ES2361739T3 - Reticulantes con elevada reactividad y solubilidad y su uso en la preparación de conjugados para el suministro dirigido de fármacos de molécula pequeña. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular y uno o más fármacos de molécula pequeña, en el que dicho conjugado está representado por la fórmula (V): en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método: 10 (1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I): en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M + o H, donde M + representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (III): en la que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y (2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) con uno o más fármacos de molécula pequeña que 20 comprenden un grupo tiol libre.

Description

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

[0001] Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/403.652,presentada el 16 de agosto de 2002.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a un método mejorado para preparar conjugados de agentesde unión celular y fármacos de molécula pequeña, especialmente agentes citotóxicos.

[0003] La presente invención también se refiere a nuevos reticulantes bifuncionales y métodos parapreparar agentes de unión celular que comprenden un reticulante capaz de reaccionar con fármacos de molécula pequeña. El método mejorado para preparar conjugados proporciona a los conjugados enlacesdisulfuro estéricamente impedidos para potenciar la estabilidad in vivo del enlace disulfuro y,inesperadamente, tiene una velocidad de reacción aumentada con fármacos de molécula pequeña quealbergan un grupo tiol libre. La reacción es aproximadamente 12 veces más rápida que con los reticulantes descritos previamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] El reactivo de modificación bifuncional 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) se ha usado para unir dos proteínas juntas a través de un enlace disulfuro. El reactivo se hace reaccionar con la primera proteína para introducir un grupo que contiene disulfuro activo en la etapa de modificación.Una segunda proteína, que contiene un grupo tiol libre, se añade después para formar un enlace disulfuroentre las dos proteínas en la etapa de conjugación. Se han descrito muchos derivados de SPDP y versiones imida de SPDP (patente de Estados Unidos 4.563.304; J. Carlsson et al. 173 Biochem. J. 723737 (1978); Goff D. A., Carroll, S. F. 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990); L. Delprino et al. 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993); S. Arpicco et al., 8 BioConjugate Chem 327-337 (1997)).

[0005] Se han descrito conjugados de agentes de unión celular con fármacos altamente citotóxicos(patentes de Estados Unidos Nº 5.208.020 y 5.416.064; R.V.J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131(1992). En estos conjugados, los agentes de unión celular primero se modifican con un agente bifuncional tal como SPDP para introducir un resto disulfuro activo. La reacción con un fármaco citotóxico quecontiene tiol proporciona un conjugado en el que el agente de unión celular, tal como un anticuerpomonoclonal, y el fármaco se unen mediante enlaces disulfuro. Para potenciar la estabilidad in vivo de este enlace disulfuro, es importante para proporcionar enlaces disulfuro estéricamente impedidos. Esteobjetivo puede conseguirse usando reticulantes que albergan uno o dos sustituyentes metilo en el átomo de carbono geminal al enlace disulfuro o usando fármacos que albergan uno o dos sustituyentes metilo enel átomo de carbono que alberga el sustituyente tiol. Sin embargo, la introducción de dichos enlacesdisulfuro impedidos sobre agentes de unión celular o tioles impedidos sobre los fármacos provoca una marcada disminución en la velocidad de reacción del fármaco que contiene tiol y el agente de unióncelular. Por tanto, los procesos para la producción de conjugados llegan a ser imposibles, o muy costosos en tiempo y poco rentables. Además, el prolongado tiempo de reacción causa dimerización no deseadadel fármaco que contiene tiol y la consiguiente pérdida de reactividad y bajos rendimientos de producto. En el caso de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, las lentas velocidades de reaccióndel intercambio de disulfuro entre el enlace disulfuro impedido y el fármaco que contiene tiol conduce a la reacción secundaria indeseada de la escisión del enlace disulfuro entre las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o fragmento.

[0006] Por tanto, existe la necesidad de proporcionar reticulantes que proporcionarán una velocidadde reacción acelerada de la reacción de intercambio de disulfuro entre el agente de unión celularmodificado y el sustituyente tiol sobre el fármaco citotóxico. Además, como los agentes de unión celular, tales como los anticuerpos monoclonales, son solamente solubles en soluciones acuosas, también esdeseable proporcionar reticulantes que sean solubles en agua o requieran solamente un pequeñoporcentaje (<5% v/v) de un disolvente orgánico para mantener la solubilidad en soluciones acuosas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención cumple estos y otros objetos proporcionando un método para prepararun conjugado que comprenda un agente de unión celular y uno o más fármacos de molécula pequeña,donde dicho conjugado está representado por la fórmula (V):

imagen1

en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unidopor un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, y m es unnúmero entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método:

(1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I) o (II):

imagen1

en las que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no 10 sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo,

-M+

isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (II) o (IV),respectivamente:

en las que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y

(2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) o (IV) con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.[0008] La invención también proporciona un método para preparar un conjugado que comprende un

20 agente de unión celular y uno o más fármacos de molécula pequeña, donde dicho conjugado está representado por la fórmula (V), comprendiendo dicho método: hacer reaccionar un compuesto de fórmula

(III) o (IV), con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.

[0009] En una realización preferida, el agente de unión celular es un anticuerpo o fragmento de unión25 a antígeno del mismo y el fármaco de molécula pequeña es un agente citotóxico.

[0010] La invención también proporciona un reticulante de fórmula (I) o (II):

imagen2

imagen1

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

en las que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclicoque tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentesy son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo,

-M+

isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y es NO2, Z no sea H.

[0011] La invención proporciona adicionalmente un método para preparar un agente de unión celularque comprende un enlazador capaz de unir el agente de unión celular a un fármaco de molécula pequeña, comprendiendo el agente de unión celular un enlazador que está representado por la fórmula

(III) o (IV), que comprende hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I) o (II), respectivamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS GRÁFICOS

[0012] La Figura 1 muestra la síntesis de reactivos reticulantes heterobifuncionales que contienen ungrupo 2-(nitropiridil)-disulfuro o un grupo 2-(dinitropiridil)-disulfuro y un éster de ácido carboxílico reactivo.Primero se hace reaccionar un compuesto de ácido mercapto-carboxílico con un compuesto 2,2'-di(nitropiridil)-disulfuro o 2,2'-di-(dinitropiridil)-disulfuro y el resto de ácido carboxílico después se esterifica con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida. Como ejemplo, el 1,3-dibromobutano se convirtió en ácido 4-mercaptopentanoico, que después se convirtió en el reactivo reticulante correspondiente.

[0013] La Figura 2 muestra la síntesis de los agentes reticulantes heterobifuncionales N-succinimidil-4(2-piridilditio)butirato (SPDB), N-succinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirato (SNPB) y N-sulfosuccinimidil-4(5-nitro-2-piridilditio)butirato (SSNPB), derivados del ácido 4-mercaptobutírico. El SPDB es un ejemplo de referencia y no forma parte de la presente invención.

[0014] La Figura 3 muestra la síntesis de los agentes reticulantes heterobifuncionales N-succinimidil-4metil-4-(5-nitro-2-piridilditio)pentanoato (SMNP), y N-sulfosuccinimidil-4-metil-4-(5-nitro-2piridilditio)pentanoato (SSMNP) derivados del ácido 4-mercapto-4-metil-pentanoico.

[0015] La Figura 4 muestra la síntesis de los reactivos reticulantes heterobifuncionales que contienen un grupo 2-(N,N-dialquilcarboxamidopiridil)-disulfuro o un grupo 2-(N,N-dialquilcarboxamidopiridil)disulfuro y un éster de ácido carboxílico reactivo. Primero se hace reaccionar un compuesto de ácido mercapto-carboxílico con un compuesto 2,2'-di-(N,N-dialquilcarboxamidopiridil)-disulfuro y el resto de ácido carboxílico después se esterifica con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida. Como ejemplo, se muestra la síntesis de los agentes reticulantes heterobifuncionales N-succinimidil-4-(5-N,Ndimetilcarboxamido-2-piridilditio)butirato (SCPB) y N-sulfosuccinimidil-4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2piridilditio)butirato (SSCPB), derivados del ácido 6,6-ditiodinicotínico.

[0016] La Figura 5 muestra la síntesis de los reactivos reticulantes heterobifuncionales que contienen un grupo 4-(N,N-dialquilcarboxamidopiridil)-disulfuro o un grupo 4-(N,N-dialquilcarboxamidopiridil)disulfuro y un éster de ácido carboxílico reactivo. Primero se hace reaccionar un compuesto de ácidomercapto-carboxílico con un compuesto 4,4'-di-(N,N-dialquilcarboxamidopiridil)-disulfuro y el resto de ácido carboxílico después se esterifica con una N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida. Como ejemplo, se muestra la síntesis de los agentes reticulantes heterobifuncionales N-succinimidil-4-(5-N,Ndimetilcarboxamido-4-piridilditio)butirato y N-sulfosuccinimidil-4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-4piridilditio)butirato.

[0017] La Figura 6 muestra la síntesis de los reactivos reticulantes heterobifuncionales que contienen un grupo 4-(nitropiridil)-disulfuro o un grupo 4-(dinitropiridil)-disulfuro y un éster de ácido carboxílico reactivo. Primero se hace reaccionar un compuesto de ácido mercapto-carboxílico con un compuesto 4,4'di-(nitropiridil)-disulfuro o 4,4'-di-(dinitropiridil)-disulfuro y el resto de ácido carboxílico después se esterifica con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida. Como ejemplo, el 1,3-dibromobutano se convirtió en ácido 4-mercaptopentanoico, que después se convirtió en los reactivos reticulantes

5 correspondientes.

[0018] La Figura 7 es una comparación de SSNPP y SPP para la eficacia de conjugación con una cantidad creciente de equivalentes de fármaco en la reacción de conjugación. La Figura 7A muestra la proporción de fármaco por anticuerpo para diversos equivalentes de fármaco usada en la reacción. La

10 Figura 7B muestra la eficacia de la conjugación para diversos equivalentes de fármaco en la reacción.

[0019] La Figura 8 muestra el transcurso del tiempo para el intercambio de tiol con el enlazadorSSNPP (cuadrados) y SPP (rectángulos) a pH 7,4. La conjugación se realizó a pH 7,4 usando un excesomolar de 1,1 veces del maitansinoide, DM1, por enlazador.

