ES2795993T3 - Formulaciones de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 - Google Patents

Formulaciones de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 Download PDF

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Abstract

Una formulación de anticuerpo estable que comprende: - 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, que comprende una cadena ligera de la fórmula N-VL1-conector-VL2-CL y una cadena pesada de la fórmula N-VH1-conector-VH2-CH1-CH2-CH3, en donde VL1 y VH1 forman un dominio de unión al antígeno de IL-13 y VL2 y VH2 forman un dominio de unión al antígeno de IL-4, en donde VL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; VH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; VL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y VH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 5, en donde el conector consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 en donde CL es el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo; en donde CH2-CH3 corresponde al dominio Fc del anticuerpo; y - 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de 6,3 mM; - 0,2 % (p/v) de polisorbato 80; - 5 % (p/v) de sacarosa; y - 3 % (p/v) de manitol; en donde el pH de la formulación es pH 7; en donde el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico IgG4 humanizado.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona formulaciones de anticuerpos farmacéuticos estables, que incluyen formulaciones liofilizadas, que comprenden un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 y un sistema tampón, en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7, y en donde la formulación tiene una baja concentración de sales para reducir la fuerza iónica de la formulación. Las formulaciones pueden comprender, opcionalmente, además un tensioactivo no iónico, un azúcar y/o un agente estabilizante no iónico. Las formulaciones se pueden usar en el tratamiento de diversas enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Tanto IL-4 como IL-13 son citocinas terapéuticamente importantes basándose en sus funciones biológicas y desempeñan funciones críticas en muchas enfermedades, que incluyen asma (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vol. 5, 161-166). Se ha mostrado que IL-4 es capaz de inhibir la enfermedad autoinmunitaria, e IL-4 e IL-13 han mostrado ambas el potencial de potenciar las respuestas inmunitarias antitumorales. Puesto que ambas citocinas participan en la patogénesis de enfermedades alérgicas, los inhibidores de estas citocinas podrían proporcionar beneficios terapéuticos.
Para desarrollar una formulación farmacéutica que contenga un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 adecuado para administración subcutánea, el anticuerpo se debe concentrar a aproximadamente 100 mg/mL o más. Sin embargo, pueden surgir muchas complicaciones a dichas altas concentraciones, que incluyen un aumento en la viscosidad, un desplazamiento del pH, un cambio en el color de la disolución y la formación de partículas visibles y sub-visibles. La formulación del anticuerpo se complica además por el hecho de que es altamente propensa a la agregación a altas concentraciones. Mientras que los anticuerpos típicos normalmente forman agregados de alto peso molecular (HMW) inferiores a 5 % durante un periodo de tiempo de 4 años a 5 °C, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 forma HMW a una tasa de entre 0,5-1 % por hora a 25 °C, y a 0,1 % por hora a 5 °C. De hecho, este anticuerpo tiene tal fuerte tendencia a agregar que no se puede formular en un líquido en el intervalo de concentración objetivo. Finalmente, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 tiene un punto isoeléctrico particularmente bajo, que lo hace más difícil de formular debido a problemas de solubilidad. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 tiene un punto isoeléctrico entre 5,8 y 6,2, mientras que la mayoría de los anticuerpos tienen un punto isoeléctrico entre 8 y 10.
Por consiguiente, existe una necesidad de formulaciones farmacéuticas mejoradas y estables que puedan tratar estas complicaciones. El documento de patente WO2012/125775 desvela una formulación liofilizada de un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 para la administración subcutánea, que comprende 100 mg/mL del anticuerpo en fosfato de sodio 6,3 mM monobásico, TRIS 3,7 mM, 5 % (p/v) de sacarosa, 3 % (p/v) de prolina, 0,2 % (p/v) de polisorbato 80, pH 7.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención es como se define por las reivindicaciones.
Para cumplir estas y otras necesidades, en el presente documento se proporcionan formulaciones de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 altamente estables. Se han encontrado formulaciones de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 altamente estables en forma de líquidos y polvos liofilizados que comprenden un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 y un sistema tampón, en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7, y en donde la formulación tiene una baja concentración de sales para reducir la fuerza iónica de la formulación. Las formulaciones pueden comprender, opcionalmente, además un tensioactivo no iónico, un azúcar y/o un agente estabilizante no iónico. Estas formulaciones mejoran las formulaciones convencionales, que frecuentemente conducen a agregación molecular (HMW) del anticuerpo aumentando la concentración del anticuerpo en la formulación, y la formación de partículas visibles y sub-visibles. En particular, las formulaciones de la invención presentan buena estabilidad en lo que respecta a las partículas visibles, partículas sub-visibles, proteínas de bajo peso molecular y proteínas de alto peso molecular.
La solicitud desvela una formulación de anticuerpo estable que comprende: un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera de la fórmula VL1 -conector-VL2 y una cadena pesada de la fórmula VH1-conector-VH2, en donde VL1 y VH1 forman un dominio de unión de IL-13 al antígeno y VL2 y VH2 forman un dominio de unión de IL-4 al antígeno; y un sistema tampón adecuado para mantener el pH de la formulación a aproximadamente pH 7; y en donde la formulación tiene una baja concentración de sales para reducir la fuerza iónica de la formulación.
En aspectos específicos, VL1 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 1; VH1 comprende las secuencias de c Dr de s Eq ID n O: 2; VL2 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 3; y VH2 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 4 o 5. Según la invención, VL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; VH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; VL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y VH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 5.
En realizaciones específicas, la cadena ligera comprende la fórmula N-VL1-conector-VL2-CL, en donde CL es un dominio constante de la cadena ligera de un anticuerpo, y en donde la cadena pesada comprende la fórmula N-VH1-conector-VH2-CH1-CH2-CH3, en donde CH2-CH3 corresponde al dominio Fc de un anticuerpo. Según la invención, el conector consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende además un dominio de la región constante. En realizaciones específicas, el dominio de la región constante se selecciona del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CL.
El anticuerpo biespecífico en la formulación de la invención es un anticuerpo biespecífico IgG4 humanizado.
La concentración de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 100 mg/mL.
En ciertas realizaciones, el sistema tampón comprende al menos dos tampones. Según la invención, la concentración del sistema tampón es 10 mM y el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de 6,3 mM.
La formulación comprende además un tensioactivo no iónico. En aspectos específicos, la concentración de tensioactivo no iónico es aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 0,2 % (p/v). En aspectos específicos, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En aspectos específicos, el polisorbato es polisorbato 80. En aspectos específicos, la concentración de polisorbato 80 es aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 0,2 % (p/v). Según la invención, la formulación comprende polisorbato 80 a la concentración de 0,2 % (p/v).
La formulación comprende además un azúcar. En aspectos específicos, la concentración de azúcar es aproximadamente 5 % (p/v). En aspectos específicos, el azúcar es un disacárido. En aspectos específicos, el disacárido es sacarosa. Según la invención, la formulación comprende sacarosa a la concentración de 5 % (p/v).
La formulación comprende un agente estabilizante no iónico que es manitol. Según la invención, la concentración de manitol es 3 % (p/v).
En ciertas realizaciones de la invención, la formulación es una formulación liofilizada.
En ciertas realizaciones de la invención, la formulación presenta buena estabilidad con respecto a las partículas visibles, partículas sub-visibles, proteínas de bajo peso molecular y proteínas de alto peso molecular.
La divulgación proporciona una formulación de anticuerpo liofilizado estable que comprende: aproximadamente 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3; aproximadamente 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de aproximadamente 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2 % (p/v) de polisorbato 80; aproximadamente 5 % (p/v) de sacarosa; y aproximadamente 3 % (p/v) de prolina; en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7.
La divulgación proporciona una formulación de anticuerpo liofilizado estable que comprende: aproximadamente 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3; aproximadamente 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de aproximadamente 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2 % (p/v) de polisorbato 80; aproximadamente 5 % (p/v) de sacarosa; y aproximadamente 3 % (p/v) de manitol; en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7.
Una realización de la invención proporciona un kit que comprende un recipiente que comprende una formulación de la invención e instrucciones para la administración y uso de la formulación.
Una realización de la invención proporciona una formulación para su uso para tratar una enfermedad alérgica, cáncer, asma, una enfermedad asociada a la producción anormal de IL-4 y/o IL-13, o una enfermedad asociada a una elevada respuesta mediada por TH-2 en donde la formulación es la formulación de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un esquema que muestra una molécula de anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 a modo de ejemplo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Las dos cadenas ligeras comprenden el resto N-VLhB -B i3-conector-VLh8D4-8-CL-C y las dos cadenas pesadas comprenden el resto N-VHhB -B i3-conector-VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C. La secuencia conectora comprende (G4S)2 o GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6).
La Figura 2 ilustra las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo a modo de ejemplo, es decir, dominios variables humanizados del anticuerpo anti-IL-13 B-B13 (SEQ ID NOS: 1 y 2) y dominios variables humanizados del anticuerpo anti-IL-48D4-8 (SEQ ID NOS: 3, 4 y 5). El subrayado indica los cambios de aminoácidos hechos. La negrita indica las secuencias de CDR (SEQ ID NOS: 7-21).
La Figura 3 es un grupo de imágenes que muestran la contaminación de partículas para el ensayo N° P5 (cribado de pH-tampón) después del estrés por agitación.
La Figura 4 es un gráfico que muestra partículas sub-visibles >1,5 pm de contaminación después de varios estreses para el ensayo N° P6 (cribado pH-tampón).
La Figura 5 es un gráfico que muestra partículas sub-visibles >10 pm de contaminación después de varios estreses para el ensayo N° P6 (cribado pH-tampón).
La Figura 6 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P6 (cribado pH-tampón) después de estrés térmico.
La Figura 7 es un gráfico que muestra cromatogramas de SEC del ensayo N° P5 (cribado pH-tampón) después de 2 semanas a 45 °C.
La Figura 8 es una imagen de un gel de SDS-PAGE del ensayo N° P5 (cribado pH-tampón) después de 2 semanas a 45 °C.
La Figura 9 es una imagen de un gel de IEF después de 2 semanas a 45 °C para el ensayo N° P5 y 6 (cribado pH-tampón).
La Figura 10 es un gráfico que muestra el nivel de HMW después del programa de estrés en el ensayo N° P13 (efecto de sal).
La Figura 11 muestra imágenes de imágenes binoculares del ensayo N° P12 (tensioactivo) después del estrés mecánico.
La Figura 12 es un gráfico que muestra la monitorización de HMW para el ensayo N° P12 (tensioactivo) mientras se almacena 6 semanas a 5 °C.
La Figura 13 es un gráfico que muestra la monitorización de HMW para el ensayo N° P12 (aditivo) mientras se almacena 6 semanas a 5 °C.
La Figura 14 es un gráfico que muestra la monitorización de HMW para el ensayo N° P20-FDS (aditivo) mientras se almacena 4 semanas a 5 °C.
La Figura 15 es un gráfico que muestra la monitorización de HMW para el ensayo N° P21 (aditivo) mientras se almacena 2 semanas a 5 °C.
La Figura 16 es un gráfico de la inversa del contenido de monómero en función del tiempo comparando 1 % de prolina frente a 3 % prolina en la formulación principal.
La Figura 17 es un gráfico que sigue la temperatura durante un proceso de liofilización para la formulación N° P16-1.
La Figura 18 muestra imágenes de la torta N° P18-1 en un vial de vidrio moldeado de 15 mL.
La Figura 19 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P14 (aditivo) después del proceso de liofilización.
La Figura 20 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P20 (aditivo) después de la liofilización.
La Figura 21 es un gráfico que muestra el nivel de HMW (a) e imágenes (b) después de un ciclo de congelación/descongelación en DS no formulado (ensayo N° 9).
La Figura 22 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P14 (aditivo) después de la reconstitución.
La Figura 23 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P20 (aditivo) después de la reconstitución.
La Figura 24 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P17 (aditivo) después del almacenamiento y la reconstitución de la torta.
La Figura 25 es un gráfico que muestra el nivel de HMW para el ensayo N° P20 (aditivo) después del almacenamiento y la reconstitución de la torta.
La Figura 26 es un gráfico que muestra los resultados de DSC para el primer cribado (ensayos N° H04-150 a 172 - cribado pH-tampón).
La Figura 27 muestra imágenes de un aspecto visual de las formulaciones de histidina y succinato (ensayos N° P-H04-144 y 148, N2 H04-150 A1 a A6).
La Figura 28 son gráficos que muestran evoluciones de HMW para el cribado del tampón a 5 °C (ensayos N° H04-150 B1) y TA (ensayos N2 H04-163 A1, B1, B2 y H04-172 A1, A2) por SEC.
La Figura 29 es un gráfico que muestra los resultados de DSC para el cribado de pH en tampón fosfato/Tris (ensayos N° H04-187).
La Figura 30 es un gráfico que muestra evoluciones de HMW para el cribado de pH en tampón fosfato/Tris por SEC (ensayos N° H04-187).
La Figura 31 es un gráfico que muestra los resultados de DSC para el cribado de la concentración de tampón (ensayos N° H04-185).
La Figura 32 son gráficos que muestran evoluciones de HMW con la concentración de tampón a TA por SEC (ensayos N° H04-185).
La Figura 33 es un gráfico que muestra evoluciones de HMW para NaCl a TA por SEC (ensayos N° H04-185).
La Figura 34 es un diagrama que muestra evoluciones de HMW para glicina frente a sacarosa a TA por SEC (ensayos N° H04-185).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención no se limita a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, vectores o reactivos descritos en el presente documento. Se puede usar en la práctica de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento y solo se describen en el presente documento métodos, dispositivos y materiales a modo de ejemplo.
A. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica.
Se observa aquí que como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" también incluyen referencia al plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo.
El término "aproximadamente" significa dentro de 10 %, y más preferentemente dentro de 5 % (o 1 % o menos) de un valor o intervalo dado.
Los términos "administrar" o "administración" se refieren al acto de inyectar o suministrar físicamente de otro modo una sustancia que existe fuera del cuerpo (por ejemplo, una formulación de la invención) en un paciente, tal como por administración mucosa, intradérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular y/o cualquier otro método de administración física descrito en el presente documento o conocido en la técnica. Cuando se está tratando una enfermedad, o un síntoma de la misma, la administración de la sustancia normalmente ocurre después de la aparición de la enfermedad o síntomas de la misma. Cuando se está previniendo una enfermedad o sus síntomas, la administración de la sustancia normalmente ocurre antes de la aparición de la enfermedad o síntomas de la misma.
En el contexto de un polipéptido, el término "análogo" se refiere a un polipéptido que posee una función similar o idéntica a la que un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, pero no comprende necesariamente una secuencia de aminoácidos similar o idéntica de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, o poseen una estructura similar o idéntica de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos similar se refiere a un polipéptido que cumple al menos uno de los siguientes: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % y preferentemente al menos 90 %, más preferentemente al menos 95 %, o lo más preferentemente al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1-5), un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 descrito en el presente documento; (b) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (o región VH o VL del mismo) descrito en el presente documento de al menos 5 restos de aminoácidos, al menos 10 restos de aminoácidos, al menos 15 restos de aminoácidos, al menos 20 restos de aminoácidos, al menos 25 restos de aminoácidos, al menos 40 restos de aminoácidos, al menos 50 restos de aminoácidos, al menos 60 restos de aminoácidos, al menos 70 restos de aminoácidos, al menos 80 restos de aminoácidos, al menos 90 restos de aminoácidos, al menos 100 restos de aminoácidos, al menos 125 restos de aminoácidos o al menos 150 restos de aminoácidos (véanse, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); y (c) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % y preferentemente al menos 90 %, más preferentemente al menos 95 % o lo más preferentemente al menos 99 % idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (o región VH o VL del mismo) descrito en el presente documento. Un polipéptido con estructura similar a un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 polipéptido, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 se refiere a un polipéptido que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar a un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un fragmento de un polipéptido biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, un epítope biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. La estructura de un polipéptido se puede determinar por métodos conocidos para los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y microscopía electrónica cristalográfica.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de un primer aminoácido o secuencia de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos). Entonces se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad=número de posiciones de solapamiento idénticas/número total de posiciones X 100 %). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) también se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:22642268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:58735877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAs T de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden realizar con el conjunto de parámetros del programa de nucleótidos NBLAST, por ejemplo, para la puntuación=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de interés. Se pueden realizar búsquedas de proteínas con BLAST con el conjunto de parámetros del programa XBLAST, por ejemplo, para puntuar 50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de interés. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402. Alternativamente, se puede usar PSI BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) (véase, por ejemplo, Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI) en internet en ncbi dot nlm dot nih dot gov). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software del alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de restos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. En el cálculo del porcentaje de identidad, normalmente solo se cuentan coincidencias exactas.
Un "antagonista" o "inhibidor" se refiere a una molécula capaz de inhibir una o más actividades biológicas de una molécula diana, tal como la señalización por IL-4 y/o IL-13. Los antagonistas pueden interferir con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, incapacitando o destruyendo células activadas por un ligando, y/o interfiriendo con la activación de receptores o ligandos (por ejemplo, activación de tirosina cinasa) o transducción de señales después de la unión del ligando a un receptor. El antagonista puede bloquear completamente las interacciones receptor-ligando o puede reducir sustancialmente dichas interacciones. En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 son anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 antagonistas humanizados, preferentemente anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 antagonistas monoclonales humanizados.
Los términos "anticuerpo", "inmunoglobulina" o "Ig" se pueden usar intercambiablemente en el presente documento. El término anticuerpo incluye, pero no se limita a, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantemente producidos, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, Fvs monocatenarios (scFv) (por ejemplo, que incluyen monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs unidos por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) y fragmentos de unión a epítope de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, dominios de unión al antígeno o moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se unen específicamente a un antígeno IL-4 o IL-13 (por ejemplo, una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13). Los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), cualquier clase (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En realizaciones preferidas, los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 son humanizados, tales como anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 monoclonales humanizados. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 son anticuerpos IgG, anticuerpos IgG4 humanos.
El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida por los anticuerpos de la presente invención. Un antígeno puede tener uno o más de un epítope. Los ejemplos de antígenos reconocidos por los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas séricas, por ejemplo, citocinas tales como IL-4, IL5, IL9 e IL-13, péptidos bioactivos, moléculas de la superficie celular, por ejemplo, receptores, transportadores, canales de iones, proteínas virales y bacterianas.
El término "sitio de unión al antígeno" se refiere a parte del anticuerpo que comprende el área que se une específicamente y es complementaria a parte o todo un antígeno. Donde un antígeno es grande, un anticuerpo solo se puede unir a una parte particular del antígeno, parte que se llama el epítope. Un dominio de unión al antígeno se puede proporcionar por uno o más dominios variables de anticuerpos. Preferentemente, un dominio de unión al antígeno está hecho de la asociación de un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH).
El término "agente de unión" significa cualquier molécula, tal como un anticuerpo, un ARNip, un ácido nucleico, un aptámero, una proteína o un compuesto orgánico de molécula pequeña, que se une o se une específicamente a IL-4 y/o IL-13, o una variante o un fragmento de la misma.
Los términos "anticuerpo biespecífico" o "anticuerpos biespecíficos (BsAbs)" se refieren a moléculas que combinan los sitios de unión al antígeno de dos anticuerpos dentro de una única molécula. Así, un anticuerpo biespecífico es capaz de unir dos antígenos diferentes simultáneamente. Además de las aplicaciones para fines diagnósticos, los BsAbs sientan las bases para nuevas aplicaciones terapéuticas redireccionando los potentes sistemas efectores a áreas enfermas o aumentando la neutralización o estimulando actividades de anticuerpos. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser monoclonales, pero preferentemente son humanos o humanizados. Se conocen bien en la técnica métodos de preparación de anticuerpos biespecíficos.
El término "subproducto" incluye productos no deseados, que quitan valor o disminuyen la proporción de agente de unión terapéutico/profiláctico, tal como un anticuerpo, en una formulación dada. Por ejemplo, los subproductos típicos incluyen agregados de anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, por ejemplo producidos por la degradación del anticuerpo por desamidación o hidrólisis, o mezclas de los mismos. Normalmente, los agregados son complejos que tienen un peso molecular superior al anticuerpo monomérico. Los productos de degradación de anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, provocados por desamidación o hidrólisis. Normalmente, los productos de degradación son complejos que tienen un peso molecular inferior al anticuerpo monomérico. En el caso de un anticuerpo IgG, dichos productos de degradación son inferiores a aproximadamente 150 kD.
Los términos "composición" y "formulación" pretenden englobar un producto que contiene los componentes especificados (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13) en, opcionalmente, las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los componentes especificados en, opcionalmente, las cantidades especificadas.
Los términos "región constante" o "dominio constante" se refieren a una porción del extremo carboxi de la cadena ligera y pesada que no participa directamente en la unión del anticuerpo al antígeno, pero presenta diversas funciones efectoras, tales como interacción con el receptor de Fc. Los términos se refieren a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con respecto a la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión al antígeno. El dominio constante contiene los dominios CH1, CH2 y CH3 de la cadena pesada y el dominio CHL de la cadena ligera.
El término "trastorno" se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con la formulación de la presente invención. Éste incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen las afecciones patológicas que predisponen al mamífero, y en particular a los seres humanos, al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se va a tratar en el presente documento incluyen cánceres, inflamación, enfermedades autoinmunitarias, infecciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas y enfermedades metabólicas.
El término "epítope" se refiere a una región localizada sobre la superficie de un antígeno, tal como un polipéptido IL-4 o IL-13 o fragmento de polipéptido IL-4 o IL-13, que es capaz de ser unido a una o más regiones de unión al antígeno de un agente de unión, tal como un anticuerpo, y que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferentemente un mamífero, y lo más preferentemente en un ser humano, que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria. Un epítope que tiene actividad inmunogénica es una porción de un polipéptido que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítope que tiene actividad antigénica es una porción de un polipéptido al que un anticuerpo se une específicamente, como se ha determinado por cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, tal como un inmunoensayo. Los epítopes antigénicos no necesitan ser necesariamente inmunogénicos. Los epítopes normalmente consisten en agrupaciones de superficies químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Una región de un polipéptido que contribuye a un epítope puede ser aminoácidos contiguos del polipéptido o el epítope se puede juntar de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. El epítope puede o puede no ser una característica superficial tridimensional del antígeno. En ciertas realizaciones, un epítope de IL-4 o IL-13 es una característica superficial tridimensional de un polipéptido IL-4 o IL-13. En otras realizaciones, un epítope IL-4 o IL-13 es una característica lineal de un polipéptido IL-4 o IL-13. Los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 se pueden unir específicamente a un epítope de la forma desnaturalizada de IL-4 o IL-13, un epítope de la forma nativa de IL-4 o IL-13, o ambos, la forma desnaturalizada y la forma nativa de IL-4 o IL-13.
