DE10322077A1

DE10322077A1 - Isotopencodierte Affinitätsmarker 6

Info

Publication number: DE10322077A1
Application number: DE2003122077
Authority: DE
Inventors: Oswald Dr. Lockhoff; Andreas Dr. Schumacher; Hans-Georg Dr. Lerchen; Dorian Dr. Immler
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2003-05-15
Filing date: 2003-05-15
Publication date: 2004-12-02

Abstract

Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung, Verwendung und diese enthaltende Kits.

Description

Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung, Verwendung und diese enthaltende Kits.
Die Proteomics-Technologie eröffnet die Möglichkeit, durch Analyse von biologischen Systemen auf der Proteinebene neue biologische Targets und Marker zu identifizieren. Es ist bekannt, dass von den im Genom codierten Proteinen nur jeweils ein bestimmter Teil aller möglichen Proteine exprimiert wird, wobei beispielsweise Gewebetyp, Entwicklungsstand, Aktivierung von Rezeptoren oder zelluläre Interaktionen die Expressionsmuster und -raten beeinflussen. Um Unterschiede der Expression von Proteinen in gesundem oder krankem Gewebe festzustellen, können verschiedene vergleichende Methoden zur Analyse von Protein-Expressionsmustern herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 9390; (b) D. R. Goodlett et al., Proteome Protein Anal., 2000, 3; (c) S. P. Gygi et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11, 396).
Eine leistungsfähige Methode ist dabei die massenspektrometrische Detektion von Proteinen. Bei Verwendung von unterschiedlich isotopencodierten Affinitätsmarkern (ICAT^® = Isotope Coded Affinity Tags) und Tandem-Massenspektrometrie kann dieses Verfahren zur quantitativen Analyse von komplexen Proteinmischungen herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 994; (b) R. H. Aebersold et al., WO 00/11208). Das Verfahren beruht darauf, dass jede von zwei oder mehr zu vergleichenden Proteinmischungen, die in verschiedenen Zellzuständen erhalten worden sind, mit einem Affinitätsmarker anderer Isotopencodierung umgesetzt wird. Die Proteinmischungen werden danach kombiniert, gegebenenfalls fraktioniert oder proteolytisch behandelt und affinitätschromatographisch gereinigt. Nach Elution der gebundenen Fragmente werden die Eluate durch Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert. Paare bzw. Gruppen von mit sich nur in der Isotopencodierung unterscheidenden Affinitätsmarkern markierten Peptiden sind chemisch identisch und werden in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) nahezu zeitgleich eluiert, sie unterscheiden sich im Massenspektrometer jedoch um die jeweiligen Molekulargewichtsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Isotopenmuster der Affinitätsmarker. Relative Proteinkonzentrationen können direkt durch Messungen der Peakflächen erhalten werden. Geeignete Affinitätsmarker sind Konjugate aus Affinitätsliganden, die über Brückenglieder kovalent mit proteinreaktiven Gruppen verknüpft sind. Dabei werden in die Brückenglieder unterschiedliche Isotope eingebaut. Das Verfahren wurde anhand von Affinitätsmarkern beschrieben, die aus oligomeren Ethylenglycoleinheiten aufgebaut sind und in denen Wasserstoff-Atome durch Deuterium-Atome ersetzt wurden (¹H/²D-Isotopencodierung).
Diese Verbindungen weisen eine Reihe von Nachteilen auf, insbesondere eine schwierige Herstellbarkeit, eine nicht ausreichende Stabilität der Affinitätsmarker im allgemeinen und speziell im LC-MS/MS sowie eine mangelnde Effizienz der Avidin-Monomer-basierten Affinitätschromatographie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Verbindungen der Formel A-L-PRG (I), in der
A für einen Affinitätsliganden-Rest,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe und
L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
wobei der Linker L mindestens eine Kohlenhydrat-Gruppe enthält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Begriffe, Substituenten und Symbole, soweit nicht ausdrücklich anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkylen, Alken(yl), Oxaalkylen, Alkoxy und Alkylcarbonyl stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkylen steht für bivalente Alkylgruppen, beispielhaft und vorzugsweise für Methylen, Ethylen (-[CH₂]₂-), n-Propylen (-[CH₂]₃-), Isopropylen(-CH₂-CH(CH₃)-), n-Butylen (-[CH₂]₄-), n-Pentylen(-[CH₂]₅-) und n-Hexylen(-[CH₂]₆-).
Oxaalkylen steht für Alkylen, in dem eine CH₂-Gruppe durch ein Sauerstoffatom ersetzt oder dem ein terminales Sauerstoffatom hinzugefügt ist, beispielhaft und vorzugsweise für -O-CH₂-, -O-[CH₂]₂-, -O-[CH₂]₃-, -O-CH₂-CH(CH₃-, -O-CH(CH₃)-CH₂-, -O-[CH₂]₄-, -O-[CH₂]₅- und -O-[CH₂]₆-, Oligomeres Oxaalkylen steht für zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr, insbesondere zwei oder drei, aneinandergereihte, gleiche oder verschiedene Oxaalkylene, beispielhaft und vorzugsweise für -O-CH₂-O-CH₂-, -O-[CH₂]₂-O-[CH₂]₂-, -O-CH₂-O-[CH₂]₂-, und -O-[CH₂]₂-O-CH₂-.
Alken(yl) steht für Alkylgruppen, die eine, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Doppelbindungen und dementsprechend mindestens 2 Kohlenstoffatome aufweisen, beispielsweise und vorzugsweise für Ethenyl, n-Propenyl, Methylethenyl und n-But-3-enyl.
Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Aryl und "Aryl" in Arylthiol steht für einen mono- bis tricyclischen aromatischen, carbocyclischen Rest mit in der Regel 6 bis 14 Kohlenstoffatomen; beispielhaft und vorzugsweise für Phenyl, Naphthyl und Phenanthrenyl.