15

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0020] El nuevo método descrito en este documento usa reticulantes heterobifuncionales. Los ejemplos de algunos reticulantes adecuados y sus síntesis se muestran en las Figuras 1 a 6.20 Preferiblemente, los reticulantes son 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoato de N-succinimidilo (1) o el análogo altamente soluble en agua 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoato de N-sulfosuccinimidil (2), N-succinimidil-4(2-piridilditio)butirato (SPDB, 3a), N-succinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirato (SNPB, 3b), y Nsulfosuccinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirato (SSNPB, 3c), N-succinimidil-4-metil-4-(5-nitro-2piridilditio)pentanoato (SMNP, 4a), N-succinimidil-4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2-piridilditio)butirato 25 (SCPB, 5a) o N-sulfosuccinimidil-4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2-piridilditio)butirato (SSCPB, 5b). El SPDB es un ejemplo de referencia y no forma parte de la presente invención. Los agentes de unión celularmodificados con los reticulantes 1, 2, 3a, 3b, 3c, 4a, 5a o 5b después pueden hacerse reaccionar con unpequeño exceso de un fármaco de molécula pequeña que contiene un resto tiol para dar excelentesrendimientos de conjugado. Las velocidades de reacción son aproximadamente 12 veces más rápidas

30 que con los reticulantes menos reactivos descritos previamente. Los nuevos reactivos tienen la ventaja adicional de que el progreso de la reacción de intercambio de disulfuro puede controlarse fácilmente acausa del elevado coeficiente de extinción de la nitro-piridina-2-tiona que se libera en la reacción. Ladisminución de la necesidad en el exceso de tiol tiene el beneficio imprevisto de reducir la escisión de los puentes disulfuro internos encontrados en las proteínas nativas.

35

Reticulantes

[0021] Los reticulantes heterobifuncionales de la presente invención tienen una doble ventaja sobreotros reticulantes porque (1) permiten la formación de un enlace disulfuro impedido entre el agente de

40 unión celular y el resto de fármaco, y (2) proporcionan una velocidad de reacción acelerada del intercambio de disulfuro con el sustituyente tiol sobre el fármaco de molécula pequeña. Además, losreticulantes son soluble en agua o solamente requieren un pequeño porcentaje (<5% v/v) de un disolvente orgánico para mantener la solubilidad en soluciones acuosas.

45 [0022] Los reticulantes heterobifuncionales usados en la presente invención comprenden un grupo nitropiridilditio, dinitropiridilditio, N,N-dialquilcarboxamidopiridilditio o di-(N,N-dialquilcarboxamido)piridilditio y un grupo éster carboxílico reactivo tal como un grupo éster de N-succinimidilo o éster de Nsulfosuccinimidilo.

imagen3

en las que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclicoque tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentesy son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o

5 terc-butilo, y Z es SO3-M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio.

[0024] Los ejemplos de alquilos lineales, ramificados o cíclicos que tienen de 3 a 6 átomos de carbono incluyen propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, ciclobutilo, ciclopentilo, yciclohexilo.

10 [0025] Los ejemplos de iones metálicos adecuados, M+, incluyen Li+, Na+, K+, y Rb+, y los ejemplos de iones tetraalquilamonio adecuados incluyen tetrametilamonio, tetraetilamonio, tetrapropilamonio, tetrabutilamonio e iones tetraalquilamonio con grupos alquilo mixtos, tales como dimetil-dietilamonio, etiltrimetilamonio, metil-etil-propil-butilamonio.

15 [0026] En realizaciones preferidas, tanto R como R1, son H o metilo, o uno de R y R1 es H y el otro es metilo.

[0027] En una realización más preferida, n es 1, R1 es metilo y R, R2, y R3 son H. En otra realización

20 más preferida, n es 1 y R, R1, R2, y R3 son H. En una realización adicional más preferida, n es 1, R y R1 son ambos metilo, y R2 y R3 son ambos H.

[0028] La síntesis de reticulantes que contienen 2-ditionitropiridilo y 2-ditio-dinitropiridilo de fórmulas (I) se muestra en las Figuras 1, 2 y 3 y la síntesis de los correspondientes reticulantes que contienen 4

25 ditionitropiridilo y 4-ditio-dinitropiridilo de fórmula (II) se muestra en la Figura 6. La síntesis de reticulantes que contienen 2-ditio-N,N-dimetilcarboxamidopiridilo de fórmula (I) se muestra en la Figura 4 y la síntesis de los correspondientes reticulantes que contienen 4-ditio-N,N-dimetilcarboxamidopiridilo de fórmula (II) se muestra en la Figura 5.

30 [0029] Se hace reaccionar ácido mercapto con ditiobis(nitropiridina), ditiobis(dinitropiridina), o ditiobis(dimetilcarboxamidopiridina), en un disolvente orgánico, preferiblemente un disolvente orgánicopolar, tal como tetrahidrofurano, con o sin base, pero preferiblemente con una base tal como trietilamina.El ácido disulfuro no simétrico resultante después se hace reaccionar con N-hidroxisuccinimida o Nhidroxisulfosuccinimida en un disolvente orgánico, preferiblemente un disolvente orgánico aprótico polar,

35 tal como dimetilformamida, en presencia de un agente de acoplamiento, preferiblemente una carbodiimida tal como diciclohexilcarbodiimida, para dar el compuesto deseado.

[0030] En realizaciones preferidas, tanto R como R1 son H o metilo, o uno de R y R1 es H y el otro es metilo.

40 [0031] En una realización más preferida, n es 1, R1 es metilo y R, R2, y R3 son H. En otra realización más preferida, n es 1 y R, R1, R2, y R3 son H. En una realización adicional más preferida, n es 1, R y R1 son ambos metilo, y R2 y R3 son ambos H. [0032] La presente invención también proporciona nuevos reticulantes de fórmula (I) o (II), mostradasanteriormente, en las que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal,

45 ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentes y son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo,

-M+

etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y es NO2, Z no sea H.

50

Agentes de unión celular que albergan un reticulante que contiene disulfuro

imagen4

imagen1

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

en las que CB representa un agente de unión celular, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o unnúmero entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a 10

más preferida, n es 1 y R, R1, R2, y R3 son H. En una realización adicional más preferida, n es 1, R y R1

o más.

[0034] metilo.

En realizaciones preferidas, tanto R como R1, son H o metilo, o uno de R y R1 es H y el otro es

[0035]

En una realización más preferida, n es 1, R1, es metilo y R, R2, y R3 son H. En otra realización

son ambos metilo, y R2 y R3 son ambos H.

[0036] El agente de unión celular que alberga un reticulante puede sintetizarse por métodos conocidosen la técnica (patentes de Estados Unidos Nº 6.340.701 B1, 5.846.545, 5.585.499, 5.475.092, 5.414.064,5.208.020, y 4.563.304; R.V.J. Chari et al. Cancer Research 52, 127-131, 1992; R.V.J. Chari et al. Cancer Research 55, 4079-4084, 1995; J. Carlsson et al. 173 Biochem. J. (1978) 723-737(1978); Goff D. A.,Carroll, S. F. 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990); L. Delprino et al. 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993);

S. Arpicco et al., 8 Bioconjugate Chem 327-337 (1997)). De forma ventajosa, a causa de que los gruposreticulantes son solubles en agua o requieren solamente un pequeño porcentaje de disolvente orgánico para mantener la solubilidad en solución acuosa, la reacción entre el agente de unión celular y elreticulante puede realizarse en solución acuosa. El reactivo reticulante se disuelve en un disolventeorgánico polar que es miscible con agua, por ejemplo diferentes alcoholes, tales como metanol, etanol, y propanol, dimetilformamida, dimetilacetamida, o ácido dimetilsulfóxido a una elevada concentración, porejemplo, 1-100 mM, y después se añade una alícuota apropiada a la solución acuosa tamponada delagente de unión celular. Una alícuota apropiada es una cantidad de solución que introduce 1-10 gruposreticulantes por agente de unión celular, preferiblemente 2-5 grupos, y el volumen a añadir no debeexceder del 10%, preferiblemente del 5%, y mucho más preferiblemente del 1-3% del volumen de la solución de agente de unión celular. Las soluciones acuosas para los agentes de unión celular setamponan entre pH 6 y 9, preferiblemente entre 6,5 y 7,5 y pueden contener cualquier sal tamponante nonucleófila útil para estos intervalos de pH. Los tampones típicos incluyen tampones fosfato, trietanolamina.HCl, HEPES, y MOPS, que puede contener componentes adicionales, tales como sacarosay sales, por ejemplo, NaCl. Después de la adición, la reacción se incuba a una temperatura de 4ºC a 40ºC, preferiblemente a temperatura ambiente. El progreso de la reacción puede controlarse midiendo elaumento en la absorción a 495 nm u otra longitud de onda apropiada. Después de completarse lareacción, puede realizarse el aislamiento del agente de unión celular modificado de un modo rutinario,usando, por ejemplo, cromatografía por filtración en gel, o cromatografía de adsorción.

[0037] El grado de modificación puede evaluarse midiendo la absorbancia del grupo nitropiridina tiona,dinitro-piridina ditiona, carboxamidopiridina ditiona o dicarboxamidopiridina ditiona liberado.

[0038] El agente de unión celular que comprende los conjugados de la presente invención puede serde cualquier tipo actualmente conocido, o que llegue a conocerse, e incluye péptidos y no péptidos. El agente de unión celular puede ser cualquier compuesto que pueda unirse a una célula, de un modoespecífico o no específico. Generalmente, pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerposmonoclonales y fragmentos de anticuerpo), interferones, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento,vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula osustancia de unión celular.

[0039] Los ejemplos más específicos de agentes de unión celular que pueden usarse incluyen:

-

anticuerpos revestidos (patente de Estados Unidos Nº 5.639.641);

-

fragmentos de anticuerpos tales como sFv, Fab, Fab', y F(ab')2 (Parham, J. Immunol. 131:28952902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960));

-

interferones (por ejemplo, , , );

-

linfoquinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;

-

hormonas tales como insulina, TRH (hormona liberadora de tirotropina), MSH (hormonaestimuladora de melanocitos), hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos;

-

vitaminas tales como ácido fólico;

-

factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGF-, G-CSF, M

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

55 60

CSF y GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)); y

- transferrina (O'Keefe et al, J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)).

[0040] Las técnicas de anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes de unión celularextremadamente específicos en forma de anticuerpos monoclonales específicos. Son particularmente bien conocidas en la técnica las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos porinmunización de ratones, ratas, hámsteres o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés tal comola célula diana intacta, antígenos aislados de la célula diana, virus completos, virus completos atenuados, y proteínas virales tales como proteínas de la envuelta viral. También pueden usarse células humanassensibilizadas. Otro método para crear anticuerpos monoclonales es el uso de bibliotecas fágicas de sFv (región variable de cadena sencilla), específicamente sFv humano (véase, por ejemplo, Griffiths et al,patente de Estados Unidos Nº 5.885.793; McCafferty et al, documento WO 92/01047; Liming et al,documento WO 99/06587).

[0041] La selección del agente de unión celular apropiado es un tema de elección que depende de la población celular particular que tiene que abordarse, pero, en general, se prefieren anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a epítopo de los mismos, si está disponible uno apropiado.

