BR112015027193B1 - Formulações estáveis de anticorpo, seu uso e kit - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE ANTICORPO, SEU USO E KIT. A presente invenção refere-se formulações farmacêuticas estáveis de anticorpos, incluindo formulações liofilizadas, compreendendo um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 e um sistema de tamponamento, em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7 e em que a formulação possui baixa concentração de sal a fim de reduzir a força iônica da formulação. As formulações podem, opcionalmente, compreender ainda um tensoativo não iônico, um açúcar e/ou um agente estabilizante não iônico. As formulações podem ser utilizadas no tratamento de várias doenças.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção provê formulações farmacêuticas estáveis de anticorpos, incluindo formulações liofilizadas, compreendendo um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 e um sistema de tamponamento, em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7 e em que a formulação possui baixa concentração de sal a fim de reduzir a força iônica da formulação. As formulações podem, opcionalmente, compreender ainda um tensoativo não iônico, um açúcar e/ou um agente estabilizante não iônico. As formulações podem ser utilizadas no tratamento de várias doenças.

Antecedentes da invenção

[002] IL-4 e IL-13 são ambas citocinas terapeuticamente importantes com base em suas funções biológicas, e desempenham papéis essenciais em muitas doenças, incluindo asma (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vol. 5, 161-166). IL-4 demonstrou ser capaz de inibir doença autoimune e as duas, IL-4 e IL-13, demonstraram o potencial para intensificar respostas imunes antitumorais. Tendo em vista o seu envolvimento na patogênese de doenças alérgicas, os inibidores destas citocinas poderiam oferecer benefícios terapêuticos.

[003] Para que se possa desenvolver uma formulação farmacêutica contendo um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 adequada para a administração subcutânea, a concentração do anticorpo precisa ser próxima ou superior a 100 mg/mL. No entanto, muitas complicações podem surgir em tais concentrações elevadas, inclusive aumento da viscosidade, desvio do pH, mudança na cor da solução, e a formação de partículas visíveis e subvisíveis. A formulação do anticorpo torna-se mais complicada pelo fato de que este é altamente propenso à agregação em concentrações elevadas. Embora os anticorpos típicos normalmente formem agregados de elevado peso molecular (HMW) abaixo de 5% ao longo de um período de tempo de 4 anos a 5 °C, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 forma HMW a uma taxa entre 0,5-1% por hora a 25 °C, e de 0,1% por hora a 5 °C. De fato, esse anticorpo possui uma propensão tão forte para se agregar que não se consegue formulá-lo em um líquido na faixa pretendida de concentração. Finalmente, o anticorpo biespecífico anti-IL4/anti-IL13 possui um ponto isoelétrico especialmente baixo, tornado a formulação mais difícil por questões de solubilidade. Por exemplo, o anticorpo biespecífico anti-IL4/anti-IL13 possui um ponto isoelétrico entre 5,8 e 6,2, enquanto que, na maioria dos anticorpos, o ponto isoelétrico é entre 8 e 10.

[004] Consequentemente, há necessidade de formulações farmacêuticas melhoradas e estáveis que possam abordar essas complicações.

Sumário da invenção

[005] Visando atender a estas e a outras necessidades, a presente invenção provê formulações altamente estáveis de anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13. Surpreendentemente, foram descobertas formulações altamente estáveis de anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 na forma de líquidos e pós liofilizados, que compreendem um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 e um sistema de tamponamento, em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7 em que a formulação possui baixa concentração de sal a fim de reduzir a força iônica da formulação. As formulações podem, opcionalmente, compreender ainda um tensoativo não iônico, um açúcar e/ou um agente estabilizante não iônico. Essas formulações são melhores do que as formulações convencionais, que frequentemente levam à agregação molecular (HMW) do anticorpo à medida que a concentração do anticorpo aumenta na formulação e à formação de partículas visíveis e subvisíveis. Especificamente, as formulações da invenção exibem boa estabilidade no que diz respeito a partículas visíveis, partículas subvisíveis, proteínas de baixo peso molecular e proteínas de elevado peso molecular.

[006] Uma modalidade da invenção provê uma formulação estável de anticorpo compreendendo: um anticorpo biespecífico anti- IL-4/anti-IL-13, ou seu fragmento de ligação a antígeno, compreendendo uma cadeia leve da fórmula VL1-ligante (linker)-VL2 e uma cadeia pesada da fórmula VH1-ligante-VH2, em que VL1 e VH1 formam um domínio de ligação a antígeno de IL-13 e VL2 e VH2 formam um domínio de ligação a antígeno de IL-4; e um sistema de tamponamento adequado para manter o pH da formulação em aproximadamente pH 7; e em que a formulação possui baixa concentração de sal a fim de reduzir a força iônica da formulação.

[007] Em modalidades específicas, VL1 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 1; VH1 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 2; VL2 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 3; e VH2 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 4 ou 5. Em modalidades específicas alternativas, VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; VH1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; VL2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e VH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 5.

[008] Em modalidades específicas, a cadeia leve compreende a fórmula N-VL1-ligante-VL2-CL, em que CL é um domínio constante da cadeia leve de um anticorpo, e em que a cadeia pesada compreende a fórmula N-VH1-ligante-VH2-CH1-CH2-CH3, em que CH2-CH3 corresponde ao domínio Fc de um anticorpo. Em modalidades específicas, o ligante (elemento de ligação) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[009] Em modalidades específicas, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio de região constante. Em modalidades específicas, o domínio de região constante é selecionado a partir do grupo constituído por CH1, CH2, CH3 e CL.

[0010] Em modalidades específicas, o anticorpo biespecífico, ou seu fragmento de ligação a antígeno, é um anticorpo biespecífico IgG4 humanizado, ou seu fragmento de ligação a antígeno.

[0011] Em modalidades específicas, a concentração de anticorpo ou de seu fragmento de ligação a antígeno é cerca de 100 mg/mL.

[0012] Em certas modalidades da invenção, o sistema de tamponamento compreende ao menos dois tampões. Em modalidades específicas, a concentração do sistema de tamponamento é cerca de 10 mM. Em modalidades específicas, p sistema de tamponamento compreende o tampão Tris e o tampão Fosfato. Em modalidades específicas, a concentração do tampão Tris é de aproximadamente 3,7 mM. Em modalidades específicas, a concentração do tampão Fosfato é de aproximadamente 6,3 mM. Em modalidades específicas, a concentração do tampão Tris é de aproximadamente 3,7 mM e a concentração do tampão Fosfato é de aproximadamente 6,3 mM.

[0013] Em certas modalidades da invenção, a formulação compreende ainda um tensoativo não iônico. Em modalidades específicas, a concentração do tensoativo não iônico é de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,2% (p/v). Em modalidades específicas, o tensoativo não iônico é um polissorbato. Em modalidades específicas, o polissorbato é polissorbato 80. Em modalidades específicas, a concentração do polissorbato 80 é de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,2% (p/v). Em modalidades específicas, a concentração de polissorbato 80 é de aproximadamente 0,2% (p/v).

[0014] Em certas modalidades da invenção, a formulação compreende ainda um açúcar. Em modalidades específicas, a concentração do açúcar é de aproximadamente 5% (p/v). Em modalidades específicas, o açúcar é um dissacarídeo. Em modalidades específicas, o dissacarídeo é sacarose. Em modalidades específicas, a concentração de sacarose é de aproximadamente 5% (p/v).

[0015] Em certas modalidades da invenção, a formulação compreende ainda um agente estabilizante não iônico. Em modalidades específicas, a concentração do agente estabilizante não iônico concentração é de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (p/v). Em modalidades específicas, o agente estabilizante não iônico é um aminoácido ou um açúcar. Em modalidades específicas, o aminoácido é prolina. Em modalidades específicas, o açúcar é manitol. Em modalidades específicas, a concentração de prolina é de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (p/v). Em modalidades específicas, a concentração de prolina é de aproximadamente 3% (p/v). Em modalidades específicas, a concentração de manitol é de aproximadamente 3% (p/v).

[0016] Em certas modalidades da invenção, a formulação é uma formulação liofilizada.

[0017] Em certas modalidades da invenção, a formulação exibe boa estabilidade no que diz respeito a partículas visíveis, partículas subvisíveis, proteínas de baixo peso molecular e proteínas de elevado peso molecular.

[0018] Uma modalidade da invenção provê uma formulação liofilizada estável de anticorpo compreendendo: cerca de 100 mg/mL de um anticorpo biespecífico ou de seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3; cerca de 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende uma concentração de tampão Tris de aproximadamente 3,7 mM e uma concentração de tampão Fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2% (p/v) de polissorbato 80; aproximadamente 5% (p/v) de sacarose; e aproximadamente 3% (p/v) de prolina; em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7.

[0019] Uma modalidade da invenção provê a formulação liofilizada estável de anticorpo compreendendo: cerca de 100 mg/mL de um anticorpo biespecífico ou de seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3; cerca de 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende uma concentração de tampão Tris de aproximadamente 3,7 mM e uma concentração de tampão Fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2% (p/v) de polissorbato 80; aproximadamente 5% (p/v) de sacarose; e aproximadamente 3% (p/v) de manitol; em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7.

[0020] Uma modalidade da invenção provê um kit contendo um recipiente compreendendo uma formulação da invenção e instruções para a administração e o uso da formulação.

[0021] Uma modalidade da invenção provê um método para tratar uma doença alérgica, câncer, asma, uma doença associada com produção anormal de IL-4 e/ou IL-13 ou uma doença associada com uma resposta elevada mediada por TH-2, compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade desse tratamento uma formulação da invenção.

Descrição resumida dos desenhos

[0022] A Figura 1 é um desenho esquemático mostrando uma molécula exemplar do anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, compreendendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. As duas cadeias leves compreendem a porção N-VLhB-B13-ligante-VLh8D4-8-CL-C, e as duas cadeias pesadas compreendem a porção N-VHhB-B13-ligante- VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C. A sequência do ligante compreende (G4S)2 ou GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6).

[0023] A Figura 2 ilustra as sequências de aminoácidos de um anticorpo exemplar, ou seja, os domínios variáveis humanizados do anticorpo anti-IL-13 B-B13 (SEQ ID NOS: 1 e 2) os domínios variáveis humanizados do anticorpo anti-IL4 8D4-8 (SEQ ID NOS: 3, 4 e 5). O sublinhado indica as mudanças feitas em aminoácidos. O negrito indica as sequências de CDR (SEQ ID NOS: 7-21).

[0024] A Figura 3 é um grupo de fotografias mostrando a contaminação por partículas no ensaio no P5 (rastreamento de tampões do pH) após estresse por agitação mecânica.

[0025] A Figura 4 é um gráfico mostrando a contaminação por partículas subvisíveis >1,5 µm após diversos estresses no ensaio no P6 (rastreamento de tampões do pH).

[0026] A Figura 5 é um gráfico mostrando a contaminação por partículas subvisíveis >10 µm após diversos estresses no ensaio no P6 (rastreamento de tampões do pH).

[0027] A Figura 6 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P6 (rastreamento de tampões do pH) após estresse térmico.

[0028] A Figura 7 é um gráfico mostrando cromatogramas por SEC do ensaio no P5 (rastreamento de tampões do pH) após 2 semanas a 45 °C.

[0029] A Figura 8 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE do ensaio no P5 (rastreamento de tampões do pH) após 2 semanas a 45 °C.

[0030] A Figura 9 é uma fotografia de um gel de IEF após 2 semanas a 45 °C do ensaio no P5 e 6 (rastreamento de tampões do pH).

[0031] A Figura 10 é um gráfico mostrando o nível de HMW após o programa de estresses sobre o ensaio no P13 (efeito do sal).

[0032] A Figura 11 mostra fotografias de imagens binoculares do ensaio no P12 (tensoativo) após estresse mecânico.

[0033] A Figura 12 é um gráfico mostrando o monitoramento de HMW para o ensaio no P12 (tensoativo) enquanto armazenado por 6 semanas a 5 °C.

[0034] A Figura 13 é um gráfico mostrando o monitoramento de HMW para o ensaio no P12 (aditivo) enquanto armazenado por 6 semanas a 5 °C.

[0035] A Figura 14 é um gráfico mostrando o monitoramento de HMW para o ensaio no P20-FDS (aditivo) enquanto armazenado por 4 semanas a 5 °C.

[0036] A Figura 15 é um gráfico mostrando o monitoramento de HMW para o ensaio no P21 (aditivo) enquanto armazenado por 2 semanas a 5 °C.

[0037] A Figura 16 é um gráfico do inverso do teor de monômero em função do tempo, comparando prolina 1% versus prolina 3% na formulação líder.

[0038] A Figura 17 é um gráfico seguindo a temperatura durante um processo de liofilização para a formulação no P16-1.

[0039] A Figura 18 mostra fotografias do bolo no P18-1 em um frasco de vidro moldado de 15 mL.

[0040] A Figura 19 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P14 (aditivo) após o processo de liofilização.

[0041] A Figura 20 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P20 (aditivo) após a liofilização.

[0042] A Figura 21 é um gráfico mostrando o nível de HMW (a) e fotografias (b) após um ciclo de congelamento/descongelamento em DS não formulado DS (ensaio no 9).

[0043] A Figura 22 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P14 (aditivo) após a reconstituição.

[0044] A Figura 23 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P20 (aditivo) após a reconstituição.

[0045] A Figura 24 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P17 (aditivo) após o armazenamento e a reconstituição do bolo.

[0046] A Figura 25 é um gráfico mostrando o nível de HMW no ensaio no P20 (aditivo) após o armazenamento e a reconstituição do bolo.

[0047] A Figura 26 é um gráfico mostrando os resultados de DSC para o primeiro rastreamento (ensaios no H04-150 a 172 - pH - rastreamento de tampões).

[0048] A Figura 27 mostra fotografias de um aspecto visual de formulações com Histidina e Succinato (ensaios no P-H04-144 e 148, no H04-150 A1 a A6).

[0049] A Figura 28 representa gráficos mostrando evoluções de HMW para o rastreamento de tampões a 5 °C (ensaios no H04-150 B1) e RT (ensaios no H04-163 A1, B1, B2 e H04-172 A1, A2) por SEC.

[0050] A Figura 29 é um gráfico mostrando os resultados de DSC para o rastreamento do pH em tampão Fosfato/Tris (ensaios no H04- 187).

[0051] A Figura 30 é um gráfico mostrando as evoluções de HMW para o rastreamento do pH em tampão Fosfato/Tris por SEC (ensaios no H04-187).

[0052] A Figura 31 é um gráfico mostrando os resultados de DSC para o rastreamento da concentração de tampões (ensaios no H04- 185).

[0053] A Figura 32 representa gráficos mostrando as evoluções de HMW com a concentração do tampão a RT por SEC (ensaios no H04- 185).

[0054] A Figura 33 é um gráfico mostrando as evoluções de HMW para NaCl a RT por SEC (ensaios no H04-185).

[0055] A Figura 34 é um quadro mostrando as evoluções de HMW para Glicina versusSacarose a RT por SEC (ensaios no H04-185). Descrição Detalhada

[0056] Esta invenção não se limita à metodologia, protocolos, linhagens celulares, vetores ou reatores especificamente aqui descritos, pois estes podem variar sem que, contudo, se desviem do espírito e alcance da invenção. Além disso, a terminologia usada neste relatório descritivo tem como fins exemplificar modalidades específicas somente e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção. Qualquer método e material similar ou equivalente àqueles aqui descritos podem ser utilizados na prática da presente invenção e, neste relatório descritivo, são descritos apenas métodos, dispositivos e materiais exemplares.

[0057] Todas as patentes e as publicações presentemente citadas são aqui incorporadas, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente para efeitos de descrever e revelar as proteínas, enzimas, vetores, células hospedeiras e metodologias aqui relatados que poderiam ser utilizados com e na presente invenção. Contudo, nada aqui contido deverá ser interpretado como admissão de que a invenção não tenha o direito de anteceder tal divulgação em virtude de invenção anterior.

A. Definições

[0058] A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório descritivo têm o mesmo significativo como são comumente entendidos pelo técnico no assunto.

[0059] Note-se que, quando usadas neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas no singular "um", "um", "o" e "a" também incluem a referência no plural, a menos que o contexto indique nitidamente o contrário.

[0060] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de 10% e mais preferivelmente dentro de 5% (ou igual ou menos de 1%) de um dado valor ou faixa.

[0061] Os termos "administrar" ou "administração" referem-se ao ato de injetar ou de outra forma liberar fisicamente uma substância como existe fora do corpo (por exemplo, uma formulação da invenção) em um paciente, tal como liberação através da mucosa, intradérmica, intravenosa, subcutânea, intramuscular e/ou qualquer outro método de liberação física aqui descrito ou conhecido na técnica. Quando uma doença, ou seu sintoma, está sendo tratada, a administração da substância tipicamente ocorre após o aparecimento da doença ou de seus sintomas. Quando uma doença ou seus sintomas estão sendo prevenidos, a administração da substância tipicamente ocorre antes do aparecimento da doença ou de seus sintomas.

[0062] No contexto de um polipeptídeo, o termo "análogo" refere- se a um polipeptídeo que possui uma função similar ou idêntica à de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um epítopo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou de um anticorpo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13, mas que, porém, não compreende necessariamente uma sequência de aminoácidos similar ou idêntica à de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um epítopo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13 ou de um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, ou que possui uma estrutura similar ou idêntica à de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um epítopo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13 ou de um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. Um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos similar refere- se a um polipeptídeo que satisfaz ao menos uma das condições seguintes: (a) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% e de preferência pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou ainda mais preferivelmente pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-5), de um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um epítopo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou de um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 aqui descritos; (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, de um epítopo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou de um anticorpo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13 (ou sua região VH ou VL) aqui descritos contendo pelo menos 5 resíduos de aminoácidos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos, pelo menos 60 amino resíduos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 150 resíduos de aminoácidos (ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); e (c) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% e de preferência pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou ainda mais preferivelmente pelo menos 99% idêntica à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, um epítopo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (ou sua região VH ou VL) aqui descritos. Um polipeptídeo com estrutura similar à de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti- IL-4/anti-IL-13, um epítopo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 refere-se a um polipeptídeo com uma estrutura secundária, terciária ou quaternária similar à de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, um fragmento de um polipeptídeo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, um epítopo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. A estrutura de um polipeptídeo pode ser determinada por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo, entre outros, cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e análise cristalográfica por microscopia eletrônica.

[0063] Para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, gaps (lacunas) podem ser introduzidos na sequência de um a primeira sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico para o alinhamento ideal com uma sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições correspondentes de aminoácido ou nucleotídeo são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que na posição correspondente da segunda sequência, então, as moléculas são idênticas naquela posição. O percentual de identidade entre as duas sequências é em função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % de identidade = número de posições sobrepostas idênticas/ número total de posições X 100%). Em uma modalidade, as duas sequências são do mesmo comprimento.

[0064] A determinação do percentual de identidade entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácidos ou sequências de ácido nucleico) pode também ser realizada utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268, modificado em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotídeos pelo BLAST podem ser realizadas com o conjunto de parâmetros do programa NBLAST para nucleotídeos, por exemplo, para pontuação = 100, comprimento de palavra =12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico de interesse. As pesquisas de proteínas pelo BLAST podem ser realizadas com o conjunto de parâmetros do programa XBLAST, por exemplo, para pontuação 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas à molécula de uma proteína de interesse. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402. Alternativamente, PSI BLAST pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Quando se utiliza os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI Blast, podem ser empregados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) (ver, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) na rede mundial em www.ncb.nlm.nih.gov). Outro exemplo preferido não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que integra o pacato de softwares de alinhamentos de sequência GCG. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, pode-se empregar uma tabela PAM120 do peso de resíduos PAM120, uma penalidade por comprimento de gap igual a 12 e uma penalidade por gap de a 4.

[0065] O percentual de identidade entre duas sequências pode ser determinado utilizando técnicas semelhantes àquelas descritas acima, com permissão ou não de lacunas. No cálculo do percentual de identidade, tipicamente somente correspondências exatas são contadas.

[0066] Um "antagonista" ou "inibidor" refere-se a uma molécula capaz de inibir uma ou mais atividades biológicas de uma molécula alvo, tal como a sinalização por IL-4 e/ou IL-13. Os antagonistas podem com a ligação de um receptor a um ligante e vice-versa, ao incapacitarem ou eliminarem células ativadas por um ligante e/ou ao interferirem com a ativação do receptor ou do ligante (por exemplo, ativação de tirosina quinase) ou com a transdução de sinais após a ligação do ligante a um receptor. O antagonista pode bloquear completamente as interações receptor-ligante ou pode reduzir substancialmente tais interações. Em certas modalidades da invenção, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 são anticorpos humanizados biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 antagonistas, de preferência, anticorpos monoclonais humanizados biespecíficos anti- IL-4/anti-IL-13 antagonistas.

[0067] Os termos "anticorpo", "imunoglobulina" ou "Ig" podem ser usados alternadamente neste relatório descritivo. O termo anticorpo inclui, entre outros, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos por recombinação, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intrabodies, Fvs de cadeia única (scFv) (por exemplo, incluindo monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticorpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos precedentes. Especificamente, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulinas e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulinas, ou seja, domínios de ligação a antígeno ou moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente a um antígeno de IL-4 ou IL-13 (por exemplo, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti- IL-13). Os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Em modalidades preferidas, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 são humanizados, tais como anticorpos monoclonais humanizados biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 são anticorpos IgG, anticorpos IgG4 humana.

