WO2014166029A1

WO2014166029A1 - 针对表皮生长因子受体的抗体

Info

Publication number: WO2014166029A1
Application number: PCT/CN2013/073811
Authority: WO
Inventors: 刘劼; 张卓兵; 单继宽; 索伟
Original assignee: 永卓博济(上海)生物医药技术有限公司; 上海众合医药科技有限公司
Priority date: 2013-04-07
Filing date: 2013-04-07
Publication date: 2014-10-16
Also published as: EP2985292A4; US9644031B2; BR112015025549A2; RU2015147913A; RU2652880C2; US20160017045A1; EP2985292A1; ZA201508035B

Abstract

提供了改进的EGFR抗体或其功能性片段，其包含经改造的重链和轻链。特别地，所述抗体为经改造的全人源单克隆抗体。还提供了制备所述全人源抗体的方法以及所述抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

Description

针对表皮生长因子受体的抗体

技术领域

本发明涉及新型表皮生长因子受体（ EGFR )抗体或其功能性片段及其用途。特别地，本发明涉及全人源 EGFR抗体或其功能性片段。本发明还涉及制备所述抗体的方法以及所述抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

抗体已用于治疗癌症以及免疫学或血管源性疾病。抗体-药物缀合物的应用允许靶向递送药物部分至肿瘤以及另一些患病组织，而全身施用非缀合药物试剂可能对正常细胞带来难以承受的毒性水平。天然抗体的基本单位是单体，其由通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链组成。存在至少 5 种不同类型的重链，即丫、 α、 δ、 μ和 ε, 其提供不同的效应子功能。重链 γ、 α和 δ具有 3个恒定结构域（C_H1、 C_H2和 C_H3 ) , 重链 μ和 ε具有 4个恒定结构域（C_H1、 C_H2、 C_H3和 C_H4 ) 。每条重链还具有一个可变结构域（V_H) 。存在至少两种类型的轻链，即 λ和 κ, 其中每种轻链包含一个恒定结构域（CJ和一个可变结构域（V_L) 。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，天然的人类抗体可归为 5类： IgG、 IgA, IgM、 IgD 和 IgE。这些类别中的几类可以进一步分为亚类或同种型，如 IgG IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA或 IgA2。典型的 I gG分子由两条重链 γ和两条相同的轻链（ λ或 κ )组成。二硫键连接轻链与重链以及重链之间。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域配对，轻链的可变结构域（VL)与重链的可变结构域（v_H) 配对，从而形成抗原识别位点。可变结构域（或 ) 的可变性在整个结构域中并非均匀分布的。通常集中于被称为高变区的 3 个片段。可变结构域的较为保守的部分被称为框架区 ( framework region, FR )。天然的重链和轻链的每个可变结构域包含 4个 FR, 所述 FR主要采取通过 3个高变区连接的 β片层结构，其形成连接 β片层结构以及在某些情形中形成部分 β片层结构的环。每条链中的高变区通过 FR紧密靠近，并且与另一链的高变区一起负责形成抗体的抗原结合位点。参见 Kabat et al.， SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。表皮生长因子受体 ( epidermal growth factor receptor, EGFR, HER1, c -ErbBl )是由 1186个氨基酸残基构成，分子量为 170 kD的一种跨膜糖蛋白。 EGFR分为月包夕卜区、跨月莫区和月包内区 3部分 ( Jorissen RN, Walker F， Pouliot N，等人, Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signaling . Exp Cell Res, 2003; 284: 31-53 )。 EGFR属于 I型酪氨酸激酶受体亚族（ErbB 1-4), 具有酪氨酸激酶的活性。 EGFR稳定的表达于许多上皮组织，以及间质和神经源性组织。不同器官发生的实体瘤也高表达 EGFR, 如头颈部癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌等（Mendelsohn J， Baselga J. Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer. J Clin Oncol, 2003; 21: 2787-2799 )。转化生长因子 α ( transforming growth factor a, TGF a ) 和表皮生长因子 ( epidermal growth factor, EGF )等生长因子是 EGFR的配体。这些配体与 EGFR的结合导致 EGFR二聚化，激活了受体胞内酪氨酸蛋白激酶的活性，使 C末端特异的酪氨酸残基磷酸化，为细胞内信号转导因子提供结合位点，由此启动 She, Grb2, Ras/MAPK, PI 3K及 JAKs/STATs等多条信号转导途径（ Mendelsohn J， Baselga J. Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer. J CI in Oncol, 2003; 21: 2787-2799; 以及 Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, 等人. The EerbB Signaling network: receptor heterodimerzat ion in development and cancer. The EMB0 J, 2000; 19: 3159-3167 )。 EGFR通过介导这些通路调节正常细胞的生长和分化，增加肿瘤细胞的侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡（ Castillo L, Etienne-Grimaldi MC, Fischel JL, et al. Pharmacological background of EGFR targeting. Ann Oncol, 2004; 15: 1007-1012 )₀ EGFR在肿瘤中的高度表达及其在肿瘤细胞生长、分化中起着重要作用的这些特点，使 EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和治疗的靶点。

