PT1951759E - Anticorpos anti-egfr - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ANTI-EGFR"

Campo do invento 0 invento situa-se no campo da medicina, particularmente no campo dos anticorpos monoclonais contra o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Mais especificamente, o invento está relacionado com anticorpos anti-EGFR humanizados de elevada afinidade e com a utilização dos anticorpos em terapia, profilaxia ou diagnóstico de vários cancros.

Fundamento do invento 0 receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é um membro da família de receptores cinases de tirosina que são largamente expressos em tecidos epiteliais, mesenquimatosos e neuronais e desempenham papéis fundamentais durante o desenvolvimento e diferenciação. EGFR, também conhecido como HERl ou c-erbB-1, é uma glicoproteína transmembranar de 170 kDa consistindo num dominio extracelular de ligação a um ligando, numa região transmembranar e num domínio intracelular com actividade de cinase de tirosina (Ullrich et al., Human Epidermal growth factor cDNA Sequence and 2

Aberrant Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-25 (1986)). Os ligandos de mamífero que se ligam e activam EGFR, incluem EGF, factor de crescimento transformante α (TGFa), factor de crescimento de ligação a heparina do tipo EGF, anfirregulina, betacelulina, epirregulina e epigene (Singh, A. e Harris, R., 2005, Cellular Signaling 17:1183-1193). A ligação dos factores de crescimento EGF ou do factor decrescimento transformante α (TGFa) ao receptor do factor de crescimento epidérmico resulta em dimerização do receptor, autofosforilação e indução de uma cascata de cinases de tirosina, conduzindo no final à síntese de DNA e à divisão celular. EGFR é anormalmente activado em muitos tumores epiteliais, incluindo os de cancro das células pequenas do pulmão, cancro da mama, cancro colo-rectal, cancros da cabeça e pescoço e cancro da próstata (Adams, G. e Weiner, L., 2005, Nature Biotechnology, 23:1147-1157). A activação anormal de EGFR pode derivar da expressão excessiva do receptor, da amplificação do gene, de mutações activadoras, da expressão excessiva dos ligandos do receptor e/ou da perda de reguladores da actividade de EGFR (Baselga J. e Arteaga, C., 2005, J, of Clin. Oncol. 23:2445-2459). A activação anormalmente elevada de EGFR resulta na fosforilação de vários substratos intracelulares, os quais por sua vez dão origem a sinalização mitogénica assim como a outras actividade indutoras de tumores. Consequentemente, EGFR é um alvo para estratégias terapêuticas anti-cancro 3 que podem potencialmente inibir ou reduzir a expressão aberrante do receptor.

Agentes anti-cancro que têm como alvo EGFR incluem anticorpos monoclonais. 0 anticorpo monoclonal quimérico C225 (ou cetixumab), o qual possui a região variável da cadeia murina do mAb 225 e uma região constante IgGl humana, está presentemente disponível para tratamento nos Estados Unidos e Europa (Baselga J. e Arteaga, C., 2005, J. Clin. Oncol. 23:2445-2459). Foram ainda estudados anticorpos monoclonai humanos e humanizados contra EGFR. O anticorpo totalmente humano ABX-EGF (panitumumab) possui afinidade para EGFR aproximadamente 8 vezes superior à de C225 (Yang, X-D et al., 2001, Crit. Ver. Oncol./Hemat., 38:17-23). A afinidade do anticorpo humanizado EMD72000 (matuzumab) para EGFR é semelhante à de C225 (Vanhoefer, U. et al., 2004, J. Clin. ONcol., 22:175-184) e a afinidade do anticorpo humanizado h-R3 para EGFR é inferior à de C225 (Crombet, T. et al., 2004, J. Clin. Oncol., 22:1646-1654). Foram observadas complicações na clinica com doses de cetuximab superiores a 100 mg/m2. Estas incluem toxicidade cutânea que resulta em enrubescimento, dermatite seborreica e erupção acniforme (Herbst, R. e Langer, C., 2002, Semin. Oncol. 29:27-36). WO 98/50433 descreve anticorpos monoclonais humanos totalmente humanos contra o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) humano. Um anticorpo, E2.5, liga-se com uma afinidade de 16 pM e inibe a interacção 4 EGFR/EFR. WO 96/40210 descreve versões quimerizadas e humanizadas do anticorpo anti-receptor de EGF 225 e seus fragmentos para o tratamento de tumores. Este anticorpo, no entanto, não atinge uma afinidade de 0,1-10 pM.

Existe a necessidade terapêutica de um anticorpo anti-EGFR que se ligue a EGFR com uma elevada afinidade e que iniba a activação anormal de EGFR em tumores epiteliais. Um anticorpo anti-EGFR de elevada afinidade permitirá que sejam administradas doses mais pequenas para eliminar potenciais efeitos secundários tais como toxicidade cutânea. Ainda, existe a necessidade de obter um anticorpo anti-EGFR que minimize qualquer potencial resposta imune contra o anticorpo que possa ser induzida através de dosagem múltipla. O presente invento satisfaz estas necessidades e proporciona vantagens relacionadas.

Sumário do invento

Anticorpos do invento são anticorpos monoclonais humanizados específicos de EGFR e porções dos mesmos de ligação ao antigénio, que inibem a activação de EGFR. Os anticorpos do invento são caracterizados pela ligação de elevada afinidade a EGFR, em que um anticorpo monoclonal anti-EGFR possui afinidade de ligação a EGFR (Kd) entre cerca de 0,01 pM e cerca de 0 pM. 5

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, é proporcionado um anticorpo, ou uma porção do mesmo de ligação ao antigénio, que inibe a activação de EGFR e se liga a EGFR com um kd entre 0,01 pM e 10 pM, compreendendo uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e uma região variável da cadeia leve (LCVR), em que a referida HCVR e a referida LCVR são seleccionadas de entre: a) uma HCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:50 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:67; b) uma HCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 51 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO : 68; c) uma HCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO :12} e d) uma HCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 56 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO : 73.

Uma outra realização do presente invento inclui o anticorpo monoclonal de qualquer uma das realizações atrás referidas em que o anticorpo é um anticorpo de tamanho completo, um anticorpo substancialmente intacto, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia simples. De preferência, o anticorpo, ou porção do mesmo de ligação ao antigénio, de qualquer uma das realizações acima é um anticorpo humanizado. 6

De acordo com um segundo aspecto do presente invento, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com o presente invento e um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 invento inclui moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo polinucleótidos que codificam os anticorpos aqui descritos e vectores, de preferência vectores de expressão, compreendendo as referidas moléculas de ácido nucleico. 0 invento também inclui células hospedeiras transfectadas com vectores contendo estes polinucleótidos que expressam os anticorpos aqui descritos.

Finalmente, o invento inclui a utilização de um anticorpo, de acordo com o presente invento aqui descrito, para a produção de um medicamento para o tratamento de um cancro mediado por EGFR num indivíduo necessitado.

Breve descrição dos desenhos

Fig. 1. mostra os resultados de um ELISA de captura com Fabs 2.69, 4.15, 4.21, anticorpo quimérico C225 e anticorpo AGX-EGF humanizado.

Fig. 2. mostra os resultados de um ensaio de proliferação de células A431 com Fabs 4.14, 4.15, 4.21, 4.4 e o anticorpo quimérico C225. 7

Fig. 3. mostra a inibição da proliferação de células A431 pelos anticorpos de tamanho completo 4.15, anticorpo murino 225 e anticorpo quimérico C225.

Fig.4. mostra a quantidade de EGFR fosforilado (p-TyrEGFR) detectado nas células A431 pré-incubadas com os anticorpos 4.15, 4.21 ou anticorpo quimérico C225.

Fig. 5. mostra que a inibição da proliferação de células A431 pelo anticorpo 4.15 e pelo anticorpo quimérico C225 está correlacionada com a inibição da fosforilação de EGFR.

Fig. 6. mostra os resultados de um ensaio para a indução por anticorpos da apoptose de células A431 por anticorpos de tamanho completo 4.15, anticorpo quimérico C225 e anticorpo humano ABX-EGF.

Fig. 7. mostra a inibição de tumores A431 num modelo de murganho por anticorpos de tamanho completo 2.69, 4.15, 4.21 e anticorpo quimérico C225.

Descrição detalhada do invento

Definições

Como aqui usado, o "receptor do factor de crescimento epidérmico" ou "EGFR" refere-se ao receptor 8 cinase de tirosina, maduro, da superfície celular. O termo "EGFR solúvel" ou "sEGFR" refere-se a uma porção de EGFR contendo o domínio extracelular de ligação a ligandos de EGFR. Mais especificamente, sEGFR possui os aminoácidos 1-619 de EGFR maduro (Ullrich et al., Human Epidermal growth factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-25 (1986)) . A frase "cancro mediado por EGFR" refere-se a um cancro caracterizado por tumores epiteliais em que EGFR é anormalmente activado para níveis superiores ao normal, correspondentes aos do tecido epitelial. Estes níveis mais elevados de actividade de EGFR promovem o crescimento tumoral em muitos tipos de cancro Tais cancros incluem, mas não estão limitados a cancro das células pequenas do pulmão, cancro da mama, cancro colo-rectal e cancros da cabeça e pescoço, e cancro da próstata. A activação anormal de EGFR pode surgir da expressão excessiva do receptor, amplificação do gene, mutações activadoras, expressão excessiva dos ligandos do receptor e/ou da perda de reguladores da actividade de EGFR. O termo "anticorpo", como aqui usado, destina-se a referir moléculas de imunoglobulina de quatro cadeias polipeptidicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) inter-ligadas por ligações dissulfureto. Cada uma das cadeias pesadas é constituída por uma região variável da cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma 9 região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é constituída por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada uma das cadeias leves é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviado com LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas do extremo amínico para o extremo carboxílico na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A atribuição de aminoácidos a cada um dos domínios é, geralmente, de acordo com convenções bem conhecidas (e.g., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ou o esquema de numeração de Chothia como descrito em Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273-927-948, 1997) . As CDRs de VH são aqui referidas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3. As CDRs de VL são aqui referidas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3.

As cadeias leves são classificadas como capa e lambda. As cadeias pesada são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variável e constante são ligadas por uma região "J" de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma 10 região "D" de aproximadamente 3 ou mais aminoácidos.

