.0 /タエン酸塩 pH5.04.

5. 20mMクェン酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.5 /タエン酸塩 pH5.55.

6. 20mMクェン酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH6.0 /タエン酸塩 pH6.01.

[0037] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 8.4 mg/mLに統一し、保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプルの安定性試験を 4°Cで実施した。サンプルは初期状態、 4°C-2ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる単量体残存率の変化により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、 G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の単量体残存率を算出した。各サンプルの初期状態における単量体残存率を 100%とし、 4°C -2ヶ月の単量体残存率を表 1に示した。

[0038] [表 1] 残存率％

PH 酢酸塩クェン酸塩

5.0 99.33 99.16

5.5 99.51 99.3

6.0 98.92 98.9

[0039] これより、 300mM NaClを含む pH5.0— pH6.0のクェン酸あるいは酢酸緩衝液において、安定な高濃度 MABON-01溶液を調製することができた。

[0040] 以下の実施例において、クェン酸緩衝液を用いた pH5.5の溶液に多価カチオンを添加することでさらに水溶性の会合体の増加を抑制し安定ィ匕した高濃度 MABON-01 溶液を示す。

[0041] [実施例 2]

MABON-01溶液を濃縮し、約 18 mg/mLの高濃度溶液を調製した。これを透析膜 SLIDE- A-LYZER Dialysis Cassette 10000MWCO (PIERCE)により透析を行い、 20 mMクェン酸， 300 mM NaCl, pH 5.5の溶液に緩衝液置換を行った（添加物なしの状態では、緩衝液種、 pHを最適化してある）。この高濃度 MABON-01溶液を以下の 1. 一 9.の緩衝液に透析 EasySep (TOMY)を用いて透析し、緩衝液置換を行った。

1. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, pH5.5 Iなし

2. 20 mMクェン酸ナトリウム， 900 mM NaCl, pH5.5 I NaCl

3. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , pH5.5

2 I MgCl

2

4. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM Na SO , pH5.5

2 4 I Na SO

2 4

5. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 100 mM L-グルタミン酸ナトリウム塩， pH 5.5 I L-グルタミン酸ナトリウム塩

6. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 100 mM L-アルギ-ン塩酸塩， pH 5.5

I L-アルギニン塩酸塩

7. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 100 mM N-ァセチルトリプトフアンナトリゥム塩， pH5.5 I N-ァセチルトリプトファンナトリウム塩

8. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 10mM尿素， pH 5.5 I尿素

9. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, lOOmMトレハロース， pH 5.5 Iトレハロース

[0042] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 18.5 mg/mLに統一し、保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプルの安定性試験を 25°Cで実施した。サンプルは初期状態、 25°C-1ヶ月、及び、 25°C-2 ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変化 (増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、

G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの 25°C-1ヶ月、及び、 25°C-2ヶ月の会合体含有率から初期状態における会合体含有率を差し引いた値を Δ aggregateとして、図 1に示した。

[0043] その結果、 1.なし (300mM NaClを含む)に比べて、 2. NaCl(900mM NaClを含む)は会合体の増加が抑制された。これより、 NaCl濃度を高くすることによって、会合体の増加を抑制できることが分力つた。

[0044] 一方、 2. NaCl(900mM NaClを含む)、 3. MgCl (300mM NaCl+200mM MgClを含む）

2 2

、 4. Na SO (300mM NaCl+200mM Na SOを含む)において、これらは同じイオン強度

2 4 2 4

(いずれもイオン強度 0.9M)であるにも関わらず、 2価のカチオンを含む MgClは著し

2 い安定ィ匕効果が認められ、 2価のァ-オンを含む 4. Na SOの安定化効果は 2. NaCl

2 4

と同程度であった。

[0045] また、同じイオン性のアミノ酸である L-グルタミン酸ナトリウム塩を含む 5. L-ダルタミン酸ナトリウム塩では安定ィ匕効果が認められないにも関わらず、 2価のカチオンである L-アルギニン塩酸塩を含む 6. L-アルギニン塩酸塩では、 3. MgClと同等の安定ィ匕