Acyl und "Acyl" oder "acyl" in Acyloxybenzylether und Halogenacyl steht für Formyl und Alkylcarbonyl, beispielhaft und vorzugsweise für Formyl, Acetyl und Propanoyl.
Halogen und "Halogen" in Halogenacyl steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod.
Ein Symbol @ an einer Bindung bedeutet die Verknüpfungsstelle im Molekül.
Der Affinitätsligand A dient zur selektiven Anreicherung von Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie. Die Affinitätssäulen sind mit den entsprechenden komplementären Partnern zu den Affinitätsliganden versehen, welche kovalente oder nicht kovalente Bindungen mit den Affinitätsliganden eingehen. Ein Beispiel für einen geeigneten Affinitätsliganden ist Biotin oder ein Biotin-Derivat, das mit den komplementären Proteinen Avidin oder Streptavidin starke, nicht-kovalente Bindungen eingeht. Auf diese Weise können zu untersuchende Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie selektiv aus Probenmischungen isoliert werden. Im gleichen Sinn können beispielsweise auch Kohlenhydrat-Cluster, die nicht kovalente Wechselwirkungen mit fixierten Lektinen eingehen können, als Affinitätsliganden verwendet werden. Weiterhin kann im gleichen Sinn die Wechselwirkung von Haptenen mit Antikörpern oder die Interaktion von Übergangsmetallen mit entsprechenden Liganden als Komplexbildner genutzt werden oder andere Systeme, die miteinander in Wechselwirkung treten.
Proteinreaktive Gruppen PRG dienen der gezielten Markierung der Proteine an ausgewählten funktionellen Gruppen. PRG haben eine spezifische Reaktivität für endständige funktionelle Gruppen der Proteine. Aminosäuren als Elemente von Proteinen, die häufig für gezielte Markierungen verwendet werden, sind beispielsweise Mercaptoaminomonocarbonsäuren wie Cystein, Diaminomonocarbonsäuren wie Lysin oder Arginin oder Monoaminodicarbonsäuren wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Proteinreaktive Gruppen können beispielsweise thiolreaktive Gruppen sein wie Halogene, Epoxide, Alkene, Nitrile, Maleinimide, Sulfonsäureester, Vinylsulfone, Iodacetamide, Thiosulfonsäureester, Arylthiole oder ortho-Pyridyldisulfide. Aminreaktive Gruppen können beispielsweise Dichlorotriazine, Methansulfonate, Trifluormethansulfonate, Tresylate, Succinimidylcarbonate, Benzotriazolcarbonate, p-Nitrophenylcarbonate, Trichlorphenylcarbonate, Carbonylimidazole, Succinimidylsuccinate, Isocyanate oder Thiocyanate sein. Aminreaktive Gruppen können auch Aldehyde wie substituierte Acetaldehyde oder Propionaldehyde sein, die nach ihrer Kopplung zu Schiffschen Basen zu stabilen sekundären Aminen reduziert werden können. Aminreaktive Gruppen können auch aktivierte Ester von substituierten Carbonsäuren sein wie beispielsweise N-Hydroxysuccinimidester, die mit primären Aminen unter nahezu physiologischen Bedingungen zu stabilen Amiden umgesetzt werden können. Carboxylatreaktive Gruppen enthalten beispielsweise Amin- oder Alkoholgruppen in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln. Weiterhin können proteinreaktive Gruppen auch phosphatreaktive Gruppen wie beispielsweise Metallchelate sowie aldehyd- oder ketonreaktive Gruppen wie beispielsweise Amine sein, die nach Bildung einer Schiff-Base reduziert werden zu sekundären Aminen, beispielweise mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid. Ebenso können es Gruppen sein, die nach einer gezielten Proteinderivatisierung wie beispielsweise einer Bromcyanspaltung oder einer Elimination von Phosphatgruppen etc. mit den Umsetzungsprodukten reagieren.
Die Linker L in Formel (I) verknüpfen kovalent die Affinitätsliganden A mit den proteinreaktiven Gruppen. Die Linker L enthalten eine oder mehrere Kohlenhydrat-Gruppen als Strukturelemente.
Die Kohlenhydrat-Gruppen als Substrukturen von L sind ausgewählt aus der Gruppe der monomeren und oligomeren Kohlenhydrate und ihrer Desoxy-Derivate, in denen eine (Monodesoxy-) oder mehrere Hydroxygruppen durch Wasserstoff ersetzt sind. Die Kohlenhydrat-Gruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide, der Disaccharide und der aus 3 bis 10 kondensierten Monosaccharide bestehenden Oligosaccharide und ihrer Desoxy-Derivate. Die Kohlenhydrat-Gruppen sind besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und ihrer auch Desoxyzucker (engl. deoxy sugars) genannten Desoxy-Derivate, insbesondere ihrer Monodesoxy-Derivate (Monodesoxyzucker).
Die Monosaccharide als solche und auch als Bestandteile der Di- und höheren Oligosaccharide sowie ihre Desoxy-Derivate sind linear oder cyclisch, vorzugsweise cyclisch und besonders bevorzugt pyranosid oder furanosid.
Die Linker L können zusätzlich Fragmente mit solchen funktionellen Gruppen enthalten, die selektiv und unter relativ milden Bedingungen spaltbar sind und deren Spaltung eine Trennung der kovalenten Verknüpfung von A und PRG bewirkt. Dadurch wird es möglich, markierte Peptid- und Proteinfragmente auch von sehr fest gebundenen Analytmischungen unter schonenden Bedingungen und mit guten Ausbeuten von den Affinitätssäulen freizusetzen.