De acordo com o que se segue, os anticorpos do presente invento são anticorpos monoclonais. Tais anticorpos, no entanto, são monoclonais apenas no sentido de poderem derivar de um clone de um único tipo celular. No entanto, isto não pretende limitá-los a uma origem particular. Tais anticorpos podem ser facilmente produzidos em células que normalmente não produzem anticorpos, tais como células CHO, NSO ou COS. Ainda, tais anticorpos podem ser produzidos noutros tipos celulares, especialmente células de mamífero e mesmo células vegetais, através da manipulação genética de tais células para expressarem e montarem as cadeias polipeptídicas pesada e leve formadoras do produto anticorpo. Ainda, tais cadeias podem ser obtidas por síntese química mas, uma vez que são específicas de um determinado determinante antigénico, ainda constituem anticorpos "monoclonais" dentro do espírito em que o termo é usado. Assim, como aqui usado, o termo anticorpo monoclonal destina-se a significar mais a especificidade e pureza das moléculas de anticorpo em vez do mero mecanismo usado para a produção dos referidos anticorpos. 0 termo "porção ligação de ligação ao antigénio", como aqui usado, refere-se à porção de uma molécula de anticorpo, dentro da região variável, que é necessária para se ligar ao antigénio com interesse. A porção de ligação ao antigénio contem resíduos de aminoácidos que interagem com um antigénio e conferem ao anticorpo a sua especificidade e 11 afinidade para o antigénio. A função de ligação ao antigénio pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho completo. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto da região charneira; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iv) e fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo e (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH. Ainda, apesar dos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, serem codificados por genes diferentes, podem ser ligados, usando métodos recombinantes, por um elemento de ligação sintético que lhes permite fazer uma única cadeia proteica, em que o par de regiões VL e VH formam moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv) ; ver e.g., Bird et al., (1988) Science 242:423-426; e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples destinam-se também a serem abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos são igualmente abrangidos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, bi-específicos em que os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptídica, mas usando um elemento de ligação que é demasiado pequeno para emparelhamento entre os dois 12 domínios da mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de uma outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver e.g., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123) . O termo "anticorpo humanizado" significa um anticorpo que é composto parcial ou totalmente por sequências de aminoácidos derivadas de uma linha germinal de anticorpo humano ou por uma sequência rearranjada e preparada através da combinação de tais sequências com regiões determinantes de complementaridade (CDRs) não humanas. As regiões estruturais das regiões variáveis são substituídas por regiões estruturais totalmente humanas ou substancialmente humanas. Num anticorpo humanizado para utilização terapêutica em seres humanos, a sequência estrutural é, de preferência, total ou substancialmente de origem humana (i.e., pelo menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de origem humana) . As CDRs de um anticorpo humanizado podem ser optimizadas a partir das CDRs de um anticorpo não humano de onde derivam para gerar as propriedades pretendidas, e.g., especificidade, afinidade e capacidade. As CDRs optimizadas podem ter substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos quando comparadas com as CDRs originais não humanas. Como aqui discutido, o anticorpo no contexto de anticorpo humanizado não está limitado a anticorpo de tamanho completo e pode incluir porções de ligação ao antigénio do mesmo, tais como 13 fragmentos e formas de cadeia simples. 0 termo "anticorpo humano", como aqui usado, destina-se a incluir anticorpos humanos, assim como os preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes. Os anticorpos humanos gerados por meios recombinantes incluem os anticorpos expressos usando um vector de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca recombinante combinatória de anticorpos humanos, anticorpos isolados a partir de um animal (e.g., um murganho) que é transgénico relativamente aos genes de imunoglobulina humana (ver, e.g. Taylor, L.D., et ai. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam "splicing" de sequências de genes de imunoglobulinas humanas com outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências germinais de imunoglobulina humana. Em determinadas realizações, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são sujeitos a mutagénese in vitro e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes sao sequências que, ainda que derivadas e relacionadas com sequências germinais VH e VL humanas, podem não existir naturalmente no reportório germinal de anticorpos humanos in vivo.

As frases "propriedade biológica" ou "actividade 14 biológica", em referência a um anticorpo do presente invento, são usadas indiferentemente e incluem mas não estão limitadas a afinidade de epitopo/antigénio, a capacidade para neutralizar ou antagonizar uma actividade de EGFR in vivo ou in vitro e a estabilidade in vivo do anticorpo e as propriedades imunogénicas do anticorpo. Outras propriedades identificáveis de um anticorpo incluem, por exemplo, especificidade, reactividade cruzada, (i.e., com homólogos não humanos do péptido alvo, ou com outras proteínas ou tecido, de um modo geral) e capacitar para preservar níveis elevados de expressão proteica em células de mamífero. As propriedades ou características referidas podem ser observadas ou medidas ou avaliadas usando técnicas reconhecidas na área incluindo, mas não estando limitado a ELISA, ELISA competitiva, análise de ressonânica de plasmões de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo, ligação a receptores e imuno-histoquímica com secções de tecido de diferentes fontes, incluindo humana ou qualquer outra fonte conforme adequado. 0 termo "inibir" como aqui usado relativamente a uma actividade de um anticorpo do invento significa a capacidade para antagonizar, proibir, prevenir, restringir, desacelerar, destruir, eliminar, parar, reduzir ou reverter e.g., a progressão ou a gravidade do que se pretende inibir incluindo, mas não estando limitado a uma actividade ou propriedade biológica, uma doença ou condição. A inibição ou neutralização é, de preferência, pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais. 15 A frase “capacidade para inibir a activação de EGFR" relativamente a um anticorpo como aqui usado, destina-se a referir um anticorpo cuja ligação a EGFR resulta na inibição da activação de EGFR humano e da actividade biológica de EGFR humano que ocorre quando da activação do receptor. A medição de um ou mais indicadores da actividade biológica de EGFR conforme determinado usando um ensaio de proliferação celular, um ensaio de apoptose, um ensaio de ligação a receptores, um ensaio de fosforilação de receptores ou um modelo murino de tumor (ver Exemplos 6-10) pode avaliar a capacidade do anticorpo para inibir a activação de EGFR. Um "anticorpo isolado", como aqui usado, destina-se a referir um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigénicas (e.g., um anticorpo isolado que se liga a EGFR está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antigénios). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a EGFR humano pode, no entanto, ter reactividade cruzada com outros antigénios, tais como moléculas de EGFR de outras espécies. Ainda, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou compostos químicos. 0 termo "Kon", como aqui usado destina-se a referir a constante de associação ou de velocidade de associação, ou velocidade de reacção específica, da reacção directa ou formadora de complexo, medida em unidades: M- 16 16 1 1seg' 0 termo "Koff", como aqui usado, destina-se a referir à constante de dissociação ou de velocidade de dissociação, ou velocidade de reacção especifica, para dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antigénio, medido em unidades: seg-1. 0 termo "Kd" como aqui usado, destina-se a referir à constante de dissociação de uma interacção particular anticorpo-antigénio. É calculada pela fórmula: "Koff"/"Kon"= Kd

Os anticorpos do presente invento são anticorpos de elevada afinidade, de um modo geral apresentando baixos valores de "K0ff". Para fins do presente invento, o termo "elevada afinidade" refere-se a uma afinidade ou Kd entre 1 x 10-1½ e cerca de 1 x 1(Γ14Μ ou refere-se ainda a uma afinidade ou Kd não superior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,08, 0, 06, 0, 04, 0,02 ou 0,01 pM. O termo "molécula de ácido nucleico", como aqui usado, destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou dupla, mas preferencialmente é DNA de cadeia dupla. O termo "molécula de ácido nucleico isolado", 17 como aqui usado na referência a ácidos nucleicos codificadores de anticorpos ou de porções de anticorpos (e.g., VH, VL, CDR3) que se ligam a EGFR humano destina-se a referir uma molécula de ácido nucleico em que as sequências nucleotidicas codificadoras do anticorpo ou porção de anticorpo estão livres de outras sequências nucleotidicas codificadoras de anticorpos ou de porções de anticorpos que se ligam a antigénios que não sejam EGFR humano, essas outras sequências podem naturalmente flanquear o ácido nucleico no DNA genómico humano. Assim, por exemplo, um ácido nucleico isolado do invento codificador de uma região VH de um anticorpo anti-EGFR humano não contém outras sequências codificadoras de outras regiões VH que se liguem a antigénios que não sejam EGFR humano. 0 termo "vector", como aqui usado, destina-se a referir uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual está ligado. Um tipo de vector é um "plasmídeo", o qual se refere a um DNA de cadeia dupla circular no qual outros segmentos de DNA podem ser ligados. Um outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma virai. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), como aqui usado, destina-se a referir uma célula em que um vector de expressão recombinante foi introduzido. 18

Caracterizaçao de anticorpos

Uma vantagem importante de um anticorpo humanizado é que são minimizadas as respostas imunes devidas à administração repetida em doentes. Quanto mais sequências humanas forem empregues num anticorpo humano, menor o risco de imunogenicidade. Ainda, os anticorpos humanizados injectados, de um modo geral, possuem uma maior semi-vida na circulação do que os anticorpos injectados que não sejam humanos ou que sejam parcialmente não humanos.

Como aqui discutido, as regiões variáveis estruturais humanas e suas variantes podem ser usadas no presente invento. No entanto, independentemente da região estrutural escolhida, se for um objectivo reduzir o risco de imunogenicidade, o número de alterações relativamente à região estrutural humana escolhida é minimizado.

Os resíduos estruturais da região variável da cadeia pesada e leve podem derivar das mesmas sequências de anticorpo humano ou de sequências diferentes. As sequências de anticorpo humano podem ser as sequências de anticorpos naturais humanos ou podem ser sequências de consenso de vários anticorpos humanos. 0 anticorpo humanizado do presente invento pode compreender ou derivar de uma região estrutural de cadeia leve germinal humana. Igualmente, o anticorpo humanizado do presente invento pode compreender ou derivar de uma região estrutural da cadeia pesada 19 germinal humana. 0 contexto estrutural das CDRs influencia a sua ligação ao antigénio, de forma que a variação entre as regiões estruturais podem conduzir a perda parcial ou significativa da afinidade de ligação ao antigénio. Em realizações preferidas, a região estrutural germinal da cadeia pesada humana é seleccionada entre VH2-26 e VH4-59. Ver WO 2005/005604 para uma descrição de diferentes sequências germinais.

As sequências de aminoácidos da região constante da cadeia pesada humana preferidas dos anticorpos humanizados do presente invento incluem a região constante de IgGl ou a região constante de IgG4, que são ambas bem conhecidas na área. O presente invento inclui anticorpos, ou porções da ligação ao antigénio dos mesmos, que se ligam a EGFR e inibem a ligação ao receptor de ligandos e subsequente activação. Assim, as CDRs e as regiões variáveis das cadeias pesada e leve aqui descritas são usadas para produzir anticorpos de tamanho completo, assim como fragmentos funcionais que mantêm a afinidade de ligação da proteína empregando as CDRs para a ligação a EGFR. A afinidade de ligação dos anticorpos foi determinada usando um ensaio KINEXA Sapidyne (ver Exemplo 7) . O anticorpo quimérico C225 possui um Kd de aproximadamente 380 pM (picomolar). Os anticorpos humanizados do presente invento possuem um Kd entre cerca 20 de 0,01 e cerca de 10 pM; cerca de 0,1 e cerca de 10 pMol; cerca de 0,1 e cerca de 1 pM; cerca de 0,2 e cerca de 10 pM; cerca de 0,2 e cerca de 1 pM; cerca de 0,6 e cerca de 10 pM; e cerca de 0,6 e cerca de 1 pM. De preferência, os anticorpos humanizados do presente invento possuem um Kd não superior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,6, 0, 4, 0,2, 0, 08, 0, 06, 0, 04, 0, 02 ou 0,01 pM. É igualmente preferido que os anticorpos, ou porções de ligação ao antigénio dos mesmos, do presente invento inibem a activação de EGFR. Vários ensaios são utilizados para testar a capacidade dos anticorpos do presente invento para inibir a activação de EGFR (ver Exemplo 6-10) .

