KR20130087632A

KR20130087632A - 간질성 방광염의 치료

Info

Publication number: KR20130087632A
Application number: KR1020137019454A
Authority: KR
Inventors: 이안 윌리암 밀스; 아논 로젠탈; 데이비드 피터 스콜필드; 데이비드 루이스 쉘튼; 스티븐 찰스 필립스
Original assignee: 화이자 리미티드
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2013-08-06
Also published as: KR101499278B1; WO2009077993A2; JP2018012692A; JP6388985B2; WO2009077993A3; CA2709135C; RU2570559C2; IL260508B; AU2008337100A1; BRPI0822049A2; RU2010124830A; CA2709135A1; CN106977601A; JP6173997B2; JP2015110562A; IL205836A0; US8591898B2; AU2008337100B2; JP2011506595A; US20100260775A1

Abstract

본 발명은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료 또는 예방에 있어 항-NGF 항체의 이용에 관한 것이다.

Description

간질성 방광염의 치료{TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS}

간질성 방광염(IC)은 통증, 예를 들면 골반통의 증후, 및 하부 요로 증후군(LUTS), 예를 들면 증가된 빈뇨/절박뇨를 특징으로 하는, 원인이 밝혀지지 않은 만성 방광 질환이다. 보다 최근의 용어는 이 복합 증후를 집합적으로 개시하기 위해 IC와 함께 통증성 방광 증후군(PBS)([MacDiarmid SA et al. Rev Urol 2007; 9(1): 9-16]) 또는 방광 통증 증후군(BPS)([(van der Merve et al. European Urology 53(2008) 60-67])를 포함하는 것으로, 즉 IC/PBS/BPS로 변화되고 있다.

IC/PBS/BPS의 유병율은 임상적으로 확인된 질병을 갖는 100,000명의 여성당 67 내지 230명으로 다양하며, 흔히 자궁내막염, 재발성 요로 감염, 과민성 방광 또는 외음부 통증으로 잘못 진단되거나 저진단되기 때문에 이 수치는 아마도 더 높을 것이다([(Forrest J B et al. Clinical Courier 2006; 24(3): 1-8)]). IC는 삶의 질에 상당한 영향을 미치고, 여행, 가족관계 및 활동에 영향을 미치고([Slade D et al. Urol 1997; 49 (5A Suppl): 10-3]), 또한 우울성 증후과 관련되어 있다([Rothrock N E et al. J Urol 2002; 167: 1763-1767]).

IC를 목표로 하는 잘 수행되고, 위약-제어된 무작위 시험은 거의 없고, 치료는 종종 다양한 시행착오적 접근법으로 구성되며, 이는 183가지의 서로 다른 유형의 치료법에 대해 보고하고 있는 간질성 방광염 자료 베이스 연구에서 환자들의 리뷰에 의해서 입증된다([Rovner E et al. J Urol 2000; 56: 940-5]).

단일한 병인이 확인되지 않았고, 이는 아마도 악화되는 조직 손상, 흉터 및 섬유증을 이끌어내는 상피 세포 기능부전, C-신경 섬유 활성화, 및 비만 세포의 증식이라는 자가-영속성 과정을 야기하는 여러 곳의 요도 손상을 갖는 다원적인 과정이다. 염증으로부터 C 섬유의 반복적인 자극 및 방광의 감각 신경의 상향조절은 궁극적으로 영구적인 변화(집중화)를 일으켜, 통각과민, 만성 방광 통증 및 배뇨 장애를 일으킨다([Forrest J B et al. Clinical Courier 2006; 24(3):1-8]).

비록 IC의 근본적인 원인에 대한 합의에는 이르지 못하였지만, 현재의 자료는 하기의 3가지 병리생리학적 기작이 포함될 수 있으리라는 추측을 이끌어내었다: 상피 기능부전, 비만세포 활성화 및 신경 염증([Nazif O et al. Urol 2007; 69 (Suppl 4A): 24-33]).

현재 이용가능한 치료법의 부작용이나 효능 제한이 없는, 신규하고 효과적인 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군의 통증 및/또는 하부 요로 증후군 치료법이 제공될 필요가 지속적으로 존재한다.

재조합 인간 항-NGF(신경 성장 인자) 항체를 간질성 방광염 환자에서 시험한 보고서가 있다([Dimitrakov, et al., J. Urology. Vol 171(4), Supplement, 363 (2004)]). 비록 상기 연구의 목적이 "다양한 이전 치료법이 실패한 상당한 신경 손상과 신경병증성 통증을 갖는 IC 환자 군"에서 효능과 안전성을 평가하는 것이었지만, 비뇨기 신경 손상 마커 수준을 이용하여 신경 손상에 대한 효과만을 보고하였다. 질환의 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 치료에 대해서는 아무런 효능도 보고되지 않았다는 점을 주목하는 것이 중요하다.

항-NGF 항체 E3는 류마티스 관절염 통증, 골관절염 통증 및 수술후 통증을 비롯한 통증의 치료에 유용한 것으로 이전에 보고되었다(예를 들면 제WO2004/058184호 참조). 그러나, 간질성 방광염의 병인과 질환의 기작이 거의 이해되지 않고있다는 점을 고려할 때, 항-NGF 항체, 예를 들면 항체 E3가 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료에 이용될 수 있으리라고는 쉽게 예측할 수 없다.

본원발명은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하기 위한 항-NGF 항체의 용도에 관한 것이다.

또한, 본원발명은 항-NGF 항체를 포함하는, 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본원발명은 항-NGF 항체를 이용하여 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 양태에서는, 효과량의 항-NGF 길항제 항체를 투여함을 포함하는, 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 약 2nM 미만의 K_D로 NGF에 결합하고/하거나, (b) 약 100pM 이하의 IC₅₀(IC₅₀은 약 15pM의 인간 NGF의 존재하에서 측정된다)으로 마우스 E13.5 3차 신경성 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제하고/하거나, (c) 약 10pM 이하의 IC₅₀(IC₅₀은 약 1.5pM의 NGF의 존재하에서 측정된다)으로 마우스 E13.5 3차 신경성 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제한다.

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증은 하복부(골반) 통증; 방광 통증; 치골위 통증; 질 통증; 음경, 고환, 음낭, 회음부의 통증; 요도 통증; 성교통; 방광이 채워짐에 따라 증가할 수 있는 통증, 압력 또는 불편함을 포함한다.

하부 요로 증후군은 저장(자극성), 배설(폐색성) 및 배뇨후 증후으로서 정의될 수 있는 3가지 군의 요로 증후를 포함한다. 저장 증후는 절박뇨, 빈뇨, 야뇨증, 절박성 요실금 및 스트레스성 요실금을 포함하고, 이들은 과민성 방광(OAB) 및 양성 전립선 비대증(BPH)과 관련될 수 있다. 배설 증후는 배뇨지연, 열악한 흐름, 간헐성, 힘주기 및 배뇨곤란을 포함한다. 배뇨후 증후는 소변이 조금씩 떨어지는 현상, 배설후 조금씩 떨어지는 현상 및 불완전하게 비운 느낌을 포함한다.

민감성 방광(OAB)은 절박성 요실금이 있거나 없고, 일반적으로 빈뇨와 야뇨증이 있는 절박성으로 정의된다([Abrams et al., Neurourology and Urodynamics 21:167-178 (2002)]). OAB의 유병율은 남성과 여성에서 비슷하며, 미국 인구의 약 16%가 이 증상으로 고통받고 있다([Stewart et al, Prevalence of Overactive Bladder in the United States: Results from the NOBLE Program; Abstract Presented at the 2^nd International Consultation on Incontinence, July 2001, Paris, France].

용어 OAB Wet 및 OAB Dry는 각각 요실금이 있고 없는 OAB 환자를 의미한다. 이전에, OAB의 근본적인 증후는 요실금으로 생각되어왔다. 그러나, 새로운 용어가 출현함에 따라, 이는 요실금이 없는 다수의 환자(즉, OAB Dry 환자)에게는 명확하게 유효하지 않다. 따라서, 리버만(Liberman) 등의 2001년의 연구['Health Related Quality of Life Among Adults with Symptoms of Overactive Bladder: Results From A US Community-Based Survey'; Urology 57(6), 1044-1050, 2001]에서는 미국 국민의 지역사회에 근거한 시료에서 모든 OAB 증후가 삶의 질에 미치는 영향을 조사하였다. 이 연구는 뇨의 임의의 명백한 손실이 없으면서 OAB로 고통받는 사람들의 경우 대조군과 비교하였을 때 삶의 질이 손상됨을 입증하였다.

BPH는 급성 요축적, 재발성 요로 감염, 방광 결석 및 신장 기능부전과 같은 복합증을 야기할 수 있는 만성 진행성 질환이다. 남성에서 BPH와 관련된 LUTS의 유병율 및 평균적인 심각성은 나이가 듦에 따라 증가한다.

BPH는 전립선 부피를 증가시키고, 요로와 방광의 유출을 폐색시키며, 방광 기능을 이차적으로 변화시킨다. 이러한 효과들은 저장(자극성) 및 배설(폐색성) 증후 둘 모두에 의해 명확하다.

본 발명에 따르면, 항-NGF 길항체 항체가 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 억제하거나 차단할 수 있는 것으로 나타났다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체를 투여한 후 약 24시간 이내에 통증 및/또는 하부 요로 증후군이 경감된다. 일부 실시양태에서는, 항-NGF 길항제 항체를 투여한 후 약 4일 이내에 통증 및/또는 하부 요로 증후군이 경감된다. 일부 실시양태에서, 통증 및/또는 하부 요로 증후군은 관찰하기 전에 경감되거나, 개인의 증상의 개선 징후가 없다.

본 발명의 추가 양태에서는, (a) 서열번호 3에 도시된 CDR1 영역, (b) 서열번호 4에 도시된 CDR2 영역 및 (c) 서열번호 5에 도시된 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 효과량의 항-NGF 길항제 항체를 투여함을 포함하는, 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에서는, (a) 서열번호 6에 도시된 CDR1 영역, (b) 서열번호 7에 도시된 CDR2 영역 및 (c) 서열번호 8에 도시된 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 효과량의 항-NGF 길항제 항체를 투여함을 포함하는, 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

항-NGF 길항제 항체는 (a) 서열번호 3에 도시된 CDR1 영역, (b) 서열번호 4에 도시된 CDR2 영역 및 (c) 서열번호 5에 도시된 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.

항-NGF 길항제 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 NGF에 특이적으로 결합한다.

항-NGF 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역은 하나 이상의 개별적인 프레임워크 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 프레임워크 돌연변이는 인간의 프레임워크 잔기를 상보적인 쥐과(murine) 프레임워크 잔기로 대체할 수 있다. 돌연변이는 중쇄 가변 영역에서의 치환 V71K를 포함할 수 있다.

항-NGF 길항제 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

항-NGF 길항제 항체는 서열번호 1 및 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 항-NGF 길항제 항체는 서열번호 16 및 17에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다.

항-NGF 길항제 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 항체는 NGF에 특이적으로 결합한다.

항-NGF 길항제 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항-NGF 길항제 항체와 NGF 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 항-NGF 길항제 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 NGF 결합에 대해 경쟁할 수 있다.

항-NGF 길항제 항체는 인간화될 수 있다. 항체는 인간과 쥐과 NGF에 특이적으로 결합하는 항체 E3일 수 있다. 항체 E3은 제WO2004/058184호에 개시되어 있고, 이의 내용은 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다. E3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 도시되어 있다(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B). (코티아(Chothia) 및 카바트(Kabat) CDR을 포함하는) 항체 E3의 CDR 부분은 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B에 도식적으로 나타나 있다. E3 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 개별적으로 연장된 CDR의 아미노산 서열 또한 도시되어 있다(하기의 "항체 서열"을 참조할 수 있다). 항체 E3는 NGF를 포착하고 이의 수용체와의 상호작용을 방지하는데 매우 강력하다. E3 및 이의 쥐과 전구체 항체 911은 관절염, 암 통증 및 수술후 통증을 비롯한 병리학적 통증의 비-임상적 동물 모델에서 효과적인 진통제인 것으로 나타났다.

다른 양태에서, 항체는 항체 E3(본원에서는 "E3"와 서로 교환가능하다)의 절편 또는 영역을 포함한다. 한 양태에서, 절편은 제WO2004/058184호의 도 1B 및 본원의 서열번호 17에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄이다. 다른 양태에서, 절편은 제WO2004/058184호의 도 1A 및 본원의 서열번호 16에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄이다. 또다른 양태에서, 절편은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄에서 나온 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또다른 양태에서, 절편은 각각 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B 및 본원의 서열번호 17 및 16에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄에서 나온 하나 이상의 CDR을 함유한다.

다른 양태에서, 항체는 ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 경쇄를 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 중쇄를 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 (a) ATCC No. PTA-4894 또는 ATCC No. PTA-4893의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 경쇄; 및 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 중쇄를 포함한다(본원에서는 편의상, 기탁된 숙주 세포에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드가 ATCC No. PTA-4894, ATCC No. PTA-4893 및 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 것으로 언급된다). 다른 양태에서, 항체는 ATCC No. PTA-4894 또는 ATCC No. PTA-4893의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 경쇄의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 중쇄의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 (a) ATCC No. PTA-4894 또는 ATCC No. PTA-4893의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 경쇄의 경쇄 가변 영역, 및 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 중쇄의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 양태에서, 항체는 (a) ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 하나 이상의 CDR; 및/또는 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 중쇄를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 전장 항체일 수 있고, 이는 IgG2 아강에 속할 수 있다. 항체는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 경쇄 카파 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 개질된 불변 영역, 예를 들면 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 포함하고, 예를 들면 보체 매개된 용균을 야기하지 않거나, 항체-독립적 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는다. 다른 양태에서, 불변 영역은 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; 제PCT WO9958572호에 개시된 바와 같이 개질된다. 항체는 A330P331에서 S330S331(아미노산 번호는 야생형 IgG2a 서열을 기준으로 한다)로의 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 항체 절편, 예를 들면 Fab 또는 Fab'2 절편이거나, 또는 단일 쇄 항체일 수 있다.

다른 양태에서, 항체는 다음의 것들중 임의의 하나 이상을 포함한다: a) 서열번호 1 내지 8(제WO2004/058184호의 도 1A 및 도 1B)에 도시된 항체 E3의 하나 이상의 CDR; b) 서열번호 1 및 5에 도시된 항체 E3의 중쇄에서 나온 CDR H3(제WO2004/058184호의 도 1A); c) 서열번호 2 및 8에 도시된 항체 E3의 경쇄에서 나온 CDR L3(제WO2004/058184호의 도 1B); d) 서열번호 2, 6 내지 8에 도시된 항체 E3의 경쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1B); e) 서열번호 1, 3 내지 5에 도시된 항체 E3의 중쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A); f) 서열번호 1 내지 8에 도시된 항체 E3의 경쇄에서 나온 3개의 CDR 및 중쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B). 다른 양태에서, 항체는 다음의 것들중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: a) 서열번호 1 내지 8에 도시된 항체 E3에서 유래된 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B); b) 서열번호 1 및 5에 도시된 항체 E3의 중쇄에서 나온 CDR H3로부터 유래된 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A); 및/또는 c) 서열번호 2 및 8에 도시된 항체 E3의 경쇄에서 나온 CDR L3로부터 유래된 CDR(제WO2004/058184호의 도 1B). 일부 양태에서, CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR 또는 카바트와 코티아 CDR의 조합(본원에서는 "연장된" 또는 "조합된" CDR로서 언급된다)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 본원에 개시된 CDR 배열중 임의의 것(조합, 변형체 등 포함)을 포함한다.

한 양태에서, 항체는 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 I34가 S, L, V, A 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S로 치환된다. 본원에서 편의상, 내용중 또는 아미노산을 언급할 때의 "치환된" 또는 "~는 ~이다"는 주어진 위치에서의 아미노산의 선택을 의미한다. 명확하게, 치환 또는 선택은 본원의 서열목록에 개시된 아미노산일 수 있다.

다른 양태에서, 항체는 M50이 M, I, G, Q, S, 또는 L이고; A62가 A, 또는 S이고; L63이 L 또는 V인 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이고; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 G98이 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서는, 항체는 S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A, 또는 Y이고; H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서는, 항체는 I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서는, S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R 또는 S이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 양태에서는, 항체는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 양태에서, 항체는 I34가 S, L, V, A, 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 M50이 M, I, G, Q, S, 또는 L이고; A62가 A, 또는 S이고; L63이 L 또는 V인 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이고; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 G98이 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A, 또는 Y이고; H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R, 또는 S이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 I34가 S, L, V A, 또는 I이고; N35가 N, T 또는 S인 서열번호 9의 CDR1 영역; M50이 M, I, G, Q, S, 또는 L이고, A62가 A, 또는 S이고; L63이 L 또는 V인 서열번호 10의 CDR2 영역; 및 Y100이 Y, L, 또는 R이고, Y101이 Y 또는 W이고, G103이 G, A, 또는 S이고, T104가 T 또는 S이고, S105가 S, A, 또는 T이고, Y106이 Y, R, T, 또는 M이고, Y107이 Y 또는 F이고, F108이 F 또는 W이고, D109가 D, N, 또는 G이고, Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열변호 11의 CDR3 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 G98이 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 항체 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 S26이 S 또는 F이고, D28이 D, S, A, 또는 Y이고, H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 CDR1 영역; I51이 I, T, V 또는 A이고, S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 CDR2 영역; 및 S91이 S 또는 E이고, K92가 K, H, R, 또는 S이고, Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 경쇄 가변 영역은 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 항체 중쇄를 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) I34가 S, L, V A, 또는 I이고, N35가 N, T 또는 S인 서열번호 9의 CDR 1 영역; M50이 M, I, G, Q, S, 또는 L이고, A62가 A, 또는 S이고, L63이 L 또는 V인 서열번호 10의 CDR 2 영역; 및 Y100이 Y, L, 또는 R이고, Y101이 Y 또는 W이고, G103이 G, A, 또는 S이고, T104가 T 또는 S이고, S105가 S, A, 또는 T이고, Y106이 Y, R, T, 또는 M이고, Y107이 Y 또는 F이고, F108이 F 또는 W이고, D109가 D, N, 또는 G이고, Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11의 CDR 3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) S26이 S 또는 F이고, D28이 D, S, A, 또는 Y이고, H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 CDR1 영역; I51이 I, T, V 또는 A이고, S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 CDR2 영역; 및 S91이 S 또는 E이고, K92가 K, H, R, 또는 S이고, Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 경쇄 가변 영역은 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 G98이 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 항체 경쇄를 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 I34가 S, L, V A, 또는 I이고, N35가 N, T 또는 S인 서열번호 9의 아미노산 서열; M50이 M, I, G, Q, S, 또는 L이고, A62가 A, 또는 S이고, L63이 L 또는 V인 서열번호 10에 도시된 아미노산 서열; 및 Y100이 Y, L, 또는 R이고, Y101이 Y 또는 W이고, G103이 G, A, 또는 S이고, T104가 T 또는 S이고, S105가 S, A, 또는 T이고, Y106이 Y, R, T, 또는 M이고, Y107이 Y 또는 F이고, F108이 F 또는 W이고, D109가 D, N, 또는 G이고, Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드는 G98이 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 S26이 S 또는 F이고, D28이 D, S, A, 또는 Y이고, H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 아미노산 서열; I51이 I, T, V 또는 A이고, S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 아미노산 서열; 및 S91이 S 또는 E이고, K92가 K, H, R, 또는 S이고, Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 항체 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) I34가 S, L, V A, 또는 I이고, N35가 N, T 또는 S인 서열번호 9의 아미노산 서열; M50이 M, I, G, Q, S, 또는 L이고, A62가 A, 또는 S이고, L63이 L 또는 V인 서열번호 10에 도시된 아미노산 서열; 및 Y100이 Y, L, 또는 R이고, Y101이 Y 또는 W이고, G103이 G, A, 또는 S이고, T104가 T 또는 S이고, S105가 S, A, 또는 T이고, Y106이 Y, R, T, 또는 M이고, Y107이 Y 또는 F이고, F108이 F 또는 W이고, D109가 D, N, 또는 G이고, Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11에 도시된 아미노산 서열; 및 (b) S26이 S 또는 F이고, D28이 D, S, A, 또는 Y이고, H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 아미노산 서열; I51이 I, T, V 또는 A이고, S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 아미노산 서열; 및 S91이 S 또는 E이고, K92가 K, H, R, 또는 S이고, Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 S91이 S 또는 E이고; K92가 임의의 아미노산이고; T93이 임의의 아미노산이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드는 G98이 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; G99가 G, S, A, C, V, N, D, 또는 T이고; Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 S, A, C, G, D, N, T, 또는 G이고; Y110이 임의의 아미노산인 서열번호 11에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 항체 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) I34가 S, L, V A, 또는 I이고, N35가 N, T 또는 S로 치환된 서열번호 9의 CDR1 영역; (b) M50이 I, G, Q, S, 또는 L이고; A62가 A, 또는 S이고; L63이 L 또는 V인 서열번호 10의 CDR2 영역; (c) Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이고; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 항체는 NGF에 결합한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A, 또는 Y이고; H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 CDR1 영역; (b) I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 CDR2 영역; (c) K92가 K, H, R, 또는 S이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 항체는 NGF에 결합한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) (i)I34가 S, L, V A, 또는 I이고, N35가 N, T 또는 S로 치환된 서열번호 9의 CDR1 영역; (ii) M50이 I, G, Q, S, 또는 L이고; A62가 A, 또는 S이고; L63이 L 또는 V인 서열번호 10의 CDR2 영역; (iii) Y100이 Y, L, 또는 R이고; Y101이 Y 또는 W이고; G103이 G, A, 또는 S이고; T104가 T 또는 S이고; S105가 S, A, 또는 T이고; Y106이 Y, R, T, 또는 M이고; Y107이 Y 또는 F이고; F108이 F 또는 W이고; D109가 D, N, 또는 G이고; Y110이 Y, K, S, R 또는 T인 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) S26이 S 또는 F이고; D28이 D, S, A, 또는 Y이고; H32가 H, N, 또는 Q인 서열번호 12의 CDR1 영역; (ii) I51이 I, T, V 또는 A이고; S56이 S 또는 T인 서열번호 13의 CDR2 영역; (iii) S91이 S 또는 E이고; K92가 K, H, R, 또는 S이고; Y96이 Y 또는 R인 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 항체는 NGF에 결합한다.

달리 언급되지 않는 한, 한 위치에서의 아미노산의 선택(예를 들면 치환)은 임의의 다른 위치의 아미노산의 선택으로부터 독립적으로 선택된다.

일부 실시양태에서, 항체는 본원에 개시된 임의의 CDR 배열(조합, 변이 등을 포함)을 포함한다.

본원의 개시내용으로부터 명확하듯이, 본원에 사용되는 가변 영역 번호는 순차적인 번호이다. 당분야의 숙련자들은 다수의 항체 번호매김 시스템(예를 들면 카바트 및 코티아 번호)이 존재하며, 순차적 번호를 다른 번호 시스템, 예를 들면 카바트 번호 또는 코티아 번호로 전환시키는 방법을 쉽게 이해할 것이다.

다른 양태에서, 항체는 서열번호 46 또는 50에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR3 서열)을 포함한다. 또다른 양태에서, 항체는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8에 도시된 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 양태에서, 항체는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 28 및/또는 29; (b) 서열번호 30 및/또는 31; (c) 서열번호 32 및/또는 33; (d) 서열번호 34 및/또는 35; (e) 서열번호 36 및/또는 37; (f) 서열번호 38 및/또는 39, 및 (g) 서열번호 40 및 41에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR 영역, 예컨대 CDRH1 및/또는 CDR H2 영역)을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36, 38 및 40에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR H1 영역)을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39 및 41에서 선택된 아미노산 서열 (예를 들면 CDR H2 영역)을 포함한다. 또다른 양태에서, 항체는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서는, 항체는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다.

한 양태에서는, 항체가 (a) 서열번호 18 및/또는 19; (b) 서열번호 20 및/또는 21; 및 (c) 서열번호 22 및/또는 23에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR 영역, 예를 들면 CDRL1 및/또는 CDR L2 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 폴리펩타이드가 서열번호 18, 20 및 22에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR L1 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 항체가 서열번호 19, 21 및 23에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR L2 영역)을 포함한다. 또다른 실시양태에서는, 항체는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또다른 양태에서는, 항체가 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다.

한 양태에서는, 항체가 (a) 서열번호 51 및/또는 52; (b) 서열번호 55 및/또는 56; (c) 서열번호 57 및/또는 58; (c) 서열번호 59 및/또는 60; (d) 서열번호 61 및/또는 62; (e) 서열번호 63 및/또는 64에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR 영역, 예를 들면 CDRL3 및/또는 CDR H3 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 항체가 서열번호 51, 55, 57, 59, 61 및 63에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR L3 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 항체가 서열번호 52, 56, 58, 60, 62 및 64에서 선택된 아미노산 서열(예를 들면 CDR H3 영역)을 포함한다. 또다른 실시양태에서는, 항체가 서열번호 18, 19, 30 및 31중 하나 이상에 도시된 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서는, 항체가 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또다른 양태에서는, 항체가 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상을 추가로 포함한다.

한 양태에서는, 항체가:

(a) (i) 서열번호 30의 CDR1 영역;

(ii) 서열번호 31의 서열을 포함하는 CDR2 영역;

(iii) 서열번호 11, 56, 58, 60, 62 및 64로 구성된 군에서 선택되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) (i) 서열번호 18의 CDR1 영역;

(ii) 서열번호 19의 CDR2 영역;

(iii) 서열번호 14, 55, 57, 59, 61 및 63으로 구성된 군에서 선택되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함할 수 있다.

다른 양태에서는, 항체가 서열번호 61, 63, 18, 19, 30 및 31에 도시된 하나 이상의 아미노산 서열(예를 들면 CDR 영역)을 포함한다.

다른 양태에서는, 항체가 당 분야에 공지된 항-NGF 항체, 예를 들면 제WO2005019266호에 개시된 항체(항체 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 및 4G6 포함) 또는 제WO2006131951호에 개시된 항체(항체 Hu-αD11 포함)에서 선택될 수 있다. 항체는 당분야에 공지된 항-NGF 항체, 예를 들면 제WO2005019266호에 개시된 항체(항체 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 및 4G6 포함) 또는 제WO2006131951호에 개시된 항체(항체 Hu-αD11 포함) 또는 본원에 정의된 항체로서 NGF, 특히 인간 NGF 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있고/있거나, 또는 이런 항체와 함께 NGF에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항-NGF 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 분해된다. 다양한 경우, 항-NGF 항체의 중쇄 및 경쇄는 선택적으로 신호 서열을 포함할 수 있다.

한 양태에서, 항체는 높은 친화성으로 NGF(예를 들면 인간 NGF)에 결합하는 항-NGF 길항제 항체이다. 일부 실시양태에서, 높은 친화성은 (a) 약 2 nM 미만 (예를 들면 약 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40pM, 30pM, 20pM, 10pM, 5pM 또는 이의 미만중 임의의 것)의 K_D, 및/또는 약 6x10^-5s^-1 보다 느린 k_off로 NGF에 결합하고/하거나; (b) 약 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM 또는 이의 미만의 IC₅₀(약 15pM의 NGF의 존재하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)하고/하거나; (c) 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM 또는 이의 미만의 IC₅₀(약 1.5pM의 NGF의 존재하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)하고/하거나; (d) 약 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM 또는 이의 미만의 IC₅₀(약 15pM의 NGF의 존재하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 래트 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)하고/하거나; (e) 약 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM 또는 이의 미만의 IC₅₀(약 1.5pM의 NGF의 존재하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 래트 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)하고/하거나; (f) trkA 수용체보다 더 높은 친화성으로 NGF에 결합하는 것을 의미한다.

