DE102005051976B4

DE102005051976B4 - Kit für hoch-sensitive Nachweisassays

Info

Publication number: DE102005051976B4
Application number: DE102005051976A
Authority: DE
Inventors: Steffen Dr.rer.nat. Bade; Niels Dr.rer.nat. Röckendorf; Milan Dr.Sc. Fránek; Hans-Heiner Dr.rer.nat. Gorris; Andreas PD Dr.-Ing. Frey
Original assignee: VYZKMNY USTAV VETERINARNIHO LE; Vyzkmny Ustav Veterinarniho Lekarstvi; Forschungszentrum Borstel Zentrum fuer Medizin und Biowissenschaften
Current assignee: VYZKMNY USTAV VETERINARNIHO LE; Vyzkmny Ustav Veterinarniho Lekarstvi; Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2025-11-01
Also published as: WO2007051603A2; WO2007051603A3; DE102005051976A1; EP1971864A2; US20090104633A1

Abstract

Kit umfassend
Mindestens eine Markierungsverbindung, gekennzeichnet durch Formel (I)

die in Wasser stabil und löslich ist, wobei der „Spacer" 1 bis 25 gleiche oder verschiedene geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Saccharide oder aus der folgenden Gruppe ausgewählte Reste umfasst:

wobei X -O- oder -S- ist und n eine ganze Zahl im Bereich zwischen 1 und 10 ist,
wobei RG aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist

wobei R gleiche oder verschiedene Reste aus der folgenden Gruppe sind:
-H, linearer, verzweigter oder zyklischer Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, linearer oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, geschütztes oder ungeschütztes Amin,
ferner umfassend einen Antikörper, monovalentes Fab- oder divalentes (Fab)₂-Fragment, der/das geeignet ist, an die Markierungsverbindung zu binden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kits umfassend neue 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate sowie Antikörper, die an diese Derivate binden. Die Kits lassen sich unter anderem zur Markierung von Biomolekülen in analytischen und diagnostischen Anwendungen verwenden. Ein Teil der hier beschriebenen Verbindungen ermöglicht Markierungen von Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen und ohne in situ Aktivierung anwenden zu müssen. Außerdem verbessert das Vorhandensein von Abstandhaltern innerhalb der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate ihre Bindung an Antikörper.
Hintergrund der Erfindung:
Techniken und Anwendungen analytischer und diagnostischer Verfahren entwickeln sich schnell. Im Rahmen der meisten derzeitigen Verfahren ist der Nachweis von Substrat-Molekülen von entscheidender Bedeutung. Es existieren verschiedene Verfahren, um Nachweisassays durchzuführen, z. B. das Biotin/Streptavidin-System oder Varianten davon (Symons RH, 1990, US 4898951 A , Compounds used as intermediates in the preparations of nonradioactive biological grobes; Boehringer Mannheim GmbH, 1993, US 5219764 A , Hapten-biotin conjugates and their use) oder Digoxigenin/Antikörper-basierte Ansätze (Boehringer Mannheim GmbH, 1990, DE 3836656 A1 , Neue Digoxigenin-Derivate und ihre Verwendung). Wegen der insgesamt großen Bedeutung von Substrat-Nachweisassays und des häufigen Bedarfs an Mehrfach-Markierungen im Verlauf von Verfahren, die bei gegenwärtigen Analytica und Diagnostika zum Einsatz kommen, ist es notwendig, neue Kits für Nachweisassays zu entwickeln.
Gegenüber dem Stand der Technik stellt sich daher die Aufgabe neue Kits zum Nachweis von Substatmolekülen, wie z. B. Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nukleotiden, Nukleinsäuren, Lipiden oder Sacchariden, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Kits umfassend mindestens eine Markierungsverbindung der Formel (I)
die in Wasser stabil und löslich ist, wobei der „Spacer" 1 bis 25 gleiche oder verschiedene geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Saccharide, Polyole oder aus der folgenden Gruppe ausgewählte Reste umfasst:
wobei X -O- oder -S- ist und n eine ganze Zahl im Bereich zwischen 1 und 10 ist,
wobei RG aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
wobei R jeweils gleiche oder verschiedene Reste aus der folgenden Gruppe sind:
Wasserstoff, linearer, verzweigter oder cyclischer Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, linearer oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, geschütztes oder ungeschütztes Amin,
wobei die Kits ferner einen Antikörper, monovalentes Fab- oder divalentes (Fab)₂ umfassen, der/das geeignet ist, an die Markierungsverbindung zu binden.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der von einem Hybridom produziert wird, das erhältlich ist gemäß dem Verfahren von Franek et al. (Franek M, Kolar V, Granatova M, Nevorankova Z (1994). Monoclonal ELISA for 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid: Characterization of Antibodies and Assay Optimization. J Agric Food Chem. 42: 1369–1374.). Ferner eingeschlossen sind Antigen-bindende Antikörper-Fragmente, d. h. monovalentes Fab und divalentes (Fab)₂, die von den monoklonalen anti-2,4-D-Antikörpern ableitbar sind.
Die folgenden Verbindungen sind erfindungsgemäß eingeschlossen:
Als Aminosäuren kommen alle natürlichen Aminosäuren in Frage, vorzugsweise Alanin, beta-Alanin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin, Citrullin, Cystein, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Homoserin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Sarcosin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, und Valin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D-Konfigurationen, sowie auch nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, wie z. B. Phenylglycin, Penizillamin, Norvalin, Norleucin, Alpha-Aminobuttersäure, Diaminopropionsäure, Cyclohexylalanin, Butylglycin, Aminoisobuttersäure, Thienylalanin, Statin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D-Konfigurationen, sowie Amino-Oligoethylenglycol-Carbonsäuren und Amino-Oligopropylenglycol-Carbonsäuren.
Unter geschützten Aminosäuren werden Aminosäuren verstanden, die eine Schutzgruppe tragen, wie z. B. S-Acetamidomethyl-(Acm), t-Butyloxycarbonyl-(Boc), t-Butyl-(tBu), Trityl-(Trt), 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl-(Pbf), Tosyl-(Ts), Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc), (1,1,-dioxobenzo[b]thiophene-2-yl-methyl)oxycarbonyl (Bsmoc), Benzyloxycarbonyl (CBz) oder beta-2-Adamantyl (Ada). Ungeschützte Aminosäuren sind demnach Aminosäuren, die eine solche Schutzgruppe nicht tragen.
Bei den Nukleosiden kann es sich um Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in syn- oder anti-Konfiguration, sowie um ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (Nukleotide) und Derivate davon handeln, wie z. B. zyklische Formen, wie 3'-5'-zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP), oder ihre Desoxy- oder Didesoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie 6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5-Iod-2'-desoxyuridin, 6- Thioguanin, Azothymidin oder Didesoxyinosin und ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (synthetische Nukleotid-Analoga).
Saccharid-Einheiten innerhalb des Spacers können erfindungsgemäß zum Beispiel aus linearen oder verzweigten Oligosacchariden aus 1 bis 10 gleichen oder verschiedenen Monosacchariden bestehen, wie z. B. aus Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Arabinose, N-Acetylglucosamin oder Fructose, oder aus 1 bis 5 gleichen oder verschiedenen Disacchariden, wie z. B. Cellobiose, Lactose, Chitobiose, Lactosamin, die vorzugsweise beta-1,4-glycosidisch verknüpft sind, oder aus Kombinationen oder Derivaten der genannten Strukturen. Außerdem kann der Spacer aus O-glycosylierten Serin-, Threonin- oder N-glycosylierten Asparagin- und/oder Glutaminsäure-Untereinheiten aufgebaut sein oder diese enthalten. Der Spacer kann darüber hinaus aus linearen oder verzweigten Polyolen mit 3 bis 15 Hydroxylgruppen aufgebaut sein, die mit jeder der oben genannten Spacer-Komponenten, wie z. B. Saccharid- oder Polyolstrukturen, verknüpft sein können.
Unter 'linearer oder verzweigter Alkylrest' wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel C_nH_2n+1 verstanden. Es handelt sich insbesondere um Reste mit 1, 2, 3, 4, 5, ... 14 oder 15 Kohlenstoffatomen. Explizit eingeschlossen sind die Reste Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, und mit Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppen substituierte Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decyl-Reste, wie z. B. 6,7,8,9,10-Pentamethyldecyl oder 8-Methyl-9,10-diethyldecyl.
Nicht einschränkende Beispiele für ein erfindungsgemäßes lineares oder verzweigtes Alkenyl sind Kohlenwasserstoffreste mit 2, 3, 4, 5, ..., 14 oder 15 Kohlenstoffatomen sowie einer oder ggf. mehreren cis oder trans konfigurierten C-C-Doppelbindungen. Explizit eingeschlossen sind Propenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 1,3-Hexadienyl, 1,5-hexadienyl, Alkenylreste mit konjugierten C-C-Doppelbindungen, wie z. B. 1,3,5,7,9-Decapentenyl.
Bei den oben genannten Alkoxyresten handelt es sich um lineare oder verzweigte Alkylreste der obigen Definition, die über ein Sauerstoffatom an die in den obigen Formeln gezeigten C- oder N-Atome gebunden sind.
Das oben genannte Amin kann eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe sein, also -NH₂, NHR' oder NR'₂, wobei R' ein Alkylrest der obigen Definition sein kann.
Bevorzugte Verbindungen haben die Formel (II)
bei der Z1 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten
mit n1 = 1–15,
wobei Z2 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten
mit n2 = 1–15,
wobei M⁺ ein einwertiges, anorganisches oder organisches Kation ist,
wobei PG eine Amino-Schutzgruppe ist.
Gemäß der vorstehenden Definition kann n2 eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 15 sein, also 1, 2, 3, 4, ... 14 oder 15. Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit n1 = 5 oder n1 = 10 und/oder n2 = 5 oder n2 = 10,
Bei dem Kation handelt es sich insbesondere um Lithium, Kalium, Ammonium, Rubidium, Cäsium, vorzugsweise Natrium oder Tetraalkylammonium (insbesondere Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Tetrapropylammonium, Tetrabutylammonium, Tetrapentylammonium oder Tetrahexylammonium).
Bevorzugte Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise (1,1-Dioxobenzo[b]thiophen-2-yl-methyl)oxycarbonyl (Bsmoc), t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (CBz) und insbesondere Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc).
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden Kits, welche Verbindungen der Formel (III) enthalten, bereitgestellt:
mit n = 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.
Der Rest R ist vorzugsweise Wasserstoff (-H), Succinimidyl, Sulfo-succinimidyl, Hydrazyl oder Fmoc-Lysinyl.
Bei den Verbindungen der erfindungsgemäßen Kits handelt es sich um Derivate der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), die hierin auch als „2,4-D-Derivate" bezeichnet werden. Die Substanz 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure sowie Ester- oder Amid- oder andere Derivate und Salze davon wurden ursprünglich als Herbizide entwikkelt und genutzt ( US 2,857,261 ). Konjugate, bei denen die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure kovalent an nieder- oder hochmolekulare Träger gebunden vorliegt, werden für eine Vielzahl von bioanalytischen Zwecken verwendet. Hauptsächlich werden derartige Derivate in kompetitiven Immunoassays eingesetzt, die der toxikologischen Analytik des Herbizides im Trinkwasser, in Nahrungsmitteln oder in Körperflüssigkeiten dienen sollen (vgl. z. B.: Kroger S, Setford SJ, Turner AP (1998). Immunosensor for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in aqueous/organic solvent soil extracts. Anal Chem. 70: 5047–5053; Bier FF, Kleinjung F, Ehren treich-Forster E, Scheller FW (1999). Changing functionality of surfaces by directed self-assembly using oligonucleotides-the Oligo-Tag. Biotechniques. 27: 752–756; DE 197 45 668 A1 ; Halamek J, Hepel M, Skladal P (2001). Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Biosens Bioelectron. 16: 253–260). In den beschriebenen Tests wird 2,4-D nach gängigen Methoden direkt in situ an Trägermoleküle gebunden und in Kompetition mit freier 2,4-D durch spezifische Antikörper (vgl. Fránek M, Kolar V, Granatova M, Nevorankova Z (1994). Monoclonal ELISA for 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid: Characterization of antibodies and assay optimization. J Agric Food Chem. 42: 1369–1374; Franek M, Brichta J (2003). Identification of Monoclonal Antibodies against 2,4-D Herbicide by ELISA and DNA Sequencing. J Agric Food Chem. 51: 6091–6097.) nachgewiesen. Die dazu erforderlichen Antikörper wurden durch Immunisierung von Versuchstieren mit 2,4-D-Protein- oder 2,4-D-Poly-L-Lysinkonjugaten gewonnen (vgl. z. B. Franek M (1989). CS8707109A1 , Immunogenes for production of antibodies against polychlorinated biphenyls and method of their preparation; Schecklies E (1995). DE 19529250 C1 , Herstellung von Hapten-Träger-Konjugaten, die Polyaminosäuren als Träger enthalten.).
US 2004/0082079 A1 beschreibt ein Verfahren zur Siebtestung (High-throughput-Screening) von Substanzbibliotheken unter Verwendung niedrig affiner Bindungspartner. In anderem Zusammenhang wurde neben zahllosen Beispielen unterschiedlichster Verbindungsklassen auch eine von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure abgeleitete Verbindung offenbart, die sich strukturell aber von den hierin beschriebenen 2,4-D-Derivaten unterscheidet.
Die Verbindungen der erfindungsgemäßen Kits lassen sich sehr gut an Trägermoleküle, Festphasen und Substratmoleküle binden (nachfolgend auch als „Substrate" bezeichnet). Dabei sind Trägermoleküle und Substratmoleküle lösliche und Festphasen unlösliche Stoffe, an die die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate über die Einheit „RG" gekoppelt werden können. Substratmoleküle sind z. B. Makromoleküle (makromolekulare Substratmoleküle), wie biogene Makromoleküle, wobei Makromoleküle chemische Verbindungen mit einer molekularen Masse von mindestens 500 g/mol sind. Biogene Makromoleküle sind chemische Verbindungen, deren Strukturen Verbindungen entsprechen, die aus metabolischen Prozessen resultieren oder daran beteiligt sind. Biogene Makromoleküle, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind, müssen jedoch nicht zwangsläufig das Ergebnis metabolischer Vorgänge sein, sondern können anderen Quellen entstammen.
Die Begriffe "löslich" und "unlöslich" beziehen sich auf wässrige beziehungsweise organische Flüssigkeiten. Vorzugsweise ist die Verbindung zwischen den Substraten und den Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine kovalente Bindung, jedoch können andere Verknüpfungen ebenso geeignet sein und sind somit ausdrücklich eingeschlossen.
Im Sinne der Erfindung bedeutet "in Wasser stabil", dass etwa 50% der Menge der entsprechenden Verbindung in flüssigen Medien, die einen Wasseranteil von mindestens 80% und einen pH-Wert im Bereich von 3 bis 9 besitzen, bei einer Temperatur von 0°C bis zu einigen Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, noch reaktiv sind, bzw. dass weniger als 50% der Menge der entsprechenden Verbindung in flüssigen Medien, die einen Wasseranteil von mindestens 80% und einen pH-Wert von 7 besitzen, bei 4°C innerhalb von 1 Stunde zerfällt.
„In Wasser löslich" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass 100 μMol der entsprechenden erfindungsgemäßen 2,4-Dichlorphenoxyacetatderivate in 1 l eines flüssigen Mediums mit einem Wasseranteil von mindestens 80 bei 25°C aufgelöst werden können.