[0068] O termo "antígeno"refere-se a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada pelos anticorpos da presente invenção. Um antígeno pode ter um ou mais de um epítopo. Os exemplos de antígenos reconhecidos pelos anticorpos da presente invenção incluem, entre outros, proteínas séricas, por exemplo, citocinas como IL-4, IL5, IL9 e IL-13, peptídeos bioativos, moléculas da superfície celular, por exemplo, receptores, transportadores ou canais iônicos, proteínas virais e bacterianas.

[0069] O termo "sítio de ligação a antígeno"refere-se à parte do anticorpo que compreende a área que se liga especificamente e é complementar à parte ou à totalidade de um antígeno. Quando um antígeno é grande, um anticorpo pode somente ligar-se a uma determinada parte do antígeno e que é denominada epítopo. Um domínio de ligação a antígeno pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis do anticorpo. De preferência, um domínio de ligação a antígeno é criado pela associação de um domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo.

[0070] O termo "agente de ligação"significa qualquer molécula, como um anticorpo, um siRNA, um ácido nucleico, um aptâmero, uma proteína ou um composto orgânico molecular pequeno, que se liga ou se liga especificamente a IL-4 e/ou IL-13, ou uma de suas variantes ou fragmentos.

[0071] Os termos "anticorpo biespecífico"ou "anticorpos biespecíficos (BsAbs)" referem-se a moléculas que combinam os sítios de ligação a antígeno de dois anticorpos dentro de uma única molécula. Assim, um anticorpo biespecífico é capaz de se ligar a dois antígenos diferentes simultaneamente. Além de aplicações para fins diagnósticos, os BsAbs abrem o caminho para novas aplicações terapêuticas ao redirecionarem sistemas efetores potentes para áreas doentes ou aumentando ou estimulando atividades neutralizantes dos anticorpos. Os anticorpos biespecíficos podem ser monoclonais, mas são de preferência humanos ou humanizados. Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são bem conhecidos na técnica.

[0072] O termo "subproduto" inclui produtos indesejados, que impedem ou diminuem a proporção do agente de ligação terapêutico/profilático, como um anticorpo, em uma dada formulação. Por exemplo, os subprodutos típicos incluem agregados do anticorpo, fragmentos do anticorpo, por exemplo, produzidos pela degradação do anticorpo por desamidação ou hidrólise, ou misturas destes. Tipicamente, os agregados são complexos com peso molecular superior ao do anticorpo em monômero. Os produtos de degradação de anticorpos podem incluir, por exemplo, fragmentos do anticorpo, por exemplo, ocasionados por desamidação ou hidrólise. Tipicamente, os produtos de degradação são complexos com peso molecular inferior ao do anticorpo em monômero. No caso de um anticorpo IgG, tais produtos de degradação são inferiores a cerca de 150 kD.

[0073] Os termos "composição"e "formulação"destinam-se a abranger um produto contendo os ingredientes especificados (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13), opcionalmente, nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados, opcionalmente, nas quantidades especificadas.

[0074] Os termos "região constante" ou "domínio constante" referem-se a uma porção carboxi terminal da cadeia leve e da pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno, porém que exibe várias funções efetoras, como a interação com o receptor Fc. Os termos referem-se à porção de uma molécula de imunoglobulina com uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação a antígeno. O domínio constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3 de uma cadeia pesada e o domínio CHL de uma cadeia leve.

[0075] O termo "transtorno" refere-se a qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com a formulação da presente invenção. O termo abrange transtornos ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero e, especificamente, humanos, ao transtorno em questão. Exemplos não limitantes de transtornos a serem tratados de acordo com a invenção incluem cânceres, inflamação, doenças autoimunes, infecções, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas.

[0076] O termo "epítopo"refere-se a uma região localizada sobre a superfície de um antígeno, como um polipeptídeo IL-4 ou IL-13 ou fragmento polipeptídico de IL-4 ou IL-13, que é capaz de ser ligado a uma ou mais regiões de ligação a antígeno de um agente de ligação, como um anticorpo, e que possui atividade antigênica ou imunogênica em um animal, de preferência um mamífero e mais preferivelmente em um humano, que é capaz de suscitar uma resposta imune. Um epítopo com atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídeo que suscita uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo com atividade antigênica é uma porção de um polipeptídeo à qual um anticorpo se liga, conforme determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, como um imunoensaio. Os epítopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos. Os epítopos habitualmente consistem em agrupamentos de moléculas com a superfície quimicamente ativa, tais como as cadeias laterais de aminoácidos ou de açúcares, e possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Uma região de um polipeptídeo contribuinte para um epítopo pode aminoácidos contíguos do polipeptídeo ou o epítopo pode resultar da união de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídeo. O epítopo pode ou não ser uma característica tridimensional na superfície do antígeno. Em certas modalidades, um epítopo de IL-4 ou IL-13 é uma característica tridimensional na superfície de um polipeptídeo IL-4 ou IL-13. Em outras modalidades, um epítopo de IL-4 ou IL-13 é uma característica linear de um polipeptídeo IL-4 ou IL-13. Os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 podem ligar-se especificamente a um epítopo da forma desnaturada de IL-4 ou IL-13, um epítopo da forma nativa de IL- 4 ou IL-13 ou ambas, da forma desnaturada e da forma nativa de IL-4 ou IL-13.

[0077] O termo "excipientes" refere-se a substâncias inertes que são comumente utilizadas como diluente, veículo, conservante, aglutinante, agente estabilizante, etc. para fármacos e incluem, entre outros, proteínas (por exemplo, albumina sérica, etc.), aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos graxos e fosfolipídios (por exemplo, alquil sulfonatos, caprilato, etc.), tensoativos (por exemplo, SDS, polissorbato, tensoativo não iônico, etc.), sacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose, trealose, etc.) e polióis (por exemplo, manitol, sorbitol, etc.). Ver, também, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa., cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

[0078] No contexto de um peptídeo ou polipeptídeo, o termo "fragmento" refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreende menos do que a sequência completa de aminoácidos. Tal fragmento pode surgir, por exemplo, de um truncamento na terminação amino, um truncamento na terminação carboxi e/ou de uma deleção interna de um ou mais resíduos da sequência de aminoácidos. Os fragmentos podem, por exemplo, resultar do splicing (processamento) alternativo do RNA ou da atividade in vivo de proteases. Em certas modalidades, os fragmentos hIL-4 ou hIL-13 incluem polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos ou pelo menos 250 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo IL-4 ou IL- 13 ou de um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo IL-4 ou IL-13.

[0079] As expressões e termos "fragmento, variante, derivado ou análogo funcional" e os semelhantes, bem como formas destes, de um anticorpo ou antígeno é um composto ou molécula com atividade biológica qualitativa em comum com o anticorpo ou o antígeno completo de interesse. Por exemplo, um fragmento ou análogo funcional de um anticorpo anti-IL-4 é aquele que consegue se ligar a uma molécula de IL-4 ou aquele que consegue impedir ou reduzir substancialmente a capacidade de um ligante ou de um anticorpo agonista ou antagonista de se ligar a IL-4.

[0080] O termo "cadeia pesada" quando usado em referência a um anticorpo refere-se a cinco tipos distintos, denominados alfa (a), delta (?), epsilon (e), gama (Y) e mu (µ), com base na sequência de aminoácidos de um domínio constante de cadeia pesada. Esses tipos distintos são bem conhecidos na técnica e dão origem a cinco classes de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, a saber IgG1, IgG1, IgG3 e IgG4. De preferência, uma cadeia pesada é uma cadeia pesada humana.

[0081] O termo "articulação (hinge)" ou "região de articulação" refere-se ao polipeptídeo flexível compreendendo os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínio constante de um anticorpo.

[0082] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação alvo de anticorpos) que contêm sequências derivadas de imunoglobulinas não humanas, quando comparadas a um anticorpo humano. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de um e, tipicamente, dois domínios variáveis, no qual todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência modelo de uma imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode também compreender uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela do modelo escolhido de imunoglobulina humana. Em geral, o objetivo é obter uma molécula de anticorpo que seja minimamente imunogênica em um humano. Assim, é possível que um ou mais aminoácidos em uma ou mais CDRs também possa ser mudada por outra que seja menos imunogênica para um hospedeiro humano, sem minimizar substancialmente a função de ligação específica da uma ou mais CDRs a IL-4 e/ou IL-13. Alternativamente, a região FR pode ser não humana, mas aqueles aminoácidos mais imunogênicos são substituídos por outros menos imunogênicos. Não obstante, o enxerto de CDR, como discutido acima, não é a única maneira para obter um anticorpo humanizado. Por exemplo, modificar apenas as regiões CDR pode ser insuficiente, pois não é incomum que resíduos do arcabouço (framework) participem na determinação da estrutura tridimensional das alças de CDR e na afinidade global do anticorpo por seu ligante. Consequentemente, qualquer meio pode ser praticado para que a molécula de anticorpo original não humana seja modificada para ser aquela menos imunogênica a um humano, e a identidade global da sequência com um anticorpo humano nem sempre é necessária. Assim, a humanização também pode ser conseguida, por exemplo, pela simples substituição de apenas poucos resíduos, especialmente aqueles que estão expostos na molécula do anticorpo e não encerrados dentro da molécula e, dessa forma, não facilmente acessíveis ao sistema imune do hospedeiro. Ver, por exemplo, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 e Patente U.S. No 5 869 619. Alternativamente, os anticorpos podem ser humanizados por outras técnicas, incluindo enxerto de CDR (EPO 0 239 400; WO 91/09967; e Patente U.S. Nos 5 530 101 e 5 585 089), veneering (folheamento) ou resurfacing (substituição superficial) (EPO 0 592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) e chain shuffling(empilhamento de cadeias) (Patente U.S. No 5 565 332). Anticorpos humanos podem ser criados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, métodos de apresentação em fagos, ver as Patentes Nos 4 444 887, 4 716 111, 5 545 806 e 5 814 318; e WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741, utilizando animais transgênicos, como roedores, utilizando células quiméricas e assim por diante.

[0083] "Interleucina-4" (IL-4) refere-se às proteínas IL-4 naturais ou endógenas de mamíferos e a proteínas com uma sequência de aminoácidos que é igual àquela de uma proteína IL-4 natural ou endógena do mamífero correspondente (por exemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (ou seja, produzidas utilizando os métodos de química orgânica sintética)). Dessa forma, conforme definido neste relatório descritivo, o termo inclui proteína IL-4 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas de uma IL-4, além de formas modificadas ou não das precedentes (por exemplo, transformadas com lipídios, glicosiladas). IL-4 natural ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem, como IL-4 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas e formas mutantes que ocorrem naturalmente em mamíferos (por exemplo, humanos, primatas não humanos). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de um fonte que produz naturalmente IL-4, por exemplo. Essas proteínas e proteínas, cuja sequência de aminoácidos é igual à de uma IL-4 natural ou endógena correspondente, recebem o nome do mamífero correspondente. Por exemplo, quando o mamífero correspondente é um humano, a proteína é designada como IL-4 humana. Diversas proteínas IL-4 mutantes são conhecidas na técnica, tais como aquelas descritas em WO 03/038041.

[0084] "Interleucina-13" (IL-13) refere-se a proteínas IL-13 mamíferas ou endógenas e a proteínas cuja sequência de aminoácidos é igual àquela de uma proteína de uma proteína IL-13 natural ou endógena do mamífero correspondente (por exemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (ou seja, produzidas utilizando os métodos de química orgânica sintética)). Dessa forma, conforme definido neste relatório descritivo, o termo inclui proteína IL- 13 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas de IL- 13 (por exemplo, produzidas por splicing alternativo ou outros processos celulares), além de formas modificadas ou não das precedentes (por exemplo, transformadas com lipídios, glicosiladas). IL-13 natural ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem, como IL- 13 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas e formas mutantes que ocorrem naturalmente em mamíferos (por exemplo, humanos, primatas não humanos). Por exemplo, neste relatório descritivo, IL-13 abrange a variante de IL-13 humana na qual Arg na posição 110 da IL-13 humana madura é substituída por Gin (a posição 110 da IL-13 madura corresponde à posição 130 da proteína precursora) que é associada com asma (asma atópica e não atópica) e outras variantes de IL-13. (Heinzmann el al, Hum MoI Genet. 9:549559 (2000)). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de uma fonte que produz naturalmente IL-13, por exemplo. Essas proteínas e proteínas cuja sequência de aminoácidos é igual à de uma IL-13 natural ou endógena correspondente recebem o nome do mamífero correspondente. Por exemplo, quando o mamífero correspondente é um humano, a proteína é designada como IL-13 humana. Diversas proteínas IL-13 mutantes são conhecidas na técnica, tais como aquelas descritas em WO 03/035847.

[0085] Um agente de ligação "isolado" ou "purificado", como um anticorpo, é substancialmente livre de material celular ou de outras proteínas contaminantes da fonte celular ou tecidual da qual o agente de ligação é derivado, ou substancialmente livre de precursores químicos ou de outras substâncias químicas quando sintetizado quimicamente. Por exemplo, a expressão "substancialmente livre de material celular" inclui preparados de um anticorpo nos quais o anticorpo é separado de componentes celulares das células a partir das quais este é isolado ou produzido por recombinação. Assim, um anticorpo que é substancialmente livre de material celular inclui preparados de anticorpo com menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína heteróloga (também designada neste relatório descritivo como "proteína contaminante"). Quando é produzido por recombinação, o anticorpo é também de preferência substancialmente livre do meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos de aproximadamente 20%, 10% ou 5% do volume do preparado proteico. Quando produzido por síntese química, o anticorpo é de preferência substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas, ou seja, é separado dos precursores químicos ou de outras substâncias químicas que estão envolvidos na síntese da proteína. Dessa forma, tais preparados do anticorpo possuem menos aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou compostos, excluindo o anticorpo de interesse. Em uma modalidade preferida, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 são isolados ou purificados.

[0086] O termo "numeração de Kabat" e termos semelhantes são reconhecidos na técnica e referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (ou seja, hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada e da leve de um anticorpo, ou de sua parte de ligação a antígeno (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382391 e Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH No 91-3242). Para uma região variável de cadeia pesada, a região hipervariável varia das posições 31 a 35 de aminoácidos para CDR1, posições 50 a 65 de aminoácidos para CDR2 e posições 95 a 102 de aminoácidos para CDR3. Para uma região variável de cadeia leve, a região hipervariável tipicamente varia das posições 24 a 34 de aminoácidos para CDR1, posições 50 a 56 de aminoácidos para CDR2 e posições 89 a 97 de aminoácidos para CDR3.

[0087] O termo "cadeia leve", quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a dois tipos distintos, denominados kappa (K) e lambda (À) com base na sequência de aminoácidos dos domínios constantes. Sequências de aminoácidos da cadeia leve são bem conhecidos na técnica. Em modalidades preferidas, uma cadeia leve é uma cadeia leve humana.

[0088] O termo "ligante" refere-se a uma molécula que conecta os domínios de ligação a antígeno do anticorpo. O ligante pode ser qualquer tipo de molécula de ligação. De preferência, o ligante é um polipeptídeo. Os ligantes podem ser iguais ou diferirem um do outro entre e dentro de uma cadeia pesada polipeptídica e uma cadeia leve polipeptídica. Além disso, o ligante pode ter um comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos. Uma unidade do peptídeo de ligação para domínios de cadeia pesada bem como para domínios de cadeia leve é (G4S)2, ou seja, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Os números de unidade do ligante de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve pode ser igual (ordem simétrica) ou diferir um do outro (ordem assimétrica). Um peptídeo de ligação é de preferência suficientemente longo para conferir um grau adequado de flexibilidade e impedir que as porções de ligação a antígeno interfiram com a atividade uma da outra, por exemplo, por impedimento estérico, para permitir o alinhamento apropriado da proteína e, se necessário, permitir que as moléculas do anticorpo interajam com dois ou mais receptores possivelmente bastante distanciados na mesma célula; contudo, o linkeré de preferência suficientemente curto para permitir que as porções do anticorpo permaneçam estáveis na célula. Portanto, o comprimento, a composição e/ou a conformação dos peptídeos de ligação podem ser facilmente pelo técnico no assunto a fim de aperfeiçoar as propriedades desejadas do anticorpo polivalente.

[0089] Os termos "baixo teor de sal" e "baixa concentração de sal" significam uma concentração relativamente baixa de sal igual ou inferior a 15 mM, incluindo uma concentração de sal igual a 0 ou nenhum sal. A concentração de sal é determinada pela quantidade de sais e tampões na formulação. É preferível que o sistema de tamponamento esteja presente nas formulações em uma concentração baixa, ou seja, próxima ou inferior a 15 mM, a fim de reduzir a força iônica das formulações. Alternativamente, algumas modalidades preferidas não contêm sal nem tampão. É também preferível que sais adicionais, como NaCl, não sejam acrescentados às formulações, a fim de manter a força iônica da formulações tão baixa quanto possível.

[0090] Os termos "controla", "controlar" e "controle" referem-se aos efeitos benéficos a um indivíduo, derivados de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), que não resulta em uma cura da infecção. Em certas modalidades, uma ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como uma formulação da invenção) são administradas a um indivíduo para "controlar" uma doença mediada por IL-4 ou IL-13 (por exemplo, cânceres, inflamação, doenças autoimunes, infecções, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas), um ou mais sintomas de seus sintomas, de modo a prevenir a progressão ou o agravamento da doença.

[0091] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos homogêneos ou substancialmente homogêneos, e cada anticorpo monoclonal reconhecerá tipicamente um único epítopo no antígeno. Em modalidades preferidas, um "anticorpo monoclonal"é um anticorpo produzido por um único hibridoma ou outra célula. O termo "monoclonal"não se limita a qualquer método específico para criar o anticorpo. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser criados pelo método do hibridoma como descrito em Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975) ou podem ser isolados de bibliotecas de fagos. Outros métodos para preparar linhagens celulares clonais e anticorpos monoclonais neles expressas são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, o Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002), quinta edição; Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York).

[0092] O termo "composição farmacêutica", como usado na presente invenção, refere-se a formulações de vários preparados. As formulações contendo quantidades terapeuticamente eficazes dos anticorpos são soluções líquidas estéreis, suspensões líquidas ou versões liofilizadas e opcionalmente contêm estabilizantes ou excipientes.

[0093] O termo "farmaceuticamente aceitável"significa ser aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou de um estadual, ou estar listado na Farmacopeia dos Estados Unidos, Farmacopeia Europeia ou outra Farmacopeia geralmente reconhecida para o uso em animais e, mais especificamente, em humanos.

[0094] "Excipiente farmaceuticamente aceitável", neste relatório descritivo, significa qualquer substância inerte que é combinada com uma molécula ativa, como um anticorpo monoclonal, para preparar uma forma farmacêutica agradável ou conveniente. O "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um excipiente que não é toxico a receptores nas doses e concentrações empregadas e é compatível com outros ingredientes da formulação compreendendo o anticorpo monoclonal.

[0095] Os termos "prevenir", "preveni" e "prevenção"referem-se à inibição total ou parcial do desenvolvimento, da recorrência, do aparecimento ou da disseminação de uma doença mediada por IL-4 ou IL-13 e/ou de um sintoma relacionado à doença, resultante da administração de uma terapia ou de terapias combinadas aqui (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos, tal como uma formulação da invenção).

[0096] O termo "agente profilático"refere-se a qualquer agente que pode inibir total ou parcialmente o desenvolvimento, a recorrência, o aparecimento ou a disseminação de uma doença mediada por IL-4 ou IL-13 e/ou de um sintoma relacionado à doença em um indivíduo. Em certas modalidades, o termo "agente profilático"refere-se a uma formulação da invenção. Em certas outras modalidades, o termo "agente profilático"refere-se a um agente que não seja uma formulação da invenção. De preferência, um agente profilático é um agente conhecido por ser útil ou que tenha sido ou esteja seja correntemente utilizado para prevenir uma doença mediada por IL-4 ou IL-13 - e/ou um sintoma relacionado à doença, ou para impedir o aparecimento, o desenvolvimento, a progressão e/ou a gravidade de uma doença mediada por IL-4 ou IL-13 e/ou de um sintoma relacionado à doença. Em modalidades específicas, o agente profilático é um anticorpo biespecífico humanizado anti-IL-4/anti-IL-13.

[0097] A expressão "anticorpo recombinante" inclui anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória recombinante de anticorpos humanos, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo ou vaca) que é transgênico e/ou transcromossômicos para genes de imunoglobulinas humanas (ver, por exemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências gênicas de imunoglobulinas humanas em outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas (ver Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e de Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH No 91-3242). Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Igs humanas é utilizado, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas a sequências da linhagem germinativa de VH e VL, podem não existir naturalmente dentro do repertório de anticorpos da linhagem germinativa in vivo.

[0098] O termo "sacarídeo" refere-se a uma classe de moléculas que são derivadas de alcoóis poli-hídricos. Os sacarídeos são comumente referidos como carboidratos e podem conter quantidades diferentes de unidades de açúcar (sacarídeo), por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.