近年来有越来越多证据表明表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor, EGFR)与许多肿瘤的发生和发展有关。在各种实体肿瘤中 EGFR表达率最高的是头颈部肿瘤，达 95%-100%。结直肠癌则为第 2位，表达率高达 72%-89%。 EGFR表达阳性的肿瘤具有恶性度高、侵袭力强的特点，而且 EGFR 表达水平的高低与预后相关。因而同样成为当前肿瘤分子靶向治疗的一个重要靶点。有依据证实 HER1/EGFR在实体肿瘤中表达异常，其临床体现为转移，生存期缩短，预后差，对化疗及激素治疗耐受。阻断 HER1/EGFR后能抑制肿瘤的形成，同时改善上述状况。

目前用于 EGFR靶向性治疗肿瘤的药物主要分为两类： EGFR单克隆抗体和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂。酪氨酸激酶拮抗剂主要为小分子喹啉类化合物，能够竟争性抑制 ATP与 EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基磷酸化，抑制 EGFR下游的信号转导。

EGFR单克隆抗体是与内源性配体竟争结合 EGFR, 通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进 EGFR内化等作用产生抗肿瘤效应。目前国内外已有 3种抗 EGFR单克隆抗体上市，与其他化疗药相比，这些抗体作用特异性强，副作用小，在临床上取得了较好的疗效。 EGFR是抗体药物开发的成熟靶点，作为抗肿瘤抗体药物开发的三个最大的成熟靶点 ( HER2, EGFR, VEGF )之一， EGFR靶点相关的靶向治疗药物包括抗体药物在肿瘤治疗中地位非常重要。由于目前已经上市的抗 EGFR抗体药物的局限性，研究开发高效低毒的新型抗 EGFR抗体药物一直是国际医药界研究的热点。

体外分析和动物体内试验表明， EGFR单克隆抗体爱必妥（cetuximab ) — 方面与 EGFR结合阻断磷酸化，抑制配体激活 EGFR的酪氨酸激酶活性，并促进 EGFR 的内吞和降解，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡；另一方面，爱必妥 ( cetuximab)通过招募自然杀伤（ NK )等细胞至肿瘤表面，进一步通过细胞毒作用抑制肿瘤细胞生长 ( Bleeker WK, Lammerts van Bueren JJ, van Ojik HH, Gerritsen AF, Pluyter M, Houtkamp M, Halk E, Goldstein J, Schuurman J, van Di jk MA, van de Winkel JG, Parren PW. Dual mode of act ion of a human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for cancer therapy. J Immunol. 2004; 173: 4699-707. )。结，可以发现,'各种抗 GFR单克隆、抗体在体内发挥治疗作用不但与其与 EGFR 的亲和力相关，同时还与 ADCC活性相关 (Patel D, Guo X, Ng S， Melchior M, Balderes P, Bur t rum D, Per saud K， Luna X, Ludwig DL, Kang X. IgG isotype, glycosylation, and EGFR express ion determine the induct ion of antibody—dependent cellular cytotoxicity in vitro by cetuximab. Hum Antibodies. 2010; 19: 89-99 )₀

再者，在不改变抗体三维立体结构的基础上，可以通过抗体工程技术，实现 IgG 抗体亚型之间的转换 ( Z Steplewski, L K Sun, C W Shearman, J Ghrayeb, P Daddona, and H Koprowski. Biological activity of human-mouse IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 chimeric monoclonal antibodies with antitumor specificity. PNAS 1988; 85 : 4852-4856 )₀ 目前，治疗性单克隆抗体随着技术的发展分成约 70%人源序列的嵌合抗体、 90-94%人源序列的人源化抗体，以及 100%人源序列的全人源抗体三个种类。人源序列比例的多少意味抗体用于人体治疗时潜在产生免疫原性可能性的高低，所以，全人源抗体产生免疫原性的可能性低于嵌合抗体，用作治疗性药物时全人源抗体优于嵌合和人源化抗体。