2,4-Dichlorphenoxyacetat ist ein Hapten. Dabei bezeichnet der Begriff Hapten ein kleines organisches Molekül, das einen spezifischen Bindungspartner für einen Antikörper darstellt, der wiederum spezifisch ist für dieses Hapten. Hierbei besteht die Möglichkeit, dass bei der Bindung eines Antikörpers an die an ein Substratmolekül gebundene 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure angrenzende Regionen des Substratmoleküls die Bindung stören könnten. Andererseits könnte der Antikörper aber auch Strukturelemente des bei seiner Entwicklung verwendeten Hapten-Trägerproteinkonjugates, insbesondere die Struktur der Verknüpfung zwischen Hapten und Trägermolekül, zusammen mit dem Hapten erkennen und daher ein solches Trägermolekül für eine hochaffine Bindung benötigen. Verbindungen der hier beanspruchten Kits enthalten Spacer, um störende Effekte zu verringern und/oder um Strukturelemente der Hapten-Trägerproteinverknüpfung zu imitieren.
Wenn die 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivate aliphatische Spacer umfassen, wie z. B. 11-Aminoundecansäure oder 6-Aminohexansäure, ist die untere Nachweisgrenze von damit markierten Substraten besser als die von Substraten, die mit 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivaten markiert sind, die keinen Spacer enthalten, wenn der Assay mit den erfindungsgemäß verwendeten Antikörpern durchgeführt wird. Die Affinität der Bindung zwischen der 2,4-Dichlorphenoxygruppe und dem Antikörper wird insbesondere gesteigert, wenn lineare Alkyl-Spacer an die Carboxylgruppe des 2,4-Dichlorphenoxyacetats geknüpft sind. Die erfindungsgemäßen 2,4-Dichlorphenoxyacetatderivate schließen vorzugsweise lineare Alkyl-Spacer entsprechend der Formel III ein, bei denen n eine ganze Zahl im Bereich von 1–15 ist. Der Vorteil von Aminohexansäure (n = 5) oder 11-Aminoundecansäure (n = 10) umfassenden Spacern in einem Enzym-gekoppelten Immunsorbentassay ist beispielhaft in 2 gezeigt. In den erfindungsgemäßen 2,4-Dichlorphenoxyacetatderivaten können zusätzlich im Spacer oder den reaktiven Gruppen (RG) Reste gemäß Formel (I) enthalten sein, die die Löslichkeit in Wasser steigern. Diese Reste können aus geladenen Einheiten oder Oligoethylenglycol-Einheiten oder Oligopropylenglycol-Einheiten bestehen. Löslichkeitsvermittelnde Saccharid-Reste innerhalb des Spacers sind beispielsweise lineare oder verzweigte Oligosaccharide, die 1 bis 10 gleiche oder verschiedene Monosaccharide enthalten, wie z. B. Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Arabinose, N-Acetylglucosamin oder Fructose, oder die 1 bis 5 gleiche oder verschiedene Disaccharide, wie z. B. Cellobiose, Lactose, Chitobiose oder Lactosamin, die vorzugsweise beta-1,4-glycosidisch verknüpft sind, enthalten, oder die Kombinationen oder Derivate davon enthalten. Außerdem kann der Spacer aus O-glycosyliertem Serin, Threonin oder N-glycosyliertem Asparagin- und/oder Glutaminsäure aufgebaut sein oder diese enthalten. Der Spacer kann darüber hinaus lineare oder verzweigte Polyole mit 3 bis 15 Hydroxylgruppen enthalten, die mit den oben genannten Spacer-Komponenten, wie z. B. Saccharid- oder Polyolstrukturen, verknüpft sein können. Die im Spacer enthaltenen Saccharid-Substrukturen können einerseits mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder einer Alkylspacer einschließenden Variante der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, andererseits mit einer der für Struktur (I) definierten reaktiven Gruppen (RG) substituiert sein. „Löslichkeitsvermittelnd" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die entsprechenden 2,4-Dichlorphenoxyacetat- Derivate in flüssigen Medien mit einem Wasseranteil von mindestens 80% löslich sind.
Ladungsträger, die sich in Substituenten des Spacers oder RG der generischen Formel (I) befinden, können beispielsweise sein: Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Phosphatgruppen als negative Ladungsträger sowie Ammonium- oder Guanidylgruppen als positive Ladungsträger.
Oligoethylenglycol-Substrukturen sind beispielsweise folgende Strukturen: lineare oder verzweigte, an einem oder mehreren Enden substituierte Ethylenglycol-Homopolymere oder Propylenglycol-Homopolymere, sowie gemischte Ethylenglycol-/Propylenglycol-Copolymere mit durchschnittlichen Molekulargewichten zwischen 100 und 5000 g/mol. Explizit eingeschlossen sind die Strukturelemente 1-Ethoxy-2-ethoxy-ethyl, 1-Ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)ethyl, 1-ethoxy-2-[2-(2-ethoxyethoxy)ethoxy]ethyl und deren Homologe, die einerseits mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder einer Alkylspacer-enthaltenden Variante der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, andererseits mit einer für Struktur (I) definierten reaktiven Gruppe (RG) substituiert sind.
Die Kopplung der Verbindungen der erfindungsgemäßen Kits an Substrate ermöglicht ihre Verwendung als Markierungssubstanzen. Die Verknüpfung zwischen Substrat und 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivat wird erfindungsgemäß durch die Gruppe RG vermittelt. Einige Gruppen RG können ohne weitere in situ Aktivierung an Substrate gekoppelt werden, bei anderen ist eine Aktivierung in situ notwendig. Aminoreaktive 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivate, wie z. B. Aldehyde, Aziridine oder Epoxide, sowie Aktivester, wie Pentafluorophenyl-, Succinimidyl- or Sulfosuccinimidylester können ohne weitere Aktivierung direkt an Aminogruppen gekoppelt werden. Carboxylate müssen in wässrigen Lösungen durch die Zugabe von beispielsweise N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDAC) aktiviert werden, um an Substrate gekoppelt zu werden. Aldehydreaktive 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivate wie Hydrazide werden in situ nicht weiter aktiviert, ebenso wenig wie Sulfhydryl-reaktive Derivate, wie Maleinimide, Vinylsulfone oder Pyridylthiole.
Kits der Erfindung umfassen ferner monoklonale Antikörper (mAKs), vorzugsweise spezifische mAKs, die an die erfindungsgemäßen 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivate binden. Betroffene Antikörper sind insbesondere die monoklonalen Antikörper, die von Hybridom-Klonen wie z. B. E2/G2, E2/B5, E4/C2, G5/E10, F6/C10, B5/C3, oder B7 abgeleitet sind, die nach dem im Detail in der Literatur beschriebenen Verfahren erhältlich sind (siehe: Fránek M (1989) CS 707109 A1 . Immunogenes for production of antibodies against polychlorinated biphenyls and method of their preparation; Fránek M, Kolar V, Granatova M, Nevorankova Z (1994). Monoclonal ELISA for 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid: Characterization of Antibodies and Assay Optimization. J Agric Food Chem. 42: 1369–1374.).
Die hier beschriebenen Aminoalkyl-Derivate der 2,4-D nutzen den so genannten Brückenbindungseffekt, den alle bei dieser Erfindung verwendeten 2,4-D-spezifischen Antikörper zeigen (siehe Tabelle 4; z. B. Eremin SA, Lunskaya IM, Egorov AM (1993). The influence structure of labelled antigen an sensitivity and specificity for polarisation fluoroimmunoassay of 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Russian Journal of Bioorganic Chemistry 19: 836–843).
Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung neben den durch die oben genannten Hybridome produzierten Antikörper geeigneten mAKs schließen folglich 2,4-D-spezifische monoklonale Antikörper ein, die ebenfalls den oben erwähnten so genannten Brückenbindungseffekt ausüben.
Die 2,4-D-Derivate der vorliegenden Erfindung sind äußerst geeignete Markierungsmoleküle, da bei Verwendung 2,4-D-spezifischer Antikörper aufgrund des Vorliegens der "Spacer"-Einheit eine niedrigere Nachweisgrenze beobachtet wird als bei Verbindungen, bei denen der "Spacer" fehlt und die somit den oben erwähnten so genannten Brückenbindungseffekt nicht gestatten. Wenn 2,4-D zum Beispiel mit einem aliphatischen Linker zwischen der 2,4-D-Einheit und RG ausgestattet ist, wie 11-Aminoundecansäure oder 6-Aminohexansäure, ist die Nachweisgrenze von damit markierten Biomolekülen niedriger als im Vergleich zu Biomolekülen, die mit 2,4-D markiert sind, die keinen Linker zwischen der 2,4-D-Einheit und RG besitzen, wenn der Assay mit den in dieser Erfindung verwendeten Antikörpern durchgeführt wird.
Die hierin beschriebenen Kits umfassen die erfindungsgemäßen Markierungsverbindungen, die geeignet sind, um im Rahmen eines Markierungsverfahrens an Substrate geknüpft zu werden, das in markierten Substraten resultiert. Markierte Substrate können mit erfindungsgemäßen Antikörpern im Rahmen von Nachweisassays detektiert werden. Abhängig vom Substrat und der "RG" Einheit, können die Markierungsverfahren in unterschiedlichen Puffern und/oder Lösungen unter Verwendung verschiedener Reagenzien durchgeführt werden. Ferner können die Nachweisassays in einer Vielzahl verschiedener Puffer und/oder Lösungen durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Kits Puffer, Lösungen, Mittel und Reagenzien, die zur Durchführung von Markierungsverfahren und Nachweisassays geeignet sind.
Die folgenden beispielhaften Ausführungsformen des Kits sollen die Erfindung nicht beschränken. Ferner können die genannten Kits oder Bestandteile derselben in unterschiedlicher Weise kombiniert oder zusammengestellt sein.
Zur Markierung von Proteinen, Glycoproteinen, Peptiden, Nucleosiden, Nucleotiden, Lipiden oder Sacchariden kann das Kit erfindungsgemäße 2,4-D-Derivate, wasserfreies organisches Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylsulfoxid oder N,N-Dimethylformamid (DMF), Natrium-m-Periodat, Glycin, Hydrazinhydrat, Natriumacetat, Natriumtetraborat, Bicarbonat oder Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung zur Markierung von Substraten, Kontrollsubstanzen, wie z. B. glycosylierte und nicht-glycosylierte Proteine, sowie semi-permeable Dialyse-Membranen und Gelfiltrationssäulen, wie z. B. Sephadex G-25, zur Reinigung der markierten Konjugate, sowie 2,4-D-markierten Standard, wie z. B. Albumin oder Immunglobulin, und Konservierungsstoffe, wie z. B. Natriumazid oder Thimerosal, umfassen.
Zur Markierung von DNA- oder PCR-Fragmenten oder zur Erzeugung von DNA-Hybridisierungssonden kann das Kit eine geeignete DNA-Polymerase, wie z. B. Taq DNA Polymerase, Didesoxy- oder Desoxy nukleotide, wie z. B. 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat (dATP), 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (dCTP), 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP), 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat (dTTP), 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (dUTP) und markierte Didesoxy- oder Desoxynukleotide, wie z. B. 2,4-D-11-dUTP, Puffer mit oder ohne Magnesiumchlorid (MgCl₂), wie z. B. Kaliumchlorid und Tris enthaltende Puffer, MgCl₂-Stammlösung, Kontroll-Oligonukleotide spezifisch für eine Kontroll-Matrize, Kontroll-Matrizen-DNA, 2,4-D-markierte Kontroll-DNA und steriles Wasser umfassen. Zusätzlich können mit 2,4-D markierte DNA Molekulargewichtsmarker eingeschlossen sein.
Zur Markierung von RNA-Fragmenten oder zur Erzeugung von RNA-Hybridisierungssonden kann das Kit einen geeigneten Transkriptionsvektor, der eine Polylinkerstelle und Promotoren geeigneter RNA-Polymerasen enthält, wie z. B. von SP6 und T7, eine geeignete RNA-Polymerase, wie z. B. SP6 oder T7, 2,4-D-markierte Kontroll-RNA, unmarkierte Kontroll-RNA, Kontroll-DNA, Nukleotide, wie z. B. Adenosin-5'-triphosphat (ATP), Cytidin-5'-triphosphat (CTP), Guanosin-5'-triphosphat (GTP), Thymidin-5'-triphosphat (TTP), Uridin-5'-triphosphat (UTP) und markierte Nukleotide, wie z. B. 2,4-D-11-UTP, eine RNase-freie DNase, einen RNase-Inhibitor und optional 2,4-D-markierte RNA Molekulargewichtsmarker umfassen.
Zur Unterscheidung von Kohlenhydrateinheiten, wie z. B. Glycanen (Polysacchariden), die an Glycoproteine oder Glycokonjugate geknüpft sind, kann das Kit 2,4-D-markierte Lectine, wie z. B. Weizenkeimagglutinin, Erdnußagglutinin oder Sambucus nigra Agglutinin, Kontroll-Glycokonjugate, wie z. B. das Protein Transferrin, welche Polysaccharide tragen, die an die eingeschlossenen 2,4-D- markierten Lectine binden, und nicht-glykosylierte Kontroll-Proteine umfassen.
Zur Markierung von biologischen oder artifiziellen Membranen, wie z. B. Phospholipid-Doppelschichten (z. B. Plasmamembranen und intrazelluläre Membranen lebender Zellen oder kleine unilamellare Vesikel und Liposomen), kann das Kit 2,4-D-markierte Lipide, wie z. B. Phospholipide (einschließlich Phospholipid-Analoga wie Phosphatidylinositol), Sphingolipide (einschließlich Ganglioside und Ceramide), Fettsäuren, Triglyceride oder Steroide, stabilisierende Additive, wie z. B. Rinderserumalbumin, organische Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol oder Chloroform, Hanks' gepufferte Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlösung, Tris, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), Glutaraldehyd, Paraformaldehyd, steriles deionisiertes Wasser und Konservierungsstoffe, wie z. B. Natriumazid oder Thimerosal, umfassen.
Zum Nachweis markierter Konjugate kann das Kit 2,4-D-markierte Protein-Molekulargewichtsmarker, hierin genannte anti-2,4-D-Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon, Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF)Membranen, Absättigungs-Reagenzien, wie z. B. Casein, synthetische Detergenzien oder Magermilchpulver, 2,4-D-markierten Standard, wie z. B. Albumin oder Immunglobulin, Konservierungsstoffe, wie z. B. Natriumazid oder Thimerosal, umfassen. Die anti-2,4-D-Antikörper können unmarkiert oder für den Chemilumineszenz-Nachweis, den colorimetrischen Nachweis oder den Fluoreszenz-Nachweis des Substrat-gebundenen 2,4-D mit Farbstoffen wie Fluorescein, Rhodamin oder AlexaFluor680 oder mit Enzymen wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder beta-Galactosidase markiert sein. Im Fall, dass unmarkierte anti-2,4-D-Antikörper bereitgestellt werden, können wie oben beschrieben markierte sekundäre anti-Maus-Antikörper eingeschlossen sein. Chromogene Substrate, wie z. B. ABTS (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure), TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) oder NBT/BCIP (3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumblau-chlorid] (4-Nitroblau Tetrazoliumchlorid) und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) können im Kit eingeschlossen sein.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Kits zum Nachweis von Substratmolekülen (siehe oben).
