ES2788515T3 - Formulaciones liofilizadas y acuosas de anticuerpos anti-CD40 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica acuosa, en la que la composición tiene un pH de 6,0 y comprende (i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, (ii) 270 mM de sacarosa como estabilizante, (iii) 30 mM de histidina como agente tamponante y (iv) un 0,06 % de polisorbato 20 como tensioactivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones liofilizadas y acuosas de anticuerpos anti-CD40

Campo técnico

La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica de un anticuerpo contra CD40, un proceso para la preparación de la misma y usos de la formulación.

Antecedentes

A pesar de la disponibilidad de varios tratamientos inmunosupresores para enfermedades autoinmunitarias, sigue habiendo una gran necesidad insatisfecha de fármacos más eficaces y más seguros en una gran fracción de la población de pacientes. Por ejemplo, a pesar de la eficacia presentada de los tratamientos de reducción/inhibición de linfocitos B como Rituximab y Belimumab en artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado, síndrome de Sjogren y esclerosis múltiple, estos tratamientos son solamente eficaces en una parte de los individuos enfermos, y con Rituximab, con un riesgo concomitante de leucoencefalopatía multifocal progresiva. Además, otros múltiples tipos celulares leucocíticos a menudo están implicados en la patología de estas enfermedades autoinmunitarias tales como los macrófagos, las células dendríticas y los linfocitos T, por lo tanto, la intervención terapéutica dirigida a tipos celulares adicionales o rutas inmunológicas clave que inhibieran su función podrían proporcionar beneficio. Dadas las múltiples funciones inmunológicamente relevantes de CD40-CD154 en la activación y función de estos tipos celulares, es probable que un anticuerpo anti-CD40 confiriera beneficio terapéutico a pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias presentadas anteriormente más allá del proporcionado actualmente por los tratamientos actuales. Además, la función central de las interacciones de CD40-CD154 en trastornos inflamatorios intestinales tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, y las vinculaciones mecánicas de la ruta de CD40 con la patología en trastornos más infrecuentes tales como vasculitis autoinmunitaria, pénfigo vulgar y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) también resalta el potencial de los anticuerpos anti-CD40 en estas indicaciones.

Los inmunosupresores actualmente disponibles usados después del trasplante de un órgano sólido proporcionan excelente eficacia a corto plazo. Se observan rechazos agudos dentro del periodo de novo en un 5 %-20 % de los receptores (dependiendo del órgano, población de pacientes y pauta) y la proporción de injertos perdidos respecto a los rechazos agudos dentro del periodo de novo está por debajo de un 5 % en cualquier situación. Actualmente, la necesidad insatisfecha clave es la tolerabilidad de la inmunosupresión con el paciente y la supervivencia del injerto a largo plazo. Después de un trasplante renal, un 33 % de los pacientes muere y/o pierde su injerto en 5 años; el promedio de edad de muerte del receptor de trasplante es de 58 años. Los inhibidores de calcineurina (CNI) siguen siendo el componente principal del tratamiento inmunosupresor para la inmensa mayoría de los pacientes de trasplante. Aunque la nefrotoxicidad y la morbilidad cardiovascular asociadas con CNI es uno de los factores de nefropatía crónica de aloinjertos, así como de muerte de los pacientes con un injerto funcional, la inmunosupresión primaria alternativa no ha podido remplazar los CNI. Globalmente, todavía hay margen de mejora en la inmunosupresión de trasplantes a largo plazo. El daño inmunológico mediado por linfocitos B de riñones trasplantados puede contribuir a malos resultados a largo plazo y la comunidad médica cada vez reconoce más la necesidad de nuevos agentes para abordar el rechazo de linfocitos B.

Los anticuerpos contra CD40 son conocidos en la técnica. C h irl2.12 es un anticuerpo no agonista completamente humanizado anti-CD40 (IgG1, kappa) que bloquea la activación de leucocitos mediada por CD154 (también conocido como ligando de CD40; CD40L) y puede mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de los linfomas humanos de leucocitos y linfocitos B in vitro (véase el documento WO 2006/073443). El documento WO 2005/044306 describe anticuerpos antagonistas anti-CD40, incluyendo Chir12.12 para su uso en particular en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios e inflamatorios. Además, Chir12.12 es eficaz en retardar el rechazo de aloinjerto de riñón cuando se dosifica como monoterapia en Macaca fascicularis (macacos cangrejeros) [Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]. Sin embargo, Chir12.12 también puede mediar la reducción de linfocitos B periféricos en primates no humanos (NHP).

Se prevé que los mAb anti-CD40 con actividad ADCC inactivada tendrán un perfil de seguridad mejorado con respecto a los anticuerpos anti-CD40 precursores y, en particular, pueden ser más adecuados para indicaciones no oncológicas, tales como enfermedades autoinmunitarias y uso en un entorno de trasplante. El solicitante ha desarrollado tres anticuerpos anti-CD40 inactivados basados en el anticuerpo C h irl2.12. Estos anticuerpos, a partir de ahora en este documento denominados mAb1, mAb2 y mAb3 se caracterizan por determinadas mutaciones aminoacídicas en la región Fc que inactivan la actividad ADCC.

El mAb1 comprende una mutación N297A en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo. El anticuerpo comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5 respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. El mAb1 comprende un dominio V^h con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un dominio V^l con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El mAb1 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de la SEQ ID NO: 10.

El mAb2 comprende una mutación D265A en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo. El anticuerpo comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5 respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. El mAb2 comprende un dominio V^h con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un dominio V^l con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El mAb2 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de la SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de la SEQ ID NO: 14.

El mAb3 comprende una mutación L234A, L235A (LALA) en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo. El anticuerpo comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5 respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. El mAb3 comprende un dominio VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un dominio VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El mAb3 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de la SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de la SEQ ID NO: 18.

Las formulaciones con alta concentración de anticuerpo pueden tener semividas cortas y los anticuerpos formulados pueden perder actividad biológica como resultado de inestabilidades químicas y físicas durante el almacenamiento. Existe constancia de que, entre ellas, la agregación, la desamidación y la oxidación son las causas más habituales de la degradación de los anticuerpos. En particular, la agregación puede dar lugar potencialmente a una mayor respuesta inmunitaria en los pacientes, que da lugar a problemas de seguridad. Por tanto, debe minimizarse o evitarse. Una formulación liofilizada de acuerdo con métodos de preparación convencionales se describe en el documento WO 2009/062054 A1.

Un objeto de la invención es proporcionar formulaciones adicionales y mejoradas de anticuerpos anti-CD40 y, en particular, formulaciones con alta concentración de anticuerpos anti-CD40 y bajos niveles de agregación de anticuerpos.

Divulgación de la invención

Los anticuerpos terapéuticos se formulan normalmente ya sea en forma acuosa lista para la administración parenteral o como liofilizados para su reconstitución con un diluyente adecuado antes de su administración. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-CD40 puede formularse como una composición acuosa, por ejemplo, en jeringas prellenadas. La formulación adecuada puede proporcionar una composición farmacéutica acuosa con una alta concentración del principio activo de anticuerpo y un bajo nivel de agregación de los anticuerpos para su suministro a un paciente. Altas concentraciones de anticuerpo son útiles ya que reducen la cantidad de material que debe suministrarse a un paciente. Volúmenes de dosificación reducidos minimizan el tiempo que se tarda en suministrar una dosis fija al paciente. Las composiciones acuosas de la invención con alta concentración de anticuerpos anti-CD40 son particularmente adecuadas para administración subcutánea.