[0099] Os termos "liga-se especificamente" ou "ligar-se especificamente" significa ligar-se especificamente a um antígeno ou seu fragmento e não se ligar especificamente a outros antígenos. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno pode ligar-se a outros peptídeos ou polipeptídeos com afinidade inferior, conforme determinado, por exemplo, por radioimunoensaios (RIA), ensaios imunoenzimáticos de absorção (ELISA), BIACORE ou outros ensaios conhecidos na técnica. Anticorpos ou suas variantes ou fragmentos que se ligam especificamente a um antígeno podem apresentar reatividade cruzada com antígenos relacionados. De preferência, os anticorpos ou suas variantes ou fragmentos que se ligam especificamente a um antígeno não apresentam reatividade cruzada com outros antígenos. Um anticorpo ou sua variante ou fragmento que se liga especificamente a um antígeno de IL-4 e/ou IL- 13 pode ser identificado, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore ou outras técnicas conhecidas pelos entendidos no assunto. Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos o dobro do sinal ou ruído de fundo e, mais tipicamente, acima de 10 vezes o emitido de fundo. Ver, por exemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, segunda edição, Raven Press, Nova York, nas páginas 332-336 para uma discussão referente à especificidade de anticorpos.

[00100] Uma formulação "estável"ou "estabilizada"é aquela na qual o agente de ligação, como um anticorpo, ali contido retém essencialmente a sua estabilidade física, identidade, integridade e/ou estabilidade química, identidade, integridade e/ou atividade biológica quando do armazenamento. Várias analíticas para aferir a estabilidade de proteínas estão disponíveis na técnica e são revisadas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser aferida a uma temperatura selecionada e em outras condições de armazenamento por um período de tempo selecionado. A estabilidade pode ser determinada por pelo menos um dos métodos selecionados a partir do grupo constituído por inspeção visual, SDS-PAGE, IEF, HPSEC, RFFIT e ELISA para kappa/lambda. Por exemplo, um anticorpo "retém sua estabilidade física"em uma formulação farmacêutica, se não mostrar sinais de agregação, precipitação e/ou desnaturação quando do exame visual da cor e/ou clareza, ou conforme aferida por dispersão de luz UV, SDS-PAGE ou por cromatografia de exclusão por tamanho (alta eficiência) (HPSEC). De preferência, quando as formulações da invenção são utilizadas, 5% ou menos, tipicamente 4% ou menos, preferivelmente 3% ou menos, mais preferivelmente 2% ou menos e especialmente 1% ou menos dos anticorpos formam agregados, conforme medidos por HPSEC ou qualquer outro método adequado para medir a formação de agregação. Por exemplo, um anticorpo é considerado estável em uma determinada formulação se o monômero do anticorpo tiver uma pureza de aproximadamente 90%, de preferência aproximadamente 95%, em particular de aproximadamente 98% após certo período predeterminado de tempo sob certas condições de armazenamento em uma determinada formulação. A estabilidade química pode ser avaliada detectando e quantificando formas quimicamente alteradas da proteína. A alteração química pode envolver modificação do tamanho (por exemplo, cortes), que pode ser avaliada utilizando (HP)SEC, SDS-PAGE e/ou espectrometria de massa acoplada à ionização por dessorção a laser/tempo de voo assistida por matriz (MALDI/TOF MS), por exemplo. Outros tipos de alteração química incluem alteração da carga (por exemplo, ocorrida como resultado de desamidação), que pode ser avaliada por cromatografia de troca iônica, por exemplo. Um anticorpo "retém sua atividade biológica"em uma formulação farmacêutica em um dado tempo, se a atividade biológica do anticorpo em um dado tempo é pelo menos cerca de 90% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada, conforme determinado em um ensaio de ligação a antígeno ou ensaio de neutralização viral, por exemplo.

[00101] Os termos "indivíduo"e "paciente"são usados alternadamente. Neste relatório descritivo, um indivíduo é de preferência um mamífero, tal como um não primata (por exemplo, vacas, suínos, cavalos, gatos, cães, ratos, etc.) ou um primata (por exemplo, macaco e humano), mais preferivelmente um humano. Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero, de preferência um humano, portador de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13. Em outra modalidade, o indivíduo é um mamífero, de preferência um humano, em risco de desenvolver uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13.

[00102] A expressão "substancialmente idêntica"com respeito a uma sequência polipeptídica da cadeia de um anticorpo pode ser interpretada como uma cadeia de anticorpo exibindo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência polipeptídica de referência. O termo com respeito a uma sequência de ácido nucleico pode ser interpretado como uma sequência de nucleotídeos exibindo pelo menos próximo ou acima de 85%, 90%, 95% ou 97% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de referência.

[00103] Variantes "de substituição" são aquelas que tiveram pelo menos um resíduo de aminoácido removido ou substituído em uma sequência nativa por um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição. As substituições podem ser únicas, em que somente um aminoácido na molécula é substituído, ou podem ser múltiplas, quando dois ou mais aminoácidos são substituídos na mesma molécula. As substituições plurais podem ser em sítios consecutivos. Além disso, um aminoácido pode ser substituído por resíduos plurais, em cujo caso uma variante compreende uma substituição e uma inserção. Variantes "de inserção" são aquelas com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido em uma determinada posição em uma sequência nativa. Imediatamente adjacente a um aminoácido significa conectado ao grupo funcional a-carboxila ou a-amino do aminoácido. Variantes "de deleção" são aquelas com um ou mais aminoácidos na sequência nativa de aminoácidos removidos. Ordinariamente, as variantes de deleção terão um ou dois aminoácidos excluídos em uma região específica da molécula.

[00104] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de uma terapia (por exemplo, uma formulação da invenção) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a gravidade e/ou a duração de uma dada doença e/ou de um sintoma relacionado à doença. Esse termo também abrange uma quantidade necessária para a redução ou melhora do avanço ou da progressão de uma dada doença, a redução ou melhora da recorrência, do desenvolvimento ou do aparecimento de uma dada doença e/ou melhorar ou intensificar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia (por exemplo, uma terapia que não seja uma formulação da invenção). Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção proporciona uma concentração local entre aproximadamente 5 e 20 ng/mL, e de preferência, entre aproximadamente 10 e 20 ng/mL. Em algumas modalidades, "quantidade terapeuticamente eficaz", neste relatório descritivo, também se refere à quantidade de um anticorpo da invenção para obter um resultado específico (por exemplo, inibição de uma citocina IL-4 e/ou IL-13).

[00105] O termo "agente terapêutico"refere-se a qualquer agente que pode ser utilizado no tratamento, controle ou na melhora de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 e/ou de um sintoma relacionado à doença. Em certas modalidades, o termo "agente terapêutico"refere- se a uma formulação da invenção. Em certas outras modalidades, o termo "agente terapêutico"refere-se a um agente excluindo uma formulação da invenção. De preferência, um agente terapêutico é um agente conhecido por ser útil ou que tenha sido ou seja correntemente utilizado para o tratamento, o controle ou a melhora de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 e/ou de um sintoma relacionado à doença.

[00106] O termo "terapia" refere-se a qualquer protocolo, método e/ou agente que pode ser utilizado na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, cânceres, inflamação, doenças autoimunes, infecções, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas). Em certas modalidades, os termos "terapias" e "terapia" referem-se a uma terapia biológica, terapia de apoio e/ou outras terapias úteis na prevenção, no controle, no tratamento e/ou na melhora de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13, conhecidas pelo técnico no assunto, tal como pessoas da área médica.

[00107] Os termos "trata", "tratamento" e "tratar" referem-se à redução ou à melhora da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, cânceres, inflamação, doenças autoimunes, infecções, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas) resultante da administração de uma ou mais terapias (incluindo, entre outras, a administração de um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos, tais como uma formulação da invenção).

[00108] Os termos "região variável"ou "domínio variável"referem- se a uma porção da cadeia leve e da pesada, tipicamente cerca de 120 a 130 aminoácidos na terminação amino, em uma cadeia pesada, e cerca de 100 a 110 aminoácidos em uma cadeia leve, cuja sequência difere extensamente entre os anticorpos e que são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular por seu antígeno em particular. A variabilidade na sequência é concentrada naquelas regiões denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), enquanto as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são denominadas regiões framework (arcabouço) (FR). As CDRs das cadeias leves e pesadas são responsáveis primariamente pela interação do anticorpo com o antígeno. A numeração das posições de aminoácidos é de acordo com o EU Index, como em Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, Washington, D.C.), 5a ed. ("Kabat et al."). Em modalidades preferidas, a região variável é uma região variável humana.

B. Formulações e componentes da formulação

[00109] Como informado previamente, as formulações da invenção compreendem um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 e um sistema de tamponamento, em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7 e em que a formulação possui baixa concentração de sal a fim de reduzir a força iônica da formulação. As formulações podem, opcionalmente, compreender ainda um tensoativo não iônico, um açúcar e/ou um agente estabilizante não iônico. As formulações da invenção demonstraram oferecer melhoras significativas sobre formulações prévias de anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13, as quais frequentemente levam à agregação molecular do anticorpo à medida que a concentração do anticorpo aumenta na formulação, e à formação de partículas visíveis e subvisíveis. Especificamente, as formulações da invenção exibem boa estabilidade no que diz respeito a partículas visíveis, partículas subvisíveis, proteínas de baixo peso molecular e proteínas de elevado peso molecular. i. Anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 e suas variantes e fragmentos

[00110] Em certas modalidades, as formulações da invenção incluem um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. O anticorpo biespecífico liga-se ou liga-se especificamente a IL-4 e/ou IL-13, ou variantes ou fragmentos destas. As moléculas de IL-4 e/ou IL-13 podem ser de qualquer espécie. De preferência, as moléculas de IL-4 e/ou IL-13 são de um humano. As sequências de aminoácidos e estruturas proteicas de ambas, IL-4 e IL-13, são bem conhecidas na técnica.

[00111] Em certas modalidades exemplares, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 é um anticorpo humanizado, um anticorpo inteiramente humano, ou uma variante deste ou seu fragmento de ligação a antígeno. Os anticorpos biespecíficos anti-IL- 4/anti-IL-13 preferidos impedem a ligação de IL-4 e IL-13 com seus receptores e inibem a atividade biológica de IL-4 e IL-13.

[00112] Em uma modalidade específica, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia leve (VL) que se liga a IL- 13, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (O sublinhado indica as mudanças feitas de aminoácidos. O negrito indica as CDRs; CDR1 é SEQ ID NO: 7 RASESVDSYGQSYMH; CDR2 é SEQ ID NO: 8 LASNLES; e CDR3 é SEQ ID NO: 9 QQNAEDSRT). Anti-IL13 hB-B13 VL3 (SEQ ID NO: 1): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT iscRASESVD SYGQSYMHWY QQKAGQPPKL LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVQAEDAATY YCQQNAEDSR TFGGGTKLEI K

[00113] Em uma modalidade específica, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que se liga a IL-13, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (O sublinhado indica as mudanças feitas de aminoácidos. O negrito indica as CDRs; CDR1 é SEQ ID NO: 10 GFSLTDSSIN; CDR2 é SEQ ID NO: 11 DGRID; e CDR3 é SEQ ID NO: 12 DGYFPYAMDF). Anti-IL13 hB-B13 VH2 (SEQ ID NO: 2): EVQLKESGPG LVAPGGSLSI TCTVSGFSLT DSSINWVRQP PGKGLEWLGM IWGDGRIDYA DALKSRLSIS KDSSKSQVFL EMTSLRTDDT ATYYCARDGY FPYAMDFWGQ GTSVTVSS

[00114] Em uma modalidade específica, p anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia leve (VL) que se liga a IL- 4, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (O sublinhado indica as mudanças feitas de aminoácidos. O negrito indica as CDRs; CDR1 é SEQ ID NO: 13 HASQNIDVWLS; CDR2 é SEQ ID NO: 14 KASNLHTG; CDR3 é SEQ ID NO: 15 QQAHSYPFT). Anti-IL4 h8D4-8 VL1 (SEQ ID NO: 3): DIQMTQSPAS LSVSVGDTIT LTCHASQNID VWLSWFQQKP GNIPKLLIYK ASNLHTGVPS RFSGSGSGTG FTLTISSLQP EDIATYYCQQ AHSYPFTFGG GTKLEIKR

[00115] Em uma modalidade específica, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que se liga a IL-4, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (O sublinhado indica as mudanças feitas de aminoácidos. O negrito indica as CDRs; CDR 1 é SEQ ID NO: 16 GYSFTSYWIH; CDR2 é SEQ ID NO: 17 IDPSDGETR; e CDR3 é SEQ ID NO: 18 LKEYGNYDSFYFDV). Anti-IL4h8D4-8 VH1 (SEQ ID NO: 4): QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYSFT SYWIHWIKQR PGQGLEWIGM IDPSDGETRL NQRFQGRATL TVDESTSTAY MQLRSPTSED SAVYYCTRLK EYGNYDSFYF DVWGAGTLVT VESA

[00116] Em outra modalidade específica, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que se liga a IL-4, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (O sublinhado indica as mudanças feitas de aminoácidos. O negrito indica as CDRs; CDR 1 é SEQ ID NO: 19 GYSFTSYWIH; CDR2 é SEQ ID NO: 20 IDASDGETR; e CDR3 é SEQ ID NO: 21 LKEYGNYDSFYFDV). Anti-IL4 h8D4-8 VH2 (SEQ ID NO: 5): QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYSFT SYWIHWIKQR PGQGLEWIGM IDASDGETRL NQRFQGRATL TVDESTSTAY MQLRSPTSED SAVYYCTRLK EYGNYDSFYF DVWGAGTLVT VSSA

[00117] Em algumas modalidades específicas, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-13, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável da cadeia leve que se liga IL-13 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00118] Em outras modalidades específicas, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-4, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e uma região variável da cadeia leve que se liga a IL-4 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[00119] Em ainda outras modalidades específicas, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-4, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma região variável da cadeia leve que se liga IL-4 incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[00120] Em modalidades mais específicas, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-13 e a IL-4, incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, ou 2 e 5; e uma região variável da cadeia leve que se liga a IL-13 e a IL-4 incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3.

[00121] Em uma modalidade mais específica, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 compreende uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-13 e a IL-4, incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4; e uma região variável da cadeia leve que se liga a IL-13 e a IL-4 incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3 (o "Anticorpo Líder"). Um desenho esquemático de uma modalidade do anticorpo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13 é mostrado na Figura 1, e regiões variáveis exemplares da cadeia pesada e da leve são mostradas na Figura 2. O peso molecular do Anticorpo Líder, conforme determinado por espectrometria de massa, é 198 kDa. O ponto isoelétrico do Anticorpo Líder, conforme determinado por focalização isoelétrica, varia entre 5,8 e 6,2.

[00122] Em modalidades alternativas mais específicas, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma cadeia leve da fórmula VL1-ligante-VL2 e uma cadeia pesada da fórmula VH1-ligante-VH2, em que VL1 e VH1 formam um domínio de ligação a antígeno de IL-4 e VL2 e VH2 formam um domínio de ligação a antígeno de IL-13. Em algumas modalidades, VL1 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 1; VH1 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 2; VL2 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 3; e VH2 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 4 ou 5. Em modalidades alternativas, VL2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; VH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e VH1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 5.

[00123] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um ligante entre os domínios de ligação a antígeno do anticorpo. O ligante pode ser qualquer tipo de molécula de ligação. De preferência, o liganteé um polipeptídeo. Os ligantes podem ser iguais ou diferentes um do outro entre e dentro de um polipeptídeo da cadeia pesada e um polipeptídeo da cadeia leve. Além disso, o ligante pode ter um comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos. Uma unidade preferida do peptídeo de ligação para domínios da cadeia pesada bem como para domínios da cadeia leve é (G4S)2, ou seja, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Mais preferivelmente, as SEQ ID NOs: 2 e 4 são unidas por um primeiro peptídeo de ligação, e as SEQ ID NOs: 1 e 3 são unidas por um segundo peptídeo, em que o primeiro e o segundo peptídeo de ligação compreendem, cada um destes, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Os números de unidades do ligante de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve podem ser iguais (ordem simétrica) ou diferirem entre si (ordem assimétrica). Um peptídeo de ligação é de preferência suficientemente longo para conferir um grau adequado de flexibilidade e impedir as porções de ligação a antígeno de interferirem com a atividade uma da outra, por exemplo, por impedimento estérico, para permitir o dobramento apropriado da proteína e, se necessário, permitir que as moléculas do anticorpo interajam com dois ou mais receptores possivelmente bastante distanciados na mesma célula; contudo, é de preferência suficientemente curto para permitir que as porções do anticorpo permaneçam estáveis na célula. Portanto, o comprimento, a composição e/ou a conformação dos peptídeos de ligação podem ser facilmente selecionados pelo técnico no assunto a fim de aperfeiçoar as propriedades desejadas do anticorpo polivalente.

[00124] Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo humanizado. Os exemplos de isotipos de anticorpo humanizado incluem IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. De preferência, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 é um anticorpo IgG. Há quatro formas de IgG. De preferência, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 é um anticorpo IgG4. Em uma modalidade mais preferida da invenção, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 é um anticorpo IgG4 humanizado.

[00125] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-IL- 4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende ainda uma região constante, por exemplo, CH1, CH2, CH3 e CL.

[00126] Certas modalidades de formulações da invenção também incluem variantes de anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 ou de seus fragmentos de ligação a antígeno. As variantes de anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 podem ter propriedades físico- químicas semelhantes com base em sua elevada similaridade e, portanto, estão também incluídas no âmbito da invenção. As variantes são definidas como anticorpos com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, por exemplo, pelo menos 98% ou 99% homóloga a anticorpos biespecíficos anti-IL- 4/anti-IL-13, e são capazes de competir pela ligação a um polipeptídeo IL-4 e/ou IL-13, um fragmento do polipeptídeo IL-4 e/ou IL-13 ou a um epítopo de IL-4 e/ou IL-13. De preferência, as variantes melhorarão, neutralizarão ou de outra forma inibirão a atividade biológica de IL-4 e/ou IL-13. A competição pela ligação ao alvo pode ser determinada por métodos rotineiros conhecidos pelo técnico no assunto. De preferência, as variantes are anticorpos humanos ou humanizados e, preferivelmente, são moléculas de IgG4. Em modalidades preferidas, uma variante é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, em termos de sequência de aminoácidos, a uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-13 e a IL-4 e compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4 e 5; a uma região variável da cadeia leve que se liga a IL-13 e a IL-4 e compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3. O termo "variante" refere-se a um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos que é alterada em um ou mais aminoácidos quando comparada às sequências de aminoácidos do anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL- 13. A variante pode conter modificações conservadoras na sequência, incluindo substituições, modificações, adições e deleções de aminoácidos.

[00127] Os exemplos de modificações, incluem, entre outras, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação com grupos de proteção/bloqueio, clivagem proteolítica e ligação a um ligante celular ou a outra proteína. As modificações de aminoácidos podem ser introduzidas por técnicas padrão conhecidas no assunto, tais como mutagênese sítio-dirigida, clonagem, mutagênese oligonucleotídeos-dirigida e mutagênese aleatória mediada por PCR no ácido nucleico codificador dos anticorpos. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com propriedades estruturais ou químicas similares. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Será evidente para o técnico no assunto que outras classificações de famílias de resíduos de aminoácidos além daquela utilizada podem também ser empregadas. Além disso, uma variante pode ter substituições não conservadoras de aminoácidos, por exemplo, substituição de um aminoácido por outro aminoácido com propriedades estruturais ou químicas diferentes. Variações mínimas semelhantes podem também incluir deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. Orientações para determinais quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, modificados, inseridos ou excluídos, sem que a atividade imunológica seja abolida, podem ser encontradas utilizando programas de computador bem conhecidos na técnica. Algoritmos de computador, como, entre outros, Gap ou Bestfit, conhecidos pelo técnico no assunto, podem ser utilizados para alinhar de modo ideal sequências de aminoácidos a serem comparadas e para definir resíduos de aminoácidos similares ou idênticos. As variantes podem ter afinidades de ligação iguais ou diferentes, sejam maiores ou menores, quando comparadas a um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, mas são ainda capazes de se ligar especificamente a IL-4 e/ou IL-13, e podem ter atividade biológica igual, maior ou menor que o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13.

[00128] Modalidades da invenção também incluem fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13. O termo "domínio de ligação a antígeno", "região de ligação a antígeno", "fragmento de ligação a antígeno"e termos semelhantes referem-se àquela porção de um anticorpo que compreende os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação a sua especificidade e afinidade pelo antígeno (por exemplo, as regiões determinantes de complementaridade (CDR)). A região de ligação a antígeno pode ser derivada de qualquer espécie animal, tais como roedores (por exemplo, coelho, rato ou hamster) e de humanos. De preferência, a região de ligação a antígeno será de origem humana. Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação a antígeno incluem: fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, moléculas de Fv de cadeia única (scFv), fragmentos dAb e unidades mínimas de reconhecimento constituídas pelos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável do anticorpo.

[00129] Em modalidades preferidas da invenção, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (ou sua variante ou seu fragmento de ligação a antígeno) melhorará, neutralizará ou de outra forma inibirá a atividade biológica de IL-4 e/ou IL-13 in vivo.