Ein sehr stark bindendes Affinitätsmaterial für Biotin-haltige Proben ist zum Beispiel Streptavidin. Biotin-haltige Liganden können von Streptavidin-haltigen Affinitätssäulen gewöhnlich nur unter weitgehender Zerstörung der Analytmischungen freigesetzt werden. Eine leichte chemische Spaltbarkeit der funktionellen Gruppe in den Fragmenten L ermöglicht es nun, dass die chemische Bindung zwischen A und L gespalten wird, wobei die Affinitätsliganden A weiterhin an der Affinitätssäule gebundenen bleiben, und die Peptid- oder Protein-Mischungen in markierter Form von der Affinitätssäule freigesetzt werden können.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind solche der Formel A-B-Z-E-PRG (II), in der
A für einen Affinitätsliganden-Rest steht,
B für eine substituierte Schutzgruppe eines Kohlenhydrates mit bis zu 25 Nichtwasserstoff-Atomen steht, die über die Stelle ihrer Substitution direkt oder über eine Alkyleneinheit oder eine monomere oder oligomere Oxaalkyleneinheit eine kovalente Bindung zum Affinitätsliganden ausbildet,
Z für eine monomere oder oligomere Kohlenhydrat-Gruppe oder deren Desoxy-Derivat steht,
E für eine kovalente Brücke oder Bindung zwischen Z und PRG steht und
PRG für eine proteinreaktive Gruppe steht.
Die substituierte Schutzgruppe B ermöglicht aufgrund ihrer spezifischen Eigenschaften als Schutzgruppe eine selektive Funktionalisierbarkeit der Affinitätsliganden.
Die kovalente Brücke oder Bindung E verbindet ein Sauerstoffatom einer Hydroxygruppe von Z oder ein Desoxy-Kohlenstoffatom von Z mit PRG.
Bevorzugt sind besonders solche erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (II), in welchen
A für Biotinoyl, Galactosyl, Mannosyl, Fucosyl oder einen Kohlenhydrat-Cluster steht,
B für eine substituierte Schutzgruppe eines Kohlenhydrates mit bis zu 25 Nichtwasserstoff-Atomen steht, die über die Stelle ihrer Substitution direkt oder über eine Alkyleneinheit oder eine monomere oder oligomere Oxaalkyleneinheit eine kovalente Bindung zum Affinitätsliganden ausbildet,
Z für eine monomere oder oligomere Kohlenhydrat-Gruppe deren Desoxy-Derivat steht,
E für eine kovalente Brücke oder Bindung zwischen Z und PRG steht und
PRG für Halogen, 2-Halogenacyl, Epoxid, Alken, Acryloyl, Acryloylamino (-NH-CO-CH=CH₂), Maleinimid, Nitril, Sulfonsäureester, Vinylsulfonsäureester, Thiosulfonsäureester, Arylthiol, ortho-Pyridyldisulfid, Dichlorotriazin, Methansulfonat, Trifluormethansulfonat, Tresylat, Succinimidylcarbonat, Benzotriazolcarbonat, p-Nitrophenylcarbonat, Trichlorphenylcarbonat, Carbonylimidazol, Succinimidylsuccinat, Isocyanat, Isothiocyanat (-N=C=S), Acetaldehyd, Propionaldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, N-Succinimidyl oder Amin- oder Alkoholgruppen in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind auch solche der Formel (II), in welchen
A für einen Affinitätsliganden-Rest steht,
B für -NR¹-(CH₂)_m-R², -O-(CH₂)_n-R², -O-C₆H₄-CH₂-, -O-C₆H₄-CH₂-R² oder -O-CH₂-C₆H₄-R² steht,
wobei
R¹ für Wasserstoff, C_1-3-Alkyl oder C_1-7-Acyl steht,
R² für CH steht, wobei das Kohlenstoffatom an acetalisch an zwei Sauerstoffatome von Hydroxygruppen von Z gebunden ist,
Z für eine Desoxy-Derivat einer Hexose-Gruppe aus der Reihe Glucose, Mannose oder Galactose steht, bei dem ein oder zwei Wasserstoffatome der primären oder sekundären Hydroxygruppen ersetzt sind durch ein Fragment B,
E für ^@-O-(CH₂)_p-, ^@-NH-CO-(CH₂)_q-, ^@-(CH₂)_r- steht, deren mit ^@ gekennzeichneter Terminus an ein Desoxy-Kohlenstoffatom von Z gebunden ist, oder für eine direkte Bindung zwischen einem Desoxy-Kohlenstoffatom von Z und PRG steht,
PRG für proteinreaktive Gruppe steht und
m, n, p, q, r unabhängig voneinander jeweils für eine der Zahlen 0, 1, 2, 3, 4 und 5 stehen.
Bevorzugt sind darunter besonders solche erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II), in welchen
A für Biotinoyl, Galactosyl, Mannosyl, Fucosyl oder einen Kohlenhydrat-Cluster steht,
B für -NR¹-(CH₂)_m-R², -O-(CH₂)_n-R², -O-C₆H₄-CH₂-, -O-C₆H₄-CH₂-R², -O-C₆H₄-R² oder -O-CH₂-C₆H₄-R² steht,
wobei
R¹ für Wasserstoff, C_1-3-Alkyl oder C_1-7-Acyl steht,
R² für CH steht, wobei das Kohlenstoffatom an acetalisch an zwei Sauerstoffatome von Hydroxygruppen von Z gebunden ist,
Z für eine Monodesoxy-Derivat einer cyclischen Hexose-Gruppe aus der Reihe Glucose, Mannose oder Galactose steht, bei dem ein oder zwei Wasserstoffatome der primären oder sekundären Hydroxygruppen ersetzt sind durch ein Fragment B,
E für ^@-O-(CH₂)_p-, ^@-NH-CO-(CH₂)_q-, ^@-(CH₂)_r- steht, deren mit ^@ gekennzeichneter Terminus an das Desoxy-Kohlenstoffatom von Z gebunden ist, oder für eine direkte Bindung zwischen dem Desoxy-Kohlenstoffatom von Z und PRG steht,
PRG für Chlor, Brom, Iod, 2-Halogenacyl, Epoxid, Alken, Acryloyl, Acryloylamino, Maleinimid, Nitril, Methansulfonat, Trifluormethansulfonat, Tresylat, Vinylsulfonat, Methanthiosulfonat, Arylthiol, ortho-Pyridyldisulfid, Dichlorotriazin, Succinimidylcarbonat, Benzotriazolcarbonat, p-Nitrophenylcarbonat, Trichlorphenylcarbonat, Carbonylimidazol, Succinimidylsuccinat, Acetaldehyd, Propionaldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, N-Succinimidyl, Amin, Alkohol, Isocyanat oder Isothiocyanat steht und
m, n, p, q, r unabhängig voneinander jeweils für eine der Zahlen 0, 1, 2, 3, 4 und 5 stehen.