Por tanto, la invención proporciona una composición farmacéutica acuosa, adecuada para administración parenteral en un sujeto, por ejemplo, para administración subcutánea, que comprende un anticuerpo anti-CD40.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica acuosa que comprende: un anticuerpo monoclonal anti-CD40 como se describe anteriormente, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, especialmente mAb1; un estabilizante; un agente tamponante; y un tensioactivo. La composición preferiblemente incluye también un aminoácido libre.

La divulgación también proporciona un liofilizado que comprende: un anticuerpo monoclonal anti-CD40 como se describe anteriormente, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, especialmente mAb1; un glúcido; un agente tamponante; y un tensioactivo. El liofilizado preferiblemente incluye también un aminoácido libre.

La divulgación también proporciona un liofilizado que comprende un anticuerpo monoclonal anti-CD40 como se describe anteriormente, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, especialmente mAb1; en el que el liofilizado puede reconstituirse con un reconstituyente acuoso para proporcionar una composición acuosa en que el anticuerpo tiene una concentración de al menos 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml, después de su reconstitución en una solución acuosa.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica acuosa que comprende alta concentración de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 como se describe anteriormente, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, especialmente mAb1; en la que se agrega o degrada menos de un 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % del anticuerpo anti-CD40.

La divulgación también proporciona un proceso para preparar un liofilizado, que comprende las etapas de: (i) preparar una solución acuosa que comprende un anticuerpo monoclonal anti-CD40, un glúcido, un agente tamponante, un tensioactivo y opcionalmente un aminoácido libre; y (ii) liofilizar la solución acuosa.

La divulgación también proporciona un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende una etapa de mezclar un liofilizado con un reconstituyente acuoso, en el que el liofilizado comprende un anticuerpo monoclonal anti-CD40, un glúcido, un agente tamponante, un tensioactivo y opcionalmente un aminoácido libre.

Más específicamente, la divulgación proporciona una formulación liofilizada preparada por liofilización de una formulación acuosa que tiene un pH de 5,0-7,0 y que comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20-150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) un estabilizante,

(iii) un agente tamponante,

(iv) un tensioactivo y, opcionalmente,

(v) un aminoácido.

En una realización, dicha formulación se prepara a partir de una formulación acuosa que tiene un pH de 5,0-7,0 y que comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20-150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) sacarosa o trehalosa como estabilizante,

(iii) histidina como agente tamponante,

(iv) polisorbato 20 como tensioactivo y, opcionalmente,

(v) un aminoácido seleccionado de arginina, metionina y glicina.

En una realización, dicha formulación liofilizada se prepara a partir de una formulación acuosa que tiene un pH de 5,0-7,0 y que comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20-150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 3-300 mM de sacarosa o trehalosa como estabilizante,

(iii) 1-60 mM de histidina como agente tamponante,

(iv) hasta un 0,2 % de polisorbato 20 como tensioactivo y, opcionalmente,

(v) 2-80 mM de arginina, metionina o glicina.

En una realización, dicha formulación liofilizada se prepara a partir de una formulación acuosa que tiene un pH de 6,0 y que comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 90 mM de sacarosa como estabilizante,

(iii) 10 mM de histidina como agente tamponante,

(iv) polisorbato 20 al 0,02% como surfactante.

En una realización, dicha formulación liofilizada se prepara a partir de una formulación acuosa que tiene un pH de 6,0 y que comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 90 mM de sacarosa como estabilizante,

(iii) 10 mM de histidina como agente tamponante,

(iv) un 0,02 % de polisorbato 20 como tensioactivo y

(v) 17 mM de arginina.

En una realización, dicha formulación liofilizada se prepara a partir de una formulación acuosa que tiene un pH de 6,0 y que comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 270 mM de sacarosa como estabilizante,

(iii) 30 mM de histidina como agente tamponante y

(iv) un 0,06 % de polisorbato 20 como tensioactivo.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica acuosa obtenida por reconstitución de una formulación liofilizada como se describe anteriormente, en la que el factor de reconstitución es entre 1:0,5 y 1:6.

En una realización el factor de reconstitución es de 1:3.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica acuosa que tiene un pH de 5,0 a 7,0, que comprende (i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de al menos 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la CDR1, CDR2 y c Dr 3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) un estabilizante,

(iii) un agente tamponante,

(iv) un tensioactivo y, opcionalmente,

(v) un aminoácido.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa que tiene un pH de 5,0 a 7,0 comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de al menos 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la Cd R1, CDR2 y c Dr 3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) sacarosa o trehalosa como estabilizante,

(iii) histidina como agente tamponante,

(iv) polisorbato 20 como tensioactivo y, opcionalmente,

(v) un aminoácido seleccionado de arginina, metionina o glicina.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa que tiene un pH de 5,0 a 7,0 comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de al menos 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la Cd R1, CDR2 y c Dr 3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 200-300 mM de sacarosa como estabilizante,

(iii) 25-35 mM de histidina como agente tamponante,

(iv) hasta un 0,2 % de polisorbato 20 como tensioactivo y, opcionalmente,

(v) 10-80 mM de arginina, metionina o glicina.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa tiene un pH de 6,0 y comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de al menos 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la Cd R1, CDR2 y c Dr 3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 270 mM de sacarosa como estabilizante,

(iii) 30 mM de histidina como agente tamponante y

(iv) un 0,06 % de polisorbato 20 como tensioactivo.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa tiene un pH de 6,0 y comprende

(i) un anticuerpo anti-CD40 en el que el anticuerpo tiene una concentración de al menos 50 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-CD40 incluye la Cd R1, CDR2 y c Dr 3 de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8,

(ii) 270 mM de sacarosa como estabilizante,

(iii) 30 mM de histidina como agente tamponante,

(iv) un 0,06% de polisorbato 20 como tensioactivo y

(v) 51 mM de arginina.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación tiene una concentración de anticuerpo anti-CD40 de 150 mg/ml.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende un anticuerpo anti-CD40 que comprende una región de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 y una región de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende el anticuerpo anti-CD40 Chir12.12 que tiene una mutación N297A.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende un anticuerpo anti-CD40 que comprende una región de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 y una región de cadena ligera de la SEQ ID NO: 14.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende el anticuerpo anti-CD40 Chir12.12 que tiene una mutación D265A.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende un anticuerpo anti-CD40 que comprende una región de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una región de cadena ligera de la SEQ ID NO: 18.

En una realización, la formulación liofilizada o la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende el anticuerpo anti-CD40 Chir12.12 que tiene una mutación L234A L235A.

La divulgación también comprende un dispositivo de suministro que incluye la composición farmacéutica acuosa de la divulgación.

La divulgación también comprende una jeringa prellenada que incluye la composición farmacéutica acuosa de la divulgación.

La divulgación también comprende un método para suministrar un anticuerpo anti-CD40 a un mamífero, que comprende una etapa de administración al paciente de una composición farmacéutica acuosa de la divulgación.

La divulgación también comprende una formulación liofilizada o una composición farmacéutica acuosa de acuerdo con la divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que está mediado por CD40.

La divulgación también comprende una formulación liofilizada o composición farmacéutica acuosa de acuerdo con la divulgación para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

La divulgación también proporciona una formulación liofilizada o composición farmacéutica acuosa de acuerdo con la divulgación para esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes; enfermedad de injerto contra hospedador, pénfigo vulgar.

Composiciones farmacéuticas acuosas con alta concentración de anticuerpos anti-CD40

La invención depende, al menos parcialmente, de las propiedades de formulación de anticuerpos tales como m A b l, que retienen estabilidad excelente y propiedades bioactivas cuando se formulan en una alta concentración como una composición líquida (acuosa).

