ES2334494T3 - Proteinas de union especificas y uso de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos que reconoce un epítopo de EGFR que se encuentra en células tumorigénicas o hiperproliferativas o células que expresan en exceso EGFR o expresan un EGFR mutante, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos (i) se une a EGFR de tipo salvaje humano unido a la célula sólo cuando el EGFR es amplificado o expresado en exceso; (ii) se une a EGFR de2-7 en un epítopo distinto del péptido de empalme LEEKKONYVVTDH y (iii) se une a un epítopo en la secuencia de los restos 273-501 del EGFR humano de tipo salvaje.
Description
Proteínas de unión específicas y usos de las
mismas.
La presente invención se refiere a miembros de
unión específica, concretamente anticuerpos y sus fragmentos, que
se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico amplificado
(EGFR) y al truncamiento de2-7 EGFR del EGFR. En
particular, el epítopo reconocido por los miembros de unión
específica, concretamente anticuerpos y sus fragmentos, es
intensificado o evidente tras la modificación
post-traduccional aberrante. Estos miembros de
unión específica son útiles en la diagnosis y el tratamiento del
cáncer. Los miembros de unión de la presente invención también se
pueden utilizar en terapia combinados con agentes quimioterapéuticos
o anti-cancerosos y/o otros anticuerpos o sus
fragmentos.
El tratamiento de las enfermedades
proliferativas, concretamente el cáncer, mediante métodos
quimioterapéuticos a menudo depende de la explotación de las
diferencias en las células diana en proliferación y otras células
normales del organismo humano o animal. Por ejemplo, muchos agentes
químicos se diseñan para ser absorbidos por el ADN que replica
rápidamente de manera que el proceso de replicación del ADN y de
división celular es interrumpido. Otro enfoque consiste en
identificar antígenos sobre la superficie de las células tumorales
u otras células anómalas que no son expresados normalmente en el
tejido humano desarrollado, tales como los antígenos tumorales o
los antígenos embrionarios. Tales antígenos pueden ser localizados
con proteínas de unión tales como anticuerpos que pueden bloquear o
neutralizar el antígeno. Además, las proteínas de unión, incluyendo
los anticuerpos y sus fragmentos, pueden liberar un agente tóxico u
otra sustancia que sea capaz de activar directa o indirectamente un
agente tóxico en el sitio del tumor.
El EGFR es una diana atractiva para la terapia
con anticuerpos dirigida a tumores debido a que es
sobre-expresado en muchos tipos de tumores
epiteliales (27,28). Por otra parte, la expresión de EGFR está
asociada con una prognosis pobre en numerosos tipos de tumores
incluyendo de estómago, de colon, de vejiga urinaria, de mama, de
próstata, de endometrio, de riñón y de cerebro (p. ej., glioma). Por
consiguiente, se ha informado sobre numerosos anticuerpos para EGFR
en la literatura con varias evaluaciones clínicas en marcha (18, 19,
29). Los resultados de los estudios en los que se utilizan mAb para
EGFR en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón
de células escuamosas, gliomas cerebrales y astrocitomas malignos
han sido esperanzadores. La actividad antitumoral de la mayoría de
los anticuerpos para EGFR es potenciada por su capacidad para
bloquear la unión al ligando (30, 31). Tales anticuerpos pueden
mediar su eficacia a través tanto de la modulación de la
proliferación celular como de la funciones inmunitarias dependientes
de los anticuerpos (p. ej., activación del complemento). El uso de
estos anticuerpos, no obstante, puede estar limitado por la
absorción en órganos que tienen niveles endógenos elevados de EGFR
tales como el hígado y la piel (18, 19).
Una proporción significativa de tumores que
contienen amplificaciones del gen EGFR (esto es, múltiples copias
del gen EGFR) también expresan simultáneamente una versión truncada
del receptor (13) conocido como de2-7 EGFR,
\DeltaGFR, o \Delta2-7 (términos utilizados aquí
indistintamente) (2). El reordenamiento observado en
de2-7 EGFR da como resultado un ARNm maduro en marco
que carece de 801 nucleótidos que abarcan los exones
2-7 (6-9). La correspondiente
proteína EFGR tiene una deleción de 267 aminoácidos que comprende
los restos 6-273 del dominio extracelular y un
resto glicina novedoso en la confluencia de la fusión (9). Esta
deleción, junto con la inserción de un resto glicina, produce un
péptido de empalme único en la interfaz de la deleción (9). Se ha
informado de de2-7 EGFR (2) en numerosos tipos de
tumores incluyendo glioma, mama, pulmón, ovárico y próstata
(1-4). Si bien este receptor truncado no se une al
ligando, posee poca actividad constitutiva y confiere una ventaja
de crecimiento significativa a las células de glioma desarrolladas
como xenoinjertos tumorales en ratones carentes de sistema
inmunitario (10) y es capaz de transformar células NIH3T3 (11) y
células MCF-7. Los mecanismos utilizados por
de2-7 EGFR en células de glioma no están
completamente definidos pero se ha informado que incluyen una
disminución de la apoptosis (12) y un pequeño aumento de la
proliferación (12).
Como la expresión de este receptor truncado está
restringida a las células tumorales, ésta representa una diana
altamente específica para la terapia con anticuerpos. Por
consiguiente, numerosos laboratorios han informado sobre la
generación de anticuerpos tanto policlonales (14) como monoclonales
(3, 15, 16) específicos para el único péptido de
de2-7 EGFR. Una serie de mAb de ratón, aislados
después de la inmunización con el péptido de2-7
único, mostraron selectividad y especificidad para el receptor
truncado y eligieron como diana los xenoinjertos
de2-7 EGFR positivos desarrollados en ratones
carentes de sistema inmunitario (3, 25, 32).
No obstante, un defecto potencial de los
anticuerpos para de2-7 EGFR es que solamente una
proporción de tumores que muestran amplificación del gen EGFR
también expresan de2-7 EGFR (5). El porcentaje
exacto de tumores que contienen de2-7 EGFR no está
completamente establecido, debido a que el uso de técnicas
diferentes (esto es PCR versus inmunohistoquímica) y diferentes
anticuerpos, ha producido una amplia gama de valores referidos para
la frecuencia de su presencia. Los datos publicados indican que
aproximadamente 25-30% de los gliomas expresan
de2-7 EGFR siendo la expresión más baja en
astrocitomas anaplásicos y la más alta en glioblastoma multiforme
(6,13,17). Se ha informado de que la proporción de células positivas
en los gliomas que expresan de2-7 EGFR oscila entre
37-86% (1). Se encontró que un 27% de los carcinomas
de mama y un 17% de los cánceres de pulmón eran positivos para
de2-7 EGFR (1, 3, 13, 16). De este modo, cabría
esperar que los anticuerpos específicos para de2-7
EGFR fueran útiles solamente en un porcentaje de tumores positivos
para EGFR.
De este modo, si bien la evidencia existente de
actividad de los anticuerpos para EGFR es esperanzadora, continúan
las limitaciones observadas sobre el intervalo de aplicabilidad y
eficacia reflejadas antes. Por consiguiente, sería deseable
desarrollar anticuerpos y agentes similares que demuestren eficacia
con una amplia gama de tumores, y es a la consecución de ese
objetivo a la que está dirigida la presente invención.
No se debe considerar que la mención de
referencias en la presente memoria represente técnica anterior de
la presente invención.
Kuan et al, International Journal of
Cancer (2000) 88(6): 962-969 describen un
fragmento scfv que reconoce el péptido de empalme en
EGFRvIII/de2-7 EGFR que está presente en células
tumorales que albergan el mutante por deleción y está ausente en
células normales.
La presente invención proporciona un anticuerpo
aislado o uno de sus fragmentos activos que reconoce un epítopo
EGFR que se encuentra en células tumorigénicas o hiperproliferativas
o células que expresan en exceso EGFR o que expresan un mutante de
EGFR, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos (i) se
une a EGFR de tipo salvaje humano unido a la célula solamente
cuando EGFR es amplificado o expresado en exceso; (ii) se une a
de2-7 EGFR en un epítopo distinto del péptido de
empalme LEEKKGNYVVTDH y (iii) se une a un epítopo en la secuencia
de restos 273-501 del EGFR de tipo salvaje
humano.
La presente invención proporciona un miembro de
unión específico aislado, concretamente un anticuerpo o uno de sus
fragmentos, que reconoce un epítopo EGFR que no demuestra ninguna
alteración o sustitución en la secuencia de aminoácidos con
respecto al EGFR de tipo salvaje y que se encuentra en células
tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales y no es detectable
en células normales o de tipo salvaje (el término "célula de tipo
salvaje" según se utiliza en la presente memoria contempla una
célula que expresa EGFR endógeno pero no 2-7 EGFR y
el término excluye específicamente una célula que expresa en exceso
el gen EGFR; el término "tipo salvaje" hace referencia a un
genotipo o fenotipo u otra característica presente en una célula
normal en lugar de un una célula anormal o tumorigénica). El
miembro de unión específica, concretamente un anticuerpo o uno de
sus fragmentos, reconoce un epítopo de EGFR que se encuentra en las
células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales y no es
detectable en células normales o de tipo salvaje, donde el epítopo
es aumentado o evidenciado tras la modificación
post-traduccional aberrante o la expresión
aberrante. En una ilustración no limitante concreta proporcionada
en la presente memoria, el epítopo EGFR es aumentado o resulta
evidente en el que la modificación
post-traduccional no es completa o total hasta el
punto observado en la expresión normal de EGFR en las células de
tipo salvaje. En un aspecto, el epítopo EGFR es aumentado o resulta
evidente tras la modificación e carbohidratos inicial o simple o la
glicosilación temprana, concretamente modificación con alto
contenido de manosa, y es reducido o no resulta evidente en
presencia de una modificación de carbohidratos compleja.
El miembro de unión específica, que puede ser un
anticuerpo o uno de sus fragmentos, tal como uno de sus fragmentos
inmunogénicos, no se une a ni reconoce células de tipo salvaje o
normales que contienen un epítopo EGFR de tipo salvaje en ausencia
de expresión aberrante y en presencia de una modificación
post-traduccional de EGFR normal. Más
concretamente, el miembro de unión específica de la invención, que
puede ser un anticuerpo o uno de sus fragmentos, reconoce un
epítopo EGFR que está presente en las células que expresan EGFR en
exceso (p. ej., el gen EGFR es amplificado) o que expresan
de2-7 EGFR, concretamente en presencia de una
modificación post-traduccional aberrante, y que no
es detectable en células que expresan EGFR en condiciones normales,
concretamente en presencia de una modificación
post-traduccional normal.
Los autores de la presente invención han
descubierto los anticuerpos monoclonales novedosos, ilustrados en
la presente memoria por el anticuerpo denominado mAb 806, que
reconocen específicamente EFGR expresado aberrantemente. En
particular, los anticuerpos de la presente invención reconocen un
epítopo EGFR que se encuentra en células tumorigénicas,
hiperproliferativas o anormales y no es detectable en células
normales o de tipo salvaje, donde el epítopo es aumentado o resulta
evidente tras la modificación post-traduccional
aberrante. Los anticuerpos de la presente invención son ilustrados
adicionalmente por los anticuerpos mAb 124 y mAb 1133 descritos en
la presente memoria. Los anticuerpos novedosos de la invención
también reconocen EGFR de tipo salvaje amplificado y
de2-7 EGFR, pero se unen a un epítopo distinto del
péptido de empalme único de la mutación de2-7 EGFR.
Los anticuerpos de la presente invención reconocen específicamente
el EGFR expresado aberrantemente, incluyendo EGFR amplificado o
EGFR mutante (ilustrado en la presente memoria por la mutación
de2-7), concretamente tras la modificación
post-traduccional aberrante. Adicionalmente,
mientras mAb 806 no reconoce el EGFR cuando es expresado sobre la
superficie de la célula de una línea celular de glioma que expresa
cantidades normales de EGFR, no se une al dominio extracelular del
EGFR (sEGFR) inmovilizado sobre la superficie de placas ELISA,
indicando el reconocimiento de un epítopo conformacional. MAb 806 se
une a la superficie de las células A431, que tienen una
amplificación del gen EGFR pero no expresan de2-7
EGFR. En gran medida, mAb 806 no se unía significativamente a
tejidos normales tales como hígado y piel, que expresan niveles de
EGFR de tipo salvaje (wt) endógeno que son mayores que en la
mayoría de los otros tejidos normales, pero donde EGFR no es
expresado o amplificado aberrantemente.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
clasificar específicamente la naturaleza de los tumores o células
tumorigénicas con EGFR, tiñendo o reconociendo de otro modo aquellos
tumores o células en los que se encuentra presente la expresión de
EGFR aberrante, incluyendo la amplificación de EGFR y/o la mutación
de EGFR, concretamente de2-7EGFR. Adicionalmente,
los anticuerpos de la presente invención, ilustrados por mAb 806,
demuestran una actividad anti-tumoral in vivo
significativa frente a tumores que contienen EGFR amplificado y
contra xenoinjertos de2-7 EGFR positivos.
La especificidad única de mAb 806, donde el mAb
806 se une a de2-7 EGFR y EGFR amplificado pero no
al EGFR de tipo salvaje, normal proporciona usos diagnósticos y
terapéuticos para identificar, caracterizar y dirigir numerosos
tipos de tumores, por ejemplo, tumores de cabeza y cuello, mama, o
próstata y glioma, sin los problemas asociados con la absorción en
tejido normal que se pueden observar con los anticuerpos EGFR
conocidos previamente.
Por consiguiente, la invención proporciona
proteínas de unión específica, tales como anticuerpos, que se unen
a de2-7 EGFR en un epítopo que es distinto del
péptido de empalme pero que no se unen a EGFR en células normales
en ausencia de amplificación del gen EGFR. Por amplificación, se
quiere significar que la célula comprende múltiples copias del gen
EGFR.
El epítopo reconocido por mAb 806 está
localizado en la región que comprende los restos
273-501 de la secuencia de EGFR normal o de tipo
salvaje madura. Por lo tanto, se proporcionan proteínas específicas,
tales como anticuerpos, que se unen a de2-7 EGFR en
un epítopo localizado en la región que comprende los restos
273-501 de la secuencia de EGFR. El epítopo puede
ser determinado mediante cualquiera de las técnicas de mapeo
epitópico convencionales conocidas por los expertos en la técnica.
Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica los restos
273-501 podía ser digerida, y los fragmentos
resultantes expresados en un anfitrión adecuado. La unión al
anticuerpo podía ser determinada como se ha mencionado antes.
En un aspecto preferido, el anticuerpo es uno
que tiene las características del anticuerpo que han identificado y
caracterizado los autores de la invención, en particular que
reconoce el EGFR expresado aberrantemente, como se encuentra en el
EGFR amplificado y el de2-7EGFR. En un aspecto
particularmente preferido el anticuerpo es el mAb 806, o uno de sus
fragmentos activos. En un aspecto adicionalmente preferido el
anticuerpo de la presente invención comprende las secuencias de
aminoácidos de VH y VL representadas en las Figuras 14 (SEQ ID NO:
2) y Figuras 15 (SEQ ID NO: 4) respectivamente.
En otro aspecto, la invención proporciona un
anticuerpo capaz de competir con el anticuerpo 806, en condiciones
en las que se bloquea la unión de al menos un 10% de un anticuerpo
que tiene las secuencias de VH y VL del anticuerpo 806 a
de2-7EGFR mediante competición con semejante
anticuerpo en un análisis ELISA. En particular, se contemplan
anticuerpos anti-idiotípicos y se ilustran en la
presente memoria. Los anticuerpos anti-idiotípicos
LMH-11, LMH-12 y
LMH-13 se proporcionan en la presente memoria.
Un polipéptido aislado que consiste
esencialmente en el epítopo que comprende los restos
273-501 del EGFR de tipo salvaje, normal maduro
(restos 6-234 de de2-7 EGFR maduro)
forma otro aspecto de la presente invención. El péptido de la
invención es particularmente útil en análisis o kits de diagnóstico
y terapéuticamente o profilácticamente, incluyendo en forma de
vacuna contra tumores o anticancerosa. De este modo las
composiciones del péptido de la presente invención incluyen
composiciones farmacéuticas y composiciones inmunogénicas.
La unión de un anticuerpo a su antígeno diana
está mediada por las regiones determinantes de la complementariedad
(CDR) de sus cadenas pesadas y ligeras, siendo el papel de la CDR3
de particular importancia. Por consiguiente, los miembros de unión
específica basados en las regiones CDR3 de la cadena pesada o
ligera, y preferiblemente ambas, de mAb806 serán miembros de unión
específica útiles para la terapia in vivo. Las CDR del
anticuerpo mAb 806 se muestran en las Figuras 16 y 17.
Por consiguiente, las proteínas de unión
específica tales como los anticuerpos que están basados en el
anticuerpo mAb 806 identificado, particularmente las regiones CDR
3, serán útiles para elegir como diana los tumores con EGFR
amplificado independientemente de su estado de2-7
EGFR. Puesto que el mAb 806 no se une significativamente al
receptor de tipo salvaje. normal, no habría una absorción
significativa en tejido normal, una limitación de los anticuerpos
contra EGFR que están siendo desarrollados en la actualidad (18,
19). En los dibujos adjuntos, se muestra en la Figura 14 la
secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) y la traducción de la
misma (SEQ ID NO: 2) del gen 806 VH. El gen VL del anticuerpo 806
se muestra en la Figura 15 como secuencia de ácido nucleico (SEQ ID
NO: 3) y secuencia de aminoácidos pronosticada (SEQ ID NO: 4). En
las Figuras 16 y 17, que representan las secuencias polipeptídicas
de VH y VL de mAb 806, las CDR se indican en recuadros.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un miembro de unión específica aislado capaz de unirse
aun antígeno, donde dicho miembro de unión específica comprende un
dominio de unión al polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos esencialmente presentada como los restos
115-123 del SEQ ID NO: 2. La invención proporciona
adicionalmente dicho miembro de unión específica aislado que
comprende adicionalmente uno o ambos dominios de unión al
polipéptido esencialmente presentada como los restos
44-54 y 68-83 del SEQ ID NO: 2,
preferiblemente ambos. Un ejemplo de semejante realización es la
secuencia expuesta esencialmente en el SEQ ID NO: 2. En una
realización preferida, los dominios de unión son portados por un
marco del anticuerpo humano.
En otro aspecto, la invención proporciona un
miembro de unión específico aislado capaz de unirse a un antígeno
tumoral, donde dicho miembro de unión específica comprende un
dominio de unión al polipéptido que comprende una secuencia de la
cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 del SEQ ID
NO: 2, junto con una cadena ligera que comprende las CDR cuyas
secuencias de aminoácidos son esencialmente las encontradas en el
SEQ ID NO: 4. Un ejemplo de semejante realización es la secuencia
que se muestra esencialmente en el SEQ ID NO: 4. En una realización
preferida, las CDR son portadas por un marco de un anticuerpo
humano.
En aspectos adicionales, la invención
proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia
que codifica un miembro de unión específico como se ha definido
antes, y los métodos para la preparación de los miembros de unión
específicos de la invención que comprenden expresar dichos ácidos
nucleicos en condiciones que ocasionen la expresión de dicho
miembro de unión, y recuperar el miembro de unión.
Otro aspecto adicional más de la invención son
las composiciones de tales proteínas de unión con proteínas de
unión adicionales, tales como las proteínas de unión que se unen a
EGFR, preferiblemente inhibiendo la unión del ligando a esta. Tales
composiciones pueden ser cócteles de "una aplicación", kits,
etcétera, formulados preferiblemente para facilitar la
administración.
Los miembros de unión específica de acuerdo con
la invención se pueden utilizar en un método de tratamiento o
diagnosis del organismo humano o animal, tal como un método de
tratamiento de un tumor en un paciente humano que comprende
administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un miembro de
unión específico de la invención.
La presente invención también se refiere a una
molécula de ADN recombinante o un gen clonado, o una de sus
variantes degeneradas, que codifica un anticuerpo de la presente
invención; preferiblemente una molécula de ácido nucleico, en
particular una molécula de ADN recombinante o gen clonado, que
codifica la VH del anticuerpo que tiene una secuencia de
nucleótidos o es complementaria a una secuencia de ADN mostrada en
la Figura 14 (SEQ ID NO: 1). En otra realización, la presente
invención también se refiere a una molécula de ADN recombinante o
gen clonado, o una de sus variantes degeneradas, preferiblemente una
molécula de ácido nucleico, en particular una molécula de ADN
recombinante o gen clonado, que codifica la VL del anticuerpo que
tiene una secuencia de nucleótidos o es complementaria a una
secuencia de ADN mostrada en la Figura 15 (SEQ ID NO: 3).
La presente invención también incluye
polipéptidos o anticuerpos que tienen las actividades indicadas en
la presente memoria, y que presentan las secuencias de aminoácidos
mostradas y descritas antes y en las Figuras 14 y 15 de la presente
y seleccionadas entre los SEQ ID NO: 2 y 4.
En una realización adicional de la invención, la
secuencia de ADN completa de la molécula de ADN recombinante o gen
clonado proporcionado en la presente memoria puede estar conectado
operativamente a una secuencia de control de la expresión que puede
ser introducida en un anfitrión apropiado. La invención se extiende
por consiguiente a anfitriones unicelulares transformados con el
gen clonado o la molécula de ADN recombinante que comprende una
secuencia de ADN que codifica la VH y/o VL presentes, o sus
porciones, del anticuerpo, y más concretamente, la VH y/o VL
expuestas antes y en los SEQ ID NO: 1 y 3.
La presente invención contempla naturalmente
diversos medios para la preparación de los anticuerpos y sus
fragmentos activos, incluyendo como se ilustra en la presente
memoria las técnicas recombinantes conocidas, y por consiguiente se
pretende que la invención abarque tales preparaciones de anticuerpo
sintético o quimérico dentro de su alcance. El aislamiento del ADNc
y las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria
facilita la reproducción del anticuerpo de la presente invención
mediante tales técnicas recombinantes, y por consiguiente, la
invención se extiende a los vectores de expresión preparados a
partir de las secuencias de ADN descritas para su expresión en
sistemas anfitriones mediante técnicas de ADN recombinante, y a los
anfitriones transformados resul-
tantes.
tantes.
La presente invención proporciona fármacos u
otras entidades, incluyendo anticuerpos tales como anticuerpos
anti-idiotípicos, que son capaces de unirse al
anticuerpo modulando, inhibiendo o potenciando de ese modo la
actividad del anticuerpo. Así, se proporcionan y se ilustran en la
presente memoria anticuerpos anti-idiotípicos para
mAb806. Tales anticuerpos anti-idiotípicos serían
útiles en el desarrollo de fármacos que se unirían específicamente
a anticuerpos tales como mAb806 o su epítopo o que potenciarían su
actividad.
La utilidad diagnóstica de la presente invención
se extiende al uso de los anticuerpos de la presente invención en
análisis para caracterizar tumores o muestras celulares o para
escrutar tumores o cáncer, incluyendo análisis diagnósticos in
vitro e in vivo.
En un inmunoanálisis, se puede preparar una
cantidad de control de los anticuerpos, o similares y se pueden
marcar con una enzima, un compañero de unión específico y/o un
elemento radiactivo, y después se pueden introducir en una muestra
celular. Una vez que el material marcado o su compañero o sus
compañeros de unión han tenido la oportunidad de reaccionar con los
sitios de la muestra, se puede examinar la masa resultante mediante
técnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza de la marca
unida.
Los miembros de unión específica de la invención
pueden llevar una marca detectable o funcional. Los miembros de
unión específica pueden llevar marcas radiactivas, tales como los
isótopos H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35}, Cl^{36},
Cr^{51}, Co^{57}, Co^{58}, Fe^{59}, Y^{90}, I^{121},
I^{124}, I^{125}, I^{131}, In^{111}, At^{211},
Au^{198}, Cu^{67}, Ac^{225}, Bi^{213}, Tc^{99} y
Re^{186}. Cuando se utilizan marcas radiactivas, se pueden
emplear procedimientos de recuento asequibles en la actualidad
conocidos para identificar y cuantificar los miembros de unión
específica. En el caso en el que la marca es una enzima, la
detección se puede completar mediante cualquiera de las técnicas
colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas,
amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas conocidas en la
técnica.
Los miembros de unión específica radiomarcados,
particularmente los anticuerpos y sus fragmentos, son útiles en
técnicas diagnósticas in vitro y en técnicas de formación de
imágenes radiológicas in vivo. En un aspecto adicional de la
invención, los miembros de unión específica radiomarcados,
concretamente los y sus fragmentos, particularmente los productos
radioinmunoconjugados, son útiles en radioinmunoterapia,
particularmente como anticuerpos radiomarcados para la terapia
contra el cáncer. En un aspecto adicional, los miembros de unión
específica radiomarcados particularmente los anticuerpos y sus
fragmentos, son útiles en las técnicas de cirugía
radioinmuno-guíada, donde pueden identificar e
indicar la presencia y/o o localización de células cancerosas,
células precancerosas, células tumorales, y células
hiperproliferativas, antes de, durante o después de la cirugía para
eliminar tales células.
Los productos inmunoconjugados o las proteínas
de fusión con anticuerpos de la presente invención, donde los
miembros de unión específica, particularmente anticuerpos y sus
fragmentos, de la presente invención están conjugados o anclados a
otras moléculas o agentes incluyen adicionalmente, pero no están
limitados a miembros de unión conjugados con un agente de ablación
química, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotóxico,
agente quimioterapéutico o fármaco.
La presente invención incluye un sistema de
análisis que puede ser preparado en forma de un kit de ensayo para
el análisis cuantitativo del grado de presencia, por ejemplo de EGFR
amplificado o de2-7EGFR. El sistema o kit de ensayo
puede comprender un componente marcado preparado mediante una de las
técnicas radiactivas y/o enzimáticas comentadas en la presente
memoria, acoplamiento de una marca al anticuerpo, y uno o más de
reactivos inmunoquímicos adicionales, al menos uno de los cuales es
un componente libre o inmovilizado que va a ser determinado o su
compañero o compañeros de fusión.
En una realización adicional, la presente
invención hace referencia a ciertos métodos terapéuticos que
estarían basados en la actividad del miembro de unión, anticuerpo,
o sus fragmentos activos, o en agentes u otros fármacos que se ha
determinado que poseen la misma actividad. Un primer método
terapéutico está asociado con la prevención o tratamiento del
cáncer, incluyendo, pero no limitado al de cabeza y cuello, mama,
próstata y glioma.
En particular, los miembros de unión y
anticuerpos de la presente invención, y en una realización concreta
el anticuerpo 806 cuyas secuencias están presentes en los SEQ ID NO:
2 y 4 en la presente memoria, o sus fragmentos activos, y los
anticuerpos quiméricos (biespecíficos) o sintéticos derivados de
ellos pueden ser preparados en composiciones farmacéuticas,
incluyendo un vehículo, portador o diluyente adecuado, para la
administración en los casos en los que la terapia es apropiada, por
ejemplo para tratar el cáncer. Tales composiciones farmacéuticas
también pueden incluir métodos de modulación de la vida media de los
miembros de unión, anticuerpos o fragmentos mediante métodos
conocidos en la técnica tal como la pegilación. Tales composiciones
farmacéuticas pueden comprender anticuerpos o agentes terapéuticos
adicionales.
De este modo, una composición de la presente
invención puede ser administrada sola o combinada con otros
tratamientos, sustancias terapéuticas o agentes, ya sea
simultáneamente o sucesivamente dependiendo de la condición que se
vaya a tratar. Además, la presente invención contempla e incluye
composiciones que comprenden el miembro de unión, concretamente
anticuerpo o su fragmento, descrito en la presente memoria y otros
agentes o sustancias terapéuticas tales como agentes
anti-cancerosos o terapéuticos, agentes o
anticuerpos anti-EGFR, o moduladores inmunitarios.
Más generalmente estos agentes anticancerosos pueden ser inhibidores
de tirosina quinasa o inhibidores de la cascada de fosforilación,
moduladores post-traduccionales, inhibidores del
crecimiento o la división celular (p. ej.
anti-mitóticos), inhibidores de PDGFR o inhibidores
de la transducción de la señal. Otros tratamientos o agentes
terapéuticos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de
fármacos de fármacos que alivian el dolor tales como los fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos (p. ej.
aspirina, paracetamol, ibuprofeno o cetoprofeno) u opiáceos tales
como morfina, o anti-eméticos. De este modo, estos
agentes pueden ser agentes específicos anti-EGFR,
tales como AG1478, o pueden ser agentes
anti-cancerosos y anti-neoplásicos
más generales, incluyendo los ejemplos no limitantes doxorrubicina,
carboplatino y cisplatino. Además, la composición puede ser
administrada con moduladores inmunitarios, tales como
interleuquinas, factor de necrosis tumoral (TNF) u otros factores
de crecimiento, citoquinas u hormonas tales como dexametasona que
estimula la respuesta inmunitaria y la reducción o eliminación de
las células cancerosas o tumores. La composición también puede ser
administrada con, o puede incluir combinaciones con otros
anticuerpos anti-EGFR, incluyendo pero no limitados
a los anticuerpos anti-EGFR anticuerpos 528; 225;
SC-03; 108 (ATCC HB9764) Patente de los Estados
Unidos Núm. 6.217.866; 14E1 (Patente de los Estados Unidos Núm.
5.942.602); DH8.3; L8A4; Y10; HuMAX-EGFr
(Genmab/Medarex); ICR62; y ABX-EGF
(Abgenix).
(Abgenix).
La presente invención también incluye miembros
de unión, incluyendo anticuerpos y sus fragmentos, que se unen
covalentemente o se asocian de otro modo con otras moléculas o
agentes. Estas otras moléculas o agentes incluyen, pero no están
limitados a, moléculas (incluyendo anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos) con características de reconocimiento distintas,
toxinas, ligandos, y agentes quimioterapéuticos.
Otros objetos y ventajas se harán evidentes para
los expertos en la técnica a partir de una revisión de la
consiguiente descripción detallada, que continúa con la referencia a
los siguientes dibujos ilustrativos, y las reivindicaciones
adjuntas.
La Figura 1 presenta los resultados del análisis
de citometría de flujo de líneas celulares de glioma. Se tiñeron
células U87MG (histogramas gris claro) y
U87MG.\Delta2-7 (histogramas gris oscuro) con
anticuerpo IgG2b irrelevante (histogramas vacíos), DJ8.3
(específico para de2-7 EGFR), MAb 806 o 528 (se une
tanto al tipo salvaje como a de2-7 EGFR) según se
indique.
Las Figuras 2A.C presentan los resultados del
ELISA de los anticuerpos MAb 806, DH8.3 y 528. (A) Unión de
concentraciones crecientes de anticuerpo MAb 806 (\ding{115})
DH8.3 (\medbullet) o 528 (\blacksquare) a placas de ELISA
recubiertas con sEGFR. (B) Inhibición de la unión de MAb 806 y 528 a
placas de ELISA recubiertas con sEGFR por concentraciones
crecientes de sEGFR en solución. (C) La unión de concentraciones
crecientes de DH8.3 al péptido de empalme de2-7
ilustra las curvas de unión para los anticuerpos mAb 806 y 528 a
sEGFR de tipo salvaje inmovilizado.
Las Figuras 2D y 2E presentan gráficamente los
resultados de los estudios de unión BIAcore utilizando péptido
biotinilado C-terminal e incluyendo un anticuerpo
monoclonal de la invención, junto con otros anticuerpos conocidos,
entre ellos el anticuerpo L8A4 que reconoce el péptido de empalme
del de2-7 EGFR mutante, y controles.
La Figura 3 describe la internalización del
anticuerpo MAb 806 y DH8.3. Se pre-incubaron células
U87MG.\Delta2-7 con MAb 806 (\ding{115}) o
DH8.3 (\medbullet) a 4ºC, se transfirieron a 37ºC y se determinó
la internalización mediante FACS. Los datos representan la
internalización media en cada momento puntual \pm DT de 3 (DH8.3)
o 4 (MAb 806) experimentos separados.
Las Figuras 4A y 4B ilustran la biodistribución
(% DI/g tumor) de (a) MAb 806-I^{125} y (b) DH8.3
I^{131} radiomarcados en ratones carentes de sistema inmunitario
que portan xenoinjertos U87MG y U87MG.\Delta2-7.
Cada punto representa la media de 5 ratones \pm DT excepto para 1
hr donde n = 4.
Las Figuras 5A y 5B ilustran la biodistribución
de los anticuerpos MAb 806 I^{125} (barra vacía) y DH8.3
I^{131} (barra opaca) radiomarcados expresada como las razones (a)
tumor:sangre o (b) tumor:hígado en ratones carentes de sistema
inmunitario que portaban xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7. Cada barra representa la media
de 5 ratones \pm DT excepto para 1 hr donde n = 4.
La Figura 6 ilustra el análisis de citometría de
flujo de líneas celulares que contienen la amplificación del gen
EGFR. Las células A431 fueron teñidas con MAb 806, DH8.3 o 528
(histogramas en negro) y comparadas con el anticuerpo IgG2b
irrelevante (histograma vacío).
Las Figuras 7A y 7B ilustran la biodistribución
(% DI/g tumor) de (a) MAb 806-I^{125} y (b)
528-I^{131} radiomarcados en ratones carentes de
sistema inmunitario que portaban xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 y A431.
Las Figuras 8A - 8D ilustran la biodistribución
de los anticuerpos MAb 806-I^{125} (barra vacía) y
528-I^{131} (barra opaca) y anticuerpos expresada
en forma de razones (a,b) tumor:sangre o (c,d) tumor:hígado en
ratones carentes de sistema inmunitario que portaban (a,c)
xenoinjertos U87MG\Delta2-7 y (b,d) xenoinjertos
A431.
La Figura 9 ilustra el efecto
anti-tumoral de mAb 806 sobre las velocidades de
crecimiento de xenoinjerto A) U87MG y B)
U87MG.\Delta2-7 en un modelo preventivo. Se
inyectaron s.c. 3 x 10^{6} células U87MG o
U87MG.\Delta2-7 en ambos flancos de ratones
carentes de sistema inmunitario BALB/c de 4-6
semanas de edad, (n=5) el día 0. Se inyectaron a los ratones i.p. o
bien 1 mg de mAb 806 (\medbullet); 0,1 mg de mAb 806
(\ding{115}); o bien vehículo (\medcirc) empezando un día antes
de la inoculación de las células tumorales. Se les administraron
inyecciones tres veces por semana durante dos semanas según se
indica mediante flechas. Los datos se expresan como el volumen
medio del tumor \pm D.T.
La Figura 10 ilustra el efecto
anti-tumoral de mAb 806 sobre xenoinjertos A) U87MG,
B) U87MG.\Delta2-7 y C)
U87MG.wtEGFR en un modelo establecido. Se inyectaron s.c. 3 x 10^{6} células U87MG, U87MG.\Delta2-7, o
U87MG.wtEGFR, en ambos flancos de ratones BALB/c carentes de sistema inmunitario de 4-6 semanas de edad, (n=5). Se inyectaron i.p. a los ratones dosis de 1 mg de mAb 806 (\medbullet); dosis de 0,1 mg de mAb 806 (\ding{115}); o vehículo (\medcirc) empezando cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de tumor de 65 - 80 mm^{3}. Las inyecciones se administraron tres veces por semana durante dos semanas según se indica mediante flechas. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor \pm D.T.
U87MG.wtEGFR en un modelo establecido. Se inyectaron s.c. 3 x 10^{6} células U87MG, U87MG.\Delta2-7, o
U87MG.wtEGFR, en ambos flancos de ratones BALB/c carentes de sistema inmunitario de 4-6 semanas de edad, (n=5). Se inyectaron i.p. a los ratones dosis de 1 mg de mAb 806 (\medbullet); dosis de 0,1 mg de mAb 806 (\ding{115}); o vehículo (\medcirc) empezando cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de tumor de 65 - 80 mm^{3}. Las inyecciones se administraron tres veces por semana durante dos semanas según se indica mediante flechas. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor \pm D.T.
La Figura 11 ilustra el efecto
anti-tumoral de mAb 806 sobre xenoinjertos A431 en
modelos A) preventivos y B) establecidos. Se inyectaron s.c. 3 x
10^{6} células A431 en ambos flancos de ratones BALB/c carentes
de sistema inmunitario de 4-6 semanas de edad (n=5).
Se inyectaron a los ratones i.p. o bien dosis de 1 mg de mAb 806
(\medbullet); o bien vehículo (\medcirc), empezando un día antes
de la inoculación de las células tumorales en el modelo preventivo,
o cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de tumor de
200 mm^{3}. Las inyecciones se administraron tres veces por
semana durante dos semanas como se indica mediante flechas. Los
datos se expresan como el volumen medio del tumor \pm D.T.
La Figura 12 ilustra el efecto
anti-tumoral del tratamiento con mAb 806 combinado
con el tratamiento con xenoinjertos AG1478 sobre xenoinjertos A431
en un modelo preventivo. Los datos se expresan como el volumen medio
del tumor \pm D.T.
La Figura 13 describe la unión del anticuerpo
806 a células A431 en presencia de concentraciones crecientes de
AG1478 (0,5 \muM y 5 \muM).
La Figura 14 ilustra la secuencia de ácido
nucleico y su traducción a aminoácidos del gen 806 VH (SEQ ID NO: 1
y SEQ ID NO: 2, respectivamente).
La Figura 15 ilustra la secuencia de ácido
nucleico y su traducción a aminoácidos del gen 806 VL (SEQ ID NO: 3
y SEQ ID NO: 4, respectivamente).
La Figura 16 muestra la secuencia de VH numerada
de acuerdo con Kabat, con las CDR en recuadros. Los restos clave de
VH son el 24, 37, 48, 67 y 78.
La Figura 17 muestra la secuencia de VL numerada
de acuerdo con Kabat, con las CDR en recuadros. Los restos clave de
VL son el 36, 46, 57 y 71.
La Figura 18A - 18D muestra los resultados de
estudios in vivo diseñados para determinar el efecto
terapéutico de la terapia con anticuerpos combinados,
particularmente los anticuerpos mAb806 y 528. Los ratones recibieron
inoculaciones de U87MG.D2-7 (A y B), U87MG.DK (C),
o células A431 (D).
Figura 19 A-D Análisis de
internalización mediante microscopía electrónica. Las células
U87MG.\Delta2-7 fueron
pre-incubadas con MAb 806 o DH8.3 seguido de
anti-IgG de ratón conjugado con oro a 4ºC,
transferidas a 37ºC y la internalización fue examinada en
diferentes momentos mediante microscopía electrónica. (A)
localización del anticuerpo DH8.3 en una fosita recubierta (flecha)
después de 5 min; (B) internalización de MAb 806 mediante
macropinocitosis (flecha) después de 2 min; (C) localización de
DH8.3 en lisosomas (flecha) después de 20 min; (D) localización de
MAb 806 en lisosomas (flecha) después de 30 min. El aumento
original para todas las imágenes es X30.000.
Figura 20 Autorradiografía de una sección de
xenoinjerto U87MG.\Delta2-7 recogida 8 hr después
de la inyección de MAb 806-I^{125}.
Figura 21 Análisis de citometría de flujo de
líneas celulares que contienen una amplificación del gen EGFR. Se
tiñeron células HN5 y MDA-468 con un anticuerpo
IgG2b irrelevante (histograma vacío con línea discontinua), MAb 806
(histograma en negro) o 528 (histograma vacío con líneas cerradas).
El anticuerpo DH8.3 era completamente negativo en ambas líneas
celulares (datos no mostrados).
Figura 22 Inmunoprecipitación de EGFR a partir
de líneas celulares. El EGFR fue inmunoprecipitado a partir de
células U87MG.\Delta2-7 marcadas con S^{35} o
células A431 con MAb 806, anticuerpo sc-03 o un
control de isotipo IgG2b. Las flechas en el lateral indican la
posición de de2-7 y wt EGFR. Se obtuvieron patrones
de bandas idénticos en 3 experimentos independientes.
Figura 23 Autorradiografía de una sección de
xenoinjerto de A431 recogida 24 hr después de la inyección de MAb
806-I^{125}, se indican las zonas de localización
en tejido viable (flechas).
Figura 24 A y B, aumento de la supervivencia
ratones carentes de sistema inmunitario que portan xenoinjertos
intracraneales U87 MG.\DeltaEGFR (A) y
LN-Z308.\DeltaEGFR (B) con tratamiento con mAb 806
sistémico. Las células U87 MG.\DeltaEGFR (1 x 10^{5}) o
LN-Z308.\DeltaEGFR (5 X 10^{5}) fueron
implantadas en cerebros de ratones carentes de sistema inmunitario,
y los animales se trataron con mAb 806, PBS, o isotipo IgG desde
los días 0 a 14 después de la implantación. C y D, inhibición del
crecimiento de tumores intracraneales por tratamiento con mAb 806.
Los ratones carentes de sistema inmunitario (cinco por grupo),
tratados con mAb 806 o el control de isotipo IgG, fueron
sacrificados el día 9 para U87 MG.\DeltaEGFR (C) y el día 15 para
LN-Z308.\DeltaEGFR (D), y sus cerebros fueron
recogidos, fijados, y seccionados. Los datos se calcularon tomando
el volumen de control del tumor como el 100%. Los valores son la
media \pm DT. ***, P < 0,001; control versus mAb
806. Puntas de flecha, tejido tumoral. E, aumento de la
supervivencia de ratones carentes de sistema inmunitario que portan
xenoinjertos intracraneales U87 MG.\DeltaEGFR con tratamiento con
mAb 806 intratumoral. Se implantaron células U87 MG.\DeltaEGFR
como se ha descrito. Se inyectaron 10 mg de mAb 806 o control de
isotipo IgG en un volumen de 5 \mul en el
tumor-sitio de inyección en días alternos empezando
el día 1 durante cinco veces.
Figura 25 mAb 806 prolonga la supervivencia de
los ratones con tumores cerebrales U87 MG.wtEGFR pero no con
tumores cerebrales U87 MG.DK. o U87 MG. Se implantaron células (5 X
10^{5}) U87 MG (A), U87 MG.DK (B), o U87 MG.wtEGFR (C) en
cerebros de ratones carentes de sistema inmunitario, y se trataron
los animales con mAb 806 desde el día 0 al 14 después del implante
seguido de observación una vez interrumpida la terapia.
Figura 26 A, análisis FACS de la reactividad de
mAb 806 con líneas de células U87 MG. Se tiñeron células U87 MG,
U87 MG.\DeltaEGFR, U87 MG. DK, y U87 MG.wtEGFR con mAbs
anti-EGFR 528, EGFR.1, y anticuerpo
anti-\DeltaEGFR, mAb 806. El anticuerpo
monoclonal EGFR.1 reconocía exclusivamente wtEGFR y el anticuerpo
monoclonal 528 reaccionaba tanto con wtEGFR como con \DeltaEGFR,
mAb 806 reaccionaba intensamente con U87 MG.\DeltaEGFR y U87 MG.
DK y débilmente con U87 MG.wtEGFR Barras en la abscisa,
tinción máxima de células en ausencia de anticuerpo primario. Los
resultados se reprodujeron en tres experimentos independientes. B,
inmunoprecipitación con mAb 806de formas de EGFR. El mutante y el
wtEGFR se inmunoaislaron con anticuerpos anti-EGFR,
528, o EGFR.1, o anticuerpo anti-\DeltaEGFR, mAb
806, de células (Calle 1) U87 MG, (Calle 2)
U87\Delta.EGFR, (Calle 3) U87 MG. DK, y (Calle 4)
U87 MG.wtEGFR y después se detectaron mediante transferencia Western
con anticuerpo anti-pan EGFR, C13.
Figura 27 el tratamiento con MAb 806 conduce a
una disminución del crecimiento y vasculogénesis y a un incremento
en la apoptosis y acumulación de macrófagos en tumores U87
MG.\DeltaEGFR. Las secciones de los tumores se tiñeron para
Ki-67. El índice de proliferación celular se valuó
mediante el porcentaje de células totales que eran positivas para
Ki-67 de cuatro campos de alta potencia
seleccionados al azar (X400) en tumores intracraneales de cuatro
ratones de cada grupo. Los datos son la media \pm DT. Las células
apoptóticas se detectaron mediante análisis TUNEL. El índice
apoptótico se evaluó mediante la razón de células
TUNBL-positivas:número total de células de cuatro
campos de alta potencia seleccionados al azar (X400) en tumores
intracraneales de cuatro ratones de cada grupo. Los datos son la
media \pm DT. las secciones de tumor se inmunotiñeron con
anticuerpo anti-CD31. Se analizaron las MVA
mediante análisis de imágenes por ordenador de cuatro campos
seleccionados al azar (X200) de tumores intracraneales de cuatro
ratones de cada grupo. Infiltrados peritumorales de macrófagos en
tumores U87MG.\DeltaEGFR tratados con mAb 806. Las secciones de
tumor se tiñeron con anticuerpo anti-F4/80.
Figura 28 El tratamiento sistémico con mAb 806
disminuye la fosforilación de \DeltaEGFR y la expresión de
Bcl-X_{L} en tumores cerebrales U87
MG.\DeltaEGFR. Los tumores U87 MG.\DeltaEGFR fueron extirpados
el día 9 de tratamiento con mAb 806, congelados inmediatamente en
nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC antes de la preparación del
producto lisado tumoral. A, análisis de transferencia Western de la
expresión y el grado de autofosforilación de \DeltaEGFR. Se
sometieron 30 g de productos lisados tumorales a geles de
SDS-poliacrilamida, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa, y se sondearon con mAb antifosfotirosina, después se
separaron y se volvieron a sondear con anticuerpo
anti-EGFR, C13. B, transferencia Western de
Hcl-X_{L} utilizando los mismos productos lisados
tumorales que en A. Se sondearon las membranas con anticuerpo
policlonal anti Bcl-X humano. Calles 1 y 2,
tumores cerebrales U87 MG.\DeltaEGFR tratados con control de
isotipo; Calles 3 y 4, tumores cerebrales U87
MG.\DeltaEGFR tratados con
mAb 806.
mAb 806.
Figura 29 Análisis citométrico de flujo de
líneas celulares de glioma U87 MG parentales y transfectadas. Las
células se tiñeron con anticuerpo IgG2b irrelevante (histogramas
vacíos) o anticuerpo 528 o mAb 806 (histogramas opacos)
según se indica.
Figura 30 Inmunoprecipitación de EGFR a partir
de líneas celulares. Se inmunoprecipitó EGFR a partir de células
U87 MG.wtEGFR, U87 MG. \Delta2-7, y A431 marcadas
con S^{35} con mAb806 (806), anticuerpo sc-03
(c-terminal), o un control de isotipo IgG2b (con).
Flechas, posición de de2-7 y wt EGFR.
