ES2609915T3 - Anticuerpo monoclonal 175 direccionado al receptor de EGF y derivados y usos del mismo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento de fijación de antígeno que se fija a EGFR, en donde dicho anticuerpo o fragmento no reconoce el péptido juntural LEEKKGNYWTDH (SEQ ID NO: 13), teniendo dicho anticuerpo o fragmento (i) secuencias CDR 1, 2 y 3 de región variable de cadena pesada que comprenden SDYAWN (SEQ ID NO:4), YISYSANTRYNPSLKS (SEQ ID NO: 5) y ATAGRGFPY (SEQ ID NO: 6) respectivamente; y (ii) secuencias CDR 1, 2 y 3 de región variable de cadena ligera que comprenden HSSQDISSNIG (SEQ ID NO: 1), YHGTNLED (SEQ ID NO: 2), y VQYGQFPWT (SEQ ID NO:3) respectivamente.

Description

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Anticuerpo monoclonal 175 direccionado al receptor de EGF y derivados y usos del mismo. CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a anticuerpos, particularmente el anticuerpo 175, y fragmentos del mismo, que se fijan al receptor de EGF, particularmente al receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) amplificado o sobreexpresado y a la truncacion EGFR de2-7 del EGFR. Estos anticuerpos son utiles en la diagnosis y el tratamiento del cancer. Los anticuerpos de la presente invencion pueden utilizarse tambien en terapia en combinacion con agentes quimioterapeuticos o anti-cancer y/o con otros anticuerpos o fragmentos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El tratamiento de una enfermedad proliferativa, particularmente cancer, por medios quimioterapeuticos esta basado a menudo en el aprovechamiento de las diferencias en celulas proliferantes diana y otras celulas normales en el cuerpo humano o animal. Por ejemplo, muchos agentes qufmicos estan disenados para ser absorbidos por replicacion rapida del DNA a fin de que el proceso de replicacion del DNA y la division celular se interrumpa. Otro enfoque consiste en identificar antfgenos en la superficie de celulas tumorales u otras celulas anormales que no se expresan normalmente en el tejido humano desarrollado, tales como antfgenos tumorales o antfgenos embrionarios. Dichos antfgenos pueden estar direccionados con protefnas de fijacion tales como anticuerpos que pueden bloquear o neutralizar el antfgeno. Adicionalmente, las protefnas de fijacion, que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden suministrar un agente toxico u otra sustancia que es capaz de activar directa o indirectamente un agente toxico en el sitio de un tumor.

El EGFR es una diana atractiva para terapia con anticuerpos direccionados a tumores, debido a que se sobreexpresa en muchos tipos de tumores epiteliales (Voldborg, B. R., et al. (1997) Ann Oncol 8:1197-206; den Eynde, B. y Scott, A. M. (1998) Tumor Antigens. En: P. J. Delves y I. M. Roitt (eds.), Encyclopedia of Immunology, Segunda Edicion, pp. 2424-31. Londres: Academic Press). Ademas, la expresion del EGFR esta asociada con una mala prognosis en numerosos tipos de tumor que incluyen estomago, colon, vejiga urinaria, mama, prostata, endometrio, rinon y cerebro (v.g., glioma). Como consecuencia, se han publicado en la bibliograffa numerosos anticuerpos de EGFR, estando sometidos varios de ellos a evaluacion clfnica (Baselga, J., et al. (2000) J Clin Oncol. 18: 904; Faillot, T., et al. (1996) Neurosurgery 39: 478-83; Seymour, L. (1999) Cancer Treat Rev 25: 301-12). Los resultados de estudios de utilizacion de mAbs de EGFR en pacientes con cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon de celulas escamosas, gliomas cerebrales y astrocitomas malignos han sido alentadores. La actividad antitumor de la mayorfa de los anticuerpos EGFR se mejora por su capacidad para bloquear la fijacion de ligandos (Sturgis, E. M., et al. (1994) Otolaryngol Head Neck Surg 111: 633-43; Goldstein, N. I., et al. (1995) Clin Cancer Res 1: 1311-8). Tales anticuerpos pueden mediar su eficacia por modulacion de la proliferacion celular y las funciones inmunes dependientes de anticuerpos (v.g. activacion del complemento). El uso de estos anticuerpos, sin embargo, puede estar limitado por la absorcion en organos que tienen niveles endogenos altos de EGFR tales como el hfgado y la piel (Baselga, J., et al. (2000) J Clin Oncol. 18: 904; Faillot, T., et al. (1996) Neurosurgery 39: 478-83).

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Una proporcion significativa de tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR (es decir, copias multiples del gen EGFR) co-expresan tambien una version truncada del receptor (Wikstrand, C. J., et al. (1998) J Neurovirol 4: 148-58) conocida como EGFR de2-7, AEGFR, o A2-7 (terminos utilizados intercambiablemente en esta memoria) (Olapade-Olaopa, E. O., et al. (2000) Br J Cancer 82: 186-94). La transposicion observada en el EGFR de2-7 da como resultado un mRNA maduro en entramado que carece de 801 nucleotidos que abarcan los exones 2-7 (Wong, A. J., et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 2965-9; Yamazaki, H., et al. (1990) Jpn J Cancer Res 81: 773-9; Yamazaki, H., et al. (1998) Mol Cell Biol 8: 1816-20; Sugawa, N., et al. (1990) Proc Natl Acad Sci U S A 87: 8602-6). La protefna EGFR correspondiente tiene una delecion de 267 aminoacidos que comprenden los residuos 6-273 del dominio extracelular y un nuevo residuo glicina en la juntura de fusion (Sugawa, N., et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 8602-6). Esta delecion, junto con la insercion de un residuo glicina, produce un peptido juntural singular en la interfaz de la delecion. El EGFR de2-7 ha sido consignado en cierto numero de tipos de tumor que incluyen glioma, mama, pulmon, ovario y prostata (Wikstrand, C. J., et al. (1997) Cancer Res. 57: 4130-40; Olapade-Olaopa, E. O., et al. (2000) Br J Cancer 82: 186-94; Wikstrand, C. J., et al. (1995) Cancer Res 55: 3140-8; Garcia de Palazzo, I. E., et al. (1993) Cancer Res 53: 3217-20). Si bien este receptor truncado no fija ligando alguno, posee actividad constitutiva baja e imparte una ventaja de crecimiento significativa a las celulas de glioma que crecen como xenoinjertos tumorales en los ratones lampinos (Nishikawa, R., et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7727-31, 1994.) y es capaz de transformar las celulas NIH3T3 y las celulas MCF-7 (Batra, S. K., et al. (1995) Cell Growth Differ 6: 1251-9). Los mecanismos celulares utilizados por el EGFR de2-7 en las celulas de glioma no estan totalmente definidos, pero se ha informado que incluyen una disminucion en la apoptosis y un pequeno aumento de proliferacion (Nagane, M., et al. (1996) Cancer Res 56: 5079-86).

Dado que la expresion de este receptor truncado esta restringida a las celulas tumorales, la misma representa una diana muy especffica para la terapia de anticuerpos. De acuerdo con ello, varios laboratorios han comunicado la generacion de anticuerpos tanto policlonales como monoclonales especfficos para el peptido singular del EGFR de2- 7 (Wikstrand, C. J., et al (1998) J Neurovirol 4: 148-58; Humfrey, P. A., et al (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 4207-11; Okamoto, S., et al (1996) Br J Cancer 73: 1366-72; Hills, D., et al (1995) Int J Cancer 63: 537-43). Una serie de mAbs de raton, aislados despues de inmunizacion con el peptido singular de2-7, exhibfan todos ellos selectividad y especificidad para el receptor truncado y estaban direccionados a xenoinjertos EGFR de2-7 positivos desarrollados en ratones lampinos (Wikstrand, C. J., et al (1995) Cancer Res 55: 3140-8; Reist, C. J., et al (1997) Cancer Res 57: 1510-5; Reist, C. J., et al (1995) Cancer Res 55: 4375-82)..

Sin embargo, un posible inconveniente de los anticuerpos EGFR de2-7 es que solo una proporcion de tumores que exhiben amplificacion del gen EGFR expresa tambien el EGFR de2-7. Por tanto, serfa de esperar que los anticuerpos especfficos EGFR de2-7 fuesen utiles solo en cierto porcentaje de tumores EGFR-positivos. Asf, si bien la evidencia existente de actividad de los anticuerpos EGFR es alentadora, persisten las limitaciones observadas en cuanto a la gama de aplicabilidad y eficacia arriba reflejadas. De acuerdo con ello, serfa deseable disponer de anticuerpos y agentes analogos que demuestren eficacia con una amplia gama de tumores, y es hacia la consecucion de dicho objetivo a lo que esta dirigida la presente invencion. Ademas, anticuerpos que no esten direccionados a los tejidos normales y al EGFR en ausencia de amplificacion, sobreexpresion, o mutacion, serfan particularmente utiles. Un anticuerpo de este tipo, el anticuerpo monoclonal mAb806, ha sido descrito previamente en WO02092771 y WO05081854. T ales anticuerpos adicionales son necesarios y serfan deseables.

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La citacion de referencias en esta memoria no debe interpretarse como admision de que ello constituya tecnica anterior a la presente invencion.

SUMARIO DE LA INVENCION

Los anticuerpos de la presente invencion, anticuerpo 175 y fragmentos del mismo o anticuerpos monomeros, recombinantes, o hfbridos derivados de los mismos, reconocen un epftopo de EGFR que se encuentra en celulas tumorfgenas, hiperproliferativas o anormales y no es detectable en celulas normales o tipo salvaje. Los anticuerpos de la presente invencion se ilustran adicionalmente por el anticuerpo mAb175 descrito en esta memoria.

Esta invencion describe un anticuerpo direccionado al mismo epftopo del receptor de EGF que el anticuerpo monoclonal (mAb) 806 descrito previamente (descrito en WO02092771 y WO05081854). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), los aminoacidos mas importantes para fijacion de antfgeno, de mAb175 son altamente homologas al anticuerpo 806, con solo un pequeno numero de diferencias de aminoacidos.

La fijacion de un anticuerpo a su antfgeno diana esta mediada por las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de sus cadenas pesada y ligera, existiendo tres regiones CDR, a saber CDR1, CDR2, y CDR3. De acuerdo con ello, los anticuerpos basados en las regiones CDR de mAb175 seran anticuerpos utiles para aplicaciones diagnosticas y terapeuticas, con inclusion de la terapia in vivo. Los anticuerpos que estan basados en las CDRs del anticuerpo mAb175 identificado seran utiles para direccionamiento de tumores con EGFR amplificado con indiferencia de su estatus de EGFR de2-7. Dado que mAb175 no se fija significativamente al receptor normal tipo salvaje, no existirfa una absorcion significativa en el tejido normal, una limitacion de los anticuerpos EGFR que estan siendo desarrollados actualmente.

Las secuencias del anticuerpo monoclonal 175, direccionadas al receptor de EGF, han sido determinadas y las regiones CDR del anticuerpo tienen las secuencias de aminoacidos expuestas en la Figura 1. Las CDRs para cada una de la cadena ligera y la cadena pesada se proporcionan en esta memoria. Las CDRs de la cadena ligera de Ab175 corresponden a CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2) y CDR3 (SEQ ID NO: 3). Las CDRs de la cadena pesada de Ab175 corresponden a CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 5) y CDR3 (SEQ ID NO: 6).

Analogamente al anticuerpo 806, los anticuerpos 175 de la invencion reconocen tambien EGFR amplificado tipo salvaje y el EGFR de2-7, pero se fijan a un epftopo distinto del peptido juntural singular de la mutacion EGFR de2-7 (peptido juntural LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO:13). MAb175 se fija a la superficie de las celulas A431, que tienen una amplificacion del gen EGFR pero no expresan el EGFR de2-7. Es importante que mAb175, al igual que mAb806, no se fija significativamente a tejidos normales tales como hfgado y piel, que expresan niveles de EGFR endogeno tipo salvaje (wt), pero en los cuales EGFR no esta expresado o amplificado de modo aberrante.

Si bien tiene caracterfsticas muy similares a mAb806 en lo que respecta a la fijacion de epftopo, tincion inmunohistoqufmica etc., mAb175 exhibe de hecho una potencia mayor que mAb806 en el tratamiento de los xenoinjertos de glioma humano que expresan el receptor de EGF de2-7. La presente invencion y realizaciones de la misma se expresan en las reivindicaciones adjuntas.

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En un aspecto, la presente invencion proporciona un anticuerpo como se define en la reivindicacion 1.

En una realizacion preferida, los dominios de fijacion estan transportados por un entramado de anticuerpo humano.

En aspectos adicionales, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo como se ha definido arriba, y metodos de preparacion de anticuerpos de la invencion que comprenden expresar dichos acidos nucleicos en condiciones que llevan a cabo la expresion de dicho miembro de fijacion y recuperar el miembro de fijacion.

Otro aspecto adicional de la invencion son composiciones de tales anticuerpos con anticuerpos adicionales, tales como anticuerpos que se fijan a EGFR, inhibiendo preferiblemente la fijacion de ligandos al mismo. Tales composiciones pueden ser cocteles, kits o analogos “one pot”, formulados preferiblemente para facilidad de administracion.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos segun la invencion pueden estar destinados a uso en un metodo de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal, tal como un metodo de tratamiento de un tumor en un paciente humano que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invencion.

La presente invencion se refiere tambien a una molecula o gen clonado de DNA recombinante, o una variante degenerada del mismo, que codifica un anticuerpo de la presente invencion; preferiblemente una molecula de acido nucleico en particular una molecula o gen clonado de DNA recombinante que codifica los dominios CDR 1, 2, y 3 VH del anticuerpo representados en la Figura 1 (SEQ ID NOs: 4-6). En otra realizacion, la presente invencion se refiere tambien a una molecula o gen clonado de DNA recombinante, o una variante degenerada del mismo, preferiblemente una molecula de acido nucleico, en particular una molecula de DNA recombinante de o gen clonado, que codifica los dominios CDR 1, 2, y 3 VL del anticuerpo representados en la Figura 1 (SEQ ID NOs: 1-3).

En una realizacion adicional de la invencion, la secuencia completa de DNA de la molecula o gen clonado de DNA recombinante que codifica las secuencias proporcionadas en esta memoria puede estar enlazada operativamente a una secuencia de control de la expresion que puede estar introducida en un hospedador apropiado. La invencion se extiende de acuerdo con ello a hospedadores unicelulares transformados con el gen clonado o la molecula de DNA recombinante que comprende una secuencia de DNA que codifica las CDRs VH y/o VL presentes, o porciones de las mismas, del anticuerpo, y mas particularmente, una secuencia de DNA que codifica las CDRs VH y/o VL indicadas anteriormente y en la Figura 1 y en SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 y 6.

La presente invencion contempla naturalmente varios medios para preparacion de los anticuerpos y fragmentos activos de los mismos, que incluyen, como se ilustra en esta memoria, tecnicas recombinantes conocidas, y la invencion se propone, de acuerdo con ello, abarcar tales preparaciones de anticuerpos sinteticas o quimericas dentro de su alcance. El aislamiento de las secuencias de acido nucleico y aminoacidos descritas en esta memoria facilita la reproduccion del anticuerpo de la presente invencion por tales tecnicas recombinantes, y de acuerdo con ello, la invencion se extiende a vectores de expresion preparados para expresion en sistemas hospedadores por tecnicas de DNA recombinante, y a los hospedadores transformados resultantes.

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La utilidad diagnostica de la presente invencion se extiende al uso de los anticuerpos de la presente invencion en ensayos para caracterizar tumores o muestras celulares o para investigar tumores o cancer, con inclusion de ensayos diagnosticos in vitro. En un inmunoensayo, una cantidad de control de los anticuerpos, o analogos puede prepararse y marcarse con una enzima, una pareja de fijacion especffica y/o un elemento radiactivo, y puede introducirse luego en una muestra de celulas. Despues que el material marcado o su o sus parejas de fijacion han tenido una oportunidad de reaccionar con sitios existentes en la muestra, la masa resultante puede examinarse por tecnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza de la marca fijada.

Los anticuerpos de la invencion pueden llevar un marcador detectable o funcional. Los miembros de fijacion especffica pueden llevar un marcador radiactivo, tal como los isotopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213Bi, 99Tc y 186Re. Cuando se utilizan marcadores radiactivos, pueden emplearse procedimientos de conteo conocidos disponibles actualmente para identificar y cuantificar los anticuerpos. En el caso de que el marcador sea una enzima, la deteccion puede realizarse por cualquiera de los

metodos colorimetricos, espectrofotometricos, amperometricos o gasometricos conocidos en la tecnica utilizados actualmente.

Los anticuerpos radiomarcados y fragmentos de los mismos, son utiles en tecnicas diagnosticas in vitro y en tecnicas de obtencion de radioimagenes in vivo. Los anticuerpos radiomarcados y fragmentos de los mismos, en particular radioinmunoconjugados, son utiles en radioinmunoterapia, particularmente como anticuerpos radiomarcados para terapia del cancer. Los anticuerpos radiomarcados y fragmentos de los mismos, son utiles en tecnicas de cirugfa radioinmuno-guiadas, en las cuales aquellos pueden identificar e indicar la presencia y/o localizacion de celulas de cancer, celulas precancerosas, celulas tumorales, y celulas hiperproliferativas, antes de, durante o despues de la cirugfa para eliminar tales celulas.

Los inmunoconjugados o protefnas de fusion de anticuerpos de la presente invencion, en los cuales los anticuerpos y fragmentos de los mismos, de la presente invencion estan conjugados o fijados a otras moleculas o agentes incluyen ademas, pero sin caracter limitante, miembros de fijacion conjugados a un agente de ablacion qufmica, toxina, inmunomodulador, citocina, agente citotoxico, agente quimioterapeutico o farmaco.

La descripcion incluye un sistema de ensayo que puede prepararse en la forma de un kit de test para el analisis cuantitativo de la extension de la presencia de, por ejemplo, EGFR amplificado o EGFR de2-7. El sistema o kit de test puede comprender un componente marcado preparado por una de las tecnicas radiactivas y/o enzimaticas expuestas en esta memoria, acoplando un marcador al anticuerpo, y uno o mas reactivos inmunoqufmicos adicionales, al menos uno de los cuales es un componente libre o inmovilizado a determinar o su(s) pareja(s) de fijacion.

En una realizacion adicional, la descripcion se refiere a ciertos metodos terapeuticos que podrfan estar basados en la actividad del anticuerpo, o fragmentos activos del mismo, o en agentes u otros farmacos determinados que posean la misma actividad. Un primer metodo terapeutico esta asociado con la prevencion o tratamiento del cancer, incluyendo pero sin caracter limitante cancer de cabeza y cuello, mama, prostata y glioma.

En particular, los anticuerpos de la presente invencion, y en una realizacion particular el anticuerpo 175 cuyas

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secuencias de regiones de dominio CDR se presentan en la Figura 1 y en las SEQ ID NOs 1-6 de esta memoria, o fragmentos activos de las mismas, y anticuerpos quimericos (biespecfficos) o sinteticos derivados de ellas pueden prepararse en composiciones farmaceuticas, que incluyen un vehfculo, portador o diluyente adecuado, para administracion en casos en que la terapia sea apropiada, tales como para tratar un cancer. Tales composiciones farmaceuticas pueden incluir tambien metodos de modulacion de la semi-vida de los anticuerpos o fragmentos por metodos conocidos en la practica, tales como pegilacion. Dichas composiciones farmaceuticas pueden comprender ademas anticuerpos o agentes terapeuticos adicionales.

Asf pues, una composicion de la presente invencion puede administrarse sola o en combinacion con otros tratamientos, terapias o agentes, simultanea o sucesivamente dependiendo de la condicion a tratar. Adicionalmente, la presente invencion contempla e incluye composiciones que comprenden el anticuerpo o fragmento del mismo, descrito en esta memoria, y otros agentes o terapeuticas tales como agentes o terapeuticas anti-cancer, agentes o anticuerpos anti-EGFR, o inmunomoduladores. Mas generalmente, estos agentes anti-cancer pueden ser inhibidores de tirosina-quinasa o inhibidores de la cascada de fosforilacion, moduladores posteriores a la traduccion, inhibidores del crecimiento o division celular (v.g. anti-mitoticos), inhibidores de PDGFR o inhibidores de transduccion de senales. Otros tratamientos o terapeuticas pueden incluir la administracion de dosis adecuadas de farmacos de alivio del dolor tales como farmacos anti-inflamatorios no esteroidales (v.g. aspirina, paracetamol, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiaceos tales como morfina, o antiemeticos. Asf, estos agentes pueden ser agentes especfficos anti- EGFR, tales como AG1478, o pueden ser agentes anti-cancer y anti-neoplasticos mas generales, incluyendo ejemplos no limitantes doxorrubicina, carboplatino y cisplatino. Adicionalmente, la composicion puede administrarse con inmunomoduladores, tales como interleucinas, factor de necrosis de tumores (TNF) u otros factores de crecimiento, citocinas u hormonas tales como dexametasona que estimulan la respuesta inmune y la reduccion o eliminacion de celulas de cancer o tumores. La composicion puede administrarse tambien con, o puede incluir combinaciones junto con otros anticuerpos anti-EGFR, que incluyen pero sin caracter limitante los anticuerpos anti- EGFR mAb806; anticuerpo 528; 225; SC-03; 108 (ATCC HB9764) Patente U.S. No. 6,217,866; 14E1 (Patente U.S. No. 5,942,602); DH8.3; L8A4; Y10; HuMAX- EGFR (Genmab/Medarex); ICR62; y ABX-EGF (Abgenix).

La presente invencion incluye tambien anticuerpos y fragmentos de los mismos, que estan unidos covalentemente a o asociados de otro modo con otras moleculas o agentes. Estas otras moleculas o agentes incluyen, pero sin caracter limitante, moleculas (con inclusion de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo) con caracterfsticas de reconocimiento, toxinas, ligandos, y agentes quimioterapeuticos distintos.

Otros objetos y ventajas seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de una revision de la descripcion detallada que sigue, que prosigue con referencia a los dibujos ilustrativos siguientes, y las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Alineacion de las secuencias de aminoacidos para CDR's de mAb806 y mAb175. Las diferencias de secuencia entre los dos anticuerpos estan marcadas en negrita.

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Figura 2: Tincion inmunohistoqufmica de linajes de celulas e hfgado humano normal con mAb175. A: Se utilizo mAb175 biotinilado para tenir secciones preparadas a partir de bloques que contenfan celulas A431 (que sobreexpresan el EGFR tipo salvaje), celulas U87MG.A 2-7 (que expresan el EGFR A2-7) y celulas U87MG (que expresan el EGFR tipo salvaje a niveles moderados). B: Tincion de hfgado humano normal (400x) con mAb175 (panel izquierdo), control isotipo (panel central) y control de anticuerpo secundario (panel derecho). No se observo tincion sinusoidal o de los hepatocitos especffica.

