BRPI0822049B1 - Composiqao farmaceutica compreendendo anticorpo antagonista anti-ngf, kit e uso de um anticorpo antingf - Google Patents

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Abstract

anticorpo antagonista anti-ngf, kit e composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo, e usos do mesmo. a presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo anti-ngf no tratamento ou na prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (luts) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo anti- NGF no tratamento ou na prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A cistite intersticial (IC) é uma doença da bexiga crônica, de origem desconhecida, caracterizada por sintomas de dor, tal como dor pélvica, e sintomas do trato urinário inferior (LUTS) tal como uma fre- quência/urgência urinária alta. Mais recentemente a terminologia evoluiu para incluir síndrome da bexiga dolorosa (PBS) (MacDiarmid, S.A. e outros, Rev. Urol. 2007;9(1):9-16) ou síndrome da dor na bexiga (BPS)(van der Merve e outros, European Urology53(2008) 60-67, junto com IC, que é IC/PBS/BPS para descrever coletivamente este complexo de sintoma.
[003] As taxas de prevalência de IC/PBS/BPS variam de 67 a 230 por 100.000 mulheres tendo doença clinicamente confirmada, embora o número seja provavelmente maior do que este devido a subdiagnós- tico ou diagnóstico errado, geralmente como endometriose, infecção do trato urinário recorrente, bexiga hiperativa ou vulvodinia (Forrest, J.B. e outros, Clinical Courier2006;24(3):1-8). A IC tem um impacto significante sobre a qualidade de vida, afetando viagem, relações de família e emprego (Slade, D. e outros, Urol.1997;49 (5A Supl.):10-3), bem como estando associada a sintomas depressivos (Rothrock, N.E. e outros, J. Urol., 2002; 167:1763-1767).
[004] Há alguns testes aleatorizados, controlados com placebo, bem realizados, de terapias objetivando a IC, e tratamento frequentemente consiste em uma abordagem de teste-e-erro multimodal, conforme evidenciado por uma revisão de pacientes no estudo de Interstitial Cystitis Data Base que relatou 183 tipos diferentes de tratamento (Rovner, E. e outros, J. Ural., 2000;56:940-5).
[005] Nenhuma etiologia foi identificada, e é mais provavelmente um processo multifatorial com vários insultos urológicos causando um processo de autoperpetuação de disfunção de célula epitelial, ativação de fibra de nervo C e proliferação de mastócitos, levando a dano de tecido pior, cicatrização e fibrose. A estimulação repetitiva de fibras C da inflamação e supra-regulagem de nervos sensoriais na bexiga por fim levam a alterações permanentes (centralização) resultando em hi- peralgesia, dor na bexiga crônica e disfunção de urina (Forrest, J.B. e outros, Clinical Courier 2006;24(3): 1-8).
[006] Embora tenha havido consenso sobre as causas fundamentais da IC, dados existentes levaram à especulação que três mecanismos patológicos podem estar implicados: disfunção epitelial, ativação de mastócito e inflamação neurogênica (Nazif, O. e outros, Urol. 2007;69 (Supl. 4A):24-33).
[007] Há uma necessidade contínua de tratamento eficaz, novo, para dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior de cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga sem os efeitos adversos ou eficácia limitada de terapias atualmente disponíveis.
[008] Foi relatado que um anticorpo anti-NGF humano recombi- nante (fator de crescimento de nervo) foi testado em pacientes com cistite intersticial (Dimitrakov e outros, J. Urology, Vol. 171(4), Supplement,363 (2004)). Embora o objetivo do estudo fosse avaliar a eficácia e a segurança "em um grupo de pacientes IC com dano ao nervo significante ou componente de dor neuropática que falhou em vários tratamentos anteriores", apenas efeitos sobre dano ao nervo foram relatados usando níveis de marcador de dano ao nervo urinário. É importante notar que nenhuma eficácia é relatada no tratamento de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior da condição.
[009] O anticorpo anti-NGF E3 foi anteriormente relatado como sendo útil no tratamento de dor, incluindo dor de artrite reumatoide, dor de osteoartrite e dor pós-cirúrgica (vide, por exemplo, W02004/058184). No entanto, dada a etiologia da cistite intersticial e compreensão mecanística pobre da condição, não pode ser facilmente previsto que um anticorpo anti-NGF, tal como anticorpo E3, pudesse ser usado para tratamento de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome de dor da bexiga.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] Em um aspecto da invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF. Em uma modalidade, o anticorpo: (b) se liga a NGF com uma KD de menos do que cerca de 2 nM; (c) inibe sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF humano; e/ou (d) inibe sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 1,5 pM de NGF.
[001] Dor associada à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga compreende dor abdominal inferior (pélvica); dor da bexiga; dor suprapúbica; dor vaginal; dor no pênis, testículos, escroto e períneo; dor uretral; dispareneuria; dor, pressão ou desconforme que pode aumentar conforme a bexiga enche.
[002] Sintomas do trato urinário inferior compreendem três grupos de sintomas urinários, que podem ser definidos como sintomas de armazenamento (irritativo), esvaziamento (obstrutivo) e pós-micção. Sintomas de armazenamento compreende urgência, frequência, noctú- ria, incontinência de urgência e incontinência de estresse, que podem estar associados à bexiga hiperativa (OAB) e hiperplasia prostática benigna (BPH). Sintomas de esvaziamento compreendem hesitação, fluxo pobre, intermitência, tensão e disúria. Sintomas pós-micção compreendem gotejamento terminal, gotejamento pós-esvaziamento e uma sensação de esvaziamento incompleto.
[003] Bexiga Hiperativa (OAB) é definida com urgência, com ou sem incontinência de urgência, geralmente com frequência e noctúria [Abrams e outros, Neurology and Urodynamics 21:167-178 (2002)]. Prevalência de OAC em homens e mulheres é similar, com aproximadamente 16% da população dos Estados Unidos sofrendo da condição [Stewart e outros, Prevalence of Overactive Bladder in the United States: Results from the NOBLE Program’, Abstract Presented at the 2nd International Consultation on Incontinence, julho de 2001, Paris, França].
[004] Os termos OAB Úmida e OAB Seca descrevem pacientes com OAB com ou sem incontinência urinária respectivamente. Anteriormente, o sintoma cardinal da OAB era acreditado ser incontinência urinária. No entanto, com o advento de novos termos isto claramente não é significante para o grande número de sofredores que não são incontinentes (isto é, pacientes com OAB Seca). Então, um estudo de 2001 de Liberman e outros ['Health Related Quality of Life Among Adults with Symptoms of Overactive Bladder: Results From A US Community-Based Survey'; Urology 57(6), 1044-1050, 2001] examinou o impacto de todos os sintomas de OAB sobre a qualidade de vida de uma amostra com base na comunidade da população dos Estados Unidos. Este estudo demonstrou que indivíduos sofrendo de OAB sem qualquer perda demonstrável de urina têm uma qualidade de vida prejudicada quando comparado com controles.
[005] BPH é uma doença cronicamente progressiva que pode levar a complicações tal como retenção urinária aguda, infecções do trato urinário recorrentes, pedras na bexiga e disfunção renal. A prevalência e a severidade média de LUTS associadas a BPH em homens aumentam com a idade.
[006] BPH leva a um aumento no volume da próstata, criando obstrução de fluxo de saída uretral e da bexiga bem como mudanças secundárias no funcionamento da bexiga. Os efeitos disto são manifestados por ambos os sintomas de armazenamento (irritativo) e esvaziamento (obstrutivo).
[007] Foi mostrado de acordo com a invenção que um anticorpo antagonista anti-NGF é capaz de inibir ou bloquear dor e/ou sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. Em algumas modalidades, a dor e/ou o sintoma do trato urinário inferior é/são aliviados dentro de cerca de 24 horas após administração do anticorpo antagonista anti-NGF. Em algumas modalidades, a dor e/ou o sintoma do trato urinário inferior é/são aliviados dentro de cerca de 4 dias após administração do anticorpo antagonista anti-NGF. Em algumas modalidades, a dor e/ou o sintoma do trato urinário inferior é/são aliviados antes da observação ou na ausência de uma indicação de melhora da condição no indivíduo.
[008] Em um aspecto adicional da invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF compreendendo uma região variável de cadeia longa compreendendo: Uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:3; uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.
[009] Em um aspecto adicional da invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF compreendendo uma região variável de cadeia curta compreendendo: Uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:6; uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:7; e uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:8.
[0010] O anticorpo antagonista anti-NGF pode compreender ainda uma região variável de cadeia longa compreendendo: Uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:3; uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.
[0011] O anticorpo antagonista anti-NGF pode compreender uma região variável de cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:2, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
[0012] A região variável de cadeia longa e/ou a região variável de cadeia curta do anticorpo anti-NGF pode compreender uma ou mais mutações de estrutura principal respectivas. Em um aspecto, a mutação de estrutura principal pode substituir um resíduo de estrutura principal humano com o resíduo de estrutura principal de murino complementar. A mutação pode compreender a substituição V71K na região variável de cadeia longa.
[0013] O anticorpo de antagonista anti-NGF pode compreender uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1 e/ou pode compreender uma região variável de cadeia curta compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2.
[0014] O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS:1 e 2. O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS:16e 17.
[0015] O anticorpo antagonista anti-NGF pode compreender uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16 e uma cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
[0016] O anticorpo antagonista anti-NGF pode competir para ligação com NGF com um anticorpo antagonista anti-NGF conforme aqui definido. O anticorpo antagonista anti-NGF pode competir para ligação com NGF com um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia curta compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2.
[0017] O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser um humanizado. O anticorpo pode ser anticorpo E3, que se liga especificamente a NGF humano ou de roedor. O anticorpo E3 é descrito na WQ2004/058184, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta de E3 são mostradas nas SEQ ID NOS:1 e 2 (figuras 1A e 1B da WQ2004/058184), respectivamente. As porções de CDR de anticorpo E3 (incluindo CDRs de Chothia e Kabat) são diagramaticamente mostradas nas figuras 1A e 1B da WQ2004/058184. As sequências de aminoácido de cadeias longa e curta E3 e das CDRs prolongadas individuais são também mostradas abaixo (vide "sequências de anticorpo" abaixo). O anticorpo E3 é altamente potente em sequestrar NGF e prevenir interação com seu receptor. E3 e seu anticorpo precursor de murino 911 foram mostrados ser um analgésico eficaz em modelos de animal não-clínicos de dor patológico incluindo artrite, dor de câncer e dor pós-cirúrgica.
[0018] Em outro aspecto, o anticorpo compreende um fragmento ou uma região do anticorpo E3 (intercomutavelmente chamado "E3" aqui). Em uma modalidade, o fragmento é uma cadeia curta do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1B da WQ2004/058184 e SEQ ID NO: 17 aqui. Em outra modalidade, o fragmento é uma cadeia longa do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1A da WQ2004/058184 da SEQ ID NO: 16 aqui. Em ainda outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia curta e/ou uma cadeia longa do anticorpo E3. Em ainda outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais CDRs de uma cadeia curta e/ou uma cadeia lon- ga do anticorpo E3 conforme mostrado nas figuras 1A e 1B da W02004/058184 e SEQ ID NOS: 17 e 16, respectivamente, aqui.
[0019] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma cadeia curta que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA- 4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma cadeia longa que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, o anticorpo compreende (a) uma cadeia curta que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894 ou ATCC No. PTA-4893; e (b) uma cadeia longa que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895 (para conveniência aqui, o(s) polinucleotídeo(s) produzido(s) por uma célula hospedeira depositada é (são) referido(s) como tendo um número de depósito de ATCC Nos. PTA-4894, PTA-4893 e PTA-4895). Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta de uma cadeia curta que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894 ou ATCC No. PTA-4893. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa de uma cadeia longa que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia curta de uma cadeia curta que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894 ou ATCC No. PTA-4893 e (b) uma região variável de cadeia longa de uma cadeia longa que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em ainda outro aspecto, o anticorpo compreende uma ou mais CDRs codificadas por (a) um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito ATCC No. PTA-4894; e/ou (b) uma cadeia longa que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895.
[0020] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo de comprimento integral, que pode ser da subclasse lgG2. O anticorpo pode compreender a região constante de lgG2a de cadeia longa humana. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região constante capa de cadeia curta humana. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, por exemplo, não dispara lise mediada por complemento, ou não estimula citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em outras modalidades, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624; PCT WO9958572. O anticorpo pode compreender uma região constante de lgG2a de cadeia longa humana compreendendo as mutações que seguem: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à sequência de lgG2a do tipo selvagem).
[0021] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um fragmento de anticorpo, tais como fragmentos Fab ou Fab'2 ou um anticorpo de cadeia simples.
[0022] Em outro aspecto, o anticorpo compreende qualquer um ou mais dos que seguem: a) uma ou mais CDRs de anticorpo E3 mostradas nas SEQ ID NOs: 1-8 (figuras 1A e 1B da W02004/058184); b)CDR H3 da cadeia longa do anticorpo E3 mostrada na SEQ ID Nos. 1 e 5 (figura 1A da WO 2004/058184); c) CDR L3 da cadeia curta de anticorpo E3 mostrada nas SEQ ID NOs: 2 e 8 (figura 1B da W02004/058184); d) três CDRs da cadeia curta de anticorpo E3 mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6-8 (figura 1B da W02004/058184); e) três CDRs da cadeia longa do anticorpo E3 mostradas nas SEQ ID NOs:, 1, 3-5 (figura 1A da W02004/058184); f) três CDRs da cadeia curta e três CDRs da cadeia longa de anticorpo E3 mostradas nas SEQ ID NOs:1-8 (as figuras 1A e 1B da W02004/058184). Em outro aspecto, o anticorpo pode compreender qualquer um ou mais do que segue: a) uma ou mais (um, dois, três, quatro, cinco ou seis) CDRs derivadas de anticorpo E3 mostradas nas SEQ ID NOs:1-8 (figuras 1A e 1B da W02004/058184); b) uma CDR derivada da CDR H3 da cadeia longa de anticorpo E3 mostrada nas SEQ ID NOs: 1 e 5 (figura 1A da W02004/058184); e/ou c) uma CDR derivada de CDRL L3 da cadeia curta de anticorpo E3 mostrada nas SEQ ID NOs:2 e 8 (figura 1B da W02004/058184). Em algumas modalidades, as CDRs podem ser CDRs de Kabat, CDRs de Chothia ou uma combinação de CDRs de Kabat e Chothia (chamadas aqui CDRs "estendidas" ou "combinadas"). Em algumas modalidades, os polipeptídeos compreendem qualquer uma das configurações de CDR (incluindo combinações, variantes, etc) descritas aqui.
[0023] Em um aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo SEQ ID NO:9, em que I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é substituída com N, T ou S. Para conveniência aqui, "substituído" ou "é" no presente contexto ou referência a um aminoácido refere-se a escolhas de aminoácido(s) para uma dada posição. Como é claro, a substituição, ou a escolha, pode ser o aminoácido mostrado na SEQ ID aqui.
[0024] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo SEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V.
[0025] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; e em que Y110 é Y, K, S, R ou T.
[0026] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo a SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido.
[0027] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo SEQ ID NO:11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido.
[0028] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo SEQ ID NO:12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q.
[0029] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo SEQ ID NO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T.
[0030] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e em que Y96 é Y ou R.
[0031] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é You R.
[0032] Em um aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:9, em que I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é N, Tou S.
[0033] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:10, em que M50 é M, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V.
[0034] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; e em que Y110 é Y, K, S, R ou T.
[0035] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou T; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D019 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido.
[0036] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D019 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido.
[0037] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q.
[0038] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:12, em que 151 é I, T, V ou A; em que S56 é S ou T.
[0039] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e em que Y96 é Y ou R.
[0040] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R.
[0041] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo a região CDR1 de SEQ ID NO:9, em que I34 é S, L, V, A ou I; e N35 é N, T ou S; a região de CDR2 de SEQ ID NO:10, em que M50 é M, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e a região de CDR3 de SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; em que Y110 é Y, K, S, R ou T. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia longa compreende a região de CDR3 de SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; em que Y110 é qualquer aminoácido. Em outras modalidades, a região de variável de cadeia longa compreende a região de CDR3 de SEQ ID NO:11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, anticorpo compreende ainda uma região variável de cadeia curta de anticorpo.
[0042] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo a região CDR1 de SEQ ID NO:12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N, ou Q; a região CDR2 de SEQ ID NO:13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e a região CDR3 de SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia curta compreende a região CDR3 de SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda uma cadeia longa de anticorpo.
[0043] Em outro aspecto, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia longa compreendendo a região CDR1 de SEQ ID NO:9, em que I34 é S, L, V A ou I; e N35 é N, T ou S; a região CDR2 de SEQ ID NO:10, em que M50 é M, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e a região CDR3 de SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é You W; em que G103 é G, Aou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; em que Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma região variável de cadeia curta compreendendo a região CDR1 de SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q; a região CDR2 de SEQ ID NO:13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e a região CDR3 de SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia curta compreende a região CDR3 de SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia longa compreende a região CDR3 de SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, Aou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; em que Y110 é qualquer aminoácido. Em outras modalidades, a região variável de cadeia longa compreende a região CDR3 de SEQ ID NO:11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda uma cadeia curta de anticorpo.
[0044] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9, em que I34 é S, L, V A ou I; e N35 é N, T ou S; uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:10, em que M50 é M, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 11, em que Y100 é I, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; em que Y110 é Y, K, S, R ou T. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; e em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido. Em outras modalidades, o poli- peptídeo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID N0:11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e onde Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda uma região variável de cadeia curta de anticorpo.
[0045] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q; uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R, ou S; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e onde Y96 é I ou R. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda uma região variável de cadeia longa de anticorpo.
[0046] Em outro aspecto, o anticorpo compreende (a) uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:9, em que I34 é S, L, V A ou I; e N35 é N, T ou S; uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:10, em que M50 é M, I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; e em que Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q; uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:14, em que S91 éSouE; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; em que Y110 é qualquer aminoácido. Em outras modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D ou T; em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda uma região variável de cadeia curta de anticorpo.
[0047] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo: (a) uma região CDR1 de SEQ ID NO:9, em que I34 é S, L, V A ou I; e N35 é substituído com N, T ou S; (b) uma região CDR2 de SEQ ID NO: 10, em que M50 é I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e (c) uma região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; e onde Y110 é Y, K, S, R ou T; em que o anticorpo se liga a NGF.
[0048] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo: (a) uma região CDR1 de SEQ ID NO:12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q; (b) uma região CDR2 de SEQ ID NO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e (c) uma região CDR3 de SEQ ID NO:14, em que K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R; em que o anticorpo se liga a NGF.
[0049] Em outro aspecto, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia longa compreendendo: (i) uma região CDR1 de SEQ ID NO:9, em que I34 é substituído com S, L, V A ou I; e N35 é substituído com N, T ou S; (ii) uma região CDR2 de SEQ ID NQ:10, em que M50 é I, G, Q, S ou L; A62 é A ou S; e L63 é L ou V; e (iii) uma região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A ou T; em que Y106 é Y, R, T ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N ou G; em que Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma região variável de cadeia curta compreendendo: (i) uma região CDR1 de SEQ ID NO:12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A ou Y; e H32 é H, N ou Q; (ii) uma região CDR2 de SEQ ID NO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e (iii) uma região CDR3 de SEQ ID NO:14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R ou S; e onde Y96 é Y ou R; em que o anticorpo se liga a NGF.
[0050] A menos que de outro modo mencionado, escolha (por exemplo, substituição) de um aminoácido em um local é independentemente selecionada de seleção de um aminoácido em qualquer outro local.
[0051] Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem qualquer uma das configurações de CDR (incluindo combinações, variações, etc) descritas aqui.
[0052] Como é evidente a partir do presente relatório, a numera ção de região variável usada aqui é numeração sequencial. Um versado na técnica compreende prontamente que vários sistemas de numeração de anticorpo existem (tais como numerações Kabat e Chothia) e como converter numeração sequencial em outro sistema de numeração, tal como numeração Kabat ou numeração Chothia.
[0053] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma sequência de CDR3) selecionada de SEQ ID NO:46 ou 50. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:3, 4, 5, 6, 7 e 8. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15.
[0054] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR, tal como região CDR H1 e/ou CDR H2) selecionada de (a) SEQ ID NOs: 28 e/ou 29; (b) SEQ ID NQs:30 e/ou 31; (c) SEQ ID NOs:32 e/ou 33; (d) SEQ ID NOs:34 e/ou 35; (e) SEQ ID NOs:36 e;ou 37; (f) SEQ ID NOs:38 e/ou 39; e (g) SEQ ID NQs:40 e 41. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR H1) selecionada de SEQ ID NOs:28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR H2) selecionada de SEQ ID NOs:29, 31, 33, 35, 37, 39 e 41. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:3, 4, 5, 6, 7 e 8. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15.
[0055] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR, tal como uma região CDR L1 e/ou CDR L2) selecionada de (a) SEQ ID NOs: 18 e/ou 19; (b) SEQ ID NOs:20 e/ou 21; e (c) SEQ ID NOs:22 e/ou 23. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR L1) selecionada de SEQ ID NOs:18, 20 e 22. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR L2) selecionada de SEQ ID NOs:19, 21 e 23. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:3, 4, 5, 6, 7, 8. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:9, 10, 11,1 2, 13, 14 e 15.
[0056] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR, tal como uma região CDR L3 e/ou CDR H3) selecionada de (a) SEQ ID NOs:51 e/ou 52; (b) SEQ ID NOs:55 e/ou 56; (c) SEQ ID NOs:57 e/ou 58; (c) SEQ ID NOs:59 e/ou 60; (d) SEQ ID NOs:61 e/ou 62; SEQ ID NOs:63 e/ou 64. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR L3) selecionada de SEQ ID NOs:51, 55, 57, 59, 61 e 63. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR H3) selecionada de SEQ ID NOs:52, 56, 58, 60, 62 e 64. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma sequência de aminoácido mostrada em uma ou mais das SEQ ID NOs:18, 19, 30 e 31. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:3, 4, 5, 6, 7 e 8. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende ainda uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:9, 10, 11, 12, 13, 14e15.
[0057] Em outro aspecto, o anticorpo pode compreender: uma região variável de cadeia longa compreendendo: uma região CDR1 de SEQ ID NO:30; uma região CDR2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO:31; uma região CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:11, 56, 58, 60, 62 e 64; e uma região variável de cadeia curta compreendendo: uma região CDR1 de SEQ ID NO:18; uma região CDR2 de SEQ ID NO:19; uma região CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:14, 55, 57, 59, 61 e 63.
[0058] Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma ou mais de uma sequência de aminoácido (tal como uma região CDR) mostrada nas SEQ ID NOs:61, 63, 18, 19, 30 e 31.
[0059] Em outro aspecto, o anticorpo pode ser selecionado de um anticorpo anti-NGF conhecido na técnica, tais como anticorpos descritos na W02005019266 (incluindo anticorpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 e 4G6) ou na W02006131951 (incluindo anticorpo Hu-aD11). O anticorpo pode se ligar ao mesmo epitopo em NGF, particularmente NGF humano, como um anticorpo anti-NGF conhecido na técnica, tais como anticorpos descritos na W02005019266 (incluindo anticorpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 e 4G6) ou na W02006131951 (incluindo anticorpo Hu-aD11), ou um anticorpo definido aqui, e/ou pode competir para ligação a NGF com tal anticorpo.
[0060] Em algumas modalidades, a lisina C-terminal da cadeia longa de qualquer um dos anticorpos anti-NGF descritos aqui é clivada. Em vários casos, as cadeias longa e curta dos anticorpos anti-NGF pode incluir opcionalmente uma sequência de sinal.
[0061] Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo antagonista anti-NGF que se liga a NGF (tal como NGF humano) com uma alta afinidade. Em algumas modalidades, alta afinidade é (a) ligar NGF com uma KD de menos do que cerca de 2 nM (tal como qualquer um de 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40pM, 30pM, 20pM, 10pM, 5pM ou menos) e/ou kOff menor do que cerca de 6x1 O'5 s'1); e/ou (b) inibição (redução e/ou bloqueio) de sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qualquer uma de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM ou menos; e/ou (c) inibição (redução e/ou bloqueio) de sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qualquer uma de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM ou menos; e/ou (d) inibição (redução e/ou bloqueio) de sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônicos trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qualquer uma de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM ou menos; e/ou (e) inibição (redução e/ou bloqueio) de sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qualquer urn de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM ou menos; e/ou (f) e/ou ligação de NGF com afinidade maior do que o receptor trkA.
[0062] Em outro aspecto, os anticorpos (a) se ligam a NGF (tai como NGF humano) com uma KD de menos do que cerca de 2 nM (tai como qualquer uma de cerca de 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40pM, 30pM, 20pM, 10pM, 5pM ou menos) e/ou kOff de menos do que cerca de 6x1 O'5 s-1); e/ou (b)inibição de sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qualquer uma de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM ou menos; e/ou (c) inibição de sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qualquer urn de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM ou menos; e/ou ligação de NGF com maior afinidade do que o receptor trkA. Em algumas modalidades, os anticorpos (a) se ligam a NGF com uma KD de menos do que cerca de 2 nM; e/ou (b) inibem a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF; e/ou (c) inibem sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 1,5 pM de NGF, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF. Em algumas modalidades, os anticorpos (a) se ligam a NGF com uma KD de menos do que cerca de 100 pM; e/ou (b) inibem sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 20 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF; e/ou (c) inibem sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 2 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 1,5 pM de NGF.
[0063] Em algumas modalidades, os anticorpos acima são isolados. Em algumas modalidades, o anticorpo é substancialmente purificado. Em ainda outras modalidades, o anticorpo é amadurecido por afinidade. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende sequências de estrutura humana. Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende um ou mais resíduos de estrutura não-humana. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a NGF (tal como NGF huma- no) com uma KD de 2 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) substituições de aminoácido humanas com relação a uma sequência de aminoácido não-humana (tal como uma sequência de região variável, tal como uma sequência de CDR, tal como uma sequência de estrutura). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende pelo menos 1, pelo menos 2 ou mais tal como pelo menos 3, 4, 5, 6 ou mais substituições de aminoácido com relação a uma sequência de aminoácido de polipeptídeo de origem (tal como uma sequência de 911 aminoácidos de anticorpo, tal como qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs:9-14). Em algumas modalidades, a afinidade de ligação do anticorpo foi alterada (em algumas modalidades, aumentada) com relação a uma afinidade de anticorpo de origem (tal com o Mab 911). Em ainda outras modalidades, a afinidade de ligação do anticorpo é menor do que a afinidade de ligação do receptor trkA para NGF (tal como NGF humano). Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos humanos. Em outras modalidades, os anticorpos são anticorpos humanizados. Em ainda outras modalidades, os anticorpos são anticorpos monoclonais. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo amadurecido por afinidade.
[0064] A invenção utiliza polinucleotídeos (incluindo polinucleotídeo isolado) compreendendo polinucleotídeos codificando qualquer um dos anticorpos das modalidades acima.
