CN105829345B - 结合egfr和met的多功能抗体 - Google Patents

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Abstract

提供多功能抗体和/或抗原结合片段，所述多功能抗体和/或抗原结合片段结合人表皮生长因子受体(EGFR)和MET并抑制其活性，并且在治疗其中发病机理受EGFR和MET介导的癌症和其他疾病、病症或状况中是有效的。

Description

结合EGFR和MET的多功能抗体
本发明涉及结合人表皮生长因子受体（EGFR）和MET的多功能抗体、其生产方法、包含所述多功能抗体的药物组合物及其用途。
EGFR是生长因子受体的1类酪氨酸激酶家族的成员，其在细胞生长、分化和存活中起重要作用。这些受体的激活通常经特异性配体结合与酪氨酸激酶结构域的随后自磷酸化而发生。该激活引发涉及细胞增殖和存活的胞内信号传导途径的级联。
靶向EGFR并阻断EGFR信号传导途径的癌症疗法的多种策略已经建立。小分子酪氨酸激酶抑制剂例如吉非替尼和埃罗替尼阻断胞内酪氨酸激酶区中EGFR的自磷酸化，由此抑制下游信号传导事件。面对抗EGFR酪氨酸激酶抑制剂的临床使用的主要挑战之一是癌症对这类疗法的内在和获得性抗性。另一方面，某些治疗性单克隆抗体（mAb）靶向EGFR的胞外部分，其导致阻断配体结合并从而抑制导致细胞增殖的抑制的下游事件。已经批准嵌合小鼠/人抗EGFR单克隆抗体C225（或西妥昔单抗）和帕尼单抗（完全人抗EGFR mAb）用于治疗转移性结肠直肠癌和头颈癌，所述抗体靶向EGFR的外部。然而，其肿瘤含有KRAS突变的患者经常无法从西妥昔单抗或帕尼单抗疗法中获益。KRAS突变通过持续发送生长信号（即使EGFR已被阻断）改变肿瘤细胞中的信号传导特性。
MET，酪氨酸激酶超家族的一个成员，是人肝细胞生长因子（HGF）的人受体。HGF结合至MET导致受体二聚化或多聚化、胞内区中多个酪氨酸残基的磷酸化、催化激活、和下游信号传导。MET还经不依赖于配体的机制进行激活，包括受体过表达、扩增和突变。MET激活增强细胞增殖、迁移、形态发生和存活，其与侵袭性细胞表型和差的临床结果相关。因此，MET也是抗癌疗法的靶标。例如，onartuzumab，本领域中也称为单臂(one-armed) 5D5、OA5D5或MetMAb，已经开发用于癌症的潜在治疗，并且是衍生自MET激动性单克隆抗体5D5的人源化的、单价的、拮抗的抗MET抗体（参见，例如，Spigel, D.R.,等, Randomized PhaseII Trial of Onartuzumab in Combination With Erlotinib in Patients WithAdvanced Non Small-Cell Lung Cancer, J. Clinical Oncology, 31(32):4105-4114(November 2013)和Xiang H.,等, Onartuzumab (MetMAb):Using NonclinicalPharmacokinetic and Concentration – Effect Data to Support ClinicalDevelopment, Clin Cancer Res., (2013))。Onartuzumab结合MET并与MET保留在细胞表面上，阻止HGF结合和随后的MET磷酸化以及下游信号传导活性和细胞应答。
WO 2010/059654描述了多种MET抗体，包括高亲和力拮抗性抗体，所述抗体结合MET的α-链内的表位并且在HGF存在或不存在的情况下并在通过获得功能突变（其通常对已知的MET拮抗剂是抗性的）表征的肿瘤中诱导MET内化和/或降解。公开于WO 2010/059654中的MET抗体之一LY2875358，已被报道不具有对MET的激动剂活性或另外具有对MET可忽略的激动剂活性（参见，例如，Zeng, W.,等, 104rd AACR Annual Meeting, 海报#5465 (2013年)）。
美国专利号7,723,484描述了人源化和亲合力优化的EGFR特异性抗体及其抗原结合部分，其抑制EGFR的激活。更具体地，该专利尤其描述了全长单克隆抗体，其如通过在室温下进行的Sapidyne KINEXA所测量的，以亚皮摩尔结合亲合力（Kd）结合人表皮生长因子受体（EGFR）。
MET和EGFR共表达于许多肿瘤中。阻断一种受体趋于上调另一种，频繁地且经常迅速导致对单一药剂治疗的抗性(Engelman, J.A.,等MET amplification leads togefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling.Science,2007; 316:1039–43)。相反地，暴露于抑制MET药剂延长时期的MET扩增的肺癌细胞经EGFR途径发展抗性(McDermott, U.,等, Acquired resistance of non-small cell lungcancer cells to MET kinase inhibition is mediated by a switch to epidermalgrowth factor receptor dependency, Cancer Res., 2010; 70(4):1625-34)。
MET抗体和EGFR抗体的共施用需要注射两种单独的产品或单一注射两种不同抗体的共制剂。两种注射允许剂量的量和时机的灵活性，但对于患者而言在依从性和疼痛上是不便的。共制剂也可以提供剂量的量的一些灵活性，但通常是非常具有挑战性的或不可能发现允许两种抗体的化学和物理稳定性的配制条件，这是由于两种不同抗体的不同分子特征。
WO 199509917公开了生产双特异性、四价抗体的方法，其使用重组DNA技术，通过产生融合至具有不同特异性的完整抗体的单链片段可变（scFv）抗体。这种基因融合体通过转染表达，产生具有双特异性的四价抗体。然而，本领域中通常认为当遵循本领域中的教导包括WO 199509917同时尝试产生可用的双特异性抗体时，技术人员通常会遇到与所产生的双特异性抗体的化学和物理稳定性相关的问题。常常是，在所产生的双特异性抗体中需要氨基酸改变以充分克服这些问题。本领域中既未说明对氨基酸改变的需要，也未说明将克服所产生问题的实际改变。此外，需要的改变最经常地是非常规的或不是来源于公知常识。同样，通常发现，当相比于其亲代抗体时，从已知抗体产生的双特异性抗体在至少一种重要的功能性药代动力学或药效动力学特性中是不那么令人满意的。
PCT国际公开WO 2010/115551公开了三价、双特异性抗人EGFR和MET抗体(BsAB01)，其中单链Fab片段即单臂5D5融合至西妥昔单抗的两个重链之一的羧基末端。已报道相比于由单特异性、单价亲代MET抗体诱导的MET的内化，BsAB01降低MET的内化。在OVCAR-8增殖测定中，相比于用西妥昔单抗和onartuzumab的组合的2%抑制，BsAB01导致8%抑制。在HGF存在的情况下，相比于用西妥昔单抗和onartuzumab的组合的10%抑制，BsAB01导致15%抑制。
另外地，已经公开了使用受控Fab臂交换（cFAE），一种涉及在还原条件下混合两种亲代抗体（在该情况下，具有对EGFR或MET的特异性）随后再氧化的方法，生成靶向EGFR和cMET的双特异性抗体EM1-mAb (Moores, S.,等, EORTC Annual Meeting, 海报 #B241(2013年))。尤其报道了EM1-mAb相比于单价对照抗体的组合在至少一种体外ERK磷酸化测定中展示出优秀的活性。
美国专利申请公开US 2014/0302029描述了生成靶向EGFR和cMET的双特异性抗体，其通过将基于西妥昔单抗序列的抗EGFR scFv与针对c-Met的小鼠抗体（即AbF46）的亲合力成熟且人源化的衍生物的IgG2 Fc的C末端融合而构建。
因此，需要这样的多功能抗体作为某些癌症的有效药物介入，所述多功能抗体以高亲合力结合MET和EGFR，有效中和通过HGF的MET激活和通过EGF家族配体的EGFR激活，和/或提供相比于单一药剂的组合在内化和/或降解MET和EGFR（野生型和突变体两者）中优秀的活性。具体而言，期望的是这样的抗MET/EGFR抗体，其i）可以更有效地治疗特征在于具有一个或多个KRAS突变的癌症，ii）相比于单一药剂的相关组合，证明在预防或延迟对其他MET和/或EGFR抑制剂的抗性的发展中的优秀活性，所述其他MET和/或EGFR抑制剂包括但不限于埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼和维罗非尼，iii）引起最低的或不引起可测量的激动剂活性，和/或iv）证明体内稳定性、物理和化学稳定性包括但不限于热稳定性、溶解性、低自结合和对于开发和/或用于治疗癌症可接受的药代动力学特征。然而，尽管普遍按照WO199509917中的教导，当尝试产生包含WO 2010/059654的某些抗MET抗体和美国专利号7,723,484的某些抗EGFR抗体的四价、多功能抗MET/EGFR抗体时，本发明人遇到与化学和物理稳定性以及关于靶受体MET和EGFR之一或两者的期望的结合特性的丧失相关的明显的问题。因此，需要涉及许多氨基酸改变的广泛的工程化工作以足以克服这些问题。本领域中既未暗示对实际改变的需求也未暗示实际改变。此外，若干改变不是常规的或不是来源于公知常识。类似地，亲本抗体本身不具有这些问题，表明关键区域周围的局部环境与多功能抗MET/EGFR抗体的环境并不同。
因此，本发明提供了结合EGFR和MET的四价多功能抗体。这些多功能抗体诱导EGFR和MET在细胞表面上的共定位、MET的内化和/或降解、和令人惊奇的是，相比于西妥昔单抗在具有高MET表达的肿瘤细胞中EGFR甚至更大的内化和降解。此外，这些抗MET/EGFR多功能抗体展示在具有低至中等MET表达的肿瘤细胞中比亲本抗MET抗体更高的结合MET的抗体亲抗原性。
因此，本发明提供了结合EGFR和MET的四价多功能抗体。这些多功能抗体诱导EGFR和MET在细胞表面上的共定位、MET的内化和/或降解、和令人惊奇的是，相比于西妥昔单抗在具有高MET表达的肿瘤细胞中EGFR甚至更大的内化和降解。此外，这些抗MEG/EGFR多功能抗体展示在具有低至中等MET表达的肿瘤细胞中比亲本抗MET抗体更高的结合MET的抗体亲抗原性。此外，这些多功能抗MET/EGFR抗体相比于两种单独抗体的组合在抑制细胞培养物中以及小鼠异种移植模型中的肿瘤细胞生长中展示出优秀的活性。它们还似乎在恢复对各种靶疗法包括埃罗替尼和PLX4032（即，B-Raf抑制剂）在HGF和/或EGF存在的情况下的肿瘤细胞敏感性中比单独的MET和EGFR抗体的组合具有优秀的活性。此类抗MET/EGFR抗体还可以证实针对高EGFR表达的肿瘤、或对于一种或多种抗EGFR抗体（例如西妥昔单抗、帕尼单抗等）和/或EGFR的一种或多种小分子抑制剂（例如埃罗替尼）具有抗性或已变得有抗性的肿瘤（包括但不限于携带KRAS突变的肿瘤）是更有效的。在本发明的各种实施方案中，这些多功能抗体同时结合MET和EGFR，中和MET通过HGF的激活和EGFR通过EGF的激活，抑制许多类型的表达MET和EGFR的癌细胞的配体依赖性和配体不依赖性的细胞增殖，诱导EGFR和MET在细胞表面上的共定位，诱导MET的内化和/或降解，和令人惊奇地，相比于西妥昔单抗在具有高MET表达的肿瘤细胞中EGFR甚至更大的内化和降解。
本发明的实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 重链，所述重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链互补性决定区域（CDR）HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 轻链，所述轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) scFv多肽，所述scFv多肽结合人EGFR并包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT(SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中所述scFv多肽的C末端经肽接头融合至MET抗体重链的N末端。
本发明的另一实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 第一重链和第二重链，其中每一重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO:11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 第一轻链和第二轻链，其中每一轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO:14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽结合人EGFR并且其中每一scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT(SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中第一scFv多肽的C末端经肽接头融合至第一重链的N末端并且第二scFv多肽的C末端经肽接头融合至第二重链的N末端。
本发明的进一步的实施方案为多功能抗体，其包含两个第一多肽和两个第二多肽，其中两个第一多肽包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；且两个第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，且其中所述多功能抗体结合EGFR和MET。
本发明的另一实施方案是药物组合物，其包含任一前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段、和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一实施方案是任一前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗。
本发明的另一实施方案是任一前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗癌症。