Figura 3: Reactividad de mAb806 y mAb175 con fragmentos del EGFR presentados en levadura. A: Histogramas de citometrfa de flujo representativos que muestran la senal de fluorescencia media de la marcacion con mAb175 y mAb806 de fragmentos EGFR presentados en levadura. Con la presentacion en levadura cierto porcentaje de celulas no expresan protefna en su superficie, dando como resultado 2 picos de histograma. Se utiliza el anticuerpo 9E10 como control positivo, dado que todos los fragmentos contienen una etiqueta c-myc lineal en el terminal C. B: Sumario de la fijacion de anticuerpos a diversos fragmentos EGFR. C: Los fragmentos EGFR se desnaturalizaron por calentamiento de pelets de levadura a 80 °C durante 30 min. La etiqueta c-myc era reconocida todavfa por el anticuerpo 9E10 anti-myc en todos los casos, demostrando que el tratamiento termico no pone en compromiso la protefna presentada en la superficie de la levadura. El anticuerpo EGFR mAb 225 sensible a la conformacion se utilizo para confirmar la desnaturalizacion.

Figura 4: Efectos antitumorales de mAb175 sobre xenoinjertos de cancer de cerebro y prostata. A: Ratones (n = 5) que llevaban xenoinjertos U87MG.A2-7 se inyectaron por via intraperitoneal con PBS, 1 mg de mAb175 o mAb806 (control positivo), 3 veces por semana durante 2 semanas los dfas 6, 8, 10, 13, 15 y 17 cuando el volumen inicial del tumor era 100 mm3. Los datos se expresan como volumen medio del tumor ± SE. B: Las celulas se tineron con dos anticuerpos irrelevantes (azul, macizo y verde, hueco), mAb 528 para EGFR total (rosado, macizo), mAb806 (azul claro, hueco) y mAb175 (anaranjado, hueco) y se analizaron luego por FACS. C: Celulas DU145 se lisaron, se sometieron a IP con mAb 528, mAb806, mAb175 o dos anticuerpos irrelevantes independientes y se sometieron luego a inmunotransferencia para EGFR. D: Ratones (n = 5) portadores de xenoinjertos DU145 se inyectaron por via intraperitoneal con PBS, 1 mg de mAb175 o mAb806, diariamente los dfas 18-22, 25-29 y 39-43 cuando el volumen inicial del tumor era 85 mm3. Los datos se expresan como volumen medio del tumor ± SE.

Figura 5: Estructuras cristalinas del peptido EGFR 287-302 fijado a los fragmentos Fab. (A) Dibujo de Fab 806, con cadena ligera, rojo; cadena pesada, azul; peptido fijado, amarillo; y el EGFR287-302 de EGFR superpuesto, purpura. (B) Dibujo de Fab175 con la cadena ligera, amarillo; cadena pesada, verde; peptido fijado, lila; y EGFR287-302 de EGFR(D1-3), purpura. (C) Detalle de (B) que muestra la semejanza de EGFR- 287-302 en el receptor al peptido fijado a Fay 175. Las cadenas principales de los peptidos se muestran como trazas Ca, y las cadenas laterales interaccionantes como palillos. Los atomos O estan coloreados en rojo; N, azul; S, anaranjado y C, como para la cadena principal. (D) Superposicion de EGFR con el complejo Fab175: peptido que muestra solapamiento espacial. Coloracion como en (C) con la superficie de EGFR187-286 coloreada en turquesa. (E) Vista ortogonal a (D) con EGFR 187-286 representado en azul opaco y la superficie de las cadenas ligera (anaranjada) y pesada (verde) transparentes. (F) Vista estereoscopica detallada del complejo 175 Fab mirando hacia el sitio de fijacion de antfgeno. Coloracion

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como en (C) y con los enlaces de hidrogeno de la cadena lateral moteados en negro. Las moleculas de agua ocultas como resultado de la formacion del complejo se muestran como esferas rojas.

Figura 6: Influencia del enlace cistina 271-283 sobre la fijacion de mAb806 al EGFR. A: Celulas transfectadas con EGFR tipo salvaje, EGFR-C271A, EGFR-C283A o el mutante C271A/C283A se tineron con mAb 528 (histograma rosado macizo), mAb806 (lfnea azul) o solo el anticuerpo secundario (purpura) y se analizaron luego por FACS. La ganancia se establecio utilizando un anticuerpo irrelevante de la misma clase.

B: Celulas BaF3 que expresaban el EGFR-C 271A o EGFR C 271/283A se examinaron en cuanto a su respuesta a EGF en un ensayo MTT como se describe en Metodos. Los valores CE50 se obtuvieron utilizando el ajuste de Bolzman de los puntos de datos. Los datos representan la media y la desviacion estandar de medidas triplicadas. C: Celulas BaF3 que expresaban el tipo salvaje o el EGFR-C271A/C283A se dejaron sin alimento de IL-3 y suero, exponiendose despues a EGF o control de vehfculo. Los lisados de celulas enteras se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo anti- fosfotirosina (panel superior) o anticuerpo anti-EGFR (panel inferior). D: Celulas BaF3 que expresaban el EGFR tipo salvaje (panel izquierdo) o el C271A/C283A (panel derecho) se estimularon con concentraciones crecientes de EGF en ausencia de anticuerpo (sfmbolos vacfos), o en presencia de mAb 528 (cfrculos grises) o mAb806 (triangulos negros), ambos a 10 pg/mL. Los datos se expresan como el valor medio y la desviacion estandar de medidas triplicadas.

Figura 7: A) Imagen de camara gamma de cuerpo entero de la biodistribucion de 111Inch806 en un paciente con carcinoma metastasico de celulas escamosas de las cuerdas vocales, mostrando absorcion cuantitativa alta en el tumor en el lado derecho del cuello (flecha). Se observa tambien la actividad del conjunto de la sangre, y catabolismo menor de 111In libre en el hfgado. B) Imagen por Tomograffa Computarizada de Fotones Simples (SPECT) del cuello de este paciente, mostrando la absorcion de 111In-ch806 en el tumor viable (flecha), indicando la absorcion central reducida necrosis. C) Escaneo CT correspondiente del cuello que demuestra una gran masa tumoral en el lado derecho del cuello (flecha) con necrosis central.

Figura 8: Modelo estereoscopico de la estructura del EGFR 1-621 no restringido. La cadena principal del receptor esta trazada en azul y el ligando TGF-a en rojo. El epftopo mAb806/175 esta representado en turquesa, y los enlaces disulfuro en amarillo. Los atomos del enlace disulfuro que une el epftopo al receptor se muestran en formato de llenado espacial. El modelo se construyo por acoplamiento del dominio CR2 de EGFR-ECD de la conformacion restringida (13) a la estructura de un monomero EGFR no restringido en presencia de su ligando (14).

Figura 9: Reactividad de mAb806 con fragmentos del EGFR. Lisados de celulas 293T transfectadas con vectores que expresaban el fragmento soluble 1-501 de EGFR o protefnas de fusion del fragmento GH/EGFR (GH-274-501, GH-282-501, GH-290-501 and GH-298-501) se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirieron a

membrana y se sometieron a inmunotransferencia con mAb806 (panel izquierdo) o el anticuerpo anti-myc 9B11 (panel derecho).

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DESCRIPCION DETALLADA

De acuerdo con la presente invencion, pueden emplearse metodos de bioiogfa molecular convencional, microbiologfa, y DNA recombinante dentro de la experiencia en la tecnica. Tales metodos se expresan detalladamente en la bibliograffa. Veanse, v.g., Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” volumenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; “Cell Biology: A Laboratory Handbook” volumenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; “Current Protocols in Immunology” volumenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; “Transcription And Translation” [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; “Animal Cell Culture” [R.I. Freshney, ed. (1986)]; “Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984).

Por consiguiente, si aparecen en esta memoria, los terminos siguientes tendran las definiciones expuestas a continuacion.

A. TERMINOLOGIA

El termino “expresion aberrante” en sus diversas formas gramaticales puede significar e incluir cualquier expresion o sobreexpresion aumentada o alterada de una protefna en un tejido, v.g. un aumento en la cantidad de una protefna, causado por cualquier medio que incluya expresion o traduccion intensificada, modulacion del promotor o un regulador de la protefna, amplificacion de un gen para una protefna, o semi-vida o estabilidad incrementadas, de tal modo que existe o puede detectarse en un momento dado mayor cantidad de la protefna, en contraste con un estado no sobreexpresado. Expresion aberrante incluye y contempla cualquier escenario o alteracion en la que la expresion o la maquinaria de modificacion posterior a la traduccion de la protefna en una celula esta gravida o alterada de otro modo debido a expresion intensificada o niveles o cantidades incrementados de una protefna, con inclusion de aquellos casos en los que se expresa una protefna alterada como en protefna o variante mutada debido a alteracion, delecion o insercion de secuencia, o plegamiento alterado.

Es importante apreciar que el termino “expresion aberrante” se ha seleccionado espedficamente en esta memoria para abarcar el estado en que estan presentes cantidades/niveles anormales (usualmente aumentados) de la protefna, con indiferencia de la causa eficiente de dicha cantidad o nivel anormal. Asf, cantidades anormales de protefnas pueden ser resultado de sobreexpresion de la protefna en ausencia de amplificacion de gen, que es el caso v.g. en muchas muestras celulares/tisulares tomadas de la cabeza y el cuello de individuos con cancer, en tanto que otras muestras exhiben niveles de protefna anormales atribuibles a amplificacion genica.

A este respecto, parte del trabajo de los inventores que se presenta en esta memoria para ilustrar la invencion incluye el analisis de muestras, algunas de las cuales exhiben niveles anormales de protefna resultantes de la amplificacion de EGFR. Esto da cuenta por tanto de la presentacion en esta memoria de hallazgos experimentales en los que se hace referencia a amplificacion y del uso de los terminos “amplificacion/amplificado” y analogos en la descripcion de libras anormales de EGFR. Sin embargo, es la observacion de las cantidades o niveles anormales de la protefna lo que define el entorno o circunstancia en que se contempla la intervencion clfnica como por recurso a

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los miembros de fijacion de la invencion, y por esta razon, la presente memoria descriptiva considera que el termino “expresion aberrante” capta de un modo mas general el entorno causal que produce la anormalidad correspondiente en los niveles de EGFR.

Conforme a ello, si bien se entiende que los terminos “sobreexpresion” y “amplificacion” en sus diversas formas gramaticales tienen significados tecnicos distintos, los mismos deben considerarse equivalentes uno a otro, en la medida en que los mismos representan el estado en que estan presentes niveles anormales de protefna EGFR en el contexto de la presente invencion. Por consiguiente, se ha elegido el termino “expresion aberrante” dado que se cree que subsume los terminos “sobreexpresion” y “amplificacion” dentro de su alcance para los propositos de esta memoria, por lo que todos los terminos pueden considerarse equivalentes unos a otros cuando se utilizan en esta memoria.

El termino “anticuerpo” describe una inmunoglobulina, tanto si se produce naturalmente o por smtesis parcialmente o en su totalidad. El termino abarca tambien cualquier polipeptido o protefna que tenga un dominio de fijacion que es, o es homologo a, un dominio de fijacion de anticuerpo. Por este termino se contemplan tambien anticuerpos injertados en CDR.

Dado que los anticuerpos pueden modificarse de diversas maneras, debe interpretarse que el termino “anticuerpo” abarca cualquier miembro o sustancia de fijacion especffica que tenga un dominio de fijacion con la especificidad requerida. Asf, este termino abarca fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homologos de anticuerpos, con inclusion de cualquier polipeptido que comprenda un dominio de fijacion de inmunoglobulina, sea natural o sintetico total o parcialmente. Por tanto, se incluyen moleculas quimericas que comprenden un dominio de fijacion de inmunoglobulina, o equivalente, fusionadas a otro polipeptido. La clonacion y expresion de anticuerpos quimericos se describen en EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en las Patentes U.S. NOs. 4,816,397y 4,816,567.

Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo entero pueden realizar la funcion de antfgenos de fijacion. Ejemplos de fragmentos de fijacion son (i) el fragmento Fab constituido por dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de un anticuerpo simple; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) moleculas Fv monocatenarias (scFv), en las cuales un dominio VH y un dominio VL estan unidos por un enlazador peptfdico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de fijacion de antfgeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) fragmentos de anticuerpo multivalentes (dfmeros, trfmeros y/o tetrameros scFv (Power and Hudson, J Immunol. Methods 242: 193204 9 (2000)); (ix) dfmeros Fv monocatenarios biespecfficos (PCT/US92/09965) y (x) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multi-especfficos construidos por fusion de genes (WO94/13804; P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, (1993)).

Un “sitio de combinacion de anticuerpos” es una porcion estructural de una molecula de anticuerpo que compr ende regiones variables e hipervariables de cadena ligera o de cadenas pesada y ligera que fija especfficamente un antfgeno.

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La expresion “molecula de anticuerpo” en sus diversas formas gramaticales como se utilizan en esta memoria contempla tanto una molecula de inmunoglobulina intacta como una porcion inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina.

Moleculas de anticuerpo ilustrativas son moleculas intactas de inmunoglobulina, moleculas sustancialmente intactas de inmunoglobulina y aquellas porciones de una molecula de inmunoglobulina que contiene el paratopo, con inclusion de aquellas porciones conocidas en la tecnica como Fab, Fab', F(ab')2 and F(v), porciones que se prefieren para uso en los metodos terapeuticos descritos en esta memoria.

Los anticuerpos pueden ser tambien biespecfficos, en los cuales un dominio de fijacion del anticuerpo es un miembro de fijacion especffica de la invencion, y el otro dominio de fijacion tiene una especificidad diferente, v.g. para reclutar una funcion efectora o analoga. Anticuerpos biespecfficos de la presente invencion incluyen aquellos en los cuales un dominio de fijacion del anticuerpo es un miembro de fijacion especffica de la presente invencion, con inclusion de un fragmento del mismo, y el otro dominio de fijacion es un anticuerpo distinto o fragmento del mismo, que incluye el de un anticuerpo anti-EGFR distinto, por ejemplo el anticuerpo 528 (Patente U.S. No. 4,943,533), el anticuerpo quimerico y humanizado 225 (patente U.S. No. 4,943,533 y WO/9640210), un anticuerpo anti-de2-7 tal como DH8.3 (Hills, D. et al (1995) Int. J. Cancer 63(4):537-543), el anticuerpo L8A4 y Y10 (Reist, CJ et al (1995) Cancer Res. 55(19):4375-4382; Foulon CF et al. (2000) Cancer Res. 60(16):4453-4460), ICR62 (Modjtahedi H et al (1993) Cell Biofys. Jan-Jun;22(1-3):129-46; Modjtahedi et al (2002) P.A.A.C.R. 55(14):3140- 3148, o el anticuerpo de Wikstrand et al (Wikstrand C. et al (1995) Cancer Res. 55(14):3140-3148). El otro dominio de fijacion puede ser un anticuerpo que reconoce o esta direccionado a un tipo de celula particular, como en un anticuerpo especffico de celulas neurales o gliales. En los anticuerpos biespecfficos de la presente invencion, uno de los dominios de fijacion del anticuerpo de la invencion puede estar combinado con otros dominios de fijacion o moleculas que reconocen receptores celulares particulares y/o modulan las celulas de una manera particular, como por ejemplo un inmunomodulador (v.g., interleucina(s)), un modulador del crecimiento o citocina (v.g. factor de necrosis de tumores (TNF), y particularmente, la modalidad biespecffica de TNF demostrada en U.S.S.N. 60/355.838 presentado el 13 de febrero de 2002) o una toxina (v.g., ricina) o un agente o factor anti-mitotico o apoptotico.

Porciones Fab y F(ab')2 de moleculas de anticuerpo pueden prepararse por la reaccion proteolftica de papafna y pepsina, respectivamente, sobre moleculas de anticuerpo sustancialmente intactas por metodos bien conocidos. Vease, por ejemplo la patente U.S. No. 4.342.566 otorgada a Theofilopolous et al. Porciones Fab' de moleculas de anticuerpo son tambien bien conocidas y se producen a partir de porciones F(ab')2 seguido por reduccion de los enlaces disulfuro que unen las dos porciones de cadena pesada como en el caso de mercaptoetanol, y seguido por alquilacion del mercaptano de la protefna resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. En esta memoria se prefiere un anticuerpo que contiene moleculas de anticuerpo intactas.

La expresion “anticuerpo monoclonal” en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene una sola especie de sitio de combinacion de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antfgeno particular. Un anticuerpo monoclonal exhibe por tanto tfpicamente una afinidad de fijacion unica para cualquier antfgeno con el cual inmunorreaccione el mismo. Un anticuerpo monoclonal puede contener tambien una molecula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinacion de anticuerpo, cada uno inmunoespecffico para un antfgeno diferente; v.g., un anticuerpo monoclonal biespecffico (quimerico).

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El termino “dominio de fijacion de antfgeno” describe la parte de un anticuerpo que comprende el area que se fija especfficamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antfgeno. En el caso de un antfgeno grande, un anticuerpo puede fijarse solo a una parte del antfgeno unicamente, parte que se conoce como un epftopo. Un dominio de fijacion de antfgeno puede estar proporcionado por uno o mas dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, un dominio de fijacion de antfgeno comprende una region variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una region variable de cadena pesada del anticuerpo (VH).

“Modificacion post-traduccional” puede abarcar una cualquiera de o combinacion de modificaciones, con inclusion de modificacion covalente, que sufre una protefna despues de su traduccion completa y despues de ser liberada del ribosoma o en el polipeptido naciente simultaneamente a la traduccion. Modificacion post-traduccional incluye, pero sin caracter limitante, fosforilacion, miristilacion, ubiquitinacion, glicosilacion, fijacion de coenzima, metilacion y acetilacion. La modificacion post-traduccional puede modular o influenciar la actividad de una protefna, su destino intracelular o extracelular, su estabilidad o semi-vida, y/o su reconocimiento por ligandos, receptores u otras protefnas. La modificacion post-traduccional puede ocurrir en organulos de la celula, en el nucleo o citoplasma o extracelularmente.

El termino “espedfico” puede utilizarse para hacer referencia a la situacion en la que un miembro de un par de fijacion especffica no exhibira fijacion significativa alguna a moleculas distintas de su(s) pareja(s) de fijacion especffica(s). El termino es aplicable tambien donde v.g. un dominio de fijacion de antfgeno es especffico para un epftopo particular que es llevado por varios antfgenos, en cuyo caso el miembro de fijacion especffica que lleva el dominio de fijacion de antfgeno sera capaz de fijarse a los diversos antfgenos que llevan el epftopo.

El termino “comprender” se utiliza generalmente en el sentido de inclusion, es decir que permite la presencia de una o mas caracterfsticas o componentes.

El termino “constituido esencialmente por” se refiere a un producto, particularmente una secuencia peptfdica, de un numero definido de residuos que no esta unido covalentemente a un producto mayor. En el caso del peptido de la invencion al que se hace referencia anteriormente, los expertos en la tecnica apreciaran que pueden contemplarse sin embargo modificaciones menores en el terminal N-o C-del peptido, tales como la modificacion qufmica del terminal para anadir un grupo protector o analogo, v.g. la amidacion del termino C.

El termino “aislado” se refiere al estado en el cual se encontraran los anticuerpos de la invencion, o el acido nucleico que codifica tales anticuerpos o CDRs del mismo, de acuerdo con la presente invencion. Los anticuerpos y el acido nucleico estaran exentos o sustancialmente exentos de material con el cual estan asociados naturalmente, tales como otros polipeptidos o acidos nucleicos con los cuales se encuentran aquellos en su entorno natural, o el entorno en el cual se preparan los mismos (v.g. cultivo de celulas) cuando tal preparacion se practica por tecnologfa de DNA recombinante in vitro o in vivo. Los anticuerpos y el acido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y estar aislados todavfa para propositos practicos -por ejemplo los miembros estaran mezclados normalmente con gelatina u otros portadores si se utilizan para recubrir placas de microtitulacion para uso en inmunoensayos, o estaran mezclados con portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables cuando se utilizan en diagnosis o terapia. Los anticuerpos pueden estar glicosilados, sea naturalmente o por sistemas de celulas eucariotas heterologas, o pueden no estar glicosilados (por ejemplo si se producen por expresion en una celula procariota).

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Asimismo, como se utilizan en esta memoria, los terminos “glicosilacion” y “glicosilado” incluyen y abarcan la modificacion post-traduccional de protemas, denominadas glicoprotemas, por adicion de oligosacaridos. Los oligosacaridos se anaden en los sitios de glicosilacion en las glicoprotemas, incluyendo particularmente oligosacaridos enlazados a N y oligosacaridos enlazados a O. Los oligosacaridos enlazados a N se anaden a un residuo Asn, particularmente donde el residuo Asn se encuentra en la secuencia N-X-S/T, donde X no puede ser Pro o Asp, y son los mas comunes encontrados en las glicoprotemas. En la biosmtesis de glicoprotemas enlazadas a N un oligosacarido de tipo rico en manosa (constituido generalmente por dolicol, N-acetilglucosamina, manosa, y glucosa) se forma primeramente en el retmulo endoplasmico (ER). Las glicoprotemas de tipo rico en manosa son transportadas luego desde el ER al Golgi, donde tiene lugar el procesamiento y la modificacion ulteriores de los oligosacaridos. Los oligosacaridos enlazados a O se anaden al grupo hidroxilo de residuos Ser o Thr. En los oligosacaridos enlazados a O, la N-acetilglucosamina es transferida primeramente al residuo Ser o Thr por la N- acetil-glucosaminiltransferasa en el ER. La protema se desplaza luego al Golgi donde tienen lugar la modificacion y alargamiento de cadena ulteriores. Modificaciones enlazadas a O pueden ocurrir con la simple adicion del monosacarido OGlcNAc solo en aquellos sitios Ser o Thr que pueden tambien, en condiciones diferentes, sufrir fosforilacion en lugar de glicosilacion.

Como se utiliza en esta memoria, “pg” significa picogramo, “ng” significa nanogramo, “ug” o “pg” significa microgramo, “mg” significa miligramo, “ul” o “pl” significa microlitro, “ml” significa millilitro, y “l” significa litro.

Los terminos “anticuerpo 175”, “175 anticuerpo”, “mAb175”, y cualesquiera variantes no citadas espedficamente, pueden utilizarse de modo intercambiable de esta memoria, y como se utiliza a lo largo de la presente solicitud y las reivindicaciones se extienden a aquellas protemas que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, y 6 y el perfil de actividades indicado en esta memoria y en las reivindicaciones.

Los residuos de aminoacidos descritos en esta memoria estan preferiblemente en la forma isomera “L”. Sin embargo, pueden sustituirse residuos en la forma isomera “D” en lugar de cualquier residuo de L-aminoacido, siempre que la propiedad funcional deseada de fijacion de inmunoglobulina sea retenida por el polipeptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el termino amino de un polipeptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el termino carboxi de un polipeptido. De acuerdo con la nomenclatura estandar de los polipeptidos, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas para los residuos de aminoacido se muestran en la Tabla de Correspondencia siguiente:

TABLA DE CORRESPONDENCIA

SIMBOLO

aminoAcido

1-Letra

3-Letras

Y

Tyr Tirosina

G

Gly Glicina

F

Fe Fenilalanina

M

Met Metionina

TABLA DE CORRESPONDENCIA

SIMBOLO

AMINOACIDO

1-Letra

3-Letras

A

Ala Alanina

S

Ser Serina

I

Ile Isoleucina

L

Leu Leucina

T

Thr Treonina

V

Val Valine

P

Pro Prolina

K

Lys Lisina

H

His Histidina

Q

Gln Glutamina

E

Glu Acido glutamico

W

Trp Triptofano

R

Arg Arginina

D

Asp Acido aspartico

N

Asn Asparagina

C

Cys Cistefna

Debe indicarse que todas las secuencias de residuos de aminoacido se representan en esta memoria por formulas cuya orientacion izquierda y derecha se encuentra en la direccion convencional del termino amino al termino carboxi. Adicionalmente, debe indicarse que un guion al comienzo o al final de una secuencia de residuo de aminoacido 5 indica un enlace peptfdico a una secuencia adicional de uno o mas residuos de aminoacido. La Tabla anterior se presenta para correlacionar las notaciones de tres letras y una sola letra que pueden aparecer alternativamente en esta memoria.