El término "excipientes" se refiere a sustancias inertes que se usan comúnmente como un diluyente, vehículo, conservante, aglutinante, agente estabilizante, etc., para fármacos e incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero, etc.), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, alquilsulfonatos, caprilato, etc.), tensioactivos (por ejemplo, SDS, polisorbato, tensioactivo no iónico, etc.), sacáridos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, etc.) y polioles (por ejemplo, manitol, sorbitol, etc.). Véase, por tanto, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.
En el contexto de un péptido o polipéptido, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa. Dicho fragmento puede surgir, por ejemplo, de una truncación en el extremo amino, una truncación en el extremo carboxi y/o una deleción interna de un resto(s) de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos pueden resultar, por ejemplo, de corte y empalme de ARN alternativo o de actividad de proteasas in vivo. En ciertas realizaciones, los fragmentos hIL-4 o hIL-13 incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácidos contiguos, al menos 10 restos de aminoácidos contiguos, al menos 15 restos de aminoácidos contiguos, al menos 20 restos de aminoácidos contiguos, al menos 25 restos de aminoácidos contiguos, al menos 40 restos de aminoácidos contiguos, al menos 50 restos de aminoácidos contiguos, al menos 60 restos de aminoácidos contiguos, al menos 70 restos de aminoácidos contiguos, al menos 80 restos de aminoácidos contiguos, al menos 90 restos de aminoácidos contiguos, al menos 100 restos de aminoácidos contiguos, al menos 125 restos de aminoácidos contiguos, al menos 150 restos de aminoácidos contiguos, al menos 175 restos de aminoácidos contiguos, al menos 200 restos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-4 o IL-13 o un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido IL-4 o IL-13.
Las expresiones y términos "fragmento funcional, variante, derivado o análogo" y similares, así como formas de los mismos, de un anticuerpo o antígeno es un compuesto o molécula que tiene actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo de longitud completa o antígeno de interés. Por ejemplo, un fragmento o análogo funcional de un anticuerpo anti-IL-4 es uno que se puede unir a una molécula de IL-4 o uno que puede prevenir o reducir sustancialmente la capacidad de un ligando, o un anticuerpo agonista o antagonista, para unirse a IL-4.
El término "cadena pesada", cuando se usa en referencia a un anticuerpo, se refiere a cinco tipos distintos, llamados alfa (a), delta (A), épsilon (e), gamma (y) y mu (g), basados en la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. Estos tipos distintos de cadenas pesadas se conocen bien en la técnica y dan lugar a cinco clases de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, que incluyen cuatro subclases de IgG, concretamente IgG1, IgG1, IgG3 e IgG4. Preferentemente, la cadena pesada es una cadena pesada humana.
El término "bisagra" o "región bisagra" se refiere al polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y segundo dominios constantes de un anticuerpo.
Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv , Fab, Fab', F(ab)2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a diana) que contienen secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana, en comparación con un anticuerpo humano. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de molde de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la del molde de inmunoglobulina humana elegida. En general, el objetivo es tener una molécula de anticuerpo que sea mínimamente inmunogénica en un ser humano. Así, es posible que uno o más aminoácidos en una o más CDRs también se puedan cambiar a una que es menos inmunogénica para un huésped humano, sin minimizar sustancialmente la función de unión específica de la una o más CDRs a IL-4 y/o IL-13. Alternativamente, la FR puede ser no humana, pero los aminoácidos más inmunogénicos se sustituyen por unos menos inmunogénicos. Sin embargo, el injerto de CDR, como se trata anteriormente, no es la única forma de obtener un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el modificar solo las regiones CDR puede ser insuficiente, ya que no es extraño que los restos de la región estructural tengan una función en determinar la estructura tridimensional de los bucles de CDR y la afinidad global del anticuerpo por su ligando. Por tanto, se puede poner en práctica cualquier medio de manera que la molécula de anticuerpo parental no humana se modifique para ser una que es menos inmunogénica para un ser humano, y la identidad de secuencia global con un anticuerpo humano no siempre es una necesidad. Así, también se puede lograr la humanización, por ejemplo, por la mera sustitución de solo algunos restos, particularmente los que se exponen sobre la molécula de anticuerpo y no enterrados dentro de la molécula, y por tanto, no fácilmente accesibles al sistema inmunitario del huésped. Véanse, por ejemplo, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chotia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), documento de patente WO 2006/042333 y la patente de EE. UU. N° 5.869.619. Alternativamente, los anticuerpos se pueden humanizar por otras técnicas que incluyen injerto de CDR (documentos de patente EPO 0239400; WO 91/09967; y las patentes de EE. UU. N° 5.530.101 y 5.585.089), inactivación o acondicionamiento superficial (documentos de patente EPO 0592 106; EPO 0519596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) y barajado de cadenas (patente de EE. UU. N° 5.565.332). Se pueden preparar anticuerpos humanos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, métodos de presentación en fagos, véanse las patentes de EE. UU. N° 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; y los documentos de patente WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741, usando animales transgénicos, tales como roedores, usando células quiméricas, etc.
"Interleucina-4" (IL-4) se refiere a las proteínas IL-4 de mamífero que existen de forma natural, o endógenas, y a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es la misma que la de una a proteína IL-4 de mamífero que existe de forma natural o endógena correspondiente {por ejemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (es decir, producidas usando los métodos de química orgánica sintética)). Por consiguiente, como se define en el presente documento, el término incluye proteína IL-4 madura, variantes polimórficas o alélicas, y otras isoformas de una IL-4 y formas modificadas o sin modificar de las anteriores (por ejemplo, lipidadas, glucosiladas). IL-4 que existe de forma natural o endógena incluye proteínas naturales tales como IL-4 madura, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas y formas mutantes que ocurren naturalmente en mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos). Dichas proteínas se pueden recuperar o aislar de una fuente que produce naturalmente IL-4, por ejemplo. Estas proteínas y proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que una IL-4 que existe de forma natural o endógena correspondiente se denominan por el nombre del mamífero correspondiente. Por ejemplo, donde el mamífero correspondiente sea un ser humano, la proteína se designa una IL-4 humana. Se conocen en la técnica varias proteínas IL-4 mutantes, tales como las desveladas en el documento de patente WO 03/038041.
"Interleucina-13" (IL-13) se refiere a proteínas IL-13 de mamífero que existen de forma natural o endógenas y a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es la misma que la de una proteína IL-13 de mamífero que existe de forma natural o endógena correspondiente (por ejemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (es decir, producidas usando los métodos de química orgánica sintética)). Por consiguiente, como se define en el presente documento, el término incluye proteína IL-13 madura, variantes polimórficas o alélicas, y otras isoformas de IL-13 (por ejemplo, producidas por corte y empalme alternativo u otros procesos celulares), y formas modificadas o sin modificar de las anteriores (por ejemplo, lipidadas, glucosiladas). Las IL-13 que existen de forma natural o endógenas incluyen proteínas naturales tales como IL-13 madura, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas y formas mutantes que ocurren naturalmente en mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos). Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la IL-13 engloba la variante de IL-13 humana en la que Arg en la posición 110 de IL-13 humana madura se sustituye por Gin (la posición 110 de IL-13 madura corresponde a la posición 130 de la proteína precursora) que está asociada con asma (asma atópica y no atópica) y otras variantes de IL-13 (Heinzmann el al, Hum Mol Genet. 9:549-559 (2000)). Dichas proteínas se pueden recuperar o aislar de una fuente que produce naturalmente IL-13, por ejemplo. Estas proteínas y proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que una IL-13 que existe de forma natural o endógena correspondiente se denominan por el nombre del mamífero correspondiente. Por ejemplo, donde el mamífero correspondiente es un humano, la proteína se designa una IL-13 humana. Se conocen en la técnica varias proteínas IL-13 mutantes, tales como las desveladas en el documento de patente WO 03/035847.
Un agente de unión "aislado" o "purificado", tal como un anticuerpo, está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de célula o tejido de la que deriva el agente de unión, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Por ejemplo, la forma de hablar "sustancialmente libre de material celular " incluye preparaciones de un anticuerpo en las que el anticuerpo se separa de componentes celulares de las células de las que se aísla o produce recombinantemente. Así, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpo que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominado en el presente documento una "proteína contaminante"). Cuando el anticuerpo se produce recombinantemente, también está preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteína. Cuando el anticuerpo se produce por síntesis química, está preferentemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de precursores químicos u otros productos químicos que participan en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones de anticuerpo tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del anticuerpo de interés. En una realización preferida, se aíslan o purifican anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13.
El término "numeración de Kabat" y términos similares son reconocidos en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de restos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros restos de aminoácidos en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 y Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91­ 3242). Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable normalmente varía de las posiciones de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácidos 50 a 65 para CDR2 y posiciones de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable normalmente varía de las posiciones de aminoácidos 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácidos 50 a 56 para CDR2 y posiciones de aminoácidos 89 a 97 para CDR3.
El término "cadena ligera", cuando se usa en referencia a un anticuerpo, se refiere a dos tipos distintos, llamados kappa (k) o lambda (A) basándose en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Se conocen bien en la técnica las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera. En realizaciones preferidas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
El término "conector" se refiere a una molécula que conecta los dominios de unión al antígeno del anticuerpo. El conector puede ser cualquier tipo de molécula conectora. Preferentemente, el conector es un polipéptido. Los conectores pueden ser iguales o se diferencian entre sí y dentro del polipéptido de la cadena pesada y el polipéptido de la cadena ligera. Además, el conector puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. Una unidad preferida de conector peptídico para los dominios de la cadena pesada en cuanto a los dominios de la cadena ligera es (G4S)2 , es decir, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Los números de unidades de conector de la cadena pesada y de la cadena ligera pueden ser iguales (orden simétrico) o se diferencian entre sí (orden asimétrico). Un conector peptídico es preferentemente suficientemente largo como para proporcionar un grado adecuado de flexibilidad para prevenir que los restos de unión al antígeno interfieran con la actividad de los otros, por ejemplo por impedimento estérico, para permitir el apropiado plegamiento de proteínas y, si fuera necesario, para permitir que las moléculas de anticuerpo interaccionen con dos o más receptores, posiblemente ampliamente separados, en la misma célula; además, es preferentemente lo suficientemente corto para permitir que los restos de anticuerpo permanezcan estables en la célula. Por tanto, la longitud, composición y/o conformación de los conectores peptídicos se puede seleccionar fácilmente por un experto en la técnica para optimizar las propiedades deseadas del anticuerpo polivalente.
Los términos "bajo en sal" y "baja concentración en sales" significan una concentración de sales relativamente baja de 15 mM o menos, que incluye una concentración de sales de 0 o sin sal. La concentración de sales se determina por la cantidad de sales y tampones en la formulación. Es preferible que el sistema tampón esté presente en las formulaciones en una baja concentración, es decir, aproximadamente 15 mM o menos, para reducir la fuerza iónica de las formulaciones. Alternativamente, algunas realizaciones preferidas no contienen ni sal ni tampón. También es preferible que no se añadan sales adicionales, tales como NaCl, a las formulaciones, para mantener la fuerza iónica de las formulaciones tan baja como sea posible.
Los términos "manejan", "manejar" y "manejo" se refieren a los efectos beneficiosos que un sujeto obtiene de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico), que no da como resultado una cura de la infección. En ciertas realizaciones, un sujeto se administra con una o más terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos, tales como una formulación de la invención) para "manejar" una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 (por ejemplo, cánceres, inflamación, enfermedades autoinmunitarias, infecciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas y enfermedades metabólicas), uno o más síntomas de las mismas, para prevenir la progresión o el empeoramiento de la enfermedad.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos homogéneos o sustancialmente homogéneos, y cada anticuerpo monoclonal reconocerá normalmente un único epítope sobre el antígeno. En realizaciones preferidas, un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un único hibridoma u otra célula. El término "monoclonal" no se limita a ningún método particular de preparación del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales por el método de hibridoma como se describe en Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975) o se pueden aislar de bibliotecas de fagos. Se conocen bien en la técnica otros métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por las mismas (véase, por ejemplo, Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a Ed.; Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York).
El término "composición farmacéutica", como se usa en la presente invención, se refiere a formulaciones de diversas preparaciones. Las formulaciones que contienen cantidades terapéuticamente eficaces de los anticuerpos son disoluciones estériles líquidas, suspensiones líquidas o versiones liofilizadas y opcionalmente contienen estabilizadores o excipientes.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa que está autorizado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal, o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos, Farmacopea Europea u otra generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" se indica cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa, tal como un anticuerpo monoclonal, para preparar una forma farmacéutica aceptable o conveniente. El "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un excipiente que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y es compatible con otros componentes de la formulación que comprenden el anticuerpo monoclonal.
Los términos "previenen", "prevenir" y "prevención" se refieren a la inhibición total o parcial del desarrollo, reaparición, aparición o propagación de una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 y/o síntoma relacionado con la misma, resultante de la administración de una terapia o combinación de terapias proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos, tales como una formulación de la invención).
El término "agente profiláctico" se refiere a cualquier agente que pueda inhibir totalmente o parcialmente el desarrollo, reaparición, aparición o propagación de una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 y/o síntoma relacionado con la misma en un sujeto. En ciertas realizaciones, el término "agente profiláctico" se refiere a una formulación de la invención. En ciertas otras realizaciones, el término "agente profiláctico" se refiere a un agente distinto de una formulación de la invención. Preferentemente, un agente profiláctico es un agente que se conoce por ser útil para o ha sido o está siendo actualmente usado para prevenir una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 y/o un síntoma relacionado con la misma, o impedir la aparición, desarrollo, progresión y/o intensidad de una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 y/o un síntoma relacionado con la misma. En realizaciones específicas, el agente profiláctico es un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 humanizado.
La expresión "anticuerpo recombinante" incluye anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria recombinante de anticuerpos humanos, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón o vaca) que es transgénico y/o transcromosómico para genes de la inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de la inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina (véase Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N° 91-3242). En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan y están relacionadas con las secuencias de la línea germinal VH y VL, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos in vivo.
El término "sacárido" se refiere a una clase de moléculas que se obtienen de alcoholes polihidroxilados. Los sacáridos se denominan comúnmente hidratos de carbono y pueden contener diferentes cantidades de unidades de azúcar (sacárido), por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
Los términos "se une específicamente a" o "que se une específicamente" significan unir específicamente a un antígeno o un fragmento del mismo y no unir específicamente a otros antígenos. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno se puede unir a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad, como se ha determinado por, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos o variantes o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un antígeno pueden reaccionar de forma cruzada con antígenos relacionados. Preferentemente, los anticuerpos o variantes o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un antígeno no reaccionan de forma cruzada con otros antígenos. Se puede identificar un anticuerpo o una variante o un fragmento del mismo que se une específicamente a un antígeno IL-4 y/o IL-13, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Normalmente, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal o el ruido de fondo, y más normalmente superior a 10 veces el fondo. Véase, por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, Segunda Edición, Raven Press, Nueva York, en las páginas 332-336 para una discusión referente a la especificidad del anticuerpo.
Una formulación "estable" o "estabilizada" es una en la que el agente de unión, tal como un anticuerpo, en ella retiene esencialmente su estabilidad física, identidad, integridad y/o estabilidad química, identidad, integridad y/o actividad biológica al almacenamiento. Están disponibles en la técnica diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada y otras condiciones de almacenamiento durante un periodo de tiempo seleccionado. La estabilidad se puede determinar por al menos uno de los métodos seleccionados del grupo que consiste en inspección visual, SDS-PAGE, IEF, HPSEC, RFFIT y ELISA de kappa/lambda. Por ejemplo, un anticuerpo "retiene su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual de color y/o claridad, o como se mide por dispersión de luz UV, SDS-PAGE o por cromatografía de exclusión por tamaño (alta presión) (HPSEC). Preferentemente, cuando se usan las formulaciones de la invención, 5 % o menos, normalmente 4 % o menos, preferentemente 3 % o menos, más preferentemente 2 % o menos, y particularmente 1 % o menos de los anticuerpos forman agregados, como se mide por HPSEC o cualquier otro método adecuado para medir la formación de agregación. Por ejemplo, se considera que un anticuerpo es estable en una formulación particular si el monómero de anticuerpo tiene una pureza de aproximadamente 90 %, preferentemente aproximadamente 95 %, en particular aproximadamente 98 % después de un cierto periodo de tiempo predeterminado a ciertas condiciones de almacenamiento en una formulación particular. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar la modificación del tamaño (por ejemplo, recorte), que se puede evaluar usando, por ejemplo, (HP)SEC, SDS-PAGE y/o espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (EM MALDI/TOF). Otros tipos de alteración química incluyen alteración de la carga (por ejemplo, que ocurre como resultado de desamidación), que se puede evaluar, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico. Un anticuerpo "retiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica en un momento dado si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado es al menos aproximadamente 90 % (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica presentada en el momento en que se preparó la formulación farmacéutica, como se determina, por ejemplo, en un ensayo de unión al antígeno o ensayo de neutralización de virus.
Los términos "sujeto" y "paciente" se usan intercambiablemente. Como se usa en el presente documento, un sujeto es preferentemente un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) o un primate (por ejemplo, mono y humano), lo más preferentemente un humano. En una realización, el sujeto es un mamífero, preferentemente un humano, que tiene una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13. En otra realización, el sujeto es un mamífero, preferentemente un humano, en riesgo de desarrollar una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13.
La expresión "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia de polipéptidos de la cadena de anticuerpo se puede interpretar como una cadena de anticuerpo que presenta al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia de polipéptidos de referencia. El término con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos se puede interpretar como una secuencia de nucleótidos que presenta al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 95 % o 97 % o más identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de referencia.
Variantes de "sustitución" son las que tienen al menos un resto de aminoácido en una secuencia nativa retirada y sustituida con un aminoácido diferente insertado en su sitio en la misma posición. Las sustituciones pueden ser individuales, donde solo se sustituye un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, donde se sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula. Las sustituciones plurales pueden ser en sitios consecutivos. Por tanto, un aminoácido se puede sustituir con restos plurales, en cuyo caso dicha variante comprende tanto una sustitución como una inserción. Las variantes de "inserción" son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado con o el grupo funcional a-carboxilo o a-amino del aminoácido. Las variantes de "deleción" son aquellas con uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos nativa retirada. En general, las variantes de deleción tendrán uno o dos aminoácidos delecionados en una región particular de la molécula.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, una formulación de la invención) que es suficiente para reducir y/o mejorar la intensidad y/o duración de una enfermedad dada y/o un síntoma relacionado con la misma. Este término también engloba una cantidad necesaria para la reducción o mejora del avance o progresión de una enfermedad dada, reducción o mejora de la reaparición, desarrollo o aparición de una enfermedad dada, y/o para mejorar o potenciar el (los) efecto(s) profiláctico(s) o terapéutico(s) de otra terapia (por ejemplo, una terapia distinta de una formulación de la invención). En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención proporciona una concentración local de entre aproximadamente 5 y 20 ng/mL, y preferentemente entre aproximadamente 10 y 20 ng/mL. En algunas realizaciones, "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento también se refiere a la cantidad de un anticuerpo de la invención para lograr un resultado especificado (por ejemplo, inhibición de una citocina IL-4 y/o IL-13).
El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que se pueda usar en el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 y/o un síntoma relacionado con la misma. En ciertas realizaciones, el término "agente terapéutico" se refiere a una formulación de la invención. En ciertas otras realizaciones, el término "agente terapéutico" se refiere a un agente distinto de una formulación de la invención. Preferentemente, un agente terapéutico es un agente que se conoce por ser útil, o ha sido o está siendo actualmente usado, para el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13, o uno o más síntomas relacionados con la misma.
El término "terapia" se refiere a cualquier protocolo, método y/o agente que se puede usar en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, cánceres, inflamación, enfermedades autoinmunitarias, infecciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas y enfermedades metabólicas). En ciertas realizaciones, los términos "terapias" y "terapia" se refieren a una terapia biológica, terapia complementaria y/u otras terapias útiles en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 conocida por un experto en la técnica, tal como el personal médico.
Los términos "tratan", "tratamiento" y "tratar" se refieren a la reducción o mejora de la progresión, intensidad y/o duración de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, cánceres, inflamación, enfermedades autoinmunitarias, infecciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas y enfermedades metabólicas) resultante de la administración de una o más terapias (que incluyen, pero no se limitan a, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, tales como una formulación de la invención).
Los términos "región variable" o "dominio variable" se refieren a una porción de las cadenas ligeras y pesadas, normalmente aproximadamente 120 a 130 aminoácidos del extremo amino en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, que se diferencian ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad en secuencia se concentra en las regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones estructurales (FR). Las CDRs de las cadenas ligeras y pesadas son principalmente responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. La numeración de posiciones de aminoácidos es según el índice EU, como en Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5a edición. ("Kabat et al."). En realizaciones preferidas, la región variable es una región variable humana.
B. Formulaciones y componentes de formulación
Como se estableció previamente, las formulaciones de la invención comprenden un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 y un sistema tampón, en donde el pH de la formulación es pH 7, y es como se define en las reivindicaciones. Las formulaciones comprenden además un tensioactivo no iónico, un azúcar y un agente estabilizante no iónico que es manitol. Se ha encontrado que las formulaciones de la invención proporcionan mejoras significativas con respecto a las formulaciones previas de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13, que frecuentemente conducen a la agregación molecular del anticuerpo tras el aumento de la concentración del anticuerpo en la formulación, y la formación de partículas visibles y sub-visibles. En particular, las formulaciones de la invención presentan buena estabilidad en lo referente a las partículas visibles, partículas sub-visibles, proteínas de bajo peso molecular y proteínas de alto peso molecular.
i. Anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13, y variantes y fragmentos de los mismos
Las formulaciones de la invención incluyen un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. El anticuerpo biespecífico se une o se une específicamente a IL-4 y/o IL-13, o variantes o fragmentos del mismo. Las moléculas de IL-4 y/o IL-13 pueden ser de cualquier especie. Preferentemente, las moléculas de IL-4 y/o IL-13 son de un ser humano. Se conocen bien en la técnica las secuencias de aminoácidos y las estructuras de proteínas de ambas IL-4 e IL-13.