[0042] Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal My9 es un anticuerpo lgG2a murino que es específicopara el antígeno CD33 encontrado en células de leucemia mieloide aguda (AML) (Roy et al. Blood 77:2404-2412 (1991)) y puede usarse para tratar a pacientes de AML. Asimismo, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una lgG1 murina, que se une al antígeno CD19 en células B (Nadler et al, J.Immunol. 131:244-250 (1983)) y puede usarse si las células diana son células B o células enfermas queexpresan este antígeno tal como en linfoma no Hodgkin o leucemia linfoblástica crónica. Asimismo, elanticuerpo N901 es un anticuerpo monoclonal lgG1 murino que se une a CD56 encontrado en células de carcinoma pulmonar microcítico y en células de otros tumores de origen neuroendocrino (Roy et al. J. Nat. Cancer Inst. 88:1136-1145 (1996)).

[0043] Además, el GM-CSF, que se une a células mieloides, puede usarse como agente de unióncelular para células enfermas de leucemia mielógena aguda. La IL-2, que se une a células T activadas, puede usarse para la prevención del rechazo de transplantes de injertos, para la terapia y prevención dela enfermedad de injerto contra hospedador, y para el tratamiento de leucemia aguda de células T. LaMSH, que se une a melanocitos, puede usarse para el tratamiento de melanoma. El ácido fólico, que estádirigido al receptor de folato expresado en cáncer de ovario y otros cánceres también es un agente deunión celular adecuado.

[0044] Los cánceres de mama y testículos pueden abordarse satisfactoriamente con estrógenos (oanálogos de estrógeno) o andrógenos (o análogos de andrógeno), respectivamente, como agentes deunión celular.

[0045] El nuevo método es especialmente ventajoso cuando el agente de unión celular es un anticuerpo o fragmento del mismo, ya que la velocidad aumentada del intercambio de disulfuro entre elenlace disulfuro impedido y el fármaco que contiene tiol reduce el grado de la reacción secundariaindeseada de la escisión del enlace disulfuro entre las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o fragmento.

Conjugados citotóxicos

[0046] Los conjugados citotóxicos de la presente invención comprenden, cada uno, uno o más fármacos de molécula pequeña unidos covalentemente a un agente de unión celular a través de un reticulante como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, los conjugados citotóxicos tienen la siguiente fórmula (V):

imagen1

en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unidopor un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, como se ha definido anteriormente, n es 0 o unnúmero entero de 1 a 4, y m es de 1 a 10 o más.

[0047] En realizaciones preferidas, tanto R como R1 son H o metilo, o uno de R y R1 es H y el otro es metilo.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

[0048] En una realización preferida, n es 1, R1 es metilo y R, R2, y R3 son H. En otra realización preferida, n es 1 y R, R1, R2, y R3 son H. En una realización adicional más preferida, n es 1, R y R1 son ambos, y R2 y R3 son ambos H.

[0049] Preferiblemente la cantidad de fármacos de molécula pequeña unida a cada agente de unión celular es 1-10, más preferiblemente 2-5, e incluso más preferiblemente 3-4.

[0050] La síntesis de los conjugados implica un intercambio de disulfuro entre el enlace disulfuro en elreticulante unido covalentemente al agente de unión celular y un fármaco de molécula pequeña quecontiene un grupo tiol libre. La reacción produce un conjugado en el que el agente de unión celular y los fármacos de molécula pequeña están unidos a través de enlaces disulfuro estéricamente impedidos. Deforma importante, cuando se realiza la reacción usando agentes de unión celular modificados para quecontengan los reticulantes de la presente invención, inesperadamente, la reacción de intercambio de disulfuro (a temperatura ambiente y pH 6,5-7,5) sucede hasta doce veces más rápido que cuando se usanotros reticulantes.

[0051] El conjugado citotóxico puede purificarse por medios bioquímicos convencionales, tales comofiltración en gel en una columna Sephadex G25 o Sephacryl S 300, o por diálisis como se ha descritopreviamente.

Fármacos de molécula pequeña

[0052] Los fármacos de molécula pequeña útiles en el método incluyen cualquier fármaco de moléculapequeña que tenga un grupo tiol para unirse al agente de unión celular. La invención incluye fármacosconocidos así como aquellos que pueden llegar a conocerse. Los fármacos de molécula pequeña especialmente preferidos incluyen agentes citotóxicos.

[0053] El agente citotóxico puede ser cualquier compuesto que provoque la muerte de una célula, oinduzca la muerte celular, o en de algún modo disminuya la viabilidad celular, donde cada agente citotóxico comprende un resto tiol. Los agentes citotóxicos preferidos son compuestos de maitansinoide, compuestos de taxano, compuestos de CC-1065, compuestos de daunorrubicina y compuestos dedoxorrubicina, y análogos y derivados de los mismos, algunos de los cuales se describen a continuación.

Maitansinoides

[0054] Los maitansinoides que pueden usarse en la presente invención son bien conocidos en latécnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o prepararse sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.

[0055] Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromáticomodificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones.

[0056] Los ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen un anillo aromáticomodificado incluyen:

(1)

C-19-descloro (patente de Estados Unidos Nº 4.256.746) (preparado por reducción con LAH deansamitocina P2);

(2)

C-20-hidroxi (o C-20-desmetilo) +/-C-19-descloro (patentes de Estados Unidos Nº 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descloración usando LAH); y

(3)

C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (patente de Estados Unidos Nº 4.294.757) (preparado por acilación usando cloruros de acilo).

[0057] Los ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen modificaciones deotras posiciones incluyen:

(1)

C-9-SH (patente de Estados Unidos Nº 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol conH2S o P2S5);

(2)

C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente de Estados Unidos Nº 4.331.598);

(3)

C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de Estados Unidos Nº 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia);

(4)

C-15-hidroxi/aciloxi (patente de Estados Unidos Nº 4.364.866) (preparado por la conversión demaitansinol por Streptomyces);

(5)

C-15-metoxi (patentes de Estados Unidos Nº 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora);

(6)

C-18-N-desmetilo (patentes de Estados Unidos Nº 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y

(7)

4,5-desoxi (patente de Estados Unidos Nº 4.371.533) (preparado por la reducción con triclorurode titanio/LAH del maitansinol).

[0058] La síntesis de maitansinoides que contienen tiol útiles en la presente invención se describecompletamente en las patentes de Estados Unidos Nº 5.208.020 y 5.416.064.

[0059] Se espera que todos los maitansinoides con un resto tiol en la posición C-3, la posición C-14, la

5 posición C-15 o la posición C-20 sean útiles. Se prefiere la posición C-3 y es especialmente preferida la posición C-3 de maitansinol. También se prefiere un maitansinoide con un resto C-3 tiol que contenga Nmetil-alanina, y un maitansinoide con un resto C-3 tiol que contenga N-metil-cisteína, y análogos de cada uno.

10

imagen5

en la que:l es un número entero de 1 a 10; y may es un maitansinoide.

imagen1

en la que:R1 y R2 son H, CH3 o CH2CH3, y pueden ser iguales o diferentes; m es 0, 1, 2 ó 3; y may es un maitansinoide.

imagen1

en la que: n es un número entero de 3 a 8; y may es un maitansinoide.

en la que:l es 1, 2 ó 3; Y0 es Cl o H; yX3 es H o CH3.

imagen1

en la que:R1, R2, R3, R4 son H, CH3 o CH2CH3, y pueden ser iguales o diferentes; m es 0, 1, 2 ó 3; y

10 may es un maitansinoide.

15 en la que:

o es 1, 2 ó 3; p es un número entero de 0 a 10; y may es un maitansinoide.

imagen6

imagen1

en la que:

o es 1, 2 ó 3; q es un número entero de 0 a 10;

5 Y0 es CI o H; y X3 es H o CH3.

Taxanos

10 [0062] El agente citotóxico de acuerdo con la presente invención, también puede ser un taxano. [0063] Los taxanos que pueden usarse en la presente invención se han modificado para quecontengan un resto tiol. Algunos taxanos útiles en la presente invención tienen la fórmula T1 mostrada a continuación:

imagen7

[0065] En las realizaciones (1), (2), (3), y (4), R1, R1', y R1'' son iguales o diferentes y son H, un grupo aceptor de electrones, tales como F, NO2, CN, Cl, CHF2, o CF3 o un grupo donador de electrones, tal como -OCH3, -OCH2CH3, -NR7R8, -OR9, donde R7 y R8 son iguales o diferentes y son grupos alquilo20 lineales, ramificados o cíclicos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono o arilo simple o sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferiblemente, la cantidad de átomos de carbono para R7 y R8 es de 1 a 4. Además, preferiblemente R7 y R8 son iguales. Los ejemplos de grupos -NR7R8 preferidos incluyendimetilamino, dietilamino, dipropilamino, y dibutilamino, donde el resto butilo es cualquiera de primario,secundario, terciario o isobutilo. R9 es alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de

25 carbono.

[0066] R1 preferiblemente es OCH3, F, NO2, o CF3.

[0067] Además, preferiblemente, R1 está en posición meta y R1' y R1'' son H u OCH3.

5 [0068] R2 en las realizaciones (1), (2) y (4), es H, un éster heterocíclico, lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un éter heterocíclico, lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10átomos de carbono o un carbamato de fórmula -CONR10R11, donde R10 y R11 son iguales o diferentes y son H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos o arilo simple o sustituido que tienede 1 a 10 átomos de carbono. Para ésteres, los ejemplos preferidos incluyen -COCH2CH3 y

10 COCH2CH2CH3. Para éteres, los ejemplos preferidos incluyen -CH2CH3 y -CH2CH2CH3. Para carbamatos, los ejemplos preferidos incluyen -CONHCH2CH3, -CONHCH2CH2CH3, -CO-morfolino, -CO-piperazino, CO-piperidino, o -CO-N-metilpiperazino.

[0069] R2 en la realización (3), es un resto que contiene tiol.

15 [0070] R3 en las realizaciones (1), (3) y (4), es arilo, o es alquilo lineal, ramificado o cíclico que tienede 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente -CH2CH(CH3)2.

[0071] R3 en la realización (2), es -CH=C(CH3)2.

20

[0072] R4 en las cuatro realizaciones, es -OC(CH3)3 o -C6H5.

[0073] R5 en las realizaciones (1) y (2), es un resto que contiene tiol y R6 tiene la misma definición que anteriormente para R2 para las realizaciones (1), (2) y (4).

25 [0074] R5 y R6 en la realización (3), son iguales o diferentes, y tienen la misma definición queanteriormente para R2 para las realizaciones (1), (2) y (4).

[0075] R5 en la realización (4), tiene la misma definición que anteriormente para R2 para las 30 realizaciones (1), (2) y (4) y R6, es un resto tiol.