Un “replicon” es cualquier elemento genetico (v.g., plasmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad 10 autonoma de replicacion de DNA in vivo; es decir capaz de replicacion bajo su propio control.

Un “vector” es un replicon, tal como un plasmido, fago o cosmido, al cual puede estar unido otro segmento de DNA para llevar a cabo la replicacion del segmento unido.

15 Una “molecula de DNA” se refiere a la forma polfmera de desoxirribonucleotidos (adenina, guanina, timina, o

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citosina) en su forma monocatenaria, o una helice bicatenaria. Este termino se refiere unicamente a la estructura primaria y secundaria de la molecula, y no limita la misma a forma terciaria particular alguna. Asf, este termino incluye DNA bicatenario encontrado, inter alia, en moleculas de DNA lineales (v.g., fragmentos de restriccion), virus, plasmidos, y cromosomas. En la discusion de la estructura de moleculas de DNA bicatenarias particulares, las secuencias pueden describirse en esta memoria de acuerdo con la convencion normal de presentar solo la secuencia en la direccion 5' a 3' a lo largo de la cadena de DNA no transcrita (es decir la cadena que tiene una secuencia homologa al mRNA).

Un “origen de replicacion” se refiere a aquellas secuencias de DNA que participan en la smtesis del DNA.

Una “secuencia codificante” de DNA es una secuencia de DNA bicatenario que se transcribe y traduce en un polipeptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificante estan determinados por un codon de comienzo en el termino 5' (amino) y un codon de parada de la traduccion en el termino 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin caracter limitante, secuencias procariotas, cDNA de mRNA eucariota, secuencias de DNA genomico de DNA eucariota (v.g. de mairnfero), e incluso secuencias de DNA sintetico. Una senal de poliadenilacion y secuencia de terminacion de la transcripcion estara localizada usualmente en posicion 3' respecto a la secuencia codificante.

Las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion son secuencias reguladoras de DNA, tales como promotores, intensificadores, senales de poliadenilacion, terminadores, y analogas, que proporcionan la expresion de una secuencia codificante en una celula hospedadora.

Una “secuencia promotora” es una reaccion reguladora de DNA capaz de fijar RNA-polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante aguas abajo (direccion 3'). Para los propositos de definicion de la presente invencion, la secuencia promotora esta unida en su extremo 3' por el sitio de iniciacion de la transcripcion y se extiende aguas arriba (direccion 5') para incluir el numero mmimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion a niveles detectables por encima del ruido de fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de iniciacion de la transcripcion (definido convenientemente por mapeado con nucleasa S1), asf como dominios de fijacion de protemas (secuencias de consenso) responsables de la fijacion de RNA-polimerasa. Los promotores eucariotas contendran con frecuencia, pero no siempre, secuencias “TATA” y secuencias “CAT”. Los promotores procariotas contienen secuencias Shine-Dalgarno ademas de las secuencias de consenso -10 y -35.

Una “secuencia de control de la expresion” es una secuencia de DNA que controla y regula la transcripcion y traduccion de otra secuencia de DNA. Una secuencia codificante se encuentra “bajo el control” de secuencias controladoras de la transcripcion y la traduccion en una celula cuando la RNA-polimerasa transcribe la secuencia codificante en mRNA, que se traduce luego en la protema codificada por la secuencia codificante.

Una “secuencia senal” puede incluirse antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un peptido senal, N-terminal al polipeptido, que se comunica con la celula hospedadora para dirigir el polipeptido a la superficie celular o secretar el polipeptido en el medio, y este peptido senal es cortado por la celula hospedadora antes que la protema abandone la celula. Las secuencias senal pueden encontrarse asociadas con una diversidad de protemas nativas a

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procariotas y eucariotas.

El termino “oligonucleotido”, como se utiliza en esta memoria para hacer referencia a la sonda se define como una molecula que comprende dos o mas ribonucleotidos, preferiblemente mas de tres. Su tamano exacto dependera de muchos factores que, a su vez, dependen de la funcion y el uso ultimos del oligo nucleotido. El termino “cebador”, como se utiliza en esta memoria, se refiere a un oligonucleotido, tanto si existe naturalmente como si se encuentra en un material digerido de restriccion purificado o producido por sfntesis, que es capaz de actuar como punto de iniciacion de la sfntesis cuando se pone en condiciones en las cuales se induce la sfntesis de un producto de extension del cebador, que es complementario a una cadena de acido nucleico, es decir, en presencia de nucleotidos y un agente inductor tal como una DNA-polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser monocatenario o bicatenario y tiene que ser suficientemente largo para cebar la sfntesis del producto de extension deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependera de muchos factores, que incluyen temperatura, fuente del cebador y uso del metodo. Por ejemplo, para aplicaciones diagnosticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotfdico contiene tfpicamente 15-25 nucleotidos o mas, aunque puede contener menos nucleotidos. Los cebadores se seleccionan de modo que sean “sustancialmente” complementarios a diferentes cadenas de una secuencia de DNA diana particular. Esto significa que los cebadores tienen que ser suficientemente complementarios para hibridarse con sus cadenas respectivas. Por tanto, la secuencia del cebador no precisa reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleotido no complementario puede estar unido al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementario a la cadena. Alternativamente, bases no complementarias o secuencias mas largas pueden estar intercaladas en el cebador, con tal que la secuencia cebadora tenga complementariedad suficiente con la secuencia de la cadena para hibridarse con ella y formar de este modo el molde para la sfntesis del producto de extension.

Como se utiliza en esta memoria, los terminos “endonucleasas de restriccion” y “enzimas de restriccion” se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el DNA bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleotidos especffica.

Una celula ha sido “transformada” por DNA exogeno o heterologo cuando dicho DNA se ha introducido en el interior de la celula. El DNA transformante puede estar integrado (enlazado covalentemente) o no en el DNA cromosomico que constituye el genoma de la celula. En procariotas, levaduras, y celulas de mamffero por ejemplo, el DNA transformante puede mantenerse en un elemento episomico tal como un plasmido. Con respecto a las celulas eucariotas, una celula transformada establemente es una en la cual el DNA transformante se ha integrado en un cromosoma de tal modo que el mismo es heredado por las celulas hijas por replicacion cromosomica.

Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la celula eucariota para establecer linajes o clones de celulas que comprenden una poblacion de celulas hijas que contienen el DNA transformante. Un “clon”es una poblacion celulas derivadas de una sola celula o ancestro comun por mitosis. Un “linaje de celulas” es un clon de una celula primaria que es capaz de crecer establemente in vitro durante muchas generaciones.

Dos secuencias de DNA son “sustancialmente homologas” cuando al menos aproximadamente 75 % (con preferencia al menos aproximadamente 80 %, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 90 o 95 %) de

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los nucleotidos coinciden a lo largo de la longitud definida de las secuencias de DNA. Secuencias que son sustancialmente homologas pueden identificarse por comparacion de las secuencias utilizando software estandar disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridacion Southern, por ejemplo, en condiciones severas como se definen para dicho sistema particular. La definicion de condiciones de hibridacion apropiadas esta dentro de la experiencia en la tecnica. Vease, v.g., Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Debe apreciarse que estan tambien dentro del alcance de la presente invencion secuencias de DNA codificantes de anticuerpos de la invencion, que codifican v.g. un anticuerpo que tiene un dominio de region variable que tiene o comprende la misma secuencia de aminoacidos que SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, y 6.

Es bien conocido en la tecnica que los codones siguientes pueden utilizarse intercambiablemente para codificar cada aminoacido especffico:

Fenilalanina (Phe o F)

UUU o UUC

Leucina (Leu o L)

UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG

Isoleucina (Ile o I)

AUU o AUC o AUA

Metionina (Met o M)

AUG

Valina (Val o V)

GUU o GUC of GUA o GUG

Serina (Ser o S)

UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC

Prolina (Pro o P)

CCU o CCC o CCA o CCG

Treonina (Thr o T)

ACU o ACC o ACA o ACG

Alanina (Ala o A)

GCU o GCG o GCA o GCG

Tirosina (Tyr o Y)

UAU o UAC

Histidina (His o H)

CAU o CAC

Glutamina (Gln o Q)

CAA o CAG

Asparagina (Asn o N)

AAU o AAC

Lisina (Lys o K)

AAA o AAG

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Acido glutamico (Glu o E)

GAA o GAG

Cisteina (Cys o C)

UGU o UGC

Arginina (Arg o R)

CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG

Glicina (Gly o G)

GGU o GGC o GGA o GGG

Triptofano (Trp o W)

UGG

Codon de terminacion

UAA (ocre) o UAG (ambar) o UGA (opal)

Debe entenderse que los codones arriba especificados son para secuencias de RNA. Los codones correspondientes para DNA tienen una T en sustitucion de U.

Pueden realizarse mutaciones en las secuencias de acido nucleico que codifican los dominios de anticuerpo expuestos en esta memoria de tal modo que un codon particular es cambiado por un codon que codifica un aminoacido diferente. Una mutacion de este tipo se hace generalmente realizando los mfnimos cambios de nucleotido posibles. Una mutacion de sustitucion de esta clase puede hacerse para cambiar un aminoacido en la protefna resultante de una manera no conservadora (es decir, cambiando el codon de un aminoacido perteneciente a una agrupacion de aminoacidos que tienen un tamano o caracterfstica particular por un aminoacido perteneciente a otra agrupacion) o de una manera conservadora (es decir cambiando el codon de un aminoacido perteneciente a una agrupacion de aminoacidos que tienen un tamano o caracterfstica particular por un aminoacido perteneciente a la misma agrupacion). Un cambio conservador de este tipo conduce generalmente a menos cambio en la estructura y funcion de la protefna resultante. Un cambio no conservador es mas probable que altere la estructura, actividad o funcion de la protefna resultante. Debe considerarse que la presente invencion incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o caracterfsticas de fijacion de la protefna resultante.

Lo que sigue es un ejemplo de diversas agrupaciones de aminoacidos:

Aminoacidos con grupos R no polares

Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofano, Metionina

Aminoacidos con grupos R polares no cargados

Glicina, Serina, Treonina, Cisteina, Tirosina, Asparagina, Glutamina

Aminoacidos con grupos R cargados polares (cargados negativamente a pH 6,0)

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Aminoacidos basicos (cargados positivamente a pH 6,0)

Lisina, Arginina, Histidina (a pH 6,0)

Otra agrupacion puede estar constituida por aquellos aminoacidos que tienen grupos fenilo: Fenilalanina; Triptofano, Tirosina.

Otra agrupacion puede ser segun el peso molecular (es decir, el tamano de los grupos R):

Glicina

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Alanina

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Serina

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Prolina

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Valina

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Treonina

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Cistefna

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Leucina

131

Isoleucina

131

Asparagina

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Acido aspartico

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Glutamina

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Lisina

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Acido glutamico

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Metionina

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Histidina (a pH 6,0)

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Arginina

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Sustituciones particularmente preferidas son:

- Lys en lugar de Arg y viceversa de tal modo que puede mantenerse una carga positiva;

- Glu en lugar de Asp y viceversa de tal modo que puede mantenerse una carga negativa;

- Ser en lugar de Thr de tal modo que puede mantenerse un -OH libre; y

- Gln en lugar de Asn de tal modo que puede mantenerse un -NH2 libre.

Pueden introducirse tambien sustituciones de aminoacidos para sustituir un aminoacido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, puede introducirse un Cys en un sitio potencial para puentes disulfuro con otro Cys. Puede introducirse un His como un sitio particularmente “catalftico” (a saber, His puede actuar como acido o base y es el aminoacido mas comun en catalisis bioqufmica). Puede introducirse Pro debido a su estructura particularmente plana, que induce vueltas p en la estructura de la protema.

Dos secuencias de aminoacido son “sustancialmente homologas” cuando al menos aproximadamente 70 % de los residuos de aminoacido (con preferencia al menos aproximadamente 80 %, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 90 o 95 %) son identicos, o representan sustituciones conservadoras.

Una region “heterologa” del constructo de DNA es un segmento identificable de DNA dentro de una molecula de DNA mayor que no se encuentra en asociacion con la molecula mayor en la naturaleza. Asf, cuando la region heterologa codifica un gen de mamffero, el gen estara flanqueado usualmente por DNA que no flanquea el DNA genomico del mamffero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia codificante heterologa es un constructo en el que la secuencia codificante propiamente dicha no se encuentra en la naturaleza (v.g., un cDNA en el que la secuencia genomica codificante contiene intrones, o secuencias sinteticas que tienen codones diferentes que el gen nativo). Las variaciones alelicas o eventos de mutacion existentes naturalmente no dan lugar a una region heterologa de DNA como se define en esta memoria.

La expresion “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que son fisiologicamente tolerables y no producen tfpicamente una reaccion alergica o adversa similar, tal como perturbacion gastrica, mareo y analogas, cuando se administran a un humano.

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La expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” se utiliza en esta memoria para significar una cantidad suficiente para prevenir, y preferiblemente reducir al menos aproximadamente 30 %, con preferencia al menos 50 %, con mas preferencia al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, y preferiblemente al menos 90%, un cambio clfnicamente significativo en el crecimiento o progresion o actividad mitotica de una masa celular diana, grupo de celulas de cancer o tumor, u otra particularidad de patologfa. Por ejemplo, puede reducirse el grado de activacion de EGFR o la actividad o cantidad o numero de celulas EGFR-positivas, particularmente de celulas reactivas o positivas para el anticuerpo o miembro de fijacion.

Una secuencia de DNA esta “enlazada operativamente” a una secuencia de control de la expresion cuando la secuencia de control de la expresion controla y regula la transcripcion y traduccion de dicha secuencia de DNA. La expresion “enlazada operativamente” incluye el hecho de tener una senal de inicio apropiada (v.g., ATG) delante de la secuencia de DNA a expresar y mantener el entramado de lectura correcto que permite la expresion de la secuencia de DNA bajo el control de la secuencia de control de la expresion y la produccion del producto deseado codificado por la secuencia de DNA. Si un gen que se desea insertar en una molecula de DNA recombinante no contiene una senal de inicio apropiada, dicha senal de inicio puede insertarse delante del gen.

La expresion “condiciones estandar de hibridacion” se refiere a condiciones de sal y temperature sustancialmente equivalentes a 5 x SSC y 65 °C tanto para hibridacion como para lavado. Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara que dichas “condiciones estandar de hibridacion” dependen de condiciones particulares que incluyen la concentracion de sodio y magnesio en el tampon, la longitud y concentracion de la secuencia de nucleotidos, el porcentaje de desapareamiento, el porcentaje de formamida, y analogos. Tambien es importante en la determinacion de las “condiciones estandar de hibridacion” si las dos secuencias que se hibridan son RNA-RNA, DNA-DNA o RNA- DNA. Tales condiciones estandar de hibridacion son determinadas facilmente por un experto en la tecnica segun formulas bien conocidas, en las cuales la hibridacion tiene lugar tfpicamente 10-20 °C por debajo de la Tm predicha o determinada con lavados de mayor severidad, en caso deseado.

B. DESCRIPCION DETALLADA

La presente invencion proporciona un nuevo anticuerpo 175 o fragmento del mismo, con inclusion de fragmentos inmunogenos, que reconoce un epftopo de EGFR, particularmente el peptido EGFR

(287CGADSYEMEEDGVRKC302(SEQ ID NO: 14)), que se presenta en celulas tumorfgenas, hiperproliferativas o anormales en las cuales el epftopo esta aumentado, se revela, es evidente y no es detectable en celulas normales o tipo salvaje. En una realizacion particular pero no limitante, el anticuerpo reconoce un epftopo de EGFR que esta intensificado o es evidente despues de modificacion simple de carbohidratos o glicosilacion temprana y esta reducido o no es evidente en presencia de modificacion o glicosilacion de carbohidratos complejos. El anticuerpo o fragmento del mismo no se fija o reconoce las celulas normales o tipo salvaje que contienen epftopo de EGFR normal o tipo salvaje en ausencia de sobreexpresion, amplificacion, o un evento tumorfgeno.

En un aspecto particular de la invencion y como se ha expuesto anteriormente, los presentes inventores han descubierto el nuevo anticuerpo monoclonal 175, que reconoce especfficamente EGFR amplificado tipo salvaje y el EGFR de2-7, pero se fija a un epftopo distinto del peptido juntural singular de la mutacion de EGFR de2-7. Adicionalmente, si bien mAb175 no reconoce el EGFR normal tipo salvaje expresado en la superficie celular de las

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celulas de glioma, se fija de hecho al dominio extracelular del EGFR inmovilizado en la superficie de placas ELISA, indicando un epftopo de conformacion con un aspecto polipeptfdico. Es importante que mAb175 no se fijaba significativamente a tejidos normales tales como el hfgado, que expresan niveles de EGFR endogeno tipo salvaje que son mayores que en la mayorfa de los tejidos normales restantes, pero en los cuales EGFR no esta sobreexpresado o aumentado. Asf, mAb175 demuestra especificidad nueva y util, reconociendo EGFR de2-7 y EGFR amplificado, en tanto que no reconoce EGFR normal tipo salvaje o el peptido juntural singular que es caracterfstico de EGFR 2-7. El anticuerpo 175 de la presente invencion comprende las secuencias de aminoacidos de los dominios CDR VH y VL representadas en la Figura 1 y en SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, y 6.

Usos Diagnosticos y Terapeuticos

La especificidad singular de los anticuerpos 175 o fragmentos de los mismos, de la presente invencion, proporciona usos diagnosticos y terapeuticos para identificar, caracterizar, direccionar y tratar, reducir o eliminar numerosos tipos de celulas tumorfgenas y tipos de tumor, por ejemplo tumores de cabeza y cuello, mama, pulmon, vejiga o prostata y glioma, sin los problemas asociados con la absorcion de tejido normal que pueden encontrarse con anticuerpos EGFR conocidos previamente. Asf, celulas que sobreexpresan EGFR (v.g. por amplificacion o expresion de un EGFR mutante o variante), particularmente aquellas que demuestran modificacion aberrante post-traduccional pueden reconocerse, aislarse, caracterizarse, direccionarse y tratarse o eliminarse utilizando el o los anticuerpos 175 o fragmentos de los mismos de la presente invencion.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden clasificar asf especfficamente la naturaleza de tumores o celulas tumorfgenas de EGFR, por tincion o reconocimiento de otro modo de dichos tumores o celulas en los que esta presente sobreexpresion de EGFR, particularmente amplificacion y/o mutacion de EGFR, particularmente EGFR de2-7. Adicionalmente, los anticuerpos 175 de la presente invencion demuestran actividad anti-tumor significativa in vivo contra tumores que contienen EGFR amplificado y contra xenoinjertos EGFR de2-7 positivos. En un ejemplo adicional de la descripcion, se proporciona un metodo de tratamiento de un tumor, una condicion cancerosa, una condicion pre-cancerosa, y cualquier condicion relacionada con o resultante de crecimiento hiperproliferativo de celulas que comprende la administracion de un anticuerpo 175 de la invencion.

Los anticuerpos de la presente invencion estan disenados para ser utilizados en metodos de diagnosis y tratamiento de tumores en individuos humanos o animales, particularmente tumores epiteliales. Estos tumores pueden ser tumores solidos primarios o secundarios de cualquier tipo con inclusion, pero sin caracter limitante, de tumores de glioma, mama, pulmon, prostata, cabeza o cuello.

Generacion de anticuerpos

La metodologfa general para produccion de anticuerpos monoclonales por hibridomas es bien conocida. Pueden crearse tambien linajes de celulas inmortales productoras de anticuerpos por tecnicas distintas de la fusion, tales como transformacion directa de linfocitos B con DNA oncogenico, o transfeccion con virus Epstein- Barr. Vease, v.g., M. Schreier et al., “Hybridoma Techniques” (1980); Hammerling et al., “Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas” (1981); Kennett et al., “Monoclonal Antibodies” (1980); veanse tambien las Patentes U.S. NOs.

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4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890. Paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra EGFR pueden clasificarse respecto a diversas propiedades; a saber isotipo, epftopo, afinidad, etc. De particular interes son los anticuerpos monoclonales que mimetizan la actividad de EGFR o sus subunidades. Tales anticuerpos monoclonales pueden identificarse facilmente en ensayos de actividad de miembros de fijacion especffica. Anticuerpos de afinidad alta son utiles tambien cuando es posible la purificacion por inmunoafinidad de miembros de fijacion especffica nativos o recombinantes. Un anticuerpo monoclonal util en la practica de la presente invencion puede producirse por iniciacion de un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene un hibridoma que secreta moleculas de anticuerpo con la especificidad de antfgeno apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moleculas de anticuerpo en el medio. El medio que contiene el anticuerpo se recoge luego. Las moleculas de anticuerpo pueden aislarse despues adicionalmente por tecnicas bien conocidas.

Metodos para produccion de anticuerpos anti-EGFR monoclonales son tambien bien conocidos en la tecnica. Vease Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Tfpicamente, se utiliza el EGFR o un peptido analogo, sea solo o conjugado a un portador inmunogeno, como el inmunogeno en el procedimiento descrito anteriormente para produccion de anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Los hibridomas se seleccionan respecto a la capacidad para producir un anticuerpo que inmunorreaccione con el EGFR presente en celulas tumorfgenas, anormales o hiperproliferativas. Otros anticuerpos anti-EGFR incluyen, pero sin caracter limitante, el anticuerpo HuMAX-EGFR de Genmab/Medarex, el anticuerpo 108 (ATCC HB9764) y la Patente U.S. No. 6,217,866, y el anticuerpo 14E1 de Schering AG (Patente U.S. No. 5,942,602).

Anticuerpos Quimericos, Biespedficos y Fragmentos Recombinantes

En general, las regiones CDR, que comprenden secuencias de aminoacidos expuestas como las regiones CDR de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 estaran transportadas en una estructura que permite la fijacion de las regiones CDR a un antfgeno de tumor.

La estructura para el transporte de las CDRs de la invencion sera generalmente la de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o porcion sustancial de la misma en la cual las regiones CDR estan localizadas en posiciones correspondientes a la region CDR de dominios variables de anticuerpo VH y VL existentes naturalmente, codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse por referencia a Kabat, E. A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a edicion, US Department of Health and Human Services. 1987, y actualizaciones del mismo, disponibles ahora en Internet
(http://immuno.bme.nwu.edu)).

Las secuencias de aminoacidos expuestas como SEQ ID NO: 4, 5 y 6 son transportadas como las CDR 1, 2 y 3 en un dominio variable de cadena pesada humana o una porcion sustancial del mismo, y las secuencias de aminoacidos expuestas como SEQ ID NOs: 1, 2 y 3 son transportadas como las CDRs 1-3 respectivamente en un dominio variable de cadena ligera humana o una porcion sustancial del mismo.

