ES2699584T3

ES2699584T3 - Anticuerpos multifuncionales que se unen a EGFR y MET

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Publication number: ES2699584T3
Application number: ES14830758T
Authority: ES
Inventors: Hector Aldaz; Barrett Allan; Ling Liu; Ying Tang; Sheng-Hung Rainbow Tschang; Pia Yachi; Jirong Lu
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2019-02-11
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: TW201609805A; CA2930162A1; WO2015100104A1; AR098663A1; US20150175708A1; JP2017504608A; EP3087097A1; CN105829345A; EP3087097B1; US9328173B2; CN105829345B

Abstract

Un anticuerpo multifuncional que comprende: (a) un anticuerpo que se une a MET y comprende: i) una cadena pesada que comprende las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y ii) una cadena ligera que comprende las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente; y (b) un polipéptido scFv que se une a EGFR y comprende: i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) o VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, y scFv-LCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), RYAKESIS (SEQ ID NO: 5) o YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6), respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos multifuncionales que se unen a EGFR y MET

La presente invención se refiere a anticuerpos multifuncionales que se unen a receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) y MET, procedimientos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos multifuncionales, y usos de los mismos.

El EGFR es un miembro de la familia de tirosina quinasa de tipo 1 de receptores del factor de crecimiento, que desempeña papeles fundamentales en crecimiento, diferenciación, y supervivencia celulares. La activación de estos receptores generalmente se produce mediante unión a ligando específico con la posterior autofosforilación del dominio de tirosina quinasa. Esta activación desencadena una cascada de rutas de señalización intracelular implicadas tanto en la proliferación como en la supervivencia celular.

Se han establecido diversas estrategias de terapia contra el cáncer para atacar el EGFR y bloquear las rutas de señalización del EGFR. Los inhibidores de la tirosina quinasa de molécula pequeña, por ejemplo, gefitinib y erlotinib, bloquean la autofosforilación de EGFR en la región intracelular de la tirosina quinasa, inhibiendo de ese modo los sucesos de señalización corriente abajo. Uno de los principales desafíos a los que se enfrenta el uso clínico de los inhibidores de tirosina quinasa anti-EGFR es la resistencia inherente y adquirida de los cánceres a esta clase de agentes terapéuticos. Por otro lado, ciertos anticuerpos monoclonales terapéuticos (los mAb) se dirigen a la parte extracelular de EGFR, lo que da como resultado el bloqueo de la unión del ligando y, por lo tanto, inhibe los sucesos corriente abajo que conducen a la inhibición de la proliferación celular. El anticuerpo monoclonal anti-EGFR quimérico de ratón/humano, C225 (o cetuximab), y panitumumab, un mAb anti-EGFR completamente humano, han sido aprobados para el tratamiento del cáncer colorrectal y el de cabeza y cuello metastásicos que se dirigen a la parte externa del EGFR. Sin embargo, los pacientes cuyo tumor contiene una mutación KRAS a menudo no se benefician de la terapia con cetuximab o panitumumab. Las mutaciones KRAS alteran las propiedades de señalización en las células tumorales al enviar continuamente una señal de crecimiento incluso si se ha bloqueado el EGFR.

MET, un miembro de la superfamilia de la tirosina quinasa, es el receptor humano para el factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HGF). La unión de HGF a MET conduce a la dimerización o multimerización del receptor, fosforilación de múltiples restos de tirosina en la región intracelular, activación catalítica y señalización corriente abajo. MET también se activa a través de mecanismos independientes de ligando, incluyendo sobreexpresión, amplificación y mutación del receptor. La activación de MET aumenta la proliferación, migración, morfogénesis y supervivencia celular, ya que está asociada con el fenotipo de células invasivas y los resultados clínicos deficientes. Por lo tanto, MET también es un objeto para la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, onartuzumab, también conocido en la técnica como 5D5 de una sola rama, OA5D5 o MetMAb, se ha desarrollado para el tratamiento potencial del cáncer, y es un anticuerpo anti-MET antagonista humanizado, monovalente obtenido a partir del anticuerpo monoclonal agonista MET 5D5. (Véase, por ejemplo, Spigel, D.R., y col., Randomized Phase II Trial of Onartuzumab in Combination With Erlotinib in Patients With Advanced Non Small-Cell Lung Cancer, J. Clinical Oncology, 31 (32): 4105-4114 (noviembre de 2013) y Xiang H., y col., Onartuzumab (MetMAb): Using Nonclinical Pharmacokinetic and Concentration - Effect Data to Support Clinical Development, Clin Cancer Res., (2013)). Onartuzumab se une a MET y permanece en la superficie celular con MET, evitando la unión de HGF y la posterior fosforilación de MET, así como la actividad de señalización y las respuestas celulares corriente abajo.

El documento WO 2010/059654 describe diversos anticuerpos MET que incluyen anticuerpos antagonistas de afinidad elevada que se unen a un epítopo dentro de la cadena a de MET y que inducen la internalización y/o degradación de MET en presencia o ausencia de HGF y en tumores caracterizados por el aumento de las mutaciones de función que generalmente son resistentes a antagonistas de MET conocidos. Se ha informado que uno de los anticuerpos MET que se desvela en el documento WO 2010/059654, LY2875358, no tiene actividad agonista o la tiene de forma imperceptible en MET (véase, por ejemplo, Zeng, W., y col., 104th AACR Annual Meeting, póster N.° 5465 (abril de 2013)).

El documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.723.484 describe anticuerpos específicos para EGFR humanizados y con afinidad optimizada, y partes de unión a antígeno del mismo, que inhiben la activación de EGFR. De forma más específica, esta patente describe, entre otros, anticuerpos monoclonales de longitud completa que se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) con afinidades de unión subpicomolares (Kd) tal como se mide con un Sapidyne KINEXA realizado a temperatura ambiente.

MET y EGFR se expresan conjuntamente en muchos tumores. El bloqueo de un receptor tiende a regular al alza al otro, con frecuencia y a menudo rápidamente conduciendo a resistencia al tratamiento con un solo agente (Engelman, J.A., y col. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science, 2007; 316: 1039-43). Por el contrario, las células de cáncer de pulmón amplificadas por MET expuestas a agentes inhibidores de MET durante un periodo prolongado desarrollan resistencia a través de la ruta del EGFR (McDermott, U., y col., Acquired resistance of non-small cell lung cancer cells to MET kinase inhibition is mediated by a switch to epidermal growth factor receptor dependency, Cancer Res., 2010; 70 (4):1625-34). La coadministración de un anticuerpo MET y un anticuerpo EGFR requiere inyecciones de dos productos separados o una inyección única de una coformulación de dos anticuerpos diferentes. Dos inyecciones podrían permitir la flexibilidad de la cantidad de dosis y el momento, pero podrían ser inconvenientes para los pacientes tanto para el cumplimiento como para el dolor. Una formulación conjunta también podría proporcionar una cierta flexibilidad de las cantidades de dosis, pero a menudo es bastante difícil o imposible encontrar condiciones de formulación que permitan la estabilidad química y física de ambos anticuerpos debido a las diferentes características moleculares de los dos anticuerpos diferentes.

El documento WO 199509917 desvela un procedimiento para producir anticuerpos biespecíficos, tetravalentes usando tecnología de ADN recombinante mediante la producción de un anticuerpo variable de fragmento de una sola cadena (scFv) fusionado a un anticuerpo completo que tiene una especificidad diferente. Esta fusión genética se expresa por transfección, dando como resultado un anticuerpo tetravalente que tiene doble especificidad. Sin embargo, generalmente se reconoce en la técnica que cuando las enseñanzas en la técnica, incluyendo el documento WO 199509917, se siguen a la vez que se intentan crear anticuerpos biespecíficos útiles los expertos en la materia con frecuencia se enfrentan a problemas significativos asociados con la estabilidad química y física del anticuerpo o anticuerpos biespecíficos resultantes. En ocasiones, son necesarios cambios de aminoácido en el anticuerpo o anticuerpos biespecíficos resultantes para superar recientemente estos problemas. En la técnica no se sugieren y la necesidad de cambios de aminoácido, ni los cambios reales que puedan superar los problemas resultantes. Además, los cambios que se necesitan con la mayor frecuencia no son de rutina o se obtienen a partir del conocimiento general común. De forma análoga, a menudo se encuentra que los anticuerpos biespecíficos generados a partir de anticuerpos conocidos son menos deseables en al menos una propiedad farmacocinética o farmacodinámica funcional importante en comparación con los propios anticuerpos precursores.

La Publicación Internacional PCT WO 2010/115551 desvela un anticuerpo EGFR y MET anti-humano y específico, trivalente (BsAB01), en el que un fragmento de Fab de una sola cadena, es decir, 5D5 de una sola rama, se fusionó con el extremo carboxilo-terminal de una de las dos cadenas pesadas de cetuximab. Se ha informado que BsAB01 reduce la internalización de MET, en comparación con la internalización de MET inducida por el anticuerpo MET precursor monovalente, monoespecífico. En ensayos de proliferación de OVCAR-8, BsAB01 condujo a una inhibición de un 8 % en comparación con una inhibición de un 2 % con la combinación de cetuximab y onartuzumab. En presencia de HGF, BsAB01 condujo a una inhibición de un 15 % en comparación con una inhibición de un 10 % con la combinación de cetuximab y onartuzumab.

Además, la generación de un anticuerpo y especificó que se dirige tanto a EGFR como a cMET, EM1-mAb, usando Intercambio de Rama de Fab (cFAE), se ha desarrollado un proceso que implica la mezcla de dos anticuerpos precursores (en este caso, con especificidad ya sea para EGFR o MET) en condiciones reductoras, seguido de re oxidación (Moores, S., y col., Eo Rt C Annual Meeting, póster N.° B241 (octubre de 2013)). Se informó que EM1-mAb, entre otras cosas, presentaba una actividad superior en comparación con la combinación de anticuerpos de control monovalentes en al menos un ensayo de fosforilación de ERK in vitro.

La Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos US 2014/0302029 describe la generación de anticuerpos biespecíficos que se dirigen tanto a EGFR como a cMET que se construyeron fusionando un scFv anti-EGFR basándose en la secuencia de cetuximab al extremo C-terminal del Fc de IgG2 de un derivado madurado y humanizado por afinidad de un anticuerpo de ratón (es decir, AbF46) con respecto a c-Met.

Por lo tanto, un anticuerpo multifuncional que se une a MET y EGFR con alta afinidad, neutraliza de manera efectiva la activación de MET por HGF y la activación de EGFR por ligandos de la familia EGF, y/o proporciona una actividad superior en la internalización y/o la degradación de MET y EGFR (tanto de tipo silvestre como mutantes) con respecto a combinaciones de agentes individuales se necesita como una intervención farmacológica eficaz para ciertos cánceres. En particular, son deseables tales anticuerpos anti-MET/EGFR que i) pueden tratar de forma más eficaz los cánceres caracterizados por tener una o más mutaciones KRAS, ii) pueden demostrar una actividad superior para prevenir o retrasar el desarrollo de resistencia a otros inhibidores de MET y/o EGFR que incluyen, pero no se limitan a, erlotinib, gefitinib, lapatinib y vemurafenib, en comparación con las combinaciones relevantes de agentes individuales, iii) provocan una actividad agonista mínima o que no se puede medir, y/o iv) demuestran estabilidad in vivo, estabilidad física y química que incluye, pero no se limita a, estabilidad térmica, solubilidad, baja autoasociación y características farmacocinéticas son aceptables para el desarrollo y/o el uso en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, aunque en general se siguen las enseñanzas del documento WO 95/09917 cuando se intentan crear anticuerpos anti-MET/EGFR tetravalentes y multifuncionales que comprenden ciertos anticuerpos anti-MET del documento WO 2010/059654 y ciertos anticuerpos anti-EGFR del documento de patente de Estados Unidos N.° 7.723.484, los presentes inventores encontraron problemas significativos asociados con la estabilidad química y física y la pérdida de las propiedades de unión deseadas con respecto a uno o ambos de los receptores diana, MET y EGFR. Por lo tanto, se requirió un gran esfuerzo de ingeniería que implicó muchos cambios de aminoácidos para superar suficientemente estos problemas. En la técnica no se sugiere ni la necesidad con respecto a lo mismo ni cambios reales. Además, los diversos cambios no son rutinarios o se obtienen a partir del conocimiento general común. De forma análoga, los propios anticuerpos precursores no tuvieron estos problemas, lo que sugiere que el entorno local alrededor de las áreas críticas se diferenciaba en el contexto de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR.

Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos multifuncionales tetravalentes que se unen a EGFR y MET. Estos anticuerpos multifuncionales inducen colocalización de EGFR y MET en la superficie celular, intemalización y/o degradación de MET, y, de forma sorprendente, incluso una mayor intemalización y degradación de EGFR en comparación con cetuximab en células tumorales con expresión elevada de MET. Además, estos anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR presentan una avidez más elevada en la unión a MET que el anticuerpo anti-MET precursor en células tumorales con expresión de MET de baja a moderada.

Además, estos anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR presentan actividades superiores en comparación con la combinación de dos anticuerpos individuales en la inhibición del crecimiento de células tumorales en cultivos celulares, así como en modelos de xenoinjerto de ratón. También parece que tienen una actividad superior a la combinación de los anticuerpos MET y EGF^rindividuales para restaurar la sensibilidad de las células tumorales a diversas terapias diana, incluyendo erlotinib y PLX4032 (es decir, un inhibidor de B-Raf) en presencia de HGF y/o EGF. También se puede demostrar que los anticuerpos anti-MET/EGFR de ese tipo son más eficaces contra un tumor que expresa EGFR elevado o un tumor que es resistente, o que se ha hecho resistente, a uno o más anticuerpos anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab, panitumumab, etc.) y/o uno o más inhibidores de molécula pequeña de EGFR (por ejemplo, erlotinib), que incluyen, pero no se limitan a, tumores portadores de mutaciones KRAS. En diversas realizaciones de la presente invención, estos anticuerpos multifuncionales se unen a MET y EGFR de forma simultánea, neutralizan la activación de MET por HGF, y EGFR por EGF, inhiben la proliferación celular dependiente e independiente del ligando de muchos tipos de células cancerosas que expresan MET y EGFR, inducen la colocalización de EGFR y MET en la superficie celular, inducen la internalización Y/o degradación de MET, y, de forma sorprendente, inducen incluso una mayor internalización y degradación de EGFR en comparación con cetuximab en células tumorales con expresión de MET elevada.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo multifuncional que comprende:

a) un anticuerpo que se une a MET y comprende:

i) una cadena pesada que comprende las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y

ii) una cadena ligera que comprende las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente; y

b) un polipéptido scFv que se une a EGFR y comprende:

i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) o VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y

ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, y scFv-LCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), RYAKESⁱS (SEQ ID NO: 5) o YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6).

