JP5646457B2 - 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用 - Google Patents
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Description
本願は、2008年4月29日に出願された米国仮特許出願61/125,834号、2008年7月8日に出願された米国仮特許出願61/134,283号、2008年10月23日に出願された米国仮特許出願61/197,191号及び2008年11月12日に出願された米国仮特許出願61/199,009号(参照により、これらの内容は本明細書に組み込まれる)。に対する優先権を主張する非仮出願である。
本発明は、多価及び多重特異的な結合タンパク質、それらの製造方法に関し、特に、急性及び慢性炎症疾患、癌並びにその他の疾病の診断、予防及び/又は治療におけるそれらの使用に関する。
2つ又はそれ以上の抗原に結合することが可能な多重特異的抗体などの加工されたタンパク質が、本分野において公知である。このような多重特異的結合タンパク質は、細胞融合、化学的連結又は組み換えDNA技術を用いて作製することが可能である。
本発明は2つ又はそれ以上の抗原を結合することが可能な多価結合タンパク質に関する。本発明は、高い親和性で、2つ又はそれ以上の抗原を結合することが可能な結合タンパク質の新規ファミリーを提供する。
レビー小体型の老年性認知症、血清反応陰性関節炎、ショック、鎌形赤血球貧血症、皮膚同種異系移植拒絶、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶、固形腫瘍、固有不整脈(specific arrythmias)、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、湿疹、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、T細胞又はFABALL、毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷/出血、III型過敏症反応、IV型過敏症、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、じんましん、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染、ウイルス性脳炎(vital encephalitis)/無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウィルソン病、何れかの臓器又は組織の異種移植拒絶、急性冠不全症候群、急性突発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発性神経障害、急性虚血、成体スチル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染を伴う自己免疫性疾患、自己免疫性腸疾患、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖性症候群(ALPS)、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早発閉経、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頚部脊椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症に対するリスクを有する最初のエピソードからなる症候群(cis;clinically isolated syndrome)、結膜炎、小児発症精神疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、糖尿病、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物によって誘導される免疫溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、上強膜炎、多型性紅斑、重症型多型性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギランバレー症候群(GBS)、花粉症、ヒューズ症候群、突発性パーキンソン病、突発性間質性肺炎、IgE媒介性アレルギー、免疫溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼性炎症疾患、炎症性脱髄性疾患、炎症性心臓病、炎症性腎臓病、IPF/UIP、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病又はクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、網状皮斑、黄斑変性、顕微鏡的多発性血管炎、ベフテレフ病、運動神経疾患、粘膜類天疱瘡、多発性臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根疾患、神経障害、非A非B型肝炎、視神経炎、骨溶解、卵巣癌、少関節性JRA、末梢動脈閉塞疾患(PAOD)、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患(PAD)、静脈炎、結節性多発性動脈炎(又は結節性動脈周囲炎)、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、白毛症、多関節性JRA、多内分泌欠乏症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛(PMR)、ポンプ後症候群(post−pump)症候群、原発性パーキンソン病、前立腺及び直腸癌及び造血系の悪性腫瘍(白血病及びリンパ腫)、前立腺炎、純赤血球形成不全、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心疾患、sapho(滑膜炎、ざ瘡、嚢胞、骨肥大症及び骨炎)、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、坐骨神経痛、続発性副腎不全、シリコーン関連結合組織疾患、スネドン−ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)、全身性炎症性応答症候群、側頭動脈炎、トキソプラズマ網膜炎、毒性表皮剥離症、横断性脊髄炎、TRAPS(腫瘍壊死因子受容体1型アレルギー性反応)、II型糖尿病、じんましん、通常型間質性肺炎(UIP)、血管炎、春季カタル、ウイルス性網膜炎、フォークト・コヤナギ・ハラダ症候群(VKH症候群)、滲出型黄斑変性、創傷治癒、エルシニア及びサルモネラ関連関節症からなる群から選択される。
本発明は、2つ又はそれ以上の抗原に結合することが可能な多価及び/又は多重特異的結合タンパク質に関する。具体的には、本発明は、二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)及びその医薬組成物並びにこのようなDVD−Igを作製するための核酸、組み換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。インビトロ又はインビボの何れかで、特異的抗原を検出するために本発明のDVD−Igを使用する方法も、本発明によって包含される。
抗体(「Ab」)+抗原(「Ag」)−>Ab−Ag
Ab+Ag<−Ab−Ag
本発明は、1つ又はそれ以上の標的に結合することが可能な二重可変ドメイン結合タンパク質及びこれを作製する方法に関する。一実施形態において、結合タンパク質はポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−C−(X2)n(VD1は第一の可変ドメインであり、VD2は第二の可変ドメインであり、Cは定常ドメインであり、X1はアミノ酸又はポリペプチドを表し、X2はFc領域を表し、及びnは0又は1である。)を含む。本発明の結合タンパク質は、様々な技術を用いて作製することが可能である。本発明は、発現ベクター、宿主細胞及び結合タンパク質を作製する方法を提供する。
DVD結合タンパク質の可変ドメインは、目的の抗原に結合することができるポリクローナル及びモノクローナル抗体など、親抗体から取得することが可能である。これらの抗体は、天然に存在し得、又は組み換え技術によって作製され得る。
本発明の一実施形態は、DVD−Ig分子中に所望される少なくとも1つ又はそれ以上の特性を有する親抗体を選択することに関する。一実施形態において、所望の特性は1つ又はそれ以上の抗体パラメータから選択される。別の実施形態において、抗体パラメータは、抗原特異性、抗原に対する親和性、強度、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解度、産生効率、免疫原性、薬物速度論、生物学的利用性、組織交叉反応性及びオーソロガス抗原結合から選択される。
治療用mAbの所望される親和性は、抗原の性質及び所望される治療的評価項目に依存し得る。一実施形態において、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用は通常高い親和性の相互作用(例えば、<pMから<nMの範囲)なので、モノクローナル抗体は、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用を遮断する場合に、より高い親和性(Kd=0.01から0.50pM)を有する。このような事例において、標的に対するmAbの親和性は、サイトカインの受容体に対するサイトカイン(リガンド)の親和性と等しく又はそれより優れているべきである。他方、より低い親和性を有するmAb(>nM範囲)は、例えば、病原性を有する可能性がある循環タンパク質、例えば、A−βアミロイドの循環種に結合し、取り囲み、及び排除するモノクローナル抗体を除去する上で、治療的に有効であり得る。他の事例では、起こり得る副作用(例えば、高親和性mAbは、その意図する標的の全てを取り囲み/中和することによって、標的とされるタンパク質の機能を完全に枯渇/除去し得る。)を回避するために、部位指定突然変異導入によって既存の高親和性mAbの親和性を低下させること又はその標的に対してより低い親和性を有するmAbを使用することを使用し得る。このシナリオでは、低親和性mAbは、疾病の症候の原因となり得る標的の一部を囲い込み/中和し得るので(病理学的な又は過剰産生されたレベル)、標的の一部はその正常な生理的機能を遂行し続けることが可能である。従って、用量を調整し、及び/又は副作用を低減するために、Kdを低下させることが可能であり得る。親mAbの親和性は、所望の治療的結果を達成するために、細胞表面分子に適切に標的化する上で役割を果たし得る。例えば、標的が、高い密度で癌細胞上に発現され、低い密度で正常な細胞上に発現されていれば、より低い親和性のmAbは、正常な細胞より腫瘍細胞上の標的のより多数を結合し、ADCC又はCDCを介した腫瘍細胞の除去をもたらし、従って、治療的に望ましい効果を有し得る。従って、所望の親和性を有するmAbを選択することは、可溶性及び表面標的の両方に関して妥当であり得る。
親モノクローナル抗体の所望される親和性/強度は、所望される治療結果に依存する。例えば、受容体−リガンド(R−L)相互作用に関して、親和性(kd)は、R−Lのkd(pM範囲)と等しく又はそれを上回る。病的な循環タンパク質の単純な排除のために、kdは、低nM範囲であり得る(例えば、循環しているA−βペプチドの様々な種の排除)。さらに、kdは、標的が同じエピトープの複数コピーを発現するかどうかにも依存する(例えば、Aβオリゴマー中の立体構造エピトープを標的とするmAb)。
モノクローナル抗体は、潜在的に幾つかの機能を発揮し得る。これらの機能の幾つかが、表1に列記されている。これらの機能は、インビトロアッセイ(例えば、細胞を基礎とする生化学的アッセイ)及びインビボ動物モデルの両方によって評価することができる。
タンパク質の異なる領域は、異なる機能を発揮し得る。例えば、サイトカインの特異的な領域は、サイトカイン受容体と相互作用して受容体の活性化をもたらすのに対して、タンパク質の他の領域はサイトカインを安定化させるために必要とされ得る。この事例では、サイトカイン上の受容体相互作用領域に特異的に結合することにより、サイトカイン−受容体相互作用を遮断するmAbを選択し得る。幾つかの事例では、例えば、複数のリガンドを結合するある種のケモカイン受容体、1つのリガンドのみと相互作用するエピトープ(ケモカイン受容体上の領域)に結合するmAbを選択することができる。他の事例では、モノクローナル抗体は、タンパク質の生理的機能に直接必要とされないが、これらの領域へのmAbの結合が生理機能を妨害し(立体的妨害)又はタンパク質が機能できないようにタンパク質の立体構造を変化させ得る(何れのリガンドも結合できないように、受容体の立体構造を変化させる、複数のリガンドを有する受容体に対するmAb)標的上のエピトープに結合することができる。その受容体へのサイトカインの結合を遮断しないが、シグナル伝達を遮断する抗サイトカインモノクローナル抗体も、同定されている(例えば、125−2H、抗IL−18mAb)。
抗体を用いた治療的処置には、(典型的に高い分子量の結果、質量当りの能力が低いために)高い用量の投与をしばしば必要とし、しばしば、数mg/kgを必要とする。患者に服薬を遵守させ、及び慢性疾患の療法及び外来患者の治療に十分に対処するために、治療用mAbの皮下(s.c.)又は筋肉内(i.m.)投与が望ましい。例えば、皮下投与のための最大の望ましい容量は、約1.0mLであり、従って、>100mg/mLの濃度は、注射回数/投薬を限定することが望ましい。一実施形態において、治療用抗体は1回の投薬で投与される。しかしながら、タンパク質−タンパク質相互作用(例えば、免疫原性リスクを増大させる可能性を有する凝集)によって、並びに加工及び輸送の間の限界によって(例えば、粘度)、このような製剤の開発は制約される。その結果、臨床的な有効性のために必要とされる多量及び付随する開発の制約は、抗体製剤の可能性の完全な活用及び高用量治療計画での皮下投与を制約する。タンパク質分子及びタンパク質溶液の生理化学的及び薬学的特性(例えば、安定性、溶解度及び粘度特性)は、最も有用であると思われる。
「安定な」抗体製剤は、保存に際して、その中の抗体がその物理的安定性及び/又は化学的安定性及び/又は生物活性を実質的に保持する抗体製剤である。安定性は、選択された期間にわたって、選択された温度で測定することができる。一実施形態において、製剤中の抗体は、室温で(約30℃)で又は40℃で少なくとも1ヶ月間及び/又は約2から8℃で、少なくとも1年間、少なくとも2年間安定である。さらに、一実施形態において、製剤は、凍結(例えば、−70℃への)、及び製剤の融解(以下、「凍結/融解サイクル」と称される。)後に安定である。別の例では、「安定な」製剤は、製剤中の凝集物として、タンパク質の約10%未満及び約5%未満が存在する製剤であり得る。
mAbの「溶解度」は、正確に折り畳まれた単量体IgGの産生と相関する。従って、IgGの溶解度がHPLCによって評価され得る。例えば、可溶性(単量体)IgGはHPLCクロマトグラフィー上に単一のピークを生じるのに対して、不溶性の(例えば、多量体及び凝集した)は複数のピークを生じる。従って、当業者は、定型的なHPLC技術を用いて、IgGの溶解度の増加又は減少を検出することができる。溶解度を分析するために使用され得る分析技術のより包括的なリストに関しては、Jones,A. G. Dep.Chem.Biochem.Eng.,Univ. Coll. London,London,UK.Editor(s):Shamlou,P. Ayazi.Process. Solid−Liq.Suspensions (1993),93−117.Publisher:Butterworth−Heinemann,Oxford,UK and Pearlman,Rodney; Nguyen,Tue H,Advances in Parenteral Sciences (1990),4 (Pept.Protein Drug Delivery),247−301)を参照されたい。治療用mAbの溶解度は、十分な投薬のためにしばしば必要とされる高い濃度になるように調合するために重要である。本明細書に概説されているように、効率的な抗体投薬量を収容するためには、>100mg/mLの溶解度が必要とされ得る。例えば、抗体の溶解度は、初期研究期では約5mg/mL以上であり得、一実施形態において、進んだプロセス科学段階では約25mg/mL以上であり得、又はある実施形態において、約100mg/mL以下であり得、又は一実施形態において、約150mg/mL以下であり得る。タンパク質分子の固有の特性は、タンパク質溶液の重要な物理化学的特性(例えば、安定性、溶解度、粘度)であることが当業者に自明である。しかしながら、当業者は、最終のタンパク質製剤の特性に有益な影響を与えるための添加物として使用され得る幅広い様々な賦形剤が存在することを理解する。これらの賦形剤には、(i)液体溶媒、共溶媒(例えば、エタノールなどのアルコール)、(ii)緩衝剤(例えば、ホスファート、アセタート、シトラート、アミノ酸緩衝液);(iii)糖又は糖アルコール(例えば、ショ糖、トレハロース、フルクトース、ラフィノース、マニトール、ソルビトール、デキストラン);(iv)界面活性剤(例えば、ポリソルベート20、40、60、80、ポロキサマー);(v)等張性改変物質(例えば、NaClなどの塩、糖、糖アルコール)及び(vi)その他(例えば、防腐剤、キレート剤、抗酸化剤、キレート物質(例えば、EDTA)、生物分解性ポリマー、担体分子(例えば、HSA、PEG)が含まれ得る。
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞中で効率的に発現されるDVD−Igの作製は、一実施形態において、哺乳動物中でそれ自体効率的に発現される2つの親モノクローナル抗体を必要とする。安定な哺乳動物株(すなわち、CHO)からの作製収率は、約0.5g/L超、一実施形態において、約1g/L超、別の実施形態において、約2から5g/L又はそれ以上の範囲内とすべきである(Kipriyanov SM,Little M. 1999 Mol Biotechnol.12:173−201; Carroll S,Al−Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther.4:1821−9)。
治療用mAbの投与は、免疫応答のある種の発生(すなわち、治療用mAbに対して誘導された内在性抗体の形態)をもたらし得る。免疫原性を誘導し得る潜在的な要素は、親モノクローナル抗体の選択の間に分析すべきであり、DVD−Igの構築の前に、親モノクローナル抗体を最適化するために、このようなリスクを低減させるための工程を踏むことができる。マウス由来の抗体は、患者内で高度に免疫原性であることが見出されている。マウスの可変領域とヒトの定常領域から構成されるキメラ抗体の作製が、治療用抗体の免疫原性を低下させるための論理的な次のステップとなる(Morrison and Schlom,1990)。あるいは、免疫原性は、Riechmann他、1988によって治療用抗体に関して記載されたように、ヒト抗体フレームワーク中にマウスCDR配列を転移させることによって低減させることができる(リシェーピング/CDRグラフティング/ヒト化)。別の方法は、げっ歯類の可変軽及び重ドメインから始まり、表面接近可能なフレームワークアミノ酸のみがヒトのアミノ酸に改変される一方、CDR及び埋没されたアミノ酸は親げっ歯類抗体のままである、「リサーフェシング」又は「ベニアリング」と称される(Roguska et al.,1996)。ヒト化の別の種類では、CDR全体を移植する代わりに、1つの技術は、抗体の標的への抗体の結合に関与するCDR残基の亜群と定義される「特異性決定領域」(SDR)のみを移植する(Kashmiri et al.,2005)。これには、抗体−標的複合体の利用可能な三次元構造の分析又は何れが標的と相互作用するかを決定するための抗体CDR残基の変異分析の何れかを通じたSDRの同定が必要とされる。あるいは、完全なヒト抗体は、マウス、キメラ又はヒト化抗体と比べて低下した免疫原性を有し得る。