다른 양태에서, 항체는 (a) 약 2 nM 미만 (예를 들면 약 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40pM, 30pM, 20pM, 10pM, 5pM 또는 이의 미만중 임의의 것)의 K_D, 및/또는 약 6x10^-5s^-1 보다 느린 k_off로 NGF에 결합하고/하거나; (b) 약 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM 또는 이의 미만의 IC₅₀(약 15pM의 NGF의 존재하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제하고/하거나; (c) 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM 또는 이의 미만의 IC₅₀(약 1.5pM의 NGF의 존재하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제하고; trkA 수용체보다 더 높은 친화성으로 NGF에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 약 2 nM 미만의 K_D로 NGF에 결합하고/하거나; (b) 약 100 pM 이하의 IC₅₀(여기서 IC₅₀은 약 15pM의 NGF의 존재하에서 측정됨)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제하고/하거나; (c) 약 10 pM 이하의 IC₅₀(여기서 IC₅₀은 약 1.5pM의 NGF의 존재하에서 측정됨)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 약 100 pM 미만의 K_D로 NGF에 결합하고/하거나; (b) 약 20 pM 이하의 IC₅₀(여기서 IC₅₀은 약 15pM의 NGF의 존재하에서 측정됨)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제하고/하거나; (c) 약 2 pM 이하의 IC₅₀(여기서 IC₅₀은 약 1.5pM의 NGF의 존재하에서 측정됨)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제한다.

일부 실시양태에서는, 상기 항체가 단리된다. 일부 실시양태에서는, 항체가 실질적으로 정제된다. 또다른 실시양태에서는, 항체가 친화성 성숙된다. 일부 실시양태에서는, 항체가 인간 프레임워크 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서는, 항체가 하나 이상의 비-인간 프레임워크 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 2nM 이하의 K_D로 NGF(예를 들면 인간 NGF)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 비-인간 아미노산 서열(예를 들면 가변 영역 서열, 예를 들면 CDR 서열, 예를 들면 프레임워크 서열)에 비해 하나 이상(예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상)의 인간 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 모 펩타이드의 아미노산 서열(예를 들면 서열번호 9 내지 14중 임의의 하나 이상과 같은 항체 911 아미노산 서열)에 비해 1개 이상, 2개 이상, 또는 예를 들면 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 항체의 결합 친화성이 모 항체(예를 들면 Mab 911) 친화성에 비해 변화(일부 실시양태에서는 증가)되었다. 또다른 실시양태에서는, 항체의 결합 친화성이 NGF(예를 들면 인간 NGF)에 대한 trkA 수용체의 결합 친화성에 비해 더 낮다. 일부 실시양태에서는 항체가 인간 항체이다. 다른 실시양태에서는, 항체가 인간화된 항체이다. 또다른 실시양태에서는, 항체가 모노클론 항체이다. 일부 실시양태에서는, 항체가 친화성 성숙된 항체이다.

본 발명은 상기 양태의 항체중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드(단리된 폴리뉴클레오타이드 포함)를 이용한다.

다른 양태에서, 본 발명은 항체 E3(본원에서 "E3"와 교환되어 사용됨)의 절편 또는 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 한 실시양태에서, 절편은 제WO2004/058184호의 도 1B에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄이다. 다른 실시양태에서, 절편은 제WO2004/058184호의 도 1A에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄이다. 또다른 실시양태에서, 절편은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄에서 나온 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또다른 실시양태에서, 절편은 제WO2004/058184호의 도 1A 및 도 1B에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄에서 나온 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.

다른 양태에서, 본 발명은 항체 E3를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 제WO2004/058184호의 도 2 및 3에 도시된 폴리뉴클레오타이드중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 E3 경쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 이용한다. 다른 양태에서 본 발명은 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 E3 중쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드이다. 또다른 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 (a) ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 가변 영역, 및 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 가변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 (a) ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 하나 이상의 CDR, 및/또는 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 하나 이상의 CDR을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체(항체 절편 포함) 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이용한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(발현 벡터 및 클로닝 벡터 포함) 및 숙주 세포를 이용한다.

다른 양태에서, 본 발명은 E3 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 E3 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 이용하고, 여기서 E3 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 ATCC No. PTA-4893 및/또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖고, E3 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 (a) ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 가변 영역 및/또는 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 가변 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 (a) ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 하나 이상의 CDR, 및/또는 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 인코딩되는 하나 이상의 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-NGF 길항제 항체를 제공한다. 항-NGF 길항제 항체는 본원에 개시된 바와 같을 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 항-NGF 길항제 항체의 용도를 제공한다. 항-NGF 길항제 항체는 본원에 개시된 바와 같을 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 폴리펩타이드(항체 E3과 같은 항체 포함), 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, 예를 들면 항체 E3 또는 항체 E3의 절편, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트 및 조성물에 관한 것이다. 일반적으로 적합한 포장에 들어있으며 적절한 지시서가 제공되어 있는 이들 키트는 본원에 개시된 임의의 방법에 유용하다.

본 발명은 또한 약제로서의 용도 또는 약제의 제조를 위한 용도인 본원에 개시된 임의의 용도를 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 각각의 양태의 바람직한 특징은 각각의 다른 양태에도 동일하게 적용된다.

본원에 개시된 발명은 치료 효과량의 항-NGF 길항제 항체를 투여함으로써 개인에서 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.

본원에 개시된 본 발명은 또한 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 항-NGF 길항제 항체에 관한 것이다. 또한, 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 항-NGF 길항제 항체의 용도에 관한 것이다.

본원에 개시된 본 발명은 높은 친화성으로 NGF(예를 들면 인간 NGF)에 결합하는 항-NGF 길항제 항체의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 NGF에 결합하는 인간화된 항체, E3을 이용한다. 본 발명은 또한 NGF에 결합하는 E3 폴리펩타이드(항체 포함), E3 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩티드를 이용한다. 본 발명은 또한 NGF에 결합하는 E3로부터 유래된 항체 및 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.

일반적인 기법

본 발명의 실시는, 달리 개시되어 있지 않은 한, 당분야의 기술 범위 이내인 분자생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기법을 이용할 것이다. 이런 기법은 문헌, 예를 들면 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]에 충분히 설명되어 있다.

정의

"항체"란 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예를 들면 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역 글로불린 분자이다. 본원에서 이용되는 용어는 손상되지 않은 폴리클론 또는 모노클론 항체 뿐만 아니라 이의 절편(예를 들면 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb), 단일 쇄 항체(ScFv), 이의 돌연변이체, 키메릭 항체, 다이아바디(diabody), 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 다른 개질된 배열을 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예를 들면 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하부 부류)의 항체를 포함하고, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역 글로불린은 여러 부류로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 면역 글로불린의 5가지 주 부류가 있고, 이중 몇몇은 하부 부류(아이소타입)으로 추가로 나누어진다(예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 면역 글로불린의 다른 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 언급된다. 여러 부류의 면역 글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 배열은 잘 공지되어 있다.

항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합된, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 의미한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 또한 초가변 영역으로도 공지되어 있는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 구성된다. 각각의 쇄의 CDR은 FR에 의해 다른 쇄의 CDR과 매우 밀접하게 유지되어 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는 2가지 이상의 기법이 있다: (1) 종간 서열 다양성에 근거한 접근법(즉, [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학 연구에 근거한 접근법([Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)]). 본원에서 이용되는 CDR은 이중 한가지 접근법 또는 2가지 접근법의 조합에 의해 한정된 CDR을 의미할 수 있다.

항체의 "불변 영역"은 단독으로 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 의미한다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 항체 절편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이 영역은 밀접한, 비-공유결합 연결된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일 쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄와 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 이량체 구조로 연결될 수 있도록 가요성 펩타이드 연결기에 의해 공유결합으로 연결될 수 있다. 바로 이러한 배열에서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원 결합 특이성을 한정한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도, 전체 결합 부위에 비해서는 일반적으로 더 낮은 친화성을 갖긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.

Fab 절편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제 1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 절편은 항체 경첩 영역에서 나온 하나 이상의 시스테인을 비롯하여 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇개의 잔기가 추가되었다는 점이 Fab 절편과는 상이하다. F(ab)2 절편은 경첩 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 절편을 포함하는 2가 절편이다.

단일 쇄 항체(scFc)는 단일 단백질쇄로서 제조되게 할 수 있는 합성 연결기를 통해 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 항체이다([Bird et al Science, 242: 423-426 (1988)] 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)]).

다이아바디는 VH 도메인과 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍을 허용하기에는 너무 짧은 연결기를 사용함으로써 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 이가의 이중특이적 항체이다.

항체는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 이상의 결합 부위가 있다면, 결합 부위는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면 천연 면역글로불린이 2개의 동일한 결합 부위를 갖고, 단일 쇄 항체 또는 Fab 절편은 하나의 결합 부위를 갖는 반면, "이중특이적" 또는 "이작용성" 항체(다이아바디)는 2개의 서로 다른 결합 부위를 갖는다.

"단리된 항체"는 (1) 천연 상태에서는 동반되어 있는 다른 자연적으로 결합된 항체를 비롯하여 자연적으로 결합되는 성분과 결합되지 않거나, (2) 동일한 종에서 나온 다른 단백질이 없거나, (3) 다른 종에서 나온 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연 상태에서는 존재하지 않는 항체이다.

"모노클론 항체"란 동종 항체 집단을 의미하며, 여기서 모노클론 항체는 항원의 선택적인 결합에 관여하는 아미노산(천연 또는 비천연)으로 구성된다. 모노클론 항체의 모집단은 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 용어 "모노클론 항체"는 손상되지 않은 모노클론 항체 및 전장 모노클론 항체뿐만 아니라, 이의 절편(예를 들면 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb), 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 요구되는 특이성 및 항원에 결합하는 능력을 갖는 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 다른 개질된 배열을 포함한다. 항체의 공급원 또는 이것이 제조되는 방식(예를 들면 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물 등)을 한정하고자 하는 것은 아니다.

본원에서 이용되는 "인간 항체"는 인간에 의해 생성되는 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 및/또는 당분야에 공지되어 있거나 본원에 개시된 인간 항체를 제조하는 임의의 기법을 이용하여 제조된 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 하나 이상의 인간 중쇄 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 인간 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다. 한가지 이런 예는 쥐과 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 한 양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리에서 선택되고, 여기서 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다([Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381]; [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]). 인간 항체는 또한 인간 면역 글로불린 유전자좌를 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 형질전환된 동물, 예를 들면 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 개시되어 있다. 다르게는, 인간 항체는 표적 항원에 대한 항체를 생성하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다(이런 B 림프구는 개인으로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관 내에서 면역시킬 수 있다). 예를 들면 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호를 참고할 수 있다.

"키메릭 항체"란 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열의 각각의 한 부분이 특정한 종에서 유래되거나 특정한 부류에 속한 항체 내의 상응하는 서열에 대해 상동성을 갖는 반면, 쇄의 나머지 부분은 다른 것의 상응하는 서열에 대해 상동성을 갖는 항체를 의미한다. 전형적으로, 이러한 키메릭 항체에서는, 경쇄와 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 포유동물의 한 종에서 나온 항체의 가변 영역을 흉내내지만, 불변 부분은 다른 것에서 유래된 항체의 서열에 대해 상동성을 갖는다. 이런 키메릭 형태의 한가지 명확한 이점은, 예를 들면, 가변 영역이 통상적으로 예를 들면 인간 세포 제조에서 유래된 불변 영역과 조합되어 인간이 아닌 숙주 유기체에서 나온 B 세포를 이용하거나 쉽게 이용가능한 하이브리도마를 이용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유도될 수 있다는 점이다. 가변 영역이 제조하기 쉬운 이점을 갖고 있고 특이성이 그의 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 불변 영역이 인간의 것이면 인간이 아닌 공급원에서 나온 불변 영역을 갖는 항체에 비해 주입되었을 때 인간에서 면역 반응을 이끌어낼 가능성이 더 적다. 그러나, 이 정의가 이러한 특정한 예로 한정되어서는 안된다.

"작용성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 효능기 작용을 갖는다. 예시적인 "효능기 작용"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들면 B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 이런 효능기 작용은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들면 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하고, 이런 항체 효능기 작용을 평가하기 위해 당 분야에 공지된 다양한 분석법을 이용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변종 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 개질에 의해 천연 서열 Fc 영역과는 상이하지만, 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 효능기 작용을 보유하고 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변종 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하였을 때 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변종 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 가질 것이다.

본원에서 이용되는 "항체 독립적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들면 천연 킬러(NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후 표적 세포의 용균을 야기하는 세포-매개되는 반응을 의미한다. 흥미있는 분자의 ADCC 활성은 예를 들면 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 개시된 바와 같은 시험관내 ACDD 분석법을 이용하여 평가될 수 있다. 이런 분석법에 유용한 효능기 세포는 말초 혈관 단핵구 세포(PMBC) 및 NK 세포를 포함한다. 다르게는 또는 부가적으로, 흥미있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들면 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본원에서 이용되는 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 의미한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것들이고 FcγI, FcγII 및 FcγIII 서브클래스의 수용체 및 이들 수용체의 대립유전자 변종 및 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγII 수용체는 FcγIIA("활성화 수용체") 및 FcγIIB("억제 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92]; [Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34]; 및 [de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에 개관되어 있다. "FcR"은 또한 신생아 수용체, FcRn을 포함하고, 이는 엄마의 IgG를 태아에게 전달시키는 역할을 한다([Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587]; 및 [Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).

"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적의 용균을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)이 동족의 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들면 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 개시된 바와 같은 CDC 분석법을 수행할 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "E3", "3E" 및 "항체 E3"는 각각 서열번호 1 및 2(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B)에 도시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 의미하는 것으로 서로 교환되어 사용된다. 항체 E3의 CDR 부분(코티아 및 카배트 CDR 포함)은 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B에 도식적으로 나타나 있다. 제WO2004/058184호의 도 2 및 3은 각각 도 1A 및 1B에 도시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. E3의 생성 및 특성화는 그의 전체 내용이 본원에 참고로 혼입되어 있는 제WO2004/058184호의 실시예에 개시되어 있다. NGF에 결합하고 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호에 의해 매개되는 다운스트림 경로을 억제하고; 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 NGF-의존성 생존을 억제하는 능력을 포함하지만, 이로 한정되지 않는 상이한 생물학적 기능이 E3와 관련되어 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 본 발명에서 이용하기 위한 항체는 이들 특징중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 용어 "E3"는 (a) ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 E3 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 E3 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 면역글로불린을 의미한다.

본원에서 이용되는, 항체의 "면역특이적" 결합은 항체의 항원-조합 부위와 그 항체에 의해 인식되는 특정한 항원 사이에서 일어나는 항원 특이적 결합 상호작용을 의미한다(즉, 항체는 ELISA 또는 다른 면역분석법에서 단백질과 반응하지만, 무관한 단백질과는 검출되도록 반응하지 않는다).

항체 또는 폴리펩타이드에 대해 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"(본원에서 서로 교환되어 이용됨)하는 에피토프란 당 분야에서 잘 이해되는 용어이고, 이런 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법 또한 당 분야에 잘 공지되어 있다. 분자가 다른 세포나 물질에 비해 특정한 세포나 물질에 보다 자주, 보다 신속하게, 보다 오래 및/또는 보다 큰 친화성으로 반응하면, 그 분자가 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 말해진다. 항체가 다른 물질에 결합될 때에 비해 표적에 더 큰 친화성, 결합활성(avidity)으로 보다 기꺼이 및/또는 더 오랫동안 결합하는 경우, 항체가 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들면 NGF 에피토프에 특이적 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 NGF 에피토프 또는 비-NGF 에피토프에 결합하는 경우보다 더 큰 친화성, 결합활성으로 보다 신속하게 및/또는 보다 오래 동안 결합하는 항체이다. 이 정의를 읽음으로써, 예를 들면 제 1 표적에 특이적 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 잔기 또는 에피토프)가 제 2 표적에는 특이적 또는 우선적으로 결합하거나 하지 않을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 반드시 요구하는 것은 아니다(배타적 결합을 포함할 수도 있긴 하다). 일반적으로 반드시 그런 것은 아니지만, 결합을 언급하는 경우 우선적 결합을 의미한다.

용어 "폴리펩타이드", "올리고펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 언급하기 위해 본원에서 상호교환되어 이용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 개질된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 개질된, 예를 들면 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 라벨링 성분과의 컨쥬게이트와 같은 임의의 다른 조작 또는 개질에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들면 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들면 비천연 아미노산 등을 포함한다), 및 또한 당 분야에 공지된 다른 개질을 함유하는 폴리펩타이드도 이 정의에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드가 항체에 근거한 것이기 때문에, 폴리펩타이드는 단일 쇄 또는 결합된 쇄로서 존재할 수 있는 것으로 이해된다.

"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 의미하고, DNA와 RNA를 포함하는 것으로 본원에서 서로 교환되어 사용된다. 뉴클레오타이드는 데옥시라이보뉴클레오타이드, 라이보뉴클레오타이드, 개질된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 개질된 뉴클레오타이드, 예를 들면 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 개질은 중합체의 조합 전 또는 후에 일어날 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후에, 예를 들면 라벨링 성분과의 컨쥬게이션에 의해 추가로 개질될 수 있다. 다른 유형의 개질은 예를 들면 "캡", 하나 이상의 천연 뉴클레오타이드의 유사체, 뉴클레오타이드간 개질, 예를 들면 비하전된 연결기(예를 들면 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)를 갖는 것들 및 하전된 연결(예를 들면 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)을 갖는 것들, 매달린 잔기를 함유하는 것들, 예를 들면 단백질(예를 들면 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-라이신 등), 인터칼레이터를 갖는 것들(예를 들면 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터를 함유하는 것들(예를 들면 금속, 방사활성 금속, 붕소, 산화 금속 등), 알킬화제를 함유하는 것들, 개질된 연결기(예를 들면 알파 아노머성 핵산 등)를 갖는 것들 및 또한 폴리뉴클레오타이드의 개질되지 않은 형태로의 치환을 포함한다. 또한, 당에 원래 존재하는 하이드록실 기 중 임의의 것을 예를 들면 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체하거나, 표준 보호기로 보호하거나, 활성화시켜 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가 연결기를 제조하거나, 또는 고형 지지체로 컨쥬게이트될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 포스포릴화되거나 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑 기 잔기로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 당분야에 일반적으로 공지된 라이보스 또는 데옥시라이보스 당의 유사 형태를 함유할 수 있고, 예를 들면 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-라이보스, 탄소환 당 동족체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들면 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환상 유사체 및 어베이직(abasic) 뉴클레오사이드 유사체, 예를 들면 메틸 라이보사이드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결기가 다른 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("포름아세탈")(여기서 R 또는 R'은 독립적으로 H이거나, 또는 에터(-O-) 연결기를 선택적으로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(탄소수 1 내지 20), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜이다)로 대체되는 양태를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오타이드에서 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 이전의 설명은 RNA 및 DNA를 포함한 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.

용어 "동일성"은 2개의 핵산 서열 또는 2개의 아미노산 서열의 "동일성" %를 의미한다. 동일성%는 일반적으로 최적의 비교 목적으로 서열을 배열하고(예를 들면 제 2 서열과의 최적의 정렬을 위해 제 1 서열에 간극을 도입할 수 있다), 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교함으로써 일반적으로 결정된다. "최적의 정렬"은 가장 높은 동일성%를 생성하는 2개의 서열의 정렬이다. 동일성 %는 서열 내부에서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수를 비교함으로써 결정된다(즉, 동일성% = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100).

2개의 서열 사이의 동일성%의 결정은 당 분야의 숙련자들에게 공지된 수학적 알고리듬을 이용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리듬의 예는 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리듬, 및 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같은 개질된 것이다. [Altschul, et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램이 이런 알고리듬에 혼입되었다. BLAST 뉴클레오타이드 서치는 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12를 이용하여 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 서치는 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3을 이용하여 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 간극이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드 BLAST(Gapped BLAST)를 [Altschul et al. (1997) Nucliec Acids Res. 25:3389-3402]에 개시된 바와 같이 이용할 수 있다. 다르게는 PSI-Blast를 이용하여 분자들 사이의 거리 관계를 검출하는 반복 서치를 수행할 수 있다. BLAST, 갭드 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 변수(예를 들면 XBLAST 및 NBLAST)를 이용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참고할 수 있다. 서열 비교에 이용되는 수학적 알고리듬의 다른 예는 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리듬이다. GCG 서열 정렬 프로그램 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)이 이런 알고리듬에 혼입되었다. 당 분야에 공지된 서열 분석을 위한 다른 알고리듬은 [Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5]에 개시된 ADVANCE 및 ADAM; 및 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8]에 개시된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 서치의 속도 및 민감성을 설정하는 제어 옵션이다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 성장 인자" 및 "NGF"는 NGF의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 신경 성장 인자 및 이의 변수를 의미한다. 본원에서 이용되는, NGF는 인간, 개과, 고양이과, 말과, 또는 소과를 포함한 모든 포유동물 종의 천연 서열 NGF를 포함한다.

"NGF 수용체"는 NGF에 결합되거나 이에 의해 활성화되는 폴리펩티드를 의미한다. NGF 수용체는 인간, 개과, 고양이과, 말과, 영장류 또는 소과를 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 포유동물의 TrkA 수용체 및 p75수용체를 포함한다.

본원에서 이용되는 "항-NGF 작용제 항체"(이는 "항-NGF 항체"와 교환될 수 있다)는 NGF에 결합하고 NGF의 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제할 수 있는 항체를 의미한다. 항-NGF 길항제 항체는 NGF 신호전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로, 예를 들면 수용체 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 도출을 포함하는 NGF의 생물학적 활성을 (유의하게) 차단, 길항, 억제 또는 감소시키는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적의 경우, 용어 "항-NGF 길항제 항체"가 모든 이전에 정의된 용어, 제목 및 작용 상태, 및 이에 의해 NGF 그자체, NGF 생물학적 활성(수술후 통증의 임의의 양상을 매개하는 능력을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다) 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 유의한 정도로 실질적으로 무효가 되거나, 감소되거나, 중화되는 특징을 포함하는 것으로 명확하게 이해되어야만 한다. 일부 양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF에 결합하고, NGF 이량체화 및/또는 NGF 수용체(예를 들면 p75 및/또는 trkA)에 대한 결합을 방해한다. 다른 양태에서, 항-NGF 항체는 NGF에 결합하고, trkA 수용체 이량체화 및/또는 trkA 자가인산화를 방해한다. 항-NGF 길항제 항체의 예는 본원에 제공되어 있다.

NGF의 "생물학적 활성"은 일반적으로 NGF 수용체가 결합하고/하거나 NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 의미한다. 제한하지 않고, 생물학적 활성은 다음중 임의의 하나 이상을 포함한다: NGF 수용체(예를 들면 p75 및/또는 trkA)에 결합하는 능력; trkA 수용체 이량체화 및/또는 자가인산화를 촉진시키는 능력; NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화시키는 능력; (말초 및 중추 뉴론을 포함하는 뉴론의 경우) 뉴론 형태, 시냅스생성, 시냅스 기능, 신경전달물질 및/또는 신경펩타이드 방출 및 손상 후의 재생을 비롯한 세포 분화, 증식, 생존, 성장 및 세포 생리학에서의 다른 변화를 촉진시키는 능력; 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 생존을 촉진시키는 능력; 및 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 매개하는 능력.

본원에서 이용되는 "실질적으로 순수한"은 50% 이상 순수한(즉, 오염물이 없는), 보다 바람직하게는 90% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 95% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 98% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 99% 이상 순수한 물질을 의미한다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입체로 혼입되기 위한 벡터를 위한 수납체일 수 있거나 수납체였던 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손들은 천연, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 (형태학 또는 게놈 DNA 상보성 측면에서) 원래의 모 세포와 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.

본원에서 이용되는 "치료"는 유리하거나 바람직한 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해서, 유리하거나 바람직한 임상 결과를 다음중 하나 이상을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다: 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 임의의 양상의 개선 또는 경감. 본 발명의 목적을 위해서, 유리하거나 바람직한 임상 결과는 다음중 하나 이상을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다: 통증의 임의의 양상(예를 들면 통증 기간의 감소, 통증 민감성 또는 느낌의 감소)을 비롯한 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 개선, 심각성 경감.

약물, 화합물 또는 약학 조성물의 "효과량"은 통증 감각의 경감 또는 감소와 같은 임상적 결과를 포함하는 유리하거나 바람직한 결과를 생성하기에 충분한 양이다. 효과량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 효과량은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료, 개선, 강도 감소 및/또는 예방하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, "효과량"은 휴식시의 통증(휴지기 통증) 또는 기계적으로 야기되는 통증(움직임 후의 통증 포함) 또는 이들 둘 모두를 감소시킬 수 있고, 이는 통증 자극 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 임상적 내용에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 효과량은 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "효과량"은 하나 이상의 치료제의 투여라는 측면에서 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 약제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우, 단일 약물이 효과량으로 주어진 것으로 간주될 수 있다.

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 "발생율 감소"는 심각성(예를 들면 오피오이드를 비롯한 이 증상에 일반적으로 이용되는 다른 약물 및/또는 치료법(에 대한 노출)의 필요성 및/또는 양을 감소시키는 것을 포함할 수 있다), 기간 및/또는 빈도(예를 들면 개인이 통증을 느끼는 시간을 지연시키거나 증가시키는 것 포함)의 임의의 감소를 의미한다. 당 업자들에게 이해되는 바와 같이, 개인은 치료에 대한 반응의 측면에서 다양할 수 있고, 따라서, 예를 들면 "개인에서 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 발생율을 감소시키는 방법"은 이런 투여가 아마도 특정한 개인에게서 발생율을 감소시킬 수 있을 것이라는 합리적인 예상에 근거한 항-NGF 길항제 항체 투여를 반영한다.

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 "개선"은 항-NGF 길항체 항체를 투여하지 않은 경우와 비교하였을 때 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 하나 이상의 증후의 감소 또는 개선을 의미한다. "개선"은 또한 증후를 나타내는 기간을 단축 또는 감소시키는 것을 포함한다.

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 "일시적 완화"시키는 것은 개인 또는 개인들의 모집단에서 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 하나 이상의 바람직하지 않은 임상적 징후의 정도를 감소시키는 것을 의미한다.

본원에서 이용되는 통증 발전의 "지연"은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 진행을 연장, 방해, 서행, 지연, 안정화 및/또는 연기시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질병의 이력 및/또는 치료되는 개인에 따라 다양한 기간일 수 있다. 당 분야의 숙련자들에게 명확한 바와 같이 충분하거나 유의한 지연은 사실상 개인에서 통증이 발생되지 않는 예방을 포함할 수 있다. 증후의 발생을 "지연"시키는 방법은, 방법을 이용하지 않는 경우와 비교하였을 때, 주어진 시간 프레임에서 증후가 발생될 가능성을 감소시키고/시키거나, 주어진 시간 프레임에서 증후의 정도를 감소시키는 방법이다. 이런 비교는 전형적으로 통계학적으로 유의한 수의 개체를 이용한 임상 연구에 근거한다.

본원에서 이용되는 "통증"은 급성 통증, 만성 통증, 및 염증 요소를 갖는 임의의 통증을 비롯한 임의의 병인의 통증을 의미한다. 본원에서 이용되는 "통증"은 통증의 수용 및 감지를 포함하고, 통증은 통증 점수 및 당 분야에 잘 공지된 다른 방법을 이용하여 주관적으로 및 객관적으로 평가될 수 있다. 당 분야에 공지되어 있는 바와 같이 통증은 1차 또는 2차 통증일 수 있다.

본원에서 이용되는 "간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증"은 하복부(골반) 통증; 방광 통증; 치골위 통증; 질 통증; 음경, 고환, 음낭 및 회음부의 통증; 요도 통증; 성교통; 방광이 채워짐에 따라 증가할 수 있는 통증, 압력 또는 불편함을 포함한다.

"간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 하부 요로 증후군"은 저장(자극성), 배설(폐색성) 및 배뇨후 증후군으로서 정의될 수 있는 3가지 군의 요로 증후를 포함한다. 저장 증후는 절박성, 빈발성, 야뇨증, 절박성 요실금 및 스트레스성 요실금을 포함하고, 이들은 과민성 방광(OAB) 및 양성 전립선 비대증(BPH)과 관련될 수 있다. 배설 증후는 배뇨지연, 열악한 흐름, 간헐성, 힘주기 및 배뇨곤란을 포함한다. 배뇨후 증후는 소변이 조금씩 떨어지는 현상, 배설후 조금씩 떨어지는 현상 및 불완전하게 비운 느낌을 포함한다.