De preferencia, el anticuerpo multifuncional del polipéptido scFv de la presente invención comprende:

a) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y

b) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

De preferencia, el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

Más preferentemente, el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención tiene el extremo C-terminal del polipéptido scFv fusionado mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo MET.

De preferencia, el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

De preferencia, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo que se une a MET que comprende:

a) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que cada una de las cadenas pesadas comprende las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y

b) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que cada una de las cadenas ligeras comprende las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente.

En este sentido el anticuerpo multifuncional comprende dos polipéptidos de scFv cada uno comprendiendo :

i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) o VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, y scFv-LCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), RYAKESIS (SEQ ID NO: 5) o YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6).

De preferencia, el primer polipéptido scFv y el segundo polipéptido scFv cada uno comprende:

a. un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y

b. un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

Incluso más preferentemente, el primer y el segundo polipéptidos de scFv cada uno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

De acuerdo con una realización preferente de la presente invención el anticuerpo que se une a MET comprende: i) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que cada una de las cadenas pesadas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y

ii) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que cada una de las cadenas ligeras comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33.

De preferencia, el extremo C-terminal del primer polipéptido scFv fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la primera cadena pesada y el extremo C-terminal del segundo polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la segunda cadena pesada.

Más preferentemente, el anticuerpo multifuncional comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que la secuencia de aminoácidos de ambos primeros polipéptidos es SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de ambos segundos polipéptidos es SEQ ID NO: 33.

El anticuerpo multifuncional de preferencia induce internalización y/o degradación de MET y EGFR de superficie celular.

De preferencia, el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención tiene un scFv que se une a EGFR comprende:

i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y

ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, scFv-LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6), respectivamente.

De preferencia, el polipéptido scFv comprende:

a) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y

b) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

Más preferentemente, el anticuerpo que se une a MET comprende:

i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y

ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

El extremo C-terminal del polipéptido scFv de preferencia se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo ^mE^t.

El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención de preferencia comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

Incluso más preferentemente, este comprende:

i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; y

ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

De acuerdo con una realización preferente de la presente invención, el anticuerpo que se une a MET comprende: a) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que ambas cadenas pesadas comprenden las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), and ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y

b) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que ambas cadenas ligeras comprenden las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente.

El anticuerpo multifuncional del primer polipéptido scFv y el segundo polipéptido scFv de la presente invención de preferencia cada uno comprende:

Más preferentemente, el primer polipéptido scFv y el segundo polipéptido scFv cada uno comprende:

i) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y

ii) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

Incluso más preferentemente, el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención tiene un primer y segundo polipéptidos scFv cada uno comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención de preferencia es un anticuerpo que se une a MET que comprende:

i) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que ambas cadenas pesadas comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y

ii) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que ambas cadenas ligeras comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33.

El anticuerpo multifuncional de preferencia, tiene el extremo C-terminal del primer polipéptido scFv fusionado mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la primera cadena pesada y el extremo C-terminal del segundo polipéptido scFv fusionado mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la segunda cadena pesada.

De preferencia este comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en los que la secuencia de aminoácidos de ambos primeros polipéptidos es SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de ambos segundos polipéptidos es SEQ ID NO: 33.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptables.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención, para uso en terapia.

De preferencia, el anticuerpo multifuncional es para uso en el tratamiento de un cáncer.

Más preferentemente, el anticuerpo multifuncional is para uso en el tratamiento de NSCLC, SCLC, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de esófago, melanoma, melanoma uveal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, o cáncer de cabeza y cuello.

En particular, el anticuerpo multifuncional de acuerdo con la presente invención es para uso en el tratamiento de NSCLC, SCLC, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de esófago, melanoma, melanoma uveal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, o cáncer de cabeza y cuello en el que el cáncer se caracteriza por que comprende células tienen una o más mutaciones de KRAS.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una molécula de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una molécula de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

De preferencia, la molécula de ADN comprende:

a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; y b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una célula de mamífero transformada con la molécula de ADN de acuerdo con la presente invención, célula que es capaz de expresar un anticuerpo multifuncional que comprende un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

De preferencia, la célula de mamífero es CHO.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo multifuncional que comprende un primer polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 27 y un segundo polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 33, que comprende: (1) cultivar la célula de mamífero de la presente invención en condiciones tales que el anticuerpo multifuncional se expresa, y (2) recuperar el anticuerpo multifuncional expresado.

La Fig. 1 ilustra resultados de transferencia de Western que muestran que los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, inducen degradación de EGFR y MET en las líneas de células de cáncer H1993 (NSCLC), MKN45 (carcinoma gástrico), y H441 (NSCLC). Las líneas de células de cáncer se trataron durante una noche con 100 nM de anticuerpo NH-YK, anticuerpo NH-H9 o anticuerpos de control. La degradación de EGFR y MET se determinó mediante transferencia de Western de lisados celulares. Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, desencadenan una degradación de EGFR significativa mientras que cetuximab o una combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab no lo hicieron. Calle 1: hIgG4; Calle 2: Ab anti-MET; Calle 3: cetuximab; Calle 4 Ab anti-MET cetuximab; Calle 5: NH-YK; Calle 6: NH-H9.

La Fig. 2 es un gráfico que muestra que la administración del anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, da como resultado una disminución del volumen tumoral significativamente más elevada (% de T/C de un 28,5%, p< 0,001) en un modelo de xenoinjerto de ratón H1993 en comparación con la administración de un vehículo de control o una combinación del anticuerpo anti-Met precursor y cetuximab (% de T/C de un 86,1 %). La Fig. 3 es un gráfico que muestra que la administración del anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, da como resultado una disminución del volumen tumoral significativamente más elevada (% de T/C de un 28,5%, p< 0,001) en un modelo de xenoinjerto de ratón H441 en comparación con la administración de un control de vehículo o una combinación del anticuerpo anti-Met precursor y cetuximab.

La Fig. 4 es un gráfico que muestra que la administración del anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, da como resultado una disminución del volumen tumoral significativamente más elevada (% de T/C de un 32,9 % (p < 0,001)) en un modelo de xenoinjerto de ratón EBC-1 NSCLC en comparación con la administración de un control de vehículo.

La Fig. 5 es un gráfico que muestra que la administración del anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, da como resultado una eficacia antitumoral comparable en comparación con la administración de una combinación del anticuerpo MET precursor y cetuximab (T/C %= 17,4%, p < 0,001 y 18,6%, p< 0,001, respectivamente) o un control de vehículo en un modelo de xenoinjerto gástrico MKN45.

La Fig. 6 es un gráfico que muestra que la administración del anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, H9, a 27 mg/kg dio como resultado una eficacia antitumoral significativamente más elevada que cualquier otro tratamiento en ratones inmunodeficientes portadores de xenoinjertos H1993 NSCLC. Los xenoinjertos de ratones se trataron con cualquiera de control de vehículo, el anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, H9 (4 y 27 mg/kg), anti-MET solo (3 y 20 mg/kg), cetuximab (3 y 20 mg/kg) o la combinación de anti-MET más cetuximab (3 mg/kg y 20 mg/kg de cada anticuerpo) una vez a la semana durante cinco semanas consecutivas.

La Fig. 7 es un gráfico que muestra que la administración del anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, H9, a 27 mg/kg dio como resultado una eficacia antitumoral significativamente más elevada que cualquier otro tratamiento en ratones inmunodeficientes portadores de xenoinjertos de H441. Los xenoinjertos de ratones se trataron con cualquiera de control de vehículo, el anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, H9 (4 y 27 mg/kg), anti-MET solo (3 y 20 mg/kg), cetuximab (3 y 20 mg/kg) o la combinación de anti-MET más cetuximab (3 mg/kg y 20 mg/kg de cada anticuerpo) una vez a la semana durante cinco semanas consecutivas.

Los términos "EGFR", "ErbB1", y "receptor EGF" se usa indistintamente en el presente documento para hacer referencia a la proteína EGFR (véase, por ejemplo, entrada P00533 de UniProtKB/Swiss-Prot). En el presente documento, "dominio extracelular de EGFR" o "ECD de EGFR" se refiere a un dominio de EGFR que está fuera de una célula, ya sea anclado a una membrana celular, o en circulación, incluyendo fragmentos del mismo. En una realización, el dominio extracelular de EGFR puede comprender cuatro dominios: "Dominio I" (restos de aminoácido de aproximadamente 1-158), "Dominio II" (restos de aminoácido 159-336), "Dominio III" (restos de aminoácido 337 470), and "Dominio IV" (restos de aminoácido 471-645), en los que los límites son aproximados, y pueden variar en aproximadamente 1-3 aminoácidos.

Las expresiones "polipéptido de MET", "receptor MET " , "MET", "receptor HGF" o "HGFR" se usan indistintamente en el presente documento y, a menos que se indique de otro modo, pretenden hacer referencia a la tirosina quinasa receptora humana, así como formas muladas, funcionalmente activas de la misma, que según en al factor de crecimiento de hepatocitos humano. Los ejemplos específicos de MET incluyen, por ejemplo, un polipéptido humano codificado por la secuencia de nucleótidos que se proporciona en GenBank con el de n.° de referencia NM_000245, o la proteína humana codificada por la secuencia de polipéptidos que se proporciona en GenBank con el de n.° de referencia NP_000236. La estructura de MET se representa de forma esquemática como:

Dominio Extracelular (ECD) Dominio Intracelular

r _____ A _____ A

- TM - JM - K D - cola intracelular

SEMA: Dominio Sema

PSI: Dominio de Plexina, Semaforinas, e Integrinas

IPT: 4 Dominios de Inmunoglobulinas, Plexinas, y factor de Transcripción

TM: Región transmembrana

JM: Dominio de yuxtamembrana

KD: Dominio de quinasa

El dominio extracelular de MET humano (en el presente documento, MET-ECD) tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 35. Sin embargo, los aminoácidos 1-24 de SEQ ID NO: 35 comprenden la secuencia señal. Por lo tanto, a menos que se indique de otro modo, el término "MET-ECD" como se usa en el presente documento se refiere a la proteína madura que comienza y termina en los aminoácidos 25 y 932, respectivamente, de SEQ ID NO: 35 (es decir, la SEQ ID NO: 36). El dominio SEMA consiste en aproximadamente 500 restos de aminoácido en el extremo N-terminal de MET, y contiene la cadena a (restos de aminoácido 25-307 de SEQ ID NO: 35 (es decir, SEQ ID NO: 37) y parte de la cadena p (restos de aminoácido 308-519 de SEQ ID NO: 35 (es decir, SEQ ID NO: 38)).

Como se usa en el presente documento, los términos "baja", "moderada", y "elevada" en referencia a la expresión en la superficie celular de MET o EGFR para un tumor o una línea celular pretende indicar menos de aproximadamente 0,3 millones, más de aproximadamente 0,3 millones, y más de aproximadamente 1 millón de receptores por célula, respectivamente.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo multifuncional" se refiere a una molécula que comprende un anticuerpo que tiene una especificidad de unión a antígeno y un fragmento de unión a antígeno que tiene una especificidad de unión a antígeno diferente. De preferencia, un anticuerpo multifuncional se refiere a una molécula que comprende i) un anticuerpo que tiene especificidad de unión a antígeno con respecto a MET y ii) un fragmento variable de una sola cadena (scFv) que tiene especificidad de unión a antígeno con respecto a EGFR.

A menos que se indique de otro modo, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) interconectadas mediante enlaces disulfuro. La parte amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 110 aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento antigénicos mediante las CDR contenidas en la misma. La parte carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

A menos que se indique de otro modo, el término "NH-YK", como se usa en el presente documento en referencia a un anticuerpo multifuncional de la invención, pretende hacer referencia a un anticuerpo multifuncional que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que ambos primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; y ambos segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, y en el que dicho anticuerpo multifuncional se une a EGFR y MET. A menos que se indique de otro modo, el término "NH-H9", como se usa en el presente documento en referencia a un anticuerpo multifuncional de la invención, pretende hacer referencia a un anticuerpo multifuncional que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que ambos primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; y ambos segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, y en el que dicho anticuerpo multifuncional se une a EGFR y MET. A menos que se indique de otro modo, el término "H9", como se usa en el presente documento en referencia a un anticuerpo multifuncional de la invención, pretende hacer referencia a un anticuerpo multifuncional que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que ambos primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; y ambos segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, y en el que dicho anticuerpo multifuncional se une a EGFR y MET.

A menos que se indique de otro modo, el término "YK", como se usa en el presente documento en referencia a un anticuerpo multifuncional de la invención, pretende hacer referencia a un anticuerpo multifuncional que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que ambos primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; y ambos segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, y en el que dicho anticuerpo multifuncional se une a EGFR y MET.

El término "fragmento de unión a antígeno" como se usa en el presente documento pretende indicar cualquier fragmento de anticuerpo que mantenga la capacidad para unirse a su antígeno. Los "fragmentos de unión a antígeno" de ese tipo se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en fragmentos y diacuerpos de Fv, scFv, Fab, F(ab')², Fab', scFv-Fc. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo generalmente comprenderá al menos una región variable. De preferencia, un fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR). Más preferentemente, un fragmento de unión a antígeno comprende las HCVR y las LCVR que proporcionan una especificidad de unión a antígeno tanto para MET como para EGFR (es decir, un "fragmento de unión a MET y EGFR").