En ciertos ejemplos, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, o una variante del mismo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Los anticuerpos biespecíficos anti-I L-4/anti-IL-13 preferidos previenen la unión de IL-4 e IL-13 con sus receptores, e inhiben la actividad biológica de IL-4 e IL-13.
En un aspecto específico, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena ligera (VL) que se une a IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (el subrayado indica los cambios de aminoácidos hechos. La negrita indica las CDRs; CDR1 es SEQ ID NO: 7 RASESVDSYGQSYMH; CDR2 es SEQ ID NO: 8 LASNLES; y CDR3 es SEQ ID NO: 9 QQNAEDSRT).
Anti-IL13 KB-B13 VL3 (SEQ ID NO: 1):
D IV L T Q SP A S LAV5LGQRAT I S C R A S E S V D SYG QSYM HW Y QQKAGQPFKL
liyLASNLES gvparfsgsg srtdftltid fvqaedaaty ycQQNAEDSR Tfgggiklei k
En un aspecto específico, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que se une a IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (el subrayado indica los cambios de aminoácidos hechos. La negrita indica las CDRs; CDR1 es SEQ ID NO: 10 GFSLTDSSIN; CDR2 es SEQ ID NO: 11 DGRID; y CDR3 es SEQ ID NO: 12 DGYFPYAMDF).
Anti-ILB hB-BB VH2 {SEQ ID NO: 2):
EVQLKESGPG LVAPGGSLSI T C T V S G F S L I D SSIN W Y RQ P PGKGLEWLGM
iwgDGRIDya dal.ksrl.s i s kdssksqvfl emtslrtddt atyycarDGY FPYftMDFWGQ G TS¥T¥SS
En un aspecto específico, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena ligera (VL) que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (el subrayado indica los cambios de aminoácidos hechos. La negrita indica las CDRs; CDR1 es SEQ ID NO: 13 HASQNIDVWLS; CDR2 es SEQ ID NO: 14 KASNLHTG; CDR3 es SEQ ID NO: 15 QQAHSYPFT).
Anti-IL4 h8D4-8 VL1 (SEQ ID NO: 3):
DIQMTQSFAS L5¥5¥GDTIT LTCHASQNID VWLSWFQQKP GNIPKLLIYK
ASNLHTGVPS RFSGSGSGTG FTLTISSLQP EDIATYYCQQ AHSYPFTPGG
GTKLEIKR
En un aspecto específico, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (el subrayado indica los cambios de aminoácidos hechos. La negrita indica las CDRs; CDR1 es SEQ ID NO: 16 GYSFTSYWIH; CDR2 es SEQ ID NO: 17 IDPSDGETR; y CDR3 es SEQ ID NO: 18 LKEYGNYDSFYFDV).
Anti-IL4 h8D4-8 VH1 (SEQ ID NO: 4):
QVQLQQSGPE LVKPGASVKI sckasGYSFT sy w ih w ik q r pgqglewigm
ID PSD GE TRl nqrfqgratl tvdeststay mqlrsptsed savyyctrLK EYGNYDSFYF DVftGAGTLVT VSSA
En otro aspecto específico, el anticuerpo biespecífico anti-1L-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (el subrayado indica los cambios de aminoácidos hechos. La negrita indica las CDRs; CDR1 es SEQ ID NO: 19 GYSFTSYWIH; CDR2 es SEQ ID NO: 20 IDASDGETR; y CDR3 es SEQ ID NO: 21 LKEYGNYDSFYFDV).
Anti-IL4 h8D4-8 VH2 (SEQ ID NO: 5):
qvqlqqsgpe lvkpgasvki sckasGYSFT SYWIHwikqr pgqglewigm IDASDGETRl nqrfqgratl tvdeststay mqlrsptsed savyyctrLK EYGNYDSFYF DVWGAGTLVT VSSA
En algunos aspectos específicos, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que se une a IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y una región variable de la cadena ligera que se une a IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En otras aspectos específicos, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y una región variable de la cadena ligera que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En todavía más aspectos específicos, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y una región variable de la cadena ligera que se une a IL-4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
El anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, o 2 y 5; y una región variable de la cadena ligera que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3.
En una realización más específica, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 comprende una región variable de la cadena pesada que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4; y una región variable de la cadena ligera que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3 (el "anticuerpo principal"). Un dibujo esquemático de una realización del anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 se muestra en la Figura 1, y las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras a modo de ejemplo se muestran en la Figura 2. El peso molecular del anticuerpo principal, como se ha determinado por espectrometría de masas, es 198 kDa. El punto isoeléctrico del anticuerpo principal, como se ha determinado por isoelectroenfoque, varía entre 5,8 y 6,2.
En aspectos alternativos, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o un fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena ligera de la fórmula VL1-conector-VL2 y una cadena pesada de la fórmula VH1-conector-VH2, en donde VL1 y VH1 forman un dominio de unión al antígeno de IL-4 y VL2 y VH2 forman un dominio de unión al antígeno de IL-13. En algunas realizaciones, VL1 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 1; VH1 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 2; VL2 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 3; y VH2 comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 4 o 5. En realizaciones alternativas, VL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; VH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; VL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y VH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 5.
En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un conector entre los dominios de unión al antígeno del anticuerpo. El conector puede ser cualquier tipo de molécula conectora. Preferentemente, el conector es un polipéptido. Los conectores pueden ser iguales o se diferencian entre sí entre y dentro del polipéptido de la cadena pesada y el polipéptido de la cadena ligera. Además, el conector puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. Según la invención, la unidad de conector peptídico para los dominios de la cadena pesada como para los dominios de la cadena ligera es (G4S)2 , es decir, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Lo más preferentemente, SEQ ID NOs: 2 y 4 se unen juntos por un primer conector peptídico, y SEQ ID NOs: 1 y 3 se unen juntos por un segundo péptido, en donde el primer y segundo conectores peptídicos comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Los números de unidades conectoras de la cadena pesada y de la cadena ligera pueden ser iguales (orden simétrico) o se diferencian entre sí (orden asimétrico). Un conector peptídico es preferentemente lo suficientemente largo como para proporcionar un grado de flexibilidad adecuado para prevenir que los restos de unión al antígeno interfieran con la actividad de los otros, por ejemplo por impedimento estérico, para permitir el apropiado plegamiento de proteínas y, si fuera necesario, para permitir que las moléculas de anticuerpo interaccionen con dos o más receptores, posiblemente ampliamente separados, en la misma célula; además es preferentemente lo suficientemente corto para permitir que los restos de anticuerpo sigan estables en la célula. Por tanto, la longitud, composición y/o conformación de los conectores peptídicos se puede seleccionar fácilmente por un experto en la técnica para optimizar las propiedades deseadas del anticuerpo polivalente.
En una realización preferida de la invención, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado. Los ejemplos de isotipo humanizado de los anticuerpos incluyen IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 es un anticuerpo IgG. Existen cuatro formas de IgG. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 es un anticuerpo IgG4. En una realización más preferida de la invención, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 es un anticuerpo IgG4 humanizado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende además una región constante, por ejemplo, CH1, CH2, CH3 y CL.
Ciertos aspectos de formulaciones también incluyen variantes de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Las variantes de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 pueden tener propiedades fisicoquímicas similares basándose en su alta similitud. Las variantes se definen como anticuerpos con una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, preferentemente al menos 97 %, por ejemplo al menos 98 % o 99 % homóloga a anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13, y capaz de competir para unirse a un polipéptido IL-4 y/o IL-13, un fragmento de polipéptido IL-4 y/o IL-13, o un epítope IL-4 y/o IL-13. Preferentemente, las variantes mejorarán, neutralizarán, o inhibirán de otro modo la actividad biológica de IL-4 y/o IL-13. La determinación de la competencia para unirse a la diana se puede hacer por métodos rutinarios conocidos por el experto en la técnica. Preferentemente, las variantes son anticuerpos humanos o humanizados, y preferentemente son moléculas IgG4. En aspectos preferidos, una variante es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica en secuencia de aminoácidos con una región variable de la cadena pesada que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4 y 5; y una región variable de la cadena ligera que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3. El término "variante" se refiere a un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13. La variante puede tener modificaciones de secuencia conservativas, que incluyen sustituciones, modificaciones, adiciones y deleciones de aminoácidos.
Los ejemplos de modificaciones incluyen, pero no se limitan a, glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica y enlace a un ligando celular u otra proteína. Las modificaciones de aminoácidos se pueden introducir por técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio, clonación molecular, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y mutagénesis aleatoria mediada por PCR en el ácido nucleico que codifica los anticuerpos. Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). Será evidente para el experto que también se pueden emplear clasificaciones de familias de restos de aminoácidos distintas de las usadas anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, por ejemplo, sustitución de un aminoácido con un resto de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas diferentes. Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. La orientación en la determinación de qué restos de aminoácidos se pueden sustituir, modificar, insertar o delecionar sin abolir la actividad inmunológica se puede encontrar usando programas informáticos bien conocidos en la técnica. Se pueden usar algoritmos informáticos, tales como, entre otros, Gap o Bestfit, que se conocen por un experto en la técnica, para alinear óptimamente secuencias de aminoácidos a comparar y para definir restos de aminoácidos similares o idénticos. Las variantes pueden tener afinidades de unión iguales o diferentes, ya sea más altas o más bajas, en comparación con un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, pero son todavía capaces de unirse específicamente a IL-4 y/o IL-13, y pueden tener la misma actividad biológica, más alta o más baja, que el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13.
Las realizaciones de la divulgación también incluyen fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13. El término "dominio de unión al antígeno", "región de unión al antígeno", "fragmento de unión al antígeno" y términos similares se refieren a la porción de un anticuerpo que comprende los restos de aminoácidos que interaccionan con un antígeno y confieren al agente de unión su especificidad y afinidad por el antígeno (por ejemplo, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR)). La región de unión al antígeno se puede obtener de cualquier especie de animal, tal como roedores (por ejemplo, conejo, rata o hámster) y seres humanos. Preferentemente, la región de unión al antígeno será de origen humano. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, moléculas Fv monocatenarias (scFv), fragmentos dAb y unidades mínimas de reconocimiento que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable del anticuerpo.
En realizaciones preferidas de la invención, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 (o una variante del mismo o un fragmento de unión al antígeno del mismo) mejorará, neutralizará o inhibirá de otro modo la actividad biológica de IL-4 y/o IL-13 in vivo.
En realizaciones preferidas de la invención, los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 (o una variante de los mismos o un fragmento de unión al antígeno de los mismos) son anticuerpos antagonistas que mejoran, neutralizan o inhiben de otro modo la actividad biológica de IL-4 y/o IL-13 in vivo.
Se han descrito con detalle en la publicación PCT WO 2009/052081 la identificación, aislamiento, preparación y caracterización de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 o variantes o fragmentos de los mismos que se unen a tanto IL-13 como a IL-4, que incluyen el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3.
Según la divulgación, los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 (o una variante de los mismos o un fragmento de unión al antígeno de los mismos) están presentes en las formulaciones en una cantidad desde aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 200 mg/mL, por ejemplo, aproximadamente 50 mg/mL hasta aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 75 mg/mL hasta aproximadamente 125 mg/mL y aproximadamente 100 mg/mL. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/anti-IL-13 (o una variante de los mismos o un fragmento de unión al antígeno de los mismos) están presentes en las formulaciones en una cantidad desde aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 65 mg/mL, aproximadamente 66 mg/mL hasta aproximadamente 130 mg/mL, aproximadamente 131 mg/mL hasta aproximadamente 200 mg/mL. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 35 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 45 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 55 mg/mL, aproximadamente 60 mg/mL, aproximadamente 65 mg/mL, aproximadamente 70 mg/mL, aproximadamente 75 mg/mL, aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 85 mg/mL, aproximadamente 90 mg/mL, aproximadamente 95 mg/mL, aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 105 mg/mL, aproximadamente 110 mg/mL, aproximadamente 115 mg/mL, aproximadamente 120 mg/mL, aproximadamente 125 mg/mL, aproximadamente 130 mg/mL, aproximadamente 135 mg/mL, aproximadamente 140 mg/mL, aproximadamente 145 mg/mL, aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 155 mg/mL, aproximadamente 160 mg/mL, aproximadamente 165 mg/mL, aproximadamente 170 mg/mL, aproximadamente 175 mg/mL, aproximadamente 180 mg/mL, aproximadamente 185 mg/mL, aproximadamente 190 mg/mL, aproximadamente 195 mg/mL o aproximadamente 200 mg/mL.
Según la invención, el anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 está presente en la formulación en una cantidad de 100 mg/mL. En otra realización a modo de ejemplo, un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-IL-4/anti-IL-13 humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, o 2 y 5; y una región variable de la cadena ligera que se une a tanto IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3 está presente en la formulación en una cantidad de 100 mg/mL.
ii. Agentes de tamponamiento, sistemas tampón, fuerza iónica y pH
Los agentes de tamponamiento ayudan a mantener el pH de las formulaciones en un intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Los tampones están presentes preferentemente en las formulaciones a una concentración que varía desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. Los agentes de tamponamiento adecuados para su uso incluyen tanto ácidos orgánicos e inorgánicos como sales de los mismos, tales como tampones citrato (por ejemplo, mezcla citrato de monosodio-citrato de disodio, mezcla de ácido cítrico-citrato de trisodio, mezcla de ácido cítrico-citrato de monosodio, etc.), tampones succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato de monosodio, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato de disodio, etc.), tampones tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumáricofumarato de monosodio, mezcla de ácido fumárico-fumarato de disodio, mezcla de fumarato de monosodio-fumarato de disodio etc.), tampones gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico, etc.), tampones oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido lácticohidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). También son adecuados y se pueden usar tampones fosfato, tampones carbonato, tampones histidina, sales de trimetilamina tales como Tris, HEPES y otros tampones conocidos de este tipo. Preferentemente, se usa en las formulaciones una combinación de tampones, es decir, dos o más agentes de tamponamiento. Una combinación de dos o más tampones se denomina en el presente documento un sistema tampón.
Las formulaciones de la invención comprenden un sistema tampón como se define en las reivindicaciones. Un sistema tampón mantiene un pH fisiológicamente adecuado. Además, un sistema tampón participa en lograr la isotonicidad y estabilidad química de la formulación. Debido a la dificultad de desarrollar una formulación de anticuerpo estable para el anticuerpo biespecífico, es preferible usar un sistema tampón combinado para aprovechar los beneficios de dos o más tampones. Combinando los beneficios de dos o más tampones, se puede desarrollar una formulación de anticuerpo más estable.
Preferentemente, el sistema tampón está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, por ejemplo, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 25 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, o aproximadamente 10 mM. Alternativamente, el sistema tampón está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 hasta aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 hasta aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 46 mM hasta aproximadamente 50 mM. Por ejemplo, el sistema tampón puede estar presente en la formulación a una concentración de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 mM, aproximadamente 32 mM, aproximadamente 33 mM, aproximadamente 34 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 37 mM, aproximadamente 38 mM, aproximadamente 39 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 41 mM, aproximadamente 42 mM, aproximadamente 43 mM, aproximadamente 44 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 46 mM, aproximadamente 47 mM, aproximadamente 48 mM, aproximadamente 49 mM y aproximadamente 50 mM. Más preferentemente, el sistema tampón está presente en la formulación a una concentración desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, e incluso más preferentemente desde aproximadamente 8 mM hasta aproximadamente 12 mM. En una realización más preferida, el sistema tampón está presente a una concentración de aproximadamente 10 mM.
Preferentemente, el sistema tampón comprende un tampón Tris y un tampón fosfato. Preferentemente, el tampón Tris está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, el tampón Tris puede estar presente en la formulación a una concentración de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM o aproximadamente 5 mM. Más preferentemente, el tampón Tris está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 4 mM, e incluso más preferentemente desde aproximadamente 3 mM hasta aproximadamente 4 mM. En una realización más preferida, el tampón Tris está presente a una concentración de aproximadamente 3,7 mM.
Preferentemente, el tampón fosfato está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mM. Por ejemplo, el tampón fosfato puede estar presente en las formulaciones a una concentración de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM o aproximadamente 10 mM. Más preferentemente, el tampón fosfato está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 3 mM hasta aproximadamente 8 mM, e incluso más preferentemente desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 7 mM. En una realización más preferida, el tampón fosfato está presente a una concentración de aproximadamente 6,3 mM.
Según la invención, el sistema tampón comprende un tampón Tris a una concentración de 3,7 mM y un tampón fosfato a una concentración de 6,3 mM. Esta combinación de tampón Tris y tampón fosfato en un sistema tampón es altamente poco usual y no se conoce en la técnica.
También es preferible que el sistema tampón esté presente en las formulaciones en una baja concentración, es decir, aproximadamente 15 mM o menos, para reducir la fuerza iónica de la formulación. Esto es debido al hecho de que a medida que aumenta la fuerza iónica de la formulación, aumenta la cinética de agregación del anticuerpo. Se necesita disminuir la agregación del anticuerpo y/o la velocidad de agregación del anticuerpo para mejorar la estabilidad de la formulación.
En ciertos aspectos, las formulaciones tienen un pH alrededor de pH 7. Preferentemente, el pH de las formulaciones varía desde aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 8,0. Por ejemplo, el pH de las formulaciones puede ser aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9 y aproximadamente 8,0. Más preferentemente, el pH de las formulaciones puede variar desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7,5. Según la invención, el pH es 7,0. Las formulaciones presentan buena estabilidad en lo que respecta a las partículas visibles, partículas sub-visibles, proteínas de bajo peso molecular y proteínas de alto peso molecular cuando el pH de las formulaciones es aproximadamente pH 7. El pH de la formulación se puede medir mediante cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Un medio preferido para medir el pH es usando un pH-metro con un micro-electrodo. El pH de la formulación se puede ajustar usando cualquier medio conocido en la técnica. Los productos químicos preferidos para alterar el pH de las formulaciones son ácido clorhídrico (HCl) e hidróxido sódico (NaOH).
En ciertas realizaciones, las formulaciones tienen un pH por encima del punto isoeléctrico (pI) del anticuerpo. El punto isoeléctrico es el pH al que una molécula o superficie particular no lleva carga eléctrica neta. El pI del anticuerpo biespecífico se puede determinar por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Preferentemente, el pI del anticuerpo biespecífico se determina por isoelectroenfoque desnaturalizado. El pI del anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4; y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3 es 5,8-6,2.
iii. Tensioactivos no iónicos
Las formulaciones comprenden además un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos son compuestos químicos que estabilizan moléculas biológicas y/o excipientes farmacéuticos generales en una formulación. Los tensioactivos, en general, protegen las moléculas y los excipientes de los estreses inducidos por la interfase aire/disolución y los estreses inducidos por la disolución/superficie, que de otro modo pueden dar como resultado la agregación de moléculas. Los tensioactivos también previenen la formación de partículas visibles y sub-visibles.
Preferentemente, el tensioactivo no iónico está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 1 % (p/v), por ejemplo, aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,3 %, o aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,2 %. Alternativamente, el tensioactivo no iónico está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,05 % (p/v), aproximadamente 0,06 % hasta aproximadamente 0,10 % (p/v), aproximadamente 0,11 % hasta aproximadamente 0,15 % (p/v), aproximadamente 0,16 % hasta aproximadamente 0,20 % (p/v), aproximadamente 0,20 % hasta aproximadamente 0,30 % (p/v), aproximadamente 0,30 % hasta aproximadamente 0,40 % (p/v), aproximadamente 0,40 % hasta aproximadamente 0,50 % (p/v), aproximadamente 0,50 % hasta aproximadamente 0,60 % (p/v), aproximadamente 0,60 % hasta aproximadamente 0,70 % (p/v), aproximadamente 0,70 % hasta aproximadamente 0,80 % (p/v), aproximadamente 0,80 % hasta aproximadamente 0,90 % (p/v) o aproximadamente 0,90 % hasta aproximadamente 1,0 % (p/v). Por ejemplo, el tensioactivo no iónico puede estar presente en las formulaciones en una cantidad de aproximadamente 0,01 % (p/v), aproximadamente 0,02 % (p/v), aproximadamente 0,03 % (p/v), aproximadamente 0,04 % (p/v), aproximadamente 0,05 % (p/v), aproximadamente 0,06 % (p/v), aproximadamente 0,07 % (p/v), aproximadamente 0,08 % (p/v), aproximadamente 0,09 % (p/v), aproximadamente 0,1 % (p/v), aproximadamente 0,2 % (p/v), aproximadamente 0,3 % (p/v), aproximadamente 0,4 % (p/v), aproximadamente 0,5 % (p/v), aproximadamente 0,6 % (p/v), aproximadamente 0,7 % (p/v), aproximadamente 0,8 % (p/v), aproximadamente 0,9 % (p/v), y aproximadamente 1 % (p/v). En realizaciones particulares, el tensioactivo no iónico está presente en las formulaciones desde aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 0,2 % (p/v).
Los ejemplos de tensioactivos incluyen, pero no se limitan a, polisorbatos, glicerina, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido succínico, ácidos fumáricos, ácidos ftálicos y combinaciones de los mismos. Los expertos en la técnica son conscientes de que se pueden usar otros tensioactivos no iónicos, en tanto que sean farmacéuticamente aceptables, es decir, adecuados para administración a sujetos. El tensioactivo no iónico es preferentemente un polisorbato. Los ejemplos de polisorbatos incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65 y polisorbato 80. Lo más preferentemente, el tensioactivo no iónico es polisorbato 80.