2

効果が認められた。

[0046] このような結果から、 NaCl等の塩をカ卩ぇイオン強度を高くすることによって、会合体を抑制できることが分力つた。さらに、同じイオン強度においても、 2価のカチオンであるマグネシウムイオンやアルギニンを用いることによってさらに高い会合体抑制効果が得られることが分かった。一方、 2価のァ-オンである硫酸イオンやグルタミン酸では高い会合体抑制効果が得られない。すなわち、マグネシウムイオンやアルギニン等の 2価のカチオンが MABON- 01と相互作用することで、 MABON- 01の会合化を著しく抑制し、安定な高濃度溶液を調製することが出来た。

[0047] [実施例 3]

MABON-01溶液を濃縮し、約 19 mg/mLの MABON- 01高濃度溶液を調製した。これを以下の 1.一 9.の緩衝液に透析膜 EasySep (TOMY)を用いて透析し、緩衝液置換を行った。

1. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, pH5.51.

2. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 10 mM MgCl , pH5.52. 3. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 50 mM MgCl , pH5.53.

2

4. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , pH5.54.

2

5. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , lOOmMトレハロース，

2

pH5.55.

6. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 10 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 pH5.56.

7. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 50 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 pH5.57.

8. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 100 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 pH5.58.

9. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 100 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 lOOmMトレノヽロース、 _PH 5.5

[0048] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 18.9 mg/mLに統一し、保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプルの安定性試験を実施した。サンプルは初期状態、 4°C-3ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変化 (増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、 G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの初期状態、 4°C-3ヶ月における会合体含有率を図 2 に示した。

[0049] その結果、 MgClと L-アルギニン塩酸塩の濃度依存的に会合体抑制効果が見られ

2

た。すなわち、 MgClと L-アルギニン塩酸塩の濃度を高くすることによって、大きな安

2

定ィ匕効果が得られた。さらに、トレハロース単独では安定ィ匕効果がないものの（実施例 2及び実施例 4) 200 mM MgClあるいは 100 mM L-アルギニン塩酸塩存在下に

2

100 mM trehaloseを添加することによって、安定化効果が得られた。

[0050] [実施例 4]

MABON- 01溶液を濃縮し、より高濃度の約 27 mg/mLの MABON- 01高濃度溶液を調製した。これを以下の 1.一 3.の緩衝液に透析膜 EasySep (TOMY)を用いて透析し、緩衝液置換を行った。

1. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, pH5.5 Iなし 2. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , pH5.5 I MgCl

2 2

3. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, lOOmMトレハロース， pH 5.5 Iトレハロース

[0051] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 26.8 mg/mLに統一し、保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプルの安定性試験を実施した。サンプルは初期状態、 4°C-4ヶ月および 25°C-4ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変ィ匕（増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、 G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの初期状態、 4°C-4ヶ月および 25°C_4ヶ月における会合体含有率を図 3に示した。

[0052] その結果、 4°Cと 25°Cにおいて、ともに MgClの安定ィ匕効果が認められた。一方、

2 一般的なタンパク質の安定化剤として知られ、 Journal of Immunological Methods 1995, 181(1), 37-43において凍結乾燥時の IgMの安定化効果が認められている trehalose に関しては、ほとんど効果が認められな力つた（図 3)。

[0053] [実施例 5]

ぐ準備 >

「50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl, pH5.5、 5%スクロース」または「50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCU pH5.5、 5%スクロース」または「50 mMタエン酸ナトリウム、 180 mM MgCl、 pH5.5、 5%スクロース」において MABON- 01の大規模な透

2

析を行った。透析後、フィルター遠心法によって溶液を濃縮した。 VIVASPIN6 5000MWCO (VIVASCIENCEゝ VS061)を用いて、 himac CF8DL (Hitachiゝ No.