La expresión "región determinante de la complementariedad" y "CDR" como se usa en el presente documento pretende indicar los sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados en la región variable de ambos polipéptidos HC y LC de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Estas regiones particulares han sido descritas por otros incluyendo Kabat, y col., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat y col., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977); Kabat, y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N.° 91-3242 (1991); Chotia, y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); MacCallum, y col., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996); y North, y col., J. Mol. Biol., 406, 228-256 (2011) en los que las definiciones incluyen solapamiento o subconjuntos de restos de aminoácido cuando se comparan entre sí.

Las CDR se intercalan con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas ("FR"). Cada LCVR y HCVR está formada por tres CDR y cuatro FR, colocadas desde el extremo amino-terminal al extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las tres CDR de la cadena ligera se denominan "LCDR1, LCDR2, y LCDR3" y las tres CDR de la cadena pesada se denominan "HCDR1, HCDR2, y HCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y colocación de los restos de aminoácido de la CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR está de acuerdo con convenciones conocidas (por ejemplo, Kabat (1991) Chotia (1987), y/o North (2011)). En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o se puede modificar de forma natural o artificial.

Un "fragmento variable de una sola cadena" o " scFv" o "polipéptido scFv" se refiere a un polipéptido plegado una sola vez que comprende el dominio LCVR y el dominio ^hC^vR de un anticuerpo unido a través de una molécula de engarce. En un polipéptido scFv de ese tipo, el dominio HCVR y el dominio LCVR pueden estar en cualquier orden de HCVR - engarce - LCVR o LCVR - engarce - HCVR. El engarce puede ser un engarce peptídico flexible que permita que el dominio HCVR en los dominios LCVR se pierden como una unidad monomérica funcional para reconocer un antígeno. Las tres CDR del dominio LCVR del scFv en el presente documento se denominan "scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, y scFv-LCDR3" y las tres CDR del dominio HCVR del scFv en el presente documento se denominan "scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3".

La expresión "resonancia de plasmón superficial (SPR)", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real mediante detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences Division, GE Healthcare, Piscataway, NJ).

El término "K^d", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno o fragmento de anticuerpo-antígeno.

La expresión "se une de forma específica", o similar, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. Los procedimientos para determinar si un anticuerpo se une de forma específica a un antígeno se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, SPR, y similares. Por ejemplo, un anticuerpo que "se une de forma específica" a MET o EGFR, como se usa en el contexto de la presente invención, incluye anticuerpos que se unen a MET-ECD (o una parte del mismo) y/o EGFR-ECD (o una parte del mismo) con una K^dinferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 4 nM, inferior a aproximadamente 3 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 0,5 nM, inferior a aproximadamente 0,3 nM, inferior a aproximadamente 0,2 nM, o inferior a aproximadamente 0,1 nM tal como se mide en un ensayo de SPR. (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1, en el presente documento). De preferencia, un anticuerpo multifuncional de la presente invención se une de forma específica a MET-ECD (o parte del mismo) y EGFR-ECD (o parte del mismo) con una K^dentre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 0,1 nM, entre aproximadamente 5 nM y aproximadamente 0,1 nM, entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 0,1 nM, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 0,1 nM, entre aproximadamente 0,75 nM y aproximadamente 0,1 nM, entre aproximadamente 0,5 nM y aproximadamente 0,1 nM tal como se mide con un ensayo de SPR.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como un paratopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos se pueden unir a zonas diferentes en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptidos lineal. Un epítopo lineales uno producido mediante restos de aminoácido adyacentes en una cadena de polipéptidos. En determinada circunstancia, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión "molécula de engarce" o "engarce" como se usa dentro de la invención de preferencia representa un engarce peptídico. Los engarces peptídicos usados en ciertas realizaciones de la invención se usan para unirse al anticuerpo, sitios de unión a antígeno, y/o fragmentos de anticuerpo que comprenden los diferentes sitios de unión a antígeno (por ejemplo, scFv, anticuerpo de longitud completa, un dominio Vh y/o un dominio Vl) juntos para formar un anticuerpo multifuncional de acuerdo con la invención. De preferencia, los engarces peptídicos son tejidos ricos en glicina con al menos 5 aminoácidos, de preferencia de al menos 10 aminoácidos, más preferentemente entre 10 y 50 aminoácidos. En algunas realizaciones de la presente invención, dicho engarce peptídico rico en glicina es (GxS)n con G = glicina, S = serina, (x = 3 y n = 3, 4, 5 o 6) o (x = 4 y n = 2, 3, 4 o 5). Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, dicho engarce peptídico rico en glicina es (GxS)n con G = glicina, S = serina, x = 4 y n = 2, 3, 4 o 5 (es decir, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 48), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 49), o GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 50), respectivamente. En ciertas realizaciones de la presente invención, se pueden añadir glicinas o treoninas adicionales, por ejemplo, GSTG, TG, GG, o GGGT a cualquier extremo del engarce peptídico rico en glicina con el formato (GxS)n. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, dicho engarce peptídico rico en glicina es GGGSGGGGSGGGGSGSTG (SEQ ID NO: 51).

La expresión "extremo C-terminal", y variaciones gramaticales de la misma, que incluyen, pero no se limitan a, extremo carboxilo-terminal, extremo carboxi-terminal, C-terminal, extremo C-terminal, o extremo COOH-terminal, en el presente documento se usan para indicar el extremo de una cadena de aminoácidos (proteína o polipéptido), que puede terminar en un grupo carboxilo libre (-COOH). Cuando la proteína se traduce desde ARN mensajero, se crea desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal. La convención para indicar secuencias peptídicas es representar el extremo C-terminal en la parte derecha y enumerar la secuencia desde el extremo N- al C-terminal.

La expresión "extremo N-terminal", ", y variaciones gramaticales de la misma, que incluyen, pero no se limitan a, extremo amino-terminal, extremo NH²-terminal, extremo N-terminal o extremo amina-terminal, en el presente documento se usan para indicar el extremo de una cadena de aminoácidos (proteína o polipéptido), terminará por un aminoácido con un grupo amino libre (-NH²). La convención para indicar secuencias peptídicas es poner el extremo N-terminan en la parte izquierda y enumerar la secuencia desde el extremo N- al C-terminal.

La expresión "anticuerpo humano modificado por ingeniería" o "anticuerpo humanizado" se refiere a los compuestos de anticuerpo que se desvelan en el presente documento así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen propiedades de unión y funcionales similares a las de los compuestos de anticuerpo que se desvelan en el presente documento, y que tienen regiones marco conservadas que son esencialmente humanas o totalmente humanas que rodean las CDR obtenidas a partir de un anticuerpo no humano. "Región marco conservada" o "secuencia de marco" se refiere a una cualquiera de las regiones marco conservadas 1 a 4. Los anticuerpos humanos modificados por ingeniería y fragmentos de unión a antígeno incluidos en la presente invención incluyen compuestos en los que una cualquiera o más de las regiones marco conservadas 1 a 4 es esencial o totalmente humana, es decir, en la que está presente en cualquiera de las posibles combinaciones de las regiones marco conservadas 1 a 4 esencial o totalmente humanas individuales. Por ejemplo, esto incluye compuestos de unión a antígeno en los que la región marco conservada 1 y la región marco conservada 2, la región marco conservada 1 y la región marco conservada 3, la región marco conservada 1, 2, y 3, etc., son esencial o totalmente humanas. Las regiones marco conservadas esencialmente humana son aquellas que tienen una identidad de secuencias de al menos aproximadamente un 80 % con respecto a una secuencia marco conservada de línea germinal humana. De preferencia, las regiones marco conservadas esencialmente humanas tienen una identidad de secuencias de al menos aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, o aproximadamente un 95 % con respecto a una secuencia de región marco conservada de línea germinal humana conocida.

Las regiones marco conservadas totalmente humanas son aquellas que son idénticas a una secuencia de región marco conservada de línea germinal humana conocida. En la técnica se conocen secuencias de línea germinal de región marco conservada humana y se pueden obtener a partir de diversas fuentes que incluyen IMGT®, el sistema de información internacional ImMunoGeneTics (véase, por ejemplo, Marie-Paule Lefranc, y col., Nucleic Acid Research, volumen 37, expedición de base de datos, D1006-D1012) o a partir de The Immunoglobulin Facts Book de Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, las regiones marco conservadas de cadena ligera de línea germinal se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, O2, y O8; y las regiones marco conservadas de cadena pesada de línea germinal se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, y VH5-5I.

Los anticuerpos humanos modificados por ingeniería que presentan propiedades funcionales similares a los compuestos de anticuerpo que se desvelan en el presente documento se pueden generar usando varios procedimientos diferentes. Los compuestos de anticuerpos específicos que se desvelan en el presente documento se pueden usar como moldes o como compuestos de anticuerpo precursores para preparar compuestos de anticuerpo adicionales. En un enfoque, las CDR del compuesto de anticuerpo precursor se injertan en un armazón humano que tiene una identidad de secuencias elevada con el armazón del compuesto de precursor. La identidad de secuencias del nuevo armazón generalmente será al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia del armazón correspondiente en el compuesto de anticuerpo precursor. Este injerto puede dar como resultado una reducción de la afinidad en comparación con la del anticuerpo precursor. En este caso, el armazón se puede retromutar con respecto al armazón precursor en ciertas posiciones basándose en criterios específicos que desvelados por Queen y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Las referencias adicionales que describen procedimientos útiles en humanización de anticuerpos de ratón incluyen los documentos de Patente de Estados Unidos N.os 4.816.397; 5.225.539, y 5.693.761; los programas informáticos ABMOD y ENCAD como se describe en Levitt, J. Mol. Biol. 168:595-620 (1983); y el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann, y col. Nature, 332: 323-327 (1988); y, y col. Science 239: 1534-1536 (1988).

Aplicando las enseñanzas de la presente divulgación, una persona con experiencia en la materia puede usar técnicas comunes, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, para sustituir aminoácidos dentro de las secuencias de CDR y de armazón que se desvelan en la presente y para generar de ese modo secuencias de aminoácidos de región variable adicionales obtenidas a partir de las presentes secuencias. Hasta los 19 aminoácidos que se producen de forma natural alternativos se pueden introducir en un sitio de sustitución específico. Los procedimientos que se desvelan en el presente documento a continuación se pueden usar para identificar sistemáticamente estas secuencias de aminoácidos de región variable adicionales para identificar secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. En este sentido, se pueden identificar secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos humanos modificados por ingeniería y partes de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con la presente divulgación. De preferencia, la sustitución del aminoácido dentro de él los armazones se limita a una, dos, o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las regiones marco conservadas de cadena ligera y/o cadena pesada que se desvelan en el presente documento. De preferencia, la sustitución de aminoácido dentro de las CDR se limita a una, dos, o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las tres CDR de cadena ligera y/o cadena pesada. En el presente documento también se contemplan combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones marco conservadas y las CDR que se han descrito anteriormente.

Las Tablas 1 y 2 que siguen a continuación representan las secuencias de aminoácidos y secuencias de aminoácidos consenso de las CDR para los anticuerpos humanos modificados por ingeniería que se desvelan en el presente documento, y los Nos de SEQ ID para las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de HCVR y LCVR para los anticuerpos humanos modificados por ingeniería preferentes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se desvelan en el presente documento.

Tabla 1

En la Tabla 1 que se ha mencionado anteriormente, X¹es Y o W y X²es K o T.

Tabla 2

En la Tabla 2 que se ha mencionado anteriormente, Xi es R o Y, X²es K o S, y X³es E o R

En algunas realizaciones de la presente invención, la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 21, y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 22, que ambas se obtienen a partir del Clon C8-H241 de anti-MET (que se describe con detalle en el documento WO 2010/059654), se puede usar para formar sitios de unión a antígeno del anticuerpo MET que se une de forma específica a MET.

Mediante técnicas de síntesis genética y de biología molecular recombinante, la HCVR de SEQ ID NO: 17 y la LCVR de SEQ ID NO: 18, o la HCVR de SEQ ID NO: 19 y la LCVR de SEQ ID NO: 20, se unen mediante un engarce rico en glicina de la fórmula (GxS)n, x = 4, n = 5 para formar un scFv que se une de forma específica a EGFR. El scFv de unión a EGFR a continuación se une al extremo N- o C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-MET, C8-H241 (subtipo de IgG4 humana) mediante otro engarce rico en glicina, creando anticuerpos multifuncionales NH-YK (que comprenden una fusión de YKn anti-EGFR-scFv y HC anti-Met (es decir, SEQ ID NO: 27)), NH-H9 (que comprende una fusión de H9n anti-EGFR-scFv y HC anti-Met (es decir, SEQ ID NO: 29)), YK (que comprende una fusión de HC anti-Met e YK anti-EGFR-scFv (es decir, SEQ ID NO: 31)), y H9 (que comprende una fusión de HC anti-Met y H9 anti-EGFR-scFv (es decir, SEQ ID NO: 52)).

