CN101875695B

CN101875695B - 一种抗体及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101875695B
Application number: CN2009102378023A
Authority: CN
Inventors: 戴维·威孚; 米歇尔·瑞奇韦兹; 曹诚; 靳彦文
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: CN101875695A; WO2011057437A1

Abstract

本发明公开了一种抗体及其编码基因与应用。该抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示。实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性(亲和力为2.7×10^-8mol/L)和抑制肿瘤细胞生长迁移能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1.1×10^-9M。本发明的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链可变区。综上，所述本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。

Description

一种抗体及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种抗体及其编码基因与应用。

背景技术

表皮生长因子受体(epidemic growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子基因(erbB)家族的一员，在约30％的人体肿瘤中过度表达，尤其是非小细胞型肺癌、头颈部鳞状细胞癌和结直肠癌等。国内外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对EGFR信号转导导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌(80％～100％)，结直肠癌(25％～77％)，非小细胞型肺癌(40％～80％)等有较好的疗效。表皮生长因子受体成为目前研究较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程研制抗EGFR的单克隆抗体，成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一。

2004、2006年，美国FDA先后批准了针对EGFR的鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗(cetuximab)和全人抗体帕尼单抗(panitumumab)，用于结直肠癌治疗；2005年，抗EGFR的人源化抗体尼莫珠单抗(nimotuzumab)获得了我国药监局(SFDA)批准的一类新药证书，目前正在进行II/III期临床试验。鼠源单抗在人体应用中可产生人抗鼠抗体反应，从而影响其功能的发挥。采用基因工程技术改造的鼠-人嵌合抗体可大幅度减弱鼠单抗的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理及ADCC效应，进而增强抗体的生物学效应，但该嵌合抗体结合抗原的能力低于鼠源抗体98.7％。大量临床前及临床试验均已证实西妥昔单抗单药及联合化疗/放疗具有较好的疗效，但简单CDR移植往往会引起抗原抗体亲和力的下降；帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人抗体，与嵌合抗体和人源化抗体相比，人源序列接近100％，大大增强了抗体靶亲和力，但该抗体具有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反应更多等缺点。尼莫珠单抗则通过对抗EGFR鼠源单抗进行人源化改造获得了人源化抗体，并把抗体的轻、重链基因分别连接至不同的表达载体进行表达，由于轻重链表达存在较大差异，往往导致完整抗体分子表达水平极低。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可与表皮生长因子受体(EGFR)结合的抗体。

本发明所提供的抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

上述抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述重链可变区的编码基因为如下1)、2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链可变区的DNA分子；

3)与序列表中序列5自5′末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的DNA分子；

所述轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示：

I)其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；

II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；

III)与序列表中序列6自5′末端起第72bp-102bp位核苷酸具有70％以上的同源性且编码所述轻链的DNA分子。

扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对为如下引物对：如下引物对是扩增所述重链可变区编码基因的。

1)一条引物序列如序列表中序列7所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中序列8所示；

2)一条引物序列如序列表中序列9所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中序列10所示。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述抗体的方法。

本发明所提供的制备上述抗体的方法，是将上述任一所述编码基因导入宿主细胞中，培养，得到所述抗体。

所述方法中，可以是通过重组载体将上述任一所述编码基因导入宿主细胞中的；所述重组载体中既含有上述任一所述重链可变区的编码基因又含有上述任一所述轻链的编码基因，且所述重链可变区的编码基因和所述轻链的编码基因在所述重组载体中受同一启动子的调控。

本发明的另一个目的是提供一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂、一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂或一种预防和/或治疗肿瘤的药物。

本发明所提供的药物或抑制剂的活性成分为上述抗体和/或任一所述编码基因。

上述抗体和/或任一所述编码基因在制备抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述抗体和/或任一所述编码基因在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。所述肿瘤细胞具体可为SW480细胞。

上述抗体和/或任一所述编码基因在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护范围。所述肿瘤具体可为结肠癌。

本发明基于抗体抗原晶体结构的建立，通过计算机模拟，对西妥昔单抗抗体的鼠源可变区FR表面基因进行突变，使之类似于人抗体FR的型式，从而获得亲和力较西妥昔单抗显著提高的抗EGFR人源化抗体。实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性(亲和力为2.7×10^-8mol/L)和抑制肿瘤细胞生长迁移能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1.1×10^-9M。本发明的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1∶1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上，所述本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1轻链基因、重链可变区基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。

图2含有本发明抗体的表达载体的结构示意图。

图3本发明抗体的还原型SDS-PAGE检测。

图4本发明抗体的免疫印记分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗体的轻链和重链可变区编码基因的获得

根据计算机模拟，以鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗氨基酸序列为模板，对其鼠源FR表面基因进行人源化改造而设计合成轻链氨基酸序列L1和重链可变区氨基酸序列H1；