Por ejemplo, el polisorbato 80 está presente en las formulaciones en una cantidad desde aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 1 % (p/v). Por ejemplo, el polisorbato 80 puede estar presente en las formulaciones en una cantidad de aproximadamente 0,01 % (p/v), aproximadamente 0,02 % (p/v), aproximadamente 0,03 % (p/v), aproximadamente 0,04 % (p/v), aproximadamente 0,05 % (p/v), aproximadamente 0,06 % (p/v), aproximadamente 0,07 % (p/v), aproximadamente 0,08 % (p/v), aproximadamente 0,09 % (p/v), aproximadamente 0,1 % (p/v), aproximadamente 0,2 % (p/v), aproximadamente 0,3 % (p/v), aproximadamente 0,4 % (p/v), aproximadamente 0,5 % (p/v), aproximadamente 0,6 % (p/v), aproximadamente 0,7 % (p/v), aproximadamente 0,8 % (p/v), aproximadamente 0,9 % (p/v) y aproximadamente 1 % (p/v). En realizaciones particulares, el polisorbato 80 está presente en las formulaciones desde aproximadamente 0,03 % hasta aproximadamente 0,2 % (p/v). Por ejemplo, el polisorbato 80 puede estar presente en una cantidad desde aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 0,02 % a aproximadamente 0,5 % (p/v) y aproximadamente 0,03 % a aproximadamente 0,2 % (p/v). Según la invención, el polisorbato 80 está presente en las formulaciones en una cantidad de 0,2 % (p/v).
iv. Azúcares
Las formulaciones de la invención comprenden además un azúcar que es sacarosa. Normalmente, se usan azúcares como agente estabilizante para proteínas de alto peso molecular o como crioprotector o como lioprotector. Según la divulgación, el azúcar está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10 % (p/v), por ejemplo, aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 3 % hasta aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 4 % hasta aproximadamente 6 % (p/v), o aproximadamente 5 % (p/v). Alternativamente, el azúcar está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 3 % hasta aproximadamente 6 % (p/v), o aproximadamente 6 % hasta aproximadamente 10 % (p/v). Por ejemplo, el azúcar puede estar presente en las formulaciones en una cantidad de aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 9 % (p/v) o aproximadamente 10 % (p/v). En aspectos particulares, el azúcar está presente en las formulaciones desde aproximadamente 3 % hasta aproximadamente 7 % (p/v), y más preferentemente aproximadamente 5 %.
Los ejemplos de azúcares incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Los ejemplos de sacáridos incluyen glucosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, dextrosa, xilitol, fructosa y manitol. Los expertos en la técnica son conscientes de que se pueden usar otros azúcares, en tanto que sean farmacéuticamente aceptables, es decir, adecuados para administración a los sujetos. Preferentemente, el azúcar es un disacárido. Según la invención, el azúcar es sacarosa.
En ciertos aspectos, la sacarosa está presente en las formulaciones en una cantidad desde aproximadamente 1 % hasta 10 % (p/v). Por ejemplo, la sacarosa puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 9 % (p/v) o aproximadamente 10 % (p/v). Preferentemente, la sacarosa puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 3 % a aproximadamente 7 % (p/v), o aproximadamente 4 % a aproximadamente 6 % (p/v). Según la invención, sacarosa está presente en las formulaciones en una cantidad de 5 % (p/v).
v. Agentes estabilizantes no iónicos
Las formulaciones de la invención comprenden un agente estabilizante no iónico que es manitol. Agentes estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que puede variar en función de un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Los agentes estabilizantes también minimizan la formación de proteínas de alto peso molecular.
Según la divulgación, el agente estabilizante no iónico está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10 % (p/v), por ejemplo, aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 4 % (p/v), o aproximadamente 3 % (p/v). Alternativamente, el agente estabilizante no iónico está presente en las formulaciones a una concentración desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 4 % hasta aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 6 % hasta aproximadamente 8 % (p/v) o aproximadamente 8 % hasta aproximadamente 10 % (p/v). Por ejemplo, el agente estabilizante no iónico puede estar presente en las formulaciones en una cantidad de aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 9 % (p/v) o aproximadamente 10 % (p/v). En realizaciones particulares, el agente estabilizante no iónico está presente en las formulaciones desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 5 % (p/v), más preferentemente desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 3 % (p/v), y lo más preferentemente aproximadamente 3 % (p/v).
Los ejemplos de agentes estabilizantes incluyen alcoholes polihidroxilados de azúcar; aminoácidos, tales como prolina, arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, arabitol, eritritol, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, que incluyen ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácido; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona, sacáridos, monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa; polisacáridos tales como dextrano, etc. Los expertos en la técnica son conscientes de que se pueden usar otros agentes estabilizantes no iónicos, en tanto que sean farmacéuticamente aceptables, es decir, adecuados para administración a los sujetos.
En ciertos aspectos, la prolina está presente en las formulaciones en una cantidad desde aproximadamente 1 % hasta 10 % (p/v). Por ejemplo, la prolina puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 9 % (p/v) o aproximadamente 10 % (p/v). Preferentemente, la prolina puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 % (p/v), o aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 % (p/v). Lo más preferentemente, la prolina está presente en las formulaciones en una cantidad de aproximadamente 3 % (p/v).
En ciertas realizaciones, el manitol está presente en las formulaciones en una cantidad desde aproximadamente 1 % hasta 10 % (p/v). Por ejemplo, el manitol puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 9 % (p/v) o aproximadamente 10 % (p/v). Preferentemente, el manitol puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 % (p/v), o aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 % (p/v). Según la invención, el manitol está presente en las formulaciones en una cantidad de 3 % (p/v).
v. Otros excipientes
Además, las formulaciones de la invención pueden comprender, opcionalmente, adicionalmente otros excipientes que incluyen, pero no se limitan a, agua para inyección, diluyentes, agentes solubilizantes, agentes calmantes, tampones adicionales, sales inorgánicas u orgánicas, antioxidantes, conservantes, agentes de carga, agentes quelantes, agentes de tonicidad, o similares. Preferentemente, sin embargo, las formulaciones de la invención no comprenden otros excipientes, excepto los anteriormente descritos. Se pueden incluir en la formulación otros vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980), a condición de que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. En una realización particular, la formulación está sustancialmente libre de conservantes, aunque, en realizaciones alternativas, se pueden añadir conservantes, según sea necesario. Por ejemplo, se pueden incluir crioprotectores o lioprotectores en las formulaciones liofilizadas.
vi. Formulaciones líquidas o liofilizadas
Las formulaciones de la invención pueden o ser formulaciones líquidas o formulaciones liofilizadas. Preferentemente, las formulaciones son formulaciones líquidas. Más preferentemente, las formulaciones líquidas están listas para inyección. Alternativamente, las formulaciones pueden ser polvos liofilizados. Preferentemente, los polvos liofilizados están listos para ser combinados con un disolvente justo antes de la administración.
vii. Formulaciones a modo de ejemplo
La divulgación proporciona una formulación líquida de anticuerpo adecuada para administración subcutánea, comprendiendo la formulación:
aproximadamente 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3;
aproximadamente 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de aproximadamente 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2 % (p/v) de polisorbato 80;
aproximadamente 5 % (p/v) de sacarosa; y
aproximadamente 3 % (p/v) de prolina;
en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7.
En un ejemplo, la divulgación proporciona una formulación líquida de anticuerpo adecuada para administración subcutánea, comprendiendo la formulación:
aproximadamente 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3;
aproximadamente 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de aproximadamente 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2 % (p/v) de polisorbato 80;
aproximadamente 5 % (p/v) de sacarosa; y
aproximadamente 3 % (p/v) de manitol;
en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7.
La divulgación también proporciona una formulación de anticuerpo liofilizado estable adecuada para administración subcutánea, comprendiendo la formulación:
aproximadamente 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3;
aproximadamente 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de aproximadamente 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de aproximadamente 6,3 mM; aproximadamente 0,2 % (p/v) de polisorbato 80;
aproximadamente 5 % (p/v) de sacarosa; y
aproximadamente 3 % (p/v) de prolina;
en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7.
En otro ejemplo, la divulgación proporciona una formulación de anticuerpo liofilizado estable adecuada para administración subcutánea, comprendiendo la formulación:
aproximadamente 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3;
aproximadamente 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de aproximadamente 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de aproximadamente 6,3 mM;
aproximadamente 0,2 % (p/v) de polisorbato 80;
aproximadamente 5 % (p/v) de sacarosa; y
aproximadamente 3 % (p/v) de manitol;
en donde el pH de la formulación es aproximadamente pH 7.
vii. Estabilidad
Las formulaciones de la invención son estables a 2-8 °C durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36 meses o más. En realizaciones a modo de ejemplo, son estables a 2-8 °C durante al menos aproximadamente 6 meses o más. En otras realizaciones a modo de ejemplo, son estables a 2-8 °C durante al menos aproximadamente 9 meses. En realizaciones adicionales a modo de ejemplo, son estables a 2-8 °C durante al menos aproximadamente 1 año o más, más preferentemente aproximadamente 2 años, e incluso más preferentemente aproximadamente 3 años.
C. Modos de administración
En ciertas realizaciones de la invención, las formulaciones son adecuadas para administración por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intradérmica, por vía subcutánea, o una combinación de las mismas. Las formulaciones de la invención son adecuadas para administración mediante una variedad de técnicas. En realizaciones preferidas de la invención, la formulación se administra por vía subcutánea. Por ejemplo, se prefiere que las formulaciones que contienen 100 mg/mL de anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 se administren por vía subcutánea. Por tanto, las formulaciones son preferentemente estériles. Se conocen bien en la técnica los métodos de preparación de formulaciones estériles e incluyen, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estériles o esterilización en autoclave de los componentes de la formulación, con la excepción de los anticuerpos, a aproximadamente 120 °C durante aproximadamente 30 minutos.
D. Dosificaciones y formas farmacéuticas
Las dosis eficaces de las formulaciones de la invención varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otras medicaciones administradas y si tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el sujeto es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos. Se puede necesitar ajustar las dosificaciones de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. Preferentemente, la dosis varía desde 100-200 mg/vial.
Las formulaciones de la invención se pueden administrar en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una cierta concentración de agente de unión a plasma, tal como un anticuerpo. La dosificación y frecuencia variarán dependiendo de la semivida del anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13 en el sujeto. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguido por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos.
En realizaciones adicionales, la invención proporciona una forma de dosificación unitaria farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación de la invención para el tratamiento de una o más enfermedades en un sujeto mediante administración de la forma farmacéutica al sujeto. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. El ser humano puede ser un adulto o puede ser un lactante. El término "forma de dosificación unitaria farmacéutica" se refiere a una unidad físicamente discreta adecuada como dosificaciones unitarias por los sujetos que se van a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico/profiláctico deseado en asociación con el tampón citrato y pH requeridos.
La forma farmacéutica unitaria puede ser un recipiente que comprende la formulación. Los recipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, ampollas selladas, viales, botellas, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico, y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). En una realización preferida, el recipiente es un vial. En general, el recipiente debe mantener la esterilidad y estabilidad de la formulación.
En realizaciones específicas, las formulaciones se envasan en viales de 7, 10, 15 o 20 mL que están hechos de vidrio claro incoloro de tipo I y cerrados con un tapón (bromobutilo recubierto con fluoropolímero) sellado con tapas abatibles con pestaña (polipropileno).
En una realización específica, las formulaciones se envasan en segundo lugar en un recipiente, tal como una caja de cartón, que protege los viales de la luz.
Las formulaciones que se van a usar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se puede conseguir, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Por ejemplo, las formulaciones líquidas de la presente invención se pueden esterilizar por filtración usando un filtro de 0,2 pm o 0,22 pm.
E. Métodos de tratamiento
En el presente documento se proporcionan además métodos de tratamiento de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 o trastorno, comprendiendo los métodos administrar una formulación de la invención a un sujeto. En ciertas realizaciones, la enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 es cánceres, inflamación, enfermedades autoinmunitarias, infecciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas y enfermedades metabólicas.
Las formulaciones de la presente invención se pueden usar para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad, tal como una enfermedad alérgica, una enfermedad mediada por Th2, enfermedad mediada por IL-13, enfermedad mediada por IL-4 y/o enfermedad mediada por IL-4/IL-13. Los ejemplos de dichas enfermedades incluyen enfermedad de Hodgkin, asma, asma alérgica, dermatitis atópica, alergia atópica, colitis ulcerosa, esclerodermia, rinitis alérgica, fibrosis pulmonar idiopática COPD3, rechazo crónico del injerto, fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar inducida por radiación, granuloma pulmonar, esclerosis sistémica progresiva, esquistosomiasis, fibrosis hepática, cáncer renal, linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, síndrome de Sezary, asma, artritis séptica, dermatitis herpetiforme, urticaria idiopática crónica, colitis ulcerosa, esclerodermia, cicatrices hipertróficas, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostática benigna, un trastorno pulmonar en el que el receptor de IL-4 desempeña una función, afección en la que la rotura de la barrera epitelial mediada por el receptor de IL-4 desempeña una función, un trastorno del aparato digestivo en el que el receptor de IL-4 desempeña una función, una reacción alérgica a una medicación, enfermedad de Kawasaki, drepanocitosis, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preeclampsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis, fibrosis quística, micosis broncopulmonar alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumopatía inducida por bleomicina y fibrosis, proteinosis alveolar pulmonar, síndrome de dificultad respiratoria aguda, sarcoidosis, síndrome de hiper-IgE, síndrome hipereosinofílico idiopático, una enfermedad vesicante autoinmune, pénfigo vulgar, penfigoide bulloso, miastenia grave, síndrome de fatiga crónica, nefrosis.
El término "enfermedad alérgica" se refiere a una afección patológica en la que un paciente es hipersensibilizado a y genera una reacción inmunológica contra una sustancia que normalmente es no inmunogénica. La enfermedad alérgica se caracteriza, en general, por la activación de mastocitos por IgE dando como resultado una respuesta inflamatoria (por ejemplo, respuesta local, respuesta sistémica) que puede dar como resultado síntomas tan benignos como rinorrea hasta el potencialmente mortal choque anafiláctico y muerte. Los ejemplos de enfermedad alérgica incluyen, pero no se limitan a, rinitis alérgica (por ejemplo, fiebre del heno), asma (por ejemplo, asma alérgica), dermatitis alérgica (por ejemplo, eccema), dermatitis de contacto, alergia alimentaria y urticaria (ronchas).
El término "enfermedad mediada por Th2" se refiere a una enfermedad en la que la patología se produce (por completo o en parte) por una respuesta inmunitaria (respuesta inmunitaria de tipo Th2) que está regulada por linfocitos T CD4+ Th2, que producen característicamente IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Una respuesta inmunitaria de tipo Th2 está asociada con la producción de ciertas citocinas (por ejemplo, IL-4, IL-13) y de ciertas clases de anticuerpos (por ejemplo, IgE), y se asocia con inmunidad humoral. Las enfermedades mediadas por Th2 se caracterizan por la presencia de niveles elevados de citocinas Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-13) y/o ciertas clases de anticuerpos (por ejemplo, IgE) e incluyen, por ejemplo, enfermedad alérgica (por ejemplo, rinitis alérgica, dermatitis atópica, asma (por ejemplo, asma atópica), enfermedad alérgica de las vías respiratorias (AAD), choque anafiláctico, conjuntivitis), trastornos autoinmunitarios asociados a niveles elevados de IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad injerto contra huésped, enfermedad renal (por ejemplo, síndrome nefrítico, nefritis lúpica)) e infecciones asociadas a niveles elevados de IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, infección viral, parasítica, fúngica (por ejemplo, C. albicans)). Ciertos cánceres están asociados con niveles elevados de IL-4 y/o IL-13 o asociados a proliferación celular de cáncer inducido por IL-4 y/o inducido por IL-13 (por ejemplo, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, mieloma múltiple, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama y cáncer de ovario). Estos cánceres se pueden tratar, suprimir o prevenir usando las formulaciones de la invención.
El término "cáncer" se refiere a o describe la afección fisiológica en mamíferos, en particular seres humanos, que normalmente se caracteriza por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.
El término "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a una enfermedad o trastorno no maligno que surge de y dirigido contra los propios tejidos de un individuo. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias o trastornos incluyen, pero no se limitan a, respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel que incluyen psoriasis y dermatitis; afecciones alérgicas tales como eccema y asma; otras afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus de tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina); esclerosis múltiple y trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC).
En ciertas realizaciones, las formulaciones de la invención se pueden administrar en combinación con una o más terapias (por ejemplo, terapias que no son las formulaciones de la invención que se administran actualmente para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13. El uso del término "en combinación" no limita el orden en que las terapias se administran a un sujeto. Una primera terapia se puede administrar antes (por ejemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas), simultáneamente o después (por ejemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas) de la administración de una segunda terapia a un sujeto que tuvo, tiene o es susceptible a una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13. Se puede administrar cualquier terapia adicional en cualquier orden con las otras terapias adicionales. Los ejemplos no limitantes de terapias que se pueden administrar en combinación con un anticuerpo de la invención incluyen agentes antiinflamatorios autorizados listados en la Farmacopea Estadounidense y/o vademécum.
F. Kits
Ciertas realizaciones de la invención incluyen un kit que comprende una formulación de la invención. El kit puede comprender además uno o más receptores que comprenden excipientes farmacéuticamente aceptables, e incluyen otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluye filtros, agujas y jeringas. Asociados a los kits pueden estar instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, profilácticos o diagnósticos, que contienen información sobre, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosificación, fabricación, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de dichos productos terapéuticos, profilácticos o diagnósticos.
Ejemplos
Para ayudar a ilustran la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos. Los ejemplos no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la invención. En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de formulación farmacéutica, química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología tal como tecnología de anticuerpos, y técnicas convencionales de preparación de polipéptidos como se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), volumen 51, Ed.: Paul S., Humana Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), Eds.: McCafferty J. et al., Humana Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Las abreviaturas usadas en los Ejemplos 2-6 son:
BD: Desarrollo de biotecnología
BsAb: Anticuerpo biespecífico
DLS: Dispersión de luz dinámica
DoE: Diseño de experimento
DP: Medicamento
DS: Principio activo
DSC: Calorimetría diferencial de barrido
FCM: Microscopía en celda de flujo
FDS: Principio activo formulado
FT-IR: Transformada de Fourier - Infrarrojos
HAP: Cromatografía con hidroxiapatita
HDPE: Polietileno de alta densidad
HMW: Alto peso molecular
HPLC: Cromatografía de líquidos de alta resolución
IEF: Isoelectroenfoque
IgG: Inmunoglobulina G
IL: Interleucina
kDa: kilodálton
LMW: Bajo peso molecular
Nd: No determinado
PEG: Polietilenglicol
PES: Poliétersulfona
PS80: Polisorbato 80
PVDF: Poli(difluoruro de vinilideno)
rpm: Rondas por minuto
SC: Subcutánea
SDS-PAGE: Electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida
SEC: Cromatografía de exclusión por tamaño
SLS: Dispersión de luz estática
c.s.: Cantidad suficiente
TGA: Análisis termogravimétrico
UF/DF: Ultrafiltración/diafiltración
USP: Farmacopea de los Estados Unidos
UV-Vis: Ultravioleta-visible
p/v: peso/volumen
WFI: Agua para inyección
XRPD: Difracción de rayos X de polvo
Se usó en los siguientes ejemplos un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-IL-4/anti-IL-13 humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada que se une tanto a IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que se une tanto a IL-13 como a IL-4 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3 (el "anticuerpo principal") para determinar condiciones óptimas de formulación.
El objetivo de los siguientes estudios de formulación (Ejemplos 2-6) fue entender el comportamiento del anticuerpo principal en disolución y en el estado liofilizado (es decir, para identificar las principales vías de degradación) y para determinar los sistema tampón-pH adecuados y aditivos que proporcionan una buena estabilidad para el anticuerpo principal a aproximadamente 100 mg/mL para el desarrollo adicional de la formulación.
Lo siguiente muestra el principio activo usado en los Ejemplos 2-6:
El anticuerpo principal después de la etapa de purificación por HAP (última etapa del procesamiento en la dirección 3'): Lote N° RSN0169 (estudio N° P5 a P6)
Tampón de formulación: tampón fosfato de sodio 75 mM, pH 6,7
Concentración: 10,4 mg/mL;
Lotes N2 RSN0169-SZW 320, 326 y 327 (estudio N2 P7 a P13)
Tampón de formulación: tampón fosfato de sodio 59 mM, pH 6,9
Concentración: 4,5 mg/mL;
Lote N2 RSN0169-SZW 330 (estudio N2 P14)
Tampón de formulación: tampón fosfato de sodio 55 mM, NaCI 20 mM, pH 6,8
Concentración: 4,4 mg/mL; y
Lote N2 *RSN0152 (estudio N2 P15 a P21)
Tampón de formulación: tampón fosfato de sodio 55 mM, NaCl 20 mM, pH 6,8
Concentración: 3,9 mg/mL.
Para cada ensayo de formulación, se ajustó la concentración de anticuerpo principal al final de la UF/DF en agua o tampón final y luego se diluyó adicionalmente con cantidades apropiadas de tampón concentrado y disoluciones de aditivos hasta la formulación final deseada (véase la Tabla 1 para detalles).
Tabla 1 - Detalles del ajuste de la formulación
Ensayo N° Concentración inicial* Tampón inicial* Concentración final6 P5-7 2 mg/mL Agua 1 mg/mL
P12 95 mg/mL Agua 85 mg/mL
P13 112 mg/mL Agua 100 mg/mL
P14-16 27 mg/mL Agua 20 mg/mL
P15 125 mg/mL Agua 100 mg/mL
17 46 mg/mL Agua 38 mg/mL
P18 46 mg/mL Fosfato/Tris 3,5 mM 38 mg/mL
P20 42 mg/mL Fosfato/Tris 3,5 mM 35 mg/mL
P21 42 mg/mL Fosfato/Tris 3,5 mM 35 mg/mL
a Concentración y tampón después del ajuste de UF/DF
b Concentración después de la dilución con tampón concentrado y disoluciones de aditivos
Se esterilizó por filtración cada formulación (Millex® GV, Millipore, 0,22 gm, PVDF) bajo flujo laminar y se dispensó una fracción en un vial de vidrio de tipo 1 según fuera apropiado para cada momento de tiempo de estabilidad, excepto para el estudio de congelación / descongelación para el que se usaron tubos de polipropileno.
Se determinaron las condiciones de estrés mecánico y estrés térmi
Para evaluar la influencia del estrés por agitación en los ensayos de formulación N° P5-7, se agitaron viales a 350 rpm {xe " rpm " \f Abbreviation \t "ronda por minuto"} durante 2 a 15 h a temperatura ambiente usando un Rota test 74401 y luego se analizaron.
Para evaluar la influencia del estrés por inyectabilidad en los ensayos de formulación N° P12, 13, 16-18 y 20, se evaluó un posible impacto de inyectabilidad (es decir, estrés por cizallamiento dentro de la aguja) con jeringas de HPLC (Unimetrics Corporation 100 gL) cuando estuvieron disponibles muestras de pequeño volumen y con jeringas Terumo 26G x 1/2 - 0,45 x 12 mm cuando estuvieron disponibles muestras de mayor volumen.