SZGEQ054)により 3000 rpmで遠心を行った。濃縮および回収後、 UV吸光度（ ε = 1.40)で濃度を測定した。次いで、緩衝液を用いてサンプルを 48.4 mg/mLに希釈した。さら〖こ 1%ポリソルベート 80溶液を加え、 0.01%ポリソルベート製剤を得た。上記サンプルをそれぞれ 500 μ Lずつ 5 mLガラスバイアルに充填し、それぞれ 30 μ Lずつ Multiply-Safecup 0.1 ml Biosph. (SARSTEDT)に充填した。下記の条件において、 5 mLガラスバイアルを凍結乾燥した。初期サンプルとして 1 mg/mL MABON- 01を使用し、分析時まで 4°Cで保管した。

[表 2] 温度 C】時間 [hr]

-50 24

-20 0.02

-20 18

23 2.5

23 28

30 0.25

30 10

1=1 B l 82.77

[0055] く実験の条件〉

"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソルべート 80"

"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCl、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソルベー卜 80"

"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM MgCl

2、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソルべート 80"

MABON- 01： 48.4 mg/mL

溶液/ 40°C- 8日

溶液/ 40°C-8日 +4°C-3日

凍結乾燥/ 40°C-8日

凍結乾燥/ 40°C-8日 +4°C-3日（再溶解後）

凍結乾燥/ 40°C-8日 +4°C-3日（再溶解後) +再凍結乾燥/ 50°C-8日

[0056] 〈分析〉

インキュベーション後、希釈溶液（1/50希釈溶液: 4+296 L)力も一 lmg/mLを用いて SECによって 10 μ Lを分析した。「50 mMクェン酸ナトリウム、 500 mM KC1、 pH7.4j を移動相（流量 0.3 ml/分、 280 nmまたは 220 nmで検出）として使用し、 G4000SWxl (TOSOH)によって SEC分析を行った（図 4)。

同濃度の NaClに比べて、 ArgHClおよび MgClは、 50°Cでインキュベーションされて

2

いる間も、凍結乾燥の安定ィ匕効果が高力つた。

[0057] [実施例 6]

ぐ準備 >

「50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl、 pH5.5、 5%スクロース」または「50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCU pH5.5、 5%スクロース」において MABON- 01の大規模な透析を行った。透析後、フィルター遠心法によって溶液を濃縮した。

VIVASPIN6 5000MWCO (VIVASCIENCEゝ VS061)を用いて、 himac CF8DL (Hitachi 、 No. SZGEQ054)により 3000 rpmで遠心を行った。濃縮および回収後、 UV吸光度（ ε = 1.40)で濃度を測定した。さら〖こ、 1%ポリソルベート 80溶液を加え、 0.01%ポリソルベート製剤を得た。また、サンプルを希釈し、 50 mg/mL製剤を得た。上記のサンプルをそれぞれ 300 L、 3本の 5 mLガラスバイアルに充填した。下記の条件において 5 mLガラスバイアルを凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は初期サンプルとして、分析時まで 4°Cで保管した。

[0058] [表 3] 温度 c】時間 [hr]

-50 24

-20 0.02

-20 18

23 2.5

23 28

30 0.25

30 10

口 PT 82.77

[0059] く実験の条件〉

MABON-01： 50mg/mL

凍結乾燥/ 40°C_2ヶ月

[0060] 〈分析〉

インキュベーション後、希釈溶液（1/50希釈溶液: 4+296 L)力らー lmg/mLを用いて SECによって 10 μ Lを分析した。「50 mMクェン酸ナトリウム、 500 mM KC1、 pH7.4」を移動相（流量 0.3 ml/分、 280 nmまたは 220 nmで検出）として使用し、 G4000SWxl ( TOSOH)によって SEC分析を行った（図 5)。

40°C-2ヶ月の長期加速試験でも、同濃度の NaClに比べて、 ArgHClは高い安定ィ匕効果を示した。

[0061] [参考例 1]ガンダリオシド GM3に対する組換え型ヒト抗体の作製

1.1 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子の構築

ガンダリオシド GM3に結合するヒト抗体の H鎖をコードする遺伝子は、 Epstein-Barrゥィルスで形質転換されたヒト B細胞（以下、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞と表記する）より抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。