[00130] Em modalidades preferidas da invenção, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 (ou sua variante ou seu fragmento de ligação a antígeno) são anticorpos antagonistas que melhoram, neutralizam ou de outra forma inibem a atividade biológica de IL-4 e/ou IL-13 in vivo.

[00131] A identificação, o isolamento, o preparo e a caracterização de anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 ou suas variantes ou fragmentos que se ligam a IL-13 e a IL-4, incluindo o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 compreendendo uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3, foram descritos detalhadamente na Publicação PCT WO 2009/052081, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente.

[00132] De preferência, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL- 13 (ou sua variante ou seu fragmento de ligação a antígeno) estão presentes nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, por exemplo, aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 75 mg/mL a aproximadamente 125 mg/mL e aproximadamente 100 mg/mL. Alternativamente, os anticorpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 (ou sua variante ou seu fragmento de ligação a antígeno) estão presentes nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 65 mg/mL, aproximadamente 66 mg/mL a aproximadamente 130 mg/mL, aproximadamente 131 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL. Por exemplo, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 pode estar presente na formulação em uma quantidade de aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 35 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 45 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 55 mg/mL, aproximadamente 60 mg/mL, aproximadamente 65 mg/mL, aproximadamente 70 mg/mL, aproximadamente 75 mg/mL, aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 85 mg/mL, aproximadamente 90 mg/mL, aproximadamente 95 mg/mL, aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 105 mg/mL, aproximadamente 110 mg/mL, aproximadamente 115 mg/mL, aproximadamente 120 mg/mL, aproximadamente 125 mg/mL, aproximadamente 130 mg/mL, aproximadamente 135 mg/mL, aproximadamente 140 mg/mL, aproximadamente 145 mg/mL, aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 155 mg/mL, aproximadamente 160 mg/mL, aproximadamente 165 mg/mL, aproximadamente 170 mg/mL, aproximadamente 175 mg/mL, aproximadamente 180 mg/mL, aproximadamente 185 mg/mL, aproximadamente 190 mg/mL, aproximadamente 195 mg/mL ou aproximadamente 200 mg/mL.

[00133] Em certas modalidades exemplares, o anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 está presente na formulação em uma quantidade de aproximadamente 100 mg/mL. Em outra modalidade exemplar, um anticorpo IgG4 humanizado biespecífico anti-IL-4/anti-IL- 13, compreendendo uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-13 e a IL-4 e incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, ou 2 e 5; e uma região variável da cadeia leve que se liga a IL-13 e a IL-4, incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3, está presente na formulação em uma quantidade de aproximadamente 100 mg/mL. ii. Agentes de tamponamento, sistemas de tamponamento, força iônica e pH

[00134] Os agentes de tamponamento ajudam a manter o pH das formulações em uma faixa que se aproxima das condições fisiológicas. Os tampões estão, de preferência, presentes nas formulações a uma concentração que varia de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. Os agentes de tamponamento adequados para o uso com a presente invenção incluem ácidos orgânicos e inorgânicos, e seus sais, tais como tampões citrato (por exemplo, mistura de citrato monossódico-citrato dissódico, mistura de ácido cítrico-citrato trissódico, mistura de ácido cítrico-citrato monossódico, etc.), tampões succinato (por exemplo, mistura de ácido succínico- succinato monossódico, mistura de ácido succínico-hidróxido de sódio, mistura de ácido succínico-succinato dissódico, etc.), tampões tartarato (por exemplo, mistura de ácido tartárico- tartarato de sódio, mistura de ácido tartárico- tartarato de potássio, mistura de ácido tartárico-hidróxido de sódio, etc.), tampões fumarato (por exemplo, mistura de ácido fumárico- fumarato monossódico, mistura de ácido fumárico- fumarato dissódico, mistura de fumarato monossódico- fumarato dissódico, etc.), tampões gluconato (por exemplo, mistura de ácido glucônico-gliconato de sódio, mistura de ácido glucônico- hidróxido de sódio, mistura de ácido glucônico- gluconato de potássio, etc.), tampões oxalato (por exemplo, mistura de ácido oxálico-oxalato de sódio, mistura de ácido oxálico-hidróxido de sódio, mistura de ácido oxálico-oxalato de potássio, etc.), tampões lactato (por exemplo, mistura de ácido láctico-lactato de sódio, mistura de ácido láctico- hidróxido de sódio, mistura de ácido láctico-lactato de potássio, etc.) e tampões acetato (por exemplo, mistura de ácido acético-acetato de sódio, mistura de ácido acético-hidróxido de sódio, etc.). Tampões fosfato, tampões carbonato, tampões histidina, sais de trimetilamina como Tris, HEPES e outros de tais tampões conhecidos são também adequados e podem ser utilizados. De preferência, uma combinação de tampões, ou seja, dois ou mais agentes de tamponamento, é utilizada nas formulações da presente invenção. Uma combinação de dois ou mais tampões é referida neste relatório descritivo como um sistema de tamponamento.

[00135] As formulações da invenção compreendem um sistema de tamponamento. Um sistema de tamponamento mantém um pH fisiologicamente adequado. Além disso, um sistema de tamponamento participa para se alcançar isotonicidade e estabilidade química da formulação. Pela dificuldade de se desenvolver uma formulação estável de anticorpos para o anticorpo biespecífico, é preferível utilizar um sistema de tamponamento combinado para tirar proveito dos benefícios de dois ou mais tampões. Os benefícios combinados de dois ou mais tampões possibilita desenvolver uma formulação de anticorpo mais estável.

[00136] De preferência o sistema de tamponamento está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, por exemplo, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM ou aproximadamente 10 mM. Alternativamente, o sistema de tamponamento está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 a aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 a aproximadamente 45 mM ou aproximadamente 46 mM a aproximadamente 50 mM. Por exemplo, o sistema de tamponamento pode estar presente na formulação a uma concentração de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 mM, aproximadamente 32 mM, aproximadamente 33 mM, aproximadamente 34 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 37 mM, aproximadamente 38 mM, aproximadamente 39 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 41 mM, aproximadamente 42 mM, aproximadamente 43 mM, aproximadamente 44 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 46 mM, aproximadamente 47 mM, aproximadamente 48 mM, aproximadamente 49 mM e aproximadamente 50 mM. Mais preferivelmente, o sistema de tamponamento está presente na formulação a uma concentração de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 12 mM. Em uma modalidade mais preferida, o sistema de tamponamento está presente a uma concentração de aproximadamente 10 mM.

[00137] De preferência, o sistema de tamponamento compreende um tampão Tris e um tampão fosfato. De preferência, o tampão Tris está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mM. Por exemplo, o tampão Tris pode estar presente na formulação a uma concentração de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM ou aproximadamente 5 mM. Mais preferivelmente, o tampão Tris está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 4 mM e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 4 mM. Em uma modalidade mais preferida, o tampão Tris está presente a uma concentração de aproximadamente 3,7 mM.

[00138] De preferência, o tampão fosfato está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM. Por exemplo, o tampão fosfato pode estar presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM ou aproximadamente 10 mM. Mais preferivelmente, o tampão fosfato está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 8 mM e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 7 mM. Em uma modalidade mais preferida, o tampão fosfato está presente a uma concentração de aproximadamente 6,3 mM.

[00139] Em uma modalidade mais preferida da invenção, o sistema de tamponamento compreende um tampão Tris a uma concentração de aproximadamente 3,7 mM e um tampão fosfato a uma concentração de aproximadamente 6,3 mM. Essa combinação de tampão Tris e tampão fosfato em um sistema tampão é altamente incomum e não é conhecida na técnica.

[00140] É também preferível que o sistema de tamponamento esteja presente nas formulações em uma concentração baixa, ou seja, próxima ou inferior a 15 mM, a fim de reduzir a força iônica da formulação. Isso se deve ao fato de que à medida que a força iônica da formulação aumenta, a cinética de agregação do anticorpo torna-se maior. Para que a estabilidade da formulação melhore, é preciso diminuir a agregação do anticorpo e/ou a velocidade de agregação do anticorpo.

[00141] Em certas modalidades, as formulações da invenção possuem um pH por volta de pH 7. De preferência, o pH das formulações varia de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0. Por exemplo, o pH das formulações pode ser aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,5, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,7, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,6, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,8, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9 e aproximadamente 8,0. Mais preferivelmente, o pH das formulações pode variar de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. Em uma modalidade mais preferida, o pH é aproximadamente 7,0, As formulações exibem boa estabilidade, no que diz respeito a partículas visíveis, partículas subvisíveis, proteínas de baixo peso molecular e proteínas de elevado peso molecular, quando o pH das formulações é aproximadamente pH 7. O pH da formulação pode ser medido por qualquer meio conhecido pelos técnicos no assunto. Um meio preferido para medir o pH é utilizando um medidor de pH equipado com um microeletrodo. O pH da formulação pode ser ajustado utilizando qualquer meio conhecido na técnica. As substâncias químicas preferidas para alterar o pH das formulações são ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH).

[00142] Em certas modalidades, as formulações da invenção possuem um pH acima do ponto isoelétrico (pI) do anticorpo. O ponto isoelétrico é o pH no qual uma determinada molécula ou superfície não carrega carga elétrica líquida. O pI do anticorpo biespecífico pode ser determinado por qualquer meio conhecido pelos técnicos no assunto. De preferência, o pI do anticorpo biespecífico é determinado por focalização isoelétrica desnaturante. O pI do anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 compreendendo uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4; e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3 é 5,8-6,2. iii. Tensoativos não iônicos

[00143] As formulações da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda um tensoativo não iônico. Os tensoativos são compostos químicos que estabilizam moléculas biológicas e/ou excipientes farmacêuticos gerais em uma formulação. Os tensoativos geralmente protegem as moléculas e os excipientes de estresses induzidos à interface ar/solução e estresses induzidos à solução/superfície, os quais podem de outra forma resultar na agregação de moléculas. Os tensoativos também evitam a formação de partículas visíveis e subvisíveis.

[00144] De preferência, o tensoativo não iônico está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1% (p/v), por exemplo, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,3% ou de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,2%. Alternativamente, o tensoativo não iônico está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,05% (p/v), aproximadamente 0,06% a aproximadamente 0,10% (p/v), aproximadamente 0,11% a aproximadamente 0,15% (p/v), aproximadamente 0,16% a aproximadamente 0,20% (p/v), aproximadamente 0,20% a aproximadamente 0,30% (p/v), aproximadamente 0,30% a aproximadamente 0,40% (p/v), aproximadamente 0,40% a aproximadamente 0,50% (p/v), aproximadamente 0,50% a aproximadamente 0,60% (p/v), aproximadamente 0,60% a aproximadamente 0,70% (p/v), aproximadamente 0,70% a aproximadamente 0,80% (p/v), aproximadamente 0,80% a aproximadamente 0,90% (p/v) ou de aproximadamente 0,90% a aproximadamente 1,0% (p/v). Por exemplo, o tensoativo não iônico pode estar presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 0,01% (p/v), aproximadamente 0,02% (p/v), aproximadamente 0,03% (p/v), aproximadamente 0,04% (p/v), aproximadamente 0,05% (p/v), aproximadamente 0,06% (p/v), aproximadamente 0,07% (p/v), aproximadamente 0,08% (p/v), aproximadamente 0,09% (p/v), aproximadamente 0,1% (p/v), aproximadamente 0,2% (p/v), aproximadamente 0,3% (p/v), aproximadamente 0,4% (p/v), aproximadamente 0,5% (p/v), aproximadamente 0,6% (p/v), aproximadamente 0,7% (p/v), aproximadamente 0,8% (p/v), aproximadamente 0,9% (p/v) e aproximadamente 1% (p/v). Em modalidades especiais, o tensoativo não iônico está presente nas formulações de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,2% (p/v).

[00145] Os exemplos de tensoativos incluem, entre outros, polissorbatos, glicerina, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido succínico, ácidos fumáricos, ácidos ftálicos e suas combinações. Os técnicos no assunto estão cientes de que outros tensoativos não iônicos podem ser utilizados desde que sejam farmaceuticamente aceitáveis, ou seja, adequados para administração a indivíduos. O tensoativo não iônico é de preferência um polissorbato. Os exemplos de polissorbatos incluem polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 65 e polissorbato 80. Mais preferivelmente, o tensoativo não iônico é o polissorbato 80.

[00146] Em modalidades exemplares, o polissorbato 80 está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1% (p/v). Por exemplo, o polissorbato 80 pode estar presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 0,01% (p/v), aproximadamente 0,02% (p/v), aproximadamente 0,03% (p/v), aproximadamente 0,04% (p/v), aproximadamente 0,05% (p/v), aproximadamente 0,06% (p/v), aproximadamente 0,07% (p/v), aproximadamente 0,08% (p/v), aproximadamente 0,09% (p/v), aproximadamente 0,1% (p/v), aproximadamente 0,2% (p/v), aproximadamente 0,3% (p/v), aproximadamente 0,4% (p/v), aproximadamente 0,5% (p/v), aproximadamente 0,6% (p/v), aproximadamente 0,7% (p/v), aproximadamente 0,8% (p/v), aproximadamente 0,9% (p/v) e aproximadamente 1% (p/v). Em modalidades especiais, o polissorbato 80 está presente nas formulações de aproximadamente 0,03% a aproximadamente 0,2% (p/v). Por exemplo, o polissorbato 80 pode estar presente em uma quantidade de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 0,02% a aproximadamente 0,5% (p/v) e de aproximadamente 0,03% a aproximadamente 0,2% (p/v). Em modalidades mais preferidas da invenção, o polissorbato 80 está presente nas formulações em uma quantidade de 0,2% (p/v).

iv. Açúcares

[00147] As formulações da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda um açúcar. Tipicamente, os açúcares são utilizados como agente estabilizante para proteínas de elevado peso molecular ou como crioprotetor ou lioprotetor.

[00148] De preferência, o açúcar está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/v), por exemplo, aproximadamente 2% a aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 3% a aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 4% a aproximadamente 6% (p/v) ou aproximadamente 5% (p/v). Alternativamente, o açúcar está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 3% a aproximadamente 6% (p/v) ou de aproximadamente 6% a aproximadamente 10% (p/v). Por exemplo, o açúcar pode estar presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), modalidades especiais, o açúcar está presente nas formulações de aproximadamente 3% a aproximadamente 7% (p/v) e mais preferivelmente aproximadamente 5%.

[00149] Os exemplos de açúcares incluem, entre outros, monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos. Os exemplos de sacarídeos incluem glicose, sacarose, maltose, trealose, dextrose, xilitol, frutose e manitol. Os técnicos no assunto estão cientes de que outros açúcares podem ser utilizados desde que sejam farmaceuticamente aceitáveis, ou seja, adequados para administração a indivíduos. De preferência, o açúcar é um dissacarídeo. Mais preferivelmente, o açúcar é sacarose.

[00150] Em certas modalidades, sacarose está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 1% a 10% (p/v). Por exemplo, sacarose pode estar presente na formulação em uma quantidade de aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v) ou aproximadamente 10% (p/v). De preferência, sacarose pode estar presente em uma quantidade de aproximadamente 3% a aproximadamente 7% (p/v) ou de aproximadamente 4% a aproximadamente 6% (p/v). Mais preferivelmente, sacarose está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 5% (p/v).

v. Agentes estabilizantes não iônicos

[00151] As formulações da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda um agente estabilizante não iônico. Agentes estabilizantes referem-se a uma ampla categoria de excipientes, cuja função pode variar de agente de volume a um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a prevenir a desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Os agentes estabilizantes também pode minimizar a formação de proteínas de elevado peso molecular.

[00152] De preferência, o agente estabilizante não iônico está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/v), por exemplo, aproximadamente 2% a aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 2% a aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 2% a aproximadamente 4% (p/v) ou aproximadamente 3% (p/v). Alternativamente, o agente estabilizante não iônico está presente nas formulações a uma concentração de aproximadamente 1% a aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 2% a aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 4% a aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 6% a aproximadamente 8% (p/v) ou de aproximadamente 8% a aproximadamente 10% (p/v). Por exemplo, o agente estabilizante não iônico pode estar presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v) ou aproximadamente 10% (p/v). Em modalidades especiais, o agente estabilizante não iônico está presente nas formulações de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% (p/v), mais preferivelmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (p/v) e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 3% (p/v).

[00153] Os exemplos de agentes estabilizantes incluem, entre outros, alcoóis poli-hídricos de açúcares; aminoácidos, como prolina, arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc.; açúcares orgânicos ou alcoóis de açúcares como lactose, trealose, estaquiose, arabitol, eritritol, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol e os semelhantes, incluindo ciclitóis como inositol; polietilenoglicol; polímeros de aminoácidos; agentes redutores contendo enxofre, como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, a-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; polipeptídeos de baixo peso molecular (ou seja, <10 resíduos); proteínas, como albumina sérica humana, albumina sérica bovina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona, sacarídeos, monossacarídeos, como xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos, como lactose, maltose e sacarose; trissacarídeos como rafinose; polissacarídeos como dextrano e assim por diante. Os técnicos o assunto estão cientes de que outros agentes estabilizantes não iônicos podem ser utilizados de que sejam farmaceuticamente aceitáveis, ou seja, adequados para administração a indivíduos. De preferência, o agente estabilizante não iônico é um aminoácido. Mais preferivelmente, o agente estabilizante não iônico é prolina ou glicina. Mais preferivelmente, o agente estabilizante não iônico é prolina. Alternativamente, o agente estabilizante não iônico é manitol.

[00154] Em certas modalidades, prolina está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 1% a 10% (p/v). Por exemplo, prolina pode estar presente na formulação em uma quantidade de aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v) ou aproximadamente 10% (p/v). De preferência, prolina pode estar presente em uma quantidade de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% (p/v) ou de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (p/v). Mais preferivelmente, prolina está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 3% (p/v).

[00155] Em certas modalidades alternativas, manitol está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 1% a 10% (p/v). Por exemplo, manitol pode estar presente na formulação em uma quantidade de aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v) ou aproximadamente 10% (p/v). De preferência, manitol pode estar presente em uma quantidade de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% (p/v) ou de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (p/v). Mais preferivelmente, manitol está presente nas formulações em uma quantidade de aproximadamente 3% (p/v).

v. Outros excipientes

[00156] Além disso, as formulações da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda outros excipientes incluindo, entre outros, água para injetáveis, diluentes, agentes solubilizantes, agentes calmantes, tampões adicionais, sais inorgânicos ou orgânicos, antioxidantes, conservantes, agentes de volume, agentes quelantes, agentes de tonicidade ou os semelhantes. De preferência, contudo, as formulações da invenção não compreendem outros excipientes, exceto aqueles descritos acima. Outros veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqueles descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 16aedição, Osol, A. Ed. (1980), podem ser incluídos na formulação desde que não afetem desfavoravelmente as características desejadas da formulação. Em uma modalidade especial, a formulação é substancialmente livre de conservantes, embora, em modalidades alternativas, os conservantes possam ser adicionados se necessário. Por exemplo, crioprotetores ou lioprotetores podem ser incluídos em formulações liofilizadas.

vi. Formulações líquidas ou liofilizadas

[00157] As formulações da invenção podem ser formulações líquidas ou formulações liofilizadas. De preferência, as formulações são formulações líquidas. Mais preferivelmente, as formulações líquidas estão pronta para serem injetadas. Alternativamente, as formulações podem ser pós liofilizados. De preferência, os pós liofilizados estão prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes da administração.

vii. Formulações exemplares

[00158] Em uma modalidade exemplar da invenção, a invenção provê um formulação líquida de anticorpo, adequada para administração subcutânea, em que a formulação compreende:

[00159] cerca de 100 mg/mL de um anticorpo biespecífico ou de seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4 e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3;

[00160] cerca de 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende um tampão Tris a uma concentração de aproximadamente 3,7 mM e um tampão Fosfato a uma concentração de aproximadamente 6,3 mM;

[00161] aproximadamente 0,2% (p/v) de polissorbato 80;

[00162] aproximadamente 5% (p/v) de sacarose; e

[00163] aproximadamente 3% (p/v) de prolina;

[00164] em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7.

[00165] Em outra modalidade exemplar da invenção, a invenção provê uma formulação líquida de anticorpo, adequada para administração subcutânea, em que a formulação compreende:

[00166] cerca de 100 mg/mL de um anticorpo biespecífico ou de seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4 e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos of SEQ ID NOs: 1 e 3;

[00167] cerca de 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende tampão Tris a uma concentração de aproximadamente 3,7 mM e tampão Fosfato a uma concentração de aproximadamente 6,3 mM;

[00168] aproximadamente 0,2% (p/v) de polissorbato 80;

[00169] aproximadamente 5% (p/v) de sacarose; e

[00170] aproximadamente 3% (p/v) de manitol;

[00171] em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7.

[00172] Em uma modalidade exemplar alternativa da invenção, a invenção provê uma formulação liofilizada estável de anticorpo adequada para administração subcutânea, em que a formulação compreende:

[00173] cerca de 100 mg/mL de um anticorpo biespecífico ou de seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4 e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3;

[00174] cerca de 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende tampão Tris a uma concentração de aproximadamente 3,7 mM e tampão Fosfato a uma concentração de aproximadamente 6,3 mM;

[00175] aproximadamente 0,2% (p/v) de polissorbato 80;

[00176] aproximadamente 5% (p/v) de sacarose; e

[00177] aproximadamente 3% (p/v) de prolina;

[00178] em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7.