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo multifuncional que se une a MET y EGFR que comprende: (a) dos primeros polipéptidos en el que ambos de los primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52, o SEQ ID NO: 53; y (b) dos segundos polipéptidos en el que ambos de los segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

Otra realización de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multifuncional que se une a MET y EGFR que comprende: (a) dos primeros polipéptidos en el que ambos de los primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52, o SEQ ID NO: 53; y (b) dos segundos polipéptidos en el que ambos de los segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptables.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento para tratar cáncer, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un anticuerpo multifuncional que se une a MET y EGFR que comprende: (a) dos primeros polipéptidos en el que ambos de los primeros polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52, o SEQ ID NO: 53; y (b) dos segundos polipéptidos en el que ambos de los segundos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones de una invención de ese tipo el cáncer es NSCLC, SCLC, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de esófago, melanoma, melanoma uveal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, o cáncer de cabeza y cuello. En algunas realizaciones de una invención de ese tipo el paciente con cáncer es un ser humano. En otras realizaciones de una invención de ese tipo el tumor del paciente se caracteriza por que comprende células tienen una o más mutaciones de KRAS. En otras realizaciones de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar un cáncer, que incluye la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de uno de los anticuerpos multifuncionales que se han mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a MET y EGFR de los mismos, a un paciente con necesidad del mismo en el que MET y/o EGFR se expresan mediante el tumor del paciente a un nivel bajo, moderado, o elevado y/o tumor o un tumor que es resistente, o se ha hecho resistente, a uno o más anticuerpos anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab, panitumumab, etc.) y/o uno o más inhibidores de molécula pequeña de EGFR (por ejemplo, erlotinib), que incluyen, pero no se limitan a, tumores portadores de mutaciones de KRAS. En diversas realizaciones de invención de ese tipo, el procedimiento para tratar un cáncer en el que MET y/o EGFR se expresan por el tumor del paciente a un nivel bajo, moderado, o elevado y/o en el que el tumor es resistente, o se ha hecho resistente, a uno o más anticuerpos anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab, panitumumab, etc.) y/o uno o más inhibidores de EGFR de molécula pequeña (por ejemplo, erlotinib), que incluyen, pero no se limitan a, tumores portadores de mutaciones de KRAS pueden comprender adicionalmente una etapa de identificación del paciente con necesidad del tratamiento del cáncer, antes de la etapa de administración del anticuerpo multifuncional, o un fragmento de unión a MET y EGFR del mismo, al paciente midiendo los niveles de MET y EGFR expresados por el tumor del paciente y/o evaluación de sí el tumor del paciente comprende células tienen una o más mutaciones de KRAS.

La Tabla 3 que sigue a continuación representa los NOs de SEQ ID de las secuencias de aminoácidos de scFv y fusiones de scFv de la presente invención.

Tabla 3

Cuando en el presente documento se usa en referencia a un scFv, incluyendo en la Tabla 3 que se ha mencionado anteriormente, el subíndice "n" indica que el scFv de YK anti-EGFR o el scFv de H9 anti-EGFR está fusionado con el extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo MET.

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo multifuncional que comprende dos primeros polipéptidos idénticos y dos segundos polipéptidos idénticos en el que la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido es S^eQ ID NO: 33, en el que dicho anticuerpo multifuncional se une a EGFR y MET. Además como en diversas realizaciones de una invención de ese tipo el anticuerpo multifuncional induce internalización y/o degradación independiente de HGF e independiente de EGF de MET y EGFR de superficie celular, respectivamente.

Las técnicas de biología molecular convencionales se usan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar transformantes, aislar líneas de células huésped que producen un anticuerpo multifuncional de la invención, cultivar estas células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

La presente invención también se refiere a células huésped que expresan un anticuerpo multifuncional de la invención. Una amplia diversidad de sistemas de expresión de hospedador conocidos en la técnica se puede usar para expresar un anticuerpo de la presente invención incluyendo sistemas de expresión procariota (bacteriano) y eucariota (tales como células de levadura, baculovirus, plantas, mamíferos y otras células animales, animales transgénicos, y células de hibridoma).

Un anticuerpo multifuncional de la invención se puede preparar mediante expresión recombinantes de inmunoglobulinas en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante en una célula huésped, una célula huésped se transforma, transduce, infecta o similares con uno o más vectores de expresión recombinante que portan fragmentos de ADN que codifican la cadena ligera y/o la fusión de scFv-cadena pesada del anticuerpo multifuncional. La cadena pesada de la cadena ligera se puede expresar independientemente de diferentes promotores a los que se unen de forma operativa en un vector o, como alternativa, la cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar independientemente de diferentes promotores a los que se unen de forma operativa en dos vectores - uno que expresa la cadena pesada y uno que expresa la cadena ligera. Opcionalmente, la cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar en diferentes células huésped. De preferencia, los anticuerpos recombinantes se secretan en el medio en el que las células huésped se cultivan, a partir del cual los anticuerpos se pueden recuperar o purificar.

Un ADN aislado que codifica una región HCVR se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa mediante unión de forma operativa del ADN que codifican la HCVR a otra molécula de ADN que codifican regiones constantes de cadena pesada. En la técnica se conocen las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana, así como de otros mamíferos. Los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones se pueden obtener por ejemplo, mediante amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser de cualquier tipo, (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM o IgD), clase (por ejemplo, IgG-i, IgG², IgG³e IgG⁴) o subclase de región constante y cualquier variante alotípica de la misma como se describe en Kabat (mencionado anteriormente).

Un ADN aislado que codifica una región LCVR se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera de Fab) mediante unión de forma operativa del ADN que codifica la LCVR a otra molécula de ADN que codifican una región constante de cadena ligera. En la técnica se conocen las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humanas, así como de otros mamíferos. Los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones se pueden obtener mediante amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Además del gen o genes de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, un vector de expresión recombinante de la invención porta secuencias reguladores que controlan la expresión del gen o genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación), si fuera necesario, para controlar la transcripción o traducción del gen o genes de la cadena del anticuerpo. El diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada. Las secuencias reguladoras precedentes para expresión de célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores obtenidos a partir de citomegalovirus (CMV), Virus 40 de Simio (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y/o virus de polioma.

Además, los lectores de expresión recombinante de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y uno o más genes marcadores seleccionables. El gen marcado seleccionables facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector. Por ejemplo, generalmente el gen marcador seleccionables confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina, o metotrexato, en una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionables preferentes incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) (para uso en células huésped dhfr-negativas con selección/amplificación de metotrexato), el gen neo (para selección de G418), y glutamina sintetasa (GS) en una línea celular negativa para GS (tal como NS0) para selección/amplificación.

Para expresión de las cadenas ligera y/o pesada, el vector o lectores de expresión que codifican las cadenas pesada y/o ligera se introduce en una célula huésped mediante técnicas convencionales por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano, transducción, infección y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención en cualquier célula huésped procariota o eucariota, son preferentes las células eucariotas, y más preferentemente células huésped de mamífero, porque es más probable que las células de ese tipo se ensamblen y secreten un anticuerpo legado de forma apropiada e inmunológicamente activo. Las células huésped de mamíferos preferentes para expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) [incluyendo células de CHO dhfr negativas, como se describe en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159: ^{601-21, 1982], células de mieloma NS0, células}CoS, ^{y células SP2/0. Cuando en las células huésped de mamífero}se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo, los anticuerpos se producen mediante cultivo de las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que las células huésped crecen en condiciones apropiadas conocidas en la técnica. Los anticuerpos se pueden recuperar a partir de la célula huésped y/o el medio de cultivo usando procedimientos de purificación convencionales.

Las células huésped también se pueden usar para producir partes, o fragmentos, de anticuerpos intactos, por ejemplo, fragmentos de Fab o moléculas de scFv mediante técnicas que son convencionales. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifican a cualquiera de la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. La tecnología del ADN recombinante donde se puede usar para retirar una cierta parte o todo el ADN que codifica a cualquiera o ambas de las cadenas ligera y pesada que no sea necesaria para la unión a EGFR y MET. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también están incluidas por los anticuerpos de la invención.

La invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención. De preferencia, una célula huésped de la invención comprende uno o más vectores o construcciones que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Por ejemplo, una célula huésped de la invención es una célula en la que se ha introducido un vector de la invención, dicho vector comprendiendo un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención. La invención también proporciona una célula huésped en la que se han introducido dos vectores de la invención.

Una vez expresados, los anticuerpos intactos, cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, intercambio iónico, afinidad (por ejemplo, Proteína A), fase inversa, cromatografía en columna por interacción hidrófoba, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, y similares. Son preferentes las inmunoglobulinas esencialmente puras con una homogeneidad de al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 94 % o aproximadamente un 96 %, y las más preferentes son las que tienen una homogeneidad de aproximadamente un 98 % a aproximadamente un 99 % o más, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente vuestra homogeneidad si se desea, los anticuerpos estériles se pueden usar a continuación de forma terapéutica, como se menciona en el presente documento.

La expresión "polinucleótido aislado" como se usa en el presente documento significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, de modo que en virtud de su origen el polinucleótido aislado (1) no se asocia con toda o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislados se encuentra en la naturaleza, (2) se une a un polinucleótido al que no se une en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia de mayor tamaño.

Un anticuerpo multifuncional "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con usos de diagnóstico terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferentes, un anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo tal como se determina con el procedimiento de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de cubeta giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, SimplyBlue™ SafeStain (Life Technologies) o, de preferencia, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente.

Como se usa en el presente documento, "esencialmente puro" o "esencialmente purificado" significa un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En ciertas realizaciones, una composición esencialmente purificada es una composición en la que la especie comprende al menos aproximadamente un 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas realizaciones, una composición esencialmente pura comprenderá más de aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, o un 99 % de todas las especies macromolares presentes en la composición. En ciertas realizaciones, la especie se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante procedimientos de detección convencionales) en las que la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular. En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifican la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 27, 29, y 33.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende polinucleótido que codifican la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 27, 29, y 33.

La expresión "que trata" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a disminuir, interrumpir, detener, controlar, para, reducir, o revertir la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección, o enfermedad, pero no necesariamente implica una eliminación total de todos los síntomas, afecciones, o trastornos relacionados con la enfermedad.

El término "cáncer" (o "un cáncer") se refiere a enfermedades proliferativas, tales como cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC), cáncer de pulmón de células microcíticas (SCLC), cáncer de la cabeza o cuello, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, carcinoma colorrectal (CRC), cáncer de esófago, melanoma, que incluye, pero no se limita a, melanoma uveal, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, incluyendo versiones refractarias de cualquiera de los cánceres que se han mencionado anteriormente, o una combinación de uno o más de los cánceres que se han mencionado anteriormente.

La expresión "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad necesaria (a dosificaciones y durante periodos de tiempo y para el medio de administración) para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz del anticuerpo multifuncional puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, género, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo, o fragmento de unión a MET y EGFR del mismo, para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz también es una en la que el efecto o efectos perjudiciales del anticuerpo, o fragmento de unión a MET y EGFR del mismo, se compensan con los efectos terapéuticamente beneficios.

Una cantidad eficaz es al menos la cantidad mínima, pero menos que una cantidad nociva global, de un agente activo que es necesaria para producir un beneficio terapéutico en un sujeto. Indicado de otro modo, una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención es una cantidad que, en mamíferos, de preferencia seres humanos, reduce en número de células cancerosas; reduce el tamaño del tumor; inhibe (es decir, ralentiza en cierta medida o detiene) la infiltración de células cancerosas en órganos de tejidos periféricos; inhibe (es decir, ralentiza en cierta medida o detiene) la metástasis tumoral; inhibe, en cierta medida, el crecimiento tumoral; y/o alivia en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Una cantidad eficaz de un anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR de la invención se puede administrar en una sola dosis o en múltiples dosis. Además, una cantidad eficaz de un anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR de la invención se puede administrar en múltiples dosis de cantidades que podrían ser inferiores a una cantidad eficaz sino se administran más de una vez.

Como se sabe bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un sujeto cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto en particular que se va a administrar, género, tiempo y vía de administración, salud general, y otros fármacos que se están administrando de forma simultánea. La dosis puede variar adicionalmente dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad. Una dosis habitual puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg; de preferencia, de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 100 mg; más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg; sin embargo, se conciben dosis por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo, especialmente teniendo en cuenta los factores que se han mencionado anteriormente. Un régimen de dosificación parenteral diario puede ser de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. La evolución se puede monitorizar mediante evaluación periódica, y la dosis se puede ajustar en consecuencia.

En algunas realizaciones de la presente invención, una sola dosis de un anticuerpo multifuncional de la presente invención se puede administrar por vía intravenosa para tratar un cáncer en un paciente adulto. Una sola dosis habitual para administración intravenosa puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1250 mg; de preferencia, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 1250 mg; más preferentemente, de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 1250 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 750 mg a aproximadamente 1250 mg, incluso más preferentemente, de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1250 mg; incluso más preferentemente, o lo más preferentemente de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1000 mg; sin embargo, se conciben dosis por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo, especialmente teniendo en cuenta los factores que se han mencionado anteriormente. Como alternativa, una sola dosis habitual para administración intravenosa de un anticuerpo multifuncional de la presente invención puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 12 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, o incluso más preferentemente de aproximadamente 12 mg/kg a aproximadamente 13 mg/kg. Las dosis de ese tipo se pueden administrar por vía intravenosa una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres meses, o una vez cada mes, por ejemplo. La evolución se puede monitorizar mediante evaluación periódica, y la dosis se puede ajustar en consecuencia.

Estas cantidades de anticuerpo sugeridas son objeto de un gran discreción terapéutica. El factor fundamental en la selección de una dosis y la pauta de dosificación apropiados es el resultado obtenido. Los factores a tener en cuenta en el presente contexto incluyen el trastorno en particular que se está tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el procedimiento de administración, las pautas de administración, y otros factores conocidos por los expertos en medicina.

Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR de la presente invención se pueden usar como medicamentos en medicina humana, administrados mediante una diversidad de vías. Por consiguiente, la invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno cualquiera de los anticuerpos multifuncionales que se han mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a MET y EGFR de los mismos, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptables. Más preferentemente, las composiciones de ese tipo son para administración parenteral. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal, o intraperitoneal. La administración parenteral mediante administración intravenosa o intraperitoneal o cutánea es preferente. La administración intravenosa es la más precedente. En la técnica se conocen bien vehículos adecuados para una administración de ese tipo.