[0062] Total RNAは、 RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN社製）を用いて 1 X 10⁷細胞の抗ガングリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出した。 Hoonらが報告して、る抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体遺伝子の塩基配列（Cancer Research 1993 ;53 : 5244- 5250)に基づいて、 2本のオリゴヌクレオチド（LMH-f3、 LMH-r3)を設計した。 LMH-f3 (配列番号： 7)はセンス方向で、 LMH-r3 (配列番号： 8)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit ( CLONTECH社製)を用い 5'末端側と 3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。 5' 末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド LMH-r3を用い、 3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド LMH- を用いた。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反応させた。

[0063] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。 5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,

5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、

0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、

1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix、

(以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）

2.5 Lの逆転写反応産物、

lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド LMH- βまたは LMH- r3

また反応温度条件は次のとおりである。

94°Cの初期温度にて 30秒間、

94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回

94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復

94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復

最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。

[0064] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル力精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。塩基配列決定の後、 5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 Apal (宝酒造社製)及び SacII (宝酒造社製)で消化して得られる約 l.lkbpの断片、および 3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 Apal (宝酒造社製)及び Notl (宝酒造社製)で消化して得られる約 l.lkbpの断片を混合し、 pBluescript KS +ベクター（東洋紡社製）へクローニングし、完全長抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子を得た。

[0065] 動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチド

LMH-fxho, LMH-rsalを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。 LMH-fxho (配列番号： 11)は前方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子の 5'末端にハイブリダィズし、かつ Xhol制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また LMH-rsal (配列番号： 12)は後方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子の 3'末端にノ、イブリダィズし、 Sal淛限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

[0066] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。 5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ

ImM MgSO、

4

0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、

1ユニットの DNAポリメラーゼ KOD— Plus—

(以上の成分は!、ずれも東洋紡社製)、

10ngの完全長抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子を含む pBluescript KS + ベクター

lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド LMH- fxho、 LMH- rsal

また反応温度条件は次のとおりである。

94°Cの初期温度にて 2分間、

94°C/15秒間、 60°C/30秒間、 68°C/2分間のサイクルを 30回反復

最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。

[0067] 増幅した遺伝子断片は、制限酵素 Xhol (宝酒造社製)および制限酵素 Sail (宝酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 pUCAGの制限酵素 Xhol部位に連結し、クローユングした。本ベクター pUCAGは、 pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108 : 193-200)を制限酵素 BamHIで消化して得られる 2.6kbpの断片を pUC19ベクター (東洋紡社製)の制限酵素 BamHI部位に連結し、クロ一ユングしたベクターである。完成したプラスミドを pUCAG/L612Hと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号： 1及び配列番号： 2に示す。

[0068] 1.2 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖遺伝子の構築

抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の L鎖をコードする遺伝子は抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。 Total RNAは、上記と同様にして抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出した。 Hoonらが報告している抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体遺伝子の塩基配列（Cancer Research 1993 ;53 : 5244- 5250)に基づいて、 2本のオリゴヌクレオチド（LML- fl、 LML-rl)を設計した。 LML-fl (配列番号： 9)はセンス方向で、 LML-rl (配列番号： 1 0)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。 [0069] 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (

CLONTECH社製)を用い 5'末端側と 3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。 5' 末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド LML-rlを用い、 3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド LML-flを用いた。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反応させた。

[0070] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。

5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,

5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、

0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、

1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix

(以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）

2.5 Lの逆転写反応産物、

1 Opmoleの合成オリゴヌクレオチド LML-flまたは LML- r 1

また反応温度条件は次のとおりである。

94°Cの初期温度にて 30秒間、

94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復

94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、

94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復

最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。

[0071] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル力精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。塩基配列決定の後、 5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化して得られる約 0.7kbpの断片、および 3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化して得られる約 0.9kbpの断片を混合し、合成オリゴヌタレォチド LML-feco、 LML-rnotを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。 LML-feco ( 配列番号： 13)は前方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖遺伝子の 5'末端にハイブリダィズし、かつ EcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また LML-rnot (配列番号： 14)は後方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖遺伝子の 3'末端にハイブリダィズし、 Notl制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