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis von Aminosäuren, verzweigten oder unverzweigten Oligopeptiden, Polypeptiden, Proteinen, Nukleinbasen, Oligonukleosiden, Polynukleosiden, Nukleotiden, Oligonukleotiden, Polynukleotiden, Nukleinsäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden, Glykoproteinen oder Lipiden. Vorzugsweise betrifft die Erfindung den Nachweis von Aminosäuren, Polypeptiden mit 2 bis 25 Aminosäuren, Proteinen mit einer Masse von mehr als 5 kDa, Nukleinbasen, Nukleotiden oder Nukleotiden, sowie Derivaten davon, wie z. B. ihren Mono-, Di-, oder Triphosphaten oder zyklischen Formen, Polynukleotiden mit 2–75 Nukleotiden, Sacchariden oder Polysacchariden aus 2 bis 25 Monosacchariden.
Saccharide mit 1 bis 25 Monosaccharideinheiten können folgende Aldosen und Ketosen enthalten: D-Erythrose, D-Threose, D-Ribose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Lyxose, D-Allose, D-Altrose, D-Glucose, D-Mannose, D-Gulose, D-Idose, D-Galactose, D-Talose und D-Tetrulose, D-Ribulose, D-Xylulose, D-Psicose, D-Fructose, D- Sorbose, D-Tagatose sowie außerdem D-Glucosamin, N-Acetyl-D-Glucosamin (GlcNAc), D-Galactosamin, N-Acetyl-D-Galactosamin (GalNAc), D-Mannosamin, N-Acetyl-D-Mannosamin (ManNAc), L-Daunosamin, N-Acetyl-Daunosamin, L-Fucose, L-Rhamnose, D-Quinovose, D-Olivose, D-Digitoxose, D-Cymarose, D-Glucuronsäure, D-Mannuronsäure, D-Galacturonsäure, L-Iduronsäure, 2-Desoxy-D-Ribose, N-Acetyl-Muraminsäure (MurAc), 5-N-Acetyl-Neuraminsäure (Neu5Ac) und 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulopyranosonsäure (Kdo).
Nukleinbasen können Purin- oder Pyrimidinbasen, wie z. B. Cytosin, Uracil, Thymin, Adenin, Guanin, Xanthin oder Hypoxanthin und Derivate davon sein.
Bei den Nukleosiden kann es sich um Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in ihren syn- oder anti-Konfigurationen, sowie um ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (Nukleotide) und Derivate davon handeln, wie z. B. zyklische Formen, wie 3'-5'-zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP), oder ihre Desoxy- oder Didesoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie 6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5-Iod-2'-desoxyuridin, 6-Thioguanin, Azothymidin oder Didesoxyinosin und ihre Mono-, Di-, und Triphosphate (synthetische Nukleotid-Analoga).
Lipide können entweder zyklisch, azyklisch oder polyzyklisch sein und aus entweder gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren wie z. B. Buttersäure, Dodecansäure, oder Alpha-Linolensäure, aufgebaut sein oder Triglyzeride, Wachse, oder membranbildende Lipide, wie z. B. Phospholipide, Glycerophospholipide, Glycolipide oder Sphingolipide (z. B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Diphosphatidylglycerin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Sphin gomyeline, Cerebroside, Ganglioside, Ceramide oder Sulfatide) oder Terpenoide, wie z. B. Steroide, Retinoide oder Carotinoide (z. B. Cholesterol, Phytosterol, Ergosterol, Vitamin D, Digitalis, Strophantin, Testosteron oder Progesteron) sein.
Der Begriff „Assay" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein qualitatives oder quantitatives Nachweis-, Mess- oder Untersuchungsverfahren zum Nachweis oder zur Messung von Substratmolekülen (Analyten). Insbesondere sind immunologische Assays, festphasengestützte diagnostische Anwendungen, enzymgekoppelte Immunosorbent Assays, Hybridisierungsassays, Polymerasekettenreaktionen und biologische Markierungs- und Aufnahmeexperimente eingeschlossen.
Der Begriff „immunologischer Assay" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung einen Assay, bei dem Antikörper als Liganden zur Bindung eines Analyten eingesetzt werden. Diese immunologischen Assays schließen insbesondere enzymgekoppelte Immunosorbent Assays und Hybridisierungsassays ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Der Begriff „Hybridisierungsassay" schließt Assays ein, bei denen mit erfindungsgemäßen 2,4-D-Derivaten markierte Sonden in biologischen Standard-Assays verwendet werden, wie z. B. Polymerasekettenreaktionen, Genexpressionsanalysen und Blot-Analysen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „festphasengestützte diagnostische Anwendung" ein diagnostisches Verfahren, bei dem auf einer festen Phase für einen Analyten spezifische Fängermoleküle immobilisiert sind. Der Analyt kann dadurch selektiv aus flüssigen Medien heraus gebunden werden, und ungebundene Komponenten können von der festen Phase durch Waschen entfernt werden. Der Analyt kann anschließend unter Verwendung von markierten Sonden nachgewiesen werden.
Analyte sind in diesem Zusammenhang die bei der Analyse zu bestimmenden Komponenten. Analyte können dabei Moleküle sein, wie z. B. in dieser Erfindung definierte Substrat- oder Trägermoleküle, aber auch Aminosäuren, verzweigte oder unverzweigte Oligopeptide, Polypeptide, Proteine, Nukleinbasen, Oligonukleoside, Polynukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide oder Lipide. Vorzugsweise umfassen die Oligo- und Polypeptide 2 bis 25 Aminosäuren, die Polynukleotide 2 bis 75 Nukleotide und die Polysaccharide 2 bis 25 Monosaccharide. Darüber hinaus können die Analyten mit zusätzlichen Markermolekülen, wie z. B. Biotin, Enzymen oder Farbstoffen ausgestattet sein, die den Nachweis des Analyten über Chemolumineszenz-, Kolorimetrie- oder Floureszenz-Standardverfahren ermöglichen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „biologisches Markierungsexperiment" ein Experiment, bei dem ein Substrat, das mit den 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivaten der vorliegenden Erfindung markiert ist, zur Markierung von biologischen Proben verwendet wird. Solche biologische Proben können beispielsweise Mikroorganismen, Gewebe, Körperflüssigkeiten, lebende Zellen, Plasmamembranen und intrazelluläre Membranen, künstliche Membranen und Liposomen, Zellkerne, Organellen und subzelluläre Strukturen, Rezeptoren und extrazelluläre Matrix-Komponenten einschließen, sind darauf aber nicht beschränkt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „biologisches Aufnahmeexperiment" ein Experiment, bei dem einem Versuchstier in vivo ein Substrat, das mit den 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivaten der vorliegenden Erfindung markiert ist, entweder peripher (beispielsweise durch Verfüttern) oder systemisch (z. B. durch Injektion) verabreicht wird. Der Verbleib des Trägermoleküls in unterschiedlichen Zellen oder Geweben wird nach Tötung des Tieres mit Hilfe der spezifischen 2,4-D-Antikörper der vorliegenden Erfindung bestimmt. Alternativ werden ein Gewebeexplantat oder kultivierte Zellen mit einem Substrat inkubiert, das mit 2,4-D-Derivaten markiert ist, wobei man den Verbleib des Substrats in unterschiedlichen Zelltypen oder subzellulären Kompartimenten mit hierin genannten spezifischen 2,4-D-Antikörpern bestimmt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der hierin genannten 2,4-D-spezifischen monoklonalen Antikörper, die geeignet sind, Substratmoleküle nachzuweisen, indem sie an die Markierungsverbindungen der Erfindung, die an die Substratmoleküle gekoppelt sind, binden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und Figuren beschrieben, wobei es sich um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung handelt, die die Erfindung jedoch nicht einschränken.
Beschreibung der Figuren:
1: Reaktionsschema.
Überblick über die in den Beispielen beschriebene Synthese einiger erfindungsgemäßer 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivate.
2: 2,4-Dichlorphenoxyacetat-Derivate in der Peptidsynthese und ihr Nachweis im Immunoverfahren (ELISA).
Ein 15mer Epitop aus Ovalbumin(NH₂-(I)-GSIGAASMEFCFDCF-COOH, oder NH₂-GSIGAAS-(II)-MEFCFDCF-COOH, oder NH₂-GSIGAASMEFCFDCF-(III)-COOH) wurde im SPOT-Maßstab auf einer Zellulosemembran synthetisiert. Epsilon-amino 2,4-D-markierte Lysine (Verbindungen (2c), (4b), (4d)) mit unterschiedlichen Abstandhaltern (–, C6 und C11) wurden amino- (I) oder carboxyterminal (III) aufgebracht oder innerhalb der 15mer Sequenz (II) eingefügt. Terminal mit epsilon-amino 2,4-D-markierten Lysinen markierte Peptide wurden am jeweils gegenüber liegenden Ende mit Biocytin versehen. Innerhalb des Sequenzmotivs mit epsilon-2,4-D-markierten Lysinen markierte Peptide wurden am Carboxyterminus mit Biocytin ausgestattet (für Details siehe Beispiel 10). Nach Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen wurden die Peptide von der Zellulosemembran abgelöst, gefriergetrocknet und in physiologischer Salzlösung aufgenommen. Seriell verdünnte markierte Peptide wurden auf mit monoklonalem anti-2,4-D-Antikörper (Klon E2/G2) beschichteten und mit 1% (w/v) Casein in Phosphatgepufferter Salzlösung (Casein-PBS) abgesättigten Mikrotitrationsplatten gebunden. Der Nachweis der gebundenen Peptide erfolgte mit Meerrettichperoxidasegekoppeltem Streptavidin gefolgt von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxid. Nach Anpassung einer 4-Parameterkurve an die Messwerte wurde als Maß für das Bindungsverhalten der jeweiligen Peptide die maximale optische Dichte (OD) bei 450 nm (gefüllte Balken) und der EC₅₀-Wert der Verdünnungsreihe (offene Balken) bestimmt. * = signifikant höhere optische Dichte als nach Markierung an Position I, II, III- und. IIIC6 (P < 0,05; One-way ANOVA, Bonferroni Post hoc test).
3: Reversible Markierung von Peptiden mit 2-(2-(2,4-dichlorphenoxy)-1-hydroxyethyliden)-5,5-dimethylcyclohexan-1,3-dion (2,4-D-Dimedon).
Ein 15mer Epitop aus Ovalbumin (NH₂-GSIGAASMEFCFDCF-COOH) wurde im SPOT-Maßstab auf einer Zellulosemembran synthetisiert und nachfolgend aminoterminal mit 2,4-D-Dimedon (1c) markiert. Nach Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen wurde die Membran mit 1% (w/v) Casein in Phosphat-gepufferter Salzlösung (Casein-PBS) abgesättigt. Der Nachweis der 2,4-D-Markierung erfolgte mit biotinyliertem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2) und AlexaFluor680 markiertem Streptavidin, und die Fluoreszenzsignale wurden quantifiziert (Inset a). Zur Visualisierung der Abspaltbarkeit wurde das Konjugat mit 5% (v/v) Hydrazinhydrat in D-PBS versetzt und die verbleibende Fluoreszenz bestimmt (Inset b). Die Integrität des Peptides nach Abspaltung der Markierung wurde nach aminoterminaler Acetylierung des Peptides, Absättigung in Casein-PBS, Reaktion mit einem monoklonalen anti-Ovalbumin Antikörper gefolgt von AlexaFluor680 markiertem Zweitantikörper und Quantifizierung der Fluoreszenzsignale bestätigt (Inset c).
Beispiele
Die Beispiele 1 bis 7 erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Beispiele 8 bis 11 ihre Anwendung als Markierung sowie den Nachweis markierter Moleküle durch monoklonale 2,4-D-spezifische Antikörper. 1 gibt einen Überblick über die in den Beispielen 1 bis 7 beschriebenen Synthesen.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 zur Synthese von Alkylaminosäurederivaten von (1b)
Die entsprechende Alkylaminosäure wurde bei 37°C in einer äquimolaren Menge Tetrabutylammoniumhydroxidlösung (25% (w/v) in Wasser) gelöst. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der ölige Rückstand über Phosphorpentoxid (P₂O₅) getrocknet. 50 mMol der erhaltenen Alkylaminosäuresalze wurden mit 50 mMol der Verbindung (1b) in 200 ml absolutem Dioxan gelöst, 70 mMol Triethylamin wurden zugesetzt und der Ansatz wurde anschließend über Nacht bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in 40 ml ammoniakalischem Wasser gerührt (resultierender pH: 10). 250 ml 10% (w/v) Zitronensäure wurden hinzugefügt (resultierender pH: 5). Der entstandene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit 50 ml 10% (w/v) Zitronensäure und 40 ml Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wurde in Dioxan gelöst und mit einem Überschuss an Kationenaustauscherharz (Amberlite IR-120) unter vorsichtigem Schwenken 30 Minuten bei RT entsalzt. Das Harz wurde entfernt und das Lösemittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde am Ölpumpenvakuum getrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 zur Synthese von Succinimidylestern der Derivate (2a) und (2b)
1 mMol des entsprechenden Carbonsäurederivates der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurde in 20 ml absolutem Dioxan gelöst. 1,1 mMol Pyridin wurden zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 mMol Di-(N-succinimidyl)-carbonat initiiert. Der Ansatz wurde 48 Stunden bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml eiskaltem Wasser suspendiert und nachfolgend 60 Minuten bei RT gerührt. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration isoliert, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen, am Ölpumpenvakuum getrocknet und trocken gelagert.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 zur Synthese von Sulfosuccinimidylestern der Verbindungen (2a) und (2b)
1 mMol des entsprechenden Carbonsäurederivates der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurde in 3 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Eine äquimolare Menge N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz und 1,15 mMol Dicyclohexylcarbodiimid wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Kieselgel60; Laufmittel Essigsäureethylester; > 95%). Nachdem 30 Minuten auf Eis weitergerührt wurde, wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der Rückstand in 25 ml eiskaltem Ethanol für 40 Minuten bei RT gerührt. Der weiße Feststoff wurde isoliert, mit Ethanol gewaschen und am Ölpumpenvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 zur Synthese von N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin-Derivaten der Verbindungen (1b), (3a) und (3c)
0,3 mMol des entsprechenden aktivierten Carbonsäurederivates der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden äquimolar mit N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. 0,36 mMol Triethylamin wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Laufmittel: Cyclohexan:Aceton (1:1), 1% Trifluoressigsäure). Die Rohprodukte wurden isoliert und anschließend säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Laufmittel: Cyclohexan:Aceton (1:1), 1% Trifluoressigsäure) gereinigt. Produkt enthaldende Fraktionen wurden isoliert und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Das Produkt wurde trocken bei 4°C gelagert.
Beispiel 1
Herstellung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-N-hydroxysuccinimidylester (1b)