本发明的另一实施方案是任一前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗其中MET和EGFR两者均由患者肿瘤表达的癌症。
本发明的另一实施方案是任一前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗其中MET和/或EGFR由患者肿瘤以低、中等、或高水平表达的癌症和/或肿瘤或对于一种或多种抗EGFR抗体（例如西妥昔单抗、帕尼单抗等）和/或EGFR的一种或多种小分子抑制剂（例如埃罗替尼）具有抗性或已变得有抗性的肿瘤（包括但不限于携带KRAS突变的肿瘤）。在本发明的多种实施方案中，多功能抗体或其MET和EGFR结合片段用于治疗其中MET和/或EGFR由患者肿瘤以低、中等、或高水平表达的癌症和/或对于一种或多种抗EGFR抗体（例如西妥昔单抗、帕尼单抗等）和/或EGFR的一种或多种小分子抑制剂（例如埃罗替尼）具有抗性或已变得有抗性的肿瘤（包括但不限于携带一个或多个KRAS突变的肿瘤）的用途可以进一步包括在向患者施用本发明的多功能抗体或其MET和EGFR结合片段的步骤前，鉴定需要癌症治疗的患者的步骤。
本发明的另一实施方案是任一前述的多功能抗体或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗NSCLC、SCLC、胃癌、结肠直肠癌、胆管癌、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素瘤、肾癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、或头颈癌。
本发明的另一实施方案是治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的人患者施用有效量的任一前述多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段。
图1说明显示抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9诱导癌细胞系H1993 (NSCLC)、MKN45 (胃癌)和H441 (NSCLC)中EGFR和MET降解的western印迹结果。将癌细胞系用100 nM抗体NH-YK、抗体NH-H9或对照抗体处理过夜。通过细胞裂解物的western印迹测定EGFR和MET降解。抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9触发了显著的EGFR降解，然而西妥昔单抗或亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合却不会触发。泳道1：hIgG4；泳道2:抗MET Ab；泳道3:西妥昔单抗；泳道4 抗MET Ab + 西妥昔单抗；泳道5：NH-YK；泳道6：NH-H9。
图2是显示相比于施用媒介物对照或亲本抗Met抗体和西妥昔单抗的组合（86.1%的T/C%），施用抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK导致在H1993小鼠异种移植模型中的肿瘤体积的显著更大降低（28.5%的T/C%；p<0.001）的图。
图3是显示相比于施用媒介物对照或亲本抗Met抗体和西妥昔单抗的组合，施用抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK导致在H441小鼠异种移植模型中的肿瘤体积的显著更大降低（28.5%的T/C%；p<0.001）的图。
图4是显示相比于施用媒介物对照，施用抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK导致在EBC-1 NSCLC小鼠异种移植模型中的肿瘤体积的显著更大降低（32.9%的T/C%；p<0.001）的图。
图5是显示相比于施用亲代MET抗体和西妥昔单抗的组合（分别T/C% = 17.4%, p< 0.001和18.6%, p < 0.001）或媒介物对照，施用抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK导致在MKN45胃异种移植模型中相当的抗肿瘤效力的图。
图6是显示以27 mg/kg施用抗MET/EGFR多功能抗体H9在携带H1993 NSCLC异种移植物的免疫缺陷小鼠中导致比任何其他治疗显著更高的抗肿瘤效力的图。利用媒介物对照、抗MET/EGFR多功能抗体H9（4和27 mg/kg）、单独抗MET（3和20 mg/kg）、西妥昔单抗 (3和20 mg/kg)或抗MET加西妥昔单抗的组合(3 mg/kg和20 mg/kg的每种抗体)每周一次处理小鼠异种移植物，持续连续5周。
图7是显示以27 mg/kg施用抗MET/EGFR多功能抗体H9在携带H441异种移植物的免疫缺陷小鼠中导致比任何其他治疗显著更高的抗肿瘤效力的图。利用媒介物对照、抗MET/EGFR多功能抗体H9（4和27 mg/kg）、单独抗MET（3和20 mg/kg）、西妥昔单抗 (3 和20 mg/kg)或抗MET加西妥昔单抗的组合(3 mg/kg和20 mg/kg的每种抗体)每周一次处理小鼠异种移植物，持续连续5周。
术语“EGFR”、“ErbB1”和“EGF受体”在本文中互换用于指EGFR蛋白(参见例如，UniProtKB/Swiss-Prot登录P00533)。在本文中，“EGFR胞外结构域”或“EGFR ECD”指细胞外的EGFR结构域，其锚定在细胞膜上，或处于循环中，包括其片段。在一个实施方案中，EGFR的胞外结构域可以包含四个结构域：“结构域I”（从约1-158的氨基酸残基）、“结构域II”（氨基酸残基159-336）、“结构域III”（氨基酸残基337-470），和“结构域IV”（氨基酸残基471-645），其中边界是大概的，并且可以有约1-3个氨基酸的变异。
术语“MET多肽”、“MET受体”、“MET”、“HGF受体”或“HGFR”在本文中互换使用，并且除非另有说明，旨在指人受体酪氨酸激酶，以及其功能活性的突变形式，其结合人肝细胞生长因子。MET的具体实例包括，例如GenBank登录号NM_000245中提供的核苷酸序列编码的人多肽，或GenBank登录号NP_000236中提供的多肽序列编码的人蛋白质。将MET的结构图示性地描述为：
SEMA:Sema结构域
PSI:Plexin、信号素和整联蛋白结构域
IPT:4个免疫球蛋白、Plexins和转录因子结构域
TM:跨膜区
JM:近膜结构域
KD:激酶结构域。
人MET的胞外结构域（在本文中，MET-ECD）具有例如SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列。然而，SEQ ID NO:35的氨基酸1-24包含信号序列。因此，除非另有说明，如本文所用的术语“MET-ECD”表示分别以SEQ ID NO: 35 的氨基酸25和932开始和结束的成熟蛋白(即，SEQ ID NO: 36)。SEMA结构域由MET的N末端的大概500个氨基酸残基组成，并且含有α-链(SEQ ID NO: 35的氨基酸残基25-307(即，SEQ ID NO: 37)和β-链的部分(SEQ ID NO:35的氨基酸残基308-519(即，SEQ ID NO: 38))。
如本文所用，对于MET或EGFR对肿瘤或细胞系的细胞表面表达，术语“低”、“中等”和“高”分别旨在表示每个细胞少于约30万，高于约30万，和高于约100万个受体。
如本文所用，“多功能抗体”指这样的分子，其包含具有一种抗原结合特异性的抗体和具有不同抗原结合特异性的抗原结合片段。优选地，多功能抗体指这样的分子，其包含i）对MET具有抗原结合特异性的抗体，和ii）对EGFR具有抗原结合特异性的单链可变片段(scFv)。
除非另有说明，如本文所用，术语“抗体”旨在指包含通过二硫键互相连接的两条重链（HC）和两条轻链（LC）的免疫球蛋白分子。每一条链的氨基末端部分包括经其中包含的CDR主要负责抗原识别的约100-约110个氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端部分确定主要负责效应子功能的恒定区。
除非另有说明，对于本发明的多功能抗体，如本文所用，术语“NH-YK”旨在指包含两个第一多肽和两个第二多肽的多功能抗体，其中两个第一多肽包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列；并且两个第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗体结合EGFR和MET。
除非另有说明，对于本发明的多功能抗体，如本文所用，术语“NH-H9”旨在指包含两个第一多肽和两个第二多肽的多功能抗体，其中两个第一多肽包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列；并且两个第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗体结合EGFR和MET。
除非另有说明，对于本发明的多功能抗体，如本文所用，术语“H9”旨在指包含两个第一多肽和两个第二多肽的多功能抗体，其中两个第一多肽包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列；并且两个第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗体结合EGFR和MET。
除非另有说明，对于本发明的多功能抗体，如本文所用，术语“YK”旨在指包含两个第一多肽和两个第二多肽的多功能抗体，其中两个第一多肽包含SEQ ID NO: 31的氨基酸序列；并且两个第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗体结合EGFR和MET。
如本文所用的术语“抗原结合片段”旨在表示保留结合其抗原的能力的任何抗体片段。此类“抗原结合片段”可以选自Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、 scFv-Fc片段和双体。抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变区。优选地，抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。更优选地，抗原结合片段包含HCVRs和LCVRs，其赋予针对MET和EGFR的抗原结合特异性（即，“MET和EGFR结合片段”）。
如本文所用的术语“互补性决定区域”和“CDR”旨在意指抗体或其抗原结合片段的HC和LC多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点(combining sites)。这些特定区域已被其他人所描述，包括Kabat,等, Ann.NY Acad.Sci.190:382-93 (1971); Kabat等,J. Biol.Chem.252:6609-6616 (1977); Kabat,等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242 (1991); Chothia,等, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987); MacCallum,等, J. Mol.Biol., 262:732-745 (1996);和North,等, J.Mol.Biol., 406, 228-256 (2011)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。
CDR散布在更保守的名为框架区(“FR”)的区域中。每一LCVR和HCVR由三个CDR和四个FR构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。将轻链的3个CDR称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”并将重链的3个CDR称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR包含大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。LCVR和HCVR区域内CDR氨基酸残基的编号和位置与已知的惯例一致(例如Kabat (1991) Chothia (1987)、和/或North (2011))。在本发明的不同实施方案中，抗体和/或抗原结合片段（例如scFv）的FR可以与人种系序列一致，或者可以是天然或人工修饰的。
“单链片段可变(single chain fragment variable)”或“scFv”或“scFv多肽”指包含经接头分子连接的抗体的LCVR结构域和HCVR结构域的单折叠的多肽。在此类scFv多肽中，HCVR结构域和LCVR结构域可以以HCVR - 接头 - LCVR或LCVR - 接头 - HCVR次序。接头可以是柔性肽接头，其使得HCVR结构域和LCVR结构域能够折叠作为功能性单体单元用于识别抗原。scFv的LCVR结构域的三个CDR本文称为“scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3”且scFv的HCVR结构域的三个CDR本文称为“scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3”。
如本文所用，术语“表面等离子共振（SPR）”指通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度改变来允许分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcore™系统(Biacore LifeSciences Division, GE Healthcare, Piscataway, NJ)。