"민감성 방광(OAB)"은 절박성 요실금이 있거나 없고, 일반적으로 빈뇨와 야뇨증이 있는 절박성으로 정의된다([Abrams et al., Neurourology and Urodynamics 21:167-178 (2002)]). OAB의 유병율은 남성과 여성에서 비슷하며, 미국 인구의 약 16%가 이 증상으로 고통받고 있다([Stewart et al, Prevalence of Overactive Bladder in the United States: Results from the NOBLE Program; Abstract Presented at the 2^nd International Consultation on Incontinence, July 2001, Paris, France].

용어 OAB Wet 및 OAB Dry는 각각 요실금이 있고 없는 OAB 환자를 의미한다. 이전에, OAB의 근본적인 증후는 요실금으로 생각되어왔다. 그러나, 새로운 측면이 출현함에 따라, 이는 요실금이 없는 다수의 환자(즉, OAB Dry 환자)에게는 명확하게 유효하지 않다. 따라서, 리버만(Liberman) 등의 2001년의 연구['Health Related Quality of Life Among Adults with Symptoms of Overactive Bladder: Results From A US Community-Based Survey'; Urology 57(6), 1044-1050, 2001]는 미국 국민의 지역사회에 근거한 시료에서 모든 OAB 증후가 삶의 질에 미치는 영향을 조사하였다. 이 연구는 뇨의 임의의 명백한 손실이 없고 OAB로 고통받는 사람들의 경우 대조군과 비교하였을 때 삶의 질이 손상됨을 입증하였다.

"BPH"는 급성 요축적, 재발성 요로 감염, 방광 결석 및 신장 기능부전과 같은 복합증을 야기할 수 있는 만성 진행성 질환이다. 남성에서 BPH와 관련된 LUTS의 유병율 및 평균 가혹성은 나이가 듬에 따라 증가한다. BPH는 전립선 부피를 증가시키고, 요로와 방광의 유출을 폐색시키며, 방광 기능을 이차적으로 변화시킨다. 이러한 효과들은 저장(자극성) 및 배설(폐색성) 증후 둘 모두에서 명확하다.

"생물학적 시료"는 개인들로부터 수득되고 진단 또는 모니터링 분석법에서 이용될 수 있는 다양한 유형의 시료를 포함한다. 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 시료, 고형 조직 시료, 예를 들면 생검 시편 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포, 및 이의 자손을 포함한다. 이 용어는 또한 이들을 획득한 이후 임의의 방식으로 조작된, 예를 들면 시약으로 처리되거나, 용해되거나, 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 특정 성분이 풍부하거나, 절편을 만들 목적으로 반-고형 또는 고형 매트릭스에 매립된 시료를 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 임상 시료를 포함하고, 또한 배양액, 세포 상층액, 세포 용균액, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 시료 중의 세포를 포함한다.

"개인" 또는 "개체"는 척추 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 농장 동물(예를 들면 소), 스포츠 동물, 애완동물(예를 들면 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.

본원에서 이용되는 "벡터"는 숙주 세포에서 흥미있는 하나 이상의 유전자 또는 서열을 운반 및 바람직하게는 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 축합제와 조합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 일부 진핵 세포, 예를 들면 생산자 세포를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.

본원에서 이용되는 "발현 조절 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 프로모터, 예를 들면 구성적 또는 유도성 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사되는 핵산 서열에 기능적으로 연결되어 있다.

본원에서 이용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분과 조합되었을 때 성분이 생물학적 활성을 유지하게 허용하면서 개체의 면역계에 비-반응성인 임의의 물질을 의미한다. 예는 임의의 표준 약학 담체, 예를 들면 포스페이트 완충된 식염수 용액, 물, 유화액, 예를 들면 오일/물 유화액, 및 다양한 유형의 습윤화제를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충된 식염수 또는 보통(0.9%) 식염수이다. 이런 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 종래의 방법(예를 들면 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조)에 의해 배합된다.

본원에서 사용되는 용어 "K_off _"는 항체-항원 상호작용에서 항체의 해리를 위한 오프(off) 속도 상수를 의미하고자 한다. 본원에서 사용되는 용어 "K_on"은 특정한 항체-항원 상호작용의 온-속도 또는 결합 속도를 의미하고자 한다. 본원에서 이용되는 용어 "K_D"는 K_off와 K_on의 비로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표현되는 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하고자 한다. 항체에 대한 K_D 값은 당 분야에 잘 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 측정하기 위한 한가지 방법은 전형적으로 바이아코어(Biacore: 등록상표) 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 이용하는 표면 플라스몬 공명을 이용하는 것이다.

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 치료 또는 예방을 위해 항-NGF 길항제 항체를 이용하는 방법

본 발명은 인간과 비-인간 둘 모두를 비롯한 포유동물을 포함하는 개인에서 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 효과량의 항-NGF 길항제 항체를 투여함을 포함하는 개인에서 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 적합한 항-NGF 길항제 항체는 본원에 개시되어 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 개인에서 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 발생, 진전 또는 진행의 발생율 감소, 개선, 억제, 일시적 완화 및/또는 지연시키기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군을 갖는 개인에게 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군이 발전하기 전에 투여된다.

항-NGF 길항제 항체는 임의의 적합한 경로에 의해 개인에게 투여될 수 있다. 서로 다른 투여 경로의 예가 본원에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 15주마다 1회, 20주마다 1회, 25주마다 1회, 26주마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 1달마다 1회, 2달마다 1회, 3달마다 1회, 4달마다 1회, 5달마다 1회 또는 6달마다 1회 투여된다.

통증 경감 또는 하부 요로 증후군의 경감은 경감의 시간 과정을 그 특징으로 한다. 따라서, 일부 실시양태에서 경감은 항-NGF 길항제 항체를 투여한지 약 24시간 이내에 관찰된다. 다른 실시양태에서 경감은 항-NGF 길항제 항체를 투여한지 약 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 4일 이내에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 빈도 및/또는 강도는 감소되고/되거나 이러한 질환을 앓는 이들의 삶의 질이 개선된다. 일부 실시양태에서는, 항-NGF 길항제 항체의 단일 투여 후, 약 7일 이상, 약 14일 이상, 약 21일 이상, 약 28일 이상, 약 35일 이상, 약 42일 이상, 약 49일 이상, 약 56일 이상, 약 63일 이상, 약 70일 이상, 약 77일 이상, 약 84일 이상, 약 180일 이상, 또는 이보다 더 오래 동안 통증 경감이 제공된다.

통증 경감 또는 하부 요로 증후군의 경감은 통증 수치 등급 스케일(NRS)의 변화, 오리리-상트(O'Leary-Sant) 간질성 방광염 증후 지수(ICSI)의 변화, 오리리-상트 간질성 방광염 문제 지수(ICPI)의 변화, 골반 통증 및 절박뇨/빈뇨(PUF) 증후군 점수의 변화, 및/또는 배뇨 빈도, 야뇨 빈도, 요실금 에피소드 빈도, 배뇨당 평균 체적, 평균 간질성 방광염 통증 심각성, 절박뇨 에피소드, 평균 수면 교란 점수, 성 활동과 관련된 통증의 평균 통증 점수, 전반적인 반응 평가, 평가에 영향을 미치는 환자 보고 치료, 치료 실패, 생물학적 마커, 안전성 종말점 및/또는 약동학적 측정치를 포함하는 배뇨 변수에서의 변화를 특징으로 할 수 있다. 생물학적 마커는 그 중에서도 NGF, 당단백질-51(GP-51), 항증식 인자(APF) 및 HB-상피 성장 인자(HB-EGF)를 포함할 수 있다.

(간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군에 관한) 본 발명의 방법에 이용하기 위한 예시적인 항-NGF 항체는 항-NGF 길항제 항체이고, 이는 수용체 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 도출과 같은 NGF 신호전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 비롯한 NGF의 생물학적 활성을 (유의하게) 차단, 억제 또는 감소시키는 임의의 항체를 의미한다. 용어 "길항제"는 생물학적 작용의 특정한 기작을 의미하는 것이 아니고, 명확하게 NGF와의 모든 가능한 약리학적, 생리적 및 생화학적 상호작용, 및 다양한 서로 다른 화학적으로 발산성인 조성물에 의해 달성될 수 있는 이의 결과를 포함하고자 한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "길항제"는 모든 이전에 정의된 용어, 제목 및 작용 상태, 및 이에 의해 NGF 그자체, NGF 생물학적 활성(수술후 통증의 임의의 양상을 매개하는 능력을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다) 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 유의한 정도로 실질적으로 무효가 되거나, 감소되거나, 중화되는 특징을 포함하는 것으로 명확하게 이해되어야만 한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF에 결합(물리적으로 상호작용)하고, NGF 수용체(예를 들면 trkA 수용체 및/또는 p75 수용체)에 결합하고/하거나 NGF 수용체 신호전달 다운스트림을 감소(방해 및/또는 차단)한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF(예를 들면 hNGF)에 결합하고, 관련된 뉴로트로핀, 예를 들면 NT-3, NT4/5 및/또는 BDNF에 유의하게 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 부정적인 면역 반응과 관련되어 있지 않다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 인간화된다(예를 들면 본원에 개시된 항체 E3). 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체는 (본원에 개시된 바와 같은) 항체 E3이다. 다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상(예를 들면 1, 2, 3, 4, 5 또는 일부 실시양태에서는 E3에서 나온 6개 CDR 모두)의 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간의 것이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 서열번호 1(제WO2004/058184호의 도 1A)에 도시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2(제WO2004/058184호의 도 1B)에 도시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 개질된 불변 영역, 예를 들면 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 포함하고, 예를 들면 보체 매개된 용균을 야기하지 않거나, 항체-의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는다. 다른 실시양태에서, 불변 영역은 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624] 및 제PCT WO9958752호에 개시된 바와 같이 개질된다.

본 발명의 방법에서 이용되는 항체는 임의의 (하나 이상의) 하기 특징을 특징으로 한다: (a) NGF에 대한 결합 능력; (b) NGF의 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호 전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 감소 및/또는 억제하는 능력; (c) 마우스 E13.5 3차 신경 뉴론의 NGF-의존적 생존을 감소 및/또는 억제하는 능력; (d) NT3, NT4/5 및/또는 BDNF에 대한 임의의 유의한 교차 반응성의 부재; (e) 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료 및/또는 예방하는 능력; (f) NGF의 일소를 증가시키는 능력; (g) 예를 들면 키나제 수용체 활성화 분석법(KIRA)(미국 특허 제6,027,927호 참고)을 이용하여 검출되는 바와 같은 trkA 수용체의 활성화를 감소 또는 억제하는 능력.

본 발명에서, 항체는 NGF 및/또는 NGF 신호전달 작용에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제하는 방식으로 NGF와 반응한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 인간 NGF를 인식한다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 인간 NGF에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 관련된 뉴로트로핀, 예를 들면 NT-3, NT4/5 및/또는 BDNF에 유의하게 결합하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF에 결합하여 NGF가 생체 내에서 이의 TrkA 및/또는 p75 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 억제하고/하거나 NGF가 이의 TrkA 및/또는 p75 수용체를 활성화시키는 것을 효과적으로 억제할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 모노클론 항체이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 인간화된다(예를 들면 본원에 개시된 항체 E3). 일부 실시양태에서, 항체는 인간의 것이다. 예를 들면 항체 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 및 4G6을 개시하고 있는 제WO 2005/019266호를 참고할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 마우스 또는 래트 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 영장류, 개과, 고양이과, 말과 및 소과로 구성된 군에서 선택되는 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 본질적으로 MAb 911, MAb 912 및 MAb 938([Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)] 참고); 본원에 개시된 바와 같은 항체(예를 들면 항체 E3); 및/또는 제WO20050019266호에 개시된 바와 같은 항체(항체 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 및 4G6 포함) 또는 제WO2006131951호에 개시된 바와 같은 항체(항체 Hu-αD11 포함)중 임의의 하나 이상에서 선택된 항체와 동일한 NGF 에피토프 상에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체는 MAb 911과 동일한 에피토프 상에서 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 포함한다(예를 들면 보체 매개된 용균 또는 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 야기하지 않는다). ADCC 활성은 미국 특허 제5, 500, 362호에 개시된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; 제PCT WO9958752호에 개시된 바와 같이 개질된다.

일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 항체 "E3"이라 불리는 인간화된 마우스 항-NGF 모노클론 항체, 본원에 개시된 E3 관련된 항체중 임의의 것 또는 이의 임의의 절편이다.

모 쥐과 항-NGF 모노클론 항체 911과 비교하였을 때 높은 친화성 및 느린 해리 동역학으로 인간 NGF에 결합하는 항체 E3의 결합 성능을 하기에 요약하였다. E3은 모 마우스 항체 911에 비해 약 50배 더 높은 친화성으로 인간 NGF에 결합한다.

E3 항체 및 관련된 항체는 또한, 본원에 그 내용이 참고로 혼입되어 있는 제WO2004/058184호의 실시예 2 및 3에 개시되어 있는 시험관 내 분석법에 의해 평가하였을 때 인간 NGF를 길항하는 강한 능력을 나타낸다. 예를 들면 항체 E3는 15pM의 인간 NGF의 존재하에서 약 21pM의 IC₅₀으로, 그리고, 1.5pM의 인간 NGF의 존재하에서 약 1.2pM의 IC₅₀으로 마우스 E13 3차 신경 뉴론의 NGF-의존성 생존을 길항한다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드가 추가로 확인되었고, (h) 낮은 해리 동역학으로 인간 NGF에 높은 친화성 결합(일부 양태에서 K_D는 약 2nM 미만, 및/또는 약 6x10^-5s^-1 보다 느린 k_off) 및/또는 (i) 15pM의 NGF(일부 실시양태에서 인간 NGF)의 존재하에서 약 100pM 이하의 IC₅₀, 및/또는 1.5pM의 NGF의 존재하에서 약 20pM 이하의 IC₅₀으로 마우스 E13.5 3차 신경 뉴론의 NGF-의존성 생존을 억제(차단)하는 능력을 특징으로 한다.

본 발명에서 유용한 항체는 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 절편(예를 들면 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc 등), 키메릭 항체, 이중특이적 항체, 헤테로컨쥬게이트 항체, 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 인간 항체, 및 항체의 글라이코실화 변종, 항체의 아미노산 변종 및 공유결합적으로 개질된 항체를 비롯한 필요한 특이성의 항체 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 다른 개질된 배열을 포함한다. 항체는 쥐과, 래트, 인간 또는 임의의 다른 기원(키메릭 또는 인간화된 항체 포함)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 경쇄를 포함하는 항체를 이용한다. 다른 양태에서, 항체는 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 중쇄를 포함한다. 본 발명은 E3 및 등가의 항체 절편(예를 들면 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc 등), 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연 변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 필요한 특이성의 항체(NGF) 인식 부위를 포함하는 E3의 임의의 다른 개질된 배열의 다양한 배합물을 이용한다. E3의 항체 및 폴리펩타이드 절편(이는 항체일 수도 있고 항체가 아닐 수도 있다)을 포함하는 E3의 등가의 항체, 및 E3의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드가 확인되었고, 상기 개시된 기준중 임의의 (하나 이상) 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 하기 중 임의의 것을 포함하는 임의의 조성물(약학 조성물 포함)을 이용한다:

(a) 항체 E3; (b) 항체 E3의 절편 또는 영역; (c) 서열번호 17에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄(제WO2004/058184호의 도 1B); (c) 서열번호 16에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄(제WO2004/058184호의 도 1A); (d) 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄에서 나온 하나 이상의 가변 영역; (e) 서열번호 3 내지 8에 도시된 항체 E3의 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B); (f) 서열번호 5에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄에서 나온 CDR H3(제WO2004/058184호의 도 1A); (g) 서열번호 8에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄에서 나온 CDR L3(제WO2004/058184호의 도 1B); (h) 서열번호 6 내지 8에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1B); (i) 서열번호 3 내지 5에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A); (j) 서열번호 3 내지 8에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄에서 나온 3개의 CDR 및 중쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B); 및 (k) (b) 내지 (j) 중 임의의 하나를 포함하는 항체.

항체 E3의 CDR 부분(코티아 및 카바트 CDR 포함)은 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B에 도식적으로 나타나 있고, 하기 아미노산 서열로 구성된다:

(a) 중쇄 CDR 1("CDR H1") GFSLIGYDLN(서열번호 3);

(b) 중쇄 CDR 2("CDR H2") IIWGDGTTDYNSAVKS(서열번호 4);

(c) 중쇄 CDR 3("CDR H3") GGYWYATSYYFDY(서열번호 5);

(d) 경쇄 CDR 1("CDR L1") RASQSISNNLN(서열번호 6);

(e) 경쇄 CDR 2("CDR L2") YTSRFHS(서열번호 7); 및

(f) 경쇄 CDR 3("CDR L3") QQEHTLPYT(서열번호 8).

CDR 영역의 결정은 당 분야의 기술 범위 이내이다. 일부 실시양태에서는 CDR은 카바트 및 코티아 CDR의 조합일 수 있다(또한 "조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"로서 언급된다). 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 E3의 하나 이상의, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 CDR과 실질적으로 상동성인 하나 이상의 CDR을 포함한다(또는 일부 실시양태에서는 E3 또는 E3에서 유래된 모든 6개의 CDR과 실질적으로 상동성이다). 다른 실시양태는 E3 또는 E3에서 유래된 2개 이상, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR과 실질적으로 상동성인 2개 이상, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 결합 특이성 및/또는 전반적인 활성(이는 통증의 치료 및/또는 예방 또는 E13.5 마우스 3차신경 뉴론의 NGF-의존성 생존 억제 측면일 수 있다)은 일반적으로 보유되며, E3와 비교해서 활성의 정도는 변화될 수 있는(더 커지거나 더 작아질 수 있다) 것으로 이해된다.

일부 실시양태에서, 항체는 하기의 것들중 임의의 것을 갖는 E3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: E3의 서열중 5개 이상의 연속적인 아미노산, 8개 이상의 연속적인 아미노산, 약 10개 이상의 연속적인 아미노산, 약 15개 이상의 연속적인 아미노산, 약 20개 이상의 연속적인 아미노산, 약 25개 이상의 연속적인 아미노산, 약 30개 이상의 연속적인 아미노산(여기서 아미노산중 3개 이상은 E3의 가변 영역에서 나온다). Mab911의 연장된 CDR 서열이 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B, 및 본원의 서열번호 9 내지 14에 도시되어 있다. 일부 실시양태에서, 가변 영역은 E3의 경쇄에서 나온다. 다른 실시양태에서, 가변 영역은 E3의 중쇄에서 나온다. 다른 실시양태에서, 5개(또는 그 이상)의 연속적인 아미노산은 서열번호 3 내지 8(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B)에 도시된 E3의 상보성 결정 영역(CDR)에서 나온다.

다른 실시양태에서, 항체는 하기중 임의의 것을 갖는 E3의 아미노산 서열을 포함한다: E3의 서열중 5개 이상의 연속적인 아미노산, 8개 이상의 연속적인 아미노산, 약 10개 이상의 연속적인 아미노산, 약 15개 이상의 연속적인 아미노산, 약 20개 이상의 연속적인 아미노산, 약 25개 이상의 연속적인 아미노산, 약 30개 이상의 연속적인 아미노산(여기서 E3 서열은 CDRH1의 아미노산 잔기 L29, CDRH2의 I50, CDRH3의 W101, 및/또는 CDRH3의 A103; 및/또는 CDRL1의 아미노산 잔기 S28, CDRL1의 N32, CDRL2의 T51, CDRL3의 91E 및/또는 CDRL3의 H92중 임의의 하나 이상을 포함한다).

명확한 바와 같이, 본원 전체에 걸쳐, 가변 영역에서 아미노산 잔기를 언급하는데 순차적 아미노산 번호 체계를 이용한다(즉, 각각의 가변 영역에서의 아미노산은 순서대로 번호가 매겨진다). 당 분야에 잘 공지된 바와 같이, 2개의 항체 또는 폴리펩타이드, 예를 들면 E3 항체 및 E3 변종(또는 E3 변종으로 추정되는 폴리펩타이드)를 비교할 때 카바트 및/또는 코티아 번호 시스템이 유용하다. 필요한 경우, 예를 들면 E3와 다른 폴리펩타이드를 비교하는데 이용할 때 순차적 번호 시스템을 코티아 및/또는 카바트 번호 시스템으로 전환시키는 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 제WO2004/058184호의 도 23은 순차적, 코티아 및 카바트 번호 시스템을 이용하여 번호가 매겨진 E3 가변 영역을 나타낸다. 또한, 비교를 쉽게 하기 위해서, 항상 그런 것은 아니지만 일반적으로 프레임워크 잔기는 대략 동일한 수의 잔기를 갖는 것으로 이해된다. 그러나, CDR은 크기가 다양할 수 있다(즉, 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 및/또는 결실을 가질 가능성이 있다). E3 항체 및 후보자 E3 변종(예를 들면 CDR 영역이 정렬되는 항체 C3의 서열보다 더 긴 후보자 서열에서 나온 경우)을 비교할 경우, 다음 단계를 따를 수 있다(다른 방법이 당 분야에 공지되어 있긴 하다). 후보자 항체 서열을 E3 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 정렬한다. 정렬은 손으로, 또는 흔히 허용되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 컴퓨터로 수행된다. 대부분의 Fab 서열에 공통적인 일부 아미노산 서열을 이용하여 정렬이 촉진될 수 있다. 예를 들면 경쇄 및 중쇄는 각각 전형적으로 2개의 시스테인을 갖고, 이들은 종종 보존된 위치에서 발견된다. 후보자 변종 항체의 아미노산 서열이 더 길거나(즉, 삽입된 아미노산 잔기를 갖는다) 더 짧을 수 있는(결실된 아미노산 잔기를 갖는다) 것으로 이해된다. 추가의 잔기의 삽입을 나타내기 위해 잔기 번호에 접미사가 첨가될 수 있고, 예를 들면 잔기 34abc이다. 예를 들면 잔기 33과 35에 대해 E3 서열과 정렬되지만 이들 사이에 잔기 35와 정렬하기 위한 잔기가 없는 후보자 서열의 경우, 잔기 35는 단순히 잔기로서 지정되지 않는다. 다른 방법에서는, 서로 다른 길이의 CDR을 비교할 경우 구조적으로 등가인(예를 들면 항원-항체 복합체에서 동일한 위치) 아미노산 사이를 비교하는 것이 일반적으로 잘 알려져 있다. 예를 들면 코티아 번호 시스템(상기의 문헌[Al-Lazikani et al])은 (항상은 아니지만) 일반적으로 구조적으로 정확한 위치에서 삽입 및 결실을 위치시킨다. 구조적 등가성은 또한 X-선 결정학 또는 이중 돌연변이 사이클 분석을 이용하여 추론되거나 입증될 수 있다([Pons et al. (1999) Prot. Sci. 8:958-968] 참조).

항-NGF 항체의 NGF(예를 들면 hNGF)로의 결합 친화성은 K_D의 측면에서 약 0.10 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 내지 약 0.75 nM 및 약 0.18 내지 약 0.72 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, K_D는 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM를 초과한다. 한 실시양태에서, K_D는 약 2 pM 내지 22 pM이다. 다른 실시양태에서, K_D 약 10 nM 미만, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 10 pM, 약 5 pM이다. 일부 실시양태에서, K_D는 약 10 nM이다. 다른 실시양태에서, K_D는 약 10 nM 미만이다. 다른 실시양태에서, K_D는 약 0.1 nM 또는 약 0.07 nM이다. 다른 실시양태에서, K_D는 약 0.1 nM 미만 또는 약 0.07 nM 미만이다. 다른 실시양태에서, K_D는 약 10 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 10 pM 중 임의의 값 내지 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 또는 약 40 pM중 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, K_D는 약 10 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 10 pM이다. 또다른 실시양태에서, K_D는 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM 초과이다.

항체의 NGF에 대한 결합 친화성은 당 분야에 잘 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 NGF에 대한 결합 친화성을 측정하는 한가지 방법은 항체의 일작용성 Fab 절편의 결합 친화성을 측정하는 것이다. 일작용성 Fab 절편을 수득하기 위해, 항체(예를 들면 IgG)를 파파인으로 분해하거나 재조합 발현시킬 수 있다. 항체의 항-NGF Fab 절편의 친화성이 표면 플라스몬 공명(뉴저지주 피스카웨이 소재의 바이아코어 인코포레이티드(BIACore INC)의 BIAcore3000TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템)에 의해 측정될 수 있다. CM5 칩은 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이나이드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화될 수 있다. 인간 NGF(또는 임의의 다른 NGF)는 10mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0으로 희석되고, 0.005mg/mL의 농도에서 활성화된 칩 상으로 주입된다. 개별적인 칩 채널을 가로지르는 가변 유동 시간을 이용하여 하기의 2개 범위의 항체 밀도를 달성할 수 있다: 상세한 동역학 연구를 위한 100 내지 200 반응 단위(RU), 및 스크리닝 분석을 위한 500 내지 600 RU. 칩을 에탄올아민으로 블록킹할 수 있다. 재생 연구는 피어스 용출 완충액(일리노이주 록포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology), 제품 번호 21004) 및 4M NaCl(2:1)의 혼합물이 200회 주입동안 칩 상의 hNGF의 활성을 유지시키면서도 결합된 Fab를 효과적으로 제거한다는 것을 보여주었다. HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P29)을 바이아코어 분석을 위한 작업 완충액으로 이용하였다. 정제된 Fab 시료의 연속 희석물(추정된 K_D의 0.1 내지 10x)을 100㎕/분으로 1분동안 주입하고, 2시간까지의 해리 시간을 허용하였다. Fab 단백질의 농도는 표준물로서 공지된 농도(아미노산 분석에 의해 측정됨)의 Fab를 이용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 측정된다. 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)는 BIAevaluation 프로그램을 이용하여 자료를 1:1 랑뮈르(Langmuir) 결합 모델([Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110])에 부합시켜 동시에 수득된다. 평형 해리 상수(K_D) 값은 k_off/k_on으로서 계산된다. 이 프로토콜은 인간 NGF, 다른 척추동물(일부 실시양태에서는 포유동물)의 NGF(예를 들면 마우스 NGF, 래트 NGF, 영장류 NGF)뿐만 아니라 관련된 뉴로트로핀인 NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF와 같은 다른 뉴트로핀에 대한 항체의 결합 친화성을 측정하는데 이용하기 적합하다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간 NGF에 결합하고, 다른 척추동물 종(일부 실시양태에서는 포유동물)에서 나온 NGF에는 유의하게 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서는, 항체는 인간 NGF 및 또한 다른 척추동물 종(일부 실시양태에서는 포유동물)에서 나온 하나 이상의 NGF에 결합한다. 또다른 실시양태에서는 항체는 NGF에 결합하고, 다른 뉴로트로핀(예를 들면 관련된 뉴로트로핀인 NT3, NT4/5, 및/또는 BDNF)과 유의하게 교차반응하지 않는다. 일부 실시양태에서는, 항체는 NGF뿐 아니라 하나 이상의 다른 뉴로트로핀에 결합한다. 일부 실시양태에서는, 항체가 포유동물 종, 예를 들면 말 또는 개의 NGF에는 결합하지만, 다른 포유동물 종에서 나온 NGF에는 유의하게 결합하지 않는다.