所望のインビボ有効性を有するDVD−Ig分子を作製するために、組み合わせて与えられたときに、同様に所望のインビボ有効性を有するmAbを作製及び選択することが重要である。しかしながら、幾つかの事例において、DVD−Igは、2つの別個のmAbの組み合わせを用いて達成することができないインビボ有効性を示し得る。例えば、DVD−Igは2つの標的を近接させて、2つの別個のmAbの組み合わせを用いて達成することができない活性をもたらし得る。さらなる望ましい生物学的機能が、本明細書の節B3に記載されている。DVD−Ig分子において望ましい特徴を有する親抗体は、薬物速度論t1/2;組織分布;可溶性対細胞表面標的及び標的濃度−可溶性/密度−表面などの要因に基づいて選択され得る。
所望のインビボ組織分布を有するDVD−Ig分子を作製するために、一実施形態において、類似の所望のインビボ組織分布特性を有する親mAbを選択しなければならない。あるいは、二重特異的標的化戦略の機序に基づいて、別の時点では、組み合わせて与えられたときに、同様に所望のインビボ組織分布を有する親mAbを選択することが必要でない場合があり得る。例えば、1つの結合成分がDVD−Igを特異的な部位へ標的化するDVD−Igの場合には、これにより、第二の結合成分を同じ標的部位へもたらす。例えば、DVD−Igの一方の結合特異性は膵臓(膵頭細胞)を標的化することができ、他方の特異性はインシュリンを誘導するためにGLP1を膵臓にもたらすことができる。
イソタイプ、エフェクター機能及び循環半減期などの(但し、これらに限定されない。)所望の特性を有するDVD−Ig分子を作製するために、一実施形態において、治療用途及び所望の治療的評価項目に応じて適切なFc−エフェクター機能を有する親mAbが選択される。5つの主要な重鎖クラス又はイソタイプで存在し、そのうち幾つかは数個のサブタイプを有し、これらが抗体分子のエフェクター機能を決定する。これらのエフェクター機能は、抗体分子のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン中に存在する。しかしながら、抗体分子の他の部分の残基も、エフェクター機能に影響を及ぼし得る。ヒンジ領域Fc−エフェクター機能には、(i)抗体依存性細胞性細胞傷害、(ii)補体(C1q)結合、活性化及び補体依存性細胞傷害(CDC)、(iii)抗原−抗体複合体の貪食作用/排除並びに(iv)幾つかの事例におけるサイトカインの放出が含まれる。抗体分子のこれらのFc−エフェクター機能は、クラス特異的な細胞表面受容体の組みとのFc領域の相互作用を通じて媒介される。IgG1イソタイプの抗体は最も活性が高いのに対して、IgG2及びIgG4は最小限のエフェクター機能を有し又はエフェクター機能を有さない。IgG抗体のエフェクター機能は、3つの構造的に相同的な細胞性Fc受容体のタイプ(及びサブタイプ)(FcgR1、FcgRII及びFcgRIII)との相互作用を通じて媒介される。IgG1のこれらのエフェクター機能は、FcgR及びC1q結合に必要とされるより低いヒンジ領域中の特定のアミノ酸残基を変異させる(例えば、L234A、L235A)ことによって除去することができる。Fc領域中のアミノ酸残基、特に、CH2−CH3ドメインも、抗体分子の循環半減期を決定する。このFc機能は、酸性リソゾームから全身循環へ抗体分子をリサイクルするために必要な新生Fc受容体(FcRn)へのFc領域の結合を通じて媒介される。
b)所望の結果が病的タンパク質の排除である場合、活性なイソタイプを使用し得る。
c)所望の結果がタンパク質凝集物の排除である場合、活性なイソタイプを使用し得る。
d)所望の結果が表面受容体を拮抗することである場合、不活性なイソタイプが使用される(Tysabri、IgG4;OKT3、変異されたIgG1;
e)所望の結果が標的細胞を除去することである場合、活性なイソタイプが使用される(Herceptin、IgG1(及び増強されたエフェクター機能を有する。);及び
f)所望の結果が、中枢神経系に入らずに循環からタンパク質を除去することである場合、IgMイソタイプが使用され得る(例えば、循環Abペプチド種の除去)。
・IgG1−アロタイプ:G1mz
・IgG1変異体−A234、A235
・IgG−アロタイプ:G2m(n−)
・κ−Km3
・λ
などの典型的な適切な重鎖及び軽鎖定常領域であるが、これらに限定されない。
所望の薬物速度論特性を有するDVD−Ig分子を作製するために、一実施形態において、同様に所望の薬物速度論特性を有する親mAbが選択される。1つの考慮事項は、モノクローナル抗体に対する免疫原性応答(すなわち、ヒト抗ヒト抗体応答;HACA、ヒト抗キメラ抗体応答)がこれらの治療剤の薬物速度論をさらに複雑にすることである。一実施形態において、得られたDVD−Igが最小限の免疫原性を有するように、又は免疫原性を有さないように、DVD−Ig分子を構築するために、最小限の免疫原性を有するモノクローナル抗体又は免疫原性を有さないモノクローナル抗体が使用される。mAbのPKを決定する要因の幾つかには、mAbの固有の特性(VHアミノ酸配列);免疫原性;FcRn結合及びFc機能が含まれるが、これらに限定されない。
同じ染色パターンは、tox種における、潜在的なヒト毒性を評価できることを示唆する。Tox種とは、無関係な毒性が研究される動物である。
所望の特異性と選択性を有するDVD−Ig分子を作製するために、同様に所望の特異性及び選択性特性を有する親mAbを作製及び選択することが必要である。
一実施形態において、適切なtox種(例えば、カニクイザル)への十分な交叉反応性を有する各抗体が選択される。親抗体は、オーソロガスな種の標的(すなわち、カニクイザル)に結合し、適切な応答(調節、中和、活性化)を惹起することが必要である。一実施形態において、オーソロガスな種の標的への交叉反応性(親和性/強度)は、ヒト標的の10倍以内とすべきである。実際に、親抗体は、マウス、ラット、イヌ、サル(及び他の非ヒト霊長類)及び疾病モデル種(すなわち、喘息モデル用のヒツジ)などの複数の種に関して評価される。親モノクローナル抗体からのtox種への許容可能な交叉反応性は、同じ種内のDVD−Ig−Igのさらなる毒性学的研究を可能にする。この理由のために、2つの親モノクローナル抗体は、共通のtox種に対して許容可能な交叉反応性を有し、従って、同じ種内でのDVD−Igの毒性学的研究を可能にすべきである。
Medarexによって開発されているMDX−070、Medarexによって開発されているMDX−018、Osidem(R)(IDM−1)並びにMedarex及びImmuno−Designed Moleculesによって開発されている抗Her2抗体、Humax(R)−CD4、Medarex及びGenmabによって開発されている抗CD4抗体、HuMax−IL15、Medarex及びGenmabによって開発されている抗IL15抗体、CNTO148、Medarex及びCentocor/J&Jによって開発されている抗TNFα抗体、CNTO1275、Centocor/J&Jによって開発されている抗サイトカイン抗体、MOR101及びMOR102、MorphoSysによって開発されている抗細胞間接着分子−1(ICAM−1)(CD54)抗体、MOR201、MorphoSysによって開発されている抗繊維芽細胞成長因子受容体3(FGFR−3)抗体、Nuvion(R)(ビシリズマブ)、Protein Design Labsによって開発されている抗CD3抗体、HuZAF(R)、Protein Design Labsによって開発されている抗γインターフェロン抗体、Protein Design Labsによって開発されている抗α5β1インテグリン、Protein Design Labsによって開発されている抗IL12、ING−1、Xomaによって開発されている抗Ep−CAM抗体、Xolair(R)(オマリズマブ)、Genentech及びNovartisによって開発されているヒト化抗IgE抗体並びにMLN01、Xomaによって開発されている抗β2インテグリン抗体(このパラグラフ中に引用されている参考文献は全て、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。)が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、治療薬には、KRN330(Kirin);huA33抗体(A33,Ludwig Institute for Cancer Research);CNTO95(αVインテグリン,Centocor);MEDI−522(αVβ3インテグリン,Medimmune);ボロシキシマブ(αVβ1インテグリン,Biogen/PDL);ヒトmAb 216(B細胞グリコシル化 エピトープ,NCI);BiTE MT103(二特異的CD19×CD3,Medimmune);4G7xH22(二重特異的BcellxFcgammaR1,Medarex/Merck KGa);rM28(二特異的CD28×MAPG、米国特許EP1444268);MDX447(EMD 82633)(二特異的CD64×EGFR,Medarex);カツマキソマブ(レモバブ)(二特異的EpCAM×抗CD3,Trion/Fres);エルツマキソマブ(二特異的HER2/CD3,Fresenius Biotech);オレゴボマブ(OvaRex)(CA−125,ViRexx);Rencarex(R)(WX G250)(炭酸脱水酵素IX、Wilex);CNTO888(CCL2,Centocor);TRC105(CD105(エンドグリン),Tracon);BMS−663513(CD137アゴニスト,Brystol Myers Squibb);MDX−1342(CD19,Medarex);シプリズマブ(MEDI−507)(CD2,Medimmune);オファツムマブ(Humax−CD20)(CD20,Genmab);リツキシマブ(Rituxan)(CD20,Genentech);ベルツズマブ(hA20)(CD20,Immunomedics);エプラツズマブ(CD22,Amgen);ルミリキシマブ(IDEC152)(CD23,Biogen);ムロモナブ−CD3(CD3,Ortho);HuM291(CD3fc受容体,PDL Biopharma);HeFi−1,CD30,NCI);MDX−060(CD30,Medarex);MDX−1401(CD30,Medarex);SGN−30(CD30,Seattle Genentics);SGN−33(リンツズマブ)(CD33,Seattle Genentics);ザノリムマブ(HuMax−CD4)(CD4,Genmab);HCD122(CD40,Novartis);SGN−40(CD40,Seattle Genentics);Campath1h(アレムツズマブ)(CD52,Genzyme);MDX−1411(CD70,Medarex);hLL1(EPB−1)(CD74.38,Immunomedics);ガリキシマブ(IDEC−144)(CD80,Biogen);MT293(TRC093/D93)(切断されたコラーゲン,Tracon);HuLuc63(CSl,PDL Pharma);イピリムマブ(MDX−010)(CTLA4,Brystol Myers Squibb);トレメリムマブ(チシリムマブ,CP−675,2)(CTLA4,Pfizer);HGS−ETRl(マパツムマブ)(DR4 TRAIL−R1アゴニスト、Human Genome Science/GlaxoSmithKline);AMG−655(DR5,Amgen);アポマブ(DR5,Genentech);CS−1008(DR5,Daiichi Sankyo);HGS−ETR2(レキサツマブ)(DR5 TRAIL−R2 アゴニスト,HGS);セツキシマブ(Erbitux)(EGFR,Imclone);IMC−11F8,(EGFR,Imclone);ニモツズマブ(EGFR,YM Bio);パニツムマブ(Vectabix)(EGFR,Amgen);ザルツムマブ(HuMaxEGFr)(EGFR,Genmab);CDX−110(EGFRvIII,AVANT Immunotherapeutics);アデカツムマブ(MT201)(Epcam,Merck);エドレコロマブ(Panorex,17−1A)(Epcam,Glaxo/Centocor);MORAb−003(葉酸受容体a、Morphotech);KW−2871(ガングリオシドGD3,Kyowa);MORAb−009(GP−9,Morphotech);CDX−1307(MDX−1307)(hCGb,Celldex);トラスツズマブ(Herceptin)(HER2,Celldex);ペルツズマブ(rhuMAb 2C4)(HER2(DI),Genentech);アポリズマブ(HLA−DRβ鎖,PDL Pharma);AMG−479(IGF−IR,Amgen);抗IGF−1R R1507(IGFl−R,Roche);CP 751871(IGF1−R,Pfizer);IMC−A12(IGF1−R,Imclone);BIIB022(IGF−IR,Biogen);Mik−β−1(IL−2Rb(CD122),Hoffman LaRoche);CNTO 328(IL6,Centocor);抗KIR(1−7F9)(Killer細胞Ig様受容体(KIR),Novo);Hu3S193(Lewis(y),Wyeth,Ludwig Institute of Cancer Research);hCBE−11(LTBR,Biogen);HuHMFGl(MUC1,Antisoma/NCI);RAV12(N結合型炭水化物エピトープ,Raven);CAL(副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTH−rP),University of California);CT−Ol1(PD1,CureTech);MDX−1106(ono−4538)(PD1,Medarex/Ono);MAb CT−011(PD1,Curetech);IMC−3G3(PDGFRa,Imclone);バビツキシマブ(ホスファチジルセリン、Peregrine);huJ591(PSMA,Cornell Research Foundation);muJ591(PSMA,Cornell Research Foundation);GC1008(TGFb(pan)阻害剤(IgG4),Genzyme);インフリキシマブ(レミケイド)(TNFa,Centocor);A27.15(トランスフェリン受容体、Salk Institute,INSERN WO 2005/111082);E2.3(トランスフェリン受容体、Salk Institute);ベバシズマブ(Avastin)(VEGF,Genentech);HuMV833(VEGF,Tsukuba Research Lab−WO/2000/034337,University of Texas);IMC−18F1(VEGFR1,Imclone);IMC−1121(VEGFR2,Imclone)が含まれる。
二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子は、2つの異なる親モノクローナル由来の2つの異なる軽鎖可変ドメイン(VL)が、組み換えDNA技術によって、直接又は短いリンカーを介して直列に連結され、その後に軽鎖定常ドメインが続くように設計される。同様に、重鎖は、直列に連結された2つの異なる重鎖可変ドメイン(VH)の後に、定常ドメインCH1及びFc領域(図1A)を含む。
本発明の結合タンパク質は、本分野で公知の多数の何れかによって作製され得る。例えば、宿主細胞からの発現において、DVD重鎖及びDVD軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって、宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中への外来DNAの導入のために一般に使用される多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞の何れの中でも、本発明のDVDタンパク質を発現することは可能であるが、真核細胞(特に、哺乳動物細胞)は、原核細胞に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性なDVDタンパク質を集合及び分泌する傾向がより大きいので、DVDタンパク質は、真核細胞中、例えば、哺乳動物宿主細胞中で発現される。
一実施形態は、標識された結合タンパク質を提供し、ここで、本発明の結合タンパク質は、別の機能的分子(例えば、ペプチド又はタンパク質)へ誘導体化され、又は連結される。例えば、本発明の標識された結合タンパク質は、別の抗体(例えば、二特異的抗体又はダイアボティ)、検出可能な因子、細胞毒性剤、薬剤及び/又は別の分子(ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど)との、結合タンパク質の会合を媒介可能なタンパク質若しくはペプチドなどの1つ又はそれ以上の他の分子実体へ、(化学的カップリング、遺伝的融合、非共有会合又はその他によって)本発明の結合タンパク質を機能的に連結することによって誘導することが可能である。
本発明の結合タンパク質は2つ又はそれ以上の抗原に結合することができるので、本発明の結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は組織免疫組織化学など慣用のイムノアッセイを用いて、(例えば、血清又は血漿などの生物学的試料中で)抗原を検出するために使用することが可能である。DVD−Igは、結合した又は結合していない抗体の検出を促進するために、検出可能な物質で直接又は間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる;及び適切な放射性材料の例には、3H1、14C、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho又は153Smが含まれる。
サイトカイン及びサイトカイン受容体(http://www.cytokinewebfacts.com/、http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi及びhttp://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF Database/cytokine.medic.kumamoto−u.ac.jp/CFC/indexR.html);
ケモカイン(http://cytokine.medic.kumamoto−u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
ケモカイン受容体及びGPCR(http://csp.medic.kumamoto−u.ac.jp/CSP/Receptor.html、http://www.gpcr.org/7tm/);