[0072] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。

5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ

ImM MgSO、

4

0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、

1ユニットの DNAポリメラーゼ KOD— Plus—

(以上の成分は!、ずれも東洋紡社製）

5'末端側遺伝子断片、

3'末端側遺伝子断片、

lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド LML- feco、 LML- rnot

また反応温度条件は次のとおりである。

94°Cの初期温度にて 2分間

94°C/15秒間、 60°C/30秒間、 68°C/2分間のサイクルを 30回反復

最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。

[0073] 増幅した遺伝子断片は、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Notl (宝酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 pCXND3の制限酵素 EcoRIおよび Notl切断部位に連結し、クローユングした。

[0074] 本ベクター pCXND3の構築の流れについて、以下に述べる。 DHFR- Δ

E-rvH- PMl-f (W092/19759参照）の抗体 H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素 EcoRI/Smal部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、

EcoRI- Notl- BamHI adaptor (宝酒造社製）をクローユングした。このベクターを pCHOI と命名した。

[0075] pCHOIの DHFR遺伝子発現部位を pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108： 193-200)の制限酵素 Hindlll部位にクローユングしたベクターを pCXND3と命名した。また、 L鎖遺伝子断片を PCXND3にクローユングし、完成したプラスミドを pCXND3/L612Lと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号： 3および配列番号： 4に示す。 [0076] 1.3 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の発現ベクターの構築

抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現ベクターを作製するために、 pUCAG/L612Hを制限酵素 Hindlll (宝酒造社製）で消化して得られる約 4.0kbpの断片を pCXND3/L612L の制限酵素 Hindlll切断部位に連結し、クローユングした。完成したプラスミドを pCXND3/L612IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、 DHFR遺伝子、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体遺伝子を発現する。

[0077] 1.4 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖遺伝子および発現ベクターの構築

抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の J鎖をコードする遺伝子は抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。 Total RNAは、上記と同様にして抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出した。 GenBankに登録されているヒト抗体 J鎖遺伝子の塩基配列（GenBank番号： M12759)に基づいて、 2本のオリゴヌクレオチド (J-fl、 J-rl)を設計し、合成した。 J-fl (配列番号： 15)はセンス方向でヒト抗体 J鎖遺伝子 Exon3にハイブリダィズし、 J-rl ( 配列番号： 16)はアンチセンス方向でヒト抗体 J鎖遺伝子 Exon4にハイブリダィズする

[0078] 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (

CLONTECH社製)を用い 5'末端側と 3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。 5' 末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド J-rlを用い、 3'末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド J-flを用いた。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反応させた。

[0079] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。

5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,

5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、

0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、

1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix

(以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）

2.5 Lの逆転写反応産物、

1 Opmoleの合成オリゴヌクレオチド J- flまたは J- r 1 また反応温度条件は次のとおりである。

94°Cの初期温度にて 30秒間

94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復

94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復

94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復

最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。

[0080] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル力ら精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。

[0081] 塩基配列決定の後、 5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化して得られる約 0.5kbpの断片、および 3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化して得られる約 l.Okbpの断片を混合し合成オリゴヌクレオチド J-feco、 J-rxbaを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。

[0082] J-feco (配列番号： 17)は前方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖遺伝子の 5'末端にノ、イブリダィズし、かつ EcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また J-rxba (配列番号： 18)は後方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖遺伝子の 3'末端にハイブリダィズし、 Xbal制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

[0083] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。

5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ

ImM MgSO、

4

0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、

1ユニットの DNAポリメラーゼ KOD— Plus—

(以上の成分は!、ずれも東洋紡社製）

5'末端側遺伝子断片、

3'末端側遺伝子断片、

lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド J- feco、 J-rxba

また反応温度条件は次のとおりである。

94°Cの初期温度にて 2分間 94°C/15秒間、 60°C/30秒間、 68°C/2分間のサイクルを 30回反復

最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。

[0084] 増幅した遺伝子断片は、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Xbal (宝酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 pCOSII- Zeoの制限酵素 EcoRIおよび Xbal切断部位に連結し、クローユングした