에피토프는 연속성이거나 비연속성일 수 있다. 한 양태에서, 항체는 본질적으로 [Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000)]에 개시된 바와 같은 MAb 911, MAb 912 및 MAb 938; 본원에 정의된 항체(예를 들면 항체 E3); 및/또는 제WO2005019266호에 개시된 항체(항체 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 및 4G6 포함) 또는 제WO2006131951호에 개시된 항체(항체 Hu-αD11)로 구성된 군에서 선택된 항체와 동일한 인간 NGF 에피토프에 결합하고, 이들 문헌은 본원에 전체 내용이 참고로 인용되어 있다. 다른 실시양태에서, 항체는 MAb 911과 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 MAb 909와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 문헌[Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000)]. 예를 들면 에피토프는 hNGF의 가변 영역 1(아미노산 23-35) 이내의 잔기 K32, K34 및 E35; hNGF의 가변 영역 4(아미노산 81-88) 이내의 잔기 F79 및 T81; 가변 영역 4 이내의 잔기 H84 및 K88; hNGF의 가변 영역 5(아미노산 94-98)와 hNGF의 C-말단(아미노산 111-118) 사이의 잔기 R103; hNGF의 전-가변 영역 1(아미노산 10-23) 이내의 잔기 E11; hNGF의 가변 영역 2(아미노산 40-49)와 hNGF의 가변 영역 3(아미노산 59-66) 사이의 Y52; hNGF의 C-말단 이내의 잔기 L112 및 S113; hNGF의 가변 영역 3 이내의 잔기 R59 및 R69; 또는 hNGF의 전-가변 영역 1 이내의 잔기 V18, V20 및 G23중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 에피토프는 hNGF의 가변 영역 1, 가변 영역 3, 가변 영역 4, 가변 영역 5, N-말단 영역 및/또는 C-말단중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항체는 hNGF의 잔기 R103의 용매 접근성을 유의하게 감소시킨다. 비록 상기 개시된 에피토프가 인간 NGF에 관한 것이지만, 당 분야의 숙련자들은 인간 NGF의 구조를 다른 종의 NGF와 정렬하여 이들 에피토프에 대한 대응물을 확인할 수 있는 것으로 이해된다.

일부 양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 약 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, 또는 이 미만중 임의의 IC₅₀(약 15 pM의 NGF의 존재 하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 펩타이드는 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 이 미만중 임의의 IC₅₀(약 1.5 pM의 NGF의 존재 하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 인간 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 또는 펩타이드는 약 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM 또는 이 미만중 임의의 IC₅₀(약 15 pM의 NGF의 존재 하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 래트 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM, 또는 이 미만중 임의의 IC₅₀(약 1.5 pM의 NGF의 존재 하에서)으로 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 래트 NGF-의존성 생존을 억제(감소 및/또는 차단)할 수 있다. 마우스 E13 3차신경 뉴론의 NGF-의존성 생존을 측정하는 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 제WO2004/058184호의 실시예 2에 개시되어 있다.

항- NGF 길항제 항체의 확인

본 발명에서 사용하기 위한 항-NGF 길항제 항체는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 확인되거나 특징화될 수 있고, 이에 의해 NGF의 생물학적 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출 및/또는 측정될 수 있다. 제PCT WO 04/065560 호에 개시된 방법을 이용할 수 있다. 다른 방법, 예를 들면 미국 특허 제5,766,863호 및 제5,891,650호에 개시된 키나제 수용체 활성화(KIRA) 분석법을 이용하여 항-NGF제를 확인할 수 있다. 이러한 ELISA-유형 분석법은 수용체 단백질 타이로신 키나제(이후로는 "rPTK"), 예를 들면 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 자가인산화를 측정함으로써 키나제 활성화를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 또한 선택된 rPTK, 예를 들면 TrkA의 잠재적 길항제의 확인 및 특성 규명에 적합하다. 분석법의 제 1 단계는 키나제 수용체, 예를 들면 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 인산화를 포함하고, 여기서, 수용체는 진핵 세포의 세포 막에 존재한다. 수용체는 내인성 수용체일 수 있거나, 수용체 또는 수용체 구축물을 인코딩하는 핵산이 세포로 형질전환될 수 있다. 전형적으로 제 1 고형 상(예를 들면 제 1 분석 플레이트의 웰)을 세포가 고형 상에 고착되도록 이런 세포(일반적으로 포유동물 세포주)의 실질적으로 동종의 모집단으로 코팅시킨다. 종종, 세포가 부착되고, 이에 의해 제 1 고형 상에 자연적으로 부착된다. "수용체 구축물"이 사용되는 경우, 이는 일반적으로 키나제 수용체와 플랙 폴리펩타이드의 융합체를 포함한다. 플랙 폴리펩타이드는 분석법의 ELISA 부분에서 포착제, 종종 포착 항체에 의해 인식된다. 그런 다음, 키로신 키나제 수용체(예를 들면 TrkA 수용체)가 NGF와 분석물에 노출(또는 접촉)하도록 분석물, 예를 들면 후보자 NGF 길항제(항-NGF 길항제 항체를 포함)를 NGF와 함께 부착 세포를 갖는 웰에 첨가한다. 이 분석법은 이의 리간드인 NGF에 의한 TrkA의 활성화를 억제하는 길항제(항체 포함)를 확인할 수 있다. NGF와 분석물에 노출시킨 후, 용균 완충액(이는 내부에 용해성 세제를 갖는다)을 이용하여 접착 세포를 용해시키고, 부드럽게 진탕하여, 세포 용균물을 방출시켜 세포 용균물을 농축하거나 청정화할 필요없이 분석법의 ELISA 부분에 직접 가할 수 있다.

그런 다음, 이렇게 제조된 세포 용균물은 분석의 ELISA 단에 가할 준비가 된다. ELISA 단의 제 1 단계로서, 제 2 고형 상(일반적으로 ELISA 마이크로타이터 플레이트의 웰)을 타이로신 키나제 수용체 또는 수용체 구축물의 경우 플랙 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 포착제(종종 포착된 항체)로 코팅한다. 포착제가 제 2 고형 상에 부착되도록 제 2 고형 상의 코팅을 수행한다. 포착제는 일반적으로 모노클론 항체이지만, 본원의 실시예에 개시된 바와 같이, 폴리클론 항체 또한 이용될 수 있다. 그런 다음, 수용체 또는 수용체 구축물이 제 2 고형 상에 부착(또는 포착)되도록 수득된 세포 용균물을 부착된 포착제에 노출시키거나 이와 접촉시킨다. 그런 다음, 결합되지 않은 세포 용균물이 제거되고 포착된 수용체 또는 수용체 구축물이 남도록 세척 단계를 수행한다. 그런 다음, 부착 또는 포획된 수용체 또는 수용체 구축물을 타이로신 키나제 수용체의 인산화된 타이로신 잔기를 확인하는 항-포스포타이로신 항체에 노출시키거나 이와 접촉시킨다. 한 실시양태에서, 항-포스포타이로신 항체는 비-방사활성 발색 시약의 색 변화를 촉매하는 효소에 컨쥬게이트(직접적으로 또는 간접적으로)된다. 따라서, 수용체의 인산화는 시약의 후속적인 색 변화에 의해 측정될 수 있다. 효소는 항-포스포타이로신 항체에 직접 결합될 수 있거나, 또는 컨쥬게이팅 분자(예를 들면 바이오틴)는 항-포스포로타이로신 항체에 컨쥬게이트되고, 후속적으로 컨쥬게이팅 분자를 통해 효소가 항-포스포타이로신 항체에 결합될 수 있다. 최종적으로, 항-포스포타이로신 항체의 캡쳐된 수용체 또는 수용체 구축물로의 결합이 예를 들면 발색 시약의 색 변화에 의해 측정된다.

항-NGF 길항제 항체는 또한 후보자 시약을 NGF와 항온처리하는 단계 및 하기 특징중 임의의 하나 이상을 모니터링하는 단계에 의해 확인될 수 있다: (a) NGF에 결합하고, NGF의 생물학적 활성 또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제함; (b) NGF 수용체 활성화(TrkA 이량체화 및/또는 자가인산화 포함)를 억제, 차단 또는 감소시킴; (c) NGF의 청정화 증가; (d) 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 임의의 양상을 치료 또는 예방함; (e) NGF 합성, 생산 또는 방출의 억제(감소). 일부 실시양태에서, NGF 길항제(예를 들면 항-NGF 길항체 항체)는 후보자 물질을 NGF와 항온처리하고, 결합 및/또는 NGF의 생물학적 활성의 부수적인 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 분석은 정제된 NGF 폴리펩타이드, 또는 NGF 폴리펩타이드를 자연적으로 발현하는 세포 또는 이를 발현하도록 형질감염된 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 분석은 경쟁적 결합 분석이고, 여기서, 후보제 시약(예를 들면 항체)이 NGF 결합에 대해 공지된 항-NGF 길항제 항체와 경쟁하는 능력이 평가된다. 분석법은 ELISA 포맷을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, NGF 길항제(예를 들면 항-NGF 길항제 항체)는 후보자 시약을 NGF와 함께 항온처리하고, 결합 및 trkA 수용체의 이량체화 및/또는 자가인산화의 부수적인 억제를 모니터링함으로써 확인된다.

초기의 확인 후, 후보자 항-NGF 길항제 항체의 활성은 목표로 하는 생물학적 활성을 시험하는 것으로 알려진 생물학적 검정에 의해 추가로 확인되고 상세히 논해진다. 다르게는 생물학적 검정을 이용하여 후보물질을 직접 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, NGF는 반응 세포에서 다수의 형태학적으로 인식가능한 변화를 증진시킨다. 이들은 P12 세포의 분화를 촉진시키고, 이들 세포로부터 신경돌기의 성장을 개선시키고([Greene et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 73(7):2424-8, 1976]), 반응성 감각 및 교감 신경돌기의 이식편으로부터의 신경돌기의 성장을 촉진시키고([Levi-Montalcini, R. and Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48:534-569, 1968]), 배아 후근 신경절, 3차신경 신경절 또는 교감 신경절과 같은 NGF 의존성 뉴론의 생존을 촉진시키는 것(예를 들면 [Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977)]; [Buchman & Davies, Development 118:989-1001 (1993)])을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 따라서, NGF 생물학적 활성을 억제시키기 위한 분석법은 NGF 반응성 세포를 NGF + 분석물, 예를 들면 후보자 NGF 길항제(항-NGF 길항제 항체 포함)와 함께 배양하는 것을 포함한다. 적절한 시간 후에, 세포 반응(세포 분화, 신경절 성장 또는 세포 생존)을 분석할 것이다.

후보자 NGF 길항제 항체가 NGF의 생물학적 활성을 차단 또는 중화시키는 능력은 또한, [Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)]에 개시된 바와 같이 후보자 약물이 래트의 배아 후근 신경절 생존 생물학적 검정에서 NGF 매개되는 생존을 억제하는 능력을 모니터링함으로써 평가될 수 있다.

본 발명에서 이용하기 위한 항체는 당 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 이의 일부는 제WO2004/058184호의 실시예에 예시되어 있다. 항체는 제WO2004/058184호에 개시된 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩타이드) 또는 화학적 합성에 의해, 항체의 단백질분해 또는 다른 분해에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 특히 약 50개 이하 아미노산의 더 짧은 폴리펩타이드는 편리하게는 화학적 합성에 의해 제조된다. 화학적 합성 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면 E3 항체는 고형 상 방법을 이용한 자동화된 폴리펩타이드 합성기에 의해 생성될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제6,331,415호를 참고할 수 있다. 키메릭 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합제를 이용하는 것들을 비롯한 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들면, 다이설파이드 교환 반응을 이용하거나 티오에터 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.

다른 대안적인 항체는 당 분야에 잘 공지된 방법을 이용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 E3의 가변 영역과 경쇄 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포(예를 들면 CHO 세포)에서 발현하고 증식시키기 위한 벡터로 클로닝한다. 다른 양태에서는, 제WO2004/058184호의 도 2 및 3에 도시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현 또는 증식을 위한 하나 이상의 벡터로 클로닝한다. 흥미있는 항체를 인코딩하는 서열을 숙주 세포의 벡터에서 유지한 후, 숙주 세포를 확장시키고, 미래의 이용을 위해 냉동시킨다. (발현 벡터를 포함하는) 벡터 및 숙주 세포를 본원에 추가로 개시한다. 식물 또는 우유에서 항체를 재조합적으로 발현시키기 위한 방법이 개시되어 있다. 예를 들면 [Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756]; [Lonberg, N. and D. Huszar (1995) Int.Rev.Immunol 13:65]; 및 [Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231:147]를 참고할 수 있다. 항체의 유도체, 예를 들면 인간화된 항체, 단일 쇄 항체 등을 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 예를 들면 E3의 단일 쇄 가변 영역 절편("scFv")를 포함한다. 단일 쇄 가변 영역 절편은 짧은 연결 펩타이드를 이용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 제조된다. [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]. 연결 펩타이드의 예는 (GGGGS)3 (서열번호 15)이고, 이는 한 가변 영역의 카복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5nm를 가교시킨다. 다른 서열의 연결기도 고안되고 사용되어왔다([Bird et al. (1988) Science 242:423-426]). 연결기는 또한 추가의 작용, 예를 들면 약물의 부착 또는 고형 지지체로의 부착을 위해 개질될 수 있다. 단일 쇄 변종은 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. ScFv의 합성 생산을 위해서, 자동화된 합성기가 이용될 수 있다. scFv의 재조합 생산의 경우, scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드를 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵세포 또는 이. 콜라이와 같은 원핵세포중 하나인 적합한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 결찰과 같은 일상적인 조작에 의해 흥미있는 scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제조될 수 있다. 생성된 scFv를 당 분야에 공지된 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 단리할 수 있다.

다른 형태의 단일 쇄 항체, 예를 들면 다이아바디 또한 예상된다. 다이아바디는 VH와 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄의 2개의 도메인 사이의 쌍을 허용하기에는 너무 짧은 연결기를 이용하여 도메인들이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 이가의 이중특이적 항체이다([Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).

항체는 2개 이상의 서로 다른 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체, 모노클론 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어있다(예를 들면 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참고). 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 중쇄가 서로 다른 특이성을 갖고 있는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현에 근거한다([Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539]).

이중특이적 항체를 제조하는 한가지 접근법에 따르면, 바람직한 결합 특이성(항체-항원 조합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 적어도 경첩 영역, CH2 영역 및 CH3 영역의 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 이용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제 1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 바람직하게는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 동시형질감염시킨다. 이는 구축물에 동일하지 않은 비의 3개의 폴리펩타이드 쇄를 이용하면 최적의 수율이 제공되는 실시양태에서 3개의 폴리펩타이드 절편의 상호 비율을 조절하는데 있어 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄의 발현이 높은 수율을 나타내거나 비율이 특별히 중요하지 않는 경우, 2개 또는 3개 모두의 폴리펩타이드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.

한가지 접근법에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암(arm)의 제 1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제 2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 한쪽 절반에서만 면역글로불린 경쇄를 갖는 이 비대칭 구조는 원하지 않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 바람직한 이중특이적 화합물을 구분하는 것을 용이하게 만든다. 이 접근법은 1994년 3월 3일자로 공개된 PCT 공개 공보 제WO 94/04690호에 개시되어 있다.

2개의 공유 결합된 항체를 포함하는 헤테로컨쥬게이트 항체 또한 본 발명의 범위 이내이다. 이런 항체는 면역계 세포가 원하지 않는 세포를 표적으로 가게하고(미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 이용된다(PCT 출원 공개 공보 제WO 91/00360호 및 제WO 92/200373호; 제EP 03089호). 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 종래의 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기법이 당 분야에 잘 공지되어 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체는 예를 들면 당 분야에 공지되고 본원에 개시된 바와 같은 인간화된 항체일 수 있다.

본 발명은 성질에 유의한 영향을 미치지 않는 기능적으로 등가인 항체 및 개선되거나 감소된 활성을 갖는 변종을 비롯한 항체 E3에 대한 개질을 포함한다. 폴리펩타이드의 개질은 당 분야에서는 일상적인 실시이고, 실시예에 추가로 예시되어 있다. 개질된 폴리펩타이드의 예는 기능적 활성을 유의하게 해롭게 변화시키지 않는 아미노산 잔기의 치환(보존적 치환 포함), 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함한다.

본원에서 이용되는 폴리펩타이드 "변종"은 폴리펩타이드의 면역반응성이 실질적으로 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 결실 부가 및/또는 삽입에서 천연 단백질과는 상이한 폴리펩타이드이다. 달리 말하자면, 항원에 특이적으로 결합하는 변종의 능력은 천연 단백질에 대해 개선되거나 변화되지 않을 수 있거나, 또는 천연 단백질에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만 감소될 수 있다. 폴리펩타이드 변종은 바람직하게는 확인된 폴리펩타이드와 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성(본원에 개시된 바와 같이 측정됨)을 나타낸다.

항체의 아미노산 서열 변종은 항체 DNA로 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입하거나, 펩타이드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 이런 변종은 예를 들면 본원에 개시된 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열 이내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특성을 갖는 한, 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어진다. 아미노산 변화는 또한 항체의 번역 후 공정을 변화시킬 수 있고, 예를 들면 글라이코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

돌연변이 또는 개질에 바람직한 위치인 항체의 일부 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이"라 불리고, [Cunningham and Wells, 1989, Science, 244:1081-1085]에 개시되어 있다. 아미노산의 항원과의 상호작용에 영향을 미치기 위해 잔기 또는 표적 잔기의 군을 확인하고(예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 전하), 중성 또는 음전하 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체한다. 그런 다음, 치환 부위에 추가의 또는 다른 변종을 도입함으로써 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 이들 아미노산 위치가 확인된다. 따라서, 아미노산 서열 변종을 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질이 미리 결정될 필요는 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성과를 분석하기 위해서 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이를 수행하고, 발현된 돌연변이 변종을 바람직한 활성에 대해 스크리닝한다. 본원에 개시된 바와 같은 라이브러리 스캐닝 돌연변이를 이용하여 돌연변이 또는 개질에 적합한 항체에서의 위치를 확인할 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합체, 및 또한 단일 또는 여러 아미노산 산기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 택에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입성 변종은 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.

치환 변종은 항체 분자에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입한 것이다. 치환성 돌연변이에 대해 가장 흥미있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 또한 예상된다. 보존성 치환은 표 1에서 "보존성 치환"이라는 머리말 아래에 도시되어 있다. 이런 치환으로 인해 생물학적 활성의 변화가 일어난다면, "예시적 치환"으로 명명되어 있거나, 또는 아미노산 부류에 대해 하기에 추가로 개시된 보다 실질적인 변화가 도입되어 생성물이 스크리닝될 수 있다.

[표 1]

(a) 치환 영역에서의 폴리펩타이드 주쇄의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 배열, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어 이들의 효과가 상당히 달라지는 치환을 선택함으로써 항체의 생물학적 성질에서의 실질적인 개질이 달성된다. 자연적으로 발생하는 잔기는 측쇄의 공통적인 성질에 따라 다음과 같이 나누어진다:

(1) 소수성: 노르루신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) 쇄의 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

이들 부류중 하나의 것을 다른 부류로 변화시킴으로써 비-보존성 치환이 이루어진다.

항체의 적절한 배열을 유지시키는데 관여하지 않는 임의의 시스테인은 일반적으로 분자의 산화 안정성을 증가시키고, 비정상적인 가교결합을 방지하기 위해서 세린으로 치환될 수 있다. 역으로, 항체의 안정성을 증가시키기 위해, 특히 항체가 Fv 절편과 같은 항체 절편인 경우, 시스테인 결합이 항체에 도입될 수 있다.

아미노산 개질은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 개질에서 가변 영역과 같은 영역의 재설계까지의 범위일 수 있다. 가변 영역에서의 변화가 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 5개 이하의 보존성 아미노산 치환이 CDR 도메인 이내에서 만들어진다. 다른 실시양태에서는 1 내지 3개 이하의 보존성 아미노산 치환이 CDR 도메인 이내에서 만들어진다. 또다른 실시양태에서는, CDR 도메인이 CDRH3 및/또는 CDR L3이다.

개질은 또한 글라이코실화되고 비글라이코실화된 폴리펩타이드, 및 또한 다른 번역후 개질, 예를 들면 서로 다른 당을 갖는 글라이코실화, 아세틸화 및 포스포릴화를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 그들의 불변 영역의 보존성 위치에서 글라이코실화된다([Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128]; [Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32]). 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄가 단백질의 기능([Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318]; [Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180]) 및 당단백질의 부분 사이의 분자내 상호작용(이는 당단백질의 배열 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있다)([Hefferis and Lund, supra]; [Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416])에 영향을 미친다. 올리고사카라이드는 또한 특이적 인식 구조에 근거하여 주어진 당단백질이 일부 분자를 표적으로 하도록 작용할 수 있다. 항체의 글라이코실화는 또한 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되어왔다. 특히, 양분 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글라이코실트란스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트란스퍼라제 III(GnTIII)가 테트라사이클린-조절 발현되는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다([Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180)]).

항체의 글라이코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄화수소 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 의미한다. 트라이펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄화수소 잔기가 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트라이펩타이드 서열중 하나가 폴리펩타이드에 존재하면 강력한 글라이코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글라이코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌(5-하이드록시프로필 또는 5-하이드록시라이신 또한 이용될 수 있다)에 부착되는 것을 의미한다.

항체에 글라이코실 부위가 첨가되는 것은 (N-연결된 글라이코실 부위의 경우) 전형적으로 항체가 상기 개시된 트라이펩타이드 서열중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성된다. 변경은 또한 (O-연결된 글라이코실화 부위의 경우) 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래 항체의 서열에 첨가 또는 치환함으로써 제조된다. 항체의 글라이코실화 패턴은 또한 하부의 뉴클레오타이드 서열을 변화시키지 않고 변화될 수 있다. 글라이코실화는 대부분 항체를 발현하는데 이용되는 숙주 세포에 의존한다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들면 항체를 발현하는데 이용하기 위한 세포 유형이 천연 세포인 경우는 거의 없기 때문에, 항체의 글라이코실화 패턴의 변이가 예상될 수 있다(예를 들면 [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참고).

숙주 세포의 선택에 추가하여, 항체의 재조합 생산동안 글라이코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 매질 배합, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생산에 관여하는 일부 효소를 도입하거나 과발현시키는 것을 비롯한 다양한 방법이 특정한 숙주 유기체에서 달성되는 글라이코실화 패턴을 변경시키는 것으로 제안되었다(미국 특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글라이코실화 또는 일부 유형의 글라이코실화는 예를 들면 엔도글라이코시다제 H(EndoH)를 이용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 폴리사카라이드의 일부 유형의 가공에서 결합이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 및 유사한 기법이 당 분야에 잘 공지되어 있다.

다른 개질 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당 분야에 공지된 커플링 기법을 포함한다. 개질은 예를 들면 면역분석을 위한 라벨의 부착을 위해 사용될 수 있다. 개질된 E3 폴리펩타이드는 당 분야에서 확립된 방법을 이용하여 제조되고 당 분야에 공지된 표준 분석을 이용하여 스크리닝될 수 있고, 이의 일부는 하기 실시예에 개시되어 있다.

다른 항체 개질은 1999년 11월 18일에 공개된 PCT 공개공보 제WO99/58572호에 개시된 바와 같이 개질된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에 대한 결합 도메인에 추가하여 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 효능기 도메인을 포함한다. 이들 항체는 유의한 보체 의존성 용균 또는 표적의 세포 매개된 파괴를 야기하지 않고 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효능기 도메인은 FcRn 및/또는 FcγIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메릭 도메인에 근거한다. 이런 방식으로 개질된 항체는 염증 및 종래의 항체 치료에서의 다른 부작용을 피하면서 만성 항체 치료법에 이용하기에 특히 적합하다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드에서 나온 하나 이상의 절편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 이용한다. 한 실시양태에서, 서열번호 2(제WO2004/058184호의 도 1B)에 도시된 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 연속적인 아미노산, 및/또는 서열번호 1(제WO2004/058184호의 도 1A)에 도시된 가변 중쇄 영역의 10개이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩타이드는 서열번호 1 및 2(제WO2004/058184호의 도 1A 및 도 1B)에 도시된 E3의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 양태에서, 융합 폴리펩타이드는 E3의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩타이드는 항체 E3의 CDR H3 및/또는 CDR L3를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩타이드는 하기의 것들중의 임의의 하나 이상을 포함한다: CDRH1의 아미노산 잔기 L29, CDRH2의 I50 , CDRH3의 W101, 및/또는 CDRH3의 A103; 및/또는 CDRL1의 아미노산 잔기 S28, CDRL1의 N32, CDRL2의 T51, CDRL3의 91E 및/또는 CDRL3의 H92. 본 발명의 목적을 위해, E3 융합 단백질은 하나 이상의 E3 항체 및 천연 분자에서 부착되지 않는 다른 아미노산 서열, 예를 들면 다른 영역과 이종의 서열 또는 동종의 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 FLAG 택 또는 6His 택과 같은 택을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 택은 당 분야에 잘 공지되어 있다.

E3 융합 폴리펩타이드는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들면 합성 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 전형적으로, E3 융합 단백질은 예를 들면 화학적 합성을 비롯한 당 분야에 공지된 임의의 다른 수단에 의해 제조될 수 있지만, 본원에 개시된 재조합 방법을 이용하여 이들을 인코딩하는 발현 폴리뉴클레오타이드를 준비함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드의 능력, 예를 들면 NGF 결합; NGF의 생물학적 활성 감소 또는 억제; E13.5 마우스 3차신경 뉴론의 NGF-유도된 생존의 감소 및/또는 차단은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 시험될 수 있고, 이중 일부는 제WO2004/058184호의 실시예, 특히 제WO2004/058184호의 실시예 2 및 3에 개시되어 있다.

본 발명은 또한 항체 E3, 및 본원에 개시된 임의의 또는 모든 항체 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(약학 조성물 포함) 및 키트를 이용한다. 이런 조성물 및 키트는 개인에서 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 하나 이상의 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료 및/또는 예방하는데 이용될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 , 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 (제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체를 비롯한) 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 본 발명의 방법에 이용하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

따라서, 폴리뉴클레오타이드(또는 약학 조성물을 포함한 조성물)는 하기의 것들중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: (a) 항체 E3, (a) 항체 E3; (b) 항체 E3의 절편 또는 영역; (c) 서열번호 17에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄(제WO2004/058184호의 도 1B); (d) 서열번호 16에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄(제WO2004/058184호의 도 1A); (e) 항체 E3의 경쇄 및/또는 중쇄에서 나온 하나 이상의 가변 영역; (f) 서열번호 3 내지 8에 도시된 항체 E3의 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A 및1B); (g) 서열번호 5에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄에서 나온 CDR H3(제WO2004/058184호의 도 1A); (h) 서열번호 8에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄에서 나온 CDR L3(제WO2004/058184호의 도 1B); (i) 서열번호 6 내지 8에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1B); (j) 서열번호 3 내지 5에 도시된 바와 같은 항체 E3의 중쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A); (k) 서열번호 3 내지 8에 도시된 바와 같은 항체 E3의 경쇄에서 나온 3개의 CDR 및 중쇄에서 나온 3개의 CDR(제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B); 및 (l) (b) 내지 (k) 중 임의의 하나를 포함하는 항체. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 76 및 77(제WO2004/058184호의 도 2 및 3)에 도시된 폴리뉴클레오타이드중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 ATCC No. PTA-4893 또는 ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 E3 경쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 이용한다. 다른 양태에서, 본 발명은 ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 E3 중쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 이용한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 (a) ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 폴리펩타이드에 인코딩된 가변 영역 및 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 폴리펩타이드에 인코딩된 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 이용한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 (a) ATCC No. PTA-4894의 기탁 번호를 갖는 폴리펩타이드에 인코딩된 하나 이상의 CDR; 및/또는 (b) ATCC No. PTA-4895의 기탁 번호를 갖는 폴리펩타이드에 인코딩된 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 이용한다. ATCC 기탁번호 PTA-4893, ATCC No. PTA-4894 및 ATCC No. PTA-4895의 기탁은 제WO2004/058184호에 개시되어 있고, 이의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다.

본원에 개시된 (항체 절편을 비롯한) 임의의 항체 및 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물(예를 들면 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 E3 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항체 및 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 제WO2004/058184호의 도 2 및 3에 도시된 폴리뉴클레오타이드중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 발현 벡터 및 폴리뉴클레오타이드 조성물의 투여는 본원에 추가로 개시되어 있다.

또다른 양태에서, 본 발명은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료하기 위한 방법에서 이용하기 위한 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

임의의 이러한 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드 또한 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 HnRNA 분자(이는 인트론을 함유하고, 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응한다) 및 mRNA 분자(이는 인트론을 함유하지 않는다)를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내부에 존재할 수 있지만, 반드시 존재할 필요는 없고, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만, 반드시 연결될 필요는 없다.

폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 항체 또는 이의 일부를 인코딩하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이런 서열의 변종을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변종은 인코딩된 폴리펩타이드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 없어지지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 인코딩된 폴리펩타이드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 개시된 바와 같이 평가될 수 있다. 변종은 바람직하게는 천연 항체 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타낸다.

하기 개시된 바와 같이 최대 상응하도록 배열되었을 때, 2개의 서열에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 동일한 경우, 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 "동일하다"고 말해진다. 서열 유사성의 국소적 영역을 확인하고 비교하기 위한 비교 윈도우에서 서열들을 비교함으로써 전형적으로 2개의 서열을 비교한다. 본원에서 이용되는 "비교 윈도우"는 약 20개 이상, 일반적으로 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 연속적인 위치의 절편을 의미하고, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 배열한 후 동일한 수의 연속적인 위치의 기준 서열에 대해 비교될 수 있다.

비교하기 위해 서열을 최적으로 배열하는 것은 디폴트 변수를 이용하여 생물정보 소프트웨어의 레이저진 슈트(Lasergene suite)의 메그얼라인(Megalign) 프로그램(위스콘신주 매디슨 소재의 DNASTAR Inc.)을 이용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 하기 문헌에 개시된 여러 정렬 방식을 실현한다: [Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; [Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153]; [Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17]; [Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105]; [Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; [Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; [Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].

바람직하게는, "서열 동일성 %"는 20개 이상의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적 배열된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서, 비교 윈도우의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 배열을 위해 (부가 또는 결실을 함유하지 않는) 기준 서열과 비교하였을 때 20% 미만, 일반적으로 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. %는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 2개의 서열에서 발생하여 일치되는 위치의 수를 생성하는 위치의 수를 측정하는 단계, 일치된 위치의 수를 기준 서열에 존재하는 위치의 총 수(즉, 윈도우 수)로 나누는 단계, 및 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 %를 생성하는 단계에 의해 계산된다.

변종은 또한 또는 다르게는 천연 유전자 또는 이의 일부 또는 상보체와 실질적으로 상동성일 수 있다. 이런 폴리뉴클레오타이드 변종은 온화하게 엄격한 조건 하에서 천연 항체를 인코딩하는 천연 DNA 서열(또는 상보적 서열)에 하이브리드를 형성한다.

적합한 "온화하게 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서의 예비 세척; 50℃-65℃, 5 X SSC에서 하룻밤동안 하이브리드 형성; 각각 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC를 이용하여 65℃에서 20분간 세척하는 것을 포함한다.

본원에서 이용되는 "매우 엄격한 조건" 또는 "매우 엄한 조건"은 하기의 것들이다: (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들면 50℃에서 0.015M 염화 나트륨/0.0015M 시트르산 나트륨/0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 이용함; (2) 하이브리드 중에 42℃에서 변성제, 예를 들면 포름알데하이드, 예컨대 0.1% 소의 혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.5)가 있는 50%(v/v) 포름알데하이드를 750mM 염화 나트륨, 75mM 시트르산 나트륨과 함께 이용함; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름알데하이드, 5X SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산 나트륨), 50mM 인산 나트륨(pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 5x 덴하트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 이용하고, 42℃에서 0.2XSSC(염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50% 포름알데하이드로 세척한 후 55℃에서 EDTA를 함유한 0.1XSSC로 구성된 높은 엄격성 세척을 이용함. 당 분야의 숙련자들은 프로브 길이 등과 같은 인자들을 수용하는데 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인식할 것이다.

당 분야의 숙련자들은 유전자 코드 디제너러시(degeneracy)의 결과로서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드의 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소의 유사성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에서 명확하게 예상된다. 또한 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립 유전자가 본 발명의 범위 이내이다. 대립 유전자는 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연 변이의 결과로서 변화되는 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변화된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 대립 유전자는 표준 기법(예를 들면 혼성화, 증식 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인된다.

본 발명에서 이용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 이용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있고 본원에 상세하게 개시할 필요는 없다. 당 분야의 숙련자들은 본원에 제공된 서열 및 상업적 DNA 합성기를 이용하여 바람직한 DNA 서열을 생산할 수 있다.

재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 경우, 본원에 추가로 논의된 바와 같이 바람직한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 벡터로 삽입하고, 그런 다음 벡터를 복제와 증폭을 위한 적합한 숙주 세포로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포로 삽입될 수 있다. 세포는 직접적 흡수, 엔도시토시스, 형질감염, F-교배 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질감염된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비-통합된 벡터(예를 들면 플라스미드)로 세포 내부에서 유지되거나 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오타이드는 당 분야에 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들면 [Sambrook et al. (1989)]를 참고할 수 있다.

다르게는, PCR은 DNA 서열의 복제를 허용한다. PCR 기법은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호, 및 또한 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994)]에 개시되어 있다.

RNA는 적절한 벡터 중의 단리된 DNA를 이용하고 이를 적합한 숙주 세포에 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, RNA는 당 분야의 숙련자들에게 잘 공지된 방법, 예를 들면 [Sambrook et al. (1989)]에 개시된 방법을 이용하여 단리될 수 있다.

적합한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라 구축되거나, 당 분야에서 이용가능한 많은 수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터가 사용되고자 하는 숙주 세포에 따라 다양할 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제할 수 있는 능력을 가질 것이고, 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커를 위한 유전자를 가질 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들면 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들면, pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예를 들면 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 바이오래드(BioRad), 스트라트진(Strategene) 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 상업적인 판매자로부터 이용가능하다.

발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오타이드 구축물이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 일부중 하나로서 숙주 세포에서 복제가능해야만 한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미스, 바이러스 벡터(아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미스 및 PCT 공개 공보 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 벡터 성분은 다음중 하나 이상을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기원; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소(예를 들면 프로모터, 인핸서 및 터미네이터). 발현(즉, 번역)을 위해서, 하나 이상의 번역 조절 요소, 예를 들면 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 중단 코돈이 또한 일반적으로 요구된다.

흥미있는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 이용한 형질감염; 미세입자투사 충격; 리포펙션(lipofection); 및 감염(예를 들면 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 임의의 수의 적절한 수단에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 도입 방법은 종종 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 수주 세포를 이용한다. 이종 DNA를 과발현시킬 수 있는 임의의 숙주 세포를 흥미있는 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 단리시킬 목적으로 이용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비 한정적인 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 또한, PCT 공개 공보 제WO 87/04462호를 참고할 수 있다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들면 이. 콜라이 또는 비. 섭틸리스) 및 효모(예를 들면 에스. 세레비사에, 에스. 폼베; 또는 케이.락티스)를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 존재하는 경우, 숙주 세포 중에 존재하는 상응하는 내인성 항체 또는 단백질에 비해 약 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 보다 더 바람직하게는 20배 이상의 수준으로 cDNA를 발현한다. NGF에 대한 특정한 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역분석법 또는 FACS에 의해 수행된다. 흥미있는 항체 또는 단백질을 과발현시키는 세포가 또한 확인될 수 있다.

본 발명의 방법에 이용하기 위한 조성물

(간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군에 대해) 본 발명의 방법에서 이용하기 위한 조성물은 효과양의 항-NGF 길항제 항체를 포함하고, 일부 양태에서는, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 이런 조성물, 및 또한 이를 배합하는 방법의 예가 또한 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF에 결합하고, 관련된 뉴로트로핀(예를 들면 NT3, NT4/5 및/또는 BDNF)과 유의하게 교차반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 불리한 면역 반응과 관련되지 않는다. 다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간의 NGF를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간의 것이다. 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 인간화된다(예를 들면 본원에 개시된 항체 E3). 또다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 원하지 않거나 바람직하지 않은 면역 반응, 예를 들면 항체-매개된 용균 또는 ADCC를 야기하지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR(E3의 예를들면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 일부 실시양태에서는 6개 모두의 CDR)을 포함한다.

조성물은 하나 이상의 NGF 길항제를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 조성물은 서로 다른 부류의 NGF 길항제(예를 들면 항-NGF 항체 및 NGF 억제 화합물) 뿐만 아니라 하나 이상의 부류의 NGF 길항제(예를 들면 NGF의 서로 다른 에피토프를 인식하는 항-NGF 항체의 혼합물)를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프를 인식하는 하나 이상의 항-NGF항체, NGF의 다른 에피토프에 결합하는 다른 종의 항-NGF 항체, 또는 다른 NGF 억제 화합물을 포함한다.

본 발명에 이용되는 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다([Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]). 약학적으로 허용가능한 부형제가 본원에 추가로 개시되어 있다.

항-NGF 길항제 항체 및 이의 조성물은 또한 약물의 효능을 개선 및/또는 보완하는 작용을 하는 다른 약물, 예를 들면 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 치료 또는 예방에 사용되는 약물과 함께 이용될 수 있다. 항-NGF 길항제 항체는 하나 이상의 이런 약물과 조합되어 동시에, 순차적으로, 또는 별개로 투여될 수 있다.

항-NGF 항체는 하나 이상의 다른 약물과 함께 (또는 이의 임의의 조합물로서) 투여될 수 있다. 항-NGF 항체는 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)를 치료하기 위한 다른 약학적 활성 화합물, 또는 둘 이상의 다른 약학적 활성 화합물과 유용하게 조합될 수 있다. 예를 들면, 상기 정의된 바와 같은 항-NGF 항체는 하기에서 선택된 하나 이상의 약물과 조합되어 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여될 수 있다:

·오피오이드 진통제, 예를 들면 모르핀, 헤로인, 하이드로모폰, 옥시모폰, 레보파놀, 레발로판, 메타돈, 머페리딘, 펜타닐, 코카인, 코데인, 다이하이드로코데인, 옥시코돈, 하이드로코돈, 프로폭시펜, 날메펜, 날로핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노핀, 부토파놀, 날부핀 또는 판타조신;

·비스테로이드성 소염제(NSAID), 예를 들면 아스피린, 다이클로페낙, 다이플루시날, 에토돌락, 펜부펜, 페노프로펜, 플루페니살, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페남산, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프로센, 니메설라이드, 니트로플루비프로펜, 올살라진, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캄, 설파살라진, 설린닥, 톨메틴 또는 조메피락;

·바비투레이트 진정제, 예를 들면 아모바비탈, 아프로바비탈, 부타바비탈, 부타비탈, 메포바비탈, 메타비탈, 메토헥시탈, 펜토바비탈, 페노바비탈, 세코바비탈, 탈부탈, 테아미랄 또는 티오펜탈;

·진정 작용을 갖는 벤조다이아제핀, 예를 들면 클로르다이아제폭사이드, 클로라제페이트, 다이아제팜, 플루라제팜, 로라제팜, 옥사제팜, 테마제팜 또는 트라이아졸람;

·진정 활성을 갖는 H₁ 길항제, 예를 들면 다이펜하이드라민, 피릴라민, 프로메타진, 클로르페니라민 또는 클로로사이클리진;

·진정제, 예를 들면 글루테티마이드, 메프로바메이트, 메타쿠알론 또는 다이클로로알페나존;

·골격근 이완제, 예를 들면 바클로펜, 카리소프로돌, 클로족사존, 사이클로벤자프린, 메토카바몰 또는 오르프레나딘;

·NMDA 수용체 길항제, 예를 들면 덱스트로메토판 ((+)-3-하이드록시-N-메틸모피난) 또는 이의 대사산물인 덱스트로판 ((+)-3-하이드록시-N-메틸모피난), 케타민, 메마틴, 피롤로퀴놀린 퀴닌, 시스-4-(포스포노메틸)-2-피페리딘카복실산, 부디핀, EN-3231(모피덱스(MorphiDex: 등록상표, 모르핀과 덱스트로메토판의 조합 제제), 토피라메이트, 네라멕산 또는 페르진포텔, 예를 들면 이펜프로딜, 트락소프로딜 또는 (-)-(R)-6{2-[4-(3-플루오로페닐)-4-하이드록시-1-피페리디닐]-1-하이드록시에틸-3,4-다이하이드로-2(1H)-퀴놀린온과 같은 NR2B 길항제 포함;

·알파-아드레날린 약물, 예를 들면 독사조신, 탐술로신, 클로니딘, 구안파신, 덱스메타토미딘, 모다피닐, 테라조신, 인도라민, 알푸조신, 실로도신 또는 4-아미노-6,7-다이메톡시-2-(5-메탄-설폰아미도-1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀-2-일)-5-(2-피리딜)퀴나졸린; 프라조신

·삼환상 항우울제, 예를 들면 데시프라민, 이미프라민, 아미트립틸린 또는 노르트립틸린;

·경련방지제, 예를 들면 카바마제핀, 라모트리긴, 토피라트메이트 또는 발프로에이트;

·타키키닌(NK) 길항제, 특히 NK-3, NK-2 또는 NK-1 길항제, 예를 들면 (αR,9R)-7-[3,5-비스(트라이플루오로메틸)벤질]-8,9,10,11-테트라하이드로-9-메틸-5-(4-메틸페닐)-7H-[1,4]다이아조시노[2,1-g][1,7]-나프티리딘-6-13-다이온(TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-비스(트라이플루오로메틸)페닐]에톡시-3-(4-플루오로페닐)-4-모폴리닐]-메틸]-1,2-다이하이드로-3H-1,2,4-트라이아졸-3-온(MK-869), 아프레피탄트, 라네피탄트, 다피탄트 또는 3-[[2-메톡시-5-(트라이플루오로메톡시)페닐]-메틸아미노]-2-페닐피페리딘(2S,3S);

·무스카린 길항제, 예를 들면 옥시부티닌, 톨테로딘, 페소테로딘, 5-하이드록시메틸톨테로딘, 프로피베린, 트로스피움 클로라이드, 다리페나신, 솔리페나신, 테미베리딘 및 이프라트로피움;

·COX-2 선택적 억제제, 예를 들면 셀레콕시브, 로페콕시브, 파레콕시브, 발데콕시브, 데라콕시브, 에토리콕시브, 또는 루미라콕시브;

·콜타르 진통제, 특히 아세트아미노펜/파라세타몰;

·신경이완제, 예를 들면 드로페리돌, 클로르프로마진, 할로페리돌, 페르페나진, 티오리다진, 메소리다진, 트라이플루오페라진, 플루페나진, 클로자핀, 올란자핀, 리스페리돈, 지프라시돈, 쿼티아핀, 세르틴돌, 아리피프라졸, 소네피프라졸, 블로나세린, 일로페리돈, 페로스피론, 라클로프리드, 조테핀, 비페프루녹스, 아세나핀, 루라시돈, 아미설프라이드, 발라페리돈, 팔린도레, 에플리반세린, 오사네탄트, 리모나반트, 메클리네탄트, 미락시온(Miraxion: 등록상표) 또는 사리조탄;

·바닐로이드 수용체 작용제(예를 들면 레신페라톡신) 또는 길항제(예를 들면 카프사제핀);

·베타-아드레날린 약물, 예를 들면 프로프라놀롤;

·국소 마취제, 예를 들면 메실레틴;

·코르티코스테로이드, 예를 들면 덱사메타손;

·5-HT 수용체 작용제 또는 길항제(예를 들면 피조티펜), 특히 5-HT_1B _/1D 작용제, 예를 들면 엘레트립탄, 수마트립탄, 나라트립탄, 졸미트립탄 또는 리자트립탄;

·5-HT_2A 수용체 길항제, 예를 들면 (+)-알파-(2,3-다이메톡시-페닐)-1-[2-(4-플루오로페닐에틸)]-4-피페리딘메탄올(MDL-100907);

·콜린(니코틴) 진통제, 예를 들면 이스프로니클린(TC-1734), (E)-N-메틸-4-(3-피리디닐)-3-부텐-1-아민(RJR-2403), (R)-5-(2-아제티디닐메톡시)-2-클로로피리딘(ABT-594) 또는 니코틴;

·트라마돌(Tramadol: 상표명);

·PDE-5 억제제, 예를 들면 5-[2-에톡시-5-(4-메틸-1-피페라지닐-설포닐)페닐]-1-메틸-3-n-프로필-1,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(실데나필), (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-헥사하이드로-2-메틸-6-(3,4-메틸렌다이옥시페닐)-피라지노[2',1':6,1]-피리도[3,4-b]인돌-1,4-다이온(IC-351 또는 타달라필), 2-[2-에톡시-5-(4-에틸-피페라딘-1-일-1-설포닐)-페닐]-5-메틸-7-프로필-3H-이미다조[5,1-f][1,2,4]트라이아진-4-온(바르데나필), 5-(5-아세틸-2-부톡시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-에틸-3-아제티디닐)-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 5-(5-아세틸-2-프로폭시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-아이소프로필-3-아제티디닐)-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라딘-1-일설포닐)피리딘-3-일]-3-에틸-2-[2-메톡시에틸]-2,6-다이하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 4-[(3-클로로-4-메톡시벤질)아미노]-2-[(2S)-2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일]-N-(피리미딘-2-일메틸)피리미딘-5-카복사미드, 3-(1-메틸-7-옥소-3-프로필-6,7-다이하이드로-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)-N-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸]-4-프로폭시벤젠설폰아미드;

·알파-2-델타 리간드, 예를 들면 가바펜틴, 프레가발린, 3-메틸가바펜틴, (1α,3α,5α)(3-아미노-메틸-바이사이클로[3.2.0]헵트-3-일)-아세트산, (3S,5R)-3-아미노메틸-5-메틸-헵탄산, (3S,5R)-3-아미노-5-메틸-헵탄산, (3S,5R)-3-아미노-5-메틸-옥탄산, (2S,4S)-4-(3-클로로페녹시)프롤린, (2S,4S)-4-(3-플루오로벤질)-프롤린, [(1R,5R,6S)-6-(아미노메틸)바이사이클로[3.2.0]헵트-6-일]아세트산, 3-(1-아미노메틸-사이클로헥실메틸)-4H-[1,2,4]옥사다이아졸-5-온, C-[1-(1H-테트라졸-5-일메틸)-사이클로헵틸]-메틸아민, (3S,4S)-(1-아미노메틸-3,4-다이메틸-사이클로펜틸)-아세트산, (3S,5R)-3-아미노-5-메틸-노난산, (3R,4R,5R)-3-아미노-4,5-다이메틸-헵탄산 및 (3R,4R,5R)-3-아미노-4,5-다이메틸-옥탄산; (3S,5R)-3-아미노메틸-5-메틸옥탄산;

·카나비노이드;

·메타보트로픽 글루타메이트 아형 1 수용체(mGluR1) 길항제;

·세로토닌 재흡수 억제제, 예를 들면 세트랄린, 세트랄린 대사산물 데스메틸세트랄린, 플루옥세틴, 노르플루옥세틴(플루옥세틴 데스메틸 대사산물), 플루복사민, 파록세틴, 시탈로프람, 시탈로프람 대사산물 데스메틸시탈로프람, 에스시탈로프람, d,l-펜플루라민, 페목세틴, 이폭세틴, 시아노도티에핀, 리톡세틴, 다폭세틴, 네파조돈, 세리클라민 및 트라조돈;

·노르아드레날린(노르에피네프린) 재흡수 억제제, 예를 들면 마프로틸린, 로페프라민, 미르타제핀, 옥사프로틸린, 페졸라민, 토목세틴, 미안세린, 부프로프리온, 부프로프리온 대사산물 하이드록시부프로프리온, 노미펜신 및 빌록사진(비발란(Vivalan: 등록상표)), 특히 선택적 노르알드레날린 재흡수 억제제, 예를 들면 레복세틴, 특히 (S,S)-레복세틴;

·이중 세로토닌-노르아드레날린 재흡수 억제제, 예를 들면 벤라팍신, 벤라팍신 대사산물 O-데스메틸벤라팍신, 클로미프라민, 클로미프라민 대사산물 데스메틸클로미프라민, 둘록세틴, 밀나시프란 및 이미프라민;

유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 억제제, 예를 들면, S-[2-[(1-이미노에틸)아미노]에틸]-L-호모시스테인, S-[2-[(1-이미노에틸)-아미노]에틸]-4,4-다이옥소-L-시스테인, S-[2-[(1-이미노에틸)아미노]에틸]-2-메틸-L-시스테인, (2S,5Z)-2-아미노-2-메틸-7-[(1-이미노에틸)아미노]-5-헵텐산, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)-부틸]티오]-5-클로로-3-피리딘카보니트릴; 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-4-클로로벤조니트릴, (2S,4R)-2-아미노-4-[[2-클로로-5-(트라이플루오로메틸)페닐]티오]-5-티아졸부탄올, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-6-(트라이플루오로메틸)-3 피리딘카보니트릴, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-5-클로로벤조니트릴, N-[4-[2-(3-클로로벤질아미노)에틸]페닐]티오펜-2-카복사미딘, 또는 구아니디노에틸설파이드;

·아세틸콜린에스터라제 억제제, 예를 들면 도네페질;

·프로스타글란딘 E₂ 아형 4(EP4) 길항제, 예를 들면 N-[({2-[4-(2-에틸-4,6-다이메틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-1-일)페닐]에틸}아미노)-카보닐]-4-메틸벤젠설폰아미드 또는 4-[(1S)-1-({[5-클로로-2-(3-플루오로페녹시)피리딘-3-일]카보닐}아미노)에틸]벤조산;

·류코트라이엔 B4 길항제, 예를 들면, 1-(3-바이페닐-4-일메틸-4-하이드록시-크로만-7-일)-사이클로펜탄카복실산(CP-105696), 5-[2-(2-카복시에틸)-3-[6-(4-메톡시페닐)-5E-헥세닐]옥시페녹시]-발레르산(ONO-4057) 또는 DPC-11870,

·5-리폭시게나제 억제제, 예를 들면 질루톤, 6-[(3-플루오로-5-[4-메톡시-3,4,5,6-테트라하이드로-2H-피란-4-일])페녹시-메틸]-1-메틸-2-퀴놀론(ZD-2138), 또는 2,3,5-트라이메틸-6-(3-피리딜메틸), 1,4-벤조퀴논(CV-6504);

·나트륨 채널 차단제, 예를 들면 리도카인; 또는 부피비카인;

·5-HT3 길항제, 예를 들면 온단세트론;

·글리코사미노글리칸 층 대체제 및 소염제, 예를 들면 펜토산 폴리설페이트(엘미론(Elmiron: 상표명));

·베타-3 길항제, 예를 들면 YM-178(미라베그론 또는 2-아미노-N-[4-[2-[[(2R)-2-하이드록시-2-페닐에틸]아미노]에틸]페닐]-4-티아졸아세트아미드), 솔라베그론, KUC-7483(리토베그론 또는 2-[4-[2-[[(1S,2R)-2-하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-1-메틸에틸]아미노]에틸]-2,5-다이메틸페녹시]-아세트산) 또는 AK-134;

·항-히스타민제, 예를 들면 하이드록시진;

·H₂-길항제, 예를 들면 시메티딘; 또는 라니티딘;

·질산은;

·스테로이드;

·독소루비신;

·콘드로이틴 설페이트;

·다이나트륨 크로모글리케이트;

·옥시클로로센(클로팍틴(Clorpactin: 상표명); 및

·면역억제제, 예를 들면 사이클로스포린

및 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물.

항- NGF 길항제 항체의 투여

항-NGF 길항제 항체는 임의의 적합한 경로를 통해 (간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군에 대해) 개인에게 투여될 수 있다. 본원에 개시된 예가 이용가능한 기술을 제한하고자 하는 것이 아니라 이를 예시하고자 하는 것임은 당 분야의 숙련자에게 명확할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서는, 항-NGF 길항제 항체가 공지된 방법, 예를 들면 정맥내 투여, 예컨대 환괴로서 또는 일정 기간동안의 연속적 주입에 의해, 근육내, 복강내, 대뇌척수내, 피하, 관절내, 설하, 활액내, 흡입, 경막내, 경구, 흡입 경피 또는 국소 경로에 따라 개인에게 투여된다. 투여는 전신, 예를 들면 정맥내 또는 국소일 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 비롯한 상업적으로 이용가능한 액체 제제용 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조된 분말이 재구축된 후에 분무될 수 있다. 다르게는, 항-NGF 길항제 항체는 불화탄소 배합물 및 계량 투여 흡입기를 이용하여 분무되거나, 또는 동결건조되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

한 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 부위-특이적 또는 표적 국소 전달 기법을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적 국소 전달 기법의 예는 항-NGF 길항제 항체의 다양한 이식가능한 데포 공급원 또는 국소 전달 카테터, 예를 들면 주입 카테터, 내재 카테터 또는 바늘 카테터, 합성 그라프트, 외막 랩(adventitial wrap), 문합(shunt) 및 스텐트 또는 다른 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주입 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들면 PCT 공개공보 제WO 00/53211호 및 미국 특허 제5,981,568호를 참고할 수 있다.

E3 또는 이의 절편(예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 예를 들면 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 요구되는 특이성의 항원 NGF 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 개질된 배열과 같은 다양한 항체의 배합물을 투여에 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체는 단독으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제는 다양한 제형일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 당 분야에 공지되어 있고, 약학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이다. 예를 들면 부형제는 형태 또는 증점도를 제공하거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투성 조절용 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 투과 개선제를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 경구 및 비경구 약물 전달을 위한 배합물 및 또한 부형제가 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 이들 약물은 주입(예를 들면 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여를 위해 배합된다. 따라서, 이들 약제는 약학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정한 투여 처방 계획, 예를 들면 투여량, 시간 및 반복은 특정한 개인 및 개인의 의학적 이력에 의존할 것이다.

항-NGF 항체는 주입(예를 들면 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)을 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 항-NGF 항체는 또한 본원에 개시된 바와 같이 흡입에 의해 또는 다른 형태의 투여(예를 들면 경구, 점막, 설하)를 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-NGF 항체의 투여의 경우, 초기 후보자 투여는 약 2mg/kg일 수 있다.

바람직한 양태에서, 투여되는 항체의 농도는 약 0.1 내지 약 200mg/ml의 범위일 수 있다. 바람직하게는 항체의 농도는 약 0.5mg/ml, 약 1mg/ml, 약 2mg/ml, 약 3mg/ml, 약 4mg/ml, 약 5mg/ml, 약 6mg/ml, 약 7mg/ml, 약 8mg/ml, 약 9mg/ml, 약 10mg/ml, 약 11mg/ml, 약 12mg/ml, 약 13mg/ml, 약 14mg/ml, 약 15mg/ml, 약 16mg/ml, 약 17mg/ml, 약 18mg/ml, 약 19mg/ml, 약 20mg/ml, 약 21mg/ml, 약 22mg/ml, 약 23mg/ml, 약 24mg/ml, 약 25mg/ml, 약 26mg/ml, 약 27mg/ml, 약 28mg/ml, 약 29mg/ml, 약 30mg/ml, 약 31mg/ml, 약 32mg/ml, 약 33mg/ml, 약 34mg/ml, 약 35mg/ml, 약 36mg/ml, 약 37mg/ml, 약 38mg/ml, 약 39mg/ml, 약 40mg/ml, 약 41mg/ml, 약 42mg/ml, 약 43mg/ml, 약 44mg/ml, 약 45mg/ml, 약 46mg/ml, 약 47mg/ml, 약 48mg/ml, 약 49mg/ml, 약 50mg/ml, 약 51mg/ml, 약 52mg/ml, 약 53mg/ml, 약 54mg/ml, 약 55mg/ml, 약 56mg/ml, 약 57mg/ml, 약 58mg/ml, 약 59mg/ml, 약 60mg/ml, 약 70mg/ml, 약 80mg/ml, 약 90mg/ml, 약 100mg/ml 또는 약 110mg/ml이다. 가장 바람직하게는, 항체의 농도는 약 2mg/ml, 약 2.5mg/ml, 약 5mg/ml, 약 10mg/ml, 약 20mg/ml, 약 22mg/ml 및 약 50mg/ml를 포함하는 군에서 선택된다.

일부 실시양태에서, 항-NGF 항체의 투여 패턴은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 15주마다 1회, 20주마다 1회, 25주마다 1회 또는 그 이상의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 매달 1회, 2달마다 1회, 3달마다 1회, 4달마다 1회, 5달마다 1회, 6달마다 1회 또는 그 이상으로 투여된다. 가장 바람직하게는, 항-NGF 항체는 8주마다 1회 투여된다. 이 치료법의 진행은 통상의 기법 및 분석법에 의해 모니터링될 수 있다. (사용된 NGF 길항제를 비롯한) 이 투여 계획은 기간에 따라 다양할 수 있다.