重链可变区H1：氨基酸序列如序列表中序列1所示；编码基因序列如序列表中序列4所示；

重链可变区H2：氨基酸序列如序列表中序列2所示；编码基因序列如序列表中序列5所示；

轻链L1：氨基酸序列如序列表中序列3所示；编码基因序列如序列表中序列6所示；

本发明抗体由轻链L1和重链可变区H2组成，将本发明抗体记作C2。

轻链L1的编码基因和重链可变区H2的编码基因由人工合成得到。

重链可变区H2的编码基因：以重链可变区H1的编码基因为模板，采用重叠PCR方法，由引物9、10、11和12扩增，得到重链可变区H2的编码基因；

引物：9：5’-gtgtctagagccgccaccatggactgga-3’(Xba I)；(序列7)

10：5’-gggatccacttacctgtagttttgtcaca-3’(BamH I)；(序列8)

11：

5’-gaaggtgactctatcctggaatttggcgctgaagtctttgttaccaccactccagattcctcccat-3’；(序列9)

12：

5’-aaagacttcagcgccaaattccaggatagagtcaccttcaccagggacacgtccgctactacagcct-3’；(序列10)

将扩增得到的各基因进行凝胶电泳检测，结果与预期大小一致，L和H片段大小分别约为735bp和770bp(图1)。M.相对分子质量标准；A：泳道1为轻链基因产物L1；B：泳道1为重链可变区基因产物H1、泳道2为重链可变区基因产物H2。

再将轻链L1的编码基因和重链可变区H2的编码基因分别克隆入pMD18-T载体(分别记作重组载体pMD18-T/L1、pMD18-T/H2)，转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序鉴定，结果表明得到的基因序列均正确。

实施例2、抗体的制备

一、重组表达载体的构建：

pIRES双表达载体购自Clontech公司，产品目录号为631605；pMD18-T表达载体购自Takara Bio Company，产品目录号为：D504 CA.pIRES载体自身含有重链恒定区基因。

将重组载体pMD18-T/L1和pIRES双表达载体分别用相应的限制性内切酶(Nhe I和EcoR I)酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段；将轻链基因片段L1与载体片段混匀，在连接试剂的作用下，16℃反应12h。转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序鉴定，结果该重组表达载体中基因的插入方向正确及插入序列正确，记作重组表达载体pIRES/L1。

以pIRES/L1为模板，用Xba I和Not I酶切，回收质粒大片段，记作片段1；以克隆有重链可变区基因的pMD18-T/H2为模板，用Xba I和BamH I酶切，回收重链可变区片段，记作片段2；以克隆有重链恒定区基因的pIRES载体为模板，用BamH I和Not I酶切，回收重链恒定区片段，记作片段3；将片段1、2和片段3连接，得到重组载体，转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序鉴定。结果表明，得到的重组表达载体的结构正确，插入的基因的方向及顺序正确；抗体的轻重链基因共用同一个启动子，通过IRES序列连接，最终构建了表达质粒。将重组表达载体记作pIRES/L1/H2(图2)。

二、细胞转化及蛋白表达

293T细胞(293T人胚肾T细胞)购自美国菌种保藏中心(又称美国模式菌种收集中心，ATCC)，产品目录号为CRL-11268；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，产品目录号为12566014；HyQSFM4CHO培养基购自HyClone公司，产品目录号为SH30518.02；rProtein A层析柱购自购自GE公司，产品目录号为17-5079-01。

将293T细胞按1×10⁶/ml分别接种于直径为10cm的培养皿中、在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂孵箱，培养。取5μg步骤一中得到的质粒pIRES/L1/H2转染293T细胞，具体操作参照Lipofectamine 2000的试剂说明。得到重组细胞293T-pIRES/L1/H2。

将重组细胞293T-pIRES/L1/H2用无血清DMEM培养基培养，培养6～8h后吸出无血清培养基，代之以HyQSFM4CHO培养基。相同条件下继续共培养84h，间隔12h收取一次细胞上清，用ELISA法初步检测抗体的表达。扩大转染体系，收集细胞培养上清4.5L，调pH至6.0～7.0，用0.45μm滤膜过滤，再用rProtein A层析柱纯化抗体，具体操作参见产品说明书。

ELISA法：

1.包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体(一抗为山羊抗人IgG)稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体(二抗为山羊抗人IgG-HRP(山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶))：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

试剂

(1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59克，NaHCO₃2.93克，加蒸馏水至1000ml。

(2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M：KH₂PO₄ 0.2克，Na₂HPO₄·12H₂O2.9克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，Tween-200.05％0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

(3)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

(4)终止液(2M H₂SO4)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

用rProtein A层析柱纯化抗体：纯化介质：HiTrap rProtein A FF，5ml，购自GE公司，目录号17-5079-01，详细使用说明书请参阅其公司提供的说明书。