如本文所用，术语“K D ”旨在指具体抗体-抗原或抗体片段-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“特异性结合”等等表示抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。用于确定抗体是否特异性结合抗原的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、SPR等等。例如，如本发明上下文中所用的“特异性结合”MET或EGFR的抗体包括如SPR测定中测量的以以下K D 结合MET-ECD (或其部分)和/或EGFR-ECD（或其部分）的抗体：小于约10 mM、小于约5 nM、小于约4 nM、小于约3 nM、小于约2 nM、小于约1 nM、小于约0.5 nM、小于约0.3 nM、小于约0.2 nM、或小于约0.1 nM。（参见，例如实施例1，本文）。优选的，本发明的多功能抗体如SPR测定中测量的以以下K D 特异性结合MET-ECD (或其部分)和EGFR-ECD（或其部分）：约10 nM至约0.1 nM、约5 nM至约0.1 nM、约2 nM至约0.1 nM、约1nM至约0.1 nM、约0.75 nM至约0.1 nM、约0.5 nM至约0.1 nM。
术语“表位”指与抗体分子可变区内的特定抗原结合位点（已知为互补位）相互作用的抗原决定簇。单一抗原可以具有多于一个表位。因此，不同抗体可以结合抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由线性多肽链不同区段的空间上并列的氨基酸来产生。线性表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。
如本发明内所用的术语“接头分子”或“接头”优选表示肽接头。使用本发明某些实施方案中利用的肽接头以将抗体、抗原结合位点，和/或包含不同抗原结合位点的抗体片段（例如scFv、全长抗体、VH结构域和/或VL结构域）连接在一起以形成本发明的多功能抗体。优选地，肽接头是富含甘氨酸的肽，其具有至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸，更优选10-50个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，所述富含甘氨酸的肽接头是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，(x=3并且n=3、4、5或6)或(x=4并且n=2、3、4或5)。例如，在本发明的一些实施方案中，所述富含甘氨酸的肽接头是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，x=4并且n=2、3、4或5(即分别是GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 48)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 49)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:50 ))。在本发明的一些实施方案中，可以将额外的甘氨酸或苏氨酸，例如GSTG、TG、GG或GGGT添加到(GxS)n格式化的富含甘氨酸的肽接头的任一末端。例如，在本发明的一些实施方案中，所述富含甘氨酸的肽接头是GGGSGGGGSGGGGSGSTG (SEQ ID NO: 51)。
术语“C末端”及其语法变体，包括但不限于羧基（carboxyl）末端、羧基（carboxy）末端、C末端（C-terminal）、C末端（C-terminal end）或COOH末端在本文中用于表示氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端，其可以以游离的羧基(-COOH)终止。当蛋白质从信使RNA翻译时，其从N-末端至C-末端产生。用于表示肽序列的惯例是在右边描述C末端并从N至C末端列出序列。
术语“N末端”及其语法变体，包括但不限于氨基末端、NH2末端、N末端或胺末端在本文中用于表示氨基酸链（蛋白质或多肽）的开始，以具有游离胺基(-NH2)的氨基酸终止。用于表示肽序列的惯例是将N末端放在左边并从N至C末端列出序列。
短语“人改造的抗体”或“人源化抗体”指本文公开的抗体化合物和这样的抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段具有与本文公开的抗体化合物类似的结合和功能性质，并且其具有来源于非人抗体的实质上人或完全人环绕(surrounding) CDR的构架区。“构架区”或“构架序列”指构架区1-4的任何一个。本发明包括的人改造抗体和抗原结合片段包括这样的化合物，其中构架区1-4中的任何一个或更多个是实质上人的或完全人的，即其中存在单个实质上或完全人构架区1-4的任何可能组合。例如，这包括抗原结合化合物，其中构架区1和构架区2、构架区1和构架区3、构架区1、2和3等是实质上人的或完全人的。实质上人构架是与已知的人种系构架序列具有至少约80%序列同一性的那些。优选地，实质上人构架与已知人种系构架序列具有至少约85%、约90%或约95%的序列同一性。
完全人构架是与已知人种系构架序列相同的那些。人构架种系序列为本领域所知并且可以从多种来源，包括IMGT®，国际 ImMunoGeneTics信息系统(参见例如，Marie-Paule Lefranc,等, Nucleic Acid Research,第37卷, 数据库期号, D1006-D1012)，或The Immunoglobulin Facts Book 由Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc,Academic Press, 2001, ISBN 012441351获得。例如，种系轻链构架可以选自：Al1、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2和O8；并且种系重链构架区可选自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-5I。
可以使用若干不同方法产生展示与本文公开的抗体化合物类似功能性质的人改造抗体。本文公开的具体抗体化合物可以用作模板或亲本抗体化合物以制备额外的抗体化合物。在一种方法中，将亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物构架具有高度序列同一性的人构架中。新构架的序列同一性一般会与亲本抗体化合物中的相应构架的序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%，或至少约99%的同一性。该移植可以导致与亲本抗体相比结合亲合力的降低。如果这是事实，那么可以基于Queen等(1991) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:2869公开的具体标准在某些位置将构架回复突变成亲本构架。描述用于人源化小鼠抗体的方法的额外参考文献包括美国专利号4,816,397；5,225,539和5,693,761；Levitt, J. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)中描述的计算机程序ABMOD和ENCAD；Winter及同事的方法(Jones等 Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等Nature, 332:323-327 (1988)；and, 等 Science 239:1534-1536 (1988)。
应用本发明的教导，本领域技术人员可以使用常规技术，例如定点诱变来取代本发明公开的CDR和构架序列内的氨基酸并由此产生来源于本发明序列的其他可变区氨基酸序列。可以在具体取代位点上引入高达所有19个可变的天然存在的氨基酸。然后可以使用本文公开的方法来筛选这些额外的可变区氨基酸序列以鉴定具有所示体内功能的序列。这样，可以鉴定根据本发明适合于制备人改造抗体及其抗原结合部分的其他序列。优选地，构架内的氨基酸取代限制在本文公开的三个轻链和/或重链构架区任何一个或更多个内的一个、两个或三个位置中。优选地，CDR内的氨基酸取代限制在三个轻链和/或重链CDR任何一个或更多个内的一个、两个或三个位置中。本文中也涵盖上述这些构架区和CDR内的多种改变的组合。
下文表1和2描述了本文公开的优选人改造抗体的CDR的氨基酸序列和共有氨基酸序列，以及本文公开的优选人改造抗体或其抗原结合片段的HCVR和LCVR多肽的氨基酸序列的SEQ ID NO。
表1
在上文表1中，X1是Y或W并且X2是K或T。
表2
在上文表2中，X1是R或Y，X2是K或S，并且X3是E或R。
本发明的实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，其结合MET的α链内选自以下的氨基酸序列上的表位：
(b) scFv多肽，其结合EGFR并包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT(SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，其中多功能抗体诱导细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。
在本发明的多个实施方案中，多功能抗体结合MET的α链内氨基酸序列i)VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上的表位。在本发明的多个实施方案中，多功能抗体可以结合MET的α链内选自以下的氨基酸序列上的表位：
。
在本发明的多个实施方案中，多功能抗体可以结合特征在于包括氨基酸序列DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的构象表位。此外，在本发明的多个实施方案中，多功能抗体分别诱导不依赖HGF和不依赖EGF的细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3，和ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的scFv多肽包含：i)HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO:4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端经肽接头融合至MET抗体重链的N末端。
本发明的实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 重链，所述重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 轻链，所述轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) scFv多肽，所述scFv多肽结合EGFR并包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT(SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的 scFv多肽包含HCVR结构域（其包含SEQID NO: 17的氨基酸序列）和LCVR结构域（其包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列）。在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端经肽接头融合至MET抗体重链的N末端。
在本发明的其他实施方案中，多功能抗体包含：
i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链；和
ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链。
本发明的实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 重链，所述重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 轻链，所述轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) scFv多肽，其结合EGFR并包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT(SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3。
在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端经肽接头融合至MET抗体重链的N末端。
在本发明的其他实施方案中，多功能抗体包含：
i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链；和
ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链。
本发明的另一实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 第一重链和第二重链，其中每一重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO:11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 第一轻链和第二轻链，其中每一轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO:14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽结合人EGFR并且其中每一scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO:4), X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT(SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中第一scFv多肽的C末端经肽接头融合至第一重链的N末端并且第二scFv多肽的C末端经肽接头融合至第二重链的N末端。
在本发明的多个实施方案中，多功能抗体结合MET的α链内选自以下的氨基酸序列上的表位：