Sequência

As Tabelas 1 e 2 indicam as sequências de aminoácidos (usando o código de aminoácidos convencional de uma só letra) das CDRs empregues nos anticorpos do presente invento, que compreendem uma ou mais CDRs da cadeia pesada e leve. As CDRs estão apresentadas na tabela no contexto dos clones de anticorpos individuais (fragmentos Fab). Nas Tabelas 1 e 2, as localizações das substituições de aminoácidos feitas relativamente às CDRs correspondentes (i.e., localizações nas quais as CDRs diferem nos aminoácidos) estão indicadas a negrito e sublinhado. As Tabelas 1 e 2 proporcionam CDRs das cadeias pesada e leve. Estas CDRs foram combinadas com as sequências estruturais 21 germinais humanas como se segue: As CDRs da cadeia leve foram combinadas com a seguência estrutural de VL A26. As CDRs para Hu 2-26 a 2.II10 na Tabela 1 possuem uma sequência estrutural da cadeia pesada de VH2-26, enquanto as CDRs Hu 4-49 a 4.23 na Tabela 1 possuem uma sequência estrutural da cadeia pesada de VH 4-59. Exemplos de HCVRs e LCVRs mostrando as CDRs no contexto das regiões estruturais estão apresentados abaixo na Tabela 3. 22

Tabela 1. Sequências CDR - Região variável da cadeia pesada (HCVR)

Fato KCDRX SKQ H> NO, HCDHG sm m m. HCPR3 SEQ ID NO. Hu 2-.26 GFSL7NYGVK 1 . VXWSGGNTDYNTPFTS ii AADYYDYEPAY 25 2-26.1 GFSXTKÍWGVK 2 VIWSSGJSrrDYHTPFTS 11 ALDYYDYEFAY 25 2-26.2 GFSIYítYBVB 3 VXBSG3N*FDYNTPFT3 XI aadyydyefay 25 2-26.3 QFSLTm^VH 4 WWSGGNTDYHTPrrS 11 aloyydyefay 25 2-26.4 i3 F 3 LTi-I YAVB 5 VXKSGGNTDYSSYPFTS XX ALDYYOYSSFAY 25 2*26.5 GFSLTWYGVH I VrWSGG&TDTRJTFFTS 12 ALDYYJDYEFAY 25 2*26,6 ' GFSIíTNYOVH 1 VI WSGGSTÇYNTPFTS 13 ALBYYDYEFAY 25 2*26.7 GFSúTKYGVH 1 VIHSOGNDDYHTPFSS 14 ALDYYBYEFAY 25 2*26.8 GF S IjTK Y GVH 1 VI WSGGMDBYNTPFNS 11 ALBYYBYPPAY 25 2-26.9 GFSLTiTiÊWH 1 VI WSGGÍÍTDYKTPFTS 11 ALSYYDmFAY 26 2-26.10 GPSLTOYGVB 1 VXWSGGNTBYNTPFTS XX ÃMYYBYDFAY 27 2-26.11 GFStoTMYOTH 1 VXWSGGNTDYÍJTPFTS 11 ABDYYDYEFAY 25 2-26,12 GFSM1ÍW3VH 1 VI «SGGNYPYHTPFTS 1.1 AL.DYYCYEFAY 25 2-26.13 GF5LTNYGVK 1 V.mSGGTÍTDYNTPFTS 11 AIíDYYDYEFAY 25 2«26,14 GFSL7KYGVH 1 VIWSGGNTDYNTFFTS 11 AtoDYYDYÍSFAY 25 2*26, IS GFSLTNYGVH 1 VIW3GGHTD-YNTPFTS 11 ALBYYDYEFAY 25 2.21 GPS13NWGVH 6 VIWSGfSATBYHTPPDS 15 AABYYDYNPAY 26 2.33 GFSLSN«EVH 7 VIWSGGATDYOTPPTS 12 aldyybydfay 27 2.38 QFStãwmm ê VIKoGGNTDYWTPFDS 14 ALDYYPYPFAY 27 2.64 sfslsnmavm 6 VXSvSGGSTDYKTPFTS 12 ALDYYBYDFAY 27 2.69 GFSBSKmm B VIWSGQÍTDYHTPFÃS 16 AlíBYYDYNFAY 26 2,80 GFSLSMWDVH 2 VIWSGGNTDYNTPFTS 11 ALDYYDYEFAY 25 2.85 GFSLSNWAVH S V1WSGGNTDYNTPFTS 11 ALDYYDYNFAY 26 2.87 GFSSjSNWBVH 9 VIW8GG&TD YNTPFN3 17 ABDYYBYNPÂY 26 2.88 GFSLSJWOTH 9 VIWSGGNTB YMTPFTS 11 AUDYYOYEFAY 25 2.31 ÕFSLSMWGVS 8 VIS SGGHTDYí-TTPFTS 11 ÂLDYYBYNEAY 26 2.II.3 OFSLSHW0VH 9 VIWSGGKTDYMTPFTS 11 abdyydydpay 27 2.II.10 ' GPSLSMWDVH 3 VIWSGGNTBYNTPFT3 11 AIíDYYPYNFAY 26 Eu 4-59 GFSLTMYSVH 1 VIWSOSMTOYNTPFTS 11 AUDYYDYEFAY 25 4-S9.1 GFSLTSWGVB 2 VIWSQGMTDYNTPFFS 11 ALDYYDYEFAY 25 4-S9.2 GFSLTSYDVa 3 VI WSSGiaTDYNTPFYS XX AXíBYYBYEFAY 25 4«59,3 eFSkYJSTCVH X MIWSGGtíVDYNTPFTS 18 AXjDYYDYKFAY 25 4-S8,4 GFSLYKYGVH l VIW3GGATPYNTFFTS 12 ALBYYBYBPAY 25 4-59.5 GFSI.TOY<3VH 1 VIWS8GTTDYHTPFTS 19 AEtDYYBYEFAY 25 23

4~59.fi GF8LTBYGVH 1 VI«SGGNPDYNTPFTS 20 AL DYYDYB FAY 25 4-59.7 GFSLTNYGVK 1 VIRSGGHTDYNXPFTS 11 ALDYYDYDFAY 27 4-59,8 GFSLXtJYGVK 1 V2 WSGGNXDYSfXPFTS 11 ALDYYDYSYAY 28 4-59.9 GFSLTHYGVH 1 VI ií SGGHT DYHT PFTS 11 ALDYY.DYSFAY 25 4-53.10 GFSLTNYGVB 1 V1RSGGNTΒΥΜΊPFTS 11 ALBYYBYEFAY 25 4-59.11 GFSLXNYGVH 1 VI«SGGNXDYNTPFTS 11 ALDYYDYDFAY 25 4-59,12 GFSLTHYGVH 1 VIMSGGRTDYHTPFT S li ALDYYDYEFAY 25 4-53.13 GFSLTRYGVH 1 VIWSGGOTHYHTPFTS 11 ALDYYDYEFAY 25 4.1 GFSLTKYGVH 1 VIWSGGATPYNTPFTS 12 ALDYYDYDYAY 29 4,2 GFSLTNRWFi 10 N2WSGGTPDY8XPFTS 21 ALDYYDYDFAY 27 4,3 GFSLTNWSVH 2 VIWSGGATDYHT PFTS 12 ALDYYDYEYAY 28 4.4 GFSLTHWDVSÍ 10 VI SíSGGAT DYHT P FTS 12 ALDYYDYDFAY 27 4.5 GFSLTHYGVH I NIWSGGT PDYHT PFTS 21 ALDYYDYDFAY 27 4,7 GFSLTtWDVH 10 N1WSGGRT DYNTFFTS 18 ALDYYDYDYAY 29 4,8 GFSLTHWBVH 10 NIW5GGNT BYHTP FTS 18 ALDYYDYDFAY 27 4,9 GFSLTNWBVH 10 N1 W5GGAPDYHT PFTS 22 ALDYYDYDFAY 27 4.11 GFSLTNYGVH 1 N1WSGGTPDYHTP FFS 21 ALDYYDYDYAY 29 4,12 GFSLTHYGVH 1 N1 tfíSGGT FUYM T P FTS 21 ALDYYDYDYAY 29 4,13 GFSLTNTOVH 10 VIWSGGTTDYHTPFTS 19 ALDYYDYDFAY 2? 4,14 GFSLTHWDVH 10 N J WSGGsrr 0ΪΜ XPFT3 18 ALDYYDYDYAY 2:9 4.15 GFSLTHYGVH 1 HIWSGGHTDYHTFFTS 18 ALDYYDYDYAY 29 4,16 GFSLTNSFGVH ej NIWSGGNPDYNXPFTS 23 ALDYYDYDFAY 2.7 4,17 GFSLTHYGVH 1 ?«WSGGHPDYHTPFTS 23 ALDYYDYDYAY 29 4,18 GFS-lTHYWa. 3 VIWSGGB PDYNTPFTS 20 ALDYYDYDFAY 27 4,19 GFSlTKSfGVH '7 VIHSGGTTDYHTPFTS 19 ALDYYDYDFAY 27 4.21 GFSLTHS4DVH 10 VIWSGGR TDYNT PFTS 11 ALDYYDYDFAY 27 4.22 GFSLTHYGVH 1 ÍÍIWSGGNT.DYNTPFTS 18 ALDYYDYDYAY 29 4.23 GFSLTHWDVH 10 NIWSGGNXDYNXPFTS 18 ALDYYDYDFAY 27 Consenso GFSLX5NX7X8VH 43 XlIWSGGX7X8DYNTPFXi5 S 44 alx3yydyx8x9ay 45 X5: T ou S Xi: V ou N X3: T ou D X7:Y ou W X7: N, A, S ou T X8: E, N, ou D X8:G, E, D Xis: T, D, A ou N X9: F ou Y

ou A

Tabela 2. Sequências CDR - Região variável da cadeia leve (LCVR) - 24 - LCDR1

RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH rasqsigtmih

RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH

RASQSIGTNIH RASESIGTNXH R&SFSIGTNXH

RASYSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASYSIGTNIH RASESIGTNXH RASYSIGTNIH RASYSIGTNXH RASYSIGTNIH RASYSIGTNIH RASYSIGTNIH RASYSIGTNIH RASYSIGTNIH RASESIGTNXH RASYSIGTNIH RASYSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASHSIGTNXH RASYSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASQSIGTNIH RASYSIGTNIH

SEQ ID ACDR3 NO. 35 QQNNNWPTS 35 QONNMWPTS 3 5 ' QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 3 5 QQNNNWPTS 3S QQNNNWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNDWFTS 35 QQNNEWPTS 35 QQNNNWPTS 35 QQNNKWPTS 35 QQNNEWPTS 3 5 QQNNNWPTT 35 QQNNNWPTS 35 QQNNEWFTT 35 QQNNDWPTT 35· QQNNNWPTT 3 5 QQNNEWPTT 35 QQNNEWPTS 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNDWPTT 35 QQNNEWPTT 35 QQNNDWFTS 35 QQNNDWPTT

SEQ

ID NO. DCDR3 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASSS1S 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 31 YASESIS 32 YASESIS 33 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 33 YASESIS 31 YASESIS 33 YASESIS 33 YASESIS 33 YASESIS 33 YASESIS 33 YASESIS 33 YASESIS- 33 YASESIS 31 YASESIS 33 YASESIS 33 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 34 YASESIS 33 YASESIS 30 YASESIS 30 YASESIS 3 0 YASESIS 33 YASESIS 25

4.2 RASES IGTNIH 34 YASESIS 3 5 QQNNEWPTS 37 4,3 RASHSIGTSXH 34 YASESIS 35 QQNNDWPTS 37 4,4 KASQSXGTKXH 30 yãsesis 35 QQNNDWPTS 37 4,5 RASHSIGTNIH 34 YASESIS 35 qqnndwpts 37 4.7 RASYGIGTNIH 33 YASESIS 35 QQNNDWFTT 36 4.8 RASQSIGTNIH 30 YASESIS 35 QQNHENPTS 37 4,9 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 QONNDWFTT 36 4. π RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 qqnnnwfts , 37 4,12 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 qqnístopts 37 4,13 RASHSIGTNIH 34 YASESIS 35 QQNMEWPTS 37 4: . 14 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 QQNNDWPTT 36 4,15 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 GQNNEWPTfí 37 4,16 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 QQNNDWPTT 36 4,17 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 QQNMDWPTT 36 4.18 RASQSIGTNIH 30 YASESIS 35 QQNNDWFTT 36 4,19 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 QQNNDWPTS 37 4.21 RASYSIGTNIH 33 YASESIS 35 QQNHDWPTS 37 4,22 RASQSIGTNIH 30 YASESIS 35 QQNNBWPTT 36 4.23 RASQSIGTNIH 30 YASESIS 35 QQNNEWPTS 37 Consensus RASX4SIGTNIH 46 YASESIS 35 QQNNX5WFTX9 47 X4: Q, E, F, Y ou H X5:N, D, E ou K ou

X9:T ou S

Foi demonstrado que os Fabs listados nas Tabelas 1 e 2 se ligam a EGFR, conforme determinado por um ensaio de captura com réplicas em filtros (Exemplo 3) e um ELISA de captura (Exemplo 4) . 0 ELISA de captura ainda indicou que estes Fabs possuem uma maior afinidade para EGFR do que o anticorpo quimérico C225. A estrutura compreendendo uma CDR do invento será, de um modo geral, uma sequência da cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção substancial da mesma, em que a CDR está situada numa localização correspondente à CDR de uma HCVR e LCVR naturais (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, US Dept of HHS, 1991). 26

As três regiões de CDR para cada uma das cadeias, leve e pesada, são proporcionadas numa região estrutural como uma sequência contígua representada pela fórmula que se segue: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. FR1, FR2, FR3 e FR4 da cadeia pesada ou da cadeia leve combinam-se para formar a região estrutural completa quando arranjadas como uma sequência contígua com as CDRs na ordem estabelecida. De preferência, as regiões estruturais de um anticorpo do invento são humanas, humanizadas ou substancialmente de origem humana.