ADCC ( ant ibody-dependent cel l-mediated cytotoxic i ty , 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用）是指表达 IgG-Fc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的 I gG抗体的 Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。 IgG抗体可介导这些细胞发挥 ADCC 作用，其中 NK细胞是能发挥 ADCC作用的主要细胞。在抗体介导的 ADCC作用的发生过程中，抗体只能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，而 NK细胞等效应细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，故抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的， NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。

已经上市的几种抗 EGFR单克隆抗体药物仍存在许多不足。例如，爱必妥为人鼠嵌合 IgGl抗体，其具有相当程度的免疫原性，容易产生人抗鼠抗体反应，副作用较大，从而影响药效。帕尼单抗为全人源 IgG2 亚型抗体，但是其缺乏 ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）相关的生物学活性，仅仅依靠阻断 EGFR 信号通路来抑制肿瘤生长，而没有另一种 ADCC的肿瘤抑制作用机制，抗肿瘤效应较弱。

因此，仍然需要改进的抗 EGFR抗体来抑制肿瘤。本发明人出人意料地发现，利用抗体工程技术平台，将帕尼单抗由 IgG2亚型改变成为 IgGl亚型，形成全新序列的抗 EGFR全人源抗体分子，该抗体分子具有与帕尼单抗相同的靶点结合特性，同时由于抗体亚型不同，该抗体分子有更强的 ADCC生物学活性，与帕尼单抗相比抗肿瘤作用更强。此外，由于该抗体为完全人源的抗体分子，其免疫原性低于嵌合抗体爱必妥，潜在的临床应用副作用更低。因此，本发明的抗体汇集了现有技术中已知抗体的优点，获得了出人意料的技术效果。

发明内容

一般地，本发明提供了新的抗 EGFR抗体或其功能性片段，其一方面减少嵌合抗体的免疫原性副作用，另一方面通过改变 IgG抗体的亚型，提高抗体的抑制肿瘤效应。

在本发明之前，从未有人获得集中了现有技术中多种抗体产品之优点的抗 EGFR抗体。也就是说，从未有人获得既能够高水平结合 EGFR又具有 ADCC活性的全人源抗体。本发明人出人意料地，通过改造帕尼抗体的重链和轻链，特别地通过改变帕尼抗体的亚型，例如通过将帕尼抗体的重链 I gG2 恒定区替换为 IgGl 恒定区，任选地还通过优化重链和 /或轻链可变区之框架区，成功得到了集中了现有技术中多种抗体产品之优点的抗 EGFR抗体。在一些优选实施方案中，本发明提供了抗体亚型转换（例如从 IgG2转换为 I gGl ) 的抗体。在另一些优选实施方案中本发明还提供了具有经优化的重链和 /或轻链可变区之框架区的抗体。

在一个方面，本发明提供了能够结合 EGFR的抗体或其功能性片段，其包含重链和轻链，其中

( i ) 所述重链包含重链可变区和重链恒定区，其中所述重链可变区具有 SEQ ID N0: 5或SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列，并且所述重链恒定区为人 IgGl 的重链恒定区序列；并且

( ϋ )所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中所述轻链可变区具有 SEQ ID NO: 9或 SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段为全人源抗体或其功能性片段。优选地，所述

在另一些实施方案中，所述轻链恒定区为人 k轻链恒定区，例如其具有 SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列。

在又一些实施方案中，所述重链恒定区具有 SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。

在又一些实施方案中，所述重链具有 SEQ ID NO: 1或 2所示的氨基酸序列。在又一些实施方案中，所述轻链具有 SEQ ID NO: 3或 4所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有 ADCC活性。

在另一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段抑制 EGFR下游磷酸化。在又一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段抑制 EGFR信号转导。在另一个方面，本发明提供了编码根据本发明的抗体或其功能性片段的核酸分子。优选地，所述核酸分子编码本发明抗体或其功能性片段的重链和轻链。特别地，所述核酸分子是分离的核酸分子。

在又一个方面，本发明提供了核酸分子的组合，其包括：编码根据前述权利要求任一项所述抗体或其功能性片段之轻链的核酸分子和编码根据前述权利要求任一项所述抗体或其功能性片段之重链的核酸分子。特别地，所述核酸分子的组合是分离的核酸分子的组合。

在又一个方面，本发明提供了免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的本发明抗体或其功能性片段。在某些实施方案中，所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细毒剂。