。
在本发明的多个实施方案中，多功能抗体可以结合MET的α链内氨基酸序列i)VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上的表位。在本发明的多个实施方案中，多功能抗体可以结合特征在于包括氨基酸序列DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的构象表位。在本发明的其他实施方案中，多功能抗体包含：
i) 第一重链和第二重链，其中两条重链均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和
ii) 第一轻链和第二轻链，其中两条轻链均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
此外，在本发明的多个实施方案中，多功能抗体分别诱导不依赖HGF和不依赖EGF的细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。
本发明的另一实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 第一重链和第二重链，其中每一重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO:11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 第一轻链和第二轻链，其中每一轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO:14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽结合人EGFR并且其中每一scFv多肽包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4), X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中第一scFv多肽的C末端经肽接头融合至第一重链的N末端并且第二scFv多肽的C末端经肽接头融合至第二重链的N末端。
在本发明的其他实施方案中，结合EGFR的每一第一和第二scFv多肽包含：i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDRscFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和ii)LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。或者，结合EGFR的每一第一和第二scFv多肽包含：i)HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG(SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和ii)LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ IDNO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
本发明的另一实施方案是多功能抗体，其包含：
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 第一重链和第二重链，其中两条重链均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和
ii) 第一轻链和第二轻链，其中两条轻链均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列；和
(b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中两条scFv多肽均结合EGFR并且两条scFv多肽均包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ IDNO: 1)、VIX1SGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)（其中X1为Y或W且X2为K或T）和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ IDNO: 4), X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)（其中X1为R或Y，X2为K或S，且X3为E或R）和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中第一scFv多肽的C末端经肽接头融合至第一重链的N末端并且第二scFv多肽的C末端经肽接头融合至第二重链的N末端。
在本发明的其他实施方案中，第一和第二scFv多肽包含：i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH(SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFvCDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。或者，两个scFv多肽包含：i）HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG(SEQID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和ii)LCVR结构域，所述LCVR结构域包含分别由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDRscFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供多功能四价抗体，其包含：
(a) 抗体，其包含两条重链和两条轻链并能够结合MET的α链内选自以下的氨基酸序列上的表位：
(b) 两个scFv多肽，其能够结合EGFR，其包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19的重链可变区和SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20的轻链可变区，其中所述多功能抗体诱导细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。在本发明的多个实施方案中，多功能抗体可以结合MET的α链内氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS(SEQ ID NO: 40)、iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM(SEQ ID NO: 42)上的表位。在本发明的多个实施方案中，多功能抗体可以结合特征在于包括氨基酸序列DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ IDNO: 45)和KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的构象表位。此外，在本发明的多个实施方案中，多功能抗体分别诱导不依赖HGF和不依赖EGF的细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。
在本发明的一个实施方案中，提供多功能四价抗体，其包含：(a)各自能够结合EGFR的两个相同的scFv多肽；和(b)抗体或其抗原结合片段，其特异地结合由如SEQ ID NO:36中的氨基酸序列组成的MET-ECD，抗体或其抗原结合片段，其包含：
分别由氨基酸序列SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3，和
分别由氨基酸序列GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ IDNO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明的一个实施方案中，提供多功能四价抗体，其包含：(a)各自能够结合EGFR的两个相同的scFv多肽；和(b)MET抗体，其包含两条重链和两条轻链并能够结合MET，其中能够结合EGFR的两个相同的scFv多肽通过肽接头在所述全长抗体的各重链的C末端经过C末端融合MET抗体。在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO: 21的重链可变区和SEQ IDNO: 22的轻链可变区（其均来源于在WO 2010/059654中详细描述的抗MET克隆C8-H241）可以用于形成特异地结合MET的MET抗体的抗原结合位点。
通过基因合成和重组分子生物学技术，SEQ ID NO: 17的HCVR和SEQ ID NO: 18的LCVR，或SEQ ID NO: 19的HCVR和SEQ ID NO: 20的LCVR通过公式(GxS)n，x =4，n=5的富含甘氨酸的接头连接以形成特异地结合EGFR的scFv。结合 EGFR的scFv然后通过另一富含甘氨酸的接头附着到抗MET抗体C8-H241 (人 IgG4亚型)的重链的N或C末端，产生多功能抗体NH-YK（包含抗EGFR YKn-scFv和抗Met HC融合物(即，SEQ ID NO: 27))、NH-H9 (包含抗EGFR H9n-scFv和抗Met HC 融合物(即，SEQ ID NO: 29))、YK (包含抗Met HC和抗EGFRYK-scFv融合物(即，SEQ ID NO: 31))和H9 (包含抗Met HC和抗EGFR H9-scFv融合物(即，SEQ ID NO: 52)）。
本发明的另一实施方案是结合MET和EGFR的多功能抗体，其包含：(a)两条第一多肽，其中所述两条第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ IDNO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或 SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)两条第二多肽，其中所述两条第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
本发明的另一实施方案是包含结合MET和EGFR的多功能抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，所述多功能抗体包含：(a)两条第一多肽，其中所述两条第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ IDNO: 31、SEQ ID NO: 52或 SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)两条第二多肽，其中所述两条第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
本发明的另一实施方案是治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的结合MET和EGFR的多功能抗体，其包含：(a)两条第一多肽，其中所述两条第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQID NO: 52或 SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)两条第二多肽，其中所述两条第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，癌症是NSCLC、SCLC、胃癌、结肠直肠癌、胆管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、肾癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、或头颈癌。在本发明的一些实施方案中，所述癌症患者是人。在本发明的其他实施方案中，患者肿瘤的特征在于包含具有一个或多个KRAS突变的细胞。本发明的其他实施方案提供治疗癌症（其中MET和/或EGFR由患者肿瘤以低、中等、或高水平表达）和/或肿瘤或对于一种或多种抗EGFR抗体（例如西妥昔单抗、帕尼单抗等）和/或EGFR的一种或多种小分子抑制剂（例如埃罗替尼）具有抗性或已变得有抗性的肿瘤（包括但不限于携带KRAS突变的肿瘤）的方法，所述方法包括向需要其的患者施用药学上有效量的一种前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段。在本发明的多个实施方案中，治疗癌症的方法可以进一步包括在向患者施用多功能抗体或其MET和EGFR结合片段的步骤前，通过测量患者肿瘤表达的MET和EGFR的水平和/或评估患者的肿瘤是否包含具有一个或多个KRAS突变的细胞来鉴定需要癌症治疗的患者的步骤，在所述癌症中MET和/或EGFR由患者肿瘤以低、中等、或高水平表达和/或其中肿瘤对于一种或多种抗EGFR抗体（例如西妥昔单抗、帕尼单抗等）和/或EGFR的一种或多种小分子抑制剂（例如埃罗替尼）具有抗性或已变得有抗性，包括但不限于携带KRAS突变的肿瘤。
下文表3描述了本发明的scFv和scFv融合物的氨基酸序列的SEQ ID NO。
表3
YK-scFv YK<sub>n</sub>-scFv和抗MET HCVR融合物 YK<sub>n</sub>-scFv和抗MET HC融合物 抗MET HC和YK-scFv融合物
SEQ ID NO: 23 25 27 31
H9-scFv H9<sub>n</sub>-scFv和抗MET HCVR融合物 H9<sub>n</sub>-scFv和抗MET HC融合物 抗MET HC和H9-scFv融合物
SEQ ID NO: 24 26 29 52
当在本文中用于参考scFv并包括上文表3时，下标“n”表示抗EGFR YK scFv或抗EGFR H9 scFv融合MET抗体重链的N末端。
