KR101845581B1 - 3관능성 가교 시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) 표적 당단백질 수용체 상에 적어도 하나의 결합 부위를 가진 대상 리간드에 접합하기 위한 리간드-반응성 기, (ii) 산화된 수용체-당펩티드를 포획하기 위해 경우에 따라 보호된 방향족 히드라진기와 (iii) 포획된 당펩티드를 검출, 분리 및 정제하기 위한 친화성 기를 보유한 3관능성 가교 시약, 이들의 제조방법, 뿐 아니라 생체 세포 상에서 또한 생체액에서 리간드와 이들의 대응 당단백질 표적 수용체 간의 상호작용을 검출, 동정 및 특성 평가하기 위한 방법에 있어서 상기 3관능성 가교 시약의 용도에 관한 것이다.

Description

3관능성 가교 시약{TRIFUNCTIONAL CROSSLINKING REAGENTS}
본 발명은 (i) 표적 당단백질 수용체 상에 적어도 하나의 결합 부위를 가진 대상 리간드에 접합하기 위한 리간드-반응성 기, (ii) 산화된 수용체-당펩티드를 포획하기 위해 경우에 따라 보호된 방향족 히드라진기와 (iii) 포획된 당펩티드를 검출, 분리 및 정제하기 위한 친화성 기를 보유한 3관능성 가교 시약, 이들의 제조방법, 뿐 아니라 생체 세포 상에서 또한 생체액에서 리간드와 이들의 대응 당단백질 표적 수용체 간의 상호작용을 검출, 동정 및 특성 평가하기 위한 방법에 있어서 상기 3관능성 가교 시약의 용도에 관한 것이다.
글리코실화는 가장 중요한 단백질 변형 중 하나로서, 모두는 아니지만 많은 경우에 포유류 세포에 의해 생산된 분비 및 막-결합 단백질은 공유결합된 글리칸을 함유하고 있다(Varki, A. et al. Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009). 복합 생물체의 회합시 이러한 올리고당 단백질은 분비된 세포 표면 단백질의 접힘, 세포내 국재성, 대사회전(turnover), 활성과 상호작용을 위한 다양한 구조적 및 기능적 역할을 제공한다.
분비된 당단백질은 예를 들면 사이토킨, 호르몬, 성장 및 분화인자, 효소, 신경 펩티드, 혈관매개체, 항원인식분자, 면역조절분자, 구조 당단백질과 그 밖의 생물활성 분자를 포함한다. 이들 단백질은 세포간 신호전달, 면역반응, 세포사멸, 숙주-병원체 상호작용과 많은 질환의 병인학과 같은 다수의 인식 사례에 있어서 중요하다. 이에 따라, 소정의 표적 수용체에 대한 이러한 당단백질의 특이성은 세포간 정보교환에 있어 필수적이다. 따라서 분비된 당단백질과 이들의 표적과의 리간드 결합 상호작용의 동정과 특성 평가는 생물학적 정보전달의 분자적 이해를 위해 꼭 필요하다.
유사하게, 단백질, 펩티드, 호르몬, 화학분자, 약제학적 약물 또는 독소와 같은 리간드에 의한 세포 표면 당단백질 수용체(CSR)의 회합은 세포 미소환경으로부터 세포로의 정보 전달을 가능하게 한다. 이 세포 표면 정보 게이트웨이는 세포반응을 위해 중요하다는 사실에도 불구하고, 많은 기능성 리간드에 대한 수용체는 알려져 있지 않다. 이는 주로 소수성 세포막 수용체 단백질의 동정에 있어서 기술적 한계와 리간드와 이들의 대응 CSR과의 일과성이면서 낮은 친화성 상호작용 때문이다. 따라서 많은 신호전달 단백질과 분자는 공지의 1차 분자 표적이 없는 고아(orphan) 리간드로 남게 된다 - 이는 신호전달, 약물작용, 탈표적(off-target) 효과 또는 질환-관련 신호전달망의 각 기작의 상세한 분자적 이해를 위해 현재 간과하고 있는 귀중한 정보이다.
생물계에서 일과성 리간드-수용체 상호작용을 동정하기 위한 유망한 접근방법은 상호작용하는 분자를 화학적으로 가교한 후 상호작용 대상들을 질량 분광 분석에 의해 동정하는 것이다. 현재 알려져 있고 시판되고 있는 가교제는 전형적으로 용액 중에서 분리된 단백질과의 단백질 계면을 매핑하는데 사용하기 위해 고안되어 왔다. 예를 들면 동종 2관능성 또는 이종 2관능성 가교제(절단성 또는 동위원소-코딩 유도체)는 단백질을 화학적으로 가교한 후 효소 분해에 이어 단백질과 단백질 복합체의 3차원 구조 매핑용으로 가교된 펩티드를 질량 분광 분석에 의해 동정하기 위해 사용되어 왔다(JMS (2003) vol. 38 (12) pp. 1225-37). 그러나 이러한 분자와 함께 얻어진 가교된 펩티드 종은 전형적으로 존재량이 상대적으로 매우 낮고 가교된 펩티드에 의해 얻어진 질량 스펙트럼의 생물 정보를 분석하는 것은 벅찬 과제이다. 이는 특히 전형적으로 리간드와 이들의 대응 수용체와의 전형적으로 일과성인 상호작용을 검출하기 위한 복합 생체 시료에서의 가교 부위 동정을 방해한다.
복합 시료로부터 가교 펩티드를 특이적으로 농축하기 위해서 상호작용하는 단백질을 포획하기 위한 2개의 반응성(전형적으로 아민-반응성, 설프히드릴-반응성 또는 광반응성) 부위의 조합과 포획된 펩티드를 추후 농축하기 위한 친화성 기(전형적으로 비오틴)를 갖는 3관능성 가교제가 개시되었다(J Am Soc Mass Spectrom (2005) vol. 16 (12) pp. 1921-31). 이들 가교제는 분리된 단백질과 단백질 복합체의 위상 구조 매핑용으로 성공적으로 사용되었지만, 이들의 화학적 속성으로 인해 생체 세포로부터 유도된 복합 시료에서 일과성 단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 있어 부적합하다.
이는 생체액 또는 생체 세포의 원형질막과 관련한 생물학적 미소환경에서 표적 당단백질 수용체와의 리간드 상호작용의 조사, 동정 및 특성 평가를 구체적으로 보조할 수 있는 적합한 시약에 대한 필요성을 강조하는 것이다. 본 출원인들이 알고 있는 바로는, 현재 알려진 가교제 중 어느 것도 생체 세포의 표면과 같은 복합적인 자연 환경에서 기지의 리간드와 미지의 당단백질 수용체 결합 상대 간의 특이적 상호작용의 공유결합 안정화와 후속 질량-분광 분석에 의한 동정을 가능하게 하기 위한 구조적 요건을 충족할 수 없다.
이에, 본 출원인들은 이하에서 본 발명의 가교제라고도 하는 신규한 3관능성 가교 시약류가 종래기술의 표적 수용체의 리간드-기반 동정에 있어 본질적인 문제들을 극복할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 가교제는 생체 세포 상에서 또는 생체액이 적용된 유사-생리학적 조건에서 높은 감도와 특이성으로 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 리간드-수용체 상호작용을 명확하게 검출 및 특성 평가하기 위해 이용할 수 있다. 따라서 이 방법은 단백질, 펩티드, 지질, 인공 친화성 결합제, 화학분자, 약물, 바이러스 또는 박테리아와 같은 고아 리간드에 대한 미지의 표적 수용체를 동정하기 위해 적용될 수 있다. 이에 따라, 상기 신규한 가교 시약은 복합 정보 게이트웨이로서 인간 표면 단백질체(surfaceome)와 분비 단백질체(secretome)의 이해를 위한 기술적 근거 및 천연 미소환경 내에서 거의 모든 기재된 고아 리간드에 대한 표적 당단백질 수용체를 동정하기 위한 수단을 제공한다.
제1요지에 있어서, 본 발명은 3개의 분기를 보유한 코어 구조를 가진 3관능성 가교 시약으로서 상기 분기 각각은 상이한 작용기를 포함하는 3관능성 가교 시약(이에 따라 상기 가교 시약은 이종 3관능성이라고도 함)에 관한 것이다. 제1분기는 산화된 당단백질과 반응할 수 있는 보호되거나 보호되지 않은 방향족 히드라진을 포함한다. 제2분기는 선택 리간드에 접합될 수 있는 리간드-반응성 기를 포함한다. 제3분기는 제1 및 제2작용기에 의해 포획된 펩티드를 정제, 바람직하게는 친화성 정제하기 위한 친화성 기를 포함한다. 이들 시약은 하나의 분자 내 이들 3개의 서로 다른 작용기의 조합이 독창적이면서 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용의 검출과 특성 평가와 같은 다양한 생의학적 용도에서 사용되기 때문에 특별한 중요성을 갖고 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 I의 3관능성 가교 시약에 관한 것이다:
Figure 112013079011747-pct00001
상기 식에서
X는 코어 구조이고;
A는 친화성 기이고;
S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
L은 리간드-반응성 기이고;
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN은 H 또는 히드라진-보호기이다.
바람직한 실시형태에 있어서, X는 하기 화학식 II의 기이다:
Figure 112013079011747-pct00002
상기 식에서 점선은 기 S1, S2, S3에 대한 W1, W2, W3의 연결을 나타내고,
W1는 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3는 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고, s는 1 내지 12이다.
몇몇 실시형태에 있어서, L은 (i) 바람직하게는 -COOH, -NH2, -OH, -SH, -CH=CH-와 -CH=CH-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 작용기 또는 (ii) 아민-반응성 기, 히드록실-반응성 기, 티올-반응성 기, 알데히도- 또는 케토-반응성 기와 카르복시-반응성 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성화된 작용기이다.
다른 실시형태에 있어서, A는 비오틴과 같은 친화성 기이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 스페이서 기 S1, S2, S3는 서로 독립적으로 (i) 단일 결합 또는 (ii) 하나 이상, 바람직하게는 인접하지 않은 -CH2-기가 서로 독립적으로 하나 이상의 연결기 및/또는 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있되 O와 N과 같은 헤테로원자는 서로 직접 연결되지 않는 직쇄 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 C(1-24)알킬렌이다.
특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 3관능성 가교 시약은 하기 화학식 III의 구조를 갖는다:
Figure 112013079011747-pct00003
상기 식에서
A는 친화성 기이고;
L은 리간드-반응성 기이고,
S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN는 H 또는 히드라진-보호기이고
W1은 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3는 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고,
s는 1 내지 12이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 3관능성 가교 시약은 하기 화학식 VII의 구조를 갖는다:
Figure 112013079011747-pct00004
상기 식에서
S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
W1는 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3는 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN은 H 또는 히드라진-보호기이고,
s는 1 내지 12이다.
또 다른 요지에 있어서, 본 발명은 또한 리간드와 세포 표면 또는 분비된 당단백질 수용체와 같은 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 특성 평가 및 분석하기 위한 본 발명의 3관능성 가교 시약의 용도에 관한 것이다.
또 다른 요지에 있어서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 리간드와 시료 내 적어도 하나의 탄수화물 잔기를 가진 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법으로서, 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 도메인을 인식하는 방법에 관한 것이다:
i) 상기 표적 당단백질 수용체를 포함하는 시료를 제공하는 단계,
ii) 상기 표적 당단백질 수용체를 산화 처리하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기 상에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화된 표적 당단백질 수용체를 얻는 단계,
iii) 3개의 서로 다른 분기 상에 (보호된) 히드라진기, 리간드-반응성 기, 친화성 기를 보유한 본 발명에 다른 3관능성 가교 시약(화학식 I, III, V, VI, VII, VIII, IX에 따른 3관능성 가교 시약과 같은)을 제공하고, 상기 리간드에 리간드-반응성 기를 접합하여 리간드-가교 시약-복합체를 얻는 단계,
iv) (a) 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 도메인에 결합할 수 있고 (b) 보호된 히드라진기가 유리 형태로 전환되고 산화된 표적 당단백질 수용체와 반응할 수 있는 조건에서 시료를 리간드-가교 시약-복합체에 접촉시켜 2중 펩티드-결합 복합체를 얻는 단계,
v) 상기 2중 펩티드-결합 복합체를 시료로부터 분리 정제하는 단계,
vi) 단계(iv)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체로부터 펩티드를 방출하여 방출된 펩티드를 얻는 단계,
vii) 단계(v)에서 얻은 방출된 펩티드를 고질량 정확도 질량 분광 분석법에 의해 분석 및 정량화하는 단계, 및
vii) 상기 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 대조군 반응과의 정량 비교를 통해 동정하는 단계.
다른 요지에 있어서, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의되어 있는 바와 같은 3관능성 가교 시약과 같은 서로 다른 3개의 분기 상에 (보호된) 히드라진기, 리간드-반응성 기와 친화성 기를 보유한 본 발명에 따른 3관능성 가교 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1: 세포 표면 표적 당단백질 수용체의 리간드-기반 수용체 포획 과정의 흐름을 개략적으로 나타낸 도면.
도 2: 인슐린으로 포획하는 리간드-기반 수용체의 상대적-정량 평가.
도 3: CD44 항체로 포획하는 리간드-기반 수용체의 상대적-정량 평가.
달리 정의되어 있지 않는 한, 명세서 전체 내용에서 다음과 같은 정의를 사용한다:
본 명세서에서 사용하고 있는 단수 형태는 달리 언급하지 않는 한 적어도 하나를 의미한다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "포함한다"는 제한 없이 포함하는 것을 의미한다. 용어 "복수 개"는 2개 이상의 수를 의미한다.
용어 "3관능성"은 "3개의 작용기를 보유한"을 의미한다. 이에 따라, 3관능성 (가교) 시약은 3개의 작용기를 가진 (가교) 시약을 말하는 것이다. 용어 "이종 3관능성"은 "3개의 서로 다른 작용기를 보유한"을 의미한다.
용어 "(상호작용을 하는) 결합" 또는 "상호작용"은 상호 친화성 또는 결합능을 나타내는 대응하는 한 쌍의 분자(예를 들면 리간드/표적 당단백질 수용체) 간의 상호작용하는 어떠한 유형의 회합을 의미한다. 상호작용하는 회합은 예를 들면 상호 반응성을 나타내는 대응하는 한 쌍의 화학적 반응성 기(공여기/수용기, 산/염기 등) 사이에 일어난다. 예시적인 결합 사례로는 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 수소결합, 반데르발스 힘, 이온성 상호작용, 비이온성 상호작용, 정전기성 상호작용, 공유결합 등을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 결합 사례의 속성에 따라 상호작용은 서로 다른 수준, 즉 일시적이거나 영구적인, 약하거나 강한 결합을 가질 수 있다는 것으로 이해된다.
본 발명은 신규한 이종 3관능성 가교제 및 생체 세포 또는 분비된 당단백질 상에 원형질막 당단백질을 포함하는 표적 당단백질 수용체와 리간드 상호작용을 명확하게 검출하기 위한 간단한 정량적 질량 분광 분석 과정의 흐름에 있어 상기 이종 3관능성 가교제의 용도에 관한 것이다.
따라서 제1요지에 있어서, 본 발명은 3개의 분기를 보유한 코어 구조를 가진 3관능성 가교 시약으로서 상기 분기 각각은 상이한 작용기를 포함하는 3관능성 가교 시약(이에 따라 상기 가교 시약은 이종 3관능성이라고 할 수도 있음)에 관한 것이다. 제1분기는 산화된 당단백질과 반응할 수 있는 보호되거나 보호되지 않은 방향족 히드라진을 포함한다. 제2분기는 선택 리간드에 접합될 수 있는 리간드-반응성 기를 포함한다. 제3분기는 제1 및 제2작용기에 의해 포획된 펩티드를 정제, 바람직하게는 친화성 정제하기 위한 친화성 기를 포함한다. 이들 시약은 하나의 분자 내 이들 3개의 서로 다른 작용기의 조합이 독창적이면서 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용의 검출과 특성 평가와 같은 다양한 생의학적 용도에서 사용되기 때문에 특별한 중요성을 갖고 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 I의 3관능성 가교 시약을 제공한다:
Figure 112013079011747-pct00005
상기 식에서 X는 코어 구조이고; S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고; L은 리간드-반응성 기이고; A는 친화성 기이고; Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고 R1은 H 또는 히드라진-보호기이다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "알킬"은 1-24개, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 의미한다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 용어 "알콕시"는 -O-알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "알킬렌"은 예를 들면 R이 H 또는 선택된 치환기인 -CHR-(CHR)n-와 같은 탄화수소로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 전형적으로, 알킬렌기는 1 내지 24개의 탄소원자(즉, n=24), 바람직하게는 10 내지 24개의 탄소원자를 가질 것이다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "헤테로알킬렌"은 알킬 라디칼에 O, N 또는 S, 바람직하게는 O 또는 N과 같은 하나 이상의 헤테로원자가 삽입된 알킬렌을 의미한다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "아릴"은 6-탄소 단환, 10-탄소 2환, 14-탄소 3환 방향족 고리계로서, 각 고리가 비치환되거나 1 내지 4개의 치환기를 가질 수 있는 방향족 고리계를 의미한다. 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸과 안트라세닐을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 내용과 관련하여 사용하고 있는 페닐렌은 바람직하게는 경우에 따라 치환되는 1,2-, 1,3- 또는 1,4-페닐렌기를 의미한다.
