UA120164C2 - Стабільний склад на основі біспецифічного антитіла до il-4/il-13 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується стабільного складу на основі біспецифічного антитіла до IL-4/IL-13 та буферної системи, де рН складу становить приблизно рН 7, і де склад характеризується низькою концентрацією солей з метою зниження іонної сили складу.

Description

Галузь винаходу

Даний винахід передбачає стабільні фармацевтичні склади на основі антитіл, у тому числі ліофілізовані склади, що містять біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ -13 та буферну систему, де рН складу становить приблизно рн 7, і де склад характеризується низькою концентрацією солей з метою зниження іонної сили складу. Склади необов'язково можуть додатково містити неіоногенну поверхнево-активну речовину, цукор та/або неіоногенний стабілізатор. Склади можна застосовувати при лікуванні різних захворювань.

Передумови винаходу

Як 1-4, так ії І/-13 є терапевтично важливими цитокінами, що обумовлено їхніми біологічними функціями, та відіграють критично важливі ролі в багатьох захворюваннях, включаючи астму (Сигг Оріп АйПегду Сіїп Іттипої 2005, Мо. 5, 161-166). Було показано, що 1-4 здатний пригнічувати аутоіїмунні захворювання, і як 1-4, так і І/-13 продемонстрували можливість посилення протипухлинних імунних відповідей. Оскільки обидва цитокіни залучені в патогенез алергічних захворювань, інгібітори цих цитокінів можуть забезпечувати терапевтичні ефекти.

З метою розробки фармацевтичного складу, що містить біспецифічне антитіло до ЇЇ -4/ЛІ -13, який підходить для підшкірного введення, концентрацію антитіла необхідно збільшити до приблизно 100 мг/мл або більше. Однак, при таких високих концентраціях може виникнути багато ускладнень, у тому числі підвищення в'язкості, зсув рН, зміна кольору розчину та утворення видимих та не видимих неозброєним оком частинок. Складання антитіла додатково ускладнюється тим, що воно досить схильне до агрегації при високих концентраціях. У той час як типові антитіла у нормі утворюють менше 595 високомолекулярних агрегатів (НМУМ) протягом періоду часу 4 років при 5 "С, біспецифічне антитіло до І -4/ЛІ-13 утворює НМУМ при швидкості 0,5-1 95 за годину при 25 "С та при швидкості 0,1 95 за годину при 5 "С. Більш того, це антитіло має настільки сильну схильність до агрегації, що його не можна скласти в рідкій формі в цільовому діапазоні концентрацій. Нарешті, біспецифічне антитіло до 1 -4/ЛІ/-13 має надзвичайно низьку ізоелектричну точку, що ускладнює його складання у зв'язку з проблемами розчинності. Наприклад, біспецифічне антитіло до ІІ -4/І -13 має ізоелектричну точку від 5,8 до 6,2, тоді як більшість антитіл мають ізоелектричну точку від 8 до 10.

Зо Відповідно, існує необхідність у покращених і стабільних фармацевтичних складах, у яких ці ускладнення можуть бути усунуті.

Короткий опис винаходу

Для задоволення цих та інших потреб у даному документі передбачені високостабільні склади на основі біспецифічних антитіл до ІІ -4/ЛІ-13. Високостабільні склади на основі біспецифічних антитіл до ІІ -4/І -13 були несподівано виявлені у формі рідин та ліофілізованих порошків, що містять біспецифічне антитіло до І -4/ЛІ/-13 і буферну систему, де рН складу становить приблизно рн 7, і де склад характеризується низькою концентрацією солей з метою зниження іонної сили складу. Склади необов'язково можуть додатково містити неіоногенну поверхнево-активну речовину, цукор та/або неіоногенний стабілізатор. Дані склади покращені відносно традиційних складів, у яких підвищення концентрації антитіла в складі часто приводить до утворення молекулярних агрегатів (НМУМ) антитіла та утворенню видимих і не видимих неозброєним оком частинок. Зокрема, склади за даним винаходом проявляють високу стабільність відносно видимих частинок, не видимих неозброєним оком частинок, низькомолекулярних білків і високомолекулярних білків.

У варіанті здійснення даного винаходу передбачений стабільний склад на основі антитіла, що містить: біспецифічне антитіло до ІЇ-4/Л/-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент, що містять легкий ланцюг формули МІ1-лінкер-МІ 2 та важкий ланцюг формули УНІ -лінкер-УН2, де

МІ1 ї МНІ утворюють антиген-зв'язуючий домен для 1-13, а М 2 і МН2 утворюють антиген- зв'язуючий домен для 1-4; і буферну систему, що підходить для підтримки рН складу при приблизно рН 7; і де склад характеризується низькою концентрацією солей з метою зниження іонної сили складу.

В конкретних варіантах здійснення МІ/1 містить послідовності СОК ЗЕО ІЮ МО: 1; МНІ1 містить послідовності СОК 5ЕО ІЮО МО: 2; МІ 2 містить послідовності СОК 5ЕО ІЮО МО: 3; а МН2 містить послідовності СОК 5ЕО ІО МО: 4 або 5. В альтернативних конкретних варіантах здійснення МІ 1 містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 1; МНІ містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2; МІ2 містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: З; а МН2 містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 4 або 5.

В конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг має формулу М-МІ 1-лінкер-МІ 2-СІ, де СІ. являє собою константний домен легкого ланцюга антитіла, і де важкий ланцюг має формулу М- 60 МНІ-лінкер-МН2-СНІ-СН2-СНЗ, де СН2-СНЗ відповідає Ес-домену антитіла. В конкретних варіантах здійснення лінкер містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮО МО: 6.

В конкретних варіантах здійснення антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент додатково містять домен константної області В конкретних варіантах здійснення домен константної області обраний з групи, що складається з СНІ, СН2, СНЗ і СІ.

В конкретних варіантах здійснення біспецифічне антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент являють собою гуманізоване біспецифічне антитіло Ідсе4 або його антиген-зв'язуючий фрагмент.

В конкретних варіантах здійснення концентрація антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента становить приблизно 100 мг/мл.

У певних варіантах здійснення даного винаходу буферна система містить щонайменше два буфери. В конкретних варіантах здійснення концентрація буферної системи становить приблизно 10 мМ. В конкретних варіантах здійснення буферна система містить Тгі5-буфер і фосфатний буфер. В конкретних варіантах здійснення концентрація Тгіз-буфера становить приблизно 3,7 мМ. В конкретних варіантах здійснення концентрація фосфатного буфера становить приблизно 6,3 мМ. В конкретних варіантах здійснення концентрація Тгіз-буфера становить приблизно 3,7 мМ, а концентрація фосфатного буфера становить приблизно 6,3 мМ.

У певних варіантах здійснення даного винаходу склад додатково містить неіїоногенну поверхнево-активну речовину. В конкретних варіантах здійснення концентрація неіїоногенної поверхнево-активної речовини становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 0,2 95 (вага/об'єм).

В конкретних варіантах здійснення неіоногенна поверхнево-активна речовина являє собою полісорбат. В конкретних варіантах здійснення полісорбат являє собою полісорбат 80. В конкретних варіантах здійснення концентрація полісорбату 80 становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 0,2 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення концентрація полісорбату 80 становить приблизно 0,2 95 (вага/об'єм).

У певних варіантах здійснення даного винаходу склад додатково містить цукор. В конкретних варіантах здійснення концентрація цукру становить приблизно 5 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення цукор являє собою дисахарид. В конкретних варіантах здійснення дисахарид являє собою цукрозу. В конкретних варіантах здійснення концентрація цукрози становить приблизно 5 95 (вага/об'єм).

У певних варіантах здійснення даного винаходу склад додатково містить неійоногенний стабілізатор. В конкретних варіантах здійснення концентрація неіоногенного стабілізатора становить від приблизно 1 95 до приблизно 3 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення неіоногенний стабілізатор являє собою або амінокислоту, або цукор. В конкретних варіантах здійснення амінокислота являє собою пролін. В конкретних варіантах здійснення цукор являє собою маніт. В конкретних варіантах здійснення концентрація проліну становить від приблизно 195 до приблизно З 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення концентрація проліну становить приблизно З 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення концентрація маніту становить приблизно З 95 (вага/об'єм).

У певних варіантах здійснення даного винаходу склад являє собою ліофілізований склад.

У певних варіантах здійснення даного винаходу склад проявляє високу стабільність відносно видимих частинок, не видимих неозброєним оком частинок, низькомолекулярних білків і високомолекулярних білків.

У варіанті здійснення даного винаходу передбачений стабільний ліофілізований склад на основі антитіла, що містить: приблизно 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2 їі 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 і 3; приблизно 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіє-буфер у концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; приблизно 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80; приблизно 5 95 (вага/об'єм) цукрози та приблизно З 95 (вага/об'єм) проліну; де рН складу становить приблизно рн 7.

У варіанті здійснення даного винаходу передбачений стабільний ліофілізований склад на основі антитіла, що містить: приблизно 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2 ії 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 і 3; приблизно 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіє-буфер у концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; приблизно 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80; приблизно 5 95 (вага/об'єм) цукрози та приблизно З 95 (вага/об'єм) бо маніту; де рН складу становить приблизно рн 7.

У варіанті здійснення даного винаходу передбачений набір, що включає ємність, яка містить склад за даним винаходом та інструкції із введення та застосування складу.

У варіанті здійснення даного винаходу передбачений спосіб лікування алергічного захворювання, раку, астми, захворювання, асоційованого з аномальним виробленням ІІ -4 та/або 1-13, або захворювання, асоційованого з посиленою відповіддю, опосередкованою ТнН-2, який включає введення складу за даним винаходом суб'єкту, який цього потребує.

Короткий опис графічних матеріалів

Фігура 1 являє собою схематичне зображення, на якому показана ілюстративна молекула біспецифічного антитіла до ІІ -4/І-13, що містить два легких ланцюги та два важких ланцюги.

Два легких ланцюги містять компонент М-Мі нв-віз-лінкер-Мі нвол---СІ-С, а два важких ланцюги містять компонент М-МНев-віз-лінкер-МНивог-3-СНІ-СН2-СНЗ-С. Послідовність лінкера містить (с245)» або ОБОО5ОСОСО5 (5ЕО ІО МО: 6).

На фігурі 2 зображені амінокислотні послідовності ілюстративного антитіла, тобто гуманізовані варіабельні домени антитіла В-В13 до ІЇ/-13 (5ЕО ІО МО: 1 та 2) і гуманізовані варіабельні домени антитіла 804-8 до ІЇ/-4 (5ЕО ІО МО: 3, 4 та 5). Підкресленням показані проведені амінокислотні заміни. Жирним шрифтом показані послідовності СОК (ЗЕО ІЮО МО: 7- 21).

Фігура З являє собою групу зображень, на яких показано забруднення частинками в аналізі

Мо Р5 (підбирання рН буфера) після впливу струшування.

Фігура 4 являє собою графік, на якому показано забруднення не видимими неозброєним оком частинками » 1,5 мкм після декількох видів впливу в аналізі Мо РбЄ (підбирання рН буфера).

Фігура 5 являє собою графік, на якому показано забруднення не видимими неозброєним оком частинками » 10 мкм після декількох видів впливу в аналізі Мо РбЄ (підбирання рН буфера).

Фігура 6 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМУ в аналізі Ме РбЄ (підбирання рн буфера) після термічного впливу.

Фігура 7 являє собою графік, на якому показані ЗЕС-хроматограми в аналізі Мо Р5 (підбирання рН буфера) через 2 тижні при 45 "С.

Фігура 8 являє собою зображення гелю для 5О5-РАСЕ в аналізі Ме Р5 (підбирання рн буфера) через 2 тижні при 45 "С.

Зо Фігура 9 являє собою зображення гелю для ІЕЕ через 2 тижні при 45 "С в аналізах Мо Р5 і Мо 6 (підбирання рН буфера).

Фігура 10 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ після завершення програми впливу в аналізі Мо РІЗ (ефект солей).

На фігурі 11 показані зображення світлин, отриманих за допомогою бінокулярного мікроскопа в аналізі Мо Р12 (поверхнево-активна речовина) після механічного впливу.

Фігура 12 являє собою графік, на якому показано відстеження рівня НММУ в аналізі Мо Р12 (поверхнево-активна речовина) при зберіганні протягом 6 тижнів при 5 "С.

Фігура 13 являє собою графік, на якому показано відстеження рівня НММУ в аналізі Мо Р12 (добавка) при зберіганні протягом 6 тижнів при 5 "С.

Фігура 14 являє собою графік, на якому показано відстеження рівня НМУУ в аналізі Мо Р20-

ЕОЗ5 (добавка) при зберіганні протягом 4 тижнів при 5 "С.

Фігура 15 являє собою графік, на якому показано відстеження рівня НМУМ в аналізі Мо Р21 (добавка) при зберіганні протягом 2 тижнів при 5 "С.

Фігура 16 являє собою графік залежності зворотного показника змісту мономерів від часу при порівнянні 1 Фо проліну з З 95 проліном у лідерному складі.

Фігура 17 являє собою графік послідовних змін температури протягом способу сублімаційного сушіння складу Мо Р16-1.

На фігурі 18 показані зображення осаду Мо Р18-1 у флаконі з пресованого скла на 15 мл.

Фігура 19 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ в аналізі Мо Р14 (добавка) після завершення способу ліофілізації.

Фігура 20 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ в аналізі Мо Р20 (добавка) після ліофілізації.

Фігура 21 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ (а) і зображення (Б) після завершення циклу заморожування-розморожування для нескладеного О5 (аналіз Мо 9).

Фігура 22 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУУ в аналізі Мо Р14 (добавка) після розведення.

Фігура 23 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ в аналізі Мо Р2О (добавка) після розведення.

Фігура 24 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ в аналізі Мо Р17 (добавка) бо після зберігання та розведення осаду.

Фігура 25 являє собою графік, на якому показаний рівень НМУМ в аналізі Мо Р2О (добавка) після зберігання та розведення осаду.

Фігура 26 являє собою графік, на якому показані результати О5С для першого підбирання (аналізи МоМо НО4-150-172 - підбирання рН буфера).

На фігурі 27 показані зображення візуального аспекту складів з гістидином та сукцинатом (аналізи МоМе Р-НО4-144 та Мо 148, МоМмо НО4-150 А1-Аб).

Фігура 28 являє собою графіки, на яких показана динаміка рівня НММ/ для підбирання буфера при 5 "С (аналізи МоМо НО4-150 ВІ) і КТ (аналізи МоМо НО4-163 АТ, В1, В2 і НО4-172 АТ,

А2), визначена за допомогою 5ЕС.

Фігура 29 являє собою графік, на якому показані результати ЮО5С для підбирання рн фосфатного/Ігіз-буфера (аналізи МоМо НО4-187).

Фігура 30 являє собою графік, на якому показана динаміка рівня НМУМ для підбирання рн фосфатного/Ігіз-буфера, визначена за допомогою ЗЕС (аналізи МоМо НО4-187).

Фігура 31 являє собою графік, на якому показані результати О5С для підбирання концентрації буфера (аналізи МоМо НО4-185).

Фігура 32 являє собою графіки, на яких показана динаміка рівня НМУМ залежно від концентрації буфера при КТ, визначена за допомогою ЗЕС (аналізи МоМо НО4-185).

Фігура 33 являє собою графік, на якому показана динаміка рівня НМУМ для Масі при КТ, визначена за допомогою 5ЕС (аналізи МоМео НО4-185).

Фігура 34 являє собою таблицю, у якій показана динаміка рівня НМУМ для гліцину в порівнянні з цукрозою при КТ, визначена за допомогою 5ЕС (аналізи МоМе НО4-185).

Докладний опис

Даний винахід не обмежений конкретними методиками, протоколами, лініями клітин, векторами або реагентами, описаними в даному документі, оскільки вони можуть варіювати без відступу від суті та обсягу даного винаходу. Крім того, термінологія, використана в даному документі, служить тільки для пояснення на прикладі конкретних варіантів здійснення та не призначена для обмеження обсягу даного винаходу. Будь-який спосіб і матеріал, подібний до описаних в даному документі або еквівалентний їм, можна застосовувати при практичному здійсненні даного винаходу, і в даному документі описані тільки ілюстративні способи,

Ко) обладнання та матеріали.

Усі патенти та публікації, згадані в даному документі, включені в даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання з метою опису та розкриття білків, ферментів, векторів, клітин- хазяїв і методик, що описують в ньому, які можна застосовувати разом з даним винаходом та в його рамках. Однак, ніщо в даному документі не слід тлумачити як визнання того, що даний винахід не має підстав для протиставлення такому розкриттю як більш ранній винахід.

А. Визначення

Якщо не визначене інше, усі технічні та наукові терміни, використовувані в даному документі, мають таке ж значення, яке зазвичай розуміється фахівцем у даній галузі.

В даному документі зазначено, що застосовані в даному описі та доданій формулі винаходу форми однини також включають посилання на множину, якщо в контексті прямо не зазначено інше.

Термін "майже" або "приблизно" означає в межах 10 95 і більш переважно в межах 5 95 (або 1 95, або менше) від зазначеного значення або діапазону.

Терміни "вводити" або "введення" відносяться до акту ін'єкції або іншої фізичної доставки речовини, що перебуває поза організмом (наприклад, складу за даним винаходом), пацієнтові, як, наприклад, за допомогою черезслизової, внутрішньошкірної, внутрішньовенної, підшкірної, внутрішньом'язової доставки та/або будь-якого іншого способу фізичної доставки, описаного в даному документі або відомого з рівня техніки. Якщо здійснюють лікування захворювання або його симптому, то введення речовини, як правило, відбувається після початку прояву захворювання або його симптомів. Якщо здійснюють попередження захворювання або його симптомів, то введення речовини, як правило, відбувається до початку прояву захворювання або його симптомів.

Стосовно поліпептиду термін "аналог" відноситься до поліпептиду, що має функцію, подібну або ідентичну такій у біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/І/-13, фрагмента біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/І/-13, біспецифічного епітоп-зв'язуючого фрагмента для ІІ -4/ЛІ/-13 або біспецифічного антитіла до ІІ -4/ЛІ-13, але що не обов'язково містить амінокислотну послідовність, подібну або ідентичну такій у біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/І-13, фрагмента біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІЇ-4/ЛІ-13, біспецифічного епітоп-зв'язуючого фрагмента для ІІ -4/І -13 або біспецифічного антитіла до ЇЇ - 60 АЛІ-13, або, що має структуру, подібну або ідентичну такій у біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/ЛІ-13, фрагмента біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/ЛІ-13, біспецифічного епітоп-зв'язуючого фрагмента для ІІ -4/І -13 або біспецифічного антитіла до ЇЇ - 4ЛІ-13. Поліпептид, що має подібну амінокислотну послідовність, означає поліпептид, що задовольняє щонайменше одному з наступного: (а) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95 і переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 9595 або найбільш переважно щонайменше на 99595 ідентичну амінокислотній послідовності біспецифічного поліпептиду, що зв'язується зії -4/І -13 (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 1-5), фрагмент біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІЇ-4/І -13, біспецифічний епітоп-зв'язуючий фрагмент для ЇЇ -АЛІ - 13 або біспецифічне антитіло до ІІЇ-4/ЛІ/-13, описані у даному документі; (Б) поліпептид, що кодується нуклеотидною послідовністю, яка гібридизується в жорстких умовах з нуклеотидною послідовністю, що кодує біспецифічний поліпептид, що зв'язується з ІІ -4/ЛІ/-13, фрагмент біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/І/-13, біспецифічний епітоп-зв'язуючий фрагмент для ІІ -4/І -13 або біспецифічне антитіло до І -4/І -13 (або його УН-, або МІ -область), описані в даному документі, що мають щонайменше 5 амінокислотних залишків, щонайменше 10 амінокислотних залишків, щонайменше 15 амінокислотних залишків, щонайменше 20 амінокислотних залишків, щонайменше 25 амінокислотних залишків, щонайменше 40 амінокислотних залишків, щонайменше 50 амінокислотних залишків, щонайменше 60 амінокислотних залишків, щонайменше 70 амінокислотних залишків, щонайменше 80 амінокислотних залишків, щонайменше 90 амінокислотних залишків, щонайменше 100 амінокислотних залишків, щонайменше 125 амінокислотних залишків або щонайменше 150 амінокислотних залишків (див., наприклад, Затьгоок еї аї. (2001) МоіІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїогу

Мапиаї, Соїд З5ргіпд Натог І арогаюгу Ргев55, Соїд Зргіпд Наїтбог, М.У.; Мапіаїйв еї аї. (1982)

Моїесшіаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиаї, Соїд 5ргіпа Нагрог Ргезв, Соїд 5ргіпд Нагбог, М.М.); і (с) поліпептид, що кодується нуклеотидною послідовністю, щонайменше на 30 95, щонайменше на 3595, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 5595, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на

Зо 75965, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95 і переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 95 95 або найбільш переважно щонайменше на 99 95 ідентичною нуклеотидній послідовності, що кодує біспецифічний поліпептид, що зв'язується з ЇЇ -4/ЛІ-13, фрагмент біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з І/-4/ЛІ-13, біспецифічний епітоп- зв'язуючий фрагмент для ІЇ-4/І-13 або біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ-13 (або його УН-, або

МІ область), описані в даному документі. Поліпептид зі структурою, подібною такій у біспецифічного поліпептидного антитіла до ІІ-4/ЛІ/-13, фрагмента біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ-4/ЛІ-13, біспецифічного епітоп-зв'язуючого фрагмента для ІІ-4/ЛІ/-13 або біспецифічного антитіла до ІЇ-4/ЛІ/-13, означає поліпептид, що має вторинну, третинну або четвертинну структуру, подібну такій у біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІІ -4/І-13, фрагмента біспецифічного поліпептиду, що зв'язується з ІЇ-4/ЛІ-13, біспецифічного епітоп- зв'язуючого фрагмента для ІІ/-4/ЛІ/-13 або біспецифічного антитіла до ІЇ-4/ЛІ-13. Структуру поліпептиду можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у даній галузі, що включають, без обмеження, рентгенівську кристалографію, ядерний магнітний резонанс і кристалографічну електронну мікроскопію.

Для визначення відсоткової ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох послідовностей нуклеїнової кислоти послідовності вирівнюють 3 метою оптимального порівняння (наприклад, у першу амінокислотну послідовність або послідовність нуклеїнової кислоти можна вводити гепи для оптимального вирівнювання з другою амінокислотною послідовністю або послідовністю нуклеїнової кислоти). Амінокислотні залишки або нуклеотиди у відповідних положеннях амінокислот або положеннях нуклеотидів потім порівнюють. Якщо положення в першій послідовності зайняте тим же амінокислотним залишком або нуклеотидом, що й відповідне положення в другій послідовності то молекули є ідентичними за цим положенням. Відсоткова ідентичність двох послідовностей залежить від кількості ідентичних положень, загальних для послідовностей (тобто 95 ідентичності - кількість ідентичних положень, що перекриваються/загальна кількість положень Х 100 95). В одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину.

Визначення відсоткової ідентичності двох послідовностей (наприклад, амінокислотних послідовностей або послідовностей нуклеїнової кислоти) також можна здійснювати за допомогою математичного алгоритму. Переважним необмежуючим прикладом математичного бо алгоритму, використовуваного для порівняння двох послідовностей, є алгоритм Капйіп апа

АЇїзспиі, 1990, Ргос. Маї). Асай. осі. 0.5.А. 87:2264-2268, у модифікації за Капіп апа Айвсниї, 1993, Ргос. Маї. Асад. сі. Ш.5.А. 90:5873-5877. Цей алгоритм включений до складу програм

МВІ А5Т та ХВІ АТ, описаних в АЇЇ5спиЇ єї аї., 1990, 9. Мої. ВіоІ. 215:403. Пошук нуклеотидних послідовностей в ВГАБТ можна проводити за допомогою програми пошуку нуклеотидних послідовностей МВІ А5Т з параметрами, встановленими, наприклад, для ваги - 100, довжини слова - 12, для отримання нуклеотидних послідовностей, гомологічних молекулам нуклеїнових кислот, що представляють інтерес. Пошук амінокислотних послідовностей в ВГА5Т можна проводити за допомогою програми ХВІ АТ з параметрами, встановленими, наприклад, для ваги - 50, довжини слова - 3, для отримання амінокислотних послідовностей, гомологічних молекулі білка, що представляє інтерес. Для отримання вирівнювань з гепами для цілей порівняння можна використовувати ВІ А5Т з гепами, описаний в Аївбспиї еї аї., 1997, Мисієїс

Асід5 ВНев. 25:3389-3402. Альтернативно, можна застосовувати РБІ-ВІАБТ для виконання ітеративного пошуку, що виявляє віддалене споріднення між молекулами (Іа.). При використанні програм ВІГАБТ, ВІАБТ з гепами та РБІ-ВІА5БТ можна застосовувати параметри за промовчанням відповідних програм (наприклад, ХВІАБТ і МВІАБТ) (див., наприклад,

Національний центр біотехнологічної інформації (МСВІ) в Інтернеті за адресою пебі.піт.пійп.дом).

Іншим переважним необмежуючим прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовностей, є алгоритм Муєт5 апа Мійег, 1988, САВІО5 4711-17 Цей алгоритм включений до складу програми АГІСМ (версії 2.0), яка є частиною пакета програмного забезпечення СО для вирівнювання послідовностей. При використанні програми АГІСМ для порівняння амінокислотних послідовностей можна застосовувати таблицю ваг замін залишків

РАМ120, штраф за продовження гепу 12 і штраф за відкриття гепу 4.

Відсоткову ідентичність двох послідовностей можна визначити за допомогою методик, подібних описаним вище, допускаючи або не допускаючи гепи. При розрахунках відсоткової ідентичності зазвичай підраховують тільки точні збіги. "Антагоніст" або "інгібітор" відноситься до молекули, здатної до інгібування одного або декількох видів біологічної активності цільової молекули, такого як передача сигналу за допомогою 1/-4 та/або 1ІЇ/-13. Антагоністи можуть перешкоджати зв'язуванню рецептора з лігандом і навпаки шляхом обмеження здатностей або знищення клітин, що активуються

Зо лігандом, та/"або шляхом перешкоджання активації рецептора або ліганду (наприклад, активації тирозинкінази) або передачі сигналу після зв'язування ліганду з рецептором. Антагоніст може повністю блокувати взаємодії рецептора та ліганду або може значно послабляти такі взаємодії.

У певних варіантах здійснення даного винаходу біспецифічні антитіла до 1 -4/ЛІ-13 є гуманізованими антагоністичними біспецифічними антитілами до 1/-4/ЛІ-13, переважно гуманізованими моноклональними антагоністичними біспецифічними антитілами до ІЇ--АЛІ -13.

Терміни "антитіло", "імуноглобулін" або "Ід" можуть застосовуватися в даному документі на рівних підставах. Термін "антитіло" включає, без обмеження, синтетичні антитіла, моноклональні антитіла, антитіла, отримані рекомбінантним шляхом, поліспецифічні антитіла (у тому числі біспецифічні антитіла), людські антитіла, гуманізовані антитіла, химерні антитіла, внутрішньоклітинні антитіла, одноланцюгові Ем (5СсЕм) (у тому числі, наприклад, моноспецифічні, біспецифічні тощо), камелізовані антитіла, Рар-фрагменти, Е(абБ)-фрагменти, Ем з дисульфідними зв'язками (з5агм), антіїдіотипічні (анті-І4) антитіла та епітоп-зв'язуючі фрагменти будь-яких з вищевказаних об'єктів. Зокрема, антитіла включають молекули імуноглобулінів та імунологічно активні частини молекул імуноглобулінів, тобто антиген-зв'язуючі домени або молекули, що містять антиген-зв'язуючу ділянку, що специфічно зв'язується з антигеном 1-4 або І--13 (наприклад, одну або кілька областей, що визначають комплементарність (СОК), біспецифічного антитіла до ІІ -4/ЛІ-13). Біспецифічні антитіла до І -4/ЛІ -13 можуть належати до будь-якого типу (наприклад, дос, ІДЕ, ІМ, дО, ІдА та Ід), можуть належати до будь-якого класу (наприклад, Ідс1, Ідс2, ІдЗ, Ідс4, ІДА1 та ІдДАг) або будь-якому підкласу (наприклад, Ідсга та

Ід925) молекул імуноглобулінів. У переважних варіантах здійснення біспецифічні антитіла до ІІ -

АЛІ -13 є гуманізованими, такими як гуманізовані моноклональні біспецифічні антитіла до ІІ -4АЛІ - 13. У певних варіантах здійснення біспецифічні антитіла доїІ -4/І -13 являють собою антитіла

ІЧО, людські антитіла ІдсаА.

Термін "антиген" відноситься до молекули або частини молекули, здатної до зв'язування антитілами за даним винаходом. Антиген може мати один або більше одного епітопа. Приклади антигенів, що розпізнаються антитілами за даним винаходом, включають, без обмеження, сироваткові білки, наприклад, цитокіни, такі як 1І--4, ІІ -5, 1 -9 ї І--13, біологічно активні пептиди, молекули клітинної поверхні, наприклад, рецептори, переносники, іонні канали, вірусні та бактеріальні білки. 60 Термін " антиген-зв'язуюча ділянка" відноситься до частини антитіла, що містить область,

що специфічно зв'язується з частиною антигену або всім антигеном та комплементарну їм.

Якщо антиген є великим, антитіло може зв'язуватися тільки з певною частиною антигену, яка називається епітопом. Антиген-зв'язуючий домен може бути представлений у вигляді одного або декількох варіабельних доменів антитіла. Антиген-зв'язуючий домен переважно утворений з'єднанням варіабельного домену легкого ланцюга антитіла (МІ) і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла (МН).

Термін "зв'язуючий засіб" відноситься до будь-якої молекули, такої як антитіло, 5ікМА, нуклеїнова кислота, аптамер, білок або низькомолекулярна органічна сполука, що зв'язується або специфічно зв'язується з ІІ -4 та/або ІІ -13 або їх варіантом або фрагментом.

Терміни "біспецифічне антитіло" або "біспецифічні антитіла (В5АБ)" відносяться до молекул, у яких антиген-зв'язуючі ділянки двох антитіл об'єднані в одній молекулі. Таким чином, біспецифічне антитіло здатне зв'язуватися з двома різними антигенами одночасно. Крім шляхів застосування з метою діагностики, ВБАБ створюють передумови для нових шляхів застосування в терапії за допомогою перенаправлення сильних ефекторних систем на уражені ділянки або за допомогою посилення нейтралізуючих або стимулюючих видів активності антитіл. Біспецифічні антитіла можуть бути моноклональними, але переважно є людськими або гуманізованими.

Способи отримання біспецифічних антитіл добре відомі в даній галузі техніки.

Термін "побічний продукт" включає небажані продукти, які зменшують або знижують відносний зміст терапевтичного/профілактичного зв'язуючого засобу, такого як антитіло, у зазначеному складі. Наприклад, типові побічні продукти включають агрегати антитіла, фрагменти антитіла, наприклад, отримані внаслідок розпаду антитіл шляхом дезамідування або гідролізу, або їх суміші. Як правило, агрегати являють собою комплекси, що мають молекулярну масу, більшу, ніж у мономерного антитіла. Продукти розпаду антитіл можуть включати, наприклад, фрагменти антитіла, наприклад, отримані в результаті дезамідування або гідролізу.

Як правило, продукти розпаду являють собою комплекси, що мають молекулярну масу, меншу, ніж у мономерного антитіла. У випадку антитіла Ідс такі продукти розпаду мають розмір менше, ніж приблизно 150 кДа.

Терміни "композиція" та "склад" призначені для охоплення продукту, що містить конкретні інгредієнти (наприклад, біспецифічне антитіло до І--4/ЛІ--13), необов'язково в певних кількостях,

Зо а також будь-якого продукту, що прямо або побічно утворюється в результаті об'єднання певних інгредієнтів, необов'язково в певних кількостях.

Терміни "константна область" або "константний домен" відносяться до карбоксі-кінцевої частини легкого та важкого ланцюгів, безпосередньо не залученої до зв'язування антитіла з антигеном, але, що проявляє різні ефекторні функції, такі як взаємодія з Ес-рецептором.

Терміни відносяться до частини молекули імуноглобуліну, що має більш консервативну амінокислотну послідовність у порівнянні з іншою частиною імуноглобуліну, варіабельним доменом, яка містить антиген-зв'язуючу ділянку. Константний домен містить домени СНІ, СН2 і

СНЗ важкого ланцюга і домен СНІ. легкого ланцюга.

Термін "порушення" відноситься до будь-якого стану, лікування якого за допомогою складу за даним винаходом буде мати користь. Він включає хронічні та гострі порушення або захворювання, у тому числі ті патологічні стани, які провокують розвиток в ссавців, і зокрема, у людей, порушення, яке розглядається. Необмежуючі приклади порушень, що підлягають лікуванню в даному документі, включають форми раку, запалення, аутоїмунні захворювання, інфекції, серцево-судинні захворювання, захворювання органів дихання, неврологічні захворювання та метаболічні захворювання.

Термін "епітоп" відноситься до обмеженої області на поверхні антигену, такого як поліпептид

І -4 або І--13 або фрагмент поліпептиду 1-4 або 1-13, здатної до зв'язування з однією або декількома антиген-зв'язуючими областями зв'язуючого засобу, такого як антитіло, та що має антигенну або імуногенну активність у тварини, переважно в ссавця та найбільш переважно в людини, яка здатна викликати імунну відповідь. Епітоп, що має імуногенну активність, являє собою частину поліпептиду, що викликає утворення антитіл у тварини. Епітоп, що має антигенну активність, являє собою частину поліпептиду, з якою специфічно зв'язується антитіло, що визначається за допомогою будь-якого способу, добре відомого в даній галузі техніки, наприклад, такого, як імунологічний аналіз. Епітопи антигену не обов'язково повинні бути імуногенними. Епітоп зазвичай складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як амінокислоти та/або цукрові бокові ланцюги, і мають конкретні характеристики тривимірної структури, а також конкретні характеристики заряду. Область поліпептиду, що бере участь в утворенні епітопу, може являти собою суміжні амінокислоти поліпептиду, або епітоп може бути утворений двома або більшою кількістю несуміжних областей поліпептиду. Епітоп 60 може представляти або не представляти собою тривимірну характерну поверхневу ознаку антигену. У певних варіантах здійснення епітоп І/-4 або 1ІЇ/-13 являє собою тривимірну характерну поверхневу ознаку поліпептиду ІІ--4 або 1-13. В інших варіантах здійснення епітоп

ІЇ-4 або 1-13 являє собою лінійну характерну ознаку поліпептиду ІІ -4 або 1-13. Біспецифічні антитіла до ІІ -4/ЛІ -13 можуть специфічно зв'язуватися з епітопом денатурованої форми ІІ -4 або

І/-13, епітопом нативної форми ІІ -4 або ІІ -13 або як з денатурованою формою, так і з нативной формою ЇЇ -4 або ЇЇ -13.