[0085] 本ベクター pCOSII-Zeoは、上述の pCHOIの DHFR遺伝子発現部位を除去し、

Zeocin耐性遺伝子発現部位をクローユングしたベクターである。完成したプラスミドを pCOSII-Zeo/J chainと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号： 5および配列番号： 6に示す。

[0086] 1.5 動物細胞を用いた抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の発現

CHO細胞 (DG44株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。 Gene Pulserll (BioRad社製）を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子導入した。

[0087] J鎖を発現しな!ヽ細胞株の遺伝子導入につ!、て以下に述べる。抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現ベクター pCXND3/L612IgM (25 μ g)と PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 10⁷細胞/ ml)の 0.75mlを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。

[0088] 室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen社製）を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen社製） 40mLに懸濁した。同様の培地で 50倍希釈溶液を作製し、 96ゥエル培養用プレート〖こ 100 1/ゥエルで分注した。 COインキュベーター（5%CO )で 24時間培養後、

2 2

Geneticin (Invitrogen社製）を 0.5mg/mLになるように添カ卩して 2週間培養した。

[0089] Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたゥエルの培養上清中の IgM量にっ、て参考例 1.6に示す濃度定量法で測定した。抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体安定発現細胞株 CA02、 CA15、 CA19、 CA20、および CA24を得た。

[0090] また、 J鎖を発現する細胞株の遺伝子導入につ!、て以下に述べる。抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現ベクター pCXND3/L612IgM (25 μ g)および J鎖発現ベクター pCOSII- Zeo/J chain (20 μ g)と PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 10⁷細胞/ ml)の 0.75mlを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてノレスを与えた。

[0091] 室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen社製）を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen社製） 40mLに懸濁した。

[0092] 同様の培地で 50倍希釈溶液を作製し、 96ゥエル培養用プレートに 100 μ 1/ゥエルで分注した。 COインキュベーター（5%CO )で 24時間培養後、 0.5mg/mL濃度の

2 2

Geneticin (Invitrogen社製）および 0.6mg/mL濃度の Zeocin (Invitrogen社製）を添カロして 2週間培養した。 Geneticin, Zeocin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたゥエルの培養上清中の IgM量について参考例 1.6に示す濃度定量法で測定した。抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体安定発現細胞株（CJ15、 CJ25、 CJ38、 CJ45、 CJ67)を得た。

[0093] 1.6 培養上清中の IgM濃度の測定

培養上清中の IgM濃度の測定は以下のように行った。 Anti-Human IgM ( BIOSORCE社製）を 1 μ g/mlになるように Coating Buffer (0.1M NaHCO、 0.02%NaN

3

)で希釈し、 96ゥエル ELISA用プレートに 100 μ 1/ゥエルでカ卩え、 4°Cで 24時間以上反

3

応させ、コーティングを行った。

[0094] さらに、 Rinse Bufferで洗浄した後に、 200 μ L/ゥエルの Diluent Bufferをカ卩え、室温で 1時間以上反応させ、ブロッキングした。 Rinse Bufferおよび Diluent Bufferの組成はそれぞれ次のとおりである。

Rinse Buffer:

PBS (-)、

0.05% Tween20

Diluent Buffer:

50mM Tris、

ImM MgCl、

2

0.15M NaCl、 0.05% Tween20、

0.02% NaN

3、

1% BSA

[0095] その後、 Diluent Bufferで適当に希釈した培養上清を 100 μ L/ゥエルでカ卩え、室温で 1時間反応させた。 Rinse Bufferで洗浄した後に、 Goat Anti-Human IgM, Alkaline Phosphatase conjugated (BIOSORCE社製）を Diluent Bufferで 4000倍に希釈し、 100 μ L/ゥエルでカ卩え、室温で 1時間反応させた。最後に Rinse Bufferで洗浄した後にァルカリフォスファタ一ゼ基質（SIGMA社製）をカ卩え、吸光光度計 Benchmark Plus ( BioRad社製）を用いて、測定波長 405nm、対照波長 655nmの吸光度を測定した。 IgM 濃度は抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体精製品（Hoonら、 Cancer Research 1993； 53： 5244-5250)との比較で算出した。