操作：

1)清洗，用1M NaOH和ddH₂O先后清洗管道，将小滤器用0.1M NaOH煮沸10min后再用ddH₂O浸泡1～2min；

2)设定程序，连接rProtein A亲和层析柱；

3)用20mM结合缓冲液(pH7.0)平衡层析柱；

4)将已制备好的细胞上清以1～2ml/min的流速上样；细胞上清制备：以12000g离心15分钟，取出上清，经过0.22um硝酸纤维素滤膜过滤除菌。

5)上样将要结束时用1M洗脱缓冲液(pH3.0)洗脱目的蛋白；

6)收集蛋白，用Trise碱(pH9.0)将其pH调至7.0，电泳检测；

7)按步骤1)清洗管道和小滤器。

磷酸钠盐缓冲液(结合缓冲液)：用作ProteinA纯化的结合缓冲液。配制方法为：取1M Na₂HPO₄ 57.7ml和1M NaH₂PO₄ 42.3ml混匀，即为0.1M pH7.0的磷酸钠盐缓冲液100ml，再用蒸馏水稀释至20Mm备用。

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(洗脱缓冲液)：用作ProteinA纯化的洗脱缓冲液。配制方法为：取0.1M柠檬酸186ml和0.1M柠檬酸钠14ml混匀，即为0.1MpH3.0的柠檬酸盐缓冲液200ml。

三、蛋白检测

山羊抗人IgG-HRP抗体购自Sigma公司，产品目录号为(046K4801)；山羊抗鼠IgG1购自SBA(Southern Biotechnology Associates，Inc.)，产品目录号为(1010-05)；

SDS-PAGE：取15μl洗脱液(即抗体溶液)在12％凝胶上进行还原SDS-PAGE电泳，用考马斯亮兰R-250染色。

结果显示，纯化所得抗体的重链与轻链的相对分子质量分别为25×10³、50×10³(图3、图4)，与预期结果一致。图3中，泳道1表示本发明抗体C2，泳道3表示对照西妥昔单抗。

免疫印迹分析：另取洗脱液在12％凝胶上进行还原SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，取出膜用封闭液(含有5％脱脂奶粉的1×PBST)在室温封闭2h，用1∶5000稀释的羊抗人IgG-HRP抗体与之孵育2h(室温)，再用1×PBST洗膜3次。最后用ECL显色，用X线片进行曝光。同时再做加入抗鼠IgG1的对照。图4中，泳道1表示本发明抗体C2；泳道2表示鼠源单抗阴性对照；泳道4表示阳性对照西妥昔单抗。

免疫印记(12％)分析表明，该抗体可与山羊抗人IgG特异性结合。但是也出现了部分与抗人IgG二抗反应的一些非特异杂交带(包括商品化的西妥昔单抗)，这可能是纯化中有部分非全长的重链片段混合所至。但是上述结果不影响抗体亲和力的评价。上述抗体均不与抗鼠IgG1抗体反应。

由于本抗体的轻链和重链在一个表达载体上，成比例表达，自动组成含两条轻链和重链的完整抗体。

实施例3、抗体的功能检测

EGFR蛋白购自(Sigma)，产品目录号为(E2645-500UN)。

一、Biacore检测抗体与抗原的结合能力

用Biacore3000设备测定抗体C2与EGFR的亲和力。配制不同pH值(4.0，4.5，5.0和5.5)的10mmol/L NaAc稀释EGFR蛋白，在CM5芯片上做预浓缩，选择最适pH值的NaAc稀释蛋白。将纯化的抗体(即实施例2中步骤二得到的洗脱液)共价偶联于CM5传感芯片上，流动相为HBS-EP(pH7.4)，流速20μl/min，取五种浓度的抗体C2(0，10.55，21.1、42.2和84.4nmol/L)与EGFR蛋白结合亲和力的检测。亲和力用Biacore3000附带软件计算。同时以西妥昔单抗为对照。

实验设3次重复，结果取平均数。

结果显示C2对抗原EGFR具有良好的结合活性，亲和力为2.7×10^-8mol/L。西妥昔单抗的亲和力为1.1×10^-9M。

二、肿瘤细胞侵袭实验

SW480细胞购自美国菌种保藏中心(又称美国模式菌种收集中心，ATCC)，产品目录号为(

Number：CCL-228^TM)；西妥昔单抗抗体购自德国默克里昂制药公司(原产地英文商品名：ERBITUX；原产地英文药品名：Cetuximab；中文参考商品译名：爱必妥；分子结构名：西妥昔单抗；产地国家：德国；生产厂家：德国默克里昂制药公司)。