Термін "наповнювачі" відноситься до інертних речовин, що зазвичай застосовують як розріджувач, носій, консервант, зв'язуючу речовину, стабілізатор і т. п. для лікарських засобів, і включає, без обмежень, білки (наприклад, сироватковий альбумін і т. п.), амінокислоти (наприклад, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, лізин, аргінін, гліцин, гістидин і т. п.), жирні кислоти та фосфоліпіди (наприклад, алкілсульфонати, каприлат і т. п.), поверхнево- активні речовини (наприклад, 505, полісорбат, неіоногенну поверхнево-активну речовину і т. п.), сахариди (наприклад, цукрозу, мальтозу, трегалозу і т. п.) та поліоли (наприклад, маніт, сорбіт і т. п.). Див. також Кетіпдіоп'є Рпаптасешіса! 5сіепсев (1990) Маск Рибіїхпіпд Со., Еавіоп,

Ра., який включений у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Стосовно пептиду або поліпептиду термін "фрагмент" відноситься до пептиду або поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність менше ніж повної довжини. Такий фрагмент може, наприклад, бути отриманий у результаті амінокінцевого усікання, карбоксікінцевого усікання та/або внутрішньої делеції залишку(залишків) в амінокислотній послідовності. Утворення фрагментів може, наприклад, бути обумовлене альтернативним сплайсингом РНК або протеазною активністю іп мімо. У певних варіантах здійснення фрагменти

МІЇ-4 або пПІ/-13 включають в себе поліпептиди, що містять амінокислотну послідовність зі щонайменше 5 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 10 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 15 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 20 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 25 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 40 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 50 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 60 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 70 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 80 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 90 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 100 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше

Зо 125 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 150 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 175 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше 200 суміжних амінокислотних залишків або щонайменше 250 суміжних амінокислотних залишків амінокислотної послідовності поліпептиду 1-4 або 1/-13 або антитіла, що специфічно зв'язується з поліпептидом ІІ --4 або ІІ -13.

Фрази та терміни "функціональний фрагмент, варіант, похідне або аналог" і т. п., а також їх форми, стосовно антитіла або антигену означають сполуку або молекулу, що мають якісну біологічну активність нарівні з антитілом або антигеном повної довжини, що представляють інтерес. Наприклад, функціональний фрагмент або аналог антитіла до 1-4 може зв'язуватися з молекулою //-4 або може перешкоджати здатності ліганду або агоністичного або антагоністичного антитіла до зв'язування з ІЇ -4 або значно послабляти таку.

Термін "важкий ланцюг", який застосовують відносно антитіла, відноситься до п'яти різних типів, що називають альфа (0), дельта (4), епсілон (є), гамма (у) та мю (р), які виділяють на підставі амінокислотної послідовності константного домену важкого ланцюга. Ці різні типи важких ланцюгів добре відомі в даній галузі техніки та служать підставою для виділення п'яти класів антитіл, ІДА, ДО, ІДЕ, до та І9М, відповідно, що включають чотири підкласи Ідс, а саме

ІЧС1, ІДдДС1, ІдоЗ та Ідс4. Важкий ланцюг переважно являє собою людський важкий ланцюг.

Термін "шарнір" або "шарнірна ділянка" відносяться до гнучкого поліпептиду, що містить амінокислоти між першим і другим константними доменами антитіла. "Гуманізовані" форми відмінних від людських (наприклад, мишачих) антитіл являють собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (такі як Ру, ЕРаь, Ра», Е(аь)2 або інші зв'язуючі ціль підпослідовності антитіл), які містять послідовності, отримані з імуноглобуліну, відмінного від людського, у порівнянні з людським антитілом. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити один, а найчастіше два варіабельні домена, практично в усіх з яких всі або практично всі СОК-області відповідають таким в імуноглобуліні, відмінному від людського, а всі або практично всі ЕК-області отримані з матричної послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло також може містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Ес), зазвичай з обраної матриці на основі людського імуноглобуліну. Як правило, метою є отримання молекули антитіла, що має мінімальну імуногенність в організмі людини. Таким чином, одну або кілька амінокислот в одній або декількох СОК також можна бо замінити на менш імуногенні для людини-хазяїна без істотної мінімізації функції специфічного зв'язування однієї або декількох СОМ з 1І/-4 та/або І/-13. Альтернативно, ЕЕ може бути відмінною від людської, але найбільш імуногенні амінокислоти заміщують менш імуногенні.

Проте, пересадження СОМ, обговорюване вище, не є єдиним способом отримання гуманізованого антитіла. Наприклад, модифікація тільки СОК-областей може бути недостатньої, оскільки у визначенні тривимірної структури СОК-петель і загальної афінності антитіла до свого ліганду нерідко відіграють роль залишки каркасної області. Отже, на практиці можна застосовувати будь-які засоби, щоб модифікувати вихідну молекулу антитіла, відмінного від людського, роблячи її менш імуногенною для людини, і глобальна ідентичність послідовностей з людським антитілом не завжди є необхідною. Таким чином, гуманізацію також можна здійснювати, наприклад, лише шляхом заміни лише декількох залишків, зокрема тих, що знаходяться на поверхні молекули антитіла, і не занурених усередину молекули, і, отже, що не є легкодоступними для імунної системи хазяїна. Див., наприклад, 5ішапіска еї аїЇ., Ргої Епд 7(6)805-814, 1994; Мої Ітт 44:1986-1988, 2007; 5ітв еї аї., У Іттипої 151:2296 (1993); Споїніа єї а!., У Мої Віої 196:901 (1987); Сапег єї аї!., Ргос Маї! Асай бсі ОБА 89:4285 (1992); Ргевіа еї аї., У

Іттітипої 151:2623 (1993), УМО 2006/042333 і патент США Мо 5869619. Альтернативно, антитіла можна гуманізувати за допомогою інших методик, у тому числі пересадженням СОК (ЕРО 0 239 400; УМО 91/09967 і патенти США МоМо 5530101 і 5585089), веніруванням або зміни поверхні (ЕРО 0 592 106; ЕРО 0 519 596; Радіап, 1991, Моїес Ітт 28(4/5):489-498; 5щапіскКка еї а!., 1994,

Ргої Епа 7(6):805-814; ії Кодиз5ка еї аІ., 1994, РМАБЗ 91:969-973) і перетасуванням ланцюгів (патент США Мо 5565332). Людські антитіла можна одержувати за допомогою ряду способів, відомих у даній галузі техніки, що включають, без обмеження, способи фагового дисплею, див. патенти США МоМо 4444887, 4716111, 5545806 і 5814318; а також УМО 98/46645, УМО 98/50433,

УМО 98/24893, УМО 98/16654, УМО 96/34096, МО 96/33735 і МО 91/10741, з використанням трансгенних тварин, таких як гризуни, з використанням химерних клітин тощо. "Інтерлейкін-4" (ІІ -4) відноситься до білків ІЇ-4 ссавців, що зустрічаються в природі, або ендогенних білків ІЇ-4 ссавців і до білків, що мають таку ж амінокислотну послідовність, як і відповідні білки І/-4 ссавців, що зустрічаються в природі, або ендогенні білки 1-4 ссавців (наприклад, рекомбінантних білків, синтетичних білків (тобто які отримують за допомогою способів синтетичної органічної хімії)). Відповідно, визначений у даному документі термін

Зо включає зрілий білок ІЇ-4, поліморфні або алельні варіанти та інші ізоформи 1-4, а також модифіковані або немодифіковані форми вищезгаданих об'єктів (наприклад, ліпідизовані, глікозильовані). ІЇ/-4, що зустрічається в природі, або ендогенний ІЇ-4 включає в себе білки дикого типу, такі як зрілий 1-4, поліморфні або алельні варіанти та інші ізоформи і мутантні форми, що зустрічаються в природі у ссавців (наприклад, у людей, у відмінних від людини приматів). Такі білюи можна, наприклад, добувати або виділяти з джерела, що у природних умовах виробляє ІІ-4. Ці білки та білки, що мають таку ж амінокислотну послідовність, як і відповідні І/-4, що зустрічаються в природі, або ендогенні ІЇ-4, називають за назвою відповідного ссавця. Наприклад, якщо відповідним ссавцем є людина, то білок позначають як людський ЇЇ -4. У даній галузі техніки відомо кілька мутантних білків ІІ -4, таких як розкриті в МО 03/038041. "Інтерлейкін-13" (ІІ -13) відноситься до білків ІЇ-13 ссавців, що зустрічаються в природі, або ендогенних білків ІЇ/-13 ссавців і до білків, що мають таку ж амінокислотну послідовність, як і відповідні білки І/-13 ссавців, що зустрічаються в природі, або ендогенні білки 1-13 ссавців (наприклад, рекомбінантних білків, синтетичних білків (тобто які отримують за допомогою способів синтетичної органічної хімії)). Відповідно, визначений у даному документі термін включає зрілий білок І-13, поліморфні або алельні варіанти та інші ізоформи 1-13 (наприклад, отримані за допомогою альтернативного сплайсингу або інших клітинних процесів), а також модифіковані або немодифіковані форми вищезгаданих об'єктів (наприклад, ліпідизовані, глікозильовані). І--13, що зустрічаються в природі, або ендогенні І--13 включають в себе білки дикого типу, такі як зрілий 1-13, поліморфні або алельні варіанти та інші ізоформи та мутантні форми, що зустрічаються в природі в ссавців (наприклад, у людей, у відмінних від людини приматів). Наприклад, як використовується в даному документі, І/-13 охоплює варіант людського 1-13, асоційований з астмою (атопічною та неатопічною астмою), у якому Ага у положенні 110 зрілого людського 1-13 заміщений біп (положення 110 зрілого 1-13 відповідає положенню 130 білка-попередника), та інші варіанти ІЇ/-13 (Неіплтапп єї а), Нит Мої! Сепеї. 9:549-559 (2000)). Такі білюим можна, наприклад, добувати або виділяти з джерела, що у природних умовах виробляє 1/-13. Ці білки та білкию, що мають таку ж амінокислотну послідовність, як і відповідні І -13, що зустрічаються в природі, або ендогенні ІІ -13, називають за назвою відповідного ссавця. Наприклад, якщо відповідним ссавцем є людина, то білок 60 позначають як людський ІІ-13. У даній галузі техніки відомо кілька мутантних білків 1-13, таких як розкриті в МО 03/035847. "Виділений" або "очищений" зв'язуючий засіб, такий як антитіло, практично не містить клітинний матеріал або інших забруднюючих білків з клітинного або тканинного джерела, з якого отриманий зв'язуючий засіб, або практично не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин у випадку отримання шляхом хімічного синтезу. Наприклад, висловлення "практично не містить клітинний матеріал" включає препарати антитіл, у яких антитіло відділене від клітинних компонентів клітин, з яких воно виділене або отримане рекомбінантним шляхом. Таким чином, антитіло, що практично не містить клітинний матеріал, включає препарати антитіла, що мають менш ніж приблизно 30 95, 20 бо, 10 95 або 5 95 (за сухою вагою) гетерологічного білка (що також називається в даному документі "забруднюючим білком"). Якщо антитіло отримано рекомбінантним шляхом, то воно також переважно практично не містить культуральне середовище, тобто культуральне середовище представляє менш ніж приблизно 20 95, 10 95 або 5 95 від об'єму білкового препарату. Якщо антитіло отримане шляхом хімічного синтезу, то воно переважно практично не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин, тобто воно відділене від хімічних попередників або інших хімічних речовин, що брали участь у синтезі білка.

Відповідно, такі препарати антитіла мають менш ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 Фо, 5 95 (за сухою вагою) хімічних попередників або сполук, відмінних від антитіла, що представляє інтерес. У переважному варіанті здійснення біспецифічні антитіла до 1/-4/Л/-13 є виділеними або очищеними.

Термін "нумерація за Кабат" і подібні терміни прийняті в даній галузі техніки та відносяться до системи нумерації амінокислотних залишків, що є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки у варіабельних областях важкого та легкого ланцюгів антитіла або його антиген-зв'язуючої частини (КаБбаї еї а!. (1971) Апп. МУ Асад.

Зсі. 190:382-391 і Кавбаї єї а!. (1991) Зедиепсез ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, Ей Еайіоп,

И.5. ЮОерапйтепі ої Неайй апа Нитап бегмісе5, публікація МІН Мо 91-3242). У випадку варіабельної області важкого ланцюга гіперваріабельна область зазвичай знаходиться в межах положень амінокислот 31-35 для СОВІ, положень амінокислот 50-65 для СОН2 і положень амінокислот 095-102 для СОВЗ. У випадку варіабельної області легкого ланцюга гіперваріабельна область зазвичай знаходиться в межах положень амінокислот 24-34 для

Ко) СОН, положень амінокислот 50-56 для СОВАа і положень амінокислот 89-97 для СОВЗ.

Термін "легкий ланцюг", який застосовують відносно антитіла, відноситься до двох різних типів, що називають каппа (к) або лямбда (Х), які виділяють на підставі амінокислотної послідовності константних доменів. Амінокислотні послідовності легкого ланцюга добре відомі в даній галузі техніки. У переважних варіантах здійснення легкий ланцюг являє собою людський легкий ланцюг.

Термін "лінкер" відноситься до молекули, що з'єднує антиген-зв'язуючі домени антитіла.

Лінкер може являти собою лінкерну молекулу будь-якого виду. Лінкер переважно являє собою поліпептид. Лінкери можуть бути однаковими або відрізнятися один від одного в межах поліпептидного важкого ланцюга та поліпептидного легкого ланцюга та між ними. Крім того, лінкер може мати довжину 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот. Переважна пептидна лінкерна ланка для доменів важкого ланцюга, як і у випадку доменів легкого ланцюга, являє собою (545)2, тобто ОСОС5ОСОО5 (ЗЕО ІЮ МО: 6). Кількості лінкерних ланок у важкому ланцюзі та у легкому ланцюзі можуть бути однаковими (симетричний порядок) або відрізнятися один від одного (асиметричний порядок). Пептидний лінкер переважно є досить довгим для забезпечення належного ступеня гнучкості для запобігання перешкоджання антиген-зв'язуючими компонентами активності один одного, наприклад, у результаті стеричної невідповідності, для забезпечення правильного згортання білка та, при необхідності, для надання молекулам антитіла можливості взаємодії з двома або більше, можливо, розташованими на великій відстані один від одного, рецепторами на поверхні однієї й тієї ж клітини; ще він переважно є досить коротким для надання компонентам антитіла можливості збереження стабільності у клітині. Таким чином, фахівець у даній галузі може без зусиль вибрати довжину, композицію та/або конформацію пептидних лінкерів з метою оптимізації бажаних властивостей полівалентного антитіла.

Терміни "низький вміст солей" і "низька концентрація солей" означають відносно низьку концентрацію солей, яка складає 15 мМ або менше, у тому числі концентрацію солей 0 або відсутність солей. Концентрацію солей визначають за кількістю солей і буферів у складі.

Переважно, щоб буферна система була присутня в складах у низькій концентрації, тобто приблизно 15 мМ або менше, з метою зниження іонної сили складів. Альтернативно, деякі переважні варіанти здійснення не містять солі та не містять буфери. Також переважно, щоб до 60 складів не додавали додаткових солей, таких як Масі, з метою підтримки як можна більш низької іонної сили складів.

Терміни "контролювати", "контролюючий" і "контроль" відносяться до сприятливих ефектів, які суб'єкт отримує від засобу терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу), який не приводить у результаті до лікування від інфекції. У певних варіантах здійснення суб'єкту вводять один або кілька засобів терапії (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів, таких як склад за даним винаходом) для "контролю" захворювання, опосередкованого ІІ -4 або

І/-13 (наприклад, форм раку, запалення, аутоїмунних захворювань, інфекцій, серцево-судинних захворювань, захворювань органів дихання, неврологічних захворювань та метаболічних захворювань), одного або декількох його симптомів, щоб попередити прогресування або погіршення перебігу захворювання.

Термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, отриманому з популяції однорідних або практично однорідних антитіл, та кожне моноклональне антитіло, як правило, буде розпізнавати один епітоп на поверхні антигену. У переважних варіантах здійснення "моноклональне антитіло" являє собою антитіло, що продукується однією гибридомою або іншою клітиною. Термін "моноклональний" не обмежений яким-небудь конкретним способом отримання антитіла. Наприклад, моноклональні антитіла можна отримувати за допомогою гибридомного способу, описаного в Копіег еї аї.; Масиге, 256:495 (1975), або можна виділяти з фагових бібліотек. Інші способи отримання клональних ліній клітин та моноклональних антитіл, що експресуються в них, добре відомі в даній області техніки (див., наприклад, Спарієг 11 в

Зпогі Ргоїосої!5 іп Моїесшіаг Віоіоду, (2002) Бій Еа.; А!йзибеї еї аї., єдв., донп УМеу апа бопв, Мем

ХО).

Термін "фармацевтична композиція", який застосовують у даному винаході, відноситься до складів різних препаратів. Склади, що містять терапевтично ефективні кількості антитіл, являють собою стерильні рідкі розчини, рідкі суспензії або ліофілізовані варіанти і необов'язково містять стабілізатори або наповнювачі.

Термін "фармацевтично прийнятний" означає схвалений регуляторним органом федерального уряду або уряду штату або описаний у Фармакопеї США, Європейській фармакопеї або іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування у тварин і, більш конкретно, у людей.

Зо Під "фармацевтично прийнятним наповнювачем" розуміють будь-яку інертну речовину, що поєднується з активною молекулою, такою як моноклональне антитіло, для отримання прийнятної або зручної лікарської форми. "Фармацевтично прийнятний наповнювач" являє собою наповнювач, який є нетоксичним для пацієнтів, що його одержують у дозуваннях і концентраціях, що використовуються, і є сумісним з іншими інгредієнтами складу, що містить моноклональне антитіло.

Терміни "попереджати", "попереджуючий" і "попередження" відносяться до повного або часткового пригнічення розвитку, рецидиву, прояву або поширення захворювання, опосередкованого 1-4 або 1-13, та/або симптому, пов'язаного з ним, у результаті введення засобу терапії або комбінації засобів терапії, передбачених у даному документі (наприклад, комбінації профілактичних або терапевтичних засобів, таких як склад за даним винаходом).

Термін "профілактичний засіб" відноситься до будь-якого засобу, який може повністю або частково пригнічувати розвиток, рецидив, прояв або поширення захворювання, опосередкованого 1-4 або 1-13, та/або симптому, пов'язаного з ним, у суб'єкта. У певних варіантах здійснення термін "профілактичний засіб" відноситься до складу за даним винаходом.

У певних інших варіантах здійснення термін "профілактичний засіб" відноситься до засобу, відмінного від складу за даним винаходом. Профілактичний засіб переважно являє собою засіб, про який відомо, що він є застосовним, або застосовувався, або застосовується в цей час для попередження захворювання, опосередкованого ІЇ-4 або 1І-13, та/або симптому, пов'язаного з ним, або перешкоджання прояву, розвитку, прогресуванню та/або обтяженню захворювання, опосередкованого ІІ -4 або 1-13, та/"або симптому, пов'язаного з ним. В конкретних варіантах здійснення профілактичний засіб являє собою гуманізоване біспецифічне антитіло до ІЇ -4АЛІ -13.

Фраза "рекомбінантне антитіло" включає антитіла, що отримуються, експресуються, створюються або виділяються рекомбінантним шляхом, такі як антитіла, що експресуються за допомогою рекомбінантного вектора експресії, трансфікованого в клітину-хазяїна, антитіла, що виділяються з комбінаторної бібліотеки рекомбінантних людських антитіл, антитіла, що виділяються з тварини (наприклад, миші або корови), яка є трансгенною та/або трансхромосомною за генами людських імуноглобулінів (див., наприклад, Тауїог, Г. О. еї аї. (1992) МисІ. Асій5 Вев5. 20:6287-6295), або антитіла, що отримуються, експресуються, створюються або виділяються будь-яким іншим способом, що включає з'єднання 60 послідовностей генів людських імуноглобулінів з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбинантнье антитіла можуть мати варіабельні та константні області, отримані з послідовностей імуноглобулінів (див. Кабраї, Е. А. єї а). (1991) бЗедиєпсе5 ої Ргоївіпб5 ої

Іттипоіодісаї! Іпіегеві, ГА Еайіоп, 0.5. Оерапйтенпі ої Нєеайй апа Нитап 5егуісев, публікація МІН

Мо 91-3242). У певних варіантах здійснення, однак, такі рекомбінантні антитіла піддають мутагенезу іп міїго (або, якщо застосовують тварину, трансгенну за послідовностями людського

Ід, соматичному мутагенезу іп мімо), і тому амінокислотні послідовності МН- и Мі -областей рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, будучи отриманими з послідовностей МН і мі. зародкового типу та родинними їм, у природніх умовах можуть не існувати в наборі антитіл зародкового типу іп мімо.

Термін "сахарид" відноситься до класу молекул, що є похідними багатоатомних спиртів.

Сахариди звичайно називаються вуглеводами і можуть містити цукрові (сахаридні) ланки в різних кількостях, наприклад, у випадку моносахаридів, дисахаридів і полісахаридів.

Терміни "специфічно зв'язується" або "специфічне зв'язування" означають специфічне зв'язування з антигеном або його фрагментом і відсутність специфічного зв'язування з іншими антигенами. Наприклад, антитіло, що специфічно зв'язується з антигеном, може зв'язуватися з іншими пептидами або поліпептидами з більш низькою афінністю, яка визначається, наприклад, за допомогою радіоімунологічних аналізів (КІА), твердофазних імуноферментних аналізів (ЕГІЗА), аналізів на ВІАСОКЕ або інших аналізів, відомих у даній області техніки. Антитіла або їх варіанти, або фрагменти, що специфічно зв'язуються з антигеном, можуть проявляти перехресну реактивність з родинними антигенами. Антитіла або їх варіанти, або фрагменти, що специфічно зв'язуються з антигеном, переважно не реагують перехресно з іншими антигенами.

Антитіло або його варіант, або фрагмент, що специфічно зв'язуються з антигеном ІЇ--4 і/або ІЇ- 13, можна ідентифікувати, наприклад, за допомогою імунологічних аналізів, аналізів на ВіАсоге або інших методик, відомих фахівцям у даній області. Інтенсивність специфічної або вибіркової реакції в типовому випадку буде щонайменше у два рази перевищувати фоновий сигнал або шум і в більш типовому випадку більш ніж в 10 раз перевищувати фоновий рівень. Див., наприклад, Раші, єд., 1989, Еипдатепіа! Іттипоїоду Зесопа Еайоп, Камеп Рге55, Мем мок, на сторінках 332-336 відносно обговорення специфічності антитіл. "Стабільний" або "стабілізований" склад являє собою склад, у якому зв'язуючий засіб, такий

Зо як антитіло, що перебуває в ньому, по суті зберігає його фізичну стабільність, ідентичність, цілісність, або хімічну стабільність, ідентичність, цілісність, або біологічну активність при зберіганні. Різні аналітичні методики для виміру стабільності білків доступні в даній області техніки та розглядаються, наприклад, в Реріїде апа Ргоїєїп Огид Оеєїїмегу, 247-301, Міпсепі І ее

ЕЯ., Магсе! Оеккег, Іпс., Мем МогК, М.У., Риб. (1991) ії допез, А. Аду. Огид Оеєїїмегу Неу. 10:29-90 (1993). Стабільність можна вимірювати при певній температурі та інших умовах зберігання протягом певного періоду часу. Стабільність можна визначати за допомогою щонайменше одного зі способів, обраних із групи, що складається з візуального огляду, 505-РАСЕ, ІЕБК,

НРБЕС, ВЕНІТ ї ЕГІЗА каппа/лямбда-ланцюгів. Наприклад, антитіло "зберігає свою фізичну стабільність" у фармацевтичному складі, якщо воно не проявляє ознак агрегації, осадження та/або денатурації після візуального дослідження кольору та/або прозорості або згідно з вимірами за допомогою розсіювання ШМ-світла, 505-РАСЕ або за допомогою ексклюзійної хроматографії (високого тиску) (НРОЕС). При застосуванні складів за даним винаходом переважно 595 або менше, звичайно 4 96 або менше, переважно 395 або менше, більш переважно 2 95 або менше та, зокрема, 1 95 або менше антитіл утворюють агрегати згідно з вимірами за допомогою НР5ОЕС або будь-якого іншого підходящого способу виміру утворення агрегатів. Наприклад, антитіло вважається стабільним у конкретному складі, якщо мономерне антитіло має чистоту, яка складає приблизно 90 95, переважно приблизно 95 95, зокрема, приблизно 98 95, після певного заданого періоду часу за певних умов зберігання в конкретному складі. Хімічну стабільність можна оцінити шляхом виявлення та кількісного визначення хімічно змінених форм білка. Хімічна зміна може включати модифікацію розміру (наприклад, усікання), яку можна оцінити, наприклад, за допомогою (НР)ЗЕС, 505-РАСЕ і/або матрично-активованої лазерної десорбції/онізації/час-пролітної мас-спектрометрії (МАСОІ/ТОЕ М5). Інші типи хімічної зміни включають зміну заряду (наприклад, що відбувається в результаті дезамідування), яку можна оцінити, наприклад, за допомогою іонообмінної хроматографії. Антитіло "зберігає свою біологічну активність" у фармацевтичному складі в певний момент часу, якщо біологічна активність антитіла в певний момент часу становить щонайменше приблизно 90 95 (у межах помилок аналізу) від біологічної активності що проявляється в момент отримання фармацевтичного складу, що визначається, наприклад, в аналізі зв'язування антигену або аналізі нейтралізації вірусу. бо Терміни "суб'єкт" і "пацієнт" використовуються на рівних підставах. Як використовується в даному документі, суб'єкт переважно є ссавцем, таким як ссавець, відмінний від примата (наприклад, корови, свині, коні, кішки, собаки, пацюки та т.п.), або примат (наприклад, мавпа та людина), більш переважно людина. В одному варіанті здійснення суб'єкт є ссавцем, переважно людиною, що має захворювання, опосередковане ІІ -4 і/або 1І-13. В іншому варіанті здійснення суб'єкт є ссавцем, переважно людиною, що має ризик розвитку захворювання, опосередкованого ІГ--4 і/або І--13.

Фраза "практично ідентичний" стосовно поліпептидної послідовності ланцюга антитіла може бути витлумачена як ланцюг антитіла, що володіє щонайменше 70 95, 80 95, 90 95, 95 95 або більшою ідентичністю послідовності з еталонною поліпептидною послідовністю. Даний термін стосовно послідовності нуклеїнової кислоти може бути витлумачений як послідовність нуклеотидів, що володіє щонайменше приблизно 85 95, 90 95, 95 95, або 97 95, або більшою ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти.

У варіантів "з замінами" щонайменше один амінокислотний залишок в нативній послідовності вилучений і заміщений іншою амінокислотою, вставленою на його місце в те ж саме положення. Заміни можуть бути одиночними, при яких у молекулі замінена тільки одна амінокислота, або можуть бути багаторазовими, при яких в одній і тій же молекулі замінено дві або більше амінокислоти. Множинні заміни можуть мати місце в сайтах, розташованих один за одним. Також одна амінокислота може бути заміщена безліччю залишків, і в цьому випадку такий варіант містить як заміну, так і вставку. У варіантів "з вставками" одна або кілька амінокислот вставлені безпосередньо прилягаючими до амінокислоти в конкретному положенні в нативній послідовності. Безпосередньо прилягаючий до амінокислоти означає з'єднаний з функціональною а-карбоксильною або а-аміногрупою амінокислоти. У варіантів "з делеціями" одна або кілька амінокислот в нативній амінокислотній послідовності вилучені. Зазвичай у варіантів з делеціями вилучено одна або дві амінокислоти в конкретній області молекули.

Термін "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості засобу терапії (наприклад, складу за даним винаходом), достатнього для зниження та/або зменшення важкості та/або тривалості зазначеного захворювання та/або симптому, пов'язаного з ним. Даний термін також охоплює кількість, необхідну для ослаблення або зменшення інтенсивності ходу або прогресування зазначеного захворювання, ослаблення або зменшення інтенсивності рецидиву,

Зо розвитку або прояву зазначеного захворювання та/або для поліпшення або посилення профілактичного(профілактичних) або терапевтичного(терапевтичних) ефекту(ефектів) іншого засобу терапії (наприклад, засобу терапії, відмінного від складу за даним винаходом). У деяких варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість антитіла за даним винаходом забезпечує місцеву концентрацію, яка складає приблизно 5-20 нг/мл і переважно приблизно 10- 20 нг/мл. У деяких варіантах здійснення "терапевтично ефективна кількість", яку використовують в даному документі, також відноситься до кількості антитіла за даним винаходом для досягнення певного результату (наприклад, інгібування цитокіну ІІ -4 і/або 1І-13).

Термін "терапевтичний засіб" відноситься до будь-якого засобу, який можна застосовувати в лікуванні, контролі або зменшенні інтенсивності захворювання, опосередкованого ІІ -4 і/або ІІ - 13, або симптому, пов'язаного з ним. У певних варіантах здійснення термін "терапевтичний засіб" відноситься до складу за даним винаходом. У певні інших варіантах здійснення термін "герапевтичний засіб" відноситься до засобу, відмінного від складу за даним винаходом.

Терапевтичний засіб переважно являє собою засіб, про який відомо, що він є застосовним, або застосовувався, або застосовується в цей час для лікування, контролю або зменшення інтенсивності захворювання, опосередкованого 1-4 і/або 1-13, або одного або декількох симптомів, пов'язаних з ним.

Термін "терапія" відноситься до будь-якого протоколу, способу та/або засобу, які можна застосовувати в попередженні, контролі, лікуванні та/"або зменшенні інтенсивності захворювання, опосередкованого 1/-4 і/або 1-13 (наприклад, форм раку, запалення, аутоїмунних захворювань, інфекцій, серцево-судинних захворювань, захворювань органів дихання, неврологічних захворювань і метаболічних захворювань). У певних варіантах здійснення терміни "види терапії" і "терапія" відносяться до біологічної терапії, підтримувальної терапії та/"або іншим видам терапії, застосовним у попередженні, контролі, лікуванні та/або зменшенні інтенсивності захворювання, опосередкованого ІІ--4 і/або 1-13, відомого фахівцям у даній області, таким як медичний персонал.

Терміни "лікувати", "лікування" та "лікуючий" відносяться до зниження або зменшення прогресування, важкості та/або тривалості захворювання, опосередкованого ІІ -4 і/або 11-13 (наприклад, форм раку, запалення, аутоїмунних захворювань, інфекцій, серцево-судинних захворювань, захворювань органів подиху, неврологічних захворювань і метаболічних 60 захворювань), у результаті введення одного або декількох засобів терапії (у тому числі, без обмеження, уведення одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів, таких як склад за даним винаходом).

Терміни "варіабельна область" або "варіабельний домен" відносяться до частин легкого та важкого ланцюгів, що зазвичай містять приблизно 120-130 амінокінцевих амінокислот у важкому ланцюзі та приблизно 100-110 амінокислот у легкому ланцюзі, які значно відрізняються за послідовністю серед антитіл і використовуються у зв'язуванні та визначенні специфічності кожного конкретного антитіла до свого конкретного антигену. У цих областях, що звуться областями, які визначають комплементарність (СОМ), зосереджена варіабельність послідовностей, при цьому більш висококонсервативні області варіабельного домену називають каркасними областями (ЕК). СОК легкого та важкого ланцюгів несуть основну відповідальність за взаємодію антитіла з антигеном. Нумерація положень амінокислот приводиться відповідно до ЕМО-індексу згідно Кабаї еї аїЇ. (1991) бедиєпсевз ої ргоївіп5 ої іттипоіодіса! іпіегеві. (0.5.

Оерапйтепі ої Неайй апа Нитап Ббегуісе5, УМавзпіпдіоп, О.С.) 57 ей. ("Кабат і співавт.").. В переважних варіантах здійснення варіабельна область являє собою людську варіабельну область.

В. Склади та компоненти складів

Як було зазначено вище, склади за даним винаходом містять біспецифічне антитіло до ЇЇ -

АЛІ-13 і буферну систему, де рН складу становить приблизно рн 7, і де склад характеризується низькою концентрацією солей з метою зниження іонної сили складу. Склади необов'язково можуть додатково містити неіоногенну поверхнево-активну речовину, цукор та/або неіоногенний стабілізатор. Було виявлено, що в складах за даним винаходом передбачені значні поліпшення в порівнянні з більш ранніми складами на основі біспецифічних антитіл до ІЇ-4/ЛІ-13, у яких підвищення концентрації антитіла в складі часто приводить до утворення молекулярних агрегатів антитіла та утворенню видимих і не видимих неозброєним оком частинок. Зокрема, склади за даним винаходом проявляють високу стабільність відносно видимих частинок, не видимих неозброєним оком частинок, низькомолекулярних білків і високомолекулярних білків. і. Біспецифічні антитіла до ІІ--4/ЛІ -13 та їх варіанти та фрагменти

У певних варіантах здійснення склади за даним винаходом містять біспецифічне антитіло до

І -АЛІ-13. Біспецифічне антитіло або його варіанти або фрагменти зв'язуються або специфічно

Зо зв'язуються з ІІ -4 та/або ІІ-13. Молекули ІІ -4 та/або 1І/-13 можуть бути отримані від будь-якого виду. Молекули 1-4 та/або ІІ/-13 переважно отримані від людини. Амінокислотні послідовності та структури білків як ІІ -4, так і 1-13 добре відомі в даній області техніки.

У певних ілюстративних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ-13 являє собою гуманізоване антитіло, повністю людське антитіло або його варіант, або антиген- зв'язуючий фрагмент. Переважні біспецифічні антитіла до ІІ -4/ЛІ -13 запобігають зв'язуванню ІІ - 4 і 11-13 зі своїми рецепторами та інгібують біологічну активність ІІ -4 і ІЇ -13.

МІЗ антитіла НВ-В13 до ІІ -13 (ЗЕО ІЮ МО: 1)

У конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло до ІЇ-4/ЛІ/-13 або його антиген- зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область легкого ланцюга (Мі), що зв'язується з ЇЇ -13, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 1 (Підкресленням показані проведені амінокислотні заміни. Жирним шрифтом показані СОВА; СОВІ являє собою 5ЕО ІЮО МО: 7,

ВАБЕБМО5МОСОБУМН; СОН2О являє собою 5ЕО ІО МО: 8, ГАМІ Е5; а СОВЗ являє собою 5ЕО

ІО МО: 9, ООМАЕОЗНТ).

Апи-ПЛЗБВ-БВІЗ УТЗ(5ЕО МО: у

БІУБТОЗРАВ пБАМЗБОСКАТ ІЗсКАБЕБУД ЗІСОБЕМНКУ зокаАсОРРКЕ

БІХБАБВБМЕЕВБ СбУРАВЕВЗСВО З5ВТЕЕТЬРІДЮ РУСАЕПЛААТУ хсСООМАБЕОЗЕ.

ТЕССОТКЕІТБІ К

МНЕе антитіла НВ-В13 до 1-13 (5ЕО І МО: 2)

У конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло до ІЇ-4/ЛІ/-13 або його антиген- зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга (УН), що зв'язується з ЇЇ -13, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 2 (Підкресленням показані проведені амінокислотні заміни. Жирним шрифтом показані СОВА; СОВІ являє собою 5ЕО ІЮ МО: 10,

БО СЕБІТО55ІМ; СОВ2 являє собою 5ЕО І МО: 11, ОСВІО; а СОВЗ являє собою 5ЕО І МО: 12, рамЕРМАМОР).

Апи-ПІЗ БВ-В13 УНІ ГБО ПЗ МО: 2

ЕБУСІКЕЗшаРО БУЧАРОСЗІВІ тТстТУБОЕБСТ ПОБІМИУВОР РОКСТЕМЬОСМ

ІНСВОВІВУА БАТК5НІЗІВ КОСБОКООУЕї ВМІТЗБНТОБЕ АтухсАВООХ

ЕРУАМБЕКСО стбутуВВ

У конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ-13 або його антиген- зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що зв'язується з ІІ -4, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: З (Підкресленням показані проведені амінокислотні заміни. Жирним шрифтом показані СОК; СОКІ являє собою 5ЕО ІЮО МО: 13,

НАЗОМІЮОМУМ 5; СОК2 являє собою 5ЕО І МО: 14, КАЗМІ НТа; СОВЗ являє собою 5ЕО ІЮ МО: 15, ООАН5ЗУРЕТ).