Los dominios variables pueden derivarse de cualquier dominio variable humano de lfnea germinal o reordenado, o pueden ser un dominio variable sintetico basado en secuencias de consenso de dominios

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variables humanos conocidos. Las secuencias derivadas de CDR de la invencion, como se definen en el parrafo anterior, pueden introducirse en un repertorio de dominios variables que carecen de regiones CDR, utilizando tecnologfa de DNA recombinante. Por ejemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992,10:779-783) describen metodos de produccion de repertorios de dominios variables de anticuerpo en los cuales se utilizan cebadores de consenso dirigidos o adyacentes al extremo 5' del area del dominio variable en conjuncion con cebadores de consenso para la tercera region de entramado de genes VH humanos a fin de proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una o mas CDR. Marks et al describen adicionalmente de que modo puede combinarse este repertorio con una CDR de un anticuerpo particular. Utilizando tecnicas analogas, las secuencias derivadas de CDR de la presente invencion pueden desordenarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una o mas CDR, y los dominios VH y VL completos desordenados combinarse con un dominio VL o VH cognado para proporcionar anticuerpos de la invencion. El repertorio puede presentarse luego en un sistema hospedador adecuado tal como el sistema de presentacion de fago de WO 92/01047 de tal modo que pueden seleccionarse miembros de fijacion especffica adecuados. Un repertorio puede estar constituido por cualquier numero desde 104 miembros individuales en adelante, por ejemplo de 106 a 108 o 1010 miembros. Tecnicas de desordenamiento o combinatorias analogas han sido descritas tambien por Stemmer (Nature, 1994,370:389-391), que describe la tecnica en relacion con un gen de p-lactamasa pero observa que el metodo puede utilizarse para la generacion de anticuerpos.

Una alternativa adicional consiste en generar nuevas regiones VH o VL que llevan las secuencias derivadas de CDR de la invencion utilizando mutagenesis aleatoria de, por ejemplo, acido nucleico codificante de las CDRs de VH o VL de mAb175 para generar mutaciones dentro del o de los dominios. Dicha tecnica ha sido descrita por Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), que utilizaron PCR propensa a error. Otro metodo que puede utilizarse es dirigir la mutagenesis a regiones CDR de genes VH o VL. Tales tecnicas han sido descritas por Barbas et al, (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) y por Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263:551567). Todos los metodos arriba descritos se conocen como tales en la tecnica y no forman parte en si mismos de la presente invencion. Las personas expertas seran capaces de utilizar dichos metodos para proporcionar miembros de fijacion especffica de la invencion utilizando metodologfa rutinaria en la tecnica.

Una porcion sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprendera al menos las tres regiones CDR. Residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que no estan asociados normalmente con regiones de dominio variable existentes naturalmente. Por ejemplo, la construccion de anticuerpos de la presente invencion producidos por tecnicas de DNA recombinante puede dar como resultado la introduccion de residuos N-o C-terminales codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonacion u otros pasos de manipulacion. Otros pasos de manipulacion incluyen la introduccion de enlazadores para unir dominios variables de la invencion a secuencias de protefna adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo en la produccion de diacuerpos) o marcadores de protefnas como se expone con mayor detalle mas adelante.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden comprender ademas regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, anticuerpos basados en SEQ ID NOs: 1-3 pueden unirse en su extremo C- terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpos que incluyen cadenas Ck o CA humanas. Analogamente, anticuerpos basados en SEQ ID NOs: 4-6 pueden unirse en su extremo C-terminal a la

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totalidad o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, v.g. IgG, IgA, IgE, IgD e IgM y cualquiera de las subclases isotipo, particularmente IgG1, IgG2b, e IgG4.

La aplicacion de ingenierfa molecular para convertir mAbs murinos en mAbs quimericos (region V de raton, region C humana) y reactivos humanizados en los que solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del mAb son de origen murino ha sido crftica para el exito clfnico de la terapia con mAb. Los mAbs construidos por ingenierfa genetica tienen inmunogenicidad acusadamente reducida o ausente, semivida en suero aumentada, y la porcion humana Fc del mAb aumenta el potencial para reclutar los efectores inmunes del complemento y celulas citotoxicas. Investigaciones en la biodistribucion, farmacocinetica y cualquier induccion de una respuesta inmune a mAbs administrados clfnicamente requiere el desarrollo de analisis para discriminar entre las protefnas farmaceuticas y endogenas.

Los anticuerpos, o cualesquiera fragmentos de los mismos, pueden conjugarse o fusionarse tambien recombinantemente a cualquier toxina celular, bacteriana o de otro tipo, v.g. exotoxina de pseudomonas, ricina, o toxina de la difteria. La parte de la toxina utilizada puede ser la toxina entera, o cualquier dominio particular de la toxina. Tales moleculas anticuerpo-toxina han sido utilizadas con exito para direccionamiento y terapia de diferentes clases de canceres, vease v.g. Pastan, Biochim Biofys Acta. 1997 Oct 24; 1333(2):C1-6; Kreitman et al., N Engl J Med. 2001 Jul 26;345(4):241-7; Schnell et al., Leukemia. 2000 Jan; 14(1):129-35; Ghetie et al., Mol Biotechnol. 2001 Jul; 18(3):251-68.

Pueden formarse multfmeros bi-y tri-especfficos por asociacion de diferentes moleculas scFv, y han sido disenados como reactivos de reticulacion para reclutamiento de celulas T en tumores (inmunoterapia), redireccionamiento viral (terapia genica) y como reactivos de aglutinacion de los globulos rojos de la sangre (inmunodiagnosticos), vease v.g. Todorovska et al., J Immunol Methods. 2001 Feb 1; 248(1-2):47-66; Tomlinson et al., Methods Enzymol. 2000; 326:461-79; McCall et al., J Immunol. 2001 May 15; 166(10):6112-7. Pueden prepararse anticuerpos totalmente humanos por inmunizacion de ratones transgenicos que llevan porciones grandes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas humanas. Estos ratones, ejemplos de los cuales son el Xenomouse™ (Abgenix, Inc.) (Patentes U.S. NOs. 6,075,181 y 6,150,584), el HuMAb-Mouse™ (Medarex, Inc./GenFarm) (Patentes U.S. 5545806 y 5569825), el TransChromo Mouse™ (Kirin) y el KM Mouse™ (Medarex/Kirin), son bien conocidos en la tecnica. Los anticuerpos pueden prepararse luego por, v.g. la tecnica estandar del hibridoma o por presentacion de fago. Estos anticuerpos contendran entonces unicamente secuencias de aminoacidos totalmente humanas. Anticuerpos plenamente humanos pueden generarse tambien utilizando presentacion de fago de bibliotecas humanas. La presentacion de fago puede realizarse utilizando metodos bien conocidos por el profesional experto, como en Hoogenboom et al y Marks et al (Hoogenboom HR y Winter G. (1992) J Mol Biol. 227(2):381-8; Marks JD et al (1991) J Mol Biol. 222(3):581-97; y tambien en las Patentes U.S. 5885793 y 5969108).

Anticuerpos terapeuticos y usos

Las propiedades in vivo, particularmente con relacion a la ratio tumor: sangre y la tasa de aclaramiento, de los anticuerpos de la invencion seran al menos comparables a mAb175. Despues de la administracion a un individuo humano o animal, dicho miembro de fijacion especffica exhibira una ratio pico de tumor a sangre >1:1. Preferiblemente, a dicha ratio el miembro de fijacion especffica tendra tambien una ratio de tumor a organo mayor

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que 1:1, preferiblemente mayor que 2:1, mas preferiblemente mayor que 5:1. Preferentemente, a dicha ratio el miembro de fijacion especffica tendra tambien una ratio de organo a sangre < 1:1 en organos alejados del sitio del tumor. Estas ratios excluyen los organos de catabolismo y secrecion del miembro de fijacion especffica administrado.

Los anticuerpos de la invencion pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Marcadores detectables

o A A oo OC C-'l C7 CQ

incluyen, pero sin caracter limitante, radiomarcadores tales como los isotopos H, C, P, S, Cl, Cr, Co, Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213Bi, 99Tc y 186Re, que pueden unirse a los anticuerpos de la invencion utilizando qufmica convencional conocida en la tecnica de la formacion de imagenes de anticuerpos. Los marcadores incluyen tambien marcadores fluorescentes y marcadores utilizados convencionalmente en la tecnica para imagenes MRI-CT. Los mismos incluyen tambien marcadores enzimaticos tales como peroxidasa de rabano picante. Los marcadores incluyen ademas restos qufmicos tales como biotina que pueden detectarse por fijacion a un resto detectable cognado especffico, v.g. avidina marcada. Los marcadores funcionales incluyen sustancias que estan disenadas para direccionarse al sitio de un tumor para causar la destruccion del tejido tumoral. Tales marcadores funcionales incluyen farmacos citotoxicos tales como 5-fluorouracilo o ricina, y enzimas tales como carboxipeptidasa o nitrorreductasa bacterianas, que son capaces de convertir profarmacos en farmacos activos en el sitio de un tumor.

Los anticuerpos 175 y/o sus subunidades pueden poseer ciertas aplicaciones de diagnostico y pueden utilizarse por ejemplo para el proposito de detectar y/o medir condiciones tales como cancer, lesiones pre-cancerosas, condiciones relacionadas con o resultantes del crecimiento celular hiperproliferativo, o analogas. Los anticuerpos 175 radiomarcados y sus fragmentos, son utiles en tecnicas diagnosticas in vitro y en tecnicas de obtencion de radioimagenes in vivo asf como en radioinmunoterapia. En el caso de la obtencion de imagenes in vivo, los anticuerpos de la presente invencion pueden conjugarse a un agente de obtencion de imagenes en lugar de uno o mas radioisotopos, incluyendo pero sin caracter limitante un agente intensificador de imagenes de resonancia magnetica, en donde por ejemplo una molecula de anticuerpo esta cargada con un gran numero de iones paramagneticos por medio de grupos quelantes. Ejemplos de grupos quelantes incluyen EDTA, porfirinas, poliaminas, eteres corona y polioximas. Ejemplos de iones paramagneticos incluyen gadolinio, hierro, manganeso, renio, europio, lantano, holmio y ferbio. Los anticuerpos 175 radiomarcados y sus fragmentos, particularmente radioinmunoconjugados, son utiles en radioinmunoterapia, particularmente como anticuerpos radiomarcados para terapia del cancer.

Los anticuerpos 175 radiomarcados y sus fragmentos, son utiles en tecnicas de cirugfa radioinmuno-guiadas, en donde aquellos pueden identificar e indicar la presencia y/o localizacion de celulas de cancer, celulas pre- cancerosas, celulas tumorales, y celulas hiperproliferativas, antes de, durante o despues de cirugfa para eliminar tales celulas. Los inmunoconjugados o protefnas de fusion de anticuerpos de la presente invencion, en donde los anticuerpos 175 y sus fragmentos de la presente invencion estan conjugados o unidos a otras moleculas o agentes incluyen adicionalmente, pero sin limitacion, anticuerpos 175 conjugados a un agente qufmico de ablacion, toxina, inmunomodulador, citocina, agente citotoxico, agente quimioterapeutico o farmaco.

La radioinmunoterapia (RAIT) ha entrado en la clfnica y demostrado eficacia utilizando diversos inmunoconjugados de anticuerpos. El anticuerpo del antfgeno anti-carcinoembrionario (anti-CEA) humanizado marcado con 131I, hMN-

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14, ha sido evaluado en el cancer colorrectal (Behr TM et al (2002) Cancer 94(4Suppl): 1373-81) y el mismo anticuerpo con marcador 90Y ha sido valorado en el carcinoma medular de tiroides (Stein R et al (2002) Cancer 94(1 ):51 -61). La radioinmunoterapia utilizando anticuerpos monoclonales ha sido evaluada y comunicada para el linfoma no-Hodgkin's y el cancer de pancreas (Goldenberg DM (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2):195-201; Gold DV et al (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39 (1-2) 147-54). Metodos de radioinmunoterapia con anticuerpos particulares se describen tambien en las Patentes U.S. 6,306,393 y 6,331,175. La cirugfa radioinmunoguiada (RIGS) ha entrado tambien en la clfnica y demostrado eficacia y utilidad, incluyendo la utilizacion de anticuerpos anti-CEA y anticuerpos dirigidos contra antfgenos asociados a tumores (Kim JC et al (2002) Int J Cancer 97(4):542-7; Schneebaum S et al (2001) World J Surg 25(12):1495-8; Avital S et al (2000) Cancer 89(8):1692-8; McIntosh DG et al (1997) Cancer Biother Radiofarm 12 (4):287-94).

Los anticuerpos de la presente invencion pueden administrarse a un paciente que precise tratamiento por cualquier ruta adecuada, usualmente por inyeccion en el torrente sangufneo o CSF, o directamente en el sitio del tumor. La dosis precisa dependera de varios factores, que incluyen si el anticuerpo es para diagnosis o para tratamiento, el tamano y la localizacion del tumor, la naturaleza precisa del anticuerpo (si es un anticuerpo entero, fragmento, diacuerpo, etc.), y la naturaleza del marcador detectable o funcional unido al anticuerpo. En el caso de un anticuerpo utilizado para terapia, una dosis simple maxima adecuada es aproximadamente 45 mCi/m2, hasta un maximo de aproximadamente 250 mCi/m2. La dosificacion preferible esta comprendida en el intervalo de 15 a 40 mCi, con un intervalo de dosis preferido adicional de 20 a 30 mCi, o 10 a 30 mCi. Dicha terapia puede requerir reemplazo de medula osea o de celulas madre. Una dosis de anticuerpos tfpica para obtencion de imagenes de tumor o tratamiento de un tumor estara comprendida en el intervalo de 0,5 a 40 miligramos, preferiblemente de 1 a 4 mg de anticuerpo en la forma F(ab')2. Los anticuerpos desnudos se administran preferiblemente en dosis de 20 a 1000 mg de protefna por dosis, o 20 a 500 mg de protefna por dosis, o 20 a 100 mg de protefna por dosis. Esta es una dosis para un solo tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para muchachos y ninos de corta edad, y ajustarse tambien para otros formatos de anticuerpo en proporcion al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, 2 veces por semana, seminal o mensualmente, a discrecion del medico. Estas formulaciones pueden incluir una segunda protefna de fijacion, tal como las protefnas de fijacion de EGFR descritas anteriormente. En una forma especialmente preferida, esta segunda protefna de fijacion es un anticuerpo monoclonal tal como 528 o 225, considerados mas adelante.

Composiciones Farmaceuticas y Terapeuticas

Los anticuerpos de la presente invencion se administraran usualmente en forma de una composicion farmaceutica, que puede comprender al menos un componente ademas del miembro de fijacion especffica. Asf, las composiciones farmaceuticas segun la presente invencion, y para uso segun la presente invencion, pueden comprender, ademas del ingrediente activo, un excipiente, portador, tampon o estabilizador farmaceuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por los expertos en la tecnica. Tales materiales deben ser no toxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependera de la ruta de administracion, que puede ser oral, o por inyeccion, v.g. intravenosa.

Las composiciones farmaceuticas para administracion oral pueden presentarse en forma de tableta, capsula, polvo o lfquido. Una tableta puede comprender un portador solido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones

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farmaceuticas liquidas comprenden generalmente un portador lfquido tal como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Puede incluirse solucion salina fisiologica, dextrosa u otra solucion de sacarido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyeccion intravenosa, o inyeccion en el sitio de afliccion, el ingrediente activo se encontrara en forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable que esta exenta de pirogenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Quienes poseen experiencia relevante en la tecnica estan perfectamente capacitados para preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehfculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer o inyeccion de Ringer lactada. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, en caso requerido.

Una composicion puede administrarse sola o en combinacion con otros tratamientos, terapeuticas o agentes, sea simultanea o secuencialmente dependiendo de la condicion a tratar. Adicionalmente, la presente invencion contempla e incluye composiciones que comprenden el miembro de fijacion, particularmente anticuerpo o fragmento del mismo, descrito en esta memoria y otros agentes o terapeuticas tales como agentes o terapeuticas anti-cancer, hormonas, agentes o anticuerpos anti-EGFR, o inmunomoduladores. Mas generalmente, estos agentes anti-cancer pueden ser inhibidores de tirosina-quinasa o inhibidores de la cascada de fosforilacion, moduladores posteriores a la traduccion, inhibidores del crecimiento o la division celular (v.g. anti-mitoticos), o inhibidores de transduccion de senales. Otros tratamientos o terapeuticas pueden incluir la administracion de dosis adecuadas de farmacos de alivio del dolor tales como farmacos anti-inflamatorios no esteroidales (v.g. aspirina, paracetamol, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiaceos tales como morfina, o anti-emeticos. La composicion puede administrarse en combinacion (sea secuencialmente (es decir antes o despues) o simultaneamente) con inhibidores de tirosina-quinasa (que incluyen, pero sin caracter limitante, AG1478 y ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668), doxorrubicina, temozolomide, cisplatino, carboplatino, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo, citosina-arabinosido, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina, lomustina, y/u otros agentes quimioterapeuticos. Asf, estos agentes pueden ser agentes anti-EGFR especfficos, o inhibidores de tirosina-quinasa tales como AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, o SU-6668 o puede ser agentes anti-cancer y anti-neoplasticos mas generales tales como doxorrubicina, cisplatino, temozolomida, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo, citosina-arabinosido, ciclofosfamida, epipodofilotoxin, carmustina, o lomustina. Adicionalmente, la composicion puede administrarse con hormonas tales como dexametasona, inmunomoduladores, tales como interleucinas, factor de necrosis de tumores (TNF) u otros factores de crecimiento o citocinas que estimulan la respuesta inmune y la reduccion o eliminacion de celulas de cancer o tumores. Un inmunomodulador tal como TNF puede combinarse junto con un miembro de la invencion en forma de un anticuerpo biespecffico que reconoce el epftopo EGFR 806 fijandose tambien a los receptores de TNF. La composicion puede administrarse tambien con, o puede incluir combinaciones junto con otros anticuerpos anti-EGFR, incluyendo, pero sin caracter limitante, los anticuerpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62 y ABX-EGF.

Con anterioridad, el uso de agentes tales como doxorrubicina y cisplatino en asociacion con anticuerpos anti-EGFR ha producido actividad anti-tumor mejorada (Fan et al, 1993; Baselga et al, 1993). La combinacion de doxorrubicina y mAb 528 daba como resultado la erradicacion total de xenoinjertos establecidos de A431, mientras que el tratamiento con cualquiera de los agentes solo causaba unicamente inhibicion temporal del crecimiento in vivo (Baselga et al, 1993). Analogamente, la combinacion de cisplatino y cualquiera de mAb 528 o 225 conducfa

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tambien a la erradicacion de xenoinjertos A431 bien establecidos, lo que no se observaba cuando se utilizo tratamiento con cualquiera de los agentes (Fan et al, 1993).

Radioterapia Convencional

Adicionalmente, la presente invencion contempla e incluye composiciones terapeuticas para uso del anticuerpo en combinacion con radioterapia convencional. Se ha indicado que el tratamiento con anticuerpos direccionados a los receptores de EGF puede mejorar los efectos de la radioterapia convencional (Milas et al., Clin Cancer Res.2000 Feb: 6(2):701 8, Huang et al., Clin Cancer Res. 2000 Jun: 6(6):2166 74).

Se contemplan combinaciones del anticuerpo 175 o fragmento del mismo y terapeuticas anti-cancer, demostrando particularmente las terapeuticas anti-EGFR, con inclusion de otros anticuerpos anti-EGFR, terapia eficaz, y particularmente sinergia, contra tumores xenoinjertados. La combinacion de AG1478 y mAb175 es una combinacion ilustrativa de este tipo. AG1478 (4-(3-cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina) es un inhibidor potente y selectivo de la quinasa del receptor de EGF y se describe particularmente en la Patente de los Estados Unidos No. 5,457,105 (vease tambien, Liu, W. et al (1999) J. Cell Sci. 112:2409; Eguchi, S. et al (1998) J. Biol. Chem. 273:8890; Levitsky, A. y Gazit, A. (1995) Science 267:1782). Se preve y se contempla la sinergia terapeutica del anticuerpo 175 con otros anticuerpos anti-EGFR, particularmente con el anticuerpo anti-EGFR 528.

La presente invencion contempla ademas composiciones terapeuticas utiles en la practica de los metodos terapeuticos de esta invencion. Una composicion terapeutica objeto incluye, en mezcla, un excipiente farmaceuticamente aceptable (portador) y uno o mas anticuerpos 175 o fragmento del mismo, como se describe en esta memoria como ingrediente activo. En una realizacion preferida, la composicion comprende un antfgeno capaz de modular la fijacion especffica del presente miembro de fijacion/anticuerpo con una celula diana.

La preparacion de composiciones terapeuticas que contienen polipeptidos, analogos o fragmentos activos como ingredientes activos es bien conocida en la tecnica. Tfpicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, sea como soluciones lfquidas o suspensiones. Sin embargo, pueden prepararse tambien formas solidas adecuadas para disolucion en, o suspension en un lfquido antes de la inyeccion. La preparacion puede emulsionarse tambien. El ingrediente terapeutico activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol, o analogos y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, si se desea, la composicion puede contener cantidades menores de sustancias adyuvantes tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH que mejoran la eficacia del ingrediente activo. Un polipeptido, analogo o fragmento activo puede formularse en la composicion terapeutica como formas salinas neutralizadas farmaceuticamente aceptables. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la molecula de polipeptido o anticuerpo) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, los acidos clorhfdrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y analogos. Sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres pueden derivarse tambien de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etil-amino-etanol, histidina, procafna, y analogas.

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Las composiciones terapeuticas que contienen polipeptido, analogo, o fragmento activo se administran convencionalmente por via intravenosa, tal como por inyeccion de una dosis unitaria, por ejemplo. El termino “dosis unitaria“ cuando se utiliza con referencia a una composicion terapeutica de la presente invencion se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para humanos, concediendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el diluyente requerido; es decir, portador, o vehfculo.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion, y en una cantidad terapeuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del individuo a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para utilizar el ingrediente activo, y el grado de capacidad de fijacion de EGFR deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para administracion dependen del criterio del especialista y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, dosis adecuadas pueden comprender desde aproximadamente 0,1 a 20, con preferencia aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10, y mas preferiblemente 1 a varios miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo al dfa, y dependen de la ruta de administracion. Los regfmenes adecuados para administracion inicial y dosis de refuerzo son tambien variables, pero estan tipificados por una administracion inicial seguida por dosis repetidas a intervalos de una o mas horas por inyeccion u otra administracion subsiguiente. Alternativamente, se contempla la infusion intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones de 10 nanomolar a 10 micromolar en la sangre.