[00179] Em outra modalidade exemplar alternativa da invenção, a invenção provê uma formulação liofilizada estável de anticorpo adequada para administração subcutânea, em que a formulação compreende:

[00180] cerca de 100 mg/mL de um anticorpo biespecífico ou de seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4 e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3;

[00181] cerca de 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende tampão Tris a uma concentração de aproximadamente 3,7 mM e tampão Fosfato a uma concentração de aproximadamente 6,3 mM;

[00182] aproximadamente 0,2% (p/v) de polissorbato 80;

[00183] aproximadamente 5% (p/v) de sacarose; e

[00184] aproximadamente 3% (p/v) de manitol;

[00185] em que o pH da formulação é aproximadamente pH 7.

vii. Estabilidade

[00186] As formulações da invenção são estáveis a 2-8°C por pelo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 meses ou mais. Em modalidades exemplares, são estáveis a 28°C por pelo menos quase 6 meses ou mais. Em outras modalidades exemplares, são estáveis a 2-8°C por pelo menos quase 9 meses. Em modalidades exemplares adicionais, são estáveis a 2-8°C por pelo menos quase 1 ano ou mais, mais preferivelmente por quase 2 anos e ainda mais preferivelmente por quase 3 anos.

C. Modos de administração

[00187] Em certas modalidades da invenção, as formulações são adequadas para administração por via parenteral, intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutânea, ou uma combinação destes. As formulações da invenção são adequadas para liberação por uma variedade de técnicas. Em modalidades preferidas da invenção, a formulação é administrada por via subcutânea. Por exemplo, prefere- se que formulações contendo 100 mg/mL de anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 sejam administradas por via subcutânea. Portanto, as formulações são de preferência estéreis. Métodos para produzir formulações estéreis são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, filtração através de membranas filtrantes estéreis ou autoclavagem dos ingredientes da formulação, com a exceção de anticorpos, a aproximadamente 120 °C por cerca de 30 minutos.

D. Doses e formas farmacêuticas

[00188] As doses eficazes das formulações da invenção variam na dependência de muitos fatores diferentes, incluindo meio de administração, local do alvo, estado fisiológico do indivíduo, se o indivíduo é humano ou um animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Habitualmente, o indivíduo é um humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgênicos, podem também ser tratados. As doses do tratamento podem precisar ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. De preferência, a dose varia de 100200 mg/frasco.

[00189] As formulações da invenção podem ser administradas em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre as doses isoladas podem ser diário, semanal, quinzenal, mensal ou anual. Os intervalos podem também ser irregulares. Em alguns métodos, a dose é ajustada para conseguir certa concentração plasmática do agente de ligação, como um anticorpo. A dose e a frequência variarão dependendo da meia- vida do anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 no indivíduo. Em geral, os anticorpos humanos são os que mostram meia-vida mais longa, seguidos pelos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos.

[00190] Em modalidades adicionais, a invenção provê uma forma farmacêutica de dose unitária compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação da invenção para o tratamento de uma ou mais doenças em um indivíduo através da administração da forma farmacêutica ao indivíduo. Em uma modalidade preferida, o indivíduo é um humano. O humano pode ser um adulto ou pode ser um lactante. O termo "forma farmacêutica de dose unitária"refere-se a uma unidade fisicamente distinta adequada como doses unitárias para os indivíduos a serem tratados, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico/profilático desejado, associada com o tampão citrato necessário e o pH.

[00191] A forma de dose unitária pode ser um recipiente compreendendo a formulação. Os recipientes adequados incluem, entre outros, ampolas seladas, frascos, garrafas, seringas e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico, e podem dispor de uma porta para acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um frasco contendo uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha hipodérmica para injeção). Em uma modalidade preferida, o recipiente é um frasco. Em geral, o recipiente deve manter a esterilidade e a estabilidade da formulação.

[00192] Em modalidades específicas, as formulações são acondicionadas em frascos de 7, 10, 15 ou 20 mL, feitos de vidro tipo I transparente incolor e fechados com uma rolha (bromometila revestida com polímero fluorado) selada com tampas do tipo flip-off com rebordo (polipropileno).

[00193] Em uma modalidade específica, as, as formulações são embaladas secundariamente em um recipiente, como uma caixa de papelão, que protege os frascos da luz.

[00194] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo precisam ser estéreis. A esterilização pode ser realizada, por exemplo, por filtração através de membranas filtrantes estéreis. Por exemplo, as formulações líquidas da presente invenção podem ser esterilizadas pela passagem através de um filtro de 0,2 µm ou de 0,22 µm.

E. Métodos de tratamento

[00195] A presente invenção provê ainda métodos para tratar uma doença ou transtorno mediado por IL-4 e/ou IL-13, em que os métodos compreendem administrar a formulação da invenção a um indivíduo. Em certas modalidades, a doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 inclui cânceres, inflamação, doenças autoimunes, infecções, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas.

[00196] As formulações da presente invenção podem ser utilizadas para tratar, suprimir ou prevenir doença, tal como uma doença alérgica, uma doença mediada por Th2, doença mediada por IL-13, doença mediada por IL-4 e/ou uma doença mediada por IL-4/IL-13. Os exemplos de tais doenças incluem doença de Hodgkin, asma, asma alérgica, dermatite atópica, alergia atópica, colite ulcerativa, esclerodermia, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica 3 (DPOC3) ou fibrose pulmonar idiopática, rejeição crônica do enxerto, fibrose pulmonar induzida por bleomicina, fibrose pulmonar induzida por radiação, granuloma pulmonar, esclerose sistêmica progressiva, esquistossomose, fibrose hepática, câncer renal, linfoma de Burkitt, doença de Hodgkins, doença não Hodgkins, síndrome de Sezary, asma, artrite séptica, dermatite herpetiforme, urticária idiopática crônica, colite ulcerativa, esclerodermia, cicatrização hipertrófica, doença de Whipple, hiperplasia benigna da próstata, um transtorno pulmonar no qual o receptor de IL-4 está implicado, uma condição na qual o rompimento da barreira epitelial mediado pelo receptor de IL-4 está implicado, um transtorno do sistema digestivo no qual o receptor de IL-4 está implicado, uma reação alérgica a um medicamento, doença de Kawasaki, doença da célula falciforme, síndrome de Churg- Strauss, doença de Grave, pré-eclâmpsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativa autoimune, anemia hemolítica autoimune, esôfago de Barrett, uveíte autoimune, tuberculose, fibrose cística, fibrose broncopulmonar alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica, pneumopatia e fibrose induzida por bleomicina, proteinose alveolar pulmonar, síndrome da angústia respiratória do adulto, sarcoidose, síndrome hiper IgE, síndrome hipereosinofílica idiopática, uma doença bolhosa autoimune, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso, miastenia grave, síndrome da fadiga crônica, nefrose.

[00197] O termo "doença alérgica"refere-se a uma condição patológica na qual um paciente é hipersensível e desenvolve uma reação imunológica contra uma substância que normalmente não é imunogênica. A doença alérgica é em geral caracterizada pela ativação de mastócitos por IgE resultando em uma resposta inflamatória (por exemplo, resposta local, resposta sistêmica) que pode levar a sintomas de benignos, como escorrimento nasal, ao choque anafilático de risco à vida e ao óbito. Os exemplos de doença alérgica incluem, entre outros, rinite alérgica (por exemplo, febre do feno), asma (por exemplo, asma alérgica), dermatite alérgica (por exemplo, eczema), dermatite de contato , alergia alimentar e urticária.

[00198] O termo "doença mediada por Th2" refere-se a uma doença na qual a patologia é produzida (no todo ou em parte) por uma resposta imune (resposta imune tipo Th2) que é regulada por linfócitos T Th2 CD4+, que produzem caracteristicamente IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Uma resposta imune tipo Th2 é associada com a produção de certas citocinas (por exemplo, IL-4, IL-13) e de certas classes de anticorpos (por exemplo, IgE), e é associada com a imunidade humoral. As doenças mediadas por Th2 são caracterizadas pela presença de níveis elevados de citocinas de Th2 (por exemplo, IL-4, IL-13) e/ou certas classes de anticorpos (por exemplo, IgE) e incluem, por exemplo, doença alérgica (por exemplo, rinite alérgica, dermatite atópica, asma (por exemplo, asma atópica), doença alérgica das vias aéreas (AAD), choque anafilático, conjuntivite), transtornos autoimunes associados com níveis elevados de IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, artrite reumatoide, doença do enxerto contra hospedeiro, doença renal (por exemplo, síndrome nefrítica, nefrite lúpica)) e infecções associadas com níveis elevados de IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, infecção viral, parasitária, fúngica (por exemplo, C. albicans)). Certos cânceres são associados com níveis elevados de IL-4 e/ou IL-13 ou associados com proliferação de células cancerosas induzida por IL-4- e/ou induzida por IL-13 (por exemplo, linfoma de células B, linfoma de células T, mieloma múltiplo, câncer da cabeça e pescoço, câncer de mama e câncer ovariano). Esses cânceres podem ser tratados, suprimidos ou prevenidos utilizando as formulações da invenção.

[00199] O termo "câncer"refere-se ou descreve a condição fisiológica em mamíferos, especialmente em humanos, que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular não regulado. Os exemplos de câncer incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia.

[00200] O termo "doença autoimune" refere-se a uma doença ou transtorno não maligno decorrente e direcionado contra os próprios tecidos do indivíduo. Os exemplos de doenças ou transtornos autoimunes incluem, entre outros, respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite; condições alérgicas como eczema e asma; outras condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus Tipo I ou diabetes mellitus insulino-dependente); esclerose múltipla e transtorno inflamatório do sistema nervoso central (SNC).

[00201] Em certas modalidades, as formulações da invenção podem ser administradas em combinação com uma ou mais terapias (por exemplo, terapias que não são as formulações da invenção e que estão sendo correntemente administradas para tratar, controlar e/ou melhorar uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13). O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um indivíduo. Uma primeira terapia pode ser administrada antes (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas), concomitantemente ou depois (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas) da administração de uma segunda terapia a um indivíduo que apresentou, apresenta ou é suscetível a uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13. Qualquer terapia adicional pode ser administrada em qualquer ordem com as outras terapias adicionais. Exemplos não limitantes de terapias que podem ser administradas em combinação com um anticorpo da invenção incluem agentes anti-inflamatórios aprovados, listados na Farmacopeia dos Estados Unidos e/ou no Physician's Desk Reference.

F. Kits

[00202] Certas modalidades da invenção incluem um kit compreendendo uma formulação da invenção. O kit pode compreender ainda um ou mais recipientes contendo excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e inclui outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário final, entre estes, filtros, agulhas e seringas. Associados com os kits, pode haver instruções, costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos, que contêm informações sobre, por exemplo, as indicações, o uso, a posologia, a fabricação, a administração, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso de tais produtos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos.

Exemplos

[00203] A seguir, são fornecidos exemplos como ajuda para ilustrar a invenção. Os exemplos não se destinam a limitar o âmbito da invenção de maneira alguma. Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de formulação farmacêutica, química, biologia molecular, tecnologia do DNA recombinante, imunologia como tecnologia de anticorpos, e técnicas padrão para preparar polipeptídeos como descrito, por exemplo, em Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), volume 51, Ed.: Paul S., Humana Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), Eds.: McCafferty J. et al., Humana Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

[00204] BD: As abreviações usadas nos Exemplos 2-6 são: Desenvolvimento Biotecnológico BsAb: Anticorpo biespecífico DLS: Dispersão dinâmica de luz DoE: Desenho do experimento DP: Medicamento DS: Princípio ativo DSC: Calorimetria diferencial de varredura FCM: Microscopia em câmara de fluxo FDS: Princípio ativo formulado FT-IR: Transformada de Fourier - Infravermelho HAP: Cromatografia em hidroxiapatita HDPE: Polietileno de alta densidade HMW: Elevado peso molecular HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência IEF: Focalização isoelétrica IgG: Imunoglobulina G IL: Interleucina kDa: quilodalton LMW: Baixo peso molecular ND: Não determinado PEG: Polietilenoglicol PES: Poliéter sulfona PS80: Polissorbato 80 PVDF: Difluoreto de polivinilideno rpm: rotações por minuto SC: Subcutâneo SDS-PAGE:Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio SEC: Cromatografia de exclusão por tamanho SLS: Dispersão estática de luz Sq: Quantidade suficiente TGA: Análise termogravimétrica UF/DF: Ultrafiltração/Diafiltração USP: Farmacopeia dos Estados Unidos UV-Vis: Ultravioleta-visível p/v: peso/volume WFI: Água para injetáveis XRPD: Difração de raios-X em pó

[00205] Um anticorpo IgG4 humanizado biespecífico anti-IL-4/anti- IL-13, compreendendo uma região variável da cadeia pesada que se liga a IL-13 e a IL-4, incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, e uma região variável da cadeia leve que se liga a IL-13 e a IL-4 incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3 (o "Anticorpo Líder"), foi utilizado nos exemplos a seguir a fim de terminar as condições ótimas para formulação.

[00206] O objetivo dos estudos seguintes da formulação (Exemplos 2-6) era entender o comportamento do Anticorpo Líder em solução e no estado de liofilizado (ou seja, identificar as principais vias de degradação) e determinar sistemas tampão-pH adequados e aditivos que proporcionam boa estabilidade para o Anticorpo Líder a cerca de 100 mg/mL para desenvolvimento posterior da formulação.

[00207] A seguir, é mostrado o princípio ativo utilizado nos Exemplos 2-6:

[00208] Anticorpo Líder após a etapa de purificação por HAP (última etapa do processamento a jusante):

[00209] Lote no RSN0169 (estudo no P5 a P6)

[00210] Tampão da formulação: tampão fosfato de sódio 75 mM, pH 6,7

[00211] Concentração: 10,4 mg/mL;

[00212] Lotes no RSN0169-SZW 320, 326 e 327 (estudo no P7 a P13)

[00213] Tampão da formulação: tampão fosfato de sódio 59 mM, pH 6,9

[00214] Concentração: 4,5 mg/mL;

[00215] Lote no RSN0169-SZW 330 (estudo no P14)

[00216] Tampão da formulação: tampão fosfato de sódio 55 mM, NaCl 20 mM, pH 6,8

[00217] Concentração: 4,4 mg/mL; e

[00218] Lote no RSN0152 (estudo no P15 a P21)

[00219] Tampão da formulação: tampão fosfato de sódio 55 mM, NaCl 20 mM, pH 6,8

[00220] Concentração: 3,9 mg/mL.

[00221] Para o ensaio de cada formulação, a concentração do Anticorpo Líder foi ajustada no final da UF/DF em água ou no tampão final e depois diluída ainda mais com quantidades apropriadas de soluções concentradas de tampão e aditivos até a formulação final desejada (ver a Tabela 1 para detalhes). Tabela 1 - Detalhes do ajuste de formulações bConcentração após diluição com soluções concentradas de tampão e aditivos

[00222] Cada formulação foi filtrada estéril (Millex® GV, Millipore, 0,22 µm, PVDF) sob fluxo laminar, e uma fração foi dispensada em um frasco de vidro tipo 1, conforme apropriado, para cada momento da estabilidade, exceto para o estudo de congelamento/descongelamento, no qual foram utilizados tubos de polipropileno.

[00223] Determinou-se as condições de estresse mecânico e de estresse térmico para as formulações no Exemplos 2-6.

[00224] A fim de avaliar a influência do estresse por agitação mecânica nos ensaios no P5-7 das formulações, os frascos foram agitados a 350 rpm por 2 a 15 horas à temperatura ambiente utilizando um Rota Test 74401 e depois analisados.

[00225] A fim de avaliar a influência do estresse por seringabilidade nos ensaios no P12, 13, 16-18 e 20 das formulações, um impacto potencial da seringabilidade (ou seja, o estresse pelo cisalhamento dentro da agulha) foi avaliado com seringas de HPLC (Unimetrics Corporation, 100 µL) quando amostras de pequeno volume estavam disponíveis e com seringas Terumo 26G x ^ - 0,45x12 mM quando amostras de volume maior estavam disponíveis.

[00226] A fim de avaliar a influência do estresse térmico nos ensaios no P5-7 e 13 das formulações, os frascos foram armazenados a 45 °C por 1 e 2 semanas e então analisados. A temperatura relevante para o estresse térmico foi determinada por DSC. Os ensaios no P5-7 e 13 foram também armazenados a 5 °C por 2 semanas e então analisados.

[00227] A fim de avaliar a influência do estresse térmico nos ensaios no P12, 15 e 21, os frascos foram armazenados a 5 °C por 3 a 6 semanas e analisados a cada semana. As soluções antes da liofilização, denominadas Princípio Ativo Formulado (FDS), para os ensaios no P16-18 e 20, foram armazenadas a 5 °C por 4 a 5 semanas e analisadas a cada semana. As soluções reconstituídas após a liofilização, para os ensaios no P14, 16-18 e 20, foram armazenadas a 5 °C por 24 horas e então analisadas.

Exemplo 1 - Otimização do pH

[00228] A primeira etapa no processo de desenvolvimento da formulação foi determinar o pH ótimo para a formulação do Anticorpo Líder. A fim de determinar o pH ótimo, usou-se uma concentração baixa de Anticorpo Líder (1 mg/mL, ao contrário de 100 mg/mL), pois essa baixa concentração de Anticorpo Líder era suficiente para determinar o pH ótimo. A Tabela 2 mostra as formulações testadas nesse estudo. Tabela 2 - Ensaio no P5 - rastreamento do pH

[00229] Nesse estudo, a Formulação 1 não era estável, pois levou à Instabilidade na conformação do Anticorpo Líder. Especificamente, o Anticorpo Líder tendeu a se desdobrar. Além disso, a Formulação 9 levou à desamidação. Assim, determinou-se que o pH ótimo para a formulação do Anticorpo Líder estaria dentro de uma faixa estreita por volta do pH 7,0.

[00230] Estudos subsequentes de outros parâmetros da formulação, como tampões, tensoativos e agentes estabilizantes, incluíram concentrações mais altas do Anticorpo Líder. Esses estudos subsequentes confirmaram as conclusões acima referentes ao pH ótimo para a formulação do Anticorpo Líder quando concentrações altas de Anticorpo Líder foram utilizadas.

Exemplo 2 - Sistema tampão/força iônica (sal) Tampões

[00231] A etapa seguinte no processo de desenvolvimento da formulação foi determinar o tampão ótimo para a formulação do Anticorpo Líder. Diversos tampões diferentes foram testados, como histidina, fosfato, Tris e combinação destes, em diversos ensaios distintos. Tabela 3 - Ensaio no P6 - Rastreamento do sistema tampão a 1 mg/mL

[00232] Quando do processamento e da composição da formulação, os ensaios filtrados de formulações e os controles estavam livres de partículas visíveis e subvisíveis, e a análise por SEC mostrou uma pureza < 92,0% decorrente de um DS inicial contendo 5,5% de HMW.

[00233] As temperaturas de início e desnaturação, obtidas por DSC, indicaram uma estabilidade térmica melhor para os seguintes sistemas tampão-pH:

[00234] • Fosfato pH 6,5 e 7,0: no P5-5, P5-6, P6-2, P6-3

[00235] • Tris pH 7,0 e 7,5: no P6-5, P6-6

[00236] para os quais a temperatura de início era em torno de 61 °C em comparação, por exemplo, a 48 °C para pH 4,5 e a 59 °C para o tampão Histidina.

[00237] A estabilidade coloidal obtida por SLS indicou uma estabilidade melhor para os seguintes sistemas tampão-pH:

[00238] • Fosfato pH 7,5: no P6-4

[00239] • Tris pH 7,0 e 7,5: no P6-5, P6-6

[00240] para os quais o segundo coeficiente virial era próximo a 3,0 10-4 mL.mol/g2 em comparação, por exemplo, a 0,4 10-4 mL.mol/g2 para o tampão Histidina e a 1,5 10-4 mL.mol/g2 para o tampão Fosfato pH 7,0.

[00241] Níveis diferentes de contaminação por partículas foram observados após 1h30 de estresse por agitação mecânica (ver a Figura 3).

[00242] Em relação a partículas visíveis, os candidatos a sistema tampão-pH mostrando boa estabilidade para o ensaio no P5 foram como segue:

[00243] • Fosfato pH 6,5, 7,0 e 7,5: no P5-5, P5-6 e P5-7

[00244] • Tris pH 8,0 e 8,5: no P5-8 e P5-9

[00245] O Ensaio no 6 foi realizado para esses dois sistemas tampão com pHs entre 6,5 e 7,5. Os candidatos mostrando a melhor estabilidade foram como segue:

[00246] • Fosfato pH 7,0 e 7,5: no P6-3 e P6-4

[00247] • Tris pH 7,0 e 7,5: no P6-5 e P6-6

[00248] Os pHs básicos pareceram ser melhores para minimizar a formação de partículas.

[00249] O estresse por agitação mecânica e o estresse térmico (2 semanas a 45 °C) são métodos relevantes para a discriminação de sistemas tampão-pH no que diz respeito a partículas subvisíveis.