[0076] Las posiciones preferidas para la introducción del resto que contiene tiol son R2 y R5, siendo R2 la más preferida.

35 [0077] La cadena lateral que porta el resto tiol puede ser lineal o ramificado, aromático o heterocíclico. Un especialista en la técnica puede identificar fácilmente las cadenas laterales adecuadas. Los ejemplosespecíficos de restos tiol incluyen -(CH2)nSH, -CO(CH2)nSH, -(CH2)CH(CH3)SK-CO(CH2)nCH(CH3)SH, (CH2)nC(CH3)2SH, -CO(CH2)nC(CH3)2SH, -CONR12(CH2)nSH, -CONR12(CH2)nCH(CH3)SH, o CONR12(CH2)nC(CH3)2SH, -CO-morfolino-XSH, -CO-piperazino-XSH, -CO-piperidino-XSH, y -CO-N

40 metilpiperazino-XSH donde X es un alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene 1-10 átomos de carbono, R12 es un alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o arilosimple o sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o heterociclilo, y puede ser H, y n es un número entero de 0 a 10.

45 [0078] Los ejemplos de alquilos lineales incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo.

[0079] Los ejemplos de alquilos ramificados incluyen isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo y 1-etil-propilo.

50 [0080] Los ejemplos de alquilos cíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

[0081] Los ejemplos de arilos simples incluyen fenilo y naftilo.

[0082] Los ejemplos de arilos sustituidos incluyen arilos tales como los descritos anteriormente

55 sustituidos con grupos alquilo, con halógenos, tales como Cl, Br, F, grupos nitro, grupos amino, grupos ácido sulfónico, grupos ácido carboxílico, grupos hidroxi o grupos alcoxi.

[0083] Los ejemplos de heterociclilos son compuestos en los que los heteroátomos se seleccionanentre O, N, y S, e incluyen morfolino, piperidino, piperazino, N-metilpiperazino, pirrolilo, piridilo, furilo y

60 tiofeno.

[0084] Los taxanos que tienen un resto tiol pueden sintetizarse de acuerdo con métodos conocidos. El material de partida para la síntesis es la 10-desacetilbaccatina III disponible en el mercado. La química para introducir diversos sustituyentes se describe en varias publicaciones (Ojima et al., J. Med. Chem.

65 39:3889-3896 (1996); Ojima et al., J. Med Chem. 40: 267-278 (1997); Ojima et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96:4256-4261 (1999); patente de Estados Unidos Nº 5.475.011 y patente de Estados Unidos Nº 5.811.452).

[0085] El sustituyente R1 en el anillo fenilo y la posición del sustituyente R1 pueden variarse hasta70 obtenerse un compuesto de la toxicidad deseada. Además, el grado de sustitución en el anillo fenilo puede variarse para conseguir una toxicidad deseada. Es decir, el anillo fenilo puede tener uno o mássustituyentes (por ejemplo, mono-, di-, o tri-sustitución del anillo fenilo) lo que proporciona otro medio paraconseguir una toxicidad deseada. Un especialista en la técnica puede determinar el resto químico apropiado para R1 y la posición apropiada para R1 usando solamente experimentación rutinaria.

5 [0086] Por ejemplo, grupos aceptores de electrones en la posición meta aumentan la potencia citotóxica, mientras que no se espera que la sustitución en la posición para aumente la potencia encomparación con el taxano precursor. Típicamente, inicialmente se prepararán unos pocos taxanosrepresentativos con sustituyentes en las diferentes posiciones (orto, meta y para) y se evaluarán para lacitotoxicidad in vitro.

10 [0087] El resto tiol puede introducirse en una de las posiciones en las que ya existe un grupo hidroxilo.La química proteger los diversos grupos hidroxilo, haciendo reaccionar al mismo tiempo el deseado, se hadescrito previamente (véase, por ejemplo, las referencias citadas supra). El sustituyente se introduce convirtiendo simplemente el grupo hidroxilo libre en un éter que contiene disulfuro, un éster que contiene

15 disulfuro, o un carbamato que contiene disulfuro. Esta transformación se consigue del siguiente modo. El grupo hidroxilo deseado se desprotona por tratamiento con el reactivo disponible en el mercado hexametildisilazano de litio (1,2 equivalentes) en tetrahidrofurano a -40ºC como se describe en Ojima etal. (1999), supra. El anión alcóxido resultante después se hace reaccionar con un exceso de un compuesto dihalo, tal como dibromoetano, para dar un halo éter. El desplazamiento del halógeno con un

20 tiol (por reacción con tioacetato de potasio y tratamiento con una base suave o hidroxilamina) proporcionará el taxano que contiene tiol deseado.

[0088] Como alternativa, el grupo hidroxilo deseado puede esterificarse directamente por reacción conun haluro de acilo, tal como cloruro de 3-bromopropionilo, para dar un éster de bromo. El desplazamiento

25 del grupo bromo por tratamiento con tioacetato de potasio y procesamiento adicional como se ha descrito anteriormente proporcionará el éster de taxano que contiene tiol.

Análogos de CC-1065

30 [0089] El agente citotóxico de acuerdo con la presente invención también puede ser un análogo de CC-1065.

[0090] De acuerdo con la presente invención, los análogos de CC-1065 contienen una subunidad A y una subunidad B o B-C. Las subunidades A son CPI (unidad de ciclopropapirroloindol) en su forma35 ciclopropilo cerrada natural o en su forma clorometilo abierta, o la unidad CBI estrechamente relacionada (unidad ciclopropilbenzindol) en la forma ciclopropilo cerrada o la forma clorometilo abierta. Las subunidades B y C de los análogos de CC-1065 son muy similares y son derivados 2-carboxi-indol y 2carboxi-benzofurano. Para la actividad, los análogos de CC-1065 necesitan al menos una dicha subunidad 2-carboxi-indol o subunidad 2-carboxi-benzofurano, aunque dos subunidades (es decir, B-C)

40 vuelven al análogo más potente. Como es obvio a partir del CC-1065 natural y a partir de los análogos publicados (por ejemplo, Warpehoski et al, J. Med Chem. 31:590-603 (1988)), las subunidades B y Ctambién pueden portar diferentes sustituyentes en diferentes posiciones en los anillos indol o benzofurano.

45 [0091] Los análogos de CC-1065 que contienen un resto tiol pueden ser cualquiera de las siguientes subunidades A de fórmulas A-1 {CPI (forma ciclopropilo)}, A-2 {CPI (forma clorometilo)}, A-3 {CBI (forma ciclopropilo)}, y A-4 {CBI (forma clorometilo)} unida covalentemente mediante un enlace amida del grupoamino secundario del resto pirrol de la subunidad A con el grupo carboxi C-2 de la subunidad B defórmula F-1 o una B-C de fórmulas F-3 o F-7.

50

Subunidades A Subunidades B y B y C unidades covalentemente

imagen8

imagen1

imagen9

en las que cada Z puede ser igual o diferente y puede ser O o NH; y en las que, en la Fórmula F-1, R4 es un resto tiol, en la Fórmula F-3 uno de R o R4 es un resto tiol, en la

10 Fórmula F-7 uno de R' o R4 es un resto que contiene tiol; cuando R o R' es un resto tiol, entonces de R1 a R6, que pueden ser iguales o diferentes, son hidrógeno, alquilo lineal C1-C3, metoxi, hidroxilo, amino primario, amino secundario, amino terciario, o amido; y cuando R4 es un resto tiol, R, R1, R2, R3, R4, R5 yR6, que pueden ser iguales o diferentes, son hidrógeno, alquilo lineal C1-C3, metoxi, hidroxilo, amino primario, amino secundario, amino terciario, o amido, y R' es NH2, alquilo, O-alquilo, amino primario,

15 amino secundario, amino terciario, o amido.

[0094] En una realización preferida, R y R' son restos tiol y R1 y R2 son cada uno hidrógeno. En otra realización preferida, R y R' son restos tiol y de R1 a R6 son cada uno hidrógeno.

20 [0095] En una realización especialmente preferida, R o R4 es -NHCO(CH2)lSH-NHCOC6H4(CH2)lSH, u -O(CH2)lSH, y R' es -(CH2)lSH, -NH(CH2)lSH u -O(CH2)lSH donde l es un número entero de 1 a 10.

[0096] Los ejemplos de aminas primarias incluyen metilamina, etilamina e isopropilamina.

25 [0097] Los ejemplos de aminas secundarias incluyen dimetilamina, dietilamina y etilpropilamina.

[0098] Los ejemplos de aminas terciarias incluyen trimetilamina, trietilamina, y etil-isopropil-metilamina.

[0099] Los ejemplos de grupos amido incluyen N-metilacetamido, N-metil-propionamido, N-acetamido,30 y N-propionamido.

[00100] Los ejemplos de alquilo representados por R', cuando R' no es un grupo enlazador, incluyenalquilo lineal o ramificado C1-C5.

35 [00101] Los ejemplos de O-alquilo representados por R', cuando R' no es un grupo enlazador, incluyen compuestos en los que el resto alquilo es un alquilo lineal o ramificado C1-C5.

[00102] Los análogos de CC-1065 descritos anteriormente pueden aislarse de fuentes naturales y losmétodos para su preparación, que implican su posterior modificación, preparación sintética, o una combinación de ambos, están bien descritos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº5.475.092, 5.585.499 y 5.846.545).

Análogos de daunorrubicina/doxorrubicina

5

[00103] El agente citotóxico de acuerdo con la presente invención también puede ser un análogo de daunorrubicina o un análogo de doxorrubicina.

[00104] Los análogos de daunorrubicina y doxorrubicina de la presente invención puede modificarse 10 para que comprenden un resto tiol.

[00105] Los análogos de doxorrubicina/daunorrubicina modificados útiles en la presente invención

tienen la fórmula D1 mostrada a continuación:

imagen10

Y es O o NR2, donde R2 es alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono;R es un resto tiol, H, o alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono; y R' es un resto tiol, H, u -OR1, donde R1 es alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de

20 carbono; con la condición de que R y R' no sean reato tiol al mismo tiempo.

[00106] En una realización preferida, NR2 es NCH3. En otra realización preferida, R' es -O.

25 [00107] En una realización especialmente preferida, el resto tiol es -(CH2)nSH, -O(CH2)nSH, (CH2)nCH(CH3)SH, -O(CH2)nCH(CH3)SH, -(CH2)nC(CH3)2SH, o -O(CH2)nC(CH3)2SH, donde n es un número entero de 0 a 10.

[00108] Los ejemplos del alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono,

30 representados por R, R1, y R2, incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, y pentilo, en cualquiera de sus ocho disposiciones isoméricas.

[00109] R1 y R2 preferiblemente son metilo.