[0065] Em outro aspecto, a invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo codificando um fragmento ou uma região do anticorpo E3 (intercomutavelmente chamado "E3" aqui). Em uma modalidade, o fragmento é uma cadeia curta do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1B da W02004/058184. Em outra modalidade, o fragmento é uma cadeia longa do anticorpo E3 conforme mostrado na figura 1A da W02004/058184. Em ainda outra modalida de, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia curta e/ou uma cadeia longa do anticorpo E3. Em ainda outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma cadeia curta e/ou uma cadeia longa do anticorpo E3 conforme mostrado nas figuras 1A e 1B da W02004/058184.
[0066] Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo E3. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende ou um ou ambos os polinucleotídeos nas figuras 2 e 3 da W02004/058184.
[0067] Em outro aspecto, a invenção utiliza um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia curta de E3 com um número de depósito ATCC No. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia longa de E3 com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em ainda outro aspecto, o polinucleotídeo isolado compreende (a) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894 e (b) uma região variável codificada no nucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA- 4895. Em outro aspecto, o polinucleotídeo isolado compreende (a) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894; e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895.
[0068] Em outro aspecto, a invenção utiliza polinucleotídeos codificando qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) ou polipeptídeo descritos aqui.
[0069] Em outro aspecto, a invenção utiliza vetores (incluindo vetores de expressão e clonagem) e células hospedeiras compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui.
[0070] Em outro aspecto, a invenção utiliza uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo codificando cadeia curta de E3 e um polinucleotídeo codificando cadeia longa de E3, em que o(s) poli- nucleotídeo(s) codificando cadeia curta de E3 tem um número de deposito de ATCC No. PTA-4893 e/ou ATCC No. PTA-4894, e o polinucleotídeo codificando a cadeia longa de E3 tem(têm) um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende polinucleotídeos compreendendo (a) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894 e/ou (b) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um polinucleotídeo codificando (a) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894; e/ou b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero.
[0071] Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo antagonista anti-NGF para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser conforme aqui descrito.
[0072] Outro aspecto da invenção provê o uso de um anticorpo antagonista anti-NGF na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. O anticorpo antagonista anti- NGF pode ser conforme aqui descrito.
[0073] Em outro aspecto, a invenção é uma composição farmacêu- tica para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga, compreendendo qualquer um dos polipeptídeos (incluindo anticorpos tal como anticorpo E3), polinucleotídeos ou vetores descritos aqui, tais como composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo E3 ou um fragmento do anticorpo E3 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0074] Em outro aspecto, a invenção provê kits e composições compreendendo qualquer uma ou mais das composições descritas aqui. Esses kits, geral mente em embalagem adequada e providos com instruções apropriadas, são úteis para qualquer um dos métodos descritos aqui.
[0075] A invenção também provê qualquer uma das composições e kits descritos para qualquer uso descrito aqui seja no contexto de uso como medicamento e/ou uso para fabricação de um medicamento.
[0076] Características preferidas de cada aspecto da invenção se aplicam igualmente um ao outro aspecto mutatis mutandis.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0077] A invenção descrita aqui provê métodos para tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF.
[0078] A invenção descrita aqui também provê um anticorpo antagonista anti-NGF para uso no tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. É ainda provido o uso de um anticorpo antagonista anti-NGF na fabri cação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga.
[0079] A invenção descrita aqui provê o uso de anticorpos antagonistas anti-NGF que se ligam a NGF (tal como NGF humano) com alta afinidade. Em algumas modalidades, a invenção utiliza um anticorpo humanizado, E3, que se liga a NGF. A invenção também utiliza poli- peptídeos de E3 (incluindo anticorpos) que se ligam a NGF, e polinucleotídeos codificando anticorpo e/ou polipeptídeo de E3. A invenção provê ainda o uso de anticorpos e polipeptídeos derivados de E3 que se ligam a NGF.
Técnicas Gerais
[0080] A prática da presente invenção vai empregar, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook e outros, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell e Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley e Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel e outros, eds., 1987); PCR: The Poly merase Chain Reaction, (Mullis e outros, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan e outros, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita e outros, eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
Definições
[0081] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc, através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme aqui usado, o termo compreende não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também seus fragmentos (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb), anticorpos de cadeia simples (ScFv), seus mutantes, anticorpos quiméricos, diacor- pos, proteína de fusão compreendendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou suas subclasses), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe particular. Dependendo da sequência de aminoácido do anticorpo do domínio constante de suas cadeias longas, imunoglobulinas podem ser designadas a diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser divididas mais em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Os domínios constantes de cadeia longa que correspondem a classes diferentes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de su- bunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0082] Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variável da cadeia curta do anticorpo ou à região variável da cadeia longa do anticorpo, ou sozinha ou em combinação. As regiões variáveis das cadeias longa e curta consistem cada uma em quatro regiões de estrutura (FR) conectadas por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hiper- variáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos. Há pelo menos duas técnicas para determinação de CDRs: (1) uma abordagem baseada em variabilidade de sequência de espécie cruzada (isto é, Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos de an- tigeno-anticorpo (Chothia e outros (1989) Nature 342:877; Al-lazikani e outros (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Conforme aqui usado, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer abordagem ou por uma combinação de ambas as abordagens.
[0083] Uma "região constante" de um anticorpo refere-se à região constante da cadeia curta de anticorpo ou à região constante da cadeia longa de anticorpo, sozinha ou em combinação.
[0084] "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento e ligação a antígeno completo. Em uma espécie Fv de duas cadeias, esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia longa e um de curta em associação não-covalente, fir- me. Em uma espécie Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeia longa e um de curta pode ser covalentemente ligado por um ligante de peptídeo flexível de maneira que as cadeias curta e longa possam se associar em uma estrutura dimérica análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir uma especificidade de ligação a antígeno na superfície do dímero VH-VL. No entanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo apenas 3 CDRs específicas para um antígeno) tem a habilidade em reconhecer e se ligar a antígeno, embora geralmente em uma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.
[0085] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia curta e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia longa. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia longa incluindo uma ou mais cisteínas das regiões de dobradiça de anticorpo. Um fragmento F(ab)2 é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto da região de dobradiça.
[0086] Um anticorpo de cadeia simples (scFc) é um anticorpo onde as regiões VL e VH são emparelhadas para formar uma molécula mo- novalente através de um ligante sintético que permite que elas sejam feitas como uma cadeia de proteína única (Bird e outros, Science, 242:423-426 (1988) e Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5879-5883 (1988)).
[0087] Diacorpos são anticorpos biespecíficos, bivalentes, em que os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando um ligante que é muito curto para permitir empare- Ihamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desta maneira forçando os domínios a emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno.
[0088] Um anticorpo pode ter um ou mais sítios de ligação. Se houver mais de um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos um ao outro ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina de ocorrência natural tem dois sítios de ligação idênticos, um anticorpo de cadeia simples ou fragmento Fab tem um sítio de ligação, enquanto um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" (diacor- po) tem dois sítios de ligação diferentes.
[0089] Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) não está associado a componentes naturalmente associados, incluindo outros anticorpos naturalmente associados, que o acompanham em seu estado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza.
[0090] Um "anticorpo monoclonal"refere-se a uma população de anticorpo homogênea onde o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (de ocorrência natural e de ocorrência não-natural) que estão envolvidos na ligação seletiva de um antígeno. Uma população de anticorpos monoclonais é altamente específica, sendo direcionada contra um sítio antigênico único. O termo "anticorpo monoclonal"compreende não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento integral, mas também seus fragmentos (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia simples (ScFv), seus mutan- tes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida e a habilidade em se ligar a um antígeno. Ele não pretende ser limitado com relação à fonte do anticorpo ou à maneira que é feito (por exemplo, através de hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animais transgênicos, etc).
[0091] Conforme aqui usado, "anticorpo humano" significa um an- ticorpo tendo uma sequência de aminoácido correspondendo àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que foi feita usando qualquer uma das técnicas para fabricação de anticorpos humanos conhecidos na técnica ou descritos aqui. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipep- tídeo de cadeia longa humana ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia curta humana. Tal exemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeo de cadeia curta de murino e cadeia longa humana. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas no campo. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fago, em que a biblioteca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan e outros, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets e outros, 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoo- genboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks e outros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Anticorpos humanos podem ser também feitos introduzindo locide imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos onde os genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. Esta abordagem é descrita nas Patentes U.S. Nos.5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através da imortalização de linfóci- tos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um an-tígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro).Vide, por exemplo, Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner e outros, 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e Patente U.S. No. 5.750.373.
[0092] "Anticorpos quiméricos"referem-se àqueles anticorpos onde uma porção de cada uma das sequências de aminoácido de cadeias longa e curta é homóloga a sequências correspondentes em anti- corpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe particular, enquanto o segmento restante das cadeias é homólogo a sequências correspondentes em outra. Tipicamente, nesses anticorpos quiméricos, a região variável de ambas as cadeias curta e longa imitam as regiões variáveis de anticorpos derivadas de uma espécie de mamífero, enquanto as porções constantes são homólogas às sequências em anticorpos derivados de outra. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que, por exemplo, as regiões variáveis podem convenientemente ser derivadas de fontes atualmente conhecidas usando hibridomas ou células B prontamente disponíveis de organismos hospedeiros não-humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de célula humana. Enquanto a região variável tem a vantagem de facilidade de preparação, e a especificidade não seja afetada pela sua fonte, a região constante sendo humana, é menos provável de elicitar uma resposta imune de um indivíduo humano quando os anticorpos são injetados do que seria a região constante de uma fonte não-humana. No entanto, a definição não é limitada a este exemplo particular.
[0093] Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação CT; citotoxidez dependente de complemento (CDC); ligação a receptor Fc; citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; sub-regulagem de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo.
[0094] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma se- quência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda retendo pelo menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada com uma região Fc de sequência nativa ou a região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, a partir de uma a cerca de dez substituições de aminoácido e preferivelmente a partir de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc variante aqui vai possuir preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a mesma, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a mesma.
[0095] Conforme aqui usado, "citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por célula onde células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado a uma célula- alvo e subsequentemente causam lise da célula-alvo. Atividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um ensaio ADCC in vitro,tal como aquele descrito na Patente U.S. No. 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios inclu-em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes e outros, 1998, PNAS (USA), 95:652-656.
[0096] Conforme aqui usado, "receptor de Fc" e "FcR" descrevem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas desses receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") ou FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que tem sequências de aminoácido similares que diferem principal mente nos seus domínios citoplásmicos. FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol.,9:457-92; Capel e outros, 1994, Immunomethods, 4:25-34; e de Haas e outros, 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR"também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs da mãe para o feto (Guyer e outros, 1976, J. Immunol.,117:587; e Kim e outros, 1994, J. Immunol.,24:249).
[0097] "Citotoxidez dependente de complemento" e "CDC"referem-se à lise de um alvo na presença de complemento. O curso de ativação de complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro e outros, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.
[0098] Conforme aqui usado, os termos "E3", "3E" e "anticorpo E3" são usados intercomutavelmente para se referir a um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta mostradas nas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 (figuras 1A e 1B da WQ2004/058184), respectivamente. As porções de CDR de anticorpo E3 (incluindo CDRs de Chothia e Kabat) são dia- gramaticamente mostradas nas figuras 1A e 1B da W02004/058184. As figuras 2 e 3 da W02004/058184 mostram polinucleotídeos codificando cadeias longa e curta, respectivamente, compreendendo as regiões variáveis de cadeias longa e curta mostradas nas figuras 1A e 1B, respectivamente. A geração e a caracterização de E3 são descritas nos Exemplos da W02004/058184, cujo conteúdo em sua totalidade é aqui incorporado a título de referência. Funções biológicas diferentes são associadas a E3, incluindo, mas não limitado a, habilidade em se ligar a NGF e inibir a atividade biológica de NGF e/ou curso(s) a jusante mediado(s) pela sinalização de NGF; e habilidade em inibir sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13.5 de camundongos. Conforme aqui discutido, anticorpos para uso na invenção podem ter qualquer uma ou mais dessas características. Em algumas modalidades, o termo "E3" refere-se à imunoglobulina codificada por (a) um polinucleotídeo codificando cadeia curta de E3 que tem um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou ATCC No. PTA- 4894 e (b) um polinucleotídeo codificando cadeia longa de E3 que tem um número de depósito de ATCC No. PTA-4895.
[0099] Conforme aqui usado, ligação "imunoespecífica" de anticorpos refere-se à interação de ligação específica de antígeno que acontece entre o sítio de combinação de antígeno de um anticorpo e o antígeno específico reconhecido por este anticorpo (isto é, o anticorpo reage com a proteína em um ELISA ou outro imunoensaio, e não reage detectavelmente com proteínas não-relacionadas).
[00100] Um epitopo que "se liga especificamente" ou "se liga preferivelmente" (usado intercomutavelmente aqui) a um anticorpo ou um poli- peptídeo é um termo bem compreendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica ou preferida são bem conhecidos na técnica. Uma molécula é dita exibir "ligação específica" ou "ligação pre ferencial" se ela reagir ou se associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade a uma célula ou substância particular do que ela faz com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "se liga especificamente" ou "se liga preferivelmente" a um alvo se ele se ligar com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que ele se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferivelmente a um epitopo de NGF é um anticorpo que se liga a este epitopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que ele se liga a outros epitopos de NGF ou epitopos não-EGF. É também compreendido através da leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epitopo) que se liga especificamente ou preferivelmente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferivelmente a um segundo alvo. Desta maneira, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Em geral, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação preferencial.
[00101] Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados intercomutavelmente aqui para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não-aminoácidos. Os termos também compreendem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou através de intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcador. Também incluídos na definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não-naturais, etc), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É compreendido que, devido ao fato dos polipeptídeos da presente invenção serem baseados em um anticorpo, os polipeptídeos podem acontecer como cadeias simples ou cadeias associadas.
[00102] "Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", conforme aqui usado intercomutavelmente, refere-se a polímeros de nucleotídeo de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado a um polímero através de DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser realizada antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não-nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode ser modificado mais após polimerização, tal como através de conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não-carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforodi- tioatos, etc), aquelas contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc), bem como formas não-modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Ainda, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado a suportes sólidos. Os OH terminais 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos com aminas ou porções de grupos de capeamento orgânicos a partir de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem ser também derivatizadas para grupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirri- bose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'--O-metil-, 2'-O-alila, 2-flúor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclicos, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tal como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedo-heptulose, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, moda-lidades onde fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioa- to"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal") onde cada R ou R' é independentemente H ou alquila (C1-C20) substituída ou não-substituída contendo uma ligação éter -O-, arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição acima se aplica a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.
[00103] O termo "identidade"refere-se à "identidade" percentual de duas sequências de aminoácido ou de duas sequências de ácido nu- cleico. A identidade percentual é geralmente determinada alinhando as sequências para propósitos de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na primeira sequência para melhor alinhamento com a segunda sequência) e comparando os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições correspondentes. O "melhor alinhamento" é um alinhamento de duas sequências que resulta na identidade percentual mais alta. A identidade percentual é determinada comparando o número de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos idênticos dentro das sequências (isto é, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100).
[00104] A determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático conhecido daqueles versados na técnica. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873- 5877. Os programas NBLAST e XBLAST de Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 incorporaram tal algoritmo. Pesquisas de nu- cleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, score = 100, comprimento de palavra=12 para obter sequências de nucle- otídeo homólogas a uma molécula de ácido nucleico da invenção. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLAST, score = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas a uma molécula de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul e outros (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402. Altemativamente, PSI- Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa reiterada que detecte relações distantes entre moléculas (Id.). Quando utilizando programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros de defaultdos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Vide http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). O programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG incorporou tal algoritmo. Outros algoritmos para análise de sequência conhecidos na técnica incluem ADVANCE e ADAM conforme descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; e FASTA descritos em Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro do FASTA, ktupé uma opção controle que ajusta a sensibilidade e a velocidade da pesquisa.
[00105] Conforme aqui usado, o termo "fator de crescimento de nervo" e "NGF"referem-se a fator de crescimento de nervo e suas variantes que retêm pelo menos parte da atividade biológica de NGF. Conforme aqui usado, NGF inclui todas as espécies de mamífero de NGF de sequência nativa, incluindo ser humano, canino, felino, equino ou bovino.
[00106] "Receptor de NGF"refere-se a um polipeptídeo que é ligado por ou ativado por NGF. Receptores de NGF incluem o receptor TrkA e o receptor p75 de qualquer espécie de mamífero, incluindo, mas não limitado a, ser humano, canino, felino, equino, primata ou bovino.
[00107] Conforme aqui usado, um "anticorpo antagonista anti-NGF" (intercomutavelmente chamado "anticorpo anti-NGF") refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a NGF e inibir a atividade biológica de NGF e/ou curso(s) a jusante mediado(s) por sinalização de NGF. Um anticorpo antagonista anti-NGF compreende anticorpos que bloqueiam, antagoniza, suprimem ou reduzem (incluindo significantemen- te) atividade biológica de NGF, incluindo cursos a jusante mediados por sinalização de NGF, tais como ligação e/ou elicitação de receptor de uma resposta celular para NGF. Para propósito da presente invenção, será explicitamente compreendido que o termo "anticorpo antagonista anti-NGF" compreende todos os termos, títulos e estados funcionais e características previamente identificados com o que o próprio NGF, a atividade biológica de um NGF (incluindo, mas não limitado a, sua habilidade em mediar qualquer aspecto de dor pós-cirúrgica), ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anulados, diminuídos ou neutralizados em qualquer grau significante. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista anti-NGF se liga a NGF e previne dimerização de NGF e/ou ligação a um receptor de NGF (tal como p75 e/ou trkA). Em outras modalidades, um anticorpo anti-NGF se liga a NGF e previne dimerização do receptor trkA e/ou autofosforilação de trkA. Exemplos de anticorpos antagonistas anti- NGF são providos aqui.
[00108] "Atividade biológica" de NGF geralmente refere-se à habilidade em ligar receptores de NGF a/ou ativar cursos de sinalização de receptor de NGF. Sem limitação, uma atividade biológica inclui qualquer uma ou mais das que seguem: a habilidade em se ligar a um receptor de NGF (tal como p75 e/ou trkA); a habilidade em promover dimerização e/ou autofosforilação do receptor trkA; a habilidade em ativar um curso de sinalização de receptor de NGF; a habilidade em promover diferenciação, proliferação, sobrevivência, crescimento ou outras mudanças celulares em fisiologia celular, incluindo (no caso de neurônios, incluindo neurônios periférico e central) mudança em mor-fologia neural, sinaptogênese, função sinóptica, liberação e regeneração de neurotransmissor e/ou neuropeptídeo seguindo dano; a habilidade em promover sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo; e a habilidade em mediar dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga.
[00109] Conforme aqui usado "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferivelmente pelo menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, mais preferivelmente pelo menos 99% puro.
[00110] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura de célula que pode ser ou foi um recipiente para vetor(es) para incorporação de insertos de polinucleotídeo. Células hospedeiras incluem progénie de uma célula hospedeira única, e a progénie pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula de origem devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo(s) da presente invenção.
[00111] Conforme aqui usado, "tratamento" é uma abordagem para obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Para propósitos da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos que seguem: melhora ou alívio de qualquer aspecto de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. Para propósitos da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos que seguem: incluindo diminuição da severidade, alívio de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga incluindo qualquer aspecto de dor (tal como encurtamento da duração da dor, redução da sensibilidade ou sensação da dor).
[00112] Uma "quantidade eficaz" de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar resultados benéficos ou desejados incluindo resultados clínicos tal como alívio ou redução em sensação de dor. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para propósitos da presente invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, um composto ou uma composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para tratar, melhorar, reduzir a intensidade de e/ou prevenir dor ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. Em algumas modalidades, a "quantidade eficaz" pode reduzir dor em repouso ou dor mecanicamente induzida (incluindo dor seguindo movimento) ou ambas e pode ser administrada antes, durante ou após estímulo doloroso. Como é compreendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um fármaco, um composto ou uma composição farmacêutica pode ou não ser conseguida em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Então "uma quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um agente único pode ser considerado ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for atingido.
[00113] "Redução de incidência" de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga significa qualquer um de reduzir a severidade (que pode incluir redução da necessidade de e/ou quantidade de (por exemplo, exposição a) outros fármacos e/ou terapias geralmente usados para estas condições, incluindo, por exemplo, opiatos), duração e/ou frequência (incluindo, por exemplo, dor de tempo retardado ou aumentado em um indivíduo). Como é compreendido por aqueles versados na técnica, indivíduos podem variar em termos de sua resposta a tratamento, e, desta maneira, por exemplo, um "método de redução da incidência de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo" reflete admi-nistração do anticorpo antagonista anti-NGF com base em uma expectativa racional que tal administração pode provavelmente causar tal redução em incidência naquele indivíduo particular.
[00114] "Melhora" de uma dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga comparado com não-administração de um anticorpo antagonista anti-NGF. "Melhora" também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.
[00115] "Paliativo" para dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga significa diminuição do grau de uma ou mais manifestações clínicas indesejáveis de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior em um indivíduo ou população de indivíduos.
[00116] Conforme usado, "retardo" do desenvolvimento de dor significa adiar, impedir, deixar lento, retardar, estabilizar e/ou adiar progressão de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga. Este retardo pode ser de comprimentos de tempo variados, dependendo da história da doença e/ou indivíduos sendo tratados. Como é evidente a um versado na técnica, um retardo suficiente ou significante pode, na prática, compreender prevenção, pelo fato que o indivíduo não desenvolve dor. Um método que "retarda" de-senvolvimento do sintoma é um método que reduz a probabilidade de desenvolvimento do sintoma em uma dada estrutura de tempo e/ou reduz o grau dos sintomas em uma dada estrutura de tempo, quando comparado sem uso do método. Tais comparações são tipicamente baseadas em estudos clínicos usando um número estatisticamente significante de indivíduos.
[00117] "Dor" conforme aqui usado refere-se à dor de qualquer etiologia, incluindo dores aguda e crônica, e qualquer dor com um compo- nente inflamatório. Conforme aqui usado, "dor" inclui nocicepção e a sensação de dor, e dor pode ser avaliada objetivamente e subjetivamente, usando scoresde dor e outros métodos bem conhecidos na técnica. A dor pode ser dor primária ou secundária, como é bem conhecido na técnica.
[00118] "Dor associada à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga" conforme aqui usado refere-se à dor abdominal inferior (pélvica); dor na bexiga; dor su- prapúbica; dor vaginal; dor no pênis, testículos, escroto e períneo; dor uretral; dispareneuria; dor, pressão ou desconforto que pode aumentar conforme a bexiga enche.
[00119] "Sintomas do trato urinário inferior associados à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga" conforme aqui usado referem-se a três grupos de sintomas urinários, que podem ser definidos como armazenamento (irritativo), esvaziamento (obstrutivo) e pós-micção. Sintomas de armazenamento compreendem urgência, frequência, noctúria, incontinência de urgência e incontinência de estresse, que podem estar associados à bexiga hiperativa (OAB) e à hiperplasia prostática benigna (BPH). Sintomas de esvaziamento compreendem hesitação, fluxo pobre, intermitência, tensão e disúria. Sintomas pós-micção compreendem gotejamento terminal, gotejamento pós-esvaziamento e uma sensação de esvaziamento incompleto.
[00120] "Bexiga Hiperativa (OAB)" é definida com urgência, com ou sem incontinência de urgência, geralmente com frequência e noctúria [Abrams e outros, Neurology and Urodynamics 21:167-178 (2002)]. Prevalência de OAC em homens e mulheres é similar, com aproximadamente 16% da população dos Estados Unidos sofrendo da condição [Stewart e outros, 'Prevalence of Overactive Bladder in the United States: Results from the NOBLE Program'; Abstract Presented at the 2nd International Consultation on Incontinence,julho de 2001, Paris, França].
[00121] Os termos OAB Úmida e OAB Seca descrevem pacientes com ou sem incontinência urinária respectivamente. Anteriormente, o sintoma cardinal da OAB era acreditado ser incontinência urinária. No entanto, com o advento de novos termos isto claramente não é signifi- cante para o grande número de sofredores que não são incontinentes (isto é, pacientes com OAB Seca). Então, um estudo de 2001 de Liberman e outros ['Health Related Quality of Life Among Adults with Symptoms of Overactive Bladder: Results From A US Community- Based Survey'; Urology 57(6), 1044-1050, 2001] examinou o impacto de todos os sintomas de OAB sobre a qualidade de vida de uma amostra com base na comunidade da população dos Estados Unidos. Este estudo demonstrou que indivíduos sofrendo de OAB sem qualquer perda demonstrável de urina têm uma qualidade de vida prejudicada quando comparado com controles.
[00122] "BPH" é uma doença cronicamente progressiva que pode levar a complicações tal como retenção urinária aguda, infecções do trato urinário recorrentes, pedras na bexiga e disfunção renal. A prevalência e a severidade média de LUTS associados a BPH em homens aumentam com a idade. BPH leva a um aumento no volume da próstata, criando obstrução de fluxo de saída uretral e da bexiga bem como mudanças secundárias no funcionamento da bexiga. Os efeitos disto são manifestados por ambos os sintomas de armazenamento (irritati- vo) e esvaziamento (obstrutivo).
[00123] Uma "amostra biológica" compreende uma variedade de tipos de amostra obtidos de um indivíduo e pode ser usada em um ensaio de diagnóstico ou monitoramento. A definição compreende sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecido sólido tal como espécime de biópsia ou culturas de tecido ou célu- las derivadas delas e a progénie delas. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer maneira após sua aquisição, tal como através de tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento com certos componentes, tais como proteínas ou polinucleotídeos, ou embebimento em uma matriz semi-sólida ou sólida para propósitos de seccionamento. O termo "amostra biológica" compreende uma amostra clínica e também inclui células em cultura, so- brenadantes de célula, lisatos de célula, soro, plasma, fluido biológico e amostras de tecido.
[00124] Um "indivíduo" é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda (tal como vaca), animais de esporte, animais (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos.
[00125] Conforme aqui usado "vetor" significa um construto, que é capaz de aplicar, e preferivelmente expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nu, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
[00126] Conforme aqui usado, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou um indu- zível, ou um aumentador. A sequência de controle de expressão é operavelmente ligada à sequência de ácido a ser transcrita.
[00127] Conforme aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitá- vel"inclui qualquer matéria que, quando combinada a um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e seja não- reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão tal como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tal como emulsão óleo/água e vários tipos de agentes umectantes. Dilu- entes preferidos para administração aerossol ou parenteral são solução salina tamponada com fosfato ou solução salina normal (0,9%). Composições compreendendo tais veículos são formuladas através de métodos convencionais bem conhecidos (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practi-ce of Pharmacy,20aEd., Mack Publishing, 2000).
[00128] O termo "KOff", conforme aqui usado, pretende se referir à constante de off rate para dissociação de um anticorpo da interação anticorpo-antígeno. O termo "Kon", conforme aqui usado, pretende se referir à taxa de on-rate ou associação de uma interação anticorpo- antígeno particular. O termo "KD", conforme aqui usado, pretende se referir à constante de dissociação de uma interação anticorpo- antígeno, que é obtida da razão de KOff para Kon e é expressa como uma concentração molar (M). Valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinação da KD de um anticorpo é através do uso de ressonância de plasmon de superfície, tipicamente usando um sistema biossensor tal como um sistema Biacore®.