Os anticorpos do presente invento representados pelos diferentes Fabs, as CDRs das quais estão listadas nas Tabelas 1 e 2, diferem uns dos outros pelas alterações da sequência em pelo menos 1 CDR e até 5 CDRs. As diferenças nas CDRs entre os clones são indicativas que as CDRs para uma determinada posição podem ser substituídas umas pelas outras, de forma que um anticorpo substituído resultante com grande probabilidade retenha a capacidade de ligação a EGFR e iniba a sua activação. Numa realização do invento, um anticorpo compreende um HCVR compreendendo uma CDRH1 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS :1-10 e 43 e/ou uma CDRH2 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS :11-23 e 44 e/ou um CDRH3 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS : 25- -29 e 45. Numa outra realização, um anticorpo anti-EGFR do invento inclui um LCVR compreendendo uma CDRL1 compreendendo uma sequência 27 seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS :30-34 e 46, e/ou uma CDRL2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 35 e/ou uma CDRL3 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS :36-42 e 47. Numa realizaçao preferida, um anticorpo do invento compreende uma CDRH1 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS:1-10 e 43 e/ou uma CDRH2 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS :11-23 e 44 e/ou uma CDRH3 compreendendo a sequência de SEQ ID NOS:25-29 e 45 e ainda compreende uma LCVR compreendendo uma CDRL1 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS :3 0-34 e 46 e/ou uma CDRL2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO:35 e/ou uma CDRL3 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS:36-42 e 47.

Numa realização preferida, um anticorpo anti-EGFR do presente invento possui uma região variável da cadeia pesada contendo as CDRs de uma combinação de CDRs listadas na Tabela 1 e uma região variável da cadeia leve contendo as CDRs de uma combinação de CDRs listadas na Tabela 2. De preferência, estas HCVRs e LCVRs possuem as regiões estruturais como descrito para as CDRs nas Tabelas 1 e 2. Mais de preferência, um anticorpo particular possui uma HCVR contendo as CDRs de uma das combinações de CDRs listadas na Tabela 1, e uma LCVR contendo as CDRs da combinação correspondente de CDRs listada na Tabela 2, e.g., um anticorpo compreendendo HCDR1 com SEQ ID NO:l, HCDR2 com SEQ ID NO: 11, HCDR3 com SEQ ID NO: 25, LCDR1 com 28 SEQ ID NO: 30, LCDR2 com SEQ ID NO:35 e LCDR3 com SEQ ID NO:37. De preferência, estas HCVRs e LCVRs possuem as regiões estruturais como descrito para as combinações particulares de CDRs listadas nas Tabelas 1 e 2.

Numa outra realização preferida, um anticorpo anti-EGFR do presente invento possui uma HCVR seleccionada entre um dos Fabs humanizados listados na Tabela 3 e uma LCVR seleccionada entre um dos Fabs humanizados listados na Tabela 3. Mais de preferência, a HCVR e a LCVR são do mesmo Fab humanizado. A Tabela 3 apresenta as HCVRs e LCVRs preferidas dos anticorpos do presente invento. As regiões CDR estão a negrito. Estas HCVRs e LCVRs também apresentam regiões estruturais preferidas dos anticorpos do presente invento. Os anticorpos 2.38 a 2.11.3 na Tabela 3 possuem sequências estruturais FRH1 (SEQ ID NO:57), FRH2 (SEQ ID NO:58), FRH3 (SEQ ID NO: 59) e FRH4 (SEQ ID NO:60) que são da região estrutural germinal humana VH2-26. Igualmente, esta é a região estrutural preferida para os anticorpos Hu 2-26 a 2. II.10 na Tabela 1. Os anticorpos 4.14 a 4.21 na Tabela 3 possuem as regiões estruturais FRH1 (SEQ ID NO:61), FRH2 (SEQ ID NO: 62) , FRH3 (SEQ ID NO:63) e FRH4 (SEQ ID NO:64) as quais são da região estrutural germinal humana VH 4-59. Igualmente, esta é a região estrutural preferida para os anticorpos Hu 4-59 a 4.23 na Tabela 1. Todos os anticorpos na Tabela 3 possuem regiões estruturais FRL1 (SEQ ID NO: 74), FRL2 (SEQ ID NO: 75), FRL3 (SEQ ID NO: 76) e FRL4 29 (SEQ ID NO:77) da região estrutural germinal humana VK A26, que também é a região estrutural preferida para os anticorpos Hu-2-26 a 4.23 na Tabela 2.

Tabela 3. Regiões variáveis humanizadas da cadeia pesada (Matrizes VH2-26 e VH4-59) HCDR2 HCXftX. 2.3a 2. €9 2.8? 2.88 2.11,3 QVTLIÇESG5'VX,VKPTEn,TLTCTV‘SSFSLSNWGVHWIHQFPGKMImíPAVIWS<3(5HTEníRrPPI QVTLKBSGPVliVKPTBTLTLTCWSGFSS, SNWDVHKIRQPPGKALE WLAV1WSGGNTDYKTPF; QVl3íKBSGPVlJ\TíPTBTI.l^TCWSGFSSí8NSroVH!Í?2R0Pí’QKM.EWI^Vllf8Seim5mrPf3 FR81 FRH2 (SEQ X» HO;5?) {SEQ IP HOíSS} 4.14 QVQLQESÔPGLW,SSETijSI)TCTVSGPSLTIí«OVin4IRQ?PGKGtEWXbNIWSO<3NTDXím>P5

4.15 QVQLQESG PGIiVKFS ETJiSLTCTVSGFSBTHYSVHWIRQP PGKfâlíE WIGHIW3 SGNTDYETP 4.22 QVQI,aESGf'GliVK£>SETtSL'rCTVSGFSl,T*»Í»VBK?IRO.PPGKGLEKXGV2WSG<3ímmm>F5 PRH1 FRH2 (SBC 1D HOíSl) (SEQ IP HO;62) seq rr> HCDR3 Ho; 2.38 2.59 2.8? 2.88 2 .IX..3 KLTI SKDTSKSQWLTím;fMDPVSTAT¥YeARAX.DYYDY»FAYW3QGTMVTVSS 4 9. RLTISKDTSKSQV\aTM:i?aKDPVDSATYYCAÍ^DYYPYHFAYWGQGTMVTVSÊ 5(3 RLfX SKDTSKSQ\^TM2?íMDPVPTAXYYíaRADBYYP¥»FAYWGQGTMVTVSS 51. RLTI SKDTSKSQWMmHMDPVPTÃTYYCAímPPYYPYSFAYWGQGlWrVBS S 2 RXíTXSKBTSKSQVVSTOSTHMPPVBTA^ YYCARAPPYYDYBPAYWGQGXMVYVSS 5 3 FRH3 FRH3 (SEQ 2D «OíS9) l&m X» *fQ;SO) 4.14 RVTXSVDTSKMQFSLitLSSWA&DYAFYYCARMtPYYDYBYÂYWGQSlWUVSS 54 4.15 RVTlSVDTSKHQFSIiíO^SWAMJTAWYCARMtDYXOYDYAYWQQSYMTCVSS 55 4.21 RWXSVOTSKNQFSI^l^SVTAADmvyYCARASPYYBYtJFAYííGQGTOVWSjS 56 F&H3 FRH4 (SEQ ID HÔjO) (SEQ ΪΡ MOs64)

Regiões variáveis humanizadas da cadeia leve (Matriz VL A26) 30 X.CDR1 LCBR2

2.38 SIVLTQSPCFgSWPim^/TITCRASYSIOTOSHWyQQKPDOS^KLLIKYASSlSIS

2.6S EIVLTQSPDFQSVTPKBK^-TITCRASYSIGTKIHWYQOKPDQSIÍíX^IKyASESIS

2.87 EXVLTQSFDPQSVTPKKKVTITCÃÂSYSIffTKIBWYQQKPDQSPKXiliIiar&SESIS

2.88 EIVXTQSPDFQSVTPKEXYTITCRÃSYSIGTNXK^QQKPBOSPKIiXIGifASESIS

2 . II .3 EIVLTQSPtFQSItrPKEKtTrTCRASYSIGTNIHWYQQKPBQSPKLflKYÂSESIS

4.14 ElVLTOSPDFQSVTPKEKOTITCTlASYSXeTNXHWYQQKFDOSPKXíIiXKYASESIS

4.15 Il%TQSPDFQSVTPKEKVTIX,CRASYSX<3X,NimTYQQKPBÔSPttLIKY2^SESXS

4.31 BIVXTQSPDFQSVTPKBKVTITCíiASYSXGTHIlíWYQQKPBQSPKItliIKYASESXS FRii FM.2 CSEQ IB SOs74) (SEQ XB N0í75)

SBQ XD I.CDR3 NO: 3.38 GVPSRFSCÍ S<3SGT0FT1.T IHSLEAEBAATYYCQOÍJNBWPTS FGGOTKVRTK 66 2. m ÕVPSRFSGSG3GTDFTLT HÍSIjEãSBÊATYY CQQNNNWPTS PGGGTKVKIK 67 2.E7 GVPSRFSGSGSGTDFTLTXNSLEAFBAkTYYCOQNNNWPTTFGGGTK^IS: 68 2.88 GVPSRFSGSGSGTDFTI.TimLEáJSimATYYCOÍ8«KEWFTSFGGGTíamiK 69 2 ,ΧΙ-3 0νΡ^ΗΡ8θε03βΤΟΡΤΕΤΪΜ3Χ,ΕΑΕΙ>ΑΑΤΥΥ0δςΚΝ0νΤΡΤΤΡ0βδΤΚνΕIK 70 4.14 QVPSRFSGSGSGTDFTLTIKSLSAEDAarYYCOOl5KDWPTTFGGGTKVEIK 71 4.1$ GVPSRFBaSGSGTDFTríTIMSLSÃBBÃIiírYYCQeKRSWPTSFGG^rKVEIK 72 4.21 αΥΡβΚΡΒβββββΤΟΡΤΒΤΪΚβΕΕΑΕΒΜΤχΥβΟδΚϊϊΒϊίΡΤδΡβββΤΚνΕΙΚ 73 FRX.3 FRX4 (SBQ X» NO:76} ÇSEft XD NO*77}

De acordo com o invento aqui descrito, podem ser gerados anticorpos tendo maior capacidade para inibir a activação de EGFR através da combinação, numa única estrutura polipeptidica, de uma ou mais sequências novas de CDR como aqui descrito. Desta forma, várias sequências de aminoácidos novas podem ser combinadas num anticorpo, na mesma CDR ou em CDRs diferentes com níveis desejáveis de actividade anti-EGFR. Tais níveis desejáveis resultarão por vezes na produção de anticorpos cujos valores de Kd são, de preferência, 1 pM ou menos. Como exemplo não limitante, tais sequências CDR novas, como apresentado nas Tabelas 1 e 2, podem ser empregues e os anticorpos resultantes testados relativamente à capacidade para inibir a activação de EGFR, usando qualquer um ou vários ensaios descritos abaixo nos Exemplos 6-10. 31

Os anticorpos do presente invento podem ser avaliados relativamente a várias propriedades benéficas que contribuem para a utilidade de um anticorpo para uma indicação particular. Numa realização, os anticorpos do presente invento terão uma afinidade para EGFR que é superior (i.e., um valor de Kd inferior) à dos anticorpos conhecidos na área, tais como o anticorpo quimérico C225, conforme determinado pelo Kd, (e.g., ensaios Biacore ou Kinexa). Como descrito atrás, Kd é medido pela razão entre as constantes Kon e Koff. Por exemplo, um Kon de 3,1 x 107 (M“ 1s”1) e um K0ff de 0,9 x 10”4 (s”1) combinar-se-ão para dar um Kd de 2,9 x 10”12M. Assim, a afinidade pode ser melhorada através do aumento de Kon ou do decréscimo de KQff.