용어 "시클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소를 가진 포화되고 부분적으로 비치환된 고리형 탄화수소기를 의미한다. 시클로알킬기의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸과 시클로옥틸을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자(O, N 또는 S와 같은)를 가진 방향족 5-8원 단환, 8-12원 2환 또는 11-14원 3환 고리계를 의미한다. 헤테로아릴기의 예로는 피리딜, 푸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴과 티아졸릴을 포함한다. 피리딜은 2-피리딜, 3-피리딜과 4-피리딜, 바람직하게는 2-피리딜을 포함한다. 용어 "헤테로아랄킬"은 헤테로아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다.
용어 "헤테로시클로알킬"은 하나 이상의 헤테로원자(O, N 또는 S와 같은)를 가진 비방향족 5-8원 단환, 8-12원 2환 또는 11-14원 3환 고리계를 의미한다. 헤테로시클로알킬기의 예로는 피페라지닐, 피롤리디닐, 디옥사닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐과 글루코실을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴은 비치환되거나 1 내지 4개의 치환기를 가질 수 있다. 치환기의 예로는 1 내지 6개의 탄소원자를 가진 알킬, 알케닐, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 알콕시기로부터 선택되는 적어도 하나의 할로, 히드록실, 아미노, 시아노, 니트로, 메르캅토, 카르복시 또는 히드로카르빌기를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 히드로카르빌-치환 시클로알킬기로는 2-메틸시클로프로필, 2-에틸시클로프로필, 2-메틸시클로부틸, 3-메틸시클로부틸, 2-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 3-이소-프로필시클로펜틸, 2,6-디메틸시클로헥실, 4-(t-부틸)시클로헥실, 2-비닐시클로헥실, 3-알릴시클로펜틸, 3,4-디알릴시클로펜틸, 1-(4-피리디닐)피페리디닐, 1-(4-피리디닐메틸)피페리디닐, 4-(4-피리디닐)피페리디닐, 4-(4-피리디닐)피페라진-1-일과 비시클로헥실기를 포함한다.
예시적인 히드로카르빌-치환 시클로알케닐기로는 3-메틸-3-시클로펜텐-1-일, 3,4-디메틸-3-시클로펜텐-1-일, 2-이소-프로필-2-시클로펜텐-1-일, 2,3-디에틸-2-시클로펜텐-1-일, 4-비닐-1-시클로헥센-1-일, 3,4-디에틸-3-시클로펜텐-1-일과 3,4-디알릴-3-시클로펜텐-1-일기를 포함한다.
예시적인 히드로카르빌-치환 아릴기로는 톨릴, 메시틸, 크실릴, 큐메닐, 시메닐, 3,5-디(t-부틸)페닐, 2-메틸나프틸, 2-비닐페닐, 2-비닐벤질, 2-비닐나프틸, 4-시클로헥실페닐, 비페닐, 4-(4-피페리디닐)피리디닐과 p-터페닐기를 포함한다.
예시적인 히드로카르빌-치환 헤테로아릴기로는 2-메틸피리딘-1-일, 2-에틸피리딘-1-일, 3-비닐이미다졸-1-일, 2-메틸이미다졸-1-일, 2-메틸퀴녹살린-1-일, 1-알릴벤조트리아졸릴, 2,2'-비피리딜, 4,4'-비피리딜, 4-메틸피라지닐, 4-(피리디닐메틸)-피리디닐, 4-벤질피라지닐, 니코틴아미딜, 2-메틸푸라닐, 5-메틸푸르푸릴아미노, 2-메틸티오페네일, 4-메틸옥사졸릴, 2,5-디페닐-4-메틸옥사졸릴과 4-메틸티아졸릴기를 포함한다.
용어 "할로겐"은 클로로, 플루오로, 브로모 또는 요오도 치환기, 바람직하게는 클로로 또는 플루오로 치환기를 의미한다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "경우에 따라 치환된"은 전형적으로 Hal, -OR, -CN, -NO2, -COOR, C(1-8)알킬, C(1-8)알킬렌, C(1-8)알콕시에 의한 치환을 의미하는 것으로 이때 R은 1 내지 8개의 탄소원자이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 상기 가교 시약은 수용성이고 생체친화성이다.
용어 "수용성"은 전형적으로 어떤 물질의 수중 용해도가 24℃에서 상기 물질과 물의 총량 대비 1 중량%가 넘는 것을 의미한다. 수용성은 본 발명의 가교제의 친수성, 보다 구체적으로는 A, L, X, Z, S1, S2, S3와 RN 중 하나 이상의 기의 친수성에 의해 부여되는 것으로 이해된다. 당업자라면 충분히 친수성인 가교제를 얻기 위해 어떤 화학 기를 선택할 것인지 알 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 스페이서 기 S1, S2와 S3 중 하나 이상은 더 많은 친수 특성의 작용기를 포함하여 그 결과 얻어지는 가교 시약의 친수성을 증가시킬 수 있다.
용어 "생체친화성"은 인간 세포, 조직 또는 체액에 대한 화학적 불활성과 이러한 생체 물질에 대한 가교 시약의 최소 독성 효과를 의미한다.
코어 구조 X는 스페이서 기 S1, S2, S3와 작용기 A, L과 방향족 히드라진기로 구성된 3개의 분기 상에 생성하도록 하는 임의의 구조일 수 있다. 이에 따라, 상기 코어 구조는 바람직하게는 이하에 정의된 바와 같은 3개의 반응성 작용기, 바람직하게는 카르복실, 아미노, 히드록실, 티올 등을 상기 3개의 스페이서 기에 대한 부착 부위로서 보유한다.
전형적으로, 상기 코어 구조와 스페이서 기는 3개의 분기 사이(즉, 3개의 작용기 A, L과 방향족 히드라진기 사이)의 입체적 장애가 미약하거나 없도록 설계된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 코어 구조 X는 치환된 알킬기, 예를 들면 트리- 또는 테트라-치환 탄소원자, 예를 들면 α-아미노산 H2N-CHRAA-COOH(RAA는 아미노산 측쇄임)의 α-탄소와 같은 치환된 탄화수소일 수 있다. 즉, X는 반응성 기가 있는 측쇄 RAA를 가진 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 천연 아미노산의 예로는 예를 들면 라이신, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 등을 포함한다. 비천연 아미노산의 예로는 예를 들면 대응 D-아미노산, 호모세린 등을 포함한다. 이들 실시형태에 있어서, 상기 3개의 스페이서 기 S1, S2, S3은 아미노-기, 카르복시-기와 반응성 측쇄기 RAA에 연결될 수 있다.
이와 관련한 특정 실시형태에 있어서, X는 하기 화학식 II의 기일 수 있다:
Figure 112013079011747-pct00006
상기 식에서 점선은 기 S1, S2, S3에 대한 W1, W2, W3의 연결을 나타내고,
W1는 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3는 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고, s는 1 내지 12이다.
바람직한 일 실시형태에 있어서, W1과 W3은 -NH-이고, W2는 -CONH-이다.
화학식 IV의 기에서 3개의 작용기 중 어느 하나는 3개의 연결기 S1, S2, S3 중 어느 하나에 결합될 수 있는 것으로 이해된다. 바람직한 실시형태에 있어서, W1은 S1에 연결되고, W2는 S2에 연결되고, W3은 S3에 연결된다.
이와 관련한 다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 3관능성 가교 시약은 하기 화학식 III의 화합물이다:
Figure 112013079011747-pct00007
상기 식에서
A는 친화성 기이고;
L은 리간드-반응성 기이고,
S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN는 H 또는 히드라진-보호기이고
W1은 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3는 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고,
s는 1 내지 12이다.
바람직한 실시형태에 있어서, s는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, sec-펜틸, neo-펜틸, 1,2-디메틸프로필, n-헥실, 이소-헥실, n-헵틸, n-옥틸이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 코어 구조는 적어도 3-치환된 아릴 또는 헤테로아릴기, 바람직하게는 하기 화학식 IV의 3관능성 6-원 아릴 또는 헤테로아릴기일 수 있다:
Figure 112013079011747-pct00008
상기 식에서 V1, V2, V3은 서로 독립적으로 카르복시, 아민, 히드록실, 티올과 같은 작용기이고, Ra, Rb, Rc는 서로 독립적으로 O 또는 N이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 코어 구조는 선형 또는 고리형 글리세롤 또는 당 성분으로부터 유도될 수 있다. 본 명세서에 기재되어 있는 3관능성 가교 시약의 제조에 사용될 수 있는 선택적인(또한 특이적으로 제거가 가능한) 보호기를 가진 다양한 당류를 이용할 수 있다.
당업자라면 다른 다양한 코어 구조가 스페이서 기와 작용기를 위해 필요한 골격을 제공할 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 3관능성 가교 시약의 작용기 L은 스페이서를 선택된 리간드에 결합시키고 이에 따라 3관능성 가교 시약이 특정 표적 당단백질 수용체를 향하도록 하기 위해 사용되는 반응성 작용기 또는 활성화된 작용기와 같은 리간드-반응성 기이다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "반응성 작용기"는 (달리 언급하지 않는 한) 보호되지 않은 유리 작용기를 의미한다. 특정 실시형태에 있어서, 반응성 작용기는 COOH, -NH2, -OH, -SH, -CH=CH-와 CH=CH-COOH로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "활성화된 작용기"는 결합제를 이용하는 표준 화학 기술에 의해 활성화되어 해당 활성화된 작용기를 얻는 반응성 작용기를 의미한다. 상기 반응성 작용기 또는 활성화된 작용기는 리간드 상에 존재하는 이들의 대응되는 반응성 기와 반응할 수 있다.
상기 활성화된 작용기는 이들의 특이적 반응성에 따라 하위 군으로 나눌 수 있다. 이와 관련한 특정 실시형태에 있어서, 활성화된 작용기는 아민-반응성 기, 히드록실-반응성 기, 티올-반응성 기, 알데히도- 또는 케토-반응성 기와 카르복시-반응성 기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"아민-반응성 기"는 (1차 또는 2차) 아민과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 아민-반응성 기는 예를 들면 아릴 또는 알킬 활성화된 카르복실산 에스테르 -COOR로서, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 이들의 유도체(예를 들면 설포-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 페놀 에스테르 또는 이들의 유도체(예를 들면 R이 페놀, p-니트로페놀, 테트라플루오로페놀임)를 포함한다. 다른 아민 반응성 기로는 아실 클로라이드(-COCl), 아릴과 알킬 이미데이트(-C(NH)OMe)와 알킬 또는 아릴 이소시아네이트 -NCO 또는 이소티오시아네이트 -NCS를 포함한다.
"히드록실-반응성 기"는 히드록실과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 히드록실-반응성 기로는 예를 들면 알킬 또는 아릴 이소시아네이트 -NCO와 아릴 또는 알킬 활성화된 카르복실산 에스테르 -COOR를 포함한다.
"티올-반응성 기"는 티올과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 티올-반응성 기로는 예를 들면 말레이미드 또는 알파-할로아미드(-NH-CO-CH2-Hal)를 포함한다.
"알데히드- 또는 케토-반응성 기"는 (1차 또는 2차) 알데히드 또는 케톤과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 알데히드- 또는 케토-반응성 기로는 예를 들면 아릴 또는 알킬 히드라진(-NHNH2), 아릴 또는 알킬 아실히드라진(-CO-NHNH2), 알킬 또는 아릴 히드록실아민(-ONH2)을 포함한다.
"카르복시-반응성 기"는 카르복실기와 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 카르복시-반응성 기로는 예를 들면 할로겐, 알킬- 또는 아릴설포네이트, 히드록실, 에폭시, 메르캅토, 아미노, 이소시아네이트와 카르보디이미도기를 포함한다.
반응성 작용기를 활성화하기 위해 사용되는 활성화 시약의 예로는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 3-히드록시-3,4-디히드로히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온(HOOBt), N-히드록시숙신이미드(NHS), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDAC), 2-(1H-7-아자벤즈트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온-3-옥시 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HDTU), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스-(피롤리디노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop), (3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온-3-옥시)디에틸 포스페이트(DEPBt), 3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온-3-옥시 트리스-(피롤리디노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PDOP), 2-(벤조트리아졸-1-일옥시)-1,3-디메틸-2-피롤리딘-1-일-1,3,2-디아자포스폴리디늄 헥사플루오로포스포네이트(BOMP), 5-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)-3,4-디히드로-1-메틸 2H-피롤륨 헥사클로로안티모네이트(AOMP), (1H-7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(AOP), 5-(1H-벤조트리아졸-1-일)-3,4-디히드로-1-메틸 2H-피롤륨 헥사클로로안티모네이트: N-옥사이드(BDMP), 2-브로모-3-에틸-4-메틸 티아졸륨 테트라플루오로보레이트(BEMT), 2-브로모-1-에틸 피리디늄 테트라플루오로보레이트(BEP), 2-브로모-1-에틸 피리디늄 헥사클로로안티모네이트(BEPH), N-(1H-벤조트리아졸-1-일메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사클로로안티모네이트 N-옥사이드(BOMI), N,N'-비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐) 포스피닉 클로라이드(BOP-Cl), 1-(1H-벤조트리아졸-1-일옥시)페닐메틸렌 피롤리디늄 헥사클로로안티모네이트(BPMP), 1,1,3,3-비스(테트라메틸렌) 플루오로우로늄 헥사플루오로포스페이트(BTFFH), 클로로(4-모르폴리노)메틸렌 모르폴리늄 헥사플루오로포스페이트(CMMM), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트(CMBI), 2-플루오로-1-에틸 피리디늄 테트라플루오로보레이트(FEP), 2-플루오로-1-에틸 피리디늄 헥사클로로안티모네이트(FEPH), 1-(1-피롤리디닐-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌)피롤리디늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드(HAPyU), O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N;-비스(펜타메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBPipU), O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N0,N0-비스(테트라메틸렌)우리늄 헥사플루오로포스페이트(HBPyU), (1H-7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyAOP), 브로모트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBrOp), 클로로트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyClOP), 1,1,3,3-비스(테트라메틸렌) 클로로우로늄 헥사플루오로포스페이트(PyClU), 테트라메틸플루오로마미디늄 헥사플루오로포스페이트(TFFH), 트리포스겐, 트리아진계 시약[시아누릭 클로라이드, 시아누릭 플루오라이드, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(DMT-MM), 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(CDMT)], 비스(2-클로로페닐) 포스포로클로리데이트, 디페닐 포스포로클로리데이트, 디페닐 포스포로아지드(DPPA)와 이들의 임의 조합을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
리간드-반응성 기와 리간드 상에 존재하는 반응성 기의 많은 쌍이 가능하며 당업자라면 어떠한 리간드-반응성 기를 선택 리간드와 결합시키기 위해 선택할지를 알 것이라고 이해된다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 활성화된 작용기는 바람직하게는 아민-반응성 기, 바람직하게는 아릴 또는 알킬 활성화된 카르복실산 에스테르 -COOR, 가장 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.
이와 관련한 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 3관능성 가교 시약은 하기 화학식 V의 화합물이다:
Figure 112013079011747-pct00009
상기 식에서 X는 코어 구조이고;
S1, S2, S3은 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
A는 친화성 기이고;
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고
RN은 H 또는 히드라진-보호기이다.
코어 X가 α-아미노산인 경우에, 본 발명의 3관능성 가교 시약은 하기 화학식 VI의 화합물일 수 있다:
Figure 112013079011747-pct00010
상기 식에서
A는 친화성 기이고;
S1, S2, S3은 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN은 H 또는 히드라진-보호기이고
W1은 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3은 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고,
s는 1 내지 12이다.