Para evaluar la influencia del estrés térmico en los ensayos de formulación N° P5-7 y 13, se almacenaron viales a 45 °C durante 1 y 2 semanas, y luego se analizaron. Se determinó la temperatura relevante para el estrés térmico por DSC. También se almacenaron los ensayos N° P5-7 y 13 a 5 °C durante 2 semanas, y luego se analizaron.
Para evaluar la influencia del estrés térmico en los ensayos de formulación N° P12, 15 y 21, se almacenaron los viales a 5 °C durante 3 a 6 semanas y se analizaron cada semana. Se almacenaron a 5 °C durante 4 a 5 semanas las disoluciones antes de la liofilización, denominadas principio activo formulado (FDS), para los ensayos N° P16-18 y 20, y se analizaron cada semana. Se almacenaron a 5 °C durante 24 h las disoluciones reconstituidas después de la liofilización para los ensayos N° P14, 16-18 y 20 y luego se analizaron.
Ejemplo 1 - optimización del pH
La primera etapa en el proceso de desarrollo de formulaciones fue determinar el pH óptimo para la formulación de anticuerpo principal. Para determinar el pH óptimo, se usó una baja concentración de anticuerpo principal (1 mg/mL, a diferencia de 100 mg/mL), ya que esta baja concentración de anticuerpo principal fue suficiente para determinar el pH óptimo. La Tabla 2 muestra las formulaciones probadas en este estudio.
Tabla 2 - Ensayo N° P5 - cribado de pH
Formulación N° P5-x Sistema tampón pH Concentración
1 Citrato 100 mM 4,5 1 mg/mL
2 Citrato 100 mM 5,0 1 mg/mL
3 Citrato 100 mM 5,5 1 mg/mL
4 Citrato 100 mM 6,0 1 mg/mL
5 Fosfato 100 mM 6,5 1 mg/mL
6 Fosfato 100 mM 7,0 1 mg/mL
7 Fosfato 100 mM 7,5 1 mg/mL
8 Tris 100 mM 8,0 1 mg/mL
9 Tris 100 mM 8,5 1 mg/mL
En este estudio, la Formulación 1 no fue estable debido a que condujo a inestabilidad conformacional para el anticuerpo principal. Específicamente, el anticuerpo principal tendió a desplegarse. Por tanto, la Formulación 9 condujo a desamidación. Así, se determinó que el pH original para la formulación de anticuerpo principal estaría dentro de un estrecho intervalo de alrededor pH 7,0.
Estudios posteriores de otros parámetros de formulación, tales como tampones, tensioactivos y agentes estabilizantes, incluyeron mayores concentraciones de anticuerpo principal. Estos estudios posteriores confirmaron las conclusiones anteriores referentes al pH óptimo para la formulación de anticuerpo principal cuando se usaron altas concentraciones de anticuerpo principal.
Ejemplo 2 - sistema tampón/fuerza iónica (sal)
Tampones
La siguiente etapa en el proceso de desarrollo de formulaciones fue determinar el tampón óptimo para la formulación de anticuerpo principal. Se probaron varios tampones diferentes, tales como histidina, fosfato, Tris y combinaciones de los mismos, en varios ensayos diferentes.
Tabla 3 - Ensayo N° P6 - Cribado de sistemas tampón a 1 mg/mL
Formulación N° P6-x Sistema tampón pH Concentración
1 Histidina 10 mM 6,5 1 mg/mL 2 Fosfato 10 mM 6,5 1 mg/mL 3 Fosfato 10 mM 7,0 1 mg/mL 4 Fosfato 10 mM 7,5 1 mg/mL 5 Tris 10 mM 7,0 1 mg/mL 6 Tris 10 mM 7,5 1 mg/mL 7 Fosfato 60 mM 7,0 1 mg/mL
Tabla 4 - Ensayo N° P7 - Cribado de sales a 1 mg/mL
Formulación N° P7-x Sistema tampón pH Concentración Aditivo
1 Fosfato 10 mM 7,0 1 mg/mL NaCl 70 mM 2 Fosfato 10 mM 7,0 1 mg/mL NaCl 140 mM 3 Tris 10 mM 7,0 1 mg/mL NaCl 70 mM 4 Tris 10 mM 7,0 1 mg/mL NaCl 140 mM
Tabla 5 - Ensayo N° P13 - Cribado de tampones / sales a 100 mg/mL Formulación N° P13- Sistema tampón pH Concentración Aditivo
x
1 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL -2 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL NaCl 70 mM
3 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL -4 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL NaCl 70 mM
Tabla 6 - Fórmulas de sistemas tampón
Sistema tampón (ácido/base) pH Concentración de ácido Concentración de base Ácido cítrico / NaOH 4,5 100 mM c.s. pH 5,0 Ácido cítrico / NaOH 5,0 100 mM c.s. pH 5,0 Ácido cítrico / NaOH 5,5 100 mM c.s. pH 5,5 Ácido cítrico / NaOH 6,0 100 mM c.s. pH 6,0 Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 6,5 100 mM c.s. pH 6,5 Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 6,5 10 mM c.s. pH 6,5 Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 7,0 100 mM c.s. pH 7,0 Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 7,0 60 mM c.s. pH 7,0 Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 7,0 10 mM c.s. pH 7,0 Sistema tampón (ácido/base) pH Concentración de ácido Concentración de base Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 7,5 100 mM c.s. pH 7,5 Dihidrogenofosfato de sodio / NaOH 7,5 10 mM c.s. pH 7,5 Ácido fosfórico / Tris-aminometano 8,0 c.s. pH 8,0 100 mM Ácido fosfórico / Tris-aminometano 8,5 c.s. pH 8,5 100 mM Ácido fosfórico / Tris-aminometano 7,0 c.s. pH 7,0 10 mM
Ácido fosfórico / Tris-aminometano 7,5 c.s. pH 7,5 10 mM
HCl / L-Histidina 6,5 c.s. pH 6,5 10 mM Dihidrogenofosfato de sodio / Tris-aminometano 7,0 6,3 mM 3,7 mM Dihidrogenofosfato de sodio / Tris-aminometano 7,0 2,22 mM 1,28 mM
Tras el procesamiento y la incorporación mediante mezclado de la formulación, los ensayos de formulación filtrada y los controles estuvieron libres de partículas visibles y sub-visibles, y el análisis de SEC mostró una pureza < 92,0 % debido a un DS de partida que contenía 5,5 % de h Mw .
Las temperaturas de aparición y desnaturalización obtenidas por DSC indicaron una mejor estabilidad térmica para los siguientes sistemas tampón-pH:
• Fosfato pH 6,5 y 7,0: N2 P5-5, P5-6, P6-2, P6-3
• Tris pH 7,0 y 7,5: N2 P6-5, P6-6
para los que la temperatura de aparición fue aproximadamente 61 °C en comparación con, por ejemplo, hasta 48 °C para pH 4,5 y 59 °C para el tampón histidina.
La estabilidad coloidal obtenida por SLS indicó una mejor estabilidad para los siguientes sistemas tampón-pH: • Fosfato pH 7,5: N° P6-4
• Tris pH 7,0 y 7,5: N2 P6-5, P6-6
para los que el segundo coeficiente del virial fue próximo a 3,010-4 mL.mol/g2 en comparación con, por ejemplo, 0 ,410-4 mL.mol/g2 para el tampón histidina y 1,5 10-4 mL.mol/g2 para el tampón fosfato pH 7,0.
Se observaron diferentes niveles de contaminación por partículas después de 1h 30 de estrés por agitación (véase la Figura 3).
Con respecto a las partículas visibles, los candidatos del sistema tampón-pH que muestran buena estabilidad para el ensayo N° P5 fueron del siguiente modo:
• Fosfato pH 6,5, 7,0 y 7,5: N2 P5-5, P5-6 y P5-7
• Tris pH 8,0 y 8,5: N2 P5-8 y P5-9
El Ensayo N° 6 se realizó para estos dos sistemas tampón con pHs entre 6,5 y 7,5. Los candidatos que muestran la mejor estabilidad fueron del siguiente modo:
• Fosfato pH 7,0 y 7,5: N2 P6-3 y P6-4
• Tris pH 7,0 y 7,5: N2 P6-5 y P6-6
Pareció que los pHs básicos fueron mejores para minimizar la formación de partículas.
El estrés por agitación y el estrés térmico (2 semanas a 45 °C) son métodos relevantes para la discriminación del sistema tampón-pH con respecto a partículas sub-visibles.
Los candidatos del sistema tampón-pH que proporcionaron una buena estabilidad fueron:
Ensayo N° 5: formulaciones N° P5-6 a P5-9, es decir, pH > 7,0
Ensayo N° 6 (véanse la Figura 4 y la Figura 5):
- Fosfato 7,5: N2 P6-4
- Tris 7,5: N2 P6-6
Seguido por:
- Fosfato pH 7,0: N° P6-3
- Tris pH 7,0: N2 P6-5
Obsérvese que el tampón histidina (N° P6-1) mostró, para todas las condiciones de estrés, un efecto desestabilizante importante.
Las mediciones de HIAC confirmaron la inspección visual: los pHs básicos fueron mejores para minimizar la formación de partículas. Además, al mismo pH, las formulaciones basadas en fosfato proporcionaron ligeramente menos partículas sub-visibles que el sistema tampón Tris.
Con respecto al ensayo N° 5 y 6, el estrés térmico mostró resultados interesantes para tanto HMW {xe " HMW " \f Abbreviation \t "Alto peso molecular "} como LMW {xe " LMW " \f Abbreviation \t "Bajo peso molecular "}. Obsérvese que la formulación N° P5-1 (pH 4,5) se degradó totalmente después de 1 semana a 45 °C; igualmente la formulación N° P5-2 después de 2 semanas a 45 °C. Estas dos muestras serán expulsadas de los siguientes análisis.
Con respecto a HMW, los resultados después de 2 semanas a 45 °C fueron similares para las formulaciones N° P5-6 a P5-9 (pH > 7,0) y mejores para N° P5-5 a P5-3, ya que el pH disminuyó desde 6,5 hasta 5,5. Para el ensayo N° 6, se confirmó esta tendencia y los candidatos a sistemas tampón-pH que proporcionaron una buena estabilidad fueron (véase la Figura 6):
• Fosfato pH 6,5: N° P6-2
• Tris pH 7,0: N2 P6-5
• Histidina pH 6,5: N° P6-5
Así, el pH 6,5 proporcionó una mejor estabilidad para minimizar la formación de HMW que el pH 7,0, que en sí era mejor que pH 7,5. Además, al mismo pH (7,0 y 7,5), las formulaciones basadas en Tris proporcionaron ligeramente menos HMW que el sistema tampón fosfato.
Con respecto a LMW, las formulaciones N° P5-3 a P5-5 (pH < 6,5) mostraron una buena estabilidad después de 2 semanas a 45 °C. Ocurrieron formaciones de LMW sustancial y bandas en gel de SDS-PAGE adicionales para las formulación N° P5-6 a P5-9 (7,0 < pH < 8,5). La degradación de LMW fue más pronunciada para la formulación N° P5-9 (Tris pH 8,5) (véase la Figura 7) y las bandas en gel de SDS-PAGE adicionales fueron particularmente visibles para N° P5-7 (fosfato pH 7,5) (véase Figura 8). Obsérvese que los productos de degradación parecieron diferentes para los sistemas tampón fosfato y Tris.
El ensayo N° 6 confirmó estas conclusiones y mostró que para el mismo pH, las formulaciones basadas en fosfato proporcionaron ligeramente más LMW que los sistemas tampón Tris.
Con respecto a HMW y LMW, pareció que los pHs ácidos presentaron una mejor estabilidad que los básicos, con una ligera ventaja para el sistema tampón Tris con respecto a fosfato.
El estrés térmico a 45 °C durante 4 semanas fue un medio relevante para forzar la degradación química del anticuerpo principal (es decir, cambio en el patrón de ácido) evidenciado por IEF y, por tanto, para seleccionar sistemas tampónpH que proporcionan una buena estabilidad para el anticuerpo principal (véase la Figura 9). Las formulaciones menos estables fueron Tris pH 8,5 (N° P5-9) y fosfato pH 7,5 (N° P6-4), como el patrón de isoforma, ambos presentaron 2 formas ácidas adicionales y la forma principal llegó a ser minoritaria. El candidato a sistema tampón-pH que muestra una buena estabilidad fue Tris pH 7,0 (N° P6-5).
En conclusión, basándose en el análisis del estado inicial y los resultados del programa de estrés en los ensayos N° P5 y 6 (disoluciones de 1 mg/mL), el pH se ha establecido a 7,0. Esta selección es un compromiso entre una buena estabilidad con respecto a partículas visibles y sub-visibles (pHs básicos) y estabilidad con respecto a HMW y LMW (pHs ácidos). Con respectos a los sistemas tampón, tanto fosfato como tris mostraron ventajas para el pH seleccionado: Fosfato con respecto a las partículas visibles/sub-visibles y Tris con respecto a HMW y LMW.
Obsérvese que para la primera evaluación de aditivos, se han usado los sistemas tampón Fosfato 10 mM o Tris 10 mM:
• Para confirmar los resultados anteriores en disoluciones 100 mg/mL de anticuerpo principal,
• y para probar el proceso de liofilización en ambos sistemas tampón por separado.
Se confirmaron los resultados anteriores y ambos sistemas tampón (N° P14-3 y P14-8) mostraron buenos resultados durante el proceso de liofilización (véase la Figura 19).
A pH 7,0, el fosfato tiene una capacidad de tamponamiento más fuerte que Tris; sin embargo, a diferencia de Tris, su base tiene una tendencia a precipitar durante las etapas de congelación. Para combinar las ventajas de tanto Tris como fosfato, se ha seleccionado una mezcla de estos dos sistemas tampón: Fosfato 6,3 mM y Tris 3,7 mM. Aunque se conoce en la técnica el uso de tampón Tris o tampón fosfato (el uso de cada uno por separado), la combinación de tampón T ris y tampón fosfato en un sistema tampón es altamente inusual y no se conoce en la técnica.
Conductividad (selección de pH y tampón)
La disolución antes de la liofilización tuvo una conductividad de aproximadamente 300 pS/cm, que da una conductividad teórica de 850 pS/cm para la DP después de la reconstitución.
Los presentes inventores probaron primero un tampón comúnmente usado para un mAb: Histidina, en su región de tamponamiento a pH 6,2 y 6,6 y a una concentración de 10 mM. A pH 6,2, se había encontrado un problema de insolubilidad con la precipitación del anticuerpo principal a temperatura ambiente (véase la Fig. 29). A pH 6,6, la disolución fue ligeramente opalescente a temperatura ambiente, el segundo coeficiente del virial fue bajo 0,410-4 mL.mol/g2. A diferencia de la mayoría de los mAbs, la histidina no es un buen tampón para el anticuerpo principal.
Entonces, los presentes inventores probaron otro tampón comúnmente usado: Fosfato en su región de tamponamiento a pH 6,5, 7,0 y 7,5, y a una concentración de 10 mM. Para pH 6,5 y 7,0, el segundo coeficiente del virial fue inferior a 1,5 10-4 mL.mol/g2, que significa una baja estabilidad coloidal. Para pH 7,5, el segundo coeficiente del virial fue próximo a 3,010-4 mL.mol/g2, que significa una buena estabilidad coloidal, sin embargo, un estrés térmico (2 semanas a 45 °C) mostró una disminución de la pureza (tanto aumento de HMW como de LMW) más importante que para pH 6,5 y 7,0. El fosfato es un buen tampón, sin embargo a pH ácido la estabilidad coloidal es baja, y a pH básico el anticuerpo principal es sensible al estrés térmico.
Para expandir el cribado del tampón, se probó Tris en su región de tamponamiento a pH 7,0, y 7,5, y a una concentración de 10 mM. Ambos pHs presentaron una buena estabilidad coloidal con un coeficiente del virial próximo a 3,010-4 mL.mol/g2. El estrés térmico (2 semanas a 45 °C) mostró una disminución de pureza (tanto aumento de HMW como de LMW) más importante para pH 7,5 que para pH 7,0. Sin embargo, Tris a pH 7,0 proporcionó una estabilidad mucho mejor con respecto a HMW y una estabilidad ligeramente mejor con respecto a LMW que el fosfato al mismo pH. Tris pH 7,0 es un mejor sistema tampón que Tris pH 7,5 y fosfato pH 7,0. Aunque, para obtener una buena capacidad de tamponamiento de Tris a este pH (pka = 8,1), la cantidad requerida sería mayor que la máxima usada en un producto comercializado.
Para optimizar el tampón para el anticuerpo principal, se seleccionó una combinación de fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM para obtener una buena capacidad de tamponamiento a pH 7,0 debido al fosfato (pka = 7,2), y una buena estabilización del anticuerpo principal debido a Tris.
Como se ha establecido anteriormente, aunque se conoce en la técnica el uso de tampón Tris o tampón fosfato (el uso de cada uno por separado), la combinación de tampón T ris y tampón fosfato en un sistema tampón es altamente inusual y no se conoce en la técnica.
Fuerza iónica/concentración de sales
Se probó cloruro sódico (NaCl) con los dos candidatos a tampón-pH seleccionados a una concentración de 70 mM en disoluciones 100 mg/mL de anticuerpo principal.
Las temperaturas de aparición y desnaturalización obtenidas por DSC, así como la estabilidad coloidal obtenida por SLS, no indicaron ningún efecto sustancial de NaCl sobre la estabilidad de las disoluciones. Después del estrés mecánico del ensayo de formulación N° P13 y el almacenamiento de dos semanas a 5 °C de la misma formulación, los candidatos N° P13-1 y P13-3, es decir, sin NaCl, mostraron una mejor estabilidad con respecto a la formación de HMW (véase la Figura 10). Igual c/c en la Figura 33.
El aumento de la concentración de sales causó un aumento en la fuerza iónica, que causó un aumento en la cinética de agregación del anticuerpo principal. Así, se determinó que la formulación no debe contener ni sal ni un agente osmótico. Además, se determinó que la formulación óptima debe comprender una baja concentración de tampón para que tenga una baja fuerza iónica.
Ejemplo 3 - tensioactivo
La siguiente etapa en el proceso de desarrollo de formulaciones fue determinar los excipientes óptimos para la formulación de anticuerpo principal. Los excipientes deben ser suficientes para estabilizar el anticuerpo principal, y ser compatibles con la liofilización. Se probaron varios tensioactivos diferentes, tales como polisorbatos y poloxámeros, en diversas concentraciones.
Tabla 7 - Ensayo N° P12 - Cribado de aditivos a 85 mg/mL
Formulación Sistema pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2
N° P12-x tampón
1 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS800,01 % (p/v) Glicina 1 % (p/v)
(130 mM)
3 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS800,01 % (p/v) Sacarosa 5 % (p/v) 4 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS800,01 % (p/v) Trehalosa 5 % (p/v) 5 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS800,01 % (p/v) -6 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS800,1 % (p/v) -7 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS200,01 % (p/v) -8 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL PS200,1 % (p/v) -9 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL Poloxámero 0,05 % (p/v) -10 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL Poloxámero 0,1 % (p/v) -11 Fosfato 10 mM 7,0 85 mg/mL - -
Tabla 8 - Ensayo N° P23 - Cribado de aditivos a 100 mg/mL
Formulación N° P23-x Sistema tampón pH Concentración Aditivo
1 Tris / Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS800,1 % (p/v) 2 Tris / Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS800,2 % (p/v) 3 Tris / Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS800,3 % (p/v)
Inmediatamente después de la filtración de 0,22 pm, los ensayos de formulación y controles estuvieron libres de partículas visibles y sub-visibles. El análisis de SEC mostró una pureza < 92,0 % debido a la concentración del anticuerpo principal desde 4,5 mg/mL hasta 100 mg/mL (el DS de partida contuvo 3,0 % de HMW).
El estrés mecánico fue una media relevante para discriminar entre los candidatos a formulación. Debido a la disponibilidad de una cantidad limitada de material de partida, no fue posible la observación visual estándar y, por tanto, se usó observación en capilar bajo una lupa. Con respecto a partículas visibles/sub-visibles, los candidatos que muestran una buena estabilidad para el ensayo N° 12 fueron del siguiente modo (véase la Figura 11):
• PS800,1 %: N2 P12-6
• PS200,1 %: N2 P12-8
Entre los tensioactivos probados, ninguno tuvo un impacto sobre la formación de HMW en comparación con la formulación sin tensioactivo, excepto N° P12-8 (PS20 0,1 %), que tuvo un ligero efecto negativo durante el almacenamiento de seis semanas a 5 °C (véase la Figura 12).
Para concluir, no hubo una fuerte diferencia entre los tensioactivos. Se seleccionó el siguiente tensioactivo: PS80, para prevenir la formación de partículas visibles/sub-visibles.
A continuación, se probaron diversas concentraciones de PS80 en la formulación de anticuerpo principal (véase la Tabla 23). Se probaron concentraciones de PS80 desde 0,05-0,2 % para estrés por agitación durante 15 horas a 350 rpm (temperatura ambiente). Las muestras se analizaron por microscopía en celda de flujo, y los resultados se muestran en la Tabla 9. La Tabla 9 muestra que una concentración de PS80 entre 0,05 y 0,2 % tuvo un efecto estabilizador equivalente para todas las concentraciones con respecto al estrés por agitación. Así, se puede usar en la formulación una concentración de PS80 de 0,05 a 0,2 %.
Tabla 9 - Concentración de PS80
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 4 - sacarosa
Como se ha establecido anteriormente, la siguiente etapa en el proceso de desarrollo de formulaciones era determinar los excipientes óptimos para la formulación de anticuerpo principal. Los excipientes deben ser suficientes para estabilizar el anticuerpo principal, y ser compatibles con la liofilización. Se probaron varios azúcares diferentes, tales como sacarosa, trehalosa y manitol, en diversas concentraciones.