在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的抗体或其功能性片段和 /或根据本发明的免疫缀合物，以及可药用载体。

在一些方面，本发明提供了治疗或预防与 EGFR异常表达相关的疾病或病症的方法，包括对受试者施用根据本发明的抗体或其功能性片段、缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症为肿瘤相关疾病。优选地，所述肿瘤相关疾病选自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和膀胱癌。

在又一些方面，本发明提供了在对象中抑制 EGFR下游磷酸化、抑制 EGFR 信号转导和 /或提高 ADCC的方法，其包括对受试者施用根据本发明的抗体或其功能性片段、缀合物或药物组合物。

在另一些方面，本发明提供了根据本发明的抗体或其功能性片段、核酸分子、核酸分子组合、缀合物或药物组合物在制备用于治疗或预防与 EGFR异常表达相关的疾病或病症的药物中的用途。

在又一些方面，本发明提供了根据本发明的抗体或其功能性片段、核酸分子、核酸分子组合、缀合物或药物组合物在制备用于在对象中抑制 EGFR下游磷酸化、抑制 EGFR信号转导和 /或提高 ADCC的药物中的用途。

在又一些方面，本发明提供了抗体或其功能性片段、核酸分子、核酸分子组合、缀合物或药物组合物，其用于治疗或预防与 EGFR异常表达相关的疾病或病症，或者在对象中抑制 EGFR下游磷酸化、抑制 EGFR信号转导和 /或提高 ADCC。

在某些具体实施方案中，根据本发明的抗体或其功能性片段是分离的。括如下步骤：

1) 根据 SEQ I D No.： 1-4的抗体序列, 设计应的 DNA序列；

2) 合成 DNA序列，可以通过分成几个片断合成后再连接成完整片断，或采用不同的引物，通过 PCR方法合成； 3 )将合成的抗体 DNA片段克隆至表达质粒中；

4) 转染至宿主细胞；

5 )培养转染后的宿主细胞，获得细胞培养上清，纯化获得目的抗体。附图说明

图 1所示为确定重链和轻链可变区序列的 PCR产物结果。

图 2所示为 SDS-PAGE凝胶确定所述抗体的蛋白电泳图。

图 3所示为 ELISA测定永卓 EGFR抗体与 EGFR-Fc结合的示意图。其结果表明永卓 EGFR抗体 1和 2都与帕尼单抗（ SY-puni )一样，有一致的 EGFR直接结合活力。说明永卓 EGFR抗体 1和 2识别 EGFR且亲和力与帕尼单抗相似。

图 4所示为 ADCC活力测定示意图。其结果表明永卓 EGFR抗体 1和 2都与爱必妥（ cetuximab )有相似的 ADCC活力，都显著高于帕尼单抗。

图 5所示为 EGFR抗体对 EGFR下游磷酸化的抑制作用的示意图，本实验通过 Wes tern Blot的方法检测总（ Tota l )EGFR和磷酸化后 EGFR。下图 Tota l EGFR 显示总 EGFR含量，包括磷酸化和磷酸后 EGFR。上图 pEGFR显示磷酸化后的 EGFR 含量。泳道 1 : 为分子量标记； 2： PBS加 EGF; 3: PBS未加 EGF ( 2 , 3 为 PBS 阴性对照）； 4: 爱必妥（erbi tux )未加 EGF; 5: 爱必妥加 EGF; 6 : 加永卓 EGFR 抗体 1 ; 7: 加永卓 EGFR抗体 2; 8: 加帕尼单抗（ SY-puni )。结果说明总 EGFR 不变的情况下（下图），永卓 EGFR抗体 1和 2、爱必妥（erbi tux )及帕尼单抗 ( SY-puni )都能够显著抑制 EGFR下游磷酸化，从而阻止信号途径，进一步证明永卓 EGFR抗体 1和 2具有 EGFR结合、抑制下游信号通路以及潜在的肿瘤细胞抑制作用。总抗体的阳性对照和 PBS的阴性对照说明本实验的有效性。具体实施方式

定义

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考 Current Protocol s in Molecular Biology ( Ausubel ) 。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代 20个常用 L-氨基酸之一的标准 3字母和 /或 1字母代码。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的 "1至 10" 的范围应认为包含最小值 1和最大值 10之间 (包含端点 )的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值 1或更大起始的子范围，例如 1至 6. 1 , 以及以最大值 10 或更小终止的子范围，例如 5. 5至 10。另外，任何称为 "并入本文" 的参考文献应理解为以其整体并入。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语 "或" 可与术语 "和 /或" 互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本文使用的术语 "药物组合物" 、 "组合药物" 和 "药物组合" 可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和 /或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分（例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和 / 或缀合物）可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、緩冲水溶液、、等渗盐溶液如 PBS (磷酸盐緩冲液）、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、 0. 3%甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或緩冲液物质作为添加剂。