0,08 Mol 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (17,6 g) und 0,08 Mol N-Hydroxysuccinimid (9,2 g) wurden in 180 ml absolutem Dioxan gelöst. Eine äquimolare Menge an N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,08 Mol; 16,5 g) wurde hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und nach Waschen mit wenig absolutem Dioxan verworfen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und eingeengt und der Rückstand wurde mit 60 ml Methanol:Ethanol (1:1) und anschließend mit Diethylether gewaschen. Der weiße Niederschlag wurde am Ölpum penvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ausbeute betrug 73% (R_f (Kieselgel/Ethylacetat) = 0.86).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.86 (s, 4H), 5.02 (s, 2H), 6.91 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.40 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 25.6, 64.5, 115.5, 124.6, 127.8, 128.1, 130.5, 151.8, 164.0, 168.5
Beispiel 2
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure (2a)
0,05 Mol (18,67 g) 6-Aminohexansäure-tetrabutylammoniumsalz wurden mit 0,05 Mol (15,05 g) (1b) in 200 ml absolutem Dioxan und 0,07 Mol (10 ml) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt. Die Rohausbeute betrug 90%. Das Rohprodukt wurde aus Toluol rekristallisiert (Reinheit (RP-HPLC, Jupiter C18) > 98%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.41 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 2.36 (t, 2H), 3.38 (q, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.84 (d, 1H), 7.23 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.2, 26.2, 29.1, 33.7, 38.9, 68.3, 114.7, 123.7, 127.5, 128.1, 130.2, 151.6, 167.3, 178.4
MS-ESI m/z: 332,045 [M] (berechnet für C₁₄Cl₂H₁₇NO₄ = 333,053 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure (2b)
0,05 Mol (22,17 g) 11-Aminoundecansäure-tetrabutylammoniumsalz wurden mit 0,05 Mol der Verbindung (1b) (6,34 g) in 200 ml absolutem Dioxan und 0,07 Mol (10 ml) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt. Die Rohausbeute betrug 81%. Das Rohprodukt wurde in Toluol:Aceton (1:1) gelöst, und säulenchromatographisch (Kieselgel 60) gereinigt (Reinheit (RP-HPLC, Jupiter C18) > 98%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.31 (m, 12H), 1.56 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 2.34 (t, 2H), 3.36 (q, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.84 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.7, 26.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 33.9, 39.1, 68.3, 114.7, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 167.2, 178.8
MS-ESI m/z: 403,129 [M] (berechnet für C₁₉Cl₂H₂₇NO₄ = 403,132 g/mol)
Beispiel 3
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure-N-hydroxysuccinimidylester (3a)
1 mMol (0,33 g) 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetyl)aminohexansäure wurde mit 2 mMol Di-(N-succinimidyl)-carbonat (0,51 g) in 20 ml absolutem Dioxan und 1,1 mMol (82 μl) Pyridin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 2 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 90%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.48 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 2.62 (t, 2H), 2.81 (s, 4H), 3.39 (q, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.24 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.2, 25.6, 25.9, 28.9, 30.8, 38.8, 68.3, 114.7, 123.8, 127.4, 128.0, 130.2, 151.7, 167.1, 168.4, 169.1
MS-ESI m/z: 430,063 [M] (berechnet für C₁₈C₁₂H₂₀N₂O₆ = 430,070 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure-N-hydroxysuccinimidylester (3c)
1 mMol (0,40 g) 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure wurde mit 2 mMol Di-(N-succinimidyl)-carbonat (0,51 g) in 20 ml absolutem Dioxan und 1,1 mMol (82 μl) Pyridin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 2 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 90%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.29 (m, 10H), 1.40 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.83 (s, 4H), 3.36 (q, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.84 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.5, 25.6, 26.8, 28.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 30.9, 39.1, 68.3, 114.6, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 167.0, 168.6, 169.1
MS-ESI m/z: 500,142 [M] (berechnet für C₂₃Cl₂H₃₀N₂O₆ = 500,148 g/mol)
Beispiel 4
Herstellung von 2-(2,4-Dichlorphenoxy)essigsäurehydrazid (1a)
50 mMol (11 g) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden in 25fachem molarem Überschuss an Thionylchlorid (90 ml) unter zweistündigem Refluxieren zum Säurechlorid umgesetzt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde abdestilliert. Das 2,4-Dichlorphenoxyacetylchlorid wurde in 50 ml absolutem Dioxan aufgenommen und äquimolar mit Hydrazin-Monohydrat über Nacht bei RT umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde eingeengt. Die Ausbeute betrug > 90%.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO/CDCl₃ (1:1)) δ 4.60 (d, 2H), 7.01 (d, 1H), 7.23 (dd, 1H), 7.39 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO/CDCl₃ (1:1)) δ 66.2, 113.8, 121.9, 124.7, 126.3, 128.1, 151.0, 165.0
MS-ESI m/z: 234,005 [M] (berechnet für C₈Cl₂H₈N₂O₂ = 233,996 g/mol)
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäurehydrazid (4a)
0,5 mMol (215 mg) der Verbindung (3a) wurden in 10 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren zu einer Hydrazin-Monohydratlösung (5 mMol in 60 ml Dioxan) getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT weiter gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde eingeengt und der Rückstand wurde 10 Minuten in 30 ml kaltem Wasser gerührt. Der weiße Niederschlag wurde isoliert und am Ölpumpenvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ausbeute betrug 66%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.36 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 2.24, 2.55 (t, 2H), 3.35 (m, 2H), 4.51 (d, 2H), 6.86 (m, 1H), 7.21 (m, 1H), 7.38, 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.7, 24.9, 26.0, 26.2, 29.0, 29.1, 33.9, 38.8, 67.1, 68.3, 114.7, 114.9, 123.7, 127.4, 128.1, 130.1, 130.2, 151.6, 167.5, 173.3
MS-ESI m/z: 347,079 [M] (berechnet für C₁₉Cl₂H₁₉N₃O₃ = 347,080 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäurehydrazid (4c)
0,5 mMol (250 mg) der Verbindung (3c) wurden in 10 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren zu einer Hydrazin-Monohydratlösung (5 mMol in 60 ml Dioxan) getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT weiter gerührt. Das präzipitierte weiße Produkt wurde durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und am Ölpumpenvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ausbeute betrug 90%.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.24 (m, 12H), 1.43 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 2.01, 2,20 (t, 2H), 3.13 (q, 2H), 4.61 (s, 2H), 7.06 (d, 1H), 7.37 (dd, 1H), 7.60 (d, 1H).
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.4, 25.1, 26.2, 28.4, 28.5, 28.6, 28.7, 28.8, 28.9, 33.3, 33.6, 38.1, 38.2, 66.2, 67.9, 115.3, 122.4, 125.0, 127.9, 129.2, 152.4, 166.4, 166.5, 171.5
MS-ESI m/z: 417,156 [M] (berechnet für C₁₉Cl₂H₂₉N₃O₃ = 417,159 g/mol)
Beispiel 5
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure-N-hydroxysulfosuccinimidylester-Natriumsalz (3b)
1 mMol (333 mg) der Verbindung (2a) wurde mit 1 mMol (218 mg) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz in 3 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) durch Zusatz von 1,15 mMol (237 mg) N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 53%.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.34 (m, 2H), 1.46 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 2.64 (t, 2H), 2,86 (dd, 1H), 3.12 (q, 2H), 3.16 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 4.60 (s, 2H), 7.04 (d, 1H), 7.36 (dd, 1H), 7.58 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO) δ 23.8, 25.2, 28.3, 30.0, 30.8, 37.8, 38.0, 56.2, 67.8, 115.3, 122.5, 124.9, 127.9, 129.2, 152.5, 165.3, 166.5, 166.6, 168.7
MS-ESI m/z: 509,017 [M] (berechnet für C₁₈Cl₂H₁₉N₂O₉S = 509,019 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure-N-hydroxysulfosuccinimidylester-Natriumsalz (3d)
1 mMol (404 mg) der Verbindung (2b) wurde mit 1 mMol (218 mg) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz in 3 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) durch Zusatz von 1,15 mMol (237 mg) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 76%.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.24 (m, 10H), 1.34 (m, 2H), 1.41 (m, 2H), 1.61 (m, 2H), 2.63 (t, 2H), 2.85 (dd, 1H), 3.11 (q, 2H), 3.15 (m, 1H), 3.93 (m, 1H), 4.60 (s, 2H), 7.04 (d, 1H), 7.35 (dd, 1H), 7.58 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO) δ 24.2, 26.2, 27.9, 28.4, 28.6, 28.7, 28.8, 30.1, 30.8, 38.1, 56.2, 67.8, 115.3, 122.4, 124.9, 127.9, 129.2, 152.4, 165.2, 166.4, 166.5, 168.7
MS-ESI m/z: 579,096 [M] (berechnet für C₂₃Cl₂H₂₉N₂O₉S = 579,097 g/mol)
Beispiel 6
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)-2-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)hexansäure (2c)
0,3 mMol (100 mg) der Verbindung (1b) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 76%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.35 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 3.12 (q, 2H), 3.91 (m, 1H), 4.25 (m, 3H), 4.58 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 7.36 (m, 4H), 7.66 (m, 2H), 7.88 (m, 5H), 7.95 (m, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 22.9, 28.4, 30.3, 38.1, 46.6, 53.6, 65.5, 67.8, 115.3, 120.0, 122.5, 125.0, 125.1, 125.2, 126.9, 127.5, 127.9, 128.5, 129.2, 131.4, 140.6, 143.7, 152.4, 156.1, 166.5, 166.8, 172.6, 173.8
MS-ESI m/z: 570,131 [M] (berechnet für C₂₉Cl₂H₂₈N₂O₆ = 570,132 g/mol)
Herstellung von 6-(6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexanoylamino)-2-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)hexansäure (4b)
0,3 mMol (130 mg) der Verbindung (3a) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 72%. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.40 (m, 8H), 1.65 (m, 2H), 2.03 (m, 4H), 3.11 (m, 4H), 3.89 (m, 1H), 4.23 (m, 3H), 4.59 (s, 2H), 7.05 (d, 1H), 7.32 (m, 3H), 7.41 (t, 2H), 7.53 (d, 1H), 7.75 (d, 2H), 7.85 (d, 2H) ¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 23.1, 25.0, 26.0, 28.7, 28.8, 29.5, 30.5, 35.3, 35.7, 38.2, 38.3, 46.7, 53.8, 65.6, 67.9, 113.0, 115.4, 120.0, 122.6, 125.1, 125.2, 125.3, 127.0, 127.6, 128.0, 129.3, 140.7, 143.8, 152.5, 156.2, 162.3, 166.6, 171.9, 173.9 MS-ESI m/z: 683,202 [M] (berechnet für C₃₅Cl₂H₃₉N₃O₇ = 683,217 g/mol)
Herstellung von 6-(11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecanoylamino)-2-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)hexansäure(4d)
0,3 mMol (150 mg) der Verbindung (3c) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 61%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.18 (m, 12H), 1.41 (m, 8H), 1.62 (m, 2H), 2.02 (t, 2H), 3.02 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.87 (m, 1H), 4.26 (m, 3H), 4.58 (s, 2H), 7.05 (d, 1H), 7.32 (m, 3H), 7.41 (t, 2H), 7.58 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.87 (d, 2H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 23.1, 25.2, 25.3, 26.3, 28.7, 28.8, 28.9, 29.0, 30.4, 30.7, 35.4, 35.5, 38.0, 38.1, 38.3, 46.7, 53.8, 65.6, 68.0, 115.4, 120.1, 122.6, 125.1, 125.3, 125.3, 127.1, 127.6, 128.0, 140.7, 143.8, 143.9, 152.5, 156.2, 157.9, 158.2, 166.5, 166.6, 171.9, 172.0, 172.7, 173.9
MS-ESI m/z: 753,301 [M] (berechnet für C₄₀Cl₂H₉₉N₃O₇ = 753,295 g/mol)
Beispiel 7
Herstellung von 2-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)-1-hydroxyethyliden)-5,5-dimethylcyclohexan-1,3-dion (1c)
15 mMol (3,3 g) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden in 150 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. 16,5 mMol (2,3 g) 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion (Dimedon), 15 mMol (3,1 g) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und 15 mMol (1,8 g) 4-Dimethylaminopyridin wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde 48 Stunden bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Der Syntheserückstand wurde mit 50 ml Essigsäureethylester extrahiert und filtriert.
Das Filtrat wurde mit 1 M Kaliumhydrogensulfat- und anschließend mit 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand mit Diethylether gewaschen. Der Niederschlag wurde durch Filtration isoliert und am Ölpumpenvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ausbeute betrug 19% (Smp. 170–175°C, R_f (Kieselgel, Essigsäureethylester) = 0.8). Erneutes Extrahieren des Syntheserückstandes mit Essigsäureethylester erhöhte die Ausbeute auf 24–29%.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 0.95 (s, 6H), 2.11 (s, 4H), 5.06 (s, 2H), 6.69 (d, 1H), 7.24 (d, 1H), 7.47 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO) δ 28.2, 29.8, 52.7, 74.2, 112.4, 114.9, 121.6, 123.2, 127.6, 128.7, 153.6, 189.3, 194.2
MS-ESI m/z: 341,035 [M] (berechnet für C₁₆Cl₂H₁₅O₄ = 341,035 g/mol)
Beispiel 8
Markierung eines Polypeptids mit 2,4-Dichlorphenoxy-Aktivesterderivaten, Aktivestern anderer Markierungen und ihr Nachweis
Stammlösungen von 65–100 mg/ml (120–330 mM) Aktivester der Markierungsverbindungen (Tabelle 1) wurden für jedes Markierungsexperiment frisch in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt. Eine Polypeptid-Stammlösung (Ovalbumin, Merck Biosciences, Bad Soden, DE), wurde in einer Konzentration von 135 mg/ml (3 mM) in 100 mM Natriumtetraborat, pH 8,2, hergestellt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Zur Markierungsreaktion wurden 100 nMol Ovalbumin (2 μMol Aminofunktionen darstellend) umgesetzt mit 1,5 μMol des Aktivesters in einem Endvolumen von 300 μl 100 mM Natriumtetraborat, pH 8,2, das in keinem Experiment mehr als 5% (v/v) DMSO enthielt. Die Lösungen wurden bei RT durch Invertieren gemischt, bevor nach einer Reaktionszeit von 180 min die Markierungsreaktion durch Zugabe von 1,5 mMol Glycin in Natriumtetraboratpuffer gestoppt wurde. Das Mischen wurde über Nacht bei 4°C fortgesetzt, bevor die Lösung gegen Natriumtetraboratpuffer dialysiert wurde. Die Konzentrationen der markierten Polypeptide wurde nach Standardverfahren bestimmt, und es wurden serielle Verdünnungen der Stammlösungen hergestellt. Gleiche Mengen der verdünnten Lösungen (entweder 16.000–3,12 pg Konjugat/Dot oder 16.000–3,12 ng Konjugat/Dot) wurden auf Nitrocellulose-Membranen (4,8 × 3 cm, 0,2 μm Porengröße, Schleicher & Schuell, Dassel, DE) aufgebracht. Die Membranen wurden luftgetrocknet und bei –20°C gelagert.
Unmittelbar vor Fortsetzung des Experiments wurden die Membranen aufgetaut und dreimal mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gewaschen. Alle nachfolgenden Behandlungen der Membranen wurden in genau passenden Imkubationsschalen durchgeführt. Die Membranen wurden für 30 min bei RT mit 1% (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS (Casein-PBS) abgesättigt.