Tabla 10 - Ensayo N° P14 - Cribado de aditivos para un liofilizado
Form. Sistema pH iConcentracióni Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 N2 P14- tampón
x
1 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) - -10 mM
2 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) Sacarosa 10 % -10 mM (p/v)
3 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) Sacarosa 5 % (p/v) Manitol 3 % (p/v)
10 mM
4 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) NaCl 70 mM Manitol 3 % (p/v)
10 mM
5 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) NaCl 70 mM Manitol 3 % (p/v)
10 mM
6 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) Glicina 1 % (p/v) Manitol 3 % (p/v)
10 mM
7 Fosfato 7,0 100 mg/vial PS800,3 % (p/v) Sacarosa 5 % (p/v) Manitol 3 % (p/v)
10 mM
8 Tris 10 mM 7,0 100 mg/vial PS800,1 % (p/v) Sacarosa 5 % (p/v) Manitol 3 % (p/v)
Tabla 11 - Ensayo N° P15 - Cribado de aditivos a 100 mg/mL - DoE
Form. Sistema pH Conc. Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 Aditivo 4 N2 P15- tampón
x
1 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Sacarosa - Prolina 5,8 % 0,01 % 10 % (p/v) (p/v) (p/v)
2 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Manitol 3 % - Prolina 5,8 % 0,01 % (p/v) (p/v) (p/v)
Form. Sistema pH Conc. Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 Aditivo 4 N2 P15- tampón
x
3 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Trehalosa
0,01 % 10 % (p/v)
(p/v)
4 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Etanol 2 % Ácido glutámico 0,01 % (p/v) 7,3 % (p/v) (p/v) -
5 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 PEG 400 Aspartato 8,7 %
0,01 % 1 % (p/v) (p/v) (p/v) -
6 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Trehalosa Aspartato 8,7 %
0,01 % 10 % (p/v) (p/v) (p/v) -
7 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Sacarosa Glicerol 5 % Glicina 1,9 %
0,01 % 10 % (p/v) (p/v) (p/v) (p/v)
8 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Manitol 3 % PEG 400
0,01 % (p/v) 1 % (p/v)
(p/v) -
9 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Trehalosa PEG 400 Prolina 5,8 %
0,01 % 10 % (p/v) 1 % (p/v) (p/v) (p/v)
10 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Manitol 3 % Aspartato 8,7 %
0,01 % (p/v) (p/v) (p/v) -
11 Tris 10 mM 100 mg/mL PS80 Sacarosa Etanol 2 %
0,01 % 10 % (p/v) (p/v)
(p/v) -
12 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Glicerol 5 %
0,01 % (p/v)
(p/v) - -
13 Tris 10 mM 100 mg/mL PS80 Trehalosa Glicerol 5 % Ácido glutámico 0,01 % 10 % (p/v) (p/v) 7,3 % (p/v) (p/v)
14 Tris 10 mM 100 mg/mL PS80 Glicina 1,9 %
0,01 % (p/v) (p/v) - -
15 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Sacarosa Ácido glutámico 0,01 % 10 % (p/v) 7,3 % (p/v) (p/v) -
16 Tris 10 mM 7,0 100 mg/mL PS80 Manitol 3 % Etanol 2 % Glicina 1,9 %
0,01 % (p/v) (p/v) (p/v) (p/v)
Tabla 12 - Ensayo N° P16 - Cribado de aditivos y desarrollo de proceso para un liofilizado
Form. Sistema pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 Aditivo 4 N2 P16- tampón
x
1 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Manitol -(p/v) (p/v) 3 % (p/v)
2 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/vial PS800,1 % Trehalosa Manitol -(p/v) 5 % (p/v) 3 % (p/v)
3 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/vial PS80 Sacarosa 5 % Manitol -0,05 % (p/v) (p/v) 3 % (p/v)
4 Fosfato 10 mM 7,0 100 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Manitol PEG 4000 (p/v) (p/v) 3 % (p/v) 1 % (p/v)
Tabla 13 - Ensayo N° P17-FDS - Cribado de aditivos a 38 mg/mL
Form. N° Sistema pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 P17-X-FDS tampón
1 Tris / Fosfato 7,0 38 mg/mL PS800,033 % Sacarosa 3,33 % -3,3 mM (p/v) (p/v)
2 Tris / Fosfato 7,0 38 mg/mL PS800,033 % Sacarosa 1,67 % Manitol 1 %
3,3 mM (p/v) (p/v) (p/v)
3 Tris / Fosfato 7,0 38 mg/mL PS800,033 % - Glicina 0,37 %
3,3 mM (p/v) (p/v)
Tabla 14 - Ensayo N° P17 - Cribado de aditivos y desarrollo de proceso para un liofilizado
Form. N° Sistema tampón pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 P17-X
1 Tris / Fosfato 7,0 190 mg/vial PS800,1 % Sacarosa -10 mM (p/v) 10 % (p/v)
2 Tris / Fosfato 7,0 190 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Manitol 3 %
10 mM (p/v) (p/v) (p/v)
3 Tris / Fosfato 7,0 190 mg/vial PS800,1 % - Glicina 2,2 %
10 mM (p/v) (p/v)
En conclusión, basándose en los estudios anteriores, se eligió sacarosa como un excipiente debido a que estabilizó el anticuerpo principal. Además, se conoce bien que la sacarosa es un lioprotector, por lo que mejorará la formulación liofilizada. De hecho, la liofilización sin sacarosa conduce a un aumento en HMW (véase la Fig. 19). Además, se encontró que 5 % de sacarosa era óptimo para la formulación.
Ejemplo 5 - agentes estabilizantes
Como se ha establecido anteriormente, la siguiente etapa en el proceso de desarrollo de formulaciones fue determinar los excipientes óptimos para la formulación de anticuerpo principal. Los excipientes deben ser suficientes para estabilizar el anticuerpo principal, y ser compatibles con la liofilización. Se probaron varios agentes estabilizantes diferentes, tales como manitol, aspartato, prolina, glicina, arginina y leucina, en diversas concentraciones. Esto se puede observar en las tablas a continuación y en las Tablas 10-14 anteriores.
Tabla 15 - Ensayo N° P18 - Cribado de aditivos y desarrollo de proceso para un liofilizado Form. Sistema tampón pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 N2 P18-x
1 Tris / Fosfato 10 mM 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Manitol 3 % (p/v)
(p/v) (p/v)
2 Tris / Fosfato 10 mM 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Aspartato 4,3 %
(p/v) (p/v) (p/v) 3 Tris / Fosfato 10 mM 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Prolina 5,8 %
(p/v) (p/v) (p/v)
Tabla 16 - Ensayo N° P20-FDS - Cribado de aditivos a 35 mg/mL Form. N° Sistema tampón pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 P20-X-FDS
1 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS80 Sacarosa1,75 % Manitol 1,05 %
3,5 mM 0,07 % (p/v) (p/v) (p/v) 2 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS80 Sacarosa1,75 % Aspartato 3,5 mM 0,07 % (p/v) (p/v) 1,05 % (p/v) 3 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS80 Sacarosa1,75 % Prolina 1,05 %
3,5 mM 0,07 % (p/v) (p/v) (p/v) 4 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS80 Sacarosa1,75 % Glicina 1,05 %
3,5 mM 0,07 % (p/v) (p/v) (p/v) 5 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS80 Sacarosa1,75 % Arginina 1,05 %
3,5 mM 0,07 % (p/v) (p/v) (p/v)
Tabla 17 - Ensayo N° P20 - Cribado de aditivos y desarrollo de proceso para un liofilizado Form. N° Sistema tampón pH Concentración Aditivo 1 Aditivo 2 Aditivo 3 P20-x
1 Tris / Fosfato 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Manitol 3 %
10 mM (p/v) (p/v) (p/v) 2 Tris / Fosfato 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Aspartato 3 %
10 mM (p/v) (p/v) (p/v) 3 Tris / Fosfato 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Prolina 3 % (p/v)
10 mM (p/v) (p/v)
4 Tris / Fosfato 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Glicina 3 % (p/v)
10 mM (p/v) (p/v)
5 Tris / Fosfato 7,0 175 mg/vial PS800,1 % Sacarosa 5 % Arginina 3 %
10 mM (p/v) (p/v) (p/v) Tabla 18 - Ensayo N° P21 - Cribado de aditivos a 35 mg/mL
Form. N° Sistema pH Concentración Aditivos 1 Aditivo 2 Aditivo 3 P21-x tampón
1 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa Manitol 3 % (p/v)
3,5 mM (p/v) 1 % (p/v)
2 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa Sulfobutil-éter-p-3,5 mM (p/v) 1 % (p/v) ciclodextrina 3 % (p/v)
3 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa N-acetil-cisteína 3 % (p/v)
3,5 mM (p/v) 1 % (p/v)
4 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa Leucina 0,3 % (p/v)
3,5 mM (p/v) 1 % (p/v)
5 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa Monoclorhidrato de L-3,5 mM (p/v) 1 % (p/v) lisina 3 % (p/v)
6 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa N-acetil-cisteína 0,03 %
3,5 mM (p/v) 1 % (p/v) (p/v)
7c Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % Sacarosa Manitol 3 % (p/v)
3,5 mM (p/v) 1 % (p/v)
8 Tris / Fosfato 7,0 35 mg/mL PS800,01 % - -3,5 mM (p/v)
c Misma formulación que N° P21-1 pero esta muestra se inertiza gracias al nitrógeno mientras se almacena a 5 °C
El objetivo de estos cribados era encontrar un aditivo que estabilizara adicionalmente el anticuerpo principal con respecto a la formación de HMW (ensayo N° 12, 15, 20-FDS, y 21). Debido a la alta sensibilidad del anticuerpo principal a la agregación, se encontró que la temperatura de almacenamiento a largo plazo prevista (es decir, 5 °C) era relevante para monitorizar el efecto de los aditivos.
Se hizo un modelo de cribado por diseño de experimento (DoE), primer grado, matriz D-óptima, para cribar el efecto de diferentes azúcares, polioles, aminoácidos y disolventes en la formación de HMW (ensayo N° 15). El resultado de este DoE se resume en la Tabla 19.
Tabla 19 - Resultado del ensayo N° 15 (DoE) con respecto al cribado de aditivos
Parámetros HMW DSC Conclusión
Azúcares y Ligera estabilización por manitol Ligera estabilización por Ligero efecto positivo de polioles sacarosa y trehalosa azúcares y polioles
Aminoácidos Fuerte estabilización por aspartato Estabilización por aspartato Efecto positivo de y ligera estabilización por glicina, y ligeramente por glicina y aspartato, glicina y prolina prolina y glutamina prolina
Disolventes Fuerte desestabilización por etanol Fuerte desestabilización por Ningún efecto o efecto etanol desestabilizante de disolventes
Sistemas Sin efecto ND Sin diferencia entre tampón sistemas tampón
Se probaron por separado los aditivos que se encontró que tenían un efecto sobre HMW en el ensayo N° 12 y 20-FDS:
• Se encontró que los aminoácidos glicina (N° P12-1 y P20-4-FDS) y prolina (N° P20-3-FDS) tenían el mejor efecto en minimizar la formación de HMW (véase la Figura 13 y la Figura 14),
• El manitol (N° P20-1-FDS) vino después (véase la Figura 14),
• Seguido por sacarosa (N° P12-3) y trehalosa (N° P12-4), que fueron mucho menos eficientes (véase la Figura 13),
• Finalmente, no se confirmó un efecto positivo del aspartato 8 % (N° P20-2-FDS) a una concentración de 4 % (véase la Figura 14).
Se probaron varios otros aditivos durante el ensayo N° 21:
• Se encontró que la lisina (N° P21 -5) tenía un ligero efecto positivo sobre la formación de HMW (véase la Figura 15),
• Se encontró que el manitol (N° P21 -1) era el mejor en este ensayo.
Se encontró que la adición de prolina a la formulación tuvo dos efectos: controló la formación de HMW reduciendo la tasa de agregación en la formulación líquida, y actuó de agente de carga para hacer la torta más elegante en la formulación liofilizada. También se encontró que la adición de manitol a la formulación liofilizada causó que la torta fuera elegante.
A continuación, se probaron diversas concentraciones de prolina en la formulación de anticuerpo principal (véase la Tabla 23). Se probaron concentraciones de 1 % y 3 %. Las muestras se analizaron por UPLC, y los resultados se muestran en las Tablas 20 y 21, y en la Figura 16. Las Tablas 20 y 21 muestran que se puede usar en la formulación cualquiera de una concentración de prolina 1 o 3 %. Estos datos también confirman el efecto positivo de la prolina sobre la cinética de HMW. Además, la torta es ligeramente más elegante (menos replegada) con prolina 3 %, que confirma la función de la prolina como un lastre (resultados no mostrados).
Tabla 20 - 1 % de prolina
Figure imgf000038_0001
Tabla 21 - 3 % de prolina
Figure imgf000038_0002
En conclusión, aunque la formación de HMW ha sido significativamente reducida mediante la adición de excipientes, concretamente manitol y aminoácidos tales como glicina y prolina, el efecto beneficioso a una concentración de anticuerpo principal de 100 mg/mL no es lo suficientemente fuerte como para lograr la estabilidad satisfactoria en almacén. Por tanto, se ha desarrollado una formulación liofilizada, junto con un proceso de liofilización.
Ejemplo 6 - formulaciones liofilizadas
Para el proceso de congelación / secado, se dispensaron 5 a 5,5 mL del prototipo de FDS deseado que variaba desde la concentración de anticuerpo principal 20-38 mg/mL en viales de 15 mL (véanse como ejemplos la Tabla 13 y Tabla 14).
Se hizo el proceso de congelación / secado en disolución preconcentrada a 20 hasta 38 mg/mL en la formulación próxima al final de 5 a 5,5 mL dispensada en viales de 15 mL.
Se han usado tres tipos diferentes de sistemas liofilizados de Usifroid: PL45 (ensayo N° 14), SMH-300 (ensayo N° 17) y SMH-90 (ensayo N° 16, 18, 20). Para detalles de los ciclos de liofilización véase la Tabla 22. La pendiente del cambio de temperatura entre las etapas de liofilización es 1 °C/min.
Tabla 22 - Ciclos de liofilización usados para cada ensayo
Ensayo Temp. Duración Temp. Duración Temp. Duración de Tiempo de N2 congelación a secado de la secado la etapa de mantenimiento Tc o n g e l a c i ó n Tc o n g e l a c i ó n primario etapa de secundario secado a 20 °Cb secado secundario
primario3
14 -452C 100 min -102C 20 h 30 2C 7 h 14 h 16 -422C 60 min -252C 46 h 30 2C 18 h 18 h 17 -452C 60 min -252C 51 h 30 2C 21 h 20h 18 -422C 60 min -252C 37 h 30 2C 18 h 18 h 20 -422C 60 min -252C 53 h 40 2C 18 h 3 h a Fijo durante el experimento según la medición de temperatura del producto
b El ciclo termina solo durante las horas de tiempo de trabajo estándar
Entonces se reconstituyó la sustancia secada obtenida a la concentración diana de 100 mg/mL añadiendo la cantidad apropiada de WFI {xe " WFI " \f Abbreviation \t "Agua para inyección "} (1,0 a 1,6 mL).
Para los ensayos de liofilización N° P16-20, se congelaron a -20 °C disoluciones de 1 mL de FDS, se descongelaron a temperatura ambiente una vez y luego se analizaron.
También se probó la congelación y descongelación de DS intermedio (fin de la etapa de HAP - BD) (ensayo N° 9). Para este ensayo, se congelaron 20 mL de DS en 50 mL de botellas Nalgene de HDPE a tanto -20 °C como -70 °C, se descongelaron a temperatura ambiente una vez y luego se analizaron.
Se realizaron los siguientes métodos analíticos:
• Inspección visual para aspecto (claridad y color)
• Oscurecimiento de la luz (HIAC) para cuantificación de partículas sub-visibles
• SEC para pureza de proteínas
• SDS-PAGE para pureza de proteínas
• IEF para heterogeneidad de carga
• FCM para cuantificación de partículas sub-visibles
• DLS para agregación
• DSC para temperatura de desnaturalización
• SLS para estabilidad coloidal
• Espectroscopía de FT-IR para estructura secundaria
• Espectroscopia de fluorescencia para estructura terciaria
• Karl-Fisher para la determinación del porcentaje de agua residual (para liofilizado)
• XRPD para la determinación de matrices cristalinas/amorfas de la torta (para liofilizado)
Los principales criterios para la selección de las formulaciones y el proceso de liofilización fueron:
Se monitorizaron los siguientes parámetros:
• Estabilidad del anticuerpo principal durante el proceso de liofilización
• Estabilidad de la disolución reconstituida
• Estabilidad de FDS (disolución antes de la liofilización)
• Elegancia de la torta
• Tiempo de reconstitución
• Estabilidad de la torta
Se ha seleccionado el ciclo de liofilización para evitar el colapso de las tortas (véase la Tabla 22):
• Se ha establecido la temperatura de congelación por debajo de la temperatura de solidificación completa, es decir, ligeramente por debajo de la temperatura de transición vítrea (Tg'), que se ha medido por DSC para cada candidato a FDS (disolución antes de la liofilización) (véase la Figura 17).
• Se ha establecido la temperatura de secado primaria de forma que la temperatura de la muestra permanezca por debajo de la temperatura de colapso, que es próxima a Tg' (véase la Figura 17).
Las tortas obtenidas durante los diversos ensayos de liofilización fueron todas elegantes (véase la Figura 18) y el tiempo de reconstitución estuvo dentro de cinco minutos. Aunque es importante monitorizar los parámetros durante el desarrollo, no fueron relevantes para discriminar entre formulaciones.
Durante la etapa de congelación, se seleccionó una velocidad de enfriamiento de 1 °C/min para evitar los significativos desplazamientos en la concentración de anticuerpo principal y el pH. Se seleccionó la temperatura de secado secundaria (véase la Tabla 22) para obtener un nivel de agua residual en la torta medido por Karl-Fisher inferior a 1 %.
Se evaluó la estabilización del anticuerpo principal por SEC y SDS-PAGE para pureza, y DLS y FCM para la formación de partículas. Los criterios relevantes para discriminar entre formulaciones fueron el nivel de HMW antes y después de la reconstitución y el recuento de partículas sub-visibles después de la reconstitución.
Para evaluar el impacto del proceso de liofilización, se representó el nivel de HMW antes de la liofilización y después de la reconstitución para cada formulación, asi como el aumento de este nivel - en porcentaje con respecto al nivel antes de la liofilización (véase la Figura 19 y la Figura 20). Una linea de puntos indica en cada figura un aumento de 10 %. Los candidatos que proporcionaron una buena estabilidad fueron:
Fosfato con sacarosa 10 %: N° P14-2
Fosfato y Tris con sacarosa 5 % manitol 3 %: N° P14-3 y P14-8
Fosfato con manitol 3 % glicina 1 %: N° P14-6
Tris/Fosfato con sacarosa 5 % manitol 3 %: N° P20-1
Tris/Fosfato con sacarosa 5 % aspartato 3 %: N° P20-2
Tris/Fosfato con sacarosa 5 % prolina 3 %: N° P20-3
Tris/Fosfato con sacarosa 5 % glicina 3 %: N° P20-4
Obsérvese que sin ningún excipiente (N° P14-1), el anticuerpo principal es fuertemente inestable al proceso de liofilización, ya que se observó un aumento de aproximadamente 130 % para HMW antes y después de la liofilización. Se esperó este resultado, ya que un ciclo de congelación / descongelación hecho en el DS a -20 °C y - 70 °C (ensayo N° 9) mostró una fuerte desestabilización del anticuerpo principal (véase la Figura 21) - siendo la congelación la primera etapa del proceso de liofilización.
Con respecto a las partículas sub-visibles, una comparación entre las disoluciones reconstituidas por FCM mostró una mejor estabilidad para los siguientes candidatos:
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % prolina 3 %: N° P20-3
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % glicina 3 %: N° P20-4
Nota: no se determinó para el ensayo N° 14
Para estabilizar el anticuerpo principal después de la reconstitución de la torta, se usaron los excipientes que se encontró previamente que ralentizaron la agregación (véase la sección referente a Cribado de excipientes para una formulación líquida). Se evaluó la estabilización del anticuerpo principal después de la reconstitución por SEC para pureza, y DLS y FCM para la formación de partículas. Los criterios relevantes para discriminar entre formulaciones fueron:
• El nivel de HMW 24 h después de la reconstitución (almacenamiento a 5 °C)
• El número de partículas después del estrés mecánico.
Con respecto a la formación de HMW 24 h después de la reconstitución (almacenamiento a 5 °C), los candidatos que proporcionaron la mejor estabilidad fueron (véase la Figura 22 y la Figura 23):
• Fosfato con manitol 3 % glicina 1 %: N° P14-6
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % prolina 3 %: N° P20-3
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % glicina 3 %: N° P20-4
seguido por:
• Fosfato con sacarosa 10 %: N° P14-2
• Fosfato y T ris con sacarosa 5 % manitol 3 %: N° P14-3, P14-7 y P14-8
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % manitol 3 %: N° P20-1
Para evaluar la estabilidad del liofilizado, la reconstitución se hizo inmediatamente después de la fabricación y un mes (ensayos N° 16-20) a dos meses (ensayos N° 18-20) después. Se almacenaron los candidatos a liofilizado a 5 °C (ensayo N° 16-20) y 20 °C (ensayo N° 17). La estabilidad de la torta se evaluó por SEC para pureza, por FCM para la formación de partículas y por XRPD para la estructura de la torta.
Con respecto a HMW y la formación de partículas visibles/sub-visibles, se encontró que todas las formulaciones eran estables, mientras que se almacenaban a 5 °C (véase la Figura 24 y la Figura 25). El ligero aumento en el nivel de HMW observado para ambos ensayos N° 17 y 20 después de un mes a 5 °C no se reprodujo en los siguientes ensayos (no mostrados). Además, se observó un ligero aumento en el nivel de HMW mientras que se almacenaba a 20 °C (véase la Figura 24).
Se tomó la estabilidad de FDS, que es un parámetro importante para garantizar un DP de calidad, para explicar los ensayos N° 16-18 y 20. Se evaluó la estabilización del anticuerpo principal en esta etapa del proceso por SEC para pureza, y DLS y FCM para la formación de partículas. Se encontró que el almacenamiento a 5 °C era relevante para monitorizar el efecto de los aditivos sobre la estabilidad del anticuerpo principal. Un ciclo de congelación / descongelación hecho en FDS también fue relevante para discriminar entre formulaciones.