일부 실시양태에서, 투여량의 체적은 약 20ml 이하, 약 15ml 이하, 약 10ml 이하, 약 5ml 이하, 약 2.5ml 이하, 약 1.5ml 이하, 약 1.0ml 이하, 약 0.75ml 이하, 약 0.5ml 이하, 약 0.25ml 이하 또는 약 0.01ml 이하이다. 일부 실시양태에서, 투여량의 체적은 약 20ml, 약 19ml, 약 18ml, 약 17ml, 약 16ml, 약 15ml, 약 14ml, 약 13ml, 약 12ml, 약 11ml, 약 10ml, 약 9ml, 약 8ml, 약 7ml, 약 6ml, 약 5ml, 약 4ml, 약 3ml, 약 2ml 또는 약 1ml이다. 다르게는, 약 20.5ml, 약 19.5ml, 약 18.5ml, 약 17.5ml, 약 16.5ml, 약 15.5ml, 약 14.5ml, 약 13.5ml, 약 12.5ml, 약 11.5ml, 약 10.5ml, 약 9.5ml, 약 8.5ml, 약 7.5ml, 약 6.5ml, 약 5.5ml, 약 4.5ml, 약 3.5ml, 약 2.5ml, 약 1.5ml, 또는 약 0.5ml이다. 다르게는, 약 900㎕, 약 800㎕, 약 700㎕, 약 600㎕, 약 500㎕, 약 400㎕, 약 300㎕, 약 200㎕, 또는 약 100㎕이고, 다르게는 약 950㎕, 약 850㎕, 약 750㎕, 약 650㎕, 약 550㎕, 약 450㎕, 약 350㎕, 약 250㎕, 약 150㎕, 또는 약 50㎕이다. 가장 바람직하게는, 투여량의 체적은 약 2.5 ml 이하이다.

바람직한 양태에 따르면, 투여량은 약 0.5mg 이하, 약 1mg 이하, 약 2mg 이하, 약 3mg 이하, 약 4mg 이하, 약 5mg 이하, 약 6mg 이하, 약 7mg 이하, 약 8mg 이하, 약 9mg 이하, 약 10mg 이하, 약 11mg 이하, 약 12mg 이하, 약 13mg 이하, 약 14mg 이하, 약 15mg 이하, 약 16mg 이하, 약 17mg 이하, 약 18mg 이하, 약 19mg 이하, 약 20mg 이하, 약 21mg 이하, 약 22mg 이하, 약 23mg 이하, 약 24mg 이하, 약 25mg 이하, 약 26mg 이하, 약 27mg 이하, 약 28mg 이하, 약 29mg 이하, 약 30mg 이하, 약 31mg 이하, 약 32mg 이하, 약 33mg 이하, 약 34mg 이하, 약 35mg 이하, 약 36mg 이하, 약 37mg 이하, 약 38mg 이하, 약 39mg 이하, 약 40mg 이하, 약 41mg 이하, 약 42mg 이하, 약 43mg 이하, 약 44mg 이하, 약 45mg 이하, 약 46mg 이하, 약 47mg 이하, 약 48mg 이하, 약 49mg 이하, 약 50mg 이하, 약 51mg 이하, 약 52mg 이하, 약 53mg 이하, 약 54mg 이하, 약 55mg 이하, 약 56mg 이하, 약 57mg 이하, 약 58mg 이하, 약 59mg 이하, 약 60mg 이하, 약 70mg 이하, 약 80mg 이하, 약 90mg 이하, 약 100mg 이하, 또는 약 110mg 이하의 항체를 함유한다. 가장 바람직하게는, 투여량은 약 50mg 이하의 항체를 함유한다.

바람직한 양태에 따르면, 투여량은 (약물이 투여되는 포유동물의 질량 1kg 당) 약 1㎍/kg, 약 10㎍/kg, 약 20㎍/kg, 약 50㎍/kg, 약 100㎍/kg, 약 200㎍/kg, 약 500㎍/kg, 약 1mg/kg, 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 약 5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 7mg/kg, 약 8mg/kg, 약 9mg/kg, 약 10mg/kg, 또는 약 11mg/kg의 양의 항체를 함유한다.

조건에 따른 며칠 이상 동안의 반복된 투여의 경우, 증후가 바람직하게 억제될 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 통증이 감소될 때까지 치료가 지속된다. 한 실시양태에서, 투여 처방 계획은 초기에 약 2mg/kg을 투여한 후 약 1mg/kg의 항-NGF 항체를 매주 유지 투여하거나, 또는 격주로 약 1mg/kg을 유지 투여함을 포함할 수 있다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학 감쇠의 패턴에 따라 다른 투여 처방 계획이 유용할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서는 1주에 1 내지 4회의 투여가 예상된다. 보다 덜 빈번한 투여가 이용될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해서, 항-NGF 길항제 항체의 적절한 투여량은 이용되는 항체(또는 이의 조성물), 치료되는 통증 또는 하부 요로 증후군의 유형 및 심각성, 약물이 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지, 이전의 치료법, 환자의 임상 이력 및 약물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 의존할 것이다. 전형적으로, 임상의는 바람직한 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항-NGF 길항제 항체를 투여할 것이다. 투여량 및/또는 빈도는 치료 경과에 따라 상이할 수 있다.

반감기와 같은 경험적 고려사항이 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들면, 인간 면역계와 양립가능한 항체, 예를 들면 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체가 항체의 반감기를 연장하기 위해 이용되거나, 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격되는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정동안 결정되고 조절될 수 있고, 일반적으로는 통증의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 근거하지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 다르게는, 항-NGF 길항제 항체의 지속된 연속적 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속된 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당 분야에 공지되어 있다.

일부 개인의 경우, 하나 이상의 투여량이 요구될 수 있다. 투여 빈도가 치료 과정동안 결정되고 조절될 수 있다. 예를 들면, 투여 빈도는 치료되는 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 유형 및 심각성, 약물이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 이력 및 약물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 조절될 수 있다. 전형적으로 임상의는 바람직한 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항-NGF 길항제 항체를 투여할 것이다. 일부 경우, E3 항체의 지속된 연속적 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속된 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당 분야에 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-NGF 길항제 항체를 위한 투여량이 하나 이상의 NGF-길항제가 투여된 개인에서 임상적으로 결정될 수 있다. 개인에게는 항-NGF 길항제 항체의 증가된 투여량이 주어진다. 항-NGF 길항제 항체의 효능을 평가하기 위해서, 통증 수치 등급 스케일(NRS)의 변화, 오리리-상트(O'Leary-Sant) 간질성 방광염 증후군 지수(ICSI)의 변화, 오리리-상트 간질성 방광염 문제 지수(ICPI)의 변화, 골반 통증 및 절박뇨/빈뇨(PUF) 증후군 점수의 변화, 및/또는 배뇨 빈도, 야뇨 빈도, 요실금 에피소드 빈도, 배뇨당 평균 체적, 평균 간질성 방광염 통증 심각성, 절박뇨 에피소드, 평균 수면 교란 점수, 성 활동과 관련된 통증의 평균 통증 점수, 전반적인 반응 평가, 평가에 영향을 미치는 환자 보고 치료, 치료 실패, 생물학적 마커, 안전성 종말점 및/또는 약동학적 측정치를 포함하는 배뇨 변수에서의 변화와 같은 통증 또는 하부 요로 증후군의 지표를 따를 수 있다. 생물학적 마커는 그 중에서도 NGF, 당단백질-51(GP-51), 항증식 인자(APF) 및 HB-상피 성장 인자(HB-EGF)를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 항-NGF 길항제 항체의 투여는 예를 들면 수용자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료인지 예방인지의 여부, 및 당 분야의 숙련자에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항-NGF 길항제 항체의 투여는 예정된 기간동안 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 간격을 둔 투여, 예를 들면 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 전개 전, 동안 및 후; 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 전개 전; 동안; 전과 후; 동안과 후; 전과 동안; 또는 전, 동안 및 후중 하나일 수 있다.

바람직한 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제([Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)])와 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 혼합함으로써 본 발명에 따라 이용되는 항-NGF 길항제 항체의 치료 제형이 저장을 위해 준비된다. 일부 실시양태에서는 하나 이상의 항-NGF 길항제 항체가 존재할 수 있다. 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 서로 다른 항-NGF 길항제 항체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 항-NGF 길항제 항체는 서로에 부정적인 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는다. NGF 길항제는 또한 약물의 효능을 개선 및/또는 보완하는 작용을 하는 다른 약물과 함께 이용될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체는 생리학적으로 혼화성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 전형적으로, 담체는 (예를 들면 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이의 항원-결합 부분, 이뮤노컨쥬게이트, 또는 이중특이적 분자는 산 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질에서 코팅될 수 있다.

허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예를 들면 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 다른 유기 산(아미노산 완충제 포함); 염, 예를 들면 염화나트륨; 산화방지제, 예를 들면 아스코브산 및 메티오닌; 방부제(예를 들면 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄화수소; EDTA와 같은 킬레이트화제; 당, 예를 들면 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 대이온, 예를 들면 나트륨; 금속 복합체(예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트, 트윈(Tween) TM, 플루로닉스(Pluronics: 상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원의 항체는 중성 형태(양쪽이온성 형태 포함), 또는 양전하 종 또는 음전하 종으로서 존재할 수 있다. 일부 경우, 항체는 대이온과 복합체를 형성하여 약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 따라서, 본원의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.

"약학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물(예를 들면 항체)의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다(예를 들면[Berge, S.M., et al . (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19] 참조). 예를 들면, "약학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 대이온을 포함하는 복합체를 포함하고, 여기서 대이온은 약학적으로 허용가능한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된다.

이런 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예를 들면 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아인산 등으로 부터 유래된 것들, 및 또한 비독성 유기산, 예를 들면 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸 산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리토 금속, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것들, 및 또한 비독성 유기 아민으로부터 유래된 것들, 예를 들면 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등을 포함한다.

또한 약학적으로 허용가능한 무기 염기는 금속 이온을 포함한다. 금속 이온은 적절한 알칼리 금속 염, 알칼리토 금속 염 및 다른 생리학적으로 허용가능한 금속 이온을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 무기 염기로부터 유래된 염은 이들의 일반적인 원자가의 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브데늄, 바나듐, 망간, 크롬, 셀레늄, 주석, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망간 염, 제1망간, 칼륨, 루비듐, 나트륨 및 아연을 포함한다.

본원의 항체의 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 포름산, 아세트산, 아세트아미도벤조산, 아디프산, 아스코브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포산, 탄산, 사이클람산, 데하이드로콜산, 말론산, 에데트산, 에틸황산, 펜다이조산, 메타인산, 석신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 타닌산, 시트르산, 질산, 아스코브산, 글루쿠론산, 말레산, 엽산, 푸마르산, 프로피온산, 피루브산, 아스파트산, 글루탐산, 벤조산, 염산, 수소화브롬산, 수소화요드산, 라이신, 아이소시트르산, 트라이플루오로아세트산, 파모산, 프로피온산, 안트라닐린산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 실리케이트산, p-하이드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 설폰산, 메탄설폰산, 인산, 포스폰산, 에탄설폰산, 에탄다이설폰산, 암모늄, 벤젠설폰산, 판토텐산, 나프탈렌설폰산, 톨루엔설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 설파닐산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스터, 사이클로헥실아미노설폰산, β-하이드록시부티르산, 글라이신, 글라실글라이신, 글루탐산, 카코딜레이트, 다이아미노헥산산, 캄포설폰산, 글루콘산, 티오시안산, 옥소글루타르산, 피리독살 5-포스페이트, 클로로페녹시아세트산, 운데칸산, N-아세틸-L-아스파트산, 갈락타르산 및 갈락투론산을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 것들로부터 제조될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 유기 염기는 트라이메틸아민, 다이에틸아민, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 클로로프로카인, 콜린, 다이벤질아민, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민(N-메틸글루카민), 프로카인, 환상 아민, 4차 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 2-다이메틸아미노에탄올, 에탄다이아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, N-에틸모폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이미다졸, 아이소프로필아민, 메틸글루카민, 모폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 푸린, 테오브롬, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵탄올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 지환족 설폰산, 스트론튬, 트라이신, 하이드라진, 페닐사이클로헥실아민, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산, 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산, 1,4-피페라딘다이에탄설폰산, 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산, 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모폴린프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산, 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산, 4-(N-모폴리노)부탄설폰산, 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판설폰산), 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시프로판설폰산) 이수화물, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)글라이신, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산, 2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산, N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산, 4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신, 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올 및 트로메타몰을 포함한다.

다른 제제는 리포솜과 같은 담체를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 당 분야에 공지된 적합한 전달 형태를 포함한다. 예를 들면 [Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859]를 참고할 수 있다. 리포솜 제제는 사이토펙틴, 다층 소낭 및 단층 소낭을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.

항-NGF 길항제 항체를 포함하는 리포솜은 예를 들면 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 개시된 것과 같은 당 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 개선된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유래된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 바람직한 직경을 갖는 리포솜이 생성된다.

활성 성분은 또한, 예를 들면 코아세르베이트화 기법에 의해, 또는 계면간 중합에 의해, 예를 들면 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에 의해, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 미세유화액에서 포획될 수 있다. 이런 기법은 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.

지속적 방출 제제가 준비될 수 있다. 지속적 방출 제제의 적합한 예는 길항제(예를 들면 항체)를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속적 방출 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들면 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 7-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체, 예를 들면 루프론 데포(Lupron depo: 상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구), 슈크로즈 아세테이트 아이소부티레이트 및 폴리-D-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

생체 내 투여에 이용되는 배합물은 무균성이어야만 한다. 이는 예를 들면 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

치료적 항-NGF 길항제 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이얼로 위치된다.

치료 조성물은 당 분야에 공지된 의학 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들면 본원의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예를 들면 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 개시된 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 본원에서 유용한 잘 공지된 이식물 및 모듈의 예는 미국 특허 제4,487,603호(이는 제어 속도로 약물을 분배하기 위한 이식가능한 미세 주입 펌프를 개시하고 있다); 미국 특허 제4,486,194호(이는 피부를 통해 약제를 투여하기 위한 치료 장치를 개시하고 있다); 미국 특허 제4,447,233호(이는 정확한 주입 속도로 약제를 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하고 있다); 미국 특허 제4,447,224호(이는 연속적인 약물 전달을 위한 변동가능한 유동 이식성 주입 장치를 개시하고 있다); 미국 특허 제4,439,196호(이는 다-챔버 격실을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하고 있다); 및 미국 특허 제4,475,196호(이는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하고 있다)를 포함한다. 많은 다른 이런 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여용 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여용 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액 또는 좌약과 같은 단위 투여 형태일 수 있다.

정제와 같은 고형 조성물을 제조하기 위해서, 주 활성 성분을 약학적 담체, 예를 들면 종래의 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토즈, 슈크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 약학적 희석제, 예를 들면 물과 함께 혼합하여 본 발명의 화합물, 또는 이의 비-독성 약학적으로 허용가능한 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고형 예비배합 조성물을 형성한다. 이들 예비배합물이 균질한 것으로 언급되는 경우, 이는 활성 성분이 조성물에 고르게 분배되어 조성물이 동일하게 효과적인 단위 투여 형태, 예를 들면 정제, 환제 및 캡슐로 쉽게 분할될 수 있음을 의미한다. 그런 다음, 이 고형 예비배합 조성물을 0.1 내지 약 500mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 개시된 유형의 단위 투여 형태로 분할한다. 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나 또는 달리 배합되어 연장된 활성의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공한다. 예를 들면, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 후자는 전자 상의 엔벨로프의 형태이다. 장에서의 분해에 저항하게 하고, 내부 성분이 손상되지 않고 십이지장으로 통과되어 지연 방출되게 하는 장내 층에 의해 2가지 성분을 분리시킬 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장내 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이런 물질은 다수의 중합성 산 및 중합성 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면활성화제는 특히 비-이온화제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들면 트윈(상표명) 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예를 들면 스팬(Span, 상표명) 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면활성제를 갖는 조성물은 통상적으로 0.05 내지 5%의 표면활성제를 포함하고, 0.1 내지 2.5% 사이일 수 있다. 다른 성분, 예를 들면 만니톨 또는 필요한 경우 다른 약학적으로 허용가능한 비히클을 첨가할 수 있는 것으로 인식될 것이다.

적합한 유화액은 상업적으로 이용가능한 지방 유화액, 예를 들면 인트라리피드(Intralipid: 상표명), 리포신(Liposyn: 상표명), 인포누트롤(Infonutrol: 상표명), 리포룬딘(Lipofundin: 상표명) 및 리피피산(Lipiphysan: 상표명)을 이용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 프리믹스 유화액 조성물에 용해되거나, 또는 다르게는 오일(예를 들면 대두유, 홍화유, 면실유, 호마유, 옥수수유 또는 아몬드유), 및 인지질(예를 들면 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과 물을 혼합시킬 때 형성되는 유화액에 용해될 수 있다. 다른 성분, 예를 들면 글리세롤 또는 글루코스를 첨가하여 유화액의 삼투성을 조절할 수 있다. 적합한 유화액은 전형적으로 20% 이하, 예를 들면 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 유화액은 0.1 내지 1.0ml, 특히 0.1 내지 0.5ml의 지방 소적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0의 pH를 가질 수 있다.

유화액 조성물은 항-NGF 항체를 인트라리피드(상표명) 또는 이의 성분(대두유, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조되는 것들일 수 있다.

흡입 또는 취입용 조성물은 약학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매 또는 이의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 설정된 바와 같은 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해서 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 멸균된 약학적으로 허용가능한 용매중의 조성물은 기체를 이용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치에서 직접 호흡될 수 있거나, 분무 장치를 얼굴 마스크, 텐트 또는 간헐적인 양압 호흡 기계에 부착시킬 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물을 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구 또는 비강 투여할 수 있다.

처리 효율을 당 분야에 잘 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다.

본 발명의 임의의 항체 또는 폴리펩타이드(예를 들면 항체 E3)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 바람직한 세포에서 본 발명의 임의의 항체 또는 폴리펩타이드(예를 들면 항체 E3)의 전달 및 발현에 이용할 수 있다. 발현 벡터를 이용하여 E3 항체 또는 폴리펩타이드의 직접 발현에 이용할 수 있다. 발현 벡터는 당 분야에 공지된 임의의 방식, 예를 들면 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 척추강내, 심실내, 경구, 장내, 비경구, 비강, 경피, 설하 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여 및 국소 투여를 비롯한 국소 또는 전신 투여를 포함한다. 당 분야의 숙련자들은 외인성 단백질의 생체 내 발현을 수득하기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 미국 특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호를 참고할 수 있다.

본 발명의 임의의 항체 또는 폴리펩타이드(예를 들면 항체 E3)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 치료 조성물의 표적 전달이 또한 이용될 수 있다. 수용체-매개된 DNA 전달 기법이 예를 들면 [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202]; [Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655]; [Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료 조성물이 유전자 치료 프로토콜에서 국소 투여의 경우 약 100ng 내지 약 200mg의 범위로 투여된다. 약 500ng 내지 약 50mg, 약 1㎍ 내지 약 2mg, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 약 20㎍ 내지 100㎍의 DNA의 농도 범위를 또한 유전자 치료 프로토콜 동안 이용할 수 있다. 본 발명의 치료 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다(일반적으로 [Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148]을 참고할 수 있다). 이런 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 이용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다.

바람직한 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위한 바이러스계 벡터 및 바람직한 세포에서의 발현이 당 분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 바이러스계 비히클은 재조합 레트로바이러스(예를 들면 PCT 공개공보 제WO 90/07936호; 제WO 94/03622호; 제WO 93/25698호; 제WO 93/25234호; 제WO 93/11230호; 제WO 93/10218호; 제WO 91/02805호; 미국 특허 제5,219,740호; 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호 참고), 알파바이러스계 벡터(예를 들면, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들면, PCT 공개공보 제WO 94/12649호, 제WO 93/03769호; 제WO 93/19191호; 제WO 94/28938호; 제WO　95/11984호 및 제WO 95/00655호 참고). [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147]에 개시된 바와 같이 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여 또한 이용될 수 있다.

사멸된 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다양이온성 축합된 DNA(예를 들면 [Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147] 참조); 리간드-연결된 DNA(예를 들면 [Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985] 참조); 진핵세포 전달 비히클 세포(예를 들면 미국 특허 제5,814,482호; PCT 공개 공보 제WO　95/07994호; 제WO　96/17072호; 제WO　95/30763호; 및 제WO　97/42338호) 및 핵 전하 중성화 또는 세포 막과의 융합을 포함하지만 이로 한정되지 않는 비-바이러스 전달 비히클 및 방법을 또한 이용할 수 있다. 네이키드 DNA 또한 이용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 공보 제WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 개시되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 제5,422,120호; PCT 공개공보 제WO 95/13796호; 제WO 94/23697호; 제WO 91/14445호; 및 유럽 특허 제0 524 968호에 개시되어 있다. 추가의 접근법이 [Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581]에 개시되어 있다.

진단 방법 및 용도

본원에 개시된 항체는 또한 변형되거나 비정상적인 NGF 발현(일부 양태에서는 (정상 시료에 대해) 증가되거나 감소된 NGF 발현, 및/또는 부적절한 발현, 예를 들면 정상적으로는 NGF 발현이 결여된 조직 및/또는 세포에서 발현의 존재, 또는 정상적으로는 NGF가 발현되는 조직 또는 세포에서 NGF 발현이 없음)과 관련된 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 검출, 진단 및 모니터링에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, NGF 발현은 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 갖는 것으로 의심되는 개인으로부터 얻은 시료에서 검출된다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 변형되거나 이상한 NGF 발현을 갖는 것으로 의심되는 개인의 시편(시료)을 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계 및 NGF의 수준이 대조군 또는 비교 시편과는 상이한 지를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서는, 본 발명은 개인의 시편(시료)를 접촉시키고, NGF 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 개인이 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 갖는 것으로 의심된다.

진단 용도를 위해서, 항체에는 전형적으로 방사동위원소, 형광 라벨 및 다양한 효소-기질 라벨을 포함하지만 이로 한정되지 않는 검출가능한 잔기로 라벨링될 수 있다. 항체에 라벨을 컨쥬게이팅시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 라벨링될 필요가 없고, 이의 존재는 본 발명의 항체에 결합하는 라벨링된 항체를 이용하여 검출될 수 있다.

본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들면 경쟁성 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에서 이용될 수 있다. [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].

항체는 생체내 진단 분석, 예를 들면 생체내 이미징에 대해 이용될 수 있다. 일반적으로 흥미있는 세포 또는 조직이 면역섬광조형술을 이용하여 국소화될 수 있도록 항체를 방사성 핵종(예를 들면 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I 또는 3H)으로 라벨링한다.

항체는 당 분야에 잘 공지된 기법에 따라 병리학에서 염색 시약으로 이용될 수 있다.

본원에 개시된 모든 방법에 대해 항-NGF 길항제 항체를 언급하는 것은 또한 하나 이상의 이들 약물을 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 당 분야에서 잘 공지된 적합한 부형제, 예를 들면 완충액을 비롯한 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 종래의 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있다.

검출 및/또는 치료에 사용하기 위한 항- NGF 길항제 항체를 포함하는 키트

본 발명은 또한 검출 및/또는 치료에 이용하기 위한 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 키트는 항체 E3를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 임의의 항체 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 양태에서, 키트는 예를 들면 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 갖는 개인을 치료하는 것을 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법을 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 적합한 포장일 수 있고, 선택적으로 추가의 성분, 예를 들면 완충제 및 본원에 개시된 임의의 방법에서 항체를 이용하기 위한 지시서가 제공되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 통증 또는 하부 요로 증후를 치료하기 위한 지시서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 항-NGF 길항제 항체 및 개인의 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료 및/또는 예방하기 위한 지시서를 포함한다. 실시양태의 일부에서 항-NGF 길항제 항체는 항체 E3이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 E3 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 임의의 방법에서 폴리뉴클레오타이드를 이용하기 위한 지시서를 추가로 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 한정하는 것이 아니라 예시하기 위해 제공된다. 제WO2004/058184호의 실시예는 본 발명에서 이용하기 위한 항체를 예시하기 위해 언급된다. 제WO2004/058184호의 전체 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다.

본원발명의 항-NGF 항체를 이용하면 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군(LUTS)을 치료 또는 예방할 수 있다.

실시예

실시예 1: 마우스 길항제 항- NGF 항체 911의 인간화 및 친화성 성숙

A. 일반적인 방법

하기의 일반적인 방법을 본 실시예에서 이용하였다.

라이브러리 생성

라이브러리는 [Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins : a laboratory manual, San Diego, Academic Press (see, pages pg 277-291)]에 개시된 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR 카세트 돌연변이를 이용하여 생성되었다. 도핑 코돈인 NNK를 이용하여 하나의 아미노산 위치를 랜덤화시켜 20개의 가능한 아미노산을 포함시켰다. 특정한 성질을 갖는 아미노산의 부분집합만을 포함하도록 하나의 아미노산 위치를 랜덤화시키기 위해, [Balint et al, (1993) Gene 137(1):109-18]에 개시된 바와 같은 도핑 코돈을 이용하였다. [Innis et al, (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications (see, pp. 177-183)]에 개시된 바와 같은 재조합 PCR을 이용하여 부위 지향적 돌연변이를 수행하였다.

소규모 Fab 제조

Fab 라이브러리를 스크리닝하기 위해 96웰 플레이트에서의 소규모 발현을 최적화시켰다. Fab 라이브러리로 형질전환시킨 이. 콜라이로부터 시작하여, 콜로니를 따서 마스터 플레이트(아가 LB + 앰피실린(50㎍/ml) + 2% 글루코스) 및 작업 플레이트(2ml/웰, 1.5ml의 LB + 앰피실린(50㎍/ml) + 2% 글루코스를 함유하는 플레이트 당 96개 웰) 둘 모두에 접종하였다. 두가지 플레이트를 모두 30℃에서 8 내지 12시간동안 성장시켰다. 마스터 플레이트를 4℃에서 저장하고, 작업 플레이트에서 나온 세포를 5000rpm에서 펠렛화시키고, 1ml의 LB + 앰피실린(50㎍/ml) + 1mM IPTG를 이용하여 재현탁시켜 Fab의 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간의 발현 시간 후에 원심분리함으로써 세포를 수확한 후, 500㎕의 완충액 HBS-EP(100mM HEPES 완충액 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% P20, 3 mM EDTA)에 재현탁시켰다. 냉동(-80℃) 및 37℃에서의 해동의 1회 사이클에 의해 HBS-EP 재현탁된 세포를 용균시켰다. 세포 용균물을 5000rpm에서 30분동안 원심분리하여 Fab를 함유하는 상층액으로부터 세포 부스러기를 분리하였다. 그런 다음, 상층액을 BIAcore 플라스몬 공명 장치에 주입하여 각각의 Fab에 대한 친화성 정보를 수집하였다. DNA 서열 규명, 대규모 Fab 생산 및 하기 개시된 상세한 특성화를 위해 Fab를 발현하는 클론을 마스터 플레이트로부터 회수하였다.

대규모 Fab 제조

상세한 동역학 변수를 수득하게 위해, 대규모 배양액에서 Fab를 발현시키고 정제하였다. 200 mL의 LB + 앰피실린(50㎍/ml) + 2% 글루코스를 함유하는 삼각 플라스크에 선택된 Fab-발현 이. 콜라이 클론으로부터 나온 하룻밤 배양액 5ml를 접종하였다. 1.0의 OD_550nm에 도달할 때까지 클론을 30℃에서 항온배양한 후 배지를 200ml의 LB + 앰피실린(50㎍/ml) + 1mM IPTG로 대체하였다. 30℃에서 5시간의 발현 시간 후에, 원심분리하여 세포를 펠렛화한 후 10ml의 PBS(pH 8)에 재현탁시켰다. 2주기의 동결/해동(각각 -80℃ 및 37℃)에 의해 세포를 용균시켰다. 세포 용균액의 상층액을 PBS, pH 8로 평형화시킨 후 컬럼의 5배 체적의 PBS, pH 8로 세척한 Ni-NTA 슈퍼플로우 세파로스(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐(Qiagen)) 컬럼에 부하하였다. 개별적인 Fab는 PBS(pH 8) + 300mM 이미다졸을 이용하여 서로 다른 분획으로 용출되었다. Fab를 함유한 분획을 모으고, PBS에서 투석한 후, 친화성 특성을 규명하기 전에 ELISA로 정량하였다.