嗅覚受容体(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
受容体(http://www.iuphar−db.org/iuphar−rd/list/index.htm);
癌標的(http://cged.hgc.jp/cgi−bin/input.cgi);
潜在的な抗体標的として分泌されるタンパク質(http://spd.cbi.pku.edu.cn/);
タンパク質キナーゼ(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)並びに
ヒトCDマーカー(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD table final locked.pdf)及び(Zola H,2005 CD molecules 2005:human cell differentiation molecules Blood,106:3123−6)。
本発明のDVD−Ig分子は、様々な疾病を治療するための治療分子としても有用である。このようなDVD分子は、特定の疾病に関与する1つ又はそれ以上の標的に結合し得る。様々な疾病におけるこのような標的の例が、以下に記載されている。
C5、CCL1(1−309)、CCL11(エオタキシン)、CCL13(mcp−4)、CCL15(MIP−1d)、CCL16(HCC−4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp−1)、CCL20(MIP−3a)、CCL21(MIP−2)、CCL23(MPIF−1)、CCL24(MPIF−2/エオタキシン−2)、CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP−1a)、CCL4(MIP−1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp−3)、CCL8(mcp−2)、CXCL1、CXCL10(IP−10)、CXCLIl(I−TAC/IP−9)、CXCL12(SDFl)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA−78/LIX)、CXCL6(GCP−2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp−4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮単球活性化サイトカイン)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPRlA、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CERl、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、EL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2及びRNF110(ZNF144)など、多くのタンパク質が、一般的な自己免疫及び炎症性応答に関与していると推定されている。一態様において、本明細書に列記されている標的の1つ又はそれ以上に結合することが可能なDVD−Igが提供される。
アレルギー性喘息は、好酸球増加症、杯細胞異形成、上皮細胞の変化、気道過敏症(AHR)並びにTh2及びTh1サイトカイン発現並びに上昇した血清IgEレベルの存在によって特徴付けられる。気道炎症が、喘息の発病の基礎を成す中心的な因子であることは、現在では広く受け入れられており、T細胞、B細胞、好酸球、肥満細胞及びマクロファージなどの炎症性細胞と、サイトカイン及びケモカインなどの分泌されるこれらの媒介物質の複雑な相互作用が関与している。コルチコステロイドは、今日、喘息に対する最も重要な抗炎症性治療であるが、それらの作用機序は非特異的であり、特に、若い患者集団では、安全性についての懸念が存在する。従って、より特異的で、標的化された治療の開発が必要とされる。マウス中のIL−13が、好酸球性炎症とは独立に、AHR、粘膜の過剰分泌及び気道繊維症など、喘息の特徴の多くを模倣するという、証拠が増加している。(Finotto et al.,International Immunology(2005),17(8),993−1007;Padilla et al.,Journal of Immunology(2005),174(12),8097−8105)。
全身性疾患である関節リウマチ(RA)は、関節の滑液中の慢性的炎症反応によって特徴付けられ、軟骨の変性と隣接する関節骨を伴う。TNF、ケモカイン及び成長因子など、多くの炎症促進性サイトカインが、罹患した関節中に発現されている。抗TNF抗体又はsTNFR融合タンパク質の、RAのマウスモデルへの全身投与は、抗炎症性及び関節保護的であることが示された。RA患者中のTNFの活性が、静脈内に投与されたインフリキシマブ(キメラ抗TNFモノクローナル抗体(mAB))で遮断された臨床的調査(Harriman G,Harper LK,Schaible TF.1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab,an anti−TNFalpha treatment.Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:161−4)は、TNFがIL−6、IL−8、MCP−1及びVEGF産生、免疫及び炎症性細胞の関節中への動員、血管新生並びにマトリックスメタロプロテイナーゼ−1及び−3の血液レベルの低下を制御するという証拠を提供した。関節リウマチにおける炎症性経路をより深く理解することによって、関節リウマチに関与する他の治療標的の同定に結びついた。過去、インターロイキン−6アンタゴニスト(Chugai,Rocheによって開発されたIL−6受容体抗体MRA(Nishimoto,Norihiro et al.,Arthritis & Rheumatism(2004)、50(6),1761−1769参照))、CTLA4Ig(アダタセプト、Genovese Mc et al 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition.N Engl J Med.353:1114−23.)、及び抗B細胞療法(リツキシマブ、Okamoto H,Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis.N Engl J Med.351:1909)などの有望な治療が、無作為化された対照臨床試験において既に検査されてきた。インターロイキン−15(治療用抗体HuMax−IL 15,AMG714 Baslund,Bo et al.,Arthritis & Rheumatism(2005),52(9),2686−2692)、インターロイキン−17及びインターロイキン−18など、他のサイトカインが同定され、動物モデルにおいて有益であることが示されており、これらの因子の臨床試験が現在進行中である。抗TNF及び別の媒介物質を組み合わせた二重特異的抗体療法は、臨床的効力及び/又は患者の対象範囲を増大させる上で大きな可能性を秘めている。例えば、TNFとVEGF(何れも、RAの病態生理学に関与している。)の両方を遮断することは、炎症及び血管新生を根絶することができる可能性を秘めている。TNF及びIL−18、TNF及びIL−12;TNF及びIL−23;TNF及びIL−1β;TNF及びMIF;TNF及びIL−17;TNF及びIL−15を含む(但し、これらに限定されない。)、RAに関与している標的の他の対を、特異的DVDIgで遮断することも想定される。これらの標的対の定型的な安全性評価に加えて、免疫抑制の程度に対する特異的検査が保証され、最高の標的対を選択する上で役立ち得る(Luster et al.,Toxicology(1994),92(1−3),229−43;Descotes,et al.,Developments in biological standardization(1992),77 99−102;Hart et al.,Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001),108(2),250−257参照)。DVDIg分子が関節リウマチの治療に対して有用であるかどうかは、コラーゲンによって誘導された関節炎マウスモデルなど、前臨床動物RAモデルを用いて評価することが可能である。他の有用なモデルも本分野において周知である(Brand DD.,Comp Med.(2005) 55(2):114−22参照)。ヒト及びマウスのオルソログ(例えば、ヒト及びマウスTNF、ヒト及びマウスIL−15に対する反応性など)に対する交叉反応性に基づいて、マウスCIAモデルでの確証研究は、「合致されたサロゲート抗体」由来のDVD−Ig分子を用いて実施され得る。要約すると、2つ(又はそれ以上の)マウス標的特異的抗体を基礎とするDVD−Igを、ヒトDVD−Ig構築のために使用された親ヒト又はヒト化抗体の特徴に可能な限り合致させ得る(類似の親和性、類似の中和能、類似の半減期など)。
SLEの免疫病原性の特徴は、ポリクローナルB細胞活性化であり、これは、高グロブリン血症、自己抗体産生及び免疫複合体形成をもたらす。基本的な異常は、全般的なT細胞の調節不全のために、T細胞が禁じられたB細胞クローンを抑制できないことであるように見受けられる。さらに、B及びT細胞の相互作用は、第二のシグナルを開始する、IL−10並びにCD40とCD40L及びB7及びCD28とCTLA−4などの同時刺激分子などの幾つかのサイトカインによって促進される。これらの相互作用は、免疫複合体及びアポトーシス材料の損傷された食細胞の排除とともに、生じた組織傷害によって免疫応答を永続化させる。以下の標的がSLEに関与し得、治療的介入のためのDVD−Igアプローチのために使用できる可能性を秘めている。B細胞標的化療法:CD−20、CD−22、CD−19、CD28、CD4、CD80、HLA−DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S−6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA−A、HLA−DRA及びNT5E;同時刺激シグナル:CTLA4又はB7.1/B7.2;B細胞生存の阻害」BlyS、BAFF;補体不活化:C5;サイトカイン調節。中心的な原理は、何れかの組織中の総合的な生物応答は、炎症促進性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの局所レベル間のバランスの結果であるということである(Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550−7参照)。SLEは、血清IL−4、IL−6、IL−10の文献に報告された上昇を伴う、Th2によって誘導される疾病であると考えられる。IL−4、IL−6、IL−10、INF−a及びTNF−aからなる群から選択される1つ又はそれ以上の標的に結合することが可能なDVDIgも想定される。上で論述されている標的の組み合わせは、多数の狼瘡前臨床モデル中で検査することが可能なSLEに対して治療的な効力を増強する(Peng SL(2004) Methods Mol Med.;102:227−72参照)。ヒト及びマウスのオルソログ(例えば、ヒト及びマウスCD20、ヒト及びマウスインターフェロンαに対する反応性など)に対する親抗体の交叉反応性に基づいて、マウス狼瘡モデルでの検証研究は、「合致されたサロゲート抗体」由来のDVD−Ig分子を用いて実施され得る。要約すると、2つ(又はそれ以上の)マウス標的特異的抗体を基礎とするDVD−Igを、ヒトDVD−Ig構築のために使用された親ヒト又はヒト化抗体の特徴に可能な限り合致させ得る(類似の親和性、類似の中和能、類似の半減期など)。
多発性硬化症(MS)は、主に病因が不明である複雑なヒト自己免疫型疾病である。神経系を通じたミエリン塩基性タンパク質(MBP)の免疫学的破壊が、多発性硬化症の主要な病因である。MSは、CD4+及びCD8+T細胞による浸潤を伴う複雑な病変の疾病であり、中枢神経系内の応答の疾病である。サイトカイン、反応性窒素種及び同時刺激分子の中枢神経系中での発現は全て、MSにおいて記載されている。主に検討すべきであるのは、自己免疫の発達に寄与する免疫学的機序である。特に、Th1及びTh2細胞などの他のT細胞のバランス/調節を補助する、抗原発現、サイトカイン及び白血病相互作用並びに調節性T細胞は、治療標的の同定のための重要な領域である。
敗血症の病態生理は、グラム陰性生物(リポ多糖[LPS]、リピドA、エンドトキシン)及びグラム陽性生物(リポテイコ酸、ペプチドグリカン)の両方の外膜成分によって開始される。これらの外膜成分は、単球の表面上のCD14受容体に結合することが可能である。最近記載されたトール様受容体によって、シグナルは、その後、細胞へと伝達され、炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子α(TNF−α)及びインターロイキン−1(IL−1)の最終的な産生をもたらす。圧倒的な炎症性応答及び免疫応答は、敗血症性ショックの本質的な特徴であり、敗血症によって誘導される組織損傷、多臓器不全及び死亡の病因において中心的な役割を果たす。サイトカイン、特に、腫瘍壊死因子(TNF)及びインターロイキン(IL)−1は、敗血症性ショックの極めて重要な媒介物質であることが示されている。これらのサイトカインは、組織に対して直接的な毒性効果を有しており、ホスホリパーゼA2も活性化させる。これらの効果及び他の効果は、血小板活性化因子、一酸化窒素合成酵素活性の促進、好中球による組織浸潤の促進及び好中球活性の促進の増加した濃度をもたらす。
7.1神経変性疾患
慢性神経変性疾患は、通常、神経細胞機能の進行性の喪失(神経細胞死、脱ミエリン化)、運動性の喪失及び記憶の喪失によって特徴付けられる年齢依存性疾患である。慢性神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病)の基礎を成す機序として明らかになりつつある知見は、複雑な病因を示しており、それらの発達及び進行に、様々な要因、例えば、年齢、血糖状態、アミロイド産生及び多量体化、RAGE(AGEに対する受容体)に結合する後天的糖化終末産物(AGE)の蓄積、増加した脳の酸化的ストレス、減少した脳の血流、炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を含む神経炎症、神経細胞の機能不全及びミクログリアの活性化が寄与していることが認められている。従って、これらの慢性神経変性疾患は、複数の細胞種及び媒介物質の間で複雑な相互作用を示す。このような疾病に対する治療戦略は限られており、非特異的な抗炎症剤(例えば、コルチコステロイド、COX阻害剤)又は神経細胞の喪失及び/又はシナプス機能を抑制するための因子で炎症プロセスを遮断することが大部分を占める。これらの治療は、疾病の進行を停止させることができない。最近の研究は、可溶性A−bペプチド(A−bオリゴマー形態)に対する抗体などのより標的化された療法が、疾病の進行を停止させるのに役立つことができるのみならず、記憶を維持するのにも役立ち得ることを示唆している。これらの予備的な観察は、2以上の疾病媒介物質を標的とする特異的な療法(例えば、A−b及び炎症促進性サイトカイン(TNFなど))が、単一の疾病機序を標的化する場合に観察されたものより、慢性神経変性疾患に対して、ずっと優れた治療的効果を提供し得ることを示唆している(例えば、可溶性A−バロン)(CE.Shepherd,et al,Neurobiol Aging.2005 Oct 24;Nelson RB.,Curr Pharm Des.2005;l 1:3335;William L. Klein.;Neurochem Int.2002 ;41 :345;Michelle C Janelsins,et al.,J Neuroinflammation.2005 ;2:23;Soloman B.,Curr Alzheimer Res.2004;l:149;Igor Klyubin,et al.,Nat Med.2005;11:556−61;Arancio O,et al.,EMBO Journal(2004)1−10;Bornemann KD,et al.,Am J Pathol.2001;158:63;Deane R,et al.,Nat Med.2003;9:907−13;及びEliezer Masliah,et al.,Neuron.2005;46:857参照)。
病的機序の知見の増大に関わらず、脊髄損傷(SCI)は、なお、多大な損害を与える症状であり、高い医学的な要求を特徴とする医学的な適応症である。多くの脊髄損傷は、挫傷又は圧迫傷害であり、通常、一次損傷に続いて、最初の損傷を悪化させ、病変部位の著しい拡大(特には、10倍超)をもたらす二次的な損傷機序(炎症媒介物質、例えば、サイトカイン及びケモカイン)が起こる。SCIにおけるこれらの原発及び続発性の機序は、他の手段、例えば発作によって引き起こされた脳損傷における機序と極めて類似している。満足する治療は存在せず、メチルプレドニゾロン(MP)の高用量ボーラス注射は、損傷から8時間後という狭い時間枠内で使用される唯一の療法である。しかしながら、この治療は、顕著な機能的回復が全くなしに、続発性損傷を予防することのみを目的としている。明瞭な効果の欠如並びにその後の感染症を伴う免疫抑制及び重い組織病理学的な筋肉の変化などの重い副作用に対して大きな批判が為されている。内在性の再生能を刺激する他の薬物、生物学又は小分子は認可されていないが、有望な治療原理及び薬物候補が、近年、SCIの動物モデルにおいて有効性を示している。多くの場合、ヒトSCIにおける機能的回復の欠如は、病変部位における、瘢痕組織中、ミエリン中及び損傷を伴う細胞上における神経突起の増殖を阻害する因子によって引き起こされる。このような因子は、ミエリン随伴タンパク質NogoA、OMgp及びMAG、RGMA、瘢痕随伴CSPG(コンドロイチン硫酸プロテオグリカン)及び反応性星状膠細胞に対する阻害因子(一部のセマホリン及びエフリン)である。しかしながら、病変部位では、増殖阻害分子が見出されるのみならず、ニューロトロフィン、ラミニンL1及びその他のような神経突起成長刺激因子も見出される。阻害的な影響の低下が、バランスを、増殖阻害から増殖促進へとシフトさせ得るので、神経突起成長阻害分子及び神経突起成長促進分子のこの協調は、NogoA又はRGMAのような単一の因子を遮断することが、げっ歯類SCIモデルにおいて著しい機能回復をもたらしたことを説明し得る。しかしながら、単一の神経突起成長阻害分子を遮断することによって観察された回復は完全ではなかった。より速く、より顕著な回復を達成するためには、2つの神経突起成長阻害分子(例えば、Nogo及びRGMA)を遮断するか、又は神経突起成長阻害分子を遮断し、及び神経突起成長増強分子の機能を増強するか(例えば、Nogo及びニューロトロフィン)、又は神経突起成長阻害分子(例えば、Nogo)及び炎症促進性分子(例えば、TNF)を遮断することが、望ましい場合があり得る(McGee AW,et al.,Trends Neurosci.2003;26:193;Marco Domeniconi,et al.,J Neurol Sci.2005;233:43;Milan Makwanal,et al.,FEBS J. 2005;272:2628;Barry J. Dickson,Science.2002;298:1959;Felicia Yu Hsuan Teng,et al.,J Neurosci Res.2005;79:273;Tara Karnezis,et al.,Nature Neuroscience 2004;7,736;Gang Xu,et al.,J. Neurochem.2004;91;1018参照)。