본 발명의 3관능성 가교 시약의 작용기 A는 포획된 펩티드의 검출, 동정과 정제, 바람직하게는 친화성 정제를 위한 친화성 기이다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "친화성 기"는 검출, 동정과 정제 목적으로 또 다른 조성물에 의해 특이적으로 결합(경우에 따라 비드, 필터, 플레이트, 막, 크로마토그래프 수지 등과 같은 고체 지지체에 부착 또는 연결)될 수 있는 식별 가능한 표지, 기 또는 부분을 의미한다. 다수의 서로 다른 종의 친화성 기가 종래기술에 알려져 있고 본 발명의 방법을 위해 개별적으로 또는 하나 이상의 서로 다른 친화성 기의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 예시적인 친화성 기로는 에피토프 표지, 중금속, 염료, 인광기, 화학발광기, 전기화학적 검출부분, 결합 단백질, 형광체, 희토류 킬레이트, 근적외선 염료, 전기화학발광기 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것이 아닌 형광색소분자, 방사성 동위원소, 색원체, 효소, 항원을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 3관능성 가교제에서 사용하기에 특히 적합한 친화성 기로는 특정 결합 상대(전형적으로 비드, 크로마토그래피 수지 등과 같은 고체 지지체에 고정된)에 대한 (가역적) 결합 친화성으로 인해 친화성 정제법에 의한 3관능성 가교제(친화성 기가 결합된)의 분리 및 동정을 가능하게 하는 친화성 기를 포함한다. 이러한 친화성 기의 예로는 예를 들면 작은 화합물(비오틴/아비딘과 이들의 유도체, 글루타티온/GST과 같은)과 짧은 아미노산 서열, 전형적으로 길이가 2 내지 20개인 아미노산, 바람직하게는 길이가 4 내지 12개인 아미노산(항체 단편 또는 (His)6 표지, (Leu)3 표지, FLAG 표지 또는 c-Myc 표지와 같은), 핵산 서열(예를 들면 DNA, RNA 또는 PNA) 또는 형광 표지를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 친화성 표지 모두는 종래기술에 잘 규명되어 있고 상업적으로 이용 가능하다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 친화성 기는 비오틴과 그의 유도체, 탄수화물과 글리칸, 가장 바람직하게는 비오틴과 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이와 관련한 다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 3관능성 가교 시약은 하기 화학식 VII의 화합물이다:
Figure 112013079011747-pct00011
상기 식에서
S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고;
W1는 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3은 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고,
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN은 H 또는 히드라진-보호기이고,
s는 1 내지 12이다.
상기 코어 구조에는 화학식 I의 화합물에 따른 각각의 작용기 L, A와 방향족 히드라진기에 코어 구조를 연결하는 3개의 스페이서 기 S1, S2, S3이 부착되어 있다.
위에서 나타낸 바와 같이, 상기 3개의 스페이서 기는 입체 장애가 감소하고 3개의 작용기 A, L과 방향족 히드라진기의 반응성이 저하되지 않도록 선택될 수 있다. 방향족 히드라진기와 리간드-반응성 기 L을 보유한 S2 및/또는 S3를 변화시키면 결합 부위 부근을 스캔하고 대상 표적 수용체 단백질 자체 또는 인접 분자 상에 위치될 수 있는 서로 다른 당펩티드를 포획하도록 할 것이다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "스페이서"는 전형적으로 단일 결합 또는 하나 이상, 바람직하게는 인접하지 않은 -CH2-기가 서로 독립적으로 하나 이상의 연결기 및/또는 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴에 의해 치환되되; 단, O와 N과 같은 헤테로원자는 서로 직접 연결되지 않은 직쇄 또는 분지형 치환 또는 비치환된 C(1-24)알킬렌이다. 연결기는 알킬렌 사슬에 있는 -CH2-기 또는 말단 -CH2-기를 치환할 수 있다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "연결기"는 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -SO-, -CH2(SO)-, -SO2-, -CH2(SO2)-, -COO-, -OCO-, -S-CO-, -CO-S-, -SOO-, -OSO-, -SOS-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-, -NR1-CO-O-, -O-CO-NR1-, -NR1-CO-NR1-, -CH=CH-, -C≡C-, -CH=CH-COO-, -OCO-CH=CH-, -CH=N-, -C(CH3)=N-, -N=N-로부터 선택되고, 이때 R1은 수소원자 또는 C(1-6)알킬 또는 이들의 조합을 나타낸다. 바람직한 연결기는 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-, -NR1-CO-O-, -O-CO-NR1-, -NR1-CO-NR1-, -CH=CH-, -CH=N-, -C(CH3)=N-를 포함하고, 이때 R1은 H 또는 C(1-6)알킬 또는 이들의 조합을 나타낸다. 더 바람직한 연결기로는 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-를 포함하고, 이때 R1은 H 또는 C(1-6)알킬 또는 이들의 조합을 나타낸다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 스페이서 기는 6 내지 30개의 탄소원자를 가진 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌기, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜기(2 내지 24개의 에틸렌글리콜 단량체를 선형 배열로 가진), 폴리알코올기, 폴리아민기(예를 들면 스페르민, 스페르미딘과 이들의 중합체성 유도체), 폴리에스테르기(예를 들면 3 내지 15개의 에틸 아크릴레이트 단량체를 선형 배열로 가진 폴리(에틸 아크릴레이트)), 폴리아미노산기 또는 이들의 조합일 수 있다.
보다 바람직하게 상기 스페이서 기는 1 내지 8개의 아미노산을 포함하는 폴리아미노산(즉, 아미노산 또는 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 헥사-, 헵타- 또는 옥타펩티드) 또는 디-, 트리-, 테트라- 펜타- 또는 헥사에틸렌 글리콜인 폴리에틸렌글리콜기 또는 이러한 폴리아미노산과 폴리에틸렌글리콜의 조합일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 스페이서 기 S1, S2, S3은 서로 독립적으로 하기 화학식(a) 및/또는 (b)의 하나 이상의 반복단위를 포함하는 선형 사슬을 나타낸다:
(a) -[Y1-(CH2)n]p-
(b) -[Y2-(CH2)m-Y3]q- 또는 이들의 조합,
상기 식에서
Y1, Y2, Y3은 서로 독립적으로 -O-, -CO-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-이고 이때 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고,
n, m, p와 q는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
상기 기의 조합(용어 "이들의 조합"에 의해 나타낸 바와 같은)은 (a)와 (b)의 조합을 교호 또는 블록 형태로 포함하여 하기 화학식 중 하나를 가질 수 있다:
-[Y1-(CH2)n]p-[Y2-(CH2)m-Y3]q-,
-[Y2-(CH2)m-Y3]q-[(CH2)-Y1]p-,
-[Y1-(CH2)n]p-[Y1-(CH2)m-Y2]q-[(CH2)n-Y1]p-
상기 식에서 Y1, Y2, Y3은 서로 독립적으로 -O-, -CO-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-로 이루어진 군으로부터 선택되고 이때 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고,
n, m, p와 q는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
이에 따라, 바람직한 반복단위는 다음을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:
-CO-NR1-(CH2)n1-, -NR1-CO-(CH2)n2-, -(CH2)n3-CO-NR1-, -(CH2)n4-NR1-CO-,
-CO-NR1-(CH2)n5-NR1-CO-, -NR1-CO-(CH2)n6-CO-NR1-,
-COO-(CH2)m1-, -OCO-(CH2)m2-, -(CH2)m3-COO-, -(CH2)m4-OCO-,
-COO-(CH2)m5-OCO-, -OCO-(CH2)m6-COO-,
-O-(CH2)p1-, -(CH2)p2-O-
상기 식에서 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고, n1, n2, n3, n4, n5, n6, m1, m2, m3, m4, m5, m6, p1과 p2는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
상기 기의 다른 조합은 예를 들면 하기 화학식을 가진 다양한 반복단위(a)의 조합을 포함할 수도 있다:
[Y1-(CH2)n]p-[Y1-(CH2)n']q-[Y1"-(CH2)n"]q"-
상기 식에서 Y1, Y1', Y1"은 서로 독립적으로 -O-, -CO-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-이고 이때 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고 n, n', n"은 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
이와 관련한 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은
A가 친화성 기이고,
Z가 아릴 또는 헤테로아릴이고,
S1, S2, S3이 서로 독립적으로 화학식(a) -[Y1-(CH2)n]p-, (b) -[Y2-(CH2)m-Y3]q- 또는 이들의 조합 중 적어도 하나의 반복단위를 포함하는 선형 사슬이고 이때 Y1, Y2, Y3이 서로 독립적으로 -O-, -CO-, COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-로부터 선택되고 이때 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고,
n, m, p와 q가 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수인 화학식 I, III, IV, V, VI, VII의 화합물에 관한 것이다.
가장 바람직한 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 VIII의 3관능성 가교 시약에 관한 것이다:
Figure 112013079011747-pct00012
상기 식에서
W1은 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3은 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고,
Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고,
RN은 H 또는 히드라진-보호기이고,
n1, n5, p2, p3, p4, p5, s는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
본 발명의 3관능성 가교제를 제조하는데 사용하기 위해 상기 스페이서 기에는 바람직하게는 X 또는 작용기 A, L과 방향족 히드라진기에 부착을 위한 선택적으로 보호되거나 활성화될 수 있는 말단 작용기가 구비되어 있는 것으로 이해된다. 이와 관련한 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 스페이서 기는 X와 각각의 작용기(A, L 또는 방향족 히드라진기)에 연결기, 바람직하게는 -COO-, -CO-NR1-, -O-, -NR1-, -NR1-COO-와 -S-S- 연결기로부터 선택되는 기를 통해 결합될 수 있다. 또한 코어 구조, 스페이서 및 3개의 작용기 A, L과 방향족 히드라진기 중 하나를 회합시키는 바람직한 순서는 없는 것으로 이해된다. 당업자라면 다양한 상기 기의 속성에 따라 회합하는 순서가 바람직할 수 있다는 것을 알 것이다.
본 발명의 3관능성 가교 시약의 다른 작용기는 (보호되지 않은 형태에서) 세포 표면 또는 분비된 당단백질 상에 당펩티드의 산화된 탄수화물기와의 공유결합을 선택적으로 형성할 수 있는 보호되거나 보호되지 않은 방향족 히드라진기이다. 상기 산화된 당펩티드는 세포 표면 또는 분비된 당단백질 자체 또는 그 밖에 표적 당단백질 수용체와 상호작용하는 공간적으로 근접한 분자 상에 위치할 수 있다. 스페이서 S2와 S3의 길이는 리간드 결합 부위와 상기 산화된 당펩티드 사이의 거리를 결정한다. 이에 따라, 스페이서 S2와 S3의 길이를 변화시키면 리간드 결합 부위의 현재 또는 확대된 환경을 스캔 또는 조사할 수 있다.
상기 방향족 히드라진기는 보호되거나 비보호될 수 있다. 일반적으로 히드라진기를 보호하기 위해 임의의 아민 보호기를 사용할 수도 있고 이들 보호기로 아민을 보호 및 탈보호하기 위해 적합한 조건은 히드라진과 사용하기에도 적합하다. 아민에 대한 보호기와 이들 보호기로 아민을 보호 및 탈보호하기 위한 조건은 종래기술에 공지되어 있으며 예를 들면 Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons (1991)에 개시되어 있다. 적합한 히드라진 보호기의 구체적인 예로는 히드라존(R'R"C=NNH2)으로서 수소, 치환된 (C1-C6)알킬, 치환된 아릴과 치환된 헤테로아릴로부터 선택되는 치환기를 가진 알데히드 또는 케톤 히드라존일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 보호기를 선택하는 것은 가교 시약의 의도한 용도에 따라 좌우될 수 있는 것으로 이해된다. 생체 세포 상의 표면 당단백질을 표적으로 하거나 분비된 당단백질을 표적으로 하는 가교제 사용에 적합한 보호기는 인 시츄 치환이 용이해야 하는바, 즉 이들은 히드라진기를 보호하여 가급적 장시간 부반응을 방지해야 하며, 온화한 조건, 예를 들면 체내- 또는 단백질-친화성 조건에서 제거할 수 있어야 한다. 또한 다른 용도(예를 들면 체외용)로 상기 히드라진은 당펩티드 포획제로서 3관능성 가교제를 사용하기 전에 치환될 수 있는 보호기를 보유할 수도 있는 것으로 이해된다.
바람직한 히드라진 보호기는 트리플루오로아세틸, tert-부톡시카르보닐(Boc), 벤질옥시카르보닐(Cbz)과 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), sulfmoc(Fmoc-SO3H), 보다 바람직하게는 트리플루오로아세틸을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이와 관련하여 보다 바람직한 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 RN이 트리플루오로아세틸인 화학식 I, III, V, VI, VI의 화합물에 관한 것이다.
다른 실시형태에 있어서, Z는 비치환 또는 치환된 페닐, 나프틸과 안트라세닐로부터 선택되는 아릴이거나 비치환 또는 치환된 피리딜, 푸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴과 티아졸릴, 바람직하게는 피리딜, 푸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 니코틴아미딜로부터 선택되는 헤테로아릴이다.
이에 따라, 상기 보호된 방향족 히드라진기는 바람직하게는 트리플루오로아세틸-보호된 헤테로아릴-히드라진, 보다 바람직하게는 트리플루오로아세틸 니코틴아미도 히드라진기이다.
가장 바람직하게, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 IX의 3관능성 가교 시약일 수 있다:
Figure 112013079011747-pct00013
상기 식에서
W1은 -NH-, -O-, -S-이고,
W2, W3은 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고,
n1, n5, p2, p3, p4, p5, s는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
또 다른 요지에 있어서, 본 발명은 리간드-표적 당단백질 수용체 상호작용을 특성 평가하고 분석하기 위한 본 발명의 3관능성 가교 시약의 용도에 관한 것이다.
간단히, 위에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 가교제는 3관능성 분자에 2개의 서로 다른 화학 반응성 기와 친화성 기를 조합한다. 제1 화학 반응성 기는 추후 대상 (세포-표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체에 결합하는 대상 리간드에 가교제를 결합시키기 위해 사용하는 리간드-반응성 기, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드이다. 제2 화학 반응성 기는 산화된 수용체 당펩티드를 포획하기 위한 방향족 히드라진, 바람직하게는 트리플루오로아세틸화 방향족 히드라진이다. 대상 리간드에 접합된 본 발명의 친화성-태그된 가교제는 산화된 생체 세포 상 또는 용액 중에서 상호작용하는 표적 당단백질 수용체를 탄수화물-지향적으로 포획할 수 있고 추후에 친화성 기, 바람직하게는 비오틴을 통해 포획된 당펩티드를 2-단계에 걸쳐 친화성 정제할 수 있다. 비지향적인 대조군 시료와의 정량적인 비교를 통해 리간드와 이들의 대응 표적 당단백질 수용체와의 상호작용으로부터 비롯된 친화성 표지화 사례의 경우(예를 들면 비오틴화)는 임의(세포 표면 또는 분비된) 단백질의 비특이적인 확률적 친화성 표지화 사례(예를 들면 비오틴화)와는 분명하게 구별될 수 있다. 이를 통해 매우 낮은-친화성과 일과성 리간드-표적 당단백질 수용체 상호작용을 검출할 수 있을 뿐 아니라 리간드와 고유의 세포 환경에서 막-결합 형태로 존재하거나 생체액에서 분비된 형태로 존재하는 미량 당단백질과의 탈표적 효과가 가능하다.
세포 표면 표적 당단백질 수용체의 경우에 이를 도 1에 개략적으로 나타내었다: (채워진 원으로 도시되어 있는) 대상 리간드를 단백질 친화성 완충액 중에서 3관능성 가교제와 결합한다. 별도의 대조군 반응에서는 동몰량의 가교제를 대조군 단백질에 결합하거나 순수한 완충액에서 억제시킨다(도 1A). 세포 표면 탄수화물 상에 알데히드기를 생성시키기 위해서, 생체 세포를 산화시킨다(도 1B). 다음, 미리 결합시킨 리간드를 산화된 세포에 첨가하면 산화된 세포 표면 당 구조를 포획할 수 있다(단계 2와 도 1C). 이렇게 함으로써 임의의 세포 표면 당단백질을 확률 사례를 통해 표지하고 대상 리간드에 대해 세포 표면 당단백질 수용체는 직접적인 리간드-수용체 상호작용을 통해 더욱 효율적으로 포획한다. 동시에, 대조군 탐침을 동수의 세포에 첨가하여 확률적 표지화 사례만을 얻는다. 이후의 모든 단계를 위해서 2개의 탐침을 동시에 처리한다. 표지화 반응 후에 세포를 용해하고 핵 분획물을 버린다(단계 3). 남아있는 분획물을 정화, 환원, 알킬화하고 이어서 트립신으로 분해한다(단계 3, 도 1D). 상기 탐침을 완전 분해한 후에, 비오틴화된 세포 표면 당펩티드를 스트렙트아비딘 비드 상에서 다양한 완충액으로 광범위한 세척을 통해 친화성 정제한다(단계 4, 도 1E). 세척 후, 올리고당 구조의 최내부 성분과 펩티드의 N-X-S/T 글리코실화 모티프(N은 아스파라긴을 나타내고 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타내며 S/T는 세린 또는 트레오닌을 나타냄)에서 당펩티드의 아스파라긴 사이를 절단하는 PNGase F에 의한 효소 단계를 통해 비드로부터 N-당펩티드를 특이적으로 방출시킨다. 이렇게 함으로써 PNGaseF는 아스파라긴을 탈아미드화하고 미리 글리코실화한 펩티드에 특이적 N115-X-S/T 특징(signature)을 도입한다(단계 5, 도 1F). 방출된 펩티드를 고질량 정확도 질량 분광계로 분석하기 위해 탈염하고 적합한 완충액에 재현탁한다. 상기 분석을 위해, 질량 분광계를 소정의 임계치보다 높은 이온 신호가 계기를 MS로부터 MS/MS 모드로 전환하도록 자동적으로 작동시켜 펩티드의 충돌-유기 해리(CID) 스펙트럼을 생성하는 데이터 의존 방식으로 작동시킨다(단계 6, 도 1G). 모든 MS/MS 스펙트럼을 표준 단백질 데이터베이스에 대해 검색하고 동정된 펩티드를 N115-X-S/T 모티프의 존재 여부에 대해 필터링한다(단계 7, 도 1H). 리간드 시료 중 세포 표면 펩티드의 농도를 대조군 시료와 정량적으로 비교하여 세포 표면 수용체의 특이적 농축을 검출한다. 세포 표면 단백질로부터 확률적으로 표지한 펩티드의 경우에 비는 1 전후이어야 하고 리간드-기반 방식으로 특이적으로 포획한 당단백질 수용체 펩티드는 리간드 시료 대 대조군에서 더 높은 값을 얻는다. 1개 보다 많은 펩티드를 가진 단백질이 동정되면, 존재량 정보를 조합할 수 있다(단계 8, 도 H).