Bevorzugt sind darunter auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen m, n, p, q und r unabhängig voneinander jeweils für eine der Zahlen 0, 1, 2 und 3 stehen.
Bevorzugt sind darunter wiederum besonders solche erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II), in welchen
A für Biotinoyl steht,
B für -NR¹-CH₂-R², -O-C₆H₄-CH₂-, -O-C₆H₄-R² oder -O-CH₂-C₆H₄-R² steht,
wobei
R¹ für Wasserstoff steht,
R² für CH steht, wobei das Kohlenstoffatom an acetalisch an zwei Sauerstoffatome von Hydroxygruppen von Z gebunden ist,
Z für ein β-1-Desoxy-D-glucopyranos-1-yl steht, wobei das Wasserstoffatom der Hydroxygruppe an C-6 oder die beiden Wasserstoffatome der Hydroxygruppen an C-4 und C-6 ersetzt sind durch ein Fragment B,
E für ^@-O-(CH₂)₂-, ^@-O-(CH₂)₃-, ^@-NH-CO-CH₂- oder ^@-CH₂- steht, deren mit ^@ gekennzeichneter Terminus an das Desoxy-Kohlenstoffatom C-1 von Z gebunden ist, oder für eine direkte Bindung zwischen dem Desoxy-Kohlenstoffatom von Z und PRG steht und
PRG für Chlor, Brom, Iod, Acryloylamino, N-Succinimidyl oder Isothiocyanat steht.
Einen bevorzugten Affinitätsliganden A stellt der Biotinoyl-Rest dar, der über die endständige Carboxylfunktion des Biotins kovalent mit B verbunden ist. Biotin wird sehr selektiv und stark von komplementären Rezeptorproteinen wie Avidin oder Streptavidin gebunden. Bevorzugte Affinitätsliganden A sind auch monomere Kohlenhydrat-Reste oder Kohlenhydrat-Cluster, die Liganden von Lektinen darstellen. Geeignete monomere Kohlenhydrat-Reste sind beispielsweise Galactose, Mannose oder Fucose. Einzelne Kohlenhydrate können auch über dendrimere Strukturen Kohlenhydrat-Cluster bilden, die die Bindungen zu den fixierten komplementären Lektinen noch erhöhen.
Bevorzugt sind also auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen der Affinitätsligand A für Biotinoyl, Galactosyl, Mannosyl, Fucosyl oder einen Kohlenhydrat-Cluster steht.
Besonders bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen der Affinitätsligand A für Biotinoyl steht.
Bevorzugt sind auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen die proteinreaktive Gruppe PRG für Halogen, 2-Halogenacyl, Epoxid, Alken, Acryloyl, Acryloylamino (-NH-CO-CH=CH₂), Maleinimid, Nitril, Sulfonsäureester, Vinylsulfonsäureester, Thiosulfonsäureester, Arylthiol, ortho-Pyridyldisulfid, Dichlorotriazin, Methansulfonat, Trifluormethansulfonat, Tresylat, Succinimidylcarbonat, Benzotriazolcarbonat, p-Nitrophenylcarbonat, Trichlorphenylcarbonat, Carbonylimidazol, Succinimidylsuccinat, Isocyanat, Isothiocyanat (-N=C=S), Acetaldehyd, Propionaldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, N-Succinimidyl oder Amin- oder Alkoholgruppen in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe, wie sie z. B. von W.H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, Academic Press, 1987, S. 30ff beschrieben und zusammengefasst sind.
Besonders bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen die proteinreaktive Gruppe PRG für Chlor, Brom, Iod, 2-Halogenacyl, Epoxid, Alken, Acryloyl, Acryloylamino, Maleinimid, Nitril, Methansulfonat, Trifluormethansulfonat, Tresylat, Vinylsulfonat, Methanthiosulfonat, Arylthiol, ortho-Pyridyldisulfid, Dichlorotriazin, Succinimidylcarbonat, Benzotriazolcarbonat, p-Nitrophenylcarbonat, Trichlorphenylcarbonat, Carbonylimidazol, Succinimidylsuccinat, Acetaldehyd, Propionaldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, N-Succinimidyl, Amin, Alkohol, Isocyanat oder Isothiocyanat steht.
Besonders bevorzugt sind auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen die proteinreaktive Gruppe PRG für Chlor, Brom, Iod, Acryloylamino, N-Succinimidyl oder Isothiocyanat steht.
Bevorzugt sind auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen die Kohlenhydrat-Gruppen Z ausgewählt sind aus der Gruppe der Pentosen oder Hexosen.
Die nicht-isotopenmarkierten Verbindungen stellen bereits eine Isotopencodierung dar. Zur weiteren Isotopencodierung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen durch den gezielten Einbau von Isotopen markiert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in einer entsprechenden Ausführungsform mit einem oder mehreren, gleichen oder verschiedenen Isotopen markiert. Dabei sind die Isotope beispielhaft und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend ²D (Deuterium, d), ¹³C ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O und ³⁴S.