완전 항체 제조

완전 항체의 발현을 위해서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 2개의 포유동물 발현 벡터(경쇄의 경우 Eb.911.E3 또는 Eb.pur.911.3E 및 중쇄의 경우 Db.911.3E; 본원에 개시되어 있음)에 클로닝하고, 리포펙타민을 이용하여 일시적 발현을 위해 HEK 293 세포로 형질감염시켰다. 표준 방법에 의해 단백질 A를 이용하여 항체를 정제하였다.

바이아코어 분석

항-NGF Fab 및 모노클론 항체의 친화성이 BIAcore3000TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템(뉴저지주 피스카웨이 소재의 바이아코어 인코포레이티드(BIACore INC))에 의해 측정될 수 있다. CM5 칩은 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이나이드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화되었다. 인간 NGF를 10mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0으로 희석하고, 0.005mg/mL의 농도에서 활성화된 칩 상으로 주입하였다. 개별적인 칩 채널을 가로지르는 가변 유동 시간을 이용하여 하기 2개 범위의 항체 밀도를 달성할 수 있다: 상세한 동역학 연구를 위한 100 내지 200 반응 단위(RU), 및 스크리닝 분석을 위한 500 내지 600 RU. 칩을 에탄올아민으로 블록킹할 수 있다. 재생 연구는 피어스 용출 완충액(일리노이주 록포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology), 제품 번호 21004) 및 4M NaCl(2:1)의 혼합물이 200회 주입동안 칩 상의 hNGF의 활성을 유지시키면서도 결합된 Fab를 효과적으로 제거한다는 것을 보여주었다. HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P29)을 모든 바이아코어 분석을 위한 작업 완충액으로 이용하였다.

스크리닝 분석

라이브러리에서 나온 Fab 클론의 친화성을 결정하기 위해 스크리닝 바이어코어 분석을 최적화시켰다. 작은 배양 용균액의 상층액을 50㎕/분에서 2분동안 주입하였다. 바이아이밸류에이션 소프트웨어를 이용하여 단일 기하급수적 해리 속도(k_off)를 측정하기 위해 10 내지 15분의 해리 시간을 이용하였다. 라이브러리를 만드는데 이용된 주형과 동일한 범위(클론 8L2-6D5, k_off 1x10^-3s^-1)에서 k_off 속도를 나타내는 시료를 확인하기 위해 주입하고, 더 나은 k_off 값을 수득하도록 45분까지의 해리 시간을 허용하였다. 개선된(더 느린) k_off 값을 나타내는 클론을 대규모에서 발현시키고, 전체 동역학 변수, k_on 및 k_off를 정제된 단백질 상에서 측정하였다. 이 분석은 약 2배 이상의 친화성 차이를 검출할 수 있었다.

친화성 결정 분석

정제된 Fab 시료의 순차적 희석(추정된 K_D의 0.1 내지 10X)을 100㎕/분에서 1분동안 주입하고, 2시간까지의 해리 시간을 허용하였다. Fab 단백질의 농도를 (아미노산 분석에 의해 결정된) 공지된 농도의 Fab를 표준물로서 이용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 측정하였다. 바이아이밸류에이션 프로그램을 이용하여 자료를 1:1 랑뮈르 결합 모델에 부합시킴으로써 동적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다([Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110]). 평형 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on으로 계산하였다.

B. 마우스 길항제 항- NGF 항체 911의 인간화 및 친화성 성숙

마우스 길항제 항-NGF 항체, 911([Hongo et al, (2000) Hybridoma 19(3):215-227] 참고)을 인간화 및 친화성 성숙을 위해 선택하였다. Mab 911은 인간 및 래트 NGF에 높은 친화성으로 결합하고, 뉴로트로핀 NT3, NT4/5 또는 BDNF와 유의한 교차 반응성을 나타내지 않는다. [Hongo et al, (2000) Hybridoma 19(3):215-227]을 참조할 수 있다. 마우스 Mab 911의 파파인-분해된 Fab 절편의 친화성을 상기 개시된 바와 같은 바이아코어 분석을 이용하여 측정하였다. 마우스 Mab 911의 파파인 분해된 Fab 절편은 약 10nM의 K_D로 인간 NGF에 결합하였다.

인간화 및 친화성 성숙을 하기와 같이 여러 단계로 수행하였다.

(1) CDR - 그래프트된 주형의 제조. 항체 911의 경쇄 연장된 CDR(즉, 카바트 및 코티아 CDR 영역을 둘 모두 포함)을 JK2를 이용하여 인간 생식 세포 수용체 서열 O8에 그래프팅시키고, JH4를 이용하여 항체 911의 경쇄 연장된 CDR을 인간 생식 세포 수용체 서열 VH4-59에 그래프팅시켰다. 인간 생식 세포 수용체 서열의 아미노산 서열은 제WO2004/058184호의 도 1A 및 도 1B에 도시되어 있다. 아미노산 번호는 순차적이다. 상기 언급된 단백질 프레임워크를 이용하여 쥐과 CDR를 갖는 인간 프레임워크를 인코딩하는 합성 유전자에 대한 DNA 서열을 고안하였다. 이들 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 각각 hVH 및 hVL이라 부른다. 코돈은 이. 콜라이 및 햄스터에 대해 최적화되었다. 각각의 쇄에 대해 2개의 짧은 옆구리 프라이머를 갖는 hVL 및 hVH의 전체 길이에 걸친 여러개의 겹쳐지는 올리고뉴클레오타이드(69 내지 90개 염기 길이)를 이용하여 [Prodromou et al, (1992) Protein Eng 5(8): 827-9]에 개시된 바와 같은 순환 PCR에 의해 2개의 유전자를 별개로 합성하였다. 생성된 정확한 길이의 DNA 절편을 겔 정제한 후 이. 콜라이 바이시스트론 발현 플라스미드(앰피실린 내성)로 클로닝하였다. 항체는 [Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (see Vector pComb3X, at pg 2.10)]에 개시된 것과 유사한 IPTG 유도성 lacZ 프로모터의 제어 하에서 발현되지만, 개질은 하기의 추가 도메인의 첨가 및 발현을 포함하였다: 인간 카파 경쇄 불변 도메인(진뱅크(GenBank) 기탁 번호 CAA09181) 및 IgG2a 인간 면역글로불린의 CHI 불변 도메인(진뱅크 기탁 번호 P01859).

8L2-4D5라 불리는 CDR-그래프팅된 항체의 가변 영역(이는 또한 "주형"이라 불린다)의 아미노산 서열 또한 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B에 도시되어 있다. 8L2-4D5의 친화성은 상기 개시된 바와 같은 바이아코어 분석을 이용하여 측정하였다. 8L2-4D5는 인간 NGF에 약 38nM의 K_D로 결합하였다.

(2) 점 돌연변이의 프레임워크 서열로의 도입. [Innis et al, (1995) PCR strategies, San Diego, Academic Press]에 개시된 바와 같은 재조합 PCR 부위 지향적 돌연변이를 이용하여 V71K 치환을 CDR-그래프팅된 중쇄에 도입하였다. 이러한 치환은 인간 프레임워크 잔기를 상응하는 마우스 프레임워크 잔기로 대체하였다. 생성된 항체를 8L2-6D5라 칭하고, 8L2-6D5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 제WO2004/058184호의 도 1에 도시되어 있다. 8L2-6D5의 친화성은 상기 개시된 바와 같은 바이아코어 분석을 이용하여 측정되었다. 8L2-6D5의 Fab 절편은 인간 NGF에 약 15nM의 Kd로 결합하였다. 8L2-6D5는 친화성 성숙을 위한 주형으로서 선택되었다.

(3) CDR L1 , L2 , H1 및 H2 의 인간화 및 친화성 성숙. CDR L1, L2, H1 및 H2를 인간화 및 친화성 성숙시켰다. 코티아 정규 구조에 근거한 CDR의 구조에 본질적이지 않은 CDR L1, L2, H1 및 H2의 아미노산 위치를 확인하고([Al-Lazikani et al (1997) J. Mol . Biol . 273(4):927-48] 참고); 하기와 같이 랜덤화시켰다. [Balint et al, (1993) Gene 137(1):109-18]에 개시된 바와 같은 도핑 코돈을 이용하여 [Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins : a laboratory manual, San Diego, Academic Press]에 개시된 바와 같은 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드를 갖는 PCR 카세트 돌연변이를 이용하여 도 2에 도시된 2개의 경쇄 돌연변이 또는 중쇄 돌연변이, 및 각각 그래프팅된 (마우스) CDR L3 또는 CDR H3를 함유한 2개의 라이브러리를 제조하였다. 일반적으로, 항체 911 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열의 인간 생식세포 항체 서열과의 정렬에 근거하여 아미노산 잔기는 인간 항체에서 보다 흔한 잔기로 변화되었다. 야생형(비치환된) 아미노산 잔기 또한 CDR H2 잔기 50인 메티오닌을 제외하고는 라이브러리에 제시되었고, 여기서 야생형 메티오닌은 라이브러리에 제시되어 있지 않다. 메티오닌 잔기는 산화되고, 따라서, 그 잔기의 치환은 생성된 항체의 안정성을 개선시킬 것으로 예상되었다. Fab의 라이브러리를 하기와 같이 벡터 pComb3X + 인간 CH1 및 Cκ영역에 클로닝하였다.

[표 2]

1. 중쇄 H1 / H2 라이브러리:

CDR - H1

I34를 F, L, V, S, P, T, A, 또는 I로 변화시키고, N35를 N, T, S 또는 Y로 변화시켰다.

CDR - H2

M50을 모든 20개의 천연 아미노산으로 변화시키고, A62을 A 또는 S로 변화시키고, L63을 L 또는 V로 변화시켰다.

2. 경쇄 L1 / L2 라이브러리

CDR - L1

S26을 S, A, V, 또는 F로 변화시키고, D28을 D, A, S 또는 Y로 변화시키고, H32을 H, N, K, D, E, Q, 또는 Y로 변화시켰다.

CDR - L2

Y50을 Y, D, A 또는 S로 변화시키고, I51을 I, T, A 또는 V로 변화시키고, F54을 F 또는 L로 변화시키고, S56을 S 및 T로 변화시켰다.

친화성 스크리닝 실험의 경우, 각각의 라이브러리를 상응하는 CDR-그래프팅된 경쇄 또는 중쇄와 추가로 쌍을 이루고(예를 들면 H1/H2 라이브러리를 CDR-그래프팅된 경쇄와 쌍을 이루었다), 항체를 발현시키고, 개별적인 클론의 인간 NGF에 대한 친화성을 제조자의 지시 및 상기 개시된 바와 같이 바이아코어 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 바이아코어 인코포레이티드)을 이용하여 스크리닝하였다. k_off, k_on 및 k_D를 측정하였다. 일반적으로 친화성에서의 대부분의 변이가 k_off 속도에서 나타고, 추가로 k_off 속도가 항체 농도에 무관하므로, 항체 클론을 k_off 속도에 따라 등급매겼다.

결합된 클론의 서열을 측정하고, 결합된 클론의 서열을 표 3에 나타낸다.

[표 3]

L1 및 L2 아미노산 서열, H1 및 H2 아미노산 서열, 및 H1/H2 또는 L1/L2 라이브러리 클론의 친화성 스크리닝 후에 결합되어 있는 클론에 대한 동역학 자료

하기 치환을 함유하는 CDR은 결합을 유지하였다:

CDR - H1

I34: S, L, V, I 및 A 결합됨.

N35: N, T 및 S 결합됨.

CDR - H2

M50: M, I, G, Q, S, L 결합됨.

A62: A 및 S 결합됨.

L63: L 및 V 결합됨.

CDR -L1

S26: S, 및 F 결합됨.

D28: D, S, A, Y 결합됨.

H32: H, N, Q 결합됨.

CDR - L2

Y50: Y 결합됨.

I51: I, T, V, A, 결합됨.

F54 : F 결합됨.

S56: S 및 T 결합됨

일반적으로 결합 친화성에 근거하여 하기 치환을 함유하는 CDR을 선택하고, H19-L129라 불리는 단일 클론으로 조합하였다:

CDR - H1 : I34L; N35N (변화 없음)

CDR - H2 : M50I; A62A (변화 없음); L63V

CDR - L1 : S26S (변화 없음); D28S; H32N

CDR - L2 : Y50Y (변화 없음); I51T; F54F (변화 없음); S56S (변화 없음)

(PCR에 의해 H 및 L 쇄를 증폭시키고, 제한 효소를 이용하여 PCR 생성물 및 벡터(pRN8)를 절단하고, 3 절편 결찰을 수행함으로써) 이들 돌연변이를 H19-L129라 불리는 단일 클론으로 조합하였고, 이는 또한 그래프팅된 H3 및 L3 CDR을 포함하였다. H19-L129의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B에 나타나 있고, 표 4는 CDR L1, L2, H1 및 H2의 아미노산 서열을 나타낸다. 본원에 개시된 바와 같은 바이아코어 분석을 이용하여 측정하였을 때, H19-L129는 약 1nM의 KD로 NGF에 결합하였다.

[표 4]

CDR H1, H2, L1 및 L2의 아미노산 서열 및 조합된 클론 H19-L129에 대한 동역학 자료

(4) H3 및 L3 CDR 의 친화성 성숙. H3 및 L3 CDR의 친화성 성숙을 2단계로 수행하였다. 먼저, "라이브러리 스캐닝 돌연변이"라 불리는 과정에서, 돌연변이가 인간 NGF에 대한 결합 친화성을 증가시키는 아미노산 위치를 확인하기 위해서 H3 및 L3의 각각의 아미노산 잔기를 개별적으로 미리 스크리닝하였다. 라이브러리 스캐닝 돌연변이(이는 또한 "작은 라이브러리 랜덤화 분석"이라 불린다)의 결과에 근거하여 친화성 성숙 라이브러리의 제조를 위해 H3 및 L3에서 아미노산 위치의 부분집합을 선택하고, 친화성 성숙 라이브러리를 본원에 개시된 바와 같은 바이아코어 분석을 이용하여 인간 NGF에 대한 친화성에 대해 스크리닝하였다. 이들 기법이 일반적으로 적용될 수 있는 것으로 인식되고 있다.

(a) 라이브러리 스캐닝 돌연변이

H3 및 L3 CDR에서의 각각의 아미노산 위치를 결과적으로 인간 NGF에 대한 결합 친화성을 증가시키는 치환에 대해 개별적으로 미리 스크리닝하였다. 결과적으로 결합을 개선시키거나, 동일하게 결합하거나, 결합을 악화시키거나, 전혀 결합하지 않는 임의의 주어진 위치에서의 아미노산의 치환 빈도는 (모든 20개 아미노산을 포함하는) 많은 다른 아미노산으로 변화될 수 있는 CDR에서의 위치 및 변화될 수 없거나 몇개의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR에서의 위치에 대한 정보를 제공하였다. 결합 친화성을 증가시킨 아미노산 치환이 또한 확인되었다. 이러한 스크리닝의 결과에 근거하여, CDR H3 및 L3에서의 아미노산 위치의 부분집합을 친화성 성숙 라이브러리의 제조를 위해 선택하였다.

L3 및 H3 CDR의 각각의 아미노산이 모든 20개 아미노산으로 랜덤화되고, 동시에 각각이 각각의 아미노산 위치에서 20개 아미노산 가능성의 복잡성을 갖는 여러(경쇄의 경우 5개 라이브러리, 및 경쇄의 경우 13개 라이브러리) 작은 라이브러리를 생성하는 개별적인 Fab 라이브러리를 제조하였다. 모든 경우, 천연(즉, 변화되지 않은) 아미노산이 라이브러리에 나타났다. 하나의 아미노산 위치가 20개의 가능한 아미노산을 포함하도록 랜덤화되도록 도핑 코돈 NNK를 이용하여 [Kay et al. (1996), Phage display of Peptides and Proteins : a laboratory manual, San Diego, Academic Press]에 개시된 바와 같은 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR 카세트 돌연변이에 의해 라이브러리를 제조하였다. CDR 그래프팅된 항체의 더 낮은 친화성이 스크리닝동안 H3 및 L3 돌연변이체에서 친화성의 차이를 더욱 쉽게 검출할 수 있도록 하기 때문에 8L2-6D5(프레임워크 돌연변이 V71K를 갖는 CDR 그래프팅된 항체)가 라이브러리 구축을 위한 주형으로서 작용하였다. 따라서, 라이브러리의 각각의 부류는 하나의 아미노산이 치환된 CDR3(H3 또는 L3) 및 5개의 그래프팅된 CDR을 함유하였다.

본원에 개시된 바와 같은 바이아코어 분석을 이용하여 각각의 작은 라이브러리로부터 20 내지 80개의 클론을 스크리닝하였다. 바이아코어 칩의 한 채널에서는 NGF에 대한 결합 친화성에 대해 분석하고, 센서 칩의 다른 채널에서는 중쇄의 C 말단에서 히스 택을 검출하는 펜타-히스택 항체에 대한 결합에 의해 Fab의 존재에 대해 분석함으로써 시료를 바이아코어에 의해 동시에 분석하였다. 단백질을 발현하는 클론을 koff를 이용하여 분류하여 동일한 친화성, 더 나쁜 친화성, 더 좋은 친화성 또는 결합하지 않음으로 분류하였다. 이 분석 결과를 하기 표 5에 나타낸다.

[표 5]

단백질을 발현하는 클론을 koff에 근거하여 동일한 친화성, 더 나쁜 친화성, 더 좋은 친화성 또는 결합하지 않음으로 분류하였다.

개선된 친화성을 갖는 모든 클론의 서열을 측정하고, 친화성이 증가되는 아미노산 치환의 빈도 및 정체를 밝혔다. 또한, 치환이 반드시 결합 친화성을 증가시키는 것은 아니지만 주어진 위치에서 허용되는 아미노산 서열 치환을 확인하기 위해서 8I2-6D5 클론과 유사한 친화성을 보유한 몇몇의 클론을 각각의 라이브러리로부터 선택하였다. 이 분석 결과를 하기 표 6에 요약하였다.

[표 6]

여러 돌연변이는 결합 친화성을 증가시켰다. 최소한 하기 돌연변이는 8L2-6D5 주형과 비교하였을 때 결합 친화성을 상당히 증가시켰다: (H_Y101W (CDR 서열 GGYWYGTSYYFDY (서열번호 46)); H_S105A (CDR 서열 GGYYYGTAYYFDY (서열번호 47)); H_S105T (CDR 서열 GGYYYGTTYYFDY (서열번호 48)); H_G103A (CDR 서열 GGYYYATSYYFDY (서열번호 49); 및 L_S91E (CDR 서열 QQEKTLPYT (서열번호 50)).

이 실험 결과를 이용하여 친화성 성숙 라이브러리를 생성하기 위한 아미노산 위치의 선택을 안내하였다.

이 실험은 또한 표 5에 도시된 바와 같이 결합을 개선시키거나, 동일한 결합을 생성하거나, 더 나쁜 결합을 생성하거나, 결합하지 않게 하는 임의의 주어진 위치에서의 아미노산 치환의 빈도에 관한 정보를 제공하였다. 이 정보는 많은 상이한 아미노산(모든 20개 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR에서의 아미노산 위치, 및 몇개의 아미노산 또는 매우 적은 수의 아미노산(일부 실시양태에서는 하나도 없음)으로 변화될 수 있는 CDR에서의 위치를 확인하는 것을 가능하게 한다. 이들 결과는 또한 결합 친화성을 증가시키는 아미노산 치환을 나타내었다.

(b) 친화성 성숙

그런 다음, 작은 라이브러리 랜덤화 분석(상기)의 결과를 이용하여 H3 및 L3 CDR의 친화성 성숙에 대한 H3 및 L3 라이브러리의 생성에 대한 잔기를 선택하였다. H3 및 L3 CDR의 친화성 성숙을 위한 H3 및 L3 라이브러리의 생성을 위해 CDR H3의 잔기 Y101 및 G103 및 CDR L3의 잔기 S91 및 K92를 선택하였다.

이 라이브러리는 CDR-그래프팅된 클론 8L2-6D5에서는 동시에, H19-L129의 바탕값에서는 따로따로 H3와 L3에서의 돌연변이를 조합하며, 80개의 상이한 클론의 다양성을 가졌다. 표 7은 치환을 위해 선택된 아미노산 잔기, 및 각각의 위치에서 치환된 아미노산을 보여준다.

[표 7]

치환을 위해서 선택된 H3 및 L3에서의 아미노산 잔기 및 각각의 위치에서 치환된 아미노산

CDR - H3 :

Y101이 Y 및 W, C로 변화됨. (하나의 디제네레이트된 올리고뉴클레오타이드에서 코돈 TRS의 이용이 또한 코돈 C를 생성하기 때문에 C가 포함되었다는 점에 유의해야 한다).

G103이 A ,P, S로 변화되었다.

CDR - L3 :

S91이 E로 변화되었다.

K92가 모든 20개 아미노산으로 변화되었다. A, R, K, 및 H 결합됨.

각각의 폴리펩타이드가 Fab로 발현되었고, 96개의 개별적인 클론의 인간 NGF에 대한 친화성을 제조자의 지시 및 상기 개시된 바에 따라 바이아코어 분석을 이용하여 각각의 라이브러리에 대해 스크리닝하였다. 이 분석 결과를 하기 표 8에 나타낸다.

[표 8]

결합 친화성에 근거하여, 최상의 클론인 E3(이는 "3E"와 상호교환적으로 이용된다) 및 3C를 추가의 특성화에 대해 선택하였다. E3는 하기 CDR 치환을 포함하였다: CDR - H3 : Y101W, G103A; 및 CDR - L3 : S91E, K92H, 이는 하기의 L1, L2, H1 및 H2 돌연변이를 또한 포함하는 단일 클론으로 조합되었다:

CDR - H1 : I34L;

CDR - H2 : M50I; L63V;

CDR - L1 : D28S; H32N;

CDR - L2 : I51T.

E3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 서열번호 1 및 2에 도시되어 있다(또한 제WO2004/058184호의 도 1A 및 1B 참고). 3C는 하기의 CDR 치환을 포함하였다: CDR-L3: S91E; K92R; CDRH3: Y101W; G103A, 이는 클론 3E에 대해 개시된 L1, L2, H1 및 H2 돌연변이를 또한 포함하는 단일 클론으로 조합되었다.

3E 및 3C 서열을 Fab 및 완전 항체 생산을 위한 포유동물 발현 벡터로 클로닝하고, HEK293 세포에서 발현하고, Ni-NTA 또는 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 순수한 단백질을 아미노산 분석에 의해 정확하게 정량하였다.

Fab E3 및 3C의 인간 NGF에 대한 결합 친화성을 제조자의 지시에 따라 상기 개시된 바와 같이 바이아코어 분석을 이용하여 측정하였고, 단 재결합 효과를 방지하기 위해 칩 상에서 100 RU NGF를 이용하였다. 간략하게, 여러가지 농도의 항체(Fab)를 100RU의 부동화된 인간 NGF가 있는 CM5 칩 상으로 2분간 주입하고, 1800초 동안 해리되게 두었다. 마우스 항체 911(Fab)를 대조군으로서 분석하였다. 제조자의 지시에 따라 바이아이밸루에이션 소프트웨어를 이용하여 자료를 분석하였다. 항체 E3 및 911의 분석 결과가 제WO2004/058184호의 도 9 및 10에 도시되어 있다. E3는 인간 NGF에 약 0.07nM(및 약 6.0e5 M-1s-1의 k_on, 및 약 4.2e-5 s-1의 k_off)의 KD로 결합하였다. 3C는 약 0.35nM의 KD로 인간 NGF에 결합하였다(약 1.4E-5의 k_off). 대조적으로, 마우스 항체 911은 3.7 nM의 KD, 8.4x10^-5s^-1의 k_off 및 2.2x10⁴Ms^-1의 k_on으로 NGF에 결합하였다.

항체 E3(상호교환적으로 3E라고도 불린다)를 높은 결합 친화성에 근거한 추가의 분석을 위해 선택하였다. NGF가 NGF 수용체인 trkA 및 p75와 상호작용하는 것을 방해하는 E3의 능력을 시험하기 위해, 2.5nM의 인간 NGF를 미리 혼합하고 0 내지 50nM의 항체 E3(Fab)와 1시간동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 시료를 260RU의 p75(채널2) 및 600RU의 trkA(채널 3)을 함유하는 바이아코어 CM5 칩상에서 10㎕/분으로 주입하고, 억제%를 측정하였다. 이 분석 결과는 제WO2004/058184호의 도 11에 도시되어 있다. 증가된 농도의 Fab E3는 감소된 신호(RU로 측정)로 나타나는 바와 같이 NGF의 p75 및 trkA 둘 모두와의 상호작용을 차단하였고, 이는 Fab E3가 인간 NGF의 trkA 및 p75 둘 모두와의 상호작용을 차단함을 나타낸다. 항체 E3(Fab)의 농도가 NGF 농도와 동일한 경우(약 2.5nM NGF 농도), NGF 결합이 관찰되지 않았다(0의 신호에 의해 도시됨). NGF의 농도가 항체 3E 농도와 같을 때 0% NGF-수용체 결합이 일어났다는 사실은 2.5nM NGR가 NGF에 대한 KD에 비해 최소한 10배 이상 더 높고 평형상태이었음을 제안한다.

실시예 2: 마우스 E13 .5 3차신경 뉴론 생존 분석을 이용한 항- NGF 항체의 NGF-차단 능력 평가

Fab E3 또는 완전 항체 E3이 NGF 활성을 차단하는 능력은 항체가 시험관 내에서 마우스 E13.5 3차 신경 뉴론의 NGF-의존적 생존을 억제하는 능력을 측정함으로써 평가되었다. 3차신경 신경절은 안면 영역을 자극하는 피부 감각 뉴런으로 구성된다. NGF가 이들 뉴론의 생존을 지지하는데 필요하기 때문에 마우스 E13.5 3차신경 뉴론의 생존은 항-NGF 길항제 항체의 NGF-차단 활성을 평가하기 위한 감각 분석이다. 예를 들면, NGF의 포화 농도에서, 배양액에서 48시간 경과시 생존율은 100%에 가깝다. 이와는 대조적으로, NGF의 부재시에는 48시간 경과시 5% 미만의 뉴론이 살아있다.

생존 분석을 다음과 같이 수행하였다: 시간-교배된(time-mated) 임신한 스위스 웹스터 암컷 마우스를 CO2 흡입에 의해 마취시켰다. 자궁 뿔을 제거하고, 배아 단계의 배아에서 E13.5를 추출하고, 목을 잘랐다. 전해적으로 날카롭게 된 텅스텐 바늘을 이용하여 3차신경 신경절을 절개하였다. 그런 다음, 신경절을 트립신처리하고, 기계적으로 분리하고, 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 96웰 플레이트에서 한정된 무혈청 배지에서 웰당 200 내지 300개 세포의 밀도로 도말하였다.