Con respecto a la estabilidad del anticuerpo principal mientras se almacena a 5 °C, se describieron resultados en la sección con respecto a Aditivos (véase la Figura 14). Se obtuvo la mejor estabilidad para:
• Tris/Fosfato con sacarosa 1,75 % prolina 1,05 %: N° P20-3-FDS
• Tris/Fosfato con sacarosa 1,75 % glicina 1,05 %: N° P20-4-FDS seguido por:
• T ris/Fosfato con sacarosa 1,75 % manitol 1,05 %: N° P20-1 -FDS
Con respecto a la estabilidad del anticuerpo principal después de un ciclo de congelación / descongelación, el recuento de partículas hecho por FCM mostró que fueron estables los siguientes candidatos a formulación:
• Tris/Fosfato con sacarosa 1,67 % manitol 1 %: N° P17-2-FDS
• T ris/Fosfato con sacarosa 1,75 % manitol 1,05 %: N° P20-1 -FDS
• Tris/Fosfato con sacarosa 1,75 % prolina 1,05 %: N° P20-3-FDS
En conclusión, considerando los siguientes criterios: estabilidad del anticuerpo principal durante el proceso, aspecto y estabilidad de la torta, así como tiempo de reconstitución, estabilidad de la disolución reconstituida y de FDS, destacan claramente 2 candidatos a formulación:
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % manitol 3 %
• Tris/Fosfato con sacarosa 5 % prolina 3 %
Conclusiones para los Ejemplos 2-6
Durante el trabajo de preformulación, se gestionó la formación de partículas visibles/sub-visibles debido a la selección de un intervalo de pH (> 7,0), de un sistema tampón (Tris/Fosfato) y especialmente a la adición de un tensioactivo: polisorbato 80 a una concentración de 0,2 %.
Sin embargo, la formación de HMW fue todavía un problema para una formulación líquida. Aunque la formación de HMW fue significativamente reducida por la selección del pH óptimo (7,0), y algunos excipientes (concretamente sacarosa, manitol y aminoácidos tales como glicina y prolina), el efecto beneficioso a 100 mg/mL no previno suficientemente que la formación de HMW esperara una estabilidad en almacén satisfactoria para una formulación líquida.
Por tanto, se desarrolló una formulación liofilizada junto con un proceso de liofilización. Para prevenir la agregación durante el proceso de liofilización, se seleccionó un crioprotector: sacarosa a una concentración de 5 %. Se probaron en el proceso de liofilización los excipientes estabilizantes seleccionados para la formulación líquida para estabilizar mejor tanto el líquido antes de la liofilización (concentración: 35 mg/mL) como la disolución reconstituida (concentración: 100 mg/mL). Algunos de estos excipientes fueron compatibles con el proceso de liofilización y entre ellos se han seleccionado dos: manitol y prolina a una concentración de 3 %. Los criterios principales para la selección fueron: elegancia y estabilidad de la torta, así como estabilidad de FDS (disolución antes de la liofilización) y de la disolución reconstituida.
Las dos formulaciones puestas a estabilidad a largo plazo se diferencian de un excipiente (véase la Tabla 23): • Prototipo 1: Prolina
• Prototipo 2: Manitol
Tabla 23 - Descripción de las formulaciones
Compuesto Concentración Función
Anticuerpo principal 100 mg/mL Principio activo
Tris/Fosfato 10 mM Tampón - pH 7,0
Polisorbato 80 0,2 % (p/v) Agente estabilizante para partículas visibles/sub-visibles Sacarosa 5 % (p/v) Crioprotector Agente estabilizante para HMW Prototipo 1: Prolina 3 % 3 % (p/v) Agente estabilizante para HMW agente tonificante Prototipo 2: Manitol 3 % 3 % (p/v) Agente estabilizante para HMW agente tonificante
ESTUDIOS DE FORMULACIONES ADICIONALES (Ejemplos 7-8)
Las abreviaturas usadas en los Ejemplos 7-8 son:
DP: Medicamento
DS: Principio activo
FD: Desarrollo de formulación
FDS: Principio activo formulado
FIM: Primero en el hombre
GRAS: Generalmente reconocido como seguro
HDPE: Polietileno de alta densidad
HMW: Peso molecular alto
IEF: Isoelectroenfoque
IL: Interleucina
LMW: Peso molecular bajo
PC: Policarbonato
PES: Poliétersulfona
PP: Polipropileno
PVDF: Poli(fluoruro de vinilideno)
TA: Temperatura ambiente
SC: Subcutáneo
Td1: Primera temperatura de desnaturalización
TOR: Tiempo fuera de refrigeración
Sumario
El objetivo de estos estudios (Ejemplos 7-8) fue mejorar la estabilidad de FDS con respecto a la alta tendencia a la formación de HMW del anticuerpo principal en el estado líquido.
Se definió el plan del estudio basándose en el conocimiento previo adquirido en los estudios de preformulación (Ejemplos 2-6) y se centra en la cinética de la formación de HMW a temperatura ambiente, en el FDS a 35 mg/mL. Todos los tampones y excipientes usados ya fueron usados o en productos de anticuerpo comercializados o en otros productos para uso parenteral, en particular todos son GRAS (Generalmente reconocidos como seguros). El pH varía entre 6,2 y 7,4.
Se compararon juntos un total de 50 formaciones diferentes con la formulación descrita en la Tabla 23. Las principales conclusiones fueron:
• Los valores de pH de aproximadamente 6,2 disminuyen la solubilidad del anticuerpo principal: se observaron una formación de gel y una precipitación con succinato e histidina, respectivamente
• Además, se debe evitar la histidina a pH 6,6 ya que la disolución fue opalescente y ligeramente menos térmicamente estable
• En el intervalo de pH entre 6,6 y 7,4, no hubo un claro efecto del pH sobre la cinética de formación de HMW • El aumento de la fuerza iónica tuvo un efecto desestabilizante sobre la cinética de la formación de HMW
• Fosfato y citrato fueron los mejores tampones probados, siempre que estuvieran a una baja concentración tal como 1,75 mM
• Entre todos los excipientes probados, se obtuvo el mejor efecto estabilizante con glicina 10 y 72 mM, y sacarosa 2,4 %. Sin embargo, el efecto estabilizante no permitió a los presentes inventores ralentizar significativamente la formación de HMW
En conclusión, los resultados en los Ejemplos 7-8 no identificaron una nueva combinación de excipientes que pudiera mejorar significativamente las formulaciones descritas en la Tabla 23 con respecto a la formación de HMW. La recomendación fue mantener la siguiente formulación (véase la Tabla 24): Fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS80 0,2 % (p/v), sacarosa 5 % (p/v), prolina 3 % (p/v).
Tabla 24 - Descripción de la formulación
Componente Concentración
Anticuerpo principal 100 mg/mL
Fosfato 6,5 mM
Tris 3,7 mM
Sacarosa 5 % (p/v)
Prolina 3 % (p/v)
PS80 0,2 % (p/v)
Introducción
El anticuerpo principal es un anticuerpo biespecífico (BsAb) humanizado manipulado que actúa en las citocinas IL-4 e IL-13. Su peso molecular, como se ha determinado por espectrometría de masas, es 198 kDa, y su Ip, como se ha determinado por IEF, varía entre 5,8 y 6,2.
Los principales cambios del proceso de fabricación de DS están siendo implementados para la fase IIb y se planea un estudio de comparabilidad entre la calidad de DS y DP de fase I/IIa y fase IIb. Como parte de los cambios en la fabricación de DS, se decidió realizar un estudio de formulación con el objetivo de reducir la formación de HMW en el estado líquido. Así, se podrían incluir la posible mejora de la formulación en el estudio de comparabilidad.
Obsérvese que en el mismo tiempo, el proceso de fabricación de DP para la fase IIb está siendo optimizado para el aumento de escala, descongelación de FDS y cambio de dosis/vial de DP a 100 mg/vial de 7 mL en lugar de 150 mg/vial de 15 mL. Este estudio está siendo realizado en paralelo con el desarrollo de la formulación.
El actual perfil de producto diana para este estudio (Ejemplos 7-8) estipula las siguientes características del medicamento:
Vía de administración: inyección SC
Forma de DP: liofilizado
Concentración: disolución reconstituida a 100 mg/mL
Estabilidad en almacén: 24 meses
Temperatura de almacenamiento: 2 °C-8 °C
Concentración de dosis: 100 mg/vial
Recipiente primario: vial tubular de vidrio claro de tipo 1 de 7 mL
El principio activo se debe formular a 35 mg/mL antes del almacenamiento a -20 °C en botellas de policarbonato de 1 L. No se realizan excipientes adicionales o diluciones antes de la liofilización.
Los estudios de preformulación y formulación para FIM permitieron las siguientes conclusiones:
• Evitar pH ácido < 6,0 (estabilidad térmica y coloidal baja) y pH básico > 7,5 (formación de LMW y cambio de isoformas de carga bajo estrés térmico).
• Las partículas visibles/sub-visibles fueron significativamente reducidas usando polisorbato 80 a una concentración de 0,2 % en combinación con el sistema tampón fosfato/Tris, pH 7,0
• La cinética de formación de HMW aumenta con la concentración de anticuerpo principal, y las formulaciones probadas no previnieron suficientemente la formación de HMW a 100 mg/mL para que los presentes inventores esperaran una estabilidad en almacén satisfactoria para una formulación líquida.
• La formación de HMW en estado líquido condujo el desarrollo hacia un DP liofilizado reconstituido con ligeramente menos de 1/3 del volumen inicial (antes de la liofilización) para lograr 100 mg/mL de 35 mg/mL de FDS. Se seleccionaron un crioprotector y lioprotector: Sacarosa a una concentración de 5 %.
• La formulación seleccionada para la fase I y IIa fue la siguiente: Fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS800,2 % (p/v), sacarosa 5 % (p/v), prolina 3 % (p/v).
• Esta formulación se podría optimizar con respecto a la formación de HMW combinando los excipientes identificados por tener un ligero efecto positivo, concretamente: sacarosa, manitol y aminoácidos tales como glicina y prolina.
Se ha identificado que la formación de HMW en el estado líquido es la principal vía de degradación. La cinética aumenta con la temperatura de la disolución (10 veces más lenta a 5 °C que a TA en el DP) y con la concentración de anticuerpo principal:
• FDS a 35 mg/mL a TA: AHMW= 1,6 % en 7 h y 4,1 % en 24 h
• DP a 100 mg/mL a TA: AHMW= 0,6 % en 1 h y 3,5 % en 5 h
Objetivos
El objetivo de este estudio (Ejemplos 7-8) fue aumentar la estabilidad del anticuerpo principal en el estado líquido con respecto a la formación de h Mw . Para establecer dianas cuantitativas para este estudio, se propusieron los siguientes valores:
• 5 h a TA después de la reconstitución de DP para la estabilidad en uso: AHMW< 1 % en 5 h,
• 12 h de TOR para el FDS con el fin de facilitar la fabricación de DP: AHMW < 1 % en 12 h.
Estos valores objetivo tienen en cuenta las condiciones de uso del DP reconstituido a 100 mg/mL y las condiciones de fabricación del proceso cuando el FDS a 35 mg/mL está fuera de las condiciones refrigeradas. Estos valores se deben ajustar dependiendo del perfil de calidad del producto objetivo.
Diseño del estudio
El enfoque propuesto para este estudio (Ejemplos 7-8) fue cribar los excipientes combinados a lo largo de un amplio intervalo de formulaciones a las concentraciones del anticuerpo principal de 35 mg/mL.
El cribado de las formulaciones se centró en estabilizar excipientes que podrían afectar posiblemente la formación de HMW. Se decidió para este estudio lo siguiente:
• Se mantuvieron PS80 y sacarosa a las concentraciones de fase I de la formulación en el cribado ya que no se había demostrado impacto negativo sobre la formación de HMW a estas concentraciones y se había observado un fuerte impacto positivo sobre el proceso de fabricación y/o reconstitución.
• El intervalo de pH se ajustó entre 6,2 y 7,4 debido a que estudios previos habían mostrado el beneficio de mantener el pH a aproximadamente pH 7
• Se cribaron los 5 tampones inyectables dentro de este intervalo de pH, solos o en combinación con varios excipientes: otros sistemas tampón y/o aditivos (aminoácidos, sacarosa (además de la que ya estaba contenida en la formulación de fase I) y sales principalmente).
Principio activo
Se describen los DS usados en este estudio (Ejemplos 7-8) en la Tabla 25.
Tabla 25 - Descripción de DS
Número Tipo Fecha Fabricante Formulación Concentración Almacenamiento Usado de lote de para N° fabr. ensayos LT- FDS Fosfato 2,22 mM/ 33 mg/mL -202C H04-150 10006- Tris 1,28 mM, a 190 DS Sacarosa 1,75 %,
Prolina 1,05 %,
PS800,07 %
VAB- DS Sacarosa 2,1 % 42 mg/mL -20 °C H04-193 YKR1-000079
Medicamento
Se formularon los DP usados en este estudio (Ejemplos 7-8) con la fase I/IIa de formulación (fosfato 6,5 mM/Tris 3,7 mM, pH 7,0, PS800,2 %, sacarosa 5 %, prolina 3 %) (véase la Tabla 26).
Tabla 26 - Descripción de DP
Liofilizado de DP Fecha de Fabricante Concentración/Formato Del FDS N2
N2 fabr.
H04-016 150 mg /vial de 15 mL CER0315 y CER0375 H04-046 150 mg /vial de 15 mL CER0378, CER0382 y CER0392 C1016207 150 mg /vial de 15 mL GMP2
H04-193 100 mg /vial de 7 mL H04-193
Fórmula(s)
Se enumeran a continuación en la Tabla 27 las fórmulas para cada ensayo en los Ejemplos 7-8.
Tabla 27 - Fórmula
Ensayo de Sistema tampón pH Composición nominal de Concentración formulación N° excipientes nominal (mg/mL) H04-150 A1 Succinato 10 mM 6,2 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-150 A2 Succinato 10 mM 6,2 Tris 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25
PS800,07 %
H04-150 A3 Succinato 10 mM 6,2 Histidina 10 mM - Sacarosa 1,75 % 36,25
- PS800,07 %
H04-150 A4 Succinato 10 mM 6,2 Prolina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25
PS800,07 %
H04-150 A5 Succinato 10 mM 6,2 Glicina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25
PS800,07 %
H04-150 A6 Succinato 10 mM 6,2 Tris 10 mM - Glicina 10 mM - 36,25
Sacarosa 1,75 % - PS800,07 %
Prueba preliminar Histidina 10 mM 6,2 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 (P-H04-144)
Ensayo de Sistema tampón pH Composición nominal de Concentración formulación N° excipientes nominal (mg/mL) Prueba preliminar Histidina 10 mM 6,2 Glicina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 (P-H04-148) PS800,07 %
H04-150 B1 Histidina 10 mM 6,6 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-150 B2 Histidina 10 mM 6,6 Tris 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-150 B3 Histidina 10 mM 6,6 Prolina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-150 B4 Histidina 10 mM 6,6 Glicina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-150 C - 6,8 Sacarosa 2,1 % - PS800,07 % 36,25 H04-150 D Fosfato 3,33 mM 6,9 Sacarosa 8,42 % - PS800,07 % 36,25 /Tris 1,92 mM
H04-163 A1 Citrato 10 mM 6,6 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-163 A2 Citrato 10 mM 6,6 Tris 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-163 A3 Citrato 10 mM 6,6 Histidina 10 mM - Sacarosa 1,75 % 36,25 - PS800,07 %
H04-163 A4 Citrato 10 mM 6,6 Prolina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-163 A5 Citrato 10 mM 6,6 Glicina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-163 A6 Citrato 10 mM 6,6 Tris 10 mM - Glicina 10 mM - 36,25 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 %
H04-163 B1 Fosfato 10 mM 6,6 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-163 B2 Fosfato 10 mM 7,0 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-163 B3 Fosfato 10 mM 7,0 Tris 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-163 B4 Fosfato 10 mM 7,0 Histidina 10 mM - Sacarosa 1,75 % 36,25 - PS800,07 %
H04-163 B5 Fosfato 10 mM 7,0 Prolina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-163 B6 Fosfato 10 mM 7,0 Glicina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-172 A1 Tris 10 mM 7,0 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-172 A2 Tris 10 mM 7,4 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-172 A3 Tris 10 mM 7,4 Succinato 10 mM NaCl 7,5 mM - 36,25 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 %
H04-172 A4 Tris 10 mM 7,0 Histidina 10 mM - Sacarosa 1,75 % 36,25 - PS800,07 %
H04-172 A5 Tris 10 mM 7,4 Histidina 10 mM - Sacarosa 1,75 % 36,25 - PS800,07 %
H04-172 A6 Tris 10 mM 7,4 Glicina 10 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
Ensayo de Sistema tampón pH Composición nominal de Concentración formulación N° excipientes nominal (mg/mL) H04-172 B1 Fosfato 1,75 mM 7,0 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 H04-172 B2 Fosfato 1,75 mM 7,0 Sacarosa 4 % - PS800,07 % 36,25 H04-185 A1 - 6,8 Sacarosa 4,15 % - PS800,07 % 36,25 H04-185 A2 - 6,8 Glicina 72 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 B1 Fosfato 1,75 mM 6,8 Glicina 72 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 B2 Fosfato 1,75 mM 6,8 Sacarosa 4,15 % - PS800,07 % 36,25 H04-185 B3 Fosfato 1,75 mM 6,8 Benzoato de sodio 37,8 mM - 36,25 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 %
H04-185 B4 Fosfato 1,75 mM 6,8 NaCl 38,5 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 B5 Fosfato 5,25 mM 6,8 Glicina 72 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 C1 Citrato 5,25 mM 6,8 Glicina 72 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 C2 Citrato 1,75 mM 6,8 Glicina 72 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 C3 Citrato 1,75 mM 6,8 Sacarosa 4,15 % - PS800,07 % 36,25 H04-185 C4 Citrato 10 mM 6,8 Glicina 72 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 PS800,07 %
H04-185 D Fosfato 2,22 mM 6,8 Prolina 91 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 /Tris 1,28 mM PS800,07 %
H04-187 A1 Fosfato 2,22 mM 6,7 Prolina 91 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 /Tris 1,28 mM PS800,07 %
H04-187 A2 Fosfato 2,22 mM 6,8 Prolina 91 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 /Tris 1,28 mM PS800,07 %
H04-187 A3 Fosfato 2,22 mM 7,0 Prolina 91 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 /Tris 1,28 mM PS800,07 %
H04-187 A4 Fosfato 2,22 mM 7,2 Prolina 91 mM - Sacarosa 1,75 % - 36,25 /Tris 1,28 mM PS800,07 %
H04-190 A1 - 6,8 Sacarosa 20,5 % - PS800,07 % 20 H04-190 A2 - 6,8 Sacarosa 13,42 % - PS800,07 % 36,25 H04-190 A2 - 6,8 Sacarosa 1,75 % - PS800,07 % 36,25 a Las cantidades de excipientes se expresan en % de p/v
Proceso de fabricación
Se fabricaron las formulaciones en los Ejemplos 7-8 con una disolución concentrada de anticuerpo principal que se obtuvo por UF/DF a una concentración de 42 mg/mL en sacarosa 2,1 %. Esta disolución de anticuerpo principal se diluyó con disoluciones madre concentradas de excipientes.
Proceso de UF/DF
Durante el proceso de UF/DF (Ejemplos 7-8), se concentró primero la disolución de proteína inicial a 35 mg/mL hasta 40 mg/mL, luego se intercambió el tampón. Después de la diafiltración, se concentró la disolución de proteína a más de 42 mg/mL, que era la concentración final objetivo (véase la Tabla 28).
Se describen en la Tabla 28 el material usado y las condiciones de proceso de cada UF/DF. Al final de la UF/DF, se ajustó la concentración de anticuerpo principal a 42 mg/mL en una disolución al 2,1 % de sacarosa.
Tabla 28 - Parámetros de fabricación de UF/DF
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Ajuste de la formulación
Se diluyó el anticuerpo principal después de la disolución de UF/DF (Ejemplos 7-8) con cantidades apropiadas de disoluciones madre concentradas hasta la formulación final deseada. La referencia y la composición de las disoluciones concentradas fabricadas para este estudio se resumen en la Tabla 29.
Tabla 29 - Formulaciones de la disolución madre concentrada
Ensayo de formulación Sistema tampón Composición nominal del pH ajustado N° excipiente3 a
P -H04-138 Succinato 60 mM - 5,9 P -H04-139 Succinato 60 mM Tris 60 mM 5,9 P -H04-140 Succinato 60 mM Histidina 60 mM 6,2 P -H04-141 Succinato 60 mM Prolina 60 mM 5,9 P -H04-142 Succinato 60 mM Glicina 60 mM 5,9 P -H04-143 Succinato 60 mM Tris 60 mM - Glicina 60 mM 5,9 P -H04-144 Histidina 60 mM - 6,1 P -H04-145 Histidina 60 mM - 6,6 P -H04-146 Histidina 60 mM Tris 60 mM 6,4 P -H04-147 Histidina 60 mM Prolina 60 mM 6,5 P -H04-148 Histidina 60 mM Glicina 60 mM 6,1 P -H04-149 Histidina 60 mM Glicina 60 mM 6,6 (H04-150) Fos 20 mM /Tris Sacarosa 40 % Sin ajuste 11,5 mM
P -H04-151 Citrato 60 mM - 6,4 P -H04-152 Citrato 60 mM Tris 60 mM 6,3 Ensayo de formulación Sistema tampón Composición nominal del pH ajustado N2 excipiente3 a
P -H04-153 Citrato 60 mM Histidina 60 mM 6,6
P -H04-154 Citrato 60 mM Prolina 60 mM 6,4
P -H04-155 Citrato 60 mM Glicina 60 mM 6,4
P -H04-156 Citrato 60 mM Tris 60 mM- Glicina 60 mM 6,2
P -H04-157 Fosfato 60 mM - 6,4
P -H04-158 Fosfato 60 mM - 7
P -H04-159 Fosfato 60 mM Tris 60 mM 6,9
P -H04-160 Fosfato 60 mM Histidina 60 mM 7
P -H04-161 Fosfato 60 mM Prolina 60 mM 7
P -H04-162 Fosfato 60 mM Glicina 60 mM 6,8
P -H04-164 Tris 60 mM - 7,3
P -H04-165 Tris 60 mM - 7,7
P -H04-166 Tris 60 mM Succinato 60 mM NaCl 45 mM 7,7
P -H04-167 Tris 60 mM Histidina 60 mM 7,2
P -H04-168 Tris 60 mM Histidina 60 mM 7,5
P -H04-169 Tris 60 mM Glicina 60 mM 7,6
P -H04-170 Fosfato 10,5 mM - 7,2
P -H04-171 Fosfato 10,5 mM Sacarosa 13,5 % 7,2
P -H04-173 - Sacarosa 14,4 % Sin ajuste P -H04-174 - Glicina 432 mM Sin ajuste P -H04-175 Fosfato 10,5 mM Glicina 432 mM 6,8
P -H04-176 Fosfato 10,5 mM Sacarosa 14,4 % 6,8
P -H04-177 Fosfato 10,5 mM Benzoato de sodio 227 mM 6,8
P -H04-178 Fosfato 10,5 mM NaCl 231 mM 6,8
P -H04-179 Fosfato 31,5 mM Glicina 432 mM 6,8
P -H04-180 Citrato 31,5 mM Glicina 432 mM 6,8
P -H04-181 Citrato 10,5 mM Glicina 432 mM 6,8
P -H04-182 Citrato 10,5 mM Sacarosa 14,4 % 6,8
P -H04-183 Citrato 60 mM Glicina 432 mM 6,8
P -H04-184 Fos 13,3 mM /Tris Prolina 547 mM 7
7,7 mM
P -H04-186 Fos 13,3 mM /Tris Prolina 547 mM 6,5
7,7 mM
P -H04-1891 - Sacarosa 37,5 % Sin ajuste P -H04-1892 - Sacarosa 70 % Sin ajuste Ensayo de formulación Sistema tampón Composición nominal del pH ajustado N° excipiente3 a a cantidades de excipientes expresadas en % son en p/v
Se esterilizó por filtración cada formulación (Millex® GV) bajo flujo laminar y se dispensó una fracción en un vial de vidrio de tipo I de 2 mL según fuera apropiado (1 a 2 mL) y se tapó para cada momento de tiempo de estabilidad. Condiciones de estrés
Estrés térmico
Las condiciones de estrés térmico realizadas en los Ejemplos 7-8, según los ensayos de formulación, se enumeran en la Tabla 30.