In einer bevorzugten isotopenmarkierten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Verbindungen mit mindestens einem Kohlenstoffatom des Isotops ¹³C, insbesondere sechs bis 20 ¹³C-Atomen, isotopenmarkiert. Der mit ¹H/²D-isotopencodierten Affinitätsmarkern beobachtete nachteilige Isotopeneffekt in der LC ist bei ¹²C/¹³C-Isotopencodierung deutlich verringert oder sogar gar nicht ausgeprägt. Alternativ oder zusätzlich können zu dieser ¹³C-Markierung auch die Isotope ²D (Deuterium, d), ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O und/oder ³⁴S eingesetzt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden ¹³C-markierte Verbindungen zusätzlich mit mindestens einem Deuteriumatom, vorzugsweise ein bis sieben Deuteriumatomen, beispielhaft und besonders bevorzugt fünf oder sieben Deuteriumatomen, isotopenmarkiert.
Die Isotopenmarkierungen werden üblicherweise in L und/oder PRG vorgenommen, in erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II) beispielhaft und vorzugsweise in Z, E und/oder PRG.
Bevorzugt sind auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II), bei denen Z isotopenmarkiert ist.
Bevorzugt sind auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II), bei denen Z und E isotopenmarkiert sind.
Bevorzugt sind auch solche erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II), bei denen Z, E und PRG isotopenmarkiert sind.
In Z können einzelne oder mehrere oder alle Wasserstoff- oder Kohlenstoffatome ausgetauscht sein gegen Isotope, bevorzugt die jeweils schwereren Isotope. Beispielhaft und vorzugsweise können Wasserstoffatome durch Deuterium (d) oder ¹²C-Atome durch ¹³C-Atome ersetzt sein.
Beispiele für Pentosen, in denen einzelne oder mehrere Wasserstoffatome gegen einzelne oder mehrere Deuteriumatome d ausgetauscht ist, sind D-Xylose-1-C-d, D-Xylose-2-C-d, D-Ribose-2,3,5-C-d₃ oder D-Ribose-2,3,4,5,5-C-d₅. Beispiele für Pentosen, in denen einzelne oder mehrere Kohlenstoffatome gegen solche des Isotops ¹³C ausgetauscht sind, sind D-Arabinose-1,5-¹³C₂ oder D-Ribose-¹³C₅. Beispiele für Hexosen, in denen einzelne oder mehrere Wasserstoffatome gegen einzelne oder mehrere Deuteriumatome d ausgetauscht sind, sind D-Glucose-1-C-d, D-Glucose-2-C-d, D-Mannose-1-C-d, D-Glucose-2,3,4,6,6-C-d₅ oder D-Glucose-1,2,3,4,5,6,6-C-d₇. Beispiele für Hexosen, in denen einzelne oder mehrere Kohlenstoffatome gegen einzelne oder mehrere ¹³C-Atome ausgetauscht ist, sind D-Glucose-1-¹³C, D-Glucose-3-¹³C, D-Glucose-5-¹³C, D-Glucose-1,2-¹³C₂, D-Glucose-1,6-¹³C₂, D-Glucose-2,5,6-¹³C₃, D-Mannose-1,3,6-¹³C₃, D-Mannose-1,5,6-¹³C₃, D-Glucose-¹³C₆ oder D-Mannose-¹³C₆. Ein Beispiel für solche Kohlenhydrate, in denen sowohl Wasserstoff- als auch Kohlenstoffatome gegen die jeweiligen Isotope ausgetauscht sind, ist D-Glucose-¹³C₆-1,2,3,4,5,6,6-C-d₇. Im allgemeinen sind solche Kohlenhydrate bevorzugt, in denen mehrere oder alle normalen Isotope durch die schwereren ausgetauscht sind. Besonders bevorzugt sind solche Kohlenhydrate, die mehrere ¹³C-Atome aufweisen.
Dimere und höhere oligomere Kohlenhydrat-Gruppen Z sind aus den monomeren Kohlenhydrat-Gruppen zusammengesetzt, die untereinander beispielhaft und vorzugsweise über glycosidische Bindungen verknüpft sind.
Die Substituenten B sind kovalent an die Kohlenhydrat-Gruppen Z gebunden. Dabei soll die Bindung zwischen B und Z eine potentielle Spaltstelle in den Verbindungen der Formel (II) darstellen. Bevorzugte Substituenten B sind substituierte Benzylether oder substituierte Benzylidenacetale, die unter sauren oder alkalischen Bedingungen gespalten werden können. Die substituierten Benzylether-Funktionen sind bevorzugt mit den primären Kohlenstoffatomen der Kohlenhydrat-Gruppen Z verknüpft, beispielsweise mit dem Kohlenstoffatom C-6 von Hexosen. Die substituierten Benzylidenacetale stellen eine zweizähnige Verknüpfung der Substituenten B mit den Kohlenhydrat-Gruppen Z dar. Sie sind bevorzugt aufgebaut unter Einbeziehung der Hydroxygruppen an C-6 und C-4 der Kohlenhydrat-Gruppen Z.
Die in den jeweiligen Kombinationen oder bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Restedefinitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Restedefinitionen anderer Kombination ersetzt.
Ganz besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der oben genannten Vorzugsbereiche.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach prinzipiell bekannten chemischen Verfahren hergestellt werden.