Os aumentos na afinidade de um anticorpo anti-EFGR podem bem corresponder a uma maior capacidade de um anticorpo para inibir a activação de EGFR. Aspectos de aumento da estabilidade para inibir a activação de EGFR podem ser avaliados através de qualquer um de vários ensaios in vitro e in vivo, como descrito nos Exemplo 6-10. Estes ensaios incluem, mas não estão limitados a um ensaio de proliferação celular, um ensaio de apoptose, um ensaio de ligação a receptor, um ensaio de fosforilação de receptores ou um modelo de tumor murino. De preferência, os anticorpos do presente invento terão capacidade melhorada para inibir a activação de EGFR conforme determinado por qualquer um ou vários destes ensaios. Mais de preferência, os anticorpos do presente invento terão um Kd não superior 32 a 10 pM, mais de preferência não superior a 1 pM e mesmo mais de preferência não superior a cerca de 0,2 pM e possuem maior capacidade para inibir a activação de EGFR.

Expressão de anticorpos

Num outro aspecto, o presente invento também é dirigido a DNA recombinante codificador dos anticorpos e fragmentos do invento. A sequência de DNA recombinante codificadora de um anticorpo ou fragmento do invento pode ser facilmente determinada pelos familiarizados com a área usando o código genético. Um ácido nucleico tendo a sequência determinada pode ser preparado e expresso em qualquer um de uma variedade de sistemas hospedeiros usando técnicas conhecidas na área.

De preferência, o DNA codifica anticorpos que, quando expressos, compreendem uma a cinco das CDRs das cadeias leve e pesada de SEQ ID NOS:l, 11, 24, 30, 35, 36 e uma ou mais CDRs das cadeias leve e pesada de SEQ ID NOS:2-10, 12-23, 25-29, 31-34, 37-42, para um total de 6 CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, em que CDRL2 será SEQ ID NO:35). Ainda, o DNA preferencialmente codifica anticorpos que, quando expressos, compreendem estas CDRs em combinação com as regiões estruturais preferidas da cadeia leve e da cadeia pesada do presente invento, como descrito nas sequências mostradas na Tabela 3. O DNA codificador dos anticorpos do presente 33 invento incluirão tipicamente uma sequência polinucleotidica de controlo da expressão operacionalmente ligada às sequências codificadoras de anticorpos, incluindo regiões do promotor naturalmente associado ou heterólogo. De preferência, as sequências de controlo da expressão serão sistemas de promotores eucarióticos nos vectores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas podem também ser usadas sequências de controlo de hospedeiros procarióticos. Uma vez o vector incorporado na linha celular hospedeira adequada, a célula hospedeira é propagada em condições adequadas para a expressão das sequências nucleotidicas e, caso se pretenda, pode-se seguir a colheita e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros das cadeias leve/pesada ou anticorpos intactos, ligação dos fragmentos ou de outras formas de imunoglobulina.

As sequências de ácido nucleico do presente invento capazes de em última análise expressar os anticorpos pretendidos podem ser formadas a partir de uma variedade de polinucleotidos diferentes (DNA genómico ou cDNA, RNA, oligonucleótidos sintéticos, etc.) e componentes (e.g., regiões V, J, D e C) , usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas. A ligação de sequências genómicas e sintéticas adequadas é um método comum de produção, mas podem ser também usadas sequências de cDNA.

As sequências de DNA da região constante humana 34 podem ser isoladas de acordo com procedimentos bem conhecidos a partir de uma variedade de células humanas, mas de preferência a partir de células B imortalizadas. Células que são fontes adequadas para as sequências polinucleotidicas e células hospedeiras para a expressão e secreção de imunoglobulina podem ser obtidas a partir de uma série de fontes conhecidas na área.

Como aqui descrito, para além dos anticorpos aqui especificamente descritos, outros anticorpos modificados tendo sequências substancialmente semelhantes ou idênticas podem ser facilmente projectados e produzidos usando várias técnicas de DNA recombinante conhecidas dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, as regiões estruturais podem variar relativamente às sequências nativas ao nível da estrutura primária em várias substituições de aminoácidos, adições e deleções terminais e intermédias e similares. Ainda, uma variedade de regiões estruturais humanas diferentes pode ser usada, isoladamente ou em combinação, como base das imunoglobulinas humanizadas do presente invento. Em geral, as modificações dos genes podem ser facilmente conseguidas por uma variedade de técnicas bem conhecidas, tais como mutagénese dirigida.

Como alternativa, podem ser produzidos os fragmentos polipeptídicos compreendendo apenas uma porção da estrutura primária do anticorpo, fragmentos esses que possuem uma ou mais actividades de imunoglobulina (e.g., actividade de fixação do complemento). Estes fragmentos 35 polipeptídicos podem ser produzidos por clivagem proteolitica de anticorpos intactos através de métodos conhecidos na área, ou por inserção de codões de paragem nas localizações pretendidas de vectores usando mutagénese dirigida, como seja a seguir a CHI para produzir fragmentos Fab ou após a região da charneira para produzir fragmentos F(ab')2· Os anticorpos de cadeia simples podem ser produzidos através da ligação de VL e VH com um elemento de ligação de DNA.

Como anteriormente estabelecido, os polinucleótidos serão expressos nos hospedeiros após as sequências terem sido ligadas operacionalmente (i.e., posicionadas para assegurar o seu funcionamento) a uma sequência de controlo da expressão. Estes vectores de expressão são, tipicamente, replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integral do DNA cromossómico hospedeiro. Frequentemente, os vectores de expressão conterão marcas de selecção, e.g., resistência à tetraciclina, neomicina e redutase do di-hidrofolato, para permitir a detecção das células transformadas com as sequências de DNA pretendidas. E. coli é um hospedeiro procariótico particularmente útil para a clonagem dos polinucleótidos do presente invento. Outros hospedeiros microbianos adequados para usar incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis e outras enterobacteriáceas, tais como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Para estes hospedeiros 36 procarióticos, pode-se também produzir vectores de expressão que tipicamente conterão sequências de controlo da expressão compatíveis com a célula hospedeira (e.g., uma origem de replicação). Ainda, qualquer um de uma série de promotores conhecidos pode estar presente, tais como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores tipicamente controlarão a expressão, facultativamente com uma sequência de operador, e possuem sequências de locais de ligação ao ribossoma e similares, para iniciar e completar a transcrição e tradução.

Outros microrganismos, tais como leveduras, podem também ser usados para expressão. Pichia pastoris é um hospedeiro preferido, com os vectores adequados tendo sequências de controlo da expressão, tais como promotores, incluindo cinase de 3-fosfoglicerato ou outras enzimas glicolíticas, e uma origem de replicação, sequências de terminação e similares, conforme pretendido. A cultura de células de mamífero pode também ser usada para expressar e produzir os polipéptidos do presente invento. São preferidas as células eucarióticas, devido a uma série de linhas de células hospedeiras adequadas, capazes de secretarem imunoglobulinas intactas, terem sido desenvolvidas e incluem as linhas celulares CHO, várias linhas celulares COS, células HeLa, linhas celulares de mieloma, células B transformadas, linhas celulares de rim 37 embrionário humano ou hibridomas. Linhas celulares preferidas são as linhas celulares CHO e de mieloma, tais como SP2/0 e NSO.

Os vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo da expressão, como seja uma origem de replicação, um promotor, um estimulador e locais de informação necessária ao processamento, tais como locais de ligação aos ribossomas, locais de "splicing" de RNA, locais de poliadenilação e sequências terminadoras da transcrição. As sequências de controlo da expressão preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulina, SV40, virus do papiloma bovino, citomegalovirus e similares. Os locais de poliadenilação preferidos incluem sequências derivadas de SV40 e hormona de crescimento bovino.

Os vectores com as sequências polinucleotidicas de interesse (e.g., as sequências codificadoras das cadeias pesada e leve e sequências de controlo da expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, os quais variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção com cloreto de cálcio é normalmente utilizada para as células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio ou electroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares.

Uma vez expressos, os anticorpos podem ser 38 purificados de acordo com procedimentos convencionais, incluindo precipitação com sulfato de amónio, permuta iónica, afinidade (e.g., Proteína A), fase reversa, cromatografia em coluna de interacção hidrofóbica, electroforese em gel e similares. Para fins farmacêuticos são preferidas imunoglobulinas substancialmente puras tendo pelo menos cerca de 90 a 95% de pureza, e mais preferidas as que possuem 98 a 99% ou mais de pureza. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade, conforme pretendido, os polipéptidos podem então ser usados terapeuticamente ou profilaticamente, conforme indicado.

Utilização terapêutica para o anticorpo

Este invento também está relacionado com um método de tratamento de seres humanos apresentando um cancro mediado por EGFR, o qual se caracteriza pela administração de um dose eficaz de um anticorpo que se liga a EGFR a um doente necessitado. Os anticorpos do presente invento ligam-se a EGFR e inibem a sua activação. Vários cancros mediados por EGFR incluem mas não estão limitados a cancro do pulmão que não das células pequenas, cancro da mama, cancro colo-rectal, cancros da cabeça e pescoço e cancro da próstata.

Os anticorpos, ou suas porções de ligação ao antigénio, do presente invento podem ser na forma de uma composição compreendendo o anticorpo do invento suspenso num diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável. 39

Estas composições farmacêuticas podem ser administradas por quaisquer meios conhecidos na área para atingirem o objectivo geral pretendido para tratar as doenças auto-imunes, de preferência esclerose múltipla. A via de administração preferida é parentérica, aqui definido como se referindo a modos de administração que incluem injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutânea e intra-articlar. A dosagem administrada dependerá da idade, saúde e peso do recipiente, tipo de tratamento administrado simultaneamente, se existir, frequência do tratamento e da natureza do efeito pretendido.

As composições dentro do âmbito do invento incluem todas as composições em que um anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio, está presente numa quantidade que é eficaz para se atingir o efeito médico pretendido para o tratamento de cancro.

As composições farmacêuticas para administração são projectadas para serem adequadas para ao modo de administração seleccionado e excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como tampões, tensioactivos, preservativos, agentes de solubilização, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes e similares são usados conforme adequado. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, última edição, proporciona um compêndio de técnicas de formulação como são conhecidas, de um modo geral, dos praticantes. 40 A concentração do anticorpo anti -EGFR nas formulações pode ser entre cerca de 0,1% e 15 ou 2 0% por peso e será seleccionado principalmente com base nos volumes de fluido, viscosidades, estabilidade, etc., de acordo com o modo particular de administração seleccionado. As concentrações preferidas do anticorpo anti-EGFR serão, de um modo geral na gama de 1 a cerca de 100 mg/ml. De preferência, 10 a cerca de 50 mg/ml. A formulação pode ser esterilizada por filtração após preparação da formulação ou de outra forma tornada microbiologicamente aceitável. Um preservativo como seja m-cresol ou fenol, ou uma mistura dos mesmos, pode ser adicionado para evitar o crescimento microbiano e a contaminação.

Uma composição típica para infusão intravenosa poderá ter um volume até 250 ml de fluido, como seja solução de Ringer estéril, e 1-100 mg por ml, ou mais, da concentração de anticorpo. Os agentes terapêuticos do invento podem ser congelados ou liofilizados para armazenamento e reconstituído num veículo estéril adequado antes de usar. A liofilização e reconstituição podem conduzir a graus variáveis de perda de actividade do anticorpo (e.g., com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a possuir maior perda de actividade do que os anticorpos IgG). As dosagens podem ser ajustadas para compensar. 41

Se bem que os métodos referidos pareçam ser os mais convenientes e mais adequados para administração de proteínas tais como anticorpos humanizados, através da adaptação adequada, outras técnicas de administração, tais como administração transdérmica e administração oral, podem ser empregues desde que seja projectada a formulação adequada. Ainda, pode ser desejável empregar formulações de libertação controlada usando filmes e matrizes biodegradáveis ou minibombas osmóticas, ou sistemas de libertação baseados em esferas de dextrano, alginato ou colagénio.