[00250] Os candidatos a sistema tampão-pH proporcionando boa estabilidade foram:

[00251] Ensaio no 5: Formulações no P5-6 a P5-9, ou seja, pH > 7,0

[00252] Ensaio no 6 (ver a Figura 4 e a Figura 5):

[00253] - Fosfato 7,5: no P6-4

[00254] - Tris 7,5: no P6-6

[00255] Seguidos por:

[00256] - Fosfato pH 7,0: no P6-3

[00257] - Tris pH 7,0: no P6-5

[00258] Notar que o tampão Histidina (no P6-1) mostrou, em todas as condições de estresse, um efeito desestabilizante importante.

[00259] As aferições por HIAC confirmaram a inspeção visual: os pHs básicos eram melhores para minimizar a formação de partículas. Além disso, no mesmo pH, formulações à base de fosfato forneceram ligeiramente menos partículas subvisíveis do que o sistema de tamponamento com Tris.

[00260] Em relação ao ensaio no 5 e 6, o estresse térmico mostrou resultados interessantes para HMW e LMW. Notar que a formulação no P5-1 (pH 4,5) foi totalmente degradada após 1 semana a 45 °C; assim como a formulação no P5-2 após 2 semanas a 45 °C. Essas duas amostras serão retiradas da análise seguinte.

[00261] Com respeito a HMW, os resultados após 2 semanas a 45 °C foram semelhantes para as formulações no P5-6 a P5-9 (pH > 7,0) e melhores para no P5-5 a P5-3, pois o pH diminuiu de 6,5 para 5,5. Para o ensaio no 6, essa tendência foi confirmada, e os candidatos a sistema tampão-pH proporcionando boa estabilidade foram (ver a Figura 6):

[00262] • Fosfato pH 6,5: no P6-2

[00263] • Tris pH 7,0: no P6-5

[00264] • Histidina pH 6,5: no P6-5

[00265] Assim, o pH 6,5 proporcionou estabilidade melhor para minimizar a formação de HMW do que o pH 7,0, o qual era, por sua vez, melhor do que o pH 7,5. Além do mais, no mesmo pH (7,0 e 7,5), formulações à base de Tris forneceram ligeiramente menos HMW do que o sistema de tamponamento com Fosfato.

[00266] Com respeito a LMW, as formulações no P5-3 a P5-5 (pH < 6,5) mostraram boa estabilidade após 2 semanas a 45 °C. Formações de LMW substancial e de bandas extras no gel de SDS-PAGE ocorreram para a formulação no P5-6 a P5-9 (7,0 <pH < 8,5). A degradação de LMW foi mais pronunciada para a formulação no P5-9 (Tris pH 8,5) (ver a Figura 7) e bandas extras no gel de SDS-PAGE eram especialmente visíveis para no P5-7 (Fosfato pH 7,5) (ver a Figura 8). Notar que os produtos de degradação pareceram diferentes para os sistemas tamponados com Fosfato e Tris.

[00267] O Ensaio no 6 confirmou essas conclusões e mostrou que para o mesmo pH, formulações à base de Fosfato forneceram ligeiramente mais LMW do que sistemas de tamponamento com Tris.

[00268] Em relação a HMW e LMW, os pHs ácidos pareceram apresentar estabilidade melhor do que os básicos, com uma leve vantagem para o sistema de tamponamento com Tris sobre aquele com Fosfato.

[00269] O estresse térmico a 45 °C por 4 semanas foi um recurso relevante para forçar a degradação química do Anticorpo Líder (ou seja, mudança no padrão ácido) evidenciada por IEF e, portanto, para selecionar sistemas tampão-pH proporcionando boa estabilidade para o Anticorpo Líder (ver a Figura 9). As formulações menos estáveis foram com Tris pH 8,5 (no P5-9) e Fosfato pH 7,5 (no P6-4), pois o padrão de isoformas, ambas apresentaram 2 formas ácidas extras e a forma principal tornou-se a mínima. O candidato a sistema tampão-pH system mostrando boa estabilidade foi Tris pH 7,0 (no P6-5).

[00270] Em conclusão, com base na análise do estado inicial e nos resultados do programa de estresses nos ensaios no P5 e 6 (soluções a 1 mg/mL), o pH foi definido em 7,0. Essa seleção é um meio-termo entre boa estabilidade, no que diz respeito a partículas visíveis e subvisíveis (pHs básicos) e estabilidade no que diz respeito a HMW e LMW (pHs ácidos). Em relação a sistemas de tamponamento, ambos, Fosfato e Tris, mostraram desvantagens para o pH selecionado: Fosfato, em relação a partículas visíveis subvisíveis, e Tris em relação a HMW e LMW.

[00271] Notar que, para a primeira avaliação de aditivos, usou-se os sistemas de tamponamento Fosfato 10 mM ou Tris 10 mM:

[00272] • Para confirmar os resultados acima em soluções do Anticorpo Líder a 100 mg/mL,

[00273] • E para testar o processo de congelamento-secagem em ambos os sistemas de tamponamento separadamente.

[00274] Os resultados acima foram confirmados e ambos os sistemas de tamponamento (no P14-3 e P14-8) mostraram bons resultados durante o processo de congelamento e secagem (ver a Figura 19).

[00275] Em pH 7,0, Fosfato possui uma capacidade mais forte de tamponamento do que Tris; contudo, diferentemente de Tris, sua base mostra uma tendência para se precipitar durante as etapas de congelamento. Para combinar as vantagens de Tris e de Fosfato, uma mistura desses dois sistemas de tamponamento foi selecionada: Fosfato 6,3 mM e Tris 3,7 mM. Ainda que o uso de tampão Tris ou tampão fosfato seja conhecido na técnica (o uso de cada um separadamente), a combinação de tampão Tris com tampão fosfato em um sistema tampão é altamente incomum e desconhecida na técnica.

Condutividade (seleção de pH e tampão)

[00276] A solução antes da liofilização apresentou uma condutividade por volta de 300 µS/cm, o que fornece uma condutividade teórica de 850 µS/cm para o DP após a reconstituição.

[00277] Tentou-se primeiramente um tampão comumente utilizado para um mAb: Histidina, em sua região de tamponamento em pH 6,2 e 6,6 e em uma concentração de 10 mM. Em pH 6,2, encontrou-se um problema relacionado à insolubilidade, com precipitação do Anticorpo Líder à temperatura ambiente (ver a Figura 29). Em pH 6,6, a solução era ligeiramente opalescente à temperatura ambiente, o segundo coeficiente virial era baixo 0,4 10-4 mL.mol/g2. Diferentemente da maioria dos mAbs, a Histidina não é um bom tampão para o Anticorpo Líder.

[00278] Tentou-se, então, outro tampão comumente utilizado: Fosfato em sua região de tamponamento em pH 6,5, 7,0 e 7,5 e a uma concentração de 10 mM. Para pH 6,5 e 7,0, o segundo coeficiente virial foi abaixo de 1,5 10-4 mL.mol/g2, o que significa baixa estabilidade coloidal. Para pH 7,5, o segundo coeficiente virial foi próximo a 3,0 10-4 mL.mol/g2, o que significa boa estabilidade coloidal, contudo, um estresse térmico (2 semanas a 45 °C) mostrou uma diminuição de pureza (aumento de HMW e de LMW) mais importante do que para pH 6,5 e 7,0. Fosfato é um bom tampão, no entanto, em pH ácido, a estabilidade coloidal é baixa e, em pH básico, o Anticorpo Líder é sensível ao estresse térmico.

[00279] A fim de ampliar o rastreamento de tampões, Tris foi testado em sua região de tamponamento em pH 7,0, e 7,5 e a uma concentração de 10 mM. Os dois pHs apresentaram boa estabilidade coloidal com um coeficiente viral próximo a 3,0 10-4 mL.mol/g2. O estresse térmico (2 semanas a 45 °C) mostrou uma diminuição de pureza (aumento de HMW e de LMW) mais importante para pH 7,5 do que para pH 7,0. Entretanto, Tris em pH 7,0 proporcionou uma estabilidade muito melhor, em relação a HMW, e uma estabilidade ligeiramente melhor em relação a LMW do que Fosfato no mesmo pH. Tris pH 7,0 é um sistema de tamponamento melhor do que Tris pH 7,5 e fosfato pH 7,0. Embora, para que uma boa capacidade de tamponamento de Tris fosse obtida nesse pH (pka = 8,1), a quantidade necessária deveria ser maior do que a máxima utilizada em um produto comercializado.

[00280] A fim de otimizar o tampão para o Anticorpo Líder, uma combinação de Fosfato 6,5mM/Tris 3,7mM foi selecionada para obter uma boa capacidade de tamponamento em pH 7,0, que se deve ao Fosfato (pka = 7,2) e uma boa estabilização do Anticorpo Líder que se deve a Tris.

[00281] Tal como declarado acima, ainda que o uso de tampão Tris ou tampão fosfato seja conhecido na técnica (o uso de cada um separadamente), a combinação de tampão Tris com tampão fosfato em um sistema tampão é altamente incomum e desconhecida na técnica.

Força iônica/concentração de sal

[00282] Cloreto de sódio (NaCl) foi testado com os dois candidatos selecionados para tampão-pH a uma concentração de 70 mM em soluções do Anticorpo Líder a 100 mg/mL.

[00283] As temperaturas de início e de desnaturação obtidas por DSC, bem como a estabilidade coloidal obtida por SLS não indicaram qualquer efeito considerável de NaCl sobre a estabilidade das soluções.

[00284] Após o estresse mecânico do ensaio no P13 de formulação e o armazenamento por duas semanas a 5 °C da mesma formulação, os candidatos no P13-1 e P13-3, ou seja, sem NaCl, mostraram estabilidade melhor em relação à formação de HMW (ver a Figura 10). Os mesmos c/c na Figura 33.

[00285] Aumentar a concentração de sal tornou a força iônica maior, o que provocou um aumento na cinética de agregação do Anticorpo Líder. Assim, determinou-se que a formulação não deve conter sal ou um agente osmótico. Além disso, determinou-se que a formulação ideal deve comprometer-se a uma baixa concentração de tampão a fim de ter uma força iônica baixa.

Exemplo 3 - Tensoativo

[00286] A etapa seguinte no processo de desenvolvimento da formulação foi determinar os excipientes ideais para a formulação do Anticorpo Líder. Os excipientes precisam ser suficientes para estabilizar o Anticorpo Líder, além de serem compatíveis com a liofilização. Diversos tensoativos diferentes foram testados, como polissorbatos e poloxâmeros, em várias concentrações. Tabela 7 - Ensaio no P12 - Rastreamento de aditivos a 85 mg/mL Tabela 8 - Ensaio no P23 - Rastreamento de aditivos a 100 mg/mL

[00287] Imediatamente depois da filtração através de 0,22 µm, os ensaios de formulações e os controles ficaram livres de partículas visíveis e subvisíveis. A análise por SEC mostrou uma pureza < 92,0% em decorrência da concentração do Anticorpo Líder de 4,5 mg/mL para 100 mg/mL (o DS inicial continha 3,0% de HMW).

[00288] O estresse mecânico foi um recurso relevante para a discriminação entre os candidatos à formulação. Pela disponibilidade limitada de quantidade do material de partida, não foi possível uma observação visual padrão e, portanto, foi utilizada a observação embaixo uma lente de aumento. Em relação a partículas visíveis/subvisíveis, os candidatos mostrando boa estabilidade para o ensaio no 12 foram como segue (ver a Figura 11):

[00289] • PS80 0,1%: no P12-6

[00290] • PS20 0,1%: no P12-8

[00291] Entre os tensoativos testados, nenhum teve impacto sobre a formação de HMW em comparação à formulação sem tensoativo, exceto por no P12-8 (PS20 0,1%), que teve um leve efeito negativo sobre o armazenamento de seis semanas a 5 °C (ver a Figura 12).

[00292] Em conclusão, não houve diferença forte entre os tensoativos. O tensoativo seguinte, PS80, foi selecionado para evitar a formação de partículas visíveis/subvisíveis.

[00293] Em seguida, várias concentrações de PS80 foram testadas na formulação do Anticorpo Líder (ver a Tabela 23). As concentrações de PS80 de 0,05-0,2% foram testadas para estresse por agitação mecânica por 15 horas a 350 rpm (temperatura ambiente). As amostras foram analisadas por microscopia em câmara de fluxo, e os resultados são mostrados na Tabela 9. A Tabela 9 mostra que uma concentração de PS80 concentração entre 0,05 e 0,2% tinha um efeito estabilizante equivalente para todas as concentrações independentemente do estresse por agitação mecânica. Assim, uma concentração de PS80 de 0,05 a 0,2% pode ser utilizada na formulação. Tabela 9 - Concentração de PS80

Exemplo 4 – Sacarose

[00294] Tal como declarado acima, a etapa seguinte no processo de desenvolvimento da formulação foi determinar os excipientes ideais para a formulação do Anticorpo Líder. Os excipientes precisam ser suficientes para estabilizar o Anticorpo Líder, e ser compatíveis com a liofilização. Diversos açúcares diferentes foram testados, como sacarose, trealose e manitol, em várias concentrações. Tabela 10 - Ensaio no P14 - Rastreamento de aditivos para um liofilizado

[00295] Em conclusão, com base nos estudos acima, sacarose foi escolhida como excipiente porque estabilizou o Anticorpo Líder. Além disso, é bem conhecido que a sacarose é um lioprotetor, de modo que esta melhorará a formulação liofilizada. Na verdade, a liofilização sem sacarose leva a um aumento em HMW (ver a Figura 19). Ademais, sacarose 5% demonstrou ser ótima para a formulação.

Exemplo 5 - Agentes estabilizantes

[00296] Tal como declarado acima, a etapa seguinte no processo de desenvolvimento da formulação foi determinar os excipientes ideais para a formulação do Anticorpo Líder. Os excipientes precisam ser suficientes para estabilizar o Anticorpo Líder, e serem compatíveis com a liofilização. Diversos agentes estabilizantes diferentes foram testados, como manitol, aspartato, prolina, glicina, arginina e leucina, em várias concentrações. Isso pode ser visto nas Tabelas abaixo e nas Tabelas 10-14 acima.

[00297] O objetivo desses rastreamentos era encontrar um aditivo para estabilizar mais ainda o Anticorpo Líder em relação à formação de HMW (ensaio no 12, 15, 20-FDS e 21). Em decorrência da elevada sensibilidade do Anticorpo Líder à agregação, a temperatura pretendida para o armazenamento prolongado (ou seja, 5 °C) demonstrou ser relevante para monitorar o efeito dos aditivos.

[00298] Um modelo de Desenho de Experimento (DoE)- Rastreamento, primeiro grau, matriz D ótima, foi realizado para rastrear o efeito de diferentes açúcares, polióis, aminoácidos e solventes sobre a formação de HMW (ensaio no 15). O resultado desse DoE está resumido na Tabela 19. Tabela 19 - Resultado do ensaio no 15 (DoE) referente ao rastreamento de aditivos

[00299] Os aditivos que demonstraram exercer um efeito sobre HMW foram testados separadamente no ensaio no 12 e 20-FDS:

[00300] • Os aminoácidos glicina (no P12-1 e P20-4-FDS) e prolina (no P20-3-FDS) demonstraram exercer o melhor efeito em minimizar a formação de HMW (ver a Figura 13 e a Figura 14),

[00301] • Manitol (no P20-1-FDS) veio depois (ver a Figura 14),

[00302] • Seguido por sacarose (no P12-3) e trealose (no P12-4), que foram muito menos eficientes (ver a Figura 13),

[00303] • Finalmente, um efeito positive de aspartato 8% (no P20-2- FDS) não foi confirmado a uma concentração de 4% (ver a Figura 14).

[00304] • Diversos outros aditivos foram testados durante o ensaio no 21:

[00305] • Lisina (no P21-5) demonstrou exercer um leve efeito positive sobre a formação de HMW (ver a Figura 15),

[00306] • Manitol (no P21-1) demonstrou ser o melhor nesse ensaio.

[00307] Foi constatado que a adição de prolina à formulação tinha dois efeitos: controlava a formação de HMW ao reduzir a taxa de agregação na formulação líquida e atuava como um agente de volume para tornar o bolo mais elegante na formulação liofilizada. Foi também constatado que a adição de manitol à formulação liofilizada fazia com que o bolo fosse mais elegante.

[00308] Em seguida, várias concentrações de prolina foram testadas na formulação do Anticorpo Líder (ver a Tabela 23). As concentrações de 1% e 3% foram testadas. As amostras foram analisadas por UPLC, e os resultados são mostrados nas Tabelas 20 e 21 e na Figura 16. As Tabelas 20 e 21 mostram que uma concentração de prolina de 1 ou 3% pode ser utilizada na formulação. Esses dados também confirmam o efeito positivo da prolina sobre a cinética de HMW. Além disso, o bolo é ligeiramente mais elegante (menos retraído) com prolina a 3%, o que confirma a função de prolina como lastro (resultados não mostrados). Tabela 20 - Prolina 1% Tabela 21 - prolina 3%

[00309] Em conclusão, embora a formação de HMW tivesse reduzido significativamente pela adição de excipientes, a saber manitol e aminoácidos como glicina e prolina, o efeito benéfico a uma concentração do Anticorpo Líder de 100 mg/mL não é suficientemente forte para conseguir um prazo de validade satisfatório. Consequentemente, uma formulação liofilizada, juntamente com um processo de liofilização foi desenvolvida.

Exemplo 6 - Formulações liofilizadas

[00310] Para o processo de congelamento/secagem, 5 a 5,5 mL do protótipo FDS desejado a uma concentração do Anticorpo Líder variando de 20-38 mg/mL foi dispensado em frascos de 15 mL (ver como exemplos a Tabela 13 e a Tabela 14).

[00311] O processo de congelamento/secagem foi realizado em uma solução previamente concentrada de 20 a 38 mg/mL na formulação próxima à final formulação de 5 a 5,5 mL dispensados em frascos de 15 mL.

[00312] Três tipos diferentes de sistemas de liofilizados da Usifroid foram utilizados: PL45 (ensaio no 14), SMH-300 (ensaio no 17) e SMH- 90 (ensaio no 16, 18, 20). Para detalhes sobre os ciclos de liofilização, ver a Tabela 22. A inclinação na mudança de temperatura entre as etapas de liofilização é de 1 °C/minuto. Tabela 22 - Ciclos de liofilização utilizados para cada ensaio

[00313] A substância seca obtida foi então reconstituída na concentração alvo de 100 mg/mL pela adição da quantidade apropriada de água para injetáveis (WFI) (1,0 a 1,6 mL).

[00314] Para os ensaios de liofilização no P16-20, soluções com 1 mL de FDS foram congeladas a -20 °C, descongeladas à temperatura ambiente uma vez e então analisadas.

[00315] O congelamento e descongelamento do DS intermediário (final da etapa de HAP- BD) foi também testado (ensaio no 9). Para esse ensaio, 20 mL de DS em frascos Nalgene HDPE de 50 mL foram congelados a -20 °C e a -70 °C, descongelados à temperatura ambiente uma vez e então analisados.

[00316] Foram realizados os seguintes métodos analíticos:

[00317] • Inspeção visual quanto à aparência (clareza e cor)

[00318] • Obscurecimento de luz (HIAC) para quantificação de partículas subvisíveis

[00319] • SEC para pureza da proteína

[00320] • SDS-PAGE para pureza da proteína

[00321] • IEF para heterogeneidade de carga

[00322] • FCM para quantificação de partículas subvisíveis

[00323] • DLS para agregação

[00324] • DSC para temperatura de desnaturação

[00325] • SLS para estabilidade coloidal

[00326] • Espectroscopia FT-IR para estrutura secundária

[00327] • Espectroscopia por fluorescência para estrutura terciária

[00328] • Karl Fischer para determinação da porcentagem de água residual (do liofilizado)

[00329] • XRPD para determinação da matriz cristalina/amorfa do bolo (do liofilizado)

[00330] Os principais critérios para a seleção das formulações e do processo de liofilização foram:

[00331] Os parâmetros seguintes foram monitorados:

[00332] • Estabilidade do Anticorpo Líder durante o processo de liofilização

[00333] • Estabilidade da solução reconstituída

[00334] • Estabilidade do FDS (solução antes da liofilização)

[00335] • Elegância do bolo

[00336] • Tempo de reconstituição

[00337] • Estabilidade do bolo

[00338] • O ciclo de congelamento-secagem foi selecionado para evitar o colapso dos bolos (ver a Tabela 22):

[00339] • A temperatura de congelamento foi definida abaixo da temperatura de solidificação completa, ou seja, ligeiramente abaixo da temperatura de transição vítrea (Tg'), que foi medida por DSC para cada candidato a FDS (solução antes da liofilização) (ver a Figura 17).

[00340] • A temperatura de secagem primária foi definida de tal modo que a temperatura da amostra permanecesse abaixo da temperatura de colapso, que é próxima da Tg' (ver a Figura 17).

[00341] Os bolos obtidos durante os vários ensaios de liofilização eram todos elegantes (ver a Figura 18) e o tempo de reconstituição situou-se dentro de cinco minutos. Ainda que seja importante monitorá-los durante o desenvolvimento, esses parâmetros não são relevantes para a discriminação entre as formulações.

[00342] Durante a etapa de congelamento, uma taxa de resfriamento de 1 °C/minuto foi selecionada para evitar desvios significativos na concentração do Anticorpo Líder e no pH. A temperatura de secagem secundária foi selecionada (ver a Tabela 22) para obter um nível da água residual no bolo medido por Karl Fischer abaixo de 1%.