In einer ersten Sequenz werden Konjugate A-B' hergestellt, wobei A für den Affinitätsliganden und B' für die substituierte Schutzgruppe B in einer zur Kopplung mit der Kohlenhydrat-Gruppe Z geeigneten Form steht (siehe Schema 1). Die Bindung zwischen A und B' kann beispielweise eine Esterbindung oder eine amidische Bindung sein. Esterbindungen können aus den zugrundeliegenden Carbonsäuren und alkoholischen oder phenolischen Gruppen in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln wie Carbodiimiden hergestellt werden. Esterbindungen können auch aus Carbonsäurechloriden und alkoholischen oder phenolischen Gruppen in Gegenwart von Basen wie Pyridin oder Triethylamin hergestellt werden. Amidische Bindungen zwischen A und B' können beispielweise aus Carbonsäurechloriden und Aminen hergestellt werden. Diese Reaktionstypen sind prinzipiell bekannt.
Schema 1: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel A1 und A3 (Tr = Trityl)
Die Bindung zwischen B und Z ist in den erfindungsgemäßen Verbindungen ist so gestaltet, dass sie selektiv in Gegenwart aller anderen Funktionalitäten gespalten werden kann. Bevorzugte Spaltungsmethoden sind solche, die unter sauren oder alkalischen Reaktionsbedingungen ablaufen. Geeignete Funktionalitäten sind Acetale, die unter sauren Bedingungen gespalten werden können. Geeignete Funktionalitäten sind aber auch para-substituierte Benzylether wie p-Alkoxybenzylether, die bekanntermaßen unter sauren Bedingungen gespalten werden können oder p-Acyloxybenzylether, die unter basischen Bedingungen gespalten werden können. Dieses Verfahren ist prinzipiell bei Jobron und Hindsgaul (J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 5835-5836) beschrieben.
Acetale kann man beispielsweise herstellen aus Aldehyden oder offenkettigen Acetalen wie beispielsweise Dimethylacetalen und Alkoholen unter leicht sauren Bedingungen. Ether werden bevorzugt hergestellt unter sauren Reaktionsbedingungen, unter denen die chemische Stabilität der Bindung zwischen A und B nicht beeinträchtigt wird. Geeignete Gruppen, die benzylische Hydroxygruppen aktivieren können, sind Trichloracetimidate, die aus Alkoholen und Trichloracetonitril unter basischen Bedingungen erhalten werden können.
In einer zweiten Sequenz zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden die Konjugate H-Z-E-PRG hergestellt (siehe Schema 2a und 2b). Die Kohlenhydrat-Gruppen Z können mit O-, N- oder C-glycosidischen Bindungen mit den Brücken E verknüpft sein. Die proteinreaktiven Gruppen können aber auch direkt ohne Verwendung von Brückenelementen E mit den anomeren Zentren der Kohlenhydrat-Gruppen verknüpft sein.
Schema 2a: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel B4, B5 und B9 (Pfp = Pentafluorphenyl)
Schema 2b: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel B10, B13 und B14 (Pfp = Pentafluorphenyl)
Die chemischen Verfahren zur Herstellung der Konjugate H-Z-E-PRG sind prinzipiell bekannt.
In einer dritten Sequenz werden die in den oben beschriebenen Sequenzen erhaltenen Konjugate A-B' und H-Z-E-PRG miteinander umgesetzt (siehe Schema 3). Acetalische und aldehydischen Funktionalitäten der Subfragmente A-B' können unter sauren Reaktionsbedingungen mit den Hydroxygruppen der Kohlenhydrat-Gruppen Z in den Subfragmenten H-Z-E-PRG zu den Verbindungen der Formel (I) umgesetzt werden. Etherbindungen zwischen A-B' und H-Z-E-PRG können aus benzylischen Trichloracetimidaten in A-B' und primären Hydroxygruppen der Kohlenhydrat- Gruppen Z in den Subfragmenten H-Z-E-PRG unter sauren Reaktionsbedingungen hergestellt werden. Die Reaktionsbedingungen sind prinzipiell aus der Kohlenhydratchemie bekannt.
Schema 3: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel D2-1 und D4-1
Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen durchgeführt werden, üblicherweise bei 0,5 bis 2 bar, bevorzugt unter Normaldruck, das heißt bei etwa 1 bar, und bei Temperaturen im Bereich zwischen –30°C und +100°C, vorzugsweise –10°C bis +80°C, insbesondere zwischen 0°C und +30°C. Die Durchführung erfolgt in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, C₁- bis C₄-Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel. In der Regel sind Reaktionen in DMF, Dichlormethan, THF, Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur (RT), das heißt etwa 20°C, oder unter Eiskühlung und Normaldruck bevorzugt.
Es wurde ferner gefunden, dass das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung der Konjugate A-L-PRG vorteilhaft auch verwendet werden kann, wenn in den Subfragmenten Z-E-PRG einzelne ¹²C-Atome durch ¹³C-Atome ausgetauscht sind. Nach den gleichen Verfahren, wie die nicht markierten Verbindungen H-Z-E-PRG und A-B-Z-E-PRG hergestellt wurden, können auch die analogen isotopenmarkierten Verbindungen hergestellt werden hergestellt werden. Die jeweiligen chemischen Schritte sind direkt auf die ¹³C-Bausteine übertragbar. Dies wird in Schema 4a, Schema 4b und Schema 5 anhand von ¹³C-markierten D-Glucose-Fragmenten beschrieben.
Schema 4a: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel C4-1, C5-1 und C9-1
Schema 4b: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel C10-1, C13-1 und C14-1 (Pfp = Pentafluorphenyl)
Schema 5: Syntheseschemata zur Herstellung von Verbindungen gemäß Beispiel D2-2 und D4-2
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend auch ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen der Formel (II), bei dem

i) Konjugate A-B' hergestellt werden, wobei B' für die substituierte Schutzgruppe B in einer zur Kopplung mit Hydroxygruppen der Kohlenhydrat-Gruppe Z geeigneten Form steht,
ii) vor, während oder nach Schritt i) Konjugate H-Z-E-PRG hergestellt werden und
iii) anschließend die erhaltenen Konjugate A-B' und H-Z-E-PRG miteinander umgesetzt werden,

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich als Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter erfindungsgemäßer Verbindungen als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, insbesondere zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben und zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
Die erfindungsgemäße Verwendung wird im folgenden beispielhaft angeführt, wobei eine Markierung von Thiolgruppen von Cysteinen in Proteinen mit den erfindungsgemäßen Affinitätsmarkern durchgeführt wird.