本发明的其他实施方案是包含两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽的多功能抗体，其中第一多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 29并且第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 33，其中所述多功能抗体结合EGFR和MET。此外，在本发明的多个实施方案中，多功能抗体分别诱导不依赖HGF和不依赖EGF的细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。
标准的分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、产生本发明多功能抗体的分离的宿主细胞系、培养这些宿主细胞并从培养基中回收抗体。
本发明也涉及表达本发明的多功能抗体的宿主细胞。本领域已知的多种宿主表达系统可以用于表达本发明的抗体，其包括原核（细菌）和真核表达系统（如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其他动物细胞、转基因动物，和杂交瘤细胞）。
可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白制备本发明的多功能抗体。为了在宿主细胞中重组表达抗体，利用携带编码多功能抗体的轻链和/或scFv-重链融合物的DNA片段的一个或多个重组表达载体转化、转导、感染等宿主细胞。可以从在一个载体中它们可操作地连接的不同启动子独立表达重链和轻链，或，或者，可以从在两个载体（一个表达重链，一个表达轻链）中它们可操作地连接的不同启动子独立表达重链和轻链。任选地，可以在不同的宿主细胞中表达重链和轻链。优选地，重组抗体可以分泌到培养基中，在所述培养基中培养宿主细胞，从所述培养基中回收或纯化抗体。
可以通过将编码HCVR的DNA可操作地连接编码重链恒定区的另一DNA分子来将编码HCVR区的分离的DNA转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列为本领域所知。可以例如通过标准的PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是任何类型（例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD）、种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）或亚类恒定区和Kabat (上文)中描述的其任何同种异型变体。
可以通过将编码LCVR的DNA可操作地连接编码轻链恒定区的另一DNA分子来将编码LCVR区的分离的DNA转化成全长轻链基因（以及Fab轻链基因）。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列为本领域所知。可以通过标准的PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
除了抗体重链和/或轻链基因，本发明的重组表达载体携带在宿主细胞中控制抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号），需要时其控制抗体链基因的转录或翻译。表达载体的设计，包括调节序列的选择可以取决于这样的因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白的表达水平。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平的蛋白表达的病毒元件，诸如来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒（例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)）和/或多瘤病毒。
此外，本发明的重组表达载体可以携带额外序列，诸如在宿主细胞中调节载体复制的序列（例如，复制起点）和一个或多个可选标志物基因。所述可选标志物基因利于其中已经引入载体的宿主细胞的选择。例如，通常可选标记物基因赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的可选标志物基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因（用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中）、neo基因（用于G418选择），和在GS阴性细胞系（如NS0）中用于选择/扩增的谷氨酰胺合成酶（GS）。
为了表达轻链和/或重链，通过标准技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、转导、感染等将编码重链和/或轻链的表达载体引入到宿主细胞中。尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选真核细胞，并最优选哺乳动物宿主细胞，因为该细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr- CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980中，与DHFR可选标记物使用，例如如描述于Kaufman和Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982中]，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞足以允许在宿主细胞中表达抗体，或更优选地，将抗体分泌到其中在本领域已知的适当条件下生长宿主的培养基中一段时间来产生抗体。可以使用标准的纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收抗体。
也可以通过常规技术使用宿主细胞来产生完整抗体的部分或片段，例如Fab片段或scFv分子。例如，希望利用编码本发明的轻链或重链的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除对结合EGFR和MET非必需的编码轻链和重链任一者或两者的一些或所有DNA。从该截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。
本发明提供包含本发明的核酸分子的宿主细胞。优选地，本发明的宿主细胞包含一个或多个这样的载体或构建体，其包含本发明的核酸分子。例如，本发明的宿主细胞是其中已经引入本发明的载体的细胞，所述载体包含编码本发明的抗体的LCVR的多核苷酸和/或编码本发明的HCVR的多核苷酸。本发明还提供其中已经引入本发明的两个载体的宿主细胞；一个包含编码本发明的抗体的LCVR的多核苷酸，一个包含编码本发明的抗体中存在的HCVR的多核苷酸，并且各自可操作地连接增强子/启动子调节元件（例如，来源于SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件）以驱动基因的高水平转录。
一旦表达，可以根据本领域的标准方法，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲合力（例如蛋白A）、反相、疏水性相互作用柱层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳等纯化本发明的完整抗体、单条轻链和重链，或其他免疫球蛋白形式。对于药物用途，优选至少约90%、约92%、约94%或约96%同质性的实质上纯的免疫球蛋白，并且最优选约98%-约99%或更高同质性。一旦纯化（部分地或至期望的同质性的），则无菌抗体可以随后治疗性使用，如本文所指示。
如本文所用的术语“分离的多核苷酸”应表示基因组、cDNA、或合成来源或其一些组合的多核苷酸，其由于其起源，所述分离的多核苷酸（1）不伴随其中在自然界中发现所述分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分，（2）与其在自然界中不相连的多核苷酸连接，或（3）不作为更大序列的一部分存在于自然界中。
“分离的”多功能抗体是已经从它的天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质的或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，抗体将被纯化至(1)如通过Lowry法所测定，大于95重量%抗体，并最优选大约99重量%，(2)通过使用旋转杯测序仪足以获得N末端或中间氨基酸序列的至少15个残基的程度，或 (3)在还原或非还原条件下使用考马斯亮蓝、SimplyBlue™ SafeStain (Life Technologies)或，优选银染通过SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。
如本文所用，“实质上纯的”或“实质上纯化的”表示存在的主要种类的化合物或种类（即，在摩尔基础上，其比组合物中任何其他个体种类更丰富）。在某些实施方案中，实质上纯化的组合物是这样的组合物，其中所述种类占至少约50%（在摩尔基础上）的所有存在的大分子种类。在某些实施方案中，实质上纯的组合物将包含多于约80%、85%、90%、95%或99%的组合物中存在的所有大分子种类。在某些实施方案中，种类纯化至实质的同质性（污染物种类在组合物中通过常规检测方法无法检测到），其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
在另一实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NOs: 27、29和33的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供包含多核苷酸的重组表达载体，所述多核苷酸编码选自SEQ ID NOs: 27、29和33的氨基酸序列。
本发明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗。
本发明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗癌症。
本发明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗其中表达MET和EGFR的癌症。
本发明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗体，或其MET和EGFR结合片段，其用于治疗NSCLC、SCLC、胃癌、结肠直肠癌、胆管癌、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素瘤、肾癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、或头颈癌。
本发明也提供治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的人患者施用有效量的任一前述的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段。
术语“治疗”（或“治疗”或“治疗”）指减缓、中断、阻止、控制、终止、减少或反转症状、病症、状况或疾病的进程或严重性，但并不必须涉及所有疾病相关症状、状况或病症的总体消除。
术语“癌症”（或“癌症”）指增生性疾病，诸如肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌(CRC)、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素瘤、肝癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌，包括任何上述癌症的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
如本文所用的短语“有效量”指达到希望的治疗结果所必需的量（剂量和时期和施用手段）。多功能抗体的有效量可以根据这样的因素，诸如疾病状态、年龄、性别，和个体体重，以及抗体的能力，或其MET和EGFR结合片段而变化，以在个体中引发所希望的响应。有效量也是这样的量，其中抗体、或其MET和EGFR结合片段的治疗有益效果超过其任何有害效果。
有效量是活性剂的至少最小量，但低于总体有害量，其为向主体传递治疗益处所必需。换言之，本发明的抗体的有效量或治疗有效量是这样的量，其在哺乳动物，优选人中减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制（即，减缓至一定程度或终止）癌细胞浸润到外周组织器官中；抑制（即，减缓至一定程度或终止）肿瘤转移；抑制肿瘤生长至一定程度；和/或缓解与癌症相关的一种或多种症状至一定程度。可以以单次剂量或多次剂量施用有效量的本发明的抗MET/EGFR多功能抗体。此外，可以以多次剂量的量施用有效量的本发明的抗MET/EGFR多功能抗体，所述多次剂量如果不是多于一次施用，那么将会低于有效量。
如医学领域所熟知，用于任一主体的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康，和同时施用的其他药物。剂量根据疾病的类型和严重性可以进一步变化。典型剂量可以是例如以下范围，约1 mg-约 100 mg；优选约 2 mg -约 100 mg；更优选约 5 mg -约 100 mg；甚至更优选约 5 mg-约 50 mg，甚至更优选约 5 mg -约 25 mg；甚至更优选约 5 mg -约 20 mg；甚至更优选约 5 mg -约 15 mg；然而，考虑低于或高于该示例性范围的剂量，尤其考虑上述因素时。每日肠胃外剂量方案可以从约10 μg/kg-约10 mg/kg。可以通过周期评估监测进程，并因此调节剂量。