Como se usa en este documento, una composición farmacéutica "acuosa" es una composición adecuada para uso farmacéutico, en la que el vehículo acuoso es agua destilada. Una composición adecuada para uso farmacéutico puede ser estéril, homogénea y/o isotónica. Las composiciones farmacéuticas acuosas se pueden preparar directamente en forma acuosa, por ejemplo, en una jeringa prellenada lista para su uso (las "formulaciones líquidas") o como un liofilizado que se tiene que reconstituir poco antes de su uso. Como se usa en este documento, la expresión "composición farmacéutica acuosa" se refiere a la formulación líquida o formulación liofilizada reconstituida. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para administración parenteral a un sujeto humano. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para administración subcutánea.

Como se usa en este documento, la expresión "administración parenteral" significa un modo de administración distinto de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e intraesternal.

El uso de anticuerpos como principio activo de fármacos está muy extendido en la actualidad, incluyendo los productos HERCEPTIN™ (trastuzumab), RITUXAN™ (rituximab), SYNAGIS™ (palivizumab), etc. Las técnicas para la purificación de anticuerpos terapéuticos hasta calidad farmacéutica son muy conocidas en la técnica.

La composición habitualmente será apirógena, por ejemplo, contendrá < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis y preferiblemente < 0,1 UE por dosis. La composición preferiblemente no contiene gluten.

En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas acuosas de la divulgación muestran niveles de bajos a indetectables de agregación o degradación del anticuerpo, con muy poca a ninguna pérdida de las actividades biológicas durante la fabricación, preparación, transporte y largos periodos de almacenamiento, siendo la concentración del anticuerpo anti-CD40 de al menos aproximadamente 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica acuosa con alta concentración de anticuerpos anti-CD40.

Existe constancia en la técnica de que dichas composiciones farmacéuticas acuosas de alta concentración se pueden diluir antes de su inyección, por ejemplo, si se requieren concentraciones del anticuerpo más bajas para intervenciones terapéuticas específicas o cuando se traten pacientes de peso corporal más bajo, incluyendo los niños. Las concentraciones adecuadas pueden ser 25 mg/ml o 10 mg/ml. Como alternativa, la formulación original se puede producir con dicha concentración más baja.

El término "anticuerpo", como se menciona en este documento, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, "parte de unión al antígeno") o cadenas individuales del mismo. Un "anticuerpo" de origen natural es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como V^h) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres o cuatro dominios, dependiendo del isotipo, C^h1, C^h2, C^h3 y C^h4. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en este documento como V^l) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio, C^l. Las regiones V^h y V^l se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada V^h y V^l comprende tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

La expresión "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de antígeno"), como se usa en este documento, se refiere a la longitud completa o uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una parte de CD40). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo pueden realizarla fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^l y C^h1; un fragmento F(ab)², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios V^h y C^h1; un fragmento Fv que consiste en los dominios V^l y V^h de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^l y V^h estén codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, a través de un conector sintético que les permite prepararlos como una sola cadena proteínica en la que las regiones V^l y V^h se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Se pretende que la expresión "región de unión al antígeno" de un anticuerpo también englobe dichos anticuerpos monocatenarios. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se seleccionan en función de su utilidad de la misma manera que para los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que no contiene sustancialmente otros anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigénicas, por ejemplo, un anticuerpo aislado que se una específicamente a CD40 humano no contiene sustancialmente anticuerpos que se unan específicamente a antígenos distintos de CD40. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD40 puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas CD40 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede no contener sustancialmente otros materiales celulares y/o productos químicos.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usan en este documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal tiene una sola especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en este documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones flanqueantes como las CDR derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana o un anticuerpo que contiene secuencias flanqueantes consenso derivadas del análisis de secuencias flanqueantes humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86).

Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, las CDR, se pueden definir usando esquemas de numeración muy conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia, una combinación de Kabat y Chothia (AbM), etc. (véase, por ejemplo, Secuencias de proteínas de interés inmunológico, Departamento Estadounidense de Sanidad y Servicios Humanos (1991), eds. Kabat et al.; Al Lazikani et al. (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948). A lo largo de esta memoria descriptiva, la región determinante de la complementariedad ("CDR") se define de acuerdo con la definición de Kabat con la excepción de CDRH1, que es el tramo de aminoácidos definido por una combinación de las dos definiciones de Kabat y Chothia para esta CDR.

Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, no se pretende que la expresión "anticuerpo humano", como se usa en este documento, incluya anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias flanqueantes humanas.

La expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de unión, que tienen regiones variables en las que tanto las regiones flanqueantes como CDR derivan de secuencias humanas.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en este documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora transformada para que exprese el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una colección de anticuerpos humanos combinatoria recombinante y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de la totalidad o una parte de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias para otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones flanqueantes y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^h y V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de las secuencias de V^h y V^l de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, puede que no existan de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en este documento, el término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgA, IgD, IgE e IgG tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es proporcionada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en este documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

Como se usa en este documento, un anticuerpo que "se une específicamente al polipéptido CD40" o un "anticuerpo anti-CD40" se refiere a un anticuerpo que se une al polipéptido CD40 humano de la SEQ ID NO: 21 con una K^d de 100 nM o inferior, 10 nM o inferior, 1 nM o inferior. Un anticuerpo que "reacciona de forma cruzada con un antígeno distinto de CD40" se refiere a un anticuerpo que se une a ese antígeno con una K^d de 0,5 x 10-8 M o inferior, 5 x 10-9 M o inferior, o 2 x 10-9 M o inferior. Se pretende que un anticuerpo que "no reacciona de forma cruzada con un antígeno particular" se refiera a un anticuerpo que se une a ese antígeno con una K^d de 1,5 x 10-8 M o superior, o una K^d de 5-10 x 10-8 M o 1 x 10-7 M o superior. En determinadas realizaciones, dichos anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con el antígeno muestran una unión esencialmente indetectable frente a estas proteínas en ensayos de unión convencionales.

En una realización, una alta concentración de un anticuerpo anti-CD40 en la composición farmacéutica acuosa de la divulgación es al menos 50 mg/ml. En una realización, una alta concentración es al menos 100 mg/ml. En una realización, una alta concentración es al menos 150 mg/ml. En una realización, una alta concentración es al menos 200 mg/ml. En una realización, una alta concentración es al menos 250 mg/ml. En una realización, una alta concentración es al menos 300 mg/ml.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende entre 50 mg/ml y 300 mg/ml de un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende entre 75 mg/ml y 250 mg/ml de un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende entre 100 mg/ml y 250 mg/ml de un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende entre 100 mg/ml y 200 mg/ml de un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende 150 mg/ml de un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la divulgación comprende aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 110 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 140 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 160 mg/ml, aproximadamente 170 mg/ml, aproximadamente 180 mg/ml, aproximadamente 190 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 210 mg/ml, aproximadamente 220 mg/ml, aproximadamente 230 mg/ml, aproximadamente 240 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml de un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1.

Además, las composiciones farmacéuticas acuosas son estables de modo que, incluso después de almacenamiento durante 4 semanas a 2-8 °C, menos de un 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,05 % o 0,01 % del anticuerpo anti-CD40 total se agrega según se mide por SEC-HPLC.

Las composiciones farmacéuticas acuosas pueden incluir, además del anticuerpo anti-CD40, componentes adicionales tales como uno o más de los siguientes: (i) un estabilizante; (ii) un agente tamponante; (iii) un tensioactivo; y (iv) un aminoácido libre. La inclusión de cada uno de dichos componentes adicionales puede proporcionar composiciones con baja agregación del anticuerpo anti-CD40.