モノクローナル抗体療法が、癌に対する重要な治療法として登場している(von Mehren M,et al 2003 Monoclonal antibody therapy for cancer. Annu Rev Med.;54:343−69)。抗体は、アポトーシス、再誘導された細胞毒性、リガンド−受容体相互作用の妨害を誘導し、又は新生物表現型にとって重大なタンパク質の発現を抑制することによって、抗腫瘍効果を発揮し得る。さらに、抗体は、腫瘍微小環境の成分を標的とすることが可能であり、腫瘍に付随する脈管構造の形成など不可欠な構造を擾乱する。抗体は、そのリガンドが増殖因子である受容体(上皮増殖因子受容体など)を標的とすることも可能である。従って、抗体は、細胞増殖を刺激する天然のリガンドが標的とされる腫瘍細胞へ結合することを阻害する。あるいは、抗体は、抗イディオタイプネットワーク、補体媒介性細胞傷害又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導し得る。2つの別個の腫瘍媒介物質を標的とする二重特異的抗体の使用は、単一特異的療法に比べて、さらなる有利さを与えるものと思われる。腫瘍疾患を治療するために、標的の以下の対に結合することができるDVDIgも想定される。IGF1及びIGF2;IGF1/2及びErb2B;VEGFR及びEGFR;CD20及びCD3、CD138及びCD20、CD38及びCD20、CD38及びCD138、CD40及びCD20、CD138及びCD40、CD38及びCD40;CD−20及びCD−19;CD−20及びEGFR;CD−20及びCD−80;CD−20及びCD−22;CD−3及びHER−2;CD−3及びCD−19;EGFR及びHER−2;EGFR及びCD−3;EGFR及びIGF1,2;EGFR及びIGF1R;EGFR及びRON;EGFR及びHGF;EGFR及びc−MET;HER−2及びIGF1,2;HER−2及びIGF1R;RON及びHGF;VEGF及びEGFR;VEGF及びHER−2;VEGF及びCD−20;VEGF及びIGF1,2;VEGF及びDLL4;VEGF及びHGF;VEGF及びRON;VEGF及びNRPL;CD20及びCD3;VEGF及びPLGF;DLL4及びPLGF;ErbB3及びEGFR;HGF及びErbB3,HER−2及びErbB3;c−MET及びErbB3;HER−2及びPLGF;HER−2及びHER−2。
本発明は、本発明の結合タンパク質と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。本発明の結合タンパク質を含む医薬組成物は、疾患を診断し、検出し、若しくはモニタリングし、疾患又は1つ若しくはそれ以上のその症候を予防し、治療し、管理し、若しくは軽減する上で、及び/又は研究において使用されるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、1つ又はそれ以上の本発明のタンパク質を含む。別の実施形態において、医薬組成物は、1つ又はそれ以上の本発明の結合タンパク質と、及び疾患を治療するための、本発明の結合タンパク質以外の1つ又はそれ以上の予防又は治療剤とを含む。一実施形態において、予防剤又は治療剤は、疾患又は1つ若しくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理又は軽減に有用であることが知られており、又は疾患又は1つ若しくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理又は軽減においてこれまで使用されており、若しくは現在使用されている。これらの実施形態に従えば、組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
本明細書中の開示は、診断的用途も提供する。これは、以下でさらに明解にされる。
本開示は、本明細書に記載されている少なくとも1つのDVD−Igを用いて、検査試料中の分析物(又はその断片)の存在、量又は濃度を測定するための方法も提供する。本分野において公知であるあらゆる適切なアッセイを前記方法において使用することができる。例には、サンドイッチイムノアッセイ(放射性同位体検出(ラジオイムノアッセイ(RIA))及び酵素検出(酵素イムノアッセイ(EIA)又は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)(例えば、Quantikine ELISAアッセイ、R&DSystems、Minneapolis、MN))を含む、例えば、モノクローナル、ポリクローナル及び/又はDVD−Igサンドイッチイムノアッセイ又はそのあらゆる変形(例えば、モノクローナル/DVD−Ig、DVD−Ig/ポリクローナルなど))、競合阻害イムノアッセイ(例えば、フォワード及びリバース)、蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA;fluorescence polarization immunoassay)、酵素多重化イムノアッセイ技術(EMIT;enzyme multiplied immunoassay technique)、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET);及び均質な化学発光アッセイなどのイムノアッセイが含まれるが、これらに限定されない。SELDIをベースとするイムノアッセイでは、目的の分析物(又はその断片)を特異的に結合する捕捉試薬が、予め活性化されたタンパク質チップアレイなどの、質量分析プローブの表面に付着される。次いで、分析物(又はその断片)は、バイオチップ上に特異的に捕捉され、捕捉された分析物(又はその断片)は、質量分析によって検出される。あるいは、分析物(又はその断片)は捕捉試薬から溶出され、伝統的なMALDI(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化)によって又はSELDIによって検出することができる。化学発光微粒子イムノアッセイ、特に、ARCHITECT(R)自動化分析装置(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)を使用するものは、好ましいイムノアッセイの一例である。
(b)工程(a)で測定された分析物(又はその断片)の濃度又は量を所定のレベルと比較し、工程(a)で測定された分析物の濃度又は量が所定のレベルに関して好ましければ、対象は所定の疾病、疾患若しくは症状を有しておらず、又はこれらに対するリスクを有していないと決定される工程。しかしながら、工程(a)において測定された分析物の濃度又は量が所定のレベルに関して好ましくなければ、対象は、所定の疾病、疾患若しくは症状を有しており、又はこれらに対するリスクを有していると決定される。
(a)対象から得られた検査試料中の分析物の濃度又は量を測定する工程;
(b)前記対象から得られたより後の検査試料中の分析物の濃度又は量を測定する工程;及び
(c)工程(b)で測定された分析物の濃度又は量を工程(a)で測定された分析物の濃度又は量と比較し、工程(a)で測定された分析物の濃度又は量と比較したときに、工程(b)で測定された濃度又は量が変化せず又は好ましくなければ、対象中の疾病は継続し、進行し、又は悪化したと決定される。比較すると、工程(a)で測定された分析物の濃度又は量と比較したときに、工程(b)で測定された分析物の濃度又は量が好ましければ、対象中の疾病は継続せず、後退し、又は改善したと決定される。
検査試料中の分析物(又はその断片)の存在、量又は濃度に関して検査試料をアッセイするためのキットも提供される。キットは、分析物(又はその断片)に関して検査試料をアッセイするための少なくとも1つの成分及び分析物(又はその断片)に関して検査試料をアッセイするための指示書を含む。分析物(又はその断片)に関して検査試料をアッセイするための少なくとも1つの成分は、場合によって固相上に固定化された抗分析物DVD−Ig(又はその断片、変形物若しくは変形物の断片)を含む組成物を含み得る。
キット(又はその成分)及びアッセイ(本明細書中に記載されているイムノアッセイなど)によって検査試料中の分析物の存在、量又は濃度を測定する方法は、例えば、米国特許第5,089,424号及び米国特許第5,006,309号に記載されているように、並びに例えば、ARCHITECT(R)としてAbbott Laboratories (Abbott Park,IL)によって市販されているように、様々な自動化及び半自動化された系(固相が微粒子を含む系を含む。)で使用するために改変することができる。
実施例1.1:親抗体及びDVD−Igを同定及び性質決定するために使用されたアッセイ
別段の記載がなければ、実施例を通じて、親抗体及びDVD−Igを同定及び性質決定するために、以下のアッセイを使用した。
実施例1.1.1A:直接結合ELISA
所望の標的抗原を結合する抗体に関してスクリーニングするための酵素結合免疫吸着検定法を以下のように行った。所望の標的抗原(R&D Systems,Minneapolis,MN)又は所望の標的抗原細胞外ドメイン/FC融合タンパク質(R&D Systems,Minneapolis,MN)又はリン酸緩衝化された生理的食塩水(10×PBS、Abbott Bioresearch Center,Media Prep# MPS−073,Worcester,MA)中のモノクローナルマウス抗ポリヒスチジン抗体(R&D Systems # MAB050,Minneapolis,MN)の10μg/mLの100μL/ウェルで、4℃で一晩、High bind ELISAプレート(Corning Costar # 3369,Acton,MA)を被覆した。0.02%Tween20を含有するPBSで、プレートを4回洗浄した。室温で1/2時間、300μL/ウェルのブロッキング溶液(無脂肪ドライミルク粉末、様々な小売業者、PBS中に2%になるように希釈)の添加によってプレートをブロッキングした。ブロッキングの後、0.02%Tween20を含有するPBSで、プレートを4回洗浄した。
抗ヒトFc抗体(PBS中5μg/mL、Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)とともに、ELISAプレート(Nunc,MaxiSorp,Rochester,NY)を4℃で一晩温置した。洗浄緩衝液(0.05%Tween20を含有するPBS)中で、プレートを3回洗浄し、ブロッキング緩衝液(1%BSAを含有するPBS)中において、25℃で1時間ブロッキングした。ウェルを3回洗浄し、0.1%BSAを含有するPBS中の各抗体又はDVD−Igの系列希釈をウェルに添加し、25℃で1時間温置した。ウェルを3回洗浄し、ビオチン化されたVEGF(2nM)をプレートに添加し、25℃で1時間温置した。ウェルを3回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン−HRP(KPL #474−3000,Gaithersburg,MD)とともに、25℃で1時間温置した。ウェルを3回洗浄し、ウェル当りULTRA−TMBELISA(Pierce,Rockford,IL)の100μLを添加した。呈色後、1NHClを用いて反応を停止させ、450nmでの吸光度を測定した。VEGF捕捉ELISAデータは、表7に示されている。
PBS(Gibco #10010−023 from Invitrogen,Grand Island,NY)中のヤギ抗ヒトIgGFc特異的抗体(Jackson Immunoresearch # 109−055−098,West Grove,PA,50μL/ウェル)2μg/mLで、96ウェルのNunc−Immunoプレートを被覆し、4℃で一晩温置した。洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween20)でプレートを3回洗浄し、その後、室温で1時間、ブロッキング緩衝液(PBS、2%BSA)の100μL/ウェルでブロッキングした。プレートを3回洗浄し、室温で1時間、適切な抗体又はDVD−Igの1μg/mL溶液の50μL/ウェルとともに温置した。1時間の温置後、プレートを3回洗浄し、hisタグ付加された組換えRONタンパク質(R&D Systems # 1947−MS,Minneapolis,MN、1000nMから0nMの最終用量範囲)の50μL/ウェルとともに、室温で1時間温置した。プレートを3回洗浄し、ウサギ抗Hisタグ−HRP抗体(Abeam ab1187,Cambridge,MA、2%BSA/PBS溶液中に1:10,000で希釈)の50μL/ウェルを添加し、室温で1時間、プレートを温置した。最終洗浄後、TMB基質(Pierce #34028,Rockford,IL)の50μL/ウェルを添加し、2NH2SO4の50μL/ウェルを用いて、5分後に反応を停止した。450nmで、吸光度を読み取った(Spectra Max Plus plate reader,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。GraphPad Prism 4.03で、EC50を計算した。RON捕捉ELISAデータは、表7に示されている。
D−PBS(Gibco #14190,San Diego,CA)中のヒトIgGに対する抗体5μg/mL(Fcγ断片特異的、Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA #109−005−098、100μL/ウェル)を用いて、96ウェルのNunc−Immunoプレートを被覆し、4℃で一晩温置した。洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween20)中でELISAプレートを3回洗浄し、次いで、25℃で1時間、200μL/ウェルのブロッキング緩衝液(D−PBS、1%BSA)でブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、37℃で1時間、100μg/ウェルの抗体又はDVD−Ig(ブロッキング緩衝液中の0.01μg/mLから100μg/mL)とともに温置した。次いで、プレートを3回洗浄し、37℃で1時間、ビオチン標識されたヒトIGF1又はIGF2(ブロッキング緩衝液中の0.02nMから100nMの用量範囲、100μL/ウェル)とともに温置した。プレートを3回洗浄し、HRPが連結されたストレプトアビジン(KPL #474−3000,Gaithersburg,MD、ブロッキング緩衝液中に1:10,000希釈、100μL/ウェル)とともに、25℃で1時間温置した。最終の洗浄後、100μL/ウェルのELISA基質(1−Step Ultra TMB−ELISA,Pierce #340280,Rockford,IL)とともに、プレートを温置した。
25℃で5分後に、2NH2SO4の50μL/ウェルを用いて反応を停止させ、450nmで吸光度を読み取った。IGF1,2捕捉ELISAデータは、表7に示されている。
D−PBS(Gibco #14190,Grand Island,NY)中のヒトIgGに対する抗体5μg/mL(Fc断片特異的、Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA #109−005−098、100μL/ウェル)を用いて、96ウェルのNunc−Immunoプレート(#439454,Rochester,NY)を被覆し、4℃で温置した。洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween20)でELISAプレートを3回洗浄し、次いで、25℃で1時間、200μL/ウェルのブロッキング緩衝液(D−PBS、1%BSA、1mMCaCl2、0.05%、Tween20)によってブロッキングした。プレートを3回洗浄し、100μL/ウェルのDLL4抗体(0.0001から100nM、ブロッキング緩衝液中に10倍系列希釈)とともに25℃で1時間温置し、次いで、再び3回洗浄した。捕捉されたDLL4Abを含有するプレートを、ビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(ブロッキング緩衝液中10nM、100μL/ウェル)とともに25℃で1時間温置し、3回洗浄し、HRPが連結されたストレプトアビジン(KPL#474−3000)とともに温置し、3回洗浄し、HRPが連結されたストレプトアビジン(KPL#474−3000、Gaithersburg,MD、ブロッキング緩衝液中に1:10,000希釈、100μL/ウェル)とともに25℃で1時間温置した。最終の洗浄後、100μL/ウェルのELISA基質(1−Step Ultra TMB−ELISA,Pierce #340280,Rockford,IL)とともに、プレートを温置した。25℃で2分後に、2NH2SO4の100μL/ウェルを用いて反応を停止させ、450nmで吸光度を読み取った。DLL4捕捉ELISAデータは、表7に示されている。
33nMの濃度のヤギ抗ヒトIgGFc(Jackson Immunoresearch,PA)で96ウェルELISAプレートを被覆し、4℃で一晩温置した。0.05%Tween20を含有するPBSでプレートを3回洗浄し、室温で1時間、1%BSA/PBSの200μL/ウェルでブロックした。5nMDVD−Ig又は抗体50μLを各ウェルに添加し、室温で1時間温置した。プレートを洗浄し、次いで、室温で1時間、様々な濃度のビオチン化されたErbB3又はビオチン化されたEGFRの50μL/ウェルとともに温置した。プレートを再び洗浄し、次いで、ストレプトアビジンが連結されたHRP(KPL #474−3000,Protein Research Products,MD)の50μL/ウェルとともに温置し、室温で1時間温置した。ウェルを3回洗浄し、ウェル当りULTRA−TMBELISA(Pierce,Rockford,IL)の100μLを添加した。呈色後、1NHClを用いて反応を停止させ、450nmでの吸光度を測定した。