根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。

本文使用的 "治疗有效量" 或 "有效量" 是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方（例如对剂量的决定等）最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本文使用的术语 "与 EGFR异常表达相关的疾病或病症" 旨在表示由 EGFR 异常表达所导致或者以 EGFR异常表达为症状 /特征的疾病或病症，优选地所述疾病或病症包括但不限于癌症和 /或肿瘤，例如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和膀胱癌等。

本文所使用的术语 "对象"是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物（如苍鹭、鹳、鹤等），家畜（如鸭、鹅等）或实验动物（如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地^^鼠等）。

本文所使用的术语 "功能性片段" 尤其是指抗体片段如 Fv、 scFv ( sc指单链）、 Fab、 F (ab， ) 2、 Fab' , scFv-Fc片段或者双抗体 ( diabody ), 或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚（亚烷基）二醇如聚乙二醇（ "聚乙二醇化， PEG化"）（被称为 Fv-PEG、 s cFv-PEG、 Fab-PEG、 F (ab 2-PEG 或 Fab -PEG的聚乙二醇化片段）（ "PEG" 为聚乙二醇），所述片段具有 EGFR结合活性。优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重或轻可变链的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于 EGFR, 优选至少等于其来源抗体亲和力的 1 / 100 , 在更优选方式中至少等于 1 /10。这种功能片段将包含最少 5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的 10、 15、 25、 50和 100个连续氨基酸。

提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。

实施例 1 : YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2抗体序列的设计和表达

本发明可采用本领域普通技术人员熟知的基因工程的方法制备目的全人源抗体，本实施例中仅描述采用通过 293-F细胞瞬时表达、获得分析检定用抗体样品的方法，然而，本领域技术人员将理解，也可以通过细菌、酵母、病毒和其它真核细胞表达系统来制备目的抗体，其中最优化的的制备系统是采用中华卵巢仓鼠细胞（CH0 )稳定细胞系，来制备、生产本全人源抗体。

1. 以下为帕尼单抗的重链可变区的序列（SEQ ID No: 5 ), 下划线部

以下为 I gG2的重链恒定区序列 ( SEQ ID No: 以 IgGl的重链恒定区序列 (SEQ ID No:

将其原有的重链 IgG2 恒定区序列改换成 IgGl恒定区序列，形成 YZ-EGFR vl 重链序列 ( SEQ ID No: 1 )。

将其原有的重链可变区的未优化框架序列改换成优化框架序列（SEQ ID No: 6 ),

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGGSVSSGDYYWTWIR QAPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCVRDRVTGAFDIWGQGTLVTVSS

再与重链 IgGl序列结合，形成 YZ-EGFR v2 重链序列（SEQ ID No: 2)。以下为帕尼单抗的轻链可变区的序列（SEQ ID No: 9 ), 下划线部分为框架序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY 以下为轻链恒定区 CL (k)序列（SEQ ID No: 11 ) SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

将其与轻链恒定区 CL (k)序列结合，即形成 YZ-EGFR vl轻链序列（ SEQ ID No: 3)。

将其原有的轻链可变区的未优化框架序列改换成优化框架序列（ SEQ ID No:

10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY 将其与轻链恒定区 CL ( k )序列结合，即形成 YZ-EGFR v2的轻链序列（ SEQ I D 4 )。

3 .抗 EGFR抗体 YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2的制备

本实施例描述采用通过 293-F细胞瞬时表达、获得分析检定用抗体样品的方法，也可以通过细菌、酵母、病毒和其它真核细胞表达系统来制备目的抗体，其中最优化的的制备系统是采用中华卵巢仓鼠细胞（ CH0 )稳定细胞系，来制备、生产本全人源抗体。

才艮据抗体 YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2重链可变区序列和轻链可变区序列，设计并合成编码重链和轻链可变区序列的 PCR引物寡核苷酸片段。相邻寡核苷酸片段约有 18个碱基重叠， PCR引物寡核苷酸片段一般长约 54个碱基。混合同等量的各个 PCR引物片段，进行重叠延伸 PCR反应。引物片段的核酸序列：