La composición farmacéutica por lo general debe ser estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento en el recipiente proporcionado, incluyendo por ejemplo, un vial cerrado herméticamente, jeringa u otro dispositivo de administración, por ejemplo, una pluma. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden filtrar entorno estéril, o de otro modo se pueden fabricar sin contaminación microbiana, después de fabricar la formulación.

Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano solo o con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable en una sola dosis o múltiples dosis. Las composiciones farmacéuticas de ese tipo se diseñan para que sean apropiadas para el modo de administración seleccionado, y diluyentes, vehículo, y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad incluyen, pero no se limitan a, cloruro sódico, agentes estabilizantes y similares que se usan cuando sea apropiado. Dichas composiciones se pueden diseñar de acuerdo con técnicas convencionales que se desvelan en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) que proporciona un compendio de técnicas de formulación tal como las conocen generalmente los expertos. Los vehículos adecuados para composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que, cuando se combina con un anticuerpo de la invención, mantiene la actividad de la molécula y no es reactivo para el sistema inmunológico del sujeto.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran diversas propiedades de los presentes anticuerpos multifuncionales.

EJEMPLOS

Ejemplo de Referencia 1

1.1. Expresión y purificación del anticuerpo multifuncional NH-YK

El anticuerpo multifuncional, NH-YK, se puede expresar y purificar esencialmente como sigue a continuación. Un vector de expresión de glutamina sintetasa (GS) que contiene el ADN de SEQ ID NO: 28 ( que codifica el primer polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27) y SEQ ID NO: 34 (que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 33) se usa para transfectar la línea de células de hámster chino, CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, Reino Unido) mediante electroporación. El lector de expresión codifica un promotor de SV Temprano (Virus 40E Simio) y el gen para GS. La expresión de GS permite la síntesis bioquímica de glutamina, un aminoácido requerido por las células CHOK1SV. Después de la transfección, las células se someten a una selección en volumen con L-metionina sulfoximina 50 pM (MSX). La inhibición de GS por MSX se usa para aumentar la rigurosidad de la selección. Las células con integración del ADNc del vector de expresión en regiones transcriptionalmente activas del genoma de la célula huésped se seleccionan contra células CHOK1SV de tipo silvestre, que expresan un nivel endógeno de GS. Las combinaciones transfectadas se siembran en placas a una densidad baja para permitir una extensión casi clonal de células de expresión estable. Los pocillos maestros se pueden identificar sistemáticamente para expresión de anticuerpo multifuncional y a continuación aumentara está la cifra necesario en cultivos de suspensión, sin suero. Como alternativa, los transfectantes seleccionados en volumen se pueden someter a procedimientos de clonación de una sola célula tales como Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS) o dilución limitada e identificación sistemática para expresión de anticuerpo multifuncional. Una vez que se identifica una línea celular adecuada, ésta se puede aumentar a escala si fuera necesario en cultivos de suspensión, sin suelo. El medio clarificado, en el que se ha secretado el anticuerpo multifuncional, se aplica a una columna de afinidad de Proteína Protein A que se ha equilibrado con un tampón compatible, tal como solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) o tampón Tris (pH 7,4). La columna se lava para retirar componentes de unión no específicos. El anticuerpo multifuncional unido se eluye, por ejemplo, mediante gradiente de pH (tal como tampón fosfato sódico 0,1 M a pH de 6,8 a tampón citrato sódico 0,1 M a pH 2,5-3,0). Las fracciones de anticuerpo multifuncional se detectan y/o se recogen, tal como mediante corte de absorbancia a 280 nm, SDS-PAGE o exclusión por tamaño analítica. El agregado y los multímeros solubles se pueden retirar de forma eficaz mediante técnicas habituales, incluyendo exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, o cromatografía de hidroxiapatita. El anticuerpo multifuncional se puede concentrar y/o filtrar en estado estéril usando técnicas comunes. La pureza del anticuerpo multifuncional después de estas etapas de cromatografía es superior a un 90 %, de preferencia, superior a un 98 %. El anticuerpo multifuncional se puede congelar inmediatamente a -70 °C o se puede almacenar a 4 °C durante varios meses.

1.2. Expresión y purificación de los anticuerpos multifuncionales, NH-H9

El anticuerpo multifuncional, NH-H9, se puede expresar y purificar esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo de Referencia 1.1 excepto por qué se usa un vector de expresión de glutamina sintetasa (GS) que contiene el ADN de SEQ ID NO: 30 (que codifica el primer polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29) y SEQ ID NO: 34 (que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 33) para transfectar la línea de células de hámster chino, CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, Reino Unido) mediante electroporación.

1.3. Expresión y purificación del anticuerpo multifuncional, H9

El anticuerpo multifuncional, H9, se puede expresar y purificar esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo de Referencia 1.1 excepto porque se usa un vector de expresión de glutamina sintetasa (GS) que contiene un ADN que codifica el primer polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 y el ADN de SEQ ID NO: 34 (que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 33) se usa para transfectar la línea de células de hámster chino, CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, Reino Unido) mediante electroporación.

1.4. Expresión y purificación del anticuerpo multifuncional, YK

El anticuerpo multifuncional, H9, se puede expresar y purificar esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo de Referencia 1.1 excepto porque se usa un vector de expresión de glutamina sintetasa (GS) que contiene un ADN que codifica el primer polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y el ADN de SEQ ID NO: 34 (que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 33) para transfectar la línea de células de hámster chino, CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, Reino Unido) mediante electroporación.

Ejemplo 1: Análisis de unión de anticuerpos multifuncionales a MET y EGFR

Un biosensor de resonancia de plasmón superficial tal como un BIAcore® 2000, BIAcore® 3000, o un BIAcore® T100 (Biacore Life Sciences Division, GE Healthcare, Piscataway, NJ) se puede usar para medir la cinética de unión y la afinidad de anticuerpos tales como los anticuerpos que se desvelan en el presente documento de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Excepto como se indica, todos los reactivos y materiales se pueden adquirir en BIAcore® AB (Upsala, Suecia), y las mediciones se pueden realizar a 25 °C. Descrito brevemente, las muestras se pueden disolver en tampón HBS-EP (cloruro sódico 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P-20 al 0,005 % (p/v), y ácido N-2-hidroxietil-piperazin-N'-2-etanosulfónico 10 mM (HEPES) a pH 7,4). Un chip de CM5 que contiene proteína A inmovilizada (que se puede generar usando acoplamiento convencional de NHS-EDC amina) en las cuatro celdas de flujo (Fc) se puede usar para emplear una metodología de captura. Las muestras de anticuerpos se pueden preparar a 1 mcg/ml mediante dilución en tampón de desarrollo inicialmente a continuación su captura se puede someter al ensayo a un caudal de 10 pl/min durante 30 segundos. Basándose en la cantidad capturada, la concentración de anticuerpos se puede ajustar en consecuencia para dirigir la cantidad de captura entre aproximadamente 70 RU y 90 RU. MET-ECD o EGFR-ECD humanos se pueden preparar a concentraciones finales de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,78, 0,39 y 0 (blanco) nM mediante dilución en tampón de desarrollo. Cada ciclo de análisis puede consistir en (1) captura de muestras de anticuerpo en celdas de flujo separadas (Fc2, Fc3, y Fc4), (2) inyección de 250 mcl (300 s) de Fc general de MET-ECD o ^eG^fR-ECD a 50 mcl/min, (3) vuelta al flujo de tampón durante 20 minutos para monitorizar la fase de disociación, (4) regeneración de superficies de chip con una inyección de 25 mcl (30 s) de glicina, pH 1,5, (5) equilibrio de superficies de chip con una inyección de 25 mcl (30 s) de tampón HBS-EP+ (es decir, tampón HBS-EP con un 0,05 % (p/v) de tensioactivo P-20 en lugar de un 0,005 %). Los datos se pueden procesar usando referencia doble convencional y ajustando a un modelo de unión a 1:1 usando el software de Evaluación T100 de Biacore, versión 2.0 o el software de Evaluación T200 de Biacore, versión 1.0, para determinar la tasa de asociación (kasociación, unidades en M 'V ), tasa de disociación (kdisociación, unidades en s_1), y Rmáxi (unidades de RU). La constante de disociación en equilibrio (K^d) se puede calcular a partir de la relación KD _ kdisociación/kasociación.

Se sometieron a ensayo cuatro anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR de la presente invención para determinar su cinética de unión y su afinidad de unión a MET-ECD y EGFR-ECD esencialmente como se ha descrito anteriormente y los resultados se resumen en las Tablas 4 y 5 que siguen a continuación. Los anticuerpos NH-YK, NH-H9, H9, e YK se unen tanto a MET-ECD (Tabla 4) como a EGFR-ECD (Tabla 5) con una afinidad de unión elevada (Kd).

Tabla 4: Cinética de Unión y Afinidad de anticuerpos multifuncionales con respecto a MET-ECD

Tabla 5: Cinética de Unión y Afinidad de anticuerpos multifuncionales con respecto a EGFR-ECD

Ejemplo 2: Unión de NH-YK tanto a MET como EGFR de la superficie celular

La línea H441 de células NSCLC (ATCC, Manassas, VA; N.° de catálogo HTB-174) expresa tanto MET como EGFR en la superficie celular. Las células H441 (6x 106) se pueden sembrar en placas sobre placas de cultivo tisular revestidas con 100 mm de poli-D-lisina y se incubaron 2 días a 37 °C, CO²al 5 %. A continuación las células se pueden tratar con IgG4 de control 100 nM, una combinación de cetuximab 100 nM y anticuerpo anti-MET 100 nM, o NH-YK 100 nM durante 20 minutos a 4 °C. Las células se pueden lavar con DPBS enfriado el hielo y se pueden someter a lisis usando tampón de lisis CHAPS con inhibidores de proteasa y fosfatasa HALT (Thermo Scientific, Rockford, IL). Se pueden realizar inmunoprecipitaciones (IP) sobre 600 |jg de cada muestra de elemento de lisis celular usando agarosa anti-MET o Sepharose anti-EGFR y se incuba durante una noche a 4 °C. La resina se puede lavar y la proteína unida se puede eluir de la resina, y a continuación cargar sobre SDS-PAGE al 4-20 % y se pueden hacer manchas de transferencia sobre membranas de nitrocelulosa para transferencia de Western. Las membranas se pueden sondear para MET total o EGFR total.

Los experimentos de inmunoprecipitación realizados esencialmente como se ha descrito anteriormente, demuestran que m Et y EGFR co-inmunoprecipitan después de tratamiento con el anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, pero no después del tratamiento con cualquiera del anticuerpo anti-MET, cetuximab, o incluso una combinación de anticuerpo anti-MET y cetuximab. Estos datos indican que NH-YK se pueden unir tanto a MET como a EGFR (los datos no se muestran).

Ejemplo 3: Los anticuerpos multifuncionales NH-YK y NH-H9 presentan un aumento de la avidez de unión a MET de la superficie celular

La línea HCC827 de células de cáncer NSCLC tiene niveles elevados de expresión de MET. En resumen, las células HCC827 se pueden eliminar de un matraz de cultivo usando tampón de disociación sin enzimas y se pueden añadir a aproximadamente 5 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. A continuación las células se pueden tratar con valoraciones de dosis de anticuerpos sin etiquetar (comenzando a 500 nM) en combinación con anticuerpo anti-MET etiquetado con Alexa 488 5 nM durante 1 hora a 4 °C con el fin de determinar la capacidad de los anticuerpos sin etiquetar para competir por la unión al MET de superficie celular con anticuerpo anti-MET etiquetado. Por último, la unión del anticuerpo anti-MET etiquetados se puede detectar mediante FACS.

Como se demuestra con ensayos realizados esencialmente como se describe en este Ejemplo, los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, tienen una avidez de unión demostrablemente más elevada que es su anticuerpo anti-MET precursor (Tabla 6).

Tabla 6: Los anticuerpos multifuncionales ANTI-MET/EGFR presentan un aumento de la avidez de unión con respecto a células HCC827

C onc., de an ticuerpo (nM ) MFI de A b an ti-E G FR MFI de A b anti-M E T MFI de NH -YK MFI de NH-H9 HGF (ng/m l)

500,00 65,01 3,03 3,05 3,08 25,11 100,00 65,05 4,92 3,49 4,06 43,73 20,00 65,95 13,50 4,88 7,43 53,44 4,00 64,30 35,60 10,03 18,27 57,41 0,80 64,97 51,77 27,35 41,01 57,62 0,16 64,96 59,25 47,81 54,91 60,22 0,03 65,76 59,04 55,62 60,31 61,44 MFI = significa intensidad de fluorescencia como se indica mediante competición con Ab anti-MET etiquetado con Alexa 488

Ejemplo 4: Los anticuerpos multifuncionales Anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, presentan mejor actividad que cetuximab para internalización y degradación de EGFR de la superficie celular

Parte A: La línea H441 de células NSCLC expresan niveles moderados tanto de MET como de EGFR en su superficie celular. Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR se pueden someter a ensayo para su capacidad para agotar MET y EGFR de la superficie celular de células H441. En resumen, se pueden sembrar 1,5 x 105 células en 2 ml de medio de cultivo por oficio en placas de 6 pocillos y se incuban durante una noche a 37 °C, CO²al 5 %. Los anticuerpos NH-YK, NH-H9 o anticuerpos de control se pueden añadir a 50 nM a células H441. Después de tratamiento durante una noche, las células se pueden retirar de los pocillos con tampón de disociación sin enzimas, se pueden lavar y a continuación teñir con anticuerpos EGFR o MET etiquetados (que reconocen diferentes epítopos de anticuerpos multifuncionales o tratamientos de anticuerpo de control) durante 1 hora. Las células se lavan y se miden para tinción de anticuerpo etiquetado mediante FACS.