Los estabilizantes adecuados para su uso con la divulgación pueden actuar, por ejemplo, como agentes potenciadores de la viscosidad, agentes espesantes, agentes solubilizantes y/o similares. El estabilizante puede ser iónico o no iónico (por ejemplo, glúcidos). Como glúcidos se incluyen, aunque sin limitación, monosacáridos, por ejemplo, fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, por ejemplo, lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, por ejemplo, rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) y similares. Por ejemplo, el glúcido puede ser sacarosa, trehalosa, rafinosa, maltosa, sorbitol o manitol. El glúcido puede ser un alditol o un aminoglúcido. La sacarosa es particularmente útil. Como estabilizante iónico, se incluyen sales tales como NaCl o componentes aminoacídicos tales como arginina-HCl.

Los agentes tamponantes adecuados para su uso con la divulgación incluyen, aunque sin limitación, sales de ácidos orgánicos tales como sales del ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido ftálico; Tris, clorhidrato de tometamina, o tampón de fosfato. Además, también se pueden usar componentes aminoacídicos como agente tamponante. Dicho componente aminoacídico incluye, aunque sin limitación, glicina e histidina. Un tampón de histidina es particularmente útil.

Las composiciones farmacéuticas acuosas incluyen dicho agente tamponante o agente regulador del pH para proporcionar un control del pH mejorado. En una realización, una composición farmacéutica acuosa de la divulgación tiene un pH entre 5,0 y 8,0, entre 5,5 y 7,5, entre 5,0 y 7,0, entre 6,0 y 8,0, o entre 6,0 y 7,0. En una realización específica, una composición farmacéutica acuosa de la divulgación tiene un pH de aproximadamente 6,0.

Como se usa en este documento, el término "tensioactivo" en este documento se refiere a sustancias orgánicas que tienen estructuras anfipáticas; es decir, están compuestas de grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena hidrocarbonada liposoluble y un grupo iónico hidrosoluble. Los tensioactivos se pueden clasificar, dependiendo de la carga del resto tensioactivo, en agentes aniónicos, catiónicos y dispersantes para diversas composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos.

Los tensioactivos adecuados para su uso con la divulgación incluyen, aunque sin limitación, tensioactivos no iónicos, tensioactivos iónicos y tensioactivos zwiteriónicos. Los tensioactivos típicos para su uso con la divulgación incluyen, aunque sin limitación, ésteres de ácido graso de sorbitán (por ejemplo, monocaprilato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán), trioleato de sorbitán, ésteres de ácido graso de glicerina (por ejemplo, monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina, monoestearato de glicerina), ésteres de ácido graso de poliglicerina (por ejemplo, monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo, monolinoleato de decaglicerilo), ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán (por ejemplo, monolaurato de polioxietilen sorbitán, monooleato de polioxietilen sorbitán, monoestearato de polioxietilen sorbitán, monopalmitato de polioxietilen sorbitán, trioleato de polioxietilen sorbitán, triestearato de polioxietilen sorbitán), ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitol (por ejemplo, tetraestearato de polioxietilen sorbitol, tetraoleato de polioxietilen sorbitol), ésteres de ácido graso de polioxietilen glicerina (por ejemplo, monoestearato de polioxietilen glicerilo), ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, diestearato de polietilenglicol), éteres alquílicos de polioxietileno (por ejemplo, éter laurílico de polioxietileno), éteres alquílicos de polioxietilen polioxipropileno (por ejemplo, polioxietilen polioxipropilenglicol, éter propílico de polioxietilen polioxipropileno, éster cetílico de polioxietilen polioxipropileno), éteres alquilfenílicos de polioxietileno (por ejemplo, éter nonilfenílico de polioxietileno), aceites de ricino hidrogenados polioxietilenados (por ejemplo, aceite de ricino polioxietilenado, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado), derivados de cera de abejas polioxietilenados (por ejemplo, cera de abejas de polioxietilen sorbitol), derivados de lanolina polioxietilenados (por ejemplo, lanolina polioxietilenada), y amidas de ácido graso polioxietilenadas (por ejemplo, amida del ácido polioxietilen esteárico); sulfatos de alquilo C¹⁰-C¹⁸ (por ejemplo, cetil sulfato de sodio, lauril sulfato de sodio, oleil sulfato de sodio), sulfato de éter polioxietilen alquílico C¹⁰-C¹⁸ con un promedio de 2 a 4 moles de unidades de óxido de etileno añadidas (por ejemplo, lauril sulfato de sodio polioxietilenado), y sales de éster de sulfosuccinato de alquilo C¹-C¹⁸ (por ejemplo, éster de lauril sulfosuccinato de sodio); y tensioactivos naturales tales como lecitina, glicerofosfolípido, esfingofosfolípidos (por ejemplo, esfingomielina), y ésteres de sacarosa de ácidos grasos C¹²-C¹⁸. Una composición puede incluir uno o más de estos tensioactivos. Los tensioactivos preferidos son ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, por ejemplo, polisorbato 20, 40, 60 u 80. El polisorbato 80 (Tween 80) es particularmente útil.

Los aminoácidos libres adecuados para su uso con la divulgación incluyen, aunque sin limitación, arginina, lisina, histidina, metionina, ornitina, isoleucina, leucina, alanina, glicina, ácido glutámico o ácido aspártico. Se prefiere la inclusión de un aminoácido básico, es decir, arginina, lisina y/o histidina. Si una composición incluye histidina, entonces esta puede actuar a la vez como agente tamponante y como aminoácido libre, pero cuando se usa un tampón de histidina es habitual incluir un aminoácido libre que no sea la histidina, por ejemplo, incluir lisina y un tampón de histidina. Un aminoácido puede estar presente en su forma D y/o L, pero la forma L es habitual. El aminoácido puede estar presente como cualquier sal adecuada, por ejemplo, una sal clorhidrato tal como arginina-HCl.

Cuando están presentes, los componentes (i) a (iv) estarán a una concentración suficiente para mantener el anticuerpo anti-CD40 en una forma que sea activa y soluble después de

(i) liofilización y almacenamiento y reconstitución (para liofilizados), o

(ii) acondicionamiento en monodosis y almacenamiento (para formulaciones líquidas).

Por tanto, puede estar presente un glúcido en la composición farmacéutica acuosa de la divulgación, por ejemplo, después de la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración entre 3 y 400 mM, por ejemplo, 50-380 mM, 100­ 350 mM, 200-300 mM. Una concentración de 270 mM de sacarosa es útil.

Puede estar presente un agente tamponante en la composición farmacéutica acuosa de la divulgación, por ejemplo, después de la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración entre 1 y 60 mM, por ejemplo, 10-50 mM, 20­ 40 mM, 25-35 mM. Una concentración de 30 mM de tampón de histidina es útil.

Puede estar presente un tensioactivo en la composición farmacéutica acuosa de la divulgación, por ejemplo, después de la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración de hasta un 0,2 % (en volumen), por ejemplo, un 0,01­ 0,1 %, un 0,03-0,08 %, un 0,04-0,08 %. Una concentración de un 0,06 % de polisorbato 20 es útil. En algunas realizaciones, puede usarse polisorbato 80.

Puede estar presente un aminoácido libre en la composición farmacéutica acuosa de la divulgación, por ejemplo, después de la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración entre 2 y 100 mM, por ejemplo, 10-80 mM, 20-70 mM, 30-60 mM, 40-60 mM. Una concentración de 51 mM de arginina (por ejemplo, arginina-HCl) o 60 mM de metionina o glicina (por ejemplo, glicina-HCl) es útil.

Se ha mostrado que una formulación que contiene tampón de histidina, sacarosa y polisorbato 20 es adecuada para liofilización del anticuerpo mAb1 a una concentración de al menos 150 mg/ml después de su reconstitución.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 150 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa y un 0,06 % de polisorbato 20.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 150 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa, un 0,06 % de polisorbato 20 y 51 mM de arginina-HCl.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 150 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa, un 0,06 % de polisorbato 20 y 60 mM de glicina-HCl.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 200 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa y un 0,06 % de polisorbato 20.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 200 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa, un 0,06 % de polisorbato 20 y 51 mM de arginina-HCl.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 75 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa y un 0,06 % de polisorbato 20.