Las composiciones farmaceuticas para administracion oral pueden encontrarse en forma de tableta, capsula, polvo, o lfquido. Una tableta puede comprender un portador solido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmaceuticas lfquidas comprenden generalmente un portador lfquido tal como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Pueden incluirse solucion salina fisiologica, dextrosa u otra solucion de sacarido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Para inyeccion intravenosa o inyeccion en el sitio de afliccion, el ingrediente activo se encontrara en la forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable que esta exenta de pirogenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Quienes poseen una experiencia relevante en la tecnica estan perfectamente capacitados para preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehfculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer o inyeccion de Ringer lactada. En caso requerido, pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Ensayos de diagnostico

La presente invencion se refiere tambien a una diversidad de aplicaciones diagnosticas, que incluyen metodos para detectar la presencia de estfmulos tales como EGFR expresado de modo aberrante, por referencia a su capacidad para ser reconocido por el presente anticuerpo 175. Aplicaciones diagnosticas del o los anticuerpos de la presente invencion incluyen aplicaciones in vitro bien conocidas y estandar para el profesional experto, y basadas en la presente descripcion. Ensayos diagnosticos y kits para evaluacion in vitro y evaluacion del estatus de EGFR, particularmente con respecto a la expresion aberrante de EGFR, pueden utilizarse para diagnosticar, evaluar y monitorizar muestras de pacientes que incluyen aquellos que padecen o se sospecha que padecen cancer, una condicion pre-cancerosa, una condicion relacionada con crecimiento celular hiperproliferativo, o de una muestra de tumor. La valoracion y evaluacion del estatus EGFR es util tambien en la determinacion de la idoneidad de un

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paciente para una prueba clfnica de un farmaco o para la administracion de un agente quimioterapeutico o miembro de fijacion especffica particular, particularmente un anticuerpo de la presente invencion, con inclusion de combinaciones del mismo, frente a un agente o anticuerpo diferente. Este tipo de monitorizacion y evaluacion diagnostica se encuentra ya en practica utilizando anticuerpos contra la protefna HER2 en el cancer de mama (Test de Hercep, Dako Corporation), donde el ensayo se utiliza tambien para evaluar pacientes para terapia de anticuerpos utilizando Herceptina. Las aplicaciones in vivo incluyen la obtencion de imagenes de tumores o evaluacion del estatus de cancer de individuos, con inclusion de la obtencion de radioimagenes.

Como se ha sugerido anteriormente, el metodo diagnostico de la descripcion comprende examinar una muestra de celulas o medio mediante un ensayo que incluye una cantidad eficaz de un antagonista para un EGFR/protefna, tal como un anticuerpo anti-EGFR, preferiblemente mAb175 como se proporciona en esta memoria. Adicionalmente, es preferible que las moleculas de anticuerpo anti-EGFR utilizadas en esta memoria se encuentren en la forma de porciones Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) o moleculas de anticuerpo enteras. Como se ha expuesto previamente, pacientes capaces que pueden beneficiarse de este metodo incluyen aquellos que padecen cancer, una lesion pre-cancerosa, una infeccion viral, patologfas que implican o son resultado de crecimiento celular hiperproliferativo u otro trastorno patologico analogo.

La presencia de EGFR en las celulas puede averiguarse por los procedimientos inmunologicos usuales in vitro o in vivo aplicables a tales determinaciones. Se conocen varios procedimientos utiles. Los procedimientos y su aplicacion son todos ellos familiares para los expertos en la tecnica, y segun ello pueden utilizarse dentro del alcance de la presente descripcion. En tales procedimientos, el EGFR forma complejos con uno o mas anticuerpos o parejas de fijacion y un miembro del complejo se marca con un marcador detectable. El hecho de que se ha formado un complejo y, en caso deseado, la cantidad del mismo, puede determinarse por metodos conocidos aplicables a la deteccion de marcadores. Los marcadores empleados mas habitualmente para estos estudios son elementos radiactivos, enzimas, productos qufmicos que emiten fluorescencia cuando se exponen a luz ultravioleta, y otros. Se conocen varios materiales fluorescentes que pueden utilizarse como marcadores. Estos incluyen, por ejemplo, fluorescefna, rodamina, auramina, Rojo Texas, azul AMCA y Amarillo Lucifer. El anticuerpo EGFR o EGFR 175 puede marcarse tambien con un elemento radiactivo o con una enzima. El marcador radiactivo puede detectarse por cualquiera de los procedimientos de conteo disponibles actualmente. El isotopo preferido puede seleccionarse de 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213Bi, 99Tc y 186Re. Son

tambien utiles marcadores enzimaticos, que pueden detectarse por cualquiera de los metodos colorimetricos, espectrofotometricos, fluoroespectrofotometricos, amperometricos o gasometricos utilizados actualmente. La enzima se conjuga con la partfcula seleccionada por reaccion con moleculas formadoras de puentes tales como carbodiimidas, diisocianatos, aldehfdo glutarico y analogos. Muchas enzimas que pueden utilizarse en estos procedimientos se conocen y pueden ser utilizadas. Las preferidas son peroxidasa, 13-glucuronidasa, I3-D- glucosidasa, 13-D-galactosidasa, ureasa, glucosa-oxidasa mas peroxidasa y fosfatasa alcalina. Se hace referencia a las Patentes U.S. NOs. 3,654,090; 3,850,752; y 4,016,043 a modo de ejemplo para su descripcion de materiales y metodos de marcacion alternativos.

En un ejemplo adicional, pueden prepararse kits de test comerciales adecuados para uso por un medico especialista a fin de determinar la presencia o ausencia de expresion aberrante de EGFR, con inclusion, pero sin caracter limitante, de EGFR amplificado y/o una mutacion de EGFR, en celulas diana sospechosas. De acuerdo con las

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tecnicas de ensayo expuestas anteriormente, una clase de tales kits contendra al menos el EGFR marcado o su pareja de fijacion, por ejemplo un anticuerpo especffico para el mismo (anticuerpo 175), e instrucciones, por supuesto, dependiendo del metodo seleccionado, v.g., “competitivo”, “sandwich”, “DASP” y analogos. Los kits pueden contener tambien reactivos perifericos tales como tampones, estabilizadores, etc.

Conforme a lo anterior, puede prepararse un kit de test para la demostracion de la presencia o capacidad de celulas para expresion aberrante o formas aberrantes de EGFR, que comprende:

(a) una cantidad predeterminada de al menos un componente reactivo marcado inmunoqufmicamente obtenido por la fijacion directa o indirecta del anticuerpo 175 o una pareja de fijacion especffica del mismo, a un marcador detectable;

(b) otros reactivos; y

(c) instrucciones para uso de dicho kit.

Conforme a lo anterior, puede prepararse un sistema de ensayo para seleccion de farmacos potenciales eficaces para modular la actividad del EGFR, o la expresion aberrante de EGFR, y/o la actividad o fijacion del anticuerpo (particularmente anticuerpo 175). El receptor o el anticuerpo puede introducirse en un sistema de test, y el farmaco prospectivo puede introducirse tambien en el cultivo de celulas resultante, examinandose despues de ello el cultivo a fin de observar cualesquiera cambios en la actividad de fase S de las celulas, debida a a la adicion del farmaco prospectivo solo, o debida al efecto de las cantidades anadidas del o los agentes conocidos.

Acidos Nucleicos

La presente invencion proporciona adicionalmente un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo 175 de la presente invencion. El acido nucleico incluye DNA y RNA. En un aspecto preferido, la presente invencion proporciona un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion como se ha definido arriba.

La presente invencion proporciona tambien constructos en la forma de plasmidos, vectores, casetes de transcripcion o expresion que comprenden al menos un polinucleotido como se ha indicado arriba. La presente invencion proporciona tambien una celula hospedadora recombinante que comprende uno o mas constructos como se ha indicado arriba. Un acido nucleico que codifica cualquier anticuerpo 175 como se proporciona forma en si mismo un aspecto de la presente invencion, como lo hace un metodo de produccion del anticuerpo, metodo que comprende expresion del acido nucleico codificante para ello. La expresion puede lograrse convenientemente por cultivo en condiciones apropiadas de celulas hospedadoras recombinantes que contienen el acido nucleico. Despues de la produccion por expresion, puede aislarse y/o purificarse un miembro de fijacion especffica utilizando cualquier tecnica adecuada, y utilizarse despues segun sea apropiado.

Los anticuerpos y moleculas y vectores de acido nucleico codificante de acuerdo con la presente invencion pueden proporcionarse aislados y/o purificados, v.g. a partir de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u

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homogenea, o, en el caso de acido nucleico, exentos o sustancialmente exentos de acido nucleico o genes de origen distinto que la secuencia codificante de un polipeptido con la funcion requerida. El acido nucleico segun la presente invencion puede comprender DNA o RNA y puede ser total o parcialmente sintetico. Sistemas para clonacion y expresion de un polipeptido en una diversidad de celulas hospedadoras diferentes son bien conocidos. Celulas hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, celulas de mamffero, levaduras y sistemas de baculovirus. Linajes de celulas de mamffero disponibles en la tecnica para expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de crfa de hamster, celulas de melanoma de raton NSO y muchas otras. Un hospedador bacteriano comun preferido es E.coli. La expresion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en celulas procariotas tales como E.coli esta bien establecida en la tecnica. Para revision, vease por ejemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresion en celulas eucariotas en cultivo esta disponible tambien para los expertos en la tecnica como opcion para la produccion de un miembro de fijacion especffica, vease por ejemplo para revisiones recientes, Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560. Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, con inclusion de secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilacion, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias en caso apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, virales, v.g. de fago, o fagemido, en caso apropiado. Para detalles adicionales vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edicion, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para manipulacion de acido nucleico, por ejemplo en la preparacion de constructos de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de DNA en celulas y expresion genica, asf como analisis de protefnas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, 2a edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Asf, un aspecto adicional de la presente invencion proporciona una celula hospedadora que contiene acido nucleico codificante de un anticuerpo como se describe en esta memoria. Otro aspecto adicional proporciona un metodo que comprende introducir dicho acido nucleico en una celula hospedadora. La introduccion puede emplear cualquier tecnica disponible. La introduccion puede seguirse causando o permitiendo la expresion del acido nucleico, v.g. por cultivo de celulas hospedadoras en condiciones para la expresion del gen. En una realizacion, el acido nucleico de la invencion se integra en el genoma (v.g. cromosoma) de la celula hospedadora. La integracion puede promoverse por inclusion de secuencias que promueven recombinacion con el genoma, segun tecnicas estandar. La presente invencion proporciona tambien un metodo que comprende utilizar un constructo como se ha indicado arriba en un sistema de expresion a fin de expresar un anticuerpo o polipeptido como se ha indicado arriba.

Como se ha expuesto anteriormente, la presente invencion se refiere tambien a una molecula o gen clonado de DNA recombinante, o una variante degenerada del mismo, que codifica un anticuerpo 175 o un fragmento del mismo, que posee una secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, y 6; preferiblemente una molecula de acido nucleico. Como es bien conocido en la tecnica, las secuencias de DNA pueden expresarse enlazando operativamente las mismas a una secuencia de control de la expresion en un vector de expresion apropiado y empleando dicho vector de expresion para transformar un hospedador unicelular apropiado.

En la seleccion de una secuencia de control de la expresion, se consideraran normalmente una diversidad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la concentracion relativa del sistema, su controlabilidad, y su compatibilidad con la secuencia de DNA o gen particular a expresar, particularmente en lo que respecta a estructuras potenciales

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secundarias. Los hospedadores unicelulares adecuados se seleccionaran considerando, v.g., su compatibilidad con el vector seleccionado, sus caractensticas de secrecion, su capacidad para plegar correctamente las protemas, y sus requerimientos de fermentacion, asf como la toxicidad para el hospedador del producto codificado por las secuencias de DNA a expresar, y la facilidad de purificacion de los productos de expresion. Considerando estos y otros factores, una persona experta en la tecnica podra construir una diversidad de combinaciones vector/secuencia de control de la expresion/hospedador que expresaran las secuencias de DNA de esta invencion en fermentacion o en cultivo animal en gran escala.

Analogos, tales como fragmentos, puede producirse, por ejemplo, por digestion con pepsina de uno o mas peptidos o material de anticuerpos. Otros analogos, tales como mutemas, pueden producirse por mutagenesis orientada estandar de secuencias codificantes de miembros de fijacion espedfica. Los analogos que exhiben actividad afm al anticuerpo 175 tales como moleculas pequenas, tanto si funcionan como promotores o como inhibidores, pueden identificarse por ensayos in vivo y/o in vitro conocidos. Una secuencia de DNA que codifica un anticuerpo 175 puede prepararse por smtesis en vez de clonarse. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleotidos solapantes preparados por metodos estandar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Vease, v.g., Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). Las secuencias de DNA sintetico permiten la construccion comoda de genes que expresaran analogos de miembros de fijacion espedfica o “mutemas”. Alternativamente, pueden producirse mutemas codificantes de DNA por mutagenesis orientada de genes de miembros de fijacion espedfica nativos o cDNAs, y pueden producirse directamente mutemas utilizando smtesis convencional de polipeptidos. Un metodo general para incorporacion espedfica del sitio de aminoacidos no naturales en protemas se describe en Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (abril 1989). Este metodo puede utilizarse para crear analogos con aminoacidos no naturales.

La invencion puede comprenderse mejor haciendo referencia a los Ejemplos no limitantes siguientes, que se proporcionan como ilustrativos de la invencion. Los ejemplos que siguen se presentan a fin de ilustrar mas detalladamente las realizaciones preferidas de la invencion y no debenan interpretarse en modo alguno, sin embargo,

como limitantes de alcance general de la invencion.

EJEMPLO 1 SUMARIO

El EGFR existe en dos conformeros bien definidos - restringido y no restringido. El conformero restringido, que se ha observado unicamente en formas del receptor exentas de ligando (y parcialmente ligadas), puede ser inducido por un ligando para formar el conformero no restringido, espalda con espalda. mAb806 reconoce un epftopo en algunas formas truncadas, sobreexpresadas o activadas del EGFR en la superficie celular, pero no reconoce el EGFR en las celulas normales no estimuladas. Otro anticuerpo afm, mAb175, reconoce tambien este epftopo inusual. Los presentes inventores han determinado las estructuras 3D del epftopo del peptido EGFR287-302 unido a Fabs de los anticuerpos mAb806 y mAb175. En presencia del anticuerpo, el epftopo del peptido adopta una

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conformacion muy similar a la encontrada en ambas formas del receptor. Sin embargo, la fijacion de los anticuerpos mAb806 o mAb175 a la estructura de EGFR tipo salvaje estarfa prohibida por conflictos estericos importantes del Fab con el dominio CR1 en ambas conformaciones restringida y no restringida. El examen de la conformacion 3D del dominio CR1 sugerfa que la rotura de un enlace disulfuro inmediatamente delante del epftopo deberfa permitir que el dominio CR1 se abriera lo suficiente para permitir la fijacion de cualquiera de los anticuerpos. El mutante cistina EGFR C271A/C283A no solo se fija a mAb806 y mAb175, sino que la estequiometria es 1:1 (es decir equivalente a mAb 528 que reconoce el dominio de fijacion de ligando de EGFR L2). Mientras que mAb806 falla en cuanto a la inhibicion del crecimiento in vitro de celulas que expresan EGFR tipo salvaje, mAb806 inhibe completamente, expresando la estimulacion asociada al ligando de las celulas BaF/3 EGFRc271a/c283a. Los resultados obtenidos por los presentes inventores indican que los mecanismos de fijacion de los anticuerpos mAb806 y mAb175 requieren una forma del EGFR en la que el epftopo esta expuesto preferentemente durante la activacion del receptor o por truncacion o sobreexpresion. Como secuencia, y en contraste con otros anticuerpos de EGFR, mAb806 se localiza preferentemente en el tumor en los pacientes de cancer que sobreexpresan el EGFR. El mecanismo de accion sugiere nuevos metodos para la generacion de anticuerpos para deteccion de tumores y para la mejora de la ratio anticuerpo/inhibidor de la destruccion de las celulas de cancer con formas sobreexpresadas, truncadas o activadas de receptores en la familia EGFR.

SIGNIFICACION

El EGFR esta involucrado en la estimulacion del crecimiento de muchos tumores humanos. Aunque se han utilizado inhibidores y antagonistas como agentes terapeuticos, el exito se ha visto limitado, en parte por interferir con el EGFR en los tejidos normales y en parte por la accion temporal limitada de algunos de los agentes; es decir Abs que tienen accion mas duradera. Los anticuerpos mAb806 y mAb175 reconocer una conformacion inusual del receptor, que existe a menudo en las celulas tumorales, pero no en las celulas normales. El sitio de fijacion tridimensional de estos anticuerpos en el EGFR identifica la conformacion inusual, lo que explica su especificidad tumoral. Estos anticuerpos actuan sinergicamente con otros agentes anti-EGFR para inducir una destruccion profunda del tumor en los ratones. Los resultados iniciales en pacientes de cancer utilizando formas radiomarcadas de los anticuerpos confirman la selectividad para el tumor.

INTRODUCCION

La comprension de la activacion del EGFR por su familia de ligandos ha sido retadora, pero estudios geneticos elegantes (1-3), bioffsicos (4-8) y mas recientemente cristalograficos (9-17) han revelado muchos de la serie compleja de cambios de conformacion y eventos de agregacion requeridos para activar el dominio tirosina-quinasa intracelular del EGFR (18). Entre estas complejidades es evidente que, en solucion, el dominio extracelular de EGFR adopta al menos dos conformaciones fundamentales: una conformacion restringida inactiva y un dfmero active no restringido o extendido, unido a ligando “espalda con espalda”. El EGFR fue el primer receptor de factor de crecimiento que se asocio al cancer (19; 20). El EGFR es activado por ligandos autocrinos (19; 21; 22) y, en una elevada proporcion de gliomas avanzados, el dominio extracelular del receptor de EGFR esta truncado (23; 24) y como consecuencia activado. A menudo, se requiere la activacion del EGFR para el mantenimiento del estado maligno. Inversamente, excepto para un pequeno numero de celulas en los folfculos capilares y la glandula de Brunner, en organismos adultos el EGFR se expresa a niveles bajos y es inactivo durante la vida adulta.

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Se han desarrollado dos clases principales de agentes para direccionamiento al EGFR: inhibidores de tirosina- quinasa (TKI's) y an ticuerpos monoclonales (mAb's). Los TKI's tales como gefitinib (ZD1839) y erlotinib (OSI-774) se fijan competitivamente a la bolsa de ATP de EGFR para inhibir su activacion. En contraste, los anticuerpos contra EGFR, tales como cetuximab (C 225) y panitumumab (ABX-EGFR) inhiben competitivamente la fijacion de ligando y previenen con ello la activacion del receptor. Ambas clases de inhibidores y anticuerpos exhiben actividad antitumoral importante en una gama de modelos de xenoinjerto de raton dependientes de EGFR (25-29), habiendo sido aprobadas ambas en canceres seleccionados que incluyen NSCL, pancreatico, de cabeza y cuello, y de colon (30-32). Si bien las tasas de respuesta a estas terapeuticas de EGFR son modestas, se espera que la identificacion con exito de subconjuntos de pacientes que respondan analogamente al bloqueo de EGFR sera capaz de mejorar los resultados para los pacientes. En el glioma, por ejemplo, la respuesta a Tarceva parece restringida en gran parte a un subconjunto de pacientes que son positivos dobles para EGFR A2-7 (designado tambien EGFRvIII), la truncacion extracelular del EGFR expresada comunmente en el glioma, y PTEN (33). Si bien estas terapeuticas son prometedores, su uso esta restringido por toxicidades limitantes de la dosis, tales como erupcion en la piel, que es resultado de una absorcion importante de estos agentes en la piel normal donde la expresion de EGFR es notable.

Muchos gliomas sobreexpresan EGFR (23;24), debido predominantemente a la amplificacion del gen EGFR. La amplificacion del gen EGFR en el glioma esta asociada tambien con un evento de mutacion que conduce a la escision de los exones 2-7 (34) y la expresion subsiguiente de una forma truncada EGFR A2-7 parcialmente activada del EGFR (35;36), arriba mencionada. El EGFR A2-7 contiene un peptido de fusion unico el termino N, resultante del empalme de los exones 1 y 8 y la insercion de una unica glicina. Varios anticuerpos monoclonales dirigidos a este peptido juntural han sido descritos (34) y representan por tanto terapeuticas potenciales especfficas para el EGFR A2-7. Los presentes inventores generaron un panel de anticuerpos espedficos EGFR A2-7 utilizando celulas NR6 (como variante de 3T3 desprovista de miembro endogeno de la familia EGFR) que sobreexpresan este EGFR truncado. Si bien exhiben una fijacion fuerte al EGFR A2-7, algunos de estos anticuerpos se fijan tambien a EGFR tipo salvaje cuando esta sobreexpresado, pero no cuando el mismo se expresa a niveles fisiologicos. El mejor descrito de estos anticuerpos, mAb806 (35; 37; 38), parece no fijarse a celulas que expresen menos de 1 x 105 EGFR en su superficie, pero solo donde niveles de expresion mayores conducen a una poblacion diferenciada de EGFR reactivo con mAb806 (5-10 % de la poblacion total del receptor) (35, 37,38).

Estudios subsiguientes de mapeado de epftopos han demostrado que mAb806 se fija a un bucle cistefna corto entre los aminoacidos 287-302 en el dominio extracelular que esta expuesto solo transitoriamente cuando el EGFR cambia desde la conformacion restringida a la extendida (23,28). Asf, la reactividad de mAb 826 se encuentra solo en celulas con condiciones favorables para la anulacion de la restriccion del receptor, tales como la presencia de mutaciones (v.g., EGFR A2-7), sobreexpresion o activacion del receptor. En el caso de sobreexpresion de EGFR, parece existir una anulacion incrementada de la restriccion como resultado tanto de activacion de EGFR independiente de ligando como de cambios en la glicosilacion (39). Estas condiciones son comunes en las celulas tumorales, pero son raras en los tejidos normales, permitiendo por ello que mAb806 se direccione preferentemente a las celulas tumorales en comparacion con los tejidos normales, tales como el hfgado. De hecho, los resultados de la prueba clfnica de Fase I completada recientemente por los autores de la presente invencion con una version quimerica de mAb806 demuestran que el epftopo direccionado por este anticuerpo no se expresa en tejido normal, pero es accesible en una gama de tumores EGFR-positivos (28; 40). En los xenoinjertos, mAb806 tiene una actividad anti-tumor fuerte contra las celulas del glioma U87MG que expresan el EGFR A2-7, asf como una gama de

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otros modelos que sobreexpresan el EGFR tipo salvaje en ausencia de esta mutacion (28; 40). Adicionalmente, mAb806 exhibe actividad sinergica anti-tumor en modelos animales cuando se utiliza en combinacion con otras terapeuticas de EGFR, con inclusion de inhibidores de EGFR-quinasa (27) y anticuerpos (41), con epftopos no afines.