每个抗体序列有 8个（ 4对）引物序列，每对引物序列用来制备 YZ-EGFR VI 和 YZ-EGFR V2抗体的 VH和 VL小外显子 ( mini-exon )。

YZ-EGFR VI重链 ( V1-HC )：

引物 A 5' ：

引物 C 3' 引物 D 3'

YZ-EGFR V2重链 ( V2-HC ) 引物 A 5' ：

GAGGTGCAGTT

引物 B 5' ：

TGGCGATTACT

引物 C 5，：

TATAACCCCT

引物 D 5' ：

ACACGGCTGTG

引物 A 3' ：

CTGCTGACGGA

引物 B 3' ：

GTGTTCCCACT

引物 C 3' ：

CCTCGGCTCCA

引物 D 3' ：

YZ-EGFR VI轻链 ( Vl-LC ) 引物 A 5' ：

GACATCCAGAT

引物 B 5' ：

TACTTGAACTG

引物 C 5，：

AGGTTCAGCGG

引物 D 5' ： ATCACTTGCCCCTGGCATTCGGAGGCGGCACAAAGGTGGAGATTAAG 引物 A 3' ：

YZ-EGFR V2轻链 ( V2-LC )：

引物 A 5' ：

引物 D 5' ：

ACCATCTCCCGCTCGCTTTCGGACAAGGAACGAAGGTGGAAATCAAA

引物 A 3' ：

PCR反应体系： dNTPs 0.2 μΜ (最终浓度）；每个 PCR引物片段 1χ緩冲液 3 μ ΐ ；克隆的 pfu (Invitrogen) 1 μ 1 ；加水至 30 μ 1。 PCR反应条件： 94° C预变性 3 分钟后，设定 94° C变性 30 秒， 56° C 退火 30 秒， 72° C延伸 1 分钟，进行 30个循环，最后 72。 C再延伸 10 分钟。

PCR产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段，经 EcoRI酶切后，克隆到 pCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen) 载体中，转化到大肠杆菌 TOP010 (Invitrogen) 后在 LB/Kanamycin 平板上进行筛选，取 10个白色菌斑接种于含有 Kanamycin 的 LB液体培养液中培养，用 QIAGEN质粒提取试剂盒（ QIAquick PCR purification kit)提取质粒并进行测序，确定重链和轻链可变区序列。 PCR产物见图 1。

3. 构建表达载体

从正常人 B细胞分离 RNA, 用 PCR方法获得人 IgGl重链恒定区 Fc片段和轻链恒定区 κ片段，并将其预先构建到 pcDNA3.1 (Invitrogen) 表达载体中，经 DH5_a 细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。 YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2 的重链可变区由 Eco47III/NheI (来自 Invitrogen) 从 pCR-Bluntll-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入 pcDNA3.1 - Fc表达载体中。 YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2 的轻链可变区由 AscI/BsiWI (来自 Invitrogen)从 pCR-Bluntll-TOPO 的阳性克隆切下，克隆连入 pcDNA3.1 - κ表达载体中。再次经过 DH5_a 细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。测序结果与记录的抗体的编码序列一致。

4. 抗体表达

为表达重组 YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2, 分别^ ¹ YZ-EGFR VI和 YZ-EGFR V2 轻链和重链质粒共转染至 293-F细月包 ( 293fectin, 购自 Invitrogen公司）中，采用 FreeStyle 293 Express ion培养基（购自 Invitrogen公司）、 100 ml 培养瓶培养转染后的细胞 5 天，离心、 0.22um膜过滤后收集培养上清，采用 Protein A柱（ 5 ml MabSelect预装柱，购自 GE Biosciences公司 ) 纯化，具体步骤如下：用 10个柱体积（10 CV)平衡緩冲（20 mM磷酸緩冲， 150 mM NaCl, pH7.0)后， 2 ml/分钟的流速将过滤后上清上柱，采用平衡緩冲（20 mM 磷酸緩冲， 150 mM NaCl, pH7.0) 冲洗 10个柱体积（ 10 CV )后，用洗脱緩冲 ( 10mM柠檬酸钠， H3.5 ) 洗脱 5个柱体积，将洗脱的抗体采用 1 M TrisHCl, pH8.0中和 pH至 6.5, 然后透析纯化后的抗体至 PBS中，用紫外法（280 nm波长）测定抗体浓度， SDS-PAGE 法（图 2)测定抗体纯度。收集细胞培养上清分两次 Protein A纯化完成，透析至 PBS的纯化后抗体经 0.22 讓膜过滤，用于各项研究工作,