35 [00110] Los ejemplos de alquilo lineal incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo.

[00111] Los ejemplos de alquilos ramificados incluyen isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo y 1-etil-propilo.

40 [00112] Cuando R o R' no es un grupo enlazador, el sustituyente en esa posición puede variarse hasta obtener un compuesto de la toxicidad deseada. La alta toxicidad se define como que tiene una IC50 hacia células cancerosas cultivadas en el intervalo de 1 x 10-12 a 1 x 10-9 M, después de un tiempo deexposición de 72 horas. Los ejemplos representativos de sustituyentes son H, alquilo, y O-alquilo, comose ha descrito anteriormente. Un especialista en la técnica puede determinar el resto químico apropiado

45 para R y R' usando solamente experimentación rutinaria.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

[00113] Por ejemplo, se espera que los sustituyentes metilo y metoxi aumenten la potencia citotóxica, mientras que no se espera que un hidrógeno aumente la potencia en comparación con los análogos dedaunorrubicina precursores con sustituyentes en las diferentes posiciones que se prepararán inicialmentey evaluarán para la citotoxicidad in vitro.

[00114] Los análogos de doxorrubicina/daunorrubicina modificados de la presente invención, que tienenun resto tiol se describen en el documento WO 01/38318. Los análogos de doxorrubicina/daunorrubicinamodificados pueden sintetizarse de acuerdo con métodos conocidos (véase, por ejemplo, la patente deEstados Unidos Nº 5.146.064).

Análogos y derivados

[00115] Un especialista en la técnica de agentes citotóxicos entenderá fácilmente que cada uno de losagentes citotóxicos descritos en este documento pueden modificarse de tal modo que el compuestoresultante aún retenga la especificidad y/o actividad del compuesto de partida. El especialista en la técnica también entenderá que pueden usarse muchos de estos compuestos en lugar de los agentescitotóxicos descritos en este documento. Por tanto, los agentes citotóxicos de la presente invención incluyen análogos y derivados de los compuestos descritos en este documento.

EJEMPLOS

[00116] La invención se describirá ahora por referencia a los siguientes ejemplos. Salvo los ejemplos.Salvo que se especifique de otro modo, todos los porcentajes y proporciones son en volumen.

[00117] Ejemplo 1: Síntesis de ácido 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoico (NitroPPA, 8a). Un matraz de 2 cuellos de 100 l se equipó con una barra de agitación, un embudo de adición y un termómetro. Elmatraz se cargó con 1,3-dibromobutano (6) (5,2 g, 24 mmol) y dimetilsulfóxido (30 ml). El embudo deadición se cargó con una solución de cianuro sódico (1,16 g, 24 mmol) en 5 ml de agua desionizada. Loscontenidos del matraz se agitaron vigorosamente según se añadió gota a gota la solución de cianurosódico una velocidad que no permitía que la temperatura de reacción excediera de 65ºC. Después de completarse la adición, la reacción se agitó durante una noche. La mezcla se extrajo con agua desionizada (30 ml) y una solución 1:1 de acetato de etilo:hexanos (55 ml). La capa orgánica se retuvo y la capa acuosa se extrajo una segunda vez con 40 ml de acetato de etilo:hexanos 1:1. Las capasorgánicas se combinaron y se lavaron secuencialmente con agua desionizada (25 ml) y cloruro sódicoacuoso saturado (25 ml). El disolvente se retiró de la capa orgánica por evaporación rotatoria a presión reducida (1,99 kPa (15 torr)). El residuo se recogió en 15 ml de etanol de calidad reactiva y se transfirió a un matraz de 100 ml. El residuo se trató con una solución de tiourea (2,6 g, 34 mmol) en H2O (21 ml). El matraz se equipó con un condensador de reflujo y se calentó en un baño de aceite con agitación para darun reflujo suave. Después de 4 horas, se retiró el baño de aceite y el matraz se dejó enfriar a temperaturaambiente. Se añadió una solución de hidróxido sódico acuoso 10 M (25 ml) y la mezcla se calentó con un baño de aceite a un reflujo suave con agitación durante una noche. El baño de aceite se retiró y el matrazse dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución se transfirió a un embudo de decantación y se lavócon acetato de etilo (2 x 25 ml). La capa acuosa se transfirió a un matraz de 100 ml y se enfrió en un bañode hielo/agua. Se añadió acetato de etilo (40 ml) y los contenidos se agitaron rápidamente según seañadía HCl concentrado hasta que la capa acuosa estuvo a aproximadamente pH 2. La mezcla se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo. La capa orgánica se retuvo y la capa acuosa seextrajo una segunda vez con 45 ml de acetato de etilo. Las capas orgánicas que contenía el producto 7 enbruto se combinaron y se concentraron por evaporación rotatoria a temperatura ambiente hasta aproximadamente 20 ml.

[00118] Un matraz de 250 ml que contenía una barra de agitación se cargó con 2,2'-ditiobis-(5nitropiridina) (14,5 g, 47 mmol), tetrahidrofurano (170 ml) y diisopropiletilamina (12,6 ml, 72 mmol). Elmatraz se equipó con un embudo de adición que contenía la solución del ácido de tiol 7, que se añadiógota a gota durante aproximadamente 8 min. La reacción se agitó durante 1 hora adicional. El disolventese retiró por evaporación rotatoria y el residuo se recogió en un mínimo de acetato de etilo y se purificó por cromatografía en sílice. La columna se eluyó usando un gradiente por etapas, partiendo conhexanos:acetato de etilo (4:1), hasta que se retiró toda la 2,2'ditiobis-(5-nitropiridina) sin reaccionar. Lacolumna después se eluyó con hexanos:acetato de etilo 4:1 que contenía ácido acético al 2%. Lasfracciones que contenían ácido 4-(5-nitro-2-piridilditio)pentanoico se combinaron y el disolvente se retirópor evaporación rotatoria dando 8a puro (2,3 g, rendimiento global del 35%). MS (M+ + Na) 1H RMN (CDCl3) 9,26 (d, 1 H, J = 2,5 Hz), 8,39 (dd, 1 H J = 2,5, 8,9 Hz), 7,89 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 3,08 (m, 1H),2,58 (m, 2H), 1,97 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J = 6,7 Hz).

[00119] Ejemplo 2: 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoato de N-succinimidilo (1, SNPP). Un matraz de 50 ml se cargó con ácido 4-(5-nitro-2-piridilditio) pentanoico (8a, 0,51 g, 1,9 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,24 g, 2,1 mmol) y una mezcla de tetrahidrofurano:cloruro de metileno 1:1 (35 ml). Los contenidos seagitaron vigorosamente según se añadía una solución de 0,41 g de clorhidrato de 1-(3dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,41 g, 2,1 mmol) en tetrahidrofurano (5 ml). La mezcla de reacciónse agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después, el disolvente se retiró por evaporación rotatoria alvacío. El residuo se disolvió en un volumen mínimo de cloruro de metileno y se purificó por cromatografía

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

en sílice usando una fase móvil de tetrahidrofurano:hexano 1:1,5 (v/v) que contenía ácido acético al 0,5%.Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y el disolvente se retiró por evaporaciónrotatoria al vacío para dar el compuesto deseado 1. 1H RMN (CDCl3) 9,26 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 8,38 (dd, 1H, J = 2,5 y 8,9 Hz), 7,84 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 3,13 (m, 1H), 2,85 (m, 6H), 2,04 (m, 2H), 1,38 (d, 3H, J = 6,7 Hz).

[00120] Ejemplo 3. 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoato de N-sulfosuccinimidilo (2, SSNPP). Un matraz de 10 ml se cargó con ácido 4-(5-nitro-2-piridilditio)pentanoico (8a, 0,11 g, 0,41 mmol), Nhidroxisulfosuccinimida (0,83 g, 0,38 mmol), diciclohexilcarbodiimida (0,080 g, 0,39 mmol), ydimetilacetamida (1,5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche. El matraz después se enfrió en un baño de hielo durante 2 horas, y la diciclohexilurea precipitada se retiró por filtración. Se añadióacetato de etilo (45 ml) al filtrado, la suspensión resultante se agitó durante 2 min., y el precipitado se recogió por filtración. El precipitado se secó durante una noche al vacío a temperatura ambiente, lo queprodujo 0,092 g de 2 (rendimiento del 51%). MS 463,9 (M-Na+). 1H RMN (6:1 CDCl3:DMSO-d6) 8,68 (d,1H, J = 2,5 Hz), 7,93 (dd, 1H J = 2,5, 8,9 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 3,51 (dd, 1H, J = 8,8, 2,8), 2,6 (m, 5H), 1,46 (m, 2H), 0,82 (d, 3H, J = 6,7 Hz).

[00121] Ejemplo de referencia 4. Síntesis de 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB, 3a). Se preparó una solución de -tiobutirolactona (9) (3,0 g, 29,4 mmol) en tetrahidrofurano (30 ml) y agua desionizada (20 ml) en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Se añadió una solución de hidróxido sódico 5 M (9,86 ml, 49,3 mmol) al matraz de reacción; la reacción procedió en una atmósfera de argón,con agitación, a temperatura ambiente. Después de 3 h, el disolvente se retiró al vacío. Se añadieronacetato de etilo (25 ml) y agua desionizada (25 ml) al aceite en bruto resultante, y la solución resultante setransfirió a un embudo de decantación y se extrajo, guardando la fase acuosa. La fase acuosa se acidificóa pH 3 usando ácido clorhídrico concentrado y se extrajo con acetato de etilo (2 x 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro sódico saturado (10 ml) y se secaron sobresulfato sódico anhidro. La fase orgánica resultante que contenía el producto ácido 4-mercaptobutanoico10 se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

[00122] La solución de 10 se transfirió a un embudo de adición y se añadió gota a gota a una solución agitada de forma magnética de disulfuro de 2,2'-dipiridilo (9,0 g, 41 mmol) en 50 ml de alcohol etílico quecontenía 1 ml de ácido acético. Después de 3 h, el disolvente se retiró por evaporación rotatoria al vacío,después el residuo se recogió en un volumen mínimo de acetato de etilo y se purificó por cromatografíaen sílice usando una fase móvil de hexanos:acetato de etilo:ácido acético (2:1:0,02, v/v/v). Las fraccionesque contenían el producto puro se combinaron y el disolvente se retiró al vacío para dar ácido 4-(2piridilditio)butanoico (11a) (5,1 g, rendimiento del 70%). 1H RMN (CDCl3):  2,00-2,09 (2H, m), 2,46-2,55(2H, m), 2,74 (1H, t, J = 7,0), 2,86 (1H, t, J = 7,0) 7,62-7,71 (1H, m), 7,71-7,78 (1H, m), 8,48-8,51 (1H, m),11,8 (1H, s a).