이와 관련한 또 다른 요지에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 리간드와 시료 내 적어도 하나의 탄수화물 잔기를 가진 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법으로서, 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 펩티드 도메인을 인식하는 방법에 관한 것이다:
i) 상기 표적 당단백질 수용체를 포함하는 시료를 제공하는 단계,
ii) 상기 표적 당단백질 수용체를 산화 처리하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기 상에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화된 표적 당단백질 수용체를 얻는 단계,
iii) 청구범위 제1항에 따른 하기 화학식 I의 3관능성 가교 시약을 제공하고 상기 리간드에 리간드-반응성 기를 접합하여 리간드-가교 시약-복합체를 얻는 단계
Figure 112013079011747-pct00014
상기 식에서 X는 코어 구조이고; S1, S2, S3는 서로 독립적으로 스페이서 기이고; L은 리간드-반응성 기이고; A는 친화성 기이고; Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고 RN은 H 또는 히드라진-보호기임,
iv) (a) 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 단백질 도메인에 결합할 수 있고 (b) 보호된 히드라진기가 유리 형태로 전환되고 산화된 표적 당단백질 수용체와 반응할 수 있는 조건에서 시료를 리간드-가교 시약-복합체에 접촉시켜 2중 펩티드-결합 복합체를 얻는 단계,
v) 상기 2중 펩티드-결합 복합체를 시료로부터 분리 정제하는 단계,
vi) 단계(iv)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체로부터 펩티드를 방출하여 방출된 펩티드를 얻는 단계,
vii) 단계(v)에서 얻은 방출된 펩티드를 고질량 정확도 질량 분광 분석법에 의해 분석 및 정량화하는 단계, 및
viii) 상기 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 비지향 대조군 반응과의 정량 비교를 통해 동정하는 단계.
위에서 나타낸 바와 같이, 상기 표적 당단백질 수용체는 용액 중에 또는 세포 표면에 있을 수 있는 것으로 이해된다.
상기 코어 구조 X; 스페이서 기 S1, S2, S3; 리간드-반응성 기 L; 친화성 기 A; 히드라진-보호기 RN 뿐 아니라 (헤테로)아릴 Z의 구체적인 실시형태는 위에서 정의한 바와 같다. 이와 관련한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 본 발명의 방법은 화학식 III, V, VI, VII, VIII 또는 IX의 화합물을 이용하여 실시된다.
이와 관련한 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 리간드와 세포 개체군을 포함하는 시료 내 적어도 하나의 탄수화물 잔기를 가진 세포 표면 수용체 간의 특이적인 상호작용을 동정하는 방법으로서, 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 펩티드 도메인을 인식하는 방법에 관한 것이다:
i) 하나 이상이 적어도 하나의 당단백질 수용체를 발현하는 세포의 개체군을 포함하는 시료를 제공하는 단계,
ii) 상기 세포 표면 수용체를 산화 처리하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기 상에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화된 세포 표면 수용체를 얻는 단계,
iii) 본 발명의 3관능성 가교 시약, 보다 구체적으로 화학식 I, III, V, VI, VII, VIII 또는 IX의 3관능성 가교 시약을 제공하고 상기 리간드에 시약을 접합하여 리간드-가교 시약-복합체를 얻는 단계,
iv) (a) 상기 리간드가 세포 표면 수용체 상의 리간드-특이적 펩티드 도메인에 결합할 수 있고 (b) 보호된 히드라진기가 유리 형태로 전환되고 산화된 세포 표면 수용체와 반응할 수 있는 조건에서 시료를 리간드-가교 시약-복합체에 접촉시켜 2중 펩티드-결합 복합체를 얻는 단계,
v) 상기 2중 펩티드-결합 복합체를 시료로부터 분리 정제하는 단계,
vi) 단계(iv)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체로부터 펩티드를 방출하여 방출된 펩티드를 얻는 단계,
vii) 단계(v)에서 얻은 방출된 펩티드를 고질량 정확도 질량 분광 분석법에 의해 분석 및 정량화하는 단계, 및
viii) 상기 리간드와 세포 표면 수용체 간의 상호작용을 대조군 반응과의 정량 비교를 통해 동정하는 단계.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 리간드와 생체액 내 함유된 적어도 하나의 탄수화물 잔기를 가진 분비된 당단백질 수용체 간의 특이적인 상호작용을 동정하는 방법으로서, 상기 리간드가 분비된 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 펩티드 도메인을 인식하는 방법에 관한 것이다:
i) 상기 분비된 당단백질 수용체를 함유하는 생체액으로부터 농축된 시료를 제공하는 단계,
ii) 상기 분비된 당단백질 수용체를 산화 처리하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기 상에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화 형태의 분비된 당단백질 수용체를 얻는 단계,
iii) 본 발명의 3관능성 가교 시약, 보다 구체적으로 화학식 I, III, V, VI, VII, VIII 또는 IX의 3관능성 가교 시약을 제공하고 상기 리간드에 시약을 접합하여 리간드-가교 시약-복합체를 얻는 단계,
iv) (a) 상기 리간드가 분비된 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 펩티드 도메인에 결합할 수 있고 (b) 보호된 히드라진기가 유리 형태로 전환되고 산화 형태의 분비된 당단백질 수용체와 반응할 수 있는 조건에서 시료를 리간드-가교 시약-복합체에 접촉시켜 2중 펩티드-결합 복합체를 얻는 단계,
v) 상기 2중 펩티드-결합 복합체를 시료로부터 분리 정제하는 단계,
vi) 단계(iv)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체로부터 펩티드를 방출하여 방출된 펩티드를 얻는 단계,
vii) 단계(v)에서 얻은 방출된 펩티드를 고질량 정확도 질량 분광 분석법에 의해 분석 및 정량화하는 단계, 및
viii) 상기 리간드와 분비된 당단백질 수용체 간의 상호작용을 대조군 반응과의 정량 비교를 통해 동정하는 단계.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 리간드-반응성 기는 바람직하게는 활성화된 작용기, 보다 바람직하게는 아민-반응성 기, 가장 바람직하게는 (수용성이 증가된) N-히드록시숙신이미드기 또는 N-히드록시설포숙신이미드기이다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "시료" 또는 "생체 시료"는 조직 배양물, 생체반응기, 인간 또는 동물 조직, 식물, 과일, 채소, 단세포 미생물(박테리아와 효모)과 다세포 생물체를 포함하지만 이들에 한정되지 않은 모든 생체세포 또는 생물체로부터 얻어지거나 이들에 의해 배설 또는 분비되는 고형 또는 액상 시료를 의미한다. 예를 들면 생체 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 담즙, 정액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리액 또는 임의의 체분비물, 침출물, 삼출액(예를 들면 농양 또는 다른 모든 감염 또는 염증 부위로부터 얻어지는 액) 또는 관절(예를 들면 정상관절 또는 류마티스 관절염, 변형성 관절염, 통풍 또는 패혈증성 관절염과 같은 질환에 의해 영향을 받은 관절)로부터 얻어지는 액으로부터 얻어지는 생체액일 수 있다. 생체 시료는 예를 들면 임의의 기관 또는 조직(생검 또는 부검 시편을 포함)으로부터 얻어지는 시료일 수도 있고 세포(1차 세포 또는 배양 세포에 관계없이), 모든 세포, 조직 또는 기관, 조직 배양물에 의해 상태가 조절된 매질을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "당단백질" (또는 "당펩티드")은 하나 이상의 공유결합된 탄수화물 또는 올리고당기를 함유하는 단백질(또는 펩티드)일 수 있다. 상기 탄수화물기는 전형적으로 아스파라긴 아미노산의 아민 측쇄기를 통해 전형적으로 부착되거나(이에 의해 N-연결된 탄수화물이 수득됨) 또는 통상적으로 세린 또는 트레오닌 아미노산의 히드록실 측쇄기를 통해 전형적으로 부착된다(이에 의해 O-연결된 탄수화물이 수득됨). 산화된 당단백질 또는 당펩티드는 적합한 산화제에 의한 처리를 거침으로써 부착된 탄수화물의 인접 디올 부분을 절단하여 알데히드기가 생성된 당단백질 또는 당펩티드를 의미한다. 이러한 탄수화물의 산화(이에 의해 디알데히드 탄수화물이 수득됨)는 예를 들면 과요오드산 또는 과요오드산염, 납(IV)염 또는 과망간산염, 바람직하게는 (메타)과요오드산 나트륨을 이용하는 종래의 과정에 따라 실시될 수 있다. 이와 다르게, 쌍직교기(아지드, 알킨, 케톤 또는 알데히드와 같은)를 보유한 글리칸 전구체의 유사체를 이용한 세포의 대사 표지화를 이용하여 당단백질 수용체 상에 가교제를 위한 부착 부위를 생성시킬 수 있다(Current opinion in chemical biology (2007) vol. 11 (1) pp. 52-8).
본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "단백질", "폴리펩티드", "올리고펩티드"와 "펩티드"는 동일한 의미를 갖는 것으로, 임의의 길이를 가진 아미노산 폴리머를 의미한다(전형적으로 펩티드는 단백질의 단편이라고 함). 이 폴리머는 직쇄, 분지형 사슬 또는 고리형 사슬일 수 있다. 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산 또는 변이 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 용어 "단편"은 (길이 n의) 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 전장 대비 서열 길이의 범위가 1 내지 n-1인 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 단편의 길이는 목적에 따라 적절히 변경될 수 있다.
본 발명의 경우에 당단백질은 천연 당단백질이거나 이와 달리 합성적으로 가공한 서열을 가질 수도 있다(단, 가공된 당단백질은 글리코실화 부위로서 제공된 적어도 하나의 펩티드 서열을 함유함). 당단백질은 세포내 당단백질, 세포 표면 당단백질(즉, 세포의 표면에 결합된 당단백질) 또는 용액 중 당단백질(즉, 매질로 분비된 당단백질)일 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 당단백질은 수용체, 항체, 효소, 호르몬, 조절인자, 항원, 결합제 등과 같은 중요하거나 유용한 생물학적 또는 화학적 활성을 가진 약제학적으로 또는 상업적으로 적절한 당단백질일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 아래에 열거된 당단백질은 단지 예시적일 뿐 한정하여 설명하고자 하는 것은 아니다. 당업자라면 본 발명의 방법에서 어떠한 당단백질이 사용할 것인지 이해할 것이고 자신의 특별한 요구에 맞춰 특정 당단백질을 선택할 수 있을 것이다.
용어 "표적 당단백질 수용체" 또는 "당단백질 수용체"는 하나 이상의 특정 종류의 리간드 또는 신호전달 분자가 결합할 수 있는 당단백질을 의미한다. 이러한 (표적) 당단백질 수용체는 임의의 피검체, 바람직하게는 포유류 피검체, 예를 들면 인간 또는 동물로부터 유도된 생체액에 또는 세포 상에 존재할 수 있다. 따라서 용어 "세포 표면"(즉, 세포-표면 당단백질 수용체)과 조합하여 사용할 때에는 하나 이상의 특정 종류의 리간드 또는 신호전달 분자가 결합할 수 있는 세포의 원형질막과 관련된 당단백질을 의미한다. 용어 "산화된"과 조합하여 사용할 때에는 탄수화물 부분이 적합한 산화 처리에 의해 산화되어 알데히드기가 형성된 당단백질을 의미한다.
당단백질 수용체는 Varki, A. et al. Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009와 www.uniprot.org에 개시된 것들과 같은 임의의 세포-표면 수용체 또는 임의의 분비된 수용체를 포함한다. 당단백질 수용체의 비제한적인 예는 예를 들면 섬유아세포 성장인자 수용체 1(FGFR1)을 포함하는 수용체(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9QZM7, Q99AW7, Q9UD50, Q63827), 섬유아세포 성장인자 수용체 2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q96KM2, P21802, Q63241), 섬유아세포 성장인자 수용체 3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q95M13, AF487554, Q99052), 섬유아세포 성장인자 수용체 4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass. No: Q91742), 2형 신경영양인자 티로신 키나아제(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass. No: Q8WXJ5), 백혈구 항원 관련 단백질-티로신 포스파타아제(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9EQ17, Q64605, Q64604, Q9QW67, Q9VIS8 P10586), 네프린(Swiss-Prot Ass. Nos: Q925S5, Q9JIX2, Q9ET59, Q9R044, Q9QZS7, Q06500), S형 단백질-티로신 포스파타아제 수용체(PTPRS)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q64699, Q13332, O75870), 카파형 단백질-티로신 포스파타아제 수용체(R-PTP-kappa)(Swiss-Prot Ass. No: Q15262), D형 단백질-티로신포스파타아제 수용체(PTPRD)(Swiss-Prot Ass. Nos: QBWX65, Q9IAJ1, P23468, Q64487), 에프린 A형 수용체 8(EPHA8/티로신-단백질 키나아제 수용체 EEK)(Swiss-Prot Ass. Nos: O09127, P29322), 에프린 A형 수용체 3(EPHA8/티로신-단백질 키나아제 수용체 ETK-1/GEK4)(Swiss-Prot Ass. No: P29318), 에프린 A형 수용체 2(Swiss-Prot Ass. No: Q8N3Z2), 인슐린 수용체(IR)(Swiss-Prot Ass. No: Q9PWN6), 인슐린-유사 성장인자-1 수용체(IGF-1)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9QVW4, P08069, P24062, Q60751, P15127, P15208), 인슐린-관련 수용체(IRR)(Swiss-Prot Ass. No: P14616), 티로신-단백질 키나아제 수용체 타이-1(Swiss-Prot Ass. Nos: 06805, P35590, Q06806), 라운드어바웃(Roundabout) 수용체-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass. Nos: O44924, AF041082, Q9Y6N7), 신경세포 니코틴성 아세틸콜린 수용체 알파 3 서브유닛(CHRNA3)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q8VHH6, P04757, Q8R4G9, P32297), 신경세포 아세틸콜린 수용체 알파 6 서브유닛(Swiss-Prot Ass. Nos: Q15825, Q9R0W9) 혈소판-유도 성장인자 수용체 베타(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q8R406, Q05030), 인터류킨-6 수용체(IL-6R)(Swiss-Prot Ass. No: Q00560), 인터류킨-23 수용체(IL-23R)(Swiss-Prot Ass. No: AF461422), IL-3, IL5와 GmCsf의 베타-공동(Beta-common) 사이토킨 수용체(Swiss-Prot Ass. No: P32927), 사이토킨 수용체-유사 분자 3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass. No: Q9JM58), I류 사이토킨 수용체(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass. No: Q9UHH5), 네트린-1 수용체 DCC(Swiss-Prot Ass. No: P43146), 백혈구 Fc 수용체-유사 단백질(IFGP2)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q96PJ6, Q96KM2), 대식세포 청소부 수용체 2(MSR2)(Swiss-Prot Ass. No: Q91YK7) 또는 과립구 집락 자극 인자 수용체(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass. No: Q99062) 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 당단백질 수용체는 프로테오글리칸의 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 프로테오글리칸은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸을 포함하는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 프로테오글리칸은 퍼레칸(Swiss-Prot Ass. No: P98160) 또는 그의 단편 또는 변이체이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 당단백질 수용체는 막-고정 세포-표면 효소의 군으로부터 선택되는 수용체이다. 예를 들면, 상기 세포-표면 수용체는 메탈로프로테이나아제의 피트릴라이신 계열 또는 ADAM-8(Swiss-Prot Ass. No: Q05910), ADAM-19(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9H013, O35674), ADAM-8(Swiss-Prot Ass. No: P78325), ADAM-12(Swiss-Prot Ass. Nos: O43184, Q61824), ADAM-28(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9JLN6, Q61824, Q9XSL6, Q9UKQ2), ADAM-33 전구체(Swiss-Prot Ass. Nos: Q8R533, Q923W9), ADAM-9(Swiss-Prot Ass. Nos: Q13433, Q61072), ADAM-7(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9H2U9, O35227, Q63180), ADAM-1A 페르틸린 알파(Swiss-Prot Ass. No: Q8R533), ADAM-15(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9QYV0, O88839, Q13444), 단백질을 함유하는 메탈로프로테이나아제-디스인테그린 도메인(TECAM)(Swiss-Prot Ass. No: AF163291), 메탈로프로테이나아제 1(Swiss-Prot Ass. Nos: O95204, Q9BSI6)을 포함하는 디스인테그린과 메탈로프로테아제(ADAM) 계열 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 당단백질 수용체는 예를 들면 히드로라아제, 트랜스퍼라아제, 이소머라아제, 라이아제, 리가아제, 트랜스퍼라아제와 옥시도리덕타아제와 같은 효소일 수 있다. 히드로라아제의 예로는 리파아제, 콜린에스테라아제, 알칼리성 포스파타아제, β-아밀라아제 데옥시리보뉴클레아제, 글루코아밀라아제 A와 B, α-갈락토시다아제 I과 II, β-프룩토푸라노시다아제, β-글루쿠로니다아제, N-아세틸-β-글루코사미니다아제, 히알루로니다아제, 옥시토시나아제, 칼리크레인, 브로멜라인, 엔테로키나아제, 프로테이나아제 a, b와 c, 펩시노겐과 펩신을 포함한다. 옥시도리덕타아제의 예로는 글루코오스 옥시다아제, 퍼옥시다아제와 클로로퍼옥시다아제를 포함한다. 트랜스퍼라아제의 예로는 γ-글루타밀트랜스펩티다아제와 리보뉴클레아제를 포함한다. 당업자라면 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있는 공지된 효소의 다른 예를 알 것이다.