Eine zu untersuchende Proteinmischung wird in Puffer gelöst und durch Erhitzen denaturiert. Nach Reduktion der Cysteine mit Triscarboxyethylphosphin werden die freien Cysteine mit Affinitätsmarkern mit Spezifität für Thiole umgesetzt. Anschließend werden die markierten Proteine durch Trypsin gespalten und nach Verdünnung in PBS-Puffer auf Streptavidin-haltige Affinitätssäulen aufgetragen. Die Säule wird mit PBS-Puffer gewaschen.
Zur Elution wird die Säule mit Basen oder Säuren behandelt. Im Fall von acetalischen Affinitätsmarkern wird die Säule mit wässriger verdünnter Phosphorsäure gewaschen. Para-Alkoxybenzylether werden mit verdünnter Trifluoressigsäure gespalten. Para-acyloxybenzylether werden mit verdünnten Basen gespalten. Die Eluate werden neutralisiert, lyophilisiert und erst kurz vor der Analyse mit Massenspektrometrie gelöst.
Die Analyse der Peptide erfolgte mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer, das direkt mit einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie verbunden ist (LC-MS). Als Trennsäule wurde eine Reversed-Phase-Säule (C₁₈-Phase) verwendet. Die Peptide wurden in 0,025% (v/v) Trifluoressigsäure gelöst und injiziert. Sie wurden mit einem Gradienten von 0,025% (v/v) Trifluoressigsäure und 84% (v/v) Acetonitril eluiert. Die eluierenden Peptide wurden durch die Akquisitions-Software des Gerätes automatisch erkannt und für eine Identifizierung fragmentiert. damit konnte die Identität der Peptide eindeutig bestimmt werden.
Durch gemeinsame Prozessierung von zu vergleichenden Proteinen, die entweder mit den nicht markierten oder mit den markierten Affinitätsmarkern umgesetzt worden waren, waren Dubletten von Peaks zu erkennen, die sich in den Massendifferenzen der nicht-markierten und der markierten Affintätsmarker oder – im Falle von mehreren substituierten Aminosäuren – in Vielfachen davon unterschieden. Die Masse des Peptides und seine Fragmentierungen bestätigen, dass der Affinitätsmarker in der erwarteten Weise durch Säure oder Base gespalten wurde. Das Verhältnis der Massenpeaks der unmarkierten zur markierten Probe dient dabei als Maß zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus der jeweiligen Proteine.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Kit zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, enthaltend als Reagenzien eine oder mehrere unterschiedlich isotopenmarkierte erfindungsgemäße Verbindungen.
Beispiele
Verwendete Abkürzungen:

Pfp

– Pentafluorphenyl

Trityl

– Triphenylmethyl

Edukt-Serie A: Biotin-Derivate
Beispiel A1
Die Lösung von Biotin (0.37 g, 1.5 mmol), Diisopropylcarbodiimid (0.21 g, 1.7 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (0.01 g, 0.1 mmol) in DMF (4.0 ml) wird mit 4-Dimethoxymethyl-benzylalkohol (0.18 g, 1.0 mmol) versetzt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird i. Vak. eingeengt. Der Rückstand wird über säulenchromatographisch über Kieselgel gereinigt (Eluens Dichlormethan/Methanol/konz. Ammoniak = 25 : 1 : 0.1). Glasartiger Sirup. MS (ESI): m/z 431.2 (M+Na)⁺.
Beispiel A2
Die Mischung aus (3aS,4S,6aR)-Hexahydro-2-oxo-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-pentanoylchlorid (262 mg, 1.0 mmol), 4-Hydroxy-benzaldehyd (122 mg, 1.0 mmol) und 4-Dimethylamino-pyridin (5 mg) in Pyridin (5 ml) wird 16 h gerührt. Der Ansatz wird auf Eiswasser gegossen und 3-mal mit Dichlormethan gewaschen. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch über Kieselgel gereinigt. Sirup. MS (ESI): m/z 349.3 (M+H)⁺.
Beispiel A3
Die Lösung von 4-Hydroxy-benzylalkohol (0.124 g, 1.0 mmol) in Pyridin (3 ml) wird mit Tritylchlorid (33.5 mg, 1.2 mmol) versetzt. Nach 4 h wird (3aS,4S,6aR)-Hexahydro-2-oxo-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-pentanoylchlorid (262 mg, 1.0 mmol) zugesetzt und 16 h stehen gelassen. Der Ansatz wird auf Eiswasser gegossen und 3- mal mit Dichlormethan gewaschen. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluens Dichlormethan/Methanol = 20 : 1). Der erhaltene Tritylether wird mit einer Lösung von 5% Trifluoressigsäure und 5% Triisopropylsilan in Dichlormethan (5 ml) aufgenommen. Nach 16 h wird i. Vak. eingeengt und mehrfach mit Toluol coevaporiert. Der Rückstand wird in Dichlormethan (5 ml) und Tetrahydrofuran (2 ml) aufgenommen und mit 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (15 mg, 0.1 mmol) versetzt. Es wird Trichloracetonitril (144 mg, 1.0 mmol) zugegeben und 20 min gerührt. Der Ansatz wird eingeengt, der Rückstand wird durch Flashchromatographie (Eluens Hexan/Essigester = 3 : 1) gereinigt. Sirup. MS (ESI): m/z 495.5 (M+H)⁺.