Figura 31 Secciones en parafina teñidas con
H&E representativas de xenoinjertos U87 MG.2-7 y
U87MG.wtEGFR. Los xenoinjertos U87 MG.\Delta2-7
(recogido 24 días después de la inoculación del tumor) y U87
MG.wtEGFR (recogido 24 días después de la inoculación del tumor) se
extirparon de los ratones como se describe en la Fig. 10 anterior,
y se tiñeron con H&E. Los xenoinjertos U87
MG.\Delta2-7 tratado con vehículo (recogido 18
días después de la inoculación del tumor) y U87 MG.wtEGFR (recogido
37 días después de la inoculación del tumor) mostraron muy pocas
zonas de necrosis (panel izquierdo), mientras se observó una
necrosis extensa (flechas) tanto en xenoinjertos U87
MG.\Delta2-7 como U87 MG.wtEGFR tratados con mAb
806 (panel derecho).
Figura 32 Análisis inmunohistoquímico de la
expresión de EGFR en secciones congeladas derivadas de xenoinjertos
U87 MG, U87 MG.\Delta2-7, y U87 MG.wtEGFR. Se
recogieron secciones en los momentos descritos en la Fig. 31
anterior. Se inmunotiñeron secciones de xenoinjerto con el
anticuerpo 528 (panel izquierdo) y mAb 806 (panel
derecho). No se observó una disminución de la inmunorreactividad
para wt EGFR, EGFR amplificado, o de2-7 EGFR en los
xenoinjertos tratados con mAb 806. Coincidiendo con los datos in
vitro, los xenoinjertos U87 MG parentales fueron positivos para
el anticuerpo 528 pero fueron negativos para la tinción con mAb
806.
Figura 33. Representación esquemática de los
constructos de expresión bicistrónicos generados. La transcripción
de las cadenas del anticuerpo quimérico se inicia mediante el
promotor del Factor de Elongación-1 y se termina
mediante una secuencia de terminación artificial fuerte. Se
introdujeron secuencias IRES entre las regiones codificantes de la
cadena ligera y NeoR y la cadena pesada y el gen dhfr gene.
Figura 34. El análisis de la biodistribución de
ch806 radiomarcado con A) I^{125} o B) In^{111} se realizó en
ratones BALB/c carentes de sistema inmunitario que portaban tumores
por xenoinjerto U87MG-de2-7. Se
inyectaron a los ratones 5 \mug de anticuerpo radiomarcado y en
grupos de 4 ratones por momento puntual, se sacrificaron a las 8,
28, 48 o 74 horas. Se recogieron los órganos, se pesaron y se midió
la radiactividad en un contador gamma.
Figura 35. Describe (A) el % DI del tejido
tumoral por gramo y (B) la razón de tumor con respecto a sangre. El
anticuerpo con Indio-111 muestra aproximadamente 30%
DI/gramo de tejido y una razón tumor con respecto a tejido de
4,0.
Figura 36 describe la eficacia terapéutica del
anticuerpo quimérico ch806 en un modelo de tumor establecido. Se
inocularon 3x10^{6} células U87MG.\Delta2-7 en
100 \mul de PBS s.c en ambos flancos de ratones hembra carentes
de sistema inmunitario de 4-6 semanas de edad. El
mAb806 se incluyó como control positivo. El tratamiento se inició
cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de 50 mm^{3}
y consistió en 1 mg de ch806 o mAb806 administrado i.p. durante un
total de 5 inyecciones los días indicados. Los datos se expresaron
como el volumen medio del tumor +/- D.T. para cada grupo de
tratamiento.
Figura 37. Actividad CDC sobre la Diana A)
células U87MG.de2-7 y B) A431 para los anticuerpos
IgG1 quiméricos anti-EGFR ch806 y de control cG250.
Se presentan el porcentaje de citotoxicidad media (barras;
\pm DT) de determinaciones por triplicado.
Figura 38. ADCC sobre células dianas A)
U87MG.de2-7 y B) A431 a una razón Efector:Célula
diana de 50:1 mediado por ch806 y control de isotipo cG250
(0-10 \mug/ml). Los resultados se expresan como el
porcentaje de citotoxicidad media (barras; \pm DT) de
determinaciones por triplicado.
Figura 39. ADCC mediada por 1 \mug/ml de mAb
806 parental y ch806 sobre células U87MG.de2-7 diana
a lo largo de un intervalo de razones de Efector:Diana. Se presenta
la media (barras; \pm DT) de determinaciones por
triplicado.
Figura 40. Se seleccionaron inicialmente
veinticinco hibridomas productores de anticuerpos que se unían a
ch806 pero no la huIgG. Después siguieron cuatro de estos hibridomas
anti-ch806 con elevada afinidad de unión (clones
3E3, 5B8, 9D6 y 4D8) para la expansión clonal a partir de células
individuales mediante dilución limitante y se denominaron Ludwig
Institute for Cancer Research Melbourne Hybridome (LMH) -11, -12,
-13 y -14, respectivamente. Además, también se clonaron dos
hibridomas que producían mAbs específicos para huIgG y se
caracterizaron adicionalmente: clones 2C10 (LMH-15)
y 2B8 (LMH-16).
Figura 41. Después de la expansión clonal, se
examinaron los sobrenadantes de cultivo de hibridoma por triplicado
mediante ELISA en cuanto a la capacidad para neutralizar la unión
al antígeno de ch806 o mAb 806 con sEGFR621. Los resultados medios
(\pm DT) demostraron la actividad antagónica de los mAb
anti-idiotipo LMH-11, -12, -13 y -14
con el bloqueo en solución de la unión de ch806 y mAb 806 murino a
placas recubiertas con sEGFR (LMH-14 no
mostrado).
Figura 42. Se recubrieron placas de
microtitulación con 10 \mug/ml de A) LMH-11, B)
LMH-12 y C) LMH-13 purificados. Los
tres clones purificados se compararon en cuanto a su capacidad para
capturar ch806 o mAb 806 en suero o FCS/Medio al 1% y después se
detectaron ch806 o mAb806 unidos. Se incluyeron los anticuerpos de
control de isotipo hu3S193 y m3S193 en suero y FCS/Medio al 1%
además de los controles para un producto conjugado secundario
avidina-HRP y sustrato ABTS. Los resultados se
presentan como la media (\pm DT) de muestras por triplicado
utilizando LMH-12 biotinilado (10 \mug/ml) para la
detección e indican que el LMH-12 utilizado para la
captura y detección tenía la máxima sensibilidad para ch806 en suero
(3 ng/ml) con una unión de fondo insignificante.
Figura 43. Validación de las condiciones de
ELISA farmacocinético óptimo utilizando 1 \mug/ml de
LMH-12 anti-idiotipo y 1 \mug/ml
de LMH-12 biotinilado para la captura y detección,
respectivamente. Se realizaron tres ELISA separados por
cuadruplicado para medir ch806 en suero de donante (\medbullet) de
tres donantes sanos o BSA/medio al 1% (\blacksquare) con control
de isotipo hu3S193 en suero (\ding{115}) o BSA/medio al 1%
(\ding{116}). También se incluyeron los controles para producto
conjugado secundario avidina-HRP (\ding{117}) y
sustrato ABTS (hexagonal) solo con cada ELISA. Los resultados
medios (\pm DT) demuestran curvas de unión altamente reproducibles
para medir ch806 (2 \mug/ml - 1,6 ng/ml) en sueros con un límite
de detección de 3 ng/ml. (n=12; 1-100 ng/ml,
Coeficiente de Variación < 25%; 100 ng/ml- 5 \mug/ml,
Coeficiente de Variación < 15%). No era evidente ninguna unión
de fondo con ninguno de los tres sueros sometidos a ensayo y se
observó una unión insignificante con el control de isotipo
hu3S193.
La Figura 44 describe una inmunotransferencia de
sEGFR recombinante expresado en células CHO, transferido con
mAb806. Se trató sEGFR recombinante con PNGasaF para separar la
glicosilación unida a N (desglicosilada), o sin tratar (no
tratada), la proteína se hizo correr sobre SDS-PAGE,
se transfirió a la membrana y se inmunotransfirió con mAb 806.
La Figura 45 describe la inmunoprecipitación de
EGFR a partir de líneas celulares marcadas con S^{35} (U87MG
\Delta2-7, U87MG-wtEGFR, y A431)
con diferentes anticuerpos (anticuerpos SC-03, 806 y
528).
La Figura 46 describe la inmunoprecipitación de
EGFR a partir de diferentes células (A431 y
U87MG\Delta2-7) en diferentes momentos puntuales
(tiempo 0 a 240 minutos) después del marcaje por pulsos con
metionina/cisteína S^{35}. Se utilizan anticuerpos 528 y 806 para
la inmunoprecipitación.
La Figura 47 describe la inmunoprecipitación de
EGFR a partir de diferentes líneas celulares
(U87MG\Delta2-7, U87MG-wtEGFR y
A431) con diferentes anticuerpos (SC-03, 806 y 528)
en ausencia de (-) y después de la digestión con Endo H (+) para
separar el elevado contenido de carbohidratos del tipo con alto
contenido de manosa.
La Figura 48 describe la yodación en la
superficie celular de las líneas celulares A431 y
U87MG\Delta2-7 seguido de inmunoprecipitación con
el anticuerpo 806, y con o sin digestión con Endo H, confirmando que
el EGFR unido por el mAb 806 sobre la superficie celular de las
células A431 es una forma sensible a EndoH.
De acuerdo con la presente invención se pueden
emplear mecanismos de la biología molecular, la microbiología, y el
ADN recombinante convencionales dentro del conocimiento práctico de
la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la
literatura. Véase, p. ej., Sambrook et al, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in
Molecular Biology" Volúmenes I-III [Ausubel, R.
M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook"
Volúmenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))];
"Current Protocols in Immunology" Volúmenes
I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)];
"Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic
Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)];
"Transcription And Translation" [B.D. Hames & SJ. Higgins,
eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed.
(1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)];
B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning"
(1984).
Por lo tanto, si aparecen en la memoria, los
siguientes términos tendrán las definiciones expuestas más
abajo.
El término "miembro de unión específica"
describe un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad
de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específico pueden
ser obtenidos naturalmente o producidos sintéticamente parcial o
totalmente. Un miembro del par de moléculas tiene una zona sobre su
superficie, o una cavidad, que se une específicamente y por lo
tanto es complementaria a una organización espacial y polar
concreta del otro miembro del par de moléculas. De este modo los
miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente
entre sí. Los ejemplos de los tipos de pares de unión específica son
antígeno-anticuerpo,
biotina-avidina, hormona-receptor de
hormona, receptor-ligando,
enzima-sustrato. Esta solicitud se ocupa de las
reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.
El término "expresión aberrante" en sus
diferentes formas gramaticales puede significar e incluir cualquier
expresión aumentada o alterada o expresión en exceso de una proteína
en un tejido, p. ej. un incremento en la cantidad de una
proteína, causado por cualquier método incluyendo un aumento de la
expresión o traducción, una modulación del promotor o un regulador
de la proteína, una amplificación de un gen de una proteína, o un
aumento de la vida media o la estabilidad, de manera que existe o se
puede detectar en cualquier momento más proteína, en contraste con
un estado sin expresión en exceso. La expresión aberrante incluye y
contempla cualquier escenario o alteración en el que la expresión
de la proteína o la maquinaria de modificación
post-traduccional en una célula es exigida o
interrumpida de otro modo debido a un aumento de la expresión o a un
incremento de los niveles o cantidades de una proteína, incluyendo
cuando se expresa una proteína alterada, en forma de una proteína
mutada o variante debido a una alteración, deleción o inserción de
la secuencia, o a un plegamiento alterado.
Es importante apreciar que el término
"expresión aberrante" ha sido seleccionado específicamente en
la presente memoria para abarcar el estado en el que están
presentes cantidades/niveles anormales (normalmente incrementados)
de la proteína, con independencia de la causa eficaz de esa cantidad
o nivel anormal. De este modo, las cantidades anormales de proteína
puede resultar de la expresión en exceso de la proteína en ausencia
de amplificación del gen, que es el caso p. ej. en muchas
muestras de células/tejidos tomadas de la cabeza y el cuello de
sujetos con cáncer, mientras otras muestras exhiben niveles
anormales de proteína atribuibles a amplificación génica.
Con respecto a esto último, algunos de los
trabajos de los autores de la presente invención que se presentan
en la presente memoria para ilustrar la invención incluyen el
análisis de muestras, algunas de las cuales muestran niveles de
proteína anormales resultantes de la amplificación de EFGR. Esto por
lo tanto explica la presentación en la presente memoria de
descubrimientos experimentales en los que se hace referencia a la
amplificación y el uso de los términos
"amplificación/amplificado" y similares al describir niveles
anormales de EFGR. No obstante, es la observación de las cantidades
o niveles anormales de la proteína la que define el entorno o la
circunstancia en la que se contempla la intervención clínica como
recurso para los miembros de unión de la invención, y por esta
razón, la presente memoria considera que el término "expresión
aberrante" capta más ampliamente el entorno causal que produce
la correspondiente anomalía en los niveles de EGFR.
Por consiguiente, mientras se entiende que los
términos "expresión en exceso" y "amplificación" en sus
diferentes formas gramaticales tienen significados técnicos
distintos, se deben considerar equivalentes entre sí, en tanto que
representan el estado en el que están presentes los niveles
anormales de proteína EGFR en el contexto de la presente invención.
Por consiguiente, el término "expresión aberrante" ha sido
seleccionado ya que se cree que subsume los términos "expresión
en exceso" y "amplificación" dentro de su alcance para los
fines de la presente memoria, de manera que todos los términos
pueden ser considerados equivalentes entre sí según se utilizan en
la presente memoria.
El término "anticuerpo" describe una
inmunoglobulina ya sea natural o producida parcial o totalmente
sintéticamente. El término también abarca cualquier polipéptido o
proteína que tenga un dominio de unión que sea, o sea homólogo a,
un dominio de unión de un anticuerpo. Este término también contempla
los anticuerpos injertados con CDR.
Como los anticuerpos pueden ser modificados de
varias maneras, se debe considerar que el término "anticuerpo"
abarca cualquier miembro de unión específico o sustancia que tenga
un dominio de unión con la especificidad requerida. De este modo,
este término abarca fragmentos de anticuerpos, derivados,
equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo
cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión de
inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintético.
Por lo tanto se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un
dominio de unión de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro
polipéptido. La clonación y expresión de los anticuerpos quiméricos
se describen en los documentos
EP-A-0120694 y
EP-A-0125023 y en las Patentes de
los Estados Unidos Núms. 4.816.397 y 4.816.567.
Se ha demostrado que los fragmentos de un
anticuerpo completo pueden realizar la función de unirse a
antígenos. Los ejemplos de los fragmentos de unión son (i) el
fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii)
el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el
fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único
anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature
341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH;
(v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2,
un fragmento bivalentes que comprende dos fragmentos Fab unidos
(vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), donde un dominio VH y
un dominio VL están unidos por un conector peptídico que permite que
los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a un
antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426,
1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883,
1988); (viii) fragmentos de anticuerpos multivalentes (dímeros scFv,
trímeros y/o tetrámeros (Power y Hudson, J Immunol. Methods 242:
193-204 9 (2000)) (ix) dímeros Fv de cadena sencilla
biespecíficos (PCT/US92/09965) y (x) "fragmentos
biespecíficos" (diabodies), fragmentos multivalentes o
multiespecíficos construidos mediante fusión génica (documento
WO94/13804; P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
6444-6448, (1993)).
Un "sitio de combinación de un anticuerpo"
es aquella porción estructural de una molécula de anticuerpo
comprendida por regiones variables e hipervariables de la cadena
ligera o la cadena pesada y ligera que se une específicamente al
antígeno.
La frase "molécula de anticuerpo" en sus
diferentes formas gramaticales según se utiliza en la presente
memoria contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta
como una porción inmunológicamente activa de una molécula de
inmunoglobulina.
Las moléculas de anticuerpo ilustrativas son
moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina
esencialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de
inmunoglobulina que contienen el parátopo, incluyendo aquellas
porciones conocidas en la técnica tales como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v), cuyas porciones se prefieren
para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente
memoria.
Los anticuerpos también pueden ser
biespecíficos, donde un dominio de unión del anticuerpo es un
miembro de unión específica de la invención, y el otro dominio de
unión tiene una especificidad diferente, p. ej. para
reclutar una función efectora o similar. Los anticuerpos
biespecíficos de la presente invención incluyen el caso en el que
un dominio de unión del anticuerpo es un miembro de unión específico
de la presente invención, incluyendo uno de sus fragmentos, y el
otro dominio de unión es un anticuerpo distinto o uno de sus
fragmentos, incluyendo un anticuerpo anti-EGFR
distinto, por ejemplo el anticuerpo 528 (Patente de los Estados
Unidos Núm. 4.943.533), el anticuerpo 225 quimérico y humanizado
(Patente de los Estados Unidos Núm. 4.943.533 y documento
WO/9640210), un anticuerpo
anti-de2-7 tal como DH8.3 (Hills, D.
et al (1995) Int. J. Cancer
63(4):537-543), un anticuerpo L8A4 y Y10
(Reist, CJ et al (1995) Cancer Res.
55(19):4375-4382; Foulon CF et al.
(2000) Cancer Res. 60(16):4453-4460), ICR62
(Modjtahedi H et al (1993) Cell Biophys.
Enero-Junio; 22(1.3):129-46;
Modjtahcdi et al (2002) P.A.A.C.R.
55(14):3140-3148, o el anticuerpo de
Wikstrand et al (Wikstrand C. et al (1995) Cancer
Res. 55(14):3140-3148). El otro dominio de
unión puede ser un anticuerpo que reconoce o elige como diana un
tipo concreto de célula, como en un anticuerpo específico de células
neurales o gliales. En los anticuerpos biespecíficos de la presente
invención el dominio de unión del anticuerpo de la invención se
puede combinar con otros dominios de unión o moléculas que
reconocen receptores celulares concretos y/o modulan células de una
manera concreta, como por ejemplo un modulador inmunitario (p. ej.,
interleuquina(s)), un modulador del crecimiento o citoquina
(p. ej. factor de necrosis tumoral (TNF), y particularmente,
la modalidad biespecífica de TNF mostrada en el documento U.S.S.N.
60/355,838 presentado el 13 de Febrero de 2002) o una toxina (p.
ej., ricina) o un agente o factor anti-mitótico
o apoptótico.
Las porciones Fab y F(ab')_{2} de las
moléculas de anticuerpo se pueden preparar mediante reacción
proteolítica con papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas
de anticuerpo esencialmente intactas mediante métodos que son bien
conocidos. Véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm.
4.342.566 de Theofilopolous et al. Las porciones de la
molécula de anticuerpo Fab' también son bien conocidas y son
producidas a partir de porciones F(ab')_{2} seguido de
reducción de los enlaces disulfuro que unen las dos porciones de la
cadena pesada con mercaptoetanol, y seguido de alquilación del
mercaptano de la proteína resultante con un reactivo tal como
yodoacetamida. En la presente memoria se prefiere un anticuerpo que
contiene moléculas de anticuerpo intactas.
La expresión "anticuerpo monoclonal" en sus
diferentes formas gramaticales hace referencia a un anticuerpo que
tiene solamente una especie de sitio de combinación del anticuerpo
capaz de inmunorreaccionar con un antígeno concreto. Un anticuerpo
monoclonal presenta de ese modo una única afinidad de unión por
cualquier antígeno con el cual inmunorreacciona. Un anticuerpo
monoclonal también puede contener una molécula de anticuerpo que
tenga una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpos, cada
uno inmunoespecífico para un antígeno diferente; p. ej., un
anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).
El término "dominio de unión al antígeno"
describe la parte de un anticuerpo que comprende la zona que se une
específicamente y es complementario a una parte o a todo un
antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo se puede
unir a una parte concreta del antígeno solamente, cuya parte se
denomina epítopo. Un dominio de unión a un antígeno puede ser
proporcionado por uno o más dominios variables de un anticuerpo.
Preferiblemente, un dominio de unión a un antígeno comprende una
región variable de una cadena ligera del anticuerpo (VL) y una
región variable de una cadena pesada de un anticuerpo (VH).
"Modificación
post-traduccional" puede abarcar una modificación
cualquiera o una combinación de modificaciones, incluyendo una
modificación covalente, que experimenta una proteína una vez que la
traducción se ha completado y después de haber sido liberada desde
el ribosoma o sobre el polipéptido naciente
co-traduccionalmente. La modificación
post-traduccional incluye pero no está limitada a
fosforilación, miristoilación, ubicuitinación, glicosilación,
anclaje de coenzima, metilación y acetilación. La modulación
post-traduccional puede modular o influir en la
actividad de una proteína, en su destino intracelular o
extracelular, en su estabilidad o vida media, y/o su reconocimiento
por ligandos, receptores u otras proteínas. La modificación
post-traduccional se puede producir en orgánulos
celulares, en el núcleo o citoplasma o extracelularmente.
El término "específico" se puede utilizar
para hacer referencia a la situación en la que un miembro de un par
de unión específico no mostrará ninguna unión significativa con
moléculas distintas de su compañero o compañeros de unión
específica. El término también es aplicable p. ej. cuando un
dominio de unión al antígeno es específico para un epítopo concreto
que es portado por numerosos antígenos, en cuyo caso el miembro de
unión específica que lleva el dominio de unión al antígeno será
capaz de unirse a los diferentes antígenos que lleven el
epítopo.
El término "comprende" se utiliza
generalmente en el sentido de incluye, es decir que permite la
presencia de uno o más rasgos o componentes.
El término "que consiste esencialmente en"
hace referencia a un producto, particularmente una secuencia
peptídica, de un número definido de restos que no está anclado
covalentemente a un producto más grande. En el caso del péptido de
la invención referido antes, los expertos en la técnica apreciarán
que se pueden contemplar sin embargo modificaciones menores en el
extremo N o C del péptido, tales como la modificación química del
extremo para añadir un grupo protector o similar, p. ej. la
amidación del extremo C.
El término "aislado" hace referencia al
estado en el que estarán los miembros de unión específica de la
invención, o el ácido nucleico o que codifica tales miembros de
unión, de acuerdo con la presente invención. Los miembros y el
ácido nucleico estarán libres o esencialmente libres de material con
el cual están asociados naturalmente tales como otros polipéptidos
o ácido nucleicos que se encuentran en su entorno natural, o el
entorno en el cual se preparan (p. ej. cultivo celular)
cuando semejante preparación es mediante tecnología de ADN
recombinante practicada in vitro o in vivo. Los
miembros y ácidos nucleicos se pueden formular con diluyentes o
coadyuvantes e incluso con fines prácticos pueden ser aislados - por
ejemplo los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros
portadores si se utilizan para recubrir placas para su uso en
inmunoanálisis, o se mezclarán con portadores o diluyentes
farmacéuticamente aceptables cuando se utilicen en diagnosis o
terapia. Los miembros de unión específica pueden estar
glicosilados, naturalmente o por medio de sistemas de células
eucarióticas heterólogas, o pueden no estar glicosilados (por
ejemplo si se producen mediante la expresión en una célula
procariótica).
Asimismo, según se utiliza en la presente
memoria, los términos "glicosilación" y "glicosilado"
incluyen y abarcan la modificación
post-traduccional de las proteínas, denominadas
glicoproteínas, mediante la adición de oligosacáridos. Los
oligosacáridos se añaden en sitios de glicosilación de las
glicoproteínas, incluyendo particularmente oligosacáridos unido a N
y oligosacáridos unidos O. Los oligosacáridos unidos a N se añaden
en un resto Asn, particularmente cuando el resto Asn está en la
secuencia N-X-S/T, donde X no puede
ser Pro ni Asp, y son los más comunes encontrados en las
glicoproteínas. En la biosíntesis glicoproteínas unidas a N, se
forma primero un oligosacárido de tipo alto contenido de manosa
(formado generalmente por dolicol,
N-Acetilglucosamina, manosa y glucosa en el
retículo endoplásmico (RE). Después las glicoproteínas de tipo alto
contenido de manosa se transportan desde el RE al aparato de Golgi,
donde se producen un procesamiento y modificación adicionales de
los oligosacáridos. Los oligosacáridos unidos a N se añaden al grupo
hidroxilo de los restos Ser o Thr. En los oligosacáridos unidos a
o, primero se transfiere N-Acetilglucosamina al
resto Ser o Thr por medio de la
N-Acetilglucosaminiltransferasa en el RE. La
proteína se mueve después al aparato de Golgi donde se producen una
modificación y una elongación de la cadena por adición. Las
modificaciones unidas a O se pueden producir con la simple adición
del monosacárido OG1cNAc monosacárido solo en aquellos sitios de Ser
o Thr que también pueden ser fosforilados en condiciones diferentes
en lugar de glicosilados.
Según se utiliza en la presente memoria,
"pg" representa picogramos, "ng" representa nanogramos,
"ug" o "\mug" representan microgramos, "mg"
representa miligramos, "ul" o "\mul" representa
microlitros, "ml" representa mililitros, "l" representa
litros.
Los términos "anticuerpo 806",
"mAb806", "ch806" y cualquiera de las variantes no
enumerada específicamente, pueden ser utilizados en la presente
memoria indistintamente, y según se utilizan en la presente
solicitud y en las reivindicaciones hacen referencia a material
proteináceo incluyendo proteínas individuales o múltiples, y se
extiende a aquellas proteínas que tienen los datos de la secuencia
de aminoácidos descritos en la presente memoria y presentados en el
SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 4, y el anticuerpo quimérico ch806 que
se incorpora y forma parte de los SEQ ID NO: 7 y 8, y el perfil de
actividades expuesto en la presente memoria y en las
Reivindicaciones. Por consiguiente, se contemplan del mismo modo las
proteínas que presentan una actividad esencialmente equivalente o
alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo,
tales como las modificaciones obtenidas a través de la mutagénesis
dirigida al sitio, o puede ser accidental, tales como las obtenidas
a través de mutaciones en anfitriones que son productores del
complejo o sus denominadas subunidades. Asimismo, se pretende que
los términos "anticuerpo 806", "mAb806" y "ch806"
incluyan en su alcance proteínas citadas específicamente en la
presente memoria así como todos los análogos y variaciones alélicas
esencialmente homólogos.
Se prefiere que los restos aminoácido descritos
en la presente memoria estén en forma isomérica "L". Sin
embargo, los restos en forma isomérica "D" se pueden sustituir
por cualquier resto aminoácido L, con tal que el polipéptido
conserve la propiedad funcional de unión a inmunoglobulina deseada.
NH_{2} hace referencia al grupo amino libre presente en el
extremo amino de un polipéptido. COOH hace referencia al grupo
carboxi libre presente en el extremo carboxi de un polipéptido. De
acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos convencional, J. Biol.
Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas para los
restos aminoácido se muestran en la siguiente Tabla de
Correspondencias:
Se debe observar que todas las secuencias de
restos aminoácido se representan en la presente memoria mediante
fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la orientación
convencional de extremo amino a extremo carboxi. Además, se debe
observar que un guión al principio o al final de una secuencia de
restos aminoácido indica un enlace peptídico a una secuencia
adicional de uno o más restos aminoácido. La Tabla anterior se
presenta para relacionar las notaciones de tres letras y una letra
que pueden aparecer de manera alternativa en la presente
memoria.
memoria.
Un "replicón" es cualquier elemento
genético (p. ej., plásmido, cromosoma, virus) que funciona
como unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es,
susceptible de replicación bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, fago o cósmido, al que se puede anclar otro segmento de
ADN con el fin de ocasionar la replicación del segmento anclado.
Una "molécula de ADN" hace referencia la
forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina,
timina, o citosina) en su forma de hebra sencilla, o en una hélice
de doble hebra. Este término hace referencia solamente a la
estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a
ninguna de sus formas terciarias concretas. De este modo, este
término incluye ADN de doble hebra encontrado, entre otros, en
moléculas de ADN lineal (p. ej., fragmentos de restricción),
virus, plásmidos, y cromosomas. En el estudio de la estructura de
moléculas de ADN de doble hebra concretas, las secuencias pueden ser
descritas en la presente memoria de acuerdo con la convención
normal de dar solamente la secuencia en dirección 5' a 3' junto con
la hebra no transcrita de ADN (esto es, la hebra que tiene una
secuencia homóloga al ARNm).
Un "origen de replicación" hace referencia
a aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis de
ADN.
ADN.
Una "secuencia codificante" de ADN es una
secuencia de ADN de doble hebra que es transcrita y traducida a un
polipéptido in vivo cuando se coloca abajo el control de
secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia
codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo
5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3'
(carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no está
limitada a, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico,
secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (p. ej., de
mamífero), e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una señal de
poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción
están localizadas normalmente en 3' con respecto a la secuencia
codificante.
Las secuencias de control transcripcional y
traduccional son secuencias reguladoras de ADN, tales como
promotores, intensificadores, señales de poliadenilación,
terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una
secuencia codificante en una célula anfitriona.
Una "secuencia promotora" es una región
reguladora de ADN susceptible de unirse a la ARN polimerasa en una
célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas
abajo (dirección 3'). Con el fin de definir la presente invención,
la secuencia promotora es unida en su extremo 3' por el sitio de
inicio de la transcripción y se extiende aguas arriba (dirección
5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios
para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del
fondo. En la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio
de la transcripción (definido convenientemente por el mapeo con
nucleasa S1), como también los dominios de unión a proteínas
(secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
Los promotores eucarióticos comprenderán, a menudo, cajas
"TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarióticos
contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de
las secuencias consenso -10 y -35.
Una "secuencia de control de la expresión"
es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y la
traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificante está
bajo el control de las secuencias de control transcripcional y
traduccional en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la
secuencia codificante a ARNm, que después es traducido a la
proteína codificada por la secuencia codificante.
Se puede incluir una "secuencia señal"
antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un
péptido señal, N-terminal con respecto al
polipéptido, que se comunica con la célula anfitriona para dirigir
el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido al
medio, y este péptido señal desenganchado por la célula anfitriona
antes de que la proteína deje la célula. Se pueden encontrar
secuencias señal asociadas con una variedad de proteínas nativas de
procariotas y eucariotas.
El término "oligonucleótido," según se
utiliza en la presente memoria en referencia a la sonda de la
presente invención, se define como una molécula comprendida por dos
o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño
exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependerán de la
función y uso últimos del oligonucleó-
tido.
tido.
El término "cebador" según se utiliza en la
presente memoria hace referencia a un oligonucleótido, ya sea de
origen natural en forma de un producto purificado de la digestión
con enzimas de restricción ya sea producido sintéticamente, que es
capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca
en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de
extensión con cebadores, que es complementario a una hebra del
ácido nucleico, esto es, en presencia de nucleótidos y un agente
inductor tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH
adecuados. El cebador puede ser de hebra sencilla o de doble hebra y
debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto
de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud
exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la
temperatura, la fuente del cebador y el uso del método. Por
ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la
complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico
contiene típicamente 15-25 o más nucleótidos, aunque
puede contener menos nucleótidos.
Los cebadores de la presente memoria se
seleccionan para que sean "esencialmente" complementarios a
diferentes hebras de una secuencia de ADN diana concreta. Esto
representa que los cebadores deben ser suficientemente
complementarios para hibridar con sus respectivas hebras. Por lo
tanto, no es necesario que la secuencia del cebador refleje la
secuencia exacta del molde. Por ejemplo, se puede anclar un
fragmento nucleotídico no complementario al extremo 5' del cebador,
siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria a la
hebra. Alternativamente, se pueden intercalar bases no
complementarias o secuencias más largas en el cebador, siempre que
la secuencia del cebador sea suficientemente complementaria a la
secuencia de la hebra para hibridar con ellas y formar de ese modo
el molde para la síntesis del producto de extensión.
Según se utilizan en la presente memoria, los
términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de
restricción" hacen referencia de enzimas bacterianas, cada una
de las cuales cortan el ADN de doble hebra en o cerca de una
secuencia de nucleótidos específica.
Una célula ha sido "transformada" por ADN
exógeno o heterólogo cuando semejante ADN ha sido introducido dentro
de la célula. El ADN transformante puede ser integrado o no (unido
covalentemente) en el ADN cromosómico completando el genoma de la
célula. En procariotas, levadura, y células de insecto por ejemplo,
el ADN transformante puede ser mantenido sobre un elemento
episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células
eucarióticas, una célula transformada establemente es aquella en la
se ha integrado ADN transformante en el cromosoma de manera que es
heredado por las células hijas a través de la replicación del
cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la
célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones
comprendidos por una población de células hijas que contienen el
ADN transformante. Un "clon" es una población de células
derivadas de una única célula o ancestro común por mitosis. Una
"línea celular" es un clon de una célula primaria que es
susceptible de crecimiento estable in vitro durante muchas
generaciones.
Dos secuencias de ADN son "esencialmente
homólogas" cuando al menos aproximadamente 75% (preferiblemente
al menos aproximadamente 80%, y muy preferiblemente al menos
aproximadamente 90 o 95%) de los nucleótidos se emparejan a lo
largo de una longitud definida de las secuencias de ADN. Las
secuencias que son esencialmente homólogas se pueden identificar
comparando las secuencias utilizando un soporte lógico convencional
en los bancos de datos de secuencias, o en un experimento de
hibridación de Southern, por ejemplo, en condiciones restrictivas
definidas para ese sistema concreto. La definición de las
condiciones de hibridación apropiadas está dentro del alcance del
experto en la técnica. Véanse, p. ej., Maniatis et
al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra;
Nucleic Acid Hybridization, supra.
Se debe apreciar que también están dentro del
alcance de la presente invención las secuencias de ADN que codifican
miembros de unión específica (anticuerpos) de la invención que
codifican p. ej. un anticuerpo que tiene la misma secuencia
de aminoácidos como el SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, pero que son
degenerados para el SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. Por "degenerado
para" se quiere significar que se utiliza un codón de tres letras
diferente para especificar un aminoácido concreto. Es bien sabido
en la técnica que se pueden utilizar los siguientes codones
indistintamente para codificar cada aminoácido específico:
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se debe entender que los codones especificados
antes son para las secuencias de ARN. Los correspondientes codones
para ADN tienen U sustituido por T.
Se pueden realizar mutaciones en el SEQ ID NO: 2
o SEQ ID NO: 4 de manera que se cambia un codón por un codón que
codifica un aminoácido diferente. Semejante mutación se realiza
generalmente llevando a cabo los menores cambios de nucleótidos
posibles. Se puede realizar una mutación por sustitución de esta
clase para cambiar un aminoácido de la proteína resultante de una
manera no conservativa (esto es, cambiando el codón de un aminoácido
perteneciente a un agrupamiento de aminoácidos que tiene un tamaño
concreto o característico por un aminoácido perteneciente a otro
agrupamiento) o de una manera conservativa (esto es, cambiando el
codón de un aminoácido perteneciente a un agrupamiento de
aminoácidos que tiene un tamaño concreto o característico por un
aminoácido perteneciente al mismo agrupamiento). Semejante cambio
conservativo conduce generalmente a un cambio menor en la
estructura y función de la proteína resultante. Es más probable que
un cambio no conservativo altere la estructura, actividad o función
de la proteína resultante. Se debe considerar que la presente
invención incluye secuencias que contienen cambios conservativos
que no alteran significativamente la actividad o características de
unión de la proteína resultante.
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Lo siguiente es un ejemplo de diferentes
agrupamientos de aminoácidos:
Aminoácidos con grupos R no polares
Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina,
Fenilalanina, Triptófano, Metionina
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Aminoácidos con grupos R polares no
cargados
Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina,
Asparagina, Glutamina
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Aminoácidos con grupo R polares cargados
(cargados negativamente a pH 6,0)
Ácido Aspártico, Ácido Glutámico
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Aminoácidos Alcalinos (cargados
positivamente a pH 6,0)
Lisina, Arginina, Histidina (a pH 6,0)
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Otros agrupamientos pueden ser aquellos
aminoácidos con grupos Fenilo:
Fenilalanina, Triptófano, Tirosina
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Otro agrupamiento puede ser de acuerdo con el
peso molecular (esto es, tamaño de los grupos R):
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Las sustituciones particularmente preferidas
son:
- \bullet
- Lys por Arg y viceversa de manera que se puede mantener una carga positiva;
- \bullet
- Glu por Asp y viceversa de manera que se puede mantener una carga negativa;
- \bullet
- Ser por Thr de manera que se puede mantener un -OH libre; y
- \bullet
- Gln por Asn de manera que se puede mantener un NH_{2} libre.
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Las sustituciones de aminoácidos también se
pueden introducir para sustituir un aminoácido con una propiedad
particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir una Cys
en un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Se puede
introducir una His en un sitio particularmente "catalítico"
(esto es, His puede actuar como ácido o base y es el aminoácido más
común en catálisis bioquímica). Se puede introducir Pro debido a su
estructura particularmente plana, que induce giros \beta en la
estructura de la proteína.
Dos secuencias de aminoácidos son
"esencialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente 70%
de los restos aminoácido (preferiblemente al menos aproximadamente
80%, y muy preferiblemente al menos aproximadamente 90 o 95%) son
idénticos, o representan sustituciones conservativas.
Una región "heteróloga" del constructo de
ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de
ADN más grande que no se encuentra asociado con la molécula más
grande en la naturaleza. De este modo, cuando la región heteróloga
codifica un gen de mamífero, el gen estará flanqueado normalmente
por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma
del organismo de origen. Otro ejemplo de secuencia codificante
heteróloga es un constructo en el que la propia secuencia
codificante no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un
ADNc donde la secuencia codificante genómica contiene intrones, o
secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen
nativo). Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales que
ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN
como se define en la presente memoria.
La expresión "farmacéuticamente aceptable"
hace referencia a entidades moleculares y composiciones que son
fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción
alérgica o perjudicial similar, tal como trastorno gástrico, mareo
y similares, cuando se administran a un ser humano.
La expresión "cantidad terapéuticamente
eficaz" se utiliza en la presente memoria para representar una
cantidad suficiente para evitar, y preferiblemente reducir el menos
en un 50 por ciento, preferiblemente al menos un 70 por ciento,
preferiblemente al menos 80 por ciento, preferiblemente al menos
90%, un cambio clínicamente significativo en el crecimiento o
progreso o actividad mitótica de una masa celular, grupo de células
cancerosas o tumor diana, u otro rasgo de la patología. Por
ejemplo, se puede reducir el grado de activación o actividad o
cantidad de EGFR o el número de células positivas para EGFR,
particularmente de anticuerpos o miembros de unión reactivos o de
células positivas.
Una secuencia de ADN está "conectada
operativamente" a una secuencia de control de la expresión cuando
la secuencia de control de la expresión controla y regula la
transcripción y traducción de esa secuencia de ADN. El término
"conectado operativamente" incluye que tiene una señal de
inicio apropiada (p. ej., ATG) delante de la secuencia de
ADN que se va a expresar y que mantiene el marco de lectura correcto
para permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control
de la secuencia de control de la expresión y la producción del
producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si el gen que
se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene
una señal de inicio apropiada, semejante señal de inicio se puede
insertar delante del gen.
El término "condiciones de hibridación
convencionales" hace referencia a unas condiciones de sal y
temperatura esencialmente equivalentes a 5 x SSC y 65ºC tanto para
la hibridación como para el lavado. Sin embargo, un experto en la
técnica apreciará que semejantes "condiciones de hibridación
convencionales" dependen de condiciones concretas incluyendo la
concentración de sodio y magnesio en el tampón, la longitud y
concentración de la secuencia de nucleótidos, el porcentaje de
emparejamientos erróneos, el porcentaje de formamida, y similares.
También es importante en la determinación de las "condiciones de
hibridación convencionales" si las dos secuencias que hibridan
son ARN-ARN, ADN-ADN o
ARN-ADN. Tales condiciones de hibridación
convencionales son determinadas fácilmente por un experto en la
técnica de acuerdo con fórmulas bien conocidas, donde la hibridación
es típicamente 10-20ºC más baja que la T_{m}
pronosticada o determinada con lavados de mayor restricción, si se
desea.
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La presente invención proporciona un anticuerpo
aislado o uno de sus fragmentos que reconoce un epítopo de EGFR que
se encuentra en células tumorigénicas o hiperproliferativas o
células que expresan en exceso EGFR o que expresan un mutante de
EGFR, donde dicho anticuerpo o fragmento activo del mismo (i) se une
a EGFR de tipo salvaje humano unida a la célula solamente cuando el
EGFR es amplificado o expresado en exceso; (ii) se une a
de2-7 EGFR en un epítopo distinto del péptido de
empalme del LEEKKGNYVVTDH y (iii) se une a un epítopo en la
secuencia de restos 273-501 del EGFR de tipo salvaje
humano.
El miembro de unión específica novedoso de la
invención, concretamente un anticuerpo o uno de sus fragmentos,
incluyendo los fragmentos inmunogénicos, reconoce un epítopo de EGFR
que se encuentra en células tumorigénicas, hiperproliferativas o
anómalas en las que el epítopo es aumentado o evidenciado tras la
modificación post-traduccional aberrante y no
detectable en células normales o de tipo salvaje. En una realización
concreta pero no limitante, el miembro de unión, tal como el
anticuerpo, reconoce un epítopo de EGFR que está aumentado o
evidenciado tras una simple modificación de carbohidrato o una
glicosilación temprana y es reducido o no evidente en presencia de
una modificación compleja de carbohidratos o una glicosilación. El
miembro de unión específica, tal como el anticuerpo o uno de sus
fragmentos, no se une ni reconoce células normales o de tipo salvaje
que contienen un epítopo EGFR normal o de tipo salvaje en ausencia
de expresión en exceso y en presencia de una modificación
post-traduccional de EGFR normal.
La invención se refiere a un miembro de unión
específica, particularmente un anticuerpo o uno de sus fragmentos,
que reconoce un epítopo de EGFR que está presente en células que
expresan un EGFR amplificado o que expresan el
de2-7 EGFR y no detectable en células que expresan
EGFR normal o de tipo salvaje, particularmente en presencia de una
modificación post-traduccional normal.
Se observa adicionalmente y se demuestra en la
presente memoria que una observación o característica no limitante
adicional de los anticuerpos de la presente invención es su
reconocimiento de su epítopo en presencia de grupos con elevado
contenido de manosa, que es una característica de la glicosilación
temprana o la modificación simple de carbohidratos. De este modo,
la glicosilación alterada o aberrante facilita la presencia y/o
reconocimiento del epítopo del anticuerpo o comprende una porción
del epítopo del anticuerpo.
La glicosilación incluye y abarca la
modificación post-traduccional de proteínas,
denominadas glicoproteínas, por adición de oligosacáridos. Los
oligosacáridos se añaden en sitios de glicosilación en las
glicoproteínas, incluyendo particularmente oligosacáridos unidos a
N y oligosacáridos unidos a O. Los oligosacáridos unidos a N se
añaden a un resto Asn, particularmente cuando el resto Asn está en
la secuencia N-X-S/T, donde X no
puede ser Pro ni Asp, y son los más comunes encontrados en la
glicoproteínas. En la biosíntesis de las glicoproteínas unidas a N,
se forma primero un oligosacárido de tipo alto contenido de manosa
(comprendido generalmente por dolicol,
N-Acetilglucosamina, manosa y glucosa en el retículo
endoplásmico (RE). Las glicoproteínas de tipo elevado contenido de
manosa se transportan después desde el RE al aparato de Golgi, donde
se producen normalmente el procesado y modificación adicionales de
los oligosacáridos. Los oligosacáridos unidos a O se añaden al
grupo hidroxilo de los restos Ser o Thr. En los oligosacáridos
unidos a O, primero se transfiere la
N-Acetilglucosamina al resto Ser o Thr por medio de
la N-Acetilgucosaminiltransferasa en el RE. Después
la proteína se traslada al aparato de Golgi donde se producen la
modificación y la elongación de la cadena.
En un aspecto concreto de la invención y como se
ha establecido antes, los autores de la presente invención han
descubierto anticuerpos monoclonales novedosos, ilustrados en la
presente memoria por el anticuerpo denominado mAb 806 y su
quimérico ch806, que reconocen específicamente el EGFR de tipo
salvaje amplificado y el de2-7 EGFR, se unen a un
epítopo distinto del péptido de empale único de la mutación
de2-7 EGFR. Los anticuerpos de la presente
invención reconocen específicamente el EGFR expresado en exceso,
incluyendo el EGFR amplificado y el EGFR mutante (ilustrado en la
presente memoria por la mutación de2-7),
particularmente tras la modificación
post-traduccional aberrante. Adicionalmente, si bien
mAb 806 no reconoce el EGFR de tipo salvaje normal expresado sobre
la superficie celular de células de glioma, se une al dominio
extracelular del EGFR inmovilizado sobre la superficie de placas
ELISA, indicando un epítopo conformacional con un aspecto
polipeptídico. En gran medida, mAb 806 no se unía específicamente a
tejidos normales tales como hígado y piel, que expresan niveles de
wt EGFR endógeno que son superiores que en la mayoría de los otros
tejidos normales, ero en los que el EGFR no está expresado en
exceso ni amplificado. De este modo, mAb806 demuestra una
especificidad novedosa y útil, que reconoce de2-7
EGFR y EGFR amplificado, a la vez que no reconoce el EGFR de tipo
salvaje normal o el único péptido de empalme que es característico
de de2-7 EGFR.
En un aspecto preferido, el anticuerpo es uno
que tiene las características del anticuerpo que los autores de la
invención han identificado y caracterizado, en particular que
reconoce el EGFR amplificado y el de2-7EGFR. En un
aspecto particularmente preferido el anticuerpo es el mAb 806, o sus
fragmentos activos. En un aspecto preferido adicional el anticuerpo
de la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos de
VH y VL representadas en Figura 14 (SEQ ID NO: 2) y en la Figura 15
(SEQ ID NO: 4) respectivamente.
El epítopo del miembro de unión específica o
anticuerpo se localiza en la región que comprende los restos
273-501 de la secuencia de EGFR normal o de tipo
salvaje y de este modo las proteínas de unión específica
proporcionadas tales como anticuerpos, se unen al
de2-7 EGFR en un epítopo localizado en la región que
comprende los restos 273-501 de la secuencia de
EGFR. El epítopo puede ser determinado mediante cualquiera de las
técnicas de mapeo epitópico convencionales conocidas por los
expertos en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que
codifica los restos 273-501 podría ser digerida, y
los fragmentos resultantes expresados en un anfitrión adecuado. La
unión del anticuerpo se podría determinar como se ha mencionado
antes.
En particular, el miembro se unirá a un epítopo
que comprende los restos 273-501 del EGFR normal o
de tipo salvaje maduro. No obstante también forman un aspecto de la
invención otros anticuerpos que muestran el mismo patrón de
reactividad o uno esencialmente similar. Esto se puede determinar
comparando tales miembros con un anticuerpo que comprende los
dominios VH y VL mostrados en el SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4
respectivamente. La comparación se hará típicamente utilizando una
transferencia Western en la cual los miembros de unión se unen a
transferencias duplicadas preparadas a partir de una preparación
nuclear de células de manera que el patrón de unión se pueda
comparar directamente.
En otro aspecto, la invención proporciona un
anticuerpo capaz de competir con el anticuerpo 806, en condiciones
en las que se bloquea la unión de al menos el 10% de un anticuerpo
que tiene las secuencias VH y VL del anticuerpo 806 con
de2-7EGFR por competición con semejante anticuerpo
en un análisis ELISA. Como se ha expuesto antes, en la presente
memoria se contemplan y se ilustran anticuerpos
anti-idiotípicos.