다른 실시형태에 있어서, 당단백질 수용체는 성장인자 또는 다른 신호전달 분자일 수 있다. 성장인자는 전형적으로 세포에 의해 분비되고 다른 세포 상에서 수용체에 결합 및 활성화하여 수용체 세포의 대사 또는 발육 변화를 일으키는 당단백질이다. 포유류 성장인자 및 다른 신호전달 분자의 비제한적인 예는 사이토킨; 상피세포 성장인자(EGF); 혈소판-유도 성장인자(PDGF); FGF-5와 같은 섬유아세포 성장인자(FGF); 인슐린-유사 성장인자-T와 -II(IGF-I와 IGF-II); des(l-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질; CD-3, CD-4, CD-8과 CD-I 9와 같은 CD 단백질; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 항독소; 골 형성 단백질(BMP); 인터페론-알파, -베타와 -감마와 같은 인터페론; 예를 들면 M-CSF, GM-CSF와 G-CSF와 같은 집락 자극인자(CSF); 대부분의 인터류킨; 종양 괴사인자(TNF) 베타; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 단백질 C와 같은 항응고 인자; 심방성 나트륨 이뇨 인자; 폐 표면활성제; 우로키나아제 또는 인뇨 또는 조직형 플라스미노겐 활성화 인자(t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화 인자; 조혈 성장인자; 및 엔케팔리나아제를 포함한다. 본 기술분야의 당업자라면 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있는 다른 성장인자 또는 신호전달 분자를 알 것이다.
특정 표적 당단백질 수용체에 특이적인 용어 "리간드"는 본 명세서에서 광범위하게 사용되고 있으며 막-결합되고 세포 표면 상이나 분비된 형태로 위치되어 있는 표적 당단백질 수용체와 상호작용하거나 결합할 수 있는 임의의 화합물을 의미한다. 표적 당단백질 수용체 각각은 동일 또는 상이하거나 서로 다른 리간드에 대해 중복될 수 있고 리간드 결합이 일어나는 전체 표적 당단백질 수용체(즉, 단백질의 특정 부분) 내에 특정 펩티드 도메인인 하나 이상의 특정 리간드 결합 부위를 가질 수 있다. 리간드와 펩티드 도메인 간의 인식은 서열 특이성, 3차원 구조, 또는 리간드 또는 표적 당단백질 수용체의 번역 후 변형 때문일 수 있다. 리간드의 예는 당펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 펩티드, 당단백질 또는 인단백질을 포함하는 단백질, 탄수화물, 당지질, 인지질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 압타머, 비타민, 항원 및 이들의 단편, 합텐, 수용체 작용제, 부분 작용제, 혼합된 작용제, 길항제, 약물, 케모킨, 호르몬(예를 들면 LH, FSH, TRH, TSH, ACTH, CRH, PRH, MRH, MSH, 글루카곤과 프로락틴; 트랜스페린; 락토페린; 안지오텐신; 히스타민; 인슐린; 렉틴), 전달물질, 오토코이드; 성장인자(예를 들면 PDGF, VEGF, EGF, TGFa, TBFβ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, 봄베신, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, 온코스타틴과 엔도텔린 1), 인터류킨(예를 들면 인터류킨 1 내지 15)을 포함하는 사이토킨, 종양 괴사 인자(예를 들면 종양 괴사 인자 α와 β)와 인터페론(예를 들면 인터페론 α, β와 γ)과 같은 림포킨과 세포 신호 분자, 인공기관군, 조효소, 조인자, 조절인자, 또는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 동일한 결합성을 보유하는 단편, 유사체 및 다른 유도체를 포함하는 모든 천연 또는 합성 유기분자를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 세포 표면 표적 당단백질 수용체에 특이적인 리간드는 광범위한 세포 유형이나 특정 세포 유형을 표적으로 할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 리간드는 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 용어 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드 유도체, 디-, 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 물질들을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드 염기 또는 변형된 뉴클레오티드 염기, 당 잔기 또는 변형된 당 잔기 및 모노-, 디-, 트리-, 쿼드라- 또는 펜타-에스테르기를 포함하는 분자로서 정의된다. 예를 들면, 단백질의 단편, 즉 펩티드가 사용되는 경우에는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 펩티드의 (최소) 길이와 조성, 즉 아미노산의 수와 종류는 결합 상호작용의 속성에 의해 좌우되는 것으로 이해된다. 펩티드는 전형적으로 예를 들면 3-100개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 리간드는 항체일 수 있다. 항체는 이들의 아미노산 잔기 중 일부에 올리고당 사슬이 부가된 무거운(~150 kDa) 구형의 혈장 단백질이다. 항체는 특정 항원을 특이적으로 결합시키는 능력이 있다. 다수의 항체가 약제학적 또는 다른 상업용 제제로서 현재 사용 중이거나 연구 중에 있다는 것을 감안하면, 본 발명의 방법에 따른 특정 리간드와의 결합 상호작용을 분석하는 것은 특히 중요하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 치료용 항체 트라스투주맙(Trastuzumab)과 베바시주맙(Bevacizumab)과 같은 단클론성 항체일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단클론성 항체는 인간화 항체이다. 다른 실시형태에 있어서, 항체는 다클론성일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 안키린 리피트(ankyrin repeat) 결합제, 파아지 디스플레이에 의해 생성된 친화성 결합제 또는 올리고핵산 또는 펩티드 압타머와 같은 인공 친화성 결합제가 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 리간드는 위에서 언급한 당단백질 수용체와 같은 당단백질일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 리간드는 위에서 언급한 세포-표면 당단백질 수용체와 같은 세포-표면 단백질의 도메인일 수 있다.
본 발명에 따르면, 리간드는 특정 아미노산 서열 또는 결합 부위라고 하는 표적 당단백질 수용체의 단편의 3차원 구조와 같은 표적 당단백질 수용체의 특이적 펩티드 단편인 그의 결합 부위를 통해 그의 표적 당단백질 수용체와 상호작용한다. 용어 "상호작용한다" 또는 "상호작용"은 그의 (세포-표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체 결합 부위에 결합하는 리간드와 관련하여 (세포-표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체와 리간드 사이의 일과적 또는 영구적인 직접 또는 간접 접촉을 포함하고 그의 결합 친화성, 즉 그의 해리 평형 상수 Kd를 특징으로 할 수 있다. 그의 표적 당단백질 수용체에 대한 리간드의 전형적인 결합 친화성은 적어도 10-5 M, 바람직하게는 10-7 M 이상, 예를 들면 약 10-8 M 내지 약 10-12 M일 수 있다. 본 발명의 방법에 의하면 (세포-표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체와 Kd가 예를 들면 10-5 M 미만의 값인 것을 특징으로 하는 리간드의 2개의 전형적인 결합 친화성 뿐 아니라 이들 사이의 더 낮은 친화성 상호작용을 검출할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 전형적인 방법에서는 다음과 같은 단계를 수행한다:
제1단계에서, 본 발명의 가교제의 리간드-반응성 기, 바람직하게는 활성화된 작용기, 보다 바람직하게는 N-히드로숙신이미드기는 단백질 친화적 조건과 히드라진 작용기의 손실없이 1차 아민을 통해 리간드에 대해 효율적인 결합이 가능하여 리간드-가교제 복합체를 얻을 수 있다. 별도의 대조군 반응에서는 동몰량의 가교제를 대조군 단백질에 결합하거나 활성화된 작용기, 예를 들면 NHS 에스테르의 가수분해를 위한 순수한 완충액에서 배양한다.
제2단계에서, 상기 리간드-가교제 복합체를 표적 당단백질 수용체를 포함하는 세포(들), 조직(들) 또는 용액(들) 어느 하나를 포함하는 시료에 리간드가 리간드-가교제 복합체 내에서 그의 특이적 결합 부위에 결합하도록 하는 조건에서 첨가하는데, 상기 표적 당단백질 수용체는 미리 과요오드산염(예를 들면 1-2 mM NaIO4)을 이용하여 산화 처리하여 표적 당단백질 수용체 상에 존재하는 탄수화물 위에 알데히드기를 생성시킨다.
위에서 정의한 바와 같은 세포 표면 당단백질 수용체의 경우에, 상기 시료는 이러한 세포 표면 당단백질 수용체를 적어도 발현하는 세포의 개체군을 포함한다. 위에서 정의한 바와 같은 분비된 당단백질의 경우에, 상기 시료는 적어도 하나의 분비된 당단백질을 포함하는 생체액을 포함한다.
이와 관련한 본 발명의 방법의 특정한 일 실시형태에 있어서, 위에서 개시한 방법의 단계(iii)에서 언급한 산화된 당펩티드는 (단계(iii)에 따라) 시료를 리간드-가교 시약-복합체와 접촉시키기 전에 (단계(i)에 따라) 표적 당단백질 수용체의 군을 포함하는 시료를 산화 처리하여 시약 펩티드 측쇄 상에 존재하는 탄수화물을 산화시켜 얻는다. 리간드 결합시, 히드라진기는 (그의 비보호 형태에서) 이들 산화된 부위와 반응할 것이다. 당펩티드 상에서 탄수화물 구조의 산화는 통상적으로 몇 개의 잠재적인 산화된 부착 부위를 생성하지만, 리간드-가교 시약-복합체의 히드라진기에 의해 포획된 당펩티드는 그대로 남는다.
이와 관련하여 상기 방법의 단계(i)는 바람직하게는 (a) 분비된 형태로 또는 세포 표면 상에 적어도 하나의 표적 당단백질 수용체를 포함하는 시료를 제공하고, (b) 상기 시료를 산화 처리하여 적어도 하나의 산화된 표적 당단백질 수용체, 즉 적어도 하나의 산화된 탄수화물기를 보유한 적어도 하나의 표적 당단백질 수용체를 포함하는 시료를 얻는 것을 포함한다.
제3단계에서, 상기 시료를 히드라진의 보호기가 제거될 수 있는 조건에서 처리한다. 트리플루오로아세틸기가 방향족 히드라진에 대한 보호기로서 사용되면, 탄수화물을 산화시키기 위한 조건은 또한 상기 보호기가 제거되도록 하고 유리 히드라진은 산화된 당펩티드의 알데히드기를 효율적으로 포획할 수 있다. 임의의 당단백질이 확률 사례를 통해 포획되는 반면에, 수용체 상에서 리간드 결합 부위에 근접해 있는 알데히드기는 직접적인 리간드-표적 당단백질 수용체 상호작용에 의해 야기된 국소 농축에 의해 보다 효율적으로 포획된다. 3관능성 가교 시약 당 이러한 2중 표지 사례는 2중 펩티드-결합 복합체로 나타난다. 유사하게, 대조군 탐침(억제된 가교제 또는 비특이적 분자와 접합된 가교제 또는 명백한 수용체 특이성을 가진 리간드 분자와 접합된 가교제와 같은)을 동수의 세포에 첨가하여 확률적 표지화 사례만을 얻는다(모든 하기 단계의 경우에 대조군 탐침을 동시에 처리할 수 있다).
제4단계에서, 상기 시료를 표준 과정에 따라 처리 및 효소 분해한다(Wollscheid et al. Nat Biotech (2009) vol. 27 (4) pp. 378-86).
리간드와 세포 표면 수용체와 같은 세포 표면 당단백질인 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법의 경우에, 상기 세포를 포함하는 시료를 먼저 용해 단계로 처리하고 이어서 세포 단백질을 트립신과 같은 효소를 이용하여 분해하여 2중 펩티드-결합 복합체를 포함하는 처리된 세포 시료를 얻는다.
리간드와 분비된 당단백질인 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법의 경우에, 생체액에 분비된 당단백질을 포함하는 시료를 트립신과 같은 효소를 이용하여 분해하여 2중 펩티드-결합 복합체를 포함하는 처리된 세포 시료를 얻는다.
다음, 상기 2중 펩티드-결합 복합체를 친화성 기인 그의 제3작용기를 이용하여 친화성 정제한다. 예를 들면 상기 친화성 기로서 비오틴을 사용하면 2중 펩티드-결합 복합체를 표준 과정에 따라 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 친화성 정제한다(Wollscheid et al. ibid).
이와 관련하여, 상기 방법의 단계(iv)는 바람직하게는 먼저 시료를 효소 분해 처리하여 처리된 시료를 얻고 이어서 상기 처리된 시료로부터 포획된 펩티드를 친화성 정제하여 시료로부터 2중 펩티드-결합 복합체를 분리 정제하는 것을 포함한다.
제5단계에서, N-당펩티드를 프로테아제 또는 글리카나아제 처리, 예를 들면 PNGase F, PNGase A 등과 같은 제제에 노출, 바람직하게는 PNGase F를 이용하여 비드로부터 특이적으로 방출한다. PNGaseF 처리는 올리고당의 최내부 성분 및 펩티드의 N-X-S/T 글리코실화 모티프(N은 아스파라긴을 나타내고 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타내며 S/T는 세린 또는 트레오닌을 나타냄)에서 당펩티드의 아스파라긴 사이를 절단하여 펩티드 방출(또한 동시에 아스파라긴의 탈아미드화)이 일어나도록 한다.
본 명세서에서는 N-연결된 글리코실화 부위로 예시하고 있지만, 본 발명의 방법은 O-연결된 글리코실화 부위와 같이 확실하게 확인된 글리코실화 부위의 다른 유형들 또는 경우에 따라 다른 유형의 번역 후 변형(예를 들면 펩티드의 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨의 부착) 또는 당지질 등과 같은 단백질 이외의 글리코실화된 유기 화합물과 사용될 수도 있는 것으로 이해된다.
이와 관련하여 상기 방법의 단계(v)은 바람직하게는 단계(iv)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체를 글리코시다아제, 바람직하게는 서로 다른 엔도- 및 엑소글리코시다아제로 처리하여 상기 복합체로부터 포획된 펩티드를 분리하여 방출된 펩티드를 얻는 것을 포함한다. 이와 다르게, 예를 들면 환원제 또는 과요오드산염으로 각각 절단될 수 있는 연결기를 함유한 디설피드 결합 또는 시스 디올과 같은 절단성 연결기를 각각 이용할 수 있다.
제6단계에서, 이렇게 얻은 방출된 펩티드를 바람직하게는 질량 분광 분석에 의해 분석한다. 질량 분광 분석법은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면 Yates, J. Mass Spect. 33:1-19 (1998); Kinter and Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, John Wiley and Sons, New York (2000); Aebersold and Goodlett, Chem. Rev. 101:269-295 (2001) 참조). 고해상 폴리펩티드 단편 분리의 경우에는 분리방법으로서 모세관 역상 크로마토그래피를 이용하는 액체 크로마토그래피 ESI-MS/MS 또는 자동화 LC-MS/MS를 이용할 수 있다(Yates et al., Methods Mol. Biol. 112:553-569 (1999)). 바람직하게는, 동적 배제 데이터 의존성 충돌-유기 해리(CID)가 선택 질량 분광 분석법으로서 이용될 것이다(Goodlett et al., Anal. Chem. 72:1112-1118 (2000)). 이러한 분석을 위해, 질량 분광계를 전형적으로 소정의 임계치보다 높은 이온 신호가 계기를 MS로부터 MS/MS 모드로 전환하도록 자동적으로 작동시켜 펩티드의 충돌-유기 해리(CID) 스펙트럼을 생성하는 데이터 의존 방식으로 작동시킨다.