在本发明的一些实施方案中，可以经静脉内施用单次剂量的本发明的多功能抗体用于在成年患者中治疗癌症。用于静脉内施用的典型的单次剂量可以是例如，约100mg-约1250mg的范围内；优选，约200 mg - 约 1250 mg；更优选，约 500 mg - 约 1250 mg；甚至更优选，约 750 mg - 约 1250 mg，甚至更优选，约 800 mg - 约 1250 mg；甚至更优选，或最优选约 800 mg - 约 1000 mg；然而，考虑低于或高于该示例性范围的剂量，尤其考虑上述因素时。或者，用于静脉内施用本发明的多功能抗体的典型的单次剂量可以是例如，约10mg/kg - 约 20 mg/kg体重，更优选约 12 mg/kg - 约 15 mg/kg，或甚至更优选约 12 mg/kg - 约 13 mg/kg。例如，可以每周一次，每两周一次，每三周一次，或每月一次静脉内施用该剂量。可以通过周期评估监测进程，并因此调节剂量。
这些提示量的抗体进行了大量的治疗判断。选择合适剂量和方案中的关键因素是所获得的结果。在该上下文中的考虑因素包括所治疗的具体病症、个体患者的临床状况、病症起因、抗体的递送位点、抗体的具体类型、施用方法、施用方案，和医学技术人员已知的其他因素。
本发明的抗MET/EGFR多功能抗体在人医学中用作药物，其通过多种途径施用。因此，本发明还提供包含任一上述多功能抗体，或其MET和EGFR结合片段，和药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物。最优选地，该组合物用于肠胃外施用。如本文所用的术语肠胃外包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道，或腹膜内施用。优选通过静脉内或腹膜内或皮下施用的肠胃外递送。最优选静脉内施用。用于该施用的合适的媒介物为本领域所熟知。
药物组合物在所提供的容器，包括例如密封瓶、注射器或其他递送装置，例如笔(pen)中，在制造和储存条件下通常必须是无菌且稳定的。因此，药物组合物在制备制剂后必须无菌过滤，或以其他方式在无微生物污染下制备。
本发明的抗体可以单独或与药学上可接受的载体和/或稀释剂一起以单次或多次剂量向人主体施用。可以将该药物组合物设计适用于所选的施用模式，并且适当使用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，诸如分散剂、缓冲液、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂，包括但不限于氯化钠、稳定剂等。可以根据例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 第19版，Gennaro, 编辑, Mack Publishing Co., Easton, PA(1995)（其提供技术人员一般已知的配制技术的摘要）中公开的常规技术设计该组合物。用于药物组合物的合适载体包括任何材料，当与本发明的抗体组合时，其保留分子活性并不与主体免疫系统反应。
以下非限制性实施例阐明了本发明多功能抗体的多种性质。
实施例
参考实施例1
1.1. 表达和纯化多功能抗体NH-YK
可以基本如下表达和纯化多功能抗体NH-YK。使用含有SEQ ID NO: 28 (编码具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的第一多肽)和SEQ ID NO: 34 (编码SEQ ID NO: 33的轻链氨基酸序列)的DNA的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体通过电穿孔来转染中国仓鼠细胞系CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, United Kingdom)。表达载体编码SV早期（猿猴病毒40E）启动子和GS的基因。GS的表达允许谷氨酰胺（CHOK1SV细胞需要的一种氨基酸）的生物化学合成。转染后，将细胞用50µM L-甲硫氨酸磺基肟(MSX)进行大量选择。利用MSX对GS的抑制来增加选择的严格性。将整合表达载体cDNA入宿主细胞基因组的转录活性区内的细胞对CHOK1SV野生型细胞选择，其表达内源水平的GS。以低密度铺板转染的库(pool)以允许稳定表达细胞的接近克隆的生长晕(close-to-clonal outgrowth)。可以筛选主孔的多功能抗体表达，然后根据需要在无血清悬浮培养物中按比例放大。或者，批量选择的转染子可以进行单细胞克隆程序，如荧光激活细胞分选(FACS)或有限稀释并筛选多功能抗体表达。一旦鉴定到合适的细胞系，那么根据需要在无血清悬浮培养物中将其按比例放大。将多功能抗体已经分泌其中的澄清培养基应用到蛋白A亲和柱上，其已经利用相容缓冲液，诸如磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)或Tris 缓冲液(pH 7.4)进行了平衡。洗涤该柱以去除非特异性结合的组分。例如通过pH梯度（诸如0.1 M磷酸钠缓冲液pH 6.8-0.1 M柠檬酸钠缓冲液 pH2.5-3.0）洗脱结合的多功能抗体。诸如通过280 nm处切割(cutting)的吸光度、SDS-PAGE或分析大小排阻检测和/或收集多功能抗体级分。通过常见技术包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析可以将可溶的聚集体或多聚体有效去除。可以使用常见技术将多功能抗体浓缩和/或无菌过滤。这些层析步骤后多功能抗体的纯度高于90%，优选高于98%。可以在-70℃立即冰冻多功能抗体或储存在4℃数月。
1.2. 表达和纯化多功能抗体NH-H9
可以基本如参考实施例1.1中上述表达和纯化多功能抗体NH-H9，例外是使用含有SEQ ID NO: 30 (编码具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的第一多肽)和SEQ ID NO: 34(编码SEQ ID NO: 33的轻链氨基酸序列)的DNA的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体通过电穿孔来转染中国仓鼠细胞系CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, United Kingdom)。
1.3. 表达和纯化多功能抗体H9
可以基本如参考实施例1.1中上述表达和纯化多功能抗体H9，例外是使用含有编码具有SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的第一多肽的DNA和SEQ ID NO: 34的DNA(编码SEQ IDNO: 33的轻链氨基酸序列)的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体通过电穿孔来转染中国仓鼠细胞系CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, United Kingdom)。
1.4. 表达和纯化多功能抗体YK
可以基本如参考实施例1.1中上述表达和纯化多功能抗体H9，例外是使用含有编码具有SEQ ID NO: 31的氨基酸序列的第一多肽的DNA和SEQ ID NO: 34的DNA(编码SEQ IDNO: 33的轻链氨基酸序列)的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体通过电穿孔来转染中国仓鼠细胞系CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, United Kingdom)。
实施例1：多功能抗体与MET和EGFR的结合分析
可以根据本领域已知的方法，使用表面等离子体共振生物传感器，诸如BIAcore®2000、BIAcore® 3000或BIAcore® T100 (Biacore Life Sciences Division, GEHealthcare, Piscataway, NJ)来测量抗体，诸如本文公开的抗体的结合动力学和亲合力。除非另有说明，可以从BIAcore® AB (Upsala, Sweden)购买所有试剂和材料，并且可以在25℃下进行测量。简言之，可以将样品溶解在HBS-EP缓冲液中(150 mM氯化钠，3 mM EDTA，0.005% (w/v)表面活性剂P-20，和10 mM N-2-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)，pH7.4)。可以使用在所有四层流动室（Fc）上含有固定蛋白A（其可以使用标准的NHS-EDC胺偶联产生）的CM5芯片来采用捕获方法学。开始可以通过稀释到运行缓冲液中以1 mcg/mL制备抗体样品，然后可以以流速10 µl/分钟测试其捕获30秒。基于所捕获的量，因而可以调整抗体浓度以靶定约70 RU-90 RU的捕获量。可以通过稀释到运行缓冲液中以100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0 (空白) nM的终浓度来制备MET-ECD或人EGFR-ECD。每个分析周期可以由以下组成：(1)在分隔开的流动室(Fc2、Fc3和Fc4)上捕获抗体样品，(2) 在所有Fc以50 mcL/分钟注射250 mcL (300-sec)的MET-ECD或EGFR-ECD，(3)返回缓冲液流20分钟以监测解离相，(4)利用25 mcL (30-sec)注射甘氨酸，pH 1.5再生芯片表面，(5)利用25mcL (30-sec)注射HBS-EP+缓冲液(即，具有0.05% (w/v) 而非0.005%的表面活性剂P-20的HBS-EP缓冲液)平衡芯片表面。可以使用标准双参考处理数据并使用Biacore T100评估软件，2.0版本或Biacore T200评估软件，1.0版本拟合成1:1结合模型，来测定结合速率(kon,M-1s-1单位)、解离速率(koff, s-1单位)和Rmax (RU单位)。可以从关系KD = koff/kon计算平衡解离常数(KD)。
基本如上所述测试本发明的四个抗MET/EGFR多功能抗体以测定其与 MET-ECD和EGFR-ECD的结合动力学和结合亲合力并在下文表4和5中概述结果。抗体NH-YK、NH-H9、H9和YK以高结合亲合力(KD)结合MET-ECD(表4)和EGFR-ECD (表5)。
表4：多功能抗体与MET-ECD的结合动力学和亲合力
。
表5：多功能抗体与EGFR-ECD的结合动力学和亲合力
。
实施例2：NH-YK与细胞表面MET和EGFR两者的结合
NSCLC细胞系H441 (ATCC, Manassas, VA; 目录号HTB-174)在表面上表达MET和EGFR两者。可以将H441细胞(6 x 106)铺板到100 mm聚-D-赖氨酸包被的组织培养皿上并在37℃, 5% CO2下孵育2天。然后在4℃，利用100 nM对照IgG4、100 nM 西妥昔单抗和100 nM抗MET抗体的组合，或100 nM NH-YK处理细胞20分钟。可以利用冰冷的DPBS洗涤细胞并使用具有HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific, Rockford, IL)的CHAPS裂解缓冲液进行裂解。可以使用抗MET琼脂糖(agarose)或抗EGFR琼脂糖(sepharose)在600 µg各细胞裂解物样品上进行免疫沉淀（IP）并在4℃下进行孵育。可以洗涤树脂并从树脂上洗涤所结合的蛋白，然后装载到4-20% SDS-PAGE上并印迹到硝酸纤维素膜上用于Western印迹。可以探测膜的总MET或总EGFR。
基本如上所述进行的免疫沉淀实验证明在利用抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK处理后，而不是利用抗MET抗体、西妥昔单抗，或甚至抗MET抗体和西妥昔单抗的组合处理后MET和EGFR共免疫沉淀。这些数据表明NH-YK可以结合MET和EGFR（数据未显示）。
实施例3：多功能抗体NH-YK和NH-H9显示与细胞表面MET的增强的抗体亲抗原性结合
NSCLC癌细胞系HCC827具有高水平的MET表达。简言之，可以使用无酶的解离缓冲液从细胞培养瓶中取出HCC827细胞并以大约 5 x 105细胞/孔将其添加到96孔板中。然后在4℃下，利用未标记抗体（以500 nM开始）与5 nM Alexa488-标记的抗MET抗体的组合剂量滴定处理细胞1小时，以测定未标记抗体与标记的抗MET抗体竞争结合细胞表面MET的能力。最终，可以通过FACS检测标记的抗MET抗体的结合。
如通过基本如本实施例中所述进行的测定所证明，抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9比其亲本抗MET抗体具有明确较高的抗体亲抗原性结合（表6）。
表6：抗MET/EGFR多功能抗体具有与HCC827细胞增加的抗体亲抗原性结合
MFI =通过与Alexa 488-标记的抗MET Ab竞争表明的平均荧光强度。
实施例4：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9对于内化和降解细胞表面EGFR比西妥昔单抗显示更好的活性
A部分：NSCLC细胞系H441在其细胞表面上表达中等水平的MET和EGFR。可以测试抗MET/EGFR多功能抗体其耗尽来自H441细胞的细胞表面MET和EGFR的能力。简言之，可以将2mL培养基中的1.5 x 105个细胞每孔铺板到6孔板中并在37℃, 5% CO2下孵育过夜。可以以50 nM向H441细胞中加入抗体NH-YK、NH-H9或对照抗体。过夜处理后，可以利用无酶的解离缓冲液从孔中取出细胞、洗涤，然后利用标记的EGFR或MET抗体（其识别来自多功能抗体或对照抗体处理的不同表位）染色1小时。洗涤细胞并通过FACS测量标记的抗体染色。
为了评估抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK 和NH-H9在体内促进MET和EGFR降解的能力，基本如该实施例的A部分中所述进行测定。来自这些研究的结果证明，与其亲本抗MET抗体类似，抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9能够耗尽来自H441细胞的细胞表面MET。令人惊奇的是，尽管抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9触发了显著的EGFR降解，然而西妥昔单抗或抗MET抗体和西妥昔单抗的组合却不会触发（表7）。