Un polipéptido aislado que consiste
esencialmente en el epítopo que comprende los restos
273-501 del EGFR de tipo salvaje maduro (restos
6-234 del de2-7 EGFR maduro) forma
otro aspecto de la presente invención. El péptido de la invención
es particularmente útil en los análisis diagnósticos o kits y
terapéuticamente o profilácticamente, incluyendo en forma de vacuna
anti-tumoral o anti-cancerosa. De
este modo las composiciones del péptido de la presente invención
incluyen composiciones farmacéuticas y composiciones
inmunogénicas.
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La especificidad única de los miembros de unión
específica, concretamente anticuerpos o sus fragmentos, de la
presente invención, que se definen en la reivindicación 1,
proporciona usos diagnósticos y terapéuticos para identificar,
seleccionar como diana y tratar, reducir o eliminar numerosos tipos
de células tumorigénicas y tipos de tumores, por ejemplo tumores de
cabeza y cuello, mama, pulmón, vejiga o próstata y glioma, sin los
problemas asociados con la absorción por tejidos normales que se
pueden observar con los anticuerpos para EGFR conocidos
previamente. De este modo, las células que expresan EGFR en exceso
(p. ej. por amplificación o expresión de un EGFR mutante o
variante), particularmente aquellas que demuestran una modificación
post-traduccional aberrante pueden ser reconocidas,
aisladas, caracterizadas, elegidas como diana y tratadas o
eliminadas utilizando el miembro o los miembros de unión,
concretamente el anticuerpo o los anticuerpos o sus fragmentos de la
presente invención.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
clasificar de este modo específicamente la naturaleza de los
tumores o células tumorigénicas con EGFR, tiñendo o reconociendo de
otro modo esos tumores o células en los que se encuentra presente
la expresión en exceso de EGFR, concretamente la amplificación y/o
la mutación de EGFR, particularmente de2-7EGFR.
Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención, como
ilustra mAb 806 y el anticuerpo quimérico ch806, demuestran una
actividad anti-tumoral in vivo significativa
contra tumores que contienen EGFR amplificado y contra xenoinjertos
de2-7 EGFR positivos.
Como se ha esbozado antes, los autores de la
invención han descubierto que el miembro de unión específico de la
invención reconoce las formas asociadas a tumores del EGFR
(de2-7 EGFR y EGFR amplificado) pero no el receptor
normal de tipo salvaje cuando es expresado en células normales. Se
cree que el reconocimiento del anticuerpo depende de una
modificación post-traduccional aberrante (p.
ej., una única variante de glicosilación, acetilación o
fosforilación) del EGFR expresado en células que muestran una
expresión en exceso del gen EGFR.
Como se describe más abajo, mAb 806 y ch806 han
sido utilizados en estudios terapéuticos. Se demuestra que mAb 806
y ch806 inhiben el crecimiento de xenoinjertos con EGFR expresado en
exceso (p. ej. amplificado) y de xenoinjertos de expresan
de2-7 EGFR humano de tumores humanos e inducen una
necrosis significativa en tales tumores.
Por otra parte, los anticuerpos de la presente
invención inhiben el crecimiento de tumores intracraneales en un
modelo representativo. Este modelo implica inyectar células de
glioma que expresan de2-7 EGFR en ratones carentes
de sistema inmunitario y después inyectar el anticuerpo
intracranealmente o bien el mismo día o a los 1 a 3 días,
opcionalmente con dosis repetidas. Las dosis de anticuerpo son
adecuadamente de aproximadamente 10 \mug. Los ratones a los que
se ha inyectado el anticuerpo se comparan con controles, y se ha
descubierto que la supervivencia de los ratones tratados aumenta
significativamente.
Por lo tanto, en un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un miembro de unión específico de la
invención para su uso en un método de tratamiento de un tumor, un
estado canceroso, un estado precanceroso, y cualquier estado
relacionado con o resultante de un crecimiento celular
hiperproliferativo.
Los anticuerpos de la presente invención se
diseñan para ser utilizados en métodos de diagnosis y tratamiento
de tumores en sujetos humanos o animales, particularmente tumores
epiteliales. Estos tumores pueden ser tumores sólidos primarios o
secundarios de cualquier tipo incluyendo, pero no limitados a,
glioma, tumores de mama, pulmón, próstata, cabeza o cuello.
La metodología general para elaborar anticuerpos
monoclonales por medio de hibridomas es bien conocida. También se
pueden crear líneas celulares productoras de anticuerpos, inmortales
mediante técnicas distintas de la fusión, tales como la
transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o la
transfección con virus Epstein-Barr. Véase, p.
ej., M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques"
(1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies And
T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al.,
"Monoclonal Antibodies" (1980); véanse también las Patentes de
los Estados Unidos Núms. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887;
4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; 4.493.890.
Los paneles de anticuerpos monoclonales
producidos contra EFGR pueden ser escrutados en busca de diferentes
propiedades; esto es, isotipo, epítopo, afinidad, etc. Tienen un
interés particular los anticuerpos monoclonales que imitan la
actividad del EFGR o sus subunidades. Tales monoclonales pueden ser
fácilmente identificados en análisis de actividad de miembros de
unión específica. Los anticuerpos de elevada afinidad también son
útiles cuando es posible la purificación por inmunoafinidad de un
miembro de unión específica nativo o recombinante.
Los métodos para producir anticuerpos
anti-EGFR policlonales son bien conocidos en la
técnica. Véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.493.795 de
Nestor et al. Se puede preparar un anticuerpo monoclonal, que
contiene típicamente porciones Fab y/o F(ab')_{2} de
moléculas de anticuerpo útiles, utilizando la tecnología de
hibridomas descrita en Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y
Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988). En
resumen, para formar el hibridoma a partir del cual se produce la
composición de anticuerpo monoclonal, se fusiona un mieloma u otra
línea celular auto-perpetuante con linfocitos
obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con un EGFR
apropiado.
Los esplenocitos se fusionan típicamente con
células de mieloma utilizando polietilenglicol (PEG) 6000. Los
híbridos fusionados se seleccionan por su sensibilidad a HAT. Los
hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil en la
práctica de esta invención se identifican por su capacidad para
inmunorreaccionar con el presente anticuerpo o miembro de unión y
su capacidad para inhibir la actividad tumorigénica o
hiperproliferativa en células diana.
Se puede producir un anticuerpo monoclonal útil
en la práctica de la presente invención iniciando un cultivo de
hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene
un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo con la
especificidad antigénica apropiada. El cultivo se mantiene en
condiciones y durante un período de tiempo suficiente para que el
hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo al medio. Después se
recoge el medio que contiene el anticuerpo. Las moléculas de
anticuerpo se pueden aislar después mediante técnicas bien
conocidas.
Los medios útiles para la preparación de estas
composiciones son bien conocidos en la técnica y asequibles
comercialmente e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones
endogámicos y similares. Un medio sintético ilustrativo es el medio
esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al.,
Virol. 8:396 (1959)) con un suplemento de 4,5 gm/l de
glucosa, 20 mm de glutamina, y suero de ternera fetal al 20%. Una
cepa de ratón endogámica ilustrativa es Balb/c.
Los métodos para producir anticuerpos
anti-EGFR monoclonales también son bien conocidos en
la técnica. Véase Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:4949-4953 (1983). Típicamente, se utiliza el EGFR
o un análogo peptídico solo o conjugado con un portador
inmunogénico, como el inmunógeno del procedimiento descrito antes
para producir anticuerpos monoclonales anti-EGFR.
Los hibridomas se escrutan en busca de su capacidad para producir
un anticuerpo que reacciona inmunológicamente con el EGFR presente
en células tumorigénicas, anormales o hiperproliferativas. Otros
anticuerpos anti-EGFR incluyen pero no están
limitados al anticuerpo HuMAX-EGFr de
Genmab/Medarex, el anticuerpo 108 (ATCC HB9764) y Patente de los
Estados Unidos Núm. 6.217.866, y el anticuerpo 14E1 de Schering AG
(Patente de los Estados Unidos Núm. 5.942.602).
En general, las regiones CDR3, que comprenden
las secuencias de aminoácidos expuestas esencialmente como regiones
CDR3 del SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 serán portadas en una
estructura que permite la unión de las regiones CDR3 a un antígeno
tumoral. En el caso de la región CDR3 del SEQ ID NO: 4, esta es
portada preferiblemente por la región VL del SEQ ID NO: 4.
Por "esencialmente expuesto" se quiere
significar que las regiones CDR3 de la invención serán idénticas u
altamente homólogas a las regiones especificadas del SEQ ID NO: 2 y
SEQ ID NO: 4. Por "altamente homóloga" se contempla que
solamente se pueden realizar unas pocas sustituciones,
preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 5, preferiblemente
de 1 a 4, o de 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones en las CDR.
La estructura para portar las CDR3 de la
invención será generalmente de una secuencia de una cadena pesada o
ligera de un anticuerpo o una de sus porciones sustanciales en las
cuales las regiones CDR3 están localizadas en localizaciones
correspondientes a la región CDR3 de dominios variables de
anticuerpos VH y VL codificados por genes de inmunoglobulina
reordenados. Las estructuras y localizaciones de dominios variables
de inmunoglobulina se pueden determinar mediante la referencia a
Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological
Interest. 4ª Edición. US Department of Health and Human Services.
1987, y sus actualizaciones, ahora disponible en Internet
(http://immuno.bme.nwu.edu)).
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos
expuesta esencialmente como restos 115-123 del SEQ
ID NO: 2 es portada como CDR3 en un dominio variable de la cadena
pesada humana o una de sus porciones esenciales, y las secuencias
de aminoácidos expuestas esencialmente como restos
44-54, 70-76 y
109-117 del SEQ ID NO: 4 son portadas como CDR
1-3 respectivamente en un dominio variable de la
cadena ligera humana o una de sus porciones esenciales.
Los dominios variables pueden derivar de
cualquier línea germinal o dominio variable humano reordenado, o
puede ser un dominio variable sintético basado en secuencias
consenso de dominios variables humanos conocidos. Las secuencias
derivadas de CDR3 de la invención, definidas en el párrafo anterior,
pueden ser introducidas en un repertorio de dominios variables que
carecen de regiones CDR3, utilizando la tecnología de ADN
recombinante.
Por ejemplo, Marks et al (Bio/Technology,
1992,10:779-783) describen métodos para producir
repertorios de dominios variables de anticuerpos en los que se
utilizan los cebadores consenso dirigidos a o adyacentes al extremo
5' de la zona del dominio variable junto con cebadores consenso para
la tercera región marco de los genes VH humanos para proporcionar
un repertorio de dominios variables de VH que carecen de CDR3. Marks
et al describen adicionalmente cómo este repertorio se puede
combinar con una CDR3 de un anticuerpo concreto. Utilizando
técnicas análogas, se pueden barajar las secuencias derivadas de
CDR3 de la presente invención con repertorios de dominios de VH y
VL combinados con un dominio de VL o VH cognado para proporcionar
miembros de unión específica de la invención. Después se puede
presentar el repertorio en un sistema anfitrión adecuado tal como
el sistema de presentación en fagos del documento WO92/01047 de
manera que se pueden seleccionar los miembros de unión específica
adecuados. Un repertorio puede constar de 10^{4} miembros
individuales hacia arriba, por ejemplo de 10^{6} a 10^{8} o
10^{10} miembros.
El barajado o las técnicas combinatorias de
análogos también son descritas por Stemmer (Nature, 1994,
370:389-391), que describe la técnica en relación
con un gen de \beta-lactamasa pero observa que se
puede utilizar el enfoque para la generación de anticuerpos.
Una alternativa adicional consiste en generar
regiones VH y VL novedosas que portan las secuencias derivadas de
CDR3 de la invención utilizando la mutagénesis al azar, por ejemplo,
de los genes VH o Vl de mAb806 para generar mutaciones en el
dominio variable completo. Semejante técnica es descrita por Gram
et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
89:3576-3580), que utiliza la PCR con predisposición
a errores.
Otro método que se puede utilizar consiste en
dirigir la mutagénesis a regiones CDR de los genes VH o VL. Tales
técnicas son descritas por Barbas et al, (1994, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) y Schier et
al (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).
Todas las técnicas descritas antes se conocen
como tales en la técnica y en sí mismas no forman parte de la
presente invención. El experto en la técnica será capaz de utilizar
tales técnicas para proporcionar miembros de unión específica de la
invención utilizando la metodología rutinaria en la técnica.
Una porción esencial de un dominio variable de
una inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones CDR,
junto con sus regiones marco intermedias. Preferiblemente, la
porción también incluirá al menos aproximadamente 50% de cualquiera
o de ambas regiones marco primera y cuarta, siendo el 50%
C-terminal de la primera región marco y el 50%
N-terminal de la cuarta región marco. Los restos
adicionales en el extremo N-terminal o
C-terminal de la porción esencial del dominio
variable pueden ser aquellos no asociados normalmente con regiones
de los dominios variables de origen natural. Por ejemplo, la
construcción de miembros de unión específicos de la presente
invención elaborados mediante técnicas de ADN recombinante puede dar
como resultado la introducción de restos N- o
C-terminales codificados por conectores introducidos
para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras
etapas de manipulación incluyen la introducción de conectores para
unir dominios variables de la invención a secuencias de proteínas
adicionales incluyendo cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros
dominios variables (por ejemplo en la producción de fragmentos
biespecíficos) o marcas de proteína como se comenta con más detalle
más abajo.
Aunque en un aspecto preferido de la invención
se prefieren los miembros de unión específica que comprenden un par
de dominios de unión basados en secuencias expuestas esencialmente
en el SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 4, los dominios de unión
individuales basados en cualquiera de estas secuencias forman
aspectos adicionales de la invención. En el caso de los dominios de
unión basados en la secuencia expuesta esencialmente en el SEQ ID
NO: 2, se pueden utilizar tales dominios de unión como agentes de
direccionamiento para antígenos tumorales puesto que se sabe que
los dominios VH de la inmunoglobulina son capaces de unirse a
antígenos diana de una manera específica.
En el caso de cualquiera de los dominios de
unión específica de cadena sencilla, se pueden utilizar estos
dominios para escrutar en busca de dominios complementarios capaces
de formar un miembro de unión específica de dos dominios que tiene
propiedades in vivo tan buenas o iguales a las del anticuerpo
mAb806 descrito en la presente memoria.
Esto se puede lograr mediante método de
escrutinio de presentación en fagos utilizando el denominado enfoque
combinatorio dual jerárquico descrito en la Patente de los Estados
Unidos 5.969.108 en el que se utiliza una colonia individual que
contiene un clon de la cadena H o L para infectar una genoteca
completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el
miembro de unión específica de bicatenario resultante se selecciona
de acuerdo con las técnicas de presentación en fagos tales como las
descritas en esa referencia. Esta técnica también es descrita por
Marks et al, ibid.
Los miembros de unión específica de la presente
invención pueden comprender adicionalmente regiones constantes de
anticuerpos o sus porciones. Por ejemplo, los miembros de unión
específica basados en el SEQ ID NO: 4 se pueden anclar en su
extremo C-terminal a dominios constantes de la
cadena ligera de un anticuerpo incluyendo cadenas C\kappa o
C\lambda, preferiblemente cadenas C\lambda. De un modo similar,
los miembros de unión específica basados en el SEQ ID NO: 2 se
pueden anclar en su extremo C-terminal a toda o
parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier
isotipo de anticuerpo, p. ej. IgG, IgA, IgE, IgD e IgM y
cualquiera de las subclases de isotipos, concretamente IgGl, IgG2b,
e IgG4. Se prefiere IgGl.
La llegada de la tecnología de los anticuerpos
monoclonales (mAb) hace 25 años ha proporcionado un enorme
repertorio de reactivos de búsqueda útiles y ha creado la
oportunidad de utilizar anticuerpos como reactivos farmacéuticos
aprobados en la terapia contra el cáncer, los trastornos
autoinmunitarios, el rechace de transplantes, la profilaxis
antiviral y como antitrombóticos (Glennie y Johnson 2000). La
aplicación de la ingeniería molecular para convertir mAb murinos en
mAb quiméricos (región V de ratón, región C humana) y reactivos
humanizados en los que solamente las regiones determinantes de la
complementariedad del mAb (VDR) son de origen murino ha sido
crítica para el éxito clínico de la terapia con mAb. Los mAb
diseñados tienen una inmunogenicidad notablemente reducida o
ausente, un incremento de la vida media en suero y la porción Fc
humana de los mAb aumenta el potencial para reclutar los efectores
inmunitarios del complemento y las células citotóxicas (Clark
2000). Las investigaciones en la biodistribución, farmacocinética y
cualquier inducción de una respuesta inmunitaria a los mAb
administrados clínicamente requiere el desarrollo de análisis para
discriminar entre las proteínas farmacéuticas y endógenas.
Los anticuerpos, o cualquiera de sus fragmentos,
también se pueden conjugar o fusionar recombinantemente a cualquier
toxina celular, bacteriana u otra, p. ej. exotoxina de
pseudomonas, ricina, o toxina de la difteria. La parte de la toxina
utilizada puede ser la toxina completa, o cualquier dominio concreto
de la toxina. Tales moléculas de anticuerpo-toxina
se han utilizado con éxito para la localización y terapia de
diferentes clases de cánceres, véase p. ej. Pastan, Biochim
Biophys Acta. 1997 Oct 24;1333(2):C1-6;
Kreitman et al., N Engl J Med. 2001 Jul
26;345(4):241-7; Schnell et al.,
Leukemia. 2000 Jan;14(1):129-35; Ghetie et
al., Mol Biotechnol. 2001
Jul;18(3):251-68.
Se pueden formar multímeros bi- y
tri-específicos por asociación de diferentes
moléculas scFv y se han diseñado como reactivos de entrecruzamiento
para el reclutamiento de células T en tumores (inmunoterapia),
redireccionamiento viral (terapia génica) y como reactivos de
aglutinación de glóbulos rojos (inmunodiagnóstico), véase p.
ej. Todorovska et al., J Immunol Methods. 2001 Feb
1;248(1-2):47-66; Tomlinson
et al., Methods Enzymol. 2000;326:461-79;
McCall et al., J Immunol. 2001 May
15;166(10):6112-7.
Los anticuerpos completamente humanos se pueden
preparar inmunizando ratones transgénicos que portan grandes
porciones de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana.
Estos ratones, ejemplos de tales ratones son Xenomouse® (Abgenix,
Inc.) (Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.075.181 y 6.150.584),
HuMAb-Mouse® (Medarex, Inc./GenPharm) (Patentes de
los Estados Unidos 5545806 y 5569825), TransChromo Mouse® (Kirin) y
KM Mouse® (Medarex/Kirin), son bien conocidos en la técnica. Después
se pueden preparar anticuerpos, p. ej. mediante técnicas de
hibridoma convencionales o mediante presentación en fagos. Estos
anticuerpos contendrán en ese caso solamente secuencias de
aminoácidos completamente humanas.
También se pueden generar anticuerpos
completamente humanos utilizando la presentación en fagos de
genotecas humanas. La presentación en fagos se puede realizar
utilizando métodos bien conocidos por el experto en la técnica,
como los de Hoogenboom et al y Marks et al (Hoogenboom
HR y Winter G. (1992) J Mol Biol.
227(2):381-8; Marks JD et al (1991) J
Mol Biol. 222(3):581-97; y también las
Patentes de los Estados Unidos 5885793 y 5969108).
Las propiedades in vivo, concretamente
con respecto a la razón tumor:sangre y a la velocidad de
aclaramiento, de los miembros de unión específica de la invención
serán como mínimo comparables con las de mAb806. Después de la
administración a un sujeto animal o humano semejante miembro de
unión específica mostrará una razón de tumor con respecto a sangre
máxima de > 1:1. Preferiblemente a dicha razón el miembro de
unión específica también tendrá una razón de tumor con respecto a
órgano de más de 1:1, preferiblemente más de 2:1, más
preferiblemente más de 5:1. Preferiblemente a semejante razón el
miembro de unión específica también tendrá una razón de órgano con
respecto a sangre de < 1:1 en los órganos alejados del sitio del
tumor. Estas razones excluyen los órganos de catabolismo y
secreción del miembro de unión específica administrado. De este modo
en el caso de los scFv y los Fab (como se muestra en los ejemplos
adjuntos), los miembros de unión se excretan por los riñones y hay
una mayor presencia aquí que en otros órganos. En el caso de las IgG
completas, el aclaramiento será al menos en parte, por el hígado.
La razón de localización máxima del anticuerpo intacto se alcanzará
normalmente entre 10 y 200 horas después de la administración del
miembro de unión específica. Más particularmente, la razón se puede
medir en un xenoinjerto de tumor de aproximadamente 0,2 - 1,0 g
formado subcutáneamente en un flanco de un ratón carente de sistema
inmunitario atímico.
Los anticuerpos de la invención se pueden
marcar con una marca detectable o funcional. Las marcas detectables
incluyen, pero no están limitadas a, marcas radiactivas tales como
los isótopos H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35}, Cl^{36},
Cr^{51}, Co^{57}, Co^{58}, Fe^{59}, Y^{90}, I^{121},
I^{124}, I^{125}, I^{131}, In^{111}, At^{211},
Au^{198}, Cu^{67}, Ac^{225}, Bi^{213}, Tc^{99} y
Re^{186}, que pueden ser ancladas a los anticuerpos de la
invención utilizando la química convencional conocida en la técnica
de formación de imágenes con anticuerpos. Las marcas también
incluyen marcas fluorescentes y marcas utilizadas convencionalmente
en la técnica para formar imágenes por MRI-CT.
También incluyen marcas enzimáticas tales como peroxidasa de rábano
picante. Las marcas incluyen adicionalmente radicales químicos tales
como biotina que pueden ser detectadas por la unión a un radical
detectable cognado específico, p. ej. avidina marcada.
Las marcas funcionales incluyen sustancias que
se diseñan para ser dirigidas al sitio del tumor para causar la
destrucción del tejido tumoral. Tales marcas funcionales incluyen
fármacos citotóxicos tales como 5-fluorouracilo o
ricina y enzimas tales como carboxipeptidasa bacteriana o
nitrorreductasa, que son capaces de convertir los profármacos en
fármacos activos en el sitio del tumor.
Asimismo, los anticuerpos que incluyen
anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, y los fármacos que
modulan la producción o actividad de los miembros de unión
específica, los anticuerpos y/o sus subunidades poseen ciertas
aplicaciones diagnósticas y se pueden utilizar, por ejemplo, con el
fin de detectar y/o medir los estados tales como el cáncer, las
lesiones precancerosas, los estados relacionados con o resultantes
del crecimiento celular hiperproliferativo o similar. Por ejemplo,
los miembros de unión específica, anticuerpos o sus subunidades se
pueden utilizar para producir anticuerpos tanto policlonales como
monoclonales para ellos mismos en una variedad de medios celulares,
mediante mecanismos conocidos tales la técnica del hibridoma que
utiliza, por ejemplo, linfocitos de bazo de ratón y células de
mieloma fusionados. Del mismo modo, se pueden descubrir o
sintetizar pequeñas moléculas que imitan o tienen un efecto
antagónico sobre la actividad o las actividades de los miembros de
unión específica de la invención, y se pueden utilizar en protocolos
diagnósticos y/o terapéuticos.
Los miembros de unión específica radiomarcados,
concretamente anticuerpos y sus fragmentos, son útiles en técnicas
diagnósticas in vitro y técnicas con radioimágenes in
vivo y en inmunoterapia. En el caso de las imágenes in
vivo, los miembros de unión específica de la presente invención
se pueden conjugar con un agente para la formación de imágenes en
lugar de uno o varios radioisótopo, incluyendo pero no limitados a
un agente potenciador de imágenes por resonancia magnética, donde
una molécula de anticuerpo se carga, por ejemplo, con un gran
número de iones paramagnéticos a través de grupos quelantes. Los
ejemplos de los grupos quelantes incluyen EDTA, porfirinas, éteres
corona de poliaminas y polioximas. Los ejemplos de los iones
paramagnéticos incluyen gadolinio, hierro, manganeso, renio,
europio, lantano, holmio y ferbio. En un aspecto adicional de la
invención, los miembros de unión específica radiomarcados,
concretamente los anticuerpos y sus fragmentos, concretamente
radioinmunoconjugados, son útiles en radioinmunoterapia,
particularmente como anticuerpos radiomarcados para la terapia del
cáncer. En un aspecto adicional, los miembros de unión específica
radiomarcados, particularmente anticuerpos y sus fragmentos, son
útiles en las técnicas de cirugía
radioinmuno-guiada, donde pueden identificar e
indicar la presencia y/o localización de células cancerosas, células
precancerosas, células tumorales, y células hiperproliferativas,
antes, durante o después de la cirugía para eliminar tales
células.
Los inmunoconjugados o las proteínas de fusión
con anticuerpos de la presente invención, donde los miembros de
unión específica, concretamente anticuerpos y sus fragmentos, de la
presente invención están conjugados o anclados a otras moléculas o
agentes incluyen adicionalmente, pero no están limitados a miembros
de unión conjugados a un agente de ablación química, toxina,
inmunomodulador, citoquina, agente citotóxico, agente
quimioterapéutico o fármaco.
La radioinmunoterapia (RAIT) ha entrado en la
clínica y ha demostrado eficacia utilizando diferentes
inmunoconjugados con anticuerpos. El anticuerpo
anti-antígeno carcinoembriónico
(anti-CEA) humanizado marcado con I^{131}
hMN-14 ha sido evaluado en cáncer colorrectal (Behr
TM et al (2002) Cancer
94(4Suppl):1373-81) y el mismo anticuerpo
con una marca de Y^{90} ha sido evaluado en carcinoma medular de
tiroides (Stein R et al (2002) Cancer
94(1):51-61). También se ha evaluado y se ha
dado cuenta de la radioinmunoterapia utilizando anticuerpos
monoclonales para linfoma no Hodgkin y cáncer pancreático
(Goldenberg DM (2001) Crit Rev Oncol Hematol
39(1-2):195-201; Gold DV
et al (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39 (1-2)
147-54). Los métodos de radioinmunoterapia con
anticuerpos concretos también se describen en las Patentes de los
Estados Unidos 6.306.393 y 6.331.175. La cirugía radioinmunoguiada
(RIGS) también ha entrado en la clínica y se ha demostrado su
eficacia y utilidad, incluyendo el uso de anticuerpos
anti-CEA y anticuerpos dirigidos contra antígenos
asociados a tumores (Kim JC et al (2002) Int J Cancer
97(4):542-7; Schneebaum S et al
(2001) World J Surg 25(12):1495-8; Avital S
et al (2000) Cancer 89(8):1692-8;
McIntosh DG et al (1997) Cancer Biother Radiopharm 12
(4):287-94).
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden administrar a un paciente que necesita tratamiento por
cualquier ruta adecuada, normalmente mediante inyección en la
corriente sanguínea o el FCE, o directamente en el sitio del tumor.
La dosis precisa dependerá de numerosos factores, incluyendo si el
anticuerpo es para diagnosis o para tratamiento, el tamaño y
localización del tumor, la naturaleza exacta del anticuerpo (ya sea
anticuerpo completo, fragmento, fragmento biespecífico, etc), y la
naturaleza de la marca detectable o funcional anclada al
anticuerpo. Cuando se utiliza un radionúclido para terapia, la dosis
individual máxima adecuada es de aproximadamente 45 mCi/m^{2}, a
un máximo de aproximadamente 250 mCi/m^{2}. La dosis preferible
está en el intervalo de 15 a 40 mCi, con un intervalo de
dosificación adicionalmente preferido de 20 a 30 mCi, o de 10 a 30
mCi. Semejante terapia puede requerir un transplante de médula ósea
o de células madre. Una dosis de anticuerpo típica para la
formación de imágenes de un tumor o para el tratamiento de un tumor
estará en el intervalo de 0,5 a 40 mg, preferiblemente de 1 a 4 mg
de anticuerpo en forma F(ab')2. Los anticuerpos desnudos se
administran preferiblemente en dosis de 20 a 1000 mg de proteína por
dosis, o de 20 a 500 mg de proteína por dosis, o de 20 a 100 mg de
proteína por dosis. Esta es una dosis para un tratamiento individual
de un paciente adulto, que puede ser ajustada proporcionalmente
para niños o bebés, y también ajustada para otros formatos de
anticuerpo en proporción con el peso molecular. Los tratamientos se
pueden repetir a intervalos diarios, bi-semanales,
semanales o mensuales, a discreción del médico.
Estas formulaciones pueden incluir una segunda
proteína de unión, tales como las proteínas de unión a EGFR
descritas supra. En una forma especialmente preferida, esta
segunda proteína de unión es un anticuerpo monoclonal tal como 528
o 225, comentados infra.
Los miembros de unión específica de la presente
invención se administrarán normalmente en forma de una composición
farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del
miembro de unión específica.
De este modo las composiciones farmacéuticas de
acuerdo con la presente invención, y para su uso de acuerdo con la
presente invención, pueden comprender, además del ingrediente
activo, un excipiente, portador, tampón, estabilizador u otras
sustancias farmacéuticamente aceptables bien conocidas por los
expertos en la técnica. Tales sustancias deben ser no tóxicas y no
deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. La
naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la
ruta de administración, que puede ser oral, o mediante inyección,
p. ej. intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden estar en comprimidos, cápsulas, polvos o
en forma líquida. Un comprimido puede comprender un portador sólido
tal como gelatina o un coadyuvante. Las composiciones farmacéuticas
líquidas generalmente comprendes un portado líquido tal como agua,
petróleo, aceites animales o vegetales, aceites minerales o aceite
sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, dextrosa
u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol,
propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, o la inyección en
el sitio de la aflicción, el ingrediente activo estará en forma de
una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de
pirógeno y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los
expertos en la técnica relacionada son capaces de preparar
soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos
tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Solución de
Ringer, Solución de Ringer con Lactato añadido. Se pueden incluir
conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/o otros
aditivos, según se requiera.
Se puede administrar una composición sola o
combinada con otros tratamientos o agentes terapéuticos, ya sea
simultáneamente o sucesivamente dependiendo de la afección que se
vaya a tratar. Además, la presente invención contempla e incluye
composiciones que comprenden el miembro de unión, concretamente un
anticuerpo o uno de sus fragmentos, descrito en la presente memoria
y otros agentes o terapéuticos tales como agentes
anti-cancerosos o terapéuticos, hormonas, agentes o
anticuerpos anti-EGFR, o moduladores inmunitarios.
Más generalmente estos agentes anti-cancerosos
pueden ser inhibidores de tirosina quinasa o inhibidores de la
cascada de fosforilación, moduladores
post-traduccionales, inhibidores del crecimiento o
la división celular (p. ej. anti-mitóticos),
o inhibidores de la transducción de la señal. Otros tratamientos o
terapéuticos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de
fármacos para aliviar el dolor tales como fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos (p. ej.
aspirina, paracetamol, ibuprofeno o cetoprofeno) u opiáceos tales
como morfina, o antieméticos. La composición se puede administrar
combinada (ya sea sucesivamente (esto es, antes o después) o
simultáneamente) con inhibidores de tirosina quinasa (incluyendo,
pero no limitados a AG1478 y ZD1839, STI571,
OSI-774, SU-6668), doxorrubicina,
temozolomida, cisplatino, carboplatino, nitrosoureas, procarbazina,
vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo,
citosinarabinósido, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina,
lomustina, y/o otros agentes quimioterapéuticos. De este modo,
estos agentes pueden ser agentes específicos
anti-EGFR, o inhibidores de la tirosina quinasa
tales como AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, o
SU-6668 o pueden ser agentes
anti-cancerosos y anti-neoplásicos
más generales tales como doxorrubicina, cisplatino, temozolomida,
nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea,
5-fluoruracilo, citosin-arabinosido,
ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina, o lomustina. Además,
la composición se puede administrar con hormonas tales como
dexametasona, moduladores inmunitarios, tales como interleuquinas,
factor de necrosis tumoral (TNF) u otros factores de crecimiento o
citoquinas que estimulan la respuesta y la reducción o eliminación
de células cancerosas o tumores. Un modulador inmunitario tal como
el TNF se puede combinar con un miembro de la invención en forma de
un anticuerpo biespecífico que reconoce el epítopo de EGFR 806 así
como receptores del TNF. La composición también se puede
administrar, o puede incluir combinaciones con otros anticuerpos
anti-EGFR, incluyendo pero no limitados a los
anticuerpos anti-EGFR 528, 225,
SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62 y
ABX-EGF.
Previamente el uso de agentes tales como
doxorrubicina y cisplatino junto con anticuerpos
anti-EGFR había producido una mejora de la
actividad anti-tumoral (Fan et al, 1993;
Baselga eal, 1993). La combinación de doxorrubicina y mAb
528 dio como resultado la erradicación total de xenoinjertos A431,
mientras el tratamiento con cualquier agente solo causaba
únicamente una inhibición temporal del crecimiento in vivo
(Baselga et al, 1993). Del mismo modo, la combinación de
cisplatino y cualquiera de mAb 528 o 225 también condujo a la
erradicación de xenoinjertos A431 bien establecidos, que no se había
observado al utilizar el tratamiento con cualquier agente (Fun
et al, 1993).
Además, la presente invención contempla e
incluye composiciones terapéuticas para el uso del miembro de unión
combinado con radioterapia convencional. Se ha indicado que el
tratamiento con anticuerpos dirigidos a los receptores de EGF puede
aumentar los efectos de la radioterapia convencional (Milas et
al., Clin Cancer Res.2000 Feb:6 (2):701 8, Huang et al.,
Clin Cancer Res. 2000 Jun: 6(6):2166 74).
Como se demuestra en la presente memoria, las
combinaciones del miembro de unión de la presente invención,
concretamente un anticuerpo o uno de sus fragmentos, preferiblemente
mAb806, ch806 o uno de sus fragmentos, y agentes terapéuticos
anti-cancerosos, concretamente agentes terapéuticos
anti-EGFR, incluyendo otros anticuerpos
anti-EGFR, demuestran una terapia eficaz, y
concretamente sinergia, frente a tumores xenoinjertados. En los
ejemplos, se demuestra que la combinación de AG 1478 y mAb 806 da
como resultado un aumento significativo de la reducción del volumen
de tumores por xenoinjerto A431 en comparación con el tratamiento
con cualquier agente solo. AG 1478
(4-(3-cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina)
es un inhibidor potente y selectivo de la quinasa receptora de EGF
y se describe concretamente en la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.457.105, (véase también, Liu, W. et al (1999) J. Cell Sci.
112:2409; Eguchi, S. et al (1998) J. Diol. Chem. 273:8890:
Levitsky. A. y Gazit, A. (1995) Science 267:1782). Los ejemplos de
la memoria demuestran adicionalmente sinergia del anticuerpo 806 con
otros anticuerpos anti-EGFR, concretamente con el
anticuerpo anti-EGFR 528.
La presente invención contempla adicionalmente
composiciones terapéuticas útiles en la práctica de los métodos
terapéuticos de la invención. Una composición terapéutica sujeto
incluye, mezclados, un excipiente farmacéuticamente aceptable
(portador) y uno o más de un miembro de unión específica, uno de sus
análogos polipeptídicos o uno de sus fragmentos, como se describe
en la presente memoria como ingrediente activo. En una realización
preferida, la composición comprende un antígeno capaz de modular la
unión específica del presente miembro de unión/anticuerpo con una
célula diana.
La preparación de composiciones terapéuticas que
contienen polipéptidos, análogos o fragmentos activos como
ingredientes activos es bien conocida en la técnica. Típicamente,
tales composiciones se preparan en forma de inyectables, en forma
de soluciones o suspensiones líquidas. No obstante, también se
pueden preparar formas sólidas adecuadas para la disolución, o
suspensión, en líquido antes de la inyección. La preparación también
puede ser emulsionada. El ingrediente terapéutico activo se mezcla
a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y
compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados
son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol,
etanol, o similar y sus combinaciones. Además, si se desea, la
composición puede contener cantidades minoritarias de sustancias
coadyuvantes tales como agentes humectantes o emulsionantes,
agentes tamponadores del pH que aumentan la eficacia del ingrediente
activo.
Se puede formular un polipéptido, análogo o
fragmento activo en la composición terapéutica en formas salinas
farmacéuticamente aceptables neutralizadas. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido
(formadas con los tres grupos amino de la molécula de polipéptido o
anticuerpo) y que están formadas con ácidos inorgánicos tales como,
por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos
tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las
sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también se
pueden obtener de bases inorgánicas tales como, por ejemplo,
hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y bases
orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina,
2-etilamino-etanol, histidina,
procaina, y similares.
Las composiciones que contienen el polipéptido,
análogo, o fragmento activo terapéutico se administran
convencionalmente intravenosamente, mediante inyección de una dosis
unitaria, por ejemplo. El término "dosis unitaria" cuando se
utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente
invención hace referencia a unidades físicamente discretas
adecuadas como dosificación unitaria para seres humanos, conteniendo
cada unidad una cantidad predeterminada de material activo
calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con
el diluyente requerido; esto es, portador, o vehículo.
Las composiciones se administran de una manera
compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad
terapéuticamente eficaz. La cantidad que se va a administrar depende
del sujeto que se vaya a tratar, de la capacidad del sistema
inmunitario del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y del
grado de capacidad de unión a EFGR deseado. Las cantidades exactas
de ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen
del juicio del médico y son peculiares para cada individuo. Sin
embargo, las dosificaciones adecuadas pueden oscilar de
aproximadamente 0,1 a 20, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 10, y más preferiblemente de uno a varios,
miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del
individuo por día y depende de la ruta de administración. Los
regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de
refuerzo también son variables, pero están tipificados por una
administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de
una o más horas de una inyección u otra administración posterior.
Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa continua
suficiente para mantener concentraciones de diez nanomolar a diez
micromolar en sangre.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden ser en forma de comprimidos, cápsulas,
polvo o líquido. Un comprimido puede comprender un portador sólido
tal como gelatina o un coadyuvante. Las composiciones farmacéuticas
líquidas comprenden generalmente un portador líquido tal como agua,
petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite
sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, solución
de dextrosa u otro sacárido o glicoles tales como etilenglicol,
propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, o la inyección en
el lugar aquejado, el ingrediente activo estará en forma de una
solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógeno
y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos con
un conocimiento práctico de la técnica relevante son capaces de
preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos
isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de
Solución de Ringer, Inyección de Solución de Ringer con Lactato
añadido. Se pueden incluir conservantes, estabilizadores, tampones,
antioxidantes y/o otros aditivos, según se requiera.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también hace referencia a
una variedad de aplicaciones diagnósticas, incluyendo métodos para
detectar la presencia de estímulos tales como el EGFR expresado
aberrantemente, mediante la referencia a su capacidad para ser
reconocido por el miembro de unión específica de la presente
invención. Como se ha mencionado antes, se puede utilizar el EGFR
para producir anticuerpos para sí mismo mediante una variedad de
técnicas conocidas, y tales anticuerpos se podrían aislar y utilizar
después en ensayos en busca de la presencia de una actividad
concreta de EGFR en células diana sospechosas.
Las aplicaciones diagnósticas de los miembros de
unión específica de la presente invención, concretamente
anticuerpos y sus fragmentos, incluyen aplicaciones in vitro
e in vivo bien conocidas y convencionales para los expertos
en la técnica y basadas en la presente descripción. Los análisis y
kits diagnósticos para la valoración y evaluación in vitro
del estado de EGFR, concretamente con respecto a la expresión
aberrante de EGFR, se pueden utilizar para diagnosticar, evaluar y
controlar muestras de pacientes incluyendo aquellos que tienen o se
sospecha que tienen, cáncer, una afección precancerosa, una afección
relacionada con el crecimiento celular hiperproliferativo o una
muestra de tumor. La valoración y evaluación del estado de EGFR
también es útil para determinar la idoneidad de un paciente para
una prueba clínica de un fármaco o para la administración de un
agente quimioterapéutico o miembro de unión específica concreto,
particularmente un anticuerpo, de la presente invención, incluyendo
sus combinaciones, frente a un agente o miembro de unión diferente.
Este tipo de control y evaluación diagnósticos ya se pone en
práctica utilizando anticuerpos contra la proteína HER2 en el
cáncer de mama (Hercep Test, Dako Corporation), donde el análisis
también se utiliza para evaluar en pacientes la terapia con
anticuerpo utilizando Herceptin. Las aplicaciones in vivo
incluyen la formación de imágenes de tumores o la evaluación del
estado del cáncer de los individuos, incluyendo la formación de
radioimágenes.
Como se ha sugerido anteriormente, el método de
la presente invención comprende examinar una muestra o medio
celular mediante un análisis que incluye una cantidad eficaz de un
antagonista para un EFGR/proteína, tal como un anticuerpo
anti-EFGR, preferiblemente un anticuerpo policlonal
purificado por afinidad, y más preferiblemente un mAb. Además, es
preferible que las moléculas de anticuerpo anti-EFGR
utilizadas en la presente memoria estén en forma de porciones Fab,
Fab', F(ab')_{2} o F(v) o de moléculas de anticuerpo
completas. Como se ha comentado previamente, los pacientes
susceptibles de beneficiarse de este método incluyen aquellos que
padecen cáncer, una lesión pre-cancerosa, una
infección viral, patologías que implican o resultan del crecimiento
celular hiperproliferativo u otro trastorno patológico similar. Los
métodos para asilar el EGFR e inducir anticuerpos
anti-EFGR y para determinar y optimizar la capacidad
de los anticuerpos anti-EFGR para ayudar al examen
de las células diana son bien conocidos en la técnica.
Preferiblemente, el anticuerpo
anti-EFGR utilizado en los métodos diagnósticos de
esta invención es un anticuerpo policlonal purificado por afinidad.
Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal
(mAb). Además, las moléculas de anticuerpo
anti-EFGR utilizadas en la presente memoria pueden
estar en forma de porciones Fab, Fab', F(ab')_{2} o
F(v) de moléculas de anticuerpos completos.
Como se ha descrito con detalle antes, el
anticuerpo o los anticuerpos para EGFR se pueden producir y aislar
mediante métodos convencionales incluyendo las técnicas con
hibridomas bien conocidas. Por conveniencia, el anticuerpo o los
anticuerpos para EGFR serán referidos en la presente memoria como
anticuerpo o anticuerpos Ab_{1} originados en otra especie como
Ab_{2}.
La presencia de EGFR en las células se puede
averiguar mediante los procedimientos inmunológicos in vitro
o in vivo habituales aplicables a tales determinaciones. Se
conocen numerosos procedimientos útiles. Tres de estos
procedimientos que son especialmente útiles emplean o EGFR marcado
con una marca detectable, anticuerpo Ab_{1} marcado con una marca
detectable, o anticuerpo Ab_{2} marcado con una marca detectable.
Los procedimientos se pueden resumir por medio de las siguientes
ecuaciones donde el asterisco indica que la partícula está marcada,
y "R" representa el EGFR:
- A.
- R* + Ab_{1} = R*Ab_{1}
- B.
- R + Ab* = RAb_{1}*
- C.
- R + Ab_{1} + Ab_{2}* = RAb_{1}Ab_{2}*
Los procedimientos y su aplicación son
familiares para los expertos en la técnica y por consiguiente se
pueden utilizar dentro del alcance de la presente invención. El
procedimiento "competitivo", Procedimiento A, se describe en
las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.654.090 y 3.850.752. El
Procedimiento C, procedimiento "sándwich", se describe en las
Patentes de los Estados Unidos Núms. RE 31.006 y 4.016.043. Se
conocen otros procedimientos tales como el procedimiento del
"anticuerpo doble" o "DASP".
En cada caso anterior, el EGFR forma complejos
con uno o más anticuerpos o compañeros de unión y un miembro del
complejo se marca con una marca detectable. El hecho de la formación
del complejo, y si se desea, la cantidad del mismo, se pueden
determinar mediante métodos conocidos aplicables a la detección de
marcas.
A partir de lo anterior se observará, que una
propiedad característica de Ab_{2} es que éste reaccionará con
Ab_{1}. Esto es porque se ha utilizado como antígeno un Ab_{1}
originado en una especie de mamífero en otra especie para originar
el anticuerpo Ab_{2}. Por ejemplo, se puede originar Ab_{2} en
cabras utilizando anticuerpos de conejo como antígenos. Por lo
tanto Ab_{2} sería un
anticuerpo-anti-conejo originado en
cabras. Para los fines de esta descripción y de las
reivindicaciones, Ab_{1} será referido como anticuerpo primario o
anti-EGFR, y Ab_{2} será referido como anticuerpo
secundario o anti-Ab_{1}. Las marcas más
comúnmente empleadas para estos estudios son elementos radiactivos,
enzimas, productos químicos que emiten fluorescencia cuando se
exponen a la luz ultravioleta, y otros.
Se conocen y se pueden utilizar como marcas
numerosos materiales fluorescentes. Estos incluyen, por ejemplo,
fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo Texas, azul AMCA y Amarillo
Lucifer. Un material detector concreto es un anticuerpo
anti-conejo preparado en cabras y conjugado con
fluoresceína a través de un isotiocianato.
El EGFR o su compañero o compañeros de unión
tales como el miembro de unión específica presente, también pueden
ser marcados con un elemento radiactivo o con una enzima. La marca
radiactiva puede ser detectada mediante cualquier procedimiento de
recuento disponible actualmente. El isótopo se puede seleccionar
entre H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35}, Cl^{36}, Cr^{51},
Co^{57}, Co^{58}, Fe^{59}, Y^{90}, I^{121}, I^{124},
I^{125}, I^{131}, In^{111}, At^{211}, Au^{198}, Cu^{67},
Ac^{225}, Bi^{213}, Tc^{99} y Re^{186}.
Del mismo modo son útiles las marcas
enzimáticas, y se pueden detectar mediante cualquiera de las
técnicas colorimétricas, espectrofotométricas,
fluoroespectro-fotométricas, amperométricas o
gasométricas utilizadas en la actualidad. La enzima se conjuga con
la partícula seleccionada mediante reacción con moléculas formadoras
de puentes tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído
y similares. Se conocen y se pueden utilizar muchas enzimas que se
pueden utilizar en estos procedimientos. Se prefieren peroxidasa,
\beta-glucuronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Se hace
referencia a las Patentes de los Estados Unidos Núm. 3.654.090;
3.850.752; y 4.016.043 a modo de ejemplo por su descripción de
materiales y métodos de marcaje alternativos.
Un sistema de análisis concreto que se puede
utilizar ventajosamente de acuerdo con la presente invención, es
conocido como análisis de receptores. En un análisis de receptores,
el material que se va a analizar tal como el miembro de unión
específica, es marcado apropiadamente y después ciertas colonias de
ensayo celular son inoculadas con una cantidad de material marcado
y no marcado después de lo cual se realizan estudios de unión para
determinar el grado en el cual se une el material marcado a los
receptores celulares. De este modo, se pueden averiguar las
diferencias de afinidad entre los materiales.