Métodos de uso de anticorpo anmarcadoronista anti-NGF para tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga
[00129] A invenção provê métodos para tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma de trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em indivíduos incluindo mamíferos, ambos humanos e não- humanos. Desta maneira, em um aspecto, a invenção provê métodos de tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo compreen-dendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF. Anticorpos antagonistas anti-NGF adequados são descritos aqui.
[00130] Em outro aspecto, a invenção provê métodos para redução de incidência de, melhora, supressão, paliativo e/ou retardo do início, o desenvolvimento ou a progressão de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo. Então, em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é administrado antes do desenvolvimento de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo tendo cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga.
[00131] Um anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado a um indivíduo através de qualquer via. Exemplos de via de administração diferentes são descritos aqui.
[00132] Em algumas modalidades, o anticorpo de antagonista anti- NGF é administrado uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas, uma vez a cada quinze semanas, uma vez a cada vinte semanas, uma vez a cada vinte e cinco semanas ou uma vez a cada vinte e seis semanas. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses ou uma vez a cada seis meses.
[00133] Alívio de dor ou alívio de sintoma do trato urinário inferior pode ser caracterizado por curso de tempo de alívio. Desta maneira, em algumas modalidades, alívio é observado dentro de cerca de 24 horas após administração de um anticorpo antagonista anti-NGF. Em outras modalidades, alívio é observado dentro de cerca de 36, 48, 60, 72 horas ou 4 dias após administração do anticorpo antagonista anti- NGF. Em algumas modalidades, frequência e/ou intensidade de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior é diminuída e/ou qualidade de vida daqueles sofrendo da doença é aumentada. Em algumas modalidades, alívio de dor é provido para duração de pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 28 dias, pelo menos cerca de 35 dias, pelo menos cerca de 42 dias, pelo menos cerca de 49 dias, pelo menos cerca de 56 dias, pelo menos cerca de 63 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 77 dias, pelo menos cerca de 84 dias, pelo menos cerca de 180 dias ou mais após uma dose única do anticorpo antagonista anti-NGF.
[00134] Alívio de dor ou alívio de sintomas do trato urinário inferior pode ser caracterizado por uma mudança em uma escala de classificação numérica de dor (NRS), uma mudança no índice de Sintoma de Cistite Intersticial O'-Leary-Sant (ICSI), uma mudança no índice de Problema de Cistite Intersticial O'-Leary-Sant (ICPI), uma mudança no scoredo sintoma de Dor Pélvica e Urgência/Frequência (PUF) e/ou mudanças em variáveis de micção incluindo frequência de micção, frequência noturna, frequência de episódio de incontinência, volume médio esvaziado por micção, severidade da dor de cistite intersticial média, episódios de urgência urinária, scorede distúrbio do sono médio, dor média associada a scorede dor de atividade sexual, avaliação de resposta global, patente relatando avaliação de impacto de tratamento, falha de tratamento, biomarcadores, pontos finais de segurança e/ou medidas farmacocinéticas. Biomarcadores podem incluir NGF, glicoproteína-51 (GP-51), fator anti prol iferati vo (APF) e fator de crescimento epidermal HB (HB-EGF), dentre outros.
[00135] Anticorpos anti-NGF exemplares para uso nos métodos da invenção (relacionados à dor e/ou a sintomas do trato urinário inferior associados à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga) são anticorpos antagonistas anti- NGF, que referem-se a qualquer anticorpo que bloqueie, suprima ou reduza (incluindo significantemente) atividade biológica de NGF, incluindo cursos a jusante mediados por sinalização de NGF, tal como ligação a receptor e/ou elicitação de uma resposta celular a NGF. O termo "antagonista" não implica nenhum mecanismo específico de ativação biológica qualquer que seja, e é considerado incluir expressamente e compreende todas as interações farmacológicas, fisiológicas e bioquímicas possíveis com NGF e suas consequências que possam ser conseguidas por uma variedade de composições diferentes e quimicamente divergentes. Para propósito da presente invenção, será explicitamente compreendido que o termo "antagonista" compreende todos os termos, títulos e estados funcionais e características previamente identificados com o que o próprio NGF, uma atividade biológica de NGF (incluindo, mas não limitado a, sua estabilidade em mediar qualquer aspecto de dor), ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anulados, diminuídos ou neutralizados em qualquer grau significante. Em algumas modalidades, anticorpo antagonista an- ti-NGF se liga (interage fisicamente com) NGF, se liga a um receptor de NGF (tal como receptor TrkA e/ou receptor p75) e/ou reduz (impede e/ou bloqueia) sinalização de receptor NGF a jusante. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF se liga a NGF (tal como hNGF) e não se liga significantemente a neurotrofinas relacionadas, tal como NT-3, NT4/5 e/ou BDNF. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF não está associado a uma resposta imune adversa. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-NGF é humanizado (tal como anticorpo E3 descrito aqui). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF é anticorpo E3 (conforme aqui descrito). Em outras modalidades, o anticorpo anti-NGF compreende uma ou mais CDRs de anticorpo E3 (tal como um, dois, três, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs de E3). Em outras modalidades, o anticorpo é humano. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-NGF compreende a sequência de aminoácido da região variável de cadeia longa mostrada na SEQ ID NO:1 (figura 1A da W02004/058184) e/ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia curta mostrada na SEQ ID NO:2 (figura 1B da WQ2004/058184). Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, por exemplo, não dispara lise mediada por complemento, ou não estimula citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em outras modalidades, a região constante é modificada conforme descrito no Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624; PCT WO9958752.
[00136] Os anticorpos para uso nos métodos da invenção são caracterizados por qualquer uma (uma ou mais) das características que seguem: (a) habilidade em se ligar a NGF; (b) habilidade em reduzir e/ou inibir atividade biológica de NGF e/ou curso(s) a jusante media- do(s) por sinalização de NGF; (c) habilidade em reduzir e/ou inibir so brevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais de E3.15 de camundongo; (d) ausência de qualquer reatividade cruzada significante de NT3, NT4/5 e/ou BDNF; (e) habilidade em tratar e/ou prevenir dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga; (f) habilidade em aumentar a eliminação de NGF; (g) habilidade em reduzir ou inibir ativação de receptor trkA, conforme detectado, por exemplo, usando ensaio de ativação de receptor de quinase (KIRA) (vide patente U.S. No. 6.027.927).
[00137] Para propósitos da presente invenção, o anticorpo reage com NGF de uma maneira que inibe NGF e/ou cursos a jusante mediados pela função de sinalização de NGF. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF reconhece NGF humano. Em ainda outras modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF se liga especificamente a NGF humano. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF não se liga significantemente a neurotrofinas relacionadas, tais como NT-3, NT4/5 e/ou BDNF. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-NGF é capaz de se ligar a NGF e inibir eficazmente a ligação de NGF a TrkA e/ou receptor p75 in vivo e/ou inibir eficazmente NGF de ativar seu receptor TrkA e/ou p75. Em ainda outras modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é um anticorpo monoclonal. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-NGF é humanizado (tal como anticorpo E3 descrito aqui). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF é humano. Vide, por exemplo, WO 2005/019266 que descreve anticorpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 e 4G6. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo humano que reconhece um ou mais epitopos em NGF humano. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de camundongo ou rato que reco-nhece um ou mais epitopos em NGF humano. Em outra modalidade, o anticorpo reconhece um ou mais epitopos em um NGF selecionado do grupo consistindo em: primata, canino, felino, equino e bovino. Em ainda modalidades adicionais, o anticorpo antagonista anti-NGF se liga essencialmente ao mesmo epitopo de NGF que um anticorpo selecionado de qualquer um ou mais do que segue: MAb 911, MAb 912 e MAb 938 (vide Hongo e outros, Hybridoma 19:215-227 (2000)); um anticorpo conforme aqui definido (tal como anticorpo E3); e/ou um anticorpo descrito na W020050019266 (incluindo anticorpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 e 4G6) ou W02006131951 (incluindo anticorpo Hu-aD11). Em outras modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que Mab 911. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região constante que é imunologicamente inerte (por exemplo, não dispara lise mediada por complemento ou citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC)). Atividade de ADCC pode ser avaliada usando métodos descritos na Patente U.S. No. 5.500.362. Em algumas modalidades, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624; PCT WO9958752.
[00138] Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti- NGF é um anticorpo monoclonal anti-NGF de camundongo chamado anticorpo "E3", qualquer um dos anticorpos relacionados a E3 descritos aqui ou quaisquer fragmentos dos mesmos.
[00139] As propriedades de ligação de anticorpo E3, que se ligam a NGF humano com alta afinidade e baixa cinética de dissociação, comparado com anticorpo monoclonal anti-NGF de murino de origem 911, são sumarizadas abaixo. E3 se liga a NGF humano com uma afinidade de ligação 50 vezes maior do que o anticorpo de camundongo de origem 911.
Figure img0001
[00140] O anticorpo E3 e anticorpos relacionados também exibem uma capacidade forte em antagonizar NGF humano, conforme avaliado através de ensaios in vivo descritos nos Exemplos 2 e 3 da W02004/058184 cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência. Por exemplo, anticorpo E3 antagoniza a sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13 de camundongo em uma IC50 de cerca de 21 pM na presença de 15 pM de NGF humano, e cerca de 1,2 pM na presença de 1,5 pM de NGF humano.
[00141] Desta maneira, em outro aspecto, os anticorpos e polipep- tídeos da invenção podem ser identificados mais e caracterizados por: (h) afinidade alta se ligando a NGF humano com cinética de dissociação baixa (em algumas modalidades, com uma KD de menos do que cerca de 2 nM e/ou um koff de menos do que cerca de 6x10'5 s-1) e/ou (i) habilidade em inibir (bloquear) sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais de E13.5 de camundongo com um IC50 de cerca de 100 pM ou menos em cerca de 15 pM de NGF (em algumas modalidades, NGF humano) e/ou uma IC50 de cerca de 20 pM ou menos em cerca de 1,5 pM de NGF.
[00142] Os anticorpos úteis na presente invenção podem compreender anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpo, variantes de sequência de aminoácido de anticorpos e anticorpos covalentemente modificados. Os anticorpos podem ser de origem de murino, rato, ser humano ou qualquer outra (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados).
[00143] Em algumas modalidades, a invenção utiliza um anticorpo compreendendo uma cadeia curta que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma cadeia longa que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. A presente invenção também utiliza várias formulações de E3 e fragmentos de anticorpo equivalentes (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc), cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreen-dendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada de E3 que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno (NGF) da especificidade requerida. Os anticorpos equivalentes de E3, incluindo fragmentos de anticorpo e polipeptídeo (que podem ou não ser anticorpos) de E3, polipeptídeos compreendendo fragmentos de polipeptídeo de E3 são identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos critérios descritos acima.
[00144] Desta maneira, a invenção utiliza qualquer um dos que seguem ou composições (incluindo composições farmacêuticas) compreendendo qualquer um dos que seguem: (a) anticorpo E3; (b) um fragmento ou uma região do anticorpo E3; (c) uma cadeia curta do anticorpo E3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 17 (figura 1B da W02004/058184); (c) uma cadeia longa do anticorpo E3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 16 (figura 1 A da W02004/058184); (d) uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia curta e/ou uma cadeia longa do anticorpo E3; (e) uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo E3 mostrado na SEQ ID NOs:3-8 (figuras 1A e 1B da W02004/058184); (f) CDR H3 de cadeia longa de anticorpo E3 mostrada na SEQ ID NO:5 (figura 1A da W02004/058184); (g) CDR L3 da cadeia curta de anticorpo E3 mostrada na SEQ ID NO:8 (figura 1B da W02004/058184); (h) três CDRs da cadeia curta de anticorpo E3 mostrada nas SEQ ID NOs:6-8 (figura 1B da W02004/058184); (i) três CDRs da cadeia longa de anticorpo E3 mostrado nas SEQ ID NOs:3-5 (figura 1A da WQ2004/058184); (j) três CDRs da cadeia curta e três CDRs da cadeia longa, de anticorpo E3, mostradas nas SEQ ID NOs:3-8 (figuras 1A e 1B da WQ2004/058184); e (k) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a 0).
[00145] As porções de CDR de anticorpo E3 (incluindo CDRs de Chothia e Kabat) são diagramaticamente mostradas nas figuras 1A e 1B da WQ2004/058184) e consiste nas sequências de aminoácido que seguem: (e) CDR 1 de cadeia longa ("CDR H1") GFSLIGYDLN (SEQ ID NO:3); (f) CDR 2 de cadeia longa ("CDR H2") IIWGDGTTDYN- SAVKS (SEQ ID NO:4); (g) CDR 3 de cadeia longa ("CDR H3") GGYWYAT- SYYFDY (SEQ ID NO:5); (h) CDR 1 de cadeia curta ("CDR L1") RASQSISNNLN (SEQ ID NO:6); (i) CDR 2 de cadeia curta ("CDR L2") YTSRFHS (SEQ ID NO:7); e 0) CDR 3 de cadeia curta ("CDR L3") QQEHTLPYT (SEQ ID NO:8).
[00146] A determinação das regiões de CDR está dentro da habilidade da técnica. É compreendido que em algumas modalidades, CDRs podem ser uma combinação da CDR de Kabat e Chothia (também chamadas "CDRs combinadas" ou ""CDRs estendidas"). Em algumas modalidades, as CDRs compreendem a CDR de Kabat. Em outras modalidades, as CDRs são a CDR de Chothia.
[00147] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende pelo menos uma CDR que é substancialmente homóloga a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5 CDRs de E3 (ou, em algumas modalidades, substancialmente homólogas a todas as 6 CDRs de E3 ou derivadas de E3). Outras modalidades incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs que são substancialmente homólogas a pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de E3 ou derivadas de E3. É compreendido que, para propósitos da presente invenção, especificidade de ligação e/ou atividade geral (que pode ser em termos de tratamento e/ou prevenção de dor ou inibição de sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais de camundongo E13.5) é geralmente retida, embora a extensão da atividade possa variar comparada a E3 (pode ser maior ou menor).
[00148] Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácido de E3 que tem qualquer um dos que seguem: pelo menos 5 aminoácidos contíguos, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos, pelo menos 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos de uma sequência de E3, em que pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável de E3. As sequências de CDR estendidas de Mab 911 são mostradas nas figuras 1Ae 1B da W02004/058184 e SEQ ID NOs:9-14 aqui. Em uma modalidade, a região variável é de uma cadeia curta de E3. Em outra modalidade, a região variável é de uma cadeia longa de E3. Em outra modalidade, os aminoácidos contíguos 5 (ou mais) são de uma região de determinação de complementaridade (CDR) de E3 mostrada nas SEQ ID NOs:3-8 (figuras 1A e 1B da WQ2004/058184).
[00149] Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido de E3 que tem qualquer um do que segue: pe lo menos 5 aminoácidos contíguos, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos de uma sequência de E3, em que a sequência de E3 compreende qualquer um ou mais de: resíduo de aminoácido L29 de CDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CDRH3 e/ou A103 de CDRH3; e/ou resíduo de aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL2 e/ou H92 de CDRL3.
[00150] Como é evidente, em todo o presente relatório, um esquema de numeração de aminoácido sequencial é usado para se referir a resíduos de aminoácido nas regiões variáveis (isto é, os resíduos de aminoácido em cada região variável são numerados em sequência). Como é bem conhecido na técnica, os sistemas de numeração Kabat e/ou Chothia são úteis quando comparando dois anticorpos ou polipeptídeos, tal como um anticorpo E3 e uma variante de E3 (ou polipeptídeo suspeito de ser uma variante de E3). É bem compreendido na técnica como converter numeração sequencial em numeração Chothia e/ou Kabat, se desejado, por exemplo, para uso na realização de comparações entre E3 e outro polipeptídeo. A figura 23 da W02004/058184 mostra as regiões variáveis de E3 numeradas usando numeração sequencial, Chothia e Kabat. Ainda, para facilitar comparação, geralmente é compreendido que os resíduos de estrutura principal geralmente, mas nem sempre, têm aproximadamente o mesmo número de resíduos. No entanto, as CDRs podem variar em tamanho (isto é, é possível ter inserções e/ou deleções de um ou mais resíduos de aminoácido). Quando comparando um anticorpo E3 e uma variante de E3 candidata (por exemplo, no caso de uma região de CDR de uma sequência candidata que é mais longa na sequência em anticorpo E3 ao qual ela é alinhada), uma pessoa pode seguir as eta- pas que seguem (embora outros métodos sejam conhecidos na técnica). A sequência de anticorpo candidata é alinhada com as regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta de anticorpo E3. Alinhamento pode ser feito à mão ou usando computador usando programas de computador geralmente aceitos. Alinhamento pode ser facilitado usando alguns resíduos de aminoácido que são comuns a maioria das sequências Fab. Por exemplo, as cadeias curta e longa têm tipicamente cada uma duas cisteínas, que são frequentemente encontradas em uma posição conservada. É compreendido que a sequência de aminoácido de um anticorpo variante candidato possa ser mais longa (isto é, ter resíduos de aminoácido inseridos) ou mais curta (ter resíduos de aminoácido deletados). Sufixos podem ser adicionados ao número do resíduo para indicar a inserção de resíduos adicionais, por exemplo, resíduos 34 abc. Para sequências candidatas que, por exemplo, alinham com uma sequência E3 para, por exemplo, resíduos 33 e 35, mas não têm nenhum resíduo entre elas para alinhar com o resíduo 35, o resíduo 35 simplesmente não é designado a um resíduo. Em outra abordagem, é geralmente bem conhecido que comparação pode ser feita entre aminoácidos equivalentes estruturais (por exemplo, mesma posição no complexo antígeno-anticorpo) quando comparando CDRs de comprimentos diferentes. Por exemplo, a numeração Chothia (Al-Lazikani e outros, supra) geralmente (mas não em todos os casos), põe inserções e deleções nas posições estrutural mente corretas. Equivalência estrutural pode ser também deduzida ou demonstrada usando cristalografia de raios X ou análise de ciclo do duplo mutante (vide Pons e outros (1999) Prot. Sei. 8:958-968).
[00151] A afinidade de ligação de um anticorpo anti-NGF a NGF (tal como hNGF) pode ser, em termos de KD, cerca de cerca de 0,10 a cerca de 0,80 nM, cerca de 0,15 a cerca de 0,75 nM e cerca de 0,18 a cerca de 0,72 nM. Em algumas modalidades, a KD é cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM, ou maior do que cerca de 40 pM. Em uma modalidade, a KD é entre cerca de 2 pM e 22 pM. Em outras modalidades, a KD é menos do que cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM. Em algumas modalidades, a KD é cerca de 10 nM. Em outras modalidades, a KD é menos do que cerca de 10 nM. Em outras modalidades, a KD é cerca de 0,1 nM ou cerca de 0,07 nM. Em outras modalidades, a KD é menos do que cerca de 0,1 nM ou menos do que cerca de 0,07 nM. Em outras modalidades, a KD é qualquer uma de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM a qualquer uma de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM ou cerca de 40 pM. Em algumas modalidades, a KD é qualquer uma de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM. Em ainda outras modalidades, a KDé cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM, ou maior do que cerca de 40 pM.
[00152] A afinidade de ligação do anticorpo para NGF pode ser determinada usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma maneira de determinar a afinidade de ligação de anticorpos a NGF e através da medição da afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expresso re- combinantemente. A afinidade de um fragmento Fab anti-NGF de um anticorpo pode ser determinada através de ressonância de plasmon de superfície (sistema ressonância de plasmon de superfície BIAco- re3000® (SPR, BIAcore, INC, Piscaway, NJ). Chips CM5 podem ser ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. NGF humano (ou qualquer outro NGF) pode ser diluído em acetato de sódio 10 mM pH 4,0 e injetado no chip ativado em uma concentração de 0,005 mg/mL. Usando tempo de fluxo variável através dos canais de chip individuais, duas faixas de densidade de antígeno podem ser conseguidas: 100-200 unidades de resposta (RU) para estudos de cinética detalhados e 500-600 RU para ensaios de avaliação. O chip pode ser bloqueado com entanolamina. Estudos de regeneração mostram que uma mistura de tampão de eluição Pierce (No. do produto 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e NaCI 4M (2:1) remove eficazmente o Fab ligado enquanto mantendo a atividade de hNGF no chip por mais de 200 injeções. Tampão de HBS-EP (HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCI a 0,15, EDTAa 3 mM, Tensoativo P29 a 005%)é usado como tampão de administração para os ensaios BIAcore. Diluições seriais (KD estimada de 0,1-10x) de amostras de Fab purificadas são injetadas por 1 min a 100 μL/min e tempos de dissociação de até 2 horas são permitidos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas através de ELISA e/ou eletroforese de SDS- PAGE usando um Fab de concentração conhecida (conforme determinado através de análise de aminoácido) como um padrão. Taxas de associação cinética (Kon) e taxas de dissociação (Koff) são obtidas simultaneamente aplicando os dados a um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R., Ross, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology,6, 99-110) usando o programa Bdevaluation. Valores de constante de dissociação de equilíbrio (KD) são calculados como Koff/Kon- Este protocolo é adequado para uso na determinação de afinidade de ligação de um anticorpo a NGF, incluindo NGF humano, NGF de outro vertebrado (em algumas modalidades, mamífero) (tal como NGF de camundongo, NGF de rato, NGF de primata), bem como para uso com outras neurotrofinas, tal como as neurotrofinas relacionadas NT3, NT4/5 e/ou BDNF.
[00153] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a NGF humano, e não se liga significantemente a um NGF de outra espécie de vertebrado (em alguma modalidade, mamífero). Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a NGF humano bem como um ou mais NGF de outras espécies de vertebrado (em algumas modalidades, mamífero). Em ainda outras modalidades, o anticorpo se liga a NGF e não reage com reatividade significantemente com outras neurotrofinas (tais como as neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 e/ou BDNF. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a NGF bem como pelo menos outra neurotrofina. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a uma espécie de mamífero de NGF, tal como cavalo ou cachorro, mas não se liga significantemente a NGF de outra espécie de mamífero.
[00154] O(s) epitopo(s) pode(m) ser contínuo(s) ou descontínuo(s). Em uma modalidade, o anticorpo se liga essencial mente aos mesmos epitopos de NGF humano que o anticorpo selecionado do grupo consistindo em MAb911, MAb912 e MAb938 conforme descrito em Hongo e outros, Hybridoma, 19:215-227 (2000); um anticorpo definido aqui (tal como anticorpo E3); e/ou um anticorpo descrito na W02005019266 (incluindo anticorpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 e 4G6) ou W02006131951 (incluindo anticorpo Hu-aD11), cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Em outra modalidade, o anticorpo se liga essencialmente ao mesmo epitopo de hNGF que MAb911. Em ainda outra modalidade, o anticorpo se liga essencialmente ao mesmo epitopo que MAb 909. Hongo e outros, supra. Por exemplo, o epitopo pode compreender um ou mais de: resíduos K32, K34 e E35 dentro da região variável 1 (aminoácidos 23- 35) de hNGF; resíduos F79 e T81 dentro da região variável 4 (aminoácidos 81-88) de hNGF; resíduos H84 e K88 dentro da região variável 4; resíduo R103 entre a região variável 5 (aminoácidos 94-98) de hNGF e o terminal C (aminoácidos 111-118) de hNGF; resíduo E11 dentro da região 1 pré-variável (aminoácidos 10-23) de hNGF; Y52 entre a região variável 2 (aminoácidos 40-49) de hNGF e região variável 3 (aminoácidos 59-66) de hNGF; resíduos L112 e S113 dentro do ter-minal C de hNGF; resíduos R59 e R69 dentro da região variável 3 de hNGF; ou resíduos V18, V20 e G23 dentro da região pré-variável 1 de hNGF. Ainda, um epitopo pode compreender uma ou mais da região variável 1, região variável 3, região variável 4, região variável 5, a região N-terminal e/ou terminal C de hNGF. Em ainda outra modalidade, o anticorpo reduz significantemente a acessibilidade de solvente de resíduo R103 de hNGF. É compreendido que embora os epitopos descritos acima estejam se referindo a NGF humano, um versado comum na técnica pode alinhar as estruturas de NGF humano com o NGF de outras espécies e identificar contrapartes prováveis para esses epitopos.
[00155] Em algumas modalidades, os anticorpos para uso na in- venção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qualquer um de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou peptídeos da invenção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qualquer um de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou peptídeos da invenção podem inibir (reduzir e/ou bloquear) a sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca e 15 pM de NGF) de cerca de qualquer um de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos podem inibir (reduzir e/ou bloquear) sobrevivência dependente de NGF de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qualquer um de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1pM ou menos. Métodos para medição da sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13 de ca-mundongo são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, no Exemplo 2 da WG2004/058184). Identificação de anticorpos anmarcadoronistas anti-NGF
[00156] Anticorpos antagonistas anti-NGF para uso na invenção podem ser identificados ou caracterizados usando métodos conhecidos na técnica, com o que redução, melhora ou neutralização de uma atividade biológica de NGF é detectada e/ou medida. Métodos descritos no PCT W004/065560 podem ser usados. Outro método, por exemplo, um ensaio de ativação de receptor de quinase (KIRA) des crito nas Patentes U.S. Nos. 5.766.863 e 5.891.650 pode ser usado para identificar agentes anti-NGF. Este ensaio do tipo ELISA é adequado para medição qualitativa ou quantitativa de ativação de quinase através da medição da autofosforilação do domínio quinase de uma proteína receptora tirosina quinase (daqui em diante "rPTK"), por exemplo, receptor TrkA, bem como para identificação e caracterização de antagonistas potenciais de um rPTK selecionado, por exemplo, TrkA. O primeiro estágio do ensaio envolve fosforilação do domínio quinase de um receptor de quinase, por exemplo, um receptor TrkA, em que o receptor está presente na membrana de célula de uma célula eucariótica.
[00157] O receptor pode ser um receptor endógeno ou ácido nuclei- co codificando o receptor, ou um construto de receptor, pode ser transformado na célula. Tipicamente, uma primeira fase sólida (por exemplo, uma cavidade de uma primeira placa de ensaio) é revestida com uma população substancialmente homogênea de tais células (geralmente uma linhagem de célula de mamífero) de maneira que as células possam aderir à fase sólida. Frequentemente, as células são aderentes e então aderem naturalmente à primeira fase sólida. Se um "construto de receptor" for usado, ele geralmente compreende uma fusão de um receptor de quinase e um polipeptídeo flag.O polipeptí- deo flagé reconhecido pelo agente de captura, frequentemente um anticorpo de captura, na parte ELISA do ensaio. Um analito, tal como um antagonista de NGF candidato (incluindo anticorpo antagonista anti-NGF) é então adicionado junto com NGF às cavidades tendo as células aderentes, de maneira que o receptor da tirosina quinase (por exemplo, receptor TrkA) seja exposto a (ou contatado com) NGF e o analito. Este ensaio permite identificação de antagonistas (incluindo anticorpos) que inibem ativação de TrkA por seu NGF ligante. Seguindo exposição a NGF e o analito, as células aderentes são solubiliza- das usando um tampão de lise (que tem um detergente de solubiliza- ção nele) e agitação suave, desta maneira liberando lisato de célula que pode ser submetido à parte ELISA do ensaio diretamente, sem a necessidade de concentração ou clarificação do lisato de célula.