B部分：NSCLC细胞系H1993表达高水平的MET和中等水平的EGFR；胃癌细胞系MKN45表达高水平的MET和低水平的EGFR；NSCLC细胞系H441 在其细胞表面上表达中等水平的MET和EGFR。简言之，可以将2 mL培养基中的5 x 105个细胞每孔铺板到6孔板中并在37℃, 5%CO2下孵育过夜。可以以100 nM向细胞中加入抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK、NH-H9或对照抗体。过夜处理后，可以裂解细胞，可以将15 µg各样品在 4-12% BisTris凝胶上跑胶，然后印迹到PVDF膜上。可以通过western印迹探测膜的总EGFR、总MET和GAPDH。
为了评估抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK 和NH-H9在体外促进MET和EGFR降解的能力，基本如该实施例的B部分中所述进行测定。来自这些研究的结果证明，与亲本抗MET抗体类似，抗体NH-YK和NH-H9降解来自H1993、MKN45和H441细胞的MET。然而，令人惊奇的是，抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9触发了显著的EGFR降解，然而西妥昔单抗或亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合却不会触发（图1）。
表7.抗MET/EGFR多功能抗体对H441细胞上的EGFR具有增加的内化活性
MFI = 平均荧光强度；AVG = 平均数；Std.Err = 标准误差。
实施例5：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9阻断MET和EGFR激活
A部分：已经显示在存在HGF的情况下NSCLC癌细胞系H596对EGFR抑制剂的生长抑制作用具有抗性。因此，该细胞系可以用于测定在存在HGF的情况下抗体是否可以抑制H596的增殖。简言之，可以将100 µL培养基中的3 x 103个细胞/孔铺板到96孔板中并在37℃,5% CO2下孵育过夜。可以从100 nM（最终）开始在无血清培养基中以1:3稀释抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9或对照抗体并将其与50 µL中的 50 ng/mL HGF（最终）组合以4x浓度加入到H596细胞中。在细胞额外生长6天结束时，可以将平板平衡到室温30分钟并且可以加入100 µL/孔的CellTiter-Glo®试剂(Promega Corp., Fitchburg, WI )。可以通过测量发光来测定细胞活力。
基本如该实施例所述进行的测定证明抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9比西妥昔单抗或亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合更好地抑制HGF刺激的H596的体外增殖。
表8：抗MET/EGFR多功能抗体在存在HGF的情况下在抑制H596增殖中显示比单个抗体的组合较高的活性
缩写：AVG = 细胞活力的平均%；Std.Err = 标准误差。
B部分：其他肿瘤细胞系也可以用于测定抗MET/EGFR多功能抗体在体外测定中抑制肿瘤细胞的增殖中是否具有比两个单独抗体的组合较高的活性。例如，尽管具有中等水平的MET表达，但是已经显示结肠癌细胞系GEO受EGFR配体自分泌激活的驱动。肺癌细胞系H1666具有EGFR基因扩增并且已经显示其增殖受EGFR激活的驱动。NSCLC细胞系H1993和EBC-1均表达高水平的MET（由于MET基因扩增），和中等水平的EGFR。
基本如该实施例所述进行的测定证明抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9比西妥昔单抗更好地抑制结肠癌细胞系GEO的体外增殖，并且令人惊奇的是，甚至比其亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合更有效（表9）。
表9：抗MET/EGFR多功能抗体在抑制GEO增殖中显示比单个抗体的组合较高的活性
缩写：AVG = 细胞活力的平均%；Std.Err = 标准误差。
类似地，表10中显示的结果证明抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK、NH-H9和H9各自比西妥昔单抗更好地抑制H1666增殖，并且比亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合更有效。
表10：抗MET/EGFR多功能抗体在抑制H1666增殖中显示比单个抗体的组合较高的活性
缩写：AVG = 细胞活力的平均%；Std.Err = 标准误差。
类似地，表11中显示的结果证明抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9各自与其亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合一样好地抑制H1993(表11)和EBC-1(表12)增殖，或比其亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合更好地抑制H1993(表11)和EBC-1(表12)增殖。
表11：抗MET/EGFR多功能抗体在抑制H1993增殖中显示比单个抗体的组合较高的活性
缩写：AVG = 细胞活力的平均%；Std.Err = 标准误差。
表12：抗MET/EGFR多功能抗体在抑制EBC-1增殖中显示比单个抗体的组合较高的活性
缩写：AVG = 细胞活力的平均%；Std.Err = 标准误差。
实施例6：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9诱导细胞凋亡
胃癌细胞系MKN45可以用于测定抗体诱导的细胞凋亡。简言之，可以将80 µL培养基中的3 x 103细胞/孔铺板到96孔板中并在37℃, 5% CO2下孵育过夜。可以在细胞培养基中稀释CellEvent™试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA)并以每孔10 µL进行添加。为了100 nM的终浓度，以10 µL的10x浓度向MKN45细胞中加入NH-YK、NH-H9或对照抗体。在37℃, 5% CO2下，可以通过INCUCYTE™ Kinetic Imaging System (Essen Bioscience,Ann Arbor, MI)以3小时的间隔实时测量胱天蛋白酶-3/7阳性细胞，持续总计120小时。
如通过基本如该实施例中所述进行的测定所测定，抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9各自在MKN45中比亲本MET Ab和西妥昔单抗的组合诱导更多的体外细胞凋亡（表13）。此外，在基本如该实施例中所述进行的测定中，NH-YK比单臂5D5和埃罗替尼的组合诱导更高程度的MKN45细胞凋亡（数据未显示）。
表13：MKN45细胞凋亡测定
缩写：AVG = 细胞凋亡的平均%增加；
Std.Err = 标准误差。
实施例7：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK在存在HGF的情况下恢复肿瘤细胞的埃罗替尼敏感性
NSCLC癌细胞系HCC827具有EGFR基因扩增和高的MET表达。HCC827细胞对埃罗替尼处理敏感，但是在存在HGF的情况下对埃罗替尼处理变得有抗性。简言之，可以将100 µL培养基中的3 x 103细胞/孔铺板到96孔板中并在37℃, 5% CO2下孵育过夜。为了50 nM抗体、50 ng/mL HGF和1 µM 埃罗替尼的终浓度，可以向细胞中加入NH-YK或对照抗体(hIgG4)1小时，随后加入埃罗替尼和/或HGF。细胞在37℃，95%相对湿度和5% (v/v) CO2下额外生长3天结束时，可以将平板平衡至室温30分钟并加入100 µL/孔CellTiter-Glo®试剂(PromegaCorp.)。可以在定轨振荡器上振荡平板2分钟以混合内容物，然后将其在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。可以通过测量发光来测定细胞活力。
如通过进行基本如该实施例所述的测定所测定，抗体NH-YK在存在HGF的情况下能够比亲本抗MET抗体与西妥昔单抗的组合更好地恢复体外HCC827细胞的埃罗替尼敏感性（表14）。
表14：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK在存在HGF的情况下在恢复HCC827对埃罗替尼的敏感性中具有比单个抗体的组合较高的活性
缩写：AVG = 细胞活力的平均%；Std.Err = 标准误差；H = HGF。
实施例8：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK恢复利用HGF和EGF处理的HT-29细胞的B-Raf抑制剂PLX4032敏感性
结肠癌细胞系HT-29具有B-Raf突变并对B-Raf抑制剂PLX4032敏感。HT-29细胞在HGF和EGF刺激后变得对PLX4032或泛(pan)-Raf抑制剂处理有抗性。可以测试抗MET/EGFR多功能抗体其恢复利用HGF和EGF处理的HT-29细胞的PLX4032抑制剂敏感性的能力。简言之，可以将100 µL培养基中的3 x 103细胞/孔铺板到96孔板中并在37℃, 5% CO2下孵育过夜。在无血清培养基中稀释抗体NH-YK、PLX4032、HGF、EGF、阳性对照和阴性对照并将其以4x浓度加入到50 µL中的HT-29细胞中。试剂的终浓度可以是：抗体为50 nM，HGF和EGF为50 ng/mL，PLX4032从1 µM开始1:5的稀释。在细胞生长额外5天结束时，可以将平板平衡到室温30分钟并且可以加入100 µL/孔的CellTiter-Glo®试剂(Promega Corp.)。可以通过测量发光来测定细胞活力。
如通过进行基本如该实施例所述的测定所测定，抗体NH-YK能够恢复利用HGF和EGF处理的HT-29细胞的PLX4032敏感性（表15）。此外，抗体NH-YK在恢复FaDu细胞中的 拉帕替尼 (即，EGFR/HER-2抑制剂)敏感性中优于亲本抗MET抗体和西妥昔单抗的组合（表16）。
表15：抗体NH-YK在存在HGF和EGF的情况下在恢复HT-29对B-Raf抑制剂PLX4032的敏感性中具有比单个抗体的组合较高的活性
缩写：PLX = PLX4032；AVG =细胞活力的平均%；
Std.Err =标准误差；H = HGF (50 ng/mL); E = EGF (50 ng/mL)
所有抗体均为50 nM。
表16：抗MET/EGFR多功能抗体NH-YK和NH-H9在存在HGF的情况下在恢复FaDu对拉帕替尼的敏感性中具有比单个抗体的组合较高的活性
实施例9：小鼠异种移植模型中的MET和EGFR降解
可以根据本领域所熟知的方法，在携带H441 (NSCLC)和MKN45（胃癌）异种移植肿瘤的小鼠中评估抗MET/EGFR多功能抗体在体内促进MET和EGFR降解的能力。
在H441异种移植物中给药后48小时施用两个不同剂量水平（10和27mg/kg）的抗体NH-YK诱导与亲本抗MET抗体和西妥昔单抗（均以20 mg/kg给药）的组合相当水平的MET降解。相反，当与相同异种移植模型中的PBS处理的对照动物相比时，亲本抗MET抗体和西妥昔单抗（均以20 mg/kg给药）的组合不能诱导EGFR降解。令人惊奇的是，当与PBS处理的或亲本抗MET抗体和西妥昔单抗（均以20 mg/kg给药）处理的小鼠相比时，施用抗体NH-YK触发显著的EGFR降解。类似地，在携带MKN45胃异种移植物的动物中，当与亲本抗MET抗体和西妥昔单抗（均以20 mg/kg给药）的组合相比时，抗体NH-YK促进MET的同等降解，但是令人惊奇地显著更高的EGFR降解。
实施例10：在NSCLC (H1993、H441、EBC-1)和胃癌的小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长
可以通过商业途径获得，包括从Harlan Laboratories (Indianapolis, IN)获得年龄6-7周的雌性无胸腺裸鼠。允许小鼠适应一周并以正常低脂肪(4.5%)饮食随意饲喂，其可以在研究期间持续进行。可以从ATCC购买获得肿瘤细胞并可以在细胞培养基，如具有L-谷氨酰胺、25 mM HEPES的补充有10% FBS和1 mM丙酮酸钠的RPMI 1640 (LifeTechnologies)中进行培养。可以利用无血清培养基剥离洗涤细胞，然后在无血清RPMI1640中以 50 x 106 细胞/mL的终浓度进行重悬浮。可以在主体小鼠的后胁腹经皮下注射无血清生长培养基和Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA)的1:1混合物中的大约5 x 106 肿瘤细胞。每周两次进行肿瘤和体重测量。在处理前，可以使用随机算法基于肿瘤大小将小鼠随机化。可以当平均肿瘤体积达到100 mm3时开始处理。将随机化的小鼠分到不同组中并且每周一次通过尾静脉注射以抗体进行给药。
在给药前，在磷酸缓冲盐溶液（PBS）中制备所有测试或对照抗体。可以通过卡尺测量测定肿瘤大小。可以从公式A2 x B x 0.536估计肿瘤体积(mm3)，其中A是较小的垂直直径，B是较大的垂直直径。可以将肿瘤体积数据转换成对数标尺(log scale)以等于跨时间和处理组的变量。可以使用SAS PROC MIXED软件(SAS Institutes Inc, Cary, NC)，利用双向重复测量ANOVA通过时间和处理分析对数体积数据。在每个时间点上将处理组与规定的对照组进行比较。
A部分：如该实施例中上述产生携带H1993 NSCLC异种移植物的免疫缺陷小鼠并利用媒介物对照、抗体NH-YK或亲本MET抗体加西妥昔单抗的组合每周一次进行处理，持续连续5周。亲本MET抗体和西妥昔单抗(均以20 mg/kg给药)的组合导致平均处理肿瘤体积除以平均媒介物对照肿瘤体积(T/C%)值的百分比为86.1%，而等摩尔剂量的抗体NH-YK (27 mg/kg)导致肿瘤体积显著更高的降低(T/C% 为28.5%, p<0.001)（图2）。当在H441异种移植物中测试时，与媒介物对照或亲本MET抗体和西妥昔单抗的组合相比时，抗体NH-YK也显示较高的功效（图3）。