En una realización, la composición farmacéutica acuosa consiste en 75 mg/ml de mAb1, 30 mM de histidina, 270 mM de sacarosa, un 0,06 % de polisorbato 20 y 51 mM de arginina-HCl.

Otros excipientes contemplados, que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas acuosas de la divulgación incluyen, por ejemplo, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lípidos tales como fosfolípidos o ácidos grasos, esteroides tales como colesterol, excipientes proteínicos tales como seroalbúmina (seroalbúmina humana), albúmina humana recombinante, gelatina, caseína, contraiones formadores de sales tales como sodio y similares. Estos excipientes farmacéuticos y/o aditivos conocidos y otros adicionales adecuados para su uso en las formulaciones de la divulgación se conocen en la técnica, por ejemplo, como se enumera en "The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.a edición, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); y Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21.a edición, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005).

Las composiciones farmacéuticas acuosas de la divulgación pueden incluir principios activos adicionales además del anticuerpo anti-CD40. Otros agentes farmacológicos pueden incluir, por ejemplo, compuestos quimioterápicos.

Liofilizados

Las técnicas para la liofilización de anticuerpos son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase John F. Carpenter y Michael J. Pikal, 1997 (Pharm. Res. 14, 969-975); Xialin (Charlie) Tang y Michael J. Pikal, 2004 (Pharm. Res. 2 l, 191­ 200). Por ejemplo, los productos de anticuerpo monoclonal SYNAGIS™, REMICADE™, RAPTIVA™, SIMULECT™, XOLAIR™ y HERCEPTIN™ se suministran como liofilizados. Estos anticuerpos se reconstituyen hasta diversas concentraciones finales, por ejemplo, SIMULECT™ se reconstituye hasta una concentración de 4 mg/ml de anticuerpo, REMICADE™ se reconstituye hasta una concentración de 10 mg/ml, HERCEPTIN™ hasta 21 mg/ml, SYNAGIS™ y RAPTIVA™ hasta 100 mg/ml, y XOLAIR™ hasta 125 mg/ml.

Preliofilizados, liofilizados y reconstitución acuosa

Antes de que un liofilizado pueda administrarse a un paciente debe reconstituirse con un reconstituyente acuoso. Esta etapa permite que el anticuerpo y otros componentes en el liofilizado vuelvan a disolverse para proporcionar una solución que es adecuada para su inyección a un paciente.

El volumen de material acuoso usado para la reconstitución dictamina la concentración del anticuerpo en una composición farmacéutica resultante. La reconstitución con un volumen de reconstituyente menor que el volumen preliofilización proporciona una composición que está más concentrada que antes de la liofilización. El factor de reconstitución (volumen de la formulación después de la liofilización:volumen de la formulación antes) puede ser de 1:0,5 a 1:6. Un factor de reconstitución de 1:3 es útil. Como se menciona anteriormente, los liofilizados de la divulgación pueden reconstituirse para proporcionar composiciones acuosas con una concentración de anticuerpo anti-CD40 de al menos 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml, y el volumen de reconstituyente se seleccionará en consecuencia. Si se requiere, la formulación reconstituida puede diluirse antes de su administración a un paciente, según lo apropiado, para administrar la dosis pretendida.

Los reconstituyentes típicos para anticuerpos liofilizados incluyen agua o tampón estéril, que contiene opcionalmente un conservante. Si el liofilizado incluye un agente tamponante, entonces el reconstituyente puede incluir agente tamponante adicional (que puede ser igual a o diferente del agente tamponante del liofilizado) o en su lugar puede no incluir agente tamponante (por ejemplo, WFI (agua para inyección), o solución salina fisiológica).

Cuando están presentes, los componentes (i) a (iv) estarán en una concentración preliofilización suficiente para mantener el anticuerpo anti-CD40 en una forma que sea activa y soluble después de su almacenamiento (en condiciones normales) y reconstitución. Los componentes también estarán presentes después de la reconstitución.

Por tanto, puede estar presente un glúcido, tal como sacarosa o trehalosa, antes de la liofilización a una concentración entre 3 y 300 mM, por ejemplo, 15-200 mM, 30-150 mM, 80-100 mM. Una concentración de 90 mM de sacarosa es útil. Puede estar presente un agente tamponante, tal como histidina, antes de la liofilización a una concentración entre 1 y 60 mM, por ejemplo, 3-30 mM, 5-20 mM, 5-15 mM. Una concentración de 10 mM de tampón de histidina es útil. Puede estar presente un tensioactivo, tal como polisorbato 80 o polisorbato 20 antes de la liofilización a una concentración de hasta un 0,2 % (en volumen), por ejemplo, un 0,01-0,1 %, un 0,01-0,08 %, un 0,01-0,04 %. Una concentración de un 0,02 % de polisorbato 80 o polisorbato 20 es útil. Puede estar presente un aminoácido libre, tal como arginina, metionina o glicina, antes de la liofilización a una concentración entre 2 y 80 mM, por ejemplo, 3-60 mM, 3-50 mM, 6-30 mM, 10­ 25 mM, 15-20 mM. Una concentración de 17 mM de arginina-HCl o 20 mM de glicina-HCl o 60 mM de metionina es útil. El anticuerpo anti-CD40 está presente antes de la liofilización a una concentración entre 20 mg/ml y 120 mg/ml, por ejemplo, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 66,6 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml o 120 mg/ml. Una concentración de 50 mg/ml es útil.

El preliofilizado de la divulgación tiene un pH entre 5,0 y 8,0, entre 5,0 y 7,0, entre 5,5 y 6,5. En una realización específica, el preliofilizado de la divulgación tiene un pH de aproximadamente 6,0.

En una realización, el preliofilizado de la divulgación tiene una relación molar de sacarosa:anticuerpo de 90:1 y una relación molar de histidina:anticuerpo de 10:1.

En una realización, el preliofilizado de la divulgación tiene una relación molar de sacarosa:anticuerpo de 90:1, una relación molar de histidina:anticuerpo de 10:1 y una relación molar de arginina-HCl:anticuerpo de 17:1.

En una realización, el preliofilizado de la divulgación tiene una relación molar de sacarosa:anticuerpo de 90:1, una relación molar de histidina:anticuerpo de 10:1 y una relación molar de glicina-HCl:anticuerpo de 60:1.

Se ha mostrado que una formulación que contiene tampón de histidina, sacarosa, polisorbato 20 y, opcionalmente, arginina, metionina o glicina es adecuada para la liofilización del anticuerpo mAb1. Después de la reconstitución, los componentes del liofilizado pueden estar presentes a una concentración de las composiciones farmacéuticas acuosas como se describe anteriormente en este documento.

Enfermedades y trastornos diana

Las composiciones farmacéuticas acuosas de la divulgación que comprenden anticuerpos anti-CD40 pueden usarse para tratar, mejorar o prevenir trastornos autoinmunitarios relacionados con CD40, trastornos inflamatorios relacionados con CD40 y/o para prevenir o reducir el riesgo de rechazo de injerto en trasplante. Para los fines de la presente divulgación, la expresión "trastornos inflamatorios" incluye "trastornos autoinmunitarios".

Como se usa en este documento, en general se entiende que el término "autoinmunidad" engloba procesos inflamatorios mediados por el sistema inmunitario que implican "autoantígenos". En las enfermedades autoinmunitarias, el o los autoantígenos activan las respuestas inmunitarias del hospedador.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-CD40 son particularmente útiles para tratar la esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide, rechazo de trasplante; enfermedad de injerto contra hospedador, pénfigo vulgar; y neoplasias de linfocitos B tales como leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (CLL).