La secuencia de aminoacidos de EGFR entre los residuos cistefna 287 y 302 es suficiente para la fijacion de mAb806. Sin embargo, mientras que la truncacion encontrada en el EGFR A2-7 expone claramente este bucle de cistefna para la fijacion por mAb806, el mecanismo de fijacion de mAb806-EGFR tipo salvaje ha sido resuelto solo parcialmente. La estructura cristalina del EGFR se ha resuelto tanto para el dominio extracelular de longitud total como para el fragmento EGFR-ECD1-501 unido al ligando. El analisis de estas estructuras demuestra que mAb806 no podrfa fijarse al EGFR restringido como se observa en la estructura ECD de longitud total (13) o al dfmero no restringido, unido al ligando espalda con espalda observado con los constructos EGFR-ECD1-501 (14) o EGFR-ECD1- 621 (42). Por esta razon, los autores de la presente invencion han propuesto que mAb806 se fija a una forma parcialmente no restringida del EGFR tipo salvaje que existe entre los estados inactivo y activo. La incapacidad de mAb806 para fijarse al EGFR ligado no restringido se confirmo ulteriormente por preincubacion de EGFR tipo salvaje que expresaba celulas BaF/3 con EGF en condiciones que prevenfan la internalizacion del receptor. En estas condiciones, un porcentaje mayoritario del EGFR deberfa formar dfmeros ligados espalda con espalda, previniendo asf la fijacion de mAb806; observacion que se confirmo claramente (43). Sin embargo, el efecto del ligando sobre la fijacion de mAb806 en estado estacionario, tal como podrfa ocurrir en celulas con un bucle autocrino fuerte EGFR/ligando, se desconoce. Es interesante que, mientras que la fijacion de mAb806 al EGFR tipo salvaje de la superficie celular es dependiente de la conformacion del receptor, en el sentido inmunologico, el epftopo no es conformacional, dado que mAb806 es una sonda excelente para EGFR en transferencias Western, es decir, es capaz de reconocer el receptor desnaturalizado. Evidentemente, la accesibilidad al epftopo tal como se determina por la conformacion de EGFR, es el factor mas crftico en lo que respecta a la fijacion de mAb806, no la conformacion del epftopo propiamente dicho. MAb806 se fija tambien a EGFR inmovilizado en plastico y chips de resonancia de plasmones de superficie (37).

En este informe, se describe, tambien la actividad biologica, especificidad y epftopo de otros anticuerpos, generados de igual manera que mAb806. A fin de comprender la especificidad singular de estos anticuerpos, se determinaron las estructuras 3D para el epftopo del peptido mAb806 (EGFR 287-302) unido al fragmento Fab de mAb806 y mAb175 y los fragmentos Fab libres. La orientacion de EGFR287-302 en el receptor y la conformacion de este peptido unido al anticuerpo confirmaron que mAb806 tiene que unirse a una forma especffica del EGFR y que esta forma tiene que plegarse de un modo diferente al EGFR tipo salvaje observado en la conformacion restringida o extendida. Utilizando mutaciones puntuales, los autores de la invencion han examinado la influencia de un bucle cistefna adyacente (aminoacidos 271-283) en la estructura de EGFR, y la reactividad mAb806/175 en este bucle parece restringir severamente la fijacion de estos anticuerpos. Se expone la eficacia de mAb806 y 175 contra xenoinjertos DU145, un linaje de celulas de prostata que posee un bucle de estimulacion autocrina TGF-a/EGFR fuerte, y la fijacion de mAb806 radiomarcado a un paciente de cancer de cabeza y cuello tratado en un escenario de Fase I (44).

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RESULTADOS

Especificidad de mAb175

Estudios de fijacion preliminares sugerfan que mAb175 exhibfa especificidad similar para EGFR que mAb806. En las regiones CDR de mAb806 (IgG2b) y mAb175 (IgG1), las secuencias de aminoacidos son practicamente identicas, con solo un aminoacido de diferencia en cada una (Figura 1). Todas estas diferencias preservan la carga y el tamano de las cadenas laterales. Claramente, estos anticuerpos se han generado de modo independiente.

Se condujeron una serie de experimentos de inmunohistoqufmica para analizar la especificidad de fijacion de mAb175. mAb175 tine secciones de xenoinjertos A431 que sobreexpresan el EGFR (Figura 2A) y secciones de xenoinjertos de glioma U87MG.A2-7 que expresan el EGFR A2-7 (Figura 2A). En contraste, mAb175 no tine las secciones de xenoinjertos U87MG. El linaje de celulas U87MG expresa solo niveles modestos del EGFR tipo salvaje (Figura 2A) y carece de bucle autocrino de EGFR detectable. Y lo que es mas importante, mAb175 no se fija a secciones de hfgado humano normal (Figura 2B). Asf, mAb175 parece demostrar la misma especificidad que mAb806; es decir, detecta EGFR humano sobreexpresado y truncado, pero no el EGFR tipo salvaje expresado a niveles modestos.

Identificacion del epftopo de mAb175

Dado que mAb175 se fija tambien al EGFRA2-7, en el cual estan delecionados los aminoacidos 6-273, y EGFR1-501, el epftopo de mAb175 tiene que estar contenido dentro de los residuos 274-501. Durante la determinacion del epftopo de mAb806, se expresaron una serie de fragmentos EGFR marcados con c-myc fusionados al termino carboxi de GH humano, todos los cuales terminaban en el aminoacido 501 (45; 46). El mAb175 reaccionaba tambien con ambos fragmentos de EGFR 274-501 y 282-501 en transferencias Western, pero no detectaba fragmentos que comenzaran en el aminoacido 290 o 298 (Figura Suplementaria 9). La presencia de todas las protefnas de fusion GH-EGFR se confirmo utilizando el anticuerpo c-myc, 9E10 (Figura Suplementaria 9). Por tanto, un determinante crftico del epftopo Pde mAb175 esta localizado cerca del aminoacido 290. Por ultimo, un fragmento 274-501 de EGFR con el epftopo de mAb806 delecionado (EGFR A 287-302) era tambien negativo para fijacion de mAb175 (Figura 9), lo que sugerfa que esta region determinaba analogamente la mayor parte de la fijacion de mAb175.

Se utilizo un segundo metodo para caracterizar adicionalmente el epftopo de mAb175. Fragmentos que abarcaban dominios extracelulares del EGFR se expresaron en la superficie de levadura y se testaron respecto a fijacion de mAb175 por inmunofluorescencia indirecta utilizando citometrfa de flujo. El mAb175 reconocfa el fragmento de levadura 273-621, que corresponde al dominio extracelular del EGFR A2-7, pero no a los fragmentos 1-176, 1-294, 294-543 o 475-621 (Figures 3A y 3B). Asf, al menos parte del epftopo mAb175 tiene que estar contenido dentro de la region entre los aminoacidos 274-294, coincidiendo con los datos de inmunotransferencia de los autores de la invencion utilizando fragmentos de EGFR. Dado que mAb175 se fija al fragmento desnaturalizado del 273-621 (Figura 3C), el epftopo tiene que ser de naturaleza lineal (Figura Suplementaria 9). Esta claro que mAb806 y mAb175 reconocen una region y conformacion similares del EGFR.

Utilizando resonancia de plasmones de superficie (BIAcore) se investigo la fijacion de mAb175 al peptido EGFR

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(287CGADSYEMEEDGVRKC302(SEQ ID NO: 14)).El EGFR287-302 se inmovilizo en la superficie del biosensor utilizando qmmicas de acoplamiento de amina, intercambio tiol-disulfuro o Pms-Ser. El ultimo metodo inmoviliza el peptido exclusivamente por la cistema N-terminal (47). mAb175 se urna al EGFR287-302 en todas las orientaciones (Tabla 1). La afinidad de mAb175 para EGFR287-302 variaba desde 35 nM para acoplamiento Pms-serina a 154 nM para acoplamiento de amina. En todos los casos, la afinidad de fijacion de mAb175 para EGFR287-302 era menor que la obtenida para mAb806 (Tabla 1). Se determino tambien la afinidad de mAb175 para dos fragmentos extracelulares diferentes del EGFR. mAb175 se fijaba al fragmento 1-501 con una afinidad similar a la obtenida utilizando el peptido (16 nM frente a 35 nM) (Tabla 1). Como era de esperar, la afinidad de mAb175 contra el dominio extracelular de longitud total 1-621, que puede formar la conformacion restringida, era mucho menor (188 nM). Aunque mAb806 y mAb175 tienen afinidades similares para EGFR287-302, mAb175 parece presentar una afinidad mayor para el dominio extracelular del EGFR (Tabla 1). Claramente, el epftopo de mAb175 esta contenido dentro del EGFR287-302 y, como mAb806, la afinidad de fijacion al dominio extracelular del EGFR es dependiente de la conformacion.

Tabla 1: Determinacion BIAcore de afinidades de los anticuerpos para la fijacion de mAb806 y mAb175 a los

epftopos de EGFR

Fragmento de EGFR

Kd para mAb175 (nM) Kd para mAb806 (nM)

287-302 (acoplamiento Pms-Ser)

35 16

287-302 (acoplamiento de Tiol)

143 84

287-302 (acoplamiento de amina)

154 85

1-501 (no puede formar restriccion)

16 34

1-621 (puede formar restriccion)

188 389

El panel de mutantes del fragmento 273-621 de EGFR, expresado en la superficie de levadura (45; 46), se utilizo para caracterizar la estructura fina del epftopo mAb175. mAb175 y mAb806 exhibfan un patron practicamente identico de reactividad con los mutantes (Tabla 2). La rotura del enlace disulfuro 287-302 tema solo un efecto moderado sobre la creatividad del epftopo, dado que el anticuerpo se fijaba a todos los mutantes en C287 y a algunos pero no todos los mutantes en C302 (Tabla 2). Aminoacidos crfticos para la fijacion de mAb175 incluyen E293, G298, V299, R300 y C302 (Tabla 2). mAb175 parecfa moderadamente mas sensible a las mutaciones V299 y D297, pero mAb806 exhibfa tambien fijacion reducida a algunas mutaciones en estos sitios (Tabla 2). Una vez mas, el epftopo mAb175 parece ser esencialmente igual que el epftopo reconocido por mAb806.

Tabla 2: Presentacion de las mutaciones del epftopo 287-302 de EGFR en levadura y registros de fijacion para

mAb806 y mAb175

Mutante de EGFR

Fijacion de mAb806 Fijacion de mAb175

C287A

+ +

C287G

+ +

Mutante de EGFR

Fijacion de mAb806 Fijacion de mAb175

C287R

+ +

C287S

+ +

C287W

+ +

C287Y

+ +

G288A

+ + + +

A289K

+ + + +

D290A

+ + + +

S291A

+ + + +

Y292A

+ + + +

E293A

+ +

E293D

+ +

E293G

+ +

E293K

- -

M294A

+ + + +

E295A

+ + + +

E296A

+ + + +

D297A

+ + + en contacto

D297Y

+ +

G298A

+ +

G298D

- -

G298S

- -

V299A

+ + + en contacto

V299D

- -

V299K

+ + + en contacto

R300A

+ + + +

R300C

+ +

R300P

- -

K301A

+ + + +

K301E

+ +

C302A

- -

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Mutante de EGFR

Fijacion de mAb806 Fijacion de mAb175

C302F

+ +

C302G

- -

C302R

+ +

C302S

- -

C302Y

+ +

Eficacia de mAb175 contra xenoinjertos de tumor estimulados por EGFR A 2-7 o un bucle autocrino de EGFR

Se examino la actividad anti-tumor in vivo de mAb806 y mAb175 contra xenoinjertos de glioma U87MG.A2-7. Se dejo que los xenoinjertos se establecieran durante 6 dfas antes del comienzo de la terapia de anticuerpos (3 veces por semana durante 2 semanas los dfas indicados). En este momento, el volumen medio del tumor era 100 mm3 (Figura 4A). El tratamiento con mAb175 dio como resultado una reduccion en la tasa de crecimiento global del tumor comparado con el tratamiento con vehfculo o mAb806 y era muy significativo el dfa 19 despues de la inoculacion (P < 0,0001 frente al control y P < 0,002 frente a ma 806), cuando el grupo de control se sacrifico por razones eticas. El volumen medio del tumor en este momento era 1530, 300 y 100 mm3 para los grupos de tratamiento con vehfculo, mAb806 y mAb175, respectivamente (Figura 4A), confirmando que mAb175 presenta actividad anti-tumor contra los xenoinjertos que expresan el EGFR A2-7.

Aun cuando las celulas U87MG expresan aproximadamente 1 X 105 EGFR por celula, mAb806 no es capaz de reconocer EGFR alguno de la superficie y, lo que no es sorprendente, no inhibe el crecimiento in vivo de U87MG. Adicionalmente, estas celulas no co-expresan ligando alguno de EGFR. Se ensayo si el epftopo de EGFR se expone transitoriamente y es por tanto susceptible de ser reconocido por mAb806 y mAb175 en celulas que contienen un bucle autocrino de EGFR. El linaje de celulas de prostata DU145 expresa el EGFR tipo salvaje a niveles similares al observado en las celulas U87MG, pero, al contrario que las celulas U87MG, las celulas DU145 contienen una amplificacion del gen TGF-a y exhiben por tanto un bucle autocrino EGFR/TGF-a. Tanto mAb175 como 806 se fijan a las celulas DU145 como se determino por analisis FACS (Figura 4B) y ambos son capaces de inmunoprecipitar una pequena proporcion del EGFR extrafdo de estas celulas (Figura 4C). Ambas tecnicas demostraban mayor fijacion de mAb175; sin embargo, cuando se comparaba con mAb 528, que se fija al dominio L2, mAb175 y mAb806 se fijan solo a un subconjunto de EGFR en la superficie de estas celulas (Figura 4B y 4C). Se hicieron observaciones similares con un segundo linaje de celulas de prostata (LnCap); (datos no presentados) y un linaje de colon (LIM1215) los dos cuales contienen tambien bucles autocrinos de EGFR (22;48). Claramente, mAb806 y mAb175 pueden reconocer solo una pequena proporcion del EGFR en las celulas en presencia de un bucle de estimulacion autocrino.

Dado que mAb175 y mAb806 se fijan mas eficazmente al EGFR expresado en celulas DU145 que en celulas U87MG, se realizo un estudio para analizar la actividad anti-tumor de estos anticuerpos en xenoinjertos DU145 desarrollados en ratones lampinos. Se dejo que los xenoinjertos se establecieran durante 18 dfas antes del comienzo de la terapia (3 veces por semana durante 3 semanas los dfas indicados). En este momento, el volumen medio del tumor era 90 mm3 (Figura 4D). Tanto mAb175 como mAb806 inhibfan el crecimiento de los xenoinjertos

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DU145. El grupo de control se sacrifico el dfa 67 y tenia un volumen medio de tumor de 1145 mm3 comparado con 605 y 815 mm3 para los grupos mAb806 y mAb175 respectivamente (p < 0,007 and 0,02 respectivamente) (Figura 4D).

Estructura 3D de EGFR287-302 en contacto con los fragmentos Fab de mAb806 y mAb175

Con objeto de comprender los detalles moleculares del modo en que mAb806 y mAb175 podrfan reconocer EGFR en algunas, pero no todas las conformaciones, se determinaron las estructuras cristalinas de fragmentos Fab para ambos anticuerpos en complejos con el epitopo de EGFR287-302 oxidado (a resolucion 2,0 y 1,59 A respectivamente, Figuras 5A y 5B) y solos (a resolucion 2,3 A y 2,8 A, respectivamente). En ambos casos, las estructuras Fab libre y complejada eran esencialmente iguales y las conformaciones del peptido y los bucles CDR de los anticuerpos eran bien definidas (Figura 5). El epitopo adopta una estructura de cinta p, con un borde de la cinta apuntando hacia el Fab y V299 oculto en el centro del sitio de fijacion de antfgeno (Figura 5C-E). Ambos extremos del epitopo estan expuestos a disolvente, lo que es consistente con el hecho de que estos anticuerpos fijan polipeptidos mucho mas largos.

De los 20 residuos de anticuerpo en contacto con el epitopo, existen solamente dos sustituciones entre mAb806 y mAb175 (Figura 1). Los residuos de contacto de mAb175 son: S30, S31, N32, Y49, H50, Y91, F94, W96 en la cadena ligera, y D32, Y33, A34, Y51, S53, Y54, S55, N57, R59, A99, G100, R101 en la cadena pesada; los residuos de contacto de mAb806 son los mismos, con diferencias de secuencia para la cadena ligera, N30 y la cadena pesada, F33. EGFR287-302 se fija al Fab por contactos estrechos entre los residuos peptfdicos 293-302, teniendo lugar la mayor parte de los contactos entre los residuos 297 y 302. Los unicos enlaces de hidrogeno entre los atomos de la cadena principal de EGFR287-302 y el Fab corresponden a los residuos 300 y 302 (Figura 5F). El reconocimiento de la secuencia del epitopo ocurre a traves de enlaces de hidrogeno de la cadena lateral con los residuos E293 (a H50 y R101 del Fab), D297 (a Y51 y N57), R300 (a D32) y K301 (por moleculas de agua a Y51 y W96). Contactos hidrofobos tienen lugar en G298, V299 andy C302.

La conformacion de la cadena principal del epitopo entre 293 y 302 era esencialmente identica en los cristales de Fab806 y Fab175 (desviacion rms = 0,4 A, para los atomos Ca en estos residuos). Aunque constrenido por el enlace disulfuro, el termino N del peptido (287-292) no esta en contacto significativo con ninguna estructura de anticuerpo, y las conformaciones en esta region difieren. No obstante, este segmento en el complejo Fab806 aparece bastante desordenado. Y lo que es mas interesante, la conformacion del peptido EGFR287-302 en contacto con los anticuerpos esta relacionada muy estrechamente con la conformacion de EGFR287-302 observada en la cadena principal de las estructuras de EGFR restringida o no restringida (Li et al., 2005; Garrett et al., 2002). Para EGFR287-302 del complejo Fab175, las desviaciones rms en las posiciones Ca son 0,66 y 0,75 A, respectivamente (Figura 5).

Para tener una idea mas clara en cuanto al reconocimiento de EGFR por mAb806 y mAb175, se estudio la conformacion del peptido EGFR287-302 oxidado marcado con 15N por espectroscopfa NMR en solucion, libre y en presencia de 806 Fab (veanse los Datos Suplementarios para detalles). Para el peptido libre, se asignaron resonancias y se compararon con las correspondientes a un serpentfn caprichoso. Esencialmente, el peptido libre adoptaba una estructura de serpentfn caprichoso, no la cinta beta como se observaba en el EGFR nativo (14). Por

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adicion del Fab, se observaban cambios de resonancia. Sin embargo, debido a la debil senal procedente del ensanchamiento importante de las lfneas despues de adicion del Fab y la cristalizacion con exito de los complejos, la estructura en solucion del complejo Fab806-epftopo no se continuo. Sin embargo, evidentemente, cuando el peptido se fija al fragmento Fab de mAb806 (o mAb175) parece ser que el Fab selecciona o induce la conformacion del peptido que coincide con dicho peptido en el receptor nativo.

^Por que reconocen mAb806 y mAb175 solamente algunas conformaciones de EGFR? Se acoplo el fragmento Fab de mAb175 a un dominio extracelular de EGFR (monomeros restringidos y no restringidos) por superposicion de EGFR287-302. Para un fragmento como A2-7 no habfa conflictos estericos importantes con el receptor. En la forma no restringida habfa sustancialmente mas area superficial accesible del Fab oculta (920 A2 comparada con 550 A2 en la forma restringida). Por tanto, este antfgeno puede establecer contactos adicionales con regiones del anticuerpo distintas de CDR, como se indica por los mutantes de expresion de levadura (45). Inversamente, acoplando el ectodominio de EGFR entero al Fab, se produce un solapamiento espacial sustancial con la parte del dominio CR1 que precede al epftopo (residuos 187-286) y que pasa por el centro del Fab (Figura 5D, E). Por tanto, dado que el dominio CR1 tiene esencialmente la misma estructura en las conformaciones restringida o no restringida, mAb806 o mAb175 seran incapaces de fijarse a cualquier forma de EGFR. Claramente, tiene que existir una diferencia entre la orientacion del epftopo con respecto al dominio CR1 en cualquiera de las conformaciones conocidas del EGFR tipo salvaje y la orientacion que permite la fijacion del epftopo. La inspeccion del dominio CR1 indicaba que el enlace disulfuro (271-283) que precede a EGFR287-302 constrine el polipeptido que bloquea el acceso al epftopo; serfa de esperar que la rotura de este disulfuro, aun cuando no esta involucrada en la fijacion directa a los anticuerpos, permitiera el despliegue parcial del dominio CR1 de tal modo que mAb175 o mAb806 pudieran lograr acceso al epftopo.

La rotura del enlace disulfuro de EGFR 271-283 aumenta la fijacion de mAb806

Los enlaces disulfuro de las protefnas proporcionan rigidez estructural incrementada, pero en algunos receptores de la superficie celular, particularmente los de citocinas y factores de crecimiento, la rotura transitoria de enlaces disulfuro y el intercambio de disulfuro pueden controlar la funcion del receptor (49). Dado que este era un mecanismo por el cual mAb806 y mAb175 podrfan lograr acceso a su sitio de fijacion, se intento aumentar la accesibilidad del epftopo por mutacion de uno cualquiera o ambos residuos cistefna en las posiciones 271 y 283 a residuos alanina (C271A/C283A). Los vectores capaces de expresar EGFR C271A-, C283A-o C271A/C283A-de longitud total se transfectaron en el linaje de celulas Ba/F3 dependientes de IL-3. Se seleccionaron clones Ba/F3 estables que expresaban el EGFR C271A y C271A/C283A mutante a niveles equivalentes al EGFR tipo salvaje (Figura 6A). No se observaron celulas Ba/F3 que expresaran niveles altos de EGFR C283A mutante. Como se ha descrito anteriormente, el EGFR tipo salvaje reacciona debilmente con mAb806; sin embargo, los receptores mutantes reaccionaban con igual fuerza con mAb528, mAb806 y el anticuerpo anti-FLAG, lo que sugerfa que el receptor se expresa en la superficie de la celula, esta plegado correctamente y que el epftopo para mAb806 es completamente accesible en tales casos. Para confirmar que mAb806 reconoce el mutante C271A/C283A mas eficientemente que el EGFR tipo salvaje, se determino la ratio de mAb806 que se fijaba a la fijacion de mAb528. Dado que tanto el EGFR tipo salvaje como C271A/C283A estaban marcados en el terminal N con FLAG, se determino tambien la ratio de fijacion de mAb806 y mAb528 al anticuerpo M2. Como se indicado anteriormente, mAb806 reconocfa solo una pequena proporcion del EGFR tipo salvaje total expresado en la superficie de las

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celulas Ba/F3 (la ratio de fijacion mAb806/528 es 0,08) (Tabla 3). En contraste, MAb806 reconocfa virtualmente la totalidad del EGFR mutante C271A/C283A expresado en la superficie celular (una ratio de fijacion mAb806/528 de 1,01) (Figura 6A y Tabla 3).