实施例 2： ELISA检测对 EGFR的结合

材料：

永卓 EGFR抗体 -1 ( YZ-EGFR VI ); 永卓 EGFR抗体 -2 ( YZ-EGFR V2 ); 帕尼单抗 ( SY-puni , 来自 Amgen公司 ); EGFR-Fc (来自 Thermo Fi sher公司）方法：使用直接法 ELISA按如下步骤测定

1、用 1 g/ml EGFR-Fc包被 ELISA板， 50 μΐ/孔， 4 °C过夜（约 16小时）。

2、用含 1% BSA的 TBS封闭 ELISA板上的非特异性位点， 37 °C , 1小时。 3、除去 ELISA板水分，用 2 x TBST洗脱緩冲液洗涤。

4、用 1% BSA/TBS溶液封闭一个转移盘， 200 μΐ/孔， 37 °C , 1小时。

5、以 3 g/ml的初始浓度开始，在 1% BSA/TBS预封闭的转移盘里准备一系列以 1: 3稀释的抗体测试实验。每个抗体准备 8个浓度梯度，终体积 180 μΐ/ 孔。

6、在包被了 EGFR-Fc的 ELISA板（见 1-3步）中加不同浓度（按第 5步方法加）抗体， 50 μΐ /孔， 37 °C孵育 1小时，重复测定样品一次。

7、去除 ELI SA板水分，用 4 X TBST洗涤。

8、用 1% BSA/TBS 1: 1000稀译驴抗人 IgG-AP二抗， 50 μΐ/孔， 37 °C孵育 1小时。

9、使 ELISA板干燥后，用 5 x TBST洗涤。

10、加 50 μΐ /孔含 0. 1% ΡΝΡΡ底物的 ΡΝΡΡ緩冲液， 37 °C孵育 15分钟。加入 50 μΐ /孔的在 ΡΝΡΡ緩冲液中的 0. 1% ΡΝΡΡ底物。在 37 °C孵育 15 分钟。

11、加 50 μΐ /孔 1N 氢氧化钠终止反应。

12、在 ELISA酶标仪上 405 讓处读取吸光度。

13、记录并分析数据。

此测定结果见图 3。图 3表明永卓 EGFR抗体 1和 2都与帕尼单抗（ SY-puni ) 一样，有一致的 EGFR直接结合活力，说明永卓 EGFR抗体 1和 2识别 EGFR且亲和力与帕尼单抗相似。实施例 3: 体外抗 EGFR抗体的 ADCC反应

材料：

永卓 EGFR抗体 -1 ( YZ-EGFR VI ); 永卓 EGFR抗体 -2 ( YZ-EGFR V2 ); 帕尼单抗 ( SY-puni, 来自 Amgen公司 ); 爱必妥（cetuximab, 来自 Imclone公司；钙黄绿素 -AM( Invitrogen公司）；圓底 96孔盘（BD科学），外周血单核细胞（ PBMC ) 购自 AllCells公司（健康捐赠者）。

方法：按如下步骤利用钙黄绿素 -AM译放法测定 ADCC

1. 用钙黄绿素 -AM标记 A431(人表皮癌细胞）细胞（15 M/106 细胞），洗涤，在圓底 96孔盘里加 5 xl03 细胞 /孔，一式三份。

2. 加抗 EGFR抗体（0.1 和 1 g/ml) , 与标记过的 A431在 4°C预共孵育 30分钟。

3. 第 2步后，加从健康捐献来源的 PBMC效应细胞，最终效应为：在 200 ul/孔的终体积中，靶标细胞 (标记的 A431 )与效应细胞 ( PBMC )比率为 40: 1。

4. 特异性裂解率 = (AFU 平均实验译放 AFU 平均自发译放 ) / (AFU 平均最大译放 AFU 平均自发释放）。

此测定结果见图 4。图 4 结果表明永卓 EGFR 抗体 1 和 2 都与爱必妥 ( cetuximab )有相似的 ADCC活力，且都显著高于帕尼单抗。

实施例 4: EGFR的磷酸化

材料：

永卓 EGFR抗体 -1 ( YZ-EGFR VI ); 永卓 EGFR抗体 -2 ( YZ-EGFR V2 ); 帕尼单抗 (SY_puni,来自 Amgen公司 );爱必妥 (erbitux, cetuximab,来自 Imclone 公司）； A431 细胞（来自 ATCC 号： CRL-2592 ); 重组人表皮生长因子（来自 R&D公司）；细胞裂解緩冲液（10 X) (来自 Cell Signalling); BCA试剂盒（来自 Pierce); 抗 -pEGFR (pY 1068)和泛抗 EGFR (来自 CST公司）。