МІ антитіла НВО4-8 до 1І -4 (ЗЕО ІО МО: 3)

Авн-ЦцЯ Б5БН-В УТІ С5БОСТР МО: 3 пІіомтоОочЗвБАе їБУувУСЕеТІТ БТтОНАБОКМІО ММК ООСКЕ СОМІВКТ ТК

АвВМЬНнтТОаУТРВ ВЕВСВОВОТО ЕТІЕТІВВТОР ББІАТЖхСОО АНБВУРБЕТЕЗО

МНІ антитіла п8О4-8 до ІІ -4 (ЗЕО І МО: 4)

У конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло до ІЇ-4/ЛІ/-13 або його антиген- зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга (УН), що зв'язується з ЇЇ -4, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 4 (Підкресленням показані проведені амінокислотні заміни. Жирним шрифтом показані СОВА; СОВІ являє собою 5ЕО ІЮ МО: 16,

СМ5ЕТЗУМІН; СОВ2 являє собою 5ЕО ІЮ МО: 17, ІОРБОСЕТВА; а СОВЗ являє собою 5ЕО ІЮ

МО: 18, І КЕМаАММОБЕМЕОМ).

Авц-ПА БяРЯ-Я УНІВ І МОХ Як сУстооаоОЕЕ БУКРОАВУКІ ЗСКАБНЗЕБВЕТ БЕІМІНКІКОВ вБООоСсЬБШІСМ трвБбаЕте. МОВЕОБКАТІ ТУрЕБЗТОТАХ МОБЕЗРТЗЕр ЗАМХХСсТВІК

ЕТОМЕІБОЕТЕ БУХсСАстТЬУтТ УЗА

МНЕа антитіла п804-8 до ІІ -4 (ЗЕО І МО: 5)

В іншому конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло до ІЇ-4/ЛІ/-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга (МН), що зв'язується з І/-4, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 5 (Підкресленням показані проведені амінокислотні заміни. Жирним шрифтом показані СОВ; СОВІ являє собою

ЗЕО ІЮО МО: 19, ОСМ5БЕТ5УМІН; СОНО являє собою 5ЕО ІЮО МО: 20, ІСАБОСЕТВА; а СОВЗ являє собою 5ЕО ІЮ МО: 21, І КЕМаММОБЕМЕОМ).

Апи-ПЯ пЕрМ-я УНІ ЗЕО ТОЮ МО: у сОУСЬООБОБЕ БУКРОСАВБУКІ БСКАБОСЖОЕТ БУМІНКІКОВ РООСБЕКІТСМ

ІБАБОСЕТВІ. МОВЕОСБАТІ, ТУБЕСТОТАУ МОББОРТЗЕВ ЗАМ ствВіКк

Б ЕХОМІБОЕВЕТЕ ПУХсАстТьЬУтТ УВА

У деяких конкретних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ/-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що зв'язується з

І/-13, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 2; і варіабельну область легкого ланцюга, що зв'язується з ІІ--13, яка містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 1.

Зо В інших конкретних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4//-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що зв'язується з

І -4, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4; і варіабельну область легкого ланцюга, що зв'язується з ІІ -4, яка містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 3.

Ще в декількох інших конкретних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/І-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що зв'язується з ІІ -4, яка містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 5; і варіабельну область легкого ланцюга, що зв'язується з ІІ -4, яка містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮО МО: 3.

В більш конкретних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/Л/-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що зв'язується як з

І/-13, так і з 1-4, яка містить амінокислотні послідовності ЖЕО ІО МО: 2 і 4 або 2 і 5; та варіабельну область легкого ланцюга, що зв'язується як з ІІ/-13, так і з І/-4, яка містить амінокислотні послідовності ЗЕОІЮО МО: 113.11 3.

У найбільш конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/І/-13 містить варіабельну область важкого ланцюга, що зв'язується як з 1-13, так і з І/-4, яка містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 ії 4; і варіабельну область легкого ланцюга, що зв'язується як з ІІЇ-13, так ї з ІІ -4, яка містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 Її З ("лідерне антитіло"). Схематичне зображення варіанта здійснення біспецифічного антитіла до

І -А/ЛІ-13 показано на фігурі 1, а ілюстративні варіабельні області важкого та легкого ланцюгів показані на фігурі 2. Молекулярна маса лідерного антитіла, визначена за допомогою мас- спектрометрії, становить 198 кДа. Ізоелектрична точка лідерного антитіла, визначена за допомогою ізоелектричного фокусування, варіює в діапазоні від 5,8 до 6,2.

В альтернативних найбільш конкретних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -

АЛІ-13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять легкий ланцюг формули МІ 1-лінкер- МІ 2 та важкий ланцюг формули МНІ -лінкер- УН2, де МІ ї МНІ1І утворюють антиген-зв'язуючий домен для 1-4, а М2 ї МН2 утворюють антиген-зв'язуючий домен для ІЇ-13. У деяких варіантах здійснення МІ 1 містить послідовності СОК ЗЕО ІЮО МО: 1; УНІ містить послідовності СОК 5ЕО

ІО МО: 2; МІ2 містить послідовності СОК 5ЕО ІЮ МО: 3; а МН2 містить послідовності СОК 5ЕО

ІО МО: 4 або 5. В альтернативних варіантах здійснення МІ 2 містить амінокислотну послідовність

ЗБО ІЮ МО: 1; МН2 містить амінокислотну послідовність ЗЕБО 10 МО: 2; МІ містить амінокислотну послідовність БЕО ІО МО: 3; а УНІ містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ

МО: 4 або 5.

У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ/-13 або його антиген- зв'язуючий фрагмент містять лінкер між антиген-зв'язуючими доменами антитіла. Лінкер може являти собою лінкерну молекулу будь-якого виду. Лінкер переважно являє собою поліпептид.

Лінкери можуть бути однаковими або відрізнятися один від одного в межах поліпептидного важкого ланцюга та поліпептидного легкого ланцюга та між ними. Крім того, лінкер може мати довжину 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот.

Переважна пептидна лінкерна ланка для доменів важкого ланцюга, як і у випадку доменів легкого ланцюга, являє собою (545)2, тобто сОосОо5ООсОсОо5 (5БЕО ІО МО: 6). Найбільше

Ко) переважно ЗЕО ІЮ МО: 2 і 4 з'єднані першим пептидньїм лінкером, а 5ЕО ІО МО: 1 і З з'єднані другим пептидом, де кожний з першого та другого пептидних лінкерів містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 6. Кількості лінкерних ланок у важкому ланцюзі та у легкому ланцюзі можуть бути однаковими (симетричний порядок) або відрізнятися один від одного (асиметричний порядок). Пептидний лінкер переважно є досить довгим для забезпечення належного ступеня гнучкості для запобігання перешкоджання антиген-зв'язуючими компонентами активності один одного, наприклад, у результаті стеричної невідповідності, для забезпечення правильного згортання білка та, при необхідності, для надання молекулам антитіла можливості взаємодії з двома або більше, можливо, розташованими на великій відстані один від одного, рецепторами на поверхні однієї і тієї ж клітини; ще він переважно є досить коротким для надання компонентам антитіла можливості збереження стабільності у клітині. Таким чином, фахівець у даній області може без зусиль вибрати довжину, склад та/або конформацію пептидних лінкерів з метою оптимізації бажаних властивостей полівалентного антитіла.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло до ІІ -4/І -13 або його антиген-зв'язуючий фрагмент являють собою гуманізоване антитіло. Приклади ізотипів гуманізованих антитіл включають ІдА, дО, ІдЕ, дос їі ДМ. Біспецифічне антитіло до ІС-4/ЛІ-13 переважно являє собою антитіло Ід. Існують чотири форми Ід. Біспецифічне антитіло до ІЇ-

АЛІ-13 переважно являє собою антитіло Ідс4. У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло до ІІ -4/І -13 являє собою гуманізоване антитіло Ідса4.

У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ/-13 або його антиген- зв'язуючий фрагмент додатково містять константну область, наприклад, СНІ, СН2, СНЗ і СІ.

Певні варіанти здійснення складів за даним винаходом також включають варіанти біспецифічних антитіл до 1/-4/Л/-13 або їх антиген-зв'язуючих фрагментів. Варіанти біспецифічних антитіл до ЇЇ -4/І -13 можуть мати подібні фізико-хімічні властивості на підставі їх високої подоби та, таким чином, також включені в обсяг даного винаходу. Варіанти визначені як антитіла з амінокислотною послідовністю, яка щонайменше на 95 95, переважно щонайменше на 97 95, наприклад, щонайменше на 98 95 або 99 95 гомологічна послідовності біспецифічних антитіл до І -4/ЛІ-13, здатні до конкуренції за зв'язування з поліпептидом 1-4 і/або 1І-13, фрагментом поліпептиду 1-4 і/або 1-13, або епітопом 1-4, і/або І/-13. Варіанти переважно 60 будуть зменшувати, нейтралізувати або іншим способом інгібувати біологічну активність 1-4 іабо 1-13. Визначення конкуренції за зв'язування з мішенню можна виконувати звичайними способами, відомими фахівцю в даній області. Варіанти переважно являють собою людські або гуманізовані антитіла та переважно являють собою молекули Ідс4. У переважних варіантах здійснення варіант проявляє щонайменше 9595, 9695, 97 95, 9890 або 9995 ідентичність амінокислотної послідовності з варіабельною областю важкого ланцюга, що зв'язується як з ЇЇ - 13, так ї з 1-4, яка містить амінокислотні послідовності ФЕО ІЮ МО: 2, 4 і 5; та варіабельною областю легкого ланцюга, що зв'язується як з ІЇ/-13, так і з ІЇ-4, яка містить амінокислотні послідовності ЗЕБЕО ІО МО: 1 і 3. Термін "варіант" відноситься до антитіла, що містить амінокислотну послідовність, у якій одна або кілька амінокислот змінені в порівнянні з амінокислотними послідовностями біспецифічного антитіла до ІІ -4/І/-13. Варіант може мати консервативні модифікації послідовності, у тому числі амінокислотні заміни, модифікації, додавання та делеції.

Приклади модифікацій включають, без обмеження, глікозилювання, ацетилювання, пегилювання, фосфорилювання, амідування, дериватизацію за допомогою відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичного розщеплення та утворення зв'язків з клітинним лігандом або іншим білком. Амінокислотні модифікації можна впроваджувати в нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла, за допомогою стандартних методик, відомих у даній області техніки, таких як сайт-спрямований мутагенез, молекулярне клонування, спрямований мутагенез з використанням олігонуклеотидів і випадковий ПЦР-опосередкований мутагенез.

Консервативні амінокислотні заміни включають ті, при яких амінокислотний залишок заміщається амінокислотним залишком, що має подібні структурні або хімічні властивості.

Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бокові ланцюги, були визначені в рівні техніки. Ці сімейства включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бета- розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан). Фахівцю в даній області

Зо буде очевидно, що можна також застосовувати класифікації сімейств амінокислотних залишків, відмінні від той, що застосовувалась вище. Крім того, варіант може мати неконсервативні амінокислотні заміни, наприклад, заміщення амінокислоти амінокислотним залишком, що мають інші структурні або хімічні властивості. Подібні незначні зміни можуть також включати амінокислотні делеції або вставки, або обидві ці категорії. Посібник з визначення того, які амінокислотні залишки можуть бути замінені, модифіковані, вставлені або вилучені без припинення імунної активності, може бути знайдено за допомогою комп'ютерних програм, добре відомих у даній області техніки. Комп'ютерні алгоритми, такі як, серед іншого, Сар або Везнії, відомі фахівцю в даній області можна застосовувати для оптимального вирівнювання амінокислотних послідовностей, що підлягають порівнянню, і для визначення подібних або ідентичних амінокислотних залишків. Варіанти можуть мати такі ж або інші, більш високі або більш низькі значення афінності зв'язування в порівнянні з біспецифічним антитілом до ІІ -4ЛІ - 13, але як і раніше здатні до специфічного зв'язування з І! -4 і/або 1-13 і можуть мати таку ж, більш високу або більш низьку біологічну активність в порівнянні з біспецифічним антитілом до

І -4ЛІ-13.

Варіанти здійснення даного винаходу також включають антиген-зв'язуючі фрагменти біспецифічних антитіл до ІІ -4/ЛІ-13. Терміни " антиген-зв'язуючий домен", "антиген-зв'язуюча область", " антиген-зв'язуючий фрагмент" і подібні терміни відносятьсядо частини антитіла (наприклад, до областей, що визначають комплементарність (СОК)), що містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і надають зв'язуючому засобу його специфічність та афінність до антигену. Антиген-зв'язуюча область може бути отримана від будь-яких видів тварин, таких як гризуни (наприклад, кролик, пацюк або хом'як) та люди. Антиген-зв'язуюча область переважно буде походити від людини. Необмежуючі приклади антиген-зв'язуючих фрагментів включають Еар-фрагменти, Е(аб) 2-фрагменти, ЕБа-фрагменти, Ему-фрагменти, одноланцюгові молекули Ем (5сЕм), ЗАр-фрагменти та мінімальні розпізнавальні одиниці, що складаються з амінокислотних залишків, що імітують гіперваріабельну область антитіла.

В переважних варіантах здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ-13 (або його варіант, або його антиген-зв'язуючий фрагмент) буде зменшувати, нейтралізувати або іншим способом інгібувати біологічну активність ЇЇ -4 і/або ІІ -13 іп мімо.

В переважних варіантах здійснення даного винаходу біспецифічні антитіла до ІІ -4/І -13 (або бо їх варіанти, або їх антиген-зв'язуючі фрагменти) є антагоністичними антитілами, що зменшують,

нейтралізують або іншим способом інгібують біологічну активність ЇЇ -4 і/або 1-13 іп мімо.

Ідентифікація, виділення, отримання та визначення характеристик біспецифічних антитіл до

І -АЛІ-13 або їх варіантів, або фрагментів, що зв'язуються як з ІІ -13, так і з ІІ -4, у тому числі біспецифічного антитіла до ІІ -4/ЛІ-13, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 і 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 і 3, були докладно описані в публікації по

РСТ УМО 2009/052081, включеної в даний документ за допомогою посилання.

Біспецифічні антитіла до ІІ-4/ЛІ-13 (або їх варіанти, або їх антиген-зв'язуючі фрагменти) переважно присутні в складах у кількості від приблизно 5 мг/мл до приблизно 200 мг/мл, наприклад, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 150 мг/мл, від приблизно 75 мг/мл до приблизно 125 мг/мл і приблизно 100 мг/мл. Альтернативно, біспецифічні антитіла до ІІ -4/ЛІ-13 (або їх варіанти, або їх антиген-зв'язуючі фрагменти) присутні в складах у кількості від приблизно 5 мг/мл до приблизно 65 мг/мл, від приблизно 66 мг/мл до приблизно 130 мг/мл, від приблизно 131 мг/мл до приблизно 200 мг/мл. Наприклад, біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ-13 може бути присутнім у складі в кількості приблизно 5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, приблизно 15 мг/мл, приблизно 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 75 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 85 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 95 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 105 мг/мл, приблизно 110 мг/мл, приблизно 115 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 125 мг/мл, приблизно 130 мг/мл, приблизно 135 мг/мл, приблизно 140 мг/мл, приблизно 145 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 155 мг/мл, приблизно 160 мг/мл, приблизно 165 мг/мл, приблизно 170 мг/мл, приблизно 175 мг/мл, приблизно 180 мг/мл, приблизно 185 мг/мл, приблизно 190 мг/мл, приблизно 195 мг/мл або приблизно 200 мг/мл.

В певних ілюстративних варіантах здійснення біспецифічне антитіло до ІІ -4/ЛІ-13 є присутнім у складі в кількості приблизно 100 мг/мл. В іншому ілюстративному варіанті здійснення гуманізоване біспецифічне антитіло Ідс4 до ІІ -4/ЛІ-13, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що зв'язується як з ІЇ-13, так і з ІЇ-4, яка містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІО МО: 2 і 4 або 2 і 5; та варіабельну область легкого ланцюга, що зв'язується як з ІІ -13, так і з ІІ -4, яка містить амінокислотні послідовності «ЕО ІЮ МО:. 1 Її З, є присутнім у складі в кількості приблизно 100 мг/мл.

ІІ. Буферні засоби, буферні системи, іонна сила та рн

Буферні засоби сприяють підтримці рН складів у діапазоні, близькому до фізіологічних умов.

Буфери переважно присутні в складах у концентрації, що варіює в діапазоні від приблизно 1 мМ до приблизно 50 мМ. Придатні буферні засоби для застосування в даному винаході включають як органічні, так і неорганічні кислоти і їх солі, такі як цитратні буфери (наприклад, суміш цитрату мононатрію та цитрату динатрію, суміш лимонної кислоти та цитрату тринатрію, суміш лимонної кислоти та цитрату мононатрію і т.п.), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинової кислоти та сукцинату мононатрію, суміш бурштинової кислоти та гидроксиду натрію, суміш бурштинової кислоти та сукцинату динатрію і т.п.), тартратні буфери (наприклад, суміш винної кислоти та тартрату натрію, суміш винної кислоти та тартрату калію, суміш винної кислоти та гідроксиду натрію і т.п.), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарової кислоти та фумарату мононатрію, суміш фумарової кислоти та фумарату динатрію, суміш фумарату мононатрію та фумарату динатрію і т.п.), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконової кислоти та глюконату натрію, суміш глюконової кислоти та гідроксиду натрію, суміш глюконової кислоти та глюконату калію і т.п.), оксалатні буфери (наприклад, суміш щавлевої кислоти та оксалату натрію, суміш щавлевої кислоти та гідроксиду натрію, суміш щавлевої кислоти та оксалату калію і т.п.), лактатні буфери (наприклад, суміш молочної кислоти та лактату натрію, суміш молочної кислоти та гідроксиду натрію, суміш молочної кислоти та лактату калію і т.п.) і ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтової кислоти та ацетату натрію, суміш оцтової кислоти та гідроксиду натрію і т.п.). Також є придатними та можуть застосовуватися фосфатні буфери, карбонатні буфери, гістидинові буфери, солі триметиламіну, такі як Тгі5, НЕРЕЗ та інші такі відомі буфери. У складах за даним винаходом переважно застосовують комбінацію буферів, тобто два або більше буферних засобів. Комбінацію двох або більше буферів у даному документі називають буферною системою.

Склади за даним винаходом містять буферну систему. Буферна система підтримує фізіологічно прийнятний рівень рН. На додаток, буферна система бере участь у забезпеченні ізотонічності та хімічній стабільності складу. Через складність розробки стабільного складу на основі антитіла для біспецифічного антитіла кращим є застосування комбінованої буферної бо системи з метою отримання переваг від сприятливих ефектів двох або більше буферів. Шляхом комбінації сприятливих ефектів двох або більше буферів можна розробити більш стабільний склад на основі антитіла.

Буферна система переважно присутня в складах у концентрації від приблизно 1 мМ до приблизно 50 мМ, наприклад, від приблизно 5 мМ до приблизно 25 мМ, від приблизно 5 мМ до приблизно 15 мМ або приблизно 10 мМ. Альтернативно, буферна система присутня в складах у концентрації від приблизно 1 мМ до приблизно 15 мМ, від приблизно 16 мМ до приблизно 30

ММ, від приблизно 31 мМ до приблизно 45 мМ або від приблизно 46 мМ до приблизно 50 мМ.

Наприклад, буферна система може бути присутньою у складі в концентрації приблизно 1 мМ, приблизно 2 мМ, приблизно 3 мМ, приблизно 4 мМ, приблизно 5 мМ, приблизно б мМ, приблизно 7 мМ, приблизно 8 мМ, приблизно 9 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 11 мМ, приблизно 12 мМ, приблизно 13 мМ, приблизно 14 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 16 мМ, приблизно 17 мМ, приблизно 18 мМ, приблизно 19 мм, приблизно 20 мМ, приблизно 21 мМ, приблизно 22 мМ, приблизно 23 мМ, приблизно 24 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 26 мМ, приблизно 27 мМ, приблизно 28 мМ, приблизно 29 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 31 мМ, приблизно 32 мМ, приблизно 33 мМ, приблизно 34 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 36 мМ, приблизно 37 мМ, приблизно 38 мМ, приблизно 39 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 41 мМ, приблизно 42 мМ, приблизно 43 мМ, приблизно 44 мМ, приблизно 45 мМ, приблизно 46 мМ, приблизно 47 мМ, приблизно 48 мМ, приблизно 49 мМ і приблизно 50 мМ. Буферна система більш переважно присутня у складі в концентрації від приблизно 5 мМ до приблизно 15 мМ і ще більш переважно від приблизно 8 мМ до приблизно 12 мМ. У найбільш переважному варіанті здійснення буферна система присутня в концентрації приблизно 10 мМ.

Буферна система переважно містить Тгіз-буфер і фосфатний буфер. Тгі5- буфер переважно присутній у складах в концентрації від приблизно 1 до приблизно 5 мМ. Наприклад, Тгіз-буфер може бути присутнім у складі в концентрації приблизно 1 мМ, приблизно 2 мМ, приблизно З мМ, приблизно 4 мМ або приблизно 5 мМ. Тгіз-буфер більш переважно присутній у складах в концентрації від приблизно 2 мМ до приблизно 4 мМ і ще більш переважно від приблизно З мМ до приблизно 4 мМ. У найбільш переважному варіанті здійснення Тгіз-буфер присутній у концентрації приблизно 3,7 мМ.

Фосфатний буфер переважно присутній у складах в концентрації від приблизно 1 до

Зо приблизно 10 мМ. Наприклад, фосфатний буфер може бути присутнім у складах в концентрації приблизно 1 мМ, приблизно 2 мМ, приблизно З мМ, приблизно 4 мМ, приблизно 5 мМ, приблизно 6 мМ, приблизно 7 мМ, приблизно 8 мМ, приблизно 9 мМ або приблизно 10 мМ.

Фосфатний буфер більш переважно присутній у складах в концентрації від приблизно З мМ до приблизно 8 мМ і ще більш переважно від приблизно 5 мМ до приблизно 7 мМ. У найбільш переважному варіанті здійснення фосфатний буфер присутній у концентрації приблизно 6,3 мМ.

У найбільш переважному варіанті здійснення даного винаходу буферна система містить

Тгів-буфер в концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер в концентрації приблизно 6,3

ММ. Дана комбінація Тгіє-буфера та фосфатного буфера в буферній системі є досить незвичайною та невідома з рівня техніки.

Також переважно, щоб буферна система була присутня в складах в низькій концентрації, тобто приблизно 15 мМ або менше, з метою зниження іонної сили складу. Це обумовлене тим, з підвищенням іонної сили складу підвищуються кінетичні параметри агрегації антитіла. З метою поліпшення стабільності складу необхідним є зниження агрегації антитіла та/або швидкості агрегації антитіла.

В певних варіантах здійснення склади за даним винаходом мають рН близько рН 7. рн складів переважно варіює в діапазоні від приблизно 5,0 до приблизно 8,0. Наприклад, рн складів може становити приблизно 5,0, приблизно 5,1, приблизно 5,2, приблизно 5,3, приблизно 5,4, приблизно 5,5, приблизно 5,6, приблизно 5,7, приблизно 5,8, приблизно 5,9, приблизно 6,0, приблизно 6,1, приблизно 6,2, приблизно 6,3, приблизно 6,4, приблизно 6,5, приблизно 6,6,

БО приблизно 6,7, приблизно 6,8, приблизно 6,9, приблизно 7,0, приблизно 7,1, приблизно 7,2, приблизно 7,3, приблизно 7,4, приблизно 7,5, приблизно 7,6, приблизно 7,7, приблизно 7,8, приблизно 7,9 і приблизно 8,0. рН складів більш переважно може варіювати в діапазоні від приблизно 6,5 до приблизно 7,5. В найбільш переважному варіанті здійснення рН становить приблизно 7,0. Склади проявляють високу стабільність відносно видимих часток, не видимих неозброєним оком часток, низькомолекулярних білків і високомолекулярних білків, якщо рн складів становить приблизно рН 7. рН складу можна визначити будь-якими способами, відомими фахівцям у даній області. Переважним способом вимірювання рн є застосування рн- метра з мікроелектродом. РН складу можна регулювати будь-якими способами, відомими в даній області техніки. Переважними хімічними речовинами для зміни рН складів є соляна бо кислота (НС) і гідроксид натрію (Маон).

У певних варіантах здійснення склади за даним винаходом мають рН вище ізоелектричної точки(рі) антитіла. Ізоелектричною точкою є рН, при якому визначена молекула або поверхня не несе сумарного електричного заряду. рі біспецифічного антитіла можна визначити будь-якими способами, відомими фахівцям у даній області. рі біспецифічного антитіла переважно визначають за допомогою ізоелектричного фокусування в денатуруючих умовах. рі біспецифічного антитіла до ІІ -4/ЛІ-13, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності зЕО ІЮ МО: 2 і 4; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІО МО: 1 і 3, становить 5,8-6,2.

І. Неіоногенні поверхнево-активні речовини

Склади за даним винаходом необов'язково можуть додатково містити неіоногенну поверхнево-активну речовину. Поверхнево-активні речовини є хімічними сполуками, що стабілізують біологічні молекули та/або основні фармацевтичні наповнювачі в складі.

Поверхнево-активні речовини, як правило, захищають молекули та наповнювачі від впливів, що індукуються на межі розподілу повітря/розчин, і впливів, що індукуються на поверхні розчину, які в інших випадках можуть привести до агрегації молекул. Поверхнево-активні речовини також запобігають утворенню видимих і не видимих неозброєним оком часток.

Неїоногенна поверхнево-активна речовина переважно присутня у складах у концентрації від приблизно 0,01 95 до приблизно 195 (вага/об'єм), наприклад, від приблизно 0,01 95 до приблизно 0,595, від приблизно 0,01 95 до приблизно 0,395 або від приблизно 0,01 95 до приблизно 0,295. Альтернативно, неіоногенна поверхнево-активна речовина присутня в складах у концентрації від приблизно 0,01 95 до приблизно 0,05 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,06 95 до приблизно 0,10 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,1195 до приблизно 0,15 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,16 95 до приблизно 0,20 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,20 95 до приблизно 0,30 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,30 95 до приблизно 0,40 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,40 95 до приблизно 0,50 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,50 95 до приблизно 0,60 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,60 95 до приблизно 0,70 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,70 95 до приблизно 0,80 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,80 95 до приблизно 0,90 95 (вага/об'єм) або від приблизно 0,90 95 до приблизно 1,0 95 (вага/об'єм). Наприклад, неіоногенна поверхнево-активна речовина може бути присутня в складах у кількості приблизно 0,01 95 (вага/об'єм), приблизно

Зо 0,02 95 (вага/об'єм), приблизно 0,03 95 (вага/об'єм), приблизно 0,04 95 (вага/об'єм), приблизно 0,05 95 (вага/об'єм), приблизно 0,06 95 (вага/об'єм), приблизно 0,07 95 (вага/об'єм), приблизно 0,08 95 (вага/об'єм), приблизно 0,09 95 (вага/об'єм), приблизно 0,1 95 (вага/об'єм), приблизно 0,2 95 (вага/об'єм), приблизно 0,3 95 (вага/об'єм), приблизно 0,4 95 (вага/об'єм), приблизно 0,5 95 (вага/об'єм), приблизно 0,695 (вага/об'єм), приблизно 0,795 (вага/об'єм), приблизно 0,895 (вага/об'єм), приблизно 0,9 95 (вага/об'єм) і приблизно 1 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення неіїоногенна поверхнево-активна речовина присутня в складах у кількості від приблизно 0,05 95 до приблизно 0,2 95 (вага/об'єм).

Приклади поверхнево-активних речовин включають, без обмеження, полісорбати, гліцерин, двохосновні карбонові кислоти, щавлеву кислоту, бурштинову кислоту, форми фумарової кислоти, форми фталевої кислоти та їх комбінації. Фахівці в даній області інформовані про те, що можна застосовувати і інші неіоногенні поверхнево-активні речовини, оскільки вони є фармацевтично прийнятними, тобто придатними для введення суб'єктам. Неїіоногенна поверхнево-активна речовина переважно являє собою полісорбат. Приклади полісорбатів включають полісорбат 20, полісорбат 40, полісорбат 60, полісорбат 65 та полісорбат 80.

Неїоногена поверхнево-активна речовина найбільш переважно являє собою полісорбат 80.

В ілюстративних варіантах здійснення полісорбат 80 присутній в складах у кількості від приблизно 0,0195 до приблизно 1 95 (вага/об'єм). Наприклад, полісорбат 80 може бути присутнім в складах у кількості приблизно 0,01 95 (вага/об'єм), приблизно 0,02 95 (вага/об'єм), приблизно 0,03 95 (вага/об'єм), приблизно 0,04 95 (вага/об'єм), приблизно 0,05 95 (вага/об'єм), приблизно 0,06 95 (вага/об'єм), приблизно 0,07 95 (вага/об'єм), приблизно 0,08 95 (вага/об'єм), приблизно 0,09 95 (вага/об'єм), приблизно 0,195 (вага/об'єм), приблизно 0,2 95 (вага/об'єм), приблизно 0,395 (вага/об'єм), приблизно 0,495 (вага/об'єм), приблизно 0,595 (вага/об'єм), приблизно 0,695 (вага/об'єм), приблизно 0,7 95 (вага/об'єм), приблизно 0,895 (вага/об'єм), приблизно 0,9 95 (вага/об'єм) і приблизно 1 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення полісорбат 80 присутній в складах у кількості від приблизно 0,03 95 до приблизно 0,295 (вага/об'єм). Наприклад, полісорбат 80 може бути присутнім у кількості від приблизно 0,01 95 до приблизно 1 95 (вага/об'єм), від приблизно 0,02 95 до приблизно 0,595 (вага/об'єм) і від приблизно 0,03 95 до приблизно 0,295 (вага/об'єм). У найбільш переважних варіантах здійснення даного винаходу полісорбат 80 присутній в складах у кількості 0,2 95 (вага/об'єм). бо ІМ. Цукри

Склади за даним винаходом необов'язково можуть додатково містити цукор. Цукри звичайно застосовують у якості стабілізатора для високомолекулярних білків, або в якості кріопротектора, або в якості ліопротектора.

Цукор переважно присутній в складах у концентрації від приблизно 1 95 до приблизно 10 95 (вага/об'єм), наприклад, від приблизно 2 95 до приблизно 8 95 (вага/об'єм), від приблизно З 95 до приблизно 7 95 (вага/об'єм), від приблизно 4 95 до приблизно 6 95 (вага/об'єм) або приблизно 5 95 (вага/об'єм). Альтернативно, цукор присутній в складах у концентрації від приблизно 1 95 до приблизно 3 95 (вага/об'єм), від приблизно З 95 до приблизно 6 95 (вага/об'єм) або від приблизно б до приблизно 10 95 (вага/об'єм). Наприклад, цукор може бути присутнім в складах у кількості приблизно 1 95 (вага/об'єм), приблизно 2 95 (вага/об'єм), приблизно З 95 (вага/об'єм), приблизно 4 95 (вага/об'єм), приблизно 5 95 (вага/об'єм), приблизно 6 95 (вага/об'єм), приблизно 7 У (вага/об'єм), приблизно 8 95 (вага/об'єм), приблизно 9 95 (вага/об'єм) або приблизно 10 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення цукор присутній в складах у кількості від приблизно З 95 до приблизно 7 95 (вага/об'єм) та більш переважно в кількості приблизно 5 95.

Приклади цукрів включають, без обмеження, моносахариди, дисахариди та полісахариди.

Приклади сахаридів включають глюкозу, цукрозу, мальтозу, трегалозу, декстрозу, ксиліт, фруктозу та маніт. Фахівці в даній галузі інформовані про те, що можна застосовувати й інші цукри, оскільки вони є фармацевтично прийнятними, тобто придатними для введення суб'єктам.

Цукор переважно являє собою дисахарид. Цукор більш переважно являє собою цукрозу.

У певних варіантах здійснення цукроза присутня в складах у кількості приблизно 1 95 - 10 95 (вага/об'єм). Наприклад, цукроза може бути присутньою у складі в кількості приблизно 1 95 (вага/об'єм), приблизно 295 (вага/об'єм), приблизно 395 (вага/об'єм), приблизно 4 95 (вага/об'єм), приблизно 595 (вага/об'єм), приблизно б 95 (вага/об'єм), приблизно 7 95 (вага/об'єм), приблизно 8 95 (вага/об'єм), приблизно 995 (вага/об'єм) або приблизно 10 95 (вага/об'єм). Цукроза переважно може бути присутньою у кількості від приблизно З 95 до приблизно 7 95 (вага/об'єм) або від приблизно 4 95 до приблизно 6 95 (вага/об'єм). Цукроза найбільш переважно присутня в складах у кількості приблизно 5 95 (вага/об'єм).

М. Неіоногенні стабілізатори

Склади за даним винаходом необов'язково можуть додатково містити неіїоногенний

Зо стабілізатор. Стабілізатори відносяться до широкої категорії наповнювачів, які можуть варіювати за функцією від об'ємоутворюючого засобу до добавки, що солюбілізує терапевтичний засіб або сприяє запобіганню денатурації або прилипанню до стінки ємності.

Стабілізатори також мінімізують утворення високомолекулярних білків.

Неіоногенний стабілізатор переважно присутній в складах у концентрації від приблизно 1 95 до приблизно 10 95 (вага/об'єм), наприклад, від приблизно 2 95 до приблизно 8 95 (вага/об'єм), від приблизно 295 до приблизно 5 95 (вага/об'єм), від приблизно 295 до приблизно 4 95 (вага/об'єм) або приблизно 395 (вага/об'єм). Альтернативно, неіоногенний стабілізатор присутній в складах у концентрації від приблизно 1 95 до приблизно 2 95 (вага/об'єм), наприклад, від приблизно 295 до приблизно 4 95 (вага/об'єм), від приблизно 495 до приблизно 6 95 (вага/об'єм), від приблизно б 95 до приблизно 895 (вага/об'єм) або від приблизно 895 до приблизно 10 95 (вага/об'єм). Наприклад, неіоногенний стабілізатор може бути присутнім в складах у кількості приблизно 1 95 (вага/об'єм), приблизно 2 95 (вага/об'єм), приблизно З 95 (вага/об'єм), приблизно 495 (вага/об'єм), приблизно 595 (вага/об'єм), приблизно 6 95 (вага/об'єм), приблизно 7 95 (вага/об'єм), приблизно 8 95 (вага/об'єм), приблизно 9 95 (вага/об'єм) або приблизно 10 95 (вага/об'єм). В конкретних варіантах здійснення неіоногенний стабілізатор присутній в складах у кількості від приблизно 195 до приблизно 5 95 (вага/об'єм), більш переважно від приблизно 1 95 до приблизно 3 95 (вага/об'єм) і найбільше переважно приблизно

З 95 (вага/об'єм).

Приклади стабілізаторів включають, без обмеження, багатоатомні сахароспирти; амінокислоти, такі як пролін, аргінін, лізин, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аланін, орнітин,

І -лейцин, 2-фенілаланін, глутамінова кислота, треонін і т. п.; органічні цукри або сахароспирти, такі як лактоза, трегалоза, стахіоза, арабіт, еритрит, маніт, сорбіт, ксиліт, рибіт, міоінозит, галактит, гліцерин і т. п., у тому числі цикліт, такі як інозит; полієтиленгліколь; полімери амінокислот; сірковмісні відновники, такі як сечовина, глутатіон, тіоктова кислота, тіогліколят натрію, тіогліцерин, а-монотіогліцерин та тіосульфат натрію; низькомолекулярні поліпептиди (тобто, що мають « 10 залишків); білки, такі як людський сироватковий альбумін, бичачий сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон, сахариди, моносахариди, такі як ксилоза, маноза, фруктоза, глюкоза; дисахариди, такі як лактоза, мальтоза та цукроза; трисахариди, такі як рафіноза; полісахариди, бо такі як декстран, і т. п. Фахівці в даній галузі інформовані про те, що можна застосовувати й інші неіоногенні стабілізатори, оскільки вони є фармацевтично прийнятними, тобто придатними для введення суб'єктам. Неіоногенний стабілізатор переважно являє собою амінокислоту.