[00158] O lisato de célula então preparado está então pronto para ser submetido ao estágio ELISA do ensaio. Como uma primeira etapa no estágio ELISA, uma segunda fase sólida (geralmente uma cavidade de uma placa de microtitulação de ELISA) é revestida com um agente de captura (frequentemente um anticorpo de captura) que se liga especificamente ao receptor da tirosina quinase ou, no caso de um cons- truto de receptor, ao polipeptídeo flag.Revestimento da segunda fase sólida é realizado de maneira que o agente de captura possa aderir à segunda fase sólida. O agente de captura é geralmente um anticorpo monoclonal, mas como é descrito nos exemplos aqui, anticorpos poli- clonais podem ser também usados. O lisato de célula obtido é então exposto a, ou contatado com, o agente de captura aderente de maneira que o receptor ou construto de receptor passa aderir a (ou seja capturado) à segunda fase sólida. Uma etapa de lavagem é então realizada, de maneira a remover lisato de célula não-ligada, deixando o re-ceptor ou construto de receptor capturado. O receptor ou construto de receptor aderido ou capturado é então exposto a, ou contatado com, um anticorpo antifosfotirosina que identifica resíduos de tirosina fosfori- lados no receptor tirosina quinase. Em uma modalidade, o anticorpo antifosfotirosina é conjugado (diretamente ou indiretamente) a uma enzima que catalisa uma mudança de cor de um agente colorido não- radioativo. Desta maneira, fosforilação do receptor pode ser medida através de uma mudança de cor subsequente do reagente. A enzima pode ser ligada ao anticorpo antifosfotirosina diretamente ou a uma molécula de conjugação (por exemplo, biotina) pode ser conjugada ao anticorpo antifosfotirosina e a enzima pode ser subsequentemente li- gada ao anticorpo antifosfotirosina através da molécula de conjugação. Finalmente, ligação do anticorpo antifosfotirosina ao receptor ou construto de receptor capturado é medida, por exemplo, através de uma mudança de cor no reagente de cor.
[00159] Anticorpos antagonistas anti-NGF podem ser também identificados através da incubação de um agente candidato com NGF e monitoramento de qualquer uma ou mais das características que seguem: (a) ligação a NGF e inibição de atividade biológica de NGF ou cursos a jusante mediados por função de sinalização de NGF; (b) inibição, bloqueio ou diminuição de ativação do receptor NGF (incluindo dimerização de TrkA e/ou autofosforilação); (c) aumento da liberação de NGF; (d) tratamento ou prevenção de qualquer aspecto de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga; (e) inibição (redução) da síntese, produção ou liberação. Em algumas modalidades, um antagonista NGF (por exemplo, um anticorpo antagonista anti-NGF) é identificado através da incubação de um agente candidato com NGF e monitoramento de ligação e/ou redução ou neutralização presente de uma atividade biológica de NGF. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) de NGF purificado(s) ou com células naturalmente expressando, ou transfectadas para expressar, polipeptídeo(s) de NGF. Em uma modalidade, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitiva, em que a habilidade de um agente candidato (tal como um anticorpo) em competir com um anticorpo antagonista anti-NGF conhecido para ligação a NGF é avali-ada. O ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA. Em outras modalidades, um antagonista de NGF (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF) é identificado através da incubação de um agente candidato com NGF e monitoramento de ligação e inibição presente de dimerização e/ou autofosforilação de receptor trkA.
[00160] Seguindo identificação inicial, a atividade de um anticorpo antagonista anti-NGF candidato pode ser confirmada mais e refinada por bioensaios, conhecidos testar as atividades biológicas alvo. Alternativamente, bioensaios podem ser usados para avaliar candidatos diretamente. Por exemplo, NGF promove várias mudanças morfologicamente reconhecíveis em células responsivas. Essas incluem, mas não estão limitadas a, promoção da diferenciação de células PC12 e aumento do crescimento de neuritos a partir dessas células (Greene e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.73(7):2424-8, 1976), promovendo crescimento de neurito a partir de explantes de gânglios sensoriais e simpáticos responsivos (Levi-Montal, R. e Angeletti, P., Nerve growth factor, Physiol. Rev. 48:534-569, 1968) e promovendo a sobrevivência de neurônios dependentes de NGF tais como neurônios do gânglio da raiz dorsal embriônica, gânglio trigeminal ou gânglio simpático (por exemplo, Chun &Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001 (1993). Então, o ensaio para inibição de atividade biológica de NGF acarreta cultura de células responsivas a NGF com NGF mais um analito, tal como um antagonista de NGF candidato (incluindo anticorpo antagonista anti-NGF). Após um tempo apropriado a resposta celular será ensaiada (diferenciação celular, crescimento de neurito ou sobrevivência celular).
[00161] A habilidade de um anticorpo antagonista de NGF candidato em bloquear ou neutralizar uma atividade biológica de NGF pode ser também avaliada através de monitoramento da habilidade do agente candidato em inibir sobrevivência mediada por NGF no bioen- saio de sobrevivência de gânglios de raiz dorsal de rato embriônico conforme descrito em Hongo e outros, Hybridoma 19:215-227 (2000).
[00162] Os anticorpos para uso na presente invenção podem ser feitos através de procedimentos conhecidos na técnica, alguns dos quais são ilustrados nos Exemplos da W02004/058184. Os anticorpos podem ser produzidos através de degradação proteolítica ou outra dos anticorpos, através de métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) conforme descrito na W02004/058184 ou através de síntese química. Polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos de até cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente feitos através de síntese química. Métodos de síntese química são conhecidos no campo e estão comercial mente disponíveis. Por exemplo, um anticorpo E3 poderia ser produzido por um sin- tetizador de polipeptídeo automático empregando o método de fase sólida. Vide também Patentes U.S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415. Anticorpos quiméricos ou híbridos podem ser também preparados in vitrousando métodos conhecidos de química de proteína sintética, incluindo aquelas envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem imino- tiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.
[00163] Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos re- combinantemente usando procedimentos que são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência codificando as regiões variáveis e de cadeia curta de anticorpo E3 é clonado em um vetor para expressão ou propagação em uma célula hospedeira (por exemplo, células CHO). Em outra modalidade, as sequências de nucleotídeo mostradas nas figuras 2 e 3 da W02004/058184 são clonadas em um ou mais vetores para expressão ou propagação. A sequência codificando o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. Vetores (incluindo vetores de expressão) e células hospedeiras são descritos mais aqui. Métodos para expressão de anticorpos recombinantemente em plantas ou leite foram revelados. Vide, por exemplo, Peeters e outros (2001) Vaccine19:2756; Lonberg, N. e D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol.13:65 e Pollock e outros (1999) J. Immunol. Methods 231:147. Métodos para fabricação de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizado, de cadeia simples, etc, são conhecidos na técnica.
[00164] A invenção também compreende fragmentos de região variável de cadeia simples ("scFv") de anticorpos da presente invenção, tal como E3. Fragmentos de região variável de cadeia simples são feitos ligando regiões variáveis de cadeia curta e/ou longa usando um peptídeo de ligação curto. Bird e outros (1988) Science 242:423-426. Um exemplo de um peptídeo de ligação é (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15), que forma ponte de aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carboxi de uma região variável e o terminal amino da outra região variável. Li- gantes de outras sequências foram projetados e usados (Bird e outros (1988)). Ligantes podem por sua vez ser modificados para funções adicionais, tal como ligação de fármacos ou ligação a apoios sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas ou recombinantemente ou sinteticamente. Para produção sintética de scFv, um sinte- tizador automático pode ser usado. Para produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, ou eucariótica, tais como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, ou procariota, tal como E. coli. Polinucleotídeos codificando o scFv de interesse podem ser feitos através de manipulações de rotina tal como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnicas de purificação de proteína-padrão conhecidas no campo.
[00165] Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos, são também compreendidas. Diacorpos são anticorpos bi- específicos, bivalentes, em que domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando um ligante que é muito curto para permitir empareihamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desta maneira forçando os domínios a emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (vide, por exemplo, Holliger, P. e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J. e outros (1994) Structure2:1121-1123).
[00166] O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico, um anticorpo monoclonal que tem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Um anticorpo biespecífico pode ser preparado usando os anticorpos descritos aqui. Métodos para fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Suresh e outros, 1986, Methods in Enzymology121:210). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos foi baseada na coexpressão de dois pares de cadeia longa-cadeia curta de imunoglobulina, com as duas cadeias longas tendo especificidades diferentes (Millstein e Cuello, 1983, Nature305, 537-539).
[00167] De acordo com uma abordagem para fabricar anticorpos biespecíficos, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antígeno) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio constante de cadeia longa de imunoglobulina compreendendo pelo menos parte das regiões CH2 e CH3, de dobradiça. É preferido ter a primeira região constante de cadeia longa (CH1), contendo o sítio necessário para ligação à cadeia curta, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs codificando as fusões de cadeia longa de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia curta de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão sepa-rados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isto provê grande flexibilidade em ajuste das proporções mutuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando razões diferentes das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção proveem os rendimentos ótimos. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em rendimentos altos ou quando as razões não são de nenhuma significância particular.
[00168] Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia longa de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia longa-cadeia curta de imunoglobulina híbrida (provendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Esta estrutura assimétrica, com uma cadeia curta de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas. Esta abordagem é descrita na Publicação PCT No. W094/04690 publicada em 3 de março de 1994.
[00169] Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorpos covalentemente unidos, estão também dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos têm sido usados para direcionar células do sistema imune a células indesejadas (Patente U.S. No. 4.676.980), e para tratamento de infecção por HIV (Publicações do Pedido PCT Nos. 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes.
[00170] Agentes e técnicas de reticulação adequados são bem conhecidos no campo e são descritos na Patente U.S. No. 4.676.980.
[00171] O anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, como conhecido na técnica, e conforme aqui descrito.
[00172] A invenção compreende modificações para anticorpo E3, incluindo anticorpos funcionalmente equivalentes que não afetam sig-nificantemente suas propriedades e variantes que têm atividade aumentada ou diminuída. Modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica e é exemplificada mais nos Exemplos. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições (incluindo substituições conservatives) de resíduos de aminoácido, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não mudam significantemente prejudicialmente a atividade funcional ou uso de análogos químicos.
[00173] Uma "variante" de polipeptídeo, conforme aqui usada, é um polipeptídeo que difere de uma proteína nativa em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções, de maneira que a imunor- reatividade do polipeptídeo não seja substancialmente diminuída. Em outras palavras, a habilidade de uma variante em especificamente se ligar a antígeno pode ser aumentada ou não-modificada, com relação à proteína nativa, ou pode ser diminuída em menos do que 50%, e preferivelmente menos do que 20%, com relação à proteína nativa. Variantes de polipeptídeo preferivelmente exibem pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade (determinada conforme aqui descrito) para os polipeptídeos identificados.
[00174] Variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos podem ser preparadas através da introdução de mudanças de nucleotí- deo no DNA do anticorpo ou através de síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácido da SEQ ID NO:1 ou 2 descritas aqui. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácido também podem alterar processos pós-traducionais do anticorpo, tal como mudança do número ou posição de sítios de glicosilação.
[00175] Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese ou modificação é chamado "mutagênese de varredura de alanina" e é descrito por Cunningham e Wells, 1989, Science, 244:1081-1085. Um resíduo ou grupo de resíduos-alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polianilina) para realizar a interação dos aminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional para as substituições são então refinadas através da introdução de mais ou outras variantes nos, ou para, os sítios de substituição. Então, embora o sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou na região-alvo e variantes de anticorpo expressas são avaliadas quanto à atividade desejada. Mutagênese de varredura de biblioteca, conforme aqui descrito, pode ser também usada para identificar locais em um anticorpo que são adequados para mutagênese ou modificação.
[00176] Inserções de sequência de aminoácido incluem fusões amino- e/ou carboxila-terminais variando em comprimento a partir de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácido simples ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionina N-terminal ou o anticorpo fundido a um marcador de epitopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou um poli- peptídeo que aumenta a meia-vida no soro do anticorpo.
[00177] Variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. O sítio de maior interesse para mutagênese substitucional inclui as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR são também compreendidas. Substituições conservatives são mostradas na Tabela 1 sob o cabeçalho de "substituições conservatives". Se tais substituições resultarem em uma mudança em atividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou como descrito adicionalmente abaixo em referência a classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos avaliados. Tabela 1. Substituições de Aminoácido
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[001178] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas através da seleção de substituições que diferem significantemente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura da estrutura principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo ou (c) do tamanho da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) Hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) Hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr; (3) Ácida: Asp, Glu; (4) Básica: Asn, Gin, His, Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromática: Tpr, Tyr, Phe.
[001179] Substituições não-conservativas são feitas através da troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[001180] Qualquer resíduo cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo pode ser também substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reticulação aberrante. Por outro lado, ligação(ões) cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv.
[001181] Modificações de aminoácido podem variar de mudança ou modificação de um ou mais aminoácidos para completar novo desenho de uma região, tal como a região variável. Mudanças na região variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação. Em alguma modalidade, não mais do que uma a cinco substituições de aminoácido conservativas são feitas dentro de um domínio de CDR. Em outras modalidades, não mais do que uma a três substituições de aminoácido conservativas são feitas dentro de um domínio de CDR3. Em ainda outras modalidades, o domínio de CDR é CDRH3 e/ou CDR L3.
[001182] Modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não-glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-traducionais, tais como, por exemplo, glicosilação com açúcares diferentes, acetilação e fosforilação. Anticorpos são glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, 1997, Chem. Immunol.65:111-128; Wright e Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). As cadeias laterais do oligossacarídeo da imunoglobulina afetam a função da proteína (Boyd e outros, 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe e Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína, que pode afetar a conformação e superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Hefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligossacarídeos podem também servir para se direcionar a uma dada glicoproteína para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. Glicosilação de anticorpos foi também relatada afetar citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC). Em particular, células CHO com expressão regulada com te- traciclina de β(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnTIll), uma formação de catálise de glicosiltransferase de *bisecting(p.59, linha 1) GlcNAc, foram relatadas ter atividade de ADCC aperfeiçoada (Umana e outros, 1999, Mature Biotech.,17:176-180).
[001183] #59Glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências de tripeptídeo aspa- ragina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Então, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina possa ser também usada.
[001184] Adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácido de maneira que ela contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo acima descritas (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode ser também feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados). O padrão de glicosilação de anticorpos pode ser também alterado sem alterar a sequência de nucleotídeo de base. Glicosilação depende muito da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Uma vez que o tipo de célula usado para ex-pressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como terapêuticos potenciais é raramente a célula nativa, variações no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (vide, por exemplo, Hse e outros, 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).
[001185] Em adição à escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante produção recombinante de anticorpos incluem modo de crescimento, formulação dos meios, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similar. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação atingido em um organismo hospedeiro particular incluindo introdução ou supe- rexpressão de certas enzimas envolvidas em produção de oligossaca- rídeo (Patentes U.S. Nos. 5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). Glicosi- lação, ou certos tipos de glicosilação, pode ser enzimaticamente removida da glicoproteína, por exemplo, usando endoglicosidase H (en- do H). Ainda, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente engenheirada para ser defeituosa em processamento de certos tipos de polissacarídeos. Essas técnicas e técnicas similares são bem conhecidas no campo.
[001186] Outros métodos de modificação incluem uso de técnicas de acoplamento conhecidas no campo, incluindo, mas não limitado a, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. Modificações podem ser usadas, por exemplo, para ligação de marcadores para imunoensaio. Polipeptídeos E3 modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser avaliados usando ensaios padrão conhecidos na técnica, alguns dos quais podem ser descritos abaixo e nos Exemplos.
[001187] Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT NO. WO 99/58572, publicada em 18 de novembro de 1999. Esses anticorpos compreendem, em adição a um domínio de ligação direcionado na molécula alvo, um domínio efetor tendo uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga a todo ou parte de um domínio constante de uma cadeia longa de imunoglobulina humana. Esses anticorpos são capazes de ligação à molécula alvo sem disparar lise dependente de complemento significante ou destruição mediada por célula do alvo. Em algumas modalidades, o domínio efetor é capaz de se ligar especificamente a FcRn e/ou FcyRllb. Esses são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia longa de imunoglobulina humana. Anticorpos modificados desta maneira são particularmente adequados para uso em terapia de anticorpo crônica, para evitar reações inflamatórias e outras adversas para terapia de anticorpo convencional.
[001188] A invenção também utiliza proteínas de fusão compreendendo um ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos ou polipeptídeos da presente invenção. Em u ma modalidade, um polipeptídeo de fusão é provido, o qual compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região de cadeia curta variável mostrada na SEQ ID NO:2 (figura 1B da W02004/058184) e/ou pelo menos 10 aminoácidos da região de cadeia longa variável mostrada na SEQ ID NO:1 (figura 1A da WQ2004/058184). Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma região variável de cadeia curta e/ou uma região va-riável de cadeia longa de E3, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 1 e 2 (figuras 1A e 1B da WQ2004/058184). Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDR(s) de E3. Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 e/ou CDR L3 de anticorpo E3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende qualquer um ou mais de: resíduo de aminoácido L29 de CDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CDRH3 e/ou A103 de CDRH3; e/ou resíduo de aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL3 e/ou H92 de CDRL3. Para propósitos da presente invenção, uma proteína de fusão E3 contém um ou mais anticorpos E3 e outra sequência de aminoácido à qual ela não é ligada na molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região. Sequências heterólogas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, um "marcador" tal como um marcador FLAGou um marcador 6Hls. Tags são bem conhecidos na técnica.
[001189] Um polipeptídeo de fusão a E3 pode ser criado através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou re- combinantemente. Tipicamente, as proteínas de fusão E3 são feitas preparando e expressando um polinucleotídeo codificando-as usando métodos recombinantes descritos aqui, embora elas possam ser também preparadas através de outros meios conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, síntese química.
[001190] A habilidade dos anticorpos e polipeptídeos da presente invenção, tal como ligação a NGF; redução ou inibição de uma atividade biológica de NGF; redução e/ou bloqueio de sobrevivência induzida por NGF de neurônios trigeminais de camundongo E13.5, pode ser testada usando métodos conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos nos Exemplos da W02004/058184 e em particular nos Exemplos 2 e 3 da W02004/058184.
[001191] A invenção também utiliza composições (incluindo composição farmacêutica) e kits compreendendo anticorpo E3 e, como o presente relatório torna claro, qualquer um ou todos os anticorpos e/ou polipeptídeos descritos aqui. Tais composições e kits podem ser para uso em tratamento e/ou prevenção de um ou mais dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga em um indivíduo. Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras
[001192] A invenção também provê polinucleotídeos isolados codificando os anticorpos e polipeptídeos da invenção (incluindo um anticorpo compreendendo as sequências de polipeptídeo de cadeia curta e regiões variáveis de cadeia longa mostradas nas figuras 1A e 1B da W02004058184) e vetores e células hospedeiras compreendendo o polinucleotídeo para uso nos métodos da invenção.
[001193] Desta maneira, os polinucleotídeos (ou composições, incluindo composições farmacêuticas), podem compreender polinucleotídeos codificando qualquer um do que segue: (a) anticorpo E3; (b) um fragmento ou uma região do anticorpo E3; (c) uma cadeia curta do anticorpo E3 conforme mostrado na SEQ ID NO:17 (figura 1B da W02004/058184); (d) uma cadeia longa do anticorpo E3 conforme mostrado na SEQ ID NO: 16 (figura 1A da WQ2004/058184); (e) uma ou mais região(ões) variáveis de uma cadeia curta e/ou uma cadeia longa do anticorpo E3; (f) uma ou mais CDR(s) (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo E3 mostrado nas SEQ ID NOs:3- 8 (figuras 1A e 1B da WQ2004/058184); (g) CDR H3 da cadeia longa de anticorpo E3 mostrado na SEQ ID NO:5 (figura 1A da WQ2004/058184; (h) CDR L3 da cadeia curta de anticorpo E3 mostrado na SEQ ID NO:8 (figura 1B da WQ2004/058184); (i) três CDRs da cadeia curta de anticorpo E3 mostrado nas SEQ ID NOs:6-8 (figura 1B da W02004/058184); (j) três CDRs da cadeia longa do anticorpo E3 mostrado nas SEQ ID NOs:3-5 (figura 1A da WQ2004/058184); (k) três CDRs da cadeia curta e três CDRs da cadeia longa de anticorpo E3 mostrado nas SEQ ID NOs:3-8 (figuras 1a e 1B da WQ2004/058184; ou (i) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a (k). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende ou um ou ambos os polinucleotídeo(s) mostrado(s) nas SEQ ID NOs:76 e 77 (figuras 2 e 3 da WQ2004/058184).
[001194] Em outro aspecto, a invenção utiliza um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia curta de E3 com um número de depósito ATCC No. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção utiliza um polinucleotídeo isolado que codifica uma cadeia longa de E3 com um número de depósito ATCC No. PTA-4895. Em ainda outro aspecto, a invenção utiliza um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894 e (b) uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, a invenção utiliza um polinu- cleotídeo isolado compreendendo (a) uma ou mais CDR codificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894/ e/ou (b) uma ou mais CDR codificada no polinucleotídeo com um número depósito de ATCC No. PTA-4895. Os depósitos sob Nos. de Acesso ATCC PTA-4893, PTA-4894 e PTA-4895 são descritos na W02004/058184, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade.
[001195] Os polinucleotídeos codificando qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e polipeptídeos descritos aqui podem ser feitos através de procedimentos conhecidos na técnica.
[001196] Em outro aspecto, a invenção provê composições (tais como composições farmacêuticas) compreendendo qualquer um dos po-linucleotídeos da invenção para uso em tratamento ou prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga. Em algumas modalidades, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo E3 conforme aqui descrito. Em outra modalidade, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos descritos aqui. Em ainda outras modalidades, a composição compreende ou um ou ambos os polinucleotídeos mostrados nas figuras 2 e 3 da W02004/058184. Vetores de expressão, e administração de composições de polinucleotídeo, são descritos mais aqui.
[001197] Em outro aspecto, a invenção provê um método de fabricação de qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui para uso em métodos para tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga.
[001198] Polinucleotídeos complementares a qualquer uma de tais sequências são também compreendidos pela presente invenção. Poli- nucleotídeos podem ser de filamento simples (codificação ou anti- sentido) ou de filamento duplo e podem ser moléculas de DNA (genô- mico, cDNA ou sintético) ou RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm introns e correspondem a uma molécula de DNA de uma maneira um-para-um e moléculas de mRNA, que não contêm introns. Sequências de codificação ou não-codificação adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de apoio. Polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou pode compreender uma variante de tal sequência. Variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, de- leções e/ou inserções de maneira que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída, com relação a uma molécula imunor- reativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode ser geralmente avaliado conforme descrito aqui. Variantes exibem preferivelmente pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma porção do mesmo.
[001199] Duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são ditas ser "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for igual quando alinhada para correspondência máxima conforme descrito abaixo. Comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando as sequências em uma janela de comparação para identificar a comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação" conforme aqui usado refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posi ções contíguas, geralmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas.
[001200] Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no suíte Lasergene de software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) usando parâmetros default.Este programa inclui vários esquemas de alinhamento descritos nas referências que seguem: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. e Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
[001201] Preferivelmente, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada comparando duas sequências otimamente alinhadas em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos, geralmente 5 a 15 por cento ou 10 a 12 por cento conforme comparado com as sequências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determi- nação do número de posições nas quais as bases de ácido nucleico ou resíduos de aminoácido idênticos acontecem em ambas as sequências para dar o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência.
[001202] Variantes podem também, ou altemativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo ou uma porção ou complemento do mesmo. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizar sob condições moderadamente adstringentes para uma sequência de DNA de ocorrência natural codificando um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).
[001203] "Condições moderadamente adstringentes" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridização a 50° C-65° C, 5 X SSC da noite para o dia; seguido por lavagem duas vezes a 65° C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo SDS 0,1%.
[001204] Conforme aqui usado, "condições altamente adstringentes" ou "condições de alta adstringência" são aquelas que: (1) empregam resistência iônica baixa e temperatura alta para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015M de citrato de sódio/0,1% de do- decil sulfato de sódio a 50° C; (2) empregam durante a hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com albumina de soro bovino 0,1%/Ficoll 0,1 %/polivinilpirrolidona 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 mM em pH 65, com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42° C; ou (3) emprega formamida 50%, 5 X SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5 X, DNA de esperma de salmão sonifica- do (50 μg/ml), SDS 0,1% e dextrano sulfato 10% a 42° C, com lavagens a 42° C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e for- mamida 50%, seguido por uma lavagem de alta adstringência consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55° C. O versado na técnica vai reconhecer como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc, conforme necessário para acomodar fatores tais como comprimento da sonda e similar.
[001205] Será compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica, como um resultado da degeneração do código genético, que há muitas sequências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo conforme aqui descrito. Alguns desses polinucleotídeos podem carregar homologia mínima com a sequência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Não obstante, polinucleotídeos que variam devido a diferentes em uso de códon são especificamente compreendidos pela presente invenção. Ainda, alelos dos genes compreendendo as sequências de polinucleotídeo providas aqui estão dentro do escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não precisa, ter uma estrutura ou função alterada. Alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (tal como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de banco de dados).
[001206] Os polinucleotídeos para uso na invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese de polinucleotídeo química são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Um versado na técnica pode usar as sequências providas aqui e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[001207] Para preparação de polinucleotídeos usando métodos re- combinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para repli- cação e amplificação, como discutido mais aqui. Polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras através de qualquer meio conhecido na técnica. Células são transformadas através da introdução de um polinucleotídeo exógeno através de absorção direta, endo- citose, transfecção, F-mating ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não-integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado ao genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo então amplificado pode ser isolado da célula hospedeira através de métodos bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros (1989).
[001208] Alternativamente, PCR permite reprodução de sequências de DNA. Tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita nas Patentes U.S. Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis e outros eds., Birkauswer Press, Boston (1994).
[001209] RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e sua inserção em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica e o DNA é transcrito no RNA, o RNA pode ser isolado usando métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica, conforme mostrado em Sambrook e outros (1989), por exemplo.
[001210] Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira pretendida ser usada, vetores de clonagem úteis terão geralmente a habilidade em auto-replicar, podem possuir um alvo único para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem carregar ge- nes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacte- rianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago, e vetores moveis tais como pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis de vendedores comerciais tais como BioRad, Stratagene e Invitrogen.