Os níveis de dosagem típicos podem ser optimizados usando técnicas clínicas convencionais e dependerão do modo de administração e da condição do doente. De um modo geral, as doses variarão entre 10 μg/kg/mês a 10 mg/kg/mês.

Num outro aspecto, os anticorpos, ou porções de ligação ao antigénio dos mesmos, do presente invento são considerados para usar como medicamento para o tratamento de cancro.

Ainda, num outro aspecto, é considerado um artigo de manufactura como seja um recipiente, uma embalagem, material de embalagem, distribuidor e similares. O invento é ilustrado pelos exemplos que se 42 seguem que nao se destinam a ser de alguma forma limitantes.

Exemplos

Exemplo 1

Clonagem e expressão de um EGFR solúvel (sEGFR) EGFR humano consiste numa única cadeia polipeptidica contendo as regiões extracelular, transmembranar e intracelular. Para proporcionar antigénio solúvel para usar, por exemplo, em ensaios de ligação, a região extracelular foi clonada e expressa como se segue.

As sequências iniciadoras foram projectadas com base na sequência do EGFR humano para isolar os primeiros 643 aminoácidos da proteína precursora por RT-PCR. A sequência iniciadora "codificadora" a montante (sequência iniciadora 3053) adiciona um local Kpnl para clonagem e altera a sequência Kozak e o primeiro aminoácido da sequência sinal para ficar de acordo com uma sequência Kozak de consenso e melhorar a expressão eucariótica. O codão de paragem está sublinhado em cada uma das sequências apresentadas abaixo.

Sequência iniciadora 3053: TAA GGT ACC GCT CTT CGG GGA GCC ACC ATG GGA CCC TCC GGG ACG [SEQ ID NO:78] 43

Sequência nativa: GCT CTT CGG GGA GCA GCC ATG CGA CCC TCC GGG ACG [SEQ ID NO:79] A sequência iniciadora complementar da codificadora a jusante (Sequência iniciadora 3054) termina a proteína em 1619 (baseado na numeração de aminoácidos da proteína madura) e adiciona um elemento de ligação (Gli)4Ser [Gli Gli Gli Gli Ser, SEQ ID NO: 80] e uma cauda de (His) 6 [SEQ ID NO:81]. Um local Xbal foi incluído para clonagem.

Sequência iniciadora 3054: ATG TCT AGA AAC TCA ATG GTG ATG GTG ATG ATG CGA GCC ACC GCC ACC GAT CTT AGG CCC ATT CGT TGG ACA [SEQ ID NO:82] A sequência de aminoácidos de sEGFR madura com o elemento de ligação fundido e a cauda de (His>6 [SEQ ID NO: 6] está apresentada na Figura 2. mRNA foi isolado a partir de células de carcinoma da epiderme humano A431 (ATCC CRL-1555) usando um kit Fast-Track (Invitrogen). A porção extracelular do gene foi amplificada usando Super-Script One-Step RT-PCR (GibcoBRL) com as sequências iniciadoras 3053 e 3054 e clonado no vector pCRII (Invitrogen). O segmento de gene com a cauda foi confirmado por sequenciação de DNA e foi inserido como um fragmento Xbal/Kpnl no vector de expressão pCDNA 3.1 (Invitrogen). 44 0 DNA de plasmídeo foi linearizado e electroporado em células CH0-K1. Os clones foram seleccionados relativamente à resistência à Geneticina (Gibco BRL). Aproximadamente 100 sobrenadantes de colónias foram testados relativamente à expressão de EGFR solúvel (sEGFR) por transferências Western reveladas com anticorpo m225 (Ab-29 (Lab Vision Corp.). Um clone com a expressão correcta foi expandido, subclonado por diluição limite e adaptado a meio sem soro (CHO SFII, Gibco BRL). O antigénio solúvel foi semi-purifiçado a partir de sobrenadantes de frascos de cultura terminais por concentração e ligação a Ni-NTA Sepharose (Qiagen, Valência, CA) . Especificamente, o sobrenadante de células terminais foi colhido por centrifugação para sedimentar as células e depois o sobrenadante foi filtrado para remover quaisquer vestígios de detritos celulares e, subsequentemente, mantido a 0-4 °C nos restantes passos de purificação. O sobrenadante foi concentrado para um total de aproximadamente 100 ml usando o concentrador Amicon com membrana 30,000 MWCO. O concentrado foi dialisado contra Tampão A (Tampão A: fosfato de sódio 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, Imidazole 0,5 mM) durante a noite. O tampão pode ser alterado caso se pretenda. Após diálise, aproximadamente 800 μΐ de esferas Ni-NTA foram lavadas 2-3 vezes com Tampão A, e depois foram adicionadas ao sobrenadante dialisado em tubos cónicos de 50 ml e rodados numa câmara fria durante 2 horas. As esferas foram centrifugadas em tubos cónicos de 50 ml e a maior parte do sobrenadante foi transferido para 45 um outro recipiente deixando uma pequena quantidade manipulável de sobrenadante nos tubos. Este sobrenadante foi agitado com vortex para ressuspender as esferas e as esferas foram aplicadas numa coluna comercial adequada. 0 liquido passou através da coluna e depois o resto do sobrenadante foi adicionado à coluna. 0 sobrenadante foi reciclado através da coluna 2-3 vezes. A coluna foi lavada com aproximadamente 10 ml de Tampão A. A coluna foi eluida com aproximadamente 3-4 ml de tampão A contendo Imidazole 200 mM e colheram-se fracções de 250 μΐ. A D028o das fracções foi lida num leitor de placas de ELISA usando tampão de eluição como um branco. As fracções mais concentradas foram reunidas e dialisadas contra PBS durante a noite. As fracções dialisadas reunidas podem ser congeladas a -70°C após a adição de 1/10 do volume de glicerol, ou as fracções dialisadas podem ser biotiniladas (ver abaixo) . 0 sEGFR foi eluido com imidazole 500 mM e dialisado contra PBS como descrito abaixo. A mistura de fracções de proteína contendo sEGFR foi biotinilada usando Sulfo-NHS-LC-Biotin (pierce 21335) e dialisada contra PBS para remover o reagente não incorporado. Alíquotas de sEGFR biotinilado (B-sEGFR) foram guardadas em 10% de glicerol a -80 °C.

Exemplo 2

Isolamento de Fabs expressos em bactérias 46

Os Fabs expressos do presente invento podem ser isolados a partir do periplama bacteriano como se segue. Células XL-0 foram crescidas a 37°C com agitação a 250 rpm em meio YT 2X até se atingir uma D060o nm de aproximadamente 0,9 a 1,2. IPTG foi então adicionado para uma concentração final de 1 mM (a partir de um stock 1M). Para cada clone a ser analisado, 15 ml de células foram colocadas num tubo cónico estéril. As células foram infectadas com 10 μΐ de um stock de fagos com um título elevado e incubadas a 37°C durante uma hora com agitação. As células foram transferidas para 25°C e crescidas durante a noite com agitação. As células foram sedimentadas numa centrífuga de bancada a ~2000xg durante 25 minutos. As células foram ressuspensas em 1 ml de Tris-HCl 30 mM pH 8,0, NaCl 150 mM através de pipetagem para cima e para baixo, depois transferidas para um tubo eppendorf. As amostras foram sedimentadas durante 3 min a 8000 rpm numa microcentrífuga. 0 sobrenadante foi aspirado e rejeitado. O sedimento foi ressuspenso em Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, sucrose 500 mM, depois agitado com vortex e colocado em gelo durante 30 minutos. Os detritos celulares foram sedimentados durante 10 min, a 9000 rpm numa microcentrífuga, a 4°C. 0 sobrenadante foi isolado e guardado a 4°C.

Exemplo 3

Identificação de Fabs por transferência para 47 filtros

Os Fabs expressos em fagos que se ligam a sEGFR biotinilado foram detectados a partir de uma população diversificada de Fabs através de transferências em filtros ou de captura de Fabs. 0 fago ct expressou Fabs que se ligam a B-sEGFR, e.g., a partir de uma população diversificada de Fabs expressos em fagos. Resumidamente, um filtro foi revestido com um reagente de captura (anticorpo de cabra anti-cadeia capa humana) , em seguida o filtro revestido foi colocado numa placa com placas fágicas derivadas de fagos que expressam Fabs. 0 filtro foi incubado com as placas, depois o filtro foi incubado com sEGFR biotinilado e o sEGFR biotinilado ligado foi detectado através da ligação de Neutravidin-AP e incubação com o substrato de fosfatase alcalina detectável.

Especificamente, um filtro de nitrocelulose (BA85, Schleicher and Schull) foi revestido por flutuação em 5 ml de anticorpos de cabra anti-capa humano (2060-01, Southern Biotech) a 10 μρ/ml em PBS durante duas horas à temperatura ambiente. O filtro foi submerso durante 15 min. O filtro foi lavado três vezes em PBS. 0 filtro foi bloqueado em 1% BSA em PBS durante 1 horas. 0 filtro foi lavado durante três vezes em PBS. 0 filtro foi seco ao ar durante 10 min. O filtro foi cuidadosamente colocado sobre a placa de fagos e incubado durante a noite a 22°C. O filtro foi cuidadosamente removido e lavado rapidamente em PBS. O filtro foi incubado com antigénio biotinilado a uma 48 diluição de 1/1000 em 3% de leite em pó, PBS, 0,05% de Tween 20 durante 1 hora à temperatura ambiente. O filtro foi lavado sob vácuo com PBS, 0,05% Tween 20 três vezes. O filtro foi incubado com Neutravidin-AP 1/1000 em PBS, 0,05% Tween 20 durante 30 min. à temperatura ambiente. O filtro foi lavado sob vácuo com PBS, 0,05% Tween 20 três vezes. O filtro foi revelado em 10 ml de substrato de AP (Nitro-blue tetrazolium, 5-bromo-4-cloro-indolilfosfato, Pierce,

Rockford, IL) . As placas foram seleccionadas com base na intensidade da cor azul

Exemplo 4

Ensaio de ELISA de captura de Fab que se liga a

SEGFR

A ELISA de captura foi usada como um ensaio para detectar Fabs que se ligam a sEGFR como se segue. Uma placa Costar de fundo em U foi revestida com 50 μΐ/alvéolo de anticorpos de cabra anti-capa humana (2061-01 Southern Biotech, Birmingham AL) a 10 μρ/ιηΐ em tampão carbonato (carbonato de sódio 0,015M, bicarbonato de sódio 0,035M, pH 9,5) durante a noite a 4°C. Os alvéolos foram lavados 3 vezes com PBS-Tween 20 (0, 05%). Os alvéolos foram bloqueados com 50 μΐ/alvéolo de 1% BSA em PBS-Tween durante 1 hora à temperatura ambiente. Os alvéolos foram lavados 3 vezes com PBS-Tween. 50 μΐ/alvéolo Peri-prep Fab (ver Exemplo 2, diluído para 5 μρ/πιΐ em PBS-Tween) com diluições de 1:5 ao longo da placa foram adicionados em duplicado. A 49 placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas. A placa foi lavada 3 vezes com PBS-Tween. 50 μΐ/alvéolo de sEGFR biotinilado diluído a 1/1000 em PBS-Tween foram adicionados e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. A placa foi lavada 3 vezes com PBS-Tween. 50 μΐ/alvéolo de Neutravidin-Fosfatase alcalina (Neutravidin-AP; Pierce, Rockford, III) diluído a 1/1000 em PBS-Tween foram adicionados e incubados durante 30 min. à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com PBS-Tween. 150 μΐ/alvéolo de substrato pNPP (Sigma) foram adicionados e incubados a 37°C até surgir cor. A placa foi lida à DO405.

Os resultados dos Fabs testados relativamente à ligação a sEGFR por captura estão apresentados na Fig. 1.