方法，步骤如下：

1. 每块 6 孔板接种 5xl0⁵ 个 A431 细胞，用完全培养基培养过夜 (DMEM+10% FBS)。

2. 换用 2 ml DMEM 中培养，使细胞缺乏营养 16-18小时。以 2 ml DMEM 使细胞饥饿 16-18 小时。

3. 再换用 1 ml预热新鲜的培养基（不含 10% FBS)培养，孵化器中孵育 1-2小时。

4. 在用重组 EGF (表皮生长因子）刺激前 30分钟，加 10 g/ml 抗 EGFR 抗体 (终浓度 )到 A431细胞。

5. 用溶解于 PBS + 0. 01% BSA 的终浓度为 0. 5 ng/ml 的 EGF刺激细胞 5分钟。

6. 把盘放在冰上，用预冷的 1 X PBS 洗 3遍。

7. 加 250 μΐ 裂解液裂解后直接刮下来，涡旋或在冰上孵育 30分钟。

8. 离心， 14000 rpm, 4 °C， 15 分钟。

9. 蛋白定量，用 BCA试剂盒。

10. 用合适体积的荷载緩冲液（ loading buffer )调整每个蛋白裂解液的体积，煮 5分钟。

11. 倒 10孔的凝胶做 Wes tern Blot , 每个孔载入 20 克裂解液。

本实 3 通过 Wes tern Blot的方法检测总（ Tota l ) EGFR和磷酸化后 EGFR。图 5中下图 Tota l EGFR显示总 EGFR含量，包括磷酸化和磷酸后 EGFR。上图 pEGFR 显示磷酸化后的 EGFR含量。

图 5说明总 EGFR不变的情况下（下图），永卓 EGFR抗体 1和 2、爱必妥 ( erbi tux )及帕尼单抗（ SY-puni )都能够显著抑制 EGFR下游磷酸化，从而阻止信号途径，进一步证明永卓 EGFR抗体 1和 2具有 EGFR结合、抑制下游信号通路以及肿瘤细胞抑制作用。总抗体的阳性对照和 PBS的阴性对照说明本实验的有效性。

因此，以上实施例显示，本发明出人意料地发现，通过对帕尼单抗进行改造，成功地获得了集中了现有技术中多种不同抗体产品之优点的抗 EGFR抗体。本发明的抗体既

以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如 "包含"、 "含" 和 "包括" 不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及 "或"、 "或者" 意指 "和 /或"。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。

本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。

Claims

权利要求

1. 能够结合表皮生长因子受体（EGFR ) 的抗体或其功能性片段，其包含重链和轻链，其中

( i ) 所述重链包含重链可变区和重链恒定区，其中所述重链可变区具有 SEQ ID NO:5或 SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，并且所述重链恒定区为人 IgGl 的重链恒定区序列；并且

( ii ) 所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中所述轻链可变区具有 SEQ ID NO:9或 SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列。

2. 根据权利要求 1所述的抗体或其功能性片段，其为全人源抗体或其功能性片段。

3. 根据前述权利要求任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链恒定区为人 k轻链恒定区，例如其具有 SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列，和 /或所述重链恒定区具有 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

4. 根据前述权利要求任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链具有 SEQ ID ΝΟ: 1或 2所示的氨基酸序列，和 /或所述轻链具有 SEQ ID NO:3或 4 所示的氨基酸序列。

5. 根据前述权利要求任一项所述的抗体或其功能性片段，其具有 ADCC 活性。

6. 核酸分子，其编码根据前述权利要求任一项所述的抗体。

7. 核酸分子的组合，其包括：编码根据权利要求 1-5中任一项所述抗体或其功能性片段之轻链的核酸分子和编码根据权利要求 1-5中任一项所述抗体或其功能性片段之重链的核酸分子。

8. 免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的权利要求 1至 5中任一项所述的抗体或其功能性片段，优选地所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细毒剂。

9. 药物组合物，其包含权利要求 1至 5中任一项的抗体或其功能性片段和 /或权利要求 8的缀合物，以及可药用载体。

10. 权利要求 1至 5中任一项的抗体或其功能性片段、权利要求 6的核酸分子、权利要求 7的核酸分子组合、权利要求 8的缀合物或权利要求 9的药物用途。、' ⁵' 、、一 ' ' 、