Tabla 3: Reactividad de mAb806 reactivity con celulas que expresan el EGFR tipo salvaje o EGFR C271A/C283A

Ratios de fijacion de anticuerpo

Linaje de celulas

mAb 528/M2 mAb806/M2 mAb806/mAb 528

EGFR-FLAG tipo salvaje

1,37 0,11 0,08

EGFR tipo salvaje

- - 0,07

C271/283A*

1,08 ± 0,10 1,09 ± 0,38 1,01 ± 0,13

*Media de 4 clones independientes

La mutacion de las dos cistefnas no ponfa en compromiso la fijacion de EGF o la funcion del receptor. Las celulas BaF3 que expresan el EGFR 271A/C283A mutante proliferan en presencia de EGF (Figura 6B). Se ha observado reproduciblemente un desplazamiento a la izquierda en la curva dosis-respuesta para EGF en celulas que expresan las mutaciones C271A/C283, lo que sugiere mayor afinidad para el ligando, o un potencial de senalizacion intensificado para el receptor mutante. El analisis por transferencia western confirmo que el mutante C271A/C283A se expresa a niveles similares al EGFR tipo salvaje y esta fosforilado en la tirosina en respuesta a la estimulacion de EGFR (Figura 6C). Consistentemente con estudios previos en otros linajes de celulas, mAb806 no tiene efecto alguno sobre la proliferacion inducida in vitro por EGF proliferation de celulas Ba/F3 que expresan el EGFR tipo salvaje, mientras que el mAb 528 bloqueante del ligando inhibe por completo la proliferacion inducida por EGF de estas celulas (Figura 6D, panel izquierdo). En contraste, mAb806 eliminaba totalmente por ablacion la proliferacion inducida por EGFR en celulas BaF3 que expresaban el mutante C271/283A (Figura 6D, panel derecho). Cuando se rompe el bucle de cistefnas 271-283, no solo mAb806 se fija mas eficazmente, sino que una vez fijado, mAb806 previene la proliferacion inducida del ligando.

Estudio de Imagen en Fase I en el Cancer de Cabeza y Cuello

Ocho pacientes [1 mujer y 3 varones; edad media de 61 anos (intervalo 44-75)] completaron esta prueba en fase 1 como se indica (44). Todos los pacientes satisfacfan los criterios de inclusion y, excepto para el paciente 8 (que padecfa un tumor primario cerebral), todos ellos padecfan enfermedad metastasica al comienzo del studio. En todos los pacientes se observaba la absorcion del anticuerpo por el tumor, y 111In-ch806, la version chermerizada de mAb806, demostraba una absorcion rapida y de alto nivel en el tumor (Figura 7). El aclaramiento de 111In-ch806 de los organos normales (hfgado, pulmones, rinon y bazo) no exhibfa diferencia alguna entre los niveles de dosis (44). En particular, el aclaramiento del hfgado no exhibfa diferencia alguna entre los niveles de dosis, lo que indicaba la ausencia de compartimiento de antfgeno saturable en el hfgado para ch806. La absorcion total en el hfgado era un maximo de 14,45 ± 2,43 %ID inmediatamente despues de la infusion, y descendfa a 8,45 ± 1,63 %ID a las 72 horas, y 3,18 ± 0,87 %ID una semana despues de la infusion. Esto esta en contraste acusado con la absorcion de anticuerpos para EGFR tipo salvaje (v.g. 225), que se ha demostrado alcanza mas de 30 %ID en el hfgado (para una dosis de 40 mg) durante mas de 3 dfas despues de la infusion (50).

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La absorcion pico medida del tumor de 111In-ch806 ocurrfa 5-7 dfas despues de la infusion. El calculo de la absorcion cuantitativa del tumor en los pacientes 1 y 3 no pudo realizarse exactamente debido a la proximidad de la lesion diana al conjunto de sangre cardiaco y el movimiento del paciente. La absorcion pico de ch806 en el tumor oscilaba desde 5,21 a 13,73 x 10"3 %ID/g de tejido tumoral. El calculo de la concentracion real de ch806 en el tumor indicaba valores pico de (media ± SD) 0,85 ± 0 pg/g (5 mg/m2), 0,92 ± 0 pg/gm (10mg/m2), 3,80 ± 1,10pg/gm (20mg/m2), y 7,05 ± 1,40pg/gm (40mg/m2).

DISCUSION

Cuando los niveles de actividad del EGFR o el erbB2 affn se perturban, anticuerpos tales como cetuximab y herceptina, que estan direccionados a miembros de la familia EGFR, son opciones importantes para tratamiento del cancer. La determinacion de los sitios de fijacion para estos anticuerpos, las estructuras 3D tanto de los receptores diana como mas recientemente, los complejos anticuerpo: receptor, ha mejorado nuestra comprension del modo en que estos anticuerpos interfieren con la activacion del receptor. Estos estudios han sugerido tambien que el direccionamiento de otros epftopos en esta familia de receptores puede producir nuevas oportunidades para la utilizacion de combinaciones de anticuerpos a fin de mejorar el tratamiento del cancer.

Lamentablemente, todos los anticuerpos terapeuticos anti-EGFR disponibles actualmente reconocen el EGFR tipo salvaje, que se expresa practicamente en todos los tejidos normales. El EGFR expresado en los tejidos normales no solo representa un gran sumidero para los anticuerpos, sino que los mismos son probablemente crfticos en la toxicidad limitante de la dosis (tal como erupcion en la piel) observada y hacen imposible el uso de conjugados anticuerpo/citotoxico. A pesar de estos problemas, debe indicarse que la mayorfa de los tejidos normales parecen carecer de EGFR activado, por lo que la neutralizacion de los anticuerpos anti-EGFR parece no tener un efecto acusado sobre la senalizacion homeostatica vital. En contraste, muchos tumores contienen EGFR activado, sea por mecanismos autocrino/paracrino, truncacion, mutacion, amplificacion genica y/o sobreexpresion. Es importante que el EGFR activado parece contribuir a la tumorigenicidad por intensificacion del movimiento celular, proliferacion, invasion, angiogenesis y supervivencia de las celulas tumorales. Por consiguiente, la administracion de anticuerpos anti-EGFR o inhibidores de la EGFR-quinasa puede disminuir el crecimiento y la supervivencia de las celulas del tumor. Los anticuerpos dirigidos al peptido juntural unico en el EGFR A 2-7 tienen el potencial de direccionarse a varios tumores (51) sin las dificultades asociadas con la absorcion de tejido normal. En el glioma, la expresion del EGFR A 2-7 va acompanada por sobreexpresion del EGFR tipo salvaje que no serfa inhibido por otros anticuerpos EGFR A 2-7, pero deberfa ser inhibido por mAb806 o mAb175.

Previamente, los autores de la invencion han descrito un anticuerpo, mAb806, que fue generado contra celulas que expresan EGFR A 2-7. mAb806 no solo se fija a este receptor truncado, sino que se fija tambien a EGFR tipo salvaje sobreexpresado. MAb806 reconoce un epftopo contenido dentro de un bucle cistefna (aminoacidos 287-302) que es accesible en el EGFR A 2-7, pero no en el EGFR tipo salvaje cuando se expresa a niveles bajos a moderados en las celulas y en ausencia de ligandos. Analogamente, el dominio extracelular de longitud total purificado de EGFR (EGFR 1-621). Se encontro que el epftopo para este anticuerpo esta proximo a la region bisagra del dominio extracelular de EGFR que sufre cambio de conformacion durante la formacion del estado activo. Adicionalmente, el epftopo no solo esta oculto en la conformacion inactiva, sino que parece tambien estar inaccesible en el dfmero de EGFR no restringido unido a ligando espalda con espalda. Las interesantes propiedades de mAb806 incitaron a los

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autores de la invencion a reanalizar otros hibridomas que expresen los anticuerpos monoclonales aislados de la fusion inicial (38). En selecciones preliminares, uno de estos, mAb175, parecfa tener propiedades de fijacion de EGFR similares a mAb806. Las secuencias de aminoacidos dentro de sus bucles CDR son notablemente similares (90 % de identidad de secuencia), y estas diferencias preservan el tamano y la carga de la cadena lateral relevante. Al igual que mAb806, el mAb175 tine las celulas tumorales que sobreexpresan el EGFR o que expresan el EGFR A2-7, pero no las celulas con niveles moderados del EGFR tipo salvaje, v.g. el hfgado humano. Un mapeado de epftopos detallado demostro que mAb175 no solo se fija al mismo bucle de cistefna que mAb806, sino que tiene tambien un perfil de fijacion cuasi-identico a una serie de mutantes que contienen mutaciones puntuales en este bucle. Ademas, ninguno de los anticuerpos requerfa que el enlace disulfuro del epftopo estuviera intacto para la fijacion.

Tanto mAb806 como mAb175 poseen actividad antitumoral contra xenoinjertos de glioma humano que expresan el EGFR A2-7, y ambos inducen un retardo significativo en el crecimiento del tumor, aunque mAb175 parecfa ligeramente mas potente en este modelo. Es interesante que mAb806 y mAb175 se fijan al EGFR expresado en las celulas de prostata DU 145, un linaje de celulas que expresa niveles modestos de EGFR pero secreta una cantidad significativa de TGF-a (52) de manera autocrina. Como el caso de los linajes de celulas que sobreexpresan el EGFR, ambos anticuerpos fijan solamente una pequena proporcion del EGFR de la superficie en las celulas DU145. Sin embargo, los dos anticuerpos inhiben el crecimiento de los xenoinjertos de DU145 en ratones lampinos. Asf, parece que la presencia de ligando en condiciones fisiologicas aumenta la disponibilidad de la forma de transicion del EGFR reconocida por estos anticuerpos y que el direccionamiento de esta forma es suficiente para regular en sentido decreciente el crecimiento celular impulsado por EGFR.

Esta clase de anticuerpos anti-EGFR puede muy bien tener una accion antitumoral aun mayor que la considerada inicialmente. Ademas, la actividad sinergica de mAb806, cuando se utiliza en combinacion con otras terapeuticas de EGFR (41), sugiere un papel terapeutico inmediato para los anticuerpos de esta clase. mAb806 se fija tambien a las celulas tumorales que contienen mutaciones asociadas con el cancer que activan la quinasa de EGFR. mAb806 y mAb175 se fijan selectivamente a celulas que tienen un EGFR activado y pueden ser reactivos utiles para identificacion y/o monitorizacion de pacientes que respondan verosfmilmente a las terapeuticas de EGFR aprobadas actualmente.

Los estudios estructurales realizados por los autores de la invencion con el epftopo de EGFR287-302 indican que tanto mAb806 como mAb175 reconocfan el mismo motivo estructural 3D. Los residuos peptfdicos en contacto con mAb806 y mAb175 exhibfan estructuras casi identicas en ambos casos, lo que sugerfa que esta es la conformacion de estos aminoacidos, encontrados en EGFR A2-7, el antfgeno generador. De hecho, la cadena peptfdica principal de EGFR287-302 observada en las estructuras anticuerpo/peptido coincide estrechamente con la existente en las dos conformaciones conocidas de la estructura de EGFR. Sin embargo, la orientacion del epftopo en estas estructuras impedirfa el acceso del anticuerpo a los aminoacidos relevantes: esto es consistente con la observacion experimental de que el anticuerpo 806 no se fija a EGFR tipo salvaje. La inspeccion detallada de la estructura de EGFR generaba otra posibilidad interesante. El epftopo de EGFR287-302 cuelga de un segundo bucle unido por disulfuro (aminoacidos 271-283) y la rotura de este enlace disulfuro deberfa permitir el acceso al bucle de EGFR287- 302 sin cambiar la conformacion de la cadena principal del epftopo (vease la Figura 8). Los resultados obtenidos por los autores de la invencion con el mutante de EGFR C 271A/C 283A indican que el dominio CR1 debe abrirse para

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permitir que mAb806 y 175 se fijen estequiometricamente al receptor mutante. Este receptor mutante puede adoptar todavfa una conformacion nativa dado que es plenamente sensible a la estimulacion de EGF pero, al contrario que el EGFR tipo salvaje, es totalmente inhibido por mAb806.

En la superficie de las celulas que sobreexpresan el EGFR tipo salvaje, existe claramente una sub-poblacion de receptores en los cuales el epftopo de EGFR287-302 esta accesible para la fijacion de mAb806 o mAb175. Si bien el acceso ocurre muy facilmente durante la activacion del receptor, no esta claro todavfa si esta sub-poblacion de receptores son aquellos que se encuentran en transicion de conformacion a la forma no restringida, los que se hallan en transicion de la forma no restringida al estado ligado activado, o si existe una oxidacion incompleta en un subconjunto del EGFR en el cual el enlace disulfuro entre 271 y 283 se ha deteriorado (reducido). Si existe de hecho una forma reducida de EGFR en la superficie de las celulas del cancer, los datos de los inventores demuestran claramente que la misma es probablemente activa y capaz de iniciar la senalizacion celular. La capacidad de mAb806 para inhibir el crecimiento de xenoinjertos que sobreexpresan el EGFR tipo salvaje, a pesar de fijarse solamente a una pequena sub-poblacion de receptores y de no inhibir la senalizacion aguas abajo del EGFR, sigue siendo un enigma. Por esta razon, el concepto de que mAb806 se fija a un sub-conjunto unico de EGFR que tiene propiedades de senalizacion inusuales ha sido siempre atractivo, debido especialmente a su extraordinaria sinergia con otras terapeuticas de EGFR. Si existe en la superficie celular de las celulas de cancer, un EGFR reducido en el disulfuro 271-283 podrfa representar esta forma singular del EGFR. Finalmente, deberfa recordarse que, si bien la delecion en el EGFR A2-7 es muy grande, la misma termina en el aminoacido 273. El EGFR A2-7 carece de este enlace disulfuro y se sabe que tiene propiedades de senalizacion diferentes del EGFR tipo salvaje. Por otra parte, la activacion de las mutaciones de quinasa, los bucles autocrinos y la infra-glicosilacion del EGFR aumentan tambien la reactividad de mAb806 por aumentar la activacion del receptor, presumiblemente sin necesidad de romper el disulfuro 271-283. Estas observaciones respaldan el concepto de que el dominio CR1 puede plegarse para permitir el acceso a EGFR 287-302 en algun punto durante la activacion de EGFR, pero esta protegido contra el plegamiento en los estados restringido y fijado a ligando. Los inventores estan realizando actualmente estudios continuados para determinar si el EGFR reconocido por mAb806 contiene un enlace disulfuro 271-283 reducido.

El analisis de los resultados de nuestra prueba en Fase I de 806 quimerico (ch806) confirmo que el epftopo direccionado por mAb806 es especffico de tumor. El analisis cuantitativo de la biodistribucion demuestra claramente la absorcion rapida y especffica de ch806 en el tumor. Estos datos son consistentes con el direccionamiento cuantitativo maximo de anticuerpos a antfgenos expresados en celulas de cancer y notablemente superior a los valores de los anticuerpos de EGFR tipo salvaje para dosis equivalentes (44; 50). La absorcion de ch806 en todos los tejidos normales (con inclusion del hfgado) era baja, lo que indicaba la ausencia de pruebas de la fijacion a EGFR tipo salvaje en el tejido normal, y en el hfgado presentaba solo actividad en la agrupacion de sangre y un catabolismo poco importante de 111In-quelato libre. Esto se diferencia claramente de los anticuerpos que direccionan EGFR tipo salvaje (v.g. 225; cetuximab), que se ha demostrado tienen una absorcion muy alta (20-30 %ID) en hfgado retenida durante mas de 72 horas despues de la infusion, a pesar de administrarse grandes dosis de protefna (hasta 300 mg) (50). Adicionalmente, los anticuerpos para EGFR tipo salvaje requieren grandes dosis de carga para saturar el tejido normal antes que sea evidente la absorcion en el tumor (50), y tienen tambien una toxicidad limitante de la dosis de fijacion del anticuerpo a EGFR tipo salvaje en la piel y el intestino (53). Estos resultados indican que mAb806 no se direcciona al tejido normal en los humanos, y el analisis cuantitativo de la biodistribucion confirma la especificidad tumoral del epftopo de EGFR direccionado por mAb806 in vivo.

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El direccionamiento del epftopo de EGFR287-302 con anticuerpos derivados de mAb806 o mAb175 es una via de ataque del EGFR activado en las celulas de cancer con absorcion minima en tejido normal. La activacion del receptor puede ser resultado de muchos de los mecanismos asociados con el cancer. Asimismo, y lo que posiblemente es mas importante, estos anticuerpos pueden utilizarse para direccionar citotoxicos, nano-particulas terapeuticas, siRNA y radioisotopos directamente al sitio de tumor. Por ultimo, estos estudios confirman que mAb806 y mAb175 son herramientas valiosas para ayudar al mapeado de aquellos eventos asociados con la activacion de EGFR en la superficie celular.

En la comprension, a nivel molecular, del modo en que un anticuerpo puede reconocer formas aberrantes y activadas de un receptor de factores de crecimiento pero no el receptor tipo salvaje inactivo, este trabajo puede utilizarse para generar anticuerpos para otras dianas para terapeuticas del cancer, por ejemplo otros miembros de la familia EGFR. Un metodo podria utilizar el mutante de disulfuro EGFR-C 227A/C 283A que se fija estequiometricamente a los anticuerpos mAb806 y mAb175. Si las perturbaciones de conformacion observadas para EGFR ocurren tambien cuando erbB2, erbB3 o erbB4 se sobreexpresan o activan continuamente, entonces los mutantes de disulfuro homologos de estos receptores pueden actuar como inmunogenos para la creacion de otros anticuerpos de direccionamiento a miembros de la familia EGFR con selectividad para tumores. Adicionalmente, cuando las celulas tumorales sobreexpresan otros receptores, particularmente aquellos con dominios ricos en disulfuro tales como Trk, una proporcion de estos receptores puede plegarse parcialmente de modo erroneo debido a la infra-glicosilacion o romper transitoriamente los enlaces disulfuro. Es imaginable que un mutante disulfuro o receptores truncados podrian utilizarse analogamente como inmunogenos para generar potencialmente anticuerpos que reconozcan otros receptores expresados de modo aberrante.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Linajes de Celulas

El linaje de celulas U87MG.A2-7(54) transfectadas con EGFR A2-7 y el linaje A431 (2) han sido descritos anteriormente. El linaje de celulas de prostata independientes de hormonas DU145(55) se obtuvo de la ATCC (atcc.org). Veanse los Datos Suplementarios para condiciones de crecimiento de los linaje de celulas.

Anticuerpos, Fabs y peptidos

mAb806 y mAb175 se produjeron y purificaron en la Biological Production Facility (Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne). Para preparacion y caracterizacion de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y epitopos peptidicos, veanse los Datos Suplementarios.

Mapeado de mAb175 utilizando fragmentos de EGFR expresados en celulas de mamffero y levadura

El mapeado se realizo como se describe en los Datos Suplementarios.

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Resonancia de plasmones de superficie (BIAcore)

Se utilizo para todos los experimented un BIAcore 3000. Los peptidos que contenfan el epftopo putativo de mAb806 se inmovilizaron en un chip sensor CM5 utilizando acoplamiento con amina, tiol o Pms a un caudal de 5 pl/min( 47). Los mAb806 y mAb175 se sometieron a pasos sobre la superficie del sensor a un caudal de 5pl/min a 25°C. Las superficies se re-generaron entre las operaciones por inyeccion de HCl 10 mM a un caudal de 10pl/min.

Inmunoprecipitacion y transferencia Western

Las celulas se lisaron con tampon de lisis (1% Triton X-100, HEPES 30 mM, NaCl 150 mM, fluoruro de 4-(2- aminoetil)bencenosulfonilo 500 mM, aprotinina 150 nM, inhibidor de proteasa E-64 1 mM, EDTA 0,5 mM, y leupeptina 1 mM, pH 7,4) durante 20 min, se clarificaron por centrifugacion a 14,000 x g durante 30 min, se inmunoprecipitaron con los anticuerpos relevantes a una concentracion final de 5 pg/ml durante 60 min y se capturaron mediante perlas de Sepharose-A durante una noche. Las muestras se eluyeron luego con Tampon de Muestra 2X NuPAGE SDS (Invitrogen), se resolvieron en geles NuPAGE (de 3-8% o 4-12%), se sometieron a electrotransferencia a membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore) y se sondaron luego con los anticuerpos relevantes antes de deteccion por radiograffa de quimioluminiscencia.

Inmunohistoqufmica

Se tineron secciones congeladas con 5 pg/mL de mAb175 o control isotipo irrelevante durante 60 min a la temperatura ambiente. El anticuerpo fijado se detecto utilizando el sistema de deteccion HRP Dako Envision+ segun las instrucciones del fabricante. Las secciones se lavaron finalmente con agua, se sometieron a contratincion con hematoxilina y se montaron.

Modelos de Xenoinjerto

Celulas U87MG.A2-7 (3 x 106) el 100 pL de PBS se inocularon subcutaneamente en ambos flancos de ratones lampinos hembra Balb/c de 4 a 6 semanas de edad (Animal Research Centre, Perth, Australia). Todos los estudios se realizaron utilizando modelos de tumor establecidos como se ha indicado anteriormente (41). El tratamiento comenzo una vez que los tumores habfan alcanzado el volumen medio indicado en la leyenda de la Figura apropiada. El volumen de tumor en mm3 se determino utilizando la formula (longitud x anchura2)/2, donde longitud era el eje mas largo y anchura era la medida perpendicular. Los datos se expresan como volumen medio de tumor ± SE para cada grupo de tratamiento. Todos los datos se analizaron respecto a significacion por el test de Student de un solo lado donde p < 0,05 se consideraba estadfsticamente significativo. Este proyecto de investigacion fue aprobado por el Animal Ethics Committee del hospital de Austin.

Generacion y caracterizacion de linajes de celulas estables que expresan constructos mutantes de EGFR

Se generaron mutaciones del EGFR (tipo salvaje) utilizando un kit de mutagenesis orientada (Stratagene, La Jolla, CA). La plantilla para cada mutagenesis era el cDNA de EGFR humano (numero de acceso x00588)(2). Se realizo una secuenciacion de nucleotidos automatica de cada constructo para confirmar la integridad de las mutaciones de

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EGFR. Se transfectaron EGFR tipo salvaje y mutante (C 173A/C 281A) en celulas BaF/3 por electroporacion. Detalles adicionales acerca de la caracterizacion de los linajes de celulas se presentan en los Datos Suplementarios.

Determinaciones de la estructura cristalina de Fab 175, complejos Fab-peptido y la estructura NMR del epftopo del peptido 806 en solucion

Los procedimientos cristalograficos para preparacion y analisis de Fab 806, Fab 175 y los complejos individuales Fab-peptido y detalles acerca de los estudios NMR del peptido del epftopo 806 marcado con 15N en solucion se describen en los datos suplementarios. Las estructuras se determinaron por reemplazamiento molecular y el refino convergio con R=0,225/R libre=0,289 para Fab806 y R=0,226/R libre=0,279 para Fab806: peptido; R=0,210/R libre=0,05 para Fab806 y R=0,203/R libre=0,257 para Fab806: peptido.

Biodistribucion del Tumor chAb806 en los Pacientes

Para demostrar la especificidad tumoral de mAb806 in vivo, se preparo por ingenierfa genetica una version quimerica (ch806) y se produjo en condiciones de cGMP (56). Se condujo una primera prueba en hombres de Fase I para evaluar la seguridad, biodistribucion y respuesta inmune de ch806 en pacientes con tumores 806 positivos, y los resultados de seguridad, biodistribucion y farmacocinetica han sido consignados previamente (44). Para definir la especificidad de ch806 en tumor comparado con tejido normal (a saber, hfgado) en los pacientes, se realizo la absorcion cuantitativa de ch806 en tumor e hfgado por calculo del % de dosis inyectada (ID) de 111In-ch806 a partir de las imagenes en camara gamma de cuerpo total obtenidas a lo largo de una semana despues de la inyeccion de 5-7mCi (200-280 MBq) de 111In-ch806. Los calculos de dosimetrfa en hfgado y tumor se realizaron basandose en regiones de interes en el conjunto de datos de imagen de infusion de 111In-ch806 en cada paciente individual, corregidos por ruido de fondo y atenuacion, que permitfan el calculo de la actividad acumulada. El calculo de la dosimetrfa se realizo para deducir la concentracion de 111In-ch806 en tumor e hfgado durante un periodo de una semana despues de la inyeccion.