Para evaluar la capacidad de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, para estimular la degradación de ^mE^ty EGFR in vivo, se realizaron ensayos esencialmente como se ha descrito en la parte A de este Ejemplo. Los resultados de estos estudios demuestran que los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, son capaces de agotar MET de la superficie celular de células H441 del mismo modo que su anticuerpo anti-MET precursor. De forma sorprendente, sin embargo, los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, desencadenaron una degradación de EGFR significativa mientras que cetuximab o la combinación de anticuerpo anti-MET y cetuximab no lo hizo (Tabla 7).

Parte B: La línea H1993 de células NSCLC expresa un nivel elevado de MET y un nivel moderado de EGFR; la línea MKN45 de células de cáncer gástrico expresa un nivel elevado de MET y un bajo nivel de EGFR; la línea H441 de células expresan niveles moderados tanto de MET como de EGFR en su superficie celular. En resumen, se pueden sembrar 5 x 105 células en 2 ml de medio de cultivo o pocillo en placas de 6 pocillos y se pueden incubar durante una noche a 37 °C, CO²al 5 %. Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK, NH-H9, o anticuerpos de control se pueden añadir a las células a 100 nM. Después de tratamiento durante una noche, las células se pueden someter a lisis y se pueden desarrollar 15 mg de cada muestra en geles de BisTris al 4-12 % y a continuación hacer aplicaciones puntuales sobre membranas de PVDF. Las membranas se pueden sondear mediante transferencia de Western para EGFR total, MET total, y GAPDH.

Para evaluar la capacidad de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, para estimular la degradación de m Et y EGFR in vitro, se realizaron ensayos esencialmente como se ha descrito en la parte B de este Ejemplo. Los resultados de estos estudios demuestran que los anticuerpos NH-YK y NH-H9 degradan MET de las células H1993, MKN45, y H441 del mismo modo que el anticuerpo anti-MET precursor. Sin embargo, de forma sorprendente, los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, desencadenan una degradación significativa de EGFR mientras que cetuximab o una combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab no lo hizo (Fig. 1).

Tabla 7. Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR tienen un aumento de la actividad de internalización para EGFR en células H441

Conc

MFI = significa intensidad de fluorescencia; PROM = promedio; Err Est. = Error Estándar

Ejemplo 5: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, bloquean la activación tanto de m Et como de EGFR

Parte A: Se ha mostrado que la línea H596 de células de cáncer NSCLC es resistente a los efectos inhibitorias del crecimiento de inhibidores de EGFR en presencia de HGF. Por lo tanto, esta línea celular se puede usar para determinar si los anticuerpos pueden inhibir la proliferación de células H596 en presencia de HGF. Descrito en resumen, se pueden sembrar 3 x 103 células/pocillo en 100 pl de medio de cultivo en placas de 96 pocillos y se pueden incubar durante una noche a 37 °C, CO²al 5 %. Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-Yk y NH-H9, o anticuerpos de control se pueden diluir a 1:3 en medio de cultivo sin suero partiendo de 100 nM (final) y se puede añadir en combinación con 50 ng/ml de HGF (final) en 50 pl como concentraciones de 4x a las células h596. Al final de un periodo adicional de 6 días de crecimiento celular, las placas se pueden equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos y se pueden añadir 100 pl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega Corp., Fitchburg, WI). La viabilidad celular se puede determinar midiendo la luminiscencia.

Los ensayos realizados esencialmente como se describe en este Ejemplo demuestran que los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, inhiben la proliferación in vitro de H596 estimuladas con HGF mejor que cetuximab o una combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab.

Tabla 8: Los anticuerpos multifuncional es anti-MET/EGFR presentan una actividad superior a la de la combinación de anticuerpos individuales en la inhibición de la proliferación de H596 en presencia de HGF

Conc. de anticuerpo. hIgG4 cetuximab Ab anti-MET (nM)

PROM Err Est. PROM Err Est. PROM Err Est.

100 132,3 1,1 129,2 4,0 108,6 3,1 33,3 130,9 0,7 127,4 1,8 112,8 1,4 11,1 138,6 1,9 132,6 0,2 121,0 3,1 3,7 137,0 1,6 129,7 2,7 121,4 1,8 1,2 138,5 2,5 132,0 4,7 128,2 0,0 0,4 138,9 0,9 128,6 2,4 129,8 1,8 0,0 100,0 0,6

Conc. de anticuerpo. Ab anti-MET cetuximab NH-YK NH-H9

(nM)

PROM Err Est. PROM Err Est. PROM Err Est.

100 98,1 3,1 101,5 0,4 101,6 0,6 33,3 108,0 1,2 101,3 1,7 101,8 1,0 11,1 116,1 2,6 107,1 3,0 104,8 0,8 3,7 116,7 1,6 103,9 1,2 102,6 1,9 1,2 125,0 0,6 108,1 1,3 101,9 1,0 0,4 131,8 1,5 113,4 0,9 106,7 3,1 0,0

Anticuerpo solo, (100 nM) PROM Err Est. hIgG4 102,51 1,06 cetuximab 91,35 0,71 Ab anti-MET 92,33 0,98 Ab anti-MET cetuximab 94,03 0,07 NH-YK 94,10 0,38 NH-H9 91,55 0,75 HGF, 50 ng/ml 136,66 0,48 Abreviaturas: PROM = % de promedio de viabilidad celular; Err Est. = Error Estándar

Parte B: Para determinar si los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR tienen una actividad superior que la combinación de dos anticuerpos individuales para inhibir la proliferación de células tumorales en ensayos in vitro también se pueden usar otras líneas de células tumorales. Por ejemplo, se ha mostrado que la línea GEO de células de cáncer de colon está dirigida por la activación autocrina del ligando de EGFR a pesar de tener un nivel medio expresión de MET. La línea H1666 de células de cáncer de pulmón tiene amplificación genética de EGFR y se ha mostrado que su proliferación está dirigida por la activación de EGFR. Ambas líneas de células NSCLC, H1993 y EBC expresan un nivel elevado de MET, debido a la amplificación genética de MET, y un nivel moderado de EGFR.

Los ensayos realizados esencialmente como se describe en este Ejemplo demuestran que los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, inhiben la proliferación in vitro de la línea GEO de células de cáncer de colon mejor que cetuximab y, de forma sorprendente, incluso de forma más potente que la combinación de su anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab (Tabla 9).

Tabla 9: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR presentan una actividad superior a la de la combinación de anticuerpos individuales en la inhibición de la proliferación de GEO

_AnticuerpohIgG4 cetuximab Ab anti-MET ^(nM) PROM Err Est. PROM Err Est. PROM Err Est.

100 102,64 0,54 46,39 1,55 101,71 0,39

33,33 102,43 0,33 50,06 0,55 101,48 0,66

11,11 102,43 0,11 57,67 1,27 102,82 0,66

3,70 102,22 1,12 67,23 0,68 103,03 0,58

1,23 103,80 0,45 73,63 2,71 103,42 0,55

0,41 102,56 1,08 77,70 2,46 103,42 0,22

0,14 103,30 1,66 89,99 5,56 104,67 0,33

0,05 103,00 1,40 100,83 0,80 105,67 0,41

0,02 103,42 1,11 101,64 0,93 103,90 1,28

0,00 100,00 0,33

Anticuerpo Ab anti-MET cetuximab NH-YK NH-H9

(nM)

PROM Err Est. PROM Err Est. PROM Err Est.

100 57,93 0,52 46,15 1,67 42,65 0,96

33,33 61,99 2,02 45,05 1,03 41,33 1,31

11,11 69,07 2,36 44,44 0,57 43,99 0,44

3,70 76,49 1,58 47,99 0,79 45,52 1,05

1,23 77,92 0,99 47,09 0,76 44,21 1,11

0,41 92,10 4,98 51,33 0,80 47,07 0,65

0,14 103,72 1,57 61,90 1,74 59,98 1,30

0,05 104,32 0,41 77,54 1,87 76,05 1,52

0,02 104,90 0,55 103,62 2,22 102,97 1,04

0,00

Abreviaturas: PROM = % de promedio de viabilidad celular; Err Est. = Error Estándar

De forma análoga, los resultados que se muestran en la Tabla 10 demuestran que cada uno de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK, NH-H9, y H9, inhibe la proliferación de H1666 mejor que cetuximab y de forma más potente que la combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab.

Tabla 10: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR presentan una actividad superior a la de la combinación de los anticuerpos individuales en la inhibición de la proliferación de H1666

Conc. de hIgG4 cetuximab Ab anti-MET

anticuerpo

(nM)

Err Err Err

PROM Est. PROM Est. PROM Est.

100 94,45 0,92 30,60 0,36 101,25 1,63

33,33 103,42 2,64 35,13 1,17 102,15 2,90

11,11 104,25 2,50 41,65 0,63 105,58 2,99

3,70 100,34 0,46 49,31 1,96 106,48 1,57

1,23 101,46 2,01 56,26 0,47 103,49 1,48

0,41 103,94 1,53 68,71 1,40 105,72 1,99

0,14 104,85 2,46 84,94 3,16 101,01 1,33

0,05 104,24 1,46 97,56 1,50 105,35 2,11

0,02 108,89 2,07 102,80 1,80 104,50 2,24

0,00 100,00 0,47

Conc. de Ab anti-MET NH-YK NH-H9 H9

anti

cuerpo cetuximab

^(nM) Err PRO Err Err PRO Err

PROM Est. M Est. PROM Est. M Est.

100 36,78 0,73 26,36 0,14 23,11 0,27 28,02 0,25

33,,33 42,61 0,66 27,94 0,39 24,12 0,29 31,22 1,43

11, 11 48,24 0,59 31,92 0,18 26,58 0,40 34,67 0,66

3,,70 53,18 1,57 36,86 0,61 31,64 0,52 41,65 0 14

1,,23 63,92 1,76 45,62 0,96 38,65 0,75 49,45 0,40

0,,41 70,46 0,34 65,52 2,92 52,90 0,75 58,90 1 11

0, 14 81,73 1,58 87,22 3,16 77,78 2,82 79,34 2,48

0,,05 96,94 1,74 105,1 3,84 100,45 2,88 96,50 1,02

0,,02 103,30 1,02 106,3 2,88 104,51 1,19 99,45 2,59

0,,00

De forma análoga, los resultados que se muestran en la Tabla 11 demuestran que cada uno de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, inhiben la proliferación de H1993 (Tabla 11) y EBC-1 (Tabla 12) tan bien o mejor que la combinación de su anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab.

Tabla 11: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR presentan una actividad superior a la de la combinación de los anticuerpos individuales en la inhibición de la proliferación de H1993

Conc. de hIgG4 cetuximab Ab anti-MET

anticuerpo

(nM)

Err Err Err

PROM Est. PROM Est. PROM Est.

100 98,68 2,39 95,77 1,07 53,17 1,11

(continuación)

Conc. de hIgG4 cetuximab Ab anti-MET anticuerpo

(nM)

Err Err Err PROM Est. PROM Est. PROM Est.

33,33 101,50 1,91 102,27 2,01 51,66 0,75

11,11 102,77 1,47 101,18 1,95 52,92 0,41

3,70 102,53 1,41 100,52 1,08 57,39 1,31

1,23 99,73 0,63 98,61 0,28 84,82 0,93

0,41 103,23 0,02 97,18 1,78 98,80 1,71

0,14 103,29 0,33 99,45 2,35 99,69 0,98

0,05 102,09 1,01 96,62 1,79 100,67 2,36

0,02 100,28 1,18 97,48 2,79 99,77 0,56

0,00 100,00 0,63

Conc. de Anti-MET Ab NH-YK NH-H9 anticuerpo cetuximab

(nM)

Err Err Err PROM Est. PROM Est. PROM Est.

100 47,47 0,76 40,83 0,57 36,90 0,97

33,33 47,95 0,76 42,08 1,18 38,38 0,30

11,11 49,33 0,74 44,42 1,37 40,71 0,97

3,70 53,12 2,03 51,21 0,96 44,22 0,82

1,23 75,00 1,04 84,69 1,33 75,02 0,82

0,41 96,13 2,16 94,11 0,79 94,40 0,45

0,14 99,82 1,74 96,67 1,70 99,09 1,20

0,05 100,80 1,78 98,77 1,20 100,26 0,99

0,02 100,84 0,76 99,43 0,19 100,60 1,43

0,00

Tabla 12: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR presentan una actividad superior a la de la combinación de los anticuerpos individuales en la inhibición de la proliferación de EBC-1

Conc. de hIgG4 cetuximab Ab anti-MET anticuerpo

(nM)

Err Err Err PROM Est. PROM Est. PROM Est.

100 105,35 1,61 107,55 1,27 43,38 0,14

33,33 102,82 0,74 105,74 1,31 38,11 0,57

11,11 102,08 0,63 105,58 0,98 37,24 0,55

3,70 103,72 1,19 106,17 1,48 35,75 0,87

1,23 103,53 2,28 106,03 0,80 38,84 0,44 (continuación)

Conc. de hIgG4 cetuximab Ab anti-MET

anticuerpo

(nM)

Err Err Err

PROM Est. PROM Est. PROM Est.

0,41 103,48 0,72 105,02 1,70 80,23 1,47

0,14 100,42 1,09 103,51 0,57 99,04 1,21

0,05 100,00 1,96 100,73 0,95 102,58 0,54

0,02 102,36 0,92 102,02 1,88 102,25 0,77

0,00 100,00 0,38

Conc. de Anti-MET Ab NH-YK NH-H9

anticuerpo cetuximab

(nM)

Err Err Err

PROM Est. PROM Est. PROM Est.