[00123] El compuesto 11a (1,10 g, 4,8 mmol) y N-hidroxisuccinimida (0,64 g, 5,5 mmol) se disolvieron en diclorometano (50 ml). La solución se agitó de forma magnética según se añadía 1-[3(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (1,05 g, 5,5 mmol). Después de 2 h, se añadió acetato de etilo(150 ml) y la solución se transfirió a un embudo de decantación y se lavó consecutivamente con HCl 0,5M (30 ml) y cloruro sódico saturado (20 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, y después el disolvente se retiró al vacío. El residuo se recogió en un volumen mínimo de acetato de etilo y se purificó por cromatografía en sílice usando una fase móvil de hexanos:acetato de etilo:ácido acético (2,5:1:0,02, v/v/v). Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y el disolvente se retirópara dar 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB, 3a) (1,2 g, rendimiento del 76%). 1H RMN (CDCl3):  2,12-2,19 (2H, m), 2,78-2,87 (6H, m), 2,91 (2H, t, J = 7,0), 7,06-7,12 (1H, m), 7,62-7,71 (2H, m), 8,48 (1H, d, 4,4 Hz). MS (M + Na+) Encontrado: 348,8 Calculado: 349,4.

[00124] Ejemplo 5. Síntesis de 4-(5- nitro-2-piridilditio)butanoato de N-sulfosuccinimidilo (SSNPB, 3c). Una solución del ácido mercapto-carboxílico 10 (8,0 mmol) en acetato de etilo (10 ml) setransfirió a un embudo de adición y se añadió gota a gota a una solución en agitación de 2,2'-ditiobis(5nitropiridina) (3,0 g, 9,7 mmol) en tetrahidrofurano (50 ml) y 4-metilmorfolina (2,5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de decantación de 250 mly se trató con una solución de yodo (1,6 g) en acetato de etilo (100 ml). Los contenidos se agitaronvigorosamente durante 5 min., se diluyeron con hexano (40 m), y después se extrajeron con bicarbonatosódico acuoso saturado (2 x 70 ml). La capa acuosa combinada se acidificó con HCl 1 M y se extrajo conacetato de etilo (80 ml). La capa de acetato de etilo se separó y se secó sobre sulfato sódico, y se filtró. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en sílice usando una fase móvilcompuesta por acetato de etilo:hexanos:ácido acético (85:12:3, v/v/v). Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y el disolvente se retiró al vacío para dar el producto ácido 4-(5-nitro-2piridilditio)butanoico, 11b (rendimiento del 61%). 1H RMN (CDCl3):  1,87-1,93 (2H, m), 2,43-2,54 (2H, m), 2,82-2,92 (2H, m), 7,89-7,92 (1H, m), 8,34-8,43 (1H, m), 9,23 (1H, s).

[00125] El análisis de HPLC usando una columna C18 en fase inversa de Hewlett Packard (100 x 4,6mm), eluyendo con un gradiente lineal de acetonitrilo-H2O (acetonitrilo al 20% a acetonitrilo al 90% en 10min.) indicó que el producto, que eluía con un tiempo de retención de 5,1 min., tenía una pureza de >98%.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

[00126] Una solución de 11b (200 mg, 0,73 mmol), sulfo-N-hidroxisuccinimida (180 mg, 0,81 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (175 mg, 0,85 mmol) en dimetilformamida (4,5 ml) se agitó durante una noche atemperatura ambiente. Se retiró aproximadamente ½ del disolvente por evaporación rotatoria al vacío y elprecipitado resultante se retiró por filtración. El filtrado se trató con 2-propanol (17 ml) que se habíaenfriado a 4ºC. El precipitado se recogió por filtración al vacío y se lavó con éter etílico (6 ml) a 4ºC. El disolvente residual se retiró al vacío para dar 207 mg (rendimiento del 60%) del producto 3c. MS (M +Na+) Encontrado: 523,9 Calculado: 523,9, Ion Neg Encontrado: 478,0 Calculado: 478,0.

[00127] Ejemplo 6. Ácido 4-mercapto-4-metilpentanoico (14): Un matraz de 500 ml se equipó con una barra de agitación y un embudo de adición de 150 ml. El sistema se puso en una atmósfera de argón, y se cargó con tetrahidrofurano anhidro (150 ml) y n-BuLi 2,5 M (75 ml, 18,7 mmol) en hexanos (18,7mmol). La solución se enfrió a -78ºC usando un baño de hielo seco/acetona. Se añadió gota a gotaacetonitrilo (7,3 g, 9,4 ml, 18 mmol) mediante una jeringa durante aproximadamente 5 min. La reacción seagitó durante 30 min., mientras se formaba el precipitado blanco de litio-acetonitrilo. Se disolvió sulfuro deisobutileno (12), (15 g, 17 mmol) en 100 ml de THF anhidro y se añadió gota a gota durante aproximadamente 30 min. mediante el embudo de adición. El baño de refrigeración se retiró y la reacciónse dejó en agitación durante 3 horas. El matraz se enfrió en un baño de hielo/agua según se añadía gotaa gota HCl 0,5 M (38 ml). La capa de THF se retuvo y la capa acuosa se lavó dos veces con 75 ml de acetato de etilo. Las capas de THF y acetato de etilo se combinaron, se secaron sobre aproximadamente20 g de sulfato sódico anhidro y se transfirieron a un matraz de 250 ml. El disolvente se retiró por evaporación rotatoria al vacío para dar 13 en bruto. Se añadió etanol (30 ml), y los contenidos se agitaronsegún se añadía lentamente una solución de NaOH (8,0 g) en agua desionizada (30 ml). El matraz seequipó con un condensador de reflujo y se puso en una atmósfera de argón. La reacción se calentó areflujo durante una noche y después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió agua desionizada (60ml) y la mezcla se lavó con acetato de etilo:hexanos 2:1 (v/v) (2 x 25 ml). La capa acuosa se acidificó a pH 2 con HCl concentrado, y después se extrajo con acetato de etilo (3 x 75 ml). Las capas orgánicas sesecaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron, y el disolvente se retiró por evaporación rotatoria alvacío para dar 10 g de producto 14 (rendimiento del 39%). El producto se usó sin purificación adicional. 1H RMN (CDCl3):  1,38 (6H, s), 1,87-1,93 (2H, m), 2,08 (1H, s), 2,51-2,57 (2H, m).

[00128] Ejemplo 7. Síntesis de ácido 4-metil-4-(5-nitro-2-piridilditio)pentanoico (15a). El concentrado que contenía 14 (18 mmol) se transfirió a un embudo de adición y se añadió gota a gota a una solución en agitación de 2,2'-ditiobis(5-nitropiridina) (10,6 g, 34 mmol) en una mezcla de tetrahidrofurano (50 ml), dimetilformamida (150 ml) y 4-metil-morfolina (5,4 g, 53 mmol) La mezcla de reacción se agitó de forma magnética durante una noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se recogió en 200 ml de acetato de etilo y se filtró al vacío para retirar el material que no se disolvió. Elfiltrado se lavó tres veces con HCl 1 M (3 x 50 ml). El disolvente se retiró al vacío y después el residuo sepurificó por cromatografía en sílice usando una fase móvil compuesta por acetato de etilo:hexanos:ácidoacético (85:12:3, v/v/v). Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y el disolvente seretiró por evaporación rotatoria al vacío para dar 4,1 gramos de producto 15a. 1H RMN (CDCl3):  1,38 (6H, s), 1,87-1,93 (2H, m), 2,59-2,63 (2H, m), 7,89-7,92 (1H, m), 8,34-8,43 (1H, m), 9,23 (1H, s).

[00129] Ejemplo 8. Síntesis de sulfo-N-succinimidil-4-metil-4-(5-nitro-2-piridilditio)pentanoato (4b). Una solución de 15a (0,25 g, 0,83 mmol), sulfo-N-hidroxisuccinimida (0,19 g, 0,86 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (0,19 g, 0,922 mmol) en dimetilformamida (5 ml) se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Aproximadamente ½ del disolvente se retiró por evaporación rotatoria al vacío y el precipitado que se formó se retiró por filtración. El filtrado se trató con 2-propanol (20 ml que se habíanenfriado a 4ºC). El precipitado se recogió por filtración al vacío y se lavó con éter etílico enfriado en hielo (15 ml). El disolvente residual se retiró al vacío para dar el producto deseado 4b (240 mg, rendimiento del 58%). MS (M + Na+) Encontrado: 496,0 Calculado 496,0. MS (M-- Na+): Encontrado 450,1 Calculado. 450,0.

[00130] Ejemplo 9. Síntesis de ácido 4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2-piridilditio)butanoico (17a). Una solución de ácido 6-6'-ditiodinicotínico (16a) (1,6 g, 5,18 mmol) en diclorometano seco (10 ml) y dimetilformamida (4 ml) se preparó en un matraz de reacción de fondo redondo y se trató secuencialmente con clorhidrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC-HCl) (2,5 g, 12,9 mmol), dimetilamina (2,1 g, 26 mmol) y 4-metilmorfolina (1,63 g, 12,9 mmol). La reacción se dejó procedercon agitación a temperatura ambiente durante 2 h, tiempo después del cual la reacción parecía completadespués del análisis por TLC analítica, eluyendo en diclorometano:metanol:ácido acético (93,9:6:0,1, v/v/v) que indicó que el material de partida 16a se había convertido completamente en el derivado dimetilamida. La mezcla de reacción se trató con una mezcla de 2:1 de acetato de etilo/hexanos (15 ml) y se lavó secuencialmente usando tampón fosfato potásico 50 mM, pH = 6 (10 ml) y una solución de clorurosódico saturado (5 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. La evaporación deldisolvente dio un residuo bruto. El producto se purificó por cromatografía en sílice, eluyendo en una mezcla de diclorometano:metanol (95:5 v/v respectivamente). Las fracciones que contenían el producto se combinaron; el disolvente se retiró al vacío para dar 16b en forma de un sólido amarillo (rendimiento del 35%). MS: m/z: Encontrado: 385,0 (M + Na+); Calculado: 385,0. 1H RMN (CDCl3):  2,9 (6H, d, J = 35), 7,6 (2H, dd, J = 35 Hz y 10 Hz), 8,5 (1H, s).

5 10 15 20 25

30 35 40 45 50 55 60 65

[00131] Una solución de 10 (0,54 g, 4,5 mmol) en acetato de etilo (11,5 ml) se añadió gota a gota en unmatraz de reacción que contenía 16b (2,6 g, 7 mmol) y 4-metilmorfolina (1,63 g, 16 mmol). La reacción sepuso en una atmósfera de argón, con agitación, a temperatura ambiente durante 2 h, y el volumen dereacción después se concentró por evaporación rotatoria para producir un aceite amarillo en bruto. Elproducto se purificó por cromatografía en sílice, eluyendo en una mezcla 96:6:1 (diclorometano:metanol:ácido acético, v/v respectivamente). La adición de tolueno durante la evaporaciónrotatoria a alto vacío produjo el producto ácido 4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2-piridilditio)butanoico (17a) (rendimiento del 76%). MS: m/z: Encontrado 322,9 (M + Na+); Calculado: 323,0.