Por consiguiente, se puede marcar
radiactivamente y combinar una cantidad purificada del miembro de
unión específica, por ejemplo, con anticuerpos u otros inhibidores
de estos, después de lo cual se llevarían a cabo estudios de unión.
Luego se prepararían soluciones que contuvieran diferentes
cantidades de miembros de unión específica marcado y no marcado
combinados, y después se inocularían muestras de células y a partir
de ese momento se incubarían. Las monocapas de células resultantes
se lavan después, se solubilizan y luego se someten a recuento en
un contador gamma durante un lapso de tiempo suficiente para
producir un error estándar de <5%. Estos datos se someten
después a análisis Scatchard después de lo cual se pueden hacer
observaciones y sacar conclusiones referentes a la actividad del
material. Si bien lo anterior es ilustrativo, ilustra el modo en el
que se puede realizar y utilizar un análisis de receptores, en el
caso en el que la capacidad de unión celular del material analizado
pueda servir como característica distintiva.
Un análisis útil y contemplado de acuerdo con la
presente invención es conocido como análisis "cis/trans". En
resumen, en este análisis se emplean dos constructos genéticos, uno
de los cuales es típicamente un plásmido que expresa continuamente
un receptor concreto de interés cuando es transfectado a una línea
celular apropiada, y el segundo de los cuales es un plásmido que
expresa un informador tal como luciferasa, bajo el control de un
complejo receptor/ligando. De este modo, por ejemplo, si se desea
evaluar un compuesto como ligando para un receptor concreto, uno de
los plásmidos sería un constructo que diera como resultado la
expresión del receptor en la línea celular seleccionada, mientras
el segundo plásmido poseería un promotor ligado al gen de la
luciferasa en el que estaría insertado el elemento de respuesta al
receptor concreto. Si el compuesto que se va a someter a ensayo es
un agonista del receptor, el ligando formará complejo con el
receptor, y el complejo resultante se unirá al elemento de
respuesta e iniciará la transcripción del gen de la luciferasa. La
quimioluminiscencia resultante se mide después fotométricamente, y
se obtienen curvas dosis-respuesta y se comparan con
las de ligandos conocidos. El protocolo anterior se describe con
detalle en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.981.784 y en la
Publicación Internacional PCT Núm. WO 88/03168, para cuyo propósito
se refiere al experto en la técnica.
En una realización adicional de esta invención,
se pueden preparar kits de ensayo comerciales adecuados para su uso
por un especialista médico para determinar la presencia o ausencia
de la expresión aberrante de EGFR, incluyendo pero no limitado a
EGFR amplificado y/o una mutación de EGFR, en células diana
sospechosas. De acuerdo con las técnicas de ensayo descritas antes,
una clase de tales kits contendrá al menos el EGFR marcado o su
compañero de unión, por ejemplo un anticuerpo específico ara esto, e
indicaciones, por supuesto, dependiendo del método seleccionado, p.
ej., "competitivo," "sándwich," "DASP" y similares.
Los kits también pueden contener reactivos periféricos tales como
tampones, estabilizadores, etc.
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Por consiguiente, se puede preparar un kit de
ensayo para demostrar la presencia o capacidad de las células de
expresar aberrantemente o modificar
post-traduccionalmente el EGFR, que comprende:
(a) una cantidad predeterminada de al menos un
componente marcado inmunoquímicamente obtenido mediante anclaje
directo o indirecto del presente miembro de unión específica o un
compañero de unión específica para este, a una marca
detectable;
(b) otros reactivos; e
(c) instrucciones para el uso de dicho kit.
\vskip1.000000\baselineskip
Más específicamente, el kit de ensayo
diagnóstico puede comprender:
(a) una cantidad conocida del miembro de unión
específica como se ha descrito antes (o un compañero de unión)
generalmente unido a una fase sólida para formar un
inmunoabsorbente, o como alternativa, unido a una etiqueta
adecuada, o varios de tales productos finales, etc. (o sus
compañeros de unión) uno de cada;
(b) si fuera necesario, otros reactivos; y
(c) instrucciones para el uso de dicho kit de
ensayo.
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En una variación adicional, el kit de ensayo se
puede preparar y utilizar para los fines establecidos antes, que
funciona de acuerdo con un protocolo predeterminado (p. ej.
"competitivo," "sándwich," "doble anticuerpo,"
etc.), y comprende:
(a) un componente marcado que ha sido obtenido
acoplando el miembro de unión específica a una marca detectable;
(b) uno o más reactivos inmunoquímicos
adicionales de los cuales al menos un reactivo es un ligando o un
ligando inmovilizado, cuyo ligando se selecciona del grupo que
consiste en:
- (i)
- un ligando capaz de unirse con el componente marcado (a);
- (ii)
- un ligando capaz de unirse con un compañero de unión del componente marcado (a);
- (iii)
- un ligando capaz de unirse con al menos uno de los componentes que se va a determinar; y
- (iv)
- un ligando capaz de unirse con al menos uno de los compañeros de unión de al menos uno de los componentes que se van a determinar; y
(c) instrucciones para el funcionamiento de un
protocolo para la detección y/o determinación de uno o más
componentes de una reacción inmunoquímica entre el EFGR, el miembro
de unión específica, y un compañero de unión específico para
este.
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De acuerdo con lo anterior, se pueden preparar
un sistema de análisis para escrutar fármacos potenciales eficaces
para modular la actividad del EFGR, la expresión aberrante o la
modificación post-traduccional del EGFR, y/o la
actividad o unión del miembro de unión específica. El receptor o el
miembro de unión pueden ser introducidos en un sistema de ensayo, y
el futuro fármaco también puede ser introducido en el cultivo
celular resultante, y después de eso el cultivo se examina para
observar cualquier cambio en la actividad en la fase S de las
células, debida a la adición del futuro fármaco solo, o debido al
efecto de las cantidades añadidas del agente o los agentes
conocidos.
La presente invención proporciona adicionalmente
un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión
específica de la presente invención. El ácido nucleico incluye ADN y
ARN. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un
ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención como se
ha definido antes, incluyendo un polipéptido que se expone como
restos 115-123 del SEQ ID NO: 2 o
44-54, 68-83 y
115-123 del SEQ ID NO: 2, un polipéptido que se
expone como restos 44-54, 70-76 y
109-117 del SEQ ID NO: 4, y los polipéptidos
completos del SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 4.
La presente invención también proporciona
constructos en forma de plásmidos, vectores, casotes de
transcripción o expresión que comprende al menos un polinucleótido
como antes.
La presente invención también proporciona una
célula anfitriona recombinante que comprende uno o más constructos
como antes. Un ácido nucleico que codifica cualquier miembro de
unión específica proporcionado como tal forma un aspecto de la
presente invención, como lo hace el método de producción del miembro
de unión específica cuyo método comprende la expresión a partir del
ácido nucleico codificante del mismo. La expresión se puede lograr
convenientemente mediante el cultivo en condiciones apropiadas de
células anfitrionas recombinantes que contienen el ácido nucleico.
Tras la producción mediante expresión se puede aislar y/o purificar
un miembro de unión específica utilizando cualquier técnica
adecuada, después se utiliza como sea apropiado.
Los miembros de unión específica y las moléculas
de ácido nucleico codificante y los vectores de acuerdo con la
presente invención se pueden proporcionar aislados Y7o purificados,
p. ej. de su entorno natural, en una forma esencialmente pura u
homogénea, o, en el caso del ácido nucleico, libre o esencialmente
libre de ácido nucleico o genes con un origen distinto de la
secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. El
ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede
comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente
sintético.
Los sistemas para la clonación y expresión de un
polipéptido en una variedad de células anfitrionas diferentes son
bien conocidos. Las células anfitrionas adecuadas incluyen
bacterias, células de mamífero, levaduras y sistemas de
baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la
técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen
células de ovario de hámster Chino, células HeLa, células de riñón
de cría de hámster, células de melanoma de ratón NSO y otras
muchas. Un anfitrión bacteriano preferido, común es E.
coli.
La expresión de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos en células procarióticas tales como E. coli está
bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase por ejemplo
Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La
expresión en células eucarióticas en cultivo también se encuentra
disponible para los expertos en la técnica como opción para la
producción de un miembro de unión específica, para revisiones
recientes véase, por ejemplo Raff, M:E. (1993) Curr. Opinion
Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995)
Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.
Se pueden elegir o construir vectores adecuados,
que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo
secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de
poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores y
otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser
plásmidos, virales p. ej. fagos o fagémidos, según sea apropiado.
Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a
Laboratory Manual: 2^{a} edición, Sambrook et al. 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos
conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en
la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis,
secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y
análisis de proteínas, se describen con detalle en Short Protocols
in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds.,
John Wiley & Sons, 1992.
De este modo, un aspecto adicional de la
presente invención proporciona una célula anfitriona que contiene
un ácido nucleico como se describe en la presente memoria. Un
aspecto adicional más proporciona un método que comprende
introducir semejante ácido nucleico en una célula anfitriona. En la
introducción se puede emplear cualquier técnica adecuada. Para las
células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir
transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano,
electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción
utilizando retrovirus u otros virus, p. ej. vaccinia o, para
células de insecto, baculovirus. Para las células bacterianas, las
técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de
calcio, electroporación y transfección utilizando
bacteriófagos.
La introducción puede causar o permitir después
la expresión a partir del ácido nucleico, p. ej. cultivando
células anfitrionas en las condiciones para la expresión del
gen.
En una realización, el ácido nucleico de la
invención se integra en el genoma (p. ej. cromosoma) de la
célula anfitriona. La integración puede ser promovida por la
inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el
genoma, de acuerdo con técnicas convencionales.
La presente invención también proporciona un
método que comprende utilizar un constructo como se ha establecido
antes en un sistema de expresión con el fin de expresar un miembro
de unión específica o polipéptido como antes.
Como se ha establecido antes, la presente
invención también hace referencia a una molécula de ADN recombinante
o un gen clonado, o una de sus variantes degeneradas, que codifica
un miembro de unión específica, concretamente un anticuerpo o uno
de sus fragmentos, que posee una secuencia de aminoácidos expuesta
en el SEQ ID NO: 2 y/o el SEQ ID NO: 4; preferiblemente una
molécula de ácido nucleico, en particular una molécula de ADN
recombinante o un gen clonado, que codifica el miembro de unión o
anticuerpo tiene una secuencia de nucleótido o es complementaria a
una secuencia de ADN proporcionada en el SEQ ID NO: 1 y/o el SEQ ID
NO: 3.
Otro rasgo de esta invención es la expresión de
las secuencias de ADN descritas en la presente memoria. Como es
bien sabido en la técnica, las secuencias de ADN pueden ser
expresadas conectándolas operativamente a una secuencia para el
control de la expresión en un vector de expresión apropiado y
empleando ese vector de expresión para transformar un anfitrión
unicelular apropiado.
Semejante conexión operativa de una secuencia de
ADN de esta invención a una secuencia de control de la expresión,
por supuesto, incluye, si no forma parte ya de la secuencia de ADN,
la provisión de un codón de iniciación, ATG, en el marco de lectura
correcto aguas arriba de la secuencia de ADN.
Se puede emplear una amplia variedad de
combinaciones de anfitrión/vector de expresión al expresar las
secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión
útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos cromosómicos, no
cromosómicos y secuencias sintéticas de ADN. Los vectores adecuados
incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, p.
ej., los plásmidos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMB9 y
sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fagos, p. ej., los
numerosos derivados del fago \lambda, p. ej., NM989, y
otros ADN de fagos, p. ej., ADN de M13 y de fagos de hebra
sencilla filamentosos; plásmidos de levaduras tales el plásmido 2u
o sus derivados; vectores útiles en células eucarióticas, tales como
vectores útiles en células de insecto o mamífero; vectores
derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como
plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de fagos u
otras secuencias de control de la expresión; y similares.
Se puede utilizar cualquiera de una amplia
variedad de secuencias de control de la expresión - secuencias que
controlan la expresión de una secuencia de ADN conectada
operativamente a ella - en estos vectores para expresar las
secuencias de ADN de esta invención. Tales secuencias de control de
la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano
y tardío de SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema
lac, el sistema trp, el sistema TAC, el
sistema TRC, el sistema LTR, las regiones operadora y
promotora principales del fago \lambda, las regiones de control
de la proteína de la envoltura fd, el promotor para la
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida (p. ej.,
Pho5), los promotores de los factores de emparejamiento de levadura,
y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes
de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y sus
diferentes combinaciones.
También son útiles una amplia variedad de
células anfitrionas unicelulares en la expresión de las secuencias
de ADN de esta invención. Estos anfitriones pueden incluir
anfitriones eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como
cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos
tales como levaduras, y células animales, tales como células CHO,
YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W y L-M,
células de riñón de Mono verde Africano (p. ej., COS 1, COS 7,
BSC1, BSC40, y BMT10), células de insecto (p. ej., Sf9), y células
humanas y células vegetales en cultivos de tejidos.
Se entenderá que no todos los vectores,
secuencias de control de la expresión y anfitriones funcionarán
igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de esta
invención. Ni todos los anfitriones funcionarán igualmente bien con
el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica
será capaz de seleccionar los vectores, las secuencias de control
de la expresión, y los anfitriones apropiados sin una
experimentación indebida para completar la expresión deseada son
apartarse del alcance de esta invención. Por ejemplo, al
seleccionar un vector, se debe considerar el anfitrión debido a que
el vector debe funcionar en él. El número de copias del vector, la
capacidad para controlar ese número de copias, y la expresión de
cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como un
marcador antibiótico, también se tendrá en consideración. Al
seleccionar una secuencia de control de la expresión, se tendrán en
consideración normalmente una variedad de factores. Estos incluyen,
por ejemplo, la fuerza relativa del sistema, su controlabilidad, y
su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen concreto que se van
a expresar, particularmente en lo que se refiere a las estructuras
secundarias potenciales. Los anfitriones unicelulares adecuados se
seleccionarán considerando, p. ej., su compatibilidad con el
vector elegido, sus características de secreción, su capacidad para
plegar las proteínas correctamente, y sus requerimientos de
fermentación, así como la toxicidad para el anfitrión del producto
codificado por las secuencias de ADN que se van a expresar, y la
facilidad de purificación de los productos de expresión.
Considerando estos y otros factores un experto
en la técnica será capaz de construir una variedad de combinaciones
de vector/secuencia de control de la expresión/anfitrión que
expresarán las secuencias de ADN de esta invención en la
fermentación o en un cultivo animal a gran escala.
Adicionalmente se pretende que se puedan
preparar análogos del miembro de unión específica a partir de las
secuencias de nucleótidos del derivado del complejo/subunidad
proteico en el alcance de la presente invención. Los análogos,
tales como fragmentos, pueden ser producidos, por ejemplo, mediante
digestión con pepsina del material del miembro de unión específica.
Otros análogos, tales como las muteínas, pueden ser producidos
mediante mutagénesis dirigida al sitio convencional de las
secuencias que codifican el miembro de unión específica. Los
análogos que muestran "actividad del miembro de unión
específica" tales como las moléculas pequeñas, funcionen como
promotores o como inhibidores, pueden ser identificados mediante
análisis in vivo y/o in vitro conocidos.
Como se ha mencionado antes, se puede preparar
una secuencia de ADN que codifica un miembro de unión específica
sintéticamente en lugar de clonarlo. La secuencia de ADN puede ser
diseñada con los codones apropiados para la secuencia de
aminoácidos del miembro de unión específica. En general, se
seleccionarán los codones preferidos para el anfitrión pretendido
si la secuencia se va a utilizar para la expresión. La secuencia
completa se ensambla a partir de oligonucleótidos solapantes
preparados mediante métodos convencionales y se ensambla en una
secuencia codificante completa. Véase, p. ej., Edge, Nature, 292:756
(1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et
al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
Las secuencias sintéticas de ADN permiten la
construcción conveniente de genes que expresaran análogos del
miembro de unión específica o "muteínas". Alternativamente, se
pueden elaborar ADN que codifican muteínas mediante mutagénesis
dirigida al sitio de genes o ADNc de miembros de unión específica
nativos, y se pueden elaborar muteínas directamente utilizando la
síntesis de polipéptidos convencional.
Un método general para la incorporación
específica del sitio de aminoácidos no naturales en las proteínas
es descrito por Christopher J. Noren, Spencer J.
Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G.
Schultz, Science, 244:182-188 (Abril 1989). Este
método se puede utilizar para crear análogos con aminoácidos no
naturales.
La presente invención se extiende a la
preparación de oligonucleótidos antisentido y ribozimas que se
pueden utilizar para interferir en la expresión del EGFR a nivel
traduccional. Este enfoque utiliza ácidos nucleicos antisentido y
ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm específico, o bien
enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido o bien
escindiéndolo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas
de ADN o ARN que son complementarias a al menos una porción de una
molécula de ARNm específica. (Véase Weintraub, 1990;
Marcus-Sekura, 1988). En la célula, estos hibridan
con ese ARNm, formando una molécula de doble hebra. La célula no
traduce un ARNm en esta forma de doble hebra. Por lo tanto, los
ácidos nucleicos antisentido interfieren en la expresión del ARNm a
proteína. Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y
las moléculas que hibridan con el codón de iniciación AUG serán
particularmente eficaces, puesto que son fáciles de sintetizar y es
probable que posean menos problemas que las moléculas más grandes
cuando se introducen en la célula productora. Se han utilizado
métodos antisentido para inhibir la expresión de muchos genes in
vitro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor et
al.,1988).
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad para escindir específicamente otras moléculas de ARN de
cadena sencilla de una manera en cierto modo análoga a las
endonucleasas de resección del ADN. Las ribozimas fueron
descubiertas a partir de la observación de que ciertos ARNM tienen
la capacidad de escindir sus propios intrones. Modificando la
secuencia de nucleótidos de estos ARN, los investigadores han podido
diseñar moléculas que reconocen secuencias de nucleótidos
específicas en una molécula de ARN y lo escinden (Cech, 1988).
Debido a que son específicas de la secuencia, solamente son
inactivados los ARNm con secuencias concretas.
Los investigadores han identificado dos tipos de
ribozimas, de tipo Tetrahymena y de tipo "cabeza de
martillo". (Hasselhoff y Gerlach, 1988) Las ribozimas de tipo
Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases, mientras
las de tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de once a
dieciocho bases. Cuanto más larga es la secuencia de
reconocimiento, más probable es que exista exclusivamente en las
especias de ARNm diana. Por lo tanto, las ribozimas de tipo cabeza
de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo
Tetrahymena para inactivar una especie de ARNm específica, y
las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases son preferibles
para secuencias de reconocimiento más cortas.
Las secuencias de ADN descritas en la presente
memoria se pueden utilizar de este modo para preparar moléculas
antisentido contra, y ribozimas que escinden ARNm para EGFR y sus
ligandos.
La invención se puede comprender mejor mediante
la referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes, que se
proporcionan como ilustrativos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para los análisis de inmunización y
especificidad, se utilizaron diferentes líneas celulares, nativas o
transfectadas con el gen normal o de tipo salvaje "wtEGFR" o
con el gen \DeltaEGFR que portaba una mutación por deleción
\Delta2-7: Línea celular de fibroblastos murinos
NR6, NR6_{\Delta EGFR} (transfectada con \DeltaEGFR) y
NR6_{wtEGFR} (transfectada con wtEGFR), línea celular de
glioblastoma humano U87MG (que expresaba bajos niveles de wtEGFR
endógeno), US7MG_{wtEGFR} (transfectada con wtEGFR),
U87MG_{\Delta EGFR} (transfectada con \DeltaEGFR), y línea
celular de carcinoma de células escuamosas humano A431 (que
expresaba elevados niveles de wtEGFR)[38]. Las líneas celulares y
las transfecciones se habían descrito previamente (Nishikawa R.,
et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
91(16):7727-7731).
La línea celular de astrocitoma U87MG (20), que
expresa endógenamente bajos niveles de wt EGFR, se infectó con un
retrovirus que contenía de2-7 EGFR para producir la
línea celular U87MG.\Delta2-7 (10). La línea
celular transfectada U87MG.wtEGFR fue producida como describen
Nagane et al 1996 (Cancer Res., 56:
5079-5086). Mientras las células U87MG expresan
aproximadamente 1x10^{5} EGFR, las células U87MG.wtEGFR expresan
aproximadamente 1x10^{6} EGFR, y de este modo imitan la situación
observada con la amplificación génica.
Se obtuvieron células de carcinoma escamoso
humano A431 de ATCC (Rockville, MD). Todas las líneas celulares se
cultivaron en DMEM/F-12 con GlutaMAX® (Life
Technologies, Melbourne, Australia) con un suplemento de FCS al 10%
(CSL, Melbourne, Australia).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron los péptidos de empalme únicos
biotinilados (Biotina-LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO: 5) y
LEEKKGNYVVTDH-Biotina (SEQ ID NO: 6)) a partir de
de2-7 EGFR mediante la química de Fmoc convencional
y se determinó la pureza (>96%) mediante HPLC en fase inversa y
análisis de espectro de masas (Auspep, Melbourne, Australia).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de comparar los descubrimientos de
los autores de la presente invención con otros reactivos, se
incluyeron mAb adicionales en los estudios de los autores de la
presente invención. Estos reactivos fueron mAb 528 para wtEGFR
(Sato, J.D. et al. (1983) Mol. Biol. Med.
1(5):511-529) y DH8.3, que fue generado
contra un péptido sintético que abarcaba la secuencia de empalme de
la mutación por deleción \Delta2-7 EGFR. El
anticuerpo DH8.3 (IgG1) ha sido descrito previamente (Hills et
al, 1995, Int. J. Cancer 63(4); 537-543)
y fue obtenido tras la inmunización de ratones con el péptido de
empalme único encontrado en de2-7 EGFR (16). El
anticuerpo 528, que reconoce tanto el EGFR de2-7
como el de tipo salvaje, ha sido descrito previamente (21) y fue
producido en Biological Production Facility (Ludwig Institute for
Cancer Research, Melbourne) utilizando un hibridoma obtenido de
ATCC HB-8509. SC-03 es un anticuerpo
policlonal de conejo purificado por afinidad originado contra un
péptido carboxi terminal de EGFR (Santa Cruz Biotechnology
Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la línea de fibroblastos murinos
NR6_{\Delta EGFR} como inmunógeno. Se generaron hibridomas de
ratón inmunizando ratones BALB/c cinco veces subcutáneamente a
intervalos de 2-3 semanas, con 5x10^{5} -
2x10^{6} células en coadyuvante. Se utilizó coadyuvante completo
de Freund para la primera inyección. Después de eso, se utilizó
coadyuvante incompleto de Freund (Difco). Se fusionaron células de
bazo de ratones inmunizados con la línea celular de mieloma de
ratón SP2/0. Los sobrenadantes de los clones recién generados se
escrutaron en análisis de hemadsorción en busca de reactividad con
la línea celular NR6, NR6_{wtEGFR}, y NR6_{\Delta EGFR} y
después se analizaron mediante análisis de hemadsorción con líneas
celulares de glioblastoma humano U87MG, U87MG_{wtEGFR}, y
U87MG_{\Delta EGFR}. Los sobrenadantes de hibridoma seleccionados
se sometieron a ensayo con posterioridad mediante transferencia
western y se analizaron adicionalmente mediante inmunohistoquímica.
Los mAb recién generados que mostraban el patrón de reactividad
esperado se purificaron.
Se establecieron cinco hibridomas y se
seleccionaron tres clones 124 (IgG2a), 806 (IgG2b) y 1133 (IgG2a)
para la caracterización adicional basándose en el elevado título
con NR6_{\Delta EGFR} y el bajo fondo en células NR6 y
NR6_{wtEGFR} en el análisis de hemaglutinación. En un análisis de
hemaglutinación posterior, estos anticuerpos no mostraron
reactividad (sobrenadante no diluido \leq10%) con la línea celular
de glioblastoma humano nativo U87MG y U87MG_{wtEGFR}, pero eran
fuertemente reactivos con U87MG_{\Delta EGFR}; se observó menos
reactividad con A431. En contraste, en el análisis FACS, 806 no fue
reactivo con U87MG nativo y tiñó intensamente U87MG_{\Delta EGFR}
y en un grado menor U87MG_{wtEQFR} indicando unión de 806 tanto a
\DeltaEGFR como a wtEGFR (véase más abajo).
En los análisis de transferencia Western, los
mAb 124, 806 y 1133 fueron analizados en busca de reactividad con
wtEGFR y \DeltaEGFR. Los productos lisados con detergente fueron
extraídos de NR6_{\Delta EGFR}, U87MG_{\Delta EGFR} así como de
A431. Los tres mAb mostraron un patrón de reactividad similar con
los productos lisados celulares que teñían tanto la proteína wtEGFR
(170 kDa) y como \DeltaEGFR (140 kDa). Como reactivo de
referencia, se utilizó mAb R.I conocido por ser reactivo con wtEGFR
(Waterfield M.D. et al. (1982) J. Cell Biochem.
20(2):149-161) en lugar de mAb 528, que se
sabe que no es reactivo en el análisis de transferencia western.
Mab R.I mostró reactividad con wt y \DeltaEGFR. Los tres clones
recientemente generados mostraron reactividad con \DeltaEGFR y
menos intensa con wtEGFR. DH8.3 solamente era positivo en el
producto lisado de U87MG_{\Delta EGFR} y NR6_{\Delta EGFR}.
El análisis inmunohistoquímico de los clones
124, 806, y 1133 así como de mAb 528 y mAb DH8.3 en tumores por
xenoinjerto con U87MG, U87MG_{\Delta EGFR}, y A431 se muestran en
la Tabla 1. Todos los mAb mostraron una tinción del xenoinjerto
U87MG_{\Delta EGFR}. Solamente mAb 528 mostró una débil
reactividad en el xenoinjerto con U87MG nativas. En los
xenoinjertos por A431, mAb 528 mostró una reactividad homogénea
fuerte. Los mAb 124, 806, y 1133 revelaron reactividad en su mayor
parte con células localizadas basalmente del carcinoma de células
escuamosas de A431 y no reaccionaron con las capas de células
superiores o el componente queratinizante. DH8.3 fue negativo en
xenoinjertos de A431.
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\newpage
Ejemplo
2
Con el fin de determinar la especificidad de mAb
806, se analizó su unión a células U87MG,
U87MG.\Delta2-7 y U87MG.wtEGFR mediante
clasificación de células por fluorescencia activada (FACS).
Brevemente, se marcaron las células con el anticuerpo relevante (10
\mug/ml) seguido de IgG anti-ratón de cabra
conjugado con fluoresceína (dilución 1:100; Calbiochem San Diego,
USA). Se obtuvieron datos de FACS sobre un Coulter Epics Elite ESP
observando un mínimo de 5.000 eventos y se analizaron utilizando
EXPO (versión 2) para Windows. Se incluyó una IgG2b irrelevante
como control de isotipo para mAb 806 y se incluyó el anticuerpo 528
ya que reconoce tanto EGFR de2-7 como
wt.
wt.
Solamente el anticuerpo 528 fue capaz de teñir
la línea celular U87MG parental (Figura 1) coincidiendo con
informes previos que demuestran que estas células expresan el wt
EGFR (Nishikawa et al. 1994). MAb 806 y DH8.3 tuvieron
niveles de unión similares al anticuerpo de control, demostrando
claramente que no son capaces de de unirse al receptor wt (Figura
1). La unión del anticuerpo de control del isotipo para las células
U87MG.\Delta2-7 y U87MG.wtEGFR fue similar a la
observada para las células U37MG.
El mAb 806 tiñó las células
U87MG.\Delta2-7 y U87MG.wtEGFR, indicando que mAb
806 reconoce específicamente de2-7 EGFR y EGFR
amplificado (Figura 1). El anticuerpo DH8.3 tiñó las células
U87MG.\Delta2-7, confirmando que el anticuerpo
DH8.3 reconoce específicamente el de2-7 EGFR (Figura
1). Como se esperaba, el anticuerpo 528 tiñó tanto las líneas
celulares U87MG.\Delta2-7 como U87MG.wtEGFR
(Figura 1). Como se esperaba, el anticuerpo 528 tiñó
U87MG.\Delta2-7 con una intensidad mayor que la
célula parental puesto que se une a los receptores tanto
de2-7 como de tipo salvaje que sn expresados
simultáneamente en estas células (Figura 1). Se obtuvieron
resultados similares utilizando una hemadsorción mixta con proteína
A que detecta la IgG unida a la superficie mediante la aparición de
proteína A recubierta con glóbulos rojos humanos (grupo O) para las
células diana. El anticuerpo monoclonal 806 fue reactivo con las
células U87MG.\Delta2-7 pero mostró una
reactividad no significativa (sobrenadante no diluido menor del
10%) con U87MG que expresaban EGF-R de tipo
salvaje.
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Ejemplo
3
Para caracterizar adicionalmente la
especificidad de mAb 806 y el anticuerpo DH8.3, se examinó su unión
mediante ELISA. Se utilizaron dos tipos de ELISA para determinar la
especificidad de los anticuerpos. En el primer análisis, las placas
se recubrieron con sEGFR (10 \mug/ml en tampón carbonato 0,1 M pH
9,2) durante 2 h y después se bloquearon con albúmina de suero
humano al 2% (HSA) en PBS. sEGFR es el dominio extracelular
recombinante (aminoácidos 1-621) del EGFR de tipo
salvaje), y fue producido como se ha descrito previamente (22). Se
añadieron anticuerpos a los pocillos por triplicado a una
concentración creciente en HSA al 2% en solución salina tamponada
con fosfato (PBS). El anticuerpo unido se detectó mediante IgG
anti-ratón de oveja conjugada con peroxidasa de
rábano picante (Silenus, Melbourne, Australia) utilizando ABTS
(Sigma, Sydney, Australia) como sustrato y se midió la absorbancia
a 405 nm.
Tanto mAb 806 como el anticuerpo 528 presentaron
curvas de unión dependientes de la dosis y saturantes para sEGFR de
tipo salvaje inmovilizado (Figura 2A). Como el péptido de empalme
único encontrado en de2-7 EGFR no está contenido en
el sEGFR, el mAb 806 se debe estar uniendo a un epítopo localizado
en la secuencia de EGFR de tipo salvaje. La unión del anticuerpo
528 fue inferior a la observada para mAb 806. Como se esperaba el
anticuerpo DH8.3 no se unía al sEGFR de tipo salvaje ni siquiera a
concentraciones de hasta 10 \mug/ml (Figura 2A). Si bien el sEGFR
en disolución inhibía la unión del anticuerpo 528 al sEGFR
inmovilizado de una manera dependiente de la dosis, no era capaz de
inhibir la unión de mAb 806 (Figura 2B). Esto sugiere que el mAb
806 sólo se puede unir al EGFR de tipo salvaje una vez inmovilizado
sobre las placas de ELISA, un procedimiento que puede inducir
cambios conformacionales. Se observaron resultados similares
utilizando un BIAcore en el que el mAb 806 se unía a sEGFR
inmovilizado pero el mAb 806 inmovilizado no era capaz de unirse a
sEGFR en disolución (datos no mostrados). El anticuerpo DH8.3
mostró una unión dependiente de la dosis y saturable al péptido
de2-7 EGFR único
(Figura 2C).
(Figura 2C).
En el segundo análisis, el péptido específico
de2-7 biotinilado
(Biotina-LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO: 5)) se unió a
placas ELISA previamente recubiertas con estreptavidina (Pierce,
Rockford, Illinois). Los anticuerpos se unieron y se detectaron
como en el primer análisis. Ni mAb 806 ni el anticuerpo 528 se unían
al péptido, ni siquiera a concentraciones superiores a las
utilizadas para obtener una unión por saturación de DH8.3,
indicando adicionalmente que mAb 806 no reconoce un determinante
epitópico en este péptido.
Para demostrar adicionalmente que mAb 806
reconoce un epítopo distinto del péptido de empalme, se realizaron
experimentos adicionales. El péptido de2-7
biotinilado C-terminal
(LEEKKGNYVVTDH-Biotina (SEQ ID NO: 6)) se utilizó
en estudios con mAb806 y mAb L8A4, generados contra el péptido
de2-7 (Reist, CJ et al (1995) Cancer Res.
55(19):4375-4382; Foulon CF et al.
(2000) Cancer Res. 60(16):4453-4460).
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Péptido de Empalme:
LEEKKGNYVVTDH-OH (Biosource,
Camarillo, CA);
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido C:
LEEKKGNYVVTDH(K-Biot)-OH
(Biosource, Camarillo, CA);
\vskip1.000000\baselineskip
sEGFR:
dominio extracelular soluble recombinante
derivado de células CHO (aa 1-621) del EGFR de tipo
salvaje (LICR Melbourne);
\vskip1.000000\baselineskip
mAb 806:
anticuerpo monoclonal de ratón, IgG_{2b} (LICR
NYB);
\vskip1.000000\baselineskip
mAb L8A4:
anticuerpo monoclonal de ratón, IgG_{1} (Duke
University);
mAb de control del isotipo de IgG_{1};
mAb de control del isotipo de IgG_{2b}
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmovilizó el Péptido C sobre un chip
microsensor de Estreptavidina a una densidad superficial de 350RU
(+/- 30RU). Se sometieron a ensayo diluciones seriadas de mAb en
busca de reactividad con el péptido. Se realizaron experimentos de
bloqueo utilizando péptido no biotinilado para evaluar la
especificidad.
El mAb L8A4 mostró una fuerte reactividad con el
Péptido C incluso a bajas concentraciones de anticuerpo (6,25 nM)
(Figura 2D). El mAb 806 no mostró una reactividad específica
detectable con el péptido C hasta concentraciones de anticuerpo de
100 nM (concentración más alta sometida a ensayo) (Figuras 2D y 2E).
Se esperaba que mAb L8A4 reaccionara con el Péptido C debido a que
el péptido se utilizaba como inmunógeno en la generación de mAb
L8A4. La adición del Péptido de Empalme (no biotinilado, 50
\mug/ml) bloquea completamente la reactividad de mAb L8A4 con el
Péptido C, confirmando la especificidad del anticuerpo por el
epítopo del péptido de empalme.
En un segundo grupo de experimentos BIAcore, se
inmovilizó sEGFR sobre un chip microsensor CM a una densidad
superficial de -4000RU. Las diluciones seriadas de mAb se sometieron
a ensayo en cuanto a su reactividad con sEGFR.
El mAb 806 era fuertemente reactivo con el sEGFR
desnaturalizado mientras el mAb L8A4 no reaccionaba con el sEGFR
desnaturalizado. La reactividad de mAb 806 con sEGFR desnaturalizado
disminuye con las concentraciones de anticuerpo decrecientes. Se
esperaba que mAb L8A4 no reaccionara con sEGFR debido a que el mAb
L8A4 era generado utilizando el péptido de empalme como inmunógeno
y sEGFR no contenía el péptido de empalme.
También se realizaron experimentos de tinción
inmunitaria mediante transferencia puntual. Las diluciones seriadas
de péptido se aplicaron en 0,5 \mul sobre PVDF o membranas de
nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con BSA en PBS al 2%, y
después se sondearon con los anticuerpos 806, L8A4, DH8.3 y control.
Los anticuerpos L8A4 y DH8.3 se unieron al péptido sobre las
membranas (datos no mostrados). Mab806 no se unió al péptido a
concentraciones en las que L8A4 mostraba claramente unión (datos no
mostrados). Los anticuerpos de control también fueron negativos
para la unión al péptido.
El mAb 806 se unió al wtEGFR en los productos
lisados celulares después de la inmunotransferencia (resultados no
mostrados). Esto es diferente de los resultados obtenidos con el
anticuerpo DH8.3, que reaccionaba con de2-7 EGFR
pero no con wtEGFR. De este modo, mAb 806 puede reconocer el wtEGFR
después de la desnaturalización pero no cuando el receptor está en
su estado natural sobre la superficie de la célula.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
4
Se realizó un análisis de Scatchard utilizando
células U87MG.\Delta2-7 siguiente a la corrección
para la inmunorreactividad con el fin de determinar la afinidad
relativa de cada anticuerpo. Los anticuerpos se marcaron con
I^{125} (Amrad, Melbourne, Australia) mediante el método de la
cloramina T y se determinó la inmunorreactividad mediante análisis
de Lindmo (23). Todos los análisis de unión se realizaron en HSA/PBS
al 1% en 1-2 x 10^{6} células
U87MG.\Delta2-7 o A431 vivas durante 90 minutos a
4ºC con rotación suave. Se utilizó una concentración ajustada de 10
ng/ml de anticuerpo marcado con I^{125} en presencia de
concentraciones crecientes del anticuerpo no marcado apropiado. Se
determinó la unión no específica en presencia de un exceso de 10.000
veces de anticuerpo no marcado. Una vez que se hubo completado la
incubación, las células se lavaron y se sometió a recuento el
anticuerpo marcado con I^{125} unido utilizando un contador gamma
COBRA II (Packard Instrument Company, Meriden, EEUU).
Tanto mAb 806 como el anticuerpo DH8.3
conservaban una elevada inmunorreactividad cuando se yodaban y era
típicamente mayor del 90% para mAb 806 y del 45-50%
para el anticuerpo DH8.3. mAb 806 tenía una afinidad para el
receptor de2-7 EGFR de 1,1 x 10^{9} M^{-1}
mientras la afinidad de DH8.3 era 10 veces menor a 1,0 x 10^{8}
M^{-1}. Ni el mAb 806 radiomarcado con I^{125} ni el anticuerpo
DH8.3 radiomarcado con I^{125} se unían a las células U87MG
parentales. El mAb 806 reconocía una media de 2,4 x 10^{5} sitios
de unión por célula uniéndose el anticuerpo DH8.3 a una media de
5,2 x 10^{5} sitios. De este modo, sólo hubo una coincidencia en
el número de receptores entre los anticuerpos, pero mostrando
también un informe previo 2,5 x 10^{5} receptores
de2-7 por célula medido mediante un anticuerpo
específico de de2-7 EGFR diferente en la misma
línea celular (25).
Ejemplo
5
La tasa se internalización de anticuerpo
siguiente a la unión a una célula diana influye tanto en sus
propiedades de localización de un tumor como en sus opcionales
terapéuticas. Por consiguiente, los autores examinaron la
internalización de mAb 806 y del anticuerpo DH8.3 después de la
unión a células U87MG.\Delta2-7 por medio de
FACS. Se incubaron las células U87MG.\Delta2-7 con
mAb 806 o con el anticuerpo DH8.3 (10 \mug/ml) durante 1 hora en
DMEM a 4ºC. Después de lavar, las células se transfirieron a DMEM
precalentado a 37ºC y se tomaron alícuotas en diferentes momentos
después de la incubación a 37ºC. La internalización se detuvo
lavando inmediatamente las alícuotas en tampón de lavado enfriado
con hielo (HSA/PBS al 1%). Una vez completado el período de tiempo
las células se tiñeron mediante FACS como se ha descrito antes. El
porcentaje de internalización se calculó comparando la tinción del
anticuerpo en superficie en diferentes momentos con el tiempo cero
utilizando la fórmula: porcentaje de anticuerpo internalizado =
(fluorescencia media en el momento x fluorescencia del
fondo)/(fluorescencia media a tiempo 0 - fluorescencia del fondo) x
100. Este método fue validado en un análisis utilizando un
anticuerpo yodado (mAb 806) para medir la internalización como se
ha descrito previamente (24). Las diferencias en la tasa de
internalización en diferentes momentos se compararon utilizando el
test de la t de Student.
Ambos anticuerpos mostraron una internalización
relativamente rápida alcanzando niveles de estado estacionario a
los 10 min para mAb 806 y a los 30 min para DH8.3 (Figura 3). La
internalización de DH8.3 fue significativamente mayor tanto en
términos de tasa (80,5% de DH8.3 internalizado a los 10 min en
comparación con 36,8% para mAb 806, p<0,01) y como en cantidad
total internalizada a los 60 min (93,5% versus 30,4%, p<0,001).
El mAb 806 mostró niveles significativamente inferiores de
internalización a los 30 y 60 min en comparación con los 20 min en
los 4 análisis realizados (Figura 3). Este resultado también se
confirmó utilizando un análisis de internalización basado en el mAb
806 yodado.
Ejemplo
6
Dada la diferencia observada antes en las tasas
de internalización entre los anticuerpos, se realizó un análisis
detallado del tráfico intracelular de anticuerpos utilizando la
microscopía electrónica.
Se hicieron crecer células
U87MG.\Delta2-7 desarrolladas sobre portas con
cámaras recubiertos con gelatina (Nunc, Naperville, IL) a una
confluencia del 80% y después se lavaron con DMEM enfriado con
hielo. Después se incubaron las células con mAb 806 o con el
anticuerpo DH8.3 en DMEM durante 45 min a 4ºC. Después de lavar,
las células se incubaron durante 30 min más con
anti-IgG de ratón conjugado con oro (partículas de
20 nm) (BBInternational, Cardiff, UK) a 4ºC. Después de un lavado
adicional, se añadió DMEM/FCS al 10% a las células, que se
incubaron a 37ºC durante diferentes intervalos de
1-60 min. La internalización del anticuerpo se
detuvo con medio enfriado con hielo y las células se fijaron con
glutaraldehído al 2,5% en PBS/HSA al 0,1% y después se
post-fijaron en tetróxido de osmio del 2,5%. Tras la
deshidratación a través de una serie graduada de acetona, las
muestras se embebieron en resina Epon/Araldite, se cortaron en forma
de secciones ultrafinas con un microtomo Reichert
Ultracut-S (Leica) y se recogieron sobre gradillas
de níquel. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo y
citrato de plomo antes de ser visualizadas en un microscopio
electrónico de transmisión Philips CM12 a 80 kV. Se realizó el
análisis estadístico de los granos de oro contenidos en las fositas
recubiertas utilizando un test de la
Chi-cuadrado.
Si bien el anticuerpo DH8.3 era internalizado
predominantemente por medio de las fositas recubiertas, el mAb 806
parecía ser internalizado mediante macropinocitosis (Figura 19). De
hecho, un análisis detallado de 32 fositas recubiertas formadas en
las células incubadas con mAb 806 reveló que ninguna de ellas
contenía anticuerpo. En contraste, alrededor del 20% de todas las
fositas recubiertas de las células incubadas con DH8.3 fueron
positivas para el anticuerpo, conteniendo algunas múltiples granos
de oro. Un análisis estadístico del número total de granos de oro
contenidos en las fositas recubiertas descubrió que la diferencia
era muy significativa (p<0,01). Después de 20-30
min ambos anticuerpos podían ser observados en las estructuras que
se asemejaban morfológicamente a lisosomas. La presencia de
desechos celulares en estas estructuras también coincidía con su
naturaleza lisosómica.
Ejemplo
7
Se comparó la biodistribución de mAb 806 y del
anticuerpo DH8.3 en ratones carentes de sistema inmunitario que
contenían xenoinjertos U87MG en un lado y xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 en el otro. Se seleccionó un
período de tiempo relativamente corto para este estudio ya que un
informe previo demostró que el anticuerpo DH8.3 muestra niveles
máximos de localización de tumores entre 4-24 h
(16).
Se establecieron xenoinjertos de tumores en
ratones BALB/c carentes de sistema inmunitario mediante inyección
s.c. de 3 x 10^{6} células U87MG,
U87MG.\Delta2-7 o A431. La expresión de
de2-7 EGFR en xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 permaneció estable durante todo
el período de biodistribución. Asimismo, las células A431
conservaron su actividad mAb 806 cuando se hicieron crecer como
xenoinjertos de tumor como se determina mediante inmunohistoquímica
(datos no mostrados). Las células U87MG o A431 se inyectaron en un
lado 7-10 días antes de que las células
U87MG.\Delta2-7 fueran inyectadas en el otro lado
debido a la mayor velocidad de crecimiento observada para los
xenoinjertos que expresaban de2-7 EGFR. Los
anticuerpos fueron radiomarcados y evaluados en busca de
inmunorreactividad como se ha descrito antes y fueron inyectados en
los ratones por la ruta retro-orbital cuando los
tumores pesaban 100-200 mg. Cada ratón recibió dos
anticuerpos diferentes (2 \mug por anticuerpo): 2 \muCi de mAb
806 marcado con I^{125} y 2 \muCi de DH8.3 o 528 marcado con
I^{131}. A no ser que se indique, se sacrificaron grupos de 5
ratones en diferentes momentos después de la inyección y se obtuvo
sangre mediante punción cardíaca. Los tumores, hígado, bazo,
riñones y pulmones se obtuvieron por disección. Todos los tejidos
se pesaron y se analizaron en cuanto a su actividad I^{125} e
I^{131} utilizando un Dual Channel Counting Window. Los datos
fueron expresados para cada anticuerpo como % DI/g de tumor
determinado comparando con patrones de dosis inyectados o
convertidos en razones tumor/sangre/hígado (es decir, % DI/g de
tumor dividido por % DI/g de sangre o hígado). Las diferencias
entre los grupos se analizaron mediante el test de la t de
Student.
En términos de % DI/g de tumor, el mAb 806
alcanzó su nivel máximo en xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 del 18,6% m/g de tumor a las 8 h
(Figura 4A), considerablemente superior que en cualquier otro tejido
excepto la sangre. Si bien DH 8.3 también mostró niveles de tumor
máximos a las 8 h, el nivel fue estadísticamente (p<0,001)
inferior 8,8% m/g de tumor en comparación con mAb 806 (Figura 4B).
Los niveles de ambos anticuerpos disminuían lentamente a las 24 y
48 h. Ningún anticuerpo mostró una localización específica de
xenoinjertos U87MG parentales (Figura 4A,B). Con respecto a las
razones de tumor con respecto a sangre/hígado, mAb 806 mostró la
razón más alta a las 24 h tanto para sangre (razón de 1,3) como
para hígado (razón de 6,1) (Figura 5A,B). El anticuerpo DH8.3 tuvo
su razón más alta en sangre a las 8 h (razón de 0,38) y a las 24 h
en hígado (razón de 1,5) (Figura 5 A,B), ambas las cuales son
considerablemente inferiores a los valores obtenidos para mAb
806.