Неіоногенний стабілізатор більш переважно являє собою пролін або гліцин. Неіоногенний стабілізатор найбільш переважно являє собою пролін. Альтернативно, неіоногенний стабілізатор являє собою маніт.

У певних варіантах здійснення пролін присутній в складах у кількості приблизно 1 95 - 10 95 (вага/об'єм). Наприклад, пролін може бути присутнім у складі в кількості приблизно 1 95 (вага/об'єм), приблизно 295 (вага/об'єм), приблизно 395 (вага/об'єм), приблизно 4 95 (вага/об'єм), приблизно 595 (вага/об'єм), приблизно б 95 (вага/об'єм), приблизно 7 95 (вага/об'єм), приблизно 895 (вага/об'єм), приблизно 995 (вага/об'єм) або приблизно 10 95 (вага/об'єм). Пролін переважно може бути присутнім у кількості від приблизно 1 95 до приблизно 595 (вага/об'єм) або від приблизно 195 до приблизно З 95 (вага/об'єм). Пролін найбільш переважно присутній в складах у кількості приблизно З 95 (вага/об'єм).

У певних альтернативних варіантах здійснення маніт присутній в складах у кількості приблизно 1 95 - 10 95 (вага/об'єм). Наприклад, маніт може бути присутнім у складі в кількості приблизно 1 95 (вага/об'єм), приблизно 2 95 (вага/об'єм), приблизно З 95 (вага/об'єм), приблизно 495 (вага/об'єм), приблизно 5 95 (вага/об'єм), приблизно 6 95 (вага/об'єм), приблизно 7 95 (вага/об'єм), приблизно 8 95 (вага/об'єм), приблизно 995 (вага/об'єм) або приблизно 10 95 (вага/об'єм). Маніт переважно може бути присутнім у кількості від приблизно 1 95 до приблизно 595 (вага/об'єм) або від приблизно 195 до приблизно 395 (вага/об'єм). Маніт найбільш переважно присутній в складах у кількості приблизно З 95 (вага/об'єм).

М. Інші наповнювачі

Крім того, склади за даним винаходом необов'язково можуть додатково містити інші наповнювачі, у тому числі, без обмеження, воду для ін'єкцій, розріджувачі, солюбілізувальні засоби, пом'якшуючі засоби, додаткові буфери, неорганічні або органічні солі, антиоксиданти, консерванти, об'ємоутворюючі засоби, хелатоутворювачі, засоби, що регулюють тонічність, і т. п. Переважно, однак, щоб склади за даним винаходом не містили інших наповнювачів, за винятком описаних вище. Інші фармацевтично прийнятні носії, наповнювачі або стабілізатори, такі як описані в Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса! Зсієпсе5 161" еайіоп, О5ої, А. Еа. (1980), можуть бути включені до складу за умови, що вони не впливають на бажані характеристики складу. У конкретному варіанті здійснення склад практично не містить консервантів, хоча в альтернативних варіантах здійснення при необхідності можна додавати консерванти.

Наприклад, у ліофілізовані склади можуть бути включені кріопротектори або ліопротектори.

МІ. Рідкі або ліофілізовані склади

Склади за даним винаходом можуть являти собою рідкі склади або ліофілізовані склади.

Склади переважно являють собою рідкі склади. Рідкі склади більш переважно є готовими для ін'єкції. Альтернативно, склади можуть являти собою ліофілізовані порошки. Ліофілізовані порошки переважно є готовими для об'єднання з розчинником безпосередньо перед введенням.

МІ. Ілюстративні склади

В одному ілюстративному варіанті здійснення даного винаходу даний винахід передбачає рідкий склад на основі антитіла, придатний для підшкірного введення, при цьому склад містить: приблизно 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 і 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1 і 3; приблизно 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіз-буфер у концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; приблизно 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80; приблизно 5 95 (вага/об'єм) цукрози та приблизно З 95 (вага/об'єм) проліну; де рН складу становить приблизно рн 7.

В іншому ілюстративному варіанті здійснення даного винаходу даний винахід передбачає рідкий склад на основі антитіла, придатний для підшкірного введення, при цьому склад містить: приблизно 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 і 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ФБЕО ІЮ МО: 1 і 3; приблизно 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіз-буфер у концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; 60 приблизно 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80;

приблизно 5 95 (вага/об'єм) цукрози та приблизно 3 95 (вага/об'єм) маніту; де рН складу становить приблизно рн 7.

В альтернативному ілюстративному варіанті здійснення даного винаходу даний винахід передбачає стабільний ліофілізований склад на основі антитіла, придатний для підшкірного введення, при цьому склад містить: приблизно 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 і 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ФБЕО ІЮ МО: 1 і 3; приблизно 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіз-буфер у концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; приблизно 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80; приблизно 5 95 (вага/об'єм) цукрози та приблизно З 95 (вага/об'єм) проліну; де рН складу становить приблизно рн 7.

В іншому альтернативному ілюстративному варіанті здійснення даного винаходу даний винахід передбачає стабільний ліофілізований склад на основі антитіла, придатного для підшкірного введення, при цьому склад містить: приблизно 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента, де антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 і 4, та варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ФЕО ІЮО МО: 1 і З; приблизно 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіз-буфер у концентрації приблизно 3,7 мМ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; приблизно 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80; приблизно 5 95 (вага/об'єм) цукрози та приблизно З 95 (вага/об'єм) маніту; де рН складу становить приблизно рн 7.

Зо МІ. Стабільність

Склади за даним винаходом є стабільними при 2-8 "С протягом щонайменше приблизно 1, 2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 місяців або довше. В ілюстративних варіантах здійснення вони є стабільними при 2-8 "С протягом щонайменше приблизно б місяців або довше. В інших ілюстративних варіантах здійснення вони є стабільними при 2-8"С протягом щонайменше приблизно 9 місяців. У додаткових ілюстративних варіантах здійснення вони є стабільними при 2-8"7"С протягом щонайменше приблизно 1 року або довше, більш переважно протягом приблизно 2 років і ще більш переважно протягом приблизно З років.

С. Способи введення

У певних варіантах здійснення даного винаходу склади прийнятні для парентерального, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньошкірного, підшкірного введення або їх комбінації. Склади за даним винаходом прийнятні для доставки за допомогою ряду методик. У переважних варіантах здійснення даного винаходу склад вводять підшкірно. Наприклад, переважно, щоб склади, що містять 100 мг/мл біспецифічного антитіла до ІІ -4/ЛІ-13, вводили підшкірно. Отже, склади переважно є стерильними. Способи додання складам стерильності добре відомі в даній галузі техніки та включають, наприклад, фільтрацію через стерильні фільтраційні мембрани або стерилізацію інгредієнтів складу, за винятком антитіл, в автоклаві при приблизно 120 "С протягом приблизно 30 хвилин. р. Дозування та лікарські форми

Ефективні дози складів за даним винаходом варіюють залежно від багатьох різних факторів, у тому числі від способу введення, цільової ділянки, фізіологічного стану суб'єкта, без відмінності у відношенні того, чи є суб'єкт людиною або твариною, інших ліків, що вводяться, і того, чи є лікування профілактичним або терапевтичним. Зазвичай суб'єкт є людиною, але також можна лікувати відмінних від людини ссавців, у тому числі трансгенних ссавців. Може існувати необхідність у підбиранні лікувальних дозувань для оптимізації безпеки та ефективності. Доза переважно варіює в діапазоні 100-200 мг/флакон.

Склади за даним винаходом можна вводити кілька разів. Інтервали між окремими введеннями доз можуть становити добу, тиждень, два тижні, місяць або рік. Інтервали також можуть бути нерегулярними. У деяких способах дозування коректують для досягнення певної бо концентрації зв'язуючого засобу, такого як антитіло, у плазмі крові. Дозування та частота будуть варіювати залежно від періоду напіввиведення біспецифічного антитіла до ІІ -4/І -13 з організму суб'єкта. Як правило, людські антитіла демонструють найбільший період напіввиведення, а після них ідуть гуманізовані антитіла, химерні антитіла та антитіла, відмінні від людських.

У додаткових варіантах здійснення даний винахід передбачає стандартну фармацевтичну форму, що містить терапевтично ефективну кількість складу за даним винаходом для лікування одного або декількох захворювань у суб'єкта за допомогою введення лікарської форми суб'єкту.

У переважному варіанті здійснення суб'єкт є людиною. Людина може бути дорослою або може бути дитиною. Термін "стандартна фармацевтична форма" відноситься до фізично дискретної одиниці, прийнятної як стандартне дозування для суб'єктів, що підлягають лікуванню, при цьому кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для викликання бажаного терапевтичного/профілактичного ефекту, разом з цитратним буфером з необхідним рн.

Стандартна лікарська форма може являти собою ємність, що містить склад. Прийнятні ємності включають, без обмеження, запаяні ампули, флакони, бутелі, шприци та пробірки.

Ємності можуть бути виконані з ряду матеріалів, таких як скло або пластик, і можуть мати стерильний вхідний отвір (наприклад, ємність може являти собою флакон, що має пробку, яку можна проколоти голкою для підшкірних ін'єкцій). В переважному варіанті здійснення ємність являє собою флакон. У цілому, ємність повинна підтримувати стерильність і стабільність складу.

В конкретних варіантах здійснення склади розфасовані у флакони на 7, 10, 15 або 20 мл, виготовлені з прозорого безбарвного скла типу І, закриті пробкою (бромбутил, покритий фторполімером) і запечатані обтискним ковпачком з фланцем (поліпропілен).

У конкретному варіанті здійснення склади вторинно розфасовані в ємність, таку як картонна коробка, що захищає флакони від світла.

Склади, що підлягають застосуванню для введення іп мімо, повинні бути стерильними. Цього можна досягти, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтраційні мембрани

Наприклад, рідкі склади за даним винаходом можна стерилізувати шляхом фільтрації за допомогою фільтра на 0,2 мкм або 0,22 мкм.

Е. Способи лікування

Ко) У даному документі додатково передбачені способи лікування захворювання або порушення, опосередкованого І/-4 та/або 1-13, при цьому способи включають уведення суб'єкту складу за даним винаходом. У певних варіантах здійснення захворювання, опосередковане 1/-4 та/або 1-13, являє собою форми раку, запалення, аутоімунні захворювання, інфекції, серцево-судинні захворювання, захворювання органів дихання, неврологічні захворювання та метаболічні захворювання.

Склади за даним винаходом можна застосовувати для лікування, пригнічення або попередження захворювання, такого як алергічне захворювання, захворювання, опосередковане ТП2, захворювання, опосередковане ІІ -13, захворювання, опосередковане ЇЇ -4, та/лабо захворювання, опосередковане ІІ -4/Л/-13. Приклади таких захворювань включають лімфому Ходжкіна, астму, алергічну астму, атопічний дерматит, атопічну алергію, неспецифічний виразковий коліт, склеродермію, алергічний риніт, СОРОЗ, ідіопатичний легеневий фіброз, хронічне відторгнення трансплантата, блеоміцин-індукований легеневий фіброз, радіаційно-індукований легеневий фіброз, гранулему легенів, прогресуючий системний склероз, шистосомоз, фіброз печінки, рак нирки, лімфому Беркітта, лімфому Ходжкіна, неходжкінську лімфому, синдром Сезарі, астму, септичний артрит, герпетиформний дерматит, хронічну ідіоспатичну кропивницю, неспецифічний виразковий коліт, склеродермію, гіпертрофічне рубцювання, хворобу Уіппла, доброякісну гіперплазію простати, легеневе порушення, у якому відіграє роль рецептор 1-4, стан, у якому відіграє роль руйнування епітеліального бар'єра, опосередковане рецепторами 1-4, порушення з боку травної системи, у якому відіграє роль рецептор ІІ -4, алергічну реакцію на ліки, хворобу Кавасакі, серповидно- клітинну анемію, синдром Черджа-Стросс, хворобу Грейвса, прееклампсію, синдром Шегрена, аутоїмунний лімфопроліферативний синдром, аутоїмунну гемолітичну анемію, стравохід

Барретта, аутоїмунний увеїт, туберкульоз, муковісцидоз, алергічний бронхолегеневий мікоз, хронічне обструктивне захворювання легенів, блеоміцин-індуковані пневмопатію та фіброз, легеневий альвеолярний протеїноз, респіраторний дистрес-синдром дорослих, саркоїдоз, синдром гіперпродукції ІДЕ, ідіопатичний гіпереозинофільний синдром, аутоїмунну пухирчатку, звичайну пухирчатку, бульозний пемфігоїд, важку міастенію, синдром хронічної втоми, нефроз.

Термін "алергічне захворювання" відноситься до патологічного стану, при якому в пацієнта проявляється гіперчутливість до речовини, яка зазвичай є неімуногенною, і формується імунна бо реакція на неї. Алергічне захворювання, як правило, характеризується активацією гладких клітин за допомогою ІДЕ, що приводить у результаті до запальної реакції (наприклад, локальної реакції, системної реакції), яка може привести до появи полегшених симптомів, таких як ринорея, до небезпечного для життя анафілактичного шоку та до смерті. Приклади алергічних захворювань включають, без обмеження, алергічний риніт (наприклад, поліноз), астму (наприклад, алергічну астму), алергічний дерматит (наприклад, екзему), контактний дерматит, харчову алергію та кропивницю (круп).

Термін "захворювання, опосередковане Тп2" відноситься до захворювання, при якому патологію викликає (повністю або частково) імунна відповідь (імунна відповідь ТпП2-типу), регульована СО4-Т-лімфоцитами Тп2, для яких характерне продукування ІІ -4, ІІ -5, 11 -9 ї І--13.

Імунна відповідь Тп2-типу пов'язана з виробленням певних цитокінів (наприклад, ІЇ--4, ІІ -13) та антитіл певних класів (наприклад, ІДЕ), а також пов'язана з гуморальним імунітетом.

Захворювання, опосередковані Тп2, характеризуються наявністю підвищених рівнів Тп2- цитокінів (наприклад, 1І--4, ІЇ-13) та/"або антитіл певних класів (наприклад, ІДЕ) і в ключають, наприклад, алергічні захворювання (наприклад, алергічний риніт, атопічний дерматит, астму (наприклад, атопічну астму), алергічне захворювання дихальних шляхів (ААО), анафілактичний шок, кон'юнктивіт), аутоіїмунні порушення, асоційовані з підвищеними рівнями ІІ -4 та/або 1-13 (наприклад, ревматоїдний артрит, реакцію "трансплантат проти хазяїна", захворювання нирок (наприклад, нефротичний синдром, волчаковий нефрит)), та інфекції, асоційовані з підвищеними рівнями ІЇ--4 та/або 1-13 (наприклад, вірусні, паразитарні, грибкові (наприклад, С. аірісап5) інфекції). Певні форми раку (наприклад, В-клітинна лімфома, Т-клітинна лімфома, множинна мієлома, рак голови та шиї, рак молочної залози та рак яєчників) асоційовані з підвищеними рівнями 1І/-4 та/або ІЇ-13 або асоційовані з проліферацією ракових клітин, індукованою 1-4 та/або індукованою 1-13. Ці форми раку можна лікувати, пригнічувати або попереджати за допомогою складів за даним винаходом.

Термін "рак" відноситься до фізіологічного стану в ссавців, зокрема, у людей, який зазвичай характеризується нерегульованим ростом клітин, або описує його. Приклади раку включають, без обмеження, карциному, лімфому, бластому, саркому та лейкоз.

Термін "аутоїмунне захворювання" відноситься до доброякісного захворювання або порушення, що виникає від і спрямоване проти власних тканин індивідуума. Приклади

Зо аутоїмунних захворювань або порушень включають, без обмеження, запальні реакції, такі як запальні захворювання шкіри, що включають псоріаз і дерматит; алергічні стани, такі як екзема та астма; інші стани, пов'язані з інфільтрацією Т-клітинами та хронічними запальними реакціями; атеросклероз; цукровий діабет (наприклад, цукровий діабет !/ типу або інсулінозалежний цукровий діабет); розсіяний склероз і запальне порушення з боку центральної нервової системи (СМ5).

У певних варіантах здійснення склади за даним винаходом можна вводити в комбінації з одним або декількома засобами терапії (наприклад, засобами терапії, що не є складами за даним винаходом, які в цей час вводять для попередження, лікування, контролю та/або зменшення інтенсивності захворювання, опосередкованого 1-4 та/або 1-13. Використання терміна "у комбінації" не обмежує порядок, в якому засіб терапії вводять суб'єкту. Перший засіб терапії можна вводити до (наприклад, за 1 хвилину, 45 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 годину, 2 години, 4 години, 6 годин, 12 годин, 24 години, 48 годин, 72 години, 96 годин, 1 тиждень, 2 тижні, З тижні, 4 тижні, 5 тижнів, б тижнів, 8 тижнів або 12 тижнів) введення другого засобу терапії суб'єкту, що мав, що має захворювання, опосередковане 1/-4 та/або 1І/-13, або схильному до захворювання, одночасно з ним або після нього (наприклад, через 1 хвилину, 45 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 годину, 2 години, 4 години, 6 годин, 12 годин, 24 години, 48 годин, 72 години, 96 годин, 1 тиждень, 2 тижні, З тижні, 4 тижні, 5 тижнів, 6 тижнів, 8 тижнів або 12 тижнів). Будь-який додатковий засіб терапії можна вводити з іншими додатковими засобами терапії в будь-якому порядку. Необмежуючі приклади засобів терапії, які можна вводити в комбінації з антитілом за даним винаходом, включають схвалені протизапальні засоби, наведені у Фармакопеї США та/або в "Настільному довіднику лікаря".

Е. Набори

Певні варіанти здійснення даного винаходу включають набір, що містить склад за даним винаходом. Набір може додатково містити одну або кілька ємностей, що містять фармацевтично прийнятні наповнювачі, і включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та точки зору користувача, у тому числі фільтри, голки та шприци. Разом з наборами можуть бути надані інструкції, що зазвичай включені в комерційні упаковки терапевтичних, профілактичних або діагностичних продуктів, у яких міститься інформація, наприклад, про показання, застосування, дозування, виготовлення, введення, протипоказання та/або запобіжні бо заходи щодо застосування таких терапевтичних, профілактичних або діагностичних продуктів.

Приклади

Як засіб ілюстрації даного винаходу наведені наступні приклади. Приклади не призначені будь-яким чином обмежувати обсяг даного винаходу. У цілому при здійсненні на практиці даного винаходу застосовують, якщо не зазначене інше, традиційні техніки фармацевтичного складання, хімії, молекулярної біології, технології рекомбінантних ДНК, імунології, наприклад технології з використанням антитіл, і стандартні техніки отримання поліпептидів, які описані, наприклад, в затбгоокК, Егй5сп апа Мапіаїі5, МоІесшаг СіІопіпд: Со ргіпд Натог І арогафгу

Ргез5 (1989); Апіїроду Епадіпеегіпу Ргоїосої5 (Меїпоаз іп МоїІесшіаг Віоіоду), моїште 51, Еа.: Раці 5., Нитапа Ргевз5 (1996); Апібоду Епдіпеегіпа: А Ргасіїса! Арргоасі (Ргасіїса! Арргоасіи 5еїієв, 169), Еа5.: МеСанепу У. єї аІ., Нитапа Ргевз5 (1996); Апііродієз: А І арогаїогу Мапиаї, Напом апа

І апе, Соїй 5ргіпд Натог І арогаїогу Рге55 (1999); и Сштепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Еав5.

Аийзирбеї еї аї., донп Уїєу є 5опз (1992).

У прикладах 2-6 використовуються наступні скорочення:

ВО: біотехнологічна розробка

В5АБ: біспецифічне антитіло

ОрІ 5: динамічне розсіювання світла роЕ: план експерименту

ОР: лікарський препарат ре: лікарська речовина

ОС: диференційна сканувальна калориметрія

ЕСМ: Мікроскопія в проточній комірці

ЕО5: складена лікарська речовина

А-ІЕ: піддане Фур'є-перетворенню - інфрачервона область

НАР: хроматографія на гідроксіапатиті

НОРЕ: полієтилен високої щільності

НММУ: високомолекулярна сполука

НРІ С: високоефективна рідинна хроматографія

ІЕК: ізоелектрофокусування

Іо: імуноглобулін с

Зо І: інтерлейкін кДа: кілодальтон

ІГММУ: низькомолекулярна сполука

Ма: не визначене

РЕ: полієтиленгліколь

РЕ5: поліетерсульфон

РБЗВ8О: полісорбат 80

РМОЕК: полівінілідендифторид об./хв.: обертів на хвилину

ЗС: підшкірне

ЗО5-РАСЕ: електрофорез з додецилсульфатом натрію та поліакриламідним гелем

ЗЕС: ексклюзійна хроматографія

І 5: статичне розсіювання світла за: достатня кількість

ТО: термогравіметричний аналіз

ОР/ОК: ультрафільтрація/діафільтрація

ОБР: фармакопея Сполучених Штатів Америки

ОМ-Мів5: ультрафіолетова та видима область спектра

Вага/об'єм: вага/об'єм

УКГ: вода для ін'єкцій

ХЕРБ: рентгенівська порошкова дифрактометрія

Гуманізоване біспецифічне антитіло ІдсС4 до ІІ -4/Л/-13, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка зв'язується як з ЇЇ -13, так і з 1-4, що містить амінокислотні послідовності

ЗЕОІЮО МО: 2 і 4, і варіабельну область легкого ланцюга, який зв'язується як з ЇЇ -13, так і з ІІ -4, що містить амінокислотні послідовності зХЕО ІЮ МО: 1 і 3, ("лідерне антитіло") використовували в наступних прикладах для того, щоб визначити оптимальні умови складання.

Метою наступних досліджень складів (приклади 2-6) було вивчити поведінку лідерного антитіла в розчині та у висушеному за допомогою сублімаційного сушіння стані (тобто виявити основні шляхи розпаду) і визначити прийнятні буферні системи для регулювання рн і добавки, які забезпечують високу стабільність лідерного антитіла при приблизно 100 мг/мл, для 60 подальшої розробки складу.

Далі показані лікарські речовини, використані в прикладах 2-6.

Лідерне антитіло після стадії НАР-очищення (останньої стадії послідовної обробки): партія Мо К5МО169 (дослідження Ме Р5-Рб): буфер складу: натрій-фосфатний буфер, 75 мМ, рн 6,7; концентрація: 10,4 мг/мл; партії Момо КЗМО169-52МУ 320, 326 і 327 (дослідження Мо Р7-Р13): буфер складу: натрій-фосфатний буфер, 59 мМ, рн 6,9; концентрація: 4,5 мг/мл; партія Мо К5МО169-5АМ/ 330 (дослідження Мо Р14): буфер складу: натрій-фосфатний буфер, 55 мМ, масі, 20 мМ, рн 6.8; концентрація: 4,4 мг/мл і партія Мо К5МО152 (дослідження Ме Р15-Р21) буфер складу: натрій-фосфатний буфер, 55 мМ, масі, 20 мМ, рН 6,8; концентрація: 3,9 мг/мл.

У кожному аналізі складу концентрацію лідерного антитіла коректували наприкінці ШЕ/ОЕ у воді або кінцевому буфері, а потім додатково розводили відповідними кількостями концентрованого буфера та розчинів добавок з отриманням бажаного кінцевого складу (деталі див. у таблиці 1).

Таблиця 1 деталі коректування складів а Концентрація та буфер після ОР/ОЕ і коректування. р, Концентрація після розведення концентрованим буфером і розчинами добавок.

Кожний склад стерилізували шляхом фільтрації (Мійеже ЗМ, МіПіроге, 0,22 мкм, РМОБЕ) у ламінарному потоці та фракцію розподіляли в скляні флакони 1 типу, що відповідали кожному моменту часу дослідження стабільності, крім дослідження із заморожуванням/розморожуванням, для якого використовували поліпропіленові пробірки.

У прикладах 2-6 визначали умови механічного впливу та термічного впливу для складів.

Для того, щоб оцінити вплив впливу струшування на зразки складів для аналізу Мо Р5Б-7, флакони струшували при 350 об./хв. протягом 2-15 год. при кімнатній температурі за допомогою

Коїа Теві 74401, а потім аналізували.

Для того, щоб оцінити вплив стресу від проходження через голку на зразки складів для

Зо аналізу Мо РІ12, 13, 16-18 і 20, можливий вплив проходження через голку (тобто напруги зрушення в голці) оцінювали за допомогою шприців для НРІ С (Опітеїгіс5 Согрогайоп, 100 мкл), якщо були доступні зразки малого об'єму, і за допомогою шприців Тегито, 260 х » - 0,45 х 12

ММ, якщо були доступні зразки більшого об'єму.

Для того, щоб оцінити вплив термічного впливу на зразки складів для аналізу Мо Р5Б-7 і 13, флакони зберігали при 45 "С протягом 1 і 2 тижнів, а потім аналізували. Необхідну температуру для термічного впливу визначали за допомогою Ю5С. Зразки для аналізів Ме Р5-7 і 13 також зберігали при 5 "С протягом 2 тижнів, а потім аналізували.

Для того, щоб оцінити вплив термічного впливу на зразки складів для аналізу Мо Р12, 15 121, флакони зберігали при 5 С протягом 3-6 тижнів і аналізували щотижня. Розчини перед ліофілізацією, називані складена лікарська речовина (БО5), для аналізів Мо Р16-18 і 20 зберігали при 5 "С протягом 4-5 тижнів і аналізували щотижня. Розведені після ліофілізації розчини для аналізів Мо Р14, 16-18 і 20 зберігали при 5 "С протягом 24 год., а потім аналізували.

Приклад 1 - Оптимізація рн

Першою стадією в процесі розробки складу було визначення оптимального рН для лідерного складу на основі антитіла. Для того, щоб визначити оптимальний рн, використовували низьку концентрацію лідерного антитіла (1 мг/мл в порівнянні зі 100 мг/мл), оскільки ця низька концентрація лідерного антитіла була достатньою для визначення оптимального рн. В таблиці 2 показані склади, що тестували в даному дослідженні.

Таблиця 2 аналіз Мо Р5 - підбирання рн 1174 | Цитратуї00ммМ /60| імумл 1.6 | Фосфат 100мМм /70| мг/мл 78 | тівл00мМ 80) мумл і.79 | тТівлб00ммМ |85| імумл

У даному дослідженні склад 1 не був стабільним, оскільки він приводив до конформаційної нестабільності лідерного антитіла. Більш конкретно, у лідерного антитіла спостерігалася тенденція розгортатися. Крім того, склад 9У приводив до дезамідування. Таким чином, було визначено, що оптимальний рН для лідерного складу на основі антитіла буде знаходитися у вузькому діапазоні близько значення рн 7,0.

Наступні дослідження інших параметрів складу, таких як буфери, поверхнево-активні речовини та стабілізатори, включали більш високі концентрації лідерного антитіла. Ці наступні дослідження, коли використовували високі концентрації лідерного антитіла, підтвердили вищевказані висновки відносно оптимального рН для лідерного складу на основі антитіла.

Приклад 2 - Буферна система/онна сила (сіль)

Буфери

Наступною стадією в процесі розробки складу було визначення оптимального буфера для лідерного складу на основі антитіла. Тестували кілька різних буферів, таких як гістидиновий, фосфатний, Ттгі5 та їх комбінації, у декількох різних аналізах.

Таблиця З аналіз Мо РбЄ - підбирання буферної системи при 1 мг/мл 7.6 1 тпівломММ /75| мг/мл

Таблиця 4 аналіз Мо Р7 - підбирання солі при 1 мг/мл

Таблиця 5 аналіз Мо Р13 - підбирання буфера/солі при 100 мг/мл 71171711 | Фосфатїомм |70| Ч0бмуимл. | - 7779 | тів1бомМм |70| Ч0бмумл | -

Таблиця 6 склад буферних систем

Лимоннакислота)ллаОН.д 160) - лобмМм | Задлярнбо Дигідрофосфатнатрю/маоН.о 170 | бомМм | Задлярн70

ФосфорнакислотаЛтіз-амінометан /80| ЗадлярН8О | ї100мММ

При обробці та складанні складів фільтровані зразки складів для аналізу і контролі не містили видимі та не видимі неозброєним оком частинок, та аналіз ЗЕС продемонстрував чистоту х 92,0 9о у зв'язку з тим, що початкова О5 містила 5,5 95 НММУ.

Температури початку та денатурації, отримані за допомогою Ю5С, вказували на кращу термостабільність у наступних буферних систем для регулювання рн: е фосфатної з рН 6,5 та 7,0: Мо Р5-5, РБ-6, Рб-2, Рб-3; е Тгі5 з рН 7,0 і 7,5: Мо Рб-5, Рб-6; для яких температура початку становила приблизно 61 "С у порівнянні, наприклад, з 48 С для рН 4,5 і 59 "С для гістидинового буфера.

Значення колоїдної стабільності, отримані за допомогою 515, вказували на кращу стабільність у наступних буферних систем для регулювання рн: е фосфатної с рН 7,5: Мо Рб-4 е Тгі5 з рН 7,0 і 7,5: Мо Рб-5, Рб-6; для яких другий віріальний коефіцієнт становив близько 3,0 107 мл.моль/г- у порівнянні, наприклад, зі значеннями 0,4 107 мл.моль/г- для гістидинового буфера та 1,5 107 мл.моль/? для фосфатного буфера з рН 7,0.

Різні рівні забруднення частинками спостерігали через 1 год. 30 хв. впливу струшування (див. фігуру 3).

Відносно видимих частинок кандидатними буферними системами для регулювання рН, що демонстрували високу стабільність в аналізі Мо Р5, були наступні: е фосфатна з рН 6,5, 7,0 та 7,5: Мо Р5-5, РБ-6 та Р5Б-7; е Тгі5 з рН 8,0 і 8,5: Мо Р5-8 та Р5-9.

Аналіз Мо 6 виконували для цих двох буферних систем зі значеннями рН від 6,5 до 7,5.

Кандидатами, що демонстрували найкращу стабільність, були наступні: е фосфатна з рН 7,0 і 7,5: Мо Рб-3 та Рб-4;

е Тгі5 з рН 7,0 і 7,5: Мо Рб-5 та Рб-6.

Основні значення рн, очевидно, краще підходять для мінімізації утворення частинок.

Вплив струшування і термічний вплив (2 тижні при 45 С) є значимими способами для встановлення відмінностей між буферними системами для регулювання рН у відношенні не видимих неозброєним оком частинок.

Кандидатними буферними системами для регулювання рН, що забезпечували високу стабільність, були наступні: аналіз Мо 5: склади від Мо Р5-6 до РБ-9, тобто, рН 2 7,0; аналіз Мо 6 (див. фігуру 4 та фігуру 5): - фосфатна, 7,5: Мо Рб-4; - Тгіб, 7,5: Мо Рб-6; за ними ішли наступні: - фосфатна з рН 7,0: Мо Рб-3; - Тгів з РН 7,0: Мо Рб-5.

Слід зазначити, що гістидиновий буфер (Ме Рб-1) продемонстрував важливий дестабілізуючий ефект за всіх умов впливу.

Виміри НІАС підтверджували дані візуального огляду: основні значення рН краще підходили для мінімізації утворення частинок. Крім того, при однаковому рН у складах на основі фосфату спостерігалося трохи менше не видимих неозброєним оком частинок, ніж в Ттгі5-буферній системі.

Відносно аналізу Мо 5 і 6 термічний вплив демонстрував цікаві результати як у відношенні

НММУ. Слід зазначити, що склад Мо Р5Б-1 (рН 4,5) піддавався повному розпаду через 1 тиждень при 45"С також, як і склад Мо Р5бБ-2 через 2 тижні при 45 "С. Ці два зразки виключали з наступного аналізу.

У відношенні НММУ результати через 2 тижні при 45 "С були аналогічними для складів від Мо

РБ-6 до РБ-9 (рН 2 7,0) та кращими для Ме від Р5-5 до Р5-3 протягом зниження рН від 6,5 до 5,5.

Для аналізу Мо 6 підтверджувалася дана тенденція, і кандидатними буферними системами для регулювання рН, що забезпечували високу стабільність, були наступні (див. фігуру 6): ее фосфатна з рН 6,5: Мо Рб-2. е Тгі5 з РН 7,0: Мо Рб-5; е гістидинова з рН 6,5: Мо Рб-5.

Таким чином, рн 6,5 забезпечував кращу стабільність відносно мінімізації утворення НМУУ, ніж рН 7,0, який сам по собі був краще, ніж рН 7,5. Крім того, при тому самому рН (7,0 і 7,5) склади на основі Тгі5 забезпечували трохи менше НМУМ, ніж фосфатна буферна система.

У відношенні ГММУУ склади Мо Р5-3-РБ-5 (рН «х 6,5) демонстрували високу стабільність через 2 тижні при 45 "С. Утворення стійких смужок І МУМ і додаткових смужок на гелі 5ХО5-РАСЕ спостерігалося в складах Мо Р5-6-РБ-9 (7,0 « рН « 8,5). Розпад І! ММУ/ був більш вираженим у складів Мо Р5Б-9 (Тіз з рН 8,5) (див. фігуру 7), і додаткові смужки на гелі ХО5-РАСЕ були особливо видні в Ме РБ-7 (фосфат з ріН7,5) (див. фігуру 8). Слід зазначити, що продукти розпаду, очевидно, були різними у фосфатної та Тгіз-буферних систем.

Аналіз Мо 6 підтвердив ці висновки та показав, що при тому самому рН склади на основі фосфатного буфера забезпечували трохи більше І ММУ, ніж Тгіз-буферні системи.

У відношенні НМУМ і І МУМ кислотні значення рН, очевидно, забезпечували кращу стабільність, ніж основні, при цьому в Тгі5 була невелика перевага в порівнянні з фосфатною буферною системою.

Термічний вплив при 45 "С протягом 4 тижнів був значущим способом прискорення хімічного розпаду лідерного антитіла (тобто зміни характеру кислотності), що підтверджувалося ІЕРК, і таким чином, вибору буферних систем для регулювання рН, що забезпечували високу стабільність лідерного антитіла (див. фігуру 9). Найменш стабільними складами були склади з

Тгів-буфером з рН 8,5 (Мо Р5-9) і з фосфатним буфером з рН 7,5 (Мо Рб-4), оскільки в кожному з них були представлені 2 додаткові кислотні форми в ізоформному складі, і основна форма ставала другорядною. Кандидатною буферною системою для регулювання рН, що демонструвала високу стабільність, була Ттгі5 з рН 7,0 (Мо Рб-5).

У підсумку, на підставі аналізу вихідного стану та результатів програми впливу відносно зразків для аналізу Мо Р5 і 6 (розчинів з концентрацією 1 мг/мл) був встановлений рН 7,0. Даний вибір являє собою компроміс між високою стабільністю у відношенні видимих і не видимих неозброєним оком частинок (основними значеннями рн) і стабільністю у відношенні НМУМ і МУ (кислотними значеннями рН). Відносно буферних систем і фосфатна, і Тгі5 демонстрували переваги при обраному рН: фосфатна - у відношенні видимих/не видимих неозброєним оком 60 частинок, а Ттгіз - у відношенні НМУМ і СМУМ.

Зо

Слід зазначити, що для першого оцінювання добавок використовували фосфатну буферну систему при 10 мМ або Ттгіз-буферну систему при 10 мм: е для підтвердження наведених вище результатів відносно розчинів лідерного антитіла з концентрацією 100 мг/мл, е і для тестування процесу сублімаційного сушіння по відношенню до обох буферних систем окремо.

Наведені вище результати були підтверджені, і обидві буферні системи (Ме Р14-3 і Р14-8) продемонстрували високі результати в ході процесу сублімаційного сушіння (див. фігуру 19).