모든 MS/MS 스펙트럼을 표준 알고리즘(SEQUEST, Mascot, X!tandem, OMSSA,...)을 이용하여 표준 단백질 데이터베이스에 대해 검색하고 전형적으로 위양성 단백질 동정 비율을 1% 미만으로 제한하기 위해 필터링한다. 추가로, 모든 펩티드를 미리 글리코실화시킨 펩티드의 N115-X-S/T 모티프에 대해 필터링한다.
이와 관련하여 상기 방법의 단계(vi)는 단계(v)에서 얻은 방출된 펩티드를 정량 질량 분광 분석법에 의해 분석하여 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 동정하는 것을 포함한다.
상기 리간드 시료 내 당단백질의 농도를 대조군 시료와 정량적으로 비교하여 표적 당단백질 수용체의 특이적 농축을 검출할 수 있다. 상기 무-표지 질량 분광 분석 정량화를 위해서 질량 분광 분석 직전에 역상 크로마토그래피는 특성부의 체류시간을 이들의 질량/전하 비에 대해 그래프로 나타내는 MS 특성 맵으로서 표시될 수 있다. 질량 분광계에 의해 검출된 대로, 이러한 맵에서 펩티드는 소정의 시간에 걸쳐 또한 시료내 펩티드의 존재량에 따라 소정의 이온 전류 세기와 함께 뚜렷한 동위원소의 패턴으로 나타난다. 펩티드가 단편화와 MS/MS 분석을 통해 동정되었으면, 이 정보를 MS 맵에 특정 펩티드 특성부로 할당하고 오픈 소스 또는 Superhim 또는 Progenesis LC-MS(Nonlinear Dynamics)와 같은 시판 알고리즘으로 반-정량적 데이터와 조합할 수 있다(Mueller et al. Proteomics (2007) vol. 7 (19) pp. 3470-3480). 다음, 서로 다른 시료(예를 들면 시료 대 대조군)의 MS 특성 맵을 오버레이하고 비교하여 펩티드 존재량에 대한 비를 얻을 수 있다. 당단백질로부터 확률적으로 표지한 펩티드의 경우에 이들 비는 1 전후이어야 하고 리간드-기반 방식으로 특이적으로 포획한 당단백질 수용체 펩티드는 리간드 시료 대 대조군에서 더 높은 값을 얻는다. 1개 보다 많은 펩티드를 가진 단백질이 동정되면 존재량 정보를 조합할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 단일 반응 모니터링(SRM)과 세포 배양물에서 아미노산으로 안정한 동위원소 표지(SILAC)와 같은 다른 질량 분광 분석-기반 정량화 방법을 이용할 수 있다(Nilsson et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nat Methods (2010) vol. 7 (9) pp. 681-5)
또 다른 요지에 있어서, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의되어 있는 바와 같은 3관능성 가교 시약과 같은 서로 다른 3개의 분기 상에 (보호된) 히드라진기, 리간드-반응성 기와 친화성 기를 보유한 본 발명에 따른 3관능성 가교 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다.
후술하는 비제한적 실시예에 의해 본 발명을 더욱 예시한다:
실시예:
재료와 방법
건조 아르곤 분위기 중 화염-건조한 유리 용기에서 반응을 실시하였다. 모든 화학물질은 Fluka, Acros, Aldrich, Merk와 Lancaster로부터 구입하여 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. 건조 트리에틸아민(TEA)을 CaH2를 이용하여 증류하였고 디이소프로필에틸아민(DIPEA)은 KOH를 이용하여 증류하였고 메탄올(MeOH)은 산화마그네슘을 이용하여 증류하였다. N,N'-디메틸포름아미드(DMF)는 분자체를 이용하여 건조하였다. CH2Cl2는 아르곤 분위기 중 활성화 알루미나로 통과시켜 건조하였다(H2O 함량 <30 ppm, 카를 피셔 적정). 반응물을 자기 교반하였고 Merck Silica Gel 60 F254 판을 이용하여 모니터링하였으며 UV광을 이용한 형광 소광에 의해 가시화하였다. 또한 TLC 판을 닌히드린(n-부탄올과 10% 황산 중)과 과망간산칼륨을 이용하여 염색하였다. 생성물의 크로마토그래피 정제는 E. Merck Silica Gel 60(230-400 mesh) 또는 Sephadex LH-20(Aldrich)에서 수행하였다. 감압 농축은 40℃(다른 명확한 규정이 없으면)와 적절한 압력에서 회전증발에 의해 수행하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Mercury 300 분광계, Bruker DRX 400과 Bruker DRX 600 분광계로 기록하였다. 화학적 이동은 내부 표준으로서 용매 공명과 함께 ppm 단위로 기록하였다. 데이터는 다음과 같이 기록하였다: s = 단일항, brs = 넓은 단일항, d = 이중항, t = 삼중항, q = 사중항, m = 다중항; 결합상수는 Hz 단위로 기록하였다. IR 스펙트럼은 PerkinElmer Spectrum RXI FT-IR 분광광도계로 기록하였다. 흡수는 파수(cm-1)로 나타내었다. 정확한 질량 스펙트럼은 ETH Zurich의 LOC MS service에 의한 Ion Spec an Ultima 4.7 분광계 MALDI-FT로 얻었다. 피크는 퍼센트(m/z)로 나타내었다. 약어: Boc, 부톡시카르보닐; DMAP, 4-디메틸아미노피리딘; EDCI, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드; Et2O, 디에틸에테르; EtOH, 에탄올; Fmoc, 9-플루오레닐메톡시카르보닐; HBTU, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트; NHS, N-히드록시숙신이미드; TFA, 트리플루오로아세트산; TFAA, 트리플루오로아세트산 무수물; DMSO, 디메틸설폭시드; i-PrOH, 이소프로판올; DCC, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드; Hex, 헥산.
정량 분석: 분석을 위해, 질량 분광계를 소정의 임계치보다 높은 이온 신호가 계기를 MS로부터 MS/MS 모드로 전환하도록 자동적으로 작동시켜 펩티드의 충돌-유기 해리(CID) 스펙트럼을 생성하는 데이터 의존 방식으로 작동시킨다. 모든 MS/MS 스펙트럼을 표준 단백질 데이터베이스에 대해 검색하고 동정된 펩티드를 N115-X-S/T 모티프의 존재 여부에 대해 필터링한다. 리간드 시료 중 (세포 표면 또는 분피된) 펩티드의 농도를 대조군 시료와 정량적으로 비교하여 표적 수용체의 특이적 농축을 검출한다. (세포 표면 또는 분비된) 단백질로부터 확률적으로 표지한 펩티드의 경우에 비는 1 전후이어야 하고 리간드-기반 방식으로 특이적으로 포획한 당단백질 수용체 펩티드는 리간드 시료 대 대조군에서 더 높은 값을 얻는다. 1개 보다 많은 펩티드를 가진 단백질이 동정되면, 존재량 정보를 조합할 수 있다. 더 이상의 상세한 내용은 구체적인 실시예에서 찾아 볼 수 있다.
실시예 1: 가교제 Joy-06-16의 합성
Figure 112013079011747-pct00015
(a) (2S)-2-[6-(6-{(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산아미도)헥산아미도]-5-메톡시-5-옥소펜탄산(1)의 합성
Figure 112013079011747-pct00016
MeOH(130 mL) 중 (2S)-2-아미노-5-메톡시-5-옥소펜탄산(9.8 g, 22 mmol; Glenn, M. P. et al, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 640에 따라 합성함)의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(6-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산아미도)헥사노에이트(5.7 g, 29 mmol; Srinivasan, B.and Huang, X. Chirality 2008, 20, 265에 따라 합성)를 첨가한 다음, 이 용액에 TEA(9.4 mL, 67 mmol)를 첨가하였다. 30분 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 농축하고 EtOAc(200 mL)에 용해시킨 다음, 1N HCl(100 mL)로 세척하고 염수로 세척하여 MgSO4으로 건조하고 감압 농축한 다음, 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 85:15:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 65:25:4)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 포말성 고체로서 수득하였다(9.5g, 87%).
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 85:15:1 v/v): R F = 0.8; m.p. 49-51℃; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.36(dd, J = 8.6, 5.1 Hz, 1H), 3.68(s, 3H), 3.17(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.03(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.43(t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.26(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.12-2.15(m, 2H), 2.00-1.90(m, 1H), 1.69-1.28(m, 22H).
(b) 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-N-(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필)펜탄아미드(2)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00017
비오틴(6.3 g, 18 mmol)을 DMF(150 mL)에 용해시킨 다음, 이 용액에 DIPEA(3.2 mL, 18 mmol)과 HBTU(7.0 g, 18 mmol)을 첨가한 후, 상온에서 10분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 N-Boc-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민(5.9 g, 18 mmol)을 첨가한 다음, 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 감압 농축하고, 잔류물을 CH2Cl2(500 mL)에 취하고, 세척하고(1N HCl×2, 포화 NaHCO3), MgSO4으로 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 갈색 오일로서 N-Boc-N'-비오티닐-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민을 수득하였다. N-Boc-N'-비오티닐-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민을 TFA(200 mL)에서 물(1방울)과 함께 교반하였다. 1시간 후에 감압 증발시키고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 10:6:1, TEA 포함)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 약간 갈색인 오일로서 수득하였다(7.4 g, 90%).
TLC(CHCl3:MeOH, 3:1 v/v): R F = 0.2; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 4.57(dd, J = 7.7, 4.7 Hz, 1H), 4.38(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 3.80-3.65(m, 12H), 3.58(t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.33-3.25(m, 5H), 3.16(t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.00(dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.77(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.27(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.05-1.95(m, 2H), 1.85-1.61(m, 4H), 1.54-1.46(m, 2H); 13C-NMR(101 MHz, CD3OD): δ 176.0, 166.1, 71.4, 71.2, 71.1, 70.3, 69.8, 63.4, 61.7, 57.0, 41.1, 40.0, 37.7, 36.9, 30.5, 29.8, 29.6, 28.1, 26.9; HRMS(m/z): C20H38N4O5S에 대한 [M+H]+ 계산치 446.26; 실측치 447.2; IR(neat): 3289, 2928, 2873, 1673, 1551, 1463, 1431, 1200, 1177, 1126 cm-1.
(c) 메틸 (4S)-4-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-4-[6-(6-[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산아미도)헥산아미도]부타노에이트(3)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00018
화합물 1(9.4 g, 19 mmol), HBTU(7.3 g, 19 mmol)과 DIPEA(3.4 mL, 19 mmol)을 무수 DMF(90 mL)에 용해시키고 상온에서 교반하였다. 10분 후에 화합물 2(6.6 g, 15 mmol)를 첨가하고 이 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 얻어진 조혼합물을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 점성 포말로서 수득하였다(7.5 g, 55%).
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.8; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 4.57(ddd, J = 7.9, 5.0, 0.9 Hz, 1H), 4.39(dt, J = 8.0, 4.8 Hz, 2H), 3.75(s, 3H), 3.73-3.58(m, 12H), 3.39-3.22(m, 7H), 3.10(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.01(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.79(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.47(t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.35-2.23(m, 6H), 2.21-2.11(m, 1H), 2.03-1.93(m, 1H), 1.87-1.36(m, 31H).
(d) (4S)-4-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-4-[6-{(6-[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산아미도)헥산아미도]부탄산(4)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00019
에스테르 화합물 3(0.62 g, 0.68 mmol)을 i-PrOH: H2O(7:3)(13.4mL) 중CaCl2(0.8M)에 용해시킨 다음, 0.5M NaOH(1.6mL)을 상온에서 첨가하였다. 2시간 후에 이 반응 혼합물을 5 M HCl로 중성화한 다음, CHCl3로 3회(100 mL) 추출하고 Na2SO4으로 건조한 다음, 감압 농축하고 플래시 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:H2O = 85:15:1 내지 65:25:4)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 무색 점성 포말로서 수득하였다(0.24 g, 39%).
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 10:6:1 v/v): R F = 0.4; 1H-NMR(300 MHz, CD3OD): δ 8.00(t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.93(m, 1H), 4.51(ddd, J = 5.0, 0.8, 7.9 Hz, 1H), 4.35-4.31(m, 2H), 3.67-3.53(m, 12H), 3.31-3.21(m, 5H), 3.18(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.04(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.95(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.73(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.38(t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.28(t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.23-2.18(m, 4H), 2.11-2.05(m, 1H), 1.95-1.89(m, 1H), 1.80-1.32(m, 31H).
(e) tert-부틸 N-{5-[(5-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-(3-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]펜탄아미도}프로폭시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-3-[(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)카르바모일]프로필]카르바모일}펜틸)카르바모일]펜틸}카르바메이트(5)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00020
DMF(50 mL) 중 4(3.4 g, 3.8 mmol)의 용액에 HBTU(1.7 g, 4.6 mmol)과 DIPEA(0.80 mL, 4.6 mmol)을 첨가하였다. 10분 동안 상온에서 교반한 후에 이 반응 혼합물에 N-1-Fmoc-1,2-디아미노에탄 히드로클로라이드(1.3 g, 4.6 mmol)를 첨가한 다음, 30분 동안 교반하였다. 용매를 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH=10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O=65:25:4)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 무색 점성 포말(4.3 g,97%)로서 수득하였다.
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.8; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 7.82(d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.67(d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.41(t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.33(t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.49(dd, J = 7.5, 4.8 Hz, 1H), 4.35-4.30(m, 3H), 4.22(t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.66-3.48(m, 12H), 3.28-3.14(m, 10H), 3.05(dd, J = 6.9, 4.2 Hz, 2H), 2.93(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.72(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.29-2.16(m, 8H), 2.12-2.05(m, 1H), 1.94-1.89(m, 1H), 1.78-1.61(m, 12H), 1.48-1.29(m, 21H).
(f) tert-부틸 N-{5-[(5-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-3-[(2-{[6-(2,2,2-트리플루오로아세토히드라지도)피리딘-3일]포름아미도}에틸)카르바모일]프로필]카르바모일}펜틸)카르바모일]펜틸}카르바메이트(6)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00021
DMF(40 mL) 중 5(4.4 g, 3.8 mmol)의 용액에 피페리딘(20%의 용매, 8 mL)을 첨가하고 이 반응 혼합물을 20분 동안 상온에서 교반하고 Et2O(500mL)에 첨가하였다. 디에틸에테르를 따라 버리고 조화합물을 디에틸 에테르(250 mL)에 2회 부운 다음, 얻어진 시럽 화합물을 MeOH(100 mL)에 용해하고 감압 농축한 다음 2.4 g의 생성물을 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. 얻어진 생성물(2.4 g, 2.6 mmol)과 6-(2,2,2-트리플루오로아세토히드라지도)피리딘-3-카르복실산(1.3 g, 5.2 mmol; Abrams, M. J. et al, J. Nucl. Med. 1990, 31, 2022에 따라 합성함)을 DMF(30 mL)에 용해시키고 EDCI(1.1 g, 5.2 mmol)와 DMAP(63 mg, 0.52 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 증발시키고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 65:25:4)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 황색 점성 포말로서 수득하였다(1.6 g, 53%).
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 10:6:1 v/v): R F = 0.7; 1H-NMR(500 MHz, CD3OD): δ 10.10(dd, J = 2.3, 0.6 Hz, 1H), 10.05(t, J = 5.6 Hz, 1H), 9.98(t, J = 6.1 Hz, 1H), 9.76(t, J = 5.6 Hz, 1H), 9.70(dd, J = 13.5, 6.8 Hz, 1H), 9.64(dd, J = 7.7, 3.5 Hz, 1H), 9.59-9.55(m, 2H), 9.50-9.46(m, 2H), 8.34(d, J = 8.8, 1H), 8.13-8.09(m, 2H), 7.99(s, 1H), 6.04(dd, J = 7.8, 5.0 Hz, 1H), 5.86-5.77(m, 2H), 5.19-4.96(m, 16H), 4.80-4.68(m, 7H), 4.57(dd, J = 13.0, 7.0 Hz, 2H), 4.48(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 4.25(d, J = 12.6 Hz, 1H), 3.83-3.78(m, 4H), 3.75-3.69(m, 4H), 3.64-3.56(m, 1H), 3.48-3.38(m, 1H), 3.32-2.84(m, 31H).
(g) 3-({5-[(5-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-(3-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]펜탄아미도}프로폭시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-3-[(2-{[6-(2,2,2-트리플루오로아세토히드라지도)피리딘-3일]포름아미도}에틸)카르바모일]프로필]카르바모일}펜틸)카르바모일]펜틸}카르바모일)프로판산(7)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00022
화합물 6(20 mg, 18 μmol)을 TFA(0.5 mL)에 용해시키고 진공에서 증발 및 건조하였다. 추가 정제 없이 얻어진 생성물(18 mg, 18 μmol)을 DMF(1 mL)에 용해시킨 다음, DIPEA(4.3 μl, 19 μmol)와 숙신산 무수물(2.2 mg, 19 μmol)을 첨가하고 상온에서 교반한 다음, 3시간 후에 얻어진 조혼합물을 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 산 화합물을 황색 점성 포말로서 정량 수율(20 mg)로 수득하였다.