Abgesättigte Membranen wurden für 90 min bei RT mit 4 ml (0,28 ml/cm² Membran) verdünnten monoklonalen Antikörpern gegen 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder DIG oder mit AlexaFluor680-markiertem Streptavidin in Casein-PBS inkubiert (für die Arbeitskonzentrationen siehe Tabelle 2) und dreimal mit D-PBS ge waschen. Die mit anti-2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder anti-DIG behandelten Membranen wurden ferner für 90 min bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm² Membran) 2 μg/ml Zweitantikörper (Ziege anti-Maus AlexaFluor680, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in Casein-PBS inkubiert, während die mit Streptavidin AlexaFluor680 behandelten Membranen für diese Zeit in Casein-PBS gehalten wurden. Nach ausgiebigem Waschen der Membranen mit D-PBS wurden die Fluoreszenzen mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) ausgelesen und mit einem geeigneten Bildauswertungsprogramms (Odyssey-Software V1.2) quantifiziert. Die statistische Auswertung der Daten wurde mit Hilfe des Programms GraphPad Prism (V.4.0.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) vorgenommen. Die unteren Nachweisgrenzen für jedes Konjugat sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 1: Aktivester verschiedener in Polypeptid-Markierungsexperimenten verwendeter Markierungen

Aktivester von Markierung	Chemischer Name	Vertreiber (soweit zutreffend)
Biotin	Sulfo-Succinimidyl-(+)-biotin	Molecular Biosciences
LC-Biotin	Sulfo-LC-(+)-Biotin	Molecular Biosciences
SLC-Biotin*	SLC-NHS-(+)-Biotin	Molecular Biosciences
LC-DIG*	Digoxigenin-3-0-methylcarbonyl-e-aminocaproyl-N-hydroxysuccinimid	Roche Diagnostics
2,4-D*	2-(2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure-N-hydroxysuccinimidylester	-
2,4-D-Ahx	6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure-N-hydroxysulfosuccinimidylester-Natriumsalz	-
2,4-D-Aun	11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure-N-hydroxysulfosuccinimidylester-Natriumsalz	-