При рН 7,0 фосфатний буфер мав більшу буферну ємність, ніж Ттгіб; однак на відміну від

Тгі5, його основа мала тенденцію осаджуватися під час стадій заморожування. Для об'єднання переваг Ттгі5 і фосфатного буфера була обрана суміш цих двох буферних систем: фосфат, 6,3

ММ і Тгі5, 3,7 мМ. Незважаючи на те, що застосування Тгіз-буфера або фосфатного буфера відомо з рівня техніки (застосування кожного окремо), комбінування Тгіз-буфера та фосфатного буфера в буферній системі вкрай нетипово та не відомо з рівня техніки.

Провідність (вибір рН і буфера)

Розчин перед ліофілізацією мав провідність приблизно 300 мкСм/см, що теоретично давало провідність ОР після розведення, рівну 850 мкСм/см.

Спершу пробували буфер, що широко використовується для тАб - гістидиновий, у його забуферюючому діапазоні при рН 6,2 і 6,6 і при концентрації 10 мМ. При рН 6,2 виникла проблема нерозчинності, пов'язана з осадженням лідерного антитіла при кімнатній температурі (див. фіг. 29). При рН 6,6 розчин незначно опалесціював при кімнатній температурі, другий віріальний коефіцієнт був низьким - 0,4 107 мл.моль/г-. На відміну від більшості тАб, для лідерного антитіла гістидиновий буфер не був прийнятним.

Потім пробували інший буфер, що широко використовують, фосфатний, у його забуферюючому діапазоні при рН 6,5, 7,0 і 7,5 та при концентрації 10 мМ. Для рН 6,5 ії 7,0 другий віріальний коефіцієнт був нижче 1,5 107 мл.моль/-, що означало низьку колоїдну стабільність. Для рН 7,5 другий віріальний коефіцієнт становив близько 3,0 107 мл.моль/і?-, Що означало високу колоїдну стабільність, однак при термічному впливі (2 тижня при 45 С) спостерігалося більш істотне зниження чистоти (збільшення кількості і НМУМ, і МУ), ніж при рН

Зо 6,5 і 7,0. Фосфатний буфер є гарним буфером, однак при кислотному рН низька колоїдна стабільність, а при основному рН лідерне антитіло чутливе до термічного впливу.

Для того, щоб розширити зону підбирання буфера, Тгі5 тестували в його забуферюючому діапазоні при рН 7,0 і 7,5 та при концентрації 10 мМ. Обидва значення рН забезпечували високу колоїдну стабільність, при цьому віріальний коефіцієнт становив близько 3,0 107 мл.моль/І-.

При термічному впливі (2 тижні при 45 "С) при рН 7,5 спостерігалося більш істотне зниження чистоти (збільшення кількості і НМУМ, і ГМУМ), ніж при рН 7,0. Однак Ттгіз-буфер при рН 7,0 забезпечував набагато кращу стабільність по відношенню НМУУ і трохи кращу стабільність по відношенню ГММУ, ніж фосфатний буфер при такому ж рн. Тті5 з рН 7,0 є кращою буферною системою, ніж Тгі5 з рН 7,5 і фосфатна з рН 7,0. Однак для досягнення високої буферної місткості Тгіз при даному рН (рка-8,1) необхідна кількість буде більше максимальної, що використовується в продукті, який серійно випускається.

Для того, щоб оптимізувати буфер для лідерного антитіла, вибирали комбінацію фосфат, 6,5 мМЛтТі5, 3,7 мМ для досягнення високої буферної місткості при рН 7,0 за рахунок фосфату (рКа-7,2) і високої стабілізації лідерного антитіла за рахунок Ттгів5.

Як зазначено вище, незважаючи на те, що застосування Тгіз-буфера або фосфатного буфера відомо з рівня техніки (застосування кожного окремо), комбінування Тгіє-буфера та фосфатного буфера в буферній системі вкрай нетипово і не відомо з рівня техніки.

Іонна сила/концентрація солі

Хлорид натрію (МасСі) тестували з двома обраними кандидатними буферами для регулювання рН при концентрації 70 мМ відносно розчинів лідерного антитіла з концентрацією 100 мг/мл.

Температури початку і денатурації, отримані за допомогою ОС, а також значення колоїдної стабільності, отримане за допомогою 515, не вказували на будь-який значний ефект Масі відносно стабільності розчинів.

Після механічного впливу на зразки складів для аналізу Мо Р13 і двох тижнів зберігання при 5"Сб того ж складу кандидати Мо Р13-1 і Р13-3, тобто без Масі, демонстрували кращу стабільність відносно утворення НМУУ (див. фігуру 10). Те ж, але обернене на фігурі 33.

Збільшення концентрації солі викликало збільшення іонної сили, що викликало збільшення кінетичних показників агрегації лідерного антитіла. Таким чином визначили, що склад не 60 повинен містити сіль або осмотичний засіб. Крім цього, визначили, що оптимальний склад повинен містити низьку концентрацію буфера для того, щоб іонна сила була низкою.

Приклад З -Поверхнево-активна речовина

Наступною стадією в процесі розробки складу було визначення оптимальних наповнювачів для лідерного складу на основі антитіла. Наповнювачі повинні бути достатніми, щоб стабілізувати лідерне антитіло та підходити для ліофілізації. Тестували кілька різних поверхнево-активних речовин, таких як полісорбати та полоксамери, у різних концентраціях.

Таблиця 7 аналіз Мо Р12- підбирання добавок при 85 мг/мл

Склад Концент-

Мо Р12- | Буферна система | рн рація Добавка 1 Добавка 2 х (вага/об'єм) (вага/об'єм) (130 мМ) (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм) сен пен (вага/об'єм) пол ілі лобі УМАНІ ННЯ (вага/об'єм) спот в ов 1 вага/об'єм поліса лсІ віск. ЧАШІ НИВИ (вага/об'єм) пол ід Лаба Кс с ооо НИВА (вага/об'єм)

ПОЛ ілі Лоб Кс с: ПИВО НИВА (вага/об'єм) 1 | Фосфатїомм |70 | 85м/имл|-./.:(х«х:лЗ/// ЇЇ.

Таблиця 8 аналіз Мо Р23- підбирання добавок при 100 мг/мл

Безпосередньо після відфільтровування частинок розміром 0,22 мкм зразки складів для аналізу та контролі не містили видимі та не видимі неозброєним оком частинки. Аналіз 5ЕС показав чистоту х 92,0 95, обумовлену концентрацією лідерного антитіла, що становила від 4,5 мг/мл до 100 мг/мл (вихідна О5 містила 3,0 96 НМУ).

Механічний вплив був значущим способом встановлення відмінностей між кандидатними складами. У зв'язку з тим, що була доступна обмежена кількість вихідного матеріалу, стандартне візуальне спостереження було неможливе та, внаслідок цього, застосовували спостереження в капілярі під збільшувальним склом. У відношенні видимих/не видимих неозброєним оком частинок, кандидатами, що демонстрували гарну стабільність в аналізі Мо 12, були наступні (див. фігуру 11): ее РБ8О, 0,1 до: Мо Р12-6; ее РБ20, 0,1 до: Мо Р12-8.

Серед поверхнево-активних речовин, що тестували, жодна не впливала на утворення НМУУ в порівнянні зі складом без поверхнево-активної речовини, крім Ме Р12-8 (0,1 95 РБЗ20), яка спричиняла невеликий негативний ефект протягом шести тижнів зберігання при 5 С (див. фігуру 12).

На завершення, між поверхнево-активними речовинами не було сильної відмінності.

Наступна поверхнево-активна речовина: Р580 вибирали для запобігання утворення видимих/не видимих неозброєним оком частинок.

Далі тестували різні концентрації РЗ8О у лідерному складі на основі антитіла (див. таблицю 23). Концентрації РБЗВ8О від 0,05 до 0,2 95 тестували відносно впливу струшування протягом 15 годин при 350 об./хв. (кімнатна температура). Зразки аналізували за допомогою мікроскопії в проточній комірці, а результати показано в таблиці 9. В таблиці 9 показано, що концентрація

РБ8О від 0,05 до 0,295 спричиняла еквівалентний стабілізуючий ефект відносно впливу струшування при всіх концентраціях. Таким чином, у складі можна використовувати концентрацію РБЗВ8О від 0,05 до 0,2 95.

Таблиця 9 концентрація РЗ8О год. при 350 об./хв. при кімнатній температурі 1 хом | хломкм | х2вмкм рг(0оБоеРЕВО) | 2589

ЕЗ (0.07 зе РеВО

Е4 (0.1 95 РВВО

Е5 (0,2 95 РБВО тва | в | 16

ЕСМ: кількість частинок в мл

Приклад 4 - Цукроза

Як зазначено вище, наступною стадією в процесі розробки складу було визначення 15 оптимальних наповнювачів для лідерного складу на основі антитіла. Наповнювачі повинні бути достатніми, щоб стабілізувати лідерне антитіло та підходити для ліофілізації. Тестували кілька різних цукрів, таких як цукроза, трегалоза та маніт, у різних концентраціях.

Таблиця 10 аналіз Мо Р14- підбирання добавок для ліофілізату

Склад Мо Буферна .

РІА-х система рН | Концентрація Добавка 1 Добавка 2 Добавка З

Фосфат, 10 РБВО, 0,1 95

Фосфат, 10 РБВО, 0,1 96 Цукроза, 10 95 2 ММ 7,0 |100 мг/флакон (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Фосфат, 10 РБВО, 0,1 96 Цукроза, 5 95 Маніт, З 96

З ММ то (100 мг/флакон вага/об'єм вага/об'єм вага/об'єм

Фосфат, 10 РБВО, 0,1 95 Маніт, З Фо

Фосфат, 10 РБВО, 0,1 95 Маніт, З Фо

Фосфат, 10 РБВО, 0,1 96 Гліцин, 1 95 Маніт, З 96 вот ло оо мг/флакон (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Фосфат, 10 РБВО, 0,3 96 Цукроза, 5 95 Маніт, З 96

Ц ММ 7,0 |100 мг/флакон (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм) : РБВО, 0,1 96 Цукроза, 5965 |Маніт, З 95 80тв, 19 мМ 7,0 (100 мг/флакон (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Таблиця 11 аналіз Мо Р15- підбирання добавок при 100 мг/мл - БоЕ

НИ: БЕ КН Ки ев НИВИ Кс іній мм мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) (вага/об'єм) 1 ше ше 1 10 мм мг/мл |(вага/об'єм вага/об'єм вага/об'єм

З Фосфат, | 7,0 1100 РБВО, 0,01 9» | Трегалоза,

Би ЯЗ З аШІ ШИ (вага/об'єм)

ОС зби) 00 ев ето 10 мм мг/мл |(вага/об'єм) (вага/об'єм) | кислота, 7,3 95 (вага/об'єм)

НЕО Ес ШВСМ сан НВ Кен ее 10 мм мг/мл |(вага/об'єм) (вага/об'єм) |) (вага/об'єм)

ОО би н 10 мм мг/мл |(вага/об'єм) |10 95 (вага/об'єм) (вага/об'єм) 10 мм мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) (вага/об'єм) |) (вага/об'єм)

Но ДБК как е ян я зн ННІ 10 мм мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) (вага/об'єм) жирні ння

ММ мг/мл |(вага/об'єм) |10 95 (вага/об'єм) | (вага/об'єм) вага/об'єм шт шо они 0 ШШ

ММ мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) (вага/об'єм)

ПОШИ НН І кн ні сс НН

ММ мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Се тео нт І

ММ мг/мл |(вага/об'єм) (вага/об'єм) 1 рен о І ее

ММ мг/мл |(вага/об'єм) |10 95 (вага/об'єм) | кислота, 7,3 95 (вага/об'єм) (вага/об'єм)

ВОНО КАН ШК стан ПОЛОН НОВИН

ММ мг/мл |(вага/об'єм) (вага/об'єм)

Орні! 0е

ММ мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) кислота, 7,3 90 (вага/об'єм)

ММ мг/мл |(вага/об'єм) | (вага/об'єм) (вага/об'єм) |) (вага/об'єм)

Таблиця 12 аналіз Мо Р16- підбирання добавок та розробка способу для ліофілізату

ВШ БД КН Ну сосен НІНІ

ММ мг/флакон |(вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм) мер

ММ мг/флакон |(вага/об'єм) |5 95 (вага/об'єм) (вага/об'єм) тво ші

ММ мг/флакон |(вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм)

Таблиця 12 аналіз Мо Р16- підбирання добавок та розробка способу для ліофілізату

Склад Мео| Буферна Концентр-

РІб-х система рн ація Добавка 1 Добавка 2 Добавка З Добавка 4 4 Фосфат, 10) 7,0 1100 РБВО, 0,1 95 |Цукроза, 5 95 |Маніт, З 95 ІРЕС 4000, 1 96

ММ мг/флакон |(вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм) ((вага/об'єм)

Таблиця 13 аналіз Мо Р17-ЕО5 - підбирання добавок при 38 мг/мл

Склад Мо | Буферна Концент-

РІ7-х-ЕОЄ! система рн рація Добавка 1 Добавка 2 Добавка З

Тгів/фосфат, РБВО, 0,033 Фо Цукроза, 3,33 Фо 1 зм 7,0 | 38 мг/мл | вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 0,033 Фо Цукроза, 1,67 бо |Маніт, 1 95 2 3,3 ММ 1,0 | 38 мг/мл (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 0,033 90 Гліцин, 0,37 90

З Іззмм 7.0) 38 мг/мл | вага/об'єм) 7000 вино

Таблиця 14 аналіз Мо Р17- підбирання добавок та розробка способу для ліофілізату

РІ17-х система рН |Концентрація Добавка 1 Добавка 2 Добавка З

Тгів/фосфат, РБВО, 0,1 У5ІЦукроза, 10 Фо 1 Момм 7,0. 190 мг/флакон) в ага/об'єм) /(вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 0,1 95ІЦукроза, 5 У5|Маніт, З до 2 10 мм 70. )190 мг/флакон (вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 01 96 Гліцин, 2,2 95

З Момм 70 190 мг/флакон) вага/об'єм) ння,

На завершення, на підставі наведених вище досліджень як наповнювач вибирали цукрозу, оскільки вона стабілізувала лідерне антитіло. Крім цього, добре відомо, що цукроза є ліопротектором, тому вона покращить ліофілізований склад. Фактично, ліофілізація без цукрози приводила до збільшення кількості НМУМ (див. фіг. 19). Як було виявлено згодом, 5 95 цукроза є оптимальною для складу.

Приклад 5 - Стабілізатори

Як зазначено вище, наступною стадією в процесі розробки складу було визначення оптимальних наповнювачів для лідерного складу на основі антитіла. Наповнювачі повинні бути достатніми, щоб стабілізувати лідерне антитіло та підходити для ліофілізації. Тестували кілька різних стабілізаторів, таких як маніт, аспартат, пролін, гліцин, аргінін і лейцин, у різних концентраціях. Це можна побачити в таблицях, наведених нижче, і в таблицях 10-14, наведених вище.

Таблиця 15 аналіз Мо Р18- підбирання добавок та розробка способу для ліофілізату

Склад Мо й

РІВ-х Буферна система | рН |Концентрація | Добавка 1 Добавка 2 Добавка З : 175 РБВО, 0,1 96ІЦукроза, 5 95|Маніт, З до ! Тгів/фосфат, ТО ММ) 70 мг/флакон (вага/об'єм) ((вага/об'єм) |(вага/об'єм) : 175 РБВО, 0,1 96ІЦукроза, 5 бс|ІАспартат, 4,395 2 Тгів/фосфат, ТО ММ) 70 мг/флакон вага/об'єм) |(вага/об'єм вага/об'єм : 175 РБЗВ8О, 0,1 95|Цукроза, 5 95ІПролін, 5,8 90

З Тгів/фосфат, ТО ММ) 70 мг/флакон (вага/об'єм) ((вага/об'єм) |(вага/об'єм)

Таблиця 16 аналіз Мо Р2О-ЕО5 - підбирання добавок при 35 мг/мл

Склад Мо Буферна Концент-

Р2О-х-ЕО5 система рн рація Добавка 1 Добавка 2 Добавка З

Тгів/фосфат, РБВО, 0,07 бо |Цукроза, 1,75 96 Маніт, 1,05 95 ! 3,5 ММ 1,0 ) 35 мг/мл (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 0,07 бо |Цукроза, 1,75 96 Аспартат, 1,05 95 2 3,5 ММ 1,0 | 35 мг/мл вага/об'єм вага/об'єм вага/об'єм

Тгів/фосфат, РБВО, 0,07 бо |Цукроза, 1,75 96 Пролін, 1,05 95

З 3,5 ММ 1,0 ) 35 мг/мл (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 0,07 бо |Цукроза, 1,75 96 Гліцин, 1,05 95 4 3,5 ММ 1,0 ) 35 мг/мл (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тгів/фосфат, РБВО, 0,07 бо |Цукроза, 1,75 96 Аргінін, 1,05 95 9 3,5 ММ 1,0 ) 35 мг/мл (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм)

Таблиця 17 аналіз Мо Р20 - підбирання добавок та розробка способу для ліофілізату

Склад Мо Буферна Концент-

РгО-х система рн рація Добавка 1 Добавка 2 Добавка З 1 Тпів/фосфат,| 7,0 1175 РБВО, 0,1 бо Цукроза, 5 95 Маніт, З 95 10 мМ мг/флакон |(вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм) 2 Тпів/фосфат,| 7,0 1175 РБВО, 0,1 бо Цукроза, 5 95 Аспартат, З 95 10 мМ мг/флакон |(вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

З Тпів/фосфат,| 7,0 1175 РБВО, 0,1 96 Цукроза, 5 95 Пролін, З 95 10 мМ мг/флакон |)(вага/об'єм вага/об'єм вага/об'єм 4 Тпів/фосфат,| 7,0 1175 РБВО, 0,1 96 Цукроза, 5 95 Гліцин, З Фо 10 мМ мг/флакон |(вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Тпів/фосфат,| 7,0 1175 РБВО, 0,1 96 Цукроза, 5 95 Аргінін, З Фо мМ мг/флакон |(вага/об'єм) (вага/об'єм) (вага/об'єм)

Таблиця 18 аналіз Мо Р21- підбирання добавок при 35 мг/мл

Склад Буферна Концент-

Мо Р21-| система рн рація Добавки 1 Добавка 2 Добавка З х 1 Тгів/фосфат,| 7,0 |З5 мг/мл |РБВ8ВО, 0,01 95|Цукроза, 195 |Маніт, З 95 (вага/об'єм) 3,5 ММ (вага/об'єм) |(вага/об'єм) 2 Тгів/фосфат,| 7,0 |З5 мг/мл |РБВ8ВО, 0,01 95|Цукроза, 195 |Сульфобутиловий етер 3,5 ММ (вага/об'єм) |(вага/об'єм) В-циклодекстрину, З Фо вага/об'єм

З Тгів/фосфат,| 7,0 |З5 мг/мл |РБВ8ВО, 0,01 95|Цукроза, 195 |М-ацетил-цистеїн, З 95 3,5 ММ (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм) 4 Тгів/фосфат,| 7,0 ІЗ5 мг/мл |РБ8ВО, 0,01 95ІЦукроза, 195 |Лейцин, 0,3 95 3,5 ММ (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм) 5 Тгів/фосфат,| 7,0 |З5 мг/мл |РБВ8ВО, 0,01 95|Цукроза, 1 95 || -лізину монохлоргідрат, 3,5 ММ (вага/об'єм) (вага/об'єм) З 95 (вага/об'єм)

Тгів/фосфат,| 7,0 ІЗ5 мг/мл |РБВО, 0,01 95ІЦукроза, 195 |М-ацетил-цистеїн, 0,03 95 3,5 ММ (вага/об'єм) |(вага/об'єм) (вага/об'єм) 75 | ПТтів/фосфат,| 7,0 |З5 мг/мл |РБЗВ8ВО, 0,01 95|Цукроза, 1 95 |Маніт, З 95 (вага/об'єм) 3,5 ММ (вага/об'єм) |(вага/об'єм)

Тгів/фосфат,| 7,0 |З5 мг/мл |РБВ8О, 0,01 95 3,5 ММ (вага/об'єм)

Зб

Таблиця 18 аналіз Мо Р21- підбирання добавок при 35 мг/мл

Склад Буферна Концент-

Мо Р21-| система рн рація Добавки 1 Добавка 2 Добавка З х с Такий же склад, як і Мо Р21-1, але даному зразку додали інертність за допомогою азоту при зберіганні при 57

Метою цих підбирань було знайти добавку для додаткової стабілізації лідерного антитіла відносно утворення НМУМ (аналіз Мо 12, 15, 20-БО5 і 21). У зв'язку з високою схильністю лідерного антитіла до агрегації передбачувана температура тривалого зберігання (тобто 5 С), як було виявлено, є значимою для відстеження ефекту добавок.

План експерименту (ОоЕ) - модель підбирання, перша ступінь, матриця Ю-оптимального плану - був створений для спостереження ефекту різних цукрів, поліолів, амінокислот та розчинників відносно утворення НММУ (аналіз Мо 15). Підсумок даного СОЕ наведено в таблиці 19.

Таблиця 19 підсумок аналізу Мо 15 (ООЕ), що стосується підбирання добавок

Цукри та Невелика стабілізація за Невелика стабілізація за |Невеликий позитивний поліоли допомогою маніту допомогою цукрози та |ефект цукрів та поліолів трегалози

Амінокислоти |Сильна стабілізація за Стабілізація за Позитивний ефект допомогою аспартату та допомогою аспартату та |(аспартату, гліцину та невелика стабілізація за невелика за допомогою |проліну допомогою гліцину, проліну та |гліцину та проліну глутаміну

Розчинники Сильна дестабілізація за Сильна дестабілізація за Відсутність ефекту або допомогою етанолу допомогою етанолу дестабілізуючий ефект розчинників

Буферні Ефект відсутній МО Відмінність між системи буферними системами відсутня

Добавки, які, як було виявлено, спричиняли ефект на НММУ, тестували окремо в аналізі Мо 12і20-Е05: е амінокислоти гліцин (Ме Р12-1 і Р20-4-ЕО5) і пролін (Ме Р20-3-ЕО5), як було виявлено, виявляли найкращий ефект в мінімізації утворення НМУМ (див. фігуру 13 та фігуру 14), е за ними ішов маніт (Мо Р20-1-ЕО5) (див. фігуру 14), е за ним ішли цукроза (Ме Р12-3) і трегалоза (Мо Р12-4), які були набагато менш ефективними (див. фігуру 13), е зрештою, позитивний ефект 8 95 аспартату (Ме Р20-2-ЕО5) не був підтверджений при концентрації 4 95 (див. фігуру 14).

У ході аналізу Мо 21 тестували декілька інших добавок: е лізин (Мо Р21-5), як було виявлено, спричиняв невеликий позитивний ефект відносно утворення НМУМУ (див. фігуру 15), е маніт (Мо Р21-1), як було виявлено, був найкращим у цьому аналізі.

Було виявлено, що додавання проліну до складу спричиняло два ефекти: він контролював утворення НМУМ шляхом зниження швидкості агрегації в рідкому складі та він виступав як об'ємоутворюючий засіб для забезпечення більш гладкого осаду в ліофілізованому складі.

Також було виявлено, що додавання маніту в ліофілізований склад обумовлювало гладкість осаду.

Зо Далі тестували різні концентрації проліну в лідерному складі на основі антитіла (див. таблицю 23). Тестували концентрації 1 95 і З 95. Зразки аналізували за допомогою ОРІ С, а результати показано в таблицях 20 та 21 та на фігурі 16. Таблиці 20 та 21 показують, що в складі можна використовувати концентрацію проліну або 1, або 395. Ці дані також підтверджують позитивний ефект проліну відносно кінетичних показників, що стосуються НМУ.

Крім того, осад трохи більш гладкий (менш складчастий) при використанні З 95 проліну, що підтверджує роль проліну як заповнювача (результати не показані).

Таблиця 20 1 95 проліну

Е1 (1 95 проліну)

Час (год) 95 мономеру (М) 1/М-1/МО | 95 НМУ 0 юще5Б0 |ооювзі | 42 001080 | 000027. | 66. І 77.1... 806 | 001104 | ооо 0001220 | 0,00167

Таблиця 21

З до проліну

Е5 (З 95 проліну)

Час (год. | 95 мономеру (М) 1/М-1/МО | 95 НМУ 0 юще53 | о00104391 щЩщ | з8 001073 | 0,00024 | 6. .1« 001092 | 0,00042 01189 | 0,00140

На завершення, хоча утворення НМУУ було значно зменшене шляхом додавання наповнювачів, а саме маніту та амінокислот, таких як гліцин і пролін, сприятливий ефект при концентрації лідерного антитіла 100 мг/мл не досить сильний, щоб досягти задовільного строку зберігання. У зв'язку з цим був розроблений ліофілізований склад, а також спосіб ліофілізації.

Приклад 6 - Ліофілізовані склади

Для способу сублімаційного сушіння від 5-5,5 мл бажаної прототипної ЕО5 з діапазоном концентрацій лідерного антитіла 20-38 мг/мл розподіляли в 15 мл флакони (див. для прикладу таблицю 13 та таблицю 14).

Спосіб сублімаційного сушіння здійснювали в попередньо концентрованому розчині при 20- 38 мг/мл у практично кінцевому складі в кількості 5-5,5 мл, розподіленому в 15 мл флакони.

Використовували три різні типи ліофілізованих систем від О5ійтоїа: РІ 45 (аналіз Мо 14), БМН- 300 (аналіз Мо 17) і «МН-90 (аналіз Мо 16, 18, 20). Деталі циклів ліофілізації див. в таблиці 22.

Нахил кривої зміни температури між стадіями ліофілізації становив 1 "С/хв.

Таблиця 22 цикли ліофілізації, використані для кожного аналізу

Мо | Температура |) Тривалість |Температура! Тривалість |Температура!| Тривалість Час аналі-Ізаморожування при первинного стадії вторинного стадії утриман- зу Тзаморожування | Ї заморожування сушіння первинного сушіння вторинного! ня при сушіння? сушіння 20?С5

Таблиця 22 цикли ліофілізації, використані для кожного аналізу

Мо | Температура |) Тривалість |Температура! Тривалість |Температура!| Тривалість Час аналі-Ізаморожування при первинного стадії вторинного стадії утриман- зу Тзаморожування | Ї заморожування сушіння первинного сушіння вторинного! ня при сушіння? сушіння 20?С5 а Установлена під час експерименту відповідно до виміру температури продукту р. Цикл закінчувався тільки під час стандартних годин часу роботи

Отриману висушену речовину потім розбавляли при цільовій концентрації 100 мг/мл шляхом додавання відповідної кількості М/РІ (від 1,0 до 1,6 мл).

Для аналізів з ліофілізацією Мо Р16-20 1 мл розчинів ЕО5 заморожували при -20 "С, один раз розморожували при кімнатній температурі, а потім аналізували.

Також проводили тестування із заморожуванням і розморожуванням проміжної О5 (кінець стадії НАР - ВО) (аналіз Мо 9). Для даного аналізу 20 мл О5 в 50 мл пляшках МаІдепе з НОРЕ заморожували і при -20 "С, і при -70 "С, розморожували при кімнатній температурі один раз, а потім аналізували.

Застосовували наступні аналітичні методи: е візуальний огляд зовнішнього вигляду (прозорість та колір); е поглинання світла (НІАС) для кількісної оцінки не видимих неозброєним оком частинок; е ЗЕС для визначення чистоти білка; е 505-РАСЕ для визначення чистоти білка; е ІЕЕ для визначення неоднорідності заряду; е ЕСМ для кількісної оцінки не видимих неозброєним оком частинок; е ПІ 5 для визначення агрегації; е ЮО5С для визначення температури денатурації; е 5І 5 для визначення колоїдної стабільності; е ЕТ-ІВ-спектроскопія для визначення вторинної структури; е флуоресцентна спектроскопія для визначення третинної структури; е титрування за Карлом Фішером для визначення відсоткової частки залишкової води (для ліофілізату); е ХЕРО для визначення кристалічної/некристалічної матриці осаду (для ліофілізату).

Основними критеріями для вибору складів і способу ліофілізації були наступні.

Відслідковували наступні параметри: е стабільність лідерного антитіла під час здійснення способу ліофілізації; е стабільність розведеного розчину; е стабільність ЕО5 (розчину перед ліофілізацією); е гладкість осаду; е час розведення; е стабільність осаду.

Цикл сублімаційного сушіння вибирали, щоб уникнути колапсу осаду (див. таблицю 22): є температуру заморожування встановлювали нижче температури повного отвердіння, тобто трохи нижче температури склування (Т9"), яку вимірювали за допомогою О5С для кожної кандидатної ЕО5 (розчину перед ліофілізацією) (див. фігуру 17). є Температуру первинного сушіння встановлювали таким чином, що температура зразка залишалася нижче температури колапсу, яка близька То" (див. фігуру 17).

Усі осади, отримані в ході різних аналізів з ліофілізацією, були гладкими (див. фігуру 18), і час розведення становив у межах п'яти хвилин. Навіть якщо ці параметри були важливими для відстеження під час розробки, вони не були значущими для встановлення відмінностей між складами.

Під час стадії заморожування вибирали швидкість охолодження 1 "С/хв., щоб уникнути значних зрушень концентрації та рН лідерного антитіла. Температуру вторинного сушіння вибирали так (див. таблицю 22), щоб отримати рівень залишкової води в осаді, виміряний за допомогою титрування за Карлом Фішером, нижче 1 95.

Стабілізацію лідерного антитіла оцінювали за допомогою 5ЕС і 5ХО5-РАСЕ відносно чистоти і ОбБІ5 ії ЕСМ відносно утворення частинок. Значущими критеріями для встановлення відмінностей між складами були рівень НМУМ до і після розведення та підрахунок не видимих неозброєним оком частинок після розведення.

Для оцінки впливу способу ліофілізації відображали рівень НМУУ перед ліофілізацією та після розведення для кожного складу, а також збільшення даного рівня в процентних частках щодо рівня перед ліофілізацією (див. фігуру 19 та фігуру 20). Пунктирна лінія на кожній фігурі означає збільшення на 10 95. Кандидатами, що забезпечували гарну стабільність, були наступні: е фосфат з 10 95 цукрози: Мо Р14-2; е фосфат і Тгі5 з 5 95 цукрози «ж З 95 маніту: Мо Р14-3 та Р14-8; е фосфат з З 95 маніту «ж 1 95 гліцину: Мо Р14-6; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози я З 95 маніту: Мо Р20-1 е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози я З 95 аспартату: Мо Р20-2; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «т З 95 проліну: Мо Р20-3; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «х- З 95 гліцину: Мо Р20-4.

Слід зазначити, що без будь-яких наповнювачів (Ме Р14-1) лідерне антитіло було досить нестабільним при здійсненні способу ліофілізації, оскільки, як спостерігалося, кількість НМУМ до ліофілізації збільшувалася на приблизно 13095 після ліофілізації. Такий результат був очікуваний, оскільки при циклі заморожування-розморожування, виконаному для О5 при -20 "С і -70 "С (аналіз Мо 9), спостерігалася сильна дестабілізація лідерного антитіла (див. фігуру 21) - заморожування було першою стадією способу ліофілізації.

У відношенні не видимих неозброєним оком частинок порівняння за допомогою ЕСМ розведених розчинів показало кращу стабільність у наступних кандидатів: е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «т З 95 проліну: Мо Р20-3; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «х- З 95 гліцину: Мо Р20-4.

Примітка: не визначене для аналізу Мо 14.

Щоб стабілізувати лідерне антитіло після розведення осаду, використовували наповнювачі, які, як було раніше виявлено, сповільнюють агрегацію (див. розділ, що стосується підбирання наповнювачів для рідкого складу). Стабілізацію лідерного антитіла після розведення оцінювали за допомогою 5ЕС відносно чистоти і 05 ії ЕСМ відносно утворення частинок. Значущими критеріями для встановлення відмінностей між складами були наступні: е рівень НМУУ через 24 год. після розведення (зберігання при 5 С);

Зо е кількість частинок після механічного впливу.

Відносно утворення НММУ через 24 год. після розведення (зберігання при 5 "С) кандидатами, що забезпечували найкращу стабільність, були наступні (див. фігуру 22 та фігуру 23): е фосфат з З 95 маніту «ж 1 95 гліцину: Мо Р14-6; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «т З 95 проліну: Мо Р20-3; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «т З 9о гліцину: Мо Р20-4; за якими ішли наступні: е фосфат з 10 95 цукрози: Мо Р14-2; е фосфат і Тгіз з 5 9о цукрози «- З 9о маніту: Мо Р14-3, Р14-7 та Р14-8; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози я З 95 маніту: Мо Р20-1.

Щоб оцінити стабільність ліофілізату, розведення виконували безпосередньо після виготовлення та протягом від одного місяця (аналізи Мо 16-20) до двох місяців (аналізи Мо 18- 20) після нього. Кандидатні ліофілізати зберігали при 5 "С (аналіз Мо 16-20) і 20 "С (аналіз Мо 17). Стабільність осаду оцінювали за допомогою ЗЕС відносно чистоти, за допомогою ЕСМ відносно утворення частинок і за допомогою ХЕРО відносно структури осаду.

Відносно утворення НММУ і видимих/не видимих неозброєним оком частинок усі склади, як було виявлено, були стабільними при зберіганні при 5 "С (див. фігуру 24 та фігуру 25).

Невелике збільшення рівня НММУ, що спостерігалося як в аналізах Мо 17, так і 20 через один місяць при 5 "С, не повторювалося в наступних аналізах (не показане). Крім того, невелике збільшення рівня НМУУ спостерігалося при зберіганні при 20 "С (див. фігуру 24).

Стабільність ЕО5, яка є важливим параметром для забезпечення якісного ОР, враховували в аналізах Мо 16-18 і 20. Стабілізацію лідерного антитіла на цій стадії способу оцінювали за допомогою ЗЕС відносно чистоти і БІ 5 і ЕСМ відносно утворення частинок. Зберігання при 5 "С, як було виявлено, було значущим для відстеження ефекту добавок відносно стабільності лідерного антитіла. Один цикл заморожування-розморожування, виконаний для РОБ, також був значущим для встановлення відмінностей між складами.

Відносно стабільності лідерного антитіла при зберіганні при 5 "С результати були описані в розділі, що стосується добавок (див. фігуру 14). Найкраща стабільність була отримана в наступних: е Тгіз/фосфат з 1,75 95 цукрози «ж 1,05 95 проліну: Мо Р2О-3-ЕО5; бо е Тгіз/фосфат з 1,75 95 цукрози «ж 1,05 95 гліцину: Мо Р2О-4А-БО5;

за якими ішли наступні: е Тгіз/фосфат з 1,75 95 цукрози «- 1,05 95 маніту: Мо Р2О-1-ЕО5.

Відносно стабільності лідерного антитіла після одного циклу заморожування- розморожування підрахунок частинок, виконаний за допомогою ЕСМ, показав, що стабільними були наступні кандидатні склади: е Тгіз/фосфат з 1,67 95 цукрози «- 1 95 маніту: Мо Р17-2-ЕО5; е Тгіз/фосфат з 1,75 95 цукрози я 1,05 95 маніту: Мо Р2О-1-ЕО5; е Тгіз/фосфат з 1,75 95 цукрози «ж 1,05 95 проліну: Мо Р2О-3-ЕО5.

На завершення, з урахуванням наступних критеріїв: стабільності лідерного антитіла під час здійснення способу, виду і стабільності осаду, а також часу розведення, стабільності розведеного розчину та ЕО5, явно виділялися 2 кандидатні склади: е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози -«- З 95 маніту; е Тгіз/фосфат з 5 95 цукрози «- З 95 проліну.

Висновки з прикладів 2-6

Під час робіт з отримання складів-кандидатів утворення видимих/не видимих неозброєним оком частинок регулювали за допомогою вибору діапазону рН (2 7,0), буферної системи (Ттів/фосфат) і, особливо, додавання поверхнево-активної речовини, полісорбату 80, у концентрації 0,2 9о.