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 10:6:1 v/v): R F = 0.5; 1H-NMR(600 MHz, DMF-d 7): δ 11.96(brs, 1H), 9.30(brs, 1H), 8.67(d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.42(t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.11-8.07(m, 2H), 7.97(dd, J = 8.0, 3.6 Hz, 1H), 7.92(td, J = 5.6, 2.8 Hz, 1H), 7.82(t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.75(dd, J = 12.9, 5.5 Hz, 2H), 6.86(d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.45(brs, 1H), 6.36(s, 1H), 4.49-4.47(m, 1H), 4.35(td, J = 8.5, 5.2 Hz, 1H), 4.30(ddd, J = 6.7, 4.4, 1.9 Hz, 1H), 3.82-3.75(m, 1H), 3.37(m, 17H), 3.33-3.329(m, 2H), 3.25-3.19(m, 5H), 3.13(dd, J = 12.9, 6.9 Hz, 4H), 2.94(d, J = 7.4 Hz, 1H), 2.72(d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.56(t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.45(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.27-2.22(dt, J = 10.5, 5.0 Hz, 4H), 2.18-2.13(m, 4H), 2.10-2.06(m, 1H), 1.89-1.83(m, 1H), 1.79-1.68(m, 5H), 1.64-1.54(m, 7H), 1.48-1.28(m, 12H).
(h) 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-({5-[(5-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-3-[(2-{[6-(2,2,2-트리플루오로아세토히드라지도)피리딘-3-일]포름아미도}에틸)카르바모일]프로필]카르바모일}펜틸)카르바모일]펜틸}카르바모일)프로파노에이트(8)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00023
생성물 7(84 mg, 71 μmol), EDCI(34 mg, 18 μmol)과 NHS(19 mg, 16 μmol)를 DMF(1 mL)에 용해시킨 다음, 이 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 얻어진 혼합물을 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:H2O = 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 황색 점성 포말로서 수득하였다(51 mg, 56%).
TLC(CHCl3:MeOH:H2O, 10:6:1 v/v): R F = 0.7; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 8.63(d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.10(dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 6.83(d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.55(dd, J = 7.6, 4.7 Hz, 1H), 4.38-4.34(m, 2H), 3.75-3.48(m, 16H), 3.35-3.20(m, 12H), 3.01-32.97(m, 2H), 2.89(s, 3H), 2.74(s, 3H), 2.64(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.35-2.21(m, 6H), 2.17-2.05(m, 1H), 1.98-1.91(m, 1H), 1.67(m, 22H).
실시예 2: 가교제 Joy-05-125의 합성
Figure 112013079011747-pct00024
(a) tert-부틸 N-[(5S)-5-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}펜틸]카르바메이트(9)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00025
Fmoc-N-ε-Boc-L-라이신(1.7 g, 3.7 mmol)을 DMF(20 mL)에 용해시킨 다음, 이 용액에 DIPEA(0.63 mL, 3.7 mmol)와 HBTU(1.7 g, 4.4 mmol)를 첨가하고, 10분 후에 이 반응 혼합물에 DMF(5 mL) 중 1-N-비오티닐-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민(1.8 g, 4.1 mmol)의 용액을 첨가하고 상온에서 1시간 교반한 다음 용매를 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:H2O = 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 점성 포말로서 수득하였다(2.6 g, 78%).
TLC(CH2Cl2:MeOH, 10:1 v/v): R F = 0.2; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 7.86(d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.73(dd, J = 6.5, 4.7 Hz, 2H), 7.48-7.36(m, 4H), 4.53(dd, J = 7.8, 4.3 Hz, 1H), 4.46(t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.33(dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 4.28(t, J = 6.7 Hz, 1H), 4.09(dd, J = 8.3, 5.3 Hz, 1H), 3.66-3.53(m, 12H), 3.36-3.29(m, 4H), 3.27-3.20(m, 1H), 3.10(t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.96(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.76(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.24(t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.85-1.41(m, 25H); HRMS(m/z): C46H68N6O10S에 대한 [M+Na]+ 계산치 896.47; 실측치 919; IR(neat): 3283, 2929, 2866, 1690, 1652, 1529, 1365, 1247, 1166, 1102, 1042, 843, 741 cm-1.
(b) tert-부틸 N-{5-[(5-{[(5S)-5-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}펜틸]카르바모일}펜틸)카르바모일]펜틸}카르바메이트(10)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00026
화합물 9(2.6 g, 2.9 mmol)을 CH2Cl2:TFA(1:1, 20 mL) 혼합물 중에서 교반한 다음, 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 고진공에서 건조하였다. 얻어진 조생성물(2.4 g, 3.0 mmol)과 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(6-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산아미도)헥사노에이트(1.5 g, 3.5 mmol; Srinivasan, B. and Huang, X. Chirality 2008, 20, 265에 따라 합성함)를 MeOH(6 mL)에 용해시킨 다음, 이 혼합물에 TEA(0.83 mL, 5.9 mmol)를 첨가하고 상온에서 20분 동안 교반한 후, 용매를 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 9:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 85:15:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 점성 포말로서 수득하였다(2.8 g, 84%).
TLC(CH2Cl2:MeOH, 10:1 v/v): R F = 0.8; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 7.85(d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.72(dd, J = 6.7, 4.1 Hz, 2H), 7.45(t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.37(td, J = 7.5, 1.0 Hz, 2H), 4.52(dd, J = 7.5, 4.6 Hz, 1H), 4.45(t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.30(m, 2H), 4.07(dd, J = 8.3, 5.2 Hz, 1H), 3.63-3.52(m, 12H), 3.34-3.18(m, 9H), 3.09-3.05(m, 2H), 2.95(dd, J = 5.0, 12.7, 1H), 2.77(d, J = 5.7, 1H), 2.26-2.19(m, 6H), 1.83-1.34(m, 37H); HRMS(m/z): C58H90N8O12S에 대한 [M+Na]+ 계산치 1122.64; 실측치 1146; IR(neat): 3320, 2933, 2864, 2476, 2426, 1705, 1636, 1538, 1426, 1214, 1077, 742 cm-1.
(c) tert-부틸 N-{5-[(5-{[(5S)-5-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}펜틸]카르바모일}펜틸)카르바모일]펜틸}카르바메이트(11)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00027
화합물 10(0.39 g, 0.35 mmol)을 DMF(3 mL)에 용해시킨 다음, 이 반응 혼합물에 피페리딘(0.2 mL)을 상온에서 5분 동안 첨가한 후, 이 반응 혼합물에 Et2O(100 mL)를 첨가한 다음, 에테르 층을 따라 버리고, 얻어진 오일 조혼합물을 MeOH에 용해시키고 감압 농축한 후 플래시 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:H2O = 65:25:4 내지 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 점성 포말로서 수득하였다(0.21 g, 67%).
TLC(CH2Cl2:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.2; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 4.57(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 4.38(dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 3.72-3.58(m, 12H), 3.48(brs, 1H), 3.33-3.21(m, 9H), 3.10(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.00(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.78(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.29-2.23(m, 6H), 1.87-1.38(m, 37H).
(d) 3-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-{(9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-[6-(6-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노} 헥산아미도)헥산아미도]펜틸]카르바모일}프로판산(12)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00028
화합물 11(2.1 g, 2.3 mmol)을 DMF(1 mL)에 용해시킨 다음, 이 용액에 DIPEA(0.48 mL, 2.8 mmol)과 숙신산 무수물(0.28 g, 2.8 mmol)을 상온에서 1.5 시간 동안 첨가한 후, 용매를 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 65:25:4 내지 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 점성 포말로서 수득하였다(1.4 g, 61%).
TLC(2방울의 아세트산 포함 CH2Cl2:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.25; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 4.56(dd, J = 7.8, 4.7 Hz, 1H), 4.37(dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 4.31(dd, J = 9.2, 4.9 Hz, 1H), 3.72-3.64(m, 12H), 3.35-3.20(m, 9H), 3.09(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.00(dd, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.77(d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.69(dd, J = 12.9, 6.0 Hz, 2H), 2.58(dd, J = 13.8, 7.2 Hz, 2H), 2.28-2.22(m, 6H), 1.94-1.35(m, 37H).
(e) 6-(3-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-[6-(6-아미노헥산아미도)헥산아미도]펜틸]카르바모일}프로판아미도)헥산산(13)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00029
화합물 12(1.3 g, 1.3 mmol), DIPEA(0.27 mL, 1.6 mmol)와 HBTU(0.61 g, 1.6 mmol)를 DMF(15 mL)에 용해시키고 5분 후 이 용액에 6-아미노카프로산(0.21 g, 1.6 mmol)를 상온에서 첨가하고 1.5시간 동안 교반한 다음, 감압 증발하고 플래시 크로마토그래피(CHCl3:MeOH:H2O = 85:15:1 내지 65:25:4)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 백색 점성 포말로서 수득하였다(1.5 g, 정량).
TLC(2방울의 아세트산 포함 CH2Cl2:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.25; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 4.49(dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 4.30(dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.26-4.19(m, 1H), 3.63-3.45(m, 12H), 3.31-3.12(m, 11H), 3.03-2.91(m, 3H), 2.90(d, J = 4.9 Hz, 1H), 2.70(d, J = 13.5 Hz, 1H), 2.28(t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.22-2.11(m, 6H), 2.19-1.31(m, 38H); HRMS(m/z): C48H87N9O12S에 대한 [M+H]+ 계산치 1013.62; 실측치 1015.
상기 생성물(1.5 g, 1.3 mmol)을 CH2Cl2:TFA(1:1, 20 mL) 혼합물 중에서 교반한 다음, 0℃에서 10분 동안 교반한 후 증발시키고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3/MeOH/H2O = 10:6:1)에 의해 정제하여 원하는 화합물 13을 백색 점성 포말로서 수득하였다(1.4 g, 61%).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.56(dd, J = 7.9, 4.2 Hz, 1H), 4.37(dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 4.29(dd, J = 9.2, 4.8 Hz, 1H), 3.71-3.55(m, 12H), 3.34-3.21(m, 11H), 3.02-2.97(m, 3H), 2.77(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.64-2.51(m, 4H), 2.36(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.29-2.22(m, 6H), 1.95-1.38(m, 34H).
(f) 6-(3-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-[6-(6-{[6-({[(tert-부톡시)카르보닐] 아미노}아미노)피리딘-3-일]포름아미도}헥산아미도)헥산아미도]펜틸]카르바모일} 프로판아미도)헥산산(14)의 합성
Figure 112013079011747-pct00030
6-({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}아미노)피리딘-3-카르복실산(0.43 g, 1.7 mmol, Abrams, M. J. et al, J. Nucl. Med. 1990, 31, 2022에 따라 합성함), HBTU(0.51 g, 1.4 mmol)와 DIPEA(0.23 mL, 1.4 mmol)를 상온에서 5분 동안 DMF(10 mL)에 용해시킨 다음, 이 혼합물에 DMF(10 mL) 중 화합물 13(1.1 g, 1.1 mmol)의 용액을 첨가하고 상온에서 40분 동안 교반한 다음, 감압 증발시키고 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH = 10:1 내지 CHCl3:MeOH:H2O = 65:25:4)에 의해 정제하여 원하는 생성물을 약간 황색의 점성 포말로서 수득하였다(0.96 g, 68%).
TLC(CH2Cl2:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.4; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 8.60(d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.06(dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 6.76(d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.55(dd, J = 7.8, 5.0 Hz, 1H), 4.37(dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 4.29(dd, J = 9.2, 4.9 Hz, 1H), 3.71-3.55(m, 12H), 3.44-3.40(m, 2H), 3.29-3.19(m, 11H), 2.99(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.77(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.63-2.50(m, 4H), 2.35(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.27-2.22(m, 6H), 1.94-1.35(m, 43H); HRMS(m/z): C59H100N12O15S에 대한 [M+Na]+ 계산치 1248.72; 실측치 1271.7; IR(neat): 3249, 3079, 2933, 2863, 1635, 1546, 1459, 1367, 1251, 1160, 1101 cm-1.
(f) 6-(3-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-[6-(6-{[6-(2,2,2-트리플루오로아세토히드라지도)피리딘-3-일]포름아미도}헥산아미도)헥산아미도]펜틸] 카르바모일}프로판아미도)헥산산(15)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00031
화합물 14(0.16 g, 0.14 mmol)을 TFA(4 mL)에 용해시킨 다음, 상온에서 30분 동안 교반한 후 증발시키고 sephadex LH-20를 통해 여과한 다음, 진공 건조하였다(자주색). 이 자주색 무정형 고체를 DMF(1.5 mL)에 시킨 다음, 이 용액에 TFAA(21 μL, 0.15 mmol)에 첨가한 후, 이 혼합물을 상온에서 30분 동안 교반하였다(자주색 -> 녹황색). 얻어진 조혼합물을 감압 증발시키고 sephadex LH-20(CHCl3/MeOH = 95:5)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 약간 황색의 점성 포말로서 수득하였다(0.14 g, 90%).
TLC(CH2Cl2:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.6; 1H-NMR(400 MHz, CD3OD): δ 8.60(d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.06(dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.97(dd, J = 11.5, 5.9 Hz, 2H), 7.19(d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.55(dd, J = 7.7, 5.0 Hz, 1H), 4.36(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 4.29(dd, J = 9.2, 4.8 Hz, 1H), 3.69-3.54(m, 12H), 3.44-3.40(m, 2H), 3.33-3.22(m, 11H), 2.98(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.77(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.63-2.50(m, 4H), 2.34(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.24(dd, J = 16.8, 7.6 Hz, 6H), 1.86-1.38(m, 34H); 19F-NMR(282 MHz, CD3OD): δ -76.88, -76.93; HRMS(m/z): C59H100F3N12O15S에 대한 [M-2H]+ 계산치 1244.65; 실측치 1242; IR(neat): 3293, 3084, 1626, 1547, 1461, 1364, 1256, 1116 cm-1.
(g) 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(3-{[(1S)-1-[(3-{2-[2-({9-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸리딘-4-일]-5-옥소노닐}옥시)에톡시]에톡시}프로필)카르바모일]-5-[6-(6-{[6-(2,2,2-트리플루오로아세토히드라지도)피리딘-3-일]포름아미도}헥산아미도)헥산아미도]펜틸]카르바모일}프로판아미도)헥사노에이트(16)의 합성:
Figure 112013079011747-pct00032
화합물 15(28 mg, 23 μmol), NHS(3.1 mg, 27 μmol)와 EDCI(5.6 mg, 27 μmol)를 DMF(0.3 mL) 중에 용해시킨 다음, 이 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 얻어진 조혼합물을 감압 농축하고 sephadex LH-20(CHCl3/MeOH = 95:5)에 의해 정제하여 원하는 화합물을 약간 녹색의 점성 포말로서 수득하였다(19 mg, 62%).
TLC(CH2Cl2:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v): R F = 0.8; 1H-NMR(600 MHz, DMF-d 7): δ 9.46(brs, 1H), 8.70(d, J = 2.2 Hz 1H), 8.33-8.25(m, 1H), 8.14(dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 8.01-7.99(m, 2H), 7.95-7.93(m, 1H), 7.91-7.85(m, 1H), 7.78-7.71(m, 3H), 7.15(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.41(brs, 1H), 6.32(brs, 1H), 4.47(dd, J = 6.9, 5.8 Hz, 1H), 4.31-4.29(m, 1H), 4.27-4.23(m, 1H), 3.59-3.45(m, 12H), 3.336-3.32(m, 2H), 3.24-3.12(m, 11H), 2.93(s, 4H), 2.73-2.69(m, 2H), 2.54-2.42(m, 4H), 2.18-2.13(m, 8H), 1.86-1.29(m, 34H); 19F-NMR(282 MHz, CD3OD): δ -70.52, -75.60; HRMS(m/z): C60H94F3N13O16S에 대한 [M+Na+2H]+ 계산치 1341.66; 실측치 1366; LCMS 실측치 1343.3 [M+2H]+; IR(neat): 3390, 3283, 2932, 2865, 1633, 1551, 1459, 1365, 1073 cm-1.
실시예 3: 인슐린에 의한 리간드-기반 수용체 포획
(a) 3관능성 가교제 Joy-05-125(실시예 2로부터 수득함)에 리간드 결합
50 μg의 Joy-05-125(DMSO 중 100 mM)를 pH 8.2의 10 μl HEPES 중 인슐린(I9278, Sigma-Aldrich) 100 μg에 첨가하여 약 2:1의 가교제:리간드 비를 얻었다. 대조군 시료에 대해서는 50 μg의 Joy-05-125(DMSO 중 100 mM)를 억제액(pH 8.2의 10 μl HEPES 중 10 mM의 글리세린)에 첨가하였다. 반응을 상온에서 약 1시간 동안 실시하였다.