[001211] Vetores de expressão são geralmente construtos de polinucleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras ou como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossomal. Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovirus, vírus adenoassociados, retrovirus, cosmídeos e vetor(es) de expressão revelados na Publicação PCT No. WO 87/04462. Componentes de vetor podem geralmente incluir, mas não estão limitados a, um ou mais do que segue: uma sequência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcripcional adequados (tais como promotores, aumentadores e terminador). Para expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle de tradução são também geralmente requeridos, tais como sítios de ligação de ribossoma, sítios de início de tradução e códons de parada.
[001212] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira através de qualquer um de vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE- dextrano ou outras substâncias; bombardeamento com microprojétil; lipofecção; e infecção (por exemplo, em que o vetor é um agente infeccioso tal como vírus vaccinia). A escolha de introdução de vetores ou polinucleotídeos vai frequentemente depender de características da célula hospedeira.
[001213] A invenção também utiliza células hospedeiras compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressarDNAs heterólogos podem ser usadas para o propósito de isolamento dos genes codificando o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não- limitantes de células hospedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitados a, células COS, HeLa e CHO. Vide também Publicação PCT No. WO 87/04462. Células hospedeiras de não-mamífero incluem pro- cariontes (tais como E. coli ou B. subtil is) e curtadura (tal como S. ce- revisiae, S. pombe; ou K. lactis). Preferivelmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente 10 vezes maior, mais preferivelmente ainda 20 vezes maior do que aquele do anticorpo endógeno ou proteína de interesse, se presente, nas células hospedeiras. Avaliação das células hospedeiras quanto a uma ligação específica a NGF é realizada através de um imunoensaio ou FACS. Uma célula superexpressando o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.
Composições para uso nos métodos da invenção
[001214] As composições para uso nos métodos da invenção (com relação à dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga) compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF e, em algumas modalidades, compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais composições, bem como a maneira de formular, são também descritos aqui. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF se liga a NGF e não reage com cruzamento significantemente com neurotrofi- nas relacionadas (tal como NT3, NT4/5 e/ou BDNF). Em algumas mo dalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF não está associado com uma resposta imune adversa. Em outras modalidades, o anticorpo anti-NGF reconhece NGF humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF é humano. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-NGF é humanizado (tal como anticorpo E3 descrito aqui). Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-NGF compreende uma região constante que não dispara uma reposta imune indesejável, tal como lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em outras modalidades, o anticorpo anti-NGF compreende uma ou mais CDR(s) de anticorpo E3 (tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs de E3).
[001215] É compreendido que as composições podem compreender mais de um antagonista de NGF. Por exemplo, uma composição pode compreender mais de um membro de uma classe de antagonistas de NGF (por exemplo, uma mistura de anticorpos anti-NGF que reconhecem epitopos diferentes de NGF), bem como membros de classes diferentes de antagonistas de NGF (por exemplo, um anticorpo anti-NGF e um composto inibidor de NGF). Outras composições exemplares compreendem mais de um anticorpo anti-NGF que reconhecem o(s) mesmo epitopo(s), espécies diferentes de anticorpos anti-NGF que se ligam a epitopos diferentes de NGF ou compostos inibidores de NGF diferentes.
[001216] A composição usada na presente invenção pode compreender ainda veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and Practice of Pharmacy20a Ed. (2000) Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K. E. Hoover.), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são descritos mais aqui.
[001217] O anticorpo antagonista anti-NGF e composições do mesmo podem ser também usados em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou complementar a eficácia dos agentes, por exemplo, com agentes usados no tratamento ou prevenção de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior. O anticorpo antagonista anti- NGF pode ser administrado simultaneamente, sequencial mente ou separadamente em combinação com um ou mais tais agentes.
[001218] O anticorpo anti-NGF pode ser administrado em combinação com um ou mais fármacos (ou como qualquer combinação dos mesmos). O anticorpo anti-NGF pode ser utilmente combinado com outro composto farmacologicamente ativo, ou com dois ou mais outros compostos farmacologicamente ativos, para o tratamento de uma dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior (LUTS) associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga. Por exemplo, um anticorpo anti-NGF, conforme acima definido, pode ser administrado simultaneamente, sequencial mente ou separadamente, em combinação com um ou mais agentes selecionados de: • um analgésico opioide, por exemplo, morfina, heroína, hi- dromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidi- na, fentanila, cocaína, codeína, diidrocodeína, oxicodona, hidrocodo- na, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenor- fina, butorfanol, nalbufina ou pentazocina; • um fármaco antiinflamatório não-esteroidal (NSAID), por exemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinai, etodolaco, fenbufeno, feno- profeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofe- no, cetorolaco, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, nimesulida, nitroflurbiprofeno, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulfasalazina, sulindaco, tolmeti- na ou zomepiraco; • um sedativo barbiturado, por exemplo, amobarbital, apro- barbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metoexital, pentobarbital, fenobarbital, secobarbital, talbutal, teamilal ou tiopental; • uma benzodiazepina tendo uma ação sedativa, por exemplo, clordiazepóxido, clorazepate, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam ou triazolam; • um antagonista de H1 tendo uma ação sedativa, por exemplo, difenidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina ou clorciclizina; • um sedativo tal como glutetimida, meprobamato, meta- qualona ou dicloralfenazona; • um relaxante do músculo esqueletal, por exemplo, bacio- feno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol o or- fenadina; • um antagonista de receptor de NMDA, por exemplo, dex- trometorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinana) ou seu metabolito dex- trorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinana), cetamina, memantina, pirro- loquinolino quinina, ácido cis-4-(fosfonometil)-2-piperidinocarboxílico, budipina, EN-3231 (MorfiDex®, uma formulação de combinação de morfina e dextrometorfano), topiramato, neramexano ou perzinfotel incluindo um antagonista de NR2B, por exemplo, ifenprodil, traxoprodil ou (—)-(R)-6-{2-[4-(3-fluorofenil)-4-hidroxi-1-piperidinil]-1 -hydroxietil-3,4- diidro-2( 1 H)-quinolinona; • um alfa-adrenérgico, por exemplo, doxazosina, tamsulo- sina, clonidina, guanfacina, dexmetatomidina, modafinil, terazosina, indoramina, alfuzosina, silodosina ou 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5- metano-sulfonamido-1,2,3,4-tetraidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil) quinazolina; prazosina • um antidepressivo tricíclico, por exemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina ou nortriptilina; • um anticonvulsivo, por exemplo, carbamazepina, lamotri- gina, topiramato ou valproato; • um antagonista de taquiquinina (NK), particularmente um antagonista de NK-3, NK-2 ou NK-1, por exemplo, (ElR,9R)-7-[3,5- bis(trifluormetil)benzil]-8,9,10,11-tetraidro-9-metil-5-(4-metilfenil)-7H- [1,4]diazocino[2,1 -g][1,7]-naftiridino-6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)- 2-[(1R)-1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4-morfolinil]- metil]-1,2-diidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), aprepitante, lanepi- tante, dapitante ou 3-[[2-metoxi-5-(trifluormetoxi)fenil]-metilamino]-2- fenilpiperidina (2S,3S); • um antagonista muscarínico, por exemplo, oxibutinina, tolterodina, fesoterodina, 5-hidroximetiltolterodina, propiverina, cloreto de tróspio, darifenacina, solifenacina, temiverina e ipratrópio; • um inibidor seletivo de COX-2, por exemplo, celecoxibe, rofecoxibe, parecoxibe, valdecoxibe, deracoxibe, etoricoxibe ou lumi- racoxibe; • um analgésico de carvão-alcatrão, em particular acetami- nofeno/paracetamol; • um neuroléptico tal como droperidol, clorpromazina, haloperidol, perfenazina, tioridazina, mesoridazina, trifluorperazina, flufe- nazina, clozapina, olanzapina, risperidona, ziprasidona, quetiapina, sertindol, aripiprazol, sonepiprazol, blonanserina, iloperidona, perospi- rona, racloprida, zotepina, bifeprunox, asenapina, lurasidona, amisul- prida, balaperidona, palindora, eplivanserina, osanetante, rimonabante, meclinertante, Miraxion® ou sarizotano; • um agonista de receptor vaniloide (por exemplo, resinfe- ratoxina) ou antagonista (por exemplo, capsazepina); • um beta-adrenérgico tal como propanolol; • um anestésico local tal como mexiletina; • um corticosteroide tal como dexametasona; • um agonista ou antagonista do receptor 5-HT (por exemplo, pizotifeno) e particularmente um agonista de 5-HTIB/ID tal como eletriptano, sumatriptano, naratriptano, zolmitriptano ou rizatriptano; • um antagonista de receptor de 5-HT2A tal como R(+)-alfa- (2,3-dimetoxi-fenil)-1-[2-(4-fluorfeniletil)]-4-piperidinemetanol (MDL- 100907); • um analgésico colinérgico (nicotínico), tal como ispronicli- na (TC-1734), (E)-N-metil-4-(3-piridinil)-3-buten-1-amina (RJR-2403), (R)-5-(2-azetidinilmetoxi)-2-cloropiridina (ABT-594) ou nicotina; • Tramadol (marca registrada); • um inibidor de PDE-5, tal como 5-[2-etoxi-5-(4-metil-1- piperazinil-sulfonil)fenil]-1-metil-3-n-propil-1,6-diidro-7H-pirazolo[4,3- d]pirimidin-7-ona (sildenafil), (6R, 12aR)-2,3,6,7,12,12a-hexaidro-2- metil-6-(3,4-metilenodioxifenil)-pirazino[2',T:6,1]-pirido[3,4-b]indol-1,4- diona (IC-351 ou tadalafil), 2-[2-etoxi-5-(4-etil-piperazin-1-il-1-sulfonil)- fenil]-5-metil-7-propil-3H-imidazo[5,1 -f][ 1,2,4]triazin-4-ona (vardenafil), 5-(5-acetil-2-butoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1-etil-3-azetidinil)-2,6-diidro-7H- pirazol[4,3-d]pirimidin-7-ona, 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1 - isopropil-3-azetidinil)-2,6-diidro-7H-pirazol[4,3-c/]pirimidin-7-ona, 5-[2- etoxi-5-(4-etilpiperazin-1-ilsulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-[2-metoxietil]-2,6- diidro-7H-pirazol[4,3-d]pirimidin-7-ona, 4-[(3-cloro-4- methoxibenzil)amino]-2-[(2S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il]-N-(pirimidin- 2-ilmetil)pirimidino-5-carboxamida, 3-(1-metil-7-oxo-3-propil-6,7-diidro- 1 H-pirazol[4,3-d]pirimidin-5-il)-N-[2-(1 -metilpirrolidin-2-il)etil]-4- propoxibenzenossulfonamida; • um ligante alfa-2-delta tal como gabapentina, pregabalina, 3-metilgabapentina, ácido (1 □,3D,5D)(3-amino-metil-biciclo[3,2,0]hept- 3-il)-acético, ácido (3S,5R)-3-aminometil-5-metil-heptanóico, ácido (3S,5R)-3-amino-5-metil-heptanóico, ácido (3S,5R)-3-amino-5-metil- octanóico, (2S,4S)-4-(3-clorofenoxi)prolina, (2S,4S)-4-(3-fluorobenzil)- prolina, ácido [(1 R,5R,6S)-6-(aminometil)biciclo[3,2,0]hept-6-il]acético, 3-(1-aminometil-cicloexilmetil)-4H-[1,2,4]oxadiazol-5-ona, C-[1-(1 H- tetrazol-5-ilmetil)-cicloeptil]-metilamina, ácido (3S,4S)-(1 -aminometil- 3,4-dimetil-ciclopentil)-acético, (3S,5R)-3-amino-5-metil-nonanóico, ácido (3R,4R,5R)-3-amino-4,5-dimetil-heptanóico e ácido (3R,4R,5R)- 3-amino-4,5-dimetil-octanóico; ácido (3S,5R)-3-aminometil-5- metiloctanóico; • um canabinoide; • um antagonista de receptor do subtipo 1 de glutamato metabotrópico (mGluRI); • um inibidor de reabsorção de serotonina tal como sertrali- na, metabolito de sertralina desmetilsertralina, fluoxetina, norfluoxetina (metabolite de fluoxetina desmetil), fluvoxamina, paroxetina, citalopram, metabolito de citalopram desmetilcitalopram, escitalopram, d,l- fenfluramina, femoxetina, ifoxetina, cianodotiepina, litoxetina, dapoxe- tina, nefazodona, cericlamina e trazodona; • um inibidor de reabsorção de noradrenalina (norepinefri- na), tal como maprotilina, lofepramina, mirtazepina, oxaprotilina, fezo- lamina, tomoxetina, mianserina, buproprion, metabolito de buproprion hidroxibuproprion, nomifensina e viloxazina (Vivalan®), especialmente um inibidor de reabsorção de noradrenalina seletivo tal como reboxeti- na, em particular (S.S)-reboxetina; • um inibidor de reabsorção de serotonina-noradrenalina duplo, tal como venlafaxina, metabolito de venlafaxina O- desmetilvenlafaxina, clomipramina, metabolito de clomipramina des- metilclomipramina, duloxetina, milnaciprano e imipramina; • um inibidor de óxido nítrico sintase (iNOS) induzível tal como S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-L-homocisteína, S-[2-[(1-iminoetil)- amino]etil]-4,4-dioxo-L-cisteína, S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-2-metil-L- cisteína, ácido (2S,5Z)-2-amino-2-metil-7-[(1 -iminoetil)amino]-5- heptenóico, 2-[[(1 R,3S)-3-amino-4- hidroxi-1 -(δ-tiazolil)-buti l]tio]-5- cloro-3-piridinocarbonitrile; 2-[[(1 R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1 -(5- tiazolil)butil]tio]-4-clorobenzonitrila, (2S,4R)-2-amino-4-[[2-cloro-5- (trifl uorometil)fenil]tio]-5-hiazolebutanol, 2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil) butil]tio]-6-(trifluormetil)-3 piridinocarbonitrila, 2-[[(1 R,3S)-3- amino-4-hidroxi- 1 -(5- tiazolil)butil]tio]-5-clorobenzonitrila, N-[4-[2-(3- clorobenzilamino)etil]fenil]tiofeno-2-carboxamidina, ou guanidinoetildis- sulfeto; • um inibidor de acetilcolinesterase tai como donepezil; • um antagonista subtipo 4 de prostaglandina E2 (EP4) tai como /V-[({2-[4-(2-etil-4,6-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-1 -il)fenil]etil}ami no)-carbonil]-4-metilbenzenossulfonamida ou ácido 4-[(1S)-1-({[5-cloro-2- (3-fluorfenoxi)piridin-3-il]carbonil}amino)etil]benzóico; • um antagonista B4 de leucotrieno; tal como ácido 1-(3- bifenil-4-ilmetil-4-hidroxi-croman-7-il)-ciclopentanocarboxilico (CP- 105696), ácido 5-[2-(2-Carboxietil)-3-[6-(4-metoxifenil)-5E- hexe- nil]oxifenoxi]-valérico (ONO-4057) ou DPC-11870, • um inibidor de 5-lipoxigenase, tai como zileuton, 6-[(3- fluor-5-[4-metoxi-3,4,5,6-tetraidro-2H-piran-4-il])fenoxi-metil]-1-metil-2- quinolona (ZD-2138) ou 2,3,5-trimetil-6-(3-piridilmetil),1,4-benzoquino na (CV-6504); • urn bloqueador de canal de sódio, tai como lidocaina; ou bupivacaina • um antagonista de 5-HT3, tai como ondansetron; • substituto de camada de glicosaminoglicano e antiinfla- matório, tai como pentosan polissulfato (Elmiron-marca registrada); • urn agonista beta-3, tai como YM-178 (mirabegron ou - 178 (mirabegron ou 2-amino-N-[4-[2-[[(2R)-2-hidroxi-2-feniletil]ami no]etil]fenil]- 4- tiazolacetamida), solabegron, KUC-7483 (ritobegron ou ácido 2-[4-[2-[[( 1 S,2R)-2-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-1 -metiletil]amino]etil]- 2,5-dimetilfenoxi]-acético) ou AK-134; • uma anti-histamina, tai como hidroxizina; • um antagonista de H2; tal como cimetidina; ou ranitidina • nitrato de prata; • um esteroide; • doxorrubicina; • sulfato de condroitina; • cromoglicato dissódico; • oxicloroseno (Clorpactin-marca registrada); e • um imunossupressor, tal como ciclosporina. e os sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos dos mesmos. Administração de um anticorpo anmarcadoronista anti-NGF
[001219] O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado a um indivíduo (para dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga) através de qualquer via adequada. Deve ser aparente a um versado na técnica que os exemplos descritos aqui não pretendem ser limitados, mas ilustrativos, das técnicas disponíveis. Desta maneira, em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é administrado a um indivíduo de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, como bolo ou através de infusão contínua durante um período de tempo, através de via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intraarticular, sublingual, intrasinovial, através de insuflação, intratecal, oral, inalação, transdermal ou tópica. Administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa, ou localizada. Nebuliza- dores comercialmente disponíveis para formulações líquidas, incluindo nebulizadores a jato e nebulizadores ultrassónicos são úteis para ad-ministração. Formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e pó liofilizado pode ser nebulizado após reconstituição. Alternativamente, anticorpo antagonista anti-NGF pode ser aerossolizado usando uma formulação de fluorcarbono e um inalador de dose medida ou inalado como um pó liofilizado e moído.
[001220] Em uma modalidade, um anticorpo antagonista anti-NGF é administrado através de técnicas de aplicação específica de sítio ou local direcionada. Exemplos de técnicas de aplicação específica de sítio ou local direcionada incluem várias fontes de depósito implantáveis do anticorpo antagonista anti-NGF ou cateteres de aplicação local, tais como cateteres de infusão, e cateter permanente, ou um cate- ter com agulha, enxertos sintéticos, wrapsadventícios, derivações e stentsou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos de sítio, injeção direta ou aplicação direta. Vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 00/53211 e Patente U.S. No. 5.981.568.
[001221] Várias formulações de anticorpo tal como E3 e fragmentos do mesmo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc) tal como proteínas de fusão de cadeia simples (ScFv), seus mutantes, compreendendo uma porção de anticorpo, e qualquer outra configuração modificada que compreenda um sítio de reconhecimento de GNF antígeno da especificidade requerida, podem ser usadas para administração. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado puro. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar formar ou consistência ou atuar como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, agentes de estabilização, agentes umectantes e emulsifi- cantes, sais para variação da osmolalidade, agentes de encapsulação, tampões e aumentadores de penetração da pele. Excipientes bem como formulações para aplicações de fármaco parenteral e não- parenteral são mostrados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy,20aEd., Mack Publishing (2000).
[001222] Em algumas modalidades, esses agentes são formulados para administração através de injeção (por exemplo, intraperitoneal- mente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc). Desta maneira, esses agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis tais como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e similar. O regime de dosagem particular, Istoé, dose, hora e repetição, vai depender do indivíduo particular e a história média daquele indivíduo.
[001223] Um anticorpo anti-NGF pode ser administrado usando qualquer método adequado, incluindo através de injeção (por exemplo, intraperitoneal mente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc). Anticorpos anti-NGF podem ser também administrados através de inalação ou através de outras formas de administração (por exemplo, oral, mucosal, sublingual), conforme aqui descrito. Em geral, para administração de anticorpos anti-NGF, uma dosagem candidata inicial pode ser cerca de 2 mg/kg.
[001224] Em uma modalidade preferida, a concentração do anticorpo a ser administrado pode variar de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 200 mg/ml. Preferivelmente, a concentração de anticorpo é cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 1 mg/ml, cerca de 2 mg/ml, cerca de 3 mg/ml, cerca de 4 mg/ml, cerca de 5 mg/ml, cerca de 6 mg/ml, cerca de 7 mg/ml, cerca de 8 mg/ml, cerca de 9 mg/ml, cerca de 10 mg/ml, cerca de 11 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 13 mg/ml, cerca de 14 mg/ml, cerca de 15 mg/ml, cerca de 16 mg/ml, cerca de 17 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 19 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 21 mg/ml, cerca de 22 mg/ml, cerca de 23 mg/ml, cerca de 24 mg/ml, cerca de 25 mg/ml, cerca de 26 mg/ml, cerca de 27 mg/ml, cerca de 28 mg/ml, cerca de 29 mg/ml, cerca de 30 mg/ml, cerca de 31 mg/ml, cerca de 32 mg/ml, cerca de 33 mg/ml, cerca de 34 mg/ml, cerca de 35 mg/ml, cerca de 36 mg/ml, cerca de 37 mg/ml, cerca de 38 mg/ml, cerca de 39 mg/ml, cerca de 40 mg/ml, cerca de 41 mg/ml, cerca de 42 mg/ml, cerca de 43 mg/ml, cerca de 44 mg/ml, cerca de 45 mg/ml, cerca de 46 mg/ml, cerca de 47 mg/ml, cerca de 48 mg/ml, cerca de 49 mg/ml, cerca de 50 mg/ml, cerca de 51 mg/ml, cerca de 52 mg/ml, cerca de 53 mg/ml, cerca de 54 mg/ml, cerca de 55 mg/ml, cerca de 56 mg/ml, cerca de 57 mg/ml, cerca de 58 mg/ml, cerca de 59 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cerca de 90 mg/ml, cerca de 100 mg/ml ou cerca de 110mg/ml. Mais preferivelmente, a concentração de anticorpo é selecionada do grupo compreendendo cerca de 2 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml, cerca de 5 mg/ml, cerca de 10 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 22 mg/ml e cerca de 50 mg/ml.
[001225] Em algumas modalidades, o padrão de administração do anticorpo anti-NGF compreende administração de uma dose uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, a cada 4 semanas, a cada 5 semanas, a cada 6 semanas, a cada 7 semanas, a cada 8 semanas, a cada 9 semanas, a cada 10 semanas, a cada 15 semanas, a cada 20 semanas, a cada 25 semanas ou mais. Em algumas modalidades, o anticorpo é administração uma vez a cada 1 mês, a cada 2 meses, a cada 3 meses, a cada 4 meses, a cada 5 meses, a cada 6 meses ou mais. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-NGF é administrado uma vez a cada 8 semanas. O progresso desta terapia pode ser monitorado através de técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o(s) antagonista(s) anti-NGF usado(s)) pode variar com o tempo.
[001226] Em algumas modalidades, o volume de uma dose é menos do que ou igual a cerca de 20 ml, cerca de 15 ml, cerca de 10 ml, cerca de 5 ml, cerca de 2,5 ml, cerca de 1,5 ml, cerca de 1,0 ml, cerca de 0,75 ml, cerca de 0,5 ml, cerca de 0,25 ml ou cerca de 0,01 ml. Em algumas modalidades o volume de a dose é cerca de 20 ml, cerca de 19 ml, cerca de 18 ml, cerca de 17 ml, cerca de 16 ml, cerca de 15 ml, cerca de 14 ml, cerca de 13 ml, cerca de 12 ml, cerca de 11 ml, cerca de 10 ml, cerca de 9 ml, cerca de 8 ml, cerca de 7 ml, cerca de 6 ml, cerca de 5 ml, cerca de 4 ml, cerca de 3 ml, cerca de 2 ml ou cerca de 1ml. Alternativamente cerca de 20,5 ml, cerca de 19,5 ml, cerca de 18,5 ml, cerca de 17,5 ml, cerca de 16,5 ml, cerca de 15,5 ml, cerca de 14,5 ml, cerca de 13,5 ml, cerca de 12,5 ml, cerca de 11,5 ml, cerca de 10,5 ml, cerca de 9,5 ml, cerca de 8,5 ml, cerca de 7,5 ml, cerca de 6,5 ml, cerca de 5,5 ml, cerca de 4,5 ml, cerca de 3,5 ml, cerca de 2,5 ml, cerca de 1,5 ml, ou cerca de 0,5. Alternativamente cerca de 900 μl, cerca de 800 μl, cerca de 700 μl, cerca de 600 μl, cerca de 500 μl, cer ca de 400 μl, cerca de 300 μl, cerca de 200 μl, ou cerca de 100 μl, al-ternativamente cerca de 950 μl, cerca de 850 μl, cerca de 750 μl, cerca de 650 μl, cerca de 550 μl, cerca de 450 μl, cerca de 350 μl, cerca de 250 μl, cerca de 150 μl, ou cerca de 50 μl. Mais preferivelmente, o volume da dose é menos do que ou igual a cerca de 2,5 ml.
[001227] De acordo com uma modalidade preferida a dose contém menos do que ou igual a cerca de 0,5 mg, cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 3 mg, cerca de 4 mg, cerca de 5 mg, cerca de 6 mg, cerca de 7 mg, cerca de 8 mg, cerca de 9 mg, cerca de 10 mg, cerca de 11 mg, cerca de 12 mg, cerca de 13 mg, cerca de 14 mg, cerca de 15 mg, cerca de 16 mg, cerca de 17 mg, cerca de 18 mg, cerca de 19 mg, cerca de 20 cerca de 24 cerca de 28 cerca de 32 cerca de 36 cerca de 40 cerca de 44 de 21 mg, de 25 mg, de 29 mg, de 33 mg, de 37 mg, de 41 mg, de 45 mg, cerca de 22 cerca de 26 cerca de 30 cerca de 34 cerca de 38 cerca de 42 cerca de 46 de 23 mg, de 27 mg, de 31 mg, de 35 mg, de 39 mg, de 43 mg, de 47 mg, cerca de 48 mg, cerca de 49 mg, cerca de 50 mg, cerca de 51 mg, cerca de 52 mg, cerca de 53 mg, cerca de 54 mg, cerca de 55 mg, cerca de 56 mg, cerca de 57 mg, cerca de 58 mg, cerca de 59 mg, cerca de 60 mg, cerca de 70 mg, cerca de 80 mg, cerca de 90 mg, cerca de 100 mg, ou cerca de 110mg de anticorpo. Mais preferivelmente a dose contém menos do que ou igual a cerca de 50 mg de anticorpo.
[001228] De acordo com uma modalidade preferida a dose contem uma quantidade de anticorpo que é cerca de 1 μg/kg, cerca de 10 μg/kg, cerca de 20 μg/kg, cerca de 50 μg/kg, cerca de 100 μg/kg, cerca de 200 μg/kg, cerca de 500 μg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg ou cerca de 11 mg/kg (de massa do mamífero ao qual a dose deve ser administrada).
[001229] Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que uma su-pressão de sintomas desejada aconteça ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam atingidos para reduzir dor. Em uma modalidade, um regime de dosagem pode compreender administração de uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-NGF, ou seguido por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg semana sim semana não. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis, dependendo do padrão de declínio farmacocinético que o praticante deseje atingir. Por exemplo, em algumas modalidades, a dosagem de uma a quatro vezes por semana é compreendida. Até mesmo dosagem menos frequente pode ser usada.
[001230] Para o propósito da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo antagonista anti-NGF vai depender do anticorpo (ou composições do mesmo) empregado, do tipo e da severidade da dor ou do sintoma do trato urinário inferior a ser tratado, seja o agente administrado para propósitos de prevenção ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do paciente e resposta ao agente e o critério do médico atendente. Tipicamente o clínico vai administrar um anticorpo antagonista anti-NGF até que uma dosagem seja atingida, a qual atinja o resultado desejado. Dose e/ou frequência pode variar durante o curso do tratamento.