[00343] A estabilização do Anticorpo Líder foi avaliada por SEC e SDS-PAGE, em relação à pureza, e por DLS e FCM em relação à formação de partículas. Os critérios relevantes para a discriminação entre as formulações foram o nível de HMW antes e depois da reconstituição e a contagem de partículas subvisíveis após a reconstituição.

[00344] Para avaliar o impacto do processo de liofilização, o nível de HMW antes da liofilização e depois da reconstituição foi representado para cada formulação, bem como o aumento desse nível - em porcentagem relativa ao nível anterior à liofilização (ver a Figura 19 e a Figura 20). Nas figuras, uma linha tracejada indica um aumento de 10%. Os candidatos proporcionando boa estabilidade foram:

[00345] • Fosfato com Sacarose 10%: no P14-2

[00346] • Fosfato e Tris com Sacarose 5% + Manitol 3%: no P14-3 e P14-8

[00347] • Fosfato com Manitol 3% + Glicina 1%: no P14-6

[00348] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Manitol 3%: no P20-1

[00349] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Aspartato 3%: no P20-2

[00350] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Prolina 3%: no P20-3

[00351] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Glicina 3%: no P20-4

[00352] Notar que sem quaisquer excipientes (no P14-1), o Anticorpo Líder é fortemente instável frente ao processo de liofilização, pois se observou um aumento em torno de 130% para HMW antes e depois da liofilização. Esse resultado era previsto, já que um ciclo de congelamento/descongelamento efetuado no DS a -20 °C e a -70 °C (ensaio no 9) mostrou uma forte desestabilização do Anticorpo Líder (ver a Figura 21) - sendo o congelamento a primeira etapa do processo de liofilização.

[00353] Em relação a partículas subvisíveis, uma comparação por FCM entre as soluções reconstituídas mostrou uma estabilidade melhor para os seguintes candidatos:

[00354] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Prolina 3%: no P20-3

[00355] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Glicina 3%: no P20-4

[00356] Observação: não determinado para o ensaio no 14

[00357] Para estabilizar o Anticorpo Líder após a reconstituição do bolo, foram utilizados excipientes que demonstraram previamente desacelerar a agregação (ver a Seção referente a Rastreamento de excipientes para uma formulação líquida). A estabilização do Anticorpo Líder após a reconstituição foi avaliada por SEC, em relação à pureza, e por DLS e FCM em relação à formação de partículas. Os critérios relevantes para a discriminação entre as formulações foram:

[00358] • O nível de HMW 24 horas após a reconstituição (armazenamento a 5 °C)

[00359] • O número de partículas após o estresse mecânico.

[00360] Em relação à formação de HMW 24 horas após a reconstituição (armazenamento a 5 °C), os candidatos que proporcionaram a melhor estabilidade foram (ver a Figura 22 e a Figura 23):

[00361] • Fosfato com Manitol 3% + Glicina 1%: no P14-6

[00362] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Prolina 3%: no P20-3

[00363] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Glicina 3%: no P20-4

[00364] seguidos por:

[00365] • Fosfato com Sacarose 10%: no P14-2

[00366] • Fosfato e Tris com Sacarose 5% + Manitol 3%: no P14-3, P14-7 e P14-8

[00367] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Manitol 3%: no P20-1

[00368] Para avaliar a estabilidade do liofilizado, a reconstituição foi efetuada imediatamente após a fabricação e depois de um mês (ensaios no 16-20) até dois meses (ensaios no 18-20). Os candidatos a liofilizado foram armazenados a 5 °C (ensaio no 16-20) e a 20 °C (ensaio no 17). A estabilidade do bolo foi avaliada por SEC, em relação à pureza, por FCM, em relação à formação de partículas, e por XRPD em relação à estrutura do bolo.

[00369] Com respeito à formação de HMW e de partículas visíveis/subvisíveis, todas as formulações demonstraram ser estáveis enquanto armazenadas a 5 °C (ver a Figura 24 e a Figura 25). O leve aumento em nível de HMW observado para os ensaios no 17 e 20 depois de um mês a 5 °C não se reproduziu nos ensaios seguintes (não mostrados). Além disso, foi observado um leve aumento no nível de HMW durante o armazenamento a 20 °C (ver a Figura 24).

[00370] A estabilidade do FDS, que é um parâmetro importante para assegurar a qualidade de um DP, foi levam em conta para os ensaios no 16-18 e 20. A estabilização do Anticorpo Líder nesse estágio do processo foi avaliada por SEC, em relação à pureza, e por DLS e FCM em relação à formação de partículas. Constatou-se que o armazenamento a 5 °C era relevante para monitorar o efeito dos aditivos sobre a estabilidade do Anticorpo Líder. Um ciclo de congelamento/descongelamento efetuado no FDS era também relevante para a discriminação entre as formulações.

[00371] Com respeito à estabilidade do Anticorpo Líder enquanto armazenado a 5 °C, os resultados foram descritos na Seção referente a Aditivos (ver a Figura 14). A melhor estabilidade foi obtida para:

[00372] • Tris/Fosfato com Sacarose 1,75% + Prolina 1,05%: no P20-3-FDS

[00373] • Tris/Fosfato com Sacarose 1,75% + Glicina 1,05%: no P20-4-FDS

[00374] seguidos por:

[00375] • Tris/Fosfato com Sacarose 1,75% + Manitol 1,05%: no P20-1-FDS

[00376] Com respeito à estabilidade do Anticorpo Líder após um ciclo de congelamento/descongelamento, a contagem de partículas, efetuada por FCM, mostrou que os seguintes candidatos à formulação eram estáveis:

[00377] • Tris/Fosfato com Sacarose 1,67% + Manitol 1%: no P17-2- FDS

[00378] • Tris/Fosfato com Sacarose 1,75% + Manitol 1,05%: no P20-1-FDS

[00379] • Tris/Fosfato com Sacarose 1,75% + Prolina 1,05%: no P20-3-FDS

[00380] Em conclusão, considerando os seguintes critérios: estabilidade do Anticorpo Líder durante o processo, aspecto e estabilidade do bolo, bem como tempo de reconstituição, estabilidade da solução reconstituída e do FDS, dois candidatos à formulação se destacaram nitidamente:

[00381] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Manitol 3%

[00382] • Tris/Fosfato com Sacarose 5% + Prolina 3%

Conclusões relativas aos Exemplos 2-6

[00383] Durante o trabalho pré-formulação, a formação de partículas visíveis/subvisíveis foi controlada graças à seleção de uma faixa de pH (> 7,0), de um sistema de tamponamento (Tris/Fosfato) e, especialmente, à adição de um tensoativo: polissorbato 80 a uma concentração of 0,2%.

[00384] No entanto, a formação de HMW representava ainda um problema para uma formulação líquida. Embora a formação de HMW fosse significativamente reduzida pela seção do pH ótimo (7,0) e de alguns excipientes (a saber sacarose, manitol e aminoácidos como glicina e prolina), o efeito benéfico a 100 mg/mL não evitou suficientemente a formação de HMW que se esperaria para um prazo de validade satisfatório de uma formulação líquida.

[00385] Consequentemente, desenvolveu-se uma formulação liofilizada juntamente com um processo de liofilização. Para evitar a agregação durante o processo de liofilização, selecionou-se um crioprotetor: sacarose a uma concentração de 5%. Os excipientes estabilizantes para a formulação líquida foram testados no processo de liofilização para estabilizar melhor tanto o líquido antes da liofilização (concentração: 35 mg/mL) como a solução reconstituída (concentração: 100 mg/mL). Alguns desses excipientes eram compatíveis com o processo de liofilização e, entre estes, dois foram selecionados: manitol e prolina a uma concentração de 3%. Os principais critérios para a seleção foram: elegância e estabilidade do bolo, bem como estabilidade do FDS (solução antes da liofilização) e da solução reconstituída.

[00386] As duas formulações colocadas em estabilidade prolongada diferiam em um excipiente (ver a Tabela 23):

[00387] • Protótipo 1: Prolina

[00388] • Protótipo 2: Manitol Tabela 23 - Descrição das formulações

Estudos adicionais da formulação (Exemplos 7-8)

[00389] As abreviações usadas nos Exemplos 7-8 são:

[00390] DP: Medicamento

[00391] DS: Princípio ativo

[00392] FD: Desenvolvimento da Formulação

[00393] FDS: Princípio ativo formulado

[00394] FIM: Primeira vez no homem

[00395] GRAS: Geralmente reconhecido como seguro

[00396] HDPE: Polietileno de alta densidade

[00397] HMW: Elevado peso molecular

[00398] IEF: Focalização isoelétrica

[00399] IL: Interleucina

[00400] LMW: Baixo peso molecular

[00401] PC: Policarbonato

[00402] PES: Poliéter sulfona

[00403] PP: Polipropileno

[00404] PVDF: Fluoreto de polivinilideno

[00405] RT: Temperatura ambiente

[00406] SC: Subcutâneo

[00407] Td1: Primeira temperatura de desnaturação

[00408] TOR: Tempo fora de refrigeração

Sumário

[00409] O objetivo desses estudos (Exemplos 7-8) foi melhorar a estabilidade do FDS em relação à alta propensão para formação de HMW do Anticorpo Líder no estado líquido.

[00410] O plano de estudo foi definido com base no conhecimento anterior adquirido nos estudos pré-formulação (Exemplos 2-6) e é centrado na cinética de formação de HMW à temperatura ambiente, no FDS a 35 mg/mL.

[00411] Todos os tampões e os excipientes utilizados já eram utilizados seja em produtos comercializados de anticorpos ou em outros produtos para uso parenteral e, especialmente, são todos GRAS (Geralmente reconhecidos como seguros). O pH varia entre 6,2 e 7,4.

[00412] No total, 50 formações diferentes foram comparadas lado a lado com a formulação descrita na Tabela 23. As principais conclusões foram:

[00413] • Valores de pH em torno de 6,2 diminuem a solubilidade do Anticorpo Líder: formação de gel e precipitação foram observadas com Succinato e Histidina respectivamente

[00414] • Além disso, Histidina deve ser evitada em pH 6,6, pois a solução ficou opalescente e ligeiramente menos estável termicamente

[00415] • Na faixa de pH entre 6,6 e 7,4, não houve efeito nítido do pH sobre a cinética de formação de HMW

[00416] • A força iônica crescente teve um efeito desestabilizante sobre a cinética de formação de HMW

[00417] • Fosfato e Citrato foram os melhores tampões testados, desde que estivessem em concentração baixa, como 1,75 mM

[00418] • Entre todos os excipientes testados, o melhor efeito estabilizante foi obtido com Glicina 10 e 72 mM e com Sacarose 2,4%. No entanto, o efeito estabilizante não permitiu desacelerar significativamente a formação de HMW.

[00419] Em conclusão, os resultados nos Exemplos 7-8 não identificaram uma nova combinação de excipientes que pudesse melhorar significativamente as formulações descritas na Tabela 23 em relação à formação de HMW. A recomendação foi manter a formulação a seguir (ver a Tabela 24): Fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS80 0,2% (p/v), Sacarose 5% (p/v), Prolina 3% (p/v). Tabela 24 - Descrição da formulação

Introdução

[00420] O Anticorpo Líder é um anticorpo biespecífico (BsAb) humanizado obtido por engenharia genética, que é direcionado para as citocinas IL-4 e IL-13. Seu peso molecular, conforme determinado por espectrometria de massa, é 198 kDa e seu Ip, conforme determinado por IEF, varia entre 5,8 e 6,2.

[00421] Mudanças importantes no processo de fabricação de DS estão sendo implementadas para estudo de Fase IIb, e um estudo de comparabilidade da qualidade de DS e DP está planejado entre a Fase I/IIa e a Fase IIb. Como parte das mudanças no processo de fabricação de DS, decidiu-se realizar um estudo da formulação com o objetivo de reduzir a formação de HMW no estado líquido. Assim, a melhora potencial da formulação poderia ser incluída no estudo de comparabilidade.

[00422] Notar que, ao mesmo tempo, o processo de fabricação de DP para Fase IIb está sendo aperfeiçoado para aumento de escala, descongelamento de FDS e mudança de dose de DP/frasco para 100 mg/7 mL em vez de 150 mg/frasco de 15 mL. Esse estudo está sendo conduzido paralelamente ao desenvolvimento da formulação.

[00423] O perfil alvo atual do produto para esse estudo (Exemplos 7-8) estipula as características abaixo do medicamento:

[00424] • Via de administração: Injeção SC

[00425] • Forma do DP: liofilizada

[00426] • Concentração: solução reconstituída a 100 mg/mL

[00427] • Prazo de validade: 24 meses

[00428] • Temperatura de armazenamento: 2 °C-8 °C

[00429] • Concentração da dose: 100 mg/frasco

[00430] • Recipiente primário: frasco de vidro tipo 1 de 7 mL com paredes transparentes

[00431] O princípio ativo deve ser formulado a 35 mg/mL antes do armazenamento a -20 °C em frascos de policarbonato. Nenhum excipiente adicional é incluído, nem diluições são realizadas antes do congelamento-secagem.

[00432] Os estudos pré-formulação e da formulação para FIM permitiram as seguintes conclusões:

[00433] • Evitar pH ácido < 6,0 (baixa estabilidade térmica e coloidal) e pH básico > 7,5 (formação de LMW e isoformas de carga sob estresse térmico).

[00434] • As partículas visíveis/subvisíveis foram reduzidas significativamente pelo uso de polissorbato 80 a uma concentração de 0,2% em combinação com o sistema de tamponamento Fosfato/Tris, pH 7,0

[00435] • A cinética de formação de HMW aumenta com a concentração do Anticorpo Líder, e as formulações testadas não evitaram suficientemente a formação de HMW a 100 mg/mL para que se pudesse esperar um prazo de validade satisfatório para uma formulação líquida.

[00436] • A formação de HMW no estado líquido levou ao desenvolvimento de um DP liofilizado reconstituído com um pouco menos de 1/3 do volume inicial (antes da liofilização) para alcançar 100 mg/mL a partir de um FDS a 35 mg/mL. Um crioprotetor e um lioprotetor foram selecionados: Sacarose a uma concentração de 5%.

[00437] • A formulação selecionada para Fase I e IIa foi a seguinte: Fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS80 0,2% (p/v), Sacarose 5% (p/v), Prolina 3% (p/v).

[00438] Essa formulação poderia ser aperfeiçoada com respeito à formação de HMW combinando os excipientes identificados por um leve efeito positivo exercido, a saber: Sacarose, Manitol e aminoácidos como Glicina e Prolina.

[00439] A formação de HMW no estado líquido foi identificada como a principal via de degradação. A cinética aumenta com a temperatura da solução (10 vezes mais lenta a 5 °C do que a RT no DP) e com a concentração do Anticorpo Líder:

[00440] • FDS a 35 mg/mL e RT: ?HMW= +1,6% em 7h e +4,1% em 24h

[00441] • DP a 100 mg/mL e RT: ?HMW= +0,6% em 1h e +3,5% em 5h

Objetivos

[00442] O objetivo desse estudo (Exemplos 7-8) foi aumentar a estabilidade do Anticorpo Líder no estado líquido com respeito à formação de HMW. A fim de definir os alvos quantitativos para esse estudo, os valores a seguir foram propostos:

[00443] • 5h a RT depois da reconstituição de DP para estabilidade durante o uso: ?HMW<+1% em 5h,

[00444] • 12h de TOR para FDS a fim de facilitar a fabricação de DP: ?HMW<+1% em 12h.

[00445] Esses valores alvo levam em conta as condições de uso do DP reconstituído a 100 mg/mL e as condições do processo de fabricação quando o FDS a 35 mg/mL está fora de condições refrigeradas. Esses valores devem ser ajustados dependendo do Perfil de Qualidade Alvo do Produto.

Desenho do estudo

[00446] A abordagem proposta para esse estudo (Exemplos 7-8) foi rastrear os excipientes combinados sobre uma ampla variedade de formulações em concentrações do Anticorpo Líder de 35 mg/mL.

[00447] O rastreamento de formulações centrou-se em excipientes estabilizantes que pudessem potencialmente afetar a formação de HMW. Para esse estudo, decidiu-se o seguinte:

[00448] • PS80 e Sacarose nas concentrações da formulação da Fase I foram mantidos no rastreamento, pois nenhum impacto negativo sobre a formação de HMW nessas concentrações havia sido demonstrado, e um forte impacto positivo sobre o processo de fabricação e/ou reconstituição havia sido observado.

[00449] • A faixa de pH foi estreitada entre 6,2 e 7,4 porque estudos anteriores haviam demonstrado o benefício de se manter o pH em torno de pH 7.

[00450] • Os 5 tampões injetáveis dentro dessa faixa de pH foram rastreados, isoladamente ou combinados com diversos excipientes: outros sistemas de tamponamento e/ou aditivos (aminoácidos, sacarose (além daqueles já contidos na formulação da Fase I) e sais principalmente).

Princípio ativo

[00451] Os DS utilizados nesse estudo (Exemplos 7-8) são descritos na Tabela 25. Tabela 25 - Descrição de DS

Medicamento

[00452] Os DP utilizados nesse estudo (Exemplos 7-8) foram formulados com a formulação da Fase I/IIa (Fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS80 0,2%, Sacarose 5%, Prolina 3%) (ver a Tabela 26). Tabela 26 - Descrição de DP Fórmula(s)

[00453] As fórmulas para cada ensaio nos Exemplos 7-8 estão listadas abaixo na Tabela 27. Tabela 27 – Fórmula

Processo de fabricação

[00454] As formulações nos Exemplos 7-8 foram fabricadas com uma solução concentrada de Anticorpo Líder, obtida por UF/DF, a uma concentração de 42 mg/mL em sacarose 2,1%. A solução do Anticorpo Líder foi diluída com soluções estoque concentradas de excipientes.

Processo de UF/DF

[00455] Durante o processo de UF/DF (Exemplos 7-8), a solução proteica inicial a 35 mg/mL foi primeiramente concentrada para 40 mg/mL e o tampão foi então trocado. Depois da diafiltração, a solução proteica concentrou-se para acima de 42 mg/mL, que era a concentração alvo final (ver a Tabela 28).

[00456] O material utilizado e as condições do processo de cada UF/DF são descritos na Tabela 28. No final da UF/DF, a concentração do Anticorpo Líder foi ajustada para 42 mg/mL em solução de Sacarose 2,1%. Tabela 28 - Parâmetros de fabricação - UF/DF Ajuste da formulação

[00457] A solução UF/DF do Anticorpo Líder pós-UF/DF (Exemplos 7-8) foi diluída com quantidades apropriadas de soluções estoque concentradas até a formulação final desejada. A referência e a composição das soluções concentradas fabricadas para esse estudo são resumidas na Tabela 29. Tabela 29 - Fórmulas de soluções estoque concentradas

[00458] Cada formulação foi filtrada estéril (Millex® GV) sob fluxo laminar, e uma fração foi dispensada em um frasco de vidro tipo I de 2 mL, conforme apropriado (1 a 2 mL) e fechado com rolha para cada momento da estabilidade.

Condições de estresse Estresse térmico

[00459] As condições do estresse térmico realizado nos Exemplos 7-8, de acordo com os ensaios de formulação, estão listadas na Tabela 30. Tabela 30 - Condições do estresse térmico a Em decorrência do ar condicionado do laboratório, a RT varia entre 21 °C e 29°C b Realizado em uma câmara refrigerada não GMP c Câmara termostática GMP

Descrição dos métodos analíticos

[00460] Os métodos analíticos abaixo foram realizados nos

Exemplos 7-8:

[00461] • Inspeção visual quanto ao aspecto (clareza e cor)

[00462] - As soluções em frascos de 7 mL foram observadas com luz natural

[00463] • HPLC-SEC para pureza proteica

[00464] - 2 colunas PROSEC 300S- 250 x 4,6 mm a 35 °C

[00465] - Fase móvel: Fosfato 0,1 M/NaCl 0,2 M pH 7,0

[00466] - Detecção: 280 nm

[00467] - Injeção: 10 µL (concentração 5 mg/mL)

[00468] - Vazão: 0,2 mL/min

[00469] - Tempo total da corrida: 40 min

[00470] O método analítico a seguir foi realizado:

[00471] • UPLC-SEC para pureza proteica

[00472] - Coluna: 1 Acquity BEH200 SEC (150 x 4,6 mm dp = 1,7 µm) a 40 °C

[00473] - Fase móvel: Na2HPO4 50 mM/NaClO4 300 mM em pH 7,0

[00474] - Detecção: UV a 280 nm

[00475] - Injeção: 1 µL (solução a 5 mg/mL) Padrão 3014ET

[00476] - Injeção: 2 µL (soluções a 2,0 mg/mL)

[00477] - Vazão: 0,3 mL/min

[00478] - Tempo total de corrida: 8 min

[00479] O método analítico a seguir foi monitorado:

[00480] • DSC para temperatura de desnaturação:

[00481] - Calorimetria diferencial de varredura (DSC) foi utilizada para estimar a estabilidade térmica do anticorpo em diferentes formulações.

[00482] - As aferições calorimétricas foram realizadas com DSC VP-capilar de 25 °C para 100 °C com uma taxa de aquecimento de 1 °C/min.

[00483] - A curva de capacidade forneceu informações sobre a temperatura de desnaturação Td (°C) (pico máximo).