[00132] Ejemplo 10. Síntesis de 4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2-piridilditio)butanoato de Nsuccinimidilo (5a). Se preparó una solución de 17a (0,86 g, 2,86 mmol) en diclorometano (30 ml) en un matraz de reacción de fondo redondo y se trató secuencialmente con clorhidrato de 1-[3(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (0,82 g, 4,3 mmol) y N-hidroxi succinimida (0,49 g, 4,3 mmol). Lareacción procedió en una atmósfera de argón, con agitación, a temperatura ambiente durante dos horas. El análisis por TLC analítica eluyendo en una mezcla de diclorometano:metanol:ácido acético (93,9:6:0,1, v/v/v) mostró que 17a se había convertido completamente en el éster de succinimida 5a. Se añadió acetato de etilo (40 ml) a la mezcla de reacción, las fases orgánicas combinadas se lavaron usandotampón fosfato potásico 50 mM (2 x 30 ml) a pH= 6, y una vez usando una solución de cloruro sódicosaturado (15 ml). La fase orgánica resultante se secó sobre sulfato sódico anhidro y el volumen se redujoal vacío. Una parte del material en bruto se purificó por TLC preparatoria, eluyendo en una mezcla de diclorometano:metanol:ácido acético (93:6:1, v/v/v). El producto deseado se extrajo de la sílice usandouna mezcla 90:10 (diclorometano:metanol) para producir el agente modificador purificado 5a (rendimiento del 14%). MS: m/z: Encontrado 420,0 (M + Na+); Calculado: 420,0

[00133] Análisis de HPLC: La pureza se determinó por análisis de HPLC usando una columna C-18 analítica Vydac (longitud: 100 mm, i.d.: 4,6 mm, tamaño de partícula: 3 micrómetros) a un caudal de 1,5ml/min eluyendo en un gradiente lineal de agua y acetonitrilo del siguiente modo:

Tiempo (min) % de agua % de acetonitrilo

0

80 20

20

50 50

25

0 100

[00134] En estas condiciones, 5a eluía con un tiempo de retención de 7,68 min. y la pureza era del 94,9%.

[00135] Ejemplo 11 Síntesis de 4-(5-N,N-dimetilcarboxamido-2-piridilditio)butanoato de sulfo-Nsuccinimidilo (5b). Se preparó una solución de 17a (0,86 g, 2,86 mmol) en dimetilformamida destilada envidrio (30 ml) en un matraz de reacción de fondo redondo y se trató con sulfo-N-hidroxisuccinimida (0,63g, 2,9 mmol). Se preparó una solución de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (0,65 g, 3,2 mmol) en dimetilformamida destilada en vidrio (10 ml) y se añadió al matraz de reacción. La reacción procedió en una atmósfera de argón, con agitación, a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción marrón resultante se filtró usando papel de filtro grueso al vacío; la torta de filtro se lavó una vez usando dimetilformamida destilada en vidrio (5 ml). El éster de sulfosuccinimida 5b se precipitó usandonueve volúmenes de isopropanol, añadido lentamente con agitación. El precipitado resultante se filtró y se transfirió a un pre-alquitranado para producir 5b en forma de un polvo blanco (rendimiento del 47%). MSm/z: encontrado 521,9 (M + Na+); Calculado: 522.

[00136] Análisis de HPLC: La pureza se determinó por análisis de HPLC usando una columna C-18analítica Vydac (longitud: 100 mm, i.d.: 4,6 mm, tamaño de partícula: 3 micrómetros) a un caudal de 1,5 ml/min eluyendo en un gradiente lineal de agua y acetonitrilo, yendo de acetonitrilo al 20% a acetonitrilo al50% durante 20 min. En estas condiciones, 5b eluyó con un tiempo de retención de 7,48 min. y la pureza era de >90%.

[00137] Ejemplo 12: Síntesis de conjugado. Se disolvió enlazador SPP o SSNPP en etanol a una concentración de aproximadamente 10 mM. El anticuerpo se dializó en tampón A (KPi 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5). Para la reacción del enlazador, el anticuerpo estaba a 8 mg/ml, y se añadieron7 equivalentes del enlazador agitando al mismo tiempo en presencia de etanol al 5% (v/v). La reacción sedejó proceder a temperatura ambiente durante 90 minutos. El enlazador sin reaccionar se retiró delanticuerpo por filtración en gel Sephadex G25 usando una columna Sephadex G25 equilibrada con tampón A a pH 6,5 o tampón fosfato potásico 150 mM que contenía NaCl 100 mM, pH 7,4 como se indica.Para el enlazador SPP, el grado de modificación se evaluó por liberación de piridina-2-tiona usando DTT 50 mM y midiendo la absorbancia a 343 nm como se describe a continuación (343 = 8080 M-1 cm-1 parapiridina-2-tiona libre). Para SSNPP, la modificación se evaluó directamente midiendo la absorbancia a 325nm (325 = 10.964 M-1 cm-1 para el grupo 4-nitropiridil-2-ditio unido a anticuerpo). Para la reacción de conjugación, el fármaco que contenía tiol (DM1 o DC4) se disolvió en DMA (N,N-dimetilacetamida) a unaconcentración de aproximadamente 10 mM. El fármaco (exceso molar de 0,8 - 1,7 veces con relación a lacantidad de moléculas enlazadoras por anticuerpo como se indica) se añadió lentamente con agitación alanticuerpo que estaba a una concentración de 2,5 mg/ml en tampón A (pH 6,5 o pH 7,4) en unaconcentración final del 3% (v/v) de DMA. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante los tiempos indicados. El anticuerpo conjugado con fármaco se purificó usando una columna Sephadex

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

G25 equilibrada con tampón B (PBS, pH 6,5). Para DML, el grado de conjugación de fármaco al anticuerpo se evaluó midiendo la A252 y A280 del conjugado como se describe a continuación. Se usó unenfoque similar para DC4 (véase a continuación).

[00138] Medición de la concentración de piridina-2-tiona liberable y de Ab del Ab modificado con SPP. La proporción molar de piridina-2-tiona liberada por mol de anticuerpo se calcula midiendo la A280 de la muestra y después el aumento en la A343 de la muestra después de añadir DTT (50 l de DTT 1 M/ml demuestra). La concentración de piridina-2-tiona liberada por DTT se calcula usando una 343 de 8080 M1cm-1. La concentración de anticuerpo después puede calcularse usando una 280 de 194.712 M-1cm-1 después de sustraer la contribución de la absorbancia de la piridina-2-tiona a 280 nm (A343nm post DTT x 5100/8080) de la A280nm total medida antes de la adición de DTT. Después puede calcular la proporciónmolar de piridina-2-tiona:Ab. La concentración en mg/ml (g/l) de Ab se calcula usando un peso molecularde 147.000 g/mol.

[00139] Medición de la concentración de grupos 5-nitropiridil-2-ditio unidos al anticuerpo y de Ab del Ab modificado con SSNPP. La proporción molar de los grupos 4-nitropiridil-2-ditio unidos por mol de anticuerpo se calcula midiendo la A280 y A325 de la muestra sin tratamiento con DTT. La cantidad de grupos 4-nitropiridil-2-ditio unidos por el anticuerpo se calcula usando una 325nm de 10.964 M-1cm-1. La concentración de anticuerpo después puede calcularse usando una 280nm de 194.712 M-1cm-1 después de sustraer la contribución de la absorbancia del grupo 5-nitropiridil-2-ditio a 280 nm (A325nm x 3344/10964) de la A280nm total medida. Después puede calcularse la proporción molar de los grupos 4-nitropiridil-2ditio:Ab. La concentración en mg/ml (g/l) de Ab se calcula usando un peso molecular de 147.000 g/mol.

[00140] Cálculo de las concentraciones del componente Ab y DM1 de Ab-DM1. El Ab y DM1 ambosabsorben a los dos longitudes de onda usadas para medir cada componente por separado, es decir, 280 y 252 nm. Los componentes se cuantifican usando las siguientes expresiones algebraicas que representanla contribución de cada componente a cada longitud de onda (CAb es la concentración molar de Ab y CD es la concentración molar de DM1): 1) A280 Total =194.712CAb + 5.700CD 2) A252 Total = (194.712 x 0,37)CAb+ (4,7 x 5.700) CD

[00141] 1a)

Cada ecuación se resuelve para CAb: CAb= A280 - 5.700CD

194.712

2a)

CAb= A252 - 26.790CD

72.043

y se establece una igualdad (ecuación 1a = ecuación 2a) y se resuelve para CD:

CD= A252 - 0,37A280

24.681

[00142] Una vez se ha calculado CD, el valor se usa para resolver CAb en la ecuación 1a (o 2a) anterior. Después puede calcularse la proporción DM1:Ab. La concentración en mg/ml (g/l) del anticuerpo se calcula usando un peso molecular de 147.000 g/mol y la concentración de DM1 se calcula usando unpeso molecular de 736,5 g/mol (DM1 unido).

[00143] La eficacia del intercambio de disulfuro se aumenta con SSNPP. Como se muestra en la Tabla 1, la eficacia de la conjugación se potencia en reacciones en las que se usa SSNPP como reticulante encomparación con reacciones que usan SPP. El porcentaje de eficacia se calculó dividiendo el valor paraDM1 por anticuerpo por la proporción de enlazador por anticuerpo por 100. Las conjugaciones del anticuerpo N901 usando SSNPP produjeron eficacias de entrecruzamiento del 93% a ambos pH 6,5 y 7,4.La eficacia de la conjugación de N901 con SPP en estos experimentos fue del 70% a pH 6,5 y del 77% a pH 7,4. La eficacia aumentada con SSNPP demuestra que puede conseguirse una proporción diana deDM1 a anticuerpo usando un anticuerpo que está modificado con una cantidad reducida de moléculasenlazadoras. De hecho, se consiguió una proporción similar de fármaco a anticuerpo (4,3) en el conjugado final con una preparación de anticuerpo que tenía 4,2 grupo (5-nitropiridil-2-ditio) poranticuerpo introducidos con SSNPP en comparación con un anticuerpo que tenía 5,6 grupos piridil-2-ditio introducidos con SPP (Tabla 2). La cantidad de fármaco necesaria para obtener resultados de conjugación comparables fue, por lo tanto, un 25% inferior para el anticuerpo modificado con SSNPP que para el anticuerpo modificado con SPP en estas condiciones. Un beneficio potenciar adicional de laeficacia aumentada con SSNPP es que puede usarse un exceso molar reducido de DM1 en la reacciónde conjugación. Una comparación de las proporciones de DM1 por anticuerpo después de la conjugación con un intervalo de equivalentes de fármaco en la reacción (exceso de 0,8 - 1,7 veces) muestra que unexceso molar de 1,1 veces es suficiente para conseguir una eficacia de conjugación del 100% usando elreticulante SSNPP (Figura 7). Se muestra una comparación del transcurso del tiempo de la reacción deDM1 con anticuerpo que se ha modificado con SSNPP o SPP en la Figura 8. En cada caso, el anticuerpomodificado se trató con un exceso molar de 1,1 veces de DM1 por mol de enlazador incorporado. La reacción con el anticuerpo modificado con SSNPP es considerablemente más rápida que con el anticuerpo modificado con SPP (Figura 8). Incluso un exceso molar de 1,7 veces no es suficiente paraconseguir una eficacia similar usando SPP. La capacidad de usar 1) un exceso molar inferior de DM1 y 2)menos enlazadores por anticuerpo permite una reducción en la cantidad de fármaco necesaria para

5 conseguir una proporción diana de DM1 a anticuerpo en como mucho un 50% cuando se usa SSNPP como reticulante en lugar de SPP.