[0096] 各種抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体安定発現細胞株を 75cm²培養フラスコ内で初発細胞密度 2xl0⁵ _cells/mLで培養し、培養上清中の IgM濃度を上記の方法で測定した。結果を表 4に示す。 IgM産生量は培養 3日目で約 20mg/L、培養 7日目で約 50mg/L であり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は 5— 19pg/cell/dayであった。 IgMはィムノグロブリンの中でも多量体を形成するために、組換え体は発現量が低ぐ大量に調製することが困難であるとされていた力今回の結果より、 CHO細胞において高い産生量の組換え型 IgM発現細胞が作製できることが明らかになった。

[0097] [表 4]

J鎖発現細胞株培養 3日間の培養 7日間の産生能

産生量 (mg/L) 産生量 (mg/L) (pg/cel l/day)

CA02 24.1 36.9 14.1

CA15 11.8 39.7 4.9 無し

CA19 27.1 62.3 13.1

CA20 20.2 35.4 10.5

CA24 25.0 41.5 10.7

CJ15 29.4 N. T. 19.4

CJ25 24.4 N. T. 18.1 有り

CJ38 14.9 N. T. 12.4

CJ45 26.4 N. T. 18.7

CJ67 18.0 N. T. 12.8

N T : Not Tested

[0098] [参考例 2] 会合体の測定 (1)

以下の緩衝液を移動相として用いて、 MABON- 01のゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った。何れの分析でもカラムは TSKgel G4000SW を用い、流速は 0.3 mL/min

XL

検出は 280 における吸光度、試料注入量は 10 μ gとした。

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH6.21.

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH6.52.

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH6.83.

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.14.

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.45.

1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM KC1, pH6.56.

1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM KC1, pH7.47.

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH6.58.

1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH7.49.

1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH6.510

1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH7.411

[0099] 得られたクロマトグラムの会合体ピーク面積値と単量体ピーク面積値 (ピークの帰属は別途行った)を表 5に示す。 [0100] [表 5]

KC I NaC l

500 mM 300 mM 500 mM 300 mM

3073386 ― 全ピーク面積値 pH6. 2

146342 2927044 ― ― ― ― 会合体単量体

3096904 2959509 3044989 2818198

PH6. 5

155304 2941600 124880 2834629 127467 2917522 82928 2735270

3074760 ― 一 ―

pH6. 8

153682 2921078 ― 一 ― ― ― ―

3033846 ― 一一 pH7. 1

154085 2879761 一一一一一一

3074597 3098757 3130093 2948932 pH7. 4

163747 2910850 157320 2941437 144630 2985463 1 12427 2836505 各セルの上段に全ピーク面積値、下段左に会合体面積値、下段右に単量体面積値を示した。

[0101] また、全ピーク面積値に対する会合体ピーク面積比率ならびに単量体ピーク面積比率を算出した結果を表 6に示す。

[0102] [表 6]

各セルの左に会合体ピーク面積比率、単量体ピーク面積比率を示した。

[0103] これらの結果から、全ピーク面積値ならびに会合体ピーク面積比率、何れに関しても、 PH6.2-7.1の移動相緩衝液を用いた分析に比べて pH7.4の移動相緩衝液を用いた時に塩種ならびに塩濃度の影響が抑えられ、また KC1、 NaCl何れの塩を含む移動相緩衝液でも塩濃度が 300 mMの移動相緩衝液に比べて 500 mMの時に pHの影響が抑えられ、更に NaClを含む移動相緩衝液に比べて KC1を含む移動相緩衝液を用 V、た時に塩濃度もしくは移動相 pHの影響が抑えられることがわ力つた。以上から、 MABON- 01のゲル濾過クロマトグラフィー分析の移動相条件を、 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.4と設定した。