3차신경 뉴론에 다양한 투여량의 항-NGF 항체 Mab 911(Fab), 8L2-6D5; H19-L129; E3 및 3C; 및 0.4ng/ml(약 15pM; 이 농도는 생존을 위한 NGF의 포화 농도를 나타낸다) 및 0.04ng/ml(약 1.5pM; 이농도는 IC50 부근의 값이다)의 농도의 인간 또는 래트 NGF를 첨가함으로써 항-NGF Fab 또는 항체의 차단 활성을 평가하였다. 배양액에서 48시간 후, 세포를 다음과 같은 바이오멕(Biomek) FX 액체 취급 워크스테이션(베크만 쿨터(Beckman Coulter)) 상에서 수행되는 자동화된 면역세포화학 프로토콜에 가하였다: 4% 포름알데하이드, 5% 슈크로스 및 PBS를 이용한 고정; PBS 중의 0.3% 트리톤 X-100을 이용한 투과; 5% 정상 염소 혈청, PBS중의 0.11% BSA를 이용한 비특이적 결합 부위의 차단; 및 뉴론을 검출하기 위한 1차 및 2차 항체와의 순차적 항온처리. 1차 항체는 단백질 유전자 생성물 89.5에 대한 토끼 폴리클론 항체(PGP9.5, 케미콘(Chemicon))이고, 이는 확립된 뉴론 표현형 마커이다. 2차 항체는 배양액에 존재하는 모든 세포의 핵을 라벨링하기 위한 핵 염료 훽스트(Hoechst) 33342(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))와 함께 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-토끼(몰레큘라 프로브스)이었다. 이미지 포착 및 이미지 분석은 디스커버리-I/GenII 이미저(Imager)(유니버샬 이매징 코포레이션(Universal Imaging Corporation)) 상에서 수행되었다. 이미지는 알렉사 플루오르 488 및 훽스트 33342에 대한 2개의 파장에서 자동으로 포획되었고, 핵 염색이 모든 웰에 존재하기 때문에 핵 염색은 이미저의 이미지에 근거한 자동 초점 시스템에 대한 기준점으로 이용되었다. 각각의 웰의 전체 표면을 커버하도록 적절한 대상 및 웰당 지점의 수가 선택되었다. 항-PGP9.5 항체를 이용한 이들의 특이적 염색에 근거하여 배양액에서 48시간 후에 각각의 웰에 존재하는 뉴론의 수를 계수하도록 자동화된 영상 분석을 설정하였다. 이미지의 조심스러운 문턱값 및 형태 및 형광 강도에 근거한 선택성 필터의 적용으로 인해 웰당 뉴론의 정확한 수가 생성된다.

이 실험의 결과는 Fab E3가 높은 친화성으로 NGF 활성을 차단함을 입증하였다. 결과는 제WO2004/058184호의 도 4 내지 6, 및 표 9에 도시되어 있다.

제WO2004/058184호의 도 4는 다양한 농도의 인간 및 래트 NGF의 존재하에서 E13.5 뉴론의 NGF-의존적 생존을 나타내는 그래프이다.

제WO2004/058184호의 도 5는 0.04ng/ml의 인간 NGF(약 1.5pM; 아래쪽 패널에 도시됨) 또는 0.4ng/ml의 인간 NGF(약 15pM; 위쪽 패널에 도시됨) 중 하나의 존재하에서 다양한 Fab의 NGF 차단 효과를 비교하는 그래프이다. 1.5pM의 NGF는 NGF 촉진 생존의 EC50값 부근이고, 15pM은 NGF의 포화 농도를 나타낸다. 다양한 농도의 Fab E3; 쥐과 911 Fab; 및 Fab H19-L129 및 Fab 8L2-6D5 중의 E13.5 마우스 3차신경 뉴론의 생존을 상기 개시된 바와 같이 평가하였다. IC50(pM)을 각각의 NGF 농도에서 각각의 Fab에 대해 계산하고 표 9에 도시하였다. Fab E3은 15pM 인간 NGF의 존재하에서는 약 21pM의 IC50으로, 1.5pM 인간 NGF의 존재하에서는 약 1.2pM의 IC50으로 인간 NGF-의존적 3차신경 뉴론 생존을 강하게 차단하였다. Fab 3C 및 H19-L129 또한 인간 NGF-의존적 3차신경 뉴론 생존을 강하게 차단하였다. 도 6은 0.04ng/ml의 래트 NGF(약 1.5pM; 하부 패널에 도시됨) 또는 0.4ng/ml의 래트 NGF(약 15pM; 상부 패널에 도시됨)중 하나의 존재하에서 다양한 Fab의 NGF 차단 효과를 비교하는 그래프이다. 1.5pM의 NGF는 EC50 값 부근이고, 15pM은 NGF의 포화 농도를 나타내었다. 다양한 농도의 Fab E3; 쥐과 911 Fab; 및 Fab H19-L129 및 8L2-6D5 중의 E13.5 마우스 3차신경 뉴론의 생존을 상기 개시된 바와 같이 평가하였다. EC50(pM 단위)을 각각의 NGF의 농도에서 각각의 Fab에 대해 계산하고, 표 9에 나타내었다. Fab E3는 인간 NGF-의존성 3차신경 뉴론 생존을 강력하게 차단하고, 15pM 래트 NGF의 존재하에서 약 31.6pM의 IC50, 및 1.5pM 래트 NGF의 존재하에서 약 1.3pM의 IC50을 갖는다. Fab 3C 및 H19-H129는 또한 래트 NGF-의존적 3차신경 뉴론 생존을 강력하게 차단하였다.

[표 9]

다른 실험에서, 완전 항체 E3와 Fab 3E가 0.4ng/ml의 포화 농도의 인간 NGF의 존재하에서 E13.5 뉴론의 NGF-의존성 생존을 억제하는 능력을 비교하였다. 분석 결과를 제WO2004/058184호의 도 10에 나타내었다. 완전 항체 및 Fab의 농도를 NGF 결합 부위의 수에 대해 정상화하였을 때(Fab는 1개의 결합 부위를 갖고 완전 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다), 완전 항체 E3 및 Fab 3E는 유사한 수준의 NGF-의존성 생존 억제를 나타내었다. 이런 결과는 완전 항체의 NGF 이량체로의 결합으로 인한 결합활성 효과가 없다는 것을 입증하였다.

또다른 실험에서, 다양한 농도(20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.0 nM)의 항체 E3, 항체 911 및 trkA 수용체 면역접합체(면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 NGF 수용체 trkA의 세포외 도메인으로 구성됨, CH2-CH3)가 0.4ng/ml(포화 조건)의 존재하에서 E13.5 뉴론의 NGF-의존성 생존을 억제하는 능력을 비교하였다. 이들 결과는 제WO2004/058184호의 도 11에 도시되어 있다. 이들 결과는 항체 E3이 항체 911 또는 trkA 면역접합체중 하나에 비해 NGF를 더 잘 차단함을 입증하였다.

실시예 3: 마우스 3차신경 및 결절성 뉴론 생존 분석을 이용한 항- NGF 항체 E3의 특이성 평가

항체 E3가 특이적으로 NGF 활성을 차단하는 능력을 포화 농도의 NGF, NGF-관련된 뉴로트로핀 NT3 또는 NGF-무관한 뉴로트로픽 인자, 거식 세포 자극 단백질(MSP)의 존재하에서 마우스 E17/18 3차신경 뉴론의 생존을 시험관 내 억제하는 항체의 능력을 측정함으로써 평가하였다. E13.5 TG 뉴론의 생존을 지지하는데 필요한 NGF의 수준보다 더 높은 수준에서 NGF가 마우스 E17/18 3차신경 뉴론의 생존을 지지할 필요가 있기 때문에, 마우스 E17/18 3차신경 뉴론의 생존은 항-NGF 길항제 항체의 NGF-차단 활성을 평가하기 위한 감각 분석법이다. 이들 뉴론의 생존은 또한 NT3 또는 MSP에 의해 지지되고; 따라서, 이들 뉴론의 생존은 또한 항-NGF 길항제 항체가 또한 NT3 또는 MSP를 차단하였는지를 평가하는 민감성 분석법이다.

항체 E3가 NGF 활성을 특이적으로 차단하는 능력은 또한 포화 농도의 BDNF 또는 NT4/5의 존재 하에서 마우스 결절 E17 뉴론의 생존을 억제하는 항체의 능력을 측정함으로써 평가되었다. 결절 뉴론의 생존은 BDNF 또는 NT4/5에 의해 지지되고, 따라서, 이들 뉴론의 생존은 항-NGF 길항제 항체의 BDNF 또는 NT4/5를 차단 능력을 평가하는 민감성 분석법이다.

생존 분석은 하기와 같이 수행되었다: 시간 교배된 임신한 스위스 웹스터 암컷 마우스를 CO2 흡입에 의해 마취시켰다. 자궁 뿔을 제거하고, 배아(배아 제17일 또는 제18일)를 추출하고, 목을 잘랐다. 3차신경 신경절과 결절 신경절을 절개하고 깨끗하게 하였다. 그런 다음, 신경절을 트립신처리하고, 기계적으로 분리하고, 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 4웰 플레이트(그라이네르(Greiner))에서 한정된 무혈청 배지에서 웰당 100 내지 300개 세포의 밀도로 도말하였다.

E17/18 3차신경 뉴론을 뉴로트로픽 인자를 첨가하지 않거나(음성 대조군) 또는 포화 농도의 인간 NGF(400pM 및 15pM) (양성 대조군); NT3 (400 pM); 또는 MSP (600pM)의 존재하에서 성장시켰다. 다양한 농도의 E3 및 911 Fab 및 완전 항체를 포함하는 이중 배양물을 설정하였다. Fab 및 완전 항체의 농도를 결합 부위당 표시하였다(예를 들면 완전 항체는 2개의 결합 부위를 함유하는 반면, Fab는 1개의 결합 부위를 함유한다).

E17 결절 뉴론은 첨가된 뉴로트로픽 인자없이(음성 대조군) 또는 포화 농도의 BDNF (400pM) (양성 대조군) 또는 NT4/5 (400pM) 또는 NGF 무관한 성장 인자 ILF(인터루킨 억제 인자)와 함께 성장되었다. 이 실험의 목적이 항체의 특이성을 시험하기 위한 것이기 때문에 높은 농도의 뉴로트로핀을 이용하였다. 또다시 항체 E3 및 911이 첨가되고 첨가되지 않은 점이 다양한 이중 배양액을 설정하였다. 배양액에서 48시간 후에, 상-대조 현미경을 이용한 수동 계산에 의해 각각의 조건 하에서 각각의 웰에서 살아남은 총 뉴론의 수를 확인하였다.

이들 실험의 결과는 E3 및 911 항체가 E18 3차신경 뉴론에 미치는 NGF의 생존 촉진 효과를 완전히 차단하였음을 입증하였다. 이와는 대조적으로, E3 및 911 항체는 NT3 또는 MSP에 의해 촉진되는 3차신경 뉴론의 생존, 또는 BDNF 또는 NT4/5 또는 LIF에 의해 촉진되는 결절 뉴론의 생존에 아무런 영향도 미치지 않았다. NGF 차단에 효과적인 농도에 비해 1000배 내지 10,000배 더 높은 농도에서 이들 항체와 다른 NGF 관련된 뉴트로트로핀(NT3, NT5/4, BDNF) 사이에 아무런 검출된 상호작용이 없기 때문에, 이들 결과는 항체 E3가 NGF에 대해 선택적인 특이성을 갖고 있음을 입증하였다. 또한, 이들 결과는 항체 또는 Fab E3의 첨가시 NGF-의존성 뉴론의 NGF-보충된 배양물에서 나타나는 뉴론 사망이 이들 항체와 NGF 사이의 특이적 상호작용 때문이고, 일반적인 독성 효과에 의한 것이 아님을 입증하였다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911을 또한 시험하였고, 유사한 결과가 관찰되었다. 항체 E3 및 911의 NGF에 대한 결합 친화성의 차이가 높은 농도의 뉴로트로핀을 사용하는 이런 조건하에서는 덜 명확할 것이기 때문에, 사용된 뉴로트로핀의 높은 농도로 인해 항체 E3 및 911 둘 모두 이들의 적정 조건에 매우 근접하였고, 유사한 수준에서 NGF에 결합할 것으로 예상되었다.

이들 실험의 결과는 제WO2004/058184호의 도 12, 13, 14 및 15에 도시되어 있다. 자료는 각각의 실험에 대한 양성 대조군에서 나타나는 생존에 비해 배양액 중에서의 48시간 후의 평균 생존율(평균 ±표준 오차, 각 자료 점에 대해 n= 3)을 나타내었다(예를 들면, 각각 포화 NGF 농도의 존재하에서 성장한 3차 신경 뉴론의 100% 생존 및 포화 BDNF 농도의 존재 하에서 성장한 결절 뉴론의 100% 생존). 제WO2004/058184호의 도 12 내지 13은 항-NGF 길항제 항체 E3 또는 Fab E3이 심지어 200nM의 높은 항체 농도에서도 NT3 및 MSP에 의해 촉진되는 생존을 억제하지 않는다는 것을 보여주는 도면이다. 이와는 대조적으로, 20nM의 항체 E3 또는 Fab 3E 및 Fab 911은 NGF-야기된 생존을 전적으로 차단하였다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911을 또한 시험하였고, 유사한 결과가 관찰되었다. 특히, 제WO2004/058184호의 도 12는 첨가된 뉴로트로핀이 없는 상태(용어 "대조군"), 및 400pM NGF(용어 "NGF-400pM), 10nM NT3(용어 "NT3-10nM) 또는 600pM MSP(용어 "MSP-600pM)가 존재하는 상태에서 다양한 농도(20nM, 2nM, 또는 0.2nM)의 E3 Fab(도면에서 "3E") 및 마우스 항체 911 Fab가 E18 3차신경 뉴론의 생존에 미치는 영향을 비교한 도면이다. 제WO2004/058184호의 도 13은 첨가된 뉴로트로핀이 없는 상태(용어 "인자 없음"), 및 400pM NGF(용어 "NGF-400pM), 10nM NT3(용어 "NT3-10nM) 또는 600pM MSP(용어 "MSP-600pM)가 존재하는 상태에서 다양한 농도(200nM 및 80nM)의 E3 Fab 및 완전 항체 및 마우스 항체 911 완전 항체 및 Fab가 E17 3차신경 뉴론에 미치는 영향을 비교한 그래프이다.

제WO2004/058184호의 도 14 및 15는 항-NGF 길항제 항체 E3 또는 Fab E3가 BDNF, NT4/5 또는 LIF에 의해 촉진되는 E17 결절 뉴론의 생존을 억제하지 않음을 보여주는 그래프이다. 마우스 항-NGF 길항제 항체 911을 또한 시험하였고, 유사한 결과가 관찰되었다. 특히, 제WO2004/058184호의 도 14는 첨가된 뉴로트로핀이 없는 상태(용어 "인자 없음"), 및 400pM BDNF(용어 "GDNF-400pM), 400pM NT4/5(용어 "NT4/5-400nM) 또는 2.5nM LIF(용어 "LIF-2.5nM)가 존재하는 상태에서 다양한 농도(200nM 또는 80nM)의 완전 항체 E3(도면에서는 용어 "3E"), Fab E3, 완전 항체 911 또는 Fab 911이 E17 3차신경 뉴론의 생존에 미치는 영향을 비교한 그래프이다. 제WO2004/058184호의 도 15는 첨가된 뉴로트로핀이 없는 상태(용어 "대조군"), 및 400pM BDNF(용어 "GDNF-400pM), 400pM NT4/5(용어 "NT4/5-400nM) 또는 2.5nM LIF(용어 "LIF-2.5nM)가 존재하는 상태에서 다양한 농도(200nM, 20nM, 2nM)의 Fab E3(도면에서는 용어 "3E") 또는 Fab 911이 E17 결절 뉴론의 생존에 미치는 효과를 비교한 그래프이다.

실시예 4: 포유동물 발현 벡터의 제조 및 포유동물 세포에서 항체 E3 의 발현

포유동물 세포에서 항체 E3를 발현시키는데 사용하기 위해 3가지의 포유동물 발현 벡터를 고안하고 구축하였다.

벡터 Db.911.3E는 E3 항체의 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG2a 불변 영역을 포함하는 발현 벡터로서, 중쇄의 일시적 또는 안정적 발현에 적합하다. Db.911.3E는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된다: 쥐과 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오타이드 1 내지 612); 합성 인트론(뉴클레오타이드 619 내지 1507); DHFR 코딩 영역(뉴클레오타이드 707 내지 1267); 인간 성장 호르몬 신호 펩타이드(뉴클레오타이드 1525 내지 1602); 항체 3E 중쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 1603 내지 1965); A330P331에서 S330S331로의 돌연변이(아미노산 번호는 야생형 IgG2a 서열을 기준으로 함; [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624] 참고)를 함유하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역; SV40 말기 폴리아데닐화 신호(뉴클레오타이드 2974-3217); SV40 인핸서 영역(뉴클레오타이드 3218 내지 3463); 파지 f1 영역(뉴클레오타이드 3551 내지 4006); 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역(뉴클레오타이드 4443 내지 5300). Db.911.3E는 2003년 1월 8일자로 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁번호 PTA-4895가 할당되었다.

벡터 Eb.911.3E는 E3 항체의 경쇄 가변 영역 및 인간 카파쇄 불변 영역을 포함하는 발현 벡터이고, 경쇄의 일시적 발현에 적합하다. Eb.911.3E는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된다: 쥐과 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오타이드 1 내지 612); 인간 EF-1 인트론(뉴클레오타이드 619 내지 1142); 인간 성장 호르몬 신호 펩타이드(뉴클레오타이드 1173 내지 1150); 항체 E3 경쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 1251 내지 1571); 인간 카파쇄 불변 영역(뉴클레오타이드 1572 내지 1892); SV40 말기 폴리아데닐화 신호(뉴클레오타이드 1910 내지2153); SV40 인핸서 영역(뉴클레오타이드 2154 내지 2399); 파지 f1 영역(뉴클레오타이드 2487 내지 2942) 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역(뉴클레오타이드 3379-4236). Eb.911.3E는 2003년 1월 8일자로 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁번호 PTA-4893이 할당되었다.

벡터 Eb.pur.911.3E는 E3 항체의 경쇄 가변 영역 및 인간 카파쇄 불변 영역을 포함하는 발현 벡터이고, 경쇄의 안정한 발현에 적합하다. Eb.pur.911.3E는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된다: 쥐과 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오타이드 1 내지 612); 인간 EF-1 인트론(뉴클레오타이드 619 내지 1758); pac 유전자(퓨로마이신R) 코딩 영역(뉴클레오타이드 739 내지 1235); 인간 hsp70 5'UTR 영역(뉴클레오타이드 1771 내지 1973); 인간 성장 호르몬 신호 펩타이드(뉴클레오타이드 1985 내지 2062); 항체 E3 경쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 2063 내지 2383); 인간 카파쇄 불변 영역(뉴클레오타이드 2384 내지 2704); SV40 말기 폴리아데닐화 신호(뉴클레오타이드 2722 내지 2965); SV40 인핸서 영역(뉴클레오타이드 2966 내지 3211); 파지 f1 영역(뉴클레오타이드 3299 내지 3654) 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역(뉴클레오타이드 4191-5048). Eb.pur.911.3E는 2003년 1월 8일자로 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁번호 PTA-4894가 할당되었다.

일시적 세포 발현은 다음과 같이 수행되었다: 150mm 접시 중의 CHO 및 HEK293T 세포를 25㎍의 각각의 플라스미드(즉, 중쇄를 함유하는 하나의 플라스미드 및 경쇄를 함유하는 하나의 플라스미드)로 일시적 공동-형질감염시켰다. 제조자의 지시에 따라 DNA를 100㎕의 리포펙타민 2000(인비트로겐)과 혼합하였다. DNA-지질 복합체가 혈청 또는 항체 없이 5시간동안 DMEM/F12 배지 중의 세포와 접촉하게 두었다. 이러한 배양후, 이틀동안 임의의 첨가제 없이 배지를 Opti-MEM(인비트로겐)으로 발현을 위해 변경시켰다. 항체를 함유하는 세포 상층액을 연속적으로 4회 수확하고 후속적으로 배지를 교환하였다. 맵셀렉트 프로테인(MapSelect Protein) A 수지(아머샴 바이오사이언시즈 17-5199-02)를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 상층액을 정제하였다. 항체를 0.3M 글리신, 0.6M NaCl 완충액 pH 8 중의 단백질 A 수지에 결합시킨 후, 0.1M 시트레이트 완충액, pH 3으로 용출시켰다. 항체를 함유한 분획을 1M 트리스 완충액 pH8.0으로 즉각 중화시켰다. 그런 다음, 항체 분획을 투석하고 PBS에서 농축하였다.

실시예 5 - 임상 연구

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 하나 이상의 통증 및/또는 하부 요로 증후군을 치료하는데 있어 항-NGF 길항제 항체 E3의 안전성 및 효능을 확인하기 위해, 간질성 방광염으로 임상 진단된 환자를 항-NGF 길항제 항체로 치료하였다. 치료되는 환자는 치료전 스크리닝에서 16 이상의 골반통 및 절박뇨/빈뇨(PUF -[Parsons et al. Urology 2002;60:573-578]) 점수 및 8 이상의 오리리-상트(O'Leary-Sant) 간질성 방광염 증후군 지수(ICSI-[O'Leary et al. Urology 1997; 49(Suppl 5A):58-63]) 점수를 특징으로 하는 온화하거나 심한 간질성 방광염을 가질 것이다. 다른 포함 기준도 만족되어야 한다. 모든 포함 기준을 만족하지 않거나 하나 이상의 배타적 기준을 만족하지 않는 환자는 스크린 실패로 간주되고 연구에서 무작위로 골라지지 않는다.

간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 치료에 있어 위약과 비교된 주입을 통한 단일 투여 항체의 효능을 평가한다. E3 항체는 200㎍/kg의 투여량으로 환자에게 정맥내 투여된다. 효능에 추가하여, 다른 측정치 중에서도 위약과 비교된 치료 효과의 크기; 간질성 방광염에 대한 생물학적마커의 항체를 이용한 치료에 대한 반응; 및 치료 반응 등급을 평가하였다. 생물학적마커는 다른 것들 중에서도 NGF, 당단백질-51(GP-51), 항증식 인자(APF) 및 HB-상피 성장 인자(HB-EGF)를 포함한다.

1차 종말점은 단일 투여량의 E3 항체를 정맥내 주입한 지 6주 후에 분석된다. 투여 후 2, 10 및 16주에서의 평가가 또한 2차 종말점으로 포함된다. 1차 종말점은 11점 통증 수치 등급 규모(NCS)에서의 변화일 것이다. 오리리-상트(O'Leary-Sant) 간질성 방광염 증후군 지수(ICSI)를 2차 종말점으로 이용한다. 다른 2차 종말점은 오리리-상트 간질성 방광염 문제 지수(ICPI -[O'Leary et al. Urology 1997; 49(Suppl 5A):58-63]), ICSI + ICPI, 골반통 및 절박뇨/빈뇨(PUF), 평균적인 1일 통증, 배뇨 빈도, 야뇨 빈도, 요실금 에피소드 빈도, 배뇨당 평균 배설 체적, 평균 간질성 방광염 통증 심각성, 절박뇨 에피소드, 평균적인 수면 방해 점수, 성교통과 관련된 평균적인 통증 점수, 전반적인 반응 평가, 환자가 보고하는 치료 영향 평가, 치료 실패, 생물학적마커, 안전성 종말점 및/또는 약동학적 측정치를 비롯한 연구 기간동안 환자에 의해 기록된 매일의 배뇨 변수를 포함한다. 생물학적마커는 다른 것들 중에서도 NGF, 당단백질-51(GP-51), 항증식 인자(APF) 및 HB-상피 성장 인자(HB-EGF)를 포함한다.

하기의 자료는 간질성 방광염/통증성 방광 증후군/방광 통증 증후군(IC/PBS/BPS)를 갖는 환자에서 E3 항체의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 상기 프로토콜을 이용한 진행 임상 시험의 중간 분석에서 나온 것이다. 24명의 환자에서 나온 자료를 중간 분석에 이용하였다. 통증 NRS 및 ICSI 점수 둘 모두에서 명확한 개선(감소)이 나타난다. 위약이 처방된 환자에서보다 E3 항체가 처방된 환자에서 관찰된 개선이 더 크다. 이들 자료는 E3 항체가 IC/PBS/BPS와 관련된 통증 및 다른 하부 요로 증후군(LUTS)의 치료에 효과적일 수 있다는 사실을 뒷받침한다. 그러나, 최종 연구 결과가 평가될 필요가 있을 것이다.

11점(0 내지 10) 수치 등급 스케일(NRS)을 이용하여 통증을 평가하였다. 이 스케일은 통증 완화에 대한 치료의 평가에서 입증되어 있고 널리 이용되고 있다.

간질성 방광염 증후군 지수(ICSI)는 0 내지 20의 범위의 점수를 이용하여 전반적인 IC 증후군 심각성을 평가한다. 이는 IC/PBS/BPS와 관련된 통증과 LUTS에 관한 4가지 질문에 근거한다. 여기에는 지난 4주 동안의 낮과 밤시간의 배뇨 빈도, 절박뇨 및 방광 통증의 심각성의 측정이 포함된다.

생물학적 물질의 기탁

하기 물질이 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁되었다.

이들 기탁에 대한 상세한 내용은 본원에 그 전체가 참고로 인용되고 있는 제WO2004058184호에서 발견할 수 있다.

항체 서열

중쇄 가변 영역(카바트 CDR은 밑줄쳐져 있고; 코티아 CDR은 굵은 이탤릭체로 표시되어 있다)

경쇄 가변 영역(카바트 CDR은 밑줄쳐져 있고; 코티아 CDR은 굵은 이탤릭체로 표시되어 있다)

E3 중쇄 연장된 CDR

CDRH1:

(서열번호 3)

CDRH2:

(서열번호 4)

CDRH3:

(서열번호 5)

E3 경쇄 연장된 CDR

CDRL1:

(서열번호 6)

CDRL2:

(서열번호 7)

CDRL3:

(서열번호 8)

마우스 모노클론 항체 911 연장된 CDR

911 중쇄 연장된 CDR

CDRH1 :

(서열번호 9)

CDRH2 :

(서열번호 10)

CDRH3:

(서열번호 11)

911 경쇄 연장된 CDR

CDRL1:

(서열번호 12)

CDRL2:

(서열번호 13)

CDRL3:

(서열번호 14)

E3 중쇄 아미노산 서열(전체)

3E 경쇄 아미노산 서열(전체)

3E 중쇄 뉴클레오타이드 서열(완전 항체)

3E 중쇄 가변 도메인 뉴클레오타이드 서열

3E 경쇄 뉴클레오타이드 서열(완전 항체)

3E 중쇄 가변 도메인 뉴클레오타이드 서열

상기 서열 및 본원에 개시된 다른 서열은 첨부된 서열목록에 제공되어 있다.

서열 목록 자유 텍스트

첨부된 서열 목록에 첨부된 서열번호 1 내지 8, 15 내지 68, 70 내지 72 및 74 내지 77에 의해 확인된 서열은 자유 텍스트 "합성 구축물"을 갖는다.

본원에 개시된 실시예 및 양태는 단지 예시 목적이고, 이에 비추어 다양한 개질 및 변화가 당 업자에게 제안될 것이고, 본원의 진의 및 영역에 포함되고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Limited <120> Treatment of Interstitial Cystitis <130> PC33649 <140> PCT/IB2008/055383 <141> 2008. 12. 17. <150> 61/014,171 <151> 2007. 12. 17 <150> 61/061,149 <151> 2008. 6. 13. <160> 77 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr 20 25 30 Asp Leu Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 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gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540 tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660 agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720 ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840 ggagtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900 agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgccaccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa gtaa 1344 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caccttgtcc agcccctcca 780 gtggccggac catccgtgtt cctgttccct ccaaagccaa aggacaccct gatgatctcc 840 agaaccccag aggtgacctg tgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc agaggtgcag 900 ttcaactggt atgtggacgg agtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc aagagaggag 960 cagttcaact ccaccttcag agtggtgagc gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg 1020 aacggaaagg agtataagtg taaggtgtcc aacaagggac tgccatccag catcgagaag 1080 accatctcca agaccaaggg acagccaaga gagccacagg tgtataccct gccaccatcc 1140 agagaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg attctatcca 1200 tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac ggacagccag agaacaacta taagaccacc 1260 cctccaatgc tggactccga cggatccttc ttcctgtatt ccaagctgac cgtggacaag 1320 tccagatggc agcagggaaa cgtgttctct tgttccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1380 cactataccc agaagagcct gtccctgtct ccaggaaagt aattctaga 1429 <210> 77 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> 646 <223> m = A or C <400> 77 atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg 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Claims

대상의 간질성 방광염 및/또는 통증성 방광 증후군 및/또는 방광 통증 증후군과 관련된 통증 및/또는 하부 요로 증후군의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 항-신경 성장 인자(NGF) 길항제 항체.