BIACOREアッセイ(Biacore,Inc,Piscataway,NI)は、on速度及びoff速度定数の速度論的測定を用いて、抗体又はDVD−Igの親和性を測定する。標的抗原(例えば、精製された組換え標的抗原)への抗体又はDVD−Igの結合は、25℃で走行HBS−EP(10mMHEPES[pH7.4]、150mMNaCl、3mMEDTA及び0.005%界面活性剤P20)を使用して、Biacore(R)1000又は3000装置(Biacore(R)AB,Uppsala,Sweden)を用いる表面プラズモン共鳴を基礎とする測定によって測定される。全ての化学物質は、Biacore(R)AB(Uppsala,Sweden)又は本文中に記載されている別の入手先から取得した。例えば、製造業者の指示書に従う標準的なアミンカップリングキット及び25μg/mLでの操作を用いて、CM5研究等級バイオセンサーチップを横切って、10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中に希釈されたヤギ抗マウスIgG、(Fcγ)断片特異的ポリクローナル抗体(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL)の約5000RUを直接固定化する。バイオセンサー表面上の未反応部分は、エタノールアミンでブロックする。フローセル2及び4中の修飾されたカルボキシメチルデキストラン表面は、反応表面として使用する。フローセル1及び3中のヤギ抗マウスIgGなしの修飾されていないカルボキシメチルデキストランは参照表面として使用する。速度論的分析のために、Biaevaluation4.0.1ソフトウェアを用いて、8つの注射全ての会合及び解離相へ、(グローバルフィット解析を用いて)1:1のLangmuir結合モデルから誘導される速度方程式を同時にフィッティングさせる。ヤギ抗マウスIgG特異的な反応表面を横切る捕捉のために、HEPESによって緩衝化された生理的食塩水中に、精製された抗体又はDVD−Igを希釈する。リガンド(25μg/mL)として捕捉されるべき抗体又はDVD−Igを、5μL/分の流速で反応マトリックス上に注入する。25μL/分の継続的な流速下で、会合及び解離速度定数kon(M−1s−1)及びkoff(s−1)を測定する。10から200nMの範囲の異なる抗原濃度で速度論的結合測定を行うことによって、速度定数が導かれる。次いで、以下の式:KD=koff/konによって速度論的速度定数から抗体又はDVD−Igと標的抗原間での反応の平衡解離定数(M)を計算する。結合は、時間の関数として記録され、速度論的速度定数が計算される。このアッセイでは、最大106M−1S−1の速さのon速度及び最小10−6s−1までの遅さのoff速度を測定することができる。
実施例1.1.2.A:サイトカインバイオアッセイ
抗サイトカイン又は抗成長因子配列を含有する抗サイトカイン又は抗成長因子親抗体又はDVD−Igが標的サイトカイン又は成長因子の生物活性を阻害又は中和する能力は、抗体又はDVD−Igの阻害能力を測定することによって分析される。例えば、抗IL−4抗体がIL−4媒介性IgE産生を阻害する能力が使用され得る。例えば、ヒトナイーブB細胞は、それぞれ、Ficoll−paque密度遠心による軟膜、続いて、ヒトsIgDFITC標識されたヤギF(ab)2抗体に対して特異的なMACSビーズ(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)、続いて、抗FITCMACSビーズを用いる磁気分離によって、末梢血から単離される。3×105細胞/mLになるように、磁気的に分別されたナイーブB細胞をXV15中に調整し、37℃、5%CO2存在下での培養の10日の間に、PBSが充填されたウェルによって取り囲まれたプレートの中心に、6×6アレイで、96ウェルプレートの100μL/ウェル中に播種した。検査されるべき抗体当り、それぞれ非誘導及び誘導対照の3ウェルからなるそれぞれ1つのプレートを調製し、7μg/mLから始まり、29ng/mLの最終濃度まで3倍希釈で行う抗体滴定の5つ組みの反復を、希釈前の4倍濃縮された50μL中に添加した。IgE産生を誘導するために、20ng/mLのrhIL−4+0.5μg/mLの最終濃度の抗CD40モノクローナル(Novartis,Basel,Switzerland)をそれぞれ50μLで、各ウェルに添加し、標準的なサンドイッチELISA法によって、培養期間の終了時にIgE濃度を測定する。
親抗体又はDVD−Igがサイトカイン放出を引き起こす能力が分析される。ヘパリン処理されたvacutainer管の中に、静脈穿刺によって、3人の健康なドナーから末梢血を採取する。RPMI−1640培地で全血を1:5希釈し、0.5mL/ウェルで、24ウェルの組織培養プレート中に配置した。抗サイトカイン抗体(例えば、IL−4)をRPMI−1604中に希釈し、0.5mL/ウェルでプレート中に配置して、200、100、50、10及び1μg/mLの最終濃度を得た。培養プレート中の全血の最終希釈は、1:10である。サイトカイン放出に対する陽性対照として、2μg/mL及び5μg/mLの最終濃度で、LPS及びPHAを別々のウェルに添加する。陰性対照抗体として、ポリクローナルヒトIgGを使用する。実験は、2つ組みで行う。37℃、5%CO2でプレートを温置する。24時間後、ウェルの内容物を試験管の中に移し、1200rpmで5分間遠心する。無細胞上清を集め、サイトカインアッセイのために凍結した。プレート上及び管中に残った細胞を溶解溶液0.5mLで溶解し、−20℃に配置し、融解する。(容量を無細胞上清試料と同じレベルにするために)培地0.5mLを添加し、細胞調製物を集め、サイトカインアッセイのために凍結する。ELISAによって、サイトカインレベルに関して(例えば、IL−8、IL−6、IL−1β、IL−1RA又はTNF−αのレベルに関して)無細胞上清及び細胞可溶化液をアッセイする。
目的のサイトカインに対して誘導された抗サイトカイン親抗体又はDVD−Igが他のサイトカインと交叉反応する能力を分析する。Biacoreバイオセンサーマトリックス上に、親抗体又はDVD−Igを固定化する。まず、100mMN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び400mMN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)でマトリックス上のカルボキシル基を活性化することによって、遊離のアミノ基を介して、抗ヒトFcmAbをデキストランマトリックスに共有結合させる。酢酸ナトリウムpH4.5中に希釈された25μg/mLの濃度の各抗体又はDVD−Ig調製物の約50μLを、活性化されたバイオセンサーを横切って注入し、タンパク質上の遊離アミンを活性化されたカルボキシル基に直接結合させる。典型的には、5000共鳴単位(RU)を固定化する。未反応のマトリックスEDC−エステルは、1Mエタノールアミンの注入によって不活化させる。標準的なアミンカップリングキットを用いてヒトIgG1/Kを固定化することによって、参照標準として第二のフローセルを調製する。CMバイオセンサーチップを用いて、SPR測定を行う。バイオセンサー表面上の分析すべき全ての抗原を、0.01%P20を含有するHBS−EP走行緩衝液中に希釈する。
組織交叉反応性研究は、32の組織の凍結切片を含む第一の段階、最大38の組織を含む第二の段階及び以下に記載されているように、3人の無関係な成人から得られたさらなる組織を含む第三の段階という3つの段階で行われる。研究は、典型的には、2つの投薬レベルで行われる。
アッセイのために播種する前に、正常なヒト臍帯血管内皮細胞又はHUVEC(経代2から6)を、EGM−2SingleQuots (Lonza−Clonetics,Walkersville,MD,#CC−4176)が補充されたEBM−2(Lonza−Clonetics,Walkersville,MD)中に維持した。成長因子の不存在下で0.1%FBSを加えた(100μLの)EMB−2中、コラーゲンが被覆された黒い96ウェルプレート上に、10,000細胞/ウェルで、HUVEC細胞を播種した。翌日、成長因子の不存在下で、培地を0.1%FBSと交換した。翌日、EMB−2の100μL(成長因子又は血清なし)と培地を交換し、VEGF及び抗体/DVD−Igを添加する前に、4時間温置した。(67nM、6.7nM及び0.67nMの最終濃度の)抗VEGFモノクローナル抗体又はDVD−Igを、0.1%BSAを加えたEMB−2中に希釈し、組換えヒトVEGF165(50ng/mL)とともに、50μL、25℃で1時間、事前温置した。次いで、細胞(50μL)に抗体/DVD−Ig及びVEGF混合物を添加し、加湿された5%CO2雰囲気中において、72時間、37℃で、プレートを温置した。製造業者の指示書に従って、ATPliteキット(Perkin Elmer,Waltham,MA)を用いてATPレベルを評価することによって、細胞の生存/増殖を間接的に測定した。表10は、HUVECの増殖/生存の阻害を示すデータを与える。
D−PBS−BSA(0.1%BSAを加えたダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水)20μL中に希釈されたIGF1,2モノクローナル抗体又はDVD−Igを、200μL中、0.01μg/mLから100μg/mLの最終濃度のヒト腫瘍細胞に添加した。37℃で、加湿された5%CO2雰囲気中において、3日間、プレートを温置した。腫瘍増殖阻害の%を測定するために、製造業者の指示書(Promega,Madison,WI)に従って、MTS試薬を用いて、各ウェル中の生きた細胞の数を定量した。抗体処理なしのウェルは0%阻害の対照として使用されたのに対して、細胞なしのウェルは100%阻害を示すと考えた。
D−PBS−BSA(0.1%BSAを加えたダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水)20μL中に希釈されたEGFRモノクローナル抗体又はDVD−Igを、180μL中、0.01μg/mLから100μg/mLの最終濃度のヒト腫瘍細胞に添加した。37℃で、加湿された5%CO2雰囲気中において、3日間、プレートを温置した。腫瘍増殖阻害の%を測定するために、製造業者の指示書(Promega,Madison,WI)に従って、MTS試薬を用いて、各ウェル中の生きた細胞の数を定量した。抗体処理なしのウェルは0%阻害の対照として使用されたのに対して、細胞なしのウェルは100%阻害を示すと考えた。
D−PBS−BSA(0.1%BSAを加えたダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水)20μL中に希釈されたHER2モノクローナル抗体又はDVD−Igを、0.01μg/mLから100μg/mLの最終濃度のHER2発現ヒト腫瘍細胞(BT474)(180μL)に添加した。37℃で、加湿された5%CO2雰囲気中において、3日間、プレートを温置した。腫瘍増殖阻害の%を測定するために、製造業者の指示書(Promega,Madison,WI)に従って、MTS試薬を用いて、各ウェル中の生きた細胞の数を定量した。抗体処理なしのウェルは0%阻害の対照として使用されたのに対して、細胞なしのウェルは100%阻害を示すと考えた。
D−PBS(Gibco #14190,Grand Island,NY)中、5μg/mLのヒトDLL4細胞外ドメイン100μL/ウェルで96ウェル組織培養プレートを被覆し、4℃で一晩温置した。D−PBSでプレートを1回洗浄し、抗体又はDVD−Igの不存在下又は存在下で、4000EA.hy926細胞/ウェルを播種した。CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen,#C35007,Eugene,OR)を用いて、4日後に、細胞増殖を測定した。製造業者の推奨(R&D Systems #DVR100B,Minneapolis,MN)に従って、ELISAキットによって、馴化培地中でのsVEGFR1の発現を検出した。細胞増殖の差を考慮するために、CyQUANTアッセイによって測定されたRFUに対して、sVEGFR1のレベルを標準化した。
腫瘍細胞上の標的抗原に結合する親抗体又はDVD−Igは、殺腫瘍活性に関して分析され得る。簡潔に述べると、D−PBS−BSA(0.1%BSAを加えたダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水)中に希釈された親抗体又はDVD−Igを、200μL中、0.01μg/mLから100μg/mLの最終濃度のヒト腫瘍細胞に添加した。37℃で、加湿された5%CO2雰囲気中において、3日間、プレートを温置する。腫瘍増殖阻害の%を測定するために、製造業者の指示書(Promega,Madison,WI)に従って、MTS試薬を用いて、各ウェル中の生きた細胞の数を定量する。抗体処理なしのウェルは0%阻害の対照として使用されるのに対して、細胞なしのウェルは100%阻害を示すと考えた。
5%ウシ胎児血清が補充されたRPMI培地中、96ウェルの皿に、100μL中、2,000細胞/ウェルでU87−MGヒト神経膠腫瘍細胞を播種し、37℃、5%CO2で一晩温置した。翌日、抗体又はDVD−Ig(0.013nMから133nMの用量範囲)の系列希釈で細胞を処理し、37℃で、加湿された5%CO2雰囲気中において、5日間温置した。製造業者の指示書に従って、ATPliteキット(Perkin Elmer,Waltham,MA)を用いてATPレベルを評価することによって、細胞の生存/増殖を間接的に測定した。
抗MSPα鎖抗体(R&D Systems #MAB352,Minneapolis,MN,2μg/mL)50μL/ウェルで、96ウェルプレートを被覆し、プレートを4℃で一晩温置した。洗浄緩衝液(0.05%Tween20を含有するPBS)でプレートを3回洗浄し、その後、25℃で1時間、ブロッキング緩衝液(2%BSAを含有するPBS)の100μL/ウェルでブロッキングした。次いで、プレートを3回洗浄し、組換えヒトMSP1(R&D Systems #352−MS,Minneapolis,MN)の10nM溶液の50μL/ウェルとともに、25℃で1時間温置した。プレートの温置の間、検査されるべき抗体の系列10倍希釈物(0nMから1000nMの用量範囲)を、25℃で1時間、10nM組換えHis−RONpartial ECD(R&D Systems #1947−MS,Minneapolis,MN)とともに事前温置した。組換えヒトMSP1とともに温置されたプレートを3回洗浄し、次いで、抗体/His−RON複合体の50μL/ウェルを3つ組みで添加した。25℃での1時間の温置の後、次いで、プレートを洗浄し、TMB基質(Pierce #34028,Rockford,IL)の50μL/ウェルを添加し、25℃で5分間温置した。2NH2SO4の50μL/ウェルを用いて、5分後に反応を停止させた。450nmで、吸光度を読み取った(Spectra Max Plus plate reader,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。GraphPad Prism 4.03で、EC50を計算した。結果は、下表17に記載されている。
組換えVEGFR1細胞外ドメイン−Fc融合タンパク質(5μg/ml,R&D systems,Minneapolis,MN)を含有するPBS100μLとともに、ELISAプレート(Nunc,MaxiSorp,Rochester,NY)を4℃で一晩温置した。洗浄緩衝液(0.05%Tween20を含有するPBS)中で、プレートを3回洗浄し、ブロッキング緩衝液(1%BSAを含有するPBS)中において、25℃で1時間ブロッキングした。0.1%BSAを含有するPBS中の各抗体/DVD−Igの系列希釈物を、25℃で1時間、2nMのビオチン化されたVEGFの50μLとともに温置した。次いで、抗体/DVD−Ig−ビオチン化VEGF混合物(100μL)をVEGFR1−Fc被覆されたウェルに添加し、25℃で10分間温置した。ウェルを3回洗浄し、次いで、ストレプトアビジンーHRP(KPL #474−3000,Gaithersburg,MD)100μLとともに、25℃で1時間温置した。ウェルを3回洗浄し、ウェル当りULTRA−TMBELISA(Pierce,Rockford,IL)の100μLを添加した。呈色後、1NHClを用いて反応を停止させ、450nmでの吸光度を測定した。結果は、下表17に記載されている。
96ウェルのNunc−Immunoプレート(Nunc,#439454,Rochester,NY)を、16nMヒトNotch−1(R&D Systems #3647−TK,Minneapolis,MN,D−PBS中100μl/ウェル)で被覆し、4℃で一晩温置した。次いで、洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween20)でプレートを1回洗浄し、25℃で1時間、200μL/ウェルのブロッキング緩衝液(D−PBS、1%BSA、1mMCaCl2、0.05%、Tween20)によってブロッキングした。ブロッキングの間、ビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(14nM)300μLを、抗体又はDVD−Ig(3.4pMから66nM、ブロッキング緩衝液中に3倍系列希釈)と、25℃で1時間混合した。ブロッキング後、アッセイプレートを洗浄し、DLL4抗体又はDVD−Ig混合物(100μL/ウェル、25℃で1時間)とともに温置した。プレートを再び洗浄し、HRPが連結されたストレプトアビジン(KPL #474−3000,Gaithersburg,MD、ブロッキング緩衝液中に1:10,000希釈)100μL/ウェルを25℃で1時間添加した。最後の洗浄後、100μL/ウェルの基質(1−Step Ultra TMB−ELISA,Pierce #340280,Rockford,IL)を用いて、プレートを呈色させ、25℃で10から20分の温置を行った後、100μL/ウェルの2NH2SO4を用いて反応を停止させ、吸光度を450nmで読み取った。結果は、下表17に記載されている。
4℃で一晩、組換えヒトHGF(PBS中のHGF2μg/mL、R&Dsystems)の100μL/ウェルで、ELISAプレート(Nunc,MaxiSorp)を被覆した。各抗体/DVD−Ig及び2nM可溶性c−MetFc融合物(R&D systems)(50μL)の系列希釈物を同時に温置し、HGFによって被覆されたウェルに添加した。ビオチン化された抗c−Met(BAF358、R&D Systems)及びストレプトアビジン−HRP(KPL)100μLを用いて、c−Met結合を検出した。PBST(0.05%Tween20を含有するPBS)中で、ウェルを3回洗浄し、ウェル当りULTRA−TMBELISA(Pierce)100μLを添加した。呈色後、1NHClを用いて反応を停止させ、450nmでの吸光度を測定した。最大シグナル(対照抗体を添加又は抗体を添加せず)と比較したパーセント阻害を計算することによって、データを評価し、IC50値を計算した。
無血清培地(DMEM+0.1%BSA)180μL中に、40,000細胞/ウェルで、96ウェルプレート中に、ヒト癌腫細胞を播種し、37℃、5%CO2で一晩温置した。IGFR捕捉Ab(R&D Systems cat #MAB391,Minneapolis,MN,4μg/mLの最終濃度)の100μLとともにCostarEIAプレート(Lowell,MA)を被覆し、振盪しながら、室温で一晩温置した。翌日、IGFR抗体で被覆されたELISAプレートを洗浄し(PBST=PBS、pH7.2から7.4中の0.05%Tween20で3回)、振盪装置上にて、室温で2時間、ブロッキングするために、ブロッキング溶液200μL(PBS、pH7.2から7.4中の1%BSA、0.05%NaN3)を添加した。ヒト腫瘍細胞を、抗体又はDVD−Ig及びIGFリガンドと同時に温置した。D−PBS−BSA(0.1%BSAを加えたダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水)中に希釈されたIGF1,2モノクローナル抗体又はDVD−Igを、0.01μg/mLから100μg/mLの最終濃度のヒト癌腫細胞に添加した。1から100ngの濃度で(200μL)、成長因子(IGF1及びIGF2)を細胞に同時に添加し、37℃で、加湿された5%CO2雰囲気において、細胞を1時間温置した。冷細胞抽出緩衝液(10mMTris、pH7.4、100mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1mMNaF、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%Triton X−100、10%グリセロール、0.1%SDS及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)120μL/ウェル中に細胞を溶解し、振盪しながら、4℃で20分間温置した。ELISAプレートに、細胞可溶化液(100μL)を添加し、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩温置した。翌日、ELISAプレートを洗浄し、pTyr−HRP検出Abの100μL/ウェルを添加し(p−IGF1R ELISAキット、R&D System # DYC1770,Minneapolis,MN)、暗所にて、25℃で2時間、プレートを温置した。製造業者の指示書に従って、ホスホ−IGF1Rを測定するために、プレートを呈色させた。結果が、表18及び19に示されている。