(b) 세포의 수거와 세포 표면 당단백질의 산화
2 x 108개의 세포(Jurkat T)를 50 ml 관에 모으고 인산 완충 용액(PBS, pH 7.4)로 세척하였다. 이어서, 세포를 15분 동안 4℃의 광 부재 조건에서 표지화 완충액(PBS, pH 6.5) 중 1.5 mM 메타과요오드산 나트륨(Thermo Scientific)으로 산화시켰다. 얻어진 세포 펠렛을 50 ml 표지화 완충액으로 1회 세척하여 대부분의 메타과요오드산 나트륨을 제거하고 죽은 세포/단편들을 감소시켰다.
(c) 리간드-기반 수용체 포획
상기 세포 펠렛을 2개의 별도 튜브 중 표지화 완충액에 재현탁하였다(하기 단계 모두는 리간드와 대조군 반응에 대해 각각 동시에 실시하였다). Joy-05-125에 결합된 인슐린과 억제된 시약을 각각 10 ml 표지화 완충액 중 108개의 세포에 첨가하고 60분 동안 4℃의 저속 교반기 상에서 배양하였다. 포획시, 세포 펠렛을 50 ml의 PBS로 세척하였다.
(d) 세포 용해 및 트립신 분해
상기 세포 펠렛을 50 mM 중탄산 암모늄 1 ml에 재현탁하였다. 세포를 VialTweeter(Hielscher)에서 간접 초음파(100% 진폭/0.8 사이클)에 의해 용해시키고 용해물을 4℃에서 10분 동안 2,500 g에서 원심분리하여 세포핵을 펠렛화하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 산에 불안정한 계면활성제 RapiGest(Waters)를 최종 농도 0.1%까지 첨가한 후 5분 동안 간접 초음파 처리하여 반투명한 용액을 얻었다. 시료를 5 mM TCEP(Thermo Scientific)로 30분 동안 상온에서 환원시키고 이어서 10 mM 요오도아세트아미드(Thermo Scientific)로 알킬화하였다. 200 μg의 트립신(소 췌장으로부터 얻음, Sigma Aldrich)을 첨가하고 시료를 저속 교반기 상에서 밤새 분해하였다. 분해시 상기 펩티드 혼합물을 96℃로 10분 동안 가열하여 프로테아제를 불활성화시키고 분해되지 않은 입자를 10분 동안 13000 g에서 원심분리하여 제거하였다.
(e) 당펩티드 포획과 방출
2x50 μl의 UltraLink Streptavidin Plus 비드(Thermo Scientific)를 Mobicols(Bocascientific) 중 50 mM 중탄산 암모늄으로 2회 세척하였다. 세척한 스트렙트아비딘 비드를 펩티드 용액에 첨가하고 저속 교반기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 포획된 당펩티드를 10 ml의 5M 염화나트륨, 50 mM 중탄산 암모늄 중 10 ml의 1% Triton X-100(Sigma), 10 ml의 50 mM 중탄산 암모늄, 10 ml의 pH 11의 100 mM 탄산나트륨, 60℃로 가열한 10ml의 100 mM 중탄산 암모늄을 이용하여 순차적으로 집중 세척하였다. 세척은 Vac-ManLaboratory Vacuum Manifold(Promega)에 연결된 Mobicols에서 실시하였다. 세척한 비드를 37℃의 저속 교반기에서 2 μl의 PNGaseF(NEB)을 함유한 400 μl의 중탄산 암모늄 중에 밤새 배양하였다. 배양시 비드를 500 μl의 50 mM 중탄산 암모늄으로 1회 세척하고 용출액을 모아 추후 LC-MS/MS 분석을 위해 speedvac에서 건조하였다.
(f) LC-MS 데이터 획득
펩티드를 2% 아세토니트릴, 0.1% 포름산에 재용해하고 크로마토그래피 분리용 Nano LC Ultra 1D Plus(Eksigent) 장치에 연결한 나노전기분사 이온 소스를 구비한 LTQ-Orbitrap XL 질량분광계(Thermo Scientific)로 분석하였다. 펩티드를 모세관 역상 C18 칼럼(내경 75 ㎛와 베드 길이 10 cm; 200 A, 3 ㎛ C18 비드, Michrom BioResources)에 충전시켰다. (A) 0.1% 포름산, 2% 아세토니트릴과 (B) 0.1% 포름산, 98% 아세토니트릴을 이용한 유속 300 nl/분 및 선형구배 용출율 2-40% B로 역상 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 MS 계기를 데이터-의존 방식으로 작동시켜 5 충돌-유기 해리(CID) MS/MS 스펙트럼을 각각의 FT-MS 스캔 당 선형 이온 트랩에서 획득하였고, 후자는 60,000 FWHM 해상도 장치에서 획득하였다. MS/MS 시도를 촉진시키기 위한 모든 다중 하전된 이온을 포함하고 모든 단일 하전된 전구체 이온 뿐 아니라 어떠한 하전 상태도 결정될 수 없는 이온을 배제한 하전 상태 스크리닝을 이용하였다. 임계치 250개의 이온수를 넘는 펩티드 이온 만이 MS/MS-스캔을 작동시키도록 하고 5초 동안 동적 배제하였다.
(g) 데이터베이스 검색과 펩티드/단백질 정량화
모든 MS/MS 스펙트럼을 SEQUEST 알고리즘을 이용하여 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스(Version 57.15)에 대해 검색하였다. 데이터의 통계분석은 ISB 오픈 소스 소프트웨어 도구(PeptideProphet, Protein Prophet (http://tools.proteomecenter.org/software.php))의 조합을 이용하여 실시하였고 적어도 0.8의 PeptideProphet 확률 점수를 이용하여 데이터를 필터링하였다. 컨센서스 N115-X-S/T 글리코실화 모티프를 함유한 펩티드에 대해서 Progenesis LC-MS 소프트웨어(Nonlinear Dynamics)를 이용하여 무-표지 정량 데이터 분석을 실시하였다. 자동 체류시간 조절은 수동으로 확인하였고 미리 글리코실화시킨 펩티드의 특성 개요는 필요에 따라 보정하여 시료 간의 정확한 상대적 정량화를 확보하였다. 미리 글리코실화시킨 펩티드에 대한 원 존재량을 추출하고 표준화하여 리간드와 대조군 시료에서 동량의 전체 당펩티드 특성 세기를 각각 얻었다.
데이터의 상대적-정량 평가(도 2(a)와 (b) 참조)를 통해 인슐린 수용체가 각각 단백질 수준(a)과 펩티드 수준(b)에서 주르카트 세포 상에서 인슐린에 대한 특이적 수용체로서 동정된 유일한 단백질이라는 것을 알 수 있었다. 도 2(a)와 2(b)에는 상대적으로 높은 존재량의 log10으로서 단백질 또는 펩티드 존재량이 y-축을 따라 표시되어 있다(인슐린 시료 또는 대조군 시료). x 차원에서 인슐린 시료 대 대조군 시료 존재량의 비의 log2는 특이적 농축을 나타낸다(인슐린 수용체 단백질/펩티드는 검정색이 칠해진 데이터 점으로 나타내었고, 다른 단백질/펩티드는 빈 데이터 점으로 나타내었다). 이에 따라, 펩티드 존재량은 소정의 당펩티드 특성의 동위원소 경계 내 피크 면적의 합이다. 단백질 존재량은 동일한 단백질로부터 유래된 것으로서 동정된 모든 당펩티드 이온의 존재량의 합이다. 주목할 것은, 인슐린 수용체는 3개의 서로 다른 펩티드로 동정되었는데, 이는 평균화한 높은 단백질 농축비에 많은 상당한 신뢰성을 준다.
실시예 4: CD44 항체에 의한 리간드-기반 수용체 포획
(a) 3관능성 가교제 Joy-05-125(실시예 2에 따라 수득함)에 리간드 결합
50 μg의 Joy-05-125(DMSO 중 100 mM)를 pH 8.2의 50 μl HEPES 중 100 μg의 단클론성 CD44 항체(마우스 IgG1, clone DB105, Miltenyi Biotec)에 첨가하여 약 50:1의 가교제:리간드 비를 얻었다. 대조군 시료에 대해서는 50 μg의 Joy-05-125(DMSO 중 100 mM)를 억제액(pH 8.2의 50 μl의 HEPES 중 10 mM 글리세린)에 첨가하였다. 반응을 상온에서 약 1시간 동안 실시하였다.
(b) 세포의 수거와 세포 표면 당단백질의 산화
U-2 OS 세포를 50% 밀집도에 도달하도록 6개의 페트리 디시(140x20 mm)에서 배양하고 PBS로 세척하였다. 이어서, 세포를 15분 동안 4℃의 광 부재 조건에서 표지화 완충액(PBS, pH 6.5) 중 1.5 mM 메타과요오드산 나트륨(Thermo Scientific)으로 산화시켰다. 세포를 플레이트 당 20 ml의 표지화 완충액으로 세척하여 대부분의 메타과요오드산 나트륨 제거하고 죽은 세포/단편들을 감소시켰다.
(c) 리간드-기반 수용체 포획
상기 세포 펠렛을 2개의 별도 튜브 중 표지화 완충액에 재현탁하였다(하기 단계 모두는 리간드와 대조군 반응에 대해 각각 동시에 실시하였다). Joy-05-125에 결합된 CD44 항체와 억제된 시약을 각각 디시 당 5 ml의 표지화 완충액 중 3개의 디시에 첨가하고 60분 동안 4℃의 저속 진탕기에서 배양하였다. 포획시, 세포를 플레이트 당 20 ml의 PBS로 세척하였다.
(d) 세포 용해와 트립신 분해
상기 세포를 PBS 중 10 mM의 EDTA를 이용하여 페트리 디시로부터 분리하고 PBS로 1회 세척하였다. 세포 펠렛을 1 ml의 50 mM 중탄산 암모늄에 재현탁하였다. 세포를 VialTweeter(Hielscher)에서 간접 초음파(100% 진폭/0.8 사이클)에 의해 용해시키고 용해물을 4℃에서 10분 동안 2,500 g에서 원심분리하여 세포핵을 펠렛화하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 산에 불안정한 계면활성제 RapiGest(Waters)를 최종 농도 0.1%까지 첨가한 후 5분 동안 초음파 처리하여 반투명 용액을 얻었다. 시료를 5 mM TCEP(Thermo Scientific)로 5분 동안 상온에서 환원시키고 이어서 10 mM 요오도아세트아미드(Thermo Scientific)로 알킬화하였다. 200 μg의 트립신(소 췌장으로부터 얻음, Sigma Aldrich)을 첨가하고 시료를 저속 교반기 상에서 밤새 분해하였다. 분해시 상기 펩티드 혼합물을 96℃로 10분 동안 가열하여 프로테아제를 불활성화시키고 분해되지 않은 입자를 10분 동안 13000 g에서 원심분리하여 제거하였다.
과정의 나머지 단계는 실시예 3에 대해 기재한 바와 같이 실시하였다.
한번 더 말하면, 데이터의 상대적-정량 평가(도 3 참조)를 통해 CD44 세포 표면 당단백질이 U-2 OS 세포 상에서 CD44 항체에 대한 특이적 표적으로서 동정된 유일한 단백질이라는 것을 알 수 있었다.
결과를 도 3에 나타내었고, 도 3에서는 상대적으로 높은 존재량의 log10으로서 펩티드 존재량이 y-축을 따라 표시되어 있다(CD44 항체 시료 또는 대조군 시료). x 차원에서 항체 시료 대 대조군 시료 존재량의 비의 log2는 특이적 농축을 나타낸다(CD44 펩티드는 검정색이 칠해진 데이터 점으로 나타내었고, 다른 단백질로부터 유도된 펩티드는 빈 데이터 점으로 나타내었다). 이에 따라, 펩티드 존재량은 소정의 당펩티드 특성의 동위원소 경계 내 피크 면적의 합이다. 주목할 것은, CD44는 3개의 서로 다른 펩티드로 동정되었는데, 이는 평균화한 높은 단백질 농축비에 많은 상당한 신뢰성을 준다.

Claims (32)

  1. 하기 화학식 VIII의 3관능성 가교 시약으로서:
    Figure 112017081101193-pct00046

    상기 화학식 VIII에서
    W1는 -NH-, -O-, -S-이고;
    W2, W3는 서로 독립적으로 -COO-, -OOC-, -CONH-, -NHCO-, -NH-, -O-, -S-로부터 선택되는 작용기이고;
    Z는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    RN은 H 또는 히드라진-보호기이고;
    n1, n5, p2, p3, p4, p5, s는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
    S3은 하기 화학식(a) 또는 (b)의, 또는 (a)와 (b)의 조합의, 하나 이상의 반복단위를 포함하는 선형 사슬이고;
    화학식(a)는 -[Y1-(CH2)n]p-, 화학식(b)는 -[Y2-(CH2)m-Y3]q- 이고; 화학식(a), (b)에서 Y1, Y2, Y3은 서로 독립적으로 -O-, -CO-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-로부터 선택되고; R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고; n, m, p, 및 q는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이고;
    아릴은 6-탄소 단환, 10-탄소 2환, 14-탄소 3환 방향족 고리계이며, 상기 아릴은 비치환되어 있거나 1 내지 4개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 1 내지 6개의 탄소원자를 가진 알킬, 알케닐, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 알콕시기로부터 선택되는 할로, 히드록실, 아미노, 시아노, 니트로, 메르캅토, 카르복시 또는 히드로카르빌기로부터 선택되고;
    헤테로아릴은 O, N, 또는 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 가진 방향족 5-8원 단환, 8-12원 2환 또는 11-14원 3환 고리계이며, 상기 헤테로아릴은 비치환되어 있거나 1 내지 4개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 1 내지 6개의 탄소원자를 가진 알킬, 알케닐, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 알콕시기로부터 선택되는 할로, 히드록실, 아미노, 시아노, 니트로, 메르캅토, 카르복시 또는 히드로카르빌기로부터 선택되고;
    상기 히드라진-보호기는 히드라존인,
    3관능성 가교 시약.
  2. 제1항에 있어서, 상기 히드라진-보호기는 케톤 히드라존인 것을 특징으로 하는 3관능성 가교 시약.
  3. 제1항에 있어서, 상기 히드라진-보호기는 알데히드 히드라존인 것을 특징으로 하는 3관능성 가교 시약.
  4. 제1항에 있어서, W3는 -NHCO-인 것을 특징으로 하는 3관능성 가교 시약.
  5. 제1항에 있어서, R1은 H인 것을 특징으로 하는 3관능성 가교 시약.
  6. 제1항에 따른 3관능성 가교 시약을 포함하는 키트.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 3관능성 가교 시약 또는 제6항에 따른 키트를 이용하여, 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 특성 평가 및 분석하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표적 당단백질 수용체가 세포 표면 또는 분비된 당단백질인 것을 특징으로 하는, 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 특성 평가 및 분석하는 방법.
  9. 리간드와 시료 내 적어도 하나의 탄수화물 잔기를 가진 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법으로서, 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 도메인을 인식하며, 상기 방법은:
    i) 상기 표적 당단백질 수용체를 포함하는 시료를 제공하는 단계,
    ii) 상기 표적 당단백질 수용체를 산화 처리하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기 상에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화된 표적 당단백질 수용체를 얻는 단계,
    iii) 제1항에 따른 화학식 VIII의 3관능성 가교 시약을 제공하고, 상기 리간드에 리간드-반응성 기를 접합하여 리간드-가교 시약-복합체를 얻는 단계,
    iv) (a) 상기 리간드가 표적 당단백질 수용체 상의 리간드-특이적 도메인에 결합할 수 있고 (b) 보호된 히드라진기가 유리 형태로 전환되고 산화된 표적 당단백질 수용체와 반응할 수 있는, 조건에서 시료를 리간드-가교 시약-복합체에 접촉시켜 2중 펩티드-결합 복합체를 얻는 단계,
    v) 상기 2중 펩티드-결합 복합체를 시료로부터 분리 정제하는 단계,
    vi) 단계(v)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체로부터 펩티드를 방출하여 방출된 펩티드를 얻는 단계,
    vii) 단계(vi)에서 얻은 방출된 펩티드를 고질량 정확도 질량 분광 분석법에 의해 분석 및 정량화하는 단계, 및
    viii) 상기 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 상호작용을 대조군 반응과의 정량 비교를 통해 동정하는 단계;를 포함하는, 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 당단백질이 용액 중에 또는 세포의 표면상에 있으며;
    단계(v)가 먼저 시료를 효소 분해 처리하여 처리된 세포 시료를 얻고 이어서 상기 처리된 세포 시료를 친화성 정제함으로써 시료로부터 2중 펩티드-결합 복합체를 분리 정제하는 것을 포함하며;
    단계(vi)가 단계(v)에서 얻은 정제된 2중 펩티드-결합 복합체를 글리코시다아제로 처리함으로써 상기 복합체로부터 펩티드를 방출하여 방출된 펩티드를 얻는 것을 포함하는; 것을 특징으로 하는, 리간드와 표적 당단백질 수용체 간의 특이적 상호작용을 동정하는 방법.
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