Además, la presente divulgación incluye el tratamiento de inflamación asociada con rechazo de trasplante de tejido. El "rechazo de trasplante" o "rechazo de injerto" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria montada por el hospedador contra un injerto, incluyendo, aunque sin limitación, antígenos HLA, antígenos de grupo sanguíneo y similares.

La divulgación también puede usarse para tratar la enfermedad de injerto contra hospedador, tal como la asociada con trasplante de médula ósea, por ejemplo. En dicha enfermedad de injerto contra hospedador, la médula ósea donadora incluye linfocitos y células que maduran en linfocitos. Los linfocitos del donador reconocen los antígenos del receptor como no propios y montan una respuesta inmunitaria inflamatoria. Por tanto, como se usa en este documento, "enfermedad de injerto contra hospedador" o "reacción de injerto contra hospedador" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T en que los linfocitos donadores reaccionan contra los antígenos del hospedador.

Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 o proteínas descritas en este documento, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, pueden usarse de acuerdo con los métodos de la divulgación para tratar trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios incluyendo, aunque sin limitación, lupus eritematoso diseminado (SLE), lupus discoide, nefritis lúpica, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un trasplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto contra hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiperIgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca (enteropatía sensible a gluten), síndrome de Sjogren primario (pSS), hepatitis autoinmunitaria, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmunitaria, psoriasis, esclerodermia, miastenia grave, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hasimoto, enfermedad de inmunocomplejos, fatiga crónica, síndrome de disfunción inmunitaria (CFIDS), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombólisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, diabetes mellitus de tipo I y de tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1,2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunitarias indeseadas/imprevistas contra proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2002/0119151 y Koren, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349­ 60), asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis por contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, ateroesclerosis, vasculitis asociadas a ANCA, vasculitis, miopatías inflamatorias idiopáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y similares.

La destrucción genética o inhibición farmacológica de la ruta de CD40-CD154 ha demostrado previamente beneficio terapéutico en los modelos clínicos o preclínicos de SLE, pSS, ITP, MS, enfermedad de Crohn, pénfigo vulgar, vasculitis autoinmunitaria y RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009; 647:8-36); cuya necesidad médica se detalla a continuación.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-CD40 o proteínas de la divulgación son útiles en el tratamiento de: (i) lupus eritematoso diseminado (nefritis lúpica), preferiblemente en proporcionar tratamientos eficaces que evitan los esteroides para la inducción y mantenimiento de la remisión, y prevención de insuficiencia renal terminal; (ii) síndrome de Sjogren primario, preferiblemente en la prevención de la destrucción de glándulas salivales y lagrimales, e inducción y mantenimiento de la remisión de manifestaciones extraglandulares; (iii) púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, preferiblemente tratamiento de pacientes resistentes al tratamiento habitual; (iv) vasculitis asociadas a ANCA, preferiblemente inducción y mantenimiento de la remisión en pacientes resistentes a corticoesteroides, y tratamiento que evita los esteroides; (v) pénfigo vulgar, preferiblemente en la inducción y mantenimiento de la remisión en pacientes resistentes a corticoesteroides, y tratamiento que evita los esteroides; (vi) esclerosis múltiple, preferiblemente en proporcionar tratamientos más eficaces para la prevención de recidivas y progresión de la discapacidad, y conseguir un estado sin enfermedad; y (vii) enfermedad de Crohn, preferiblemente en proporcionar tratamientos más eficaces para el mantenimiento de la remisión, y tratamiento de pacientes resistentes a anti-TNF.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 o proteínas de la divulgación son útiles en el tratamiento de inflamación pulmonar, incluyendo, aunque sin limitación, rechazo de injerto de pulmón, asma, sarcoidosis, enfisema, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática, bronquitis crónica, rinitis alérgica y enfermedades alérgicas del pulmón tales como neumonitis por hipersensibilidad, neumonía eosinófila, bronquiolitis obliterante debida a trasplante de médula ósea y/o pulmón u otras causas, ateroesclerosis de injerto/fleboesclerosis de injerto, así como fibrosis pulmonar resultante de enfermedades del colágeno, vasculares y autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, esclerodermia y lupus eritematoso.

En este documento, "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un anticuerpo anti-CD40 o proteína de acuerdo con la divulgación, por ejemplo, anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, a un sujeto, o aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo anti-CD40 o proteína de la divulgación a un tejido aislado o línea celular de un sujeto, donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o una predisposición al desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, donde el propósito es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o influir en la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, cualquier síntoma asociado de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria.

Por "tratamiento" también se pretende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 o proteína de la divulgación, por ejemplo, anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, a un sujeto, o aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo anti-CD40 o proteína de la divulgación a un tejido aislado o línea celular de un sujeto, donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o una predisposición al desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, donde el propósito es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o influir en la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, cualquier síntoma asociado de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria.

Por "actividad antiinflamatoria" se pretende una reducción o prevención de la inflamación. El tratamiento con al menos un anticuerpo anti-CD40 o proteína de acuerdo con la divulgación causa una respuesta fisiológica que es beneficiosa con respecto al tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, donde la enfermedad implica células que expresan el antígeno CD40. Se reconoce que los métodos de la divulgación pueden ser útiles en la prevención del cambio fenotípico en las células, tales como proliferación, activación y similares.

Administración al paciente

Una composición farmacéutica de la divulgación puede administrarse a un paciente. La administración será habitualmente por medio de una jeringa. Por tanto, la divulgación proporciona un dispositivo de suministro (por ejemplo, una jeringa) que incluye una composición farmacéutica de la divulgación (por ejemplo, jeringa prellenada). Los pacientes recibirán una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CD40 como principio activo principal, es decir, una cantidad que es suficiente para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad o trastorno en cuestión. Los efectos terapéuticos también pueden incluir la reducción de los síntomas físicos. La cantidad y la concentración eficaces óptimas del anticuerpo para cualquier sujeto particular dependerán de varios factores, que incluyen la edad, tamaño, estado de salud y/o género del paciente, la naturaleza y el grado de la afección, la actividad del anticuerpo particular, la tasa de su eliminación por parte del organismo y también cualquier agente o agentes terapéuticos adicionales posibles administrados en combinación con el anticuerpo. La cantidad eficaz suministrada para una situación dada puede determinarse según el criterio de un médico. Para los fines de la presente divulgación, una dosis eficaz puede ser de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Los agentes farmacéuticos basados en anticuerpos conocidos proporcionan una guía a este respecto, por ejemplo, HERCEPTIN™ se administra con una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg de peso corporal; RITUXAN™ se administra semanalmente a 375 mg/m2; SYNAGIS™ se administra por vía intramuscular a 15 mg/kg de peso corporal; etc.

La divulgación también proporciona formulaciones de la divulgación para su uso como medicamentos, por ejemplo, para su uso en el suministro de un anticuerpo a un mamífero, o para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una o más de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente.

El mamífero es preferiblemente un ser humano, pero también puede ser, por ejemplo, un caballo o una vaca o un perro o un gato. Los anticuerpos, de forma ideal, se elegirán para que coincidan con la especie diana, por ejemplo, un anticuerpo humano para administración a seres humanos, un anticuerpo equino para caballos, un anticuerpo canino para perros, etc. Si los anticuerpos naturales del hospedador no están disponibles, entonces puede conseguirse la transferencia de la especificidad del anticuerpo de una especie a otra por transferencia de los residuos CDR (y, típicamente, además, uno o más residuos flanqueantes) de un anticuerpo donador a una región flanqueante receptora de la especie hospedadora, por ejemplo, como en la humanización. Se conocen en la técnica anticuerpos equinizados, bovinizados, caninizados y felinizados. El anticuerpo se unirá a CD40 de la especie diana, pero también puede reaccionar de forma cruzada con CD40 de otras especies.