96ウェルプレート中に、20,000細胞/ウェルで(100μLの総容量)、H1299非小細胞肺腫瘍細胞を播種し、37℃、5%CO2で、18時間、血清を飢餓状態にした。(67nM、6.7nM及び0.67nMの最終濃度の)抗HGFモノクローナル抗体又はDVD−Igを0.1%BSAを含有するダルベッコの最小必須培地中に希釈し、組換えヒトHGF(50ng/mL)とともに、50μL、25℃で1時間、事前温置した。次いで、これらの抗体/DVD−Ig及びHGF混合物(50μL)を細胞に添加し、加湿された5%CO2雰囲気中において、37℃で、約15分間、プレートを温置した。次いで、7.6%ホルムアルデヒドの等容量を各ウェルに添加することによって、細胞を固定し、25℃で15分間、プレートを温置した。固定後、0.1%TritonX−100を含有するPBS中で、細胞を5回洗浄した。次いで、ウェル当りLI−COR Odyssey Blocking Buffer(Li−Cor Biosciences,Lincoln,NE)の150μLで、細胞を処理し、穏やかに振盪しながら、室温で90分間温置した。ブロッキング緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液中に希釈された一次抗体(1:300希釈ホスホSer473−Akt、Cell Signaling Technology #4060,Boston,MA)とともに、4℃で一晩温置した。次いで、0.1%Tween20を含有するPBSで、ウェルを5回洗浄し、次いで、二次抗体(0.2%Tween20を加えた1×PBS中の抗ウサギIRDyeTM680CWLI−COR(Li−Cor Biosciences,Lincoln,NE)の1:400希釈)とともに、25℃で1時間温置した。0.1%Tween20を含有するPBSとともに、細胞を5回洗浄し、Odyssey Infrared Imaging Systemを用いて画像化した。
10%FBSが補充されたDMEM中、96ウェルプレート中に、20,000細胞/ウェル(100μL)で、ヒトVEGFR2(KDR)を発現するNIH3T3細胞を播種した。翌日、DMEMで細胞を2回洗浄し、FBSなしのDMEM中で3時間、血清飢餓状態にした。0.1%BSAを加えたDMEM中に希釈された(67nM、6.7nM及び0.67nMの最終濃度の)抗VEGF親抗体又はDVD−Igを、組換えヒトVEGF165(50ng/mL)とともに、25℃で1時間、事前温置した。次いで、これらの抗体/DVD−Ig及びVEGF混合物を細胞に添加し、加湿された5%CO2雰囲気中において、37℃で約10分間、プレートを温置した。氷冷されたPBSで、細胞を2回洗浄し、0.1%NP40が補充されたCell Lysis Buffer (Cell Signaling,Boston,MA)の100μL/ウェルの添加によって溶解した。2つ組みの試料をプールし、抗VEGFR2抗体(R&D systems,AF357,Minneapolis,MN)で予め被覆されたELISAプレートのウェルに170μLを添加し、穏やかに振盪しながら、25℃で2時間温置した。洗浄緩衝液(0.05%Tween20を含有するPBS)で、ウェルを5回洗浄し、ビオチン化された抗ホスホチロシン抗体(4G10;Millipore,Billerica,MA)の1:2000希釈50μLとともに、25℃で1時間温置した。0.05%Tween20を含有するPBSで、ウェルを5回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン−HRP(KPL #474−3000,Gaithersburg,MD)とともに、25℃で1時間温置した。ストレプトアビジン−HRP(KPL#474−3000、Gaithersburg、MD)で、ウェルを3回洗浄した。0.05%Tween20を含有するPBSで、ウェルを3回洗浄し、ウェル当りULTRA−TMBELISA(Pierce,Rockford,IL)の100μLを添加した。呈色後、1NHClを用いて反応を停止させ、450nmでの吸光度を測定した。結果は、表21に示されている。
D−PBS−BSA(0.1%BSAを加えたダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水)中に希釈されたEGFRモノクローナル抗体又はDVD−Igを、0.01μg/mLから100μg/mLの最終濃度のヒト癌腫細胞(180μL)に添加した。37℃で、加湿された5%CO2雰囲気中において、1時間、プレートを温置した。受容体(EGFR)の自己リン酸化を刺激するために、1から100ng/mLの最終濃度の成長因子(EGF)(20μL)を、5から15分間、細胞に添加した。抗体処理なしのウェルは0%阻害の対照として使用されたのに対して、成長因子の刺激なしのウェルは100%阻害を示すと考えた。細胞抽出緩衝液(10mMTris、pH7.4、100mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1mMNaF、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%Triton X−100、10%グリセロール、0.1%SDS及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)との温置によって、細胞可溶化液を作製した。製造業者の指示書に従って、R&D Systems(#DYC1095,Minneapolis,MN)のp−EGFRELISAキットを用いて、これらの細胞可溶化液中のホスホ−EGFRを測定した。結果が、表22及び23に示されている。
10%FBS/最小必須培地中で増殖された集密状態に満たないDU145大腸腫瘍細胞をトリプシン処理し、6ウェルの組織培養プレート(0.25×106細胞/2mLの最終容量)中に播種し、37℃、5%CO2で、18から24時間温置した。温置後、1×D−PBSで細胞を2回洗浄し、無血清培地中で一晩、飢餓状態にした。翌日、37℃で1時間、モノクローナル抗体又はDVD−Igの1μMを含有する無血清培地900μLとともに、細胞を温置した。抗体の温置後、次いで、13nMMSP1で細胞を処理した(37℃、30分)。氷冷されたD−PBSで細胞を2回洗浄し、HALT(R)ホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific,Rockford,IL)100μL、Complete(R)無EDTAプロテアーゼ阻害剤錠剤1錠(1錠/10mL、Roche Diagnostic,Mannheim,Germany)及びPMSFを含有するCell Extraction Buffer (Biosource International,Carlsbad,CA)150μL中に採集した。断続的に渦巻き撹拌を行いながら、氷上で30分間、細胞可溶化液を温置し、遠心(10分、14,000RPM、4℃)によって予め清澄化し、ウェスタンブロット分析のために処理した。1×MOPS走行緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いる4から12%のNuPageBis−Tris Gel上でのSDS−PAGEによって、細胞可溶化液計15μgを分離した。ニトロセルロース膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)上に、タンパク質を転写し、室温で1時間、TBS−T(1×TBS/0.1%Tween20)中の5%無脂肪乳中でブロッキングを行った。ブロッキング後に、ウサギポリクローナルホスホ−p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)又はウサギモノクローナルホスホ−AKT(Ser473)抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)の何れかの1:1000希釈物とともに、4℃で一晩、膜を温置した。ブロットを3回洗浄し(1×TBS−T、15分)、5%無脂肪乳/TBS−T溶液中のHRPが連結された抗ウサギIgG、二次ヤギ抗体(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)の1:5000希釈物とともに、室温で1時間温置した。ブロットを3回洗浄し(1×TBS−T、15分)、SuperSignal West Dura Luminol/Enhancer Solution(R)(Millipore,Temecula,CA)との5分間の温置によって、ペルオキシダーゼが連結された二次抗体を活性化し、化学発光を検出し、Luminescent Image Analyzer LAS−3000 (FUJIFilm,Tokyo,Japan)を用いて定量した。MultiGauge Software(FUJIFilm,Tokyo,Japan)を用いて、バンド密度を測定し、各バンドに対して、全化学発光シグナルを定量した。全ERK1/2及びAKTレベルを測定するために、1×Reblot Plus Strong Solution(R)(Thermo Scientific,Rockford,IL)を用いて、膜を15分間剥離させ、ウサギポリクローナルp44/42MAPK抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)又はウサギモノクローナルAKT抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)の何れかの1:1000希釈物を用いて、再度プローブ探索を行い、ホスホ抗体に関して上述されているように処理した。ph−ERK及びph−Aktレベルを、それぞれ、全ERK又は全Aktに対して標準化した。
99%の生存率、組織培養フラスコ中で85%の集密度になるように、A−431ヒト類上皮癌腫細胞をインビトロで増殖させた。19から25グラムのSCID雌マウス(Charles Rivers Labs,Wilmington,MA)の右の脇腹に、研究0日目に、1×106ヒト腫瘍細胞(1:1マトリゲル)を皮下注射した。約200から320mm3の平均腫瘍容積を有するマウスの群の中に、マウスの大きさを合わせた後、ヒトIgG対照又はDVD−Igの投与(腹腔内、QD、3回/週)の投与を開始した。腫瘍細胞注射から約10日後に開始して、週に2回、腫瘍を測定した。
目的の細胞表面抗原を過剰発現する安定な細胞株又はヒト腫瘍細胞株を組織培養フラスコから採集し、5%ウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝化された生理的食塩水(PBS)(PBS/FBS)中に再懸濁した。染色の前に、PBS/FCS中の5μg/mLのヒトIgG(100μL)とともに、氷上で、ヒト腫瘍細胞を温置した。氷上で30から60分間、PBS/FCS中において、抗体又はDVD−Ig(2μg/mL)とともに、1から5×105細胞を温置した。細胞を2回洗浄し、F(ab’)2ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ−フィコエリトリン(PBS中の1:200希釈)100μL(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,Cat.# 109−116−170)を添加した。氷上での30分の温置後、細胞を2回洗浄し、PBS/FBS中に再懸濁した。Becton Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて、蛍光を測定した。
細胞表面EGFR又はヒト腫瘍細胞株を過剰発現する安定な細胞株を組織培養フラスコから採集し、1%ウシ胎児血清を含有するダルベッコのリン酸緩衝化された生理的食塩水(DPBS)(DPBS/FCS)中に再懸濁した。氷上で30から60分間、DPBS/FCS中において、抗体又はDVD−Ig(10μg/mL)100μLとともに、1から5×105細胞を温置した。細胞を2回洗浄し、ヤギ抗ヒトIgG−フィコエリトリン(DPBS/BSA中で1:50希釈)50μL(Southern Biotech Associates,Birmingham,AL cat#2040−09)を添加した。氷上での30から45分の温置後、細胞を2回洗浄し、DPBS/FCS中の1%ホルムアルデヒド125μL/ウェル中に再懸濁した。Becton DickinsonLSRII(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて、蛍光を測定した。
親マウスmAbは、目的のヒト抗原に結合して中和することができ、その変形物は、以下のようにして得られる。
完全フロイントアジュバント又はImmunoeasyアジュバント(Qiagen,Valencia,CA)と混合された組換え精製ヒト抗原(例えば、IGF1,2)20μgを、第1日目に、5匹の6から8週齢のBalb/C、5匹のC57B/6マウス及び5匹のAJマウス中に皮下注射する。24日、38日及び49日目に、不完全フロイントアジュバント又はImmunoeasyアジュバントと混合された組換え精製ヒト抗原変形物20μgを同じマウス中に皮下注射する。84日又は112日又は144日目に、目的の組換え精製ヒト抗原1μgをマウスの静脈内に注射する。
ハイブリドーマを作製するために、「Kohler,G. and Milstein (1975) Nature,256:495」に記載されている確立された方法に従って、実施例1.2.Aに記載されている免疫化されたマウスから得られた脾細胞を、5:1の比で、SP2/O−Ag−14細胞と融合する。ウェル当り2.5×106個の脾細胞の密度で、96ウェルプレート中のアザセリン及びヒポキサンチンを含有する選択培地中に融合産物を播種する。融合から7ないし10日後に、肉眼で観察できるハイブリドーマコロニーが観察される。ハイブリドーマコロニーを含有する各ウェルからの上清を、(実施例1.1.1.Aに記載されているように)目的の抗原に対する抗体の存在に関して、ELISAによって検査する。次いで、抗原特異的活性を示す上清を(実施例1.1.2のアッセイに記載されているように)活性(例えば、実施例1.1.2.Iに記載されているようなバイオアッセイにおいて、目的の抗原を中和する能力)に関して検査する。
実施例1.2.C.1:親モノクローナル抗体の中和活性の分析
実施例1.2.A及び1.2Bに従って作製された、目的の抗原を結合し、目的抗原の変形物(「抗原変形物」)も結合することができる親抗体の存在に関して、ハイブリドーマ上清をアッセイする。次いで、例えば、実施例1.1.2.Iのサイトカインバイオアッセイにおいて、抗原中和効力に関して、両アッセイにおいて陽性の抗体を有する上清を検査する。バイオアッセイにおいて1000pM未満のIC50値、一実施形態では、100pM未満のIC50値を有する抗体を産生するハイブリドーマを増やし、限界希釈によってクローニングした。10%の低IgGウシ胎児血清を含有する培地(Hyclone #SH30151,Logan,UT)中に、ハイブリドーマ細胞を増殖させる。平均して、(クローン集団に由来する)各ハイブリドーマ上清250mLを採集し、「Harlow,E. and Lane,D. 1988 “Antibodies:A Laboratory Manual”」に記載されているように、濃縮し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。例えば、実施例1.1.2.Iに記載されているようなサイトカインバイオアッセイを用いて、精製されたmAbがその標的抗原の活性を阻害する能力を測定する。
本明細書に記載されている選択されたmAbが目的のカニクイザル抗原を認識するかどうかを測定するために、組換えカニクイザル標的抗原を用いて、本明細書に記載されているように(実施例1.1.1.G)、BIACORE分析を行う。さらに、目的の組換えカニクイザル抗原に対するmAbの中和能力は、サイトカインバイオアッセイにおいても測定され得る(実施例1.1.2.I)。良好なカニクイザル交叉反応性(一実施形態において、ヒト抗原に対する反応性の5倍以内)を有するmAbを、さらなる性質決定のために選択する。
cDNAの単離、組換え抗ヒトマウスmAbの発現及び性質決定は、以下のように行われる。各アミノ酸配列の決定のために、約1×106個のハイブリドーマ細胞を遠心によって単離し、製造業者の指示書に従って、Trizol(Gibco BRL/Invitrogen,Carlsbad,CA.)を用いて全RNAを単離するために処理した。製造業者の指示書に従って、Superscript First−Strand Synthesis System(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて、全RNAを第一鎖DNAの合成に供する。ポリ(A)+RNAを選択するための第一鎖合成を開始するために、オリゴ(dT)を使用する。次いで、マウス免疫グロブリン可変領域の増幅のために設計されたプライマーを用いるPCRによって、第一鎖cDNA産物を増幅する(Ig−Primer Sets,Novagen,Madison,WI)。アガロースゲル上でPCR産物を分離し、切り出し、精製し、次いで、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に、TOPOCloningキットを用いてサブクローニングし、化学的に形質転換受容能力を有するTOP10イー・コリ(E.coli)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に形質転換する。挿入物を含有するクローンを同定するために、形質転換体に対してコロニーPCRを行う。QIAprep Miniprepキット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて、挿入物を含有するクローンからプラスミドDNAを単離する。M13フォワード及びM13リバースプライマー(Fermentas Life Sciences,Hanover MD)を用いて、可変重鎖又は可変軽鎖DNA配列を決定するために、両鎖に対して、プラスミド中の挿入物を配列決定する。mAbの可変重鎖及び可変軽鎖配列を同定する。一実施形態において、次工程の開発(ヒト化)のための、リードmAbの群に関する選択基準には、以下のものが含まれる。
・抗体は、全ての抗体中の通常のシステインの他に、余分のシステインを一切含まない
・抗体配列はVH及びVLに対して最も近いヒト生殖系列配列と並置され、あらゆる異常なアミノ酸は、他の天然のヒト抗体中での発生に関してチェックされるべきである