100 40,73 0,80 34,95 0,22 22,34 0,27

33,33 36,25 1,20 30,65 0,19 21,30 0,42

11,11 34,08 0,42 30,15 0,47 21,15 0,58

3,70 33,54 0,80 33,04 0,90 22,43 0,37

1,23 35,60 0,50 46,98 1,11 24,23 0,43

0,41 73,46 0,64 91,82 0,83 79,44 0,82

0,14 101,37 1,06 97,62 1,29 97,02 1,89

0,05 102,92 0,80 102,14 1,96 100,50 1,21

0,02 101,88 1,16 101,86 1,82 101,03 0,65

0,00

Ejemplo 6 ^: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, inducen apoptosis

La línea MKN45 de células de cáncer gástrico se puede usar para someter a ensayo la apoptosis inducida por anticuerpos. En resumen, se pueden sembrar 3 x 103 células/pocillo en 80 j l de medio de cultivo en placas de 96 pocillos y se pueden incubar durante una noche a 37 °C, CO²al 5 %. El reactivo CellEvent™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) se puede diluir en medio de cultivo celular y añadir a 10 j l por pocillo. Los anticuerpos NH-YK, NH-H9 o anticuerpos de control se añadieron como concentraciones de 10x a 10 j l a células MKN45 para concentraciones finales de 100 nM. Las células positivas para caspasa-3/7 se pueden medir en tiempo real mediante el Sistema de Formación de Imágenes Cinéticas INCUCYTE™ (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI) con intervalos de 3 horas a 37 °C, CO²al 5 % para un total de 120 horas.

Como se determina mediante el rendimiento de los ensayos esencialmente como se describe en este Ejemplo, cada uno de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, induce una Apoptosis más elevada in vitro en MKN45 que una combinación del Ab de MET precursor y cetuximab (Tabla 13). Además, en ensayos realizados esencialmente como se describe en este Ejemplo, NH-YK induce la apoptosis de MKN45 en un mayor alcance que la combinación de 5D5 de una sola rama y erlotinib (los datos no se muestran).

Tabla 13: Ensayo de Apoptosis de MKN45

Conc., 24 h 48 h 72 h de anticuerpo

(100 nM)

Err Err Err

PROM Est. PROM Est. PROM Est.

sin tratar 100,00 2,92 100,00 10,14 100,00 13,83 hIgG4 83,60 8,92 106,20 3,55 111,25 13,78 cetuximab 73,56 4,69 121,70 26,26 102,24 10,34

Ab

Anti-MET 100,35 7,27 222,81 28,70 275,40 21,16

Ab

Anti-MET

cetuximab 126,73 22,78 235,60 29,73 292,40 23,35

NH-YK 114,20 9,96 291,31 19,04 393,83 43,63

NH-H9 94,60 10,59 243,82 35,58 361,13 9,04

Conc., de 96 h 120 h

anticuerpo (100 nM)

PROM Err Est. PROM Err Est.

sin tratar 100,00 13,48 100,00 7,55 hIgG4 91,24 10,61 108,28 12,02 cetuximab 107,11 3,56 127,04 14,16

Ab Anti-MET 286,63 32,84 353,84 30,08

Ab Anti-MET

cetuximab 326,83 32,56 386,84 19,08

NH-YK 446,24 28,10 557,79 32,44

NH-H9 434,42 2,87 515,31 13,63

Abreviaturas: PROM = % de promedio de apoptosis celular;

Err Est. = Error Estándar

Ejemplo 7: El anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, restaura la sensibilidad de células tumorales a erlotinib en presencia de HGF.

La línea cancer HCC827 de células de cáncer NSCLC tiene amplificación genética de EGFR y expresión elevada de MET. Las células HCC827 son sensibles al tratamiento con erlotinib, pero se hacen resistentes al tratamiento con erlotinib en presencia de HGF. En resumen, 3 x 103 células/pocillo en 100 pl de medio de cultivo se pueden sembrar en placas en de 96 pocillos y se pueden incubar durante una noche a 37 °C, CO²al 5 %. Se pueden añadir anticuerpos NH-YK o de control (hIgG4) a las células durante 1 hora seguido de la adición de erlotinib y/o HGF para concentraciones finales de anticuerpo 50 nM, 50 ng/ml de HGF, y erlotinib 1 pM. Al final de un periodo adicional de 3 días de crecimiento celular a 37 °C con una humedad relativa de un 95 % y CO²al 5 % (v/v), las placas se puede en equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos y se pueden añadir 100 pl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega Corp.). Las placas se pueden agitar durante dos minutos en un agitador orbital para mezclar los contenidos y a continuación se dejan incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal luminiscente. La viabilidad celular se puede determinar midiendo la luminiscencia.

Tal como se determina mediante el rendimiento de ensayos esencialmente como se describe en este Ejemplo, el anticuerpo NH-YK es capaz de restablecer la sensibilidad de células HCC827 a erlotinib in vitro en presencia de HGF mejor que el anticuerpo anti-MET precursor en combinación con cetuximab (Tabla 14).

Tabla 14: El anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, tiene una actividad superior a la de una combinación de anticuerpos individuales para restaurar la sensibilidad de HCC827 a erlotinib en presencia de HGF

Conc., de sin tratar Erlotinib, Erlotinib H Erlotinib H anticuerpo 1 pM 50 ng/ml hIgG4

(50 nM)

PROM 101,27 17,98 80,00 85,14

Err Est. 2,26 0,20 3,95 1,39

Conc., de Erlotinib H Erlotinib H Erlotinib H Erlotinib H anticuerpo cetuximab Ab anti-MET Ab anti-MET NH-YK

(50 nM) cetuximab

PROM 102,76 46,35 61,33 27,25

Err Est. 0,86 0,65 1,59 1,01 Abreviaturas: PROM = % de promedio de viabilidad celular; Err Est. = Error Estándar; H = HGF

Ejemplo 8: El anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, NH-YK, restaura la sensibilidad de células HT-29 tratadas con HGF y E^gF al inhibidor de B-Raf, PLX4032.

La línea HT-29 de células de cáncer de colon tiene una mutación B-Raf y es sensible al inhibidor de B-Raf, PLX4032. Las células HT-29 se hacen resistentes al tratamiento con PLX4032 o con el inhibidor de pan-Raf después de estimulación con HGF y EGF. Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR se pueden someter al ensayo para su capacidad para restaurar la sensibilidad del inhibidor PLX4032 de células HT-29 tratadas con HGF y EGF. En resumen, 3 x l03 células/pocillos en 100 pl de medio de cultivo se pueden sembrar en placas de 96 pocillos e incubar durante una noche a 37 °C, CO²al 5 %. El anticuerpo NH-YK, PLX4032, HGF, Eg F, controles positivos, y controles negativos se diluyeron en medio de cultivo sin suero y se añadieron a células HT-29 cells en 50 pl como concentraciones de 4x. Las concentraciones finales de los reactivos pueden ser: 50 nM para anticuerpos, 50 ng/ml para HGF y EGF, y diluciones a 1:5 de PLX4032 comenzando en 1 pM. Al final de un periodo adicional de 5 días de crecimiento celular, las placas se pueden equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos y se pueden añadir 100 pl por pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega Corp.). La viabilidad celular se puede determinar midiendo la luminiscencia.

Tal como se determina mediante el rendimiento de ensayos esencialmente como se describe en este Ejemplo, el anticuerpo NH-YK es capaz de restaurar la sensibilidad a PLX4032 de células HT-29 tratadas con ^hG^fy EGF (Tabla 15). Además, el anticuerpo NH-YK es superior a la combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab para restaurarla sensibilidad para lapatinib (es decir, un inhibidor de EGFR/HER-2) en células FaDu (Tabla 16).

Tabla 15: El anticuerpo NH-YK tiene una actividad superior que la combinación de anticuerpos individuales para restablecer la sensibilidad de HT-29 con respecto al inhibidor B-Raf PLX4032 en presencia de HGF y EGF

Conc., PLX PLX H E PLX H E PLX H E

de hIgG4 cetuximab

PLX

(nM)

PROM Err PROM Err PROM Err PROM Err Estd. Estd. Estd. Estd.

1000 33,67 0,19 104,02 0,58 108,76 0,64 103,80 2,43 200,00 56,66 0,36 120,67 1,65 124,38 4,18 121,05 1,36 40,00 83,14 0,18 122,51 1,39 124,52 1,61 123,21 1,19 8,00 97,63 1,05 120,42 0,51 125,81 0,31 124,51 0,44 1,60 99,92 0,94 117,09 1,98 116,77 2,15 127,26 0,76 0,32 101,11 1,13 113,02 1,57 120,78 1,56 125,35 2,78 (continuación)

Conc., PLX PLX H E PLX H E PLX H E

de hIgG4 cetuximab

PLX

(nM)

PROM Err PROM Err PROM Err PROM Err Estd. Estd. Estd. Estd.

0,00 100,00 1,01

Conc., PLX H E PLX H E PLX H E

de Ab anti-MET Ab anti-MET NH-YK

PLX cetuximab

(nM) PROM Err PROM Err PROM Err

Estd. Estd. Estd.

1000 110,65 2,28 97,86 1,41 39,98 0,89

200,00 120,52 1,18 116,73 1,20 59,53 0,94

40,00 122,38 0,19 121,34 0,65 85,59 1,03

8,00 123,57 1,94 122,98 0,70 98,74 0,86

1,60 126,02 0,86 125,28 0,50 100,39 0,11

0,32 123,46 3,30 124,17 0,31 101,93 1,59

0,00

Abreviaturas: PLX = PLX4032; PROM = % de promedio de viabilidad celular;

Err Estd. = Error Estándar; H = HGF (50 ng/ml); E = EGF (50 ng/ml)

Todos los anticuerpos a 50 nM

Tabla 16: Los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR, NH-YK y NH-H9, tienen tiene una actividad superior que la combinación de anticuerpos individuales para restablecer la sensibilidad de FaDu con respecto a lapatinib en presencia de HGF

% de viabilidad celular

lapatinib, lapatinib lapatinib

|jM lapatinib lapatinib lapatinib H H lapatinib lapatinib solo H H etuximab H H

cetuximab anti- c

MET anti- NH-H9 NH-YK MET

0 95,99 154,12 139,07 130,33 98,43 59,67 60,33

0,001 99,49 154,06 151,14 128,70 98,47 64,58 62,16

0,003 101,04 165,69 155,31 158,30 111,36 63,61 56,71

0,01 95,77 157,19 146,42 143,19 107,71 53,75 53,64

0,03 68,82 150,88 140,30 127,18 92,73 53,60 53,56

0,1 45,42 142,78 131,75 102,62 73,76 42,42 48,89

0,3 32,49 131,23 120,62 79,03 64,03 38,82 45,47

1 26,85 112,89 104,69 60,76 57,14 33,93 37,68

3 18,52 15,06 12,15 15,37 10,44 20,42 29,46

10 17,07 9,65 6,54 9,05 7,41 20,85 17,59

H = HGF (50 ng/ml); todos los anticuerpos a 50 nM

(continuación)

% de viabilidad celular

lapatinib

lapatinib, lapatinib lapatinib lapatinib lapatinib E lapatinib lapatinib 2 |jM solo E E E anti- cetuximab E E

cetuximab MET anti- NH-H9 NH-YK MET

% de viabilidad celular

lapatinib

lapatinib, lapatinib lapatinib lapatinib lapatinib E lapatinib lapatinib 2 j M solo E E E anti- cetuximab E E

cetuximab MET anti- NH-H9 NH-YK MET

0 102,84 145,35 136,60 144,82 120,07 90,91 110,53

0,001 109,28 149,73 145,86 155,81 132,52 106,86 118,84

0,003 108,81 170,83 156,56 163,50 146,05 108,79 115,48

0,01 78,67 158,71 149,86 147,32 154,82 90,88 109,72

0,03 69,43 160,76 150,95 148,64 122,95 65,99 102,30

0,1 45,64 152,45 101,10 143,07 101,54 42,00 62,87

0,3 32,47 161,37 47,58 137,03 56,25 33,46 40,24

1 26,27 141,20 31,90 128,06 36,16 29,66 27,80

3 18,99 37,11 21,17 18,19 23,48 18,10 19,41

10 19,62 21,39 17,61 15,87 22,55 14,88 7,06

E = EGF (50 ng/ml); todos los anticuerpos a 50 nM

Ejemplo 9 ^: Degradación de MET y EGFR en modelos de xenoinjerto de ratón

La capacidad de los anticuerpos multifuncionales anti-MET/EGFR para estimular la degradación de MET y EGFR in vivo se puede evaluar en ratones portadores de tumores de xenoinjerto de H441 (NSCLC) y MKN45 (carcinoma gástrico) de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.

La administración del anticuerpo NH-YK a dos niveles de dosis diferentes (10 y 27 mg/kg) indujo la degradación de MET a niveles comparables a los de la combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab (ambos dosificados a 20 mg/kg) 48 horas después de la dosificación en xenoinjertos de H441. Por el contrario, la combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab (ambos dosificados a 20 mg/kg) fracaso en la inducción de la degradación de EGFR cuando se comparó con animales de control tratados con PBS en el mismo modelo de xenoinjerto. De manera sorprendente, la administración del anticuerpo NH-YK desencadenó una degradación de EGFR significativa cuando se comparó con cualquiera de los ratones tratados con PBS o con el anticuerpo anti-MET precursor y tratados con cetuximab (ambos dosificados a 20 mg/kg). De forma análoga, en animales portadores de xenoinjertos gástricos de MKN45, el anticuerpo NH-YK estimuló una degradación de MET equivalente pero de forma sorprendente una degradación mucho mayor de EGFR cuando se comparó con la combinación del anticuerpo anti-MET precursor y cetuximab (ambos dosificados a 20 mg/kg).