Como se ha descrito antes, los niveles de mAb
806 en el tumor mostraron picos a las 8 horas. Si bien este máximo
es relativamente temprano comparado con muchos anticuerpos
localizadores de tumores, es completamente coincidente con otros
estudios utilizando anticuerpos específicos para
de2-7 EGFR que muestran todos picos a las
4-24 horas de la inyección cuando se utiliza una
dosis similar de anticuerpo (16, 25, 33). En efecto, a diferencia
de los informes anteriores, el momento puntual de las 8 horas se
incluyó en la suposición de que la localización por el anticuerpo
alcanzaría un máximo rápidamente. El % DI/g de tumor observado con
mAb 806 fue similar al referido para otros anticuerpos específicos
de de2-7 EGFR cuando se utilizaban técnicas de
yodación convencionales (16, 24, 32). La razón del máximo temprano
es probablemente doble. En primer lugar, los tumores que expresan
el de2-7 EGFR, incluyendo las células U87MG
transfectadas, crecen extremadamente rápido como xenoinjertos
tumorales. De este modo, incluso durante el período de tiempo
relativamente corto utilizado en estos estudios de biodistribución,
el tamaño del tumor aumenta hasta tal punto (incremento de
5-10 veces en la masa en 4 días) que el % DI/g de
tumor se reduce en comparación con los tumores de crecimiento
lento. En segundo lugar, si bien la internalización de mAb 806 fue
relativamente lenta en comparación con DH8.3, ésta es todavía
rápida con respecto a muchos otros sistemas anticuerpo/antígeno
tumorales. Los anticuerpos internalizados experimentan una rápida
proteolisis siendo excretados los productos de degradación de la
célula (34). Este procedimiento de internalización, degradación y
excreción reduce la cantidad de anticuerpo yodado retenida dentro
de la célula. Por consiguiente, los anticuerpos internalizantes
presentan niveles inferiores de localización que sus contrapartes
no internalizantes. Los datos de la microscopía electrónica
referidos en la presente memoria demuestran que el mAb 806
internalizado es transportado rápidamente a los lisosomas donde se
produce presumiblemente la degradación rápida. Esta observación
coincide con la rápida expulsión del yodo de la célula.
El anticuerpo monoclonal L8A4 descrito
previamente dirigido al péptido de empalme único encontrado en
de2-7 EGFR, se comporta de una manera similar al
mAb 806 (35). Utilizando células U87MG transfectadas con
de2-7 EGFR, este anticuerpo tuvo una tasa de
internalización similar (35% a 1 hora en comparación con el 30% a 1
hora para mAb 806) y presentó una localización in vivo
comparable cuando se utilizaban fibroblastos 3T3 transfectados con
de2-7 EGFR (pico de 24% DI/g de tumor a las 24 horas
en comparación con 18% DI/g de tumor a las 8 horas para mAb 806)
(25). De modo interesante, la retención in vivo de este
anticuerpo en xenoinjertos de tumor aumentó cuando se marcó con
5-yodo-3-piridino-carboxilato
de N-succinimidilo (25). Este grupo prostético
marcado está cargado positivamente al pH lisosómico y de este modo
tiene una retención celular incrementada (33). El aumento de
retención es potencialmente útil cuando se considera un anticuerpo
para la radioinmunoterapia y se podría utilizar este método para
mejorar la retención de mAb 806 yodado o sus fragmentos.
Ejemplo
8
Para examinar si mAb 806 podía reconocer el EGFR
expresado en células que contienen un gen receptor amplificado, se
analizó su unión a células A431. Como se ha descrito previamente,
las células A431 son células de carcinoma escamoso humano y
expresan elevados niveles de wtEGFR. Se observó una unión de mAb 806
a las células A431 baja, pero altamente reproducible mediante
análisis FACS (Figura 6). El anticuerpo DH8.3 no se unió a las
células A431, indicando que la unión de mAb 806 no era el resultado
del bajo nivel de expresión de de2-7 EGFR (Figura
6). Como se esperaba, el anticuerpo 528 anti-EGFR
mostró una fuerte tinción de las células A431 (Figura 6). Dado este
resultado, la unión de mAb 806 a A431 fue caracterizada por medio de
un análisis Scatchard. Si bien la unión de mAb 806 yodado fue
comparativamente baja, fue posible obtener datos consistentes para
Scatchard. La media de tales experimentos dio un valor para la
afinidad de 9,5 x 10^{7} M^{-1} con 2,4 x 10^{5} receptores
por célula. De este modo la afinidad para este receptor fue de
alrededor de 10 veces más baja que la afinidad para el
de2-7 EGFR. Además, el mAb 806 parecía reconocer
solamente una pequeña porción de EGFR unido sobre la superficie de
las células A431. Utilizando el anticuerpo 528, los autores de la
invención midieron aproximadamente 2 x 10^{6} receptores por
célula o que coincide con otros numerosos estudios (26).
El reconocimiento del sEGFR de tipo salvaje por
el mAb 806 requiere claramente una cierta desnaturalización del
receptor con el fin de exponer el epítopo. El grado de
desnaturalización requerido es sólo ligero ya que incluso la
absorción del sEGFR de tipo salvaje sobre una superficie de plástico
indujo una unión robusta del mAb 806 en los análisis ELISA. Como el
mAb 806 solamente se unió a aproximadamente un 10% del EGFR sobre la
superficie de las células A431, resulta tentador especular que este
subgrupo de receptores puede tener una conformación alterada
similar a la inducida por el truncamiento de2-7
EGFR. En efecto, la expresión extremadamente elevada del EGFR
mediada por la amplificación génica en células A431, puede ocasionar
que algunos receptores sean procesados incorrectamente conduciendo
a una alteración de la conformación. De manera interesante, la
inmunotransferencia semi-cuantitativa de los
productos lisados de células A431 con mAb 806 mostró que éste podía
reconocer la mayor parte de los receptores EGF de A431 después de
SDS-PAGE y transferencia western. Este resultado
apoya adicionalmente el argumento de que el mAb 806 se está uniendo
a un subgrupo de receptores sobre la superficie de las células A431
que tienen una conformación alterada. Estas observaciones en las
células A431 coinciden con los datos inmunohistoquímicos que
demuestran que mAb 806 se une a los gliomas que contienen la
amplificación del gen EGFR. Como la unión de mAb 806 fue
completamente negativa sobre las células U87MG parentales podría
parecer que este fenómeno está restringido a las células que
contienen EGFR amplificado aunque el nivel de receptor
"desnaturalizado" sobre la superficie de las células U87MG
puede estar por debajo del nivel de detección. No obstante, esto
parecería improbable ya que el mAb 806 yodado no se unía a los
sedimentos de células U87MG que contenían hasta 1 x 10^{7}
células.
Ejemplo
9
Se realizó un segundo estudio de biodistribución
con mAb 806 para determinar si éste podía localizar xenoinjertos de
tumor A431. El estudio se llevó a cabo a lo largo de un período de
tiempo con el fin de obtener más información referente a la
localización de xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 por
mAb 806, que fueron incluidos en todos los ratones como control
positivo. Además, se incluyó el anticuerpo anti-EGFR
528 como control positivo para los xenoinjertos A431, puesto que un
estudio previo demostró una localización baja pero significativa de
este anticuerpo para las células A431 desarrolladas en ratones
carentes de sistema inmunitario (21).
Durante las primeras 48 horas, mAb 806 presentó
propiedades de localización casi idénticas a las observadas en los
experimentos iniciales (Figura 7A en comparación con la Figura 4A).
En términos de % DI/g de tumor, los niveles de mAb 806 en
xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 disminuían lentamente
después de 24 h pero siempre permanecían superiores a los niveles
detectados en tejido normal. La absorción en los xenoinjertos A431
fue comparativamente baja, no obstante hubo un pequeño incremento
en % DI/g de tumor durante las primeras 24 h no observado en
tejidos normales tales como el hígado, bazo, riñón y pulmón (Figura
7A). La absorción del anticuerpo 528 fue muy lenta en ambos
xenoinjertos cuando se expresaba en forma de % DI/g de tumor (Figura
7B) debido en parte al aclaramiento más rápido de este anticuerpo
de la sangre. En términos de razón de tumor con respecto a sangre
el mAb 806 presentaba un máximo a las 72 h para los xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 y a las 100 h para los
xenoinjertos A431 (Figura 8A,B). Si bien la razón de tumor con
respecto a sangre para mAb 806 nunca sobrepasaba 1,0 con respecto
al tumor A431, ésta aumentó a lo largo de todo el transcurso de
tiempo (Figura 8B) y fue superior que en todos los demás tejidos
examinados (datos no mostrados) indicando bajos niveles de
localización.
La razón de tumor con respecto a sangre para el
anticuerpo 528 mostró un perfil similar para mAb 806 aunque se
observaron niveles superiores en los xenoinjertos A431 (Figura
8A,B). El mAb 806 tuvo una razón de tumor con respecto a hígado
máxima en los xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 de 7,6,
a las 72 h, demostrando claramente una absorción preferente en
estos tumores en comparación con el tejido normal (Figura 8C). Otras
razones de tumor con respecto a órgano para mAb 806 fueron
similares a las observadas en el hígado (datos no mostrados). La
razón de tumor con respecto a hígado máxima para mAb 806 en los
xenoinjertos A431 fue de 2,0 a las 100 h, indicando de nuevo una
absorción ligeramente preferente en el tumor en comparación con el
tejido normal (Figura 8D).
Ejemplo
10
Se evaluaron los efectos de mAb806 en dos
modelos de enfermedad por xenoinjerto - un modelo preventivo y un
modelo de tumor establecido.
Coincidiendo con informes previos (Nishikawa
et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(16);
7727-7731) las células U87MG transfectadas con
de2-7 EGFR crecieron más rápidamente que las células
parentales y las células U87MG transfectadas con wt EGFR. Por lo
tanto, no fue posible hacer crecer ambos tipos de células en los
mismos ratones.
Se inocularon simultáneamente 3x10^{6} células
tumorales en 100 ml de PBS en ambos flancos de ratones hembra de
4-6 semanas de edad ratones carentes de sistema
inmunitario (Animal Research Centre, Western Australia, Australia).
Se investigó la eficacia terapéutica de mAb 806 en modelos tanto
preventivos como de tumor establecido. En el modelo preventivo, se
trataron 5 ratones con 2 xenoinjertos cada uno intraperitonealmente
con 1 o 0,1 mg de mAb 806 o vehículo (PBS) empezando el día antes
de la inoculación de las células tumorales. El tratamiento continuó
durante un total de 6 dosis, 3 veces por semana durante 2 semanas.
En el modelo establecido, el tratamiento se inició cuando los
tumores hubieron alcanzado un volumen medio de 65 \pm 6,42
mm^{3} (U87MG.\Delta2-7), 84 \pm 9,07
mm^{3} (U87MG), 73 \pm 7,5 mm^{3} (U87MG.wtEGFR) o 201 \pm
19,09 mm^{3} (tumores A431). El volumen del tumor en mm^{3} se
determinó utilizando la fórmula (longitud x anchura^{2})/2, donde
la longitud era el eje más largo y la anchura la medida en los
ángulos rectos con respecto a la longitud (Scott et al,
2000). Los datos se expresaron como el volumen medio del tumor \pm
D.T. para cada grupo de tratamiento. El análisis estadístico se
realizó en momentos puntuales dados utilizando el test de la t de
Student. Los animales se sometieron a eutanasia cuando los
xenoinjertos alcanzaron un volumen aproximado de 1,5 cm^{3} y los
tumores se extirparon para el examen histológico. Este proyecto de
investigación fue aprobado por el Animal Ethics Committee del
Austin and Repatriation Medical Centre.
Se extirparon los xenoinjertos y se
diseccionaron. La mitad se fijó con formalina/PBS al 10% antes de
embeberla en parafina. Después se cortaron secciones de cuatro
micras y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para el
examen histológico rutinario. La otra mitad se embebió en el
compuesto Tissue Tek® OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), se
congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. Se cortaron
secciones criostáticas finas (5 micras) y se fijaron en acetona
enfriada con hielo durante 10 min seguido de secado al aire durante
10 min más. Las secciones se bloquearon en reactivo de bloqueo de
proteína (Lipshaw Immunon, Pittsburgh EEUU) durante 10 min y
después se incubaron con anticuerpo primario biotinilado (1 mg/ml),
durante 30 min a la temperatura ambiente (RT). Todos los
anticuerpos fueron biotinilados utilizando el módulo de
biotinilación de proteína ECL (Amersham, Baulkham Hills,
Australia), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Después
de enjuagar con PBS, las secciones se incubaron con un complejo de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante
30 minutos más (Silenus, Melbourne, Australia). Tras un lavado con
PBS final las secciones se expusieron a sustrato de
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) (ácido acético 0,1 M, acetato de sodio 0,1 M, AEC 0,02 M
(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)) en presencia de peróxido de
hidrógeno durante
30 min. Las secciones se enjuagaron con agua y se contratiñeron con hematoxilina durante 5 minutos y se montaron.
30 min. Las secciones se enjuagaron con agua y se contratiñeron con hematoxilina durante 5 minutos y se montaron.
Se examinó el mAb 806 en busca de su eficacia
contra tumores U87MG y U87MG.\Delta2-7 en un
modelo de xenoinjerto preventivo. Se administraron anticuerpo o
vehículo i.p. el día antes de la inoculación del tumor y se
administró 3 veces por semana durante 2 semanas. El mAb 806 no tuvo
efecto sobre el crecimiento de xenoinjertos U87MG parentales, que
expresan wt EGFR, a una dosis de 1 mg por inyección (Figura 9A). En
contraste, mAb 806 inhibió significativamente el crecimiento de
xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 de una manera
dependiente de la dosis (Figura 9B). El día 20, cuando los animales
de control fueron sacrificados, el volumen medio del tumor fue de
1637 \pm 178,98 mm^{3} para el grupo de control,
estadísticamente más pequeño 526 \pm 94,74 mm^{3} para el grupo
al que se habían inyectado 0,1 mg (p< 0,0001) y 197 \pm 42,06
mm^{3} para el grupo al que se había inyectado 1 mg (p<
0,0001). Los grupos de tratamiento fueron sacrificados el día 24 en
cuyo momento el volumen medio de los tumores era de 1287 \pm
243,03 mm^{3} para el grupo tratado con 0,1 mg y 492 \pm 100,8
mm^{3} para el grupo tratado con 1 mg.
Dada a eficacia del mAb 806 en el modelo de
xenoinjerto preventivo, se examinó después su capacidad para inhibir
el crecimiento de xenoinjertos de tumores establecidos. El
tratamiento con anticuerpo fue el descrito en el modelo preventivo
excepto que comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen
medio del tumor de 65 \pm 6,42 mm^{3} para los xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 y 84 \pm 9,07 mm^{3} para los
xenoinjertos U87MG parentales. Una vez más, mAb 806 no tuvo efecto
sobre el crecimiento de xenoinjertos U87MG parentales a una dosis
de 1 mg por inyección (Figura 10A). En contraste, el mAb 806 inhibió
significativamente el crecimiento de xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 de una manera dependiente de la
dosis (Figura 10B). El día 17, un día antes de que los animales de
control fueran sacrificados, el volumen medio del tumor fue de 935
\pm 215,04 mm^{3} para el grupo de control, 386 \pm 57,51
mm^{3} para el grupo al que se había inyectado 0,1 mg (p< 0,01)
y 217 \pm 58,17 mm^{3} para el grupo al que se había inyectado
1 mg (p< 0,002).
Para examinar si la inhibición del crecimiento
observada con mAb 806 estaba restringida a la célula que expresaba
de2-7 EGFR, se examinó su eficacia contra
xenoinjertos de tumor U87MG.wtEGFR en un modelo establecido. Estas
células sirven como modelo para tumores que contienen la
amplificación del gen EGFR sin la expresión de de2-7
EGFR. El tratamiento con mAb 806 comenzó cuando los tumores
hubieron alcanzado un volumen medio del tumor de 73 \pm 7,5
mm^{3}. El mAb 806 inhibió significativamente el crecimiento de
xenoinjertos U87MG.wtEGFR establecidos cuando se comparó con los
tumores de control tratados con vehículo (Figura 10C). El día que
los animales de control fueron sacrificados, el volumen medio del
tumor era de 960 \pm 268,9 mm^{3} para el grupo de control y
468 \pm 78,38 mm^{3} para el grupo tratado con inyecciones de 1
mg (p< 0,04).
Para evaluar las diferencias histológicas
potenciales entre los xenoinjertos U87MG.\Delta2-7
y U87MG.wtEGFR tratados con mAb 806 y de control (recogidos los
días 24 y 42 respectivamente), se tiñeron con H&E las secciones
embebidas en parafina, fijadas con formalina. Se observaron zonas de
necrosis en las secciones de xenoinjertos tanto
U87MG.\Delta2-7 (recogidos 3 días después del
finalizar el tratamiento), como U87MG.wtEGFR (recogidos 9 días
antes de finalizar el tratamiento) tratados con mAb 806. Este
resultado fue observado sistemáticamente en numerosos xenoinjertos
de tumores (n=4). Sin embargo, el análisis de las secciones de
xenoinjertos tratados con control no presentó las mismas zonas de
necrosis observadas con el tratamiento con mAb 806. Las secciones
de xenoinjertos U87MG tratadas con mAb 806 o control también fueron
teñidas con H&E y no revelaron diferencias en la viabilidad
celular entre los dos grupos, apoyando adicionalmente la hipótesis
de que la unión a mAb 806 induce un descenso de la viabilidad
celular/necrosis en xenoinjertos tumorales.
Se realizó un análisis inmunohistoquímico de
secciones de xenoinjerto U87MG, U87MG.\Delta2-7 y
U87MG.wtEGFR para determinar los niveles de expresión de
de2-7 y wt EGFR después del tratamiento con mAb806.
Las secciones se recogieron los días 24 y 42 como antes, y se
inmunotiñeron con los anticuerpos 528 o 806. Como se esperaba el
anticuerpo 528 tiñó todas las secciones de xenoinjerto sin un
descenso obvio en la intensidad los tumores tratados y de control.
La tinción de las secciones de U87MG no fue detectable con el mAb
806, no obstante se observó una tinción positiva de las secciones
de xenoinjerto U87MG.\Delta2-7 y U87MG.wtEGFR. No
hubo diferencia en la densidad de tinción con mAb 806 entre los
xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 y U87MG.wtEGFR
tratados y de control sugiriendo que el tratamiento con anticuerpo
no regula la expresión de de2-7 o wt EGFR.
Para demostrar que los efectos
anti-tumorales de mAb 806 no estaban restringidos a
las células U87MG, se administró el anticuerpo a ratones con
xenoinjertos A431. Estas células contienen un gen EGFR amplificado y
expresan aproximadamente 2 x 10^{6} receptores por célula. Como
se ha descrito antes, mAb 806 se une a aproximadamente 10% de estos
EGFR y xenoinjertos A431 diana. El mAb 806 inhibió
significativamente el crecimiento de los xenoinjertos A431 cuando
se examinó en el modelo de xenoinjerto preventivo descrito
previamente (Figura 11A). El día 13, cuando las animales de control
fueron sacrificados, el volumen medio del tumor fue de 1385 \pm
147,54 mm^{3} en el grupo de control y de 260 \pm 60,33
mm^{3} para el grupo con tratamiento de inyecciones de 1 mg
(p< 0,0001).
En un experimento separado, una dosis de 0,1 mg
de mAb también inhibió significativamente el crecimiento de los
xenoinjertos A431 en un modelo preventivo.
Dada la eficacia de mAb 806 en el modelo de
xenoinjerto A431, se examinó su eficacia para inhibir el crecimiento
de los xenoinjertos de tumores establecidos. El tratamiento con
anticuerpo fue el descrito en el modelo preventivo excepto que no
comenzó hasta que los tumores hubieron alcanzado un volumen medio
del tumor de 201 \pm 19,09 mm^{3}. El mAb 806 inhibió
significativamente el crecimiento de los xenoinjertos de tumores
establecidos (Figura 11B). El día 13, cuando los animales de
control fueron sacrificados, el volumen medio del tumor fue de 1142
\pm 120,06 mm^{3} para el grupo de control y de 451 \pm 65,58
mm^{3} para el grupo al que se inyectaba 1 mg (p<0,0001).
En resumen, los estudios de terapia con mAb 806
descritos aquí demostraron claramente la inhibición dependiente de
la dosis del crecimiento del xenoinjerto
U87MG.\Delta2-7. En contraste, no se observó
inhibición de los xenoinjertos U87MG parentales a pesar del hecho
de que continúan expresando el wt EGFR in vivo. El mAb 806
no solamente redujo significativamente el volumen del xenoinjerto,
también indujo una necrosis significativa en el tumor. Este es el
primer informe que muestra el uso terapéutico satisfactorio de
semejante anticuerpo in vivo contra xenoinjertos de glioma
que expresan de2-7 EGFR humano.
La amplificación génica del EGFR ha sido
referida en numerosos tumores diferentes y se observa en
aproximadamente 50% de los gliomas (Voldberg et al, 1997).
Se ha propuesto que la posterior expresión en exceso de EGFR
mediada por la amplificación génica del receptor puede conferir una
ventaja de crecimiento incrementando la señalización intracelular y
el crecimiento celular (Filmus et al, 1987). La línea
celular U87MG fue transfectada con el wt EGFR con el fin de producir
una célula de glioma que imite el proceso de amplificación del gen
EGFR. El tratamiento de los xenoinjertos U87MG.wtEGFR establecidos
con mAb 806 dio como resultado una inhibición significativa del
crecimiento. De este modo, mAb 806 también media la actividad
anti-tumoral in vivo frente a células que
contienen la amplificación del gen EGFR. De manera interesante, la
inhibición por mAb 806 de los xenoinjertos U87MG.wtEGFR parece ser
menos eficaz que la observada con tumores
U87MG.\Delta2-7. Esto refleja probablemente el
hecho de que mAb 806 tiene una afinidad de unión inferior por el
EGFR amplificado y solamente se une a una pequeña proporción de
receptores expresados sobre la superficie celular. No obstante, se
debe observar que a pesar del pequeño efecto sobre los volúmenes de
los xenoinjertos U87MG.wtEGFR, el tratamiento con mAb 806 producía
grandes zonas de necrosis en estos xenoinjertos. Para descartar la
posibilidad de que mAb 806 solamente medie la inhibición de las
líneas celulares derivadas de U87MG los autores de la presente
invención sometieron a ensayo su eficacia contra xenoinjertos A431.
Esta línea celular derivada de carcinoma de células escuamosas
contiene una amplificación del gen EGFR significativa que se
conserva tanto in vitro como in vivo. El tratamiento
de los xenoinjertos A431 con mAb 806 produjo una inhibición
significativa del crecimiento en el modelo tanto preventivo como
establecido, indicando que los efectos
anti-tumorales de mAb 806 no están restringidos a
las líneas celulares U87MG transfectadas.
Ejemplo
11
Se sometieron a ensayo los efectos
anti-tumorales de mAb 806 combinado con AG1478 en
ratones con xenoinjertos A431. AG1478
(4-(3-Cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina)
es un inhibidor potente y selectivo de la quinasa de EGFR quinasa
frente a HER2-neu y la quinasa del receptor de
crecimiento derivado de plaquetas (Calbiochem Cat. Núm. 658552). Se
incluyeron tres controles: tratamiento con vehículo solamente,
vehículo + mAb806 solamente y vehículo + AG1478 solamente. Los
resultados se ilustran en la Figura 12. Se administraron 0,1 mg de
mAb 806 1 día antes en el xenoinjerto y 1, 3, 6, 8 y 10 días
después del xenoinjerto. Se administraron 400 \mug de AG1478 los
días 0, 2, 4, 7, 9, y 11 después del xenoinjerto.
Tanto AG1478 como mAb806, cuando se
administraron solos produjeron una reducción significativa del
volumen del tumor. Sin embargo, combinados, la reducción del
volumen del tumor aumentaba enormemente.
Además, se evaluó la unión de mAb806 a EFR de
células A431 en ausencia y presencia de AG1478. Las células se
colocaron en medio sin suero durante la noche, después se trataron
con AG1478 durante 10 min a 37ºC, se lavaron dos veces en PBS luego
se lisaron en Triton al 1% y se prepararon los productos lisados.
Los productos lisados se prepararon como se describe en el Ejemplo
20 de la presente memoria. Después se evaluó el producto lisado en
busca de la reactividad 806 mediante ELISA en una versión modificada
de un análisis descrito por Schooler y Wiley, Analytical
Biochemistry 277,135-142 (2000). Las placas se
recubrieron con 10 \mug/ml de mAb 806 en PBS/EDTA durante la
noche a la durante la noche a la temperatura ambiente y después se
lavaron dos veces. Las placas se bloquearon después con albúmina de
suero/PBS al 10% durante 2 horas a 37ºC y se lavaron dos veces. Se
añadió producto lisado celular 1:20 en albúmina de suero/PBS al 10%
durante 1 hora a 37ºC, después se lavó cuatro veces. Se hizo
reaccionar anti-EGFR (SC-03 (Santa
Cruz Biotechnology Inc.)) en albúmina de suero/PBS al 10% 90 min a
la temperatura ambiente, la placa se lavó cuatro veces, y se añadió
anti-conejo-HRP (1:2000 si es de
Silenus) en albúmina de suero/PBS al 10% durante 90 min a la
temperatura ambiente, se lavó cuatro veces, y se hizo que se
desarrollara color utilizando ABTS como sustrato. Se descubrió que
la unión de mAb806 aumentaba significativamente en presencia de
cantidades crecientes de AG1478 (Figura 13).
Ejemplo
12
Dada la elevada incidencia de la expresión,
amplificación y mutación de EGFR en los glioblastomas, se realizó
un estudio inmunohistoquímico detallado con el fin de evaluar la
especificidad de 806 en tumores distintos de los xenoinjertos. Se
analizó un panel de 16 glioblastomas mediante inmunohistoquímica.
Este panel de 16 glioblastomas fue previamente tipificado mediante
RT-PCR en busca de la presencia de la expresión de
EGFR de tipo salvaje amplificado y de2-7 EGFR. Seis
de estos tumores expresaron solamente el transcrito wt EGFR, 10
tenían una amplificación del gen wtEGFR mostrado 5 de estos
transcritos EGFR de tipo salvaje solamente, y 5 tanto EGFR de tipo
salvaje como transcrito del gen de2-7. Se realizó un
análisis inmunohistoquímico utilizando secciones de 5 mm de tejido
recién congelado aplicado a portas histológicos y fijados durante 10
minutos en acetona fría. Se detectó el anticuerpo primario unido
con anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilado
seguido de una reacción de complejo de
avidina-biotina. Se utilizó tetrahidrocloruro de
diaminobenzidina (DAB) como cromógeno. El grado de reactividad
inmunohiostoquímica en los tejidos se estimó mediante microscopía
óptica y se graduó de acuerdo con el número de células
inmunorreactivas en incrementos del 25% como sigue:
Focal = menos de 5%
+=5-25%
++=25-50%
+++=50-75%
++++=>75%
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El anticuerpo 528 mostró una intensa reactividad
en todos los tumores, mientras la inmunotinción con DH 8.3 estuvo
restringida a aquellos tumores que expresaban de2-7
EGFR (Tabla 2). Coincidiendo con las observaciones previas en FACS
y en los análisis de reajuste, el mAb 806 no reaccionó con los
glioblastomas que expresaban el transcrito wtEGFR a partir de genes
EGFR no amplificados (Tabla 2). Este patrón de reactividad para mAb
806 es similar al observado en los estudios con xenoinjertos y de
nuevo sugiere que este anticuerpo reconoce el EGFR de2- 7 y el
amplificado pero no el wtEGFR cuando son expresados sobre la
superficie celular.
Ejemplo
13
Con el fin de determinar si el EGFR
de2-7 es expresado en tejido normal, se llevó a cabo
un estudio inmunohistoquímico con mAb 806 y DH8.3 en un panel de 25
tejidos. No hubo una inmunorreactividad fuerte con mAb 806 o DH8.3
en ningún tejido sometido a ensayo sugiriendo que el
de2-7 EGFR está ausente en tejidos normales (Tabla
3). Hubo una cierta tinción variable en amígdalas con mAb 806 que
estuvo restringida a la capa de células basales de la epidermis y
las células escuamosas de la mucosa del epitelio. En placenta, se
observó una inmunotinción ocasional del epitelio del trofoblasto.
De manera interesante, dos tejidos que expresan elevados niveles
endógenos de wtEGFR, hígado y piel, no lograron mostrar ninguna
reactividad con mAb 806 significativa. No se observó reactividad
con las muestras de hígado en absoluto, y solamente se detectó
ocasionalmente una reactividad focal débil y desigual (en no más de
10% de todas las muestras estudiadas) en queratinocitos basales en
muestras de sangre y en epitelio escuamoso de la mucosa de la
amígdala, demostrando adicionalmente que este anticuerpo no se une
al wtEGFR expresado sobre la superficie de las células en un grado
significativo (Tabla 3). Todos los tejidos fueron positivos para el
wtEGFR como indicó la tinción universal observada con el anticuerpo
528 (Tabla 3).
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Ejemplo
14
Se examinó el grado de de2-7
EGFR en otros tipos de tumores utilizando un panel de 12
malignidades diferentes. El anticuerpo 528 mostró a menudo una
tinción homogénea en muchos tumores analizados excepto melanoma y
seminoma. Cuando estaba presente, la inmunorreactividad con DH8.3
estaba restringida a la célula tumoral focal ocasional indicando
que hay una pequeña expresión de de2- 7 EGFR, si la hay, en los
tumores fuera del cerebro utilizando este sistema de detección
(Tabla 4). También hubo una tinción focal de los vasos sanguíneos y
una tinción difusa variable del tejido conectivo con el anticuerpo
DH8.3 en algunos tumores (Tabla 4). Esta tinción era fuertemente
dependiente de la concentración de anticuerpo utilizado y se
consideraba reactividad de fondo no específica. El mAb 806 mostró
una tinción positiva en 64% de los tumores de cabeza y cuello y en
50% de los carcinomas de pulmón (Tabla 4). Hubo poca reactividad
con mAb 806 excepto en tumores urinarios que eran positivos en 30%
de los casos. Puesto que los cánceres de cabeza y cuello y pulmón
fueron negativos para el anticuerpo DH8.3 la reactividad observada
con el mAb en estos tumores se puede asociar con la amplificación
del gen EGFR.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
15
Con el fin de confirmar la especificidad única y
evaluar la reactividad del mAb 806, éste se comparó con los
anticuerpos 528 y DH8.3 en un panel de 46 glioblastomas no
preseleccionados por su estado de EGFR. El anticuerpo 528 fue
fuertemente y homogéneamente positivo en todas las muestras excepto
dos (Núm. 27 y 29) (44/46, 95,7%). Estos dos casos también fueron
negativos para mAb806 y mAb DH8.3. El mAb 806 fue positivo en 27/46
(58,7%) casos, 22 de los cuales presentaron una inmunorreactividad
homogénea en más del 50% del tumor. El anticuerpo DH8.3 fue
positivo en 15/46 (32,6%) glioblastomas, 9 de los cuales mostraron
una inmunorreactividad homogénea. La tinción inmunoquímica de estos
tumores no seleccionados se tabula en la Tabla 5.
Hubo concordancia entre mAb 806 y DH8.3 en todos
los casos excepto uno (Núm. 35).
Se realizó un análisis molecular en cuanto a la
presencia de amplificación de EGFR en 44 casos (Tabla 5). De estos,
30 casos se tipificaron simultáneamente con el patrón de
inmunorreactividad de mAb 806 previamente establecido: p. ej. 16
casos negativos para mAb 806 no revelaron amplificación de EGFR y 14
casos con EGFR amplificado también fueron inmunopositivos para mAb
806. No obstante, 13 casos, que mostraron inmunorreactividad con
806, fueron negativos para la amplificación de EGFR mientras 1 caso
con EGFR amplificado fue negativo para mAb 806. Más abajo se
describe el análisis adicional del estado de mutación de estos casos
negativos para la amplificación y positivos para 806 y proporciona
una explicación para la mayoría de los 13 casos que fueron
negativos para la amplificación de EGFR amplificación y fueron
reconocidos por 806.
Con posterioridad, se realizó un análisis
molecular de la mutación por deleción mediante
RT-PCR en 41/46 casos (Tabla 5). De estos, 34 casos
se tipificaron simultáneamente con DH8.3 específico para la mutación
por deleción: 12 casos fueron positivos tanto en
RT-PCR como en la inmunohistoquímica y 22 casos
fueron negativo/negativo. Tres casos (Núm. 2, Núm. 34, Núm. 40)
fueron DH8.3 positivo/RT-PCR negativo para la
mutación por deleción y tres casos (Núm. 12, Núm. 18, Núm. 39)
fueron DH8.3 negativo/RT-PCR positivo. Como se
esperaba basándose en el análisis de especificidad previo de los
autores de la presente invención, la inmunorreactividad con mAb 806
se observó en todos los tejidos DH8.3-positivos
excepto en un caso (Núm. 35).
El Caso Núm. 3 también reveló una mutación
(designada A2 en la Tabla 5), que incluía las secuencias de la
mutación de2-7 pero esta no parecía ser la deleción
de2-7 clásica de 801 bases (datos no mostrados).
Este caso fue negativo para la reactividad con DH8.3 pero mostró
reactividad con 806, indicando que 806 puede reconocer una mutación
de EGFR adicional y posiblemente única.
La reactividad del anticuerpo 806 se tipificó
simultáneamente con EGFR amplificado o de2-7 mutante
en 19/27 o en más del 70% de los casos. Es notable que 2 de estos 8
casos también fueran reactivos con DH8.3.
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Ejemplo
16
Para someter a ensayo la eficacia del anticuerpo
monoclonal anti-\DeltaEGFR, mAb 806, los autores
de la presente invención trataron ratones carentes de sistema
inmunitario que portaban xenoinjertos de glioma intracraneales que
expresaban en exceso \DeltaEGFR con inyecciones intraperitoneales
de mAb806, el isotipo de control IgG o PBS.
Las líneas celulares de glioblatoma humano
U87MG, LN-Z308 y A1207 (donación del Dr. S.
Aaronson, Mount Sinai Medical Center, New York, NY) fueron
infectadas con virus con \DeltaEGFR, \DeltaEGFR carente de
quinasa (DK), o EGFR de tipo salvaje (wtEGFR). La poblaciones que
expresaban niveles elevados similares de EGFR se seleccionaron
mediante clasificación celular activada por fluorescencia y se
denominaron U87MG.\DeltaEGFR, U87MG.DK, U87MG.wtEGFR,
LN-Z308.\DeltaEGFR, LN-Z308.DK,
LN-Z308. wtEGFR, A1207.\DeltaEGFR, A1207.DK
y
A1207.wtEGFR, respectivamente. Cada una se mantuvo en medio que contenía G418 (líneas celulares U87MG, 400 \mug/ml; LN-Z308 y líneas celulares A1207, 800 \mug/ml).
A1207.wtEGFR, respectivamente. Cada una se mantuvo en medio que contenía G418 (líneas celulares U87MG, 400 \mug/ml; LN-Z308 y líneas celulares A1207, 800 \mug/ml).
Las células U87MG.\DeltaEGFR se implantaron
intracranealmente en ratones carentes de sistema inmunitario y los
tratamientos comenzaron el mismo día. Se implantaron 10^{5}
células en 5 \mul de PBS en el cuerpo estriado derecho de los
cerebros de los ratones carentes de sistema inmunitario. La terapia
generalizada con mAb 806, o el control de isotipo IgG2b, se
completó mediante inyección i.p. de 1 mg de mAb en un volumen de
100 \mul en días alternos desde el día 0
post-implantación hasta el día 14. Para la terapia
directa de los tumores U87MG.\DeltaEGFR intracerebrales, se
inyectaron 10 \mug de mAb 806, o el control de isotipo IgG2b, en
un volumen de 5 \mul en el sitio de la inyección del tumor en días
alternos empezando el día 1 durante 5 días.
Los animales tratados con PBS o control de
isotipo IgG tuvieron una supervivencia media de 13 días, mientras
los ratones tratados con mAb 806 tuvieron un incremento de 61,5% en
la supervivencia media de hasta 21 días (P<0,001).
El tratamiento de los ratones a los 3 días de la
implantación, tras el establecimiento del tumor, también prolongó
la supervivencia media de los animales tratados con mAb 806 un 46,1%
(de 13 días a 19 días; P<0,01) en comparación con la de los
grupos de control.
Para determinar si estos efectos antitumorales
de mAb 806 se extendían más allá de los xenoinjertos
U87MG.\DeltaEGFR, se administraron tratamientos similares a los animales que portaban otros xenoinjertos de células de glioma de LN-Z308.\DeltaEGFR y A 1207.\DeltaEGFR. La supervivencia media de los ratones tratados con mAb 806 que portaban xenoinjertos LN-Z308.\DeltaEGFR se prolongó de 19 días para los controles a 58 días (P<0,001). Sorprendentemente, cuatro de ocho animales tratados con mAb 806 sobrevivieron más de 60 días. La supervivencia media de los animales que portaban xenoinjertos A1207.\DeltaEGFR también se prolongó de 24 días para los controles a 29 días (P<0,01).
U87MG.\DeltaEGFR, se administraron tratamientos similares a los animales que portaban otros xenoinjertos de células de glioma de LN-Z308.\DeltaEGFR y A 1207.\DeltaEGFR. La supervivencia media de los ratones tratados con mAb 806 que portaban xenoinjertos LN-Z308.\DeltaEGFR se prolongó de 19 días para los controles a 58 días (P<0,001). Sorprendentemente, cuatro de ocho animales tratados con mAb 806 sobrevivieron más de 60 días. La supervivencia media de los animales que portaban xenoinjertos A1207.\DeltaEGFR también se prolongó de 24 días para los controles a 29 días (P<0,01).
Los ratones que portaban xenoinjertos
U87MG.\DeltaEGFR y LN-Z308.\DeltaEGFR fueron
sometidos a eutanasia el día 9 y el día 15, respectivamente. Las
secciones de tumor se analizaron histopatológicamente y se
determinaron los volúmenes de los tumores. Coincidiendo con los
resultados observados para la supervivencia animal, el tratamiento
con mAb 806 redujo significativamente los volúmenes en
aproximadamente 90% de los xenoinjertos
U87MG.\DeltaEGFR.(P<0,001) y
LN-Z308.\DeltaEGFR en más de 95% (P< 0,001) en
comparación con la de los grupos de control. Se obtuvieron
resultados similares para los animales que portaban tumores
A1207.\DeltaEGFR (reducción del volumen de 65%, P<0,01).
También se determinó la eficacia de la inyección
intratumoral directa de mAb 806 para el tratamiento de xenoinjertos
U87MG.\DeltaEGFR. Los animales recibieron inyecciones
intratumorales de mAb 806 o control de isotipo IgG un día después
de la implantación. Los animales de control sobrevivieron durante 15
días, mientras los ratones tratados con mAb 806 permanecieron vivos
durante 18 días (P<0,01). Si bien el tratamiento intratumoral
con mAb 806 resultó algo eficaz, conllevó las dificultades de las
múltiples inyecciones intracraneales y el incremento del riesgo de
infección. Por lo tanto los autores de la presente invención se
centraron en los tratamientos generalizados para estudios
adicionales.
adicionales.
Para determinar si la inhibición de crecimiento
por mAb 806 era selectiva para los tumores que expresan
\DeltaEGFR, los autores de la presente invención trataron
xenoinjertos cerebrales U87MG, U87MG.DK (\DeltaEGFR carente de
quinasa) y U87MG.wtEGFR. El tratamiento con MAb 806 no prolongó la
supervivencia de los ratones a los que se habían implantado tumores
U87MG que expresaban un bajo nivel de EGFR de tipo salvaje endógeno
(wtEGFR), o animales que portaban xenoinjertos U87MG.DK que
expresaban en exceso \DeltaEGFR carente de quinasa además de un
bajo nivel de wtEGFR endógeno. El tratamiento con mAb 806 prolongó
ligeramente la supervivencia de los ratones que portaban tumores
U87MG.wtEGFR (P<0,05, supervivencia media 23 días frente a 26
días para los grupos de control) que expresaban wtEGFR en
exceso.
Para comprender el efecto diferencial de mAb 806
sobre los tumores que expresan diferentes niveles o distintos tipos
de EGFR, los autores de la presente invención determinaron la
reactividad de mAb 806 con diferentes células tumorales mediante
análisis FACS. Coincidiendo con los informes previos, el anticuerpo
monoclonal anti-EGFR 528 reconocía tanto
\DeltaEGFR como wtEGFR, y demostró una tinción más fuerte para las
células U87MG.\DeltaEGFR en comparación con las células U87MG. En
contraste, el anticuerpo EGFR.1 reaccionaba con wtEGFR pero no con
\DeltaEGFR, ya que las células U87MG.\DeltaEGFR eran tan poco
reactivas como las células U87MG. Este anticuerpo EGFR.1
reaccionaba con U87MG.wtEGFR más intensamente que con las células
U87MG, ya que las células U87MG.wtEGFR expresaban en exceso wtEGFR.
Si bien mAb 806 reaccionaba intensamente con las células
U87MG.\DeltaEGFR y U87MG.DK y no con las células U87MG, éste
reaccionaba débilmente con U87MG.wtEGFR, indicando que mAb 806 es
selectivo para \DeltaEGFR con una reactividad cruzada débil con el
wtEGFR expresado en exceso. Este nivel de reactividad con
U87MG.wtEGFR era cuantitativamente y cualitativamente similar a la
prolongación de la supervivencia mediada por el tratamiento con
anticuerpo.
Los autores de la presente invención
determinaron adicionalmente la especificidad de mAb 806 mediante
inmunoprecipitación. Los EGFR de las diferentes líneas celulares
fueron inmunoprecipitados con los anticuerpos 528, EGFR.1 y mAb
806. Después se sondearon las transferencias de las proteínas
separadas electroforéticamente con el anticuerpo
anti-EGFR C13, que reconoce wtEGFR y también
\DeltaEGFR y DK. Coincidiendo con el análisis FACS el anticuerpo
528 reconoció wtEGFR y los receptores mutantes, mientras el
anticuerpo EGFR.1 reaccionó con wtEGFR pero no con las especies
mutantes. Por otra parte, los niveles de receptores mutantes en
células U87MG.\DeltaEGFR y U87MG.DK son comparables con los de
wtEGFR en células U87MG.wtEGFR. No obstante, el anticuerpo mAb 806
fue capaz de precipitar solamente una pequeña cantidad del wtEGFR
de los productos lisados de células U87MG.wtEGFR en comparación con
la cantidad más grande de receptor mutante precipitado de las
células U87MG.\DeltaEGFR y U87MG.DK, y una cantidad no detectable
de las células U87MG. Colectivamente, estos datos sugieren que mAb
806 reconoce un epítopo en \DeltaEGFR que también existe en una
pequeña fracción de wtEGFR solamente cuando es expresado en exceso
sobre la superficie celular.
Los autores de la presente invención
investigaron los mecanismos subyacentes a la inhibición del
crecimiento por mAb 806. Puesto que la actividad quinasa y la
autofosforilación constitutivamente activa del extremo carboxilo de
\DeltaEGFR son esenciales para sus funciones biológicas los
autores de la presente invención determinaron el estado de
fosforilación de \DeltaEGFR en tumores de animales tratados y de
control. Se encontró que el tratamiento con mAb 806 reducía
espectacularmente la autofosforilación de \DeltaEGFR, incluso
aunque los niveles de receptor disminuyeran sólo ligeramente en los
xenoinjertos tratados con mAb 806. Los autores de la presente
invención han demostrado previamente que la autofosforilación del
receptor ocasiona una regulación al alza del gen antiapoptótico,
Bcl-X_{L}, que juega un papel clave en la
reducción de la apoptosis de tumores que expresan en exceso
\DeltaEGFR. Por lo tanto, los autores de la presente invención
determinaron a continuación el efecto de mAb 806 sobre la expresión
de Bcl-XL. Los tumores \DeltaEGFR de los animales
tratados con mAb 806 mostraron en efecto una reducción de los
niveles de Bcl-X_{L}.
A la luz de la supresión in vivo causada
por el tratamiento con mAb 806 y sus efectos bioquímicos sobre la
señalización del receptor, los autores de la presente invención
determinaron la velocidad de proliferación de los tumores de
ratones de control o tratados. El índice proliferativo, medido
mediante tinción con Ki-67 de los tumores tratados
con mAb 806, fue significativamente menor que el de los tumores de
control (P< 0,001). Además, el análisis del índice apoptótico a
través de la tinción con TLTNEL demostró un incremento
significativo en el número de células apoptóticas en los tumores
tratados con mAb 806 en comparación con los tumores de control
(P< 0,001). También se analizó al grado de vascularización del
tumor mediante inmunotinción de los tumores de los especímenes
tratados y de control para CD31. Para cuantificar la vascularización
del tumor, se midieron las zonas microvasculares (MVA) utilizando
un análisis de imágenes por ordenador. Los tumores tratados con mAb
806 mostraron una MVA 30% menor que los tumores de control
(P<0,001). Para comprender si la interacción entre el receptor y
el anticuerpo puede lograr una respuesta inflamatoria, los autores
de la presente invención tiñeron secciones de tumor para el
marcador de macrófagos, F4/80, y el marcador de células NK, asialo
GM1. Los macrófagos se identificaron en toda la matriz tumoral y
especialmente se acumularon cerca de la periferia del tumor
U87MG.\DeltaEGFR tratado con mAb 86. Los autores de la presente
invención observaron algunas células NK infiltradas y alrededor de
los tumores y ninguna diferencia significativa entre los tumores
tratados con mAb 806 y de control del isotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Seguro que funciona. El ejemplo está en un
formato algo diferente de los otros que le preceden.
Los experimentos mostrados en la presente
memoria describen el trabajo in vivo diseñado para determinar
la eficacia de los anticuerpos de acuerdo con esta invención.
Se utilizaron ratones hembra carentes de sistema
inmunitario, de 4-6 semanas de edad, como animales
experimentales. Los ratones recibieron inoculaciones subcutáneas de
3 x 10^{6} células tumorales en cada uno de sus flancos.
Los animales recibieron células
U87MG.D2-7, U87MG.DK, o A431, todos los cuales se
han descrito, supra. La terapia comenzó cuando los tumores
hubieron crecido hasta un tamaño suficiente.
Los ratones recibieron después inyecciones de
uno de (i) solución salina tamponada con fosfato, (ii) mAb 806 (0,5
mg/inyección), (iii) mAb 528 (0,5 mg/inyección), o (iv) una
combinación de ambos mAb. Con respecto a "(iv)", los
diferentes grupos de ratones recibieron 0,5 mg/inyección de cada
mAb, o 0,25 mg/inyección de cada mAb.
El primer grupo de ratones examinados fueron
aquellos que habían recibido inyecciones de
U87MG.D2-7. El protocolo de tratamiento comenzó 9
días después de la inoculación y continuó, 3 veces por semana
durante 2 semanas (esto es, se inoculó a los animales 9, 11, 13,
16, 18 y 20 días después de que fueron inyectadas las células). Al
comienzo del protocolo de tratamiento, el diámetro medio del tumor
era de 115 mm^{3}. Cada grupo contenía 50 ratones, cada uno con
dos tumores.
En el grupo de ratones que recibieron la
combinación de anticuerpos (0,5 mg/inyección de cada uno), se
produjeron tres regresiones completas. No hubo regresiones en
ninguno de los demás grupos. La Figura 18A muestra los resultados
gráficamente.
En un segundo grupo de ratones, las sustancias
fueron las mismas, excepto que la terapia combinada contenía 0,25
mg de cada anticuerpo por inyección. Las inyecciones se
administraron 10, 12, 14, 17, 19 y 21 días después de la
inoculación con las células. Al comienzo de la terapia el tamaño
medio del tumor era de 114 mm^{3}. Los resultados se muestran en
la Figura 18B.