Exemplo 5 0 ensaio da ligação de Fab aos lisados das células de carcinoma A431 A ligação de Fab a EGFR pode ser testada com lisados de células de carcinoma A431 como se segue. Os lisados de células A -431 foram preparados como descrito em "Purification of na Active EGF Receptor kinase with Monoclonal Antireceptor Antibodies, Yarden et al., (1985) J. Biol. Chem., 260, 315-319". Resumidamente, as monocamadas confluentes das células A-431 foram lavadas duas vezes com PBS e uma vez com HNEG (tampão Hepes 20 mM, 50 ρΗ 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, 10% glicerol) . As células foram raspadas para 20 ml de HNEG e centrifugadas a 600 xg durante 10 min. 107 células foram ressuspensas em 1 ml de tampão de solubilização (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 10% glicerol, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM, 5 μg/ml de leupeptina, 1% de aprotinina) e depois homogeneizado num homogeneizador de vidro-vidro. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 40000 xg durante 30 min. O sobrenadante clarificado foi removido e congelado a -80°C.

Uma placa Costar de fundo em U foi revestida com 50 μΐ/alvéolo de lisado celular diluído a 1/20 em HEPES 20 mM pH 7,4, 0,1% Triton X-100 e seco numa estufa durante a noite. A placa foi bloqueada pela adição de 100 μΐ/alvéolo de PBS, 0,5% de BSA e incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com PBS, 0,05% de Tween. 50 μΐ/alvéolo de Fab foi adicionado, começando com 1-5 μρ/ιηΐ com diluições de 1/5 em PBS, 0,05% Tween seguido de incubação durante 1 hr à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com PBS-Tween. 100 μΐ/alvéolo de anticorpos de cabra anti-capa humana-AP (2060-01, Southern Biotech Birmingham, AL) a 1/2000 em PBS-Tween foram adicionados aos alvéolos. A placa foi incubada 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com PBS-Tween. 150 μΐ/alvéolo de substrato pNPP (N-9389, Sigma, Saint Louis, MO) [Source/Cat.#] (1 comprimido/3 ml de água) foi adicionado, seguindo-se incubação a 37°C até 1 hora. A placa foi lida à DO405. 51

Exemplo 6

Inibição da proliferação celular por anticorpos

anti-EGFR

Os ensaios de proliferação celular com células de carcinoma da epiderme A431 foram usados para determinar a potência relativa de Fabs anti-EGFR. 0 ensaio foi baseado em estudos anteriores (Sato et al., "Biological Effects in vitro of Monoclonal Antibodies to Human Epidermal Growth Factor Receptors", (1983), Mol. Biol. Med., 1, 511-529) que demonstram decréscimo da proliferação celular das células A441 como resposta aos anticorpos anti-receptor de EGFR. Os ensaios de proliferação celular foram como se segue. As células A431 foram mantidas em DMEM mais 10% FBS. No Dia 1, as células foram colocadas em PBS durante 20 minutos e tripsinizadas durante 5 minutos antes de serem semeadas. As células foram semeadas a uma densidade celular de 15000 células por alvéolo em placas de cultura de células tratadas com o formado de 384 alvéolos Greiner 384 TC usando um sistema Multidrop 384. O volume de meio final foi de 50 μΐ. As placas de culturas celulares foram cobertas com fita "airpore" (Qiagen, Valência, CA). As células foram deixadas a aderir durante a noite. No dia 2, o meio de cultura celular foi removido e colocado com 50 μΐ de DMEM sem vermelho de fenol (sem FBS) [“alvéolos testemunhas"] ou DMEM e preparação de periplasma com Fab (ver Exemplo 2) ["alvéolos de tratamento"], em duplicado, numa concentração 52 estimada de 2,5 μg/ml. Dois alvéolos testemunhas estavam adjacentes a cada alvéolo de tratamento num total de 192 alvéolos testemunhas. No dia 3, o meio foi removido e substituído com DMEM sem vermelho de fenol contendo reagente de proliferação celular MTS (Promega, Madison, WI; 1 ml/10 ml de meio) . A absorvância a 490 nm foi registada após 15 e 30 minutos. O valor médio para todos os tratamentos em duplicado foi dividido pela média de todos os alvéolos testemunhas.

Os resultados de um ensaio representativo com Fabs estão apresentados na Figura 2. Igualmente, os resultados de um ensaio representativo com anticorpos de tamanho completo estão apresentados na Figura 3. Os dados apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente estão expressos como a percentagem de sinal obtido quando as células são incubadas na ausência de Fab ou de anticorpo (=100%). Deve-se notar que uma força de sinal percentual não está necessariamente correlacionada perfeitamente com o número de células real.

Exemplo 7

Afinidade de ligação

As medições da afinidade de ligação para os anticorpos monoclonais de tamanho completo do invento foram determinadas com um ensaio Sapidyne KINEXA. Esferas de Sepharose de fluxo rápido activadas com NHS (GE Healthcare) 53 foram pré-revestidas com antigénio (50 μg de anticorpo anti-EGFR por ml de esferas) e bloqueadas com 10 mg/ml de BSA em Tris-HCl 1M, pH 8,0. Em seguida, 2 pM, 4 pM, 40 pM de um anticorpo do invento foram incubados com várias concentrações (e.g., 2,4 pM a 10 mM, diluições seriadas) de sEGFR em tampão de corrida (PBS, 0,005% (v/v) Tween-20 e 1 mg/ml de ovalbumina) durante 10 horas à temperatura ambiente. Para determinar o anticorpo livre presente em equilíbrio, cada uma das amostras foi passada através de esferas revestidas com sEGFR. A quantidade de anticorpo ligado a esferas foi então quantificada fazendo passar nas esferasuma solução de anticorpo de cabra anti-Fc humano marcado com fluorescência (Cy5) (Jackson Immuno Research) diluído a 1:4000 em tampão de corrida. O sinal de fluorescência medido foi proporcional à concentração de anticorpo livre no equilíbrio. Cada uma das concentrações de sEGFR foi medida em duplicado. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foi obtida a partir de uma regressão não linear das curvas de competição usando um modelo de ligação homogéneo de múltiplas curvas e local único (programa KINEXA). A constante de velocidade de associação (kon) para a ligação de sEGFR foi também determinada com um ensaio Sapidyne KINEXA. Anticorpo dois pM foi misturado com sEGFR 20 pM usando as mesmas condições descritas atrás. Em várias alturas, as amostras foram testadas relativamente à presença de anticorpo livre usando as condições descritas atrás para a ligação em equilíbrio e depois a dependência 54 do tempo resultante foi ajustada usando o programa KINEXA para determinar a velocidade de associação (kon) · A constante de velocidade de dissociação (koff) foi calculada usando a expressão koff = Kd x kon. As afinidades dos anticorpos monoclonais de tamanho completo foram medidas usando o ensaio descrito e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Afinidades dos anticorpos (medições realizadas com KinExA3000 Instrument (Sapidyne))

Anticorpo Velocidade de Velocidade de Kd (pM) associação dissociação C225 7,97E+06 3,00E-03 379 VH2.69 9,6 4E + 0 6 6,51E-06 0,680 VH2.87 0,215 VH4.15 1,46E+07 1,46E-06 0,012 VH4.21 1,07E+07 2,02E-06 0,188 ABX-EGF 2,98E+06 1,49E-04 50

Exemplo 8

Fosforilação de EGFR A capacidade dos anticorpos monoclonais do presente invento para inibir a fosforilação de EGFR foi testada como se segue. As células A431 foram crescidas até ~70% de confluência em placas de 6 alvéolos e deixadas com pouco soro durante a noite em DMEM 0,5% FBS. As células 55 foram então incubadas com diluições de anticorpos na presença de EGF 100 nM (Upstate) durante uma hora. As células foram lavadas com PBS frio e lisadas com 0,5 ml de tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 1% de IGEPGAL CA- 630, 0,25% de desoxicolato de sódio, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, vanadato de sódio 1 mM (NaV04), NaF 1 mM, meio comprimido de mistura de proteases em 10 ml) . O material insolúvel foi removido por ultracentrifugação a 10000 rpm durante 30 min. Os lisados celulares foram ajustados relativamente à concentração proteica e quantidades equivalentes de cada extracto foram separadas por SDS-PAGE. EGFR fosforilado foi determinado em transferências Western reveladas com anti-fosfo-EGFR (Upstate).

Os resultados de fosforilação de EGFR na presença de anticorpos monoclonais C225, VH4.15 e VH4.21 estão apresentados na Figura 4. Como se mostra na Figura 5, a inibição da fosforilação está correlacionada com a potência dos anticorpos, num ensaio baseado em células, numa comparação dos anticorpos monoclonais C224 e VH4.15.

Exemplo 9

Apoptose induzida por anticorpos anti-EGFR A capacidade de anticorpos anti-EGFR para inibirem a activação de EGFR foi testada através da indução de apoptose das células A431 como se segue. As células A431 a 20000 células/alvéolo em placas de 24 alvéolos foram 56 incubadas com 1,0 μg/ml de anticorpo durante, 0, 3, 7, 24 ou 48 horas. A apoptose foi medida por ELISA relativamente à fragmentação do DNA (Roche). A apoptose na linha de base a partir de um anticorpo não especifico foi subtraída da média.

Os resultados de apoptose de células A431 induzida por anti-EGFR com anticorpos monoclonais de tamanho completo C225, ABX-EGF e VH4.15 estão apresentados na Figura 6.

Tratamento de tumores A431 num modelo de murganho com anticorpo anti-EGFR A capacidade do anticorpo anti-EGFR para inibir a activação de EGFR in vivo foi examinada com múltiplas dosagens de anticorpos num modelo de murganho tendo tumores estabelecidos com A431. Este ensaio de modelo de tumor murino foi realizado como se segue. No dia 0, foram obtidas células A431 a crescerem em cultura, contadas e ressuspensas numa concentração de 5 x 107. Murganhos CB-SCID machos com 7 semanas de idade (Taconic) foram injectados subcutaneamente com 107 células (i.e. 200 μΐ) no flanco esquerdo (EC) . Quando os tumores mediam ~300 mm3 (tipicamente após 21 dias), os animais foram injectados intraperitonealmente com 0,5 mg de anticorpo/murganho num volume de aproximadamente 250-300 μΐ duas vezes por semana (Terça/Sexta) , com os animais testemunha a receberem 250 μΐ de soro fisiológico. Foram administradas um total de 5 57 injecções de anticorpos. 0 volume do tumor foi medido três vezes semanalmente, durante um total de três semanas começando com a primeira administração de anticorpo. num Os resultados de um tratamento de tumores A431 modelo murino com anticorpos anti-EGFR estão apresentados na Figura 7.