*= diese Derivative tragen keine Sulfo-Gruppe.

Markierung	Primär-Nachweisreagenz	Klon	Arbeitskonzentration
		E2/G2	1 μg/ml
2,4-D	Maus anti-2,4-D (M. Franek, Brno, CZ)	E4/C2	1 μg/ml
		F6/C10	1 μg/ml
		B7	1 μg/ml
DIG	Maus anti-Digoxigenin (Roche Diagnostics)	1.71.256	1 μg/ml
Biotin	Streptavidin AlexaFluor680 (Invitrogen)		438 ng/ml

Beispiel 9
Markierung eines Glykoproteins mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Hydrazidderivaten, Hydrazidderivaten anderer Markierungen und ihr Nachweis

Eine Stammlösung von 10 μg/ml eines Glykoproteins (Mucin aus Schwein, Sigmar-Aldrich, Taufkirchen, DE) wurde in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) hergestellt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Zur Markierung der Glykoproteinkohlenhydrate wurde die aufgetaute Stammlösung seriell verdünnt, gleiche Mengen der verdünnten Lösungen (2.000–1 pg Glykoprotein/Dot) wurden auf Nitrozellulose-Membranen (4,8 × 3 cm, 0,2 μm Porengröße, Schleicher & Schüll, Dassel, DE) aufgetragen, an der Luft trocknen gelassen, und die Membranen wurden bei –20°C gelagert. Unmittelbar vor Fortsetzung des Experiments wurden die Membranen aufgetaut und 3× mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gewaschen. Alle nachfol genden Behandlungen der Membranen wurden in genau passenden Imkubationsschalen ausgeführt. Zur Oxidation der Kohlenhydrateinheiten des Glykoproteins wurden die Membranen für 20 Min. bei RT in 3 ml (0,21 ml/cm² Membran) 10 mM Natrium m-periodat (Sigmar-Aldrich, Taufkirchen, DE) in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) inkubiert. Sie wurden nochmals 3× mit D-PBS gewaschen und für 60 Min. bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm²) einer 2,5 μM Markierungshydrazidlösung (Tabelle 3) in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) inkubiert, erneut 3× mit D-PBS gewaschen und mit 1% (w/v) Casein (Hammarsten Grad, BDH, Poole, GB) in D-PBS (Casein-PBS) für 30 Min. bei RT abgesättigt. Abgesättigte Membranen wurden für 90 Min. bei RT mit 4 ml (0,28 ml/cm² Membran) verdünnten monoklonalen Antikörpern gegen 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder DIG oder mit AlexaFluor680-markiertem Streptavidin (für Arbeitskonzentrationen s. Tabelle 2) in Casein-PBS inkubiert und 3× mit D-PBS gewaschen. Die mit anti-2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder anti-DIG Antikörpern behandelten Membranen wurden ferner für 90 Min. bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm² Membran) 2 μg/ml Zweitantikörper (Ziege anti-Maus AlexaFluor680, Invitrogen, (Carlsbad, CA, USA) in Casein-PBS inkubiert, während die mit Streptavidin AlexaFluor680 behandelten Membranen für diese Zeit in Casein-PBS gehalten wurden. Nach intensivem Waschen mit D-PBS wurde die Fluoreszenz mit Hilfe eines Fluoreszenz-Lesegerätes (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) ausgelesen und mit Hilfe eines geeigneten Bildauswertungsprogramms (Odyssey Software V.1.2) quantifiziert. Die statistische Analyse der Daten wurde mit der GraphPad Prism Suite (V.4.0.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die unteren Nachweisgrenzen für jedes Konjugat sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 3: Hydrazide verschiedener Markierungen, die in Glykoprotein-Markierungsexperimenten verwendet wurden

Hydrazide verschiedener Markierungen	Chemischer Name	Vertreiber (soweit zutreffend)
Biotin	(+)-Biotinoylhydrazid	Molecular Biosciences
LC-Biotin	LC-(+)-Biotinoylhydrazid	Molecular Biosciences
SLC-Biotin	SLC-(+)-Biotinoylhydrazid	Molecular Biosciences
LC-DIG	Digoxigenin-3-0-succinyl-aminohexanoyl-hydrazid	Roche Diagnostics
2,4-D	2-(2,4-Dichlorphenoxy)essigsäurehydrazid	-
2,4-D-Ahx	6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäurehydrazid	-
2,4-D-Aun	11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäurehydrazid	-

Tabelle 4: Nachweisgrenzen von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Derivatmarkierten Proteinen im Vergleich zu analogen Digoxigenin- oder Biotin-markierten Konjugaten

Markierung	Primärer Antikörper (Klon)	Spacer	Nachweisgrenze [pg] von Proteinen nach Markierung mit
Markierung	Primärer Antikörper (Klon)	Spacer	Aktivester-Derivaten^(a)	Hydrazid-Derivaten^(b)
2,4-D^(c)	E2/G2	-	161,5 ± 41,3	114,6 ± 10,4
		C6^(d)	388,4 ± 72,1	24,8 ± 4,4^(e)
		C11^(f)	625,0 ± 125,0^(g)	51,9 ± 13,8^(g)
	E4/C2	-	261,2 ± 76,3	160,7 ± 23,1
		C6^(d)	70,3 ± 17,9	25,1 ± 8,0^(e)
		C11^(f)	415,2 ± 94,2^(g)	28,7 ± 9,4^(g)
	F6/C10	-	236,3 ± 62,6	114,6 ± 10,4
		C6^(d)	253,9 ± 60,4	2,7 ± 0,4^(h)
		C11^(f)	386,7 ± 110,5^(g)	13,7 ± 1,3^(g)
	B7	-	323,7 ± 65,7	100,4 ± 28,5⁽ⁱ⁾
		C6^(d)	352,7 ± 71,8	10,9 ± 1,8^(h)
		C11^(f)	625,0 ± 178,9^(g)	15,6 ± 0,0^(g)
DIG^(j)	1.17.256	-	n. a.	n. a.
		C6⁽ ^d ⁾	171,9 ± 55,4	80,4 ± 11,5
		C11⁽ ^e ⁾	n. a.	n. a.
Biotin	-^(k)	-	246,5 ± 67,2	270,1 ± 64,2
		C6^(d)	248,0 ± 66,6	49,1 ± 6,3
		C11^(e)	39063,0 ± 5508,0	114,6 ± 10,4

(a) Ovalbumin wurde mit verschiedenen Aktivestern markiert. Konjugate wurden seriell verdünnt und auf Nitrozellulosemembran wie beschrieben immobilisiert. (b) Das glykosylierte Protein Mucin wurde seriell verdünnt, auf Nitrozellulose immobilisiert, mit Periodat oxidiert und mit verschiedenen Hydraziden wie beschrieben markiert. Die verwendeten Reagenzien enthielten entweder (c) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), (j) Digoxigenin (DIG) oder Biotin als Markierung und entweder keinen (–) aliphatischen Spacer oder (d) Aminohexansäure (C6) oder (f) Aminoundecansäure (C11) als Spacer. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure- und DIG-Markierungen wurden durch spezifische Erstantikörper und AlexaFluor680-markierte Zweitantikörper detektiert, während (k) Biotin-Markierungen mit Streptavidin-AlexaFluor680 visualisiert wurden. Die Nachweisgrenzen (arithmetische Mittel +/– Standardfehler) oberhalb des Schwellenwerts sind in pg angegeben. Der Schwellenwert wurde nach der Methode beschrieben von Frey et al. (Frey A, Di Canzio J, Zurakowski B (1998). A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J Immunol Methods. 221: 35–41.) berechnet. (i) Nachweisgrenzen für 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Markierungen, die signifikant niedriger als diejenigen nach Markierung mit Biotin waren, (e) nach Markierung mit Biotin, das einen C6 Abstandhalter trägt oder (h) nach Markierung mit Biotin oder DIG, das einen C6 Abstandhalter trägt oder (g) nach Markierung mit Biotin, das einen C11 Abstandhalter trägt (P < 0,05, One-way ANOVA, Bonferroni Post hoc test). n. a.: nicht anwendbar, da das Markierungsreagenz kommerziell nicht erhältlich ist.

Beispiel 10
In-Sequenz-Markierung eines synthetischen Peptids mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-derivatisierten N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysinen und dessen Nachweis
18mer Oligopeptide, die das 16mer aminoterminale Fragment von Ovalbumin enthielten, wurden im SPOT-Syntheseverfahren auf Zellulose-Membranen nach Frank (Frank R 1992. Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis an a membrane support. Tetrahedron. 48: 9217–9232) synthetisiert. Kurz gesagt wurden Zellulose-Membranen mit 0,02 ml/cm² Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-geschütztem Prolin (0,2 M Fmoc-Prolin, 0,46 M Methylimmidazol und 0,26 M Diisopropylcarbodiimid (DICD) in N,N-Dimethylformamid (DMF)) derivatisiert. Überschüssige Hydroxylgruppen wurden für 24 h mit 15 ml (0,13 ml/cm² Membran) 2% (v/v) Essigsäureanhydrid in DMF geblockt, und die Membranen wurden 3× mit DMF gewaschen. Die Fmoc-Spaltung wurde zweimal durch 5 Min. Inkubation mit 10 ml (0,09 ml/cm² Membran) 20% (v/v) Piperidin in DMF durchgeführt, die Membranen wurden nochmals 5× mit DMF gewaschen, und das Vorliegen primärer Aminogruppen auf der Membran wurde durch Anfärben für 10 Min. bei RT mit 15 ml (0,13 ml/cm² Membran) 0,01% (w/v) Bromphenolblau in DMF verifiziert. Anschließend wurden die Membranen 3× mit 100% Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Diese Waschschritte und die Anfärbung wurden zwischen allen Synthesezyklen wiederholt. Zum Blockieren der nicht-reagierten Aminofunktionen wurde die Inkubation mit Essigsäureanhydrid nach dem dritten Synthesezyklus auf 20 Min. verkürzt. Die Synthesezyklen erfolgten mit einer automatischen Pipettiermaschine (ASP 222, Intavis Bioanalytical Instruments AG, Köln, DE). Die Maschine trug 0,1 μl einer 0,2 M Lösung von Boc-(tert-Butoxycarbonyl)-Lysin-(Fmoc)-OH, die 0,35 M Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 0,25 M DICD in N-Methylpyrrolidon enthielt, in definierten Arealen, sogenannten SPOTs, auf. In nachfolgenden Synthesezyklen wurden auf diese SPOTs 0,2 μl von 0,2 M Lösungen von N-alpha-Fmoc-geschützten Aminosäuren mit, soweit zutreffend, geschützten Seitenketten (tert.-Butyl (tBu) für Serin, Threonin, Tyrosin, Glutaminsäure, Asparaginsäure; Trityl für Asparagin, Glutamin, Histidin; t-Butyloxycarbonyl (Boc) für Lysin, Tryptophan; 2,2,4,6,7-Pentametyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) für Arginin; Acetamidomethyl (Acm) für Cystein), die 0,35 M HOBt in N-Methylpyrrolidon und 0,25 M DICD enthielten, aufgebracht. 30 Min. bevor die entsprechenden Kopplungslösungen verwendet wurden, wurden die darin enthaltenen Aminosäuren durch Zugabe von 1,25 Mol DICD pro Mol Aminosäure in ihre entsprechenden Aktivester überführt. Die Mischung ließ man für 30 Min. bei RT reagieren und zentrifugierte, um Präzipitate zu entfernen. Die Kopplung jeder Aminosäure wurde dreimal wiederholt, und in jeder Runde wurde eine Mindestreaktionszeit von 40 Min gewährt. 18mer-Peptide, die mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-derivatisierten N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysinen (2c), (4b) oder (4d) markiert waren, wurden auf diese Weise synthetisiert. Die Schutzgruppen der Seitenketten (mit Ausnahme von Acm) wurden durch zwei Inkubationen der Membranen für jeweils 1 h mit 10 ml (0,09 ml/cm² Membran) 50% (v/v) Trifluoressigsäure, 2% (v/v) Wasser und 3% (v/v) Triisobutylsilan in Dichlormethan (DCM) entfernt. Anschließend wurden die Membranen 4× mit DCM, 4× mit 0,1% (v/v) HCl, 50% (v/v) Methanol in Wasser und schließlich 4× mit 1 M Essigsäure (pH 1,9) gewaschen. Die Membranen wurden über Nacht im Vakuum getrocknet. Die Peptid-SPOTs wurden ausgestanzt und in 2 ml-Polypropylen-Röhrchen überführt. Um die Pep tide von den Membranen abzuspalten, wurden 500 μl einer Lösung von 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA), 20% (v/v) Ethanol, pH 7,5, in Wasser jedem Membranstück zugegeben. Die Stücke wurden über Nacht inkubiert, der Überstand wurde in ein frisches 2 ml-Röhrchen überführt, und die Spaltungsreaktion wurde für weitere 2 h wiederholt. Beide Peptidlösungen wurden vereinigt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die getrockneten Peptide wurden in 1,5 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM NaCl (L-PBS) × 0,005% (w/v) Tween 20 gelöst, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Schema a–c gibt eine Übersicht über die synthetisierten Peptide:

a) Amino-Terminus: Ac-x-GSIGAASMEFCFDVFK-y-z:Carboxy-Terminus
b) Amino-Terminus: Ac-y-GSIGAASMEFCFDVFK-x-z:Carboxy-Terminus
c) Amino-Terminus: Ac-GSIGAAS-y-MEFCFDVFK-x-z:Carboxy-Terminus (Ac = Acetyl, x = Lysin (Biotin), y = Derivate 2c, 4b or 4d, z = Diketopiperazin-Einheit, Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren)

Zum Nachweis der markierten Peptide wurden hochbindende Mikrotitrationsplatten mit 96 Vertiefungen (Corning, Corning, NY, USA) über Nacht bei 4°C mit 75 μl/Vertiefung einer Lösung von 50 ng/ml monoklonalen anti-2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Antikörpern (Klone E2/G2, E4/C2, F6/C10 oder B7) in L-PBS beschichtet. Die Platten wurden 3× mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gewaschen und für 3–4 h bei RT mit 1% (w/v) Casein (Hammarsten Grade, BBH, Poole, GB) in D-PBS (Casein-PBS) abgesättigt. Die Platten wurden 4× mit D-PBS gewaschen, und es wurden 75 μl von Lösungen seriell verdünnter markierter Peptide zugegeben (1:750 – 1:1.536.000 in D-PBS). Man ließ die Peptide für 2,5 h bei RT binden, bevor die Platten 4× mit D-PBS gewaschen wurden.
Zum Nachweis der gebundenen Peptide wurden die Platten mit 75 μl/Vertiefung einer 1 μg/ml Lösung aus Meerrettich Peroxidasemarkiertem Streptavidin in Casein-PBS für 60 Min. bei RT (Vector Laboratories, Burlingame CA, USA) inkubiert. Die Platten wurden 6× mit D-PBS gewaschen, und nach Zugabe von 75 μl/Vertiefung eines 3,3',5,5'-Tetrametmylbenzidin-Wasserstoffperoxid-Substrats (Frey A, Meckelein B, Externest D, Schmidt MA (2000). A stable and highly sensitive 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods. 233: 47–56) ließ man die Farbe für 30 Min. entwickeln. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von 125 μl/Vertiefung einer 1 M Schwefelsäure gestoppt, und die Absorption wurde mit einem Mikrotitrationsplattenlesegerät (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei 450 nm bestimmt. Das Bindungsverhalten von Peptiden, die mit verschiedenen 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-derivatisierten N-alpha-9-Fluorenymethyloxycarbonyl)-L-lysinen markiert waren, ist in 2 gezeigt.
Beispiel 11
Reversible Markierung eines Peptids mit 2-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)-1-hydroxyethyliden)-5,5-dimethylcyclohexan-1,3-dion (2,4-D Dimedon) und Nachweis davon
Ein 15mer Fragment aus Ovalbumin (NH₂-GSIGAASMEFCFDCF-COOH) wurde wie in Beispiel 10 beschrieben im SPOT-Verfahren synthetisiert. Im Unterschied zu Beispiel 10 wurde das Peptid aber über den nicht abspaltbaren Anker beta-Alanylalanin (beta-A) an der Membran immobilisiert (NH₂-Peptid-COOH-beta-A-Membran). Nach Entfer nung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe wurde das Peptid mit 0,2 μl einer Lösung aus 0,2 M 2,4-D-Dimedon (1c) in N-Methylpyrrolidon derivatisiert. Die Seitenkettenschutzgruppen wurden wie beschrieben entfernt, die Membran 3× mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gewaschen und für 5 Stunden bei RT mit 1% (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, GB) in D-PBS (Casein-PBS) abgesättigt. Die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Markierung wurde detektiert durch Inkubation mit 4 ml (2 ml/cm² Membran) einer Lösung von 1 μg/ml biotinyliertem anti-2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Antikörper (Klon E4/C2; biotinyliert nach Herstellerangaben mit 15-([Biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecansäure-N-hydroxysuccinimidylester (NHS-PEO4-Biotin) (Uptima über KMF Laborchemie Handels GmbH, Lohmar, DE)) in Casein-PBS über Nacht bei 4°C, gefolgt von 3 ml (1,5 ml/cm² Membran) 250 μg/ml AlexaFluor680-markiertem Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in Casein-PBS für 90 min bei RT. Nach jeder Inkubation mit Antikörpern oder Streptavidin wurde die Membran 6× für 10 min bei RT mit D-PBS gewaschen. Die Fluoreszenz wurde mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes und eines entsprechenden Bildauswerteprogramms (Odyssey Infrared Imager & Odyssey Software V1.2, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) quantifiziert, und die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Markierung wurde durch Behandlung der Membran mit 4 ml (2 ml/cm² Membran) 5% (v/v) Hydrazin-Monohydrat in D-PBS für 5, 20 oder 60 min bei RT entfernt. Nach jeder Inkubation wurde die Membran 3× mit D-PBS gewaschen und die Rest-Fluoreszenz wurde erneut quantifiziert. Nach vollständiger Spaltung der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Markierung wurde die Membran mit DMF gewaschen, und das Peptid wurde aminoterminal mit 4 ml (2 ml/cm² Membran) 2% Essigsäureanhydrid in DMF acetyliert.
Die Membran wurde intensiv mit DMF gefolgt von Ethanol gewaschen und nachfolgend an der Luft getrocknet. Nach Absättigung mit Casein-PBS für 5 h bei RT, wurde die Membran mit 4 ml (2 ml/cm² Membran) einer Lösung von 1 μg/ml monoklonalem Maus anti-Ovalbumin Antikörper (reaktiv gegenüber dem hierin synthetisierten 15mer-Fragment von Ovalbumin; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, DE) in Casein-PBS über Nacht bei 4°C inkubiert, gefolgt von 4 ml (2 ml/cm² Membran) einer Lösung von 2 μg/ml Ziege anti-Maus IgG AlexaFluor680-markiertem Zweitantikörper (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in Casein-PBS für 90 min bei RT. Nach jeder Inkubation mit Antikörpern wurde die Membran 6× für 10 min bei RT mit D-PBS gewaschen. Die Fluoreszenz wurde wie oben beschrieben quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst.

Claims

Kit umfassend Mindestens eine Markierungsverbindung, gekennzeichnet durch Formel (I)
die in Wasser stabil und löslich ist, wobei der „Spacer" 1 bis 25 gleiche oder verschiedene geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Saccharide oder aus der folgenden Gruppe ausgewählte Reste umfasst:
wobei X -O- oder -S- ist und n eine ganze Zahl im Bereich zwischen 1 und 10 ist, wobei RG aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist
wobei R gleiche oder verschiedene Reste aus der folgenden Gruppe sind: -H, linearer, verzweigter oder zyklischer Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, linearer oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, geschütztes oder ungeschütztes Amin, ferner umfassend einen Antikörper, monovalentes Fab- oder divalentes (Fab)₂-Fragment, der/das geeignet ist, an die Markierungsverbindung zu binden.
Kit nach Anspruch 1, wobei die Markierungsverbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
Kit nach Anspruch 1, wobei die Markierungsverbindung gekennzeichnet ist durch Formel (II)
bei der Z1 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten
mit n1 = 1–15, wobei Z2 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten
mit n2 = 1–15, wobei M⁺ ein einwertiges, anorganisches oder organisches Kation ist, wobei PG eine Amino-Schutzgruppe ist.
Kit nach Anspruch 1, wobei die Markierungsverbindung gekennzeichnet ist durch Formel (III)
mit n = 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15.
Kit nach Anspruch 3, wobei M⁺ ein Lithium-, Kalium-, Ammonium-, Rubidium-, Cäsium-, Natrium- oder Tetraalkylammoniumion ist.
Kit nach Anspruch 3, wobei die Amino-Schutzgruppe S-Acetamidomethyl-(Acm), t-Butyloxycarbonyl- (Boc), t-Butyl-(tBu), Trityl-(Trt), 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl-(Pbf), Tosyl-(Ts), Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc), (1,1,-dioxobenzo[b]thiophene-2-yl-methyl)oxycarbonyl (Bsmoc), oder beta-2-Adamantyl (Ada) ist.
Kit nach Anspruch 3, wobei n1 5 oder 10 ist und/oder n2 5 oder 10 ist.
Kit nach den Ansprüchen 1 bis 7, das ferner Puffer und/oder Lösungen und/oder Reagenzien umfasst, die zur Kopplung der Verbindungen an Substratmoleküle und zur Durchführung von Nachweisassays mit Antikörpern geeignet sind.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Markierung und zum Nachweis von Substratmolekülen.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der das Substratmolekül ein Makromolekül ist.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der das Substratmolekül ein biogenes Makromolekül ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 9 bis 11, bei der das Substratmolekül eine Aminosäure, ein verzweigtes oder unverzweigtes Oligopeptid, Polypeptid, Protein, Nukleinbase, Oligonukleosid, Polynukleosid, Nukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotid, Nukleinsäure, Monosaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid, Lipid oder Glykoprotein ist.
Verwendung nach Anspruch 12, bei der das Substratmolekül ein Polypeptid mit 2 bis 25 Aminosäuren ist.
Verwendung nach Anspruch 12, bei der das Protein eine Masse von mehr als 5 kDa hat.
Verwendung nach Anspruch 12, bei der das Oligosaccharid 2 bis 25 Monosaccharide umfasst.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für immunologische Assays, festphasengestützte diagnostische Anwendungen, enzymgekoppelte Immunosorbent Assays, Hybridisierungsassays, Polymerasekettenreaktionen und biologische Markierungs- oder Aufnahmeexperimente.