El tercer grupo de ratones recibió inoculaciones
de U87MG.DK. Las inyecciones terapéuticas comenzaron 18 días
después de la inoculación con las células, y continuó los días 20,
22, 25, 27 y 29. El tamaño medio del tumor al inicio del
tratamiento era de 107 mm^{3}. La Figura 18C resume los
resultados. Las inyecciones terapéuticas fueron las mismas que en
el primer grupo.
Finalmente, el cuarto grupo de ratones, a los
que se habían inoculado las células A431, recibió inyecciones como
en los grupos I y III, a los 8, 10, 12 y 14 días de la inoculación.
Al inicio, el tamaño medio del tumor era de 71 mm^{3}. Los
resultados se muestran en la Figura 18D.
Los resultados indicaban que la terapia
combinada con anticuerpos mostraba un efecto sinérgico en la
reducción de tumores. Véase la Figura 18A. Se observó un efecto
similar a una dosis inferior, Figura 18B, indicando que el efecto
no se debe simplemente a los niveles de dosificación.
La terapia combinada no inhibió el crecimiento
de U87MG.DK (Figura 18C), indicando que la función inmunitaria del
anticuerpo no era la causa del descenso observado en las Figuras 18A
y 18B.
Se observa que, como se muestra en la Figura
18D, la terapia combinada también mostraba una eficacia sinérgica
sobre los tumores A431, con 4 dosis que conducían a la tasa de
respuesta completa del 60%. Estos datos sugieren que la molécula de
EGFR reconocida por mAb806 es funcionalmente diferente de la
inhibida por 528.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Los siguientes experimentos fueron presentados
por Johns et al, (2002) Int. J. Cancer, 98, y en la solicitud
co-pendiente Núm. de Serie 60/342,258 presentada el
21 de Diciembre de 2001, cuyas descripciones completas se
incorporan en la presente memoria como referencia con referencia
cruzada las Figuras de la presente memoria cuando sea apropiado. Se
estudió el anticuerpo monoclonal mAb 806 y se desarrollaron datos
adicionales respecto a sus características de unión en cuanto al
receptor EGFR, que se añaden& y corroboran los datos presentados
antes en la presente memoria. Por consiguiente, lo que sigue
representa una revisión y una presentación del material mostrado en
la solicitud de patente y la correspondiente publicación.
El anticuerpo monoclonal (MAb 806) supera
potencialmente las dificultades asociadas con la localización del
EGFR expresado sobre la superficie de las células tumorales. El MAb
806 se unía a las células de glioma U87MG transfectadas con
de2-7 EGFR (U87MG.\Delta2-7) con
una elevada afinidad (\sim1 x 10^{9} M^{-1}), pero no se
unían a las células parentales que expresaban el EGFR de tipo
salvaje. Coincidiendo con esta observación, el MAb 806 no era capaz
de unirse a una versión soluble del EGFR de tipo salvaje que
contenía el dominio extracelular. En contraste, la inmovilización
de este dominio extracelular a placas ELISA indujo la saturación y
la unión en respuesta a la dosis de MAb 806, sugiriendo que MAb 806
se puede unir al EGFR de tipo salvaje EGFR en ciertas condiciones.
El MAb 806 también se unía a la superficie de las células A431, que
debido a la amplificación del gen EGFR expresan grandes cantidades
de EGFR. De manera interesante, el MAb 806 solamente reconocía un
10% de las moléculas de EGFR totales expresadas por las células A431
y la afinidad de unión era menor que la determinada para
de2-7 EGFR. El MAb 806 localizaba específicamente
los xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 y A431
desarrollados en ratones carentes de sistema inmunitario con niveles
máximos en los xenoinjertos U87MG.\Delta2-7
detectados 8 h después de la inyección. No se observó localización
específica de los xenoinjertos U87MG parentales. Después de la
unión a las células U87MG.\Delta2-7, el MAb 806
fue rápidamente internalizado por macropinocitosis y transportado
con posterioridad a lisosomas, un procedimiento que contribuye
probablemente al rápido máximo de localización observado en los
xenoinjertos. De este modo, el MAb 806 puede ser utilizado para
localizar células tumorales que contienen la amplificación del gen
EGFR o de2-7 EGFR pero no se une al EGFR de tipo
salvaje cuando es expresado sobre la superficie de la
célula.
célula.
Como se ha comentado antes, el MAb 806 es
específico para de2-7 EGFR aunque se une a un
epítopo distinto del péptido de empalme único. De manera
interesante, si bien MAb 806 no reconocía el EGFR de tipo salvaje
expresado sobre la superficie celular de las células de glioma, se
unía al dominio extracelular del EGFR de tipo salvaje inmovilizado
sobre la superficie de placas ELISA. Además, el MAb 806 se unía a la
superficie de las células A431, que tienen una amplificación del
gen EGFR pero o expresan el de2-7 EGFR. Por lo
tanto, es posible que MAb 806 pueda ser utilizado para localizar
específicamente tumores con EGFR amplificado con independencia de
su estado de de2-7 EGFR, aunque los resultados de
los autores de la presente invención sugieren que los tumores que
expresan simultáneamente el receptor mutado mostrarían todavía una
localización preferente. Puesto que MAb 806 no se une al receptor
de tipo salvaje en ausencia de amplificación génica, no habría
absorción en el tejido normal, un problema potencial asociado con
los anticuerpos para EGFR que están siendo desarrollados en la
actualidad.^{18,19}
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular de astrocitoma U87MG ha sido
descrita con detalle previamente.^{20} Esta línea celular fue
infectada con un retrovirus que contenía el de2-7
EGFR para producir la línea celular U87MG.A2-7. Se
obtuvieron 10 células A431 de carcinoma escuamoso de ATCC
(Rockville, MD). Estas líneas celulares se cultivaron en
DMEM/F-12 con GlutaMAX^{TM} (Life Technologies,
Melbourne, Australia) con un suplemento con FCS al 10% (CSL,
Melbourne, Australia). La línea celular pro-B murina
BaF/3, que no expresa ninguna de las moléculas relacionadas con
EGFR conocidas, fue transfectada con de2-7 EGFR como
se ha descrito antes. El anticuerpo DH8.3 (IgG1) ha sido descrito
previamente y fue obtenido después de la inmunización de ratones con
el péptido de empalme único encontrado en de2-7
EGFR.^{16} Se produjo MAb 806 (IgG2b) después de la inmunización
de ratones con fibroblastos de ratón NR6 transfectados con
de2-7 EGFR. Este se seleccionó para su
caracterización adicional ya que los análisis de hemaglutinación
mostraron un elevado título frente a células NR6.\DeltaEGFR pero
bajos fondos en células NR6.wtEGFR. El anticuerpo 528, que reconoce
EGFR tanto de2-7 como de tipo salvaje, ha sido
descrito previamente^{21} y fue producido en Biological Production
Facility (Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne)
utilizando un hibridoma obtenido de ATCC. El anticuerpo policlonal
sc-03 dirigido al dominio
COOH-terminal del EGFR fue adquirido de Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA).
El dominio extracelular recombinante
(aminoácidos 1-621) del EGFR de tipo salvaje (sEGFR)
fue producido como se ha descrito previamente.^{22} El péptido de
empalme único biotinilado (Biotina-LEEKKGNYVVTDH) de
de2-7 EGFR fue sintetizado mediante la química de
Fmoc convencional y su pureza fue determinada (>96%) mediante
HPLC de fase inversa y análisis de espectro de masas (Auspep,
Melbourne, Australia).
Las células se marcaron con el anticuerpo
relevante (10 \mug/ml) seguido de IgG anti-ratón
de cabra conjugada con fluoresceína (dilución 1:100; Calbiochem,
San Diego, CA). Los datos de FACS se obtuvieron en un Coulter Epics
Elite ESP observando un mínimo de 5.000 eventos y se analizaron
utilizando EXPO (versión 2) para Windows.
Se utilizaron dos tipos de ELISA para determinar
la especificidad de los anticuerpos. En el primer análisis, las
placas se recubrieron con Segfr (10 \mug/ml en tampón carbonato
0,1 M pH 9,2) durante 2 hr y después se bloquearon con albúmina de
suero humano al 2% (HSA) en PBS. Los anticuerpos se añadieron a los
pocillos por triplicado a una concentración creciente en HSA al 2%
en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El anticuerpo unido
se detectó mediante IgG anti-ratón de oveja
conjugada con peroxidasa de rábano picante (Silenus, Melbourne,
Australia) utilizando ABTS (Sigma, Sydney, Australia) como sustrato
y se midió la absorbancia a 405 nm. En el segundo análisis, el
péptido específico de de2-7 biotinilado se unió a
placas ELISA previamente recubiertas con estreptavidina (Pierce,
Rock-ford, Illinois). Los anticuerpos se unieron y
se detectaron como en el primer análisis.
Se marcaron los anticuerpos con I^{125}
(Amrad, Melbourne, Australia) mediante el método de la cloramina T
y se determinó la inmunorreactividad mediante el análisis de
Lindmo.^{23} Todos los análisis de unión se realizaron en HSA/PBS
al 1% en 1-2 X 10^{6} células
U87MG.\Delta2-7 o A431 vivas durante 90 min a 4ºC
con rotación suave. Se utilizó una concentración establecida de 10
ng/ml de anticuerpo marcado con I^{125} en presencia de
concentraciones crecientes del anticuerpo no marcado apropiado. Se
determinó la unión no específica en presencia de un exceso de
10.000 veces de anticuerpo no marcado. Ni el Mab 806 radiomarcado
con I^{125} ni el anticuerpo DH8.3 se unían a las células U87MG
parentales. Una vez completada la incubación, las células se
lavaron y se contó el anticuerpo marcado con I125 unido utilizando
un contador gamma COBRA II (Packard Instrument Company, Meriden,
CT). El análisis Scatchard se realizó tras la corrección para la
inmunorreactividad.
Las células U87MG.\Delta2-7 se
incubaron con MAb 806 o anticuerpo DH8.3 (10 \mug/ml) durante 1 hr
en DMEM a 4ºC. Después de lavar, las células se transfirieron a
DMEM pre-calentado a 37ºC y se tomaron alícuotas en
diversos momentos puntuales después de la incubación a 37ºC. La
internalización se detuvo lavando inmediatamente las alícuotas con
tampón de lavado enfriado con hielo (HSA/PBS al 1%). Una vez
completado el tiempo las células se tiñeron mediante FACS como se
ha descrito antes. Se calculó el porcentaje de internalización
comparando la tinción del anticuerpo en superficie en diferentes
momentos puntuales con el tiempo cero utilizando la fórmula:
porcentaje de anticuerpo internalizado = (fluorescencia media a
tiempo_{x} - fluorescencia del fondo)/(fluorescencia media a
tiempo_{0} - fluorescencia del fondo) X 100. Este método se validó
en 1 análisis utilizando anticuerpo yodado (MAb 806) para medir la
internalización como se ha descrito previamente.^{24} Las
diferencias en la tasa de internalización en diferentes momentos
puntuales se compararon utilizando el test de la t de Student.
Se hicieron crecer células
U87MG.\Delta2-7 sobre portas con cámaras
recubiertos de gelatina (Nunc, Naperville, IL) a una confluencia
del 80% y después se lavaron con DMEM enfriado con hielo. Después
las células se incubaron con MAb 806 o anticuerpo DH8.3 en DMEM
durante 45 min a 4ºC. Después de lavar, las células se incubaron
durante 30 min adicionales con IgG anti-ratón
conjugada con partículas de oro (partículas de 20 nm)
(BBInternational, Cardiff, UK) a 4ºC. Tras un lavado adicional, se
añadió DMEM/FCS al 10% precalentado a las células, que se incubaron
a 37ºC varias veces de 1-60 min. La internalización
del anticuerpo se detuvo con medio enfriado con hielo y las células
se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en PBS/HSA al 0,1% y después
se post-fijaron en tetróxido de osmio al 2,5%.
Después de la deshidratación a través de una serie graduada de
acetona, las muestras se embebieron en resina Epon/Araldite, se
cortaron en secciones ultrafinas con un microtomo Reichert
Ultracut-S (Leica) y se recogieron sobre gradillas
de níquel. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo y
citrato de plomo antes de ser visualizadas en un microscopio
electrónico de transmisión Philips CM12 a 80 kV. Se realizó el
análisis estadístico de los granos de oro contenidos en las fositas
recubiertas recubiertas utilizando un test de \chi^{2}.
Las células se marcaron durante 16 hr con 100
\muCi/ml de Tran^{35}S-Label (ICN Biomedicals,
CA) en DMEM sin metionina/cisteína con un suplemento de FCS al 5%
sometido a diálisis. Después de lavar con PBS, las células se
colocaron en tampón de lisis (Triton X-100 al 1%,
HEPES 30 mM, NaCl 150 mM, AEBSF 500 \muM, aprotinina 150 nM,
inhibidor de proteasa E-64 1 \muM, EDTA 0,5 mM y
leupeptina 1 \muM, pH 7,4) durante 1 hr a 4ºC. Los productos
lisados se aclararon mediante centrifugación durante 10 min a 12.000
g, después se incubaron con 5 \mug de anticuerpo apropiado
durante 30 min a 4ºC antes de la adición de Proteína
A-Sefarosa. Los productos inmunoprecipitados se
lavaron 3 veces con tampón de lisis, se mezclaron con tampón de
muestra SDS, se separaron mediante electroforesis en gel utilizando
un gel de Tris/glicina al 4-20% que después se secó
y se expuso a película de rayos X.
Se establecieron xenoinjertos de tumores en
ratones BALB/c carentes de sistema inmunitario mediante inyección
s.c. de 3 X 10^{6} células U87MG,
U87MG.\Delta2-7 o A431. La expresión de
de2-7 EGFR en xenoinjertos
U87MG.A2-7 permanece estable durante todo el
periodo de biodistribución como se medía mediante inmunohistoquímica
en diferentes momentos puntuales (datos no mostrados). Las células
A431 también conservaron su reactividad con MAb 806 cuando se
hacían crecer como xenoinjertos tumorales mediante
inmunohistoquímica. Se inyectaron las células U87MG o A431 en 1
lado 7-10 días antes de que las células
U87MG.\Delta2-7 fueran inyectadas en el otro lado
debido a la tasa de crecimiento más rápido observada para los
xenoinjertos que expresaban de2-7 EGFR. Los
anticuerpos fueron radiomarcados y evaluados en cuanto a la
inmunorreactividad como se ha descrito antes y se inyectaron en
ratones por la ruta retro-orbital cuando los tumores
tenían 100-200 mg de peso. Cada ratón recibió 2
anticuerpos diferentes (2 \mug por anticuerpo): 2 \muCi de MAb
806 marcado con I^{12} y 2 \muCi de DH8.3 o 528 marcados con
I^{131}. A menos que se indique, se sacrificaron grupos de 5
ratones en diferentes momentos puntuales
post-inyección y se obtuvo sangre mediante punción
cardíaca. Los tumores, hígado, bazo, riñones y pulmones se
obtuvieron por disección. Todos los tejidos se pesaron y se
analizaron en cuanto a la actividad I^{125} e I^{131}
utilizando una ventana de recuento de dos canales. Los datos se
expresaron para cada anticuerpo como el porcentaje de dosis
inyectada por gramo de tumor (% DI/g de tumor) determinado mediante
comparación con los patrones de dosis inyectada o se convirtieron en
razones de sangre/hígado (esto es, % DI/g tumor ÷ % DI/g
sangre o hígado). Se analizaron las diferencias entre los grupos
mediante un test de la t de Student. Tras la inyección de MAb 806
radiomarcado, algunos tumores se fijaron en formalina, se
embebieron en parafina, se cortaron en secciones de 5 \mum y
después se expusieron a película de rayos x (AGFA, Mortsel,
Bélgica) para determinar la localización de anticuerpo mediante
autorradiografía.
Con el fin de confirmar la especificidad de MAb
806 y del anticuerpo DH8.3, se analizó la unión a células U87MG y
U87MG.\Delta2-7 mediante FACS. Se incluyó una
IgG2b murina irrelevante como control de isotipo para MAb 806 y el
528 ya que reconoce el EGFR tanto de2-7 como de tipo
salvaje. Solamente el anticuerpo 528 fue capaz de teñir la línea
celular U87MG (Figura 1) coincidiendo con informes previos que
demostraban que estas células expresan el EGFR de tipo
salvaje.^{10} Tanto MAb 806 como el anticuerpo DH8.3 tenían
niveles de unión similares a los del anticuerpo irrelevante,
demostrando claramente que son incapaces de unirse al receptor de
tipo salvaje (Figura 1). La unión del anticuerpo de control del
isotipo a las células U87MG.A2-7 fue similar a la
observada para las células U87MG. MAb 806 y el anticuerpo DH8.3
inmunotiñeron las células U87MG.\Delta2-7,
indicando que estos anticuerpos reconocen específicamente el
de2-7 EGFR (Figura 1). El anticuerpo 528 tiñó
U87MG.\Delta2-7 con una intensidad mayor que las
células parentales ya que se une a los receptores tanto
de2-7 como de tipo salvaje que son expresados
simultáneamente en estas células (Figura 1). En gran medida, MAb
806 también se unía a la línea celular
BaF/3.\Delta2-7, demostrando que la expresión
simultánea del EGFR de tipo salvaje no es un requerimiento para la
reactividad de MAb 806 (Figura 1 datos no mostrados sin embargo en
la presente memoria).
Para caracterizar adicionalmente la
especificidad de MAb 806 y el anticuerpo DH8.3, se examinó su unión
mediante ELISA. Tanto MAb 806 como el anticuerpo 528 presentaron
curvas de unión dependientes de la dosis y saturantes para sEGFR de
tipo salvaje inmovilizado (Figura 2A). Como el único péptido de
empalme encontrado en el de2-7 EGFR no está
contenido en el sEGFR, MAb 806 se debe estar uniendo a un epítopo
localizado en la secuencia de EGFR de tipo salvaje. La unión del
anticuerpo 528 era probablemente inferior a la observada para MAb
806 ya que reconoce un determinante conformacional. Como se
esperaba el anticuerpo DH8.3 no se unía al sEGFR de tipo salvaje ni
siquiera a concentraciones de hasta 10 \mug/ml (Figura 2A). Aunque
sEGFR en solución inhibía la unión del anticuerpo 528 a sEGFR
inmovilizado de una manera dependiente de la dosis, no era capaz de
inhibir la unión de MAb 806 (Figura 2B). Esto sugiere que MAb 806
solo se puede unir al EGFR de tipo salvaje una vez inmovilizado
sobre placas de ELISA, un procedimiento que puede inducir cambios
conformacionales. Se observaron resultados similares utilizando
BIAcore por medio del cual MAb 806 se unía a un sEGFR inmovilizado
pero MAb 806 inmovilizado no se podía unir a sEGFR en solución
(datos no mostrados). Después de la desnaturalización por
calentamiento durante 10 min a 95ºC, el sEGFR en solución fue capaz
de inhibir la unión de MAb 806 a sEGFR inmovilizado (Figura 2C
datos no mostrados sin embargo en la presente memoria), confirmando
que MAb 806 se puede unir al EGFR de tipo salvaje en ciertas
condiciones. De manera interesante, el sEGFR desnaturalizado fue
incapaz de inhibir la unión del anticuerpo 528 (Figura 2C datos no
mostrados sin embargo en la presente memoria), demostrando que este
anticuerpo reconoce un epítopo conformacional. El anticuerpo DH8.3
mostró una unión dependiente de la dosis y saturable al único
péptido de2-7 EGFR (Figura 2D). Ni MAb 806 ni el
anticuerpo 528 se unieron al péptido, ni siquiera a concentraciones
mayores que las utilizadas para obtener la unión por saturación de
DH8.3, indicando adicionalmente que MAb 806 no reconoce un
determinante epitópico en este péptido.
Se realizó un análisis Scatchard utilizando
células U87MG.\Delta2-7 con el fin de determinar
la afinidad relativa de cada anticuerpo. Tanto MAb 806 como el
anticuerpo DH8.3 conservaron una inmunorreactividad elevada cuando
se yodaron y era típicamente mayor del 90% para MAb 806 y del
45-50% para el anticuerpo DH8.3. MAb 806 tenía una
afinidad por el receptor de2-7 EGFR de 1,1 X
10^{9} M^{-1} mientras la afinidad de DH8.3 fue una 10 veces
menor a 1,0 X 10^{8} M^{-1}. Ni el anticuerpo yodado unido a
células parentales U87MG. MAb 806 reconocía una media de 2,4 X
10^{5} sitios de unión por célula uniéndose el anticuerpo DH8.3 a
una media de 5,2 X 10^{5} sitios. De este modo, no solo hubo una
buena coincidencia en el número de receptores entre los
anticuerpos, sino también con un informe previo que mostraba 2,5 X
10^{5} receptores de2-7 por célula medidos
mediante un anticuerpo de2-7 EGFR diferente
específico en la misma línea celular.^{25}
La tasa de internalización de anticuerpo después
de la unión a una célula diana influye tanto en sus propiedades de
localización del tumor como en sus opciones terapéuticas. Por
consiguiente, los autores de la presente invención examinaron la
internalización of MAb 806 y el anticuerpo DH8.3 después de la unión
a las células U87MG.\Delta2-7 mediante FACS.
Ambos anticuerpos mostraron una internalización relativamente rápida
alcanzando niveles en el estado estacionario a los 10 min para MAb
806 y 30 min para DH8.3 (Figura 3). La internalización de DH8.3 era
significativamente mayor tanto en términos de tasa (80,5% de DH8.3
internalizado a los 10 min en comparación con el 36,8% para MAb
806, p < 0,01) como de cantidad total internalizada a los
60 min (93,5% vs. 30,4%, p < 0,001). MAb 806 mostró
niveles ligeramente inferiores de internalización a los 30 y 60 min
en comparación con los 20 min en los 4 análisis realizados (Figura
3). Este resultado también se confirmó utilizando un análisis de
internalización basado en MAb 806 yodado (datos no mostrados).
Dada esta diferencia en las tasas de
internalización entre los anticuerpos, se realizó un análisis
detallado del tráfico intracelular de anticuerpos utilizando la
microscopía electrónica. Aunque el anticuerpo DH8.3 se internalizó
predominantemente por medio de fositas recubiertas (Figura 19A), MAb
806 parecía ser internalizado mediante macropinocitosis (Figura
19B). De hecho, un análisis detallado de 32 fositas recubiertas
formadas en células incubadas con MAb 806 reveló que ninguna de
ellas contenía anticuerpo. En contraste, alrededor del 20% de todas
las fositas recubiertas de las células incubadas con DH8.3 fueron
positivas para el anticuerpo, conteniendo algunas múltiples granos
de oro. Un análisis estadístico del número total de granos de oro
contenidos en las fositas recubiertas descubrió que la diferencia
era altamente significativa (p < 0,01). Después de
20-30 min ambos anticuerpos pudieron ser observados
en estructuras que morfológicamente se asemejaban a lisosomas
(Figura 19C). La presencia de desechos celulares en estas
estructuras también coincide con su naturaleza lisosómica.
Se comparó la biodistribución de MAb 806 y del
anticuerpo DH8.3 en ratones carentes de sistema inmunitario que
contenían xenoinjertos U87MG en 1 lado y xenoinjertos
U87MG.\Delta2-7 en el otro. Se seleccionó un
período de tiempo relativamente corto para este estudio ya que un
informe previo demostró que el anticuerpo DH8.3 muestra niveles
máximos de localización tumoral entre las 4_{-}24 hr.^{16} En
términos de % DI/g de tumor, MAb 806 alcanzó su nivel máximo en
xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 de 18,6% DI/g de
tumor a las 8 hr (Figura 4A), considerablemente mayor que cualquier
otro tejido excepto la sangre. Aunque DH 8.3 también mostró niveles
tumorales máximos a las 8 hr, el nivel fue estadísticamente inferior
(p < 0,001), 8,8% DI/g de tumor en comparación con MAb
806 (Figura 4B). Los niveles de ambos anticuerpos disminuyó
lentamente a las 24 y 48 hr. La autorradiografía de secciones de
tejido con xenoinjerto U87MG.\Delta2-7 recogidas 8
hr después de la inyección con MAb 806 solo marcado con I^{125},
ilustra claramente la localización por el anticuerpo de tumor
viable (Figura 20). Ningún anticuerpo mostró una localización
específica de los xenoinjertos parentales U87MG (Figura 4A, 4B).
Con respecto a las razones de sangre/hígado, MAb 806 mostró la razón
más alta a las 24 hr tanto para sangre (razón de 1.3) como hígado
(razón de 6,1) (Figura 5A, 5B). El anticuerpo DH8.3 tenía su razón
más alta en sangre a las 8 hr (razón de 0,38) y a las 24 hr en
hígado (razón de 1,5) (Figura 5A, 5B), ambas las cuales son
considerablemente inferiores que los valores obtenidos para MAb
806.
Para examinar si MAb 806 podía reconocer el EGFR
expresado en células que contienen un gen de receptor amplificado,
se analizó su unión a células A431. Se observó una unión de MAb 806
a células A431 baja pero muy reproducible mediante análisis FACS
(Figura 6). El anticuerpo DH8.3 no se unía a las células A431,
indicando que la unión de MAb 806 no era resultado del bajo nivel
de expresión de de2-7 EGFR (Figura 6). Como se
esperaba, el anticuerpo anti-EGFR 528 mostraba una
tinción fuerte de las células A431 (Figura 6). La media de 3 de
tales experimentos dio un valor para la afinidad de 9,5 X 10^{7}
M^{-1} con 2,4 X 10^{5} receptores por célula. De este modo la
afinidad para este receptor fue unas 10 veces menor que la afinidad
para de2-7 EGFR. Además, MAb 806 parece reconocer
solamente una pequeña porción de EGFR encontrada en la superficie de
las células A431. Utilizando el anticuerpo 528 se midieron
aproximadamente 2 X 10^{6} receptores por célula, lo que coincide
con otros numerosos estudios.^{26} Para asegurar que estos
resultados no estaban restringidos simplemente a la línea celular
A431, se examinó la reactividad MAb 806 en otras dos líneas
celulares que mostraban amplificación del gen EGFR. Se ha informado
de que tanto la línea celular de cáncer de cabeza y cuello
HN5^{27} como la línea celular de cáncer de mama
MDA-468^{28} contienen múltiples copias del gen
EGFR. Coincidiendo con estos informes, el anticuerpo 528 presentó
una tinción intensa de ambas líneas celulares (Figura 21). Como con
la línea celular A431, el MAb 806 tiñó claramente ambas líneas
celulares pero a un nivel inferior que el observado con el
anticuerpo 528 (Figura 21). De este modo, la unión de MAb 806 no
está simplemente restringida a las células A431 si no que parece
ser una observación general para las células que contienen la
amplificación del gen EGFR.
Se caracterizó adicionalmente la reactividad de
MAb 806 mediante inmunoprecipitación utilizando células marcadas
con S^{35}. El anticuerpo sc-03 (un anticuerpo
policlonal comercial específico para el dominio
c-terminal del EGFR) inmunoprecipitó 3 bandas de
células U87MG.\Delta2-7; un doblete
correspondiente a las 2 bandas de de2-7 EGFR
observadas en estas células y una banda de peso molecular superior
correspondiente al wt EGFR (Figura 22). En contraste, si bien MAb
806 inmunoprecipitaba las 2 bandas de de2-7 EGFR, el
wt EGFR estaba completamente ausente. El anticuerpo
sc-03 inmunoprecipitaba una única banda
correspondiente al wt EGFR de las células A431 (Figura 22). El MAb
806 también inmunoprecipitaba una única banda correspondiente al wt
EGFR de células A431 (Figura 22) pero coincidente con los datos de
FACS y Scatchard, la cantidad de EGFR inmunoprecipitado por MAb 806
fue sustancialmente menor que el EGFR total presente sobre la
superficie de la célula. Dado que el MAb 806 y el
sc-03 inmunoprecipitaban cantidades similares de
de2-7 EGFR, este resultado apoya la idea de que el
anticuerpo MAb 806 solamente reconoce una porción del EGFR de las
células que expresan en exceso el receptor. Una IgG2b irrelevante
(un control del isotipo para MAb 806) no inmunoprecipitó EGFR de
ninguna línea celular (Figura 22). Utilizando condiciones
idénticas, MAb 806 no inmunoprecipitó el EGFR de las células U87MG
parentales (datos no mostrados).
Se realizó un segundo estudio de biodistribución
con MAb 806 para determinar si podía localizar xenoinjertos de
tumores A431. El estudio se llevó a cabo a lo largo de un período de
tiempo más largo con el fin de obtener más información referente a
la localización de xenoinjertos U87MG.\Delta2-7
por MAb 806, que fueron incluidos en todos los ratones como control
positivo. Además, se incluyó el anticuerpo anti-EGFR
528 como control positivo para los xenoinjertos A431, puesto que un
estudio previo demostró una localización baja pero significativa
por este anticuerpo de las células A431 desarrolladas en ratones
carentes de sistema inmunitario.^{21} Durante las primeras 48 hr,
MAb 806 presentó propiedades de localización casi idénticas a las
observadas en los experimentos iniciales (Figura 7A en comparación
con la Figura 4A). En términos de % DI/g de tumor, los niveles de
MAb 806 en xenoinjertos U87MG.\Delta2-7
disminuyeron lentamente después de 24 hr pero siempre permanecieron
más altos que los niveles detectados en tejido normal. La absorción
en los xenoinjertos A431 fue comparativamente baja, sin embargo,
hubo un pequeño incremento en % DI/g de tumor durante las primeras
24 hr no observado en tejidos normales tales como hígado, bazo,
riñón y pulmón (Figura 7A). La absorción del anticuerpo 528 fue
baja en ambos xenoinjertos cuando se expresó como % DI/g de tumor
(Figura 7B). La autorradiografía de secciones de tejido con
xenoinjerto A431 recogidas 24 hr después de la inyección con MAb 806
marcada con I^{125} solo, ilustra claramente la localización por
el anticuerpo de tumor viable cerca de la periferia del tumor y no
de las zonas centrales de necrosis (Figura 23). En términos de razón
de tumor con respecto a sangre MAb 806 mostró un máximo a las 72 hr
para los xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 y a las 100
hr para los xenoinjertos A431 (Figura 8A, 8B). Aunque la razón de
tumor:sangre para MAb 806 nunca sobrepasó 1,0 con respecto al tumor
A431, aumentó todo el tiempo (Figura 8B) y fue mayor que en todos
los otros tejidos examinados (datos no mostrados) indicando bajos
niveles de localización. La razón de tumor con respecto a sangre
para el anticuerpo 528 mostró un perfil similar para MAb 806 aunque
se observaron niveles más altos en los xenoinjertos A431 (Figura 8A,
8B). MAb 806 tuvo una razón de tumor con respecto a hígado máxima
en los xenoinjertos U87MG.\Delta2-7 de 7,6 a las
72 hr, demostrando claramente una absorción preferente en estos
tumores en comparación con el tejido normal (Figura 8C). Otras
razones de tumor con respecto a órgano para MAb 806 fueron similares
a las observadas en el hígado (datos no mostrados). La razón de
tumor con respecto a hígado máxima para MAb 806 en xenoinjertos
A431 fue de 2,0 a lod hr, indicando de nuevo una absorción
ligeramente preferente en el tumor en comparación con el tejido
normal (Figura 8D).
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo monoclonal L8A4 descrito
previamente dirigido al péptido de empalme único encontrado en
de2-7 EGFR, se comporta de una manera similar a MAb
806.^{38} Utilizando células U87MG transfectadas con
de2-7 EGFR, esta anticuerpo tuvo una tasa de
internalización similar (35% a 1 hr en comparación con 30% a 1 hr
para MAb 806) y presentó una localización in vivo comparable
cuando se utilizaron fibroblastos 3T3 transfectados con
de2-7 EGFR (máximo de 24% DI/g de tumor a las 24 hr
en comparación con el 18% DI/g de tumor a las 8 hr para MAb
806).^{25}.
Quizás la ventaja más importante de MAb 806 en
comparación con los anticuerpos EGFR actuales, es que MAb 806 se
puede conjugar directamente con agentes citotóxicos. Este enfoque no
es factible con los anticuerpos específicos de EGFR actuales ya que
estos se dirigen al hígado y la conjugación citotóxica induciría
casi con certeza una grave toxicidad. La conjugación de los agentes
citotóxicos tales como fármacos^{41} o radioisótopos^{42} con
anticuerpos tiene el potencial de mejorar la eficacia y reducir la
toxicidad generalizada de estos agentes. La capacidad de un
anticuerpo conjugado para mediar la eliminación del tumor depende de
su potencial para ser internalizado. De este modo, la rápida
internalización observada con MAb 806 en células
U87MG.\Delta2-7, sugiere que MAb 806 es un
candidato ideal para este tipo de enfoque.
MAb 806 es novedoso ya que es el primer
anticuerpo específico para de2-7 EGFR dirigido a un
epítopo no asociado con el péptido de empalme único. Tiene una
afinidad superior y mejores propiedades de localización de tumores
que DH8.3, un anticuerpo para de2-7 EGFR descrito
previamente. Una propiedad importante, no obstante, es su capacidad
para reconocer un subgrupo de moléculas expresadas sobre la
superficie de células tumorales que manifiestan la amplificación
del gen EGFR. Esto sugiere que MAb 806 puede poseer una propiedad
clínica única; la capacidad para localizar el EGFR tanto
de2-7 como amplificado pero no los receptores de
tipo salvaje. Se ha demostrado que es correcto, este anticuerpo no
se dirigiría a órganos tales como el hígado y por lo tanto sería
más versátil que los anticuerpos actuales dirigidos al
EGFR,^{18,19} que no pueden ser utilizados para el acoplamiento
de agentes citotóxicos. Finalmente, MAb 806 puede ser un reactivo
útil para analizar los cambios conformacionales inducidos por el
truncamiento encontrado en el de2-7 EGFR.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
Este ejemplo presenta la evaluación de mAb 806
sobre el crecimiento de gliomas xenoinjertados intracraneales en
ratones carentes de sistema inmunitario. Lo siguiente corresponde a
y fue presentado por Mishima et al, (2001) Cancer Research,
61:5349-5354. Los datos y descubrimientos de Mishima
et al. se exponen más abajo.
El tratamiento generalizado con mAb 806 redujo
significativamente el volumen de los tumores y aumentó la
supervivencia de los ratones que portaban los xenoinjertos de
gliomas U87 MG.\DeltaEGFR, LN-7,308.\DeltaEGFR,
o A1207, cada uno de los cuales expresa elevados niveles de
\DeltaEGFR. En contraste, el tratamiento con mAb 806 fue ineficaz
con ratones que portaban los tumores U87 MG parentales, que
expresaban niveles bajos de EGFR de tipo salvaje endógeno, o
tumores U87 MG.DK, que expresaban niveles elevados de \DeltaEGFR
carente de quinasa. Se produjo un ligero incremento de
supervivencia de los ratones xenoinjertados con glioma U87 MG que
expresaba en exceso EGFR de tipo salvaje (U87 MG.wtEGFR) por medio
del mAb 806 coincidente con su débil reactividad cruzada con tales
células. El tratamiento de tumores U87 MG.\DeltaEGFR en ratones
con mAb 806 ocasionó disminuciones tanto en el crecimiento del
tumor como en la angiogénesis, así como un incremento de la
apoptosis. Mecánicamente, el tratamiento con mAb 806 in vivo
mAb dio como resultado una reducción de la fosforilación del
\DeltaEGFR activo constitutivamente y ocasionó una expresión
regulada a la baja del protector apoptótico,
Bcl-XL. Estos datos proporcionan una evidencia
preclínica de que el tratamiento con mAb 806 puede ser un agente
bioterapéutico útil para aquellos gliomas progresivos que expresan
\DeltaEGFR.
El presente ejemplo demuestra que el tratamiento
generalizado con el mAb específico de \DeltaEGFR novedoso, mAb
806, ocasiona una reducción de la fosforilación del \DeltaEGFR
activo constitutivamente y de ese modo suprime el crecimiento de
los gliomas implantados intracranealmente que expresan en exceso
este receptor mutante en ratones carentes de sistema inmunitario y
prolonga su supervivencia. La inhibición del crecimiento tumoral
estaba mediada por un descenso en la proliferación y la angiogénesis
y aumentó la apoptosis de las células tumorales. Esta supresión
afectó a la señalización activa por \DeltaEGFR debido a que los
xenoinjertos intracraneales que estaban derivados de células que
expresaban en exceso el \DeltaEGFR carente de quinasa (DK), que
son reconocidos igualmente bien por mAb 806, no fueron suprimidos
significativamente después de la misma terapia.
Líneas Celulares. Debido a que los
explantes primarios de glioblastomas humanos pierden rápidamente la
expresión los receptores reordenados, amplificados en cultivo, no
existen líneas celulares de glioblastoma que muestren semejante
expresión. Para forzar el mantenimiento de niveles de expresión
comparables con los observados en tumores humanos, se infectaron
células U87 MG, LN-Z308, y A1207 (donación del Dr.
S. Aaronson, Mount Sinai Medical Center, New York, NY) con virus
con \DeltaEGFR, \DeltaEGFR carente de quinasa (DK), o wtEGFR que
también conferían resistencia a G418 como se ha descrito
previamente (21). Las poblaciones que expresan niveles similares de
los diferentes alelos de EGFR (estos niveles de expresión
corresponden aproximadamente a un nivel de amplificación de 25
copias de genes; los glioblastomas humanos tienen típicamente
niveles de amplificación de 10 a 50 copias de genes del receptor
truncado) fueron seleccionadas mediante FACS como se ha descrito
previamente (21) y se denominaron U87 MG.\DeltaEGFR, U87 MG.DK,
U87 MG.wtEGFR, LN-Z308.\DeltaEGFR,
LN-Z308.DK, LN-Z308.wtEGFR,
A1207.\DeltaEGFR, A1207.DK, y A1207.wtEGFR, respectivamente. Cada
una se mantuvo en medio que contenía G418 (líneas celulares U87 MG,
400 mg/ml; líneas celulares LN-Z308 y A1207, 800
mg/ml). mAbs. mAb 806 (IgG2b, k), un mAb específico de
\DeltaEGFR, se produjo después de la inmunización de ratones con
fibroblastos de ratón NR6 que expresaban \DeltaEGFR. Este se
seleccionó de diferentes clones debido a que los análisis de
hemaglutinación mostraron que tenía una reactividad elevada contra
las células NR6.\DeltaEGFR, una reactividad baja para las
NR6.wtEGFR, y ninguna para las células NR6.
Inmunoprecipitación y Análisis de
Transferencia Western. Se lisaron las células con tampón de
lisis que contenía HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicerol al
10%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, SDS al 0,1%,
desoxicolato de sodio al 0,5%, PP_{i} sódico 10 mM, Fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM, Na_{3} VO_{4} 2 mM, leupeptina 5
\mug/ml, y aprotinina 5 \mug/ml. Los anticuerpos se incubaron
con productos lisados celulares a 4ºC durante 1 h antes de la
adición de proteína-A y -G/Sefarosa. Los productos
inmunoprecipitados se lavaron dos veces con tampón de lisis y una
vez con tampón HNTG [HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Triton
X-100 al 0,1%, y glicerol 10%], se sometieron a
electroforesis, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las
transferencias se sondearon con el anticuerpo
anti-EGFR, C13, y las proteínas se visualizaron
utilizando el sistema de detección quimioluminiscente ECL (Amersham
Pharmacia Biotech). Los mAbs utilizados para la precipitación fueron
mAb 806, clon de mAb anti-EGFR 528 (Oncogene
Research Products, Boston, MA), o clon EGFR. 1 (Oncogene Research
Products). Un mAb, C13, utilizado para la detección del tipo salvaje
y de \DeltaEGFR en inmunotransferencias fue proporcionado por Dr.
G. N. Gill (University of California, San Diego, CA). Se utilizaron
anticuerpos para Bcl-X (anticuerpo policlonal de
conejo; Transduction Laboratories, Lexington, KY) y fosfotirosina
(4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) para el análisis de
transferencia Western como se ha descrito previamente (26).
Análisis de Citometría de Flujo. Las
células se marcaron con el anticuerpo relevante seguido de IgG
anti-ratón de cabra conjugada con fluoresceína
(dilución 1:100; Becton-Dickinson PharMingen, San
Diego, CA) como se ha descrito previamente (21). Las células
teñidas se analizaron con un FACSCalibur utilizando el soporte
lógico Cell Quest (Becton-Dickinson PharMingen).
Para el primer anticuerpo, se utilizaron los siguientes mAb: mAb
806, mAb anti-EGFR clon 528, y clon EGFR.1. Se
utilizó IgG2a o IgG2b de ratón como control del isotipo.
Terapia Tumoral. Se implantaron células
U87 MG.\DeltaEGFR (1 X 10^{5}) o 5 X 10^{5} células
LN-Z308.\DeltaEGFR, A1207. \DeltaEGFR, U87 MG,
U87 MG.DK, y U87 MG.wtEGFR en 5 \mul de PBS en el cuerpo estriado
derecho en cerebros de ratones carentes de sistema inmunitario como
se ha descrito previamente (27). La terapia generalizada con mAb
806, o control de isotipo IgG2b, se completó mediante inyección i.p.
de 1 \mug de mAb en un volumen de 100 \mul en días alternos
desde el día 0 después de la implantación al 14. Para la terapia
directa de los tumores U87 MG.\DeltaEGFR intracerebrales, se
inyectaron 10 \mug de mAb 806, o el control de isotipo IgG2b, en
un volumen de 5 \mul en el sitio de la inyección del tumor en
días alternos comenzando el día 1 durante 5 días.
Inmunohistoquímica. Para evaluar la
angiogénesis en tumores, se fijaron en una solución que contenía
cloruro de cinc, se embebieron en parafina, se hicieron secciones,
y se inmunotiñeron utilizando un anticuerpo monoclonal CD31
anti-ratón de rata (Becton-Dickinson
PharMingen; 1:200). Se realizó la evaluación de la proliferación de
las células tumorales mediante inmunohistoquímica
Ki-67 sobre tejidos de tumor embebidos en parafina
fijados con formalina. Después de la desparafinización y la
rehidratación, se incubaron las secciones de tejido con peróxido de
hidrógeno al 3% en metanol para sofocar la peroxidasa endógena. Las
secciones se bloquearon durante 30 min con suero de cabra y se
incubaron durante la noche con el anticuerpo primario a 4ºC. Las
secciones se lavaron después con PBS y se incubaron con un
anticuerpo secundario biotinilado durante 30 min. Después de varios
lavados con PBS, los productos se visualizaron utilizando
estreptavidina- peroxidasa de rábano picante con diaminobenzidina
como cromógeno y hematoxilina como contratinción. Como medida de la
proliferación, se determinó el índice de marcaje
Ki-67 como la razón de núcleos marcados:totales en
campos de alta intensidad (3400). Se contaron aproximadamente 2.000
núcleos en cada caso mediante muestreo al azar sistemático. Para la
tinción de macrófagos y células NK, se inmunotiñeron secciones
congeladas, fijadas con solución de paraformaldehído al 4%
tamponada utilizando mAb F4/80 biotinilado (Serotec, Raleigh, NC) y
anticuerpo policlonal antiasialo GM1 de conejo (Dako Chemicals,
Richmond, VA), respectivamente. La angiogénesis se cuantificó como
la zona con vasos utilizando un análisis computarizado. Para este
fin, se inmunotiñeron secciones utilizando anti-CD31
y se analizaron utilizando un sistema para el análisis de imágenes
computarizado sin contratinción. Las MVA se determinaron capturando
imágenes digitales de las secciones a un aumento de 3200 utilizando
una cámara en color CCD como se ha descrito previamente (27).
Después se analizaron las imágenes utilizando el soporte lógico
Image Pro Plus versión 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) y
se determinó la MVA midiendo la cantidad total de tinción en cada
sección. Se evaluaron cuatro campos para cada porta. Este valor se
representó como un porcentaje de la zona total en cada campo. Los
resultados se confirmaron en cada experimento por al menos dos
observadores (K. M., H-J. S. H.).
Análisis TUNEL. Se detectaron las células
apoptóticas en tejido tumoral utilizando el método TUNEL como se ha
descrito previamente (27). Se contaron las células positivas para
TUNEL a X400. Se calculó el índice apoptótico como la razón del
número de células apoptóticas:número total de células en cada
campo.
Análisis Estadístico. Los datos se
analizaron en cuanto a la significación mediante el test de la t de
Student, excepto para los análisis de supervivencia in vivo,
que se analizaron mediante el análisis de Wilcoxon.
Para someter a ensayo la eficacia del mAb
anti-\DeltaEGFR, mAb 806, los autores de la
presente invención trataron ratones carentes de sistema inmunitario
que portaban xenoinjertos de glioma que expresaban en exceso
\DeltaEGFR intracraneales con inyecciones i.p. de mAb 806, la IgG
control de isotipo, o PBS. Se implantaron las células U87
MG.\DeltaEGFR intracranealmente en ratones carentes de sistema
inmunitario, y los tratamientos comenzaron el mismo día como se
describe en "Materiales y Métodos".
Los animales tratados con PBS o IgG control de
isotipo tuvieron una supervivencia media de 13 días, mientras los
ratones tratados con mAb 806 tuvieron un incremento del 61,5% en la
supervivencia media hasta los 21 días (P < 0,001; Figura
24A). El tratamiento de los ratones a los 3 días de la implantación,
tras el establecimiento del tumor, también prolongó la
supervivencia media de los animales tratados con mAb 806 en un 46,1%
(de 13 días a 19 días; P < 0,01) en comparación con la de
los grupos de control (datos no mostrados). Para determinar si
estos efectos antitumorales de mAb 806 se extendían más allá de los
xenoinjertos U87 MG.\DeltaEGFR, los autores de la presente
invención también realizaron tratamientos similares en animales que
portaban otros xenoinjertos de células de glioma de
LN-Z308.\DeltaEGFR y A1207.\DeltaEGFR. La
supervivencia media de los ratones tratados con mAb 806 que
portaban xenoinjertos LN-Z308.\DeltaEGFR se
prolongó de 19 días para los controles a 58 días (P <
0,001; Figura 24B). Notablemente, cuatro de los ocho animales
tratados con mAb 806 sobrevivieron más de 60 días (Figura 24B). La
supervivencia media de los animales que portaban xenoinjertos
A1207.\DeltaEGFR también se prolongó de 24 días para los controles
a 29 días (P < 0,01; datos no mostrados).
Se sacrificaron ratones que portaban
xenoinjertos U87 MG.\DeltaEGFR y LN-Z308.
\DeltaEGFR el día 9 y el día 15, respectivamente. Se analizaron
histopatológicamente secciones de los tumores, y se determinaron los
volúmenes de los tumores como se describe en "Materiales y
Métodos". Coincidiendo con los resultados observados para la
supervivencia de los animales, el tratamiento con mAb 806 redujo
significativamente los volúmenes de U87 MG.\DeltaEGFR en un 90%
(P < 0,001; Figura 24C), y de
LN-Z308.\DeltaEGFR en un 95% (P <
0,001; Figura 24D), de los xenoinjertos en comparación con los de
los grupos de control. Se obtuvieron resultados similares para
animales que portaban tumores A1207.\DeltaEGFR (reducción del
volumen del 65%; P < 0,01; datos no mostrados).