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EJEMPLO2

DATOS SUPLEMENTARIOS PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Linajes de celulas

Todos los linajes de celulas se mantuvieron en DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) que contenfa 10% FCS (CSL, Melbourne), glutamina 2 mM (Sigma Chemical Co, St. Louis), y penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Grand Island). Adicionalmente, el linaje de celulas U87MG.A2-7 se mantuvo en 400mg/ml de geneticina (Life Technologies, Inc, Grand Island). Los linajes de celulas BaF/3(1) y BaF/3 que expresaban receptores diferentes de EGF (2) se mantuvieron rutinariamente en RPMI 1640 (GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero de ternero fetal (GIBCO BRL) y 10% de medio WEHI-3B acondicionado (3) como fuente de IL-3. Todos los linajes de celulas se dejaron crecer a 37°C en una atmosfera de aire /CO2 (95%-5%).

Anticuerpos y peptidos

Generacion de anticuerpos. El linaje de fibroblastos murinos NR6&egfr se utilizo como inmunogeno. Se generaron hibridomas de raton por inmunizacion de ratones BALB/c cinco veces subcutaneamente a intervalos de 2 a 3 semanas con 5x105 -2x106 celulas en adyuvante. Se utilizo adyuvante de Freund completo para la primera

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inyeccion. Despues de ello, se utilizo adyuvante de Freund incomplete (Difco). Se fusionaron celulas de bazo de ratones inmunizados con el linaje de celulas de mieloma de raton SP2/0. Los sobrenadantes de los clones nuevamente generados se clasificaron en ensayos de hemadsorcion para reactividad con los linajes de celulas NR6, NR6wtEGFR, y NR6&EGFR, y se analizaron luego por ensayos de hemadsorcion con linajes de celulas de glioblastoma humano U87MG, U87MGwtEGFR, y U87MGaegfr.

Los mAb's intactos (50 mg) se digirieron en PBS con papafna activada durante 2-3 h a 37°C a una ratio de 1:20 y la papafna se desactivo con yodoacetamida. El material digerido se paso luego por una columna de Protefna-A Sepharose (Amersham) en tampon de fosfato de sodio 20mM de pH 8,0, purificandose ulteriormente el flujo directo por intercambio de cation utilizando una columna Mono-S (Amersham). La protefna se concentro luego utilizando un concentrador centrffugo MWCO 10,000 (Millipore). Para los complejos Fab-peptido se anadio directamente un exceso molar de peptido liofilizado al Fab y se incubo durante 2 horas a 4°C antes de realizar las pruebas de cristalizacion.

Mapeado de mAb175 utilizando fragmentos de EGFR expresados en celulas de mamffero

El dfa anterior a la transfeccion con estos fragmentos, se sembraron fibroblastos de rinon embrionario 293 T humanos a 8 x 105 por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contenfan 2 mL de medio. Las celulas se transfectaron con 3-4 pg de DNA plasmfdico complejado con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. 24 a 48 horas despues de la transfeccion, los cultivos de celulas se aspiraron y las monocapas de celulas se lisaron en 250 pL de tampon de lisis (1% Triton X-100, 10% glicerol, NaCl 150 mM, HEPES 50 mM de pH 7,4, EGTA 1 mM y mezcla de Inhibidor de Proteasas Completo (Roche). Se mezclaron partes alfcuotas del lisado de celulas (10-15 pl) con tampon de muestra de SDS que contenfa 1,5% de p-mercaptoetanol, desnaturalizado por calentamiento durante 5 min a 100°C y tratado por electroforesis en geles de poliacrilamida Bis- Tris NuPAGE al 10% (Invitrogen). Las muestras se pasaron luego por electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa que se lavaron en tampon TBST (Tris-HCI 10mM, pH 8,0, NaCl 100mM y 0,1% de Tween-20) y se bloquearon en TBST que contenfa 2,5 % de leche desnatada durante 30 min a la temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante una noche a 4°C con 0,5 pg/ml de mAb175 en tampon de bloqueo. Membranas paralelas se sondaron durante una noche con mAb 9B11 (1:5000, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachussets) para detectar el epftopo c-myc. Las membranas se lavaron en TBST, y se incubaron en tampon de bloqueo que contenfa IgG anti-raton de conejo conjugado con peroxidasa de rabano picante (Biorad) a una dilucion de 1:5000 durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron luego en TBST, y se revelaron utilizando film de autorradiograffa despues de incubacion con Sustrato Quimioluminiscente Western Pico (Pierce, Rockford, Illinois).

Mapeado de mAb175 utilizando fragmentos de EGFR expresados en celulas de mamffero y levadura

Una serie de fragmentos de ectodominio de EGFR solapantes marcados con c-myc, que comenzaban en los residuos 274, 282, 290 y 298 y que terminaban todos ellos en el aminoacido 501 y fusionados a hormona del crecimiento se han descrito anteriormente (6).

La expresion de las protefnas de EGFR en la superficie de celulas de levadura se realizo como se ha descrito arriba

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(7). Resumidamente, colonias transformadas se dejaron crecer a 30 °C en medio mfnimo que contenfa base nitrogenada de levadura, hidrolizado de casefna, dextrosa, y tampon de fosfato de pH 7,4, en una plataforma de sacudidas durante aproximadamente un dfa hasta que se alcanzo una DO600 de 5-6. Las celulas de levadura se indujeron luego respecto a presentacion de protefnas por transferencia a medio mfnimo que contenfa galactosa, y se incubaron con sacudidas a 30 °C durante 24 horas. Los cultivos se guardaron luego a 4 °C hasta su analisis. Se obtuvo fluido de ascitis bruto que contenfa el anticuerpo monoclonal c-myc 9E10 de Covance (Richmond, CA). Se lavaron 1 x 106 celulas de levadura con tampon FACS enfriado en hielo (PBS que contenfa 1 mg/mL de BSA) y se incubaron con ascitis anti-c-myc (dilucion 1:50), o anticuerpo monoclonal EGFR humano (10 pg/mL) en un volumen final de 50 pL, durante una hora a 4° C. Las celulas se lavaron luego con tampon FACS enfriado en hielo y se incubaron con IgG anti-raton marcado con ficoeritrina (dilucion 1:25), en un volumen final de 50 pL durante 1 hora a 4° C, protegido de la luz. Despues de lavado de las celulas de levadura con tampon FACS enfriado en hielo, se obtuvieron los datos de fluorescencia con un citometro de flujo Coulter Epics XL (Beckman-Coulter), y se analizaron con software de citometrfa WinMDI (J. Trotter, Scripps University). Para determinacion de los epftopos lineales frente a los conformacionales, las celulas de levadura se calentaron a 80°C durante 30 min, y se enfriaron luego en hielo 20 min antes de la marcacion con anticuerpos. La serie de mutantes de EGFR enumerados en la Tabla 2 se han descrito anteriormente (8).

Generacion y caracterizacion de linajes de celulas estables que expresan constructos mutantes de EGFR

Generation de linajes de celulas que expresan mutantes de EGFR

Se obtuvieron linajes de celulas estables que expresaban el EGFR mutante por seleccion en medio que contenfa neomicina. Despues de la seleccion final, se aislo mRNA de cada linaje de celulas, se sometio a transcripcion inversa y la secuencia de EGFR se amplifico por PCR. Todas las mutaciones en el EGFR expresado se confirmaron por secuenciacion de los productos PCR. El nivel de expresion de EGFR se determino por analisis FACS en un instrumento FACStar ((Becton and Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando el anticuerpo anti-EGFR mAb528(9;70) a 10 pg/ml en PBS, 5% FCS, EDTA 5 mM seguido por Ig anti-raton marcado con Alexa 488 (dilucion final 1:400). La fluorescencia de fondo se determino por incubacion de las celulas con un anticuerpo primario irrelevante de la misma clase. Todas las celulas se sometieron rutinariamente a pasos en RPMI, 10% FCS, 10 % de medio WEHI3B acondicionado y 1,5 mg/ml de G418.

Activation dependiente de EGF del EGFR mutante

Celulas que expresaban el EGFR tipo salvaje o C271A/C283A-EGFR se lavaron y se incubaron durante 3 horas en medio sin suero o IL-3. Las celulas se recogieron por centrifugacion y se resuspendieron el medio que contenfa EGF (100 ng/ml) o un volumen equivalente de PBS. Las celulas se cosecharon al cabo de 15min, se redujeron a un sedimento y se lisaron directamente en tampon de muestra SDS/PAGE que contenfa p-mercaptoetanol. Las muestras se separaron en geles NuPAGE de gradiente 4-12%, se transfirieron a membrana Immobilon de PVDF y se sondaron con anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnologies) o anticuerpos anti-EGFR (mAb806, producido en el LICR). Las bandas reactivas se detectaron utilizando quimioluminiscencia.

Efecto del EGF y los anticuerpos sobre la proliferation celular

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25

30

35

40

Celulas que crecfan en fase logarftmica se cosecharon y se lavaron 2 veces con PBS para separar la IL-3 residual. Las celulas se resuspendieron en RPMI 1640 mas 10% de FCS y se sembraron en placas de 96 pocillos a 105 celulas/pocillo con portador solo o con concentraciones crecientes de EGF. En caso apropiado, se anadio tambien a los cultivos una concentracion fija de mAb528 o mAb806 (2 pg/pocillo). La proliferacion se determino utilizando el ensayo MTT (11).

Reactividad con Anticuerpos especfficos de Conformacion

Las celulas se recogieron por centrifugacion y se tineron con los anticuerpos de control o de test (todos ellos a 10 pg/ml en tampon FACS durante 40 min en hielo, lavados en tampon FACS) seguido por Ig anti-raton marcada con Alexa 488 (dilucion final 1:400, 20 min en hielo). Las celulas se lavaron con tampon FACS enfriado en hielo, se recogieron por centrifugacion, y se analizaron en un canal FACScan; el canal de fluorescencia pico y la fluorescencia media se determinaron para cada muestra utilizando la herramienta estadfstica en CellQuest (Becton and Dickinson). La fluorescencia de fondo (control negativo) se dedujo de todas las medidas. Los valores de fluorescencia media se seleccionaron como los mas representativos de la forma del pico y la intensidad de fluorescencia y se utilizaron para deducir la ratio de fijacion de mAb806 a mAb 528.

Determinaciones de la estructura cristalina de 175, y 806 Fab, los complejos Fab-peptido y la estructura NMR del epftopo del peptido 806 en solucion

Los cristales de Fab 806 nativo se dejaron crecer por difusion de vapor en gota colgante utilizando 10mg/ml de Fab y un deposito que contenfa tampon de acetato de sodio 0,1 M de pH 4,6, 6-8% PEG6000 y 15-20% de isopropanol. Para la recogida de los datos, los cristales se transfirieron a una solucion crioprotectora que contenfa tampon 0,1 M de acetato de sodio de pH 4,6, 10% PEG6000, 15-20% de isopropanol y 10% de glicerol. Los cristales se montaron luego en un bucle de nailon y se sometieron directamente a congelacion subita en nitrogeno lfquido.

Los cristales del complejo 806 Fab-peptido se dejaron crecer por difusion de vapor en gota colgante utilizando 10 mg/mL de complejo Fab-peptido y un deposito que contenfa acetato de amonio 0,2 M y 16-18 % de monometileter de PEG 5000, mejorando luego la calidad de los cristales por tecnicas de siembra. Para la recogida de los datos, los cristales se transfirieron a una solucion crioprotectora constituida por un deposito suplementado con 25 % de glicerol. Los cristales se montaron luego en un bucle de nailon y se sometieron directamente a congelacion subita en nitrogeno lfquido.

Los cristales del complejo 175 Fab-peptido se dejaron crecer inicialmente por difusion interfacial libre utilizando un sistema de cristalizacion Topaz (Fluidigm, San Francisco). Los microcristales se dejaron crecer por difusion de vapor en gota colgante utilizando 7mg/ml de Fab con condiciones similares de tampon Bis-tris propano 0,1M, acetato de amonio 0,2M y 18% de PEG 10.000. Los microcristales se mejoraron luego por siembra en bandas en formiato de sodio 0,15m y 15 % de PEG 1500 para producir cristales en forma de pequenas placas. Para la recogida de los datos los cristales se transfirieron a una solucion crioprotectora constituida por un deposito suplementado con 25 % de glicerol. Los cristales se montaron luego en un bucle de nailon y se sometieron directamente a congelacion subita en nitrogeno lfquido.

5

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15

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35

Los datos de difraccion en los cristales complejo 806 Fab y 175 Fab se recogieron en la propia empresa utilizando un detector R-AXIS IV en un generador Rigaku micromax-007 provisto de optica AXCO, despues de lo cual se procesaron estos datos utilizando CrystalClear. Los datos del complejo 806-peptido se recogieron en un detector ADSC quantum315 CCD en la lfnea de luz X29, Brookhaven National Laboratory, procesandose estos datos con HKL2000(12) (las estadfsticas de recogida de los datos se muestran en Tabla 1). El Fab 806 nativo se resolvio por reemplazamiento molecular utilizando el programa MOLREP(73) con empleo de las coordenadas de la estructura 2E8. El refino de la estructura se realizo en REFMAC5(14) y el modelo de construccion en Coot (15). Las estructuras de ambos peptidos 806 y Fab 175 Fab se resolvieron por reemplazamiento molecular utilizando el programa MOLREP con empleo de las coordenadas de la estructura de 806 Fab, refino y reconstruccion que se realizaron de nuevo en REFMAC5, y COOT y O. La validacion de las estructuras finales se realizo con PROCHECK(16) y WHATCHECK(17).

Estudios NMR

Para los estudios NMR, se produjo recombinantemente un peptido marcado con 15N como una fusion con el dominio SH2 de SHP2 utilizando el metodo descrito previamente por Fairlie et al. (18), excepto que los E.coli se dejaron crecer en medio mfnimo de Neidhart suplementado con 15NH4Cl (19). El peptido se escindio de la pareja de fusion utilizando CNBr, se purifico por HPLC en fase inversa y se conformo su identidad por espectrometrfa de masas MALDI-TOF y secuenciacion del terminal N. El residuo metionina dentro de la secuencia de fijacion del anticuerpo 806 se muto a leucina para hacer posible la escision de la pareja de fusion, pero no dentro del peptido propiamente dicho.

Las muestras utilizadas para los estudios NMR se prepararon en solucion acuosa que contenfa 5 % de 2H2O, NaCl 70 mM y NaPO4 50 mM a pH 6,8. Todos los espectros se adquirieron a 298K en un espectrometro Bruker Avance500 utilizando una criosonda. Las asignaciones secuenciales del peptido en ausencia de m806Fab se establecieron utilizando TOCSY 2D estandar y NOESY asf como espectros TOCSY y NOESY 15N-editados. La interaccion entre el peptido and fAb806 se examino por monitorizacion de los espectros 15N HSQC del peptido en ausencia y presencia de fAb806. La perturbacion espectral de los espectros 15N HSQC del peptido en presencia de fAb806 indica claramente que el peptido era capaz de fijarse al fAb806 en presencia de condiciones en solucion. Sin embargo, la conformacion detallada del peptido en la forma de complejo no se determino.

Tabla Suplementaria 1. Recogida de Datos y Estadfsticas de Refino

Recogida de datos

806(nativo) 806(peptido) 175(nativo) 175(peptido)

Grupo espacial

P21212 P21 P212121 P21212

Dimensiones de la celda (A)

a

140,37 35,92 36,37 83,17

b

74,62 83,16 94,80 69,26

806(nativo) 806(peptido) 175(nativo) 175(peptido)

c

83,87 72,21 p=92,43 108,90 71,47

Fuente

la propia empresa BNL X29 la propia empresa la propia empresa

Longitud de onda (A)

1,542 1,1 1,542 1,542

Intervalo de resolucion (A)

29,7-2,2 50-2,0 50-2,8 14,18-1,59

(2,27-2,20) (2,07-2,0) (2,87-2,80) (1,65-1,59)

Rfusion (%)

6,4 (26,7) 6,6 (28,2) 8,6 (30,0)

I/oI

12,2 (3,2) 22 (3,15) 10,2 (2,2)

Completitud (%)

98,3 (91,3) 96,6 (79,2) 98,4 (90,5) 78,8 (11,8)

98,1 a 1,89 A

Reflexiones totales

156497 98374 205401

Reflexiones singulares

44905 27692 9171 43879

Los numeros entre parentesis corresponden a la envuelta de resolucion maxima.

Refino

5

Intervalo de resolucion (A)

20-2,3 72,17-2,00 50-2,6 14,18-1,6

Reflexiones

37397 26284 9171 41611

Rcrist

0,225 0,226 0,210 0,203

R libre

0,289 0,279 0,305 0,257

Atomos de protefna

6580 3294 3276 3390

Atomos de disolvente

208 199 46 247

Longitud de enlace r.m.s.d (A)

0,022 0,007 0,015 0,014

Angulo de enlace r.m.s.d (°)

1,70 1,12 1,77 1,48

Factor B medio (A2)

40,3 33,6 37,5 20,7

Factores B anisotropos totales (A2)

B11

-1,52 2,42 0,20 1,13

B22

2,22 -0,26 -1,022 -0,38

B33

-0,70 -2,11 1,03 -0,74

5

10

15

20

25

30

35

40

Referencias

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6. Johns, T. G., Adams, T. E., Cochran, J. R., Hall, N. E., Hoyne, P. A., Olsen, M. J., Kim, Y. S., Rothacker, J., Nice, E. C., Walker, F., Ritter, G., Jungbluth, A. A., Old, L. J., Ward, C. W., Burgess, A. W., Wittrup, K. D., and Scott, A. M. (2004) J Biol Chem. 279, 30375-30384.

7. Johns, T. G., Adams, T. E., Cochran, J. R., Hall, N. E., Hoyne, P. A., Olsen, M. J., Kim, Y. S., Rothacker, J., Nice, E. C., Walker, F., Ritter, G., Jungbluth, A. A., Old, L. J., Ward, C. W., Burgess, A. W., Wittrup, K. D., and Scott, A. M. (2004) J Biol Chem. 279, 30375-30384.

8. Johns, T. G., Adams, T. E., Cochran, J. R., Hall, N. E., Hoyne, P. A., Olsen, M. J., Kim, Y. S., Rothacker, J., Nice, E. C., Walker, F., Ritter, G., Jungbluth, A. A., Old, L. J., Ward, C. W., Burgess, A. W., Wittrup, K. D., and Scott, A. M. (2004) J Biol Chem. 279, 30375-30384.

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10

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15

Claims (26)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

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   40

   1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de fijacion de antfgeno que se fija a EGFR, en donde dicho anticuerpo o fragmento no reconoce el peptido juntural LEEKKGNYWTDH (SEQ ID NO: 13), teniendo dicho anticuerpo o fragmento (i) secuencias CDR 1, 2 y 3 de region variable de cadena pesada que comprenden SDYAWN (SEQ ID NO:4), YISYSANTRYNPSLKS (SEQ ID NO: 5) y ATAGRGFPY (SEQ ID NO: 6) respectivamente; y (ii) secuencias CDR 1, 2 y 3 de region variable de cadena ligera que comprenden HSSQDISSNIG (SEQ ID NO: 1), YHGTNLED (SEQ ID NO: 2), y VQYGQFPWT (SEQ ID NO:3) respectivamente.
2. 2. El anticuerpo o fragmento de la reivindicacion 1 que reconoce el epftopo del peptido de los aminoacidos de EGFR 287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEQ ID NO: 14).
3. 3. El anticuerpo o fragmento de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo o fragmento es totalmente humano, humanizado o quimerico.
4. 4. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas CDRs son transportadas por un entramado de anticuerpo humano.
5. 5. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una region constante de IgG1 humana.
6. 6. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una region constante kappa humana.
7. 7. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo o fragmento se encuentra en forma de un fragmento de anticuerpo F(ab')2, scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.
8. 8. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que lleva un marcador detectable o funcional.
9. 9. El anticuerpo o fragmento segun la reivindicacion 8, en el que dicho marcador se selecciona del grupo constituido por un farmaco unido covalentemente y un radiomarcador.
10. 10. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento esta pegilado.
11. 11. Un inmunoconjugado o protefna de fusion de anticuerpo que comprende el anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 conjugado a un agente seleccionado de un agente de ablacion qufmica como una toxina, un inmunomodulador, una citocina, un agente citotoxico, un agente quimioterapeutico o un farmaco.

    5

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12. 12. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo o fragmento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. 13. Un metodo de preparacion del anticuerpo o fragmento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende expresar el acido nucleico de la reivindicacion 12 en condiciones que llevan a cabo la expresion de dicho anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento.
14. 14. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el inmunoconjugado o protefna de fusion de anticuerpos de la reivindicacion 11, para uso en un metodo de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal.
15. 15. El anticuerpo o fragmento como se define en, una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el inmunoconjugado o la protefna de fusion de anticuerpos de la reivindicacion 11, para uso en el tratamiento de un tumor en un paciente humano.
16. 16. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o fragmento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y opcionalmente un vehfculo, portador o diluyente farmaceuticamente aceptable.
17. 17. Un kit, que comprende una forma de dosificacion farmaceutica de la composicion farmaceutica de la reivindicacion 16, y una forma de dosificacion farmaceutica separada que comprende un agente anti-cancer adicional seleccionado del grupo constituido por agentes quimioterapeuticos, anticuerpos anti-EGFR, agentes radioinmunoterapeuticos y combinaciones de los mismos.
18. 18. El kit de la reivindicacion 17, en el cual dichos inhibidores de tirosina-quinasa se seleccionan del grupo constituido por AG 1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668, y sus combinaciones.
19. 19. Un hospedador unicelular transformado con una molecula de DNA recombinante que comprende una secuencia de DNA o variante degenerada de la misma, que codifica el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
20. 20. El hospedador unicelular transformado de la reivindicacion 19, en el cual el hospedador unicelular se selecciona del grupo constituido por E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levaduras, y celulas CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSCl, BSC40, y BMT10, celulas de planta, celulas de insecto, y celulas humanas en cultivo de tejido.
21. 21. Uso del anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 16 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion del cancer en un mamffero.
22. 22. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 16, para uso en el tratamiento de canceres residentes en el cerebro que producen EGFR expresado de modo aberrante.
23. 23. La composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 22, en la cual dichos canceres residentes en el cerebro se seleccionan de glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astrocitomas neoplasticos y malformaciones arteriovenosas neoplasticas.

    5 24. La composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 22, en la cual dicha composicion

    farmaceutica debe administrarse sistemicamente.
24. 25. El uso segun la reivindicacion 21, en el cual dicho cancer esta localizado en o adyacente al cerebro.

    10 26. Uso del anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparacion de un

    medicamento para el tratamiento o la prevencion de tumores neurales en un mamffero.
25. 27. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 25 o 26, en el cual el anticuerpo o fragmento esta radiomarcado y se utiliza en radioinmunoterapia.

    15
26. 28. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 21, 25 o 26, en el cual se administra primeramente la composicion de la reivindicacion 16, administrandose despues de ello una composicion que comprende un agente quimioterapeutico.

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