・抗体の活性に影響を及ぼさなければ、N末端のグルタミン(Q)はグルタミン酸(E)に変化させる。これは、Qの環状化による不均一性を低減する
・効率的なシグナル配列の切断を質量分析法によって確認する。これは、COS細胞又は293細胞材料を用いて行うことができる
・活性の喪失をもたらし得るAsnの脱アミド化のリスクに関して、タンパク質配列がチェックされる
・抗体は、凝集の低いレベルを有する
・抗体は、>5から10mg/mLの溶解度を有する(研究相では);>25mg/mL
・抗体は、動的光散乱(DLS)によって、正常なサイズ(5から6nm)を有する
・抗体は、低い電荷不均一性を有する
・抗体は、サイトカインの放出を欠如する(実施例1.1.2.B参照)
・抗体は、目的とするサイトカインに対して特異性を有する(実施例1.1.2.C参照)
・抗体は、予想外の組織交叉反応性を欠如する(実施例1.1.2.D参照)
・抗体は、ヒトとカニクイザル組織交叉反応性の間で類似性を有する(実施例1.1.2.D参照)
実施例1.2.2.1:組換えキメラ抗ヒト親抗体の構築及び発現
細菌中での相同的組換えによって、2つのヒンジ領域アミノ酸変異を含有するヒトIgG1定常領域をコードするcDNA断片によって、マウス抗ヒト親mAbの重鎖定常領域をコードするDNAを置き換える。これらの変異は、234位のロイシンからアラニンへの変化(EU付番)及び235位のロイシンからアラニンへの変化である(Lund et al.,1991,J. Immunol.,147:2657)。これらの抗体のそれぞれの軽鎖定常領域は、ヒトκ定常領域によって置き換えられる。pBOS発現プラスミド中に連結されたキメラ重鎖及び軽鎖cDNAの同時形質移入によって、完全長キメラ抗体をCOS細胞中で一過性に発現させる(Mizushima and Nagata,Nucleic Acids Research 1990,Vol.18,pg 5322)。プロテインAセファロースクロマトグラフィーによって、組換えキメラ抗体を含有する細胞上清を精製し、酸緩衝液の添加によって、結合された抗体を溶出する。抗体を中性にし、PBS中に透析する。
実施例1.2.2.2.A:ヒト抗体フレームワークの選択
VectorNTIソフトウェアを用いて(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.で、NCBI Ig Blastウェブサイトから得られた)、44のヒト免疫グロブリン生殖系列可変重鎖又は46の生殖系列可変軽鎖配列に対して、それぞれのマウス可変重鎖及び可変軽鎖遺伝子配列を別々に並置する。
例えば、実施例1.1.2.Aに記載されているサイトカインバイオアッセイを用いて、精製されたヒト化抗体が機能的活性を阻害する能力を測定する。実施例1.1.1.Bに記載されている表面プラズモン共鳴(Biacore(R))測定を用いて、組換えヒト抗原へのヒト化抗体の結合親和性を測定する。バイオアッセイから得られたIC50値及びヒト化抗体の親和性に順位を付ける。親ハイブリドーマmAbの活性を完全に維持するヒト化mAbを、将来の開発のための候補として選択する。最も好ましい上位2から3個のヒト化mAbをさらに性質決定する。
Sprague−Dawleyラット及びカニクイザルにおいて、薬物速度論的研究を実施する。雄及び雌のラット及びカニクイザルに、4mg/kgのmAbの単回用量を静脈内又は皮下に投薬し、抗原捕捉ELISAを用いて試料を分析し、ノンコンパートメント分析によって、薬物速度論的パラメータを測定する。要約すれば、ヤギ抗ビオチン抗体(5mg/mL、4℃、一晩)でELISAプレートを被覆し、Superblock(Pierce)でブロッキングし、室温で2時間、10%SuperblockTTBS中の50ng/mLのビオチン化されたヒト抗原とともに温置する。血清試料を系列希釈し(TTBS中の0.5%血清、10%Superblock)、室温で30分間、プレート上で温置する。HRP標識されたヤギ抗ヒト抗体を用いて検出を行い、4パラメータロジスティックフィッティングを使用する標準曲線の助けを得て濃度を測定する。薬物速度論的パラメータに対する値は、WinNonlinソフトウェア(Pharsight Corporation,Mountain View,CA)を使用するノンコンパートメントモデルによって測定する。優れた薬物速度論的特性(T1/2は、8から13日又はこれより良好、低い排除速度及び優れた生物学的利用性50から100%を有する。)を有するヒト化mAbを選択する。
サイズ排除クロマトグラフィー
2.5mg/mLになるように、抗体を水で希釈し、TSKゲルG3000SWXLカラム(Tosoh Bioscience,cat# k5539−05k)を使用するShimadzuHPLCシステム上で20mLを分析する。
0.3mL/分の流速で、211mM硫酸ナトリウム、92mMリン酸ナトリウム、pH7.0で、試料をカラムから溶出する。 HPLCシステムの作動条件は、以下のとおりである。
勾配:等濃度
流速:0.3mL/分
検出波長:280nm
自動試料採取装置冷却温度:4℃
カラムオーブン温度:室温
実行時間:50分
表29は、上記プロトコールによって測定された%単量体(予想分子量の非凝集タンパク質)として表された親抗体及びDVD−Ig構築物の純度データを含む。
DVD−Igは、多くのDVD−Igが90%を超える単量体を示す優れたSEC特性を示した。このDVD−Igの特性は、親抗体に対して観察されたものと似ている。
還元及び非還元条件下の両方で、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって抗体を分析する。アダリムマブロットAFP04Cを対照として使用する。還元条件に関しては、100mMDTTを加えた2×trisグリシンSDS−PAGE試料緩衝液(Invitrogen,cat# LC2676,lot# 1323208)と試料を1:1で混合する。非還元条件に関しては、試料を試料緩衝液と1:1で混合し、100℃で5分間過熱する。還元された試料(10mg/レーン)は12%プレキャストtris−グリシンゲル(Invitrogen,cat#EC6005box,lot#6111021)上に搭載し、還元されていない試料(10mg/レーン)は、8%から16%のprecasttris−グリシンゲル(Invitrogen,cat#EC6045box,lot#6111021)上に搭載する。分子量マーカーとして、BluePlus2(Invitrogen,cat#LC5925,lot#1351542)を使用する。XCellSureLockミニセルゲルボックス(Invitrogen,cat#EI0001)中でゲルを走行させ、試料をゲル中に積み重ねるために、75の電圧を印加した後、色素の先頭がゲルの底に到達するまで、125の定常電圧を印加することによってタンパク質を分離する。使用する走行緩衝液は、10×trisグリシンSDS緩衝液(ABC,MPS−79−080106)から調製される1×trisグリシンSDS緩衝液である。コロイト状青色染色(Invitrogencat#46−7015,46−7016)を用いて、ゲルを一晩染色し、バックグラウンドが透明になるまで、Milli−Q水で脱色させた。次いで、EpsonExpressionスキャナー(モデル1680、S/NDASX003641)を用いて、染色されたゲルをスキャンした。
3つの標準的な2セクターカーボンエポンセンターピースのそれぞれの試料チャンバー中に抗体を搭載する。これらのセンターピースは1.2cmの光路長を有しており、サファイアウィンドウを用いて作製されている。参照緩衝液のためにPBSを使用し、各チャンバーは140μLを含有した。BeckmanProteomeLabXL−I分析用超遠心装置(シリアル番号PL106C01)中の4つ穴(AN−60Ti)ローターを用いて、全ての試料を同時に調べる。
走行条件はプログラムされ、遠心の管理は、ProteomeLab(v5.6)を用いて行われる。試料及びローターは、分析の前に1時間、熱的に平衡化させる(20.0±0.1℃)。3000rpmで適切な細胞の搭載の確認を行い、各細胞に対して単一の走査を記録する。沈降速度条件は、以下のとおりである。
参照セル容積:420mL
温度:20℃
ローター速度:35,000rpm
時間:8:00時間
UV波長:280nm
放射状(radial)ステップのサイズ:0.003cm
データ収集:シグナル平均化なしに、ステップ毎に1つのデータポイント
走査の総数:100
LC−MSによって、完全な状態の抗体の分子量を分析する。約1mg/mLになるように、水で各抗体を希釈する。脱塩し、APIQstarpulsari質量分析装置(Applied Biosystems)中に、試料5mgを導入するために、タンパク質マイクロトラップ(Michrom Bioresources,Inc,cat# 004/25109/03)を備えた1100HPLC(Agilent)システムを使用する。試料を溶出するために、短い勾配を使用する。50mL/分の流速で、移動相A(HPLC水中、0.08%FA、0.02%TFA)及び移動相B(アセトニトリル中、0.08%FA及び0.02%TFA)を用いて勾配を実行する。質量分析装置は、2000から3500質量対電荷比の走査範囲で、4.5kVのスプレー電圧で操作する。
抗体軽鎖(LC)、重鎖(HC)及び脱グリコシル化されたHCの分子量測定は、LC−MSによって分析する。1mg/mLになるように、水で抗体を希釈し、37℃で30分間、10mMDTTの最終濃度で、試料をLC及びHCに還元する。抗体を脱グリコシル化するために、100mLの総容量で、PGNアーゼF2mL、10%N−オクチルグルコシド5mLとともに、37℃で一晩、抗体100mgを温置する。脱グリコシル化後、10mMDTTの最終濃度を用いて、37℃で30分間、試料を還元する。脱塩し、APIQstarpulsari質量分析装置(Applied Biosystems)中に、試料(5mg)を導入するために、C4カラム(Vydac,cat# 214TP5115,S/N 060206537204069)を備えたAgilent1100HPLCシステムを使用する。試料を溶出するために、短い勾配を使用する。50mL/分の流速で、移動相A(HPLC水中、0.08%FA、0.02%TFA)及び移動相B(アセトニトリル中、0.08%FA及び0.02%TFA)を用いて勾配を実行する。質量分析装置は、800から3500質量対電荷比の走査範囲で、4.5kVのスプレー電圧で操作する。
75mM炭酸水素アンモニウム中の6M塩酸グアニジンの最終濃度を用いて、室温で15分間、抗体を変性させる。変性された試料を、37℃で60分間、10mMDTTの最終濃度で還元した後、暗所にて、37℃で30分間、50mMヨード酢酸(IAA)でアルキル化する。アルキル化に続いて、4℃で、10mM炭酸水素アンモニウムの4リットルに対して、試料を一晩透析する。10mM炭酸水素アンモニウム、pH7.8によって、透析された試料を1mg/mLになるように希釈し、37℃で4時間、1:20(w/w)のトリプシン/Lys−C:抗体比で、トリプシン(Promega,cat# V5111)又はLys−C(Roche,cat# 11 047 825 001)を用いて、抗体100mgを消化する。1NHClの1mLで、消化物を反応停止させる。質量分析検出を用いたペプチドマッピングのために、Agilent1100HPLCシステムを有するC18カラム(Vydac,cat# 218TP51,S/N NE9606 10.3.5)上での逆相高性能液体クロマトグラフィー(RPHPLC)によって、消化物40mLを分離する。50mL/分の流速で、移動相A(HPLC等級の水中の0.02%TFA及び0.08%FA)及び移動相B(アセトニトリル中の0.02%TFA及び0.08%FA)を使用する勾配を用いて、ペプチドの分離を行う。4.5kVのスプレー電圧での陽性モード及び800から2500質量対電荷比のスキャン範囲で、APIQSTAR Pulsari質量分析装置を操作する。
抗体を変性させるために、抗体100mLを100mM炭酸水素アンモニウム中の8M塩酸グアニジン300mLと混合する。pHが7と8の間にあることを確かめるために、pHをチェックし、6M塩酸グアニジンの最終濃度で、室温で15分間、試料を変性させる。変性された試料の一部(100mL)を、Milli−Q水で600mLに希釈して、1Mの最終塩酸グアニジン濃度を得る。37℃で約16時間、1:50のトリプシン又は1:50のLys−C:抗体(w/w)比(4.4mg酵素:220mg試料)のトリプシン(Promega,cat # V5111,lot# 22265901)又はLys−C(Roche,cat# 11047825001,lot# 12808000)の何れかで、試料(220mg)を消化する。試料に、トリプシン又はLys−Cをさらに5mg添加し、37℃でさらに2時間、消化を進行させる。各試料にTFA1mLを添加することによって、消化を停止させる。AgilentHPLCシステム上のC18カラム(Vydac,cat# 218TP51 S/N NE020630−4−1A)を用いるRPHPLCによって、消化された試料を分離する。50mL/分の流速で、移動相A(HPLC等級の水中の0.02%TFA及び0.08%FA)及び移動相B(アセトニトリル中の0.02%TFA及び0.08%FA)を使用するペプチドマッピングに対して使用したのと同じ勾配を用いて、分離を行う。HPLC操作条件は、ペプチドマッピングに対して使用したものと同じである。4.5kVのスプレー電圧での陽性モード及び800から2500質量対電荷比のスキャン範囲で、APIQSTAR Pulsari質量分析装置を操作する。ペプチドの観察された分子量を、ジスルフィド結合によって結合されたトリプシン又はLys−Cペプチドの予想される分子量とマッチさせることによって、ジスルフィド結合を割り振る。
抗体中の遊離のシステインを定量するために使用した方法は、Ellman試薬、5,5c−ビチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)の、スルフヒドリル基(SH)との反応(この反応は、特徴的な発色性産物である5−チオ−(2−ニトロ安息香酸)(TNB)を生成する。)を基礎とする。反応は、式:
DTNB+RSH(R)RS−TNB+TNB−+H+で図示される。
10mMリン酸ナトリウム、pH6.0を用いて、抗体を1mg/mLまで希釈する。WCX−10 ProPac分析用カラム(Dionex,cat# 054993,S/N 02722)を備えたShimadzuHPLCシステムを用いて、電荷の不均一性を分析する。80%の移動相A(10mMリン酸ナトリウム、pH6.0)及び20%の移動相B(10mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH6.0)中のカラムに試料を搭載し、1.0mL/分の流速で溶出する。
抗体のPNGアーゼF処理後に放出されるオリゴ糖を、2−アミノベンズアミド(2−AB)標識試薬を用いて誘導化する。順相高性能液体クロマトグラフィー(NPHPLC)によって、蛍光標識されたオリゴ糖を分離し、既知標準と比較した保持時間に基づいて、オリゴ糖の異なる形態を性質決定する。
抗体の緩衝液は、5.57mM一塩基性リン酸ナトリウム、8.69mM二塩基性リン酸ナトリウム、106.69mMNaCl、1.07mMクエン酸ナトリウム、6.45mMクエン酸、66.68mMマニトール、0.1%(w/v)Tween、pH5.2;又は10mMヒスチジン、10mMメチオニン、4%マニトール、pH5.9の何れかであり、Amicon超遠心フィルターを使用する。適切な緩衝液を用いて、抗体の最終濃度を2mg/mLに調整する。次いで、抗体溶液をフィルター滅菌し、0.25mLの分取試料を無菌条件下で調製する。1、2又は3週間、分取試料を−80℃、5℃、25℃又は40℃に放置する。温置期間の終了時に、サイズ排除クロマトグラフィー及びSDS−PAGEによって試料を分析する。
99%の生存率、組織培養フラスコ中で85%の集密度になるように、ヒト癌細胞をインビトロで増殖させる。19から25グラムの雌又は雄のSCIDマウス(Charles Rivers)に耳標を付け、毛を剃った。次いで、研究の0日目に、2×106個のヒト腫瘍細胞0.2mL(1:1マトリゲル)をマウスの右脇腹に皮下接種する。約150から200mm3の平均腫瘍容積を有するマウスの別々のカゴの中に、マウスの大きさを合わせた後に、ビヒクル(PBS)、ヒト化抗体及び/又は化学療法の投与(腹腔内、Q3D/週)を開始する。接種から約10日後に開始して、週に2回、測径器の対によって腫瘍を測定し、式V=L×W2/2(V:容積、mm3;L:長さ、mM;W:幅、mm)に従って腫瘍容積を計算する。mAbのみで、又は化学療法と組み合わせて処理された動物中には、ビヒクルのみ又はイソタイプ対照mAbを与えた動物中の腫瘍と比べて、腫瘍容積の低下が見られる。
予め凍結させた単離された末梢血単核細胞(PBMC)から、負の選択濃縮カラム(R&D Systems,Minneapolis,MN; Cat.#HTCC−525)によってヒトCD3+T細胞を単離した。フラスコ(vent cap,Corning,Acton,MA)中でT細胞を4日間刺激し、D−PBS(Invitrogen,Carlsbad,CA)中の、10μg/mL抗CD3(OKT−3,eBioscience,Inc.,San Diego,CA)及び2μg/mL抗CD28(CD28.2,eBioscience,Inc.,San Diego,CA)で被覆し、L−グルタミン、55mMβ−ME、ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBSを加えた完全RPMI1640培地(Invitrogen,Carlsbad,CA)中の30U/mLIL−2(Roche)中で培養する。次いで、アッセイを使用する前に、30U/mLのIL−2中で、T細胞を一晩休息させた。製造業者の指示書に従って、DoHH2又はRaji標的細胞をPKH26(Sigma−Aldrich,St. Louis,MO)で標識した。rCTLアッセイを通じて、L−グルタミン及び10%FBS(Hyclone,Logan,UT)を含有するRPMI1640培地(フェノールなし、Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用した。(Dreier et al.(2002) Int J Cancer 100:690を参照)。
本明細書に記載されているように選択された2つの親モノクローナル抗体(一方はヒト抗原Aに対し、他方はヒト抗原Bに対する。)を用いて、2つの抗原を結合することができるDVD−Ig分子を構築する。
ADCC/CDCエフェクター機能を除去するために、234及び235に変異を有するμ1Fcを含有する定常領域を使用する。4つの異なる抗A/BDVD−Ig構築物(2つは短いリンカーを有し、2つは長いリンカーを有する(それぞれ、2つの異なるドメイン方向性:VA−VB−C及びVB−VA−C)。)を作製する(表30参照)。ヒトC1/Ck又はCH1ドメインのN末端配列に由来するリンカー配列は、以下のとおりである。
軽鎖(抗Aがλを有する場合):短いリンカー:QPKAAP;長いリンカー:QPKAAPSVTLFPP
軽鎖(抗Aがκを有する場合):短いリンカー:TVAAP;長いリンカー:TVAAPSVFIFPP
重鎖(γ1):短いリンカー:ASTKGP;長いリンカー:ASTKGPSVFPLAP
DVDBA構築物の場合:
軽鎖(抗Bがλを有する場合):短いリンカー:QPKAAP;長いリンカー:QPKAAPSVTLFPP