La dosificación se puede llevar a cabo mediante una pauta de una sola dosis o una pauta de múltiples dosis.

Los ingredientes para formar composiciones de la divulgación (por ejemplo, liofilizados y reconstituyentes) pueden aportarse en recipientes cerrados herméticamente.

El anticuerpo anti-CD40

La divulgación se refiere a la formulación de anticuerpos anti-CD40 y, más específicamente los anticuerpos denominados mAb1, mAb2 y mAb3, especialmente mAb1.

Un anticuerpo adecuado que puede estar comprendido en las composiciones farmacéuticas de la divulgación es el anticuerpo recombinante humano mAb1, caracterizado estructuralmente como se describe adicionalmente a continuación. La secuencia de aminoácidos de V^h de dicho anticuerpo anti-CD40 aislado se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de V^l de dicho anticuerpo anti-CD40 aislado se muestra en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de dicho anticuerpo anti-CD40 aislado se muestra en la SEQ ID NO: 9. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de dicho anticuerpo anti-CD40 aislado se muestra en la SEQ ID NO: 10. Otro ejemplo de secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de dichos anticuerpos anti-CD40 aislados son las codificadas por las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente.

Otros anticuerpos anti-CD40 que pueden usarse para preparar las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen anticuerpos anti-CD40 con aminoácidos que se han mutado por eliminación, inserción o sustitución de aminoácidos, aunque no tienen más de 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en las regiones de la cadena pesada o ligera descritas anteriormente. En una realización específica, dichos cambios de aminoácidos aparecen únicamente dentro de las regiones flanqueantes y/o constantes y las regiones CDR presentan una identidad de un 100 % con respecto a las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 3, 4 y 5 y con respecto a las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. En una realización específica más, los cambios que se han realizado son únicamente sustituciones conservativas de aminoácidos fuera de las regiones CDR.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos son unas en las que el residuo aminoacídico se remplaza por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales de carácter básico (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más residuos aminoacídicos fuera de las regiones CDR de un anticuerpo anti-CD40, pueden remplazarse con otros residuos aminoacídicos de la misma familia de cadenas laterales, y el anticuerpo alterado puede ensayarse con respecto a la función retenida, en particular las mismas propiedades de unión a CD40.

Los anticuerpos pueden estar habitualmente glicosilados. Los glucanos ligados a N fijados al dominio CH2 de una cadena pesada, por ejemplo, pueden influir en la unión de C1q y FcR, y los anticuerpos aglucosilados (por ejemplo, que comprenden una mutación N297A) pueden tener afinidad menor o diferente por estos receptores. La estructura del glucano también puede afectar a la actividad, por ejemplo, se pueden observar diferencias en la muerte celular mediada por el complemento dependiendo del número de glúcidos de tipo galactosa (0, 1 o 2) en el extremo de una cadena biantenaria de glucano. Los glucanos de un anticuerpo preferiblemente no dan lugar a una respuesta inmunógena humana tras su administración.

Otra modificación de los anticuerpos anti-CD40 en este documento que contempla la divulgación es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar para, por ejemplo, incrementar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se puede hacer reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado de tipo aldehído del PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unan al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo).

Como se usa en este documento, se pretende que el término "polietilenglicol" englobe cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tal como monoalcoxi(C1-C10)- o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicolmaleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en el técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la divulgación. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 de Nishimura et al. y el documento EP 0401384 de Ishikawa et al.

Además se contempla cualquier otra modificación postraduccional natural o no natural de anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, mAb1) como realizaciones específicas de anticuerpos anti-CD40 que podrían usarse para preparar las composiciones farmacéuticas de la divulgación.

Los anticuerpos se pueden preparar en una forma exenta de productos con los que se asociarían de forma natural. Los componentes contaminantes del entorno natural de un anticuerpo incluyen materiales tales como enzimas, hormonas u otras proteínas de las células hospedadoras.

Las diversas características y realizaciones de la presente divulgación, mencionadas en secciones y realizaciones individuales anteriores se aplican, según lo apropiado, a otras secciones y realizaciones, mutatis mutandis. Por consiguiente, las características especificadas en una sección o realización pueden combinarse con características especificadas en otras secciones o realizaciones, según lo apropiado.

Ejemplos

Preparación de anticuerpos anti-CD40

CHIR-12.12, y mAb1 (N297A CHIR-12.12), mAb2 (D265A CHIR-12.12) y mAb3 (CHIR-12.12 LALA) se unen específicamente a CD40. Las tablas 1 y 2 a continuación resumen las características de secuencia de estos anticuerpos. Estos anticuerpos pueden producirse en células hospedadoras de mamífero, tales como una línea celular CHO transfectada con vectores de expresión que portan secuencias codificantes de la cadena pesada y ligera bajo promotores de expresión adecuados.

Tabla 1: Breve descri ción de las secuencias enumeradas en la lista de secuencias de la tabla 2

Tabla 2: Lista de secuencias

Ejemplos de formulaciones

Se deseaba una formulación liofilizada o líquida de alta concentración de mAbl y por tanto se realizaron estudios de formulación. Una formulación liofilizada que comprendía un glúcido, un agente tamponante y un tensioactivo era estable y pudo mantener altas concentraciones de anticuerpo después de la reconstitución.

Se evaluaron cinco formulaciones (F1, F2, F3, F4 y F5) de mAb1 con respecto a la estabilidad. F1 era una formulación líquida a 50 mg/ml de mAb1 a pH 6,0. Las formulaciones F2, F3, F4 y F5 tenían, antes de la liofilización, 50 mg/vial de mAb1. Las formulaciones F2, F3, F4 y F5 tenían, antes de la liofilización, 50 mg/ml de mAb1 a pH 6,0. Las formulaciones F2, F3, F4 y F5 tenían un volumen de llenado de 3,6 ml. Las cinco formulaciones incluían tampón, glúcido, tensioactivo y aminoácido libre como se enumeran en la tabla 3:

Ta

Los liofilizados F2, F3, F4 y F5 se reconstituyeron con WFI (1,0 ml) para proporcionar un volumen reconstituido de 1,2 ml (1/3 del volumen acuoso original). Las composiciones reconstituidas fueron como se enumera en la tabla 4:

Ta

El ciclo de liofilización usado se presenta en la tabla 5.

Tabla 5: Los parámetros del ciclo de liofilización

Etapa Operación Tiempo [hh:mm] Temp. almacenamiento ^{Presión de la} _cámara

1 Carga del vial Según se requiera 20°C Ambiente

2 Refrigeración a 5 °C 00:30 5°C Ambiente

3 Mantenimiento a 5 °C 3:00 5°C Ambiente

4 Rampa de congelación 1:24 de 5 °C a -37 °C Ambiente

5 Mantenimiento en congelación 6:00 -37°C Ambiente

6 Cámara de vacío Según se requiera -37°C 0,2 mbara

7 Rampa de secado principal 16:00 de -37 °C a 25 °C 0,2 mbara

8 ^{Mantenimiento de secado}

_secundario 24:00 25°C 0,2 mbara

11 Tapado del vial 25°C 850 ± 50 mbar a La presión de la cámara se controló usando nitrógeno filtrado a esterilidad. La presión se determinó mediante instrumentos basados en mediciones de capacidad.

Las cinco formulaciones se ensayaron con respecto a la estabilidad en diversos momentos puntuales después de la formulación/reconstitución como se enumera a continuación.