B部分：在EBC-1 NSCLC异种移植模型中，利用抗体NH-YK的处理（10 mpk）导致32.9%的T/C%(p<0.001)（图4）。
C部分：胃癌细胞系MKN45具有高水平的MET基因扩增并且对MET抑制剂高度敏感。在MKN45胃异种移植模型中，抗体NH-YK显示与亲本MET抗体和西妥昔单抗的组合相当的抗肿瘤功效（分别为T/C% = 17.4%, p < 0.001和18.6%, p < 0.001）（图5）。
D部分：在H1993 NSCLC异种移植模型中，利用媒介物对照、抗MET/EGFR多功能抗体H9（4和27 mg/kg）、单独抗MET（3和20 mg/kg）、西妥昔单抗 (3 和20 mg/kg)或抗MET加西妥昔单抗的组合(3 mg/kg和20 mg/kg的每种抗体)每周一次处理携带异种移植物的免疫缺陷小鼠，持续连续5周。27 mg/kg的抗MET/EGFR多功能抗体H9导致比任何其他处理显著更高的抗肿瘤功效(p<0.001)（图6）。
当在H441异种移植物中测试时，当与单个处理或亲本MET抗体和西妥昔单抗的组合相比时，抗体H9也显示较高的功效（图7）。
实施例11：在结肠直肠癌患者来源的异种移植(PDX)模型中抑制肿瘤生长
可以获得患者来源的结肠直肠癌样品并且可以将来源于单个患者的肿瘤片段植入单只缺乏免疫的小鼠中并允许其生长直至达到大概100-200 mm3的体积。可以每周一次施用以27 mg/kg的抗体NH-YK或媒介物对照，持续连续3-4周。可以每周两次通过电子卡尺测量肿瘤。也可以定期评估体重。可以利用以每周一次的安排通过腹膜内（i.p.）注射施用的磷酸缓冲盐溶液(PBS)来处理媒介物对照组，进行4个周期。可以使用公式计算肿瘤体积：A2 x B x 0.536，其中A是较小的垂直直径，B是较大的垂直直径。
基本如该实施例11中上述将来自两个患者的结肠直肠癌样品单独植入到两只不同的缺乏免疫的小鼠中。如表17和18中所示，当与携带PDX肿瘤的媒介物处理的动物进行比较时，每周施用抗体NH-YK显著减少PDX肿瘤各自的体积。
表17
。
表18
。
实施例12：在头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者来源的异种移植(PDX)模型中抑制肿瘤生长
可以获得患者来源的头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)样品并且可以将来源于单个患者的肿瘤片段植入单只缺乏免疫的小鼠中并允许其生长直至达到大概100-200 mm3的体积。可以每周两次施用以27 mg/kg的抗体NH-YK或媒介物对照，持续连续4周。可以每周两次通过电子卡尺测量肿瘤。也可以定期评估体重。可以如下处理媒介物对照组：利用以每周一次的安排通过腹膜内注射施用的PBS，进行4个周期，和以每周一次的安排通过口服饲喂(p.o.)施用的20% PEG 400/80% [蒸馏去离子水中的20% captisol]，进行28个周期。可以使用公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3) =宽度2 x长度x 0.52。
基本如该实施例12中上述将来自两个患者的头颈部鳞状细胞癌样品单独植入到两只不同的缺乏免疫的小鼠中。如表19中所示，当与携带PDX肿瘤的媒介物处理的动物进行比较时，每周两次施用抗体NH-YK显著减少PDX肿瘤的体积。
表19
均值的标准误差(SEM)。
实施例13：在埃罗替尼抗性 NSCLC (埃罗替尼抗性 HCC-827)的小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长
可以通过商业途径获得，包括从Harlan Laboratories获得年龄6-7周的雌性无胸腺裸鼠。允许小鼠适应一周并以正常低脂肪(4.5%)饮食随意饲喂，其可以在研究期间持续进行。可以从ATCC购买获得HCC-827肿瘤细胞并可以在细胞培养基诸如具有L-谷氨酰胺、25mM HEPES的补充有10% FBS和1 mM丙酮酸钠的RPMI 1640中进行培养。可以利用无血清培养基剥离洗涤细胞，然后在无血清RPMI 1640中以 50 x 106 细胞/mL的终浓度进行重悬浮。可以在雌性无胸腺裸鼠的后胁腹经皮下植入无血清生长培养基和Matrigel的1:1混合物中的大约 5 x 106 活的肿瘤细胞。一旦肿瘤建立，那么利用25 mg/kg 埃罗替尼的每日剂量处理小鼠，直至即使在存在埃罗替尼的情况下抗性肿瘤也开始重新生长。一旦抗性肿瘤达到大概1000 mm3的平均体积，可以将它们切除，分成50 mm3的片段并重新植入到主体雌性无胸腺裸鼠中。为了监测重新生长，可以每周两次进行肿瘤和体重的测量。一旦平均肿瘤体积达到100 mm3，使用随机算法将动物随机化并分到处理组中。在PBS中稀释抗体并通过尾静脉注射每周一次施用。为了保证肿瘤是埃罗替尼抗性的，对照组中的动物接受PBS媒介物和25 mg/kg 埃罗替尼。通过电子卡尺测定并可以从公式A2 x B x 0.536估计肿瘤体积(mm3)，其中A是较小的垂直直径，B是较大的垂直直径。
如该实施例中上述产生携带埃罗替尼抗性的HCC-827 NSCLC异种移植物的免疫缺陷小鼠并利用以下进行处理：(A)媒介物加25 mg/kg 埃罗替尼 (即，对照组)，(B) 25 mg/kg 埃罗替尼和27 mg/kg抗体NH-YK的组合，(C)25 mg/kg 埃罗替尼和20 mg/kg 西妥昔单抗的组合，(D)以20 mg/kg给药的亲本MET抗体和25 mg/kg 埃罗替尼的组合，或(E)以20mg/kg给药的亲本MET抗体、以20 mg/kg给药的西妥昔单抗和25 mg/kg 埃罗替尼的组合。与所有其他处理组相比，在相同或更长的时期后，抗体NH-YK和埃罗替尼的组合（即，处理组（B））导致绝对肿瘤体积的显著减少（表20）。因此，利用抗体NH-YK和埃罗替尼的组合处理后，特别是当与利用组合有PBS媒介物、西妥昔单抗或亲本MET抗体的埃罗替尼处理的动物相比时，携带埃罗替尼抗性的肿瘤的小鼠中的肿瘤生长被显著减小。当与埃罗替尼、西妥昔单抗和亲本MET抗体的组合(E)相比时，抗体NH-YK和埃罗替尼(B)的组合也显示较高的抗肿瘤功效。
表20
。

Claims (22)

1.多功能抗体，其包含
(a) 抗体，所述抗体结合MET并包含：
i) 重链，所述重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
ii) 轻链，所述轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ IDNO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；和
(b) scFv多肽，所述scFv多肽结合EGFR并包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO:1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) 或VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)、和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列 RASYSIGTNIH (SEQ ID NO:4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)或YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)、和QQNNAWPTT (SEQ ID NO:6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
2.权利要求1的多功能抗体，其中所述scFv多肽包含：
(a) 由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的HCVR结构域；和
(b) 由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的LCVR结构域。
3.权利要求1-2中任一项的多功能抗体，其中所述重链由SEQ ID NO: 53的氨基酸序列组成并且所述轻链由SEQ ID NO: 33的氨基酸序列组成。
4.权利要求1-2中任一项的多功能抗体，其中所述scFv多肽的C末端经肽接头融合至MET抗体重链的N末端。
5.权利要求1-2中任一项的多功能抗体，其由SEQ ID NO: 25的氨基酸序列组成。
6.权利要求1-2中任一项的多功能抗体，其中所述重链由SEQ ID NO: 27的氨基酸序列组成并且所述轻链由SEQ ID NO: 33的氨基酸序列组成。
7.权利要求1-2中任一项的多功能抗体，其中结合MET的抗体包含：
(a) 第一重链和第二重链，其中每一重链包含分别由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列组成的重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
(b) 第一轻链和第二轻链，其中每一轻链包含分别由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO:14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成的轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。
8.权利要求7的多功能抗体，其中所述第一scFv多肽和第二scFv多肽各自包含：
i) HCVR结构域，所述HCVR结构域包含分别由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO:1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2) 或VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)、和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)组成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3；和
ii) LCVR结构域，所述LCVR结构域包含由氨基酸序列 RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)或YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)、和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)组成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
9.权利要求8的多功能抗体，其中所述第一scFv多肽和第二scFv多肽各自包含：
(a) 由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的HCVR结构域；和
(b) 由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的LCVR结构域。
10.权利要求9的多功能抗体，其中所述第一和第二scFv多肽各自由SEQ ID NO: 23的氨基酸序列组成。
11.权利要求10的多功能抗体，其中结合MET的抗体包含：
i) 第一重链和第二重链，其中每一重链由SEQ ID NO: 53的氨基酸序列组成；和
ii) 第一轻链和第二轻链，其中每一轻链由SEQ ID NO: 33的氨基酸序列组成。
12.权利要求11的多功能抗体，其中第一scFv多肽的C末端经肽接头融合至第一重链的N末端并且第二scFv多肽的C末端经肽接头融合至第二重链的N末端。
13.权利要求12的多功能抗体，其包含两条第一多肽和两条第二多肽，其中两条第一多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27和两条第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 33。
14.权利要求1-2和8-13中任一项的多功能抗体，其中所述多功能抗体诱导细胞表面MET和EGFR的内化和/或降解。
15.权利要求1-2和8中任一项的多功能抗体，其包含两条第一多肽和两条第二多肽，其中两条第一多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 29和两条第二多肽的氨基酸序列是SEQ IDNO: 33。
16.药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的多功能抗体，或其MET和EGFR结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂。
17.权利要求16的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述药物用于治疗NSCLC、SCLC、胃癌、结肠直肠癌、胆管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、肾癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、或头颈癌。
19.权利要求18的用途，其中所述癌症的特征在于包含具有一个或多个KRAS突变的细胞。
20.权利要求1-15中任一项的多功能抗体、或其MET和EGFR结合片段在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述癌症是NSCLC、SCLC、胃癌、结肠直肠癌、胆管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、肾癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、或头颈癌。
22.权利要求21的用途，其中所述癌症的特征在于包含具有一个或多个KRAS突变的细胞。
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