Tabla 30 - Condiciones de estrés térmico
Ensayos de formulación N° Estrés por temperatura Tiempo de estrés
TAa Días: 1,2 y 3
H04-150
5 °Cb Días: 2, 3 y 6
TAa Días: 1, 2 y 3
H04-163
5 °Cb Días: 2, 3 y 7
TAa Días: 1, 2, 3 y 6
H04-172
5 °Cb Días: 2, 3 y 6
TAa Días: 1, 2 y 3
H04-185
5 °Cb Días: 2, 3 y 6
H04-187 TAa 16 h, 24 h y 40 h
H04-190 TAa 16 h, 40 h y 48 h
5 °Cc 21 h, 30 h y 46 h
H04-193
25 °Cc 21 h, 30 h y 46 h a Debido al acondicionamiento del aire de laboratorio, TA varía entre 21 °C y 29 °C
b Realizado en una cámara refrigerada estándar no GMP
c Cámara climática GMP 10*5
Descripción de métodos analíticos
Se realizaron los siguientes métodos analíticos en los Ejemplos 7-8:
• Inspección visual para aspecto (claridad y color)
- Se observó la disolución en viales de 7 mL con luz natural
• HPLC-SEC para pureza de proteínas
- 2 columnas PROSEC 300S- 250 x 4,6 mm a 35 °C
- Fase móvil: Fosfato 0,1 M/NaCl 0,2 M pH 7,0
- Detección: 280 nm
- Inyección: 10 pL (concentración 5 mg/mL)
- Flujo: 0,2 mL/min
- Tiempo de ejecución total: 40 min
Se realizó el siguiente método analítico:
• UPLC-SEC para pureza de proteínas
- Columna: 1 Acquity BEH200 SEC (150 x 4,6 mm dp=1,7 pm) a 40 °C
- Fase móvil: Na2HPÜ450 mM/NaClÜ4300 mM a pH 7,0
- Detección: UV a 280 nm
- Inyección: 1 pL (disolución a 5 mg/mL) Patrón 3014ET
- Inyección: 2 pL (disoluciones a 2,0 mg/mL)
- Flujo: 0,3 mL/min
- Tiempo de ejecución total: 8 min
Se monitorizó el siguiente método analítico:
• DSC para la temperatura de desnaturalización:
- Se usó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para estimar la estabilidad térmica del anticuerpo en diferentes formulaciones.
- Se realizaron mediciones calorimétricas con un VP-Capillary DSC desde 25 °C hasta 100 °C con una velocidad de calentamiento de 1 °C/min.
- La curva de capacidad dio información sobre la temperatura de desnaturalización Td (°C) (pico máximo). Criterios de evaluación
• SEC: Los resultados se consideraron comparables cuando la diferencia fue igual o inferior a 0,5 % de HMW. • DSC: Los resultados se consideraron comparables cuando la diferencia en Td1 fue igual o inferior a 0,4 °C. Método UPLC frente a HPLC
El primer cribado (ensayos N° H04-150 a 172) se había realizado en el método de HPLC desarrollado para la fase I. Se había observado un problema con respecto a un cambio del nivel inicial que afectó al nivel de determinación de HMW cuando se analizó un alto número de muestras en una serie.
Para el segundo cribado (ensayos N° H04-185 a 190), para obtener un nivel preciso de evolución de HMW, se usó un método de UPLC para el que no se había observado cambio del nivel inicial. Se observó el mismo perfil cromatográfico del patrón incluso después de que se inyectaran más de 200 muestras en la misma columna.
Referencias para mediciones de SEC
Para comparar las diferentes series con respecto a la evolución de HMW con el tiempo, se usó la fase I de formulación como una referencia:
• Para el primer cribado (ensayos N° H04-150 a 172), se obtuvo la fase I de FDS, para cada una de las 3 series, por reconstitución con WFI a 35 mg/mL de liofilizado de DP N° H04-016.
• Para el segundo cribado (ensayos N° H04-185 a 190), además de la fase I de FDS previa (H04-016), se usó otra fase I de FDS recién fabricada con las formulaciones probadas, para cada una de las 3 series. Además, se usó una 3a referencia de fase I de FDS (N° LT-10006-DS): el FDS no se liofilizó, sino que solo se descongeló. Inesperadamente, la cinética de HMW pareció diferente entre las diversas referencias. Para comparación, se habían probado dos liofilizados de DP adicionales junto con el liofilizado de DP N° H04-016. La diferencia dentro del liofilizado de DP fue significativa después de 40 h a TA. Sin embargo, la referencia descongelada, N° LT-10006-DS, fue significativamente diferente de todos los liofilizados de DP, desde 16 h hasta TA. El liofilizado de DP presentó cinética de HMW más rápida que la referencia descongelada, N° LT-10006-DS, y así puede no ser usada para comparar las formulaciones fabricadas en este estudio (las formulaciones para este estudio se fabricaron a partir de FDS descongelado (véase la Sección con respecto al Proceso de fabricación) con la fase I/IIa de la formulación.
Usando el mismo lote y DP liofilizado recién preparado, no se observó diferencia significativa en la cinética de HMW entre el FDS descongelado y el liofilizado de DP. Así, la cinética de HMW observada en las formulaciones recién fabricadas para este estudio también se observaría en las mismas formulaciones después de la liofilización.
La conclusión extraída de los ensayos puede no ser generalizada a todo el liofilizado de DP y todo el FDS descongelado. La comparación de la cinética de HMW entre diferentes lotes puede depender de diversos parámetros y necesitará un estudio específico y separado.
Resultados y discusión
Todas las formulaciones fabricadas en los Ejemplos 7-8 contuvieron al menos 1,75 % (p/v) de sacarosa y próxima a 0,07 % (p/v) de PS80. Estas concentraciones son valores nominales y se basan en el factor de dilución aplicado a la disolución de partida de anticuerpo principal. Con respecto a la concentración de PS80, se hizo la suposición de que la adsorción de PS80 durante UF/DF era despreciable. Estas concentraciones de excipiente fueron las mismas que la fase I de formulación.
Ejemplo 7 - cribado de tampones
Se cribó el pH en este ejemplo desde 6,2 hasta 7,4, y dentro de este intervalo se habían probado todos los tampones inyectables: Succinato, histidina, citrato, fosfato y Tris.
A) Tipo de tampón y pH
En el primer cribado (ensayos N° H04-150 a 172), se probaron los tampones anteriores a una concentración de 10 mM, en combinación con varios excipientes que se detallarán adicionalmente en el Ejemplo 8 - Cribado de aditivos. Obsérvese que la concentración de tampón se fijó a 10 mM y que su impacto sobre la formación de HMW se observará en la sección con respecto a la concentración de tampón (Ejemplo 7).
DSC
Los resultados de DSC mostraron que todas las formulaciones eran comparables a la referencia (Td1= 65,5 °C), excepto las formulaciones de histidina, que fueron térmicamente ligeramente menos estables (Td1= 64,7 °C a 65,1 °C) (véase la Figura 26).
Inspección visual en el tiempo inicial
Todas las formulaciones fueron transparentes y comparables a la referencia, excepto las formulaciones a pH 6,2 y las formulaciones de histidina a pH 6,6.
A pH 6,2, se observó una disminución de la solubilidad para ambos tampones probados:
• Las formulaciones de histidina precipitaron a TA (véase la Figura 27)
• Las formulaciones de succinato fueron ligeramente opalescentes a TA y se puede observar la formación de un gel a 5 °C (véase la Figura 27), que era reversible cuando la disolución volvió a TA y se agitó suavemente. El succinato puede tener propiedades quelantes.
Las formulaciones de histidina a pH 6,6 fueron ligeramente más opalescentes a TA que la referencia.
Evolución de HMW por SEC
Como los resultados presentados aquí fueron de 3 series diferentes, la evolución de HMW puede no compararse directamente, sino solo con la referencia.
• Histidina pH 6,6 fue comparable a la referencia a TA y ligeramente mejor a 5 °C (+2,4 % para histidina sola y 3,2 % en 144 h para la referencia).
• Citrato pH 6,6 fue ligeramente mejor a TA que la referencia (+4,6 % para citrato solo y 5,2 % en 24 h para la referencia) y comparable a la referencia a 5 °C.
• Fosfato pH 6,6 fue ligeramente mejor a TA que la referencia (+8,2 % para fosfato solo y 9,0 % en 48 h para la referencia) y comparable a la referencia a 5 °C.
• Fosfato pH 7 fue comparable a la referencia a TA y 5 °C.
• Tris pH 7 fue ligeramente peor que la referencia a TA (+7,8 % para Tris solo y 7,0 % en 48 h para la referencia) y comparable a la referencia a 5 °C.
• Tris pH 7,4 fue comparable a la referencia a TA y 5 °C.
Véase la Figura 28.
Con respecto a la formación de HMW, a pH 6,6, fosfato y citrato fueron comparables, y a pH 7,0, el fosfato fue ligeramente más estabilizante que Tris. Los tampones anteriores a 10 mM pueden no estar directamente en comparación con la fase I/IIa de la formulación, ya que la referencia usada para este cribado fue un liofilizado fabricado a partir de otro lote (véase la sección anterior con respecto a Referencias para mediciones de SEC).
Conclusión
Con respecto al cribado de sistemas tampón a una concentración de 10 mM, se puede llegar a la conclusión de que:
• valores de pH de aproximadamente 6,2 (próximo al pI) disminuyeron la solubilidad del anticuerpo principal:
- Se observó una formación de gel con succinato a pH 6,2
Se observó una precipitación con histidina a pH 6,2
• Además, la histidina se debe evitar a pH 6,6 ya que la disolución fue opalescente y ligeramente menos térmicamente estable
• No existe una clara tendencia del efecto del pH dentro del intervalo 6,6 a 7,4 sobre la formación de HMW para los tampones probados: Histidina, citrato, fosfato y Tris
• Efecto muy débil del tampón con respecto a la formación de HMW, aunque pareció que el citrato y fosfato eran los mejores tampones a 10 mM
B) Ajuste de pH en la formulación de fase I/IIA
Para determinar en la misma serie la influencia del pH sobre la formación de HMW, el pH se había cribado en el intervalo 6,7 a 7,2 en la formulación de fase I (ensayos N° H04-187).
DSC
Los resultados de DSC mostraron que todas las formulaciones fueron comparables a la referencia (pH 7,0) (véase la Figura 29).
Evolución de HMW por SEC
Hubo una ligera tendencia a disminuir la formación de HMW cuando aumentó el pH desde 6,7 hasta 7,2 (véase la Figura 30), sin embargo, esto fue significativo solo después de 24 h a TA (+4,1 % para pH 6,7 y 3,4 % para pH 7,2). Conclusión
Con un tampón fosfato 2,2 mM/Tris 1,3 mM (fase I de formulación), hubo un ligero efecto de pH en el intervalo 6,7 a 7,2 después de 24 h a TA. Sin embargo, este efecto fue débil, puesto que no fue significativo durante las primeras 16 h. Esto confirma el débil efecto del pH sobre la formación de HMW en este intervalo de pH.
C) Concentración de tampón
Se probaron citrato y fosfato a concentraciones más pequeñas que 10 mM: 0, 1,75, y 5,25 mM, para investigar la influencia de la concentración de tampón en la formación de HMW (ensayos N° H04-185). Se estableció el pH a un punto intermedio en el intervalo probado: pH= 6,8. Todas las formulaciones contuvieron glicina a 72 mM para ajustar la osmolalidad y, como se ha dicho al principio de la sección con respecto a resultados y discusión, 1,75 % de sacarosa y aproximadamente 0,07 % de PS80.
DSC
Los resultados de DSC mostraron que todas las formulaciones fueron comparables a la referencia (fase I de formulación) (véase la Figura 31). Obsérvese que la glicina sin tampón (185A2) fue ligeramente menos estable que las otras formulaciones probadas (aproximadamente 1 °C de diferencia en Td1).
Evolución de HMW por SEC
Para ambos tampones probados, hubo una ligera tendencia a disminuir la formación de HMW cuando se disminuyeron las concentraciones de tampón, los mejores resultados se obtuvieron sin tampón y 1,75 mM en tampón (para, por ejemplo, 7,8 % para citrato 10 mM y 7,0 % para sin tampón en 48 h a TA) (véase la Figura 32). Citrato a 1,75 mM y sin tampón fueron comparables a la referencia (para, por ejemplo, 7,1 % para citrato y 7,0 % para sin tampón en 48 h a TA mientras que 6,8 % para la referencia).
Conclusión
La disminución de la concentración de tampón tuvo un efecto ligeramente estabilizante sobre la cinética de formación de HMW. Este efecto estuvo probablemente relacionado con la fuerza iónica. Sin tampón y un tampón citrato 1,75 mM fueron los mejores candidatos en términos de la formación de HMW, seguido estrechamente por fosfato 1,75 mM. Los tampones probados con glicina 72 mM fueron comparables a la fase I/IIa de formulación.
Ejemplo 8 - cribado de aditivos
Se hizo el cribado de los aditivos glicina, prolina, histidina y Tris en combinación con el cribado de tampones (primer cribado: ensayos N° H04-150 a 172) para determinar las posibles sinergias entre los excipientes. Se hizo el cribado de los aditivos cloruro sódico, benzoato de sodio, glicina y sacarosa (segundo cribado: ensayos N° H04-185 a 190) en fosfato o citrato, los tampones mejor seleccionados del primer cribado (Ejemplo 7).
Las formulaciones contuvieron 1,75 % de sacarosa y aproximadamente 0,07 % de PS80.
A) Cloruro sódico y benzoato de sodio
Se probaron cloruro sódico y benzoato de sodio para evaluar los efectos de la fuerza iónica y las interacciones hidrófobas, respectivamente, sobre la formación de HMW. Estos aditivos se probaron en fosfato 1,75 mM pH 6,8 a una concentración que no superó la osmolalidad de la fase I de formulación (165 mOsm/kg en FDS).
DSC
Los resultados de DSC mostraron que la formulación de NaCl era comparable a la referencia (Td1= 65,7 °C para NaCl y 65,6 °C para la referencia), mientras que la formulación de benzoato de sodio fue térmicamente ligeramente menos estable (Td1= 65,02C).
Evolución de HMW por SEC
Para ambos aditivos probados, hubo un claro efecto negativo sobre la formación de HMW en comparación con la referencia (para, por ejemplo, 5,2 % para NaCl a 38,5 mM, 5,2 % para benzoato de sodio a 37,8 mM y 3,2 % para la referencia en 24 h a TA). Siendo la evolución similar para ambos excipientes, solo se muestran aquí los resultados de NaCl (véase la Figura 33).
Conclusión
Como se observa para la concentración de tampón, el aumentar la fuerza iónica con NaCl o benzoato de sodio tuvo un claro efecto negativo sobre la cinética de la formación de HMW. Además, no se observó el efecto de interacciones hidrófobas sobre la cinética de HMW, debido a la adición de benzoato de sodio.
B) Glicina, prolina, histidina y Tris
Se probaron estos aditivos (glicina, prolina, histidina y Tris) a una concentración de 10 mM (primer cribado: ensayos N° H04-150 a 172).
DSC
Los resultados de DSC mostraron que todas las formulaciones con los aditivos anteriores fueron comparables a la formulación sin (tampón solo).
Evolución de HMW por SEC
Las diferencias entre las formulaciones fueron débiles, aunque se pudieron observar tendencias después de 48 h a TA y 6 días a 5 °C:
• Tampón histidina:
- A TA: 0 (sin aditivos) = Glicina > Prolina > Tris
- A 5 °C: 0 > Glicina = Prolina > Tris
• Tampón citrato:
- A TA: Glicina > Prolina = Histidina = Tris = (Tris Glicina) > 0
- A 5 °C: Glicina > Prolina = Histidina = Tris = (Tris Glicina) = 0
• Tampón fosfato:
- A TA: Glicina = Prolina = 0 > Histidina = Tris
- A 5 °C: Glicina > Prolina = 0 = Histidina = Tris
• Tampón Tris:
- A TA: Glicina > 0 = Histidina
- A 5 °C: Glicina = 0 = Histidina
Conclusión
Con respecto a la formación de HMW, los efectos de estos aditivos fueron débiles, aunque pudieron observarse tendencias:
• Glicina a 10 mM tuvo un ligero efecto positivo
• Histidina y prolina a 10 mM parecieron no tener efecto
• Tris a 10 mM no tuvo efecto estabilizante e incluso pudo tener un ligero efecto desestabilizante
C) Sacarosa y glicina
En el segundo cribado (ensayos N° H04-185), se probaron una cantidad adicional de sacarosa de 2,4 % (además del ya 1,75 % de sacarosa contenido en todas las formulaciones, que dieron un total de 4,15 % (p/v) de sacarosa) y glicina a una concentración de 72 mM en los mejores tampones seleccionados (véase la sección con respecto a Cribado de tampones). Se maximizaron estas concentraciones con el fin de no superar la osmolalidad de la fase I de formulación (165 mOsm/kg en FDS).
DSC
Los resultados de DSC mostraron que todas las formulaciones de sacarosa 2,4 % y glicina 72 mM fueron comparables a la referencia (para, por ejemplo, en el caso de sacarosa, Td1= 65,7 °C para fosfato 1,75 mM y 65,6 °C para la referencia).
Evolución de HMW por SEC
Se confirmó el ligero impacto positivo de glicina cuando se comparó con formulaciones que contenían solo sacarosa para citrato 1,75 mM y sin tampón (véase la Figura 34). Sin embargo, este impacto positivo solo fue significativo después de 48 h a TA.
Conclusión
Con respecto a la formación de HMW, en la escala de tiempo de interés (< 24 h a TA), las formulaciones de sacarosa y glicina probadas en los mejores candidatos a tampón fueron comparables con la fase I de la formulación.
Conclusiones para los Ejemplos 7-8
Para este estudio, se fabricaron aproximadamente 50 formulaciones y se compararon juntas con la actual formulación de fase I/IIa. El cribado de pH varió desde 6,2 hasta 7,4, que implica a todos los tampones inyectables dentro de este intervalo de pH, solos o en combinación con varios excipientes (todos GRAS) para evaluar las posibles sinergias entre excipientes.
Aquí están las principales conclusiones:
• Valores de pH de aproximadamente 6,2 disminuyen la solubilidad del anticuerpo principal: se observaron una formación de gel y una precipitación con succinato e histidina, respectivamente;
• Además, se debe evitar la histidina a pH 6,6, ya que la disolución era opalescente y ligeramente menos térmicamente estable;
• En el intervalo de pH entre 6,6 y 7,4, no hubo un claro efecto del pH sobre la cinética de formación de HMW;
• El aumento de la fuerza iónica tuvo un efecto desestabilizante sobre la cinética de formación de HMW;
• Fosfato y citrato fueron los mejores tampones probados, siempre que estuvieran a baja concentración tal como 1,75 mM;

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación de anticuerpo estable que comprende:
- 100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13, que comprende una cadena ligera de la fórmula N-VL1 -conector-VL2-CL y una cadena pesada de la fórmula N-VH1-conector-VH2-CH1-CH2-CH3, en donde VL1 y VH1 forman un dominio de unión al antígeno de IL-13 y VL2 y VH2 forman un dominio de unión al antígeno de IL-4, en donde VL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; VH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; VL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y VH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 5, en donde el conector consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6
en donde CL es el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo;
en donde CH2-CH3 corresponde al dominio Fc del anticuerpo; y
- 10 mM de un sistema tampón, en donde el sistema tampón comprende una concentración de tampón Tris de 3,7 mM y una concentración de tampón fosfato de 6,3 mM;
- 0,2 % (p/v) de polisorbato 80;
- 5 % (p/v) de sacarosa; y
- 3 % (p/v) de manitol;
en donde el pH de la formulación es pH 7;
en donde el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico IgG4 humanizado.
2. La formulación de la reivindicación 1, en donde la formulación es una formulación liofilizada.
3. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación presenta buena estabilidad con respecto a partículas visibles, partículas sub-visibles, proteínas de bajo peso molecular y proteínas de alto peso molecular.
4. La formulación de la reivindicación 1 que comprende:
100 mg/mL de un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4, y una región variable de la cadena ligera que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 3.
5. Un kit que comprende un recipiente que comprende la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones previas e instrucciones para la administración y uso de la formulación.
6. Una formulación para su uso para tratar una enfermedad alérgica, cáncer, asma, una enfermedad asociada a la producción anormal de IL-4 y/o IL-13, o una enfermedad asociada a una elevada respuesta mediada por TH-2, en donde la formulación es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4.
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