[00144] La eficacia aumentada de conjugación usando el enlazador SSNPP se consigue sin comprometer el carácter monomérico del conjugado y la cantidad de fármaco no conjugado (libre)10 asociado con el conjugado de anticuerpo. Se usa análisis SEC para determinar la cantidad de monómero, dímero, trímero, o agregados de mayor peso molecular. Se obtuvieron resultados típicos de más del 90%de monómero con cualquier enlazador como se muestra en la Tabla 1. El nivel de fármaco no conjugadose midió por análisis de HPLC de fase inversa de la muestra de conjugado. El porcentaje de fármaco librepara cualquier reacción fue menor del 2%. Además, son posibles tiempos de reacción de conjugación15 más cortos con SSNPP en comparación con SPP (5), lo que puede disminuir la pérdida de algunos anticuerpos que son sensibles a una exposición prolongada al disolvente orgánico necesario en la reacción de conjugación. Tiempos de reacción más cortos deben disminuir la pérdida de fármaco debido ala dimerización de DM1, que es una reacción secundaria competitiva durante la conjugación. Los aumentos resultantes en el rendimiento y las reacciones secundarias reducidas deben contribuir

20 adicionalmente a necesidades reducidas de DM1.

[00145] La velocidad y eficacia potenciadas de conjugación cuando se usa SSNPP también se observaron cuando se conjugaba un fármaco diferente con el anticuerpo, lo que demuestra la ampliaaplicabilidad de este nuevo reactivo enlazador. Se muestra una comparación de las eficacias de25 conjugación usando SSNPP y SPP cuando se conjuga el anticuerpo N901 con el fármaco alquilante de ADN, DC4, un análogo de CC-1065, en la Tabla 3. En 2 horas, la reacción que usa el reactivo reticulanteSSNPP se había completado mientras que la reacción que usa el reactivo SPP mostró solamente un 73% de completitud en 2 horas y una incorporación significativa de fármaco más allá de 2 horas (el 91%después de 18 horas). Sólo tiempos de reacción muy prolongados pueden conducir a una completitud del

30 100%.

[00146]

Tabla 1. Comparación del enlazador SSNPP y SPP en la conjugación del anticuerpo N901 con DM1. La 35 conjugación se realizó durante 2 horas al pH indicado usando un exceso molar de 1,7 veces de DM1 por enlazador.

Enlazador

pH Enlazador /Ab DM1 /Ab % Eficacia % fármaco libre Análisis SEC

Monómero

Dímero Trímero HMW

SSNPP

7,4 4,1 3,8 93 0,8 91,9 6,3 0,6 0,1

SPP

7,4 5,6 4,3 77 1,8 93,6 4,9 0,4 0,2

SSNPP

6,5 4,0 3,7 93 0,9 - - - -

SPP

6,5 6,6 4,6 70 1,9 - - - -

[00147]

40

Tabla 2. Proporción reducida de enlazador a anticuerpo necesaria para alcanzar la proporción diana deDM1 a anticuerpo ratio con SSNPP como enlazador. La conjugación se realizó durante 2 horas a pH 7,4 usando un exceso molar de 1,1 veces de DM1 por enlazador.

45

Enlazador

Enlazador/Ab DM1/Ab

SSNPP

4,2 4,3

SPP

5,6 4,3

[00148]

Tabla 3. Comparación del enlazador SSNPP y SPP en la conjugación del anticuerpo N901 con DC4. La conjugación se realizó durante el tiempo indicado a pH 7,4 usando un exceso molar de 1,4 veces de DC4 50 por enlazador.

Enlazador

Tiempo, h Enlazador/Ab DC4/Ab % eficacia

SSNPP

2 4,2 4,3 102

SSNPP

18 4,2 4,1 98

SPP

2 5,6 4,1 73

SPP

18 5,6 5,1 91

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte deldocumento de patente europea. Aunque se ha tomado especial cuidado en la compilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

10  US 60403652 B [0001] US 4563304 A [0004]  US 5208020 A [0005] [0058]  US 5416064 A [0005] [0058]  US 6340701 B1 [0036]

15  US 5846545 B1 [0036]  US 5585499 B1 [0036]  US 5475092 B1 [0036]  US 5414064 B1 [0036]  US 5208020 B1 [0036]

20  US 4563304 B1 [0036]  US 5639641 A [0039]  US 5885793 A, Griffiths [0040]  WO 9201047 A, McCafferty [0040]  WO 9906587 A, Liming [0040]

25  US 4256746 A [0056]  US 4361650 A [0056]  US 4307016 A [0056]  US 4294757 A [0056]  US 4424219 A [0057]

30  US 4331598 A [0057]  US 4450254 A [0057]  US 4364866 A [0057]  US 4313946 A [0057]  US 4315929 A [0057]

35  US 4362663 A [0057]  US 4322348 A [0057]  US 4371533 A [0057]  US 5475011 A [0084]  US 5811452 A [0084]

40  US 5475092 A [0102]  US 5585499 A [0102]  US 5846545 A [0102]  WO 0138318 A [0114] US 5146064 A [0114]

45

Documentos no de patentes citados en la descripción

 J. Carlsson et al. Biochem. J., 1978, vol. 173, 723-737 [0004] [0036]  Goff D. A. ; Carroll, S. F. BioConjugate Chem., 1990, vol. 1, 381-386 [0004]

50  L. Delprino et al. J. Pharm. Sci., 1993, vol. 82, 506-512 [0004] [0036]  S. Arpicco et al. BioConjugate Chem, 1997, vol. 8, 327-337 [0004]  R.V.J. Chari et al. Cancer Res., 1992, vol. 52, 127-131 [0005]  R.V.J. Chari et al. Cancer Research, 1992, vol. 52, 127-131 [0036]  R.V.J. Chari et al. Cancer Research, 1995, vol. 55, 4079-4084 [0036]

55  Goff D. A. ; Carroll, S. F. 1. BioConjugate Chem., 1990, 381-386 [0036]  S. Arpicco et al. Bioconjugate Chem, 1997, vol. 8, 327-337 [0036]  Parham. J. Immunol., 1983, vol. 131, 2895-2902 [0039]  Spring et al. J. Immunol., 1974, vol. 113, 470-478 [0039]  Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys., 1960, vol. 89, 230-244 [0039]

60  Burgess. Immunology Today, 1984, vol. 5, 155-158 [0039]  O’Keefe et al. J. Biol. Chem., 1985, vol. 260, 932-937 [0039]  Roy et al. Blood, 1991, vol. 77, 2404-2412 [0042]  Nadler et al. J. Immunol., 1983, vol. 131, 244-250 [0042]  Roy et al. J. Nat. Cancer Inst., 1996, vol. 88, 1136-1145 [0042]

65  Ojima et al. J. Med. Chem., 1996, vol. 39, 3889-3896 [0084]  Ojima et al. J. Med Chem., 1997, vol. 40, 267-278 [0084]  Ojima et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, vol. 96, 4256-4261 [0084] Warpehoski et al. J. Med Chem., 1988, vol. 31, 590-603 [0090]

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular y uno o másfármacos de molécula pequeña, en el que dicho conjugado está representado por la fórmula (V): imagen1

   5

   en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeñaunido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilolineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método:

   10 (1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I):

   imagen1

   en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (III):

   imagen1

   en la que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y

   (2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) con uno o más fármacos de molécula pequeña que 20 comprenden un grupo tiol libre.
2. 2.

   25 en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilolineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método:

   (1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (II):

   imagen2

   imagen1

   en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n

   -M+

   propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (IV):

   imagen1

   en la que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y

   (2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IV) con uno o más fármacos de molécula pequeñaque comprenden un grupo tiol libre.

   10
3. 3.

   15 en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilolineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método: hacer reaccionar un compuesto de fórmula (III) imagen1

   20

   en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a10 o más, con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.

   25
4. 4.

   en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña

   30 unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 - 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método: hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IV):

   imagen2

   imagen2

   imagen1

   en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a10 o más, con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.

   imagen3

   en la que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o10 cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales

   o diferentes y son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y esNO2 Z no sea H.

   15

   imagen4

   en la que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado ocíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales

   o diferentes y son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y esNO2 Z no sea H.

   imagen5

   en la que CB representa un agente de unión celular, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a 10 o más, que comprende hacer reaccionar el agente de unión celular, CB, con un reticulante de fórmula (I):

   imagen6
5. 8. Un método para preparar un compuesto de fórmula (IV):

   en la que CB representa un agente de unión celular, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H,metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o unnúmero entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H,

   10 metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a 10 o más, que comprende hacer reaccionar el agente de unión celular con unreticulante de fórmula (II):
6. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7, 8, en el que el agente de unión celular es un20 anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
7. 11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fármaco de molécula pequeña esun agente citotóxico.

   25 12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fármaco de molécula pequeña es al menos un miembro seleccionado entre el grupo compuesto por un compuesto de maitansinoide, un compuesto de taxano, un compuesto de CC-1065, un compuesto de daunorrubicina, un compuesto de doxorrubicina, y análogos o derivados de los mismos.

   30 13. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que tanto R como R1 son H

   o metilo, o uno de R y R1 es H y el otro es metilo.
8. 14. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que n es 1, R1 es metilo, y R, R2 y R3 son H.

   35
9. 15. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que n es 1, y R, R1, R2 y R3 son H.
10. 16. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que n es 1, y R y R1 son40 ambos metilo, y R2 y R3 son ambos H.