軽鎖(抗Bがκを有する場合):短いリンカー:TVAAP;長いリンカー:TVAAPSVFIFPP重鎖(γ1):短いリンカー:ASTKGP;長いリンカー:ASTKGPSVFPLAP
重鎖構築物DVDABHC−LL及びDVDABHC−SLを作製するために、A抗体のVHドメイは特異的なプライマー(3’プライマーは、それぞれ、SL/LL構築物に対する短い/長いライナー配列を含有する。)を用いて、PCR増幅されるのに対して、B抗体のVHドメインは、特異的なプライマー(5’プライマーは、それぞれ、SL/LL構築物に対する短い/長いライナー配列を含有する。)を用いて増幅される。両PCR反応は、標準的なPCR技術と操作に従って行われる。2つのPCR生成物をゲル精製し、その後の重複PCR反応のための重複テンプレートとして一緒に使用する。標準的な相同的組換えアプローチを使用することによって、SrfI及びSalIによって二重消化されたpBOS−hCγl,z、非a哺乳動物発現ベクター(Abbott)の中に重複するPCR産物をサブクローニングする。
重鎖構築物DVDBAHC−LL及びDVDBAHC−SLを作製するために、抗体BのVHドメイは特異的なプライマー(3’プライマーは、それぞれ、SL/LL構築物に対する短い/長いライナー配列を含有する。)を用いて、PCR増幅されるのに対して、抗体AのVHドメインは、特異的なプライマー(5’プライマーは、それぞれ、SL/LL構築物に対する短い/長いライナー配列を含有する。)を用いて増幅される。両PCR反応は、標準的なPCR技術と操作に従って行われる。2つのPCR生成物をゲル精製し、標準的なPCR条件を使用するその後の重複PCR反応のための重複テンプレートとして一緒に使用する。標準的な相同的組換えアプローチを使用することによって、SrfI及びSalIによって二重消化されたpBOS−hCγl,z、非a哺乳動物発現ベクター(Abbott)の中に重複するPCR産物をサブクローニングする。
実施例1.4.4.1:DVD−Igベクター構築物の調製
DVD−Igの中に取り込ませるために、特異的な抗原又はそのエピトープを認識する特異的抗体に対する親抗体アミノ酸配列は、上記ハイブリドーマの調製によって取得することが可能であり、又は公知の抗体タンパク質又は核酸を配列決定することによって取得することが可能である。さらに、文献から公知の配列を得ることができる。標準的なDNA合成又は増幅技術を使用し、所望の抗体断片を発現ベクター中に集合させ、標準的な組換えDNA技術を使用して、細胞内で発現させるための核酸を合成するために、前記配列を使用することができる。
DVD−Igタンパク質を作製するために、DVD−Igベクター構築物を293細胞中に形質移入する。使用した293一過性形質移入操作は、「Durocher et al.(2002) Nucleic Acids Res.30(2):E9」及び「Pham et al.(2005) Biotech.Bioengineering 90(3):332−44」に公表されている方法の改変である。形質移入において使用された試薬は、以下のものを含んだ。
・培地:FreeStyle 293 Expression Medium(Invitrogen12338−018)+25μg/mLGeneticin(G418)(Invitrogen 10131−027)及び0.1%PluronicF−68(Invitrogen 24040−032)
・形質移入培地:FreeStyle 293 Expression Medium+10mMHEPES (Invitrogen 15630−080)
・ポリエチレンイミン(PEI)原液:直鎖25kDaPEI(Polysciences)を用いて調製され、−15℃未満で保存された1mg/mLの無菌原溶液、pH7.0。
・Tryptone Feed Medium:FreeStyle 293 Expression Medium中のTryptone N1(Organotechnie,19554)の5%w/v無菌原液。
タンパク質A及びタンパク質Bの両方に対して、抗A/BDVD−Igの結合親和性をBiacore上で分析する。Biacore上での多重結合研究によって、DVD−Igの四価特性を調べる。一方、本明細書に記載されているように、それぞれ、バイオアッセイによって、タンパク質A及びタンパク質Bに対するDVD−Igの中和能を評価する。各mAbに対して本明細書に記載されているように、詳しい物理化学的及び生物分析的(ラットPK)性質決定のために、元の親mAbの親和性及び効力を最もよく保持するDVD−Ig分子を選択する。多数の分析に基づいて、最終リードDVD−IgはCHO安定細胞株の開発に進み、カニクイザルでの安定性、薬物速度論及び有効性研究並びに前製剤活性において、CHO由来の物質を使用する。
DVD−Ig可変重及びDVD−Ig可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド断片を合成し、実施例1.4.4.1に従って、pHybC−D2ベクター中に断片をクローニングすることによって、既知のアミノ酸配列を有する親抗体を用いて二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)を作製した。実施例1.4.4.2に記載されているように、DVD−Ig構築物を293細胞中にクローニングし、発現させた。標準的な方法に従って、DVD−Igタンパク質を精製した。表記されているように、実施例1.1.1及び1.1.2に記載されている方法に従って、機能的な特徴を決定した。本発明のDVD−Igに対するDVD−IgVH及びVL鎖が、以下に記載されている。
本願を通じて引用され得る全ての引用された参考文献(文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。)の内容の全体は、本明細書中にこれらの参考文献が引用されるように、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の実施は、別段の記載がなければ、本分野において周知である免疫学、分子生物学及び細胞生物学の慣用技術を使用する。
本発明は、その精神又は不可欠な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化され得る。従って、前記実施形態は、本明細書に記載されている本発明の限定ではなく、あらゆる点で例示的なものと考えなければならない。従って、本発明の範囲は、前記記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、特許請求の範囲の均等の意義及び範囲に属する全ての変化は本発明に包含されるものとする。
Claims (17)
- 第一及び第二のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、前記ポリペプチド鎖はそれぞれ独立に、VD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、ここで、
VD1は第一の可変ドメインであり;
VD2は第二の可変ドメインであり;
Cは定常ドメインであり;
X1はリンカーであり;
X2はFc領域であり;及び
nは0又は1であり;
第一及び第二のポリペプチド鎖のVD1ドメインは第一の機能的標的結合部位を形成し、第一及び第二のポリペプチド鎖のVD2ドメインは第二の機能的標的結合部位を形成し、結合タンパク質は、下記に結合することができる、結合タンパク質:
(a)CD−20及びCD−40、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号117及び118を含む、
(b)CD−3及びCD−19、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号125及び126を含む、
(c)EGFR及びHER−2、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号127及び128、又は、
配列番号129及び130
を含む、
(d)EGFR及びIGF1R、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号139及び140、又は、
配列番号141及び142
を含む、
(e)VEGF及びEGFR、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号223及び224、又は、
配列番号225及び226
を含む、
(f)VEGF及びCD−20、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号231及び232を含む、
(g)VEGF及びIGF1,2、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号235及び236、又は、
配列番号237及び238
を含む、
(h)VEGF及びDLL4、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号239及び240、
配列番号241及び242、
配列番号407及び408、
配列番号409及び410、
配列番号417及び418、
配列番号421及び422、
配列番号423及び424、
配列番号439及び440、
配列番号441及び442、
配列番号445及び446、
配列番号447及び448、
配列番号449及び450、
配列番号453及び454、
配列番号455及び456、
配列番号465及び466、
配列番号473及び474、
配列番号477及び478、
配列番号481及び482、
配列番号485及び486、
配列番号489及び490、
配列番号491及び492、
配列番号493及び494、
配列番号497及び498、
配列番号499及び500、
配列番号503及び504、
配列番号507及び508、
配列番号509及び510、
配列番号511及び512、
配列番号513及び514、
配列番号515及び516、
配列番号517及び518、
配列番号519及び520、
配列番号521及び522、
配列番号523及び524、
配列番号525及び526、
配列番号527及び528、
配列番号529及び530、
配列番号531及び532、
配列番号533及び534、
配列番号535及び536、
配列番号537及び538、
配列番号539及び540、
配列番号541及び542、
配列番号543及び544、
配列番号545及び546、
配列番号549及び550、
配列番号557及び558、
配列番号581及び582、
配列番号585及び586、
配列番号589及び590、又は、
配列番号593及び594
を含む、
(i)VEGF及びNRP1、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号263及び264、又は
配列番号265及び266
を含む、
(j)DLL4及びPLGF、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号339及び340、又は、
配列番号341及び342
を含む、又は
(k)VEGF及びPLGF、ここで結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号343及び344、又は、
配列番号345及び346
を含む。 - 下記に結合できる請求項1に記載の結合タンパク質:
(a)EGFR及びHER−2、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号129及び130を含む、
(b)EGFR及びIGF1R、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号141及び142を含む、
(c)VEGF及びEGFR、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号223及び224を含む、
(d)VEGF及びDLL4、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号239及び240、
配列番号489及び490、
配列番号493及び494、
配列番号497及び498、
配列番号511及び512、
配列番号533及び534、
配列番号537及び538、
配列番号541及び542、又は、
配列番号545及び546
を含む、
(e)VEGF及びNRP1、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号263及び264を含む、
(f)DLL4及びPLGF、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、
配列番号339及び340、又は、
配列番号341及び342
を含む、又は、
(g)VEGF及びPLGF、ここで、結合タンパク質の第一及び第二のポリペプチド鎖は、配列番号343及び344を含む。 - 結合タンパク質は、2つの第一のポリペプチド鎖及び2つの第二のポリペプチド鎖、並びに4つの機能的結合部位を含む、請求項1又は2に記載の結合タンパク質。
- (a)Fc領域はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE又はIgDに由来するFc領域である、及び/又は
(b)結合部位が結晶化した結合タンパク質である
請求項1〜3のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合タンパク質を含み、さらに免疫接着分子、造影剤、治療剤、又は細胞障害剤を含む結合タンパク質連結体であって
前記造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識又はビオチンであり、前記放射性標識が、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、又は153Smであり、又は、前記治療剤又は細胞障害剤が、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管形成剤、抗分裂剤、アントラサイクリン、トキシン、又はアポトーシス剤である、結合タンパク質連結体。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
- 請求項6に記載の単離された核酸を含むベクターであって、pcDNA(商標)、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO(商標)、pEF6 TOPO(商標)、pBJ又はpHybEである、ベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む単離された宿主細胞であって、原核生物細胞、E.coli、真核生物細胞、原生動物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、Sf9細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、CHO細胞又はCOS細胞である、宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞を、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下にて培地中で培養することを包含する、結合タンパク質の産生方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- さらに、少なくとも1種の追加の治療剤を含む、請求項10に記載の医薬組成物であって、追加の治療剤が、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤;共刺激分子遮断剤;接着分子遮断剤;抗サイトカイン抗体又はその機能的断片;メトトレキサート;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;検出可能な標識又はレポーター;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性薬剤、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸引用ステロイド、エピネフリン又は類縁体、サイトカイン、又はサイトカインアンタゴニストである、医薬組成物。
- イムノアッセイにより、試験試料中の少なくとも1つの標的又はその断片の存在、量又は濃度を決定するためのインビトロの方法であって、
前記イムノアッセイは、少なくとも1つの結合タンパク質及び少なくとも1つの検出可能な標識を、試験試料に接触させることを含み、
少なくとも1つの結合タンパク質は、請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合タンパク質を含む、方法。 - (a)試験試料を少なくとも1つの結合タンパク質に接触させるステップと、ここで、前記結合タンパク質は標的又はその断片のエピトープに結合し、第一の複合体を形成する、
(b)前記複合体を少なくとも1つの検出可能な標識に接触させるステップと、ここで、検出可能な標識は、結合タンパク質又は前記結合タンパク質により結合されていない標的若しくはその断片のエピトープに結合して、第二の複合体を形成する、
(c)第二の複合体における検出可能な標識により生じたシグナルに基づき試験試料における標的又はその断片の存在、量又は濃度を決定するステップと、ここで、標的又はその断片の存在、量又は濃度は検出可能な標識により生じるシグナルと直接相関する、
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - (a)試験試料を少なくとも1つの結合タンパク質に接触させるステップと、ここで、前記結合タンパク質は標的又はその断片のエピトープに結合し、第一の複合体を形成する、
(b)前記複合体を少なくとも1つの検出可能な標識に接触させるステップと、ここで、検出可能な標識は、結合タンパク質への結合のために標的若しくはその断片のエピトープに結合して、第二の複合体を形成する、
(c)第二の複合体における検出可能な標識により生じたシグナルに基づき試験試料における標的又はその断片の存在、量又は濃度を決定するステップと、ここで、標的又はその断片の存在、量又は濃度は検出可能な標識により生じるシグナルと間接的に相関する、
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - (a)試験試料を標的又はその断片についてアッセイするための指示書と
(b)請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合タンパク質を含む少なくとも1つの結合タンパク質と
を含む、インビトロで試験試料を、標的又はその断片の存在、量又は濃度についてアッセイするためのキット。 - 対象の疾病又は疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合タンパク質の使用。
- 医薬が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、腔内(intracavity)、腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内又は経皮投与用に製剤される、請求項16に記載の使用。
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