用RPMI1640培养基(购自Invitrogen公司，目录号为31800-022)培养SW480细胞。用无血清RPMI1640培养基水化侵袭室(invasion chamber)，孵育2h(37℃，5％CO₂)。弃无血清RPMI1640，在侵袭室(BD BioCoat^TM Matrigel^TM InvasionChamber购自BD公司，产品目录号为354480)的孔室加入750μl RPMI 1640(含10％血清)；在插入(insert)室中加入475μl RPMI1640(含1％血清)，然后向其中加入25μl消化的SW480细胞(细胞数＞10⁵/500μl)，最后分别向插入室中加入阴性对照PBS和本发明抗体，每个样品均有两个复孔，抗体终浓度均为100ng/ml。孵育24h后，将未能穿透侵袭盒基底膜的细胞用无菌棉签擦去；穿透基底膜的细胞固定、染色、室温晾干后，光镜计数。

在100倍显微镜下计算每个插入室中样品的相应细胞数。再用Dunnett t3(双侧分析)检验将抗体组与PBS组比较，若结果为P＜0.05，可认为两种处理效果差异有统计学意义。

运用SPSS12.0统计软件对细胞侵袭实验数据进行单因素4水平方差分析，单因素4水平方差分析结果显示：F_0.05(3，44)＝2.82，P＜0.05，故可认为细胞数不等或不完全相等。

Dunnett t3(双侧分析，下文简称t)检验结果(表1)显示PBS组与C2组的t值为3.32，且P值小于0.01，表明抗EGFR抗体C2对SW480肿瘤细胞的侵袭具有一定的抑制作用。

表1、细胞侵袭实验的Dunnett’s t3检测结果

注：与PBS组对比，^*P＝0.008，^*t＝3.32。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>一种抗体及其编码基因与应用

<160>10

<210>1

<211>223

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Gln Val Lys Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Gly Asn

20 25 30

Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Gly Ile Trp Ser Gly Gly Asn Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210>2

<2l1>223

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Gln Val Lys Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Gly Asn

20 25 30

Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Gly Ile Trp Ser Gly Gly Asn Lys Asp Phe Ser Ala Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Phe Thr Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Thr Tyr Tyr Asp Tyr G1u Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210>3

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Thr Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>4

<211>669

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

caggtgaagc tgctggagca gtctggggct gaagtgaaga agcctggggc ctcagtgaag 60

gtttcctgca aggcatctgg attcagcatc ggcaactacg gcatccactg ggtgcgacag 120

gcccctggac aaagacttga gtggatggga ggaatctgga gtggtggtaa cgccgactac 180

gcacagaaat tccagggcag agtcaccatc accagggaca cgtccgctac tacagcctac 240

atgggcctgt ctagcctgag acccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagtgggc 300

acttattacg actacgagtt cgacgtgtgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgt 669

<210>5

<211>669

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

caggtgaagc tgctggagca gtctggggct gaagtgaaga agcctggggc ctcagtgaag 60

gtttcctgca aggcatctgg attcagcatc ggcaactacg gcatccactg ggtgcgacag 120

gcccctggac aaagacttga gtggatggga ggaatctgga gtggtggtaa caaagacttc 180

agcgccaaat tccaggatag agtcaccttc accagggaca cgtccgctac tacagcctac 240

atgggcctgt ctagcctgag acccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagtgggc 300

acttattacg actacgagtt cgacgtgtgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgt 669

<210>6

<211>645

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gaactcgtca tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcaac 60

attgcctgcc gggcaagtca gagcattgaa actaacttac actggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctagactcct gatcaaatat acctccagat tacatagtgg ggtcccatca 180

agattcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caatctatta ctgtcagcaa aataacaatt ggcctactac gttcggcgga 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gtgtctagag ccgccaccat ggactgga 28

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gggatccact tacctgtagt tttgtcaca 29

<210>9

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

gaaggtgact ctatcctgga atttggcgct gaagtctttg ttaccaccac tccagattcc 60

tcccat 66

<210>10

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

aaagacttca gcgccaaatt ccaggataga gtcaccttca ccagggacac gtccgctact 60

acagcct 67

Claims

1.一种抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

2.权利要求1所述抗体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述重链可变区的编码基因为序列表中序列5所示DNA分子；

和，所述轻链的编码基因为序列表中序列6所示DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

8.一种制备权利要求1所述抗体的方法，是将权利要求2或3所述编码基因导入宿主细胞中，培养，得到所述抗体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，是通过重组载体将权利要求2或3所述编码基因导入宿主细胞中的；所述重组载体中既含有权利要求3所述重链可变区的编码基因又含有权利要求3所述轻链的编码基因，且所述重链可变区的编码基因和所述轻链的编码基因在所述重组载体中受同一启动子的调控。

10.一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂或一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其活性成分为权利要求1中所述抗体；所述肿瘤为结肠癌。

11.权利要求1中所述抗体在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用；或权利要求1中所述抗体在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为结肠癌。