Однак утворення НМУМ все ще являло собою проблему для рідкого складу. Хоча утворення

НММУ було значно зменшене за допомогою вибору оптимального рН (7,0) і деяких наповнювачів (а саме цукрози, маніту та амінокислот, таких як гліцин і пролін), сприятливий ефект при 100 мг/мл не запобігав у достатній мірі утворенню НМУМ так, щоб можна було очікувати задовільного строку зберігання рідкого складу.

У зв'язку з цим розробляли ліофілізований склад, а також спосіб ліофілізації. Щоб запобігти агрегаціям під час здійснення способу ліофілізації, вибирали кріопротектор: цукрозу при концентрації 5 95. Стабілізуючі наповнювачі, обрані для рідкого складу, тестували за допомогою способу ліофілізації на предмет кращої стабілізації як рідини перед ліофілізацією (концентрація: мг/мл), так і розведеного розчину (концентрація: 100 мг/мл). Декілька з цих наповнювачів підходили для способу ліофілізації, і з них вибирали два: маніт і пролін при концентрації З 95.

Зо Основними критеріями для вибору були наступні: гладкість і стабільність осаду, а також стабільність ЕО5 (розчину перед ліофілізацією) і розведеного розчину.

Два склади, наведені в значенні довгострокової стабільності відрізнялися одним наповнювачем (див. таблицю 23): е прототип 1: пролін; 35 е прототип 2: маніт.

Таблиця 23 опис складів оком частинок

Додаткові дослідження складів (приклади 7-8)

У прикладах 7-8 використовуються наступні скорочення: рР: лікарський препарат ре: лікарська речовина

ЕО: розробка складу

ЕО5: складена лікарська речовина

РІМ: перше дослідження в людини

СКАбБ: загальновизнаний безпечним

НОРЕ: поліетилен високої щільності

НММУ: високомолекулярна сполука

ІЕЕ: ізоелектричне фокусування

І: інтерлейкін

ІГММУ: низькомолекулярна сполука

РС: полікарбонат

РЕ5: поліетерсульфон

РР: поліпропілен

РМОЕК: полівінілідендифторид

КТ: кімнатна температура

ЗС: підшкірний

Тат: перша температура денатурації

ТОК: розрив холодового ланцюга

Короткий опис

Метою даних досліджень (приклади 7-8) було покращити стабільність ЕО5 відносно сильної схильності до утворення НММУ у лідерного антитіла в рідкому стані.

План дослідження був визначений на підставі більш ранніх даних, отриманих у дослідженнях складів-кандидатів (приклади 2-6), і він сфокусований на кінетичних показниках утворення НММУУ при кімнатній температурі в ОЗ при 35 мг/мл.

Всі використані буфери та наповнювачі вже використовувалися або в представлених на ринку продуктах на основі антитіл, або в інших продуктах для парентерального використання, зокрема, вони всі є ОКА5З (загальновизнаними безпечними). рН варіював у діапазоні від 6,2 до 7 А.

У цілому 50 різних сполук порівнювали нарівні зі складом, описаним у таблиці 23. Основні висновки були наступними: е значення рН приблизно 6,2 знижують розчинність лідерного антитіла: спостерігалось утворення гелю та осадження для сукцинатного та гістидинового буферів, відповідно; е крім того, слід уникати використання гістидинового буфера при рн 6,6, оскільки розчин опалесціював і був трохи менш термостабільним; е у діапазоні рН від 6,6 до 7,4 був відсутній явний ефект рН відносно кінетичних показників утворення НМУУ;

Зо е збільшення іонної сили спричиняло дестабілізуючий ефект відносно кінетичних показників утворення НМУУ; е фосфатний і цитратний були найкращими буферами з тестованих за умови, що вони були присутні в низькій концентрації, такій як 1,75 мМ; е 3 усіх протестованих наповнювачів найкращий стабілізуючий ефект був отриманий для гліцину при 10 ї 72 мМ ії 2,4 95 цукрози. Однак стабілізуючий ефект не дозволив значно сповільнити утворення НМУУ.

На завершення, результати з прикладів 7-8 не дозволили виявити нову комбінацію наповнювачів, яка могла б значно покращити склади, описані в таблиці 23, відносно утворення

НММУ. Рекомендувалося залишити наступний склад (див. таблицю 24): фосфат, 6,5 мМЛТі5, 3,7

ММ, рн, 7,0, РБЗВО, 0,2 95 (вага/об'єм), цукроза, 5 95 (вага/об'єм), пролін, З 95 (вага/об'єм).

Таблиця 24 опис складу

Введення

Лідерне антитіло являє собою сконструйоване гуманізоване біспецифічне антитіло (В5АБ), націлене на цитокіни 1/-4 і П/-13. Його молекулярна вага, визначена за допомогою мас- спектрометрії, становить 198 кДа, а його Ір, визначена за допомогою ІЕЕ, знаходиться в діапазоні від 5,8 до 6,2.

Основні зміни способу виготовлення О5 реалізували у фазі ІБ, а дослідження порівнянності заплановане між фазою ІЛіа ї фазою б вивчення якості О5 і ОР. Як частина змін виготовлення

О5 було вирішено виконати дослідження складу з метою зменшити утворення НМУМ у рідкому стані. Таким чином, потенційне покращення складу можна включити в дослідження порівнянності.

Слід зазначити, що в той самий час спосіб виготовлення ОР для фази Ір оптимізували відносно збільшення масштабу, розморожування РОЗ і зміни дози ЮОР/флакон: 100 мг// мл флакон замість 150 мг/15 мл флакон. Дане дослідження проводили паралельно з розробкою складу.

Профіль продукту, що є в цей час цільовим, для даного дослідження (приклади 7-8) обумовлює наступні характеристики лікарського препарату: е шлях введення: С ін'єкція. е форма ОР: ліофілізована; е концентрація: розчин розведений при 100 мг/мл; е строк зберігання: 24 місяці; е температура зберігання: 2 "0-8 С; е дозування: 100 мг/флакон; е первинна ємність: 7 мл трубчастий флакон 1 типу з прозорого скла.

Лікарська речовина повинна бути складена при 35 мг/мл перед зберіганням при -20"Сві1 л полікарбонатних пляшках. Ніякі додаткові наповнювачі або розведення не застосовували до сублімаційного сушіння.

Дослідження складів-кандидатів і дослідження складів для РІМ дозволили зробити наступні висновки. е Слід уникати кислотного рН«х 6,0 (низька термостабільність і колоїдна стабільність) і основного рН» 7,5 (утворення І ММУ і зміна заряду ізоформ при термічному впливі). е Кількість видимих/не видимих неозброєним оком частинок була значно зменшена за допомогою застосування полісорбату 80 при концентрації 0,2 95 у комбінації з буферною системою фосфат/Тгі5, рН 7,0. е Кінетичні показники утворення НМУМУ збільшувалися разом зі збільшенням концентрації лідерного антитіла, і протестовані склади не запобігали в достатній мірі утворенню НМУ при 100 мг/мл так, щоб можна було очікувати задовільного строку зберігання рідкого складу.

Зо е Утворення НМУМ у рідкому стані направило розробку убік ліофілізованого ЮР, що розбавляється до трохи менше, ніж 1/3 від початкового об'єму (до ліофілізації) з отриманням 100 мг/мл з 35 мг/мл БО5. Вибирали наступні кріопротектор та ліопротектор: цукрозу при концентрації 5 95. е Склад, вибраний для фази І і МПа, був наступним: фосфат, 6,5 мМЛтів5, 3,7 мМ, рн, 7,0,

РБВО, 0,2 95 (вага/об'єм), цукроза, 5 95 (вага/об'єм), пролін, З 95 (вага/об'єм). е Цей склад може бути оптимізований відносно утворення НМУМ шляхом комбінування наповнювачів, які як було виявлено, спричиняють невеликий позитивний ефект, а саме цукрози, маніта та амінокислот, таких як гліцин і пролін.

Утворення НМУМ у рідкому стані, як було виявлено, є основним шляхом розпаду. Кінетичні показники збільшувалися разом зі збільшенням температури розчину (в 10 раз повільніше при 5 "С, ніж при КТ в ОР) і разом зі збільшенням концентрації лідерного антитіла: ее ГО5 при 35 мг/мл при КТ: ДНМУУ- «1,6 95 за 7 год. та 4,1 95 за 24 год. е ОР при 100 мг/мл при КТ: ДНМУУ- «0,6 95 за 1 год. та 3,5 95 за 5 год.

Цілі

Метою даного дослідження (приклади 7-8) було збільшити стабільність лідерного антитіла в рідкому стані відносно утворення НМУУ. Для того, щоб поставити кількісні цілі для даного дослідження, були запропоновані наступні значення: е 5 год. при КТ після розведення ОР для визначення стабільності при застосуванні: ДНМУУ« -1 95 за 5 год., е 12 год. ТОК для РОБ для того, щоб полегшити виготовлення ОР: ДНМУУ« «т-1 95 за 12 год.

Ці цільові значення враховують умови застосування розведеного ОР при 100 мг/мл і умови способу виготовлення, коли РОЗ при 35 мг/мл знаходиться поза умовами низьких температур.

Ці значення необхідно коректувати залежно від цільового профілю якості препарату.

План дослідження

Запропонованим підходом для даного дослідження (приклади 7-8) було провести підбирання комбінованих наповнювачів з широким колом складів при концентраціях лідерного антитіла 35 мг/мл.

Підбирання складів було зосереджено на стабілізуючих наповнювачах, які потенційно могли впливати на утворення НММУМ. Для даного дослідження було вирішено наступне. бо е При підбиранні РБЗ8О і цукрозу залишали в концентраціях, використаних у фазі І складання, оскільки не було продемонстровано будь-якого негативного впливу відносно утворення НМУМУ при цих концентраціях, і спостерігався сильний позитивний вплив відносно способу виготовлення та/або розведення. е Діапазон рН звузили до діапазону від 6,2 до 7,4, оскільки в попередніх дослідженнях була показана перевага підтримки рН на значенні приблизно рн 7. ее Перевіряли 5 буферів для ін'єкцій у даному діапазоні рН, окремо або в комбінації з декількома наповнювачами: іншими буферними системами та/або добавками (амінокислотами, сахарозою (крім тих, які вже містилися в складі фази І) і головним чином солями).

Лікарська речовина ре, використовувані в даному дослідженні (приклади 7-8), описано в таблиці 25.

Таблиця 25 опис О5 партії, Мо вигот. | влювач трація ня використовували

Іт- ЕеОо5 фосфат, 2,22 мМЛТтів, | 33 мг/мл |-20"7С НОод-150-190 10006-05 1,28 мМ, цукроза, 1,75 95, пролін, 1,05 95,

РБВО, 0,07 90

МАВ- ро цукроза, 2,1 95 42 мг/мл |-207С нОод-193

УКВ1- 000079

Лікарський препарат

РР, використовувані в даному дослідженні (приклади 7-8), були складені зі складом фази

Іа (фосфат, 6,5 мМЛТів, 3,7 мМ, рн, 7,0, РБЗ8О, 0,2 95, цукроза, 5 95, пролін, З 95) (див. таблицю 26).

Таблиця 26 опис ОР

Мо В ліофілізату |Дата вигот. иготов- Концентрація/рорма З ГО Мо

ОР лювач нНод-016 1150 мг/15 мг флакон ІСЕКОЗ315 и СЕКОЗ375 нод-046 1150 мг/15 мг флакон ІСЕКО378, СЕКО382 та СЕБО392 сСт016207.Ї1001150 мг/15 мг флакон |ІСМР2

НОд-193 0100 мг/7 мл флакон |НО4-193

Склад(и) компонентів

Склади компонентів для кожного аналізу з прикладів 7-8 наведені нижче в таблиці 27.

Таблиця 27 склад компонентів . Номінальна

Мо аналізу . - . й скла Буферна система| рн Номінальний склад наповнювачіва концентрація

ДУ (мг/мл)

НО4-150 АТ | Сукцинат, 10 мМ Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НО4-150 Аг. | Сукцинат, 10 мМ Тгів, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НОод-150 дз | СУкцинат, 10 мМ Гістидин, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25

НО4-150 А4 | Сукцинат, 10 мм Пролін, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РБ8О, 62 36,25 0,07 95

Таблиця 27 склад компонентів . Номінальна

Мо аналізу . - . й

Буферна система| рн Номінальний склад наповнювачіва концентрація складу (мг/мл)

НОд-150 дБ | СУукцинат, 10 мМ Гліцин, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25

НО4-150 А6 | Сукцинат, 10 мМ Тгів, 10 мМ -- гліцин, 10 мМ - цукроза, 36,25 1,75 95 - РОВО, 0,07 95

Попереднє тестування | Гістидин 10, мМ 6,2 | Цукроза, 1,75 95 - РУО8О, 0,07 95 36,25 р-НОд-144

Попереднє й Й бу. тестування | Гістидин 10, мМ б2 одно 10 мМ - цукроза, 1,75 35 - РБВО, 36,25 р-НО4-148 м

НО4-150 81 | Гістидин 10, мМ | 6,6 | Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НО4-150 82. | Гістидин 10, мМ Ка Тгів, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НО4-150 83 | Гістидин 10, мМ Ка Пролін, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 96

НО4-150 84. | Гістидин 10, мМ Ка Гліцин, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 96

НОогА150С 1-01 6,8. | Цукроза, 2,1 95 - РУОВО, 0,07 95 36,25

НО4-1500 | Фосфат, 3,33 Цукроза, 8,42 95 - РУВО, 0,07 925 36,25

ММ гів, 1,92 ММ

НО4-163 АТ |Цитрат,1О мМ | 6,6 | Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НО4-163 Аг. | Цитрат, 10 мМ Ка Тгів, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НО4-163 АЗ | Цитрат, 10 мМ Ка Гістидин, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НО4-163 А4./ | Цитрат, 10 мМ Щ Пролін, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НО4-163 АБ | Цитрат, 10 мМ Ка Гліцин, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 96

НО4-163 Аб | Цитрат, 10 мм Тгі5, 10 мМ- гліцин, 10 мМ - цукроза, 36,25 1,75 95 - РОВО, 0,07 95

НО4-163 ВІ |Фосфат,1О мМ | 6,6 | Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НО4-163 В2. / | Фосфат, 10 мМ Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НО4-163 ВЗ | Фосфат, 10 мМ Тгів, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НО4-163 В4 | Фосфат, 10 мМ Гістидин, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 95

НО4-163 В5 | Фосфат, 10 мМ Пролін, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 96

НО4-163 86. | Фосфат, 10 мМ Гліцин, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25 0,07 96

НО4-172 АТ | Тгів, 10 мМ Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НО4-172 Аг. | Ттів, 10 мМ Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

І . Кк Сукцинат, 10 мм, Масі, 7,5 мМ - цукроза, 36,25

НОд-172 АЗ | Ттів, 10 ММ 7,4 17595 - РВО, 0,07 95

Нод-172 дя. | ттів, 10 ММ Гістидин, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РБОВО, 36,25

НОд-172 АБ. | ттів, 10 ММ Гістидин, 10 мм - цукроза, 1,75 95 - РБОВО, 36,25

НОд-172 Ав. | ттів, 10 ММ Гліцин, 10 мМ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25

НО4-172 ВІ | Фосфат, 1,75 мМ Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

Таблиця 27 склад компонентів . Номінальна

Мо аналізу . - . й

Буферна система| рн Номінальний склад наповнювачіва концентрація складу (мг/мл)

НО4-172 В2. | Фосфат, 1,75 мМ Цукроза, 4 95 - РОВО, 0,07 925 36,25

НО4-185АТ |- 00000001 6,8. | Цукроза, 4,15 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

НОд-185 дО вв Гліцин, 72 ММ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25

НО4-18581 | Фосфат, 1,75 мМ КІ одно 72 мМ 7 цукроза, 1,75 365 - РБВО, 36,75

НО4-185 82 | Фосфат, 1,75мМ | 6,8 | Цукроза, 4,15 95 - РУВО, 0,07 95 36,25

Й Бензоат натрію, 37,8 мМ - цукроза, 36,25

НО4-185 83 | Фосфат, 1,75 мМ КК 1,75 95 - РУВО, 0,07 95

Ног-18584. | Фосфат, 1,75 ММ КК масі, 38, ММ - цукроза, 1,75 925 - РОВО, 36,25

НО4-185 85 | Фосфат, 5,25 мМ КК одно 72 мМ 7 цукроза, 1,75 365 - РБВО, 36,75

НО4-185 21 | Цитрат, 5,25 мМ КК одно 72 мМ 7 цукроза, 1,75 365 - РБВО, 36,75

НО4-185 02. | Цитрат, 1,75 мМ КК одно 72 мМ 7 цукроза, 1,75 365 - РБВО, 36,75

НО4-185 23 | Цитрат, 1,75 мМ | 6,8 | Цукроза, 4,15 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

Ног-185с4. | Цитрат, 10 ММ КК Гліцин, 72 ММ - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25

НОг-1850 Фосфат, 2,22 Пролін, 91 мМ - цукроза, 1,75 95 - РБ8О, 36,25

ММ Ті, 1,28 мМ 0,07 95

Й Фосфат, 2,22 Пролін, 91 мМ - цукроза, 1,75 95 - РБ8О, 36,25

НОЯ ВИ АТ мМмлтів, овмМм | 97 | 0,07 95

Й Фосфат, 2,22 Пролін, 91 мМ - цукроза, 1,75 95 - РБ8О, 36,25

Нова ММ/ттів, 128 ММ вв 0,07 96

Й Фосфат, 2,22 Пролін, 91 мМ - цукроза, 1,75 95 - РБ8О, 36,25

Ноя ВИ АВ мМмлтів, овмМм | 79 10,07 95

Фосфат, 2,22 72 Пролін, 91 мм - цукроза, 1,75 95 - РОВО, 36,25

НОВИХ мМмлтів, овмМм | 72 0,07 95 ноглеоАї | -- | 6,8 |Цукроза, 20,595- РБВО, 0,07 96

Ноя А2 |. 00001017 -Ї1 6,8 | Цукроза, 13,42 95 - РОВО, 0,07 95 36,25

Ноя А2 | 00070101017-Ї 6,8 | Цукроза, 1,75 95 - РОВО, 0,07 95 36,25 а Кількість наповнювачів виражена в 95 вага/об'єм

Спосіб виготовлення

Склади з прикладів 7-8 виготовляли з використанням концентрованого розчину лідерного антитіла, який був отриманий за допомогою ШОР/ОЕ, при концентрації 42 мг/мл в 2,1 95 цукрози.

Цей розчин лідерного антитіла розводили концентрованими маточними розчинами наповнювачів.

Спосіб ОСЕ/ЛЕ

Протягом здійснення способу ОЕ/ЮР (приклади 7-8) вихідний розчин білка при 35 мг/мл спочатку концентрували до 40 мг/мл, потім заміняли буфер. Після діафільтрації розчин білка концентрували до концентрації вище 42 мг/мл, що було цільовою кінцевою концентрацією (див. таблицю 28).

Використаний матеріал та умови здійснення способу для кожного випадку ШЕ/ЮОРЕ описано в таблиці 28. Наприкінці ШЕ/ОЕ концентрацію лідерного антитіла коректували до 42 мг/мл в 2,1 95 розчині цукрози.

Таблиця 28 параметри ОР/ОЕ при виготовленні . є. Концентрація

Мо Співвідношення: концентрація Кількість . білка й , : 2 ілка під час об'ємів, що Заміна о. аналізів | Мембрана г білка/м вд т. . б наприкінці складу мембра-ни (г/м) діафільтрації . пройшли уфера ОБЛ (мг/мл) діафільтрацію (мг/мл)

Рейсоп ЗФ, Цукроза, весен, тв | 5 1 з Ше. в

Коректування складу

Розчин лідерного антитіла після ОР/ОЕ (приклади 7-8) розводили відповідними кількостями концентрованих маточних розчинів до отримання бажаного кінцевого складу. Довідковий опис і склад концентрованих розчинів, виготовлених для даного дослідження, наведено в таблиці 29.

Таблиця 29 рецептура концентрованих маточних розчинів складу наповнювачіва он

ОР-НОЇ-138 |Сукцинат.ббмМ 17777771 -11111111111Ї111111159СсС1С

ОР-НОЇ-144 |Гістидинббо, мМ 17777771 -11111111111Ї111111116бСсС1С

ОР-НОЇ-145 |Гістидинббо, мМ 17777771 11111111 Ї1111111166сСсСщСС

ОР-НОЇ-149 )|ГістидинбО, мМ (ГліцинбомМ 77 | 77777717 66СсСщС у

ОР-НОД-Т5І |Цитра,ббмМ 17777771 11111111 Ї111111164сСс1С

ОР-НОЇ-153 |Цитрат,бО мМ 000 /Гістидинбо, мМ | 777777 66 СсСщС у

ОР-НОЇ-157 |Фосфат,вО мМ -:/ | 77777777777сс-11111111111171Ї1111117164сСс1С

ОР-НОЇ-158 |Фосфат,вбО мМ 17777711 -111111111Ї11111171

ОР-НОЇ-159 |Фосфат,бО мМ /Ті5.ббмММ 777777 | 777777777169сСс21С у

ОР-НОЇ-162 |Фосфат,бО мМ (Гліцин бомМ 77777 Ї777777171717168 СС оР-НОЇ-164 |Тів,бОмММ 77/11 -111111111111Ї1111111117331 оР-НОД-Т6Б |Тів,бОмММ 77/11 -111111111Ї111111117и

ОР-НОЇ-170 |Фосфат, 10б5мММ 17777771 -1111111111Ї11111111721

Р-НОД-173 | рю - 11111111 1 Цукроза,ї4495 //////////// Коректування відсутнє оР-НО6-174 | .ЙЮюЮюЮюЙКро- 1111111 |Гліцян432мМ ///////////// Коректування відсутнє

Таблиця 29 рецептура концентрованих маточних розчинів

Мо аналізу Буферна система Номінальний склад Скоректоване значення складу наповнювачіва он

Р-НО4-175 | Фосфат, 10,5 мМ Гліцин, 432 ММ 68

Р-НО4-176 | Фосфат, 10,5 мМ Цукроза, 14,4 95 68

Р-НО4-177 | Фосфат, 10,5 мМ Бензоат натрію, 227 мМ 68

Р-НО4-178 | Фосфат, 10,5 мМ масі, 231 мм 68

Р-НО4-179 | Фосфат, 31,5 мМ Гліцин, 432 ММ 68

Р-НО4-180 | Цитрат, 31,5 мМ Гліцин, 432 ММ 68

Р-НО4-181 | Цитрат, 10,5 мМ Гліцин, 432 мМ 68 р-нод-182 | Цитрат, 10,5 мм Цукроза, 14,4 95 77июЙЮБи.68 2 щ ЗК«Є

Р-НО4-183 | Цитрат, 60 мМ Гліцин, 432 ММ 68

Р-НО4-184 | Фос, 13,3 мМЛТтіз 7,7 ММ | Пролін, 547 мМ

Р-НО4-186 | Фос, 13,3 мМЛ"і5 7,7 ММ | Пролін, 547 ММ

Р-НОЇА18941|Ї0000000000000-000000000 | Цукроза, 37,5 95 Коректування відсутнє рР-НОА1892|- | Цукроза, 7095 Коректування відсутнє а Кількість наповнювачів, виражена у 95, наведена як співвідношення вага/об'єм.

Кожний склад стерилізували шляхом фільтрації (Міех?б (М) у ламінарному потоці та фракцію розподіляли в 2 мл скляні флакони 1 типу відповідним чином (1-2 мл) і закупорювали для кожного моменту часу дослідження стабільності.

Умови впливу

Термічний вплив

Умови термічного впливу, виконаного в прикладах 7-8, відповідно до аналізів складів зазначено в таблиці 30.

Таблиця 30 умови термічного впливу те Дні: 1,2і3 та Дні: 1,2і3 та Дні: 1,2,31і6 та Дні: 1,2і3

Нод-187 16 год., 24 год. і 40 год. нНод-190 16 год., 40 год. і 48 год.

Й 5"Се 21 год., 30 год. і 46 год. а У зв'язку з кондиціюванням повітря в лабораторії КТ варіювала від 21 "С до 29 "с.

Ю Виконували в стандартній не відповідній (ЗМР камері при низьких температурах. с Відповідна СМР камера з автоматичним регулюванням температури.

Опис аналітичних методів

У прикладах 7-8 застосовували наступні аналітичні методи: е візуальний огляд зовнішнього вигляду (прозорість та колір); - розчин в 7 мл флаконах оглядали при природному освітленні; е НРІ С-5ЕС для визначення чистоти білка - 2 колонки РКОБЕС 3005-2500 х 4,6 мМ при 35 С; - рухлива фаза: фосфат, 0,1 М/Ммасі, 0,2 М, рН 7,0;

- виявлення: 280 нм; - введення: 10 мкл (концентрація 5 мг/мл); - потік: 0,2 мл/хв.; - загальний час проганяння: 40 хв.

Застосовували наступний аналітичний метод: ее ОРІ С-5ЕС для визначення чистоти білка - колонка: 1 Асдийу ВЕН2ОО 5ЕС (150 х 4,6 мМ, ар-1,7 мкм) при 40 "С; - рухлива фаза: МагНРО», 50 мМ/Масіо», 300 мМ при рн 7,0; - виявлення: ОМ при 280 нм; - введення: 1 мкл (розчин при 5 мг/мл), стандарт 3014ЕТ; - введення: 2 мкл (розчини при 2,0 мг/мл); - потік: 0,3 мл/хв.; - загальний час проганяння: 8 хв.

Здійснювали відстеження за наступним аналітичним методом: е ЮО5С для визначення температури денатурації: - диференціальну сканувальну калориметрію (0502) використовували для оцінки термостабільності антитіла в різних складах. - Калориметричні виміри виконували за допомогою МР-Сарійагу О5С від 25 "С до 100 "С зі швидкістю нагрівання 1 "С/хв. - Крива місткості забезпечувала інформацію про температуру денатурації Та (С) (максимум піка).

Критерії оцінки ее ЗЕС: результати вважали порівнянними, якщо відмінність була рівною або меншою 0,5 95 значення НММУ. ее 050: результати вважали порівнянними, якщо відмінність за Та1 була рівною або меншою 0,476.

Спосіб ОРІ С у порівнянні з НРІ С

Перше підбирання (аналізи Мо НО4-150-172) виконували за допомогою способу НРІС, розробленого для фази І. Проблема відносно зсуву базової лінії, який впливав на визначення

Зо рівня НММУ, виникала, коли підряд аналізували велику кількість зразків.

Для другого підбирання (аналізи Мо НО4-185-190) для того, щоб одержати точні дані динаміки рівня НММУ, застосовували спосіб ОРІ С, при якому не спостерігалося будь-якого зсуву базової лінії. Той самий хроматографічний профіль стандарту спостерігався навіть після введення більше 200 зразків в ту саму колонку.

Еталонні склади для ЗЕС-вимірів

Для того, щоб порівняти різні серії відносно динаміки рівня НМУМ протягом часу, склад фази

Ї використовували як еталонний. є Для першого підбирання (аналізи Мо НО4-150-172) для кожної з З серій одержували ЕО5 фази І шляхом розведення за допомогою М/РІ при 35 мг/мл ліофілізату ОР Мо НО4-016. ее Для другого підбирання (аналізи Мо НО4-185-190) для кожної з З серій крім раніше зазначеної РОЗ фази І (НО4-016) використовували іншу свіжовиготовлену ОЗ фази І нарівні зі складами, що тестують. Також використовували 32 еталонну ЕО5 фази І (Мо І Т-10006-05): ЕО5, що не піддавалася сублімаційному сушінню, а тільки розморожена.

Несподівано виявилося, що кінетичні показники, що стосуються НММУ, відрізняються в різних еталонних складах. Для порівняння, два додаткових ліофілізата ОР тестували поряд з ліофілізатом ОР Ме НО4-016. Відмінність між ліофілізатами ОР стала істотною через 40 год. при

КТ. Однак розморожений еталонний склад Мо ІТ-10006-05 значно відрізнявся від усіх ліофілізатів ОР, починаючи 316 год. при КТ. В ліофілізата ОР спостерігалися більш високі кінетичні показники, що стосуються НММУ, ніж в розмороженого еталонного складу Мо І Т-10006-

О5, і, отже, його не можна використовувати для порівняння складів, виготовлених у даному дослідженні (склади для даного дослідження виготовляли на основі розмороженої РОБ (див. розділ, що стосується способу виготовлення), зі складом фази ІЛіа.

При використанні однієї й тієї ж партії та свіжоотриманого ОР, що піддавали сублімаційному сушінню, не спостерігалося значної відмінності за кінетичними показниками, що стосуються

НММУ, між розмороженою РОЗ та ліофілізатом ЮР. Таким чином, кінетичні показники, які стосуються НМУМ, що спостерігалися у свіжовиготовлених для даного дослідження складів, будуть також спостерігатися в тих же складів після сублімаційного сушіння.

Висновок, зроблений на підставі цих аналізів, не можна поширити на всі ліофілізати ОР і всі розморожені РО5. Порівняння кінетичних показників, що стосуються НММУ, між різними партіями бо може залежати від різних параметрів і буде вимагати спеціального та окремого дослідження.

Результати та обговорення

Усі склади, виготовлені в прикладах 7-8, містили щонайменше 1,75 95 (вага/об'єм) цукрози та близько 0,07 95 (вага/об'єм) РБ8О. Ці концентрації є номінальними значеннями та грунтуються на кратності розведення, застосованої до вихідного розчину лідерного антитіла.

Відносно концентрації РО8О було зроблене допущення, що поглинанням РБ8О у ході СЕ/ОЕ можна зневажити. Концентрації цього наповнювача були такі ж, як у складі фази І.

Приклад 7 - Підбирання буфера

У даному прикладі підбирали рН від 6,2 до 7,4 і в межах даного діапазону тестували всі буфери для ін'єкцій: сукцинатний, гістидиновий, цитратний, фосфатний та Ттгів.

А) Тип буфера та рн

У першому підбиранні (аналізи Мо НО4-150-172) зазначені вище буфери тестували при концентрації 10 мМ у комбінації з декількома наповнювачами, які будуть більш докладно описано в прикладі 8 - підбиранні добавок. Слід зазначити, що концентрація буфера була постійною при 10 мМ, і що її вплив відносно утворення НМУМ можна буде побачити в розділі, що стосується концентрації буфера (приклад 7). рас

Результати О5С показали, що всі склади були порівнянними з еталонним (Та1-65,5 "С), крім складів з гістидином, які були трохи менш термостабільними (Та1-64,7 "С-65,1 "С) (див. фігуру 26).

Візуальний огляд у початковий момент часу

Всі склади були прозорими та порівнянними з еталонним, крім складів при рн 6,2 і складів з гістидином при рн 6,6.

При рН 6,2 зниження розчинності спостерігалося в обох буферів, що тестувалися. е Склади з гістидином осаджувалися при КТ (див. фігуру 27). е Склади з сукцинатом трохи опалесціювали при КТ, і можна було спостерігати утворення гелю при 5 "С (див. фігуру 27), цей процес був оборотним, якщо розчин знову нагрівали до КІ і обережно струшували. Сукцинат міг мати хелатуючі властивості.

При рН 6,6 склади з гістидином трохи більше опалесціювали при КТ, ніж еталонний зразок.

Дослідження динаміки рівня НМУУ за допомогою ЗЕС

Оскільки результати, представлені в даному документі, були отримані для З різних серій, динаміку рівня НМУМ не можна порівнювати прямо, а тільки з еталонним складом. е Склад з гістидиновим буфером при рн 6,6 був порівнянним з еталонним складом при КІ і трохи кращим при 5 "С (142,4 95 для гістидину окремо та їт3,2 95 за 144 год. для еталонного складу). е Склад з цитратним буфером при рН 6,6 при КТ був трохи кращим, ніж еталонний склад (44,6 о для цитрату окремо та 5,295 за 24 год. для еталонного зразка), і порівнянним з еталонним складом при 5 "С. е Склад з фосфатним буфером при рН 6,6 при КТ був трохи кращим, ніж еталонний склад (48,2 ую для фосфату окремо та т9,0 95 за 48 год. для еталонного складу), і порівнянним з еталонним складом при 5 "С. е Склад з фосфатним буфером при рН 7 був порівнянним з еталонним складом при КІ і 5". е Склад з Тгіз-буфером при рН 7 був трохи гіршим, ніж еталонний склад при КТ (7,8 95 для

Тгіз окремо та 7,0 95 за 48 год. для еталонного зразка), і порівнянним з еталонним зразком при 5". е Склад з Тгіз-буфером при рн 7,4 був порівнянним з еталонним складом при КТ і 5 76.

Див. фігуру 28.

Відносно утворення НММУ при рН 6,6 фосфатний і цитратний буфери були порівнянними, а при рН 7,0 фосфатний був трохи більш стабілізуючим, ніж Тгі5. Зазначені вище буфери при 10

ММ вне можна прямо порівнювати зі складом фази ІЛіа, оскільки еталонним складом, використаним для даного підбирання, був ліофілізат, виготовлений з іншої партії (див. наведений вище розділ, що стосується еталонних складів для ЗЕС-вимірів).

Висновок

Відносно підбирання буферної системи при концентрації 10 мМ можна зробити наступні висновки. е Значення рН приблизно 6,2 (близько рі) знижували розчинність лідерного антитіла: - утворення гелю спостерігалося для сукцинатного буфера при рн 6,2.

Осадження спостерігалося для гістидинового буфера при рн 6.2. бо е Крім того, слід уникати використання гістидинового буфера при рн 6,6, оскільки розчин 5О0 опалесціював і був трохи менш термостабільним. е Відсутня явна тенденція ефекту рН у межах діапазону від 6,6 до 7,4 відносно утворення

НМУМ для тестованих буферів: гістидинового, цитратного, фосфатного та Ттгів. е Ефект буфера відносно утворення НМУМ дуже слабкий, хоча цитратний і фосфатний, як виявилося, є найкращими буферами при 10 мм.

В) Точне регулювання рН для складу фази ІЛіа

Для того, щоб визначити в цьому ж дослідженні вплив рН відносно утворення НМУУ, підбирали рн у діапазоні від 6,7 до 7,2 для складу фази І (аналізи Мо НО4-187). рас

Результати О5С показали, що всі склади були порівнянними з еталонним (рН 7,0) (див. фігуру 29).

Дослідження динаміки рівня НМУУ за допомогою ЗЕС

Спостерігалася невелика тенденція до зменшення утворення НМУ при збільшенні рН від 6,7 до 7,2 (див. фігуру 30), однак вона ставала значною тільки через 24 год. при КТ (14,1 95 для рН,?7 і 3,4 95 для рН 7,2).

Висновок

Для буфера фосфат, 2,2 мМЛТтТів, 1,3 мМ (склад фази І) спостерігався невеликий ефект рН у діапазоні від 6,7 до 7,2 через 24 год. при КТ. Однак цей ефект був слабким, оскільки він не був значним протягом перших 16 год. Це підтверджувало слабкий ефект рН відносно утворення

НММУМУ у цьому діапазоні рН.

С) Концентрація буфера

Цитратний і фосфатний буфери тестували при концентраціях менше 10 мМ: 0, 1,75 і 5,25

ММ, для того, щоб вивчити вплив концентрації буфера відносно утворення НММУ/ (аналізи Мо

НОо4-185). Встановлювали проміжне значення рН у тестованому діапазоні: рнН-б6,8. Всі склади містили гліцин при 72 мМ для коректування осмоляльності та, як було сказано на початку розділу, що стосується результатів і обговорення, 1,75 95 цукрози та приблизно 0,07 95 РЗВО. рас

Результати ОС показали, що всі склади були порівнянними з еталонним (складом фази Ї) (див. фігуру 31). Слід зазначити, що склад з гліцином при відсутності буфера (185А2) був трохи

Зо менш стабільним, ніж інші тестовані склади (Та1 відрізнялася приблизно на 1 С).