Los autores de la presente invención también
determinaron la eficacia de la inyección intratumoral directa de
mAb 806 para el tratamiento de xenoinjertos U87 MG.\DeltaEGFR. Los
animales recibieron inyecciones intratumorales de mAb 806 o IgG
control de isotipo 1 día después de la implantación, como se
describe en "Materiales y Métodos". Los animales de control
sobrevivieron durante 15 días, mientras los ratones tratados con mAb
806 permanecieron vivos durante 18 días (P < 0,01; Figura
24E). Aunque el tratamiento intratumoral con mAb 806 fue algo
eficaz, conllevaba las dificultades de múltiples inyecciones
intracraneales y del riesgo de infección. Por lo tanto, los autores
de la presente invención se centraron en los tratamientos
generalizados para los estudios adicionales.
Para determinar si la inhibición del crecimiento
por mAb 806 era selectiva para los tumores que expresan
\DeltaEGFR, los autores de la presente invención trataron animales
que portaban xenoinjertos de cerebro U87 MG, U87 MG.DK
(\DeltaEGFR carente de quinasa) o U87 MG.wtEGFR. El tratamiento
con mAb 806 no prolongó la supervivencia de los ratones con tumores
U87 MG (Figura 25A), que expresaban un nivel bajo de wtEGFR endógeno
(22), o de animales que portaban xenoinjertos U87 MG.DK, que
expresaban en exceso un \DeltaEGFR carente de quinasa además de
un nivel bajo de wtEGFR endógeno (Figura 25B). El tratamiento con
mAb 806 prolongó ligeramente la supervivencia de ratones que
portaban tumores U87 MG.wtEGFR (P < 0,05; supervivencia
media, 23 días frente a 26 días para los grupos de control), que
expresaban en exceso wtEGFR (Figura 25C).
Para comprender el efecto diferencial de mAb 806
sobre los tumores que expresan diferentes niveles o diferentes
tipos de EGFR, los autores de la presente invención determinaron la
reactividad de mAb 806 con diferentes células tumorales mediante
análisis FACS. Coincidiendo con los informes previos (21), el mAb
528 anti-EGFR reconocía tanto \DeltaEGFR como
wtEGFR y demostraba una tinción más fuerte para células U87
MG.\DeltaEGFR en comparación con las células U87 MG (Figura 26A,
528). En contraste, el anticuerpo EGFR.1 reaccionaba con wtEGFR
pero no con \DeltaEGFR (21), debido a que las células U87
MG.\DeltaEGFR son tan débilmente reactivas como las células U87
MG (Figura 26A, panel EGFR.1). Este anticuerpo EGFR.1 reaccionaba
con U87 MG.wtEGFR más intensamente que con las células U87 MG,
debido a que las células U87 MG.wtEGFR expresaban en exceso wtEGFR
(Figura 26A, panel EGFR.1). Aunque mAb 806 reaccionaba intensamente
con las células U87 MG.\DeltaEGFR y U87 MG.DK y no con las
células U87 MG, reaccionaba débilmente con U87 MG.wtEGFR, lo que
indicaba que mAb 806 es selectivo para \DeltaEGFR con una débil
reactividad cruzada con el wtEGFR expresado en exceso (Figura 26A,
panel mAb 806). Este nivel de reactividad con U87 MG.wtEGFR era
cuantitativamente y cualitativamente similar a la prolongación de
la supervivencia mediada por el tratamiento con el anticuerpo
(Figura 25C). Los autores de la presente invención determinaron
adicionalmente la especificidad de mAb 806 mediante
inmunoprecipitación. Los EGFR de diferentes células se
inmunoprecipitaron con anticuerpo 528, EGFR.1, y mAb 806. Las
transferencias de las proteínas separadas electroforéticamente se
sondearon después con el anticuerpo anti-EGFR, C13,
que reconoce wtEGFR así como \DeltaEGFR y DK (22). Coincidiendo
con el análisis FACS, el anticuerpo 528 reconocía wtEGFR y los
receptores mutantes (Figura 26B-panel IP: 528),
mientras el anticuerpo EGFR.1 reaccionaba con wtEGFR pero no con
las especies mutantes (Figura 26B, panel IP: EGFR.1). Por otra
parte, los niveles de receptores mutantes en las células U87
MG.\DeltaEGFR y U87 MG.DK son comparables con los de wtEGFR en las
células U87 MG.wtEGFR (Figura 26B, panel IP: 528).
Sin embargo, el anticuerpo mAb 806 era capaz de
precipitar solamente una pequeña cantidad del wtEGFR de los
productos lisados de células U87 MG.wtEGFR en comparación con la
gran cantidad de receptor mutante precipitado de las células U87
MG.\DeltaEGFR y U87 MG.DK, y una cantidad no detectable de las
células U87 MG (Figura 26B, panel IP: mAb 806). Colectivamente,
estos datos sugieren que mAb 806 reconoce un epítopo en \DeltaEGFR
que también existe en una pequeña fracción wtEGFR solamente cuando
es expresado en exceso sobre la superficie celular.
A continuación se investigaron los mecanismos
subyacentes a la inhibición del crecimiento por mAb 806. Debido a
que la actividad quinasa y la autofosforilación constitutivamente
activas del extremo COOH de \DeltaEGFR son esenciales para sus
funciones biológicas (21, 22, 28, 29), se determinó el estado de
fosforilación de \DeltaEGFR en los tumores de animales tratados y
de control. Como se muestra en la Figura 27A, el tratamiento con
mAb 806 redujo espectacularmente la autofosforilación de
\DeltaEGFR, aunque los niveles de receptor solo disminuyeron
ligeramente en los xenoinjertos tratadoc con mAb 806. Los autores de
la presente invención mostraron que la autofosforilación del
receptor ocasiona la regulación al alza del gen antiapoptótico,
Bcl-X_{L}, que juega un papel clave en la
reducción de la apoptosis de los tumores que expresan en exceso
\DeltaEGFR (28, 29). Por lo tanto, se determinó a continuación el
efecto del tratamiento con mAb 806 sobre la expresión de
Bcl-X_{L}. Los tumores con \DeltaEGFR de
los animales tratados con mAb 806 mostraron en efecto niveles
reducidos de Bcl-XL (Figura 27A).
A la luz de la supresión in vivo causada
por el tratamiento con mAb 806 y sus efectos bioquímicos sobre la
señalización del receptor, los autores de la presente invención
determinaron la tasa de proliferación de los tumores de los ratones
de control o tratados. El índice proliferativo, medido mediante la
tinción con Ki-67 de los tumores tratados con mAb
806, fue significativamente menor que el de los tumores de control
(P < 0,001; Figura 28). Además, el análisis del índice
apoptótico por medio de la tinción TUNEL demostró un incremento
significativo en el número de células apoptóticas en los tumores
tratados con mAb 806 en comparación con los tumores de control
(P < 0,001; Figura 28). También se analizó el grado de
vascularización del tumor mediante inmunotinción de los tumores de
los especímenes tratados y de control para CD31. Para cuantificar
la vascularización del tumor, se midieron las MVA utilizando el
análisis de imágenes computarizado. Los tumores tratados con mAb
806 mostraron un 30% menos de MVA que los tumores de control
(P <0,001; Figura 28). Para comprender si la interacción
entre receptor y anticuerpo puede provocar una respuesta
inflamatoria, los autores de la presente invención tiñeron
secciones de tumor para el marcador de macrófagos, F4/80, y el
marcador de células NK, asialo GM1. Los macrófagos fueron
identificados en toda la matriz tumoral y se acumulaban
especialmente en la periferia del tumor U87 MG tratado con mAb 806
(Figura 28). Los autores de la presente invención observaron
algunas células NK infiltradas en y alrededor de los tumores y
ninguna diferencia significativa entre los tumores tratados con mAb
806 y los de control de isotipo (datos no mostrados).
\DeltaEGFR parece ser una diana terapéutica
potencial atractiva para el tratamiento canceroso de los gliomas.
Esto esta correlacionado con una mala prognosis (25), mientras su
inhibición genética o farmacológica suprime eficazmente el
crecimiento de las células que expresan \DeltaEGFR en exceso tanto
in vitro como in vivo (29, 30). Debido a que este
EGFR mutante es expresado sobre la superficie de la célula,
representa una diana potencial para la terapia basada en
anticuerpos, y, aquí, los autores de la presente invención
sometieron a ensayo la eficacia de un mAb
anti-\DeltaEGFR novedoso, mAb 806, en el
tratamiento de los xenoinjertos intracraneales de los gliomas que
expresan \DeltaEGFR en exceso de diferentes antecedentes celulares
en ratones carentes de sistema inmunitario. La administración
generalizada de mAb 806 inhibía el crecimiento tumoral y prolongaba
la supervivencia del animal. El efecto del mAb 806 era evidente para
cada una de las líneas celulares y era independiente del estado p53
de los tumores, debido a que U87 MG. \DeltaEGFR y A1207.
\DeltaEGFR expresaban p53 de tipo salvaje, mientras
LN-Z308. \DeltaEGFR era nula para p53.
El aumento de tumorigenicidad de \DeltaEGFR
está mediado por su actividad quinasa y de autofosforilación de
tirosina activa constitutivamente en el extremo COOH (22, 28, 29).
La fosforilación de \DeltaEGFR en tumores tratados con mAb 806
disminuía significativamente, reducía su proliferación, y elevaba la
apoptosis, lo que sugiere que el efecto antitumoral de mAb 806 es,
al menos en parte, atribuible a la inhibición de la función
intrínseca del receptor. La señalización de \DeltaEGFR causada por
la regulación al alza del gen apoptótico, Bcl-X
L (28), y el tratamiento con mAb 806 dieron como resultado la
regulación a la baja de la expresión de Bcl-X
L, que sugiere adicionalmente que el efecto antitumoral de mAb
806 está mediado por la inhibición de la señalización de
\DeltaEGFR. El nivel de \DeltaEGFR en los tumores tratados con
mAb 806 también se redujo ligeramente (Figura 27A), pero no hasta el
punto de que concordara con el grado de desfosforilación del
receptor mutante o suficiente para explicar la magnitud de su efecto
biológico. Es probable que el efecto antitumoral de mAb 806
resulte, al menos en parte, de la inhibición de la función de
señalización intrínseca de \DeltaEGFR. Esta afirmación también
está apoyada por la carencia de efectos antitumorales sobre los
tumores DK, que se unen al anticuerpo pero son carentes de
quinasa.
La inyección intratumoral de un anticuerpo anti-
\DeltaEGFR diferente, mAbY10, inhibió el crecimiento de tumores
de melanoma B16 que expresaban \DeltaEGFR en cerebros de ratón por
medio de un mecanismo dependiente de Fc/receptor de Fc (31). Junto
con esto, se demostró que mAbY10 media la citotoxicidad de
macrófagos dependiente de anticuerpos in vitro con células
efectoras tanto murinas como humanas (17), aunque tenía un efecto
pequeño con la infiltración de macrófagos encontrada en los tumores
tratados con mAb 806 de los autores de la presente invención, queda
la cuestión de si el efecto anti-tumoral de mAb 806
se puede conseguir por la citotoxicidad mediada por macrófagos. Los
autores de la presente invención creen que esto es poco probable,
puesto que la infiltración de macrófagos también se producía en el
tratamiento con mAb 806 de tumores U87 MG.DK (\DeltaEGFR carente
de quinasa), en los que resultaba ineficaz en la regulación del
crecimiento del tumor.
mAb 806 parece ser selectivo para AEGFR con una
débil reactividad cruzada con el wtEGFR expresado en exceso. En
concordancia con la especificidad in vitro, el tratamiento
con mAb 806 fue muy eficaz en tumores que expresaban \DeltaEGFR
en exceso, mientras mostraba una inhibición del crecimiento mucho
menos robusta, pero reproducible para tumores que expresaban wtEGFR
en exceso. No obstante, la simple interacción entre mAb 806 y sus
moléculas diana es insuficiente para inhibir el crecimiento tumoral
porque, aunque mAb 806 es capaz de unirse igualmente bien a
receptores \DeltaEGFR carentes de quinasa (DK) y a \DeltaEGFR,
es ineficaz para afectar al crecimiento de tumores que expresan DK.
La incapacidad de mAb 806 para interaccionar con bajo nivel de
wtEGFR normalmente presente en las células sugiere una gran ventana
terapéutica para los cánceres con \DeltaEGFR expresado en exceso
así como, en un grado menor, los cánceres con wtEGFR expresado en
exceso cuando se comparaban con los tejidos normales.
Aunque el tratamiento con mAb 806 fue eficaz
para la supresión de xenoinjertos intracraneales, se debe observar
que los tumores con \DeltaEGFR crecían eventualmente, y no se
lograban remisiones duraderas. Esto puede ser el resultado de una
distribución ineficaz del anticuerpo en la masa tumoral. Los mAb
combinados con otras modalidades terapéuticas tales como toxinas,
isótopos o fármacos, para los tratamientos contra el cáncer han
demostrado ser más eficaces que el anticuerpo solo en muchos casos
(2, 3, 32-34). Los fármacos quimioterapéuticos
tales como la doxorrubicina y el cisplatino junto con los
anticuerpos para wtEGFR también han demostrado una actividad
antitumoral intensificada (35, 36). Los tratamientos combinados
dirigidos al crecimiento del tumor así como al desarrollo
angiogénico han inhibido más eficazmente el crecimiento del
glioblastoma que cualquier tratamiento solo (27). Esto eleva la
posibilidad de que mAb 806 combinado con fármacos quimioterapéuticos
o compuestos que modulan la angiogénesis puedan ser incluso más
eficaces que mAb 806 solo.
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\newpage
Ejemplo
20
El siguiente ejemplo presenta descubrimientos de
los autores de la presente invención que también son expuestos por
Luwor et al., (2001) Cancer Research,
61;5355-5361.
El anticuerpo monoclonal (mAb) 806 se originó
contra el factor de crecimiento epidérmico delta2-7
(de2-7 EGFR o EGFRvIII), una versión truncada del
EGFR expresado comúnmente en glioma. Inesperadamente, el mAb 806
también se unía al EGFR expresado por las células que mostraban la
amplificación del gen EGFR pero no por las células o el
tejido normal que expresaban el receptor de tipo salvaje en ausencia
de amplificación del gen. La especificidad única de mAb 806 ofrece
una ventaja sobre los anticuerpos para EGFR actuales, que presentan
una unión significativa al hígado y la piel en seres humanos. Por lo
tanto, los autores de la presente invención examinaron la actividad
antitumoral de mAb 806 frente a xenoinjertos de tumores humanos
desarrollados en ratones carentes de sistema inmunitario. El
crecimiento de xenoinjertos U87 MG, una línea celular de glioma que
expresa endógenamente \sim10^{5} EGFR en ausencia de
amplificación del gen, no era inhibido por mAb 806. En contraste,
mAb 806 inhibía significativamente el crecimiento de xenoinjertos
U87 MG transfectados con el de2-7 EGFR de una
manera dependiente de la dosis utilizando modelos de tumor tanto
preventivos como establecidos. Significativamente, las células U87
MG transfectadas con el EGFR de tipo salvaje, que incrementa la
expresión a \sim10^{6} EGFR/célula e imita la situación de la
amplificación del gen, también eran inhibidas por mAb 806 cuando se
desarrollaban como xenoinjertos en ratones carentes de sistema
inmunitario. Los xenoinjertos tratados con mAb 806 presentaban
todos zonas de necrosis que estaban ausentes en los tumores de
control. Esta reducción de la viabilidad del xenoinjerto no estaba
mediada por la regulación a la baja del receptor o la selección
clonal ya que los niveles de expresión antigénica eran similares en
los grupos de control y en los tratados. El efecto antitumoral de
mAb 806 no estaba restringido a las células U87 MG porque el
anticuerpo inhibía el crecimiento de los xenoinjertos A431 nuevos y
establecidos, una línea celular que expresa >10^{6}
EGFR/célula. Este estudio demuestra que mAb 806 posee una actividad
antitumoral significativa.
El mAb 806 específico de de2-7
EGFR fue producido después de la inmunización de ratones con
fibroblastos de ratón NR6 que expresaban el de2-7
EGFR truncado. El mAb 806 se une a la línea celular de glioma U87 MG
transfectada con de2-7 EGFR pero no a la línea
celular U87 MG parental, que expresa el wt EGFR sin amplificación
del gen.^{3} Se observaron resultados similares in vivo
con un mAb 806 que mostraba una localización específica de
xenoinjertos U87 MG que expresaban de2-7 EGFR pero
no de tumores U87 MG parentales.^{3} De manera interesante, mAb
806 era capaz de unirse a un subgrupo de EGFR (\sim10%) sobre la
superficie de la línea celular A431, que contiene un gen
EGFR amplificado. Por lo tanto, a diferencia de todos los
demás anticuerpos específicos de de2-7 EGFR, que
reconocen el péptido de empalme único que es generado por el
truncamiento de2-7 EGFR, mAb 806 se une a un
epítopo también encontrado en el wt EGFR expresado en exceso. No
obstante, parecería que este epítopo es expuesto preferentemente en
el de2-7 EGFR y una pequeña proporción de receptores
expresados en células que contienen la amplificación del gen wt
EGFR. Importantemente, los tejidos normales que expresan
niveles elevados de wt EFGR endógeno, tales como el hígado y la
piel, no muestran una unión significativa a mAb 806. Basándose en
la propiedad única del mAb 806 para unirse al EGFR tanto
de2-7 como wt amplificado pero no al wt EGFR nativo
cuando se expresa a niveles normales, los autores de la presente
invención decidieron examinar la eficacia de mAb 806 contra
numerosas líneas celulares de tumor desarrolladas como xenoinjertos
en ratones carentes de sistema inmunitario.
Líneas Celulares y Anticuerpos
Monoclonales. La línea celular de glioblastoma humano U87 MG,
que expresa endógenamente el wt EGFR, y las líneas celulares
transfectadas U87 MG.\Delta2-7 y U87 MG.wtEGFR,
que expresan de2-7 EGFR y expresan en exceso wt
EGFR, respectivamente, han sido descritas previamente (16, 23). La
línea celular de carcinoma epidermoide A431 ha sido descrita
previamente (24).
Todas las líneas celulares se mantuvieron en
DMEM (DMEM/F12; Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) que
contenía FCS al 10% (CSL, Melbourne, Victoria, Australia), glutamina
2 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y
penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc., Grand Island,
NY). Además, se mantuvieron las líneas celulares U87
MG.D2-7 y U87 MG.wtEGFR en 400 mg/ml de geneticina
(Life Technologies, Inc., Melbourne, Victoria, Australia). Las
líneas celulares se desarrollaron a 37ºC en una atmósfera
humidificada de CO_{2} al 5%. El mAb 806 (IgG2b) fue producido
después de la inmunización de los ratones con fibroblastos de ratón
NR6 que expresaban de2-7 EGFR. El mAb 806 se
seleccionó después de que los análisis Rosette mostraran la unión a
células NR6, que expresaban en exceso el de2-7 EGFR
(título de 1:2500). El mAb 528, que reconoce el EGFR tanto
de2-7 como wt, ha sido descrito previamente (10) y
fue producido en Biological Production Facility (Ludwig Institute
for Cancer Research, Melbourne, Victoria, Australia) utilizando un
hibridoma obtenido de la Colección de Cultivos Tipo Americana
(Rockville, MD). El DH8.3 mAb, que es específico para el
de2-7 EGFR, fue amablemente proporcionado por el
Prof. William Gullick (University of Kent and Canterbury, Kent,
United Kingdom) (19). El anticuerpo policlonal
sc-03 dirigido al dominio
COOH-terminal del EGFR fue adquirido de Santa Cruz
Bio-technology (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA).
Análisis FACS de la Expresión del
Receptor. Las líneas celulares U87 MG parentales y transfectadas
cultivas fueron analizadas en cuanto a la expresión de EGFR wt y
de2-7 utilizando los anticuerpos 528, 806, y DH8.3.
Las células (1 3 10 6) se incubaron con 5 mg/ml del anticuerpo
apropiado o un control negativo del mismo isotipo en PBS que
contenía HSA al 1% durante 30 min a 4ºC. Después de estos tres
lavados con PBS/HSA al 1%, las células se incubaron 30 minutos más
a 4ºC con anticuerpo anti-ratón de cabra acoplado a
FITC (dilución 1:100; Calbiochem, San Diego, CA). Después de tras
lavados consecutivos, las células se analizaron en un Epics Elite
ESP (Beckman Coulter, Hialeah, FL) observando un mínimo de 20.000
eventos y se analizaron utilizando EXPO (versión 2) para
Windows.
Análisis Scatchard. El mAb 806 se marcó
con I^{125} (Amrad, Mel-bourne, Victoria,
Australia) mediante el método de la Cloramina T. Todos los análisis
de unión se realizaron en HSA/PBS al 1% sobre 1-2 X
10^{6} células U87 MG.\Delta2-7 o A431 vivas
durante 90 min a 4ºC con rotación suave. Se utilizó una
concentración ajustada de 10 ng/ml de mAb 806 marcado con I^{125}
en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpo no
marcado. Se determinó la unión no específica en presencia de un
exceso de 10.000 de anticuerpo no marcado. Tras la incubación, las
células se lavaron y se contó el mAb 806 marcado con I^{125} unido
utilizando un contador gamma COBRA II (Packard Instrument Company,
Meriden, CT). El análisis Scatchard se realizó tras la corrección
para la inmunorreactividad.
Estudios de Inmunoprecipitación Studies.
Las células se marcaron durante 16 horas con 100 mCi/ml de Tran 35
S-Label (ICN Biomedicals, Irvina, CA) en DMEM sin
metionina/cisteína con un suplemento de FCS sometido a diálisis al
5%. Después de lavar con PBS, las células se colocaron en tampón de
lisis (Triton X-100 al 1%, HEPES 30 mM, NaCl 150 mM,
fluoruro de
4-(2-aminoetil)benzeno-sulfonilo
500 mM, aprotinina 150 nM, inhibidor de proteasa
E-64 1 mM, EDTA 0,5 mM, y leupeptina 1 mM, pH 7,4)
durante 1 h a 4ºC. Los productos lisados se aclararon mediante
centrifugación durante 10 min a 12, 000 3 g y después se incubaron
con 5 mg de anticuerpo apropiado durante 30 min a 4ºC antes de la
adición de proteína A-Sefarosa. Los productos
inmunoprecipitados se lavaron tres veces con tampón de lisis, se
mezclaron con tampón de muestra SDS, se separaron mediante
electroforesis en gel utilizando un gel al 7,5% que después se secó,
y se expuso a una película de rayos X.
Modelos de Xenoinjerto. En concordancia
con informes previos (23, 25), las células U87 MG transfectadas con
de2-7 EGFR crecieron más rápidamente después las
células parentales y las células U87 MG transfectadas con wt EGFR.
Se inocularon células tumorales (3 X 10^{6}) en 100 ml de PBS s.c.
en ambos flancos de ratones hembra carentes de sistema inmunitario
de 4-6 semanas de edad (Animal Research Center,
Western Australia, Perth, Australia). Se investigó la eficacia
terapéutica de mAb 806 en modelos de tumor tanto preventivos como
establecidos. En el modelo preventivo, se trataron cinco ratones con
dos xenoinjertos cada uno i.p. con 0,1 o 1 mg de mAb 806 o vehículo
(PBS) empezando el día antes de la inoculación de las células
tumorales. El tratamiento continuó durante un total de seis dosis,
tres veces por semana durante 2 semanas. En el modelo establecido,
el tratamiento se inició cuando los tumores habían alcanzado un
volumen medio de 65 mm^{3} (U87 MG.\Delta2-7),
84 mm^{3} (U87 MG), 73 mm^{3} (U87 MG.wtEGFR), o 201 mm^{3}
(tumores A431). El volumen medio del tumor en mm^{3} se determinó
utilizando la fórmula (longitud^{3} anchura^{2})/2, donde la
longitud era el eje más largo y la anchura la medida en los ángulos
rectos con respecto a la longitud (26). Los datos se expresaron
como el volumen medio del tumor \pm DT para cada grupo de
tratamiento. Este proyecto de investigación fue aprobado por el
Animal Ethics Committee del Austin and Repatriación Medical
Centre.
Examen Histológico de Xenoinjertos de
Tumor. Se extirparon los xenoinjertos en los momentos indicados
y se diseccionaron. Una mitad se fijó con formalina/PBS al 10%
antes de ser embebida en parafina. Después se cortaron secciones de
4 mm y se tiñeron con H&E para su examen histológico rutinario.
La otra mitad se embebió en compuesto Tissue Tek OCT (Sakura
Finetek, Torrance, CA), se congeló en nitrógeno líquido, y se
almacenó a 280ºC. Se cortaron secciones finas (5 mm) con un
criostato y se fijaron en acetona enfriada con hielo durante 10 min,
seguido de secado al aire durante 10 min más. Las secciones se
bloquearon en reactivo de bloqueo de proteína (Lipshaw Immunon,
Pittsburgh, PA) durante 10 min y después se incubaron con anticuerpo
primario biotinilado (1 mg/ml) durante 30 min a la temperatura
ambiente. Todos los anticuerpos se biotinilaron utilizando el módulo
de biotinilación de proteína ECL (Amersham, Baulkham Hills, NSW,
Australia), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de
enjuagar con PBS, las secciones se incubaron con un complejo de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante
30 min más (Silenus, Melbourne, Victoria, Australia). Tras un lavado
final con PBS, las secciones se expusieron a sustrato de
3-amino-9-etilcarbazol
[ácido acético 0,1 M, acetato de sodio 0,1 M,
3-amino-9-etilcarbazol
0,02 M (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)] en presencia de peróxido
de hidrógeno durante 30 min. Las secciones se enjuagaron con agua y
se contratiñeron con hematoxilina durante 5 min y se montaron.
Análisis Estadístico. Las medidas de los
tumores in vivo en mm^{3} se expresan como la media \pm
DT. Las diferencias entre los grupos de tratamiento en momentos
puntuales dados se sometieron a ensayo para la significación
estadística utilizando el test de la t de Student.
Unión de Anticuerpos a Líneas Celulares.
Para determinar la especificidad de mAb 806, se analizó su unión a
células U87 MG, U87 MG.D2-7, y U87 MG.wtEGFR
mediante FACS. Se incluyó una IgG2b irrelevante (mAb
100-310 dirigida al antígeno A33) humano como
control de isotipo para mAb 806, y se incluyó el anticuerpo 528
porque reconoce el EGFR tanto de2-7 como. Solamente
el anticuerpo 528 fue capaz de teñir la línea celular U87 MG
parental (Figura 29), en concordancia con informes previos
demostrando que estas células expresan el wt EGFR (16). El mAb 806
tenía niveles de unión similares a los del anticuerpo de control,
demostrando claramente que no es capaz de unirse al wt EGFR (Figura
29). La unión del anticuerpo de control de isotipo a las líneas
celulares U87 MG.D2-7 y U87 MG.wtEGFR fue similar a
la observada para las células U87 MG. El mAb 806 tiñó las células
U87 MG.D2-7 y U87 MG. wtEGFR, indicando que el mAb
806 reconocía específicamente el de2-7 EGFR y un
subgrupo de EGFR expresado en exceso (Figura 29). Como se esperaba,
el anticuerpo 528 tiñó las líneas celulares U87
MG.D2-7 y U87 MG.wtEGFR (Figura 29). La intensidad
de tinción del anticuerpo 528 sobre las células U87 MG.wtEGFR fue
mucho mayor que la de mAb 806, sugiriendo que mAb 806 solamente
reconoce una porción del EGFR expresado en exceso. La reactividad
de mAb 806 observada con las células U87 MG.wtEGFR es similar a la
obtenida con las células A431, otra línea celular que expresa el wt
EGFR en exceso.^{3}
Se realizó un análisis Scatchard utilizando
células U87 MG.D2-7 y A431 para determinar la
afinidad relativa y los sitios de unión para mAb 806 en cada línea
celular. mAb 806 tenía una afinidad por el receptor
de2-7 EGFR de 1,1 X 10^{9} M^{-1} y reconocía
una media (tres experimentos por separado) de 2,4 X 10^{5} sitios
de unión/célula. En contraste, la afinidad de mAb 806 por wt EGFR
sobre las células A431 era solamente de 9,5 X 10^{7} M^{-1}. De
manera interesante, mAb 806 reconocía 2,3 X 10^{5} sitios de unión
sobre la superficie de A431, que es alrededor de 10 veces inferior
que el número referido de EGFR encontrados en estas células. Para
confirmar el número de EGFR sobre la superficie de las células A431
de los autores de la presente invención, los autores de la presente
invención realizaron un análisis Scatchard utilizando anticuerpo 528
marcado con I^{125}. Como se esperaba, este anticuerpo se unía a
aproximadamente 2 X 10^{6} sitios sobre la superficie de las
células A431. De este modo, parece que mAb 806 solamente se une a
una porción de los receptores EGFR sobre la superficie de las
células A431. En gran medida, el mAb 806 marcado con I^{125} no
se unía a las células U87 MG parentales en absoluto, ni siquiera
cuando el número de células se incrementaba a 1 X 10^{7}.
Inmunoprecipitaciones. Los autores de la
presente invención caracterizaron la reactividad de mAb 806 en
diferentes líneas celulares mediante inmunoprecipitación después
del marcaje con S^{35} utilizando mAb 806, sc-03
(un anticuerpo policlonal comercial específico para el dominio
COOH-terminal del EGFR) y un control de isotipo
IgG2b. El anticuerpo sc-03 inmunoprecipitó tres
bandas de células U87 MG.\Delta2-7, un doblete
correspondiente a las dos bandas de de2-7 EGFR
observadas en estas células y una banda de peso molecular superior
correspondiente a wt EGFR (Figura 30). En contraste, aunque mAb 806
inmunoprecipitaba las dos bandas de de2-7 EGFR, el
wt EGFR estaba completamente ausente (Figura 30). El patrón
observado en las células U87 MG.wtEGFR y A431 era esencialmente
idéntico. El anticuerpo sc-03 inmunoprecipitó una
única banda correspondiente al wt EGFR de ambas líneas celulares
(Figura 30). El mAb 806 también inmunoprecipitaba una única banda
correspondiente a wt EGFR de células tanto U87 MG.wtEGFR como A431
(Figura 30). En concordancia con los datos de FACS y Scatchard, la
cantidad de EGFR inmunoprecipitado por mAb 806 era esencialmente
menor que el EGFR total presente sobre la superficie celular. Dado
que el mAb 806 y el sc-03 inmunoprecipitaban
cantidades similares de de2-7 EGFR, este resultado
apoya la idea de que el anticuerpo mAb 806 solamente reconoce una
porción del EGFR en las células que expresan en exceso el receptor.
Las comparaciones entre mAb 806 y el anticuerpo 528 mostraban un
patrón de reactividad idéntico (datos no mostrados). Una IgG2b
irrelevante (un control de isotipo para mAb 806) no
inmunoprecipitaba el EGFR de ninguna de las líneas celulares (Figura
30). Utilizando condiciones idénticas, mAb 806 no inmunoprecipitaba
el EGFR de las células U87 MG parentales (datos no mostrados).
Eficacia de mAb 806 en Modelos
Preventivos. Se examinó mAb 806 en cuanto a su eficacia contra
tumores U87 MG y U87 MG,\Delta2-7 en un modelo de
xenoinjerto preventivo. Se administró anticuerpo o vehículo i.p. el
día antes de la inoculación del tumor y se suministró tres veces por
semana durante 2 semanas (véase "Materiales y Métodos"). A una
dosis de 1 mg/inyección, el mAb 806 no tenía efecto sobre el
crecimiento de xenoinjertos U87 MG parentales que expresan el wt
EGFR (Figura 9A). En contraste, mAb 806 inhibía significativamente
el crecimiento de xenoinjertos U87 MG.\Delta2-7
de una manera dependiente de la dosis (Figura 9B). Veinte días
después de la inoculación del tumor, cuando los animales de control
fueron sacrificados, el volumen medio del tumor fue de 1600 \pm
180 mm^{3} para el grupo de control, significativamente más
pequeño, 500 \pm 95 mm^{3} para el grupo con 0,1 mg/inyección
(P < 0,0001) y 200 \pm 42 mm^{3} para el grupo con 1
mg/inyección (P < 0,0001). Los grupos con tratamiento
fueron sacrificados el día 24, en cuyo momento el volumen medio de
los tumores fue de 1300 \pm 240 mm^{3} para el grupo tratado con
0,1 mg y 500 \pm 100 mm^{3} para el grupo con 1 mg (P
<0,005).
Eficacia de mAb 806 en Modelos de Xenoinjerto
Establecido. Dada la eficacia de mAb 806 en el modelo de
xenoinjerto preventivo, se examinó su capacidad para inhibir el
crecimiento de los xenoinjertos de tumor establecidos. El
tratamiento con anticuerpo fue el descrito en el modelo preventivo,
excepto que comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen
medio del tumor de 65 mm^{3} (10 días después de la implantación)
para los xenoinjertos U87 MG.\Delta-7 y de 84
mm^{3} (19 días después de la implantación) para los xenoinjertos
U87 MG parentales. Una vez más, el mAb 806 no tuvo efecto sobre el
crecimiento de los xenoinjertos U87 MG parentales, incluso a una
dosis de 1 mg/inyección (Figura 10A). En contraste, mAb 806 inhibió
significativamente el crecimiento de los xenoinjertos U87
MG.\Delta2-7 de una manera dependiente de la dosis
(Figura 10B). El día 17, 1 día antes de que los animales de control
fueran sacrificados, el volumen medio del tumor fue de 900 \pm 200
mm^{3} para el grupo de control, de 400 \pm 60 mm^{3} para el
grupo con 0,1 mg/inyección (P < 0,01), y de 220 \pm 60
mm^{3} para el grupo con 1 mg/inyección (P < 0,002). El
tratamiento de los xenoinjertos U87 MG.\Delta2-7
con control de isotipo IgG2b no tuvo efecto sobre el crecimiento
tumoral (datos no mostrados).
Para examinar si la inhibición del crecimiento
observada con mAb 806 estaba restringida a las células que
expresaban de2-7 EGFR, también se examinó su
eficacia contra los xenoinjertos U87 MG.wtEGFR en un modelo
establecido. Estas células sirven como modelo para tumores que
contienen la amplificación del gen EGFR sin la expresión de
de2-7 EGFR. El tratamiento con mAb 806 comenzó
cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio del tumor de
73 mm 3 (22 días después de la implantación). mAb 806 inhibió
significativamente el crecimiento de xenoinjertos U87 MG.wtEGFR
establecidos cuando se comparó con los tumores de control tratados
con vehículo (Figura 10C). El día que los animales de control
fueron sacrificados, el volumen medio del tumor era de 1000 \pm
300 mm^{3} para el grupo de control y de 500 \pm 80 mm^{3}
para el grupo tratado con 1 mg/inyección (P < 0,04).
Análisis Histológico e Inmunohistoquímico de
Tumores Establecidos. Para evaluar las diferencias histológicas
potenciales entre los xenoinjertos U87
MG.\Delta2-7 y U87 MG.wtEGFR tratados con mAb 806
y de control, se tiñeron secciones fijadas con formalina, embebidas
en parafina con H&E (Figura 31). Se observaron zonas de
necrosis en las secciones de los xenoinjertos U87
MG.\Delta2-7 tratados con mAb 806 (los
xenoinjertos tratados con mAb 806 se recogieron 24 días después de
la inoculación del tumor y los xenoinjertos tratados con vehículo a
los 18 días), y de U87 MG.wtEGFR (los xenoinjertos con mAb 806 se
recogieron 42 días después de la inoculación del tumor y los
xenoinjertos tratados con vehículo a los 37 días; Figura 31). Este
resultado se observaba sistemáticamente en numerosos xenoinjertos
de tumor (n 5 4 para cada línea celular). Sin embargo, las
secciones de xenoinjertos U87 MG.\Delta2-7 y U87
MG.wtEGFR tratados con vehículo (n 5 5) no presentaron la
mismas zonas de necrosis después del tratamiento con mAb 806 (Figura
31). Los xenoinjertos tratados con vehículo y mAb 806 separados en
momentos idénticos también mostraron estas diferencias en la
necrosis tumoral (datos no mostrados). De este modo, el incremento
en la necrosis observado no estaba causado por los períodos de
crecimiento más largos utilizados para los xenoinjertos tratados con
mAb 806. Además, las secciones de los xenoinjertos U87 MG tratados
con Mab 806 también se tiñeron con H&E y no revelaron ninguna
zona de necrosis (datos no mostrados), apoyando adicionalmente la
hipótesis de que la unión a mAb 806 induce una disminución de la
viabilidad celular, dando como resultado un aumento de la necrosis
en los xenoinjertos de tumor.
Se realizó un análisis inmunohistoquímico de
secciones de xenoinjerto U87 MG, U87 MG.\Delta2-7,
y U87
MG.wtEGFR para determinar los niveles de expresión de de2-7 y wt EGFR después del tratamiento con mAb 806 (Figura 32). Como se esperaba, el anticuerpo 528 tiñó todas las secciones de xenoinjerto con una disminución obvia de la intensidad entre los tumores tratados y de control (Figura 32). La tinción de las secciones de U87 MG no fue detectable con el mAb 806; no obstante, se observó una tinción positiva de las secciones de xenoinjerto U87 MG.\Delta2-7 y U87 MG.wtEGFR (Figura 32). No hubo diferencia en la intensidad de tinción con mAb 806 entre los xenoinjertos U87 MG.\Delta2-7 y U87 MG.wtEGFR de control y tratados, sugiriendo que el tratamiento con anticuerpo no conduce a la selección de variantes clónicas que carecen de reactividad con mAb 806.
MG.wtEGFR para determinar los niveles de expresión de de2-7 y wt EGFR después del tratamiento con mAb 806 (Figura 32). Como se esperaba, el anticuerpo 528 tiñó todas las secciones de xenoinjerto con una disminución obvia de la intensidad entre los tumores tratados y de control (Figura 32). La tinción de las secciones de U87 MG no fue detectable con el mAb 806; no obstante, se observó una tinción positiva de las secciones de xenoinjerto U87 MG.\Delta2-7 y U87 MG.wtEGFR (Figura 32). No hubo diferencia en la intensidad de tinción con mAb 806 entre los xenoinjertos U87 MG.\Delta2-7 y U87 MG.wtEGFR de control y tratados, sugiriendo que el tratamiento con anticuerpo no conduce a la selección de variantes clónicas que carecen de reactividad con mAb 806.
Tratamiento de Xenoinjertos A431 con mAb
806. Para demostrar que los efectos antitumorales de mAb 806 no
estaban restringidos a las células U87 MG, se administró el
anticuerpo a ratones que contenían xenoinjertos A431. Estas células
contienen un gen EGFR amplificado y expresan aproximadamente
2 X 10^{6} receptores/célula. Los autores de la presente
invención han demostrado previamente que mAb 806 se une a -10% de
estos EGFR y localiza los xenoinjertos A431.(3) El mAb 806 inhibía
significativamente el crecimiento de los xenoinjertos A431 cuando
se examinaba en el modelo de xenoinjerto preventivo descrito
previamente (Figura 11A). El día 13, cuando los animales de control
fueron sacrificados, el volumen medio del tumor era de 1400 \pm
150 mm^{3} en el grupo tratado con vehículo y de 260 \pm 60
mm^{3} para el grupo con tratamiento de 1 mg/inyección (P
< 0,0001). En un experimento separado, una dosis de 0,1 mg de mAb
también inhibía significativamente (P < 0,05) el
crecimiento de los xenoinjertos A431 en un modelo preventivo (datos
no mostrados).
Dada la eficacia de mAb 806 en el modelo de
xenoinjerto A431 preventivo, se examinó su capacidad para inhibir
el crecimiento de xenoinjertos de tumor establecidos. El tratamiento
con anticuerpo fue el descrito en el modelo preventivo, excepto que
no comenzó hasta que los tumores hubieron alcanzado un volumen medio
del tumor de 200 \pm 20 mm^{3}. El mAb 806 inhibió
significativamente el crecimiento de los xenoinjertos A431
establecidos (Figura 11B). El día 13, el día que los animales de
control fueron sacrificados, el volumen medio del tumor fue de 1100
\pm 100 mm^{3} para el grupo de control y de 450 \pm 70
mm^{3} para el grupo con 1 mg/inyección (P <
0,0001).
Los autores de la presente invención han
demostrado previamente^{3} que mAb 806 localiza tanto los
xenoinjertos U87 MG transfectados con de2-7 EGFR
como los xenoinjertos A431 que expresan en exceso el wt EGFR. El mAb
806 no localizó las células U87 MG parentales, que expresan
\sim10^{5} EGFR^{3} (16). Como se evaluó mediante FACS,
inmunohistoquímica, e inmunoprecipitación, los autores de la
presente invención demuestran ahora que mAb 806 también es capaz
de unirse específicamente a células U87 MG.wtEGFR, que expresan
>10^{6} EGFR/célula. De este modo, la unión anterior observada
de mAb 806 a las células A431 no es el resultado de alguna propiedad
inusual de estas células si no más bien parece ser un fenómeno más
general relacionado con la expresión en exceso de wt EGFR.
(a) Los autores de la presente invención fueron
incapaces de detectar la unión de mAb 806 a la línea celular U87 MG
parental, que expresa 1 X 10^{5} wt EGFR/célula (16), ya sea
mediante FACS, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, o con
anticuerpo yodado. En efecto, el mAb 806 yodado no se unía a
sedimentos de células U87 MG que contenían 1 X 10^{7} células,
que basándose en los datos de Scatchard utilizando 1 X 10^{6}
células A431, son condiciones que deben detectar un bajo nivel de
unión del anticuerpo (esto es, siendo el número total de receptores
similar en ambos casos).
(b) El análisis Scatchard demostró claramente
que mAb 806 solamente se unía al 10% del EGFR total sobre la
superficie de las células A431. Si mAb 806 se une simplemente al wt
EGFR con una baja afinidad, se debe haber unido a un porcentaje
considerablemente mayor del receptor.
(c) La inmunoprecipitación comparativa de las
líneas celulares A431 y U87 MG. wtEGFR con mAb 806 y el anticuerpo
sc-03 también apoyó la hipótesis de que solamente un
subgrupo de receptores son reconocidos por mAb 806. Tomados juntos,
estos resultados apoyan la idea de que mAb 806 reconoce un subgrupo
de EGFR sobre la superficie de las células que expresan EGFR en
exceso. Los autores de la presente invención están analizando
actualmente el EGFR inmunoprecipitado por mAb 806 para ver si
presenta propiedades bioquímicas alteradas relacionadas con la
glicosilación o la actividad quinasa.
Los estudios de xenoinjertos con mAb 806
descritos aquí demuestran una inhibición dependiente de la dosis
del crecimiento del xenoinjerto U87 MG.D2-7. En
contraste, no se observó inhibición de los xenoinjertos U87 MG
parentales, a pesar del hecho de que continúan expresando el wt EGFR
in vivo. El mAb 806 no sólo redujo significativamente el
volumen del xenoinjerto, también indujo una necrosis significativa
en el tumor. Como se ha observado antes, se han generado otros mAb
específicos de de2-7 EGFR (20 -22), pero este es el
primer informe que demuestra el uso terapéutico satisfactorio de
semejante anticuerpo in vivo contra un xenoinjerto de glioma
que expresa de2-7 EGFR humano. Un informe reciente
demostró que el mAb Y10 específico de de2-7 EGFR
tenía una actividad antitumoral in vivo contra las células de
melanoma B16 murino transfectadas con un homólogo murino del
de2-7 EGFR humano (33). Y10 mediaba la lisis celular
in vitro (>90%) de células de melanoma B16 que expresaban
de2-7 EGFR en ausencia de células del complemento o
efectoras. En contraste con sus observaciones in vitro, la
eficacia del anticuerpo Y10 in vivo estaba mediada
completamente por la función de Fc cuando se utilizaban células de
melanoma B16 desarrolladas como xenoinjertos en un modelo
inmuno-competente. De este modo, los efectos
directos observados in vitro no parecen repetirse cuando las
células se desarrollan como xenoinjertos tumorales.
La expresión en exceso del EGFR ha sido referida
en numerosos tumores diferentes y se observa en la mayor parte de
los gliomas (4, 14). Se ha propuesto que la posterior expresión en
exceso de EGFR mediada por la amplificación del gen del receptor
puede conferir una ventaja de crecimiento aumentando la señalización
intracelular y el crecimiento celular (34). Se transfectó la línea
celular U87 MG con wt EGFR para producir una célula de glioma que
imita el proceso de amplificación del gen EGFR. El
tratamiento de los xenoinjertos U87 MG.wtEGFR establecidos con mAb
806 dio como resultado una inhibición del crecimiento significativa.
De este modo, mAb 806 también media la actividad antitumoral in
vivo contra células que expresan el EGFR en exceso. De manera
interesante, la inhibición por mAb 806 de los xenoinjertos U87
MG.wtEGFR fue menos pronunciada que la observada con los tumores
U87 MG.\Delta2-7. Esto refleja probablemente el
hecho de que mAb 806 tiene una afinidad inferior por el wt EGFR
expresado en exceso y solamente se une a una pequeña proporción de
receptores expresados sobre la superficie de la célula.(3) No
obstante, se debe observar que a pesar del pequeño efecto sobre los
volúmenes de los xenoinjertos U87 MG.wtEGFR, el tratamiento con mAb
806 produjo grandes zonas de necrosis en estos xenoinjertos. Para
excluir la posibilidad de que mAb 806 solamente medie la inhibición
de las líneas celulares derivadas de U87 MG, los autores de la
presente invención sometieron a ensayo su eficacia frente a
xenoinjertos A431. Esta línea celular derivada de carcinoma de
células escuamosas contiene una amplificación del gen EGFR
significativa, que se conserva tanto in vitro como in
vivo. El tratamiento de los xenoinjertos A431 con mAb 806
produjo una inhibición del crecimiento significativa en el modelo
tanto preventivo como establecido, indicando que los efectos
antitumorales de mAb 806 no están restringidos a las líneas
celulares U87 MG transfectadas.
La prevención completa del crecimiento del
xenoinjerto A431 por el tratamiento con anticuerpo ha sido referida
previamente. Los mAb para wt EGFR 528, 225, y 425 evitaban todos la
formación de xenoinjertos A431 cuando se administraban el día o 1
día después de la inoculación del tumor (9, 10). La razón de esta
diferencia en la eficacia entre estos anticuerpos para wt EGFR y
mAb 806 no se conoce, pero puede estar relacionada con el mecanismo
de inhibición del crecimiento celular. Los anticuerpos para wt EGFR
funcionan bloqueando la unión del ligando al EGFR, pero este
probablemente no es el caso con mAb 806 puesto que solamente se une
a un pequeño subgrupo de EGFR sobre la superficie de las células
A431. La eficacia significativa de mAb 806 contra las células U87
MG que expresan el de2-7 EGFR independiente del
ligando apoya la idea de que este anticuerpo media su actividad
antitumoral por un mecanismo que no implica el bloqueo del ligando.