[001231] Considerações empíricas, tal como a meia-vida, geralmente vão contribuir para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imune humano, tais como anticorpos humanizados ou anticorpos integralmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo e prevenir que o anticorpo seja atacado pelo sistema imune do hospedeiro. Frequência de administração pode ser determinada e ajustada durante o curso da terapia, e é geralmente, mas não necessariamente, baseada em tratamento e/ou supressão e/ou melhora e/ou retardo de dor. Alternativamente, formulações de liberação contínua sustentada de anticorpos antagonistas anti-NGF podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para atingir liberação sustentada são conhecidas na técnica.
[001232] Em alguns indivíduos, mais de uma dose pode ser requerida. Frequência de administração pode ser determinada e ajustada durante o curso da terapia. Por exemplo, frequência de administração pode ser determinada ou ajustada com base no tipo e na severidade da dor e/ou sintoma do trato urinário inferior a ser tratado, seja o agente administrado para propósitos de prevenção ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do paciente e resposta ao agente e o critério do médico atendente. Tipicamente o clínico vai administrar anticorpo antagonista anti-NGF (tal como E3), até que uma dosagem seja atingida, a qual atinja o resultado desejado. Em alguns casos, formulações de liberação contínua sustentada de anticorpos E3 podem ser apropri-adas. Várias formulações e dispositivos para atingir liberação sustentada são conhecidos na técnica.
[001233] Em uma modalidade, dosagens para um anticorpo antagonista anti-NGF podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administração(ões) de um antagonista de NGF. Os indivíduos recebem dosagens crescentes de um anticorpo antagonista anti-NGF. Para avaliar a eficácia de um anticorpo antagonista anti-NGF, um indicador de dor ou sintomas do trato urinário inferior pode ser seguido, tal como uma mudança em uma escala de classificação numérica (NRS), uma mudança no índice de Sintoma de Cistite Intersticial O'Leary-Sant (ICSI), uma mudança no índice de Problema de Cistite Intersticial O'Leary-Sant (ICPI), uma mudança no scorede sintoma de Dor Pélvica e Urgência/Frequência (PUF) e/ou mudanças nas variáveis de micção incluindo frequência de micção, frequência noturna, frequência de episódio de incontinência, volume médio esvaziado por micção, severidade da dor de cistite intersticial, episódios de urgência urinária, scorede distúrbio do sono médio, dor média associada com scorede dor de atividade sexual, avaliação de resposta global, avaliação de impacto de tratamento de relato patente, falha no tratamento, biomarcadores, pontos finais de segurança e/ou medidas farmacocinéticas. Biomarcadores podem incluir NGF, glico- proteína-51 (GP-51), fator antiproliferativo (APF) e fator de crescimento Epidermal HB (HB-EGF) dentre outros.
[001234] Administração de um anticorpo antagonista anti-NGF de acordo com o método na presente invenção pode ser contínuo ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do recipiente, seja o propósito da administração terapêutico ou profilático, e outros fatores conhecidos dos praticantes versados. A administração de um anticorpo antagonista anti-NGF pode ser essencialmente contí- nua durante um período pré-selecionado de tempo ou pode ser em uma série de dose espaçada, pro exemplo, ou antes, durante ou após desenvolvimento de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga; antes; durante; antes e após; durante e após; antes e durante; ou antes, durante e após desenvolvimento de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome de dor na bexiga.
[001235] Formulações terapêuticas do anticorpo antagonista anti- NGF usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento através da mistura de um anticorpo tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizadores farma-ceuticamente aceitáveis (Remington, The Science and Practice of Pharmacy,20° Ed., Mack Publishing (2000)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Em algumas modalidades, mais de um anticorpo antagonista anti-NGF pode estar presente. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco diferentes ou mais anticorpos antagonistas anti-NGF podem estar presentes. Em geral, esses anticorpos antagonistas anti-NGF têm atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Antagonistas de NGF podem ser também usados em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou complementar a eficácia dos agentes.
[001236] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer um e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes an- tibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similar que sejam fisiologicamente compatíveis. Tipicamente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidermal (por exemplo, através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, sua porção de ligação a antígeno, imu- noconjugado ou molécula bioespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
[001237] Veículos, excipientes ou estabilizados aceitáveis são não- tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e podem compreender tampões tal como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos orgânicos incluindo tampões de aminoácido; sais tal como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fe- nol, butil ou benzil álcool; alquil parabenos, tal como metil ou propil para be no; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; mo- nossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes que quelação tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não-iônicos tal como polisorbato, Tween®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
[001238] Em certas modalidades, os anticorpos do presente relatório podem estar presentes em uma forma neutra (incluindo formas zwitte- riônicas) ou como uma espécie negativamente carregada. Em alguns casos, os anticorpos podem ser complexados com um contra-íon para formar um sal farmaceuticamente aceitável. Então, os compostos farmacêuticos do relatório podem incluir um ou mais sais farmaceuti- camente aceitáveis.
[001239] Um "sal farmaceuticamente aceitável"refere-se a urn sal que retém a atividade biológica desejada do composto de origem (por exemplo, anticorpo) e não causa efeitos toxicológicos indesejados (vide, por exemplo, Berge, S.M. e outros (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Por exemplo, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" inclui um complexo compreendendo um ou mais anticorpos e um ou mais con- traíons, em que os contraíons são derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis.
[001240] Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácidos e sais de adição de base. Sais de adição ácidos incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não-tóxicos, tal como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodrídico, fosforoso e similar, bem como de ácidos orgânicos não-tóxicos tal como ácidos mono- e dicarboxíli- cos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos com fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similar. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tal como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similar, bem como de aminas orgânicas não-tóxicas, tal como N,N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dieta- nolamina, etilenodiamina, procaína e similar.
[001241] Ainda, bases inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem íons metálicos. íons metálicos incluem, mas não estão limitados a, sais de metal alcalino apropriados, sais de metal alcalino-terroso e outros íons de metal fisiologicamente aceitáveis. Sais derivados de bases inorgânicas incluem alumínio, amónio, cálcio, cobalto, níquel, molibdênio, vanádio, manganês, cromo, selênio, estanho, cobre, férri- co, ferroso, lítio, magnésio, sais mangânicos, manganosos, potássio, rubídio, sódio e zinco, e em suas valências comuns.
[001242] Sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis dos anticorpos da presente invenção podem ser preparados a partir dos ácidos que seguem, incluindo, sem limitação, ácido fórmico, acético, acetamidobenzóico, adípico, ascórbico, bórico, propiônico, benzóico, canfórico, carbônico, ciclâmico, desidrocólico, malônico, edético, etilsulfúrico, fendizóico, metafosfórico, succínico, glicólico, glucônico, láctico, málico, tartárico, tânico, cítrico, nítrico, ascórbico, glucurônico, maleico, fólico, fumárico, propiônico, pirúvico, aspártico, glutâmico, benzóico, clorídrico, bromídrico, iodrídico, lisina, isoctírico, trifluoracéti- co, pamóico, propiônico, antranílico, mesílico, orótico, oxálico, oxalacé- tico, oleico, esteárico, salicílico, aminosalicílico, silicato, p- hidroxibenzóico, nicotínico, fenilacético, mandélico, embônico, sulfôni- co, metanossulfônico, fosfórico, fosfônico, etanossulfônico, etanodis- sulfônico, amónio, benzenossulfônico, pantotênico, naftalenossulfôni- co, toluenossulfônico, 2-hidroxietanossulfônico, sulfanílico, sulfúrico, nítrico, nitroso, monometil éster do ácido sulfúrico, cicloexilaminossul- fônico, β-hidroxibutirico, glicina, glicilglicina, glutâmico, cacodilato, di- aminoexanóico, canforsulfônico, glucônico, tiociânico, oxoglutárico, piridoxal 5-fosfato, clorofenoxiacético, undecanóico, N-acetil-L- aspártico, ácidos galactárico e galacturônico.
[001243] Bases orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem trime- tilamina, dietilamina, N.N-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dibenzilamina, dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N- metilglucamina), procaína, aminas cíclicas, cátions de amónio quaterná-rio, arginina, betaína, cafeína, clemizol, 2-etilaminoetanol, 2- dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanodiamina, butilamina, etano- lamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, etilglucamina, glucamina, glicosamina, histidina, hidrabamina, imidazol, isopropilamina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piridina, piridoxina, neodímio, pipe- ridina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, tripropilamina, trietanolamina, trometamina, metilamina, taurina, colato, 6- amino-2-metil-2-heptanol, 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol, 2-amino-2- metil-1-propanol, ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanói- cos substituídos com fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos, estrôncio, tricina, hidrazina, fe- nilcicloexilamina, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico, bis(2-hidroxietil) amino-tris(hidroximetil)metano, ácido /V-(2-acetamido)-2-aminoetanossul fônico, ácido 1,4-piperazinodietanossulfônico, ácido 3-morfolino-2-hidroxi propanossulfônico, 1,3-bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano, ácido 4- morfolinopropanossulfônico, ácido 4-(2-hidroxietil)piperazino-1-etanossul fônico, ácido 2-[(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]etanossulfônico, ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico, ácido 4-(N- morfolino)butanossulfônico, ácido 3-(/V,/V-bis[2-hidroxietil]amino)-2-hidroxi propanossulfônico, ácido 2-hidroxi-3-[tris(hidroximetil)metilamino]-1-propa nossulfônico, ácido 4-(2-hidroxietil)piperazino-1-(2-hidroxipropanossulfô nico), diidrato do ácido piperazino-1,4-bis(2-hidroxipropanossulfônico), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinopropanossulfônico, N, N-bis(2- hidroxietil)glicina, ácido N-(2-hidroxietil)piperazino-N-(4-butanossulfôni co), ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanossulfônico, ácido N- tris(Hidroximetil)metil-4-aminobutanossulfônico, ácido N-(1,1 -dimetil-2- hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanossulfônico, ácido 2-(cicloexilamino) etanossulfônico, ácido 3-(cicloexilamino)-2-hidroxi-1-propanossulfônico, ácido 3-(cicloexilamino)-1-propanossulfônico, ácido /V-(2-acetamido) imi- nodiacético, ácido 4-(cicloexilamino)-1-butanossulfônico, A/-[tris(hidroxime til)metil]glicina, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol e trometamol.
[001244] Outras formulações incluem formas de aplicação adequadas na técnica incluindo, mas não limitado a, veículos tais como lipos- somas. Vide, por exemplo, Mahato e outros (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Preparações lipossomais incluem, mas não estão limitadas a, citofectinas, vesículas multilamelares e vesículas unilamelares.
[001245] Lipossomas contendo o anticorpo antagonista anti-NGF são preparados através de métodos conhecidos na técnica, AL como descrito em Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); e Patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são revelados na Patente U.S. No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para dar lipossomas com o diâmetro desejado.
[001246] Os ingredientes ativos podem ser também aprisionados em microcápsulas preparados, por exemplo, através de técnicas de coa- cervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, micro-cápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de aplicação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em microemul- sões. Tais técnicas são reveladas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy,20aEd., Mack Publishing (2000).
[001247] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista (tal como o anticorpo), cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou 'poli(vinil álcool)), polilactídeos (Patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não- degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sucrose e ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico.
[001248] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente conseguido através de, por exemplo, filtragem através de membranas de filtragem estéril.
[001249] Composições de anticorpo antagonista anti-NGF terapêuticas são geralmente postas em um recipiente tendo uma porta de acesso externa, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo uma rolha que pode ser furada por uma agulha de injeção hipodérmica.
[001250] Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma com-posição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispo-sitivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos revelados nas Patentes U.S. Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. No. 5.487.603, que revela uma bomba de microinfusão im- plantável para aplicação de medicação em uma taxa controlada; Patente U.S. No. 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. No. 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para aplicação de medicação em uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. No. 4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para aplicação de fármaco contínua; Patente U.S. No. 4.439.196, que revela um sistema de aplicação de fármaco osmótico tendo compartimentos multicâmara; e Patente U.S. No. 4.475.196, que revela um sistema de aplicação de fármaco osmótico. Muitos outros tais implantes, sistemas de aplicação e módulos são conhecidos daqueles versados na técnica.
[001251] As composições de acordo com a presente invenção podem estar em formas de dosagem unitária tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, para administração oral, parenteral ou retal, ou administração através de inalação ou insuflação.
[001252] Para preparar composições sólidas tais como comprimidos, o principal ingrediente ativo é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes de formação de comprimido convencionais tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável não-tóxico do mesmo. Quando se referindo a essas composições de pré-formulação como homogêneas, significa que o ingrediente ativo é disperso uniformemente na composição de maneira que a composição pode ser prontamente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. A composição de pré-formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem unitária do tipo descrito acima contendo de a partir de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou de outra maneira compostos para prover uma forma de dosagem dando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interno e um de dosagem externo, o último estando na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto para o duodeno ou ser retardado na liberação. Uma variedade de materiais pode ser usada pa- ra tais camadas e revestimentos entéricos, tais materiais incluindo vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais gomo verniz, álcool cetílico e acetato de celulose.
[001253] Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não-iônicos, tais como polietilenosorbitanos (por exemplo, Tween® 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, Span® 20, 40, 60, 80 ou 85). Composições com um agente tensoativo vão convenientemente compreender entre 0,05 e 5% de agente tensoativo, e podem estar entre 0,1 e 2,5%. Será compreendido que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.
[001254] Emulsões adequadas podem ser preparadas usando emulsões de gordura comercial mente disponíveis, tais como Intralipid®, Li- posyn®, Infonutrol®, Lipofundin® e Lipiphysan®. O ingrediente ativo pode ser ou dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou alternativamente ele pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de açafrão, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, óleo de milho ou óleo de amêndoa) e uma emulsão formada quando da mistura com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolipídeos de ovo, fosfolipídeos de soja ou lecitina de soja) e água. Será compreendido que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, gli- cerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões adequadas vão conter tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão de gordura pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 .□m, particularmente 0,1 e 0,5 .□m e têm um pH na faixa de 5,5 a 8,0.
[001255] As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas misturando um anticorpo anti-NGF com Intralipid® ou os seus componentes (óleo de soja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).
[001256] Composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes farmaceuticamente aceitáveis, aquosos ou orgânicos, ou misturas dos mesmos, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis conforme acima mostrado. Em algumas modalidades, as composições são administradas através da via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. Composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis estéreis podem ser nebulizadas através do uso de gases. Soluções nebulizadas podem ser respiradas diretamente do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser ligado a uma mascara para a face, tenda ou máquina de respiração por pressão po-sitiva intermitente. Solução, suspensão ou composições em pó podem ser administradas, preferivelmente oralmente ou nasalmente, a partir de dispositivos que liberam a formulação de uma maneira apropriada.
[001257] Eficácia de tratamento pode ser avaliada através de métodos bem conhecidos na técnica.
[001258] Um polinucleotídeo codificando qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção (tal como anticorpo E3) pode ser também usado para aplicação e expressão de qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção (tal como anticorpo E3) em uma célula desejada. É aparente que um vetor de expressão pode ser usado para direcionar a expressão de um anticorpo E3 ou polipeptídeo. O vetor de expressão pode ser administrado através de qualquer meio conhecido na técnica, tal como intraperitonealmente, intravenosamente, intra-muscularmente, subcutaneamente, intratecalmente, intraventricular- mente, oralmente, enteralmente, parenteralmente, intranasalmente, dermalmente, sublingualmente ou através de inalação. Por exemplo, administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, pistola de partícula ou administração cateterizada e administração tópica. Um versado na técnica é familiar com administração de vetores de expressão para ob- ter expressão de uma proteína exógena in vivo. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471.
[001259] Aplicação direcionada de composições farmacêuticas com-preendendo um polinucleotídeo codificando qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção (tal como anticorpo E3) pode ser também usada. Técnicas de aplicação de DNA mediadas por receptor são descritas em, por exemplo, Findeis e outros, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou e outros, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu e outros, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu e outros, J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; Wu e outros, J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia de gene. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 μg a cerca de 2 mg, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg e cerca de 20 μg a cerca de 100 μg de DNA podem ser também usadas durante um protocolo de terapia de gene. Os polinucleotídeos ou polipeptídeos terapêuticos da presente invenção podem ser aplicados usando veículos de aplicação de gene. O veículo de aplicação de gene pode ser de origem virai ou não- viral (vide geralmente Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Expressão de tais sequências de codificação pode ser induzida usando promotores de mamífero endógenos ou heterólogos. Expressão da sequência de codificação pode ser ou constitutiva ou regulada.
[001260] Vetores de base virai para aplicação de um polinucleotídeo desejado e expressão em uma célula desejada são bem conhecidos na técnica. Veículos de base virai exemplares, mas não são limitados a, retrovirus recombinantes (vide, por exemplo, Publicações PCT Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; U.S. Patent Nos. 5, 219,740; 4,777,127; Patente GB No. 2,200,651; e Patente EP No. 0 345 242), vetores baseados em alfa-vírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vetores do Virus do Rio Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e virus da encefa- lite equina Venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) e virus adenoassociados (AAV) (vide, por exemplo, Publicações PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). Administração de DNA ligado a adenovirus morto conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 pode ser também empregada.
[001261] Veículos e métodos de aplicação não-viral podem ser também empregados, incluindo, mas não limitado a, DNA condensado po- licatiônico ligado ou não-ligado a adenovirus morto sozinho (vide, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (vide, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células veí-culos de aplicação de célula eucariótica (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.814.482; Publicações PCT Nos. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nucléica ou fusão com membranas celulares. DNA nu pode ser também empregado. Métodos de introdução de DNA nu exemplares são descritos na Publicação PCT No. WO 90/11092 e Patente U.S. No. 5.580.859. Lipossomas que podem agir como veículos de aplicação de gene são descritos na Patente U.S. No. 5.422.120; Publicações PCT Nos. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e Patente EP No. 0 524 968. Abordagens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 e em Woffendina, Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:1581. Métodos de Diagnóstico e Usos
[001262] Os anticorpos descritos aqui podem ser também usados na detecção, no diagnóstico e monitoramento de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga associada com ex-pressão de NGF alterada ou aberrante (em algumas modalidades, ex-pressão de NGF aumentada ou diminuída (com relação a uma amostra normal) e/ou expressão inapropriada, tal como presença de expressão em tecido(s) e/ou célula(s) que normalmente não têm expressão de NGF, ou ausência de expressão de NGF em tecido(s) ou célu- la(s) que normalmente possuem expressão de NGF. Em algumas modalidades, expressão de NGF é detectada em uma amostra de um indivíduo suspeito de ter dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga.
[001263] Então, em algumas modalidades, a invenção provê métodos compreendendo contato de um espécime (amostra) de um indivíduo suspeito de ter expressão de NGF alterada ou aberrante com um anticorpo ou polipeptídeo da invenção e determinação de se o nível de NGF difere daquele de um espécime controle ou de comparação.
[001264] Em outras modalidades, a invenção provê métodos com-preendendo contato de um espécime (amostra) de um indivíduo e de-terminação do nível de expressão de NGF. Em algumas modalidades, o indivíduo é suspeito de ter dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga.
[001265] Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo tipicamente será marcado com uma porção detectável incluindo, mas não limitado a, radioisótopos, marcadores fluorescentes e vários marcadores de enzima-substrato. Métodos de conjugado de marcadores com um anti corpo são conhecidos na técnica. Em outras modalidades da invenção, anticorpos da invenção não precisam ser marcados, e a presença deles pode ser detectada usando um anticorpo marcador que se liga aos anticorpos da invenção.
[001266] Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitivos, ensaios sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
[001267] Os anticorpos podem ser também usados para ensaios de diagnóstico in vivo, tal como imagem in vivo. Em geral, o anticorpo é marcado com um radionuclídeo (tal como 1111na, 99Tc, 14C, 1311, 1251 ou 3H) de maneira que as células ou tecido de interesse podem estar localizados usando imunocintilografia.
[001268] O anticorpo pode ser também usado como reagente de fin-gimento em patologia, seguindo técnicas bem conhecidas no campo.
[001269] Com relação a todos os métodos descritos aqui, referência a anticorpos antagonistas anti-NGF também incluem composições compreendendo um ou mais desses agentes. Essas composições podem compreender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem conhe-cidos na técnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros métodos de tratamento convencionais.
Kits compreendendo anticorpos antagonistas anti-NFG para uso em detecção e/ou terapia
[001270] A invenção também provê kits compreendendo anticorpos para uso em detecção e/ou terapia. Desta maneira, em algumas modalidades, os kits compreendem um anticorpo E3. Em algumas modalidades, o kit compreende qualquer anticorpo ou polipeptídeo descrito aqui. Em outros aspectos, os kits podem ser usados para qualquer um dos métodos descritos aqui, incluindo, por exemplo, tratar um indivíduo com dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga. Os kits da invenção estão em embalagem adequada e podem opcionalmente prover componentes adicionais tais como tampões e instruções para uso do anticorpo em qualquer um dos métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, os kits incluem instruções para tratamento de dor ou sintomas do trato urinário inferior. Em algumas modalidades, o kit compreende um anticorpo antagonista anti-NGF descrito aqui e instruções para tratamento e/ou prevenção de dor e/ou sintomas do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga em um indivíduo. Em algumas das modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é anticorpo E3.
[001271] Em outro aspecto, a invenção provê kits compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo E3 conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, os kits compreendem instruções para uso do polinucleotídeo em qualquer um dos métodos descritos aqui.
[001272] Os exemplos que seguem são providos para ilustrar, mas não limitar, a invenção. Os exemplos na W02004/058184 são referidos para ilustrar os anticorpos para uso na presente invenção. O teor integral da W02004/058184 é aqui incorporado a título de referência. EXEMPLOS Exemplo 1: Humanização e maturação por afinidade de anticorpo anti- NGF antagonista de camundongo 911
A. Métodos gerais
[001273] Os métodos gerais que seguem foram usados neste exemplo. Geração de biblioteca
[001274] As bibliotecas foram geradas através de mutagênese de cassete de PCR com oligonucleotídeos degenerados conforme des- crito em Kay e outros (1996), Phage display of peptides and proteínas: a laboratory manual, San Diego, Academic Press (vide páginas 277- 291). O códon de dopagem NNK foi usado para aleatorizar uma posição de aminoácido para incluir 20 aminoácidos possíveis. Para aleatorizar uma posição de aminoácido para incluir apenas um subconjunto de aminoácidos com propriedades específicas, códons de dopagem foram usados conforme descrito em Balin e outros (1993) Gene 137(1): 109-18). Mutagênese direcionada a sítio foi realizada usando PCR recombinante conforme descrito em Innis e outros (1990) PCR protocols: A guide do methods and applications (vide pp. 177-183). Preparação de Fab em pequena escala
[001275] Expressão em pequena escala em placas de 96 cavidades foi otimizada para avaliação de bibliotecas de Fab. Partindo de E. coli transformada com uma biblioteca de Fab, as colônias foram colhidas para inocular ambas uma placa máster (Agar LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2%) e uma placa de trabalho (2 ml/cavidade, 96 cavi- dade/placa contendo 1,5 ml_ de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2%). Ambas as placas foram cultivadas a 30° C por 8-12 horas. A placa máster foi armazenada a 4o C e as células da placa de trabalho foram peletizadas a 5000 rpm e ressuspensas com 1 mL de LB+Ampicilina (50 pg+ml) + IPTG 1 mM para induzir expressão de Fabs. As células foram colhidas através de centrifugação após tempo de expressão de 5 horas a 30° C, então ressuspensas em 500 pL de tampão HBS-EP (tampão de HEPES 100 mM pH 7,4, NaCI 150 ml), P20 0,005%, EDTA 3 mM). A lise de células ressuspensas em HBS- EP foi conseguida por um ciclo de congelamento (-80° C) então descongelamento a 37° C. Os lisatos de célula foram centrifugados a 5000 rpm por 30 min para separar restos de célula de sobrenadantes contendo Fabs. Os sobrenadantes foram então injetados em aparelho de ressonância de plasmon BIAcore para obter informação de afinidade para cada Fab. Clones expressando Fabs foram resgatados da placa máster para sequenciar o DNA e para produção de Fab de grande escala e caracterização detalhada conforme descrito abaixo. Preparação de Fab em Grande Escala
[001276] Para obter parâmetros cinéticos detalhados, Fabs foram expressos e purificados de culturas grandes. Frascos Erlenmeyer con-tendo 200 ml_ de LB+Ampicilina (50 μg/ml) + Glicose 2% foram inocu-lados com 5 ml_ de cultura da noite para o dia de um clone de E. coli expressando Fab selecionado. Os clones foram incubados a 30° C até que um OD550 nm de 1,0 foi atingido e então induzido através de substituição do meio por 200 ml de LB+Ampicilina (50 μl/ml) + IPTG 1 mM . Após tempo de expressão de 5 horas a 30° C, as células foram peletizadas através de centrifugação, então ressuspensas em 10 mL de PBS (pH 8). A lise das células foi obtida através de dois ciclos de congelamento/descongelamento (a -80° C e 37° C respectivamente). O sobrenadante dos lisatos de célula foram carregados em colunas de sepharose de superfluxo Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA) equilibradas com PBS, pH 8, então lavadas com volumes de 5 colunas de PBS, pH 8. Fabs individuais eluíram em frações diferentes com PBS (pH 8) + Imidazol 300 mM. Frações contendo Fabs foram agrupadas e dializa- das em PBS, então quantificadas através de ELISA antes de caracterização por afinidade.
Preparação de anticorpo integral
[001277] Para expressão de anticorpos integrais, regiões variáveis de cadeias longa e curta foram clonadas em 2 vetores de expressão de mamífero (Eb.911.E3 ou Eb.pur.911.3E para cadeia curta e Db.911.3E para cadeia longa; descrito aqui) e transfectadas usando lipofectamina em células HEK 293 para expressão transiente. Os anticorpos foram purificados usando proteína A usando métodos padrão. Ensaio Biacore
[001278] Afinidades de Fabs anti-NGF e anticorpos monoclonais foram determinadas usando o sistema de ressonância de plasmon de superfície BIAcore3000® (SPR) (BIAcore, INC, Piscaway, NJ). Chips CM5 foram ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. NGF humano foi diluído em acetato de sódio 10 mM pH 4,0 e injetado no chip ativado em uma concentração de 0,005 mg/mL. Usando tempo de fluxo variável em todos os canais de chip individuais, duas faixas de densidade de antígeno foram conseguidas: 100-200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados e 500-600 RU para ensaios de avaliação. O chip foi bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração mostraram que uma mistura de tampão de eluição Pierce (No. do Produto 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e NaCI 4M (2:1) removeu eficazmente o Fab ligado enquanto mantendo a atividade de hNGF no chip por mais de 200 injeções. Tampão HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCI 0,5, EDTA 3 M, Tensoativo P29 0,005%) foi usado como tampão de administração para todos os ensaios BIAcore.