Ejemplo 10: Inhibición del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de ratón para NSCLC (H1993, H441, EBC-1) y cáncer gástrico

Los ratones desnudos atímicos hembra con edades de 6 a 7 semanas están disponibles en el mercado, incluyendo en Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Se permitió que los ratones se aclimataran durante una semana y que se alimentaran a voluntad con una dieta de bajo contenido de grasa (4,5 %) normal, que se puede continuar durante el periodo de duración del estudio. Las células tumorales están disponibles para su adquisición en la ATCC y se pueden cultivar en medio de cultivo celular tal como RPMI 1640 (Life Technologies) con L-glutamina, HEPES 25 mM suplementado con FBS al 10 % y Piruvato Na 1 mM. Las células se pueden desprender, se pueden lavar con medio sin suero y a continuación se pueden volver a suspender a una concentración final de 50 x 106 células/ml en RPMI 1640 sin suero. Las células tumorales, aproximadamente 5x 106 se pueden inyectar por vía subcutánea en el costado trasero de los ratones objeto en una mezcla a 1:1 de medio de crecimiento sin suero y Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). Las mediciones del tumor y del peso corporal se realizan dos veces a la semana. Antes del tratamiento, los ratones se pueden clasificar de forma aleatoria basándose en el tamaño del tumor usando un algoritmo de clasificación aleatoria. Los tratamientos pueden comenzar cuando el volumen medio del tumor alcanza 100 mm3 Los ratones clasificados de forma aleatoria se separaron en diferentes grupos y se les administró la dosificación de anticuerpos a través de inyección en la vena de la cola una vez a la semana.

Todos los anticuerpos de ensayo o de control se prepararon en Solución Salina Tamponada con fosfato (PBS) antes de la dosificación. El tamaño del tumor se puede determinar mediante mediciones con calibrador. El volumen tumoral (mm3) se puede calcular a partir de la fórmula A2 x B x 0,536, en la que A es el más pequeño y B el más grande de los diámetros perpendiculares. Los datos del volumen tumoral se pueden transformar a una escala log para igualar la varianza en el a través de grupos de tiempo y tratamiento. Los datos log del volumen se pueden analizar con mediciones de ANOVA repetidas bidireccionales mediante tiempo y tratamiento usando el software SAS PROC MIXED (SAS Institutes Inc, Cary, NC). Los grupos de tratamiento se comparan con el grupo de control especificado en cada punto temporal.

Parte A: Se generaron ratones inmunodeficientes portadores de xenoinjertos de H1993 NSCLC como se ha descrito anteriormente en este Ejemplo y se trataron con cualquiera de control de vehículo, el anticuerpo NH-YK, o la combinación del anticuerpo MET precursor más cetuximab una vez a la semana durante 5 semanas consecutivas. La combinación del anticuerpo MET precursor y cetuximab (ambos dosificados a 20 mg/kg) dio como resultado un valor del porcentaje del volumen del tumor tratado promedio dividido entre el valor de volumen del tumor de control de vehículo promedio (% de T/C) de un 86,1 % mientras que una dosis equimolar de anticuerpo NH-YK (27 mg/kg) dio como resultado una disminución significativamente más elevada en el volumen tumoral (% de T/C de un 28,5 %, p < 0,001) (Fig. 2). Cuando se somete a ensayo en xenoinjertos de H441, el anticuerpo NH-YK también mostraba una eficacia superior cuando se comparaba con cualquiera del control de vehículo o la combinación del anticuerpo MET precursor y cetuximab (Fig. 3).

Parte B: En un modelo de xenoinjerto de EBC-1 NSCLC, el tratamiento (10 mpk) con el anticuerpo NH-YK dio como resultado un % de T/C de un 32,9 % (p < 0,001) (Fig. 4).

Parte C: La línea de células MKN45 de cáncer gástrico tiene un nivel elevado de amplificación genética de MET y es muy sensible a los inhibidores MET. En un modelo de xenoinjerto gástrico de MKN45, el anticuerpo NH-YK mostró una eficacia anti tumoral comparable a la de la combinación del MET precursor y cetuximab (% de T/C = 17,4 %, p < 0,001 y un 18,6 %, p < 0,001, respectivamente) (Fig. 5).

Parte D: En el modelo de xenoinjerto de H1993, los ratones inmunodeficientes portadores de xenoinjertos se trataron con cualquiera de control de vehículo, el anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, H9 (4 y 27 mg/kg), anti-MET solo (3 y 20 mg/kg), cetuximab (3 y 20 mg/kg) o la combinación de anti-MET más cetuximab (3 mg/kg y 20 mg/kg de cada anticuerpo) una vez a la semana durante cinco semanas consecutivas. El anticuerpo multifuncional anti-MET/EGFR, anticuerpo H9 a 27 mg/kg dio como resultado una eficacia anti tumorales significativamente más elevada que la de cualquier otro tratamiento (p < 0,001) (Fig. 6).

Cuando se somete a ensayo en xenoinjertos de H441, el anticuerpo H9 también mostró una eficacia superior cuando se comparaba con tratamientos individuales o la combinación del MET precursor y cetuximab (Fig. 7).

Ejemplo 11: Modelos de inhibición del crecimiento tumoral en xenoinjerto obtenido a partir del paciente (PDX) para cáncer colorrectal

Las muestras de carcinoma colorrectal obtenidas a partir del paciente se pueden proporcionar los fragmentos de tumor obtenidos a partir de un paciente individual se pueden implantar en un solo ratón inmunocomprometido y se puede permitir que crezca hasta que alcance un volumen aproximado de 100-200 mm3. El anticuerpo NH-YK a 27 mg/kg o control de vehículo se puede administrar una vez a la semana durante 3-4 semanas consecutivas. Los tumores pueden medir mediante calibrador electrónico dos veces a la semana. El peso corporal también se puede evaluar de forma regular. El grupo de control de vehículo se puede tratar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada mediante inyección intra-peritoneal (i.p.) con una pauta de dosificación de cuatro ciclos. El volumen tumoral se prevé calcular usando la fórmula: A2 x B x 0,536, en la que A es el más pequeño y B es el más grande de los diámetros perpendiculares.

Las muestras de carcinoma colorrectal obtenidas a partir de los pacientes se implantaron individualmente en dos ratones inmunocomprometidos diferentes esencialmente como se ha descrito anteriormente en este Ejemplo 11. Como se muestra en las Tablas 17 y 18, la administración semanal del anticuerpo NH-YK redujo de forma significativa el volumen de cada uno de los tumores PDX cuando se comparó con los animales tratados con vehículo portadores de tumores PDX.

Tabla 17

Ejemplo 12: Inhibición del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto obtenido a partir de paciente (PDX) para Carcinoma de Células Escamosas de la Cabeza y Cuello (SCCHN)

Las muestras de carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (SCCHN) obtenidas a partir del paciente se pueden proporcionar y los fragmentos del tumor obtenidos a partir de un paciente individual se pueden implantar en un solo ratón inmunocomprometido y permitir que crezca hasta que alcance un volumen aproximado de 100 200 mm3 El anticuerpo NH-Y^ka 27 mg/kg o control de vehículos se puede administrar dos veces a la semana durante 4 semanas consecutivas. Los tumores se pueden medir mediante calibrador electrónico dos veces a la semana. El peso corporal también se puede evaluar de forma regular. El grupo de control de vehículo se puede tratar con PBS administrado mediante inyección i.p. con una pauta de dosificación de una vez a la semana durante cuatro ciclos y un 20 % de PEG al 400/80 % [captisol al 20 % en agua desionizada destilada] administrado a través de sonda oral (p.o.) con una pauta de dosificación de una vez al día durante 28 ciclos. El volumen tumoral se puede calcular usando la fórmula: Volumen Tumoral (mm3) = anchura2 x longitud x 0,52.

El carcinoma de células escamosas de las muestras de tumor de cabeza y cuello de dos pacientes se implantaron de forma individual en dos ratones inmunocomprometidos esencialmente como se ha descrito anteriormente en este Ejemplo 12. Como se muestra en la Tabla 19, la administración dos veces a la semana del anticuerpo NH-YK redujo de forma significativa el volumen del tumor PDX cuando se comparó con un animal tratado con vehículo portador de un tumor PDX.

Tabla 19

El error estándar de la media (ETM)

Ejemplo 13: Inhibición del crecimiento tumoral en modelo de xenoinjerto de ratón para NSCLC resistente a erlotinib (HCC-827 resistente a erlotinib)

Los ratones desnudos atímicos hembra con edades de 6 a 7 semanas están disponibles en el mercado, incluyendo en Harlan Laboratories. Se permitió que los ratones se aclimataran durante una semana y que se alimentaran a voluntad con una dieta de bajo contenido de grasa (4,5 %) normal, que se puede continuar durante el periodo de duración del estudio. Las células tumorales HCC-827 están disponibles para su adquisición en la ATCC y se pueden cultivar en medio de cultivo celular tal como RPMI 1640 con L-glutamina, HEPES 25 mM suplementado con FBS al 10 % y Piruvato Na 1 mM. Las células se pueden desprender, se pueden lavar con medio sin suero y a continuación se pueden volver a suspender a una concentración final de 50 x 106 células/ml en RPMI 1640 sin suero. Las células tumorales viables, aproximadamente 5x 106, se pueden implantar por vía subcutánea en el costado trasero de los ratones desnudos atímicos hembra en una mezcla a 1:1 de medio de crecimiento sin suero y Matrigel. Una vez que los tumores se establecen, los ratones se pueden tratar con dosis diarias de 25 mg/kg de erlotinib hasta que los tumores resistentes comienzan a crecer de nuevo, incluso en presencia de erlotinib. Una vez que los tumores resistentes alcanzan un volumen medio de aproximadamente 1000 mm3, éstos se pueden extirpar, dividir en fragmentos de 50 mm3 y se pueden volver a implantar en un ratón desnudo atímico hembra objeto. Con el fin de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo multifuncional que comprende:

(a) un anticuerpo que se une a MET y comprende:

i) una cadena pesada que comprende las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y

ii) una cadena ligera que comprende las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente; y

(b) un polipéptido scFv que se une a EGFR y comprende:

i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) o VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y

ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, y scFv-LCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), RYAKESiS (SEQ ID NO: 5) o YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6), respectivamente.

2. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el polipéptido scFv comprende:

(a) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y

(b) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

3. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

4. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el extremo C-terminal del polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo MET.

5. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

6. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

7. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que el anticuerpo que se une a MET comprende:

(a) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que cada una de las cadenas pesadas comprende las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y

(b) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que cada una de las cadenas ligeras comprende las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente.

8. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende dos polipéptidos scFv cada uno comprendiendo:

i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) o VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, y scFv-LCDR3 que consiste en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), RYAKESIS (SEQ ID NO: 5) o YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6).

9. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 8 en el que el primer polipéptido scFv y el segundo polipéptido scFv cada uno comprende:

(a) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y

(b) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

10. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el primer y el segundo polipéptidos scFv cada uno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

11. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 10 en el que el anticuerpo que se une a MET comprende:

i) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que cada una de las cadenas pesadas comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y

ii) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que cada una de las cadenas ligeras comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33.

12. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el extremo C-terminal del primer polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la primera cadena pesada y el extremo C-terminal del segundo polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la segunda cadena pesada.

13. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que la secuencia de aminoácidos de ambos primeros polipéptidos es SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de ambos segundos polipéptidos es SEQ ID NO: 33.

14. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que el anticuerpo multifuncional induce internalización y/o degradación de MET y EGFR de superficie celular.

15. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el scFv que se une a EGFR comprende: i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO:3), respectivamente; y

ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, scFv-LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6), respectivamente.

16. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 15 en el que el polipéptido scFv comprende:

(a) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y

(b) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

17. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en el que el anticuerpo que se une a MET comprende:

i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y

ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

18. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el extremo C-terminal del polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo MET.

19. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

20. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que comprende: i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; y

ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

21. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el anticuerpo que se une a MET comprende:

i) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que ambas cadenas pesadas comprenden las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11), RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARANWLDY (SEQ ID NO: 13), respectivamente; y

ii) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que ambas cadenas ligeras comprenden las CDR de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14), YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15) y QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente.

22. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 21 que comprende dos polipéptidos scFv cada uno comprendiendo:

i) un dominio HCVR que comprende las CDR de scFv scFv-HCDR1, scFv-HCDR2, y scFv-HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1), VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7), y ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3), respectivamente; y

ii) un dominio LCVR que comprende las CDR de scFv scFv-LCDR1, scFv-LCDR2, scFv-LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4), YYASRSIS (SEQ ID NO: 8), y QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6), respectivamente.

23. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 22 en el que el primer polipéptido scFv y el segundo polipéptido scFv cada uno comprende:

i) un dominio HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y

ii) un dominio LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

24. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el primer y el segundo polipéptidos scFv cada uno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

25. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 24 en el que el anticuerpo que se une a MET comprende:

i) una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que ambas cadenas pesadas comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y

ii) una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera en el que ambas cadenas ligeras comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33.

26. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 25 en el que el extremo C-terminal del primer polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la primera cadena pesada y el extremo C-terminal del segundo polipéptido scFv se fusiona mediante un engarce peptídico al extremo N-terminal de la segunda cadena pesada.

27. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 26 que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos en el que la secuencia de aminoácidos de ambos primeros polipéptidos es SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de ambos segundos polipéptidos es SEQ ID NO: 33.

28. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.

29. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para uso en terapia.

30. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para uso en el tratamiento de un cáncer.

31. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para uso en el tratamiento de NSCLC, SCLC, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de esófago, melanoma, melanoma uveal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, o cáncer de cabeza y cuello.

32. El anticuerpo multifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para uso en el tratamiento de NSCLC, SCLC, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de esófago, melanoma, melanoma uveal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, o cáncer de cabeza y cuello en el que el cáncer se caracteriza porque comprende células que tienen una o más mutaciones KRAS.

33. Una molécula de ADN que comprende:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; y (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. 34. Una célula de mamífero transformada con la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 33, célula que es capaz de expresar un anticuerpo multifuncional que comprende un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

35. La célula de mamífero de la reivindicación 34, en la que la célula de mamífero es CHO.

36. Un procedimiento de producción de un anticuerpo multifuncional que comprende un primer polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 27 y un segundo polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 33, que comprende: (1) cultivar la célula de mamífero de la reivindicación 34 o 35 en condiciones tales que el anticuerpo multifuncional se expresa, y (2) recuperar el anticuerpo multifuncional expresado.

37. Un anticuerpo multifuncional que se une a MET y EGFR producido con el procedimiento de la reivindicación 36.