[0104] [参考例 3] 会合体の測定 (2)

MABON- 01の GPC- MALLS分析を行い、各ピークの分子量を測定した。移動相は 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.4の緩衝液を、カラムは TSKgel G4000SW を用いた。流速は 0.3 mL/min、検出は 280nmにおける吸光度、試料注入量は 113

XL

μ gとした。得られた結果力も Debye法によって分子量を算出した。

[0105] 得られたクロマトグラムおよび算出された分子量を重ねて図 6に示す。また、図中ピーク 1ならびにピーク 2の平均分子量と、 MABON- 01のアミノ酸配列から算出した理論分子量を表 7に示す。

[0106] [表 7] 平均分子量理論分子量

M. W. [kDa] M. W. [kDa]

ピ-ーク 1 1， 109 単里体 1 , 034

ピ—ク 2 2, 193 ―里体 2, 068

[0107] 尚、ピーク 2は 21.5-22.0分、ピーク 1は 24.5-25.0分の分子量を平均し、平均分子量とした。ピーク 1ならびにピーク 2の平均分子量がそれぞれ単量体ならびに二量体の理論分子量に近いこと、またピーク 2の平均分子量がピーク 1の平均分子量の約 2倍であることから、ピーク 1には MABON- 01単量体力ピーク 2には二量体が含まれることがわかった。

産業上の利用の可能性

[0108] 本発明により、高濃度の IgMを溶液中にて安定ィ匕することが可能となった。本発明によれば、 IgMを有効成分とする医薬製剤を長期間安定に保存することが可能であるため、本発明は特に抗体製剤の調製に大きく貢献しうるものである。

Claims

請求の範囲

[I] 高濃度の免疫グロブリンが安定ィ匕された溶液であって、免疫グロブリンが IgMである溶液。

[2] IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、請求項 1に記載の溶液。

[3] 水性溶液である、請求項 1に記載の溶液。

[4] 医薬品製剤である、請求項 1に記載の溶液。

[5] 多価カチオン性イオンを含有する、請求項 1に記載の溶液。

[6] 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有する、請求項 5に記載の溶液

[7] 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、請求項 5に記載の溶液。

[8] さらに糖類を含有する、請求項 5に記載の溶液。

[9] pHが 5— 8である、請求項 1に記載の溶液。

[10] IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 1に記載の溶液

[II] IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 1に記載の溶液。

[12] 請求項 1から 11に記載の溶液を凍結又は凍結乾燥して得られる医薬品製剤。

[13] 高濃度の免疫グロブリンを含有する溶液を安定化する方法であって、免疫グロブリン力 ¾Mであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。

[14] 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、請求項 13に記載の方法。

[15] 溶液が水性溶液である、請求項 13に記載の方法。

[16] 溶液が医薬品製剤である、請求項 13に記載の方法。

[17] 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、請求項 13に記載の方法。

[18] 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、請求項 13に記載の方法。

[19] さらに糖類を添加する、請求項 13に記載の方法。

[20] 溶液の pHが 5— 8である、請求項 13に記載の方法。

[21] 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 13に記載の方法。

[22] 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 13に記載の方法。

[23] (a)請求項 13から 22のいずれかの方法を実施する工程、

[24] 高濃度の免疫グロブリンが安定ィ匕された溶液を製造する方法であって、免疫グロプリンが IgMであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。

[25] 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、請求項 24に記載の方法。

[26] 溶液が水性溶液である、請求項 24に記載の方法。

[27] 溶液が医薬品製剤である、請求項 24に記載の方法。

[28] 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、請求項 24に記載の方法。

[29] 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、請求項 24に記載の方法。

[30] さらに糖類を添加する、請求項 24に記載の方法。

[31] 溶液の pHが 5— 8である、請求項 24に記載の方法。

[32] 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 24に記載の方法。

[33] 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 24に記載の方法。

[34] 請求項 24から 33の、ずれかの方法により製造された溶液。

[35] (a)請求項 24から 33の、ずれかの方法を実施する工程、