Ensaio de avaliação
[001279] Um ensaio BIAcore de avaliação foi otimizado para determinar a afinidade de clones de Fab de bibliotecas. Sobrenadantes de lisa- tos de cultura pequenos foram injetados a 50 μl/min por 2 min. Tempos de dissociação de 10 a 15 minutos foram usados para determinação de uma taxa de dissociação exponencial única (koff) usando software BIAe- valuation. Amostras que mostraram taxas kofr na mesma faixa que o mol-de usado para criar a biblioteca (clone 8L2-6D5, koff 1x10-3 s1) foram inje-tadas para confirmação e tempos de dissociação de até 45 minutos foram permitidos para obter valores koff melhores. Clones mostrando valores koff aperfeiçoados (mais lentos) foram expressos em grande escala e parâmetros cinéticos integrais, kon e koff, foram determinados em proteína purificada. O ensaio foi capaz de detectar diferenças em atividade que foram aproximadamente 2 vezes ou mais.
Ensaio de determinação de afinidade
[001280] Diluições seriais (KD estimada 0,1-10x) de amostras de Fab purificado foram injetadas por 1 min a 100 μL/min e tempos de disso-ciação de até 2 h foram permitidos. As concentrações das proteínas Fab foram determinadas através de ELISA e/ou eletroforese de SDS- PAGE usando como um padrão um Fab de concentração conhecida (conforme determinado através de análise de aminoácido). Taxas de associação cinética (kon) e taxas de dissociação (koff) foram obtidas simultaneamente através de aplicação dos dados a um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Ross, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology6. 99-10) usando o programa BIAeva- luation. Valores de constante de dissociação de equilíbrio (KD) foram calculados com koff/kon.
B. Humanização e maturação por afinidade de anticorpo anti-NGF an-tagonista de camundongo 911
[001281] O anticorpo anti-NGF antagonista de camundongo 911 (vide Hongo e outros (2000) Hybridoma 19(3):215-227) foi selecionado para humanização e maturação por afinidade. Mab 911 se liga a NGF humano e de rato com alta afinidade e não exibe nenhuma reatividade cruzada significante com as neurotrofinas NT3, NT4/5 ou BDNF. Vide Hongo, id. A afinidade do fragmento Fab clivado com papaína de camundongo Mab 911 foi determinada usando análise BIAcore conforme descrito acima. O fragmento Fab clivado com papaína de camundongo Mab911 ligado a NGF humano com KD de aproximadamente 10 nM.
[001282] Humanização e maturação por afinidade foram conduzidas em várias etapas, como segue:
(1) Preparação de molde enxertado com CDR.
[001283] As CDRs estendidas de cadeia curta de anticorpo 911 (isto é, incluindo ambas as regiões de CDR Kabat e Chothia) foram enxertadas nas sequências aceitadoras de linhagem germinativa humanas 08 com JK2 e as CDRs estendidas de cadeia longa de anticorpo 911 foram enxertadas em sequência aceitadora de linha germinativa humana VH4-59 com JH4. As sequências de aminoácido das sequências aceitadores de linha germinativa humana são mostradas nas figuras 1A e 1B da W02004/058184. A numeração de aminoácido é sequencial. Usando as estruturas principais de proteína mencionadas acima, sequências de DNA foram projetadas para genes sintéticos codificando estrutura principal humana com as CDRs de murino. Esses domínios variáveis pesados e curtas humanizados foram chamados hVH e hVL, respectivamente. Os códons foram otimizados para uso em E. colie hamster. Vários oligonucleotídeos de sobreposição (69-90 bases de comprimento) se estendendo o comprimento completo do hVL e hVH com dois primersde flanqueamento curto para cada cadeia foram usados para sintetizar separadamente os dois genes através de PCR recursiva essencialmente conforme descrito em Prodromous e outros (1992) Protein Eng.5(8):827-9. Fragmentos de DNA resultantes do comprimento completo foram purificados com gel e então clonados em um plasmídeo de expressão bicistrônico de E. coli (resistente à ampici- lina). A expressão dos anticorpos estava sob controle de um promotor lacZ induzível por IPTG similar àquele descrito em Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (vide Vector pComb3X, na página 2.10), no entanto, modificações incluem adição e expressão dos domínios adicionados que seguem: o domínio constante de cadeia curta capa humano (vide No. de Acesso GenBank No. CAA09181) e o domínio constante CHI de imunoglobulina humana lgG2a (No. de Acesso GenBank P01859).
[001284] As sequências de aminoácido das regiões variáveis do anti- corpo enxertado com CDR (também chamado "molde"), chamado 8L2- 4D5, são também mostradas nas figuras 1A e 1B da W02004/058184. A afinidade de 8L2-4D5 foi determinada usando análise BIAcore conforme acima descrito. NGF humano ligado a 8L2-4D5 com uma KD de aproxi-madamente 38 nM. (2) Introdução de uma mutação por ponto na sequência de estrutura principal.
[001285] A substituição V71K foi introduzida na cadeia longa enxertada com CDR usando mutagênese direcionada a sítio de PCR re- combinante conforme descrito em Innis e outros (1995) PCR strategies,San Diego, Academic Press. Esta substituição substituiu o resíduo de estrutura principal humana com o resíduo de estrutura principal de camundongo correspondente. O anticorpo resultante foi chamado 8L2-6D5, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia longa de 8L2-6D5 é mostrada na figura 1A da W02004/058184. A afinidade de 8L2-6D5 foi determinada usando análise BIAcore conforme acima descrito. O fragmento Fab de NGF humano ligado a 8L2-6D5 com uma KD de aproximadamente 15 nM. 8L2-6D5 foi escolhido como molde para maturação por afinidade. (3) Humanização e maturação por afinidade de CDRs L1, L2, H1 e H2.
[001286] CDRs L1, L2, H1 e H2 foram submetidas à humanização e maturação por afinidade. Posições de aminoácido em CDRs L1, L2, H1 e H2 foram identificadas, as quais não são essenciais para a estrutura das CDRs com base na estrutura canônica de Chothia (vide Al- Lazikani e outros (1997) J. Mol. Biol. 273(4):927-48); e submetidas à aleatorização como segue. Duas bibliotecas foram preparadas contendo as mutações de cadeia curta ou mutações de cadeia longa mostradas na Tabela 2, e a CDR L3 ou CDR H3 enxertada (de camundongo), respectivamente, usando mutagênese de cassete de PCR com oligo- nucleotídeos degenerados conforme descrito em Kay e outros (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, usando códons de dopagem conforme descrito em Balint e outros (1993) Gene 137(1): 109-18). Em geral, os resíduos de aminoácido foram alterados para resíduos que são mais comuns em anticorpos humanos, com base em alinhamentos de sequências de aminoácido de cadeia curta e cadeia longa 911 com sequências de anticorpo de linha germinativa humana. O resíduo de aminoácido do tipo selvagem (não-substituído) foi também representado na biblioteca com a exceção do resíduo de CDR H2 50, uma metionina, em que a metionina do tipo selvagem não foi representada na biblioteca. Resíduos de metionina são submetidos à oxidação; então, substituição deste resíduo foi esperada melhorar a estabilidade do anticorpo resultante. As bibliotecas de Fab foram clonadas em vetor pComb3X mais as regiões CH1 humana e Ck, conforme acima descrito. Tabela 2: nqa: 1. Biblioteca H1/H2 de cadeia lo CDR-H1 I34 foi mudado para F, L, V, S, P, T, A ou I N35 foi mudado para N, T, S ou Y CDR-H2 M50 foi mudado para todos os 20 aminoácidos naturais A62 foi mudado para A ou S L63 foi mudado para L ou V 2. Biblioteca L1/L2 de cadeia curta CDR-L1 S26 foi mudado para S, A, V ou F D28 foi mudada para D, A, S ou Y H32 foi mudado para H, N, K, D, E, Q ou Y CDR-L2 Y50 foi mudado para Y, D, A ou S 151 foi mudado para I, T, A ou V F54 foi mudado para F ou L S56 foi mudado para S e T
[001287] Para experimentos de avaliação de afinidade, cada biblioteca foi emparelhada mais com a cadeia curta ou longa enxertada com CDR correspondente (por exemplo, a biblioteca H1/H2 foi emparelhada com cadeia curta enxertada com CDR), o anticorpo foi expresso e afinidade para NGF humano dos clones individuais foi avaliado usando o sistema de ressonância de plasmon de superfície BIAcore (SPR) (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante e conforme acima descrito, koff, kon e KD foram determinadas. Clones de anticorpo foram classificados com base em taxas de kOff, uma vez que geralmente a maioria da variação em afinidade é vista em taxas koff, e ainda porque taxas kOff são independentes de concentração de anticorpo.
[001288] A sequência de clones que se ligou foi determinada e a se-quência de clones que se ligou é mostrada na Tabela 3. Tabela 3: Sequências de aminoácido l 1 e L2, sequências de aminoácido H1 e H2 e dados cinéticos para clones que se ligaram seguindo avaliação de afinidade de clones de biblioteca H1/H2 ou L1/L2.
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AA em negrito foram aleatorizados conforme indicado acima *KD calculada usando kon 4e4 M'1s'1 **Para conveniência, "e" conforme aqui usado significa "x10," Então, 4e4 significa intercomutavelmente 4x104.
[001289] CDRs contendo as substituições que seguem retiveram ligação: CDR-H1
[001290] I34: S, L, V, I e A se ligaram.
[001291] N35: N, T e S se ligaram. CDR-H2
[001292] M50: M, I, G, Q, S, L se ligaram.
[001293] A62: A e S se ligaram.
[001294] L63: L e V se ligaram. CDR-L1
[001295] S26: S, e F se ligaram.
[001296] D28: D, S, A, I se ligaram.
[001297] H32: H, N, Q se ligaram. CDR-L2
[001298] I50:1 se ligou
[001299] 151:1, T, V, A se ligaram.
[001300] F54: F se ligou.
[001301] S56: S e T se ligaram.
[001302] CDRs contendo as substituições que seguem foram seleci-onadas geralmente com base em afinidade de ligação e combinadas em um clone único, chamado H19-L129:
[001303] CDR-H1: I34L: N35N (nenhuma mudança)
[001304] CDR-H2: M50I; A62A (nenhuma mudança); L63V
[001305] CDR-L1: S26S (nenhuma mudança); D28S; H32N
[001306] CDR-L2: I50I (nenhuma mudança); 151T; F54F (nenhuma mudança); S56S (nenhuma mudança).
[001307] Essas mutações foram combinadas (através da amplificação das cadeias H e L através de PCR, cortando os produtos de PCR e vetor (pRN8) com enzima de restrição e realizando uma ligação de 3 fragmentos) em um clone único, chamado H19-L129, que também in- cluia as CDRs H3 e L3 enxertadas. A sequência das regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta de H19-L129 é mostrada nas figuras 1A e 1B da W02004/058184, e a Tabela 4 mostra a sequência de aminoácido de NGF ligado às CDRs L1, L2, H1 e H2, H19-L129 com uma KD de aproximadamente 1 nM, conforme determinado usando análise BIAcore conforme aqui descrito. Tabela 4: Sequência de aminoácido de CDRs H1, H2, L1 e L2 e dados cinéticos para clone H19-L129 combinado
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*KD calculada usando kon 4e4 M'1s'1 (4) Maturação por afinidade de CDRs H3 e L3.
[001308] Maturação por afinidade de CDRs H3 e L3 foi realizada em duas etapas. Primeiro, em um processo chamado "mutagênese de varredura de biblioteca", cada resíduo de aminoácido em H3 e L3 foi individualmente pré-avaliado a fim de identificar posições de aminoácido nas quais uma mutação resultou em afinidade de ligação aumentada a NGF humano. (k) Mutagênese de varredura de biblioteca
[001309] Cada posição de aminoácido nas CDRs H3 e L3 foi indivi-dualmente pré-avaliada quanto a substituições que resultaram em afi-nidade de ligação aumentada a NGF humano. A frequência de substi-tuições de aminoácido em qualquer dada posição que resultou em ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, pior ligação ou nenhuma ligação proveu informação com relação a posições nas CDRs que podem ser mudadas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos) e posições nas CDRs que não podem ser mudadas ou que podem ser apenas mudadas para alguns aminoácidos. Substituições de aminoácido resultando em afinidade de ligação aumentada foram também identificadas. Com base nos resultados desta avaliação, um subconjunto de posições de aminoácido em CDRs H3 e L3 foi selecionado para preparação de uma biblioteca de maturação por afinidade.
[001310] Bibliotecas de Fab individuais foram preparadas, em que cada aminoácido de CDRs L3 e H3 foi aleatorizado para todos os 20 aminoácidos, um de cada vez, resultando em várias bibliotecas pequenas (5 bibliotecas para a cadeia curta e 13 bibliotecas para a cadeia longa), cada uma com uma complexidade de 20 possibilidades de aminoácido em cada posição de aminoácido. Em todos os casos, o aminoácido nativo (isto é, sem modificação) foi representado na biblioteca. As bibliotecas foram preparadas através de mutagênese de casse de PCR com oligonucleotídeos degenerados conforme descrito em Kay e outros (1996), Phage display of Peptides and Proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, usando o códon de dopa- gem NKK para aleatorizar uma posição de aminoácido para incluir 20 aminoácidos possíveis. O 8L2-6D5 (o anticorpo enxertado com CDR, tendo a mutação de estrutura principal V71K) serviu como o molde para construção de biblioteca porque a atividade menor do anticorpo enxertado com CDR permitiu detecção mais fácil de diferença em afinidade em mutantes de H3 e L3 durante avaliação. Então, cada membro de uma biblioteca continha uma CDR3 (ou H3 ou L3) com uma substituição de aminoácido e 5 CDRs enxertadas.
[001311] 20-80 clones de cada biblioteca pequena foram avaliados usando análise BIAcore conforme aqui descrito. As amostras foram simultaneamente analisadas através de BIAcore para afinidade de ligação com NGF em um canal do chip BIAcore e quanto à presença de Fab através de ligação a um anticorpo penta-histag em outro canal do chip sensor, para detectar os marcador his no terminal C da cadeia longa. Os clones que expressavam proteína foram classificados como tendo a mesma afinidade, afinidade pior, afinidade melhorou nenhuma ligação, usando koff para classificar: Os resultados desta análise são mostrados na Tabela 5. Tabela 5: Clones que expressavam proteína foram classificados como tendo a mesma afinidade, afinidade pior, afinidade melhor ou nenhuma ligação, com base em koff
Figure img0007
[001312] A sequência de todos os clones com afinidade aperfeiçoada foi determinada, revelando a frequência e a identidade de substitui- ções de aminoácido que resultaram em afinidade aumentada. Ainda, alguns clones que retiveram uma afinidade similar ao clone 8I2-6D5 foram selecionados de cada biblioteca, a fim de averiguar substituições de sequência de aminoácido que eram permitidas em uma dada posição, mesmo que a substituição não tenha aumentando necessariamente a afinidade de ligação. Os resultados desta análise são suma- rizados na Tabela 16. Tabela 6.
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*KD calculada usando kon 4e4 M'1s'1
[001313] Várias mutações resultaram em afinidade de ligação aumentada. Pelo menos as mutações que seguem resultaram em afinidade de ligação significantemente aumentada comparado com o molde 8L2- 6D5: (H I101W (sequência de CDR GGIWIGTSIIFDI (SEQ ID NO:46)); H_S105A (sequência de CDR GGIIIGTAIIFDI (SEQ ID NO:47)); H_S105T (sequência de CDR GGIIIGTTIIFDI (SEQ ID NO:48)); H_G103A (sequência de CDR GGIIIATSIIFDI (SEQ ID NO:49); e L_S91E (sequência de CDR QQEKTLPIT (SEQ ID NO:50)).
[001314] Os resultados deste experimento foram usados para guiar a seleção de posições de aminoácido para geração das bibliotecas de maturação por afinidade.
[001315] Este experimento também proveu informação com relação à frequência de substituições de aminoácido em qualquer dada posição que resultou em ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, ligação pior ou nenhuma ligação, conforme mostrado na Tabela 5. Esta informação permitiu identificação de posições de aminoácido nas CDRs que poderiam ser mudadas para muito aminoácidos diferentes (incluído todos os 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que poderiam ser mudadas para alguns aminoácidos ou muitos poucos aminoácidos (em algumas modalidades, quaisquer aminoácidos). Esses resultados também demonstraram substituições de aminoácido que aumentaram a afinidade de ligação.
(I) Maturação por afinidade
[001316] Em seguida, os resultados da análise de aleatorização de biblioteca pequena (acima) foram usados para selecionar resíduos para produção das bibliotecas de H3 e L3 para maturação por afinidade das CDRs H3 e L3. Os resíduos Y101 e G103 de CDR H3 e resíduos S91 e K92 de CDR L3 foram selecionados para produção das bibliotecas de H3 e L3 para maturação por afinidade das CDRs H3 e L3.
[001317] A biblioteca combinava mutações em H3 e L3 ao mesmo tempo em clone enxertado com CDR, e separadamente na base do H19-L129, e tinha uma diversidade de 80 clones diferentes. A Tabela 7 mostra os resíduos de aminoácido selecionados quanto à substituição e os aminoácidos que foram substituídos em cada posição. Tabela 7. Resíduos de aminoácido em H3 e L3 selecionados quanto à substituição e os aminoácidos que foram substituídos em cada posição
[001318] CDR-H3:
[001319] Y101 foi mudado para Y e W, C. (Note que C foi incluído porque uso de códons TRS em um oligonucleotídeo degenerado também gerou códon C).
[001320] CDR-L3:
[001321] S91 foi mudado para E.
[001322] K92 foi mudado para todos os vinte aminoácidos. A, R, K e H se ligaram.
[001323] Cada polipeptídeo foi expresso como um Fab, e afinidade para NGF humano de 96 clones individuais foi avaliada para cada biblioteca usando análise BIACORE de acordo com as instruções do fabricante e descrito acima. Os resultados desta análise são mostrados na Tabela 8. Tabela 8.
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Figure img0010
*KD calculada usando kon 4e4 M'1s'1
[001324] Com base em afinidade de ligação, os melhores clones, E3 (intercomutavelmente chamado "3E") e 3C, foram selecionados para caracterização adicional. E3 compreendida as substituições de CDR que seguem: CDR-H3: I101W, G103A; e CDR-L3: S91E, K92H, que foram combinadas em um único clone que também incluía as mutações que seguem L1, L2, H1 e H2:
[001325] CDR-H1: I34L:
[001326] CDR-H2: M50I: L63V:
[001327] CDR-L1: D28S: H32N:
[001328] CDR-L2: 151T.
[001329] A sequência das regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta de E3 é mostrada nas SEQ ID NOs: 1 e 2 (vide também figuras 1A e 1B da W02004/058184). 3C compreendia as substituições de CDR que seguem: CDR-L3: S91E; K92R; CDRH3: I101W; G103A, que foram combinadas em um clone único que foi também incluído nas mutações de L1, L2, H1 e H2 descritas para o clone 3E.
[001330] As sequências de 3E e 3C foram clonadas em vetores de expressão de mamífero para produção de Fab e anticorpo integral e expressas em células HEK293 e purificadas usando cromatografia de Ni-NTA ou proteína A. Proteína pura foi quantificada com precisão através de análise de aminoácido.
[001331] As afinidades de ligação a NGF humano de Fabs E3 e 3C foram medidas usando análise BIAcore de acordo com as instruções do fabricante e conforme acima descrito, exceto que NGF de 100 RU foi usado em chip para prevenir um efeito de religação. Resumidamente, várias concentrações de anticorpos (Fabs) foram injetadas por 2 minutos em um chip CM5 com 100 RU de NGF humano imobilizado nele, e permitidas dissociar por 1800 segundos. Anticorpo de camundongo 911 (Fab) foi analisado como um controle. Os dados foram analisados usando software BIAevaluation seguindo as instruções do fabricante. Os resultados da análise de anticorpo E3 e 911 são mostrados nas figuras 9 e 10 da W02004/058184. NGF humano ligado a E3 com uma KD de aproximadamente 0,07 nM (e com um kon de cerca de 6,0 e 5M-1s- e um koff de cerca de 4,2e-5 s-1). 3C se ligou a NGF humano com uma KD de aproximadamente 0,35 nM (com uma koff de cerca de 1.4E'5). Em contraste, anticorpo de camundongo 911 se ligou a NGF com uma KD de 3,7 nM, koff de 8,4x10'5s'1 e kon de 2,2x104Ms-1.
[001332] O anticorpo E3 (intercomutavelmente chamado 3E) foi se-lecionado para análise adicional com base na afinidade de ligação alta. Para testar a habilidade de E3 em prevenir a interação de NGF com os receptores de NGF trkA e p75, 2,5 nM de NGF humano foram pré- misturados e incubados por uma hora com 0 a 50 nM de anticorpo E3 (Fab). Após a incubação, as amostras foram injetadas a 10 ul/minuto em um chip CM5 BIAcore contendo 260 RU de p75 (canal 2) e 600 RU de trkA (canal 3) e a ligação percentual foi determinada. Os resultados desta análise são mostrados na figura 11 da W02004/058184. Concentrações altas de Fab E3 bloquearam a interação de NGF com ambos p75 e trkA, conforme mostrado pelo sinal menor (medido em RU), indicando que FAB E3 bloqueia a interação de NGF humano com ambos o trkA e p75. Quando a concentração de anticorpo E3 (Fab) se igual à concentração de NGF (em concentração de NGF de cerca de 2,5 nM), nenhuma ligação de NGF foi observada (conforme mostrado por um sinal de zero). O fato que zero por cento de ligação a receptor de NGF aconteceu quando a concentração de NGF era igual à concentração de anticorpo 3E sugeriu que NGF 2,5 nM era pelo menos dez vezes maior que do a ko de E3 para NGF e em equilíbrio.
Exemplo 2: avaliação da habilidade de bloqueio de NGF de anticorpos anti-NGF usando ensaio de sobrevivência de neurônio trigeminal E13.5 de camundongo
[001333] A habilidade de Fab E3 ou anticorpo E3 integral em bloquear atividade de NGF foi avaliada através da medição da capacidade do anticorpo em inibir sobrevivência dependente de NGF de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo in vitro.O gânglio trigeminal é compreendido que neurônios sensoriais cutâneos que enervam a região facial. A sobrevivência de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo é um ensaio sensível para avaliar a atividade de bloqueio de NGF de anticorpos antagonistas anti-NGF porque o NGF é necessário para apoiar a sobrevivência desses neurônios. Por exemplo, em concentrações de saturação de NGF, a sobrevivência é próxima a 100% em 48 horas em cultura. Em contraste, menos do que 5% dos neurônios sobrevivem em 48 horas em ausência de NGF.
[001334] O ensaio de sobrevivência foi conduzido como segue: ca-mundongos-fêmeas Swiss Webster grávidos foram eutanizados por inalação de CO2. As trompas uterinas foram removidas e os embriões em estágio embriônico E13.5 foram extraídos e decapitados. Os gânglios trigeminais foram dissecados usando agulhas de tungsténio ele- troliticamente afiadas. Os gânglios foram tripnizados, mecanicamente dissociados e plaqueados em uma densidade de 200-300 células por cavidade em meio livre de soro, definido, em placas de 96 cavidades revestidas com poli-L-ornitina e laminina.
[001335] A atividade de bloqueio de Fabs ou anticorpos anti-NGF foi avaliada através da adição aos neurônios trigeminais doses variáveis de anticorpos anti-NGF Mab 911 (Fab), 8L2-6D5; H19-L129; E3 e 3C; e NGF humano ou de rato nas concentrações que seguem: 0,4 ng/ml (~15 pM; esta concentração representou uma concentração de saturação de NGF para sobrevivência) e 0,04 ng/ml (—1,5 pM; esta concentração é por volta da IC50). Após 48 horas em culturas, as células foram submetidas a um protocolo de imunocitoquímica automático realizado em uma estação de manuseamento de líquido Biomek FX (Beckman Coulter) como segue: fixação usando formaldeído 4%, sacarose 5% e PBS; permeabilização usando Triton X-100 0,3% em PBS); bloqueio de sítios de ligação não-específicos usando soro de cabra normal 5%, BSA 0,11% em PBS; e incubação sequencial com anticorpos primários e secundários para detectar neurônios. O anticorpo primário era anticorpo policlonal de coelho contra o produto de gene de proteína 89.5 (PGP9.5, Chemicon), um marcador neuronal estabelecido. O anticorpo secundário era anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), junto com o corante nuclear Hoechst 33342 (Molecular Probes) para marcar os núcleos de todas as células presentes na cultura. Aquisição de imagem e análise de imagem foram realizadas em um Discovery-I/Genll Imager (Universal Image Corporation). As imagens foram automaticamente adquiridas em dois comprimentos de onda para Alexa Fluor 488 e Hoechst 33342, com o fingimento nuclear sendo usado como um ponto de referência para o sis-tema de autofoco baseado em imagem do Imager, uma vez que fingi-mento nuclear está presente em todas as cavidades. Objetivos e número de sítios com imagem por cavidade apropriados foram selecionados para cobrir a superfície toda de cada cavidade. Análise de imagem automática foi ajustada para contar o número de neurônios presente em cada cavidade após 48 horas em cultura com base em seu tingimento específico com o anticorpo anti-PGP9.5. Limiarização cui-dadosa da imagem e aplicação de filtro de seletividade baseado em morfologia e intensidade de fluorescência resultaram em uma contagem precisa de neurônios por cavidade.
[001336] Os resultados deste experimento demonstraram que Fab E3 bloqueou a atividade de NGF com uma afinidade alta. Os resultados são mostrados nas figuras 4-6 da W02004/058184 e Tabela 9.
[001337] A figura 4 da W02004/058184 é um gráfico mostrando a sobrevivência dependente de NGF de neurônios E13.5 na presença de concentração variável de NGF humano e de rato.
[001338] A figura 5 da W02004/058184 é um gráfico comparando o efeito de bloqueio de NGF de vários Fabs na presença ou de 0,04 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 1,5 pM; mostrado no painel inferior) ou 0,4 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 15 pM; mostrado no painel superior). 1,5 pM de NGF estava em torno da EC50 de NGF promovendo sobrevivência, enquanto 15 pM representavam uma concentração de saturação de NGF. Sobrevivência de neurônios trigeminais de camundongo E13.5 em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 de murino; e Fab H19-L129 e Fab 8L2-6D5 foi avaliada conforme acima descrito. A IC50 (em pM) foi calculada para cada Fab em cada concentração de NGF e é mostrada na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente sobrevivência de neurônio trigeminal dependente de NGF humano, com uma IC50 de aproximadamente 21 pM na presença de 15 pM de NGF humano, e uma IC50 de aproximadamente 1,2 pM na presença de 1,5 pM de NGF humano. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente a sobrevivência de neurônio trigeminal dependente de NGF humano.