Дослідження динаміки рівня НМУУ за допомогою ЗЕС

Для обох тестованих буферів спостерігалася невелика тенденція до зменшення утворення

НМУМ при збільшенні концентрацій буферів, при цьому найкращі результати одержували при відсутності буфера та при 1,75 мМ у буфері (наприклад, «7,8 956 для цитратного буфера при 10

ММ і ї7,0 95 для відсутності буфера за 48 год. при КТ) (див. фігуру 32). Склади з цитратним буфером при 1,75 мМ і за відсутності буфера були порівнянними з еталонним складом (наприклад, 7,1 95 для цитратного буфера та 7,0 95 для відсутності буфера за 48 год. при КТ, при цьому 16,8 95 для еталонного складу).

Висновок

Зменшення концентрації буфера спричиняло невеликий стабілізуючий ефект на кінетичні показники утворення НМУУ. Цей ефект, імовірно, був пов'язаний з іонною силою. Відсутність буфера та цитратний буфер при 1,75 мМ були найкращими кандидатами з точки зору утворення

НММУ, за якими безпосередньо ішов фосфат при 1,75 мМ. Буфери, тестовані з гліцином при 72

ММ, були порівнянними зі складом фази І/Ліа.

Приклад 8 - Підбирання добавок

Здійснювали підбирання добавок гліцину, проліну, гістидину та Тгі5 у комбінації з підбиранням буфера (перше підбирання: аналізи Ме НО4-150-172) для того, щоб виявити можливі синергетичні взаємодії між наповнювачами. Підбирання добавок хлориду натрію, бензоату натрію, гліцину та цукрози (друге підбирання: аналізи Ме НО4-185-190) виконували для фосфатного або цитратного буферів, найкращих буферів, вибраних у результаті першого підбирання (приклад 7).

Склади містили 1,75 95 цукрози та приблизно 0,07 95 РБЗ8О.

А) Хлорид натрію та бензоат натрію

Хлорид натрію та бензоат натрію тестували, щоб оцінити ефекти іонної сили та гідрофобних взаємодій, відповідно, відносно утворення НММУУ. Ці добавки тестували для фосфатного буфера при 1,75 мМ з рН 6,8 при концентрації, що не перевищувала осмоляльність складу фази І (165 мосмоль/кг в РОБ). рас

Результати О5С показали, що склад з масі був порівнянним з еталонним (Та1-65,7 "С для 60 масі ї 65,6 "С для еталонного складу), тоді як склад з бензоатом натрію був трохи менш термостабільним (Та1-65,0 "С).

Дослідження динаміки рівня НМУМ за допомогою 5ЕС

Для обох тестованих добавок, спостерігався явний негативний ефект відносно утворення

НММІУ у порівнянні з еталонним складом (наприклад, 5,2 95 для Масі при 38,5 мМ, ж5,2 95 для бензоату натрію при 37,8 мМ їі «3,2 95 для еталонного складу за 24 год. при КТ). Динаміка була однаковою для обох наповнювачів, але в даному документі показані результати тільки для Масі (див фігуру 33).

Висновок

Як видно для концентрації буфера, збільшення іонної сили за допомогою Масі або бензоату натрію спричиняло явний негативний ефект відносно кінетичних показників утворення. НМУУ.

Крім того, ефект гідрофобних взаємодій відносно кінетичних показників НММУ, обумовлений додаванням бензоату натрію, не спостерігався.

В) Гліцин, пролін, гістидин і Тгі5

Ці добавки (гліцин, пролін, гістидин і Тгіє) тестували при концентрації 10 мМ (перше підбирання: аналізи Мо НО4-150-172). рас

Результати О5С показали, що всі склади із зазначеними вище добавками були порівнянними зі складом без них (тільки з буфером).

Дослідження динаміки рівня НМУМ за допомогою 5ЕС

Відмінності між складами були слабкими, хоча тенденції можна було спостерігати через 48 год. при КТ і 6 днів при 5 "С: е гістидиновий буфер: - при КТ: Є (відсутність добавок) - гліцин »пролін» Ттгів; - при 5 "С: 0 » гліцин - пролін» Ттгів; е цитратний буфер: - при КТ: гліцин »пролін - гістидин - Тгіб - (Тгіб ї гліцин) » 0; - при 5 "С: гліцин »пролін - гістидин - Тгів - (Тгі5 кт гліцин) - 0; е фосфатний буфер: - при КТ: гліцин - пролін - 0 » гістидин - Ттгів;

Зо - при 5 "С: гліцин » пролін х 2 « гістидин - Ттгі5; е Тгіз-буфер: - при КТ: гліцин » Є - гістидин; - при 5 "С: гліцин - Є - гістидин;

Висновок

Відносно утворення НМУМ ефекти цих добавок були слабкими, хоча можна було спостерігати наступні тенденції: е гліцин при 10 мМ спричиняв невеликий позитивний ефект; е гістидин і пролін при 10 мМ, очевидно, не спричиняли ефект; е Тгіх при 10 мМ не спричиняв стабілізуючий ефект і навіть міг спричиняти невеликий дестабілізуючий ефект.

С) Цукроза та гліцин

У другому підбиранні (аналізи Мо НО4-185) додаткова кількість цукрози, що становить 2,4 95 (на додаток до 1,75 95 цукрози, що вже містилися у всіх складах, що забезпечувало загальну кількість цукрози 4,15 95 (вага/об'єм)), та гліцин при концентрації 72 мМ тестували з найкращими вибраними буферами (див. розділ, що стосується підбирання буфера). Ці концентрації максимально збільшували, щоб не перевищити осмоляльність складу фази І (165 моОсм/кг в

ЕО5). рас

Результати ЮО5С показали, що всі склади з 2,4 956 цукрози та гліцином при 72 мМ були порівнянними з еталонним складом (наприклад, у випадку цукрози Та1-65,7 "С для фосфату при 1,75 мМ і 65,6 "С для еталонного складу).

Дослідження динаміки рівня НМУУ за допомогою ЗЕС

Невеликий позитивний вплив гліцину був підтверджений при порівнянні зі складами, що містили тільки цукрозу, для цитрату при 1,75 мМ і при відсутності буфера (див. фігуру 34).

Однак цей позитивний вплив був значним тільки через 48 год. при КТ.

Висновок

Відносно утворення НМУУ у тимчасових рамках, що представляють інтерес (« 24 год. при

ЕТ) склади з цукрозою та гліцином, тестовані з найкращими кандидатними буферами, були порівнянними зі складом фази І. 60 Висновки з прикладів 7-8

Для даного дослідження виготовляли приблизно 50 складів і порівнювали поряд з розглянутим складом фази ІМіа. Підбирання рН здійснювали в діапазоні від 6,2 до 7,4, і він включав всі буфери для ін'єкцій у межах цього діапазону рН, окремо або в комбінації з декількома наповнювачами (усі ОКА5), для того, щоб оцінити можливі синергетичні взаємодії між наповнювачами.

Були зроблені наступні основні висновки: е значення рН приблизно 6,2 знижують розчинність лідерного антитіла: спостерігалось утворення гелю та осадження для сукцинатного та гістидинового буферів, відповідно; е крім того, слід уникати використання гістидинового буфера при рн 6,6, оскільки розчин опалесціював і був трохи менш термостабільним; е у діапазоні рН від 6,6 до 7,4 був відсутній явний ефект рН відносно кінетичних показників утворення НМУУ; е збільшення іонної сили спричиняло дестабілізуючий ефект відносно кінетичних показників утворення НМУУ; е фосфатний і цитратний були найкращими буферами з тестованих за умови, що вони були присутні в низькій концентрації, такій як 1,75 мМ; е 3 усіх тестованих наповнювачів найкращий стабілізуючий ефект був отриманий для гліцину при 10 ї 72 мМ їі 2,495 цукрози. Однак стабілізуючий ефект не дозволив значно сповільнити утворення НММУ, і е пролін, який не спричиняв ефект при 10 мМ, можна було використовувати як ізотонічний засіб (ефект проліну при 91 мМ (концентрація проліну в складі РОБ фази І) не оцінювали відносно утворення НММУ (наприклад, шляхом оцінювання складу ОЗ фази І з проліном та без проліну).

На закінчення, результати з прикладів 7-8 не дозволили виявити нову комбінацію наповнювачів, яка могла б значно поліпшити розглянутий склад відносно утворення. НМУУ.

Тобто результати з прикладів 7-8 підтверджують результати з прикладів 1-6. Рекомендувалося залишити розглянутий склад фази Ііа для досліджень фази ІБ. Таким чином, розглянутий склад був наступним (див. таблицю 31): фосфат 6,5 мМ/Ітгі5 3,7 мМ, рН 7,0, РБЗВ8О 0,2 95 (вага/об'єм), цукроза 5 95 (вага/об'єм), пролін З 95 (вага/об'єм).

Коо)

Таблиця 31 опис складу фази ІЛІалір пЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «ВХ ЗАМОК ще

Сагауви, Зорнтв вочеії, Охтане «1205 Композиції днти-ілеаианти-ІлЛ- 13 ВБІСПЕЦИФІЧНИХ АНТИТЕЛ кіз З4-БІВ-щО «Т5О5 5 61816, «іі» 2013-04-29 «і3О» ви за305160.5 «і515 2014-02-05 «1505 гі «1705 Басепттв его 3.5 кад «11 ЩІ «12 ВАТ «213 Штучва послідовність «д20х хгйЗ» ААКІ-ЇвІЯ на-ВІЗ УЗ «й»

А5р ї16 Уді цеу тнгобій бер о рго Аїй заг обер АТа ма! 56 бе сту 3 з 10 15 сіп ага Аа твготіб бек Суб дга Аїй бегобіб бегоуаії А5робзег луг 23 зо сіу біпо бек тує мес ні Тер о Тугє- сів біб бу5 АТа с1у біп Рго рго 403 45 цух їжи їв їі тукобеу Аа его ахаи цем бів беб біу хаї рго дій з8 БО ліф вне дек біу чає соту бек Ако ти Ар вна тик вви Те тів Ар 655 70 75 ча

Бго Уаії бій йаіз бі АБ оА1їа Аїа тиготує тує Суб бій бій АБл Аа вх чу 95 1 Ар о 5ег Аг тТнесвпа сту біу бі тпе бує без сІи тре гує 100 105 о «2105 г а «?і13 Штучні веслідовність «В20х | ! «ті дптїе ІЗ ва-віІЗ УНІ «005 2

Зін хаї біпівц бух бін бак бі вго бі бер о уді АТа РКО біу су ї 5 10 15 вег о рен дег Ті стТвЄ Су тТгоУді бес оту ре 5ег і ец Те о Ахо сек бек тів д5п Тов ма! два бій рго рго Ту ух біу ем 010 Тгро Бе

Зо 45 бі" Ме ів тео о сіу АБросіу Ага І1е Ахр тує Аїд Ар АТа Кен Гуз 30 5 60

ЧЕК Агу іви ес отів 5вг був АхроЗев хо іх5 же бій Уа! Ре ви 65 70 75 що сів меє тпгобеєс рей Абу таб оАзр ар о тве АТа та тує Туг Суб лій

Б 5

Агд Ар оту Туг вне пго тує АТЯ Меб А5рорпе тТрробіу ста біу тьг 500 195 ЛІВ зег зак ТВ Ууаї Зеє 5ег 115 «105 3 «її» 308 «1 РТ «Еї3» Штучна послідовність хойО» хеййж даті їв во мі «НЮХ 3 д5р гіє сій Мак Тит сій б5ег рго Аїд Бек ей бек уд бек уаї сіу

Н З 10 15 дер ОТГ тів тяг оба ТнгоСу5 Ні Аїй 5егоб1іп Ап їі АБ мат тер рев 25 30 ів бек тро Ра бів бів їу5 го біу д5п ї1е рго цу Бей бен пе 35 40 45 туг уз Аа 5ег дай о вец нів тв бі Ууді го 5ег Агу Ре бЗег о оїу 30 55 50 сег б1у бегосіїу тб опіу вне тик о цео Те утво ог боб ви бій рРго 05 о 75 о вій Ар тів аїа тнготує тТук Суб бій бій Аїд Ні баг тує вго вве

ВУ чо 5

Тне о впесбіу сту офу ТНР був гейш бін те ух Ага цю 05

«211» 124 «ож РЕ І Й «її» штучна лослпідовність «ах «ееїх пті- Її ипВоа-8 УНІ «Оз Я ой Уві б1й беш бій бій 5ег о б1іу вгОо бів сен уаї су Рго б1у дій ї 5 10 15

Зегозаії уз Ї1в бЗег Суз уз й1а его біу Туг ЗегоРйєе ТВб бег туг 2 25 30

Тгтрої1е нія Ткр 116 бух біп дго Рго біу бій біу сей б) Тер Ї1е 35 40 45

Зіу меї ІТе Ахр о РгОо бек дхр бу бій Тпг ого Беу А5побТп Ага ее 50 З БО сій сіу Ак о АТа тн веб тйг Уа? АЮ ОсТН его тб Заб те о АТа туг пу 750 75 5о мес сій ев Агу его Рго Тпгобек ори Ар озег о АТа уді туго туг суб 85 чо 5

Те оамі ен буб бі) Тук о п1у ап туго дбр бек Ре Тук впав АБроУВ що 105 ла

ТЧгробіу АЇа сфу Твгогрєм уаї Твг Уа! вер бек Аа 115 120 «ЩІ 5 «їз 1824 «віз ВК «213» Штучна послідовність «ЕйОх «Між впті-тЯ пЯбЯ-В ун «40025 б1п уаї бів їз сів бів б5еб сіу рго б1у гео уві бує вго с1у Аїа 1 З То 15

Заг ді уз тіе бе" бух суз Аїд бек сбіу тТуг бек бле ТР Баг тує

Тер їіе ніз тгротіє суз бій до Рго сіу вів б1іу цей бів їгротіє

З 45 сіу мес жів Ар Аа бЗег ар біу бі ТИР о Аго бебойвла біп Ако рве що

Яи сіуУ Агб АТа ТНК се Твгомаї абр обі беготнг бек ТВгОАТа тТуг

55 70 75 50

Мек сій ву ага чек обго Тговет обід азробаг АТа Уаї туго тує суб о 95

Так оАгу цен гує бін Тук б1у деп отуг АБробеє ре тур РНе авр. уд! 100 05 и)

Тер офіу Аїа піу твгореу Уа! твгожуа! его 5ег Аа 115 120 «Ох 6 «й1їх ЗО «в1ійх вих «г1їх штучна послідовність «ге «кгг35 Ттпкег «ВО 5 оту С1Уу с1уУ біу бег сту біу Ту су 5ег ї Ше 10 «2їі0» 7 «211» 15 «12» ВВ . ; «й13ж щтучна послідовність «220х Щ «аж ВВ-ВІЗ М З СОВІ «хх

Ага АТа йег січ Бег ума! дев баг отуг б1у боїв бег тує Мет нів

І 5 0 ї5 «вій» 8 кож 7 «ва РЕ «213ю Штучна послідовність «гдх «вйїх ВІЗ М сво «005 й їв Аїд Бег Ап рей бів че 1 5 «2» 9 «й 5 «іду вит «й1я» штучна послідовність хек «геї» наВ-ВІЯЇ УЗ срні «005 З сів бів дет А1а їм дер вег Ага ТНг 3 х

«ць щШ «2 юЮ. «212» ват й І «д1ї» штучна послІдеавні сть «й х й «3 вВ-ВіЗ УМО сові «4005010

Ссіу Рне 5аг іо Тиг Ар оЗебобег 16 дей 1 5 їй «5 1 5 «2125 РН І , «ІЗ» штучна послідовність «ех що ШИ «223» ні Не Ср? «Нюх 11

А«роб1у Агу пТ1о Ар 1 5 «ав 8 «кїх 10 «й12м РЕ й «2413» штучна послідовність «й | ще «203» пвУвіЗ УНИ СОоКЗ «АЦО» 17

Азв обіу Туг вбе рко Турбо Аїд мес Аврора 1 5 10 «їх 1 «їх 1 «2125 ВНТ | І «ІЗ» Штучна послідовність «В» «23» нярпа- й м сов «00» 13 ні Аїда б5ег бій Аба Тіб А5О ма тТгв о гец 5ет 1 5 10 «0 44 «її» В «ійв ВЕ | Й «2А3» штучна послідавність «РО ! «жах впВОЮв'я м СВО «005 муч АТа чего Аби ви ЧЯ5 не б1у

1 З «2» 15 ч21р 9 «ай» РЕТ І , «213» йтучна послідовність «пвх «23» нЯпа-я МІ сок «4005 15 сіпос!в Аа нів 5ег тує РгОо Ве твг 1 5 «230 їв «115 «и» ВНТ , о «її» Штучна послідовність

Уу НИ - київ ВнВра-Яя уні сові «00» ЛВ оіу туп зег вне тк обЗек тує тр оті ні ї 5 10 «ах 17

СУдає ШЕ: ЛИ «2125 ВЕ х?213з Штучна поспідовність ке 205 Щ «кий» вВра-8 УНІ СОН «40йх 17

Ів Ар оРкОо 5ег Ар бі Оу тТвг Аг 1 5 «21 й «2125 РТ | І «213» щтучна песлідшиність хай ; «йй3ж пдра-й УНІ сті «Яе 18 ви іу5 біб Тут сі ази тує Аяродег Ре Тук РВЕ АЗр Ома 1 ї 10 «ОЗ кві юю ха РА «а1іїж Штучна послідовність коййх Щі шо «2д3ю НААУ УМО срКї «Ох біу тук беговйе твгбобеб тує тт ті нів ї 5 о «20» 20 «Її «вій РК «13» штучна песлідовність «ййОх «аеїх па не Се «4005 02

І1е АБ; Аза 5ег Ар Ту 010 тАг АгО 1 я «105 21 «2115 14 «Аїр» вит «2135 Штучна послідовність «ав кайух ВАВОЯ-Н Мне СОКУ «40 1 сви фу бід тує соіу деп тТуг АБО Яес ре Туг Ве дБр уд 1 З їй

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Стабільний склад на основі антитіла, що містить: біспецифічне антитіло до ІІ -4/І -13 або його антигензв'язувальний фрагмент, що містять легкий ланцюг формули МІ1-лінкер-М/2 і важкий ланцюг формули МНІ1-лінкер-МН2, де МІ/1 та МУНІ1 утворюють антигензв'язувальний домен для 1-13, а МІ/2 та МН2 утворюють антигензв'язувальний домен для 1-4, де М/1 містить послідовності СОК 5ЕО ІЮО МО: 1, МНІ1 містить послідовності СОК ЗЕО ІЮ МО: 2, МІ 2 містить послідовності СОК 5ЕО ІЮО МО: З та МН2 містить послідовності СОР ЗЕО ІЮО МО: 4 або 5; та буферну систему, придатну для підтримання рН складу при приблизно рн 7; і де склад характеризується концентрацією солей 15 мМ або нижче з метою зниження іонної сили складу, і де склад містить маніт.

2. Склад за п. 1, де: МІ1 містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1; МНІ містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 2; МІ2 містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 3; і МНа містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 4 або 5.

З. Склад за п. 1, де легкий ланцюг має формулу М-Мі І-лінкер-Мі 2-СіІ, де Сі являє собою константний домен легкого ланцюга антитіла, і де важкий ланцюг має формулу М-МНІ-лінкер- МнН2га-Сн1-СнНг-СНЗ, де СН2-СНЗ відповідає Есо-домену антитіла.

4. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де лінкер містить амінокислотну послідовність зФЕО ІО МО: 6.

5. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент додатково містять домен константної ділянки.

6. Склад за п. 5, де домен константної ділянки вибраний з групи, що складається з СНІ, СН2, СНЗ і СІ. Зо 7. Склад за п. 1, де біспецифічне антитіло або його ангигензв'язувальний фрагмент являють собою гуманізоване біспецифічне антитіло Ідс4 або його антигензв'язувальний фрагмент.

8. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де концентрація антитіла або його антигензв'язувального фрагмента становить 100 мг/мл. бо

9. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де буферна система містить щонайменше два буфери.

10. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де концентрація буферної системи становить 10

ММ.

11. Склад за п. 9, де буферна система містить Тгіз-буфер і фосфатний буфер.

12. Склад за п. 11, де концентрація Тгіє-буфера становить приблизно 3,7 мМ.

13. Склад за п. 11, де концентрація фосфатного буфера становить приблизно 6,3 мМ.

14. Склад за п. 11, де концентрація Тгіз-буфера становить приблизно 3,7 мМ, а концентрація фосфатного буфера становить приблизно 6,3 мМ.

15. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де склад додатково містить неіоногенну поверхнево-активну речовину.

16. Склад за п. 15, де концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини становить від 0,05 до 0,2 95 (вага/об'єм).

17. Склад за п. 15, де неіоногенна поверхнево-активна речовина являє собою полісорбат.

18. Склад за п. 17, де полісорбат являє собою полісорбат 80.

19. Склад за п. 18, де концентрація полісорбату 80 становить від приблизно 0,05 до приблизно 0,2 95 (вага/об'єм).

20. Склад за п. 19, де концентрація полісорбату 80 становить приблизно 0,2 95 (вага/об'єм).

21. Склад за будь-яким з попередніх пунктів, де склад додатково містить цукор.

22. Склад за п. 21, де концентрація цукру становить 5 95 (вага/об'єм).

23. Склад за п. 21, де цукор являє собою дисахарид.

24. Склад за п. 23, де дисахарид являє собою цукрозу.

25. Склад за п. 24, де концентрація цукрози становить 5 95 (вага/об'єм).

26. Склад за п. 25, де концентрація маніту становить від 1 до З 95 (вага/об'єм).

21. Склад за п. 26, де концентрація маніту становить З 95 (вага/об'єм).

28. Склад за будь-яким з пп. 1-27, де склад являє собою ліофілізований склад.

29. Стабільний ліофілізований склад на основі антитіла, що містить: 100 мг/мл біспецифічного антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить Ко) амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 і 4, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 і 3; 10 мМ буферної системи, де буферна система містить Тгіз-буфер у концетрації приблизно 3,7 ММ і фосфатний буфер у концентрації приблизно 6,3 мМ; 0,2 95 (вага/об'єм) полісорбату 80; 5 95 (вага/об'єм) цукрози та З 95 (вага/об'єм) маніту, де рН складу становить приблизно рн 7. Фігура І а Ком Я ем. ж Чвві ак, ау вату вач чи Ма уже ра С вапа:а з Ї ше (с48)2 о, о АФІЙ жи у : ОМ

Фігура 2 У внтитла ВВ-ВІЗ до АЗС ТО МО ПІБ ТОЗРАВ БАУЗІТОЗАТ ІОСВАБЕВУЮ БУСОВУМНиХ СОКАБОЕРКЬ 1ІСАБМБЕВ СУРАВЕСОВС БЕТОЖТШТІО РООАЕОААТІ УСООМАБОБВ ТЕББОТКЬКІЕ Х УНІ антитіла БВ-ВІЗ до АТЗ (5ЕОТО МО: БУСЬКЕНСРО БУАРСОсБЬВІ ТОТУБСЕВИЖТ ОВБІВИШУВОР ВОКОСЕНМ ІЛСЇСКІВТА пАожевевІв КОбВКБОТЬ ЕМТЕБАТОСТ АтТУСлЕВОХ КРУАМОЕКНСО стЗУКУБ МТА антитіла НЕОЯ-К ло НАЯ(ВКО НУМО: 3) ОісМтОлРАБ ПБУБУСОТІТ ІТСВАЗОМІЮ УМЬЗККОСКР СТРЕСІ АБНІНТОСУве небООшегО ЕТОТІБАВОВ КОТАТУХОВО АНВУРЕТЕОЄ ПІКТКІКА УНІ антитіла НВВЕМЯНЯ до ТП -Я КО ТУ МО: Я) сМОТОЯПРЕ ПОУКРОАБУКІ ЯСКАБОЗЖБЕТ БУНІННІКОВ ВОСОГЕКІСМ: ІШЕВОСЕТВІ.

КОБЕОСЯАТЬ ТУОЕБТЯТАХ МОГВЯРТБЕВ 5АУУЖСТВІК БУСМХОаКУК ПУКОЗСТЬУТ УДО УНО антитіда НЕЮЯ-В до ПАЯВКО ТО МОК 5) ОМЬООвовЕ ГУКРОЗБУКІ ЗСКАЗСЖУВЕТ ВУМІННІКОВ.

РЕОССЕМТОМ: ІРАБОСЕТВЬ КОНКОЄВАТЬ ТУСББТЯТАХ МОБВЕРТЯКр ВАУХУУСТВІК ЕУОМІОСЕХЕ ЮУухсАСТЬУТ УВА «Фігура З 3,5 50 5.8 6,0 55 7.0 75 БО 8: Початковий стан В шшщ о що В Через Год Зх з І н- же ши и ши І ї ож ях би перезітод, хв при ШІ А а о м вм ни я ЗО ох па и ее о ие и по я фа ЗБ об/хв, ше жа ін а и сов ко Забруднення частинками апп ве с. сере ро шо не с ОБОЛКО ВОНО - мкВ о 1 І рт. МОМ 5 зва с ПАС - діаметр чі ЗНОВ пока пак ОМ я амер чає миша с кіпеос ск МЕМ о ке ВОо р с с се тв НН похветвце т ом ех 5 на с с щи в ж Бл спиноннниня п що З00О с п КО п шо я ннінь с сени ке ш о с с с СУ стру ПОН - о ПА Есе о ЗК п с В рушування, З с в: Ох с с М с -- лив стру! Як Е с г 30 струшуван шо З ее с с с і Зхв вання, ї тод в, хе Ан с с я й шо ш здо с с чо дні д о с 56 днів при 457 і. не о с с я . ї с с іш ІЗ днів пр с со вл оо я ем уся ких Ох днів й п я гово с що Е пове МО Ок НЯ Ав ен КЕ пок ПІ х дні Й і. п с шк ІЗ днів при 57 г.

ї о. с с 0 Мав щ і: с но а ех шо ее оо ох А ОХ У пово й 5, ш п п ен, Он не Ки ОК Мен ся СОНЯ о ОО КЕ З З с сен з 1500. у пн. п. с с о о З с її й с ЕЕ о ех пе веА - ше с Ес ор с Ох с . - . и: я і ки с о Е о у с с о с с

5 0. Я: с с 5 з3о0о о. Я п. КБ т, Ох с с в У о і В с с о Ох Ге зай 1 В Бо с с «Ши о. озон с МЕН В п о С о свв с с БО не и Е що В ме с о с В о що 2. г с с рах Ме пе М. «В ВВ ох по Ох ее Те пе Ох о 5 їі ШИ 5 с о о с о - ЕК, ша пе в ЖЕК кох Сіда о С КСЕНЯ Км ок МАХ ие От ОВО У; ВО з -о що с с о ОН КВН с ШОЕ, я С Ус Ния ОО соди оо а пек ох ес я ме . ше ШЕ с: Є о с с оо пе Ж ке Кй ой ев Б СО п Ве в с по що В он о с с о і й ш: ча с сів КК сх ВЕ ЕК ся и АК; ших о я с РМК ТК хо щі ОКО о зер ВИК о Ан і. п Кс М о с ше Ех с с по БВ с о пи о ев- нан пн 1 с ОК кон ев с 0 6-2 бе б с о.

: а. В пи п р Б, 7 й х. 5 ж ех 5. й і в-4 : З ек Се) в чан От щи Ан лом: З п У КМ -- ще с шати у о. г с НАС памета частинок о с кокосовою юкоібмкм ЩО - с с зе -Н-. 3 Е о с в с о о. пиши о. 5 в |. с вили» струпуванся, З за п с ох п Б с в грушування, Збха о о. с ев я о Бр ЕЕ, сплив стр Зх ГЕ в. По ще о о ден с ХА пу я лив струнуві ї о 0 а. су о Бі у СИНИ унТуваз щМ в Кз с Б ик г с 00 ох ння 1 год та с се п с І: Годо та ро с с М с Зб зані в я 0 о о . с то двів пр В о и о ох о ех Оз ех ме щи ри с ЧЕ в ее в с : щх кон Зкаое с Ам ек СУТЬ пе ех о. ІЗ дні ща ех я ся о я пе ве пе м Ота З днів п с РоЯЖ ж Є о, с ; с с о при 52О 5 Е т с г 1: че .

Б Б. п ох 5 с ОО 13 дні о Ж я: ле ши пе поь с и я 13 ДНІВ чо . уд Пол я п Мей п я Ен Кри ох пн ок при вже п К во Ох с с ре п . о и : г. 5 о 1 г. о о п. п с с сект В З і 5. с п. о: Ен Ва о о о я а ее ним я я щі пен я а в с шо ен а й о о с с о В ВОІВ Б п я с з и. с Ох о. с В 0. З З 1 5 0 о. с с с 5 о Б п о. . в пох М. їх Кн с Ох о о ОК ВМ КО КЕ 8 Бош по ке я ОО 0. Ся о о о. п. о я і с с с с о о що шо с с о зош п. с и с те со ну а В Вс о с их с п о КО В її о с пе о по о вання Ма он 5 Б он Я. шо КОХ МУ о ЕН а. ох с ще М вне Я Б. не ее КК зх я. па п о 5 КІ ШЕ ОЛЯ ох п о ох я с о 5. ще В ОН. ее Сл Аня ДК СК ку я ВАМ СЕК по ох о о с ії її о. п с с о а о г о с ще В ех В у Ве МАЯ пе я , о ЗК пе с То. щі: Ох с . о с с ек ЩЕ ще ан п де с їх о. с а Ба У со МЕТКИ ОН с о. Я п о З г 0 оРя ОБО ж Б о о о . я є с кВ п.

Я. о і й о с ме ех с ке свя Коен Во я ех ВИ я о з ис с ж и с с еру м: п шин ш с о с 0: .

т. КОКО ВХ АК по ПК в фе ХВ, ак Я Рв й -5:Ї її с о вб-? тн Б. с 5 РОЗ ох о о я ки у роя ОО т ся Ко МИ: г ц ла:

Фіг. 5 ЕМ є о і дя вро ПЕК Ж УМХ Я НМУ ваналі о в неон термі: Щ наліз ле б МЕНЕ ОВ : мічного Ві : 505 --ІСЛЖ ох ї ого виливу : лю ша лико ВУ. ше ко Х ! олешремк вою и ше що шо ПЕТ КН А між вових А еааих ОКА Вена тоже її і пн . НО Я тя п. Но ря Со п неоея о Е рел. : ме її рака АН У нея ит им щока тк МК ее: Сена пе М причус і шт ЖК ке Пелети плн Те у сен пе я ! о пліт ві ГооюЕок ТЯ оон ЗИ и яко . . орав ке ї о. поКЕкн ша ШЕ ляі я КЕ Кок ку Поу, с ак З Пре вно лнвлри с с що З Вени с пед х я со е хх ен о о с ех ОМ скокянев - нн й ехо и я о . : ТОНІВ МО синя І ой и ННЯ ва щі г що пог тя нн ДОН ах У я мое Кан. ні тк яти ВА з ня пе одн На Год А кА г и сажа: УК Бо о

! в. с о п ення г У ва Ле и я ЕК Не я п : я оз ЕОдЕ поле т ее я п. о пу З рня М. Но ЗАВ Ку ех дк СНИ Ве кре ях Ж у ХО Ї Моя вв КІ вия СА фо ня т нок я ке в КК Б: ОК А пе : 2 о З вра еЕлох СН КЕ й Іс я Ся ре Кияк інд оре пік ше є ВА "жен Со я БоЕ ра я УК ку УК До тю ВМ КЕ. з вив в. ш о с Тех Кене : пе КК йнАл ееЯ у р ОК сте. 2: Ж шо о й ЯК коки Я век : ВК У у п . -к Іо З Кая ока ее В ся Зо КВ ЕЕ ж я Мяк Кох ОД Ко с бо с г а, пні ДМ ЗХ ре он С на ї пл Косяк я ЖЕ; ее енннн З оон к сн Ж ати Я "ХЕ ВН УННИ ОТ ЗБЕ ее п дк же я ПО Ж о о ха Се Не Ве я Ту дане 1 ех ДОБІяНИ А ТИ | т . . о ой 2 ом мен ли Ж о КАН ши пе з | с. . . .: ПЕВ ВИН Що чех ОК геї шо ее нме Кк Ж, жах ний г. 0 ЛЕВ НЕ ДОН З о о т .

і. о і. ДНЯ се Й ву ни сао де о о і БО М те Ж о и п ве й о рай ща зи Р но рН, її К о -3 ХЕ Оса В-4 6-5 й ій ваше в 5-6 І а ЗЕ -черех 7 а через 14 дні ура шк днівпри 49 Я о пат ШИ! Й дрннятт Ї т) - дого і ше - ; і Ще нин НМУ | ! т р - РЕ плід М в | у а, ! ОО і їх ї фо сентееняя ; З в й і ще я ; " ре й ї 5 І | | Р І У: їй | ? . я во І В | Ба і к- г т їй ї ге з зв. | НЕ ше ре зе. | | . : в. В їі в у !

зо. ее; В: В. З пов: ТУ . ? дов: ше . пом - Ж - Ей ще ПА і ї , І Не З В; І ЗЕ Що Ї довгі є І Що А |. . люту ; і

Її. М ой ро щ ЛЮ сп З ша: ух я я скік би Ку оо: : ЦИ 2200 пнннтрінетюні й зво 2 Е а, ; 00 жвилЛИинИ Що и Ти Й

Кинь у .« росі зе Сея ти - Фігура 8 в нк Гея а Е -5 - бот че юю т хх а о юю ою юю З шо Ва й об; їмо їоїмо ба Бо чо, Ощ с сі 5: КІ щі Бо І і КІ ка - ра ж : ; ! - се р «В І Пе З и Ноя -х ЕДЕМ те ше : ЛЬ ет п о ОВ КО Коди ен не ЗОН ия соди я й дор ЧИ у ТИ п о й ан ун НН ни пово в ау о ВОВК Оті ль ВН НН о ОН же. я : ПООЯМНЖ ща кв ан и ви в ЗОН ННЯ 5 тоди т КІТ ЯМ ПІД ДЖ МИ КО пе КТ фу КВ В Пн и й УКШЕНЕЕН Мі Я ТОП НМ КЕ НЕТ Хол ЖОВ У ооо В НИ з я й " ПЛ Тео ОО В, МІНИ - Ом ук Вр А АВ щі» дя Я . - - пе ЛІК Ки ПОЛК ов ов полях ' нн - У ММ. пра зожи то. сх ВВВНЕ лемше бочку, нн о ВВ КО м то ву пу вк В. пен 007 Ат Шо: В не с ше п Ток а Ес ВВ : піз : У кити: ВАНН п мине Й ПЕР у в о КИ коту . пок Б пити ; іх НН о ВВ екю и ! ї нн еко ВВ Бе и КИ . с. . Те ЛУ В о МКМ т Не Я, ШЕ тож ТИМ х т - пу я ЛЕ в КО ВИ т: БВ жу ди Ом мати пет Ов о ЕД. гу У НН Кн ВИ НК, хо ІНВ ТК и НН ши ще ЯН дн в ИН о с: ВВ ПО нення кий и Кок офі ми Ех ги ик Он НВ ВИ НИ ан і ВЕНИ ек, 5 о Ве по я й пен. т МИ В ши» ВВ ДИ - с пиши ЕЕ ВВ Додаткові емуги і КВ о и А В и ИНА пит ВОВНИ і Б ін оо не ан о С.