Critérios de avaliação

[00484] • SEC: Os resultados eram considerados comparáveis quando a diferença era igual ou inferior a 0,5% de HMW.

[00485] • DSC: resultados eram considerados comparáveis quando a diferença Td1 era igual ou inferior a 0,4 °C.

Método UPLC versus HPLC

[00486] O primeiro rastreamento (ensaios no H04-150 a 172) havia sido realizado com o método de HPLC desenvolvido para Fase I. Uma questão referente a um desvio do basal que teve impacto sobre a determinação do nível de HMW havia sido observada quando um número alto de amostras era analisado consecutivamente.

[00487] Para o segundo rastreamento (ensaios no H04-185 a 190), a fim de obter uma evolução precisa do nível de HMW, foi utilizado um método de UPLC para o qual nenhum desvio do basal havia sido observado. O mesmo perfil cromatográfico do padrão foi observado mesmo depois que 200 amostras tivessem sido injetadas na mesma coluna.

Referências para aferições por SEC

[00488] A fim de comparar as diferentes séries em relação à evolução de HMW ao longo do tempo, a formulação Fase I foi utilizada como referência:

[00489] • Para o primeiro rastreamento (ensaios no H04-150 a 172), o FDS Fase I foi obtido, para cada uma das 3 séries, por reconstituição com WFI a 35 mg/mL do liofilizado de DP no H04-016.

[00490] • Para o segundo rastreamento (ensaios no H04-185 a 190), além do FDS Fase I anterior (H04-016), outro FDS Fase I recém- fabricado juntamente com as formulações testadas foi utilizado, para cada uma das 3 séries. Além disso um 3o FDS Fase I de referência (no LT-10006-DS) foi utilizado: o FDS não congelado-seco, mas somente descongelado.

[00491] Inesperadamente, a cinética de HMW pareceu ser diferente entre as várias referências. Para comparação, dois liofilizados de DP haviam sido comparados junto com o liofilizado de DP no H04-016. A diferença dentro do liofilizado de DP tornou-se significativa após 40 horas a RT. No entanto, a referência descongelada, no LT-10006-DS era significativamente diferente de todos os liofilizados de DP a partir de 16 horas a RT. O liofilizado de DP apresentou cinética de HMW mais rápida do que a referência descongelada, no LT-10006-DS e, assim, não pode ser utilizado para a comparação com as formulações fabricadas nesse estudo (as formulações para esse estudo foram fabricadas partindo de FDS descongelado (ver a Seção referente ao Processo de fabricação) para a formulação Fase I/IIa).

[00492] Utilizando o mesmo lote e DP congelado-seco recentemente preparado, não foi observada diferença significativa em cinética de HMW entre o FDS descongelado e o liofilizado de DP. Assim, a cinética de HMW observada nas formulações recentemente fabricadas para esse estudo seria observada também nas mesmas formulações após o congelamento-secagem.

[00493] A conclusão extraída desses ensaios não pode ser generalizada para todos os liofilizados de DP e todos os FDS descongelados. A comparação da cinética de HMW entre lotes diferentes pode depender de vários parâmetros e necessitará um estudo específico e separado.

Resultados e discussão

[00494] Todas as formulações fabricadas nos Exemplos 7-8 continham pelo menos 1,75% (p/v) de sacarose e próximo a 0,07% (p/v) de PS80. Essas concentrações são valores nominais e baseiam- se no fator de diluição aplicado à solução inicial do Anticorpo Líder. Quanto à concentração de PS80, foi pressuposto que a adsorção de PS80 durante a UF/DF era descartável. Essas concentrações de excipientes eram iguais às da formulação Fase I.

Exemplo 7 - Rastreamento de tampão

[00495] O pH neste exemplo foi rastreado de 6,2 a 7,4, e, dentro dessa faixa, todos os tampões injetáveis foram testados: Succinato, Histidina, Citrato, Fosfato e Tris.

A) Tipo de tampão e pH

[00496] No primeiro rastreamento (ensaios no H04-150 a 172), os tampões acima foram testados a uma concentração de 10 mM, em combinação com diversos excipientes que será detalhada mais no Exemplo 8 - Rastreamento de aditivos. Notar que a concentração do tampão foi fixada em 10 mM e que seu impacto sobre a formação de HMW será visto na Seção referente à Concentração de tampão (Exemplo 7).

DSC

[00497] Os resultados de DSC mostraram que todas as formulações eram comparáveis à referência (Td1= 65,5 °C), exceto para formulações com Histidina, que eram ligeiramente menos estáveis termicamente (Td1= 64,7 °C a 65,1 °C) (ver a Figura 26).

Inspeção visual no tempo inicial

[00498] Todas as formulações eram límpidas e comparáveis à referência, exceto por formulações em pH 6,2 e formulações com Histidina em pH 6,6.

[00499] Em pH 6,2, foi observada uma diminuição da solubilidade para os dois tampões estudados:

[00500] • As formulações com Histidina precipitaram a RT (ver a Figura 27)

[00501] • As formulações com Succinato eram levemente opalescentes a RT e pode-se observar a formação de um gel a 5 °C (ver a Figura 27), que era reversível quando a solução retornou a RT e foi gentilmente agitada. O succinato pode apresentar propriedades quelantes.

[00502] • As formulações com Histidina em pH 6,6 eram ligeiramente mais opalescentes a RT do que a referência.

Evolução de HMW por SEC

[00503] Os resultados apresentados neste exemplo foram obtidos de 3 séries diferentes, portanto, a evolução de HMW não pode ser comparada diretamente, mas somente com a referência.

[00504] • Histidina pH 6,6 foi comparável à referência a RT e ligeiramente melhor a 5 °C (+2,4% para Histidina apenas e +3,2% em 144h para a referência).

[00505] • Citrato pH 6,6 foi ligeiramente melhor a RT do que a referência (+4.6% para Citrato apenas e +5,2% em 24h para a referência) e comparável à referência a 5 °C.

[00506] • Fosfato pH 6,6 foi ligeiramente melhor a RT do que a referência (+8,2% para Fosfato apenas e +9,0% in 48h para a referência) e comparável à referência a 5 °C.

[00507] • Fosfato pH 7 foi comparável à referência a RT e a 5 °C.

[00508] • Tris pH 7 foi ligeiramente pior do que a referência a RT (+7,8% para Tris apenas e +7,0% em 48h para a referência) e comparável à referência a 5 °C.

[00509] • Tris pH 7,4 foi comparável à referência a RT e a 5 °C.

[00510] Ver a Figura 28.

[00511] Em relação à formação de HMW, em pH 6,6, Fosfato e Citrato foram comparáveis e, em pH 7,0, Fosfato foi ligeiramente mais estabilizante do que Tris. Os tampões acima a 10 mM não podem ser comparados diretamente à formulação Fase I/IIa, pois a referência utilizada para esse rastreamento era um liofilizado fabricado a partir de outro lote (ver a Seção acima referente a Referência para aferições por SEC).

Conclusão

[00512] Em relação ao rastreamento do sistema de tamponamento a uma concentração de 10 mM, pode ser concluído que:

[00513] • Valores de pH em torno de 6,2 (próximo ao pI) diminuíram a solubilidade do Anticorpo Líder:

[00514] - Foi observada formação de gel com Succinato em pH 6,2

[00515] Foi observada precipitação com Histidina em pH 6,2

[00516] • Adicionalmente, Histidina deve ser evitada em pH 6,6, pois a solução ficou opalescente e ligeiramente menos estável termicamente

[00517] • Não tendência evidente de efeito do pH dentro da faixa de 6,6 a 7,4 sobre a formação de HMW para os tampões testados: Histidina, Citrato, Fosfato e Tris

[00518] • Efeito muito fraco do tampão referente à formação de HMW, embora Citrato e Fosfato parecessem ser os melhores tampões a 10 mM

B) Aperfeiçoamento do pH em formulação Fase I/IIa

[00519] A fim de terminar, na mesma execução, a influência do pH sobre a formação de HMW, o pH foi rastreado sobre a faixa de 6,7 a 7,2 na formulação Fase I (ensaios no H04-187).

DSC

[00520] Os resultados de DSC mostraram que todas as formulações eram comparáveis à referência (pH 7,0) (ver a Figura 29).

Evolução de HMW por SEC

[00521] Houve uma leve tendência para formação decrescente de HMW quando o pH era aumentado de 6,7 para 7,2 (ver a Figura 30), contudo, essa diminuição tornou-se significativa somente depois de 24 horas a RT (+4,1% para pH 6,7 e +3,4% para pH 7.2).

Conclusão

[00522] Com um tampão Fosfato 2,2 mM/Tris 1,3 mM (formulação Fase I), houve um leve efeito do pH ao longo da faixa de 6,7 a 7,2 após 24 horas a RT. Contudo, esse efeito foi fraco, pois não foi significativo nas primeiras 16 horas. Isso confirmou o efeito fraco do pH sobre a formação de HMW nessa faixa de pH.

C) Concentração de tampão

[00523] Citrato e Fosfato foram testados em concentrações menores do que 10 mM: 0, 1,75 e 5,25 mM, a fim de investigar a influência da concentração do tampão sobre a formação de HMW (ensaios no H04-185). O pH foi definido em um ponto intermediário na faixa testada: pH= 6,8. Todas as formulações continham Glicina a 72 mM para ajustar a osmolalidade e, como dito no início da Seção referente a Resultados e discussão, Sacarose 1,75% e PS80 por volta de 0,07%.

DSC

[00524] Os resultados de DSC mostraram que todas as formulações eram comparáveis à referência (formulação Fase I) (ver a Figura 31). Notar que Glicina sem qualquer tampão (185A2) foi ligeiramente menos estável do que as outras formulações testadas (diferença próximo a 1 °C em Td1).

Evolução de HMW por SEC

[00525] Para os dois tampões testados, houve uma leve tendência para formação decrescente de HMW quando as concentrações do tampão eram diminuídas, sendo que os melhores resultados foram obtidos sem qualquer tampão e com tampão 1,75 mM (por exemplo, +7,8% para Citrato 10 mM e +7,0% para sem tampão em 48h a RT) (ver a Figura 32). Citrato a 1,75 mM e nenhum tampão foram comparáveis à referência (por exemplo, +7,1% para Citrato e +7,0% para sem tampão em 48h a RT, enquanto que +6,8% para a referência).

Conclusão

[00526] Diminuir a concentração do tampão teve um efeito ligeiramente estabilizante sobre a cinética de formação de HMW. Esse efeito era provavelmente relacionado à força iônica. Nenhum tampão e tampão Citrato 1,75 mM foram os melhores candidatos em termos de formação de HMW, seguidos proximamente por Fosfato 1,75 mM. Aqueles tampões testados com Glicina 72 mM foram comparáveis à formulação Fase I/IIa.

Exemplo 8 - Rastreamento de aditivos

[00527] O rastreamento dos aditivos Glicina, Prolina, Histidina e Tris havia sido realizado em combinação com o rastreamento de tampões (primeiro rastreamento: ensaios no H04-150 a 172) a fim de determinar sinergias potenciais entre os excipientes. O rastreamento dos aditivos Cloreto de sódio, Benzoato de sódio, Glicina e Sacarose (segundo rastreamento: ensaios no H04-185 a 190) havia sido efetuado em Fosfato ou Citrato, os melhores tampões selecionados a partir do primeiro rastreamento (Exemplo 7).

[00528] As formulações continham Sacarose 1,75% e PS80 em torno de 0,07%. A) Cloreto de sódio e Benzoato de sódio

[00529] Cloreto de sódio e Benzoato de sódio foram testados para avaliar os efeitos de força iônica e interações hidrofóbicas, respectivamente, sobre a formação de HMW. Esses aditivos foram testados em Fosfato 1,75 mM pH 6,8 a uma concentração inferior à osmolalidade da formulação Fase I (165 mOsm/kg no FDS).

DSC

[00530] Os resultados de DSC mostraram que a formulação com NaCl era comparável à referência (Td1= 65,7 °C para NaCl e 65,6 °C para a referência), ao passo que a formulação com benzoato de sódio era ligeiramente menos estável termicamente (Td1= 65,0 °C).

Evolução de HMW por SEC

[00531] Para os dois aditivos testados, não houve um efeito negativo nítido sobre a formação de HMW quando comparados à referência (por exemplo, +5,2% para NaCl a 38,5mM, +5,2% para benzoato de sódio a 37,8 mM e +3,2% para a referência em 24h a RT). A evolução sendo semelhante para ambos os excipientes, somente os resultados de NaCl são mostrados nesse exemplo (ver a Figura 33).

Conclusão

[00532] Tal como visto para a concentração de tampão, a força iônica crescente com NaCl ou benzoato de sódio teve um efeito negativo nítido sobre a cinética de formação de HMW. Além disso, o efeito de interações hidrofóbicas sobre a cinética de HMW, decorrente da adição de benzoato de sódio, não foi observado. B) Glicina, Prolina, Histidina e Tris

[00533] Esses aditivos (glicina, prolina, histidina e Tris) foram testados a uma concentração de 10 mM (primeiro rastreamento: ensaios no H04-150 a 172).

DSC

[00534] Os resultados de DSC mostraram que todas as formulações com os aditivos acima eram comparáveis à formulação não os contendo (apenas tampão).

Evolução de HMW por SEC

[00535] As diferenças entre as formulações foram fracas, embora tendências pudessem ser vistas após 48h a RT e 6 dias a 5 °C:

[00536] • Tampão Histidina:

[00537] - A RT: 0 (sem aditivos) = Glicina > Prolina > Tris

[00538] - A 5 °C: 0 > Glicina = Prolina > Tris

[00539] • Tampão Citrato:

[00540] - A RT: Glicina > Prolina = Histidina = Tris = (Tris + Glicina) > 0

[00541] - A 5 °C: Glicina > Prolina = Histidina = Tris = (Tris + Glicina) = 0

[00542] • Tampão Fosfato:

[00543] - A RT: Glicina = Prolina = 0 > Histidina = Tris

[00544] - A 5 °C: Glicina > Prolina = 0 = Histidina = Tris

[00545] • Tampão Tris:

[00546] - A RT: Glicina > 0 = Histidina

[00547] - A 5 °C: Glicina = 0 = Histidina

Conclusão

[00548] Em relação à formação de HMW, os efeitos desses aditivos foram fracos, embora tendências pudessem ser vistas:

[00549] • Glicina a 10 mM teve um leve efeito positivo

[00550] • Histidina e Prolina a 10 mM pareceram não ter efeito

[00551] • Tris a 10 mM não teve efeito estabilizante e pôde ter mesmo um efeito levemente desestabilizante

C) Sacarose e Glicina

[00552] No segundo rastreamento (ensaios no H04-185), uma quantidade adicional de Sacarose de 2,4% (além dos 1,75% de Sacarose já contidos em todas as formulações, que forneceram, no total, 4,15% (p/v) de Sacarose) e Glicina a uma concentração de 72 mM foram testadas nos melhores tampões selecionados (ver a Seção referente a Rastreamento de tampões). Essas concentrações foram maximizadas a fim de não excederem a osmolalidade da formulação Fase I (165 mOsm/kg no FDS). DSC

[00553] Os resultados de DSC mostraram que todas as formulações com Sacarose 2,4% e Glicina 72 mM eram comparáveis à referência (por exemplo, no caso de Sacarose, Td1= 65,7 °C para Fosfato 1,75 mM e 65,6 °C para a referência).

Evolução de HMW por SEC

[00554] O leve impacto positivo de Glicina foi confirmado quando comparada a formulações somente contendo Sacarose para Citrato 1,75 mM e nenhum tampão (ver a Figura 34). No entanto, esse impacto positivo foi significativo somente depois de 48h a RT. Conclusão

[00555] Em relação à formação de HMW, na escala de tempo de interesse (< 24h a RT), as formulações com Sacarose e Glicina, testadas nos melhores candidatos a tampão, foram comparáveis à formulação Fase I.

Conclusões relativas aos Exemplos 7-8

[00556] Para esse estudo, em torno de 50 formulações haviam sido fabricadas e comparadas lado a lado com a formulação Fase I/IIa formulação atual. O rastreamento do pH variou de 6,2 a 7,4, envolvendo todos os tampões injetáveis dentro dessa faixa de pH, isoladamente ou combinados com diversos excipientes (todos GRAS) a fim de avaliar sinergias potenciais entre os excipientes.

[00557] Nesse estudo, as principais conclusões foram:

[00558] • Valores de pH em torno de 6,2 diminuem a solubilidade do Anticorpo Líder: observou-se formação de gel e precipitação com Succinato e Histidina respectivamente;

[00559] • Além disso, Histidina deve ser evitada em pH 6,6, pois a solução ficou opalescente e ligeiramente menos estável termicamente;

[00560] • Na faixa de pH entre 6,6 e 7,4, não efeito nítido do pH sobre a cinética de formação de HMW;

[00561] • A força iônica crescente teve um efeito desestabilizante sobre a cinética de formação de HMW;

[00562] • Fosfato e Citrato foram os melhores tampões testados, desde que estivessem em concentração baixa, como 1,75 mM;

[00563] • Entre todos os excipientes testados, o melhor efeito estabilizante havia sido obtido com Glicina 10 e 72 mM e Sacarose 2,4%. No entanto, o efeito estabilizante não permitiu desacelerar significativamente a formação de HMW; e

[00564] • Prolina, sem efeito a 10 mM, que poderia ser utilizada como agente isotônico (o efeito de Prolina a 91 mM (concentração de prolina na formulação de FDS da Fase I)), não foi avaliada em relação à formação de HMW (por exemplo, avaliar a formulação de FDS da Fase I com e sem Prolina).

[00565] Em conclusão, os resultados dos Exemplos 7-8 não identificaram uma nova combinação de excipientes que pudesse melhorar significativamente a formulação atual em relação à formação de HMW. Ou seja, os resultados nos Exemplos 7-8 confirmam os resultados nos Exemplos 1-6. A recomendação foi manter a formulação atual da Fase I/IIa para estudos de Fase IIb. A formulação atual era, portanto, a seguinte (ver a Tabela 31): Fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS80 0,2% (p/v), Sacarose 5% (p/v), Prolina 3% (p/v). Tabela 31 - Descrição da formulação da Fase I/IIa/IIb

[00566] Um ajuste quantitativo da formulação atual (aperfeiçoamento das concentrações de excipientes sem a adição de novos excipientes) pode ser realizado para a formulação da Fase III/comercial.

Claims (22)

1. Formulação estável de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende: um anticorpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 ou seu fragmento de ligação a antígeno, compreendendo uma cadeia leve da fórmula VL1-ligante-VL2 e uma cadeia pesada da fórmula VH1-ligante- VH2, em que VL1 e VH1 formam um domínio de ligação a antígeno de IL-13 e VL2 e VH2 formam um domínio de ligação a antígeno de IL-4; e um sistema de tamponamento adequado para manter o pH da formulação a pH 7; em que o sistema de tamponamento compreende tampão Tris e tampão de fosfato e em que a formulação possui uma concentração de sal de 15 mM ou menos a fim de reduzir a força iônica da formulação e em que a formulação compreende manitol.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a) VL1 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 1; V H1 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 2; V L2 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 3; e V H2 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NO: 4 ou 5; ou b) VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; V H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; V L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e V H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 5.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a cadeia leve compreende a fórmula N- VL1-ligante-VL2-CL, em que CL é um domínio constante da cadeia leve de um anticorpo, e em que a cadeia pesada compreende a fórmula N-VH1-ligante-VH2-CH1-CH2-CH3, em que CH2-CH3 corresponde ao domínio Fc de um anticorpo.

4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o ligante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende ainda um domínio de região constante, em que o domínio de região constante é selecionado a partir do grupo constituído por CH1, CH2, CH3 e CL.

6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo IgG4 biespecífico humanizado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a concentração de anticorpo ou de seu fragmento de ligação a antígeno é 100 mg/mL.

8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a concentração do sistema de tamponamento é 10 mM.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração do tampão Tris é 3,7 mM e/ou a concentração do tampão Fosfato é 6,3 mM.

10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um tensoativo não iônico.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a concentração do tensoativo não iônico é 0,05% a 0,2% (p/v).

12. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é um polissorbato.

13. Formulação de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o polissorbato é polissorbato 80.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a concentração de polissorbato 80 é 0,2% (p/v).

15. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um açúcar.

16. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a concentração de açúcar é 5% (p/v).

17. Formulação de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o açúcar é sacarose.

18. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a concentração de manitol é de 1% a 3% (p/v) ou 3% (p/v).

19. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que é uma formulação liofilizada.

20. Formulação liofilizada estável de anticorpo, caracterizada pelo fato de que é reconstituída com água para produzir uma formulação que compreende: 100. mg/mL de um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 4, e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 e 3; 10 mM de um sistema de tamponamento, em que o sistema de tamponamento compreende uma concentração de tampão Tris de 3,7 mM e uma concentração de tampão Fosfato de 6,3 mM; 0,2% (p/v) de polissorbato 80; 5% (p/v) de sacarose; e 3% (p/v) de manitol; em que o pH da formulação é pH 7.

21. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente contendo a formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 e instruções para a administração e o uso da formulação.

22. Uso da formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento ou composição para tratar uma doença alérgica, câncer, asma, uma doença associada com a produção anormal de IL-4 e/ou IL-13 ou uma doença associada com resposta elevada mediada por TH-2.