[001339] A figura 6 é um gráfico comparando o efeito de bloqueio de NGF de vários Fabs na presença ou de 0,04 ng/ml de NGF de rato (aproximadamente 1,5 pM; mostrado no painel inferior) ou 0,4 ng/ml de rato (aproximadamente 15 pM; mostrado no painel superior). 1,5 pM de NGF era em torno da EC50, enquanto 15 pM representaram uma concentração saturada de NGF. Sobrevivência de neurônios trigeminais de camundongo E13.5 em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 de murino; e Fab H19-L129 e 8L2-6D5 foi avaliada conforme acima descrito. A EC50 (em pM) foi calculada para cada Fab em cada concentração de NGF e é mostrada na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente sobrevivência de neurônio trigeminal dependente de NGF humano, com uma IC50 de aproximadamente 31,6 pM na presença de 15 pM de NGF de rato, e uma IC50 de aproximadamente 1,3 pM na presença de 1,5 pM de NGF de rato. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente sobrevivência de neurônio trigeminal dependente de NGF de rato. Tabela 9:
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[001340] Em um experimento diferente, a requerente comparou a habilidade de anticorpo integral E3 e Fab E3 em inibir sobrevivência dependente de NGF de neurônios E13.5 na presença de 0,4 ng/ml de concentração de saturação) de NGF humano. Os resultados da análi- se são mostrados na figura 10 da W02004/058184. Anticorpo E3 integral e Fab E3 mostraram níveis similares de inibição de sobrevivência dependente de NGF quando a concentração de anticorpo integral e Fab foi normalizada para o número de sítios de ligação de NGF (Fab tem um sítio de ligação e anticorpo integral tem dois sítios de ligação). Esses resultados demonstraram que não houve nenhum efeito de avidez devido à ligação de um anticorpo integral ao dímero de NGF.
[001341] Em outros experimentos, a requerente comparou a habilidade de várias concentrações (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 e 0,0 nM) de anticorpo E3, anticorpo 911 e um receptor trkA imunoa- desina (consistindo no domínio extracelular do receptor de NGF trkA fundido com o domínio Fc da imunoglobulina, CH2-CH3) para inbiir a sobrevivência dependente de NGF de neurônios E13.5 na presença de 0,4 ng/ml (condições de saturação). Esses resultados são mostrados na figura 11 da W02004/058184. Esses resultados demonstraram que o anticorpo E3 bloqueou NGF melhor do que ou o anticorpo 911 ou o trkA imunoadesina.
Exemplo 3: Avaliação da especificidade de anticorpo anti-NGF E3 usando trigeminal de camundongo e ensaios de sobrevivência de neu-rônio de nodose
[001342] A habilidade do anticorpo E3 em bloquear especificamente atividade de NGF foi avaliada através da medição da capacidade do anticorpo em inibir sobrevivência de neurônios trigeminais E17/18 in vitrona presença de concentrações de saturação de NGF, a neurotro- fina NT3 relacionada a NGF, ou o fator neurotrófico não-relacionado a NGF, proteína de estimulação de macrófago (MSP). A sobrevivência de neurônios trigeminais E17/18 de camundongo é um ensaio sensível para avaliar a atividade de bloqueio de NGF de anticorpos antagonistas anti-NGF porque NGF é necessário para apoiar a sobrevivência desses neurônios em concentrações mais altas do que o nível de NGF requerido para apoiar a sobrevivência de neurônios E13.5 TG. Sobre-vivência dos neurônios é também apoiada por NT3 ou MSP; desta maneira, a sobrevivência desses neurônios é também um ensaio sensível para avaliar se o anticorpo antagonista anti-NGF também bloqueou NT3 ou MSP.
[001343] A habilidade do anticorpo E3 em especificamente bloquear atividade de NGF foi também avaliada através da medição da capacidade do anticorpo em inibir sobrevivência de neurônios E17 de nodose na presença de concentrações de saturação de BDNF ou NT4/5. A sobrevivência de neurônios de nodose é apoiada por BDNF ou NT4/5; desta maneira, a sobrevivência desses neurônios é um ensaio sensível para avaliar a habilidade de bloqueio de BDNF ou NT4/5 do anticorpo antagonista anti-NGF.
[001344] O ensaio de sobrevivência foi conduzido como segue: camundongos-fêmeas Swiss Webster grávidos foram euta- nizados por inalação de CO2. As trompas uterinas foram removidas e os embriões (no dia embriônico 17 ou 18) foram extraídos e decapitados. Os gânglios trigeminais e de nodose foram dissecados e limpos. Os gânglios foram então tripnizados, mecanicamente dissociados e plaqueados em uma densidade de 100-300 células por cavidade em meio livre de soro, definido, em placas de 4 cavidades (Greiner) revestidas com poli-L-ornitina e laminina.
[001345] Neurônios trigeminais E17/18 foram cultivados ou sem fatores neurotróficos adicionados (controle negativo) ou na presença de concen-trações de saturação de NGF humano (400 pM e 15 pM) (controle positi-vo); ou MSP (600 pM). Culturas em duplicata foram ajustadas, as quais incluíam concentrações variáveis de Fabs E3 e 911 e anticorpos integrais. A concentração de Fab e anticorpos integrais foi indicada por sítio de ligação (por exemplo, um anticorpo integral contém dois sítios de ligação, enquanto um Fab contém um sítio de ligação).
[001346] Neurônios de nodose E17 foram cultivados ou na ausência de fatores neurotróficos adicionados (controle negativo) ou com con-centrações de saturação de BDNF (400 pM) (controle positivo) ou NT4/5 (400 pM) ou fator de crescimento ILF (\nterleukin Inhibitory Factor - fator inibidor de interleucina) não-relacionado a NGF. Concentrações altas de neurotrofinas foram usadas, uma vez que o objetivo do presente experimento era testar a especificidade dos anticorpos. Culturas em duplicata foram ajustadas, as quais incluíam variar novamente com e sem a adição de anticorpo E3 e 911. Após 48 horas em cultura o número total de neurônios que sobreviveram em cada cavidade sob cada condição foi averiguado por contagem manual usando um microscópio de contraste de fase.
[001347] Os resultados desses experimentos demonstraram que an-ticorpos E3 e 911 bloquearam completamente os efeitos de promoção de sobrevivência de NGF em neurônios trigeminais E18. Em contraste, anticorpos E3 e 911 não tiveram nenhum efeito sobre a sobrevivência de neurônios trigeminais promovido por NT3 ou MSP, ou sobrevivência de neurônios de nodose promovida por BDNF ou NT4/5 ou LIF. Esses resultados demonstraram que o anticorpo E3 possuía especificidade seletiva para NGF, uma vez que não havia nenhuma interação entre esses anticorpos e outras neurotrofinas relacionadas a NGF (NT3, NT4/5, BDNF) em concentrações de 1000 vezes a 10.000 vezes maior do que a concentração eficaz de bloqueio de NGF. Ainda, esses resultados demonstraram que a morte neuronal vista em culturas suplementadas com NGF de neurônios dependentes de NGF sobre a adição de anticorpo ou Fab E3 era devido a uma interação específica entre esses anticorpos e NGF e não era devido a um efeito tóxico generalizado. Anticorpo antagonista anti-NGF de camundongo 911 foi também testado e resultados similares foram observados. Note que devido às altas concentrações de neurotrofinas usadas, ambos os an- ticorpos E3 e 911 são muito próximos em suas condições de titulação e foram esperados se ligar a NGF em níveis similares porque a diferença em afinidade de ligação desses anticorpos a NGF seria menos aparente sob essas condições.
[001348] Os resultados desses experimentos são mostrados nas figuras 12, 13, 14 e 15 da W02004/058184. Os dados mostraram sobrevivência média percentual após 48 horas em cultura (± erro padrão de média, n=3 para cada ponto de dado) com relação à sobrevivência vista no controle positivo para cada experimento (por exemplo, 100% de sobrevivência de neurônios trigeminais cultivados na presença de concentração de NGF de saturação e 100% de sobrevivência de neurônios de nodose cultivados na presença de concentração de BDNF de saturação, respectivamente). As figuras 12-13 da W02004/058184 são gráficos mostrando que anticorpo antagonista anti-NGF E3 ou Fab E3 não inibiram a sobrevivência promovida por NT3, e MSP, mesmo em concentrações de anticorpo tão altas quanto 200 nM. Em contraste, 20 nM de anticorpo E3 ou Fab 3E e Fab 911 bloqueou totalmente a sobrevivência elicitada por NGF. Anticorpo antagonista anti-NGF de camundongo 911 foi também testado, e resultados similares foram observados. Especificamente, a figura 12 da W02004/058184 é um gráfico mostrando a comparação do efeito de várias concentrações (20 nM, 2 nM ou 0,2 nM) de Fab E3 (chamado "E3" na figura) e anticorpo de camundongo 911 Fab sobre a sobrevivência de neurônios trigeminais E18 na presença de nenhuma neurotrofina adicionada (chamado "controle"), NGF 400 pM (chamado "NGF-400pM), NT3 10 nM (chamado "NT3-10nM) ou MSP 600 pM (chamado "MSP-600 pM"). Afigura 13 da W02004/058184 é um gráfico mostrando a comparação dos efeitos de várias concentrações (200 nM e 80 nM) de Fab E3 e anticorpo integral e anticorpo de camundongo 911 anticorpo integral e Fab de sobrevivência de neurônios trigeminais E17 na presença de quais quer neurotrofinas adicionadas (chamadas "nenhum fator"), NGF 400 pM (chamado "NGF-400 pM"), NT 10 nM (chamado "NT3-10 nM) ou MSP 600 pM (chamado "MSP-600pM").
[001349] As figuras 14-15 da W02004/058184 são gráficos mostrando que anticorpo antagonista anti-NGFE3 ou Fab E3 não inibiu sobrevivência de neurônios de nodose E17 promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Anticorpo antagonista anti-NGF de camundongo 911 foi também testado, e resultados similares foram observados. Especificamente, a figura 14 da W02004/058184 é um gráfico mostrando comparação do efeito de várias concentrações (200 nM ou 80 nM) de anticorpo E3 integral (chamado "3E na figura"), Fab E3, anticorpo integral 911, ou Fab 911 sobre a sobrevivência de neurônios de nodose E17 na presença de quaisquer neurotrofinas adicionadas (chamados "sem fatores"), 400 pM de BDNF (chamado "BDNF-400 pM), 40 pM de NT4/5 (chamado "NT4/5-500 pM) ou 2,5 nM de LIF (chamado "LIP-2,5 nM). A figura 15 da W02004/058184 é um gráfico mostrando a comparação do efeito de várias concentrações (200 nM, 20 nM, 2 nM) de Fab E3 (chamado "3E na figura") ou Fab 911 sobre a sobrevivência de neurônios de nodose E17 na presença de quaisquer neurotrofinas adicionadas (chamado "controle"), 400 pM de BDNF (chamado "BDNF-400pM"), 400 pM de NT4/5 (chamado "NT4/5-400pM") ou 2,5 nM de LIF (chamado "LIF-2,5nM").
Exemplo 4: Preparação de vetores de expressão de mamífero e expressão de anticorpo E3 em células de mamífero
[001350] Três vetores de expressão de mamífero foram projetados e construídos para uso na expressão de anticorpo E3 em células de mamífero.
[001351] O vetor Db.911.3E é um vetor de expressão compreendendo a região variável de cadeia longa do anticorpo E3 e a região constante de lgG2a humana, e é adequada para expressão transiente ou estável da cadeia longa. Db.911.3E consiste em sequências de nucle- otídeo correspondendo às regiões que seguem: a região de promotor de citomegalovírus de murino (nucleotídeos 1-612); um íntron sintético (nucleotídeos 619-1507); a região de codificação de DHFR (nucleotídeos 707-1267); peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1525-1602); região variável de cadeia longa de anticorpo 3E (nucleotídeos 1603-1965); região constante de lgG2a de cadeia longa humana contendo as mutações que seguem: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à sequência de lgG2 do tipo selvagem; vide Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624); sinal de poliadenilação tardio SV40 (nucleotídeos 2974-3217); região aumentadora de SV40 (nucleotídeos 3218-3463); região f1 de fago (nucleotídeos 3551-4006) e região de codificação de beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos 4443-5300). Db.911.3E foi depositado no ATCC em 8 de janeiro de 2003 e recebeu o número de acesso ATCC PTA- 4895.
[001352] O vetor Eb.911.3E é um vetor de expressão compreendendo a região variável de cadeia curta do anticorpo E3 e a região constante de cadeia capa e é adequado para expressão transiente da cadeia curta. Eb.911.3E consiste em sequências de nucleotídeo correspondendo às regiões que seguem: a região de promotor de citomegalovírus de murino (nucleotídeos 1-612); íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619-1142); peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1173-1150); região variável de cadeia curta de anticorpo E3 (nucleotídeos 1251-1571); região constante de cadeia capa humana (nucleotídeos 1572-1892); sinal de poliadenilação tardio SV40 (nucleotídeos 1910-2153); região aumentadora de SV40 (nucleotídeos 2154-2399); região f1 de fago (nucleotídeos 2487-2942) e região de codificação de beta lactamase (AmpR)(nucleotídeos 3379-4236). EB.911.3E foi depositado no ATCC em 8 de janeiro de 2003 e recebeu o No. de Acesso ATCC No. PTA-4893.
[001353] O vetor Eb.pur.911.3E é um vetor de expressão compreendendo a região variável de cadeia curta do anticorpo E3 e a região constante capa humana e é adequado para expressão estável da cadeia curta. Eb.pur.911.3E consiste em sequências de nucleotídeo correspondendo às regiões que seguem: a região de promotor de citome- galovírus de murino (nucleotídeos 1-612); íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619-1758); região de codificação do gene PAC (puromici- naR)(nucleotídeos 739-1235); região 5'UTR hsp70 humana (nucleotídeos 1771-1973); peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1985-2062); região variável de cadeia curta de anticorpo E3 (nucleotídeos 2063-2383); região constante de cadeia capa humana (nucleotídeos 2384-2704); sinal de poliadenilação tardio de SV40 (nucleotídeos 2722-2965); região aumentadora de SV40 (nucleotídeos 2966-3211); região f1 de fago (nucleotídeos 3299-3654) e região de codificação de beta lactamase (AmpR)(nucleotídeos 4191- 5048). Eb.pur.911 .E3 foi depositado no ATCC em 8 de janeiro de 2003 e recebeu o No. de Acesso ATCC PTA-4894.
[001354] A expressão de célula transiente foi realizada como segue: células CHO e HEK293T em placas de 150 mm foram transientemente co-transfectadas com 25 ug de cada plasmídeo (isto é, um plasmídeo contendo a cadeia longa e um plasmídeo contendo a cadeia curta). DNA foi misturado com 100 ul de lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os complexos de DNA-lipídeo foram deixados contatar as células em meio DMEM/F12 sem soro ou antibióticos por 5 horas. Seguindo esta incubação, o meio foi mudado para expressão para Opti-MEM (Invitrogen) sem quaisquer aditivos por dois dias. Os sobrenadantes celulares contendo anticorpo foram coletados sequencialmente até quatro vezes com substituição de meio subsequente. Os sobrenadantes foram purificados através de croma- tografia de afinidade usando resina de Proteína A MapSelect (Amers- ham biosciences 17-5199-02). O anticorpo foi ligado à resina de proteína A em glicina 0,3M, tampão de NaCI 0,6M em pH 8, então eluído com tampão de citrato 0,1M em pH 3. As frações contendo anticorpo foram imediatamente neutralizadas com tampão Tris 1M em pH 8,0. As frações de anticorpo foram então dialisadas e concentradas em PBS.
Exemplo 5 - Estudo clínico
[001355] Pacientes com diagnóstico clínico de cistite intersticial são tratados com anticorpo antagonista anti-NGF E3 para confirmar a segu-rança e a eficácia do anticorpo anti-NGF anticorpo E3 no tratamento de um ou mais dor e sintomas do trato urinário associados com cistite inters-ticial e/ou bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga. Os pacientes a serem tratados terão cistite intersticial moderada a severa conforme definido por um scorede Dor Pélvica e Urgência/Frequência (PUF - Par-sons e outros, Urology2002;60:573-578)) de pelo menos 16 e um score de índice de Sintoma de Cistite Intersticial de O'-Leary (ICSI - O'Leary e outros. Urology 1997; 49(Supl. 5A):58-63) de pelo menos 8 na avaliação de pré-tratamento. Outros critérios de inclusão devem ser satisfeitos. Pa-cientes que não satisfazem todos os critérios de inclusão ou satisfazem um ou mais critérios de exclusão serão considerados uma falha de avali-ação e não serão aleatorizados no estudo.
[001356] A eficácia de uma dose única do anticorpo através de infusão comparado com um placebo no tratamento em sintomas de dor e do trato urinário inferior associados com cistite intersticial e/ou síndrome da bexiga dolorosa e/ou síndrome da dor na bexiga é avaliada. O anticorpo E3 é administrado intravenosamente aos pacientes em uma dosagem de 200 μg/kg. Em adição à eficácia, a magnitude de efeito de tratamento comparado com placebo; a resposta de biomarcadores para cistite intersticial para tratamento com o anticorpo; e a taxa de res posta de tratamento é avaliada, dentre outras medições. Os biomarca- dores incluem NGF, glicoproteína-51 (GP-51), fator antiproliferative (APF) e fator de crescimento epidermal HB (HB-EGF), dentre outros.
[001357] O ponto final primário é analisado 6 semanas após infusão intravenosa da dose única de anticorpo E3. Avaliações em 2, 10 e 16 semanas pós-dose são incluídas como pontos finais secundários. O ponto final primário será uma mudança em uma escala de classificação numérica de dor de 11 (NCS). Scorede índice de Sintoma de Cistite Intersticial O'Leary-Sant (ICSI) é usado como um ponto final secundário. Outros pontos finais secundários incluem índice de Problema de Cistite Intersticial O'Leary-Sant (ICPI - O'Leary e outros, Urology1997; 49(Supl.5A):58-63), ICSI mais ICPI, Dor Pélvica e Urgência/Frequência (PUF), dor diária média, variáveis de micção diárias registradas pelo paciente durante o período de estudo incluindo frequência de micção, frequência noturna, frequência de episódio de incontinência, volume médio esvaziado por micção, severidade da dor de cistite intersticial média, episódios de urgência urinária, scorede distúrbio do sono médio, dor média associada com scorede dor de atividade sexual, avaliação de resposta global, avaliação de impacto de tratamento relatado patente, falência do tratamento, biomarcadores, pontos finais de segurança e/ou medidas farmacocinéticas. Biomarcadores podem incluir NGF, glicoproteína-51 (GP-51), fator antiproliferative (APF) e fator de crescimento epidermal HB (HB-EGF), dentre outros.
[001358] Os dados que seguem são derivados de uma análise ínterim de um teste clínico em andamento usando o protocolo acima para avaliar segurança e eficácia de anticorpo E3 em pacientes com cistite intersticial/síndrome da bexiga dolorosa/síndrome da dor na bexiga (IC/PBS/BPS). Dados de 24 pacientes foram usados na análise ínterim. Uma melhora clara (redução) é vista em ambos os scores de NRS e ICSI de dor. A melhora observada em pacientes recebendo anticorpo E3 é maior do que aquela vista em pacientes recebendo placebo. Esses dados proveem apoio para o fato que o anticorpo E3 pode ser eficaz no tratamento da dor e outros sintomas do trato urinário inferior (LUTS) associados com IC/PBS/BPS. No entanto, o resultado do estudo final precisará ser avaliado.
Figure img0012
[001359] A dor foi avaliada usando uma escala de classificação numérica (NRS) de 11 pontos (0-10). Esta escala é validada e amplamente usada na avaliação de tratamentos direcionados ao alívio de dor.
[001360] O índice de Cistite Intersticial (ICSI) avalia a severidade de sintoma IC global, com scores variando de 0 a 20. Isto é baseado em 4 questões se relacionado à dor e LUTS associados com IC/PBS/BPS. Esses incluem medição da severidade de frequência urinária do dia e da noite, urgência urinária e dor na bexiga durante as 4 semanas anteriores.
Depósito de Material Biológico
[001361] Os materiais que seguem foram depositados com o American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA (ATCC):
Figure img0013
[001362] Detalhes com relação a esses depósitos podem ser encontrados na W02004058184, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Sequências de Anticorpo Região variável de cadeia longa (CDRs de Kabbat estão sublinhadas: CDRs de Chothia estão em NEGRITO E ITÁLICO) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSIJG/DLA/WIRQPPGKGLE- WIG/ZWGDGTTDZ/VSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTA- VIICARGG/IVMTSZZFDZWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:1) Região variável de cadeia curta (CDRs de Kabbat estão sublinhadas: CDRs de Chothia estão em NEGRITO E ITÁLICO) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCZMSQSZSAZAZLA/WIQQK- PGKAPKLLIIZTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TIICQQEH7LPZ7FGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO:2) CDRs estendidas de cadeia longa de E3 CDRH1: GFSLIGIDLN (SEQ ID NO:3) CDRH2: IIWGDGTTDINSAVKS (SEQ ID NO:4) CDRH3: GGIWIATSIIFDI (SEQ ID NO:5) CDRs estendidas de cadeia curta de E3 CDRL1: RASQSISNNLN (SEQ ID NO:6) CDRL2: ITSRFHS (SEQ ID NO:7) CDRL3: QQEHTLPIT (SEQ ID NO:8) CDRs estendidas de anticorpo 911 monoclonal de camundongo CDRs estendidas de cadeia longa de 911 CDRH1 : GFSLIGIDIN (SEQ ID NO:9) CDRH2 : MIWGDGTTDINSALKS (SEQ ID NO:10) CDRH3: GGIIIGTSIIFDI (SEQ ID NO:11) CDRs estendidas de cadeia curta de 911 CDRL1: RASQDISNHLN (SEQ ID N0:12) CDRL2: IISRFHS (SEQ ID N0:13) CDRL3: QQSKTLPIT (SEQ ID N0:14)
[001363] Sequência de aminoácido de cadeia longa de E3 (integral) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGIDLNWIRQPPGKGLE- WIGIIWGDGTTDINSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTA- VIICARGGIWIATSIIFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS- TSESTAALGCLVKDIFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLIS- LSSWTVPSSNFGTQTITCNVDHKPSNTKVDKTVERK- CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW- DVSHEDPEVQFNWIVDGVEVHNAKTKPREEQFNST- FRWSVLTWHQDWLNGKEIKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPRE- PQVITLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFIPSDIAVEWESNGQPEN- NIKTTPPMLDSDGSFFLISKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA- LHNHITQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)
[001364] Sequência de aminoácido de cadeia curta de E3 (anticorpo integral) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWIQQK- PGKAPKLLIIITSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TIICQQEHTLPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS- WCLLNNFIPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTIS- LSSTLTLSKADIEKHKVIACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:17)
[001365] Sequência de nucleotídeo de cadeia longa de E3 (anticorpo integral) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTT- CCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACT- TATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGG- GACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGAC- TATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACAC- CTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCG- CGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGG- TACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCAC- CCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTG- TCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCA- CAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAAC- CTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCG- TGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTAC- TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGG- CACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACA- CCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTG- TCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTT- CCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCA- GAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTG- TCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACG- GAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCA- GTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTG- CACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTG- TCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAA- GACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTG- CCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGA- CCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAG- TGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCAC- CCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATT- CCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACG- TGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTA- TACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA(SEQ ID NO: 65)
[001366] Sequência de nucleotídeo de domínio variável de cadeia longa de E3 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTT- CCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACT- TATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGG- GACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGAC- TATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACAC- CTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCG- CGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGG- TACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCAC- CCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:66)
[001367] Sequência de nucleotídeo de cadeia curta de E3 (anticorpo integral) GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTG- TGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCAT- TAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAG- CCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGG- TGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTT- CACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTA- TTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGT- CAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCAC- CATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCG- GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACG- CGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAA- TCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG- GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAG- CAGACTACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT- CAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGG- TGAGTGCTAA(SEQ ID NO:67)
[001368] Sequência de nucleotídeo de domínio variável de cadeia curta de 3E GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTG- TGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCAT- TAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAG- CCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGG- TGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTT- CACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTA- TTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGT- CAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGC(SEQ ID NO:68)
[001369] As sequências acima e outras sequências descritas aqui são providas na listagem de sequência em anexo. Texto livre de sequência
[001370] Sequências identificadas pelas SEQ ID NOs.: 1-8, 15-68, 70-72, 74-77 na listagem de sequência em anexo têm o texto livre "construto sintético".
[001371] É compreendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou mudanças à luz da mesma serão sugeridas a versados na técnica e devem ser incluídas no espírito e escopo do presente pedido.

Claims (22)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo antagonista anti-NGF e um veículo farma-ceuticamente aceitável para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo antagonista anti-NGF: (a) se liga a NGF com uma KD de menos do que cerca de 2 nM; (b) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF humano; e/ou (c) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 1,5 pM de NGF.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo mo-noclonal.
4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.
5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga a NGF humano.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a dor associa- da à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à sín-drome da dor na bexiga é selecionada do grupo compreendendo dor abdominal inferior (pélvica); dor na bexiga; dor suprapúbica; dor vaginal; dor no pênis, testículos, escroto e períneo; dor uretral; dispareneu- ria; dor, pressão ou desconforto que pode aumentar conforme a bexiga enche.
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga é selecionado do grupo compreendendo sintomas de armazenamento (irritative), esvaziamento (obstrutivo) e pós-micção.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o sintoma de armazenamento com-preende urgência, frequência, noetúria, incontinência de urgência e incontinência de estresse, que pode estar associado à bexiga hiperativa (OAB) e à hiperplasia prostática benigna (BPH).
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o sintoma de esvaziamento compreende hesitação, fluxo pobre, intermitência, tensão e disúria.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o sintoma pós-micção compreende gotejamento terminal, gotejamento pós-esvaziamento e uma sensação de esvaziamento incompleto.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo antagonista anti-NGF e um veículo far-maceuticamente aceitável para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo: (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:3; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo antagonista anti-NGF e um veículo far-maceuticamente aceitável para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo: (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:6; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:7; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:8, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o anticorpo antagonista anti- NGF compreende ainda uma região variável de cadeia longa compreendendo: (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:3; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo antagonista anti-NGF e um veículo far-maceuticamente aceitável para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:2, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo antagonista anti- NGF compreende as sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:1 e 2.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o anticorpo antagonista anti- NGF compreende as sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:16e 17.
17. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF ou uma com-posição farmacêutica conforme definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 16, e instruções para administração de uma quantidade eficaz do anticorpo a um indivíduo para uso no tratamento ou na prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga, em que o anticorpo antagonista anti-NGF: (a) se liga a NGF com uma KD de menos do que cerca de 2 nM; (b) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF humano; e/ou (c) inibe a sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 1,5 pM de NGF.
18. Uso de um anticorpo anti-NGF, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo.
19. Uso de um anticorpo anti-NGF, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de dor e/ou sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo anti-NGF: (a) se liga a NGF com uma KD de menos do que cerca de 2 nM; (b) inibe sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF humano; e (c) inibe sobrevivência dependente de NGF humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 1,5 pM de NGF.
20. Uso de um anticorpo anti-NGF, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia longa compreendendo: (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:3; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
21. Uso de um anticorpo anti-NGF, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de dor e/ou um sintoma do trato urinário inferior associado à cistite intersticial e/ou à síndrome da bexiga dolorosa e/ou à síndrome da dor na bexiga em um indivíduo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia curta compreendendo: (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:6; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:7; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:8, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.
22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-NGF compreende ainda uma região variável de cadeia longa compreendendo: (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID NO:3; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.
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