ХОМИН с аа ен я ок м о НИ. с КО о А В НИ КН УМХ КАП ІМ, завада АТ НИ пев ен 7: ВЕ УМ сгажет ж и ЗПАРАСЕ: г тижні при Я С Фігура 9 ; я гро нух орех Каши ІЕЕ через 2 тижні при 4570 в! поМО1605 в5-а вай в5-Я ве РА 8Б4 сб Ор о КК В ОНИ НК ИН НН НН о со ОК в о се в ее «ШК ПК ВВ Ма и НК МИ М МН МНН пе пк ВВЕ о я ВД о о КОХ в ну А пут я шо шви и он Ок: ну Я Пк и п МА я и ор шов нано МК лек В о НЯ я плов ся п НЕ ДЕ В І Ки и ЗВ В им в МЕ . Депо ання нь о ее нею Бр В аа ПО Ее Но М и нн м Кр ВО Нв пу шк . пи пт КК о ий оон ВИ о О Мо Е Кв : ОСЛО не нет к ени А ка ПТ ов и он в ОНА ВАННА М ОБ й ПС ТМа еВ КИ и ни они ЛИШ ша М. 53 : По ь В пи нити нти тт іннніяютюттетн нн З ізоформи Зменшення кількості основної форми накористь дру орядних форм Долаткові Кислотні форми

ЗЕС- НМУ в аналізі Л5І 3 - після завершення програми впливу ще То УК ке В ОА ОК КК КК укр жекокква Й о с с 1в с с с її а о Вико ЕН ни и КК ОО ие о НЕ с с я с с о ! сел и ОО ЗВ с КО ЗВ о в в МЕМ я дл. с що ша ре п р рН с ОО сок о ОК НН п АК ВИН я що а -О у р Осн о нн НН в о т я т Б ожини Ох пе а шт о НН

4 В. їн І 0 о І с і Он Б ШЕ ОА по ВВ СО по ВК ПОХУ В З о у в ШЕ . о 24 і - - ще т щі Й же о хо КВК ПАК я; ВК ОБ ЯННН о КО А шщ- 0/0 -" ДФ Ф(шш і с б я о ни Шо НЕ п Я Свізалу РІі3-2 Св) Різ-а 0 бочатковий час 00 Бфолижнінри 5990 0 суВилдив шляхом пропускання через голку

Фіг. 10 Фігура 11 ПН с тес НЕК кит нанні ів вв КК с Я як ПЕК Я ПЕК | я ЕЯ ст ВН ву й Я ; нн ян КАУНЕК КИМ АТ Б ож кове : пи о и и Ю л-ра о сша 10 РІР-О: РБВО 01195 Бк В а ПЕ кл кв в ва ке 1 0. ла РІ2-7: РУ?О 00195 КАВА о КИ СВК КИ ин и 0 се у і по Я РІВ: РЯ2О, 0195

ДО дервлавантоввовику стик ЗЕ - 9 НМУ г оон нн ниви ще поля зберігання з нн зи. ВОМ ООН ма В Кн ен пон осока. Зх ж па пе М ерінеу тити І: с з Но 000000 початковий -- 0, 00606060 ЩО ші є Її с г с СОЇ тиздень при 59: ж и: с 00000000 Ба і і в Я. я о. о ( БАШНИ "с 85 ! її її 1 озооні т 25 Як в В: о, В В при Є х ка я ни: о ІВ ме Ен Ве ем СОН Є й а ви Б х в о Ей ше фо й: ОВ Ес 0 ділижніпря5 о Ох 8: з в ЕЕ. а Ше В 5 ші тижні при УС - св п. | ее Я: 5 (ДФ зе ко і я ще де Й пре Ме я Я тот . в В - В ої о Я р тижнів 32 дні шЩ її БИ: ЗЕ В ВВ в я люпри АТО в 5 ше й | КЕ: ше: с Я В . що тиж . и о Я В. шо Се ве Ж, нів-2 дягпри 57С вся Не ета В: шо АК ІН п се ри УС і ї г. п г |. по ще ще а Я в. КОН же ой п В зак о ж То 3 В КЕ і ШІ о: м м Й Яр Бк. КК Ера й пе Бо КО ж щ ні ВН. п що й: Я в й В: З її: . З ви ШО воші що ВЕ Б й ЗВ г ЩО Ме. ще шк 5 БВ : Бе й й й в. ві й ЕЕ. шк В В КЕ я й Я В і. С Ех ЕЕ. в А що БНО В З Не В ша Я Ще Ве ЩІ ВЕ В її 5 38 В В: й. Кк. ВВ ПЕ й й. ЕЕ ї. й я. її 8 у 8 ЕН КО. щу : що КЕНЕ в тощо ше Ко Би ща 2-5 рі2-8 в са и и РТ2-1о 12-41 Кон: Єсть контроль Фіг

ЗБ. дитя п12 ЗАЧ ай ЩІ в пяти пет щас - 3 НМАУ та кетатеттт соте х тісля зберігання: птаство Дн екжнхити ання. ті Се КК ороккр ке х при 57с по я звання. супрово ; А о о ее М ОВ я с ПЕВНЕ ше о с ші Є ПІ Й початковий о її же білки ще 300 Я 1 0. ЕНН в і п ря а пуер я о ВИН о я з ли по В їх 0000 - 0 со бо тижнінри 7 5 юі А 000 й с З п Що бітежвіпрн 3 с - й 0 й Ще 0 МО а тижні пр Ох па пишно ОВ її БО яжні при 570 яв В В 0000 БО ке ЕС Чи В В В ПОН КОН я ке тижнів 2. лні : В її Я оши ВЕК о. ше - ОБ нів 4-2 дні. при 570 се ши Б і : 3. ри 5 й й ве я. г Ен а: Й Ме 140 555 еВ с й М ВВ в а "Вин і 8 хо, зі ща ще. ЕЕ ох: Шк КЕ б " я Її ЗЕ се Вс НЕ У; кер анн Б 5 МЕ Б п: я 5 БЕ ШЕ Б Б | шо НК . її ш ш В Ж ШО п ще її Б. І т що с і. З В. і

І. КЕН М Те ПЕК у Бе хе Ї. "аз ашнни те й РІ2а5 Кон «Віг. ІЗ ТО) пурехковам оси і СЕС від ад ІНК та НИК , - Ідстеження рівня НУДУ- одне рних -зберігажня п! во не ло нев,

с. Е: ен я о МЛН он КН ВИХ 75 п УСВА с Я Початковий час й в ЕЕ О По я и КА ОК ке ше ВК я пеня В с с свЕжен с СЛ1 тиждень при 576 о 0 в с 0. я 000 сс и 0 с а с З? тижні при 570 ие 5 ГГ о о 5 о с при 5" пен Іі тет шва В п Б 0000000 щаутижні с хв шою с В ОН п ша З тижні при С в ско

І. с с шо б рис их о - пи я о п ОН по ан п зад тижві - о Б: зе у о и . кетанов НИЙ що Моне а тижні при З я Се КВ я п ш Ж с ОО дєуююх ро є 53 000 п с п. ох С ри о Б 5 ЇЇ. о. 0 с КО в Б дн Он маю кВ ах ее п ах а сс Що за о | 0 о с БІ -а НВ о. В с по щ я пф Е стакан НН . їх с я 5 го с 0. п й с с а о х; її. - с с І й в я я он за я що сс: г с о. в о 3 З с ЕВ я, ЕЕ 2 о п я ОРЕ и й В 55 М. о

: і. ще с чі. г о В с -Е о я пе пікова Ох ох Я Тен ко Ой ср ОВ В

З І. З ша 3351 В 0 ш І. ЩЕ Ба у п НЕ І В с ОА я пе РО і т с НУ - М Бе, З а Пн що Ку р ово Най В о . І щі 5 В п о. о ШЕ. її ШІ! 0 0 0 ї. а ШІ: не ші 5 й щ. А щи я сив яд КО о ОК о о У ВН ПЕТ ПОВ Кене ще ут з НЕ. Б щ. 5 ШЕ Б щі і В щ С ща мав: і сну В. о я: Ф Ф(Дщ В о о я -4 ЕВ ОВ й й хво ще Кт и ех. і рг20-2-Е ь Боводнк ОО ЖЕ ще о: пт Х жов Р20-3-ЕОБ. стерня ш. ж - ча де . ШВИ сонне рго-а-кОв в. І ф сік А 20-56 255 іг. 14

18 ооо Дт и он нн нн вв С еВ ва х й Ні й , - п Й З с За 5 - 95 НМУ вісля зберігання протягом 2 тижнів ври 57 16 с о: он нар о шо с0 г о. с с Ес с с Пи В ек мя ше ОО АК и ов о в в НЯ й с а Ь пн з ох Й во кад и вне ик чу мови пн ня ме с. с Б о в Ко сх о. п й " в її т щ- о о ке ВИЙ с г ЗВ Ве: о Во Ня о В Я - 16 і ше і Не її г ЗЕЖеН пе ни Б. і. п КЕ зн з як І: Ш В 5 В й и НВ п. В у. Б її, й. й і З і в. о ста о ве с Бе ГЕ о | в . ї . щщ- я її в її їх Е у 0 І я й ДФ ФДЙДЙяа ДФ Ф(ж8б 1 й й ЕЕ її г о В | щ. 4 І ВО в ОА п Кф: | пк Не ОО. ту ЕКОН В н о сн Й по зок ЩА Мер НН ШЕ і. з й ко 5 ПОВ в о м о. На б, з НЕ нн Я : й | й (В с : 0 8 я о й я ДФ Щ (щ. ВОЯ с --- 65 і в2аї-2 в2ї3 00 РАТЯ. бРІМ-Б У ва 00 РА? 00 РІВ явіпочатковийчає Сі покденьтри 59С 000 БО тижні при 5'С Контроль Фіг, 15 Динаміка (1/ЛМ- 17М0) залежно від-часу при Гео 000189 т ополонки од овлввлсоо нн ж ж ж мн ж аж аа а нн ал а и п м п пит и по ото п іп опадів нта піпивннй Ї ся Пролів, 155 ух трах 1 зЕОБ5 ;

0.001603 ГотнеПролін, 356 од0о140 зинннни ПіНійна залежність (пролін, ГБ) я в Точне ПіМійна залежність (прожін. 395) ; з і боб120 34777777 " дян шо А ве усе ВЕ-Ох ж ЗЕ. , з Є - 000100. : їх 0.в998 Шон -- - 00080 - , щен - опо0о6о " се о.00040 рт о:00020 ес ода В нини по спи п па пи о пис п и и п п п п пи и ов опти по и и п о о п п ит патвнн о єв) 10 15 га 2 зо Час(сода

Фіг. 16

З Фигу ! а пошу і! у ке АК пн В нон й ра І? косу ма лак ок Кт "ублімаційне сушін: ри ше в нннИ З ЕВ о Іне супиння в аналізі ПУЕ ВЕ Во ек ОККО ЕВ шо талізі А їв о вик т ВИНИ ку а мол в а 1 Тени чт я ВИК шо аку ПОКЕКя шокова БК Ина ен Но Із леви пак НОСОК Ки кн и ня З пЗаморож пимене у первин ВК осей Кен ДОН. ОВ орожування |. раннє 0: ее - я весни соя 0. Вюринне киш ре іх на ее вка око ХВО М КНУ АК п с охн «час - -51 ші З по» МшіННЯ ; з ВЕЖ УКАЗ МТК КЕ ам НВ ім жи аль їди : с 0 0 оровннее н к-4 А ТК УА Ко АН я; пк дося Кон МК Я ЗК ЕН -к НОВЕ Ки рН К ПЕ ДО их ТЕ КУ пе СА що0-15 це о, ОО ик Ер ей еВ Ен ин з З Я ех ВАД, ї Ве пе ЗОВ еле нок рова КК Ток ня 5. п но шен п. їх 4-5 щи о ех і : с ЕК сенс Я не М аКхе КК одн УК ие Ка; ж КО ОКО дк Тис НН Х с : е т ем: А Онук ОКЕАНИ ЕК Кия ВЕК ПО А юн ВДЕ о. с и ОДНЕ Б и КАК НК НА я ОУН Я - ок Є Хо нер кн Ск ОКУ нео оник них края ДОМ т заморожувай: 35 с . пе с режування з МИСКУ ке нн я ся о. а БК жев ноя клани еВ ЕН т в Бо ее она 5 им І я ПЕ: ЕД ев Так Пн Ек Ен МОМ с КО Мі КУ вд КА ее У Я ПК те те окр МН ж КС - Тез НН З Он ех пе Нмеи езпературт ЗАЯВ о п НК еКу ура продукту УЖ - ВИКЛИ пак НН Ер оя У Кк а станови є М. о ї7 Пн Пк сррна лекквкни п Я за ФПК р йй а енер КВ у зап иа нн ня подиві дя ве Я йо; доб 50. ие 7 Е Ново Час (год) 60000 ВО ій у, Бігура ІВ фен ке повар Я і ! ей сосні В я. п В ее шщ я і шк ше ЕН Ж п й й ! я х ВК НЕВ по В о. лю ХЕ пен щи ЖЕН х ен ОН о Е Ов оо ЕЕ сов ее кое Во її Б с п СОсЕ і: ий КА - ФЛ ДЕРЖ о В В Вч в Е еВ КК й КК у ІН ЩО 5ЗАКІЗО597 шо - п І-І На ж п Б сел. р вод втнрия Я ШЕ а пе ще бабі 5лоюа вв я Я г: кан ак ие ТОНИ ПН сг : шоу сс НЕ В Кен, ва З я: ку пк : Б КН «кА Ще о Ве. оо що оо. БИК Ся ох КВ оон САВА т: ВКА ЗА -4 ГУКА сок У отв Бек ВЕ с шани ря й МО шк шо. п о

0164 С2 кое по нн я КЕ п ПЕК Я 14 й . г: о Акне с 3: т ВМ. о о УОК ЩО. с ві БО с я Бе і СЕ З ше Ох есе інв, З. й її с аналізі Ме . ; 1 «14-- Її с иа с сносіб лі г с пет ліофілізації ее о пе Си Юста нон я ПОКЕК у я шк Б пе 0 ВТея в сх . ї 10 п поса є Перед лі Вих о НЯ х "г г ие ліофілі о ОО вра Зк ті МАЕ КК а ох ї сю лівза ех НК п. ох о с ЕИтісля ро: цією (20 0 - | о с Кит зведення (1 мг/мл) І шо. : г го | | с и ЕК лив'етпосой ТО мгй й Ах п м о о с п о ссобулі мл) 5 с І : с вав Ве ! о 'і то : я ОХ ос Мюи У о. о Ех Соя и ях з . : с о г нм с : | с а - с зекнесят с у я 5 В 0 с В с с с с ще! їв : с г ш БК пи М а о Я 6 БІ с с 5 Ко

Е о. ш Не Я с с с п. ко ! | | о ов хг Вей 0. пий ПЕК КеЯ - СН Коня ; 4 о ЕЕ й з В | і. о с а в БА опе Бе ша Ве дО о дова ЕКО ен

0. Я В пе в о с во о й її й о. шо - г : В вк : а : с ще 0 і і. ех о що о. і: о . КЕ у і 5: . " Б В Я В В і щ ї що. шо Ти п т о. в щк во Гл в. : ЕЕ В д.

о. с со. в. і ії ЕЕ З о є о як : т | Ів 1 | З ї її | ще Е ій г - ох же Кен Б НН ши : п Е с. о в ва и - и В а ї Ка а 5 Ен ; о ще 0. шк ПЕК жк, ї п о о г і чи й й. Я Я о її ш Я » Рі я МОЗ й х й в кі с : о в Й ї в | 8 с во ВЕ о и 4-3 У В Б ХЕ сеї я пт г о ау та - М ш 20 РІ4-5 8 В щ. 1 ВНЗ о ! со Ов пер о о В Ншшш Й 7 5вС-НМУ ве 0 Я свнже є ДЬ20-- сій «ення п УМО Кок зв ВЕ іл с. о о с Ся нізації. щи я - енвті ції нання 5-53. : Є с ек о г: с КЕН кое я т ВЕК дя в Я казни крик Сл км се ния Шо і В ше ща й де і. : о - ср с ЕЕ о : о п с с офеу шоу й ОН с ПИ КОВО КК й - КУ я і З: тес ВЕК НВО ДЕ ху НА щі ОК с о. З о Ба пе ше лив й до со ВН с о о: ДБНе Б З ї в - І |! : яке п. Я: В. п г -к с Ян ко Мав пре ОУН, ж ВЕН о. й ее а А.

: . ! ГГ о Ж 5. ох ВМ НИ 5 МК ее Ку з.

в. 1 - 0 (В ве 5) ЕЕ 5 хо Ве шо З Мем Я о о Кос ви ек А шт В я З ВИНЕН ря о й 1" т ля с ї- с во г пк 5 г - с Бе о и. ан о - кв Ба в й я 5 0. п І г її.» :

ДЮ .- ЕВ 1 іш і» Но о о З с кв с І ре ж

4 і. ! с їЕ в. с я с І: с Ге . її ї о я о: п с МАЙ Мене ав НН ни пок іо МЕ со ре ЛЕК ще т: 2 МУКИ пк Дн с 0 0 в. з НН В о ш о р с щ с. о І ї. й. п. 5 о я с й : сл) в ЯНВ. с в о ж 1. в : її - х 0 с 1 Ш г / Про: 222 и с п с КУ й о 5 рочитування во-е т. 0 я 0: с. ії чня уздовж осі зей і СтР2о-3 с с о й , В ЕЕ Ой НО . й. 8 то ВПере; ння ! : ши м й Й як д діюфі пяти РЕ ї ГеЖАНЙ о пами ТЗПІСЛЯ зілізанцією (35мг/мя, -- о і розведені Змія шк Що Й ії БІВилив ліофілі прАзіцінійни | й плив ліофілізації на і ще З подфілізаци на рівек Тінь НМ нр що Прочитування у УЗДОВЖ осі

Фігура 21 ЗКС ОО НМУЄ вана мое пбеля пилу; Зображення доста після Її пиклузаморожування- заморяжування- розморожування: позморожування прі 0 8 конт Тл поза т вах и ин пор нен пок, сови ЕМ, пн Контючь : В ее я ко в Ж онов ИНА ще нев А А ВЕ ДК Тех роя : ще п БО СИ пеклярносоо шо А шо Ж МО м мя Ще -Б2БВБ5БИ 1 жо ша Ом я од мое: ШЕ 5 ви мк БИ виклярн С і. те В шо Ї дк Ки Я я Р вчи К і «фени оенетв Дн 5 НИ ше - АВ пок и. вия я ЗЕ д а кН пе і: пн ЯКЕ В: ЯН 2500 ЗБЕ їх ОКА КУ ШЕ: ие Ки В - КЕ АЮВН КЕ : Й ода нем ши мА і г ОК о ОК шк ВКА ШО рек о вон КН ЕН КО й ше Ек Ко ие Ши и ЕН й ОНИ Он ЗІ УНН і а) ре В и в НН з окт нена кис Ме ТЕЧЕ Чі ножні сь петля пенні др їжак піно ніж касі неістот рфечіжн ноя я нотні нінс терні Він орні нд нд нінін ее пікс "ше нн нн нн ! 0: «НМУ в аналізі Ме14 -- пісня розведення (100 мг/м) БК й пер М КВ Мк КН Кн о ня 14 о жиє. З с . іму о о в о о о Б З й 1 по ен и нн е я Ко Я ще о ен . п Є ЗМочатковий часто 0000 ж 0 - Мавшшьня ши жд Я пк я В с п щ о с вс с ; КО шт Ен и А о п і. о по нон 5 ви Я с о щ й її й с ш Б пев КО Кк ВИЙ и Кф пи а в ж БА 5 а 0 ЕК КН . я с і Мн КУН В УНН я УА он аНи ТК р водив зве В ОК пижни 5. З в і. ше Ф (ФЮї о о 0 шо й що ли ож о ВН ОБУ ВН о Б ВИН з ооое: ШАВІЙ Бех ДК го о ВН Бе НН и п її Й а 0 Не о Щх 0 Б ше й | ск ВЕ о о. «ТУ уки В М: ШНй Зак Вей хе МНН З н В ОК В зов ВИН ГА я В 0. . й о а | їй. ОО. с до ЕК ВОК се ВИ хе пах АННИ кох НА о нон о. Се о ІА 1. й в. с и о ра і я ше Б 0-00 ше В Б де НИ сени ша : лож ях о кН ак щ Е КК М Ж о: НІВ ера хв у КО с ооо ВН ще о ЕН о ке ОЗ их БОБ КЕ ВОНИ вно НІНУ ОВ М с ШОВ Ріда Стляг) РІЗ) 0 Рі рРіа4-6 свза-6 3 Ср Став)

Фіг. 22 ее ноз нн вв сти діви вх жи, 131 ВЕССНМХ в аналізі Ме після розведення п Не розволення Об ммл ге о побу ВВЕШЕТ с п о с п Он с п у 3. 0. С пн 5. пк. ж о. с о - с 5 шина і. пн х с С с ! ще о . с с с с глПочатковий 3. КК г с с поні 0000 Кер я ня по о РА ї час с ! о с с чає с . - о с с с ша о с о 00000000 ря и х ОКХ о. в. ще сте с с і 5 п с п - се ЕОоОКе ин пк о. 5 г о. о ог о. с с у о. Ох сно ех и. с с. о. Ес с 0. с с 25 п п ах п. с п т ев о о. с с С. с В с с що с г о Еш В . нс її. ши 0 В що пн. - о ше и а ВН р А о ННЯ о

В . с. В що ВЕ 0 НН о Б . - 000 В 5 БЕ с 1 о . В с перо І: я о. ше о а пор в тя З ше ВИ в: п 5 Ве со ВО о 2 тій - пе 1. с Б | по о ще арх й 0! о с г все; В ОККО ЕВ я з КЕМЖЕ В хх ВИНая ки ОН й : п их о. щі 000 0 Б. 0 Ва. щ з 5 Ех 0 ОВО с НН В п щі ше й її 6 рг20-2 и 0 (в2о-3 нн ж " й 7

Фіг. 23 7 ЗЕ НМУ в аналізі М7 посил нот еінкн одекеникве 7 Туісля розведення (100 м сіна нн онн в Б її УКВ й по Ммглма) ЗВОДУ КПК ЕК Я в КК і тє ми о : с о. о кн хх х я КВ кору М Ох х я 5 о. Я п і с не ме а Од ще ЕКОН пня ВО зро ЕХ МД ся сне А я жа і о я . с с о в и о с о и с . ж ШІ с -- с її. - Ж В Ох с Би о. о о о що о о Ма А пе Кк по о пу вн, З ш о 0 о 000 В. с щ ші с о в. с щ си по На ло я У ее ЗК Я С УКХ СА: МО г й Ко ї с та о. с 0 00 ОВ с : | п і. . о ся п 0! Бя її . де: ще с: ВН о око ВВ що ОК КО О Ой пи о с о КО с шщ. ш. и ще о 0 Я ГГ. с схов с о 1 . с о с Ж С Ех р ОККО о ОО шщи 0. с: Ко пт 0. о ши ДФ (ДФ "ГіПочатковий В. с пи о ВИШ НМ У ДУ КУ Кей й татка З зи Ах Хе ану ЯоЕе й о о. . її. о я Мч ий час В с ше с кл ЕОР, зоерігання пре: о Я о п . с . о ПО й ТЯГОМ 37 я і жахе МЕ БМК З З с СУБ ОР, збері днів при УЧ п вх ВЕБНЕНКІ с А ЕЩОР, зберіганн і й о о свити в г о; З о ох дя ти Я протягом 37 пої й Ко У о ол п по пеккор вв ші

0. 000 ше я с тут і .- 5 пеки МАЕ ЗУ ХЕ ду вх а ку Ріг І с тоб» о Я Ріг шо Сс Фіг М п іг. 24

Ге зник пив налу на нин вин руна нн нн нн ЗЕС-НМУ в аназізі МБ20--- бісля розвелення (100 мг/мл) о С Е: о ИЯ в ПОошономамсс: сового мо Е М во о о конк Осно кено с |! дн в вн нн А о о она с: с и с щ с с Мі ЕК пи нн КВН ви. о со | що і 0000 0: с шо ж: охо НІ о В мето С ВЕ ОК хо НН |. к-т її, її Її їх с ВАНЯ ст оно З ВН п А ее в ее ВН до ШЕ ПК т - 1 - ! ЕД ДО й с с в я с с а с 5 о. ик «В Б Помн ЗКК ВНН ее ВІН я о Се МКК п й НК Ву и А- в ННЦ ТТ г 0 (й. 00000000 сПочатковни вас з о 000 й В о с Б я з ХО Я ик КСВ. не пе ВА НА ВхУХ ХЕ пе РИ З в щі под . В ва с п . с ЕЗОР, зберігання протягом Р місяжк при 5

3 г. по М | ш. | гг с ЕОР. зберігання протягом» місяців при 20 Ж о НН Ок к НИН ККО сс в НННЕ КН косжокоу с реко ев я її (ДЦ. | З ( ФЮ(В і й он Ковш КК шо м ков Р20-1 ргоа-2 РОЗ рга-а рага-5 Фіс 25 Фігура 25. Гістидин. НЦитрат Ффесфат Ттів в з І 55,7 вББ ВВ. шо . се в; БЕ;Й : у; я 55 й : Ба. о :4 Ї ся ке ББх Бу 5 вва 55 в т Би ВН вв. ОП паз й де ваї п в і с 85 Е з І щі. й 4 св В вів ва І. Пе КІ | 5 й Но т Е 51 Й не З ЩО й і: І ! ва, | ще Кх | Я і 5 5 У. ще ня я В - шк ОК І. ї ! та жує шк В З: Й ка за Ї у З ї 5 ие ЩІ! 1 І ї. ЩЕ Я ОВ Кі Еш ши шшш . ш: 5 БрОБВ шк ЩЕ ж шш ж. і : пе вві В ше й В НЕ - ШЕ: Ор ІНШ: Ш ОО ши шшщ І Е вої В БИ В ; в Ж Ж АВ шо ще СЕ : Я ЕЕ і й нн І ! ще 53 В ж ж шо : г І Я в І ЕЕ не пуереволяли с 1 уке вк ШО Як ШЕ ШЕ ши ШО АК Як | я ПИ ех АНА МОВА ИЙ ИН В. ка а і В В ка ня ка Ше м В В В в В В о у. 5 З Состав В Ге-м

Фігура 27 ШЕ соди НИ ШК 000 Шо Й, пе ар й й поси НН М о НЕ о ще 7 ув нн у су ЯН Ко МН Ку. З НИ ки в В зо сь шо МО НН в, ШК сен й ЗЕНИЕЖЕР. То ТУ я шо Й Ж Гістидин, КТ Сукциннат, ЗУЄ Фігура А Щ АНММ прис ШІ Чає(гедо) 150 Ві: тістичнн, | Еталонний сітах 10 ви 6,6 .156597-НВОї6 о бо 06 ав 03 | Б 72 06 1,0 їй а З.

ї. 5 у езаннне и ще ки -7е Й п я п тив пед Укііжетхкіюю їй сТКИТуТиян 5. сени и НО нн Не я ще | ів'ям, рН є ше и: 7 пт т що уд Гж Еталонний склад бос зі ня що об о їх ще ко хехвунві-є мон а й що р: ув Те киш у се пан Ю 45 ен пн ; бу ! й їв) 20 ча во во хво 120 за тво їх Час(год.)

Фігура 258 НМ прик й Час (годі 163 А: нитрат, 1635: фосфат, (105 82: фосфат, Еталонний им, вн ев | ШЮиМм, вн бе їм, ри 70 склад 156507» нео г 0; 00 00 90 24 46 Як 5,3 5,й Бу 8,8 82 57 оо р інд пуд студкнн ни п каддокостннстттет пічні нн т постити чно т тності нні окт пет окт як ? Б Гей вс я фі вра таку орки мя ки аа и раки фо А и ек ЖК дллакаакиііі ЦИ. 001100 о дллууучіляця І т Е ен Он и в и я я ч ів 1: я ук о о А КК о с око о ІНН ав ж во ан с цитрат я В о ОК В пи АНА КЄ Е тк Ше о ин нив нудні ОВ Ї

Ж. п и В в в КН Е - до НО и кН повіту г у йо бортові и і І Т163 Ві:сфосфат, Сни НИ дже в Яракж ери ди а я и 10 мМ рн єв Ин и о пише! В а тс ут са вий фо пес НЕ ОК окт ВН 1 з з в оейа ЕТ Ви: фосфат, Жоз а ПЛ оди но Но о в НІ г ст БП а 1 ЯМ вЕСТЯ Я о с на щшОщЩИ о весен нат ен ни нн Еталонани і рей ев он сни И М Я зар І ш ле онов нн но вв нн ня склад 156597. й НК о в и НИ В Де В шен ВИН о 10 20 зв 40 ща ї Час(кола Ї СЕ Є « Фігура 78С а ПМ при КТ Час(гоз) 17 А: Тв, 173 А: Ти, Ечталенний жМм, рН 7 ім, вНТЯ склад 156597 но ЕІ о о 00. 24 32 З 3. 4 785 7 ТО ок ц рн в и в и т і п а м п а а а а в ш ви | ук : п- Н ж ї жо кон и их я : кт и і - Ї т дн ї ран а фон тіжтля тт тт тож пов от сх хто пня Я палки ні. ї Й 7 шк їй у: | оре аа МА АКТ, ОО В Ва фр Ин ів мМ, ! сля ! зх ! ЗЕ | прик не АЖОСТИВО ва КОТ пунш де помп по п пт піна тів Й Н ї й До ! Ева я Мире я

2.4 Ї г Денне с : - : Кталовнний й г м певен шо яв Ї І Е склад 156597 Ор Нод-ві ' Щодо веління ні роктнніннве епі нні хе . 4 В ах Як І 18 БеІВ БВ а 5 Є: кчЧрасгол виш п ІА !

Фігура 29 й ; що вна ї щи рН 6,8 рН 7 ШИ вб,5 т рН !

!

Б. І 5,7 55,7 5 вві 65,5 се ДК 55,5 "к шани не І ши: бе ше ше . з 55 І же ОК я и: о е- її ик ЗИНе ЗеНе о. . т ех с ї кю ДІ рекет тих у я: щих СЕЕАжЕ ним тв м с шо ; и етя р ее 51 І Мовні Бик ти» о БА МО Сея ет що |і ; жо ши вило ДАНУ і : | КЕ їз і З Соня ТЕ Є я п ох У. вз 1 НИ Й і ШИ о. 187 ві 187 де 187 Аз ІА Еталовний Склад склад Фігура 30 І АнНМунри КІ Час (год) | І87АНіІ 1874 1 І187АЗ: | 187 АЖ | Еталонний вн, вн 68 в ло | вна жхкнад 1- : ШИ с АНнюв-0о5 о | 0 0 о 0.0 Ба 16 | 28 М т | а 7т.8 24 | я 40 З 3 ВВ зо 5.8 5 5 491. 5,6 5 кв ї ниви ви в нд ВВ он ВН в : г Яд бе го он о Й ен Тоня с Тх що пи и. т, Не ії ве пе шо оо о АК ни ке ТА Е Ж 38 ен пет ше ше - й Вк дних пт й лют лю Ин пе іш в й Шо т паю а нн НЕ рН 7 ж 4. ія Вк ні БЖ си ЗИ я їх пет Я - т К» пк о сей нт, «клад ТЯ Е о тю 20 за 40 іобоб-я с Час (гол

Фігура 31 62,0. ! ; : ; Беру Б Еррат тра : Фосфатг, Фосфат, Цитрат, ЦПитрат, Цитрат, : сть в СДИ | й ! 65 іЗмМ 525мМ 52я3мМ їлямМ М : ії 56.0 сб 4 ре; 5. ОН вк Б о п п о п ше.

5 . . і г .

Фе... 550 г п її г й . ії В ен Ох вин КО БО М. ше шщ-- ше ш- ше ше що ї Ка КЕОККН Не Кок ЕК о З ! ваві с о п: п. 5 о. що | її. о ча с о о. - о. я ва Ку ГО Ти КБ Кк що й у БК КОКеВЕ. п Те ех щ ше Я ОК КО Ти і С с Те Ми ВНЯ ЗЕ ПІСОК Ве еко ВОНА за: КО ВН ТИ 5 ше ки МО с З п ЯК Коко БТкНЯ МК шк ВЗ 530: ох ЩІ с ншше Ше щи - шшк ши НЩ Склад склад І зліт ЛЕ: Фігура 32А і ШО І А НМУ при КТ Часто 1185 А) 35 С питрат 385 Ст пнірат. ЗВ СЯ: витрат, | Етанонний з - з Кк - лм БоБиМ їв мМ склад 185.13 0 Ж | бо йо 00 до ве! Зак 32 ЗИ Бл З. 48 70 У 7л І 63 72 ові. 1021 8 и 58 роман п а ВО ДВО НО ОО В - - ро Склади містять 72 ММ гліцину при він 6,8 й : ре | і я й і я. Я : я я со й і Як Я анна мк тан ння м М уст ум уку ку мл ПК Му конк і с) | кт йони : і щ ! Ше ОМ НН; х о они с-м, «ЗівкА «В й І ж Не ее Н х Н - | дон | ТКС: цнтра щк . с кедр В С кнкря - ей -й 185.0: двтва 8 Е ен ние о ни и шин ЕМ ї і ко | Ї жов ветрат; Бе Ї Ши | тм - т . г . . п. г. . -к | т ній Еталони ш І й М камяєю З ик шини а В на а на С ! ї З зо зо зо за Бо ва І во и Час(тода для ііі піт іт ттт тт т тіж ТАН НТ ті т тя пт НКТ т тт АТ Тіт Кіт т тт ііі тт тент іл енд пече кістажтіг

Фігура 328 г о АНММ при БТ Час(гол.) (18545 185 Ві: фосфат, | 187 ВУ; фосфат, | Еталюнний - рим що ми складі Іо 0 по бо 00. 24 3 40 3 ща І 8 7.0 7,5 ЩО 6. 2 98 104 11 98 Е з Склади містять 72 мМ гліннну при ПОД А

Ф. їз є серия нтекв ен нн нн ше Кей я ши с ДУ НЕ А Нео ие НН ЕЕ жваво Я и ляум й а нина ення, гео сон нин : К ПН . м ПИ о СН НУ ою І; ви и уні ти ус жен Кказювний щ й в я ш ой ле ще НУ ко і Кк Часто) і

Фігтра 33 А У ДН І: іа з. : У ще г "і бу т - івс (геол) 155.1: фосфат | іа па: фосфат Еталонні -178мМ, с 75 мМ, Мас |складів5О ліпнини - ам 0-35 М | ; в ! о: по о м | 40. 52 32 48 | Ті а 68

53. І04 12,5 98 с о ЕНИТЕ КетИети п ооо т - Її Єклали мають рН 0.8 ке я че; 20 Кров реко со ик окис и Ан ко вн в с ВН ня во нести и р нн МН Я я щ она и а нн в не я ї я КИ КК ко МИ ВИ У ЖИ. : : сне овен А ен о не ік Зі: и : ОДИН Ко кн ув кн АН. дж Ж вон МВ я се ШК я дода що ее пр ня лк о Мк М, лін о жи Но о рн в ко в НД й : то а ки оо Як У с Сини ка мли ВиоНя Вл ОВ С я х іди: ж ПЕ ки пон В 8,5 замі : : НО а в М НК о Ся г : й Ся їб 5. Кв. 40 я во 70 БО; шо Час (гож) яю т я Фігура 34 споді прот АВМ НВ 0000 і1855А с 185А1 15581 15 185647 і8563 Бзалонний ! ! я - «росфат, сросфат, іЗекрат, Цитрат, «клад зрвмМ о плям зам 1з3л5мМ 1850 Глінцнн, Пукроза, Гліцин, Цукроза, Тліцин, Цукроза, ! Чис гож) ПДК Ще 72 мМ 2,4 им. за КО) ЦО ІРЖІ. КО по 00. о Од р ! 9 44 за 4,3 | 32 я 32 ! в Пк) У,8 7,8 3 | 7 Ас; 0-й 72 98 М НЕД ТЯ 101 159 ЕК