<110> Listagem de sequências ELI LILLY AND COMPANY

<120> ANTICORPOS ANTI-EGFR <13 0> X-16761 <150> US 60/735 363 <151> 2005-11-12 <160> 82 <1 7 0> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> 58 <223> Construção sintética <400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr <31 y Vai hIs 1 S 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 2 Gly Phe Ser teu Thr 1 5 1 Asn Trp Gly Vai <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 3 6ly Phe ser Léu Thr Asn tyr Asp vai His í 5 10 <210> 4 59 <211> 10

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 4

Glv Phse ser Leu Tf>r asei Tyr Glu vai hís 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 5

Gly Phe ser Leu Thr Asm Tyr Ala vai His I 3 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética 60 <400> 6

Gly Phm Ser Leu Ser Asn Trp Gly vai His 1 5 IO <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 7 61 y Phe Ser teu Ser asp Trp Glu Vai His 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 8

Gly ptie ser Leu Ser Asn Trp Ala vai Nis l 5 10 <210> 9 <211> 10 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 9 sly pine ser Leu ser Asn Trp A$p Vai hIs I 5 19 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 10

Gly Phe Ser Leu Thr ash Trp Asp vai His 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética 62 <400> 11

Vai ila Trp $ar sly -Sly Am Thr Asp Tyr Am Thr Pro Phe Thr ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 12

Vai ile Trp ser ely Gly Ala Thr Asp Tvr asp Thr pro Phe Thr ser 1 5 xS 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 13 vai lie Trp ser Gly sly ser Thr Asp Tvr asp Thr Pro Phe Thr Ser X 5 10 15 <210> 14 <211> 16 63 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 14 vai lie Trp Ser 61y 61 y Aso Asp Asp Tyr Asn Thr rro phe Asp ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 15 val lie Trp ser 6ly 6ly Ala. Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Asp ser I " 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética 64 <400> 16 vai ile Trp ssr Gly sly Asr$ Thr Asp Tyr Asn Thr pra Phe Ala Str 1 5 101 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 17 vai lie Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Thr pro Pht Asn $er 1 S 10 is <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 18

Asfí ila Trp Ser ely 6ly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pm Phe Thr s«r 1 5 10 15

<210> 23 <211> 16 <212> PRT 65 <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 18

Thr £«r IS

AsiTllâ Trp sar fíly 61 y Asm Thr Agp .Tyr Asm Thr Pro X S 10 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 19

Tyr A$n Thr pro Pfis Thr ssr vai lie Trp ser sly sly Thr Thr Asp 1 5 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 20 66 val lie Trp ser Gly 6ly Asn Pm Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr ser I $ 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 21

Asn ile Trp ser Oly 01 y Thr Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser

I 5 ' 10 IS <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 22

Asn ile Trp ser 01 y cly Alã Ptq Asp Tyr Asn Thr pro Phe Thr Ser 1 5 10 IS <210> 23 <211> 16

<212> PRT 67 67 <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 23 Asn 1¼ Trp ser 6ly oly Asn pro asd Tyr Asn Thr Pro Phe Thr ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 24 €ly Piie ser teu Arcj iy% vai Gly Arg ser vai Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética 25 <400> 68

Ala teu Asp Tyr Tyr Asp Tyr slu The Ala Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 26

Ala 10

Phe Ala Tyr 10

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr asp 1 S <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 27

Ala tey Asp Tyr Tyr Asp Tyr 1 5

<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> 69 <223> Construção sintética <400> 28

Ala teu Asp Tyr ryr Asp Tyr Glu Tyr Ala Tyr 1 ' 5' 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 29

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 30

Am Ala sor Olo ser ile «Sly Thr as« 1 5 10 70 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 31

Arg Alâ Ser Glu Ser lie Gly Thr Asn lie His X 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 32

Arg ATa ser fNe ser ile Gly iftr km ile His 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> 71 <223> Construção sintética <400> 33

Arg Ala Ser Tyr Ser lie «Sly Thr Asn lie Mis 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 34 Arg Ai a Ser Nis Ser fie Gly Thr Asn lie Mis í 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 35

Tyr Ala ser Glu ser ile Ser 1 5 <210> 36 72 <211> 9

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 36

Gin d η Ãsíi Asn Asp Trp fto Thr Thr 1. 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 37

Gin Gin Asn A$ri Glu Trp ργο Tftr Ser

1 S <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética 73 <400> 38

Gin Gln Am km Asp Trp Pro Tfsr ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 39

Gin Gin Asn Asn Gltt Trp Pro Thr ser 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 40

Gin Gin Asn Asn tys rrp Pro Jhr ser I 5 <210> 41 <211> 9 74 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 41 Gin <3ΐ 1 íi Asn Asn Gli* Trp Pro Thr Thr 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 42 Gin Gin Asη asη Asp Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> 75

<221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5) <223> X é T ou S

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) . . (7) <223> X é Y ou W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) . . (8) <223> X é G, E, D ou A <400> 43

Gly f>he Ser Leu Xaa Asπ Xaa xaa Vai Hi$ 1 S 10 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> Construção sintética <220> <221> MISC_FEATURE <222>

(D · · (D 76 <223> X é V ou Ν <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)

<223> X é A, N, S ou T <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8)

<223> X é T ou P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)

<223> X é T, D, A ou N <400> 44

Xaa lie Trp Ser £lv Gly Xaa Xaa Asp Tyr Âsrs Thr Pro Phg Xaa Ser i 5 10 15 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> 77 <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (3)..(3)

<223> X é Τ ou D <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (8)..(8)

<223> X é Ε, Ν ou D <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X é F ou Υ <400> 45

Ala teu Xaa Tyr Tyr Aap Tyr Xaa Xaâ Ala Tyr 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220>

<221> MISC FEATURE <222> (4) . . (4) 78 <223> X é Q, E, F, Y ou H <400> 46

Aro Ala ser xaa ser lie Gly Thr Asrs ile h1s 1 $ 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> Construção sintética <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5) <223> X é N, D, E ou K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) . . (9) <223> X é T ou S <400> 47

Gin Gin âsíi Asn xaa rrp pro Thr xaa <210> 48 <211> 6 79 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 48 vai xle Cys Lys ile Gly 1 5 <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 49 80

Gle Vai Thr Leu Lys Gly Ser Gly Pro Vai Leu Vai Lys Pro Thr 61 u X S 10 15

Thr Leu Thr teu Thr cys Thr vai ser Gly phe ser Leu Ser asn Trp 20 25 30

Gly Vai His Trp lie Arg Gin Pro pro &ly tys Ala Leu Glo Trp Leu 35 40 45

Ala vai ile Trp ser Gly Gly aso Thr Asp Tyr Asn Thr pro Phe Asp 50 55 m

Ser Arg Leu Thr xle Ser Lys Asp Thr ser Lys ser Gin vai vai teu 65 70 ?S 80

Thr Met Thr Aso Net Asp Pro Vai Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr cys Ala 85 09 95

Arg Ala Leu aso Tyr Tyr Asp Tyr aso phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 1IO

Thr Met Vai Thr vai ser ser 115 <210> 50 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 50 81

Gin vai Thr Leu Lys $ Glu ser Gly pro Vai teu vai Lys pro Thr Glu 1 10 15 Thr teu Thr Leu Thr Cys Thr vai Ser Gly Phe ser teu ser Asn Trp 20 as 30 Asp Vai His Trp ile Arg Gin pro PfO Gly Lys Ala Leu GlU Trp Leu 35 40 45 Ala vai ili Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp ryr Ase Thr pro Phe Ala 50 ss 60 S€f AfCj Leu Thr He Ser Lys A Sp Thr Ser Lys Ser Glil Val val Leu m 70 75 ao Thr «et Thr Asn «et 8$ Asp pro val ASp Thr 00 Ala Thr Tyr Tyr cys 95 Ala Arg Ala L€U Asp iÕQ Tyr Tyr Asp Tyr Asn 105 Phe Ala Tyr Trp Gly 110 Gl n Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 11$ <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 51 82

Gin 1 vai Thr Leu tys S Gltí ser Gly Pr© vai 10 Leu vai tys pr© Thr 15 Glu Thr im Thr teu 20 Thr Cys Thr Vai Ser 25 Gly Phe ser Leu ser 30 Asn Trp vai His Trp lie Arg Gin PfQ Pr© 01 y tys Ala Leu Glu Trp Leu 3S 40 4 5 Ai & Vai Tle Trp Ser Gly 61y Ala Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Asn 50 55 v 60 Ser Arg teu Thr lie ser tys Asp Thr Ser tys Ser Gin Vai Vai teu 65 70 75 30 Thr mt Thr Asn mt m ASp Pró Vai Asp Thr 90 Ala Thr ryr ryr Cys 95 Ala Ar§ Ala Leu Asp Tyr Tyr ASp Tyr Asn pfte Ala Tyr rrp 01 y Gin Gly íoo 105 110 Thr vai Thr Vai ser Ser ns <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 52 83 «1η vai Thr teu Lys Gl e Ser <sly pro vai Leu Vai lys pra Thr Glu 1 3 iô 15 Thr Leu Thr Leu Thr cys Thr vai ser dy phe Ser Leu Ser Asn Trp 20 25 m Asp vai «is Trp lie Arg sln pro pro siy i.ys Ala Lee Glu Trp LêU 35 40 45 Ala vai He Trp ser Gly sly Asn Thr ASp Tyr A$n Thr pre Pb« Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Thr He ser Lys ASp Thr Ser lys Ser GlH Vai vai Leu 65 70 75 B0 Thr «et Thr Asn Met A$p pro val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr CVS Ala S5 m 95 Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr ASp ryr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gl n Gly ICO TOS 110 Thr Met vai Thr Vai Ser Ser <210> 53 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 53 84 5ln vai ihr Leu Lys Glu ser Gly Pro vai teu vai Lys Pra Thr slu i . 5' m is

Thr teu Thr Leu Thr cys Thr vai $er 61 y Phe Ser Uu Ser as*i Trp 20 25 30

Ala vai ile rrp ser <s'ly 61 y asr Thr Asp Tyr asb Thr Pm Phe Thr ser Arg leu Thr Πβ Ser Lys Asp Thr ser iys S6P 6l„ Va1 Va-| lflu 65 ?Ô ?$ 80

10:

Gly Gin Gly 110

Arg Ala Leu Asp tyr tyr Asp Tyr Asp Phe Ala Tyr Trp 1QÇ 1 π*ΐ * ”

Thr mt vai Thr Vai ser ser 115 <210> 54 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 54 85 ςΊπ val Gin Lm Gin g!u Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 1 S 10 15

Thr teu ser Leu Thr Cys Thr val Ser Gly Phe Ser teu Thr Asn Trp 20 1S 30

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Gly Asn Xle Trp ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asm Thr Pro Phe Thr 50 55 60

Ser Arg Val Thr ile ser val Asp Thr ser Lys asp Gin Fhe ser Leu 6$ 70 75 80

Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tvr Tyr Cys Ala $5 90 95

Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Tyr Trp Gly sln Gly im 105 110

Thr Met val Thr val Ser ser 115 <210> 55 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 55 86 Gin vai Gin Leu Gin GlU ser Gly pro Sly Leu val Lys pro ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr val ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly vai Hls Trp ile Arg 61« pro Pro 61 y Lys 61 y Leir Glu Trp ile 35 40 4S 61 y A$« 50 ile Tfp ser Gly Gl y 5S ASA Thr Asp iyr ASO m Thr pro Phe Thr ser m Arg val Thr Xle Ser 70 val Asp Thr ser Lys 75 A$n Gin Phe Ser Leu ao Lys teu ser ser val as Thr Ala Ala A$p Thr 90 Ala Val Tyr Tyr CVS §5 Ala Arg Ala Leu ASP Tyr Tyr ASp Tyr ASÓ Tyr Ala Tyr Trp Gly 11η Glfl Gly 100 105 l.A >F Thr Met Val Thr val Ser Ser ns <210> 56 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 56 87

Gin Vai Gin Leu Gin Glu ser Gly PPO Gly Leu vai Lys Pro ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Trp 2© 25 50

Asp vai His Trp ile Arg Gin ργο ργο Gly Lys Gly teu Glu Trp lie 35 40 45

Gly vai lie Trp ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ttir Pra Phe Thr 50 55 «O ser Arg vai Thr ile ser vai Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Ô5 70 75 m

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Arg Ala Leu aso Tyr Tyr Asp Tyr Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 lio

Thr fóet vai Thr vai Ser ser 115

<210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57

Gin vai Thr teu Lys Glu ser Gly Fno vai Leu vai Lys pro Thr Glu 1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr cys Thr Vai ser 20 25

<210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

Trp ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Alá L«U‘Glu Trp Leu Ala 1 $ 10

<210> 59 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59

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<210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Construção sintética <400> 72

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<210> 74 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74

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<210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77

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Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo ou porção do mesmo de ligação ao antigénio, o qual inibe a activação de EGFR e se liga a EGFR com um Kd entre 0,01 pM e 10 pM, compreendendo uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e uma região variável da cadeia leve (LCVR), em que a referida HCVR e a referida LCVR são seleccionadas de: a) uma HCVR tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 50 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:67; b) uma HCVR tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 51 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:68; c) uma HCVR tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO :5551 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:72; e d) uma HCVR tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 56 e uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:73.

2. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo de tamanho completo, um anticorpo substancialmente intacto, um 2 fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia simples.

3. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

4. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 para usar como um medicamento.

5. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 para usar no tratamento de um cancro mediado por EGFR num doente necessitado.