Por lo tanto, los autores de la presente invención están
investigando en la actualidad los mecanismos no inmunológicos e
inmunológicos que contribuyen a los efectos antitumorales de mAb
806- Los mecanismos no inmunológicos pueden incluir cambios
sutiles, bloqueo de la señalización, o inducción de una señalización
inapropiada.
Previamente, agentes tales como doxorrubicina y
cisplatino junto con anticuerpos para wt EGFR han producido un
aumento de la actividad antitumoral (35, 36). La combinación de
doxorrubicina y mAb 528 produjo una erradicación total de los
xenoinjertos A431 establecidos, mientras el tratamiento con
cualquier agente solo causaba únicamente una inhibición temporal
del crecimiento tumoral in vivo (36). Del mismo modo, la
combinación de cisplatino y cualquier mAb 528 o 225 también condujo
a la erradicación de xenoinjertos A431 bien establecidos, que no se
observó cuando se utilizó el tratamiento con cualquier agente (35).
De este modo, se planean futuros estudios que implican la
combinación de agentes quimioterapéuticos con mAb 806 utilizando
modelos de xenoinjerto.
Puede que la ventaja más importante de mAb 806
en comparación con los anticuerpos para EGFR actuales sea que es
posible conjugar directamente agentes citotóxicos a mAb 806. Este
enfoque no es factible con los anticuerpos específicos para EGFR
actuales debido a que se dirigen al hígado y la conjugación
citotóxica induciría casi con certeza una toxicidad grave. La
conjugación de agentes citotóxicos tales como fármacos (37) o
radioisótopos (38) a anticuerpos tiene el potencial de mejorar la
eficacia y reducir la toxicidad generalizada de estos agentes. Este
estudio demuestra claramente que mAb 806 tiene una actividad
antitumoral in vivo significativa contra los xenoinjertos
positivos para de2-7 EGFR y los tumores que expresan
EGFR en exceso. La especificidad única de mAb 806 sugiere un
potencial inmunoterapéutico en la localización de numerosos tipos de
tumores, concretamente tumores de cabeza y cuello y glioma, sin las
restricciones asociadas con la absorción por los tejidos
normales.
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35. Fan, Z, Baselga, J.,
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\newpage
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cancer? Curr. Opin. Immunol., 11: 563-569,
1999.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Los anticuerpos quiméricos son una clase de
moléculas en las que regiones variables de cadenas pesadas y ligeras
por ejemplo de ratón, rata u otra especie se unen sobre regiones de
cadenas pesadas y ligeras humanas. Los anticuerpos quiméricos son
producidos recombinantemente. Una ventaja de los anticuerpos
quiméricos es que reducen los efectos xenoantigénicos, la
inmunogenicidad inherente de los anticuerpos no humanos (por
ejemplo, ratón, rata u otra especie). Además, los anticuerpos
quiméricos preparados recombinantemente pueden ser producidos a
menudo en grandes cantidades, concretamente cuando se utilizan
vectores con un elevado nivel de expresión.
Para una producción de alto nivel, el sistema de
expresión en mamíferos más ampliamente utilizado es uno que utiliza
el procedimiento de amplificación génica ofrecido por las células de
ovario de hámster Chino carentes de deshidrofolato reductasa
("dhfr-"). El sistema es bien conocido por los expertos en la
técnica. El sistema se basa en el gen de la deshidrofolato
reductasa "dhfr", que codifica la enzima DHFR, que cataliza la
conversión de deshidrofolato en tetrahidrofolato. Con el fin de
lograr una producción elevada, se transfectan células CHO dhfr- con
un vector de expresión que contiene un gen DHFR funcional, junto con
un gen que codifica una proteína deseada. En este caso, la proteína
deseada es una cadena pesada y/o una cadena ligera de anticuerpo
recombinante.
Aumentando la cantidad de inhibidor competitivo
de DHFR metotrexato (MTX), las células recombinantes desarrollan
resistencia amplificando el gen dhfr. En casos convencionales, la
unidad de amplificación empleada es mucho mayor que el tamaño del
gen dhfr, y como resultado la cadena pesada del anticuerpo es
amplificada simultáneamente.
Cuando se desea la producción a gran escala de
la proteína, tal como la cadena de anticuerpo, tanto el nivel de
expresión como la estabilidad de las células que se están empleando,
resultan críticos. En cultivos a largo plazo, las poblaciones de
células CHO recombinantes pierden homogeneidad con respecto a su
productividad de anticuerpos específicos durante la amplificación,
incluso aunque deriven de un único clon parental.
Se prepararon vectores de expresión
bicistrónicos para su uso en la expresión recombinante de los
anticuerpos quiméricos. Estos vectores de expresión bicistrónicos,
emplean un "sitio de de entrada al ribosoma interno" o
"IRES". En estos constructos para la producción de antiEGFR
quimérico, las cadenas de inmunoglobulina y los ADNc marcadores
seleccionable están unidos por un IRES. Los IRES son elementos que
actúan en cis que reclutan las subunidades ribosómicas pequeñas
para un codón iniciador interno en el ARNm con la ayuda de factores
celulares que actúan en trans. Los IRES facilitan la expresión de
dos o más proteínas de una unidad de transcripción policistrónica
en las células eucarióticas. El uso de vectores de expresión
bicistrónicos en los que el gen marcador seleccionable es traducido
de una manera dependiente de la protección terminal, y el gen de
interés de una manera dependiente de IRES, ha sido aplicado a una
variedad de métodos experimentales. Los elementos IRES han sido
incorporados satisfactoriamente a vectores para la transformación
celular, la producción de animales transgénicos, la producción de
proteína recombinante, la terapia génica, la captura de genes, y la
localización de genes.
El anticuerpo quimérico 806 fue generado
clonando la VH y la VL del anticuerpo 806 del hibridoma murino
parental utilizando técnicas de biología molecular convencionales.
Después se clonaron la VH y la VL en vectores de expresión de
mamífero pREN, cuya construcción se expone en los SEQ ID NO: 7 y SEQ
ID NO: 8, y se transfectaron en células CHO (DHFR -/-ve) para la
amplificación y la expresión. En resumen, después del tratamiento
con tripsina se co-transfectaron 4 x 10^{6}
células CHO con 10 \mug de cada uno de los vectores de expresión
LC y HC utilizando la electroporación en condiciones convencionales.
Después de un período de descanso de 10 min a la temperatura
ambiente, se añadieron las células a 15 ml de medio (suero de
ternera fetal al 10%, con un suplemento de hipoxantina/timidina con
aditivos) y se transfirieron a placas petri para el cultivo de
tejidos de 15 x 10 cm. Después las placas se colocaron en la
incubadora en condiciones normales durante 2 días. En este punto,
la adición de gentamicina, metotrexato 5 nM, la reposición de suero
de ternera fetal por suero de ternera fetal sometido a diálisis y
la separación de la hipoxantina/timidina, iniciaron la selección de
clones que se habían transfectado satisfactoriamente tanto con LC
como HC del medio. El día 17 después de la transfección, se
seleccionaron los clones individuales que crecían bajo la selección
y se escrutaron en busca de la expresión del anticuerpo 806
quimérico. Se utilizó un ELISA para el escrutinio y consistió en el
recubrimiento de la placa de ELISA con receptor de EGF soluble
desnaturalizado (se sabe que el EGFR desnaturalizado permite la
unión a 806). Este análisis permite el escrutinio de los niveles de
producción por los clones individuales y también la funcionalidad
del anticuerpo que está siendo escrutado. Se demostró que todos los
clones estaban produciendo ch806 funcional y se tomó el mejor
productor y se expandió para la amplificación. Para amplificar el
nivel de ch806 que estaba siendo producido, se sometió el clon con
la producción más alta a una re-selección bajo una
concentración de metotrexato superior (100 nM vs 5 nM). Esto se
acometió utilizando los procedimientos mencionados antes.
Después se analizaron los clones que crecían con
MTX 100 nM en Biological Production Facility, Ludwig Institute,
Melbourne, Australia para medir los niveles de producción, se fue
quitando el suero, formándose bancos de células. Se ha demostrado
que la línea celular produce establemente \sim10 mg/litro en
botellas giratorias.
La secuencia de ácido nucleico del vector pREN
ch806 LC neo se proporciona en el SEQ ID NO: 7. La secuencia de
ácido nucleico del vector pREN ch806 HC DHFR se proporciona en el
SEQ ID NO: 8.
La Figura 33 representa los vectores
pREN-HC y pREN-LC, que emplean IRES.
El sistema vector bicistrónico pREN se describe y se revela en el
documento co-pendiente U.S.S.N. 60/355.838
presentado el 13 de Febrero de 2002.
Se evaluó Ch806 mediante análisis FACS para
demostrar que el 806 quimérico presenta una especificidad de unión
idéntica a la del anticuerpo parental murino. El análisis se realizó
utilizando células de tipo salvaje (células parentales U87
MG),células que expresaban el receptor EGP en exceso (células A431 y
células UA87 wt EGFR) y células UA87 \Delta2-7
(datos no mostrados). Se obtuvo una especificidad de unión similar
de Mab806 y ch806 utilizando células que expresaban EGFR en exceso
y células que expresaban de2-7 EGFR. No se observó
unión en células de tipo salvaje. El análisis Scatchard reveló una
afinidad de unión para ch806 marcado radiactivamente de 6,4 x
10^{9} M^{-1} utilizando células U87MGde2-7
(datos no mostrados).
El análisis de la biodistribución del anticuerpo
ch806 se realizó en ratones BALB/c carentes de sistema inmunitario
que portaban tumores por xenoinjerto
U87MG-de2-7 y los resultados se
muestran en la Figura 34. Se inyectaron a los ratones 5 \mug de
anticuerpo radiomarcado y se sacrificaron en grupos de cuatro por
momento puntual a las 8, 24, 48 y 74 horas. Se recogieron los
órganos, se pesaron y se midió la radiactividad en un contador
gamma. El ch806 marcado con I^{125} presenta localización reducida
del tumor en comparación con ch806 marcado con In^{111}, que
tiene una absorción por el tumor elevada y una retención cumulativa
por el tumor a lo largo de un período de tiempo de 74 horas. A las
74 horas, el anticuerpo marcado con In^{111} presenta
aproximadamente 30% de DI/gramo de tejido y una razón de tumor con
respecto a sangre de 4,0 (Figura 35). El ch806 marcado con
In^{111} muestra cierta retención no específica en el hígado, bazo
y riñones. Esto es común para el uso de este isótopo y disminuye
con el tiempo, lo que apoya que esta unión no es específica para
ch806 y se debe a la unión a In^{111}.
Se evaluó el anticuerpo quimérico ch806 en
cuanto a su eficacia terapéutica en un modelo tumoral establecido.
Se inocularon 3x10^{6} U87MG.\Delta2-7 células
en 100 \mul de PBS s.c. en ambos flancos de ratones hembra
carentes de sistema inmunitario de 4-6 semanas de
edad (Aminal Research Center, Western Australia, Australia). El mAb
806 se incluyó como control positivo. Los resultados se representan
en la Figura 36. El tratamiento se inició cuando los tumores habían
alcanzado un volumen medio de 50 mm^{3} y consistió en 1 mg de
ch806 o mAb806 administrado i.p. durante un total de 5 inyecciones
los días indicados. Se determinó el volumen en mm^{3} utilizando
la fórmula (longitud a anchura^{2})/2, donde la longitud era el
eje más largo y la anchura la medida en los ángulos rectos con
respecto a la longitud. Los datos se expresaron como el volumen
medio del tumor +/- D.T. para cada grupo de control. El ch806 y el
mAb 806 presentaron una actividad anti-tumoral casi
idéntica contra xenoinjertos U87MG.\Delta2-7.
\vskip1.000000\baselineskip
El mAb monoclonal
anti-de2-7 EGFR murino mAb 806, el
anticuerpo quimérico ch806 (IgG_{1}) y el anticuerpo monoclonal
anti-G250 quimérico del mismo isotipo de control
cG250 fueron preparados por Biological Production Facility, Ludwig
Institute for Cancer Research, Melbourne, Australia. Los análisis
tanto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) como de
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) utilizaron
células U87MG.de2-7 y A431 como células diana. La
línea celular U87MG.de2-7 descrita previamente es
una línea celular de astrocitoma infectada con un retrovirus que
contiene de2-7EGFR (Nishikawa, R. et al.
(1994) Proc Natl Acad Sci U S A. 91: 7727-31). Las
células de carcinoma escuamoso humano A431 fueron adquiridas de la
Colección de Cultivos tipo Americana (Manassas, VA). Todas las
líneas celulares se cultivaron en DMEM/F-12 con
Glutamax® (Life Technologies, Melbourne, Australia) con un
suplemento de FCS inactivado con calor al 10% (CSL, Melbourne,
Australia), 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina. Para mantener la selección para las células
U87MG.de2-7 transfectadas retroviralmente se
incluyeron 400 \mug/ml de G418 en el medio.
Se aislaron PBMC de sangre de donantes
voluntarios sanos. La sangre completa heparinizada se fraccionó
mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre
Ficoll-Hypaque (ICN Biomedical Inc., Ohio, USA). Se
recogieron fracciones de PBMC y se lavaron tres veces con RPMR 1640
con un suplemento de 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina, L-glutamina 2 mM, que contenía FCS
inactivado con calor al 5%.
Se realizaron análisis de CDC y ADCC mediante
una modificación de un método publicado previamente ((Nelson, D. L.
et al. (1991) In: J. E. Colignan, A. M. Kruisbeek, D. D.
Margulies, E. M. Shevach, y W. Strober (eds.), Current Protocols in
Immunology, pp. 7.27.1. New York: Greene Publishing Wiley
Interscience). Brevemente, se marcaron 5 \times 10^{6} células
U87MG.de2-7 y A431 diana con 50 \muCi de Cr^{51}
(Geneworks, Adelaide, Australia) por 1 \times 10^{6} células y
se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Las células se lavaron después
con PBS (0,05 M, pH 7,4) y un cuarto lavado con medio de cultivo. Se
añadieron alícuotas (1 \times 10^{4} células/50 \mul) de las
células marcadas a cada pocillo de las placas de microtitulación de
96 pocillos (NUNC, Roskilde, Denmark).
A 50 \mul de células diana marcadas, se
añadieron 50 \mul de ch806 o anticuerpo de control del isotipo
cG250 por triplicado a lo largo de un intervalo de concentración de
0,00315 -10 \mug/ml, y se incubaron sobre hielo 5 min. Después se
añadieron 50 \mul de complemento de donante sano recién preparado
(suero) para producir una dilución final de 1:3 del suero. Las
placas de microtitulación se incubaron durante 4 hr a 37ºC. Después
de la centrifugación, se contó el Cr^{51} liberado al sobrenadante
(Contador Gamma automatizado Cobra II, Canberra Packard, Melbourne,
Australia). Se calculó el porcentaje de lisis específica a partir de
la liberación de Cr^{51} experimental, la liberación total (50
\mul de células diana + 100 \mul de Tween 20 al 10%) y
espontánea (50 \mul de células diana + 100 \mul de medio).
Se midió la ADVV mediada por Ch806 efectuada por
PBMC de donante sano mediante dos análisis de liberación de
Cr^{51} de 4 horas. En el primer análisis, se cultivaron en placa
las células diana marcadas con las células efectoras en microplacas
de fondo en "U" de 96 pocillos (NUNC, Roskilde, Denmark) a
razones de células efectoras/diana (E:D) de 50:1. Para las medidas
de la actividad ADCC, se añadieron 0,00315-10
\mug/ml (concentración final) de anticuerpos de ensayo y de
control por triplicado a cada pocillo. En el segundo análisis de
ADCC, se comparó la actividad ADCC de ch806 con la del mAb murino
parental 806 a lo largo de un intervalo de razones de células
Efectoras: Diana con la concentración de anticuerpo de ensayo
constante a 1 \mug/ml. En ambos análisis, se incubaron placas de
microtitulación a 37ºC durante 4 horas, después se recogieron 50
\mul de sobrenadante de cada pocillo y se determinó el Cr^{51}
liberado mediante recuento gamma (Contador Gamma automatizado Cobra
II, Canberra Packard, Melbourne, Australia). Los controles incluidos
en los análisis corrigieron la liberación espontánea (medio solo) y
la liberación total (Tween 20/PBS al 10%). Los controles apropiados
con los anticuerpos de la misma subclase se realizaron en
paralelo.
El porcentaje de lisis celular (citotoxicidad)
se calculó de acuerdo con la fórmula:
El porcentaje (%) de citotoxicidad se trazó
frente a la concentración de anticuerpo (\mug/ml).
Los resultados de los análisis de CDC se
presentan en la Figura 37. La actividad CDC mínima se observó en
presencia de hasta 10 \mug/ml de ch806 con una CDC comparable a la
observada con el control de isotipo cG250.
La ADCC mediada por Ch806 sobre las células
U87MG.de2-7 y A431 diana a una razón E:D de 50:1 se
presenta en la Figura 38. La citotoxicidad específica de ch806 se
presentó frente a células U87MG.de2-7 diana, pero la
ADCC mínima estaba mediada por ch806 sobre las células A431. Los
niveles de citotoxicidad logrados reflejan el número de sitios de
unión de ch806 en las dos poblaciones de células. Las células
U87MG.de2-7 diana expresan - 1 \times 10^{6}
de2-7EGFR que son reconocidos específicamente por
ch806, mientras solamente un subgrupo de 1 \times 10^{6}
moléculas de EGFR de tipo salvaje expresadas sobre las células A431
son reconocidas por ch806 (véanse los Ejemplos anteriores).
Se realizaron análisis de ADCC adicionales para
comparar la ADCC mediada por 1 \mug/ml de ch806 sobre las células
U87MG.de2-7 diana con la efectuada por 1 \mug/ml
de mAb 806 murino parental. Los resultados se presentan en la
Figura 39. La quimerización de mAb 806 ha llevado a cabo una mejora
notable de la ADCC obtenida por el mAb murino parental con una
citotoxicidad de más del 30% efectuada a razones E:D de 25:1 y
50:1.
La carencia de función efectora del mAb murino
parental 806 ha sido notablemente mejorada tras la quimerización.
Ch806 media una buena ADCC, pero una actividad CDC mínima.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Para ayudar a la evaluación clínica de mAb806 o
ch806, se requieren ensayos de laboratorio para verificar las
farmacocinéticas en suero de los anticuerpos y cuantificar cualquier
respuesta inmunitaria contra el anticuerpo quimérico de
ratón-humano. Se generaron y caracterizaron
anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales de ratón
(anti-ids) en busca de la idoneidad como reactivos
de ELISA para medir ch806 en muestras de sueros de pacientes y
utilizarlos como controles positivos en análisis de la respuesta
inmunitaria anti-anticuerpo quimérico humano. Estos
anticuerpos anti-idiotípicos pueden ser también
útiles como vacunas terapéuticas o profilácticas, generando una
respuesta de anticuerpo anti-EGFR natural en los
pacientes.
Los métodos para generar anticuerpos
anti-idiotípicos son bien conocidos en la técnica
(Bhattacharya-Chatterjee, Chatterjee et al.
2001, Uemura et al. 1994, Steffens, Boerman et al.
1997, Safa and Foon 2001, Brown and Ling 1988).
Los anticuerpos anti-idiotípicos
monoclonales de ratón (anti-ids) fueron generados,
brevemente, como sigue. Se fusionaron esplenocitos de ratones
inmunizados con ch806 con células de plasmacitoma
SP2/0-AG14 y los hibridomas que producen
anticuerpos se seleccionaron a través de ELISA en busca de la unión
específica a ch806 y la unión competitiva para el antígeno (Figura
40). Se seleccionaron inicialmente veinticinco hibridomas y cuatro,
designados LMH-11, -12 -13 y -14, anticuerpos
secretados que demostraron unión específica a ch806, mAb 806 y
fueron capaces de neutralizar la actividad de unión al antígeno
ch806 o mAb 806 (Figura 41). El reconocimiento del idiotipo
ch806/mAb 806 o de la región CDR se demostró por la carencia de
reactividad cruzada con la IgG humana policlonal purificada.
En ausencia de de2-7 EGFR
antigénico recombinante fácilmente asequible para ayudar a la
determinación de ch806 en muestras de suero, se explotó la
capacidad de los anticuerpos ch806 anti-idiotípicos
novedosos para unir simultáneamente regiones variables de 806 en el
desarrollo de un ELISA sensible, específico para medir ch806 en
muestras clínicas (Figura 42). Utilizando LMH-12
para la captura y -LMH-12 Biotinilado para la
detección, el ELISA validado demostró curvas de unión altamente
reproducibles para medir ch806 (2 \mug/ml - 1.6 ng/ml) en suero
con un límite de detección de 3 ng/ml. (n=12; 1-100
ng/ml, Coeficiente de Variación < 25%; 100 ng/ml - 5 \mug/ml,
Coeficiente de Variación < 15%). No resultó evidente una unión de
fondo con los tres sueros de donantes sanos sometidos a ensayo y se
observó una unión despreciable con hu3S193 de control isotípico. El
hibridoma produce elevados niveles de anticuerpo
LMH-12, y se planea la producción a gran escala para
posibilitar la medición de ch806 la cuantificación de cualquier
respuesta inmunitaria en muestras clínicas. (Brown and Ling
1988).
La inmunorreactividad de las muestras de suero
pre- y post-inmunización indicó el desarrollo de
mAbs anti-ch806 and anti-huIgG de
ratón de elevado título. Inicialmente se seleccionaron veinticinco
hibridomas que producen anticuerpos que se unen a ch806, pero no a
huIgG. Las características de unión de algunos de estos hibridomas
se muestran en la Figura 42A y 42B. Cuatro de estos hibridomas
anti-ch806 con alta afinidad de unión (clones 3E3,
5B8, 9D6 y 4D8) se buscaron con posterioridad para la expansión
clonal a partir de células individuales mediante dilución limitante
y se designaron Ludwig Institute for Cancer Research Melbourne
Hybridoma (LMH) -11, -12, -13, y -14, respectivamente (Figura
42).
La capacidad de los anticuerpo
anti-ch806 para unirse simultáneamente a los
anticuerpos ch806 es una característica deseable para su uso como
reactivos en un ELISA para determinar los niveles de ch806 en suero.
Los hibridomas clónicos, LMH-11, -12, -13, y -14
demostraron unión simultánea (datos no mostrados).
Después de la expansión clonal, se examinaron
los sobrenadantes de cultivo del hibridoma mediante ELISA en busca
de la capacidad para neutralizar la actividad de unión al antígeno
de ch806 o mAb 806 con sEGFR621. Los resultados demostraron la
actividad antagónica de los mAbs anti-idiotípicos
LMH-11, -12, -13, y -14 con el bloqueo en solución
de la unión tanto de ch806 como de mAb 806 de múrido a placas
recubiertas con sEGFR (Figura 41 para LMH-11, -12,
-13).
Después del cultivo a gran escala en botellas
giratorias se verificaron las especificidades de unión de los
hibridomas clónicos establecidos, LMH-11, -12, -13,
and -14 mediante ELISA. Los anticuerpos LMH-11 a -14
se identificaron como el isotipo IgG1\kappa mediante el kit de
isotipificación de anticuerpos monoclonales de ratón.
Para ayudar a la determinación de ch806 en
muestras de suero, se explotó la capacidad de los anticuerpos
ch806 anti-idiotípicos para unirse simultáneamente a
la región variable de 806 en el desarrollo de un ensayo ELISA
sensible y específico en busca de ch806 en muestras clínicas. Los
tres clones purificados LMH-11, -12, y -13 (Figura
49, B, and C respectivamente) se compararon en busca de su capacidad
para capturar y después detectar la unión a ch806 en los sueros.
Los resultados indicados utilizando LMH-12 (10
\mug/ml) para la captura y LMH-12 biotinilado
para la detección produjeron la sensibilidad más alta para ch806 en
suero (3 ng/ml) con una unión de fondo despreciable.
Habiendo establecido las condiciones de ELISA
farmacocinéticas óptimas utilizando 1 \mug/ml de
LMH-12 anti-idiotípico y 1
\mug/ml de LMH-12 biotinilado para la captura y la
detección, respectivamente, se realizó la validación del método. Se
realizaron tres ELISA separados por cuadruplicado para medir ch806
en suero de donante de tres donantes sanos o BSA/medios al 1% con
el control isotípico hu3S193. Los resultados de la validación se
presentan en la Figura 43 y demuestran curvas de unión altamente
reproducibles para medir ch806 (2 \mug/ml - 1,6 ng/ml) en sueros
con un límite de detección de 3 ng/ml. (n=12; 1-100
ng/ml, Coeficiente de Variación < 25%; 100 ng/ml- 5 \mug/ml,
Coeficiente de Variación < 15%). No resultó evidente unión de
fondo con ninguno de los tres sueros sometidos a ensayo y no se
observó una unión despreciable con hu3S193 de control isotípico.
\vskip1.000000\baselineskip
En realidad éstas se deben incorporar a las del
final del Ejemplo 17 y poner al final de todos los ejemplos
Brown, G. and N. Ling
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Practical Approach. D. Catty. Oxford, England, IRL Press:
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Domagala, T., N. Konstantopoulos,
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Uemura, Ii, E. Okajima,
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anti-idiotype antibodies related to
renal-cell carcinoma-associated
antigen G250". Int J Cancer 56(4):
609-14.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Los experimentos se emprendieron para evaluar
adicionalmente el papel de las estructuras carbohidratadas en la
unión y el reconocimiento del EGFR, tanto amplificado como
de2-7 EGFR, por el anticuerpo mAb806.
Para determinar si las estructuras
carbohidratadas están implicadas directamente en el epítopo mAb 806,
el sEGFR recombinante expresado en células CHO se trató con PNGasa
F para eliminar la glicosilación ligada a N. Después del
tratamiento, la proteína se hizo correr en SDS-PAGE,
se transfirió a una membrana y se inmunotransfirió con mAb 806
(Figura 44). Como se esperaba, el sEGFR desglicosilado corre más
rápido en la SDS-PAGE, indicando que los
carbohidratos han sido eliminados satisfactoriamente. El anticuerpo
mAb 806 se une claramente a la sustancia desglicosilada demostrando
que el epítopo del anticuerpo es un péptido en la naturaleza y no
sólo un epítopo de glicosilación.
Los productos lisados, preparados a partir de
líneas celulares marcadas metabólicamente con S^{35}, se
inmunoprecipitaron con diferentes anticuerpos dirigidos al EGFR
(Figura 45). Como se esperaba, el anticuerpo 528 inmunoprecipitó 3
bandas a partir de células U87MG.\Delta2-7, una
banda superior correspondiente al EGFR de tipo salvaje (wt) y dos
bandas inferiores correspondientes al de2-7 EGFR.
Estas dos bandas de de2-7 EGFR han sido referidas
previamente y se supone que representan glicosilación diferencial
(Chu et al. (1997) Biochem. J. Jun 15;324 (Pt
3):885-861). En contraste, mAb 806 sólo
inmunoprecipitó las dos bandas de de2-7 EGFR,
estando el receptor wt completamente ausente incluso después de la
exposición en exceso (datos no mostrados). Interesantemente, mAb806
mostró un aumento de reactividad relativa con la banda de
de2-7 EGFR inferior pero un descenso de reactividad
con la banda superior cuando se comparó con el anticuerpo 528. El
anticuerpo SC-03, un anticuerpo policlonal de
conejo comercial dirigido al dominio C-terminal del
EGFR, inmunoprecipitó las tres bandas de EGFR como se observa con
el anticuerpo 528 aunque la cantidad total de receptor
inmunoprecipitado por este anticuerpo fue considerablemente menor.
No se observaron bandas cuando se utilizó un anticuerpo IgG2b
irrelevante como control para el mAb 806.
El anticuerpo 528 inmunoprecipitó una sola banda
a partir de las células U87MG.wtEGFR correspondientes al receptor
wt (Figura 45). El mAb 806 también inmunoprecipitó una sola banda a
partir de estas células, no obstante, esta banda de EGFR migró
claramente más rápido que el receptor reactivo 528. El anticuerpo
SC-03 inmunoprecipitó ambas bandas reactivas de
EGFR a partir de las células U87MG.wtEGFR, confirmando
adicionalmente que el mAb 806 y 528 reconocen diferentes formas de
EGFR en productos lisados de células completas de estas células.
Según se observó con las células U87MG.wtEGFR,
el anticuerpo 528 inmunoprecipitó una sola banda de EGFR a partir
de las células A431 (Figura 45). La banda de EGFR reactivo 528 es
muy ancha sobre estos geles de bajo porcentaje (6%) y probablemente
refleja la diversidad de glicosilación del receptor. También se
observó una sola banda de EGFR después de la inmunoprecipitación
con mAb 806. Si bien esta banda de EGFR no migra considerablemente
más rápido que la banda reactiva ancha total de 528, ésta se
localizó en el borde delantero de la banda 528 ancha de una manera
reproducible. A diferencia de los productos lisados celulares de
U87MG.\Delta2-7, la cantidad total de EGFR
inmunoprecipitado por mAb 806 a partir de productos lisados de A431
fue considerablemente menor que con el anticuerpo 528, un resultado
coherente con los datos de Scatchard de los autores de la presente
invención que muestran que mAb 806 sólo reconoce una porción del
EGFR sobre la superficie de estas células (véase el Ejemplo 4
anterior). La inmunoprecipitación con SC-03 dio como
resultado una sola banda de EGFR ancha como para el anticuerpo 528.
Se obtuvieron resultados similares con las células HN5 (datos no
mostrados). Tomados juntos, estos datos indican que mAb 806
reacciona preferentemente con especies que migran más rápidamente
del EGFR, lo que puede representar formar glicosiladas
diferentemente del receptor.
Con el fin de determinar en que fase de
procesamiento del receptor aparecía reactividad con mAb 806 se
efectuó un experimento de pulso/caza. Las células A431 y
U87MG.\Delta2-7 se pulsaron durante 5 min con
metionina/cisteína 35S, después se incubaron a 37ºC varias veces
antes de la inmunoprecipitación con mAb 806 o 528 (Figura 46). El
patrón de inmunoprecipitación en las células A431 con el anticuerpo
528 fue típico de un anticuerpo de conformación dependiente del
EGFR. Una pequeña cantidad de receptor se inmunoprecipitó a los 0
min (esto es después de un pulso de 5 min) aumentando la cantidad
de EGFR marcado en cada momento. También hubo un aumento simultáneo
del peso molecular del receptor con el tiempo. En contraste, el
material de EGFR reactivo con mAb 806 estuvo presente a altos
niveles a los 0 min, con un máximo a los 20 min y después se redujo
en cada momento adicional. De este modo, parece que mAb 806
reconoce preferentemente una forma del EGFR encontrada en la primera
fase del procesamiento.
La reactividad del anticuerpo observada en las
células U87MG.\Delta2-7 marcadas con el pulso fue
más complicada. La inmunoprecipitación con el anticuerpo 528 a los
0 min reveló que una pequeña cantidad de la banda de
de2-7 EGFR inferior estaba marcada (Figura 46). La
cantidad de la banda inferior de de2-7 EGFR reactivo
con 528 aumentó con el tiempo, con un máximo a los 60 min y
declinando lentamente a las 2 y las 4 h. No se detectó una cantidad
significativa de la banda superior marcada de de2-7
EGFR hasta los 60 min, después de lo cual el nivel continuó
aumentando hasta el final del transcurso del tiempo. Esto indica
claramente que el de2-7 EGFR superior es una forma
más madura de receptor. La reactividad con mAb 806 también varió
durante el estudio del curso del tiempo, no obstante el mAb 806
precipitó preferentemente la banda más baja del
de2-7 EGFR. Por supuesto, no hubo niveles
significativos de la banda superior de mAb 806 observados hasta las
4 h del marcaje.
Los experimentos anteriores sugieren que el mab
806 reacciona preferentemente con una forma de glicosilación más
inmadura de de2-7 y wt EGFR. Esta posibilidad se
sometió a ensayo inmunoprecipitando el EGFR de diferentes líneas
celulares marcadas durante la noche con metionina/cisteína 35S y
sometiendo después los precipitados resultantes a digestión con
Endoglucosidasa H (Endo H). Esta enzima separa preferentemente
carbohidratos de los del tipo con alto contenido de manosa (esto
es, glicosilación inmadura) de las proteínas dejando intactos los
carbohidratos complejos (esto es, glicosilación madura). La
inmunoprecipitación y digestión con Endo H de productos lisados de
células U87MG.A2-7 con 528, mAb 806 y
SC-03 produjeron resultados similares (Figura 47).
Como se pronosticó, la banda inferior de de2-7 EGFR
fue completamente sensible a la digestión con Endo H, migrando más
rápidamente en la SDS-PAGE después de la digestión
con Endo H, demostrando que esta banda representa la forma con alto
contenido de manosa del de2-7 EGFR. La banda de
de2-7 EGFR superior fue esencialmente resistente a
la digestión con Endo H, mostrando sólo una diferencia muy ligera en
la migración tras la digestión con Endo H, indicando que la mayoría
de las estructuras carbohidratadas son de tipo complejo. El descenso
complejo pero reproducible del peso molecular de la banda superior
después de la digestión enzimática sugiere que mientras que los
carbohidratos de la banda de de2-7 EGFR superior son
predominantemente de tipo complejo, ésta posee algo de estructural
con alto contenido de manosa. Interesantemente, estas células
también expresan bajas cantidades de wt EGFR endógeno que es
claramente visible después de la inmunoprecipitación con 528.
También hubo una pequeña pero notable reducción del peso molecular
del receptor wt después de la digestión con Endo H, indicando que
también contiene estructuras con alto contenido de manosa.
La sensibilidad del wt EGFR inmunoprecipitado a
la digestión con Endo H fue similar tanto en células
U87MG.wtEGFR como A431 (Figura 47). El grueso del material precipitado por el anticuerpo 528 fue resistente a la enzima Endo H aunque una pequeña cantidad de material fue de la forma con alto contenido de manosa. De nuevo hubo un pequeño descenso del peso molecular del wt EGFR después de la digestión con Endo H sugiriendo que contiene algo de estructuras con alto contenido de manosa. Los resultados utilizando el anticuerpo SC-03 fueron similares a los del anticuerpo 528. En contraste, la mayoría del EGFR precipitado con mAb 806 fue sensible a Endo H tanto en células U87MG.wtEGFR como A431, confirmando que mAb 806 reconoce preferentemente la forma con alto contenido de manosa del EGFR. Se obtuvieron resultados similares con las células HN-5, donde la mayoría del material precipitado con mAb 806 fue sensible a la digestión con Endo H, mientras que la mayoría del material precipitado con mAb528 y SC-03 fue resistente a la digestión con Endo H (datos no mostrados).
U87MG.wtEGFR como A431 (Figura 47). El grueso del material precipitado por el anticuerpo 528 fue resistente a la enzima Endo H aunque una pequeña cantidad de material fue de la forma con alto contenido de manosa. De nuevo hubo un pequeño descenso del peso molecular del wt EGFR después de la digestión con Endo H sugiriendo que contiene algo de estructuras con alto contenido de manosa. Los resultados utilizando el anticuerpo SC-03 fueron similares a los del anticuerpo 528. En contraste, la mayoría del EGFR precipitado con mAb 806 fue sensible a Endo H tanto en células U87MG.wtEGFR como A431, confirmando que mAb 806 reconoce preferentemente la forma con alto contenido de manosa del EGFR. Se obtuvieron resultados similares con las células HN-5, donde la mayoría del material precipitado con mAb 806 fue sensible a la digestión con Endo H, mientras que la mayoría del material precipitado con mAb528 y SC-03 fue resistente a la digestión con Endo H (datos no mostrados).
La yodación de la superficie celular de la línea
celular A431, se realizó con I^{125} seguido de
inmunoprecipitación con el anticuerpo 806. El protocolo para la
yodación de la superficie fue el siguiente: La lisis celular, la
inmunoprecipitación, la digestión con Endo H, la SDS PAGE y la
autorradiografía son las descritas aquí anteriormente. Para el
marcaje, las células se hicieron crecer en medios con FCS al 10%,
se separaron con EDTA, se lavaron dos veces con PBS, después se
resuspendieron en 400 \mul de PBS (aprox
2-3x10^{6} células). A esto se le añadieron 15
\mul de I^{125} (provisión de partida de 100 mCi/ml), provisión
de partida de 100 \mul de lactoperoxidasa bovina (1 mg/ml), 10
\mul de H_{2}O_{2} (provisión de partida al 0,1%) y esto se
incubó durante 5 min. Después se añadieron 10 \mul adicionales de
H_{2}O_{2} y la incubación continuó durante 3 min adicionales.
Las células se lavaron después de nuevo 3 veces con PBS y se
lisaron en Triton al 1%. La yodación de la superficie celular de la
línea celular A431 con lactoperoxidasa, seguido de
inmunoprecipitación con el anticuerpo 806, mostró que, de una
manera similar a los productos lisados de células completas
descritos antes, la forma predominante del EGFR reconocida por 806
unida a la superficie celular de las células A431 fue sensible a la
digestión con EndoH (Figura 48). Esto confirma que la forma de EGFR
unida mediante 806 sobre la superficie de celular de la células
A431 en una forma sensible a EndoH y por tanto es del tipo con alto
contenido de manosa.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Ludwig Institute for Cancer
Research
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas de Unión Específica y sus
Usos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AHB/FP6192124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 02739258.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-05-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US02/15185
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-05-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/290,410
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/326,019
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-09-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/342,258
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-12-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Versión 4.0 de
Windows
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 384
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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<400> 4
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\newpage
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> biotinilada en la posición 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> biotinilada en la posición 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6625
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 463
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
Claims (41)
1. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos
activos que reconoce un epítopo de EGFR que se encuentra en células
tumorigénicas o hiperproliferativas o células que expresan en exceso
EGFR o expresan un EGFR mutante, donde dicho anticuerpo o uno de
sus fragmentos activos (i) se une a EGFR de tipo salvaje humano
unido a la célula sólo cuando el EGFR es amplificado o expresado en
exceso; (ii) se une a EGFR de2-7 en un epítopo
distinto del péptido de empalme LEEKKONYVVTDH y (iii) se une a un
epítopo en la secuencia de los restos 273-501 del
EGFR humano de tipo salvaje.
2. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos
activos de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo
o uno de sus fragmentos activos comprende un polipéptido que se une
al dominio que comprende una secuencia de aminoácidos presentada
como los restos 115-123 del SEQ ID NO:2 o dicha
secuencia de aminoácidos que contiene una o dos sustituciones en la
misma.
3. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos
de la reivindicación 2, donde el dominio de unión al polipéptido
comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos presentada
como una o ambas de las secuencias de los restos
44-54 y 68-83 del SEQ ID NO: 2, o
una o ambas de dichas secuencias de los restos que contienen una o
dos sustituciones en las mismas.
4. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos
activos de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo
o uno de sus fragmentos activos comprende un dominio de unión al
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos presentada
como los restos 109-117 del SEQ ID NO:4 o dicha
secuencia de aminoácidos que contiene una o dos sustituciones en la
misma.
5. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos
de la reivindicación 2 o 3, que comprende adicionalmente un segundo
dominio de unión al polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos presentada como los restos 109-117 del
SEQ ID NO:4, o dicha secuencia de aminoácidos que contiene una o dos
sustituciones en la misma.
6. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos
de la reivindicación 4, donde el dominio de unión al polipéptido
comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos presentada
como una o ambas de las secuencias de los restos
44-54 y 70-76 del SEQ ID NO: 4, o
una o ambas de dichas secuencias de los restos que contienen una o
dos sustituciones en las mismas.
7. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos
de la reivindicación 5 donde el segundo dominio de unión al
polipéptido comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos
presentada como una o ambas de las secuencias de los restos
44-54 y 70-76 del SEQ ID NO:4, o una
o ambas de dichas secuencias de los restos que contienen una o dos
sustituciones en las mismas.
8. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos
de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde dicho
anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprende la secuencia de
polipéptidos expuesta en uno o ambos del SEQ ID NO:2 y el SEQ ID
NO:4.
9. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos
de la reivindicación 8, donde la secuencia de polipéptidos es
expuesta en el SEQ ID NO:2.
10. El anticuerpo o uno de sus fragmentos
activos de la reivindicación 8, donde la secuencia de polipéptidos
es expuesta en el SEQ ID NO:4.
11. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde el anticuerpo es completamente
humano, humanizado o quimerizado.
12. El anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 11, donde los
dominios de unión al anticuerpo son portados por un marco de
anticuerpo humano.
13. El anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho
marco de anticuerpo humano es un marco de anticuerpo IgG1
humano.
14. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 12, que es un
anticuerpo quimérico o uno de sus fragmentos activos, donde dicho
anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprenden una cadena
pesada y una cadena ligera donde la cadena pesada comprende los
dominios de unión al anticuerpo presentados como el SEQ ID NO:2 y
una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
15. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 12, que es un
anticuerpo quimérico o uno de sus fragmentos activos, donde dicho
anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprenden una cadena
pesada y una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende los
dominios de unión al anticuerpo presentados como el SEQ ID NO:4 y
una región constante de la cadena ligera kappa humana.
16. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 en forma de un anticuerpo
F(ab')_{2}, un fragmento scFv, un fragmento biespecífico,
un fragmento triespecífico o un fragmento tetraespecífico.
17. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que porta una marca detectable o
funcional.
18. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 17, donde dicha
marca es un fármaco unido covalentemente o una radiomarca.
19. El anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicha
radiomarca es una cualquiera de H^{3}, C^{14}, P^{32},
S^{35}, Cl^{36}, Cr^{51}, Co^{57}, Co^{58}, Fe^{59},
Y^{90}, I^{121}, I^{124}, I^{125}, I^{131}, In^{111},
At^{211}, Au^{198}, Cu^{67}, Ac^{225}, Bi^{213},
Tc^{99} o Re^{186}.
20. Un anticuerpo aislado o uno de sus
fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que está pegilado.
21. Un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia que codifica un anticuerpo o uno de sus fragmentos
activos como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
22. Un método para preparar un anticuerpo o uno
de sus fragmentos activos como se ha definido en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 20, que comprende expresar el ácido
nucleico de la reivindicación 21 en condiciones para ocasionar la
expresión de dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos, y
recuperar el anticuerpo o uno de sus fragmentos activos.
23. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos
activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
20, para su uso en un método de tratamiento o diagnosis del cuerpo
humano o animal.
24. El uso de un anticuerpo o uno de sus
fragmentos activos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención del cancer en un mamífero.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
donde dicho cáncer está localizado en o es adyacente al cerebro.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25,
donde dicho cáncer es un cáncer residente en el cerebro seleccionado
entre un glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, astrocitoma
neoplásico y malformación arteriovenosa neoplásica.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
donde dicho cáncer es un tumor neural.
28. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, donde dicho anticuerpo o uno de sus
fragmentos activos se administra sistémicamente.
29. Un kit para la diagnosis de un tumor en el
que el EGFR es amplificado o expresado en exceso o el EGFR es
expresado en forma de una proteína truncada, comprendiendo dicho kit
un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, opcionalmente con
reactivos y/o instrucciones para su uso.
30. Una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y opcionalmente, un
vehículo, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
31. Un kit para el tratamiento de un tumor en un
paciente humano, que comprende una forma de dosificación
farmacéutica de la composición farmacéutica de la reivindicación 30,
y una forma de dosificación farmacéutica separada que comprende un
agente anticanceroso adicional seleccionado del grupo que consiste
en agentes quimioterapéuticos, anticuerpos
anti-EGFR, agentes radioinmunoterapéuticos, y sus
combinaciones.
32. El kit de la reivindicación 31, donde dichos
agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en
inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores de la cascada de
fosforilación, moduladores post-traduccionales,
inhibidores del crecimiento o la división celulares (p. ej.
anti-mitóticos), inhibidores de la transducción de
la señal, y sus combinaciones.
33. El kit de la reivindicación 32, donde dichos
inhibidores de la tirosina quinasa se seleccionan del grupo que
consiste en AG1478, ZD1839, ST1571, OSI-774,
SU-6668, y sus combinaciones.
34. El kit de la reivindicación 31, donde dichos
anticuerpos anti-EGFR se seleccionan del grupo que
consiste en los anticuerpos anti-EGFR 528, 225,
SC-03, D8.3, L8A4, Y10, ICR62,
ABX-EGF, y sus combinaciones.
\newpage
35. Un anfitrión unicelular transformado con una
molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN o
una de sus variantes degeneradas, que codifica el anticuerpo o uno
de sus fragmentos activos de una cualquiera de las reivindicaciones
1-20, seleccionado del grupo que consiste en
- (A)
- la secuencia de ADN del SEQ ID NO:1;
- (B)
- la secuencia de ADN del SEQ ID NO:3;
- (C)
- la secuencia de ADN del SEQ ID NO:1, y la secuencia de ADN del SEQ ID NO:3;
- (D)
- la secuencia de ADN del SEQ ID NO:1, con una secuencia de IgG1 constante expuesta en el SEQ ID NO:8 y la secuencia de ADN del SEQ ID NO:3, con una secuencia kappa constante expuesta in SEQ ID NO.7;
- (E)
- las secuencias de ADN que hibridan con cualquiera de las secuencias de ADN anteriores en condiciones de hibridación convencionales; y
- (F)
- las secuencias de ADN que codifican la expresión de una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;
donde dicha secuencia de ADN se une
operativamente a una secuencia de control de la expresión.
36. El anfitrión unicelular de la reivindicación
35, donde el anfitrión unicelular se selecciona del grupo que
consiste en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces,
levaduras, células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1,
B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40,
y BMT10, células vegetales, células de insecto, y células humanas
en cultivo de tejidos.
37. Un método para detectar la presencia de EGFR
o de2-7EGFR amplificado o expresado en exceso donde
dicho EGFR se mide:
- A.
- poniendo en contacto una muestra biológica de un mamífero en el que se sospecha de la presencia de EGFR o de2-7EGFR amplificado o expresado en exceso con un anticuerpo como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en condiciones que permiten que se produzca la unión de dicho EGFR a dicho anticuerpo; y
- B.
- detectando si se ha producido la unión entre dicho EGFR de dicha muestra y el anticuerpo;
donde la detección de la unión indica la
presencia de dicho EGFR en dicha muestra.
38. Un método para detectar el cáncer en
mamíferos que comprende detectar la presencia de un EGFR de acuerdo
con el método de la reivindicación 37, donde la detección de la
presencia del EGFR indica la existencia de un tumor o cáncer en
dicho mamífero.
39. El uso del anticuerpo o uno de sus
fragmentos activos de la reivindicación 17 para la fabricación de un
medicamento para su uso en la formación de imágenes para
diagnóstico.
40. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, donde el procedimiento para el tratamiento
comprende radioinmunoterapia.
41. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, donde se administra primero el anticuerpo
o uno de sus fragmentos activos, y después de eso se administra una
composición que comprende un agente quimioterapéutico.
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