Se usó cromatografía de líquidos de alta presión por exclusión de tamaño (SEC-HPLC) para evaluar la cantidad de mAb1 en cada formulación en el momento de formulación (T0), 4 semanas (25 °C), 4 semanas (40 °C), 6 meses (2-8 °C), 6 meses (25 °C) y 6 meses (40 °C). La cantidad de anticuerpo se expresa como un porcentaje de la cantidad de partida, como se enumera en la tabla 6. La formulación F1 permanece cerca de 50 mg/ml ± 5 mg/ml (100 % ± 10 %), las formulaciones F2, F3, F4 y F5 permanecen cerca de 150 mg/ml ± 15 mg/ml (100 % ± 10 %).

Tabla 6 : Cantidad de anticuer o de SEC-HPLC

La potencia del anticuerpo mAbl en cada formulación se midió por ensayo ELISA en T0, 4 semanas (25 °C), 4 semanas (40 °C), 6 meses (2-8 °C), 6 meses (25 °C) y 6 meses (40 °C). Los resultados, expresados como un porcentaje de la potencia de partida (100 %) se enumeran en la tabla 7. La potencia de la formulación F1 disminuye con la progresión del tiempo y aumento de la temperatura; después de 6 m a 40 °C se descubrió que la potencia era de un 79 %. El valor más bajo medido fue de un 85 % para F4 (6 m a 25 °C) y un 86 % para F3 (6 m a 40 °C)

Ta l 7 : L ni l ni r mi i n ELI A

La estabilidad de las formulaciones se evaluó por el % de impurezas medido por cromatografía de líquidos de alta presión por exclusión de tamaño (SEC-HPLC) y dispersión de luz dinámica (DLS). Los resultados se muestran en las tablas 8 y 9.

Ta l : Pr r i n r l E -HPL

Ta l : P rí l ñ r l r l ín i li i ri PDI i ri n l z in mi

La formulación F1 mostró un aumento de productos de agregación con temperatura y tiempo crecientes. Para las formulaciones F2 a F5 la adición de arginina (F2 y F3) redujo ligeramente el nivel de agregación; y la sacarosa (F3 y F5) fue superior a la trehalosa.

Los productos de agregación también se evaluaron midiendo la turbidez. La formulación F1 mostró un aumento de turbidez con el aumento en la temperatura y con el aumento en el tiempo. Las formulaciones F2 a F5 mostraron valores de turbidez ligeramente aumentados para formulaciones que contienen arginina (F2 y F3).

Tabla 10: Mediciones de turbidez unidades de absorbancia

La estabilidad de las formulaciones se evaluó mediante el % de productos de degradación medido por SEC-HPLC. Con las formulaciones F2 a F5, la adición de arginina redujo ligeramente la degradación. Los resultados se muestran en la tabla 11.

Tabla 11: Productos de degradación; resultados de SEC-HPLC

Las cuatro formulaciones liofilizadas F2, F3, F4 y F5 se evaluaron con respecto a la transparencia visual después de la reconstitución. Los resultados se presentan en la tabla 12.

Tabla 12: Trans arencia visual

Se evaluaron las propiedades fisicoquímicas de las formulaciones; los resultados se presentan en la tabla 13. Los valores de viscosidad son los valores de las formulaciones que tienen 50 mg/ml de anticuerpo antes de la liofilización. Los valores de osmolalidad corresponden a las composiciones reconstituidas que tienen 150 mg/ml de anticuerpo.

Tabla 13: Propiedades fisicoquímicas

Conclusiones

Globalmente, las formulaciones ensayadas mostraron buenos resultados. Los bioensayos (SEC y ELISA) mostraron que las formulaciones son comparables. Los agregados solubles se redujeron significativamente en presencia de arginina y disminuyeron ligeramente para las formulaciones que contenían sacarosa en comparación con las formulaciones que contenían trehalosa. La turbidez aumentó ligeramente en presencia de arginina; no hubo diferencias entre las formulaciones que contenían trehalosa o sacarosa. La degradación se redujo en presencia de arginina. Con respecto a las propiedades fisicoquímicas el pH, la viscosidad, el contenido de humedad residual y el aspecto visual fueron comparables para todas las formulaciones. La osmolalidad fue >300 mOsm/kg para todas las formulaciones, y fue incluso mayor en presencia de arginina-HCl (F2 y F3). Se desea tener una formulación que sea isotónica para el plasma (290 mOsm/kg), o lo más cerca posible a este valor. Las formulaciones que tienen sacarosa (F3 y F5) se consideraron preferibles a las que comprenden trehalosa. Aunque se observaron algunos efectos beneficiosos sobre la degradación con arginina (F3), la osmolalidad inferior de la formulación F5 se consideró un factor más importante. La formulación F5 se consideró la formulación más óptima.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. U n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a a c u o s a , e n la q u e la c o m p o s ic ió n t ie n e un pH d e 6 ,0 y c o m p re n d e

(i) un a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 e n e l q u e e l a n t ic u e rp o t ie n e u n a c o n c e n tra c ió n d e 150 m g /m l, y e n e l q u e d ic h o a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 in c lu y e la C D R 1 , C D R 2 y C D R 3 d e la c a d e n a p e s a d a d e la s S E Q ID N O : 3, 4 y 5, re s p e c t iv a m e n te , y la C D R 1 , C D R 2 y C D R 3 d e la c a d e n a lig e ra d e la s S E Q ID N O : 6 , 7 y 8,

( ii) 270 m M d e s a c a ro s a c o m o e s ta b il iz a n te ,

( iii) 30 m M d e h is t id in a c o m o a g e n te ta m p o n a n te y

( iv ) un 0 ,06 % d e p o lis o rb a to 20 c o m o te n s io a c t iv o .

2. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c u o s a d e la re iv in d ic a c ió n 1, e n la q u e e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 c o m p re n d e un d o m in io V h q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la S E Q ID N O : 1 y un d o m in io V l q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la S E Q ID N O : 2.

3. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a a c u o s a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 o 2 , e n la q u e el a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 c o m p re n d e u n a re g ió n d e c a d e n a p e s a d a d e la s E q ID N O : 9 y u n a re g ió n d e c a d e n a lig e ra d e la S E Q ID N O : 10.

4. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a a c u o s a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 3, e n la q u e el a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 c o m p re n d e u n a re g ió n d e c a d e n a p e s a d a d e la S E Q ID N O : 13 y u n a re g ió n d e c a d e n a lig e ra d e la S E Q ID N O : 14.

5. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a a c u o s a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 4 , e n la q u e el a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 c o m p re n d e u n a re g ió n d e c a d e n a p e s a d a d e la S E Q ID N O : 17 y u n a re g ió n d e c a d e n a lig e ra d e la S E Q ID N O : 18.

6. U n d is p o s it iv o d e s u m in is tro q u e in c lu y e la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c u o s a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 5.

7. E l d is p o s it iv o d e s u m in is tro d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 6, en el q u e e l d is p o s it iv o d e s u m in is tro e s u n a je r in g a p re lle n a d a .

8. U n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a a c u o s a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 5 p a ra s u u so e n el t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d o t ra s to rn o q u e e s tá m e d ia d o p o r C D 40.

9. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c u o s a d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 8, p a ra s u u so e n e l t ra ta m ie n to de e n fe rm e d a d e s a u to in m u n ita r ia s .

10. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c u o s a d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 9, p a ra s u u s o e n e l t ra ta m ie n to d e la e s c le ro s is m ú ltip le , lu p u s e r ite m a to s o d is e m in a d o , n e fr it is lú p ic a , s ín d ro m e d e S jo g re n , a r tr it is re u m a to id e , p é n fig o v u lg a r o m ia s te n ia g ra v e .

11. L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a a c u o s a d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 8, p a ra s u u s o e n e l t ra ta m ie n to de l re c h a z o d e tra s p la n te s o la e n fe rm e d a d d e in je r to c o n tra h o s p e d a d o r .