Beispiel A4
Die Mischung aus (3aS,4S,6aR)-Hexahydro-2-oxo-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-pentanoylchlorid (262 mg, 1.0 mmol), 2,2-Dimethoxy-ethylamin (105 mg, 1.0 mmol) und Triethylamin (110 mg, 1.1 mmol) in abs. Methanol (5 ml) wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird eingeengt. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgenommen, 2 mal mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Einheitlicher Sirup. MS (ESI): m/z 332.3 (M+H)⁺, 300.3 (M-OCH₃ ^–)⁺.
Edukt Serie B: Kohlenhydrat-Derivate
Beispiel B1
2-Bromethyl-β-D-glucopyranosid wurde hergestellt wie von Davis et al. beschrieben, siehe Tetrahedron:Asymmetry, 2000,11, 245-262
Beispiel B2
Die Mischung von 2-Bromethyl-β-D-glucopyranosid [B1] (861 mg, 3.0 mmol) und Natriumazid (195 mg, 3.0 mmol) in DMF (20 ml) wird 20 h bei 100 °C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wird eingeengt, in Wasser (20 ml) aufgenommen und mit Ionenaustauscher vollentsalzt. Die Lösung wird gefriergetrocknet. MS (ESI): m/z 252.3 (M+H)⁺.
Beispiel B3
Die Lösung von 2-Azidoethyl-β-D-glucopyranosid [B2] (650 mg, 2.59 mmol) in Wasser (5 ml) und Methanol (10 ml) wird mit 1N Salzsäure (2.6 ml) und Palladium-Kohle 10% (100 mg) versetzt und 30 min in einer Wasserstoff-Atmosphäre bei Normaldruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltiert. Der Rückstand wird bis auf ein Restvolumen von 5 ml eingeengt, mit Wasser (30 ml) versetzt und gefriergetrocknet. MS (ESI): m/z 224.3 (M+H)⁺.
Beispiel B4
Die Verbindung aus Beispiel B3 (260 mg, 1.0 mmol) wird in DMF (20 ml) gelöst und mit Triethylamin (101 mg, 1.0 mmol) und Maleinsäureanhydrid (98 mg, 1.0 mmol) vesetzt. Die Mischung wird 16 h bei RT gerührt. Es werden 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (203 mg, 1.5 mmol), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid (230 mg, 1.2 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (220 mg, 1.7 mmol) zugegeben. Die Mischung wird 2 Tage bei RT gerührt, eingeengt und durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluens Acetonitril/Wasser = 10:1). MS (ESI): m/z 304.3 (M+H)⁺.
Beispiel B5
Die Lösung aus Beispiel B3 (260 mg, 1.0 mmol) wird in DMF (20 ml) gelöst, mit Triethylamin (101 mg, 1.0 mmol) und Acrylsäureethylester (200 mg, 2.0 mmol) versetzt und 16 h bei RT gerührt. Die Mischung wird eingeengt, in Wasser (20 ml) aufgenommen und gefriergetrocknet. MS (ESI): m/z 278.3 (M+H)⁺.
Beispiel B6
Die Lösung von 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranose (1.08 g, 2.0 mmol) in 1,4-Dioxan (20 ml) wird mit wässrigem Kaliumhydroxid (40%, 8 mg) versetzt. Die Lösung wird unter Eiskühlung tropfenweise mit einer Lösung von Acrylsäurenitril (106 mg, 2.0 mmol) in 1,4-Dioxan (2 ml) versetzt. Nach Erwärmen auf RT wird 16 h nachgerührt. Die Lösung wird auf ein Volumen von ca. 5 ml eingeengt und in Dichlormethan (50 ml) aufgenommen. Die Lösung wird zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol (25 ml) gelöst, mit Palladium-Kohle (10%, 100 mg) versetzt und unter einer Wasserstoff-Atmosphäre bei Normaldruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und gewaschen, Der Rückstand wird in Wasser (50 ml) aufgenommen und gefriergetrocknet. MS (ESI): m/z 234.3 (M+H)⁺.
Beispiel B7
Die Lösung von 2-Cyanoethyl-β-D-glucopyranosid [B6] (400 mg, 1.72 mmol) in Methanol (10 ml) und konzentrierter wässriger Ammoniak-Lösung (5 ml) wird mit Raney-Nickel (0.2 g) versetzt und 5 h bei 100 °C und 100 bar Wasserstoff hydriert. nach Abkühlen auf RT wird der katalysator abgesaugt. Das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird dreimal in Ethanol aufgenommen und eingeengt. MS (ESI): m/z 238.3 (M+H)⁺.
Beispiel B8
Die Verbindung aus Beispiel B7 (237 mg, 1.0 mmol) wird in DMF (20 ml) gelöst und mit Triethylamin (101 mg, 1.0 mmol) und Maleinsäureanhydrid (98 mg, 1.0 mmol) vesetzt. Die Mischung wird 16 h bei RT gerührt. Es werden 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (203 mg, 1.5 mmol), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid (230 mg, 1.2 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (220 mg, 1.7 mmol) zugegeben. Die Mischung wird 2 Tage bei RT gerührt, eingeengt und durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluens Acetonitril/Wasser = 10:1). MS (ESI): m/z 318.3 (M+H)⁺.
Beispiel B9
Die Lösung der Verbindung aus Beispiel B3 (26 mg, 0.1 mmol) in wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (3%, 5 ml) wird mit einer Lösung von Thiophosgen (35 mg, 3.0 mmol) in Dichlormethan (1 ml) versetzt und intensiv gerührt. Nach 1 h werden die Phasen mittels Zentrifugation getrennt. Die wässrige Phase wird zweimal mit Dichlormethan (jeweils 1 ml) gewaschen, mit Wasser (5 ml) verdünnt und mit Ionenaustauscher entsalzt. Die Lösung wird gefriergetrocknet. MS (ESI): m/z 266.4 (M+H)⁺.
Beispiel B10
Die Lösung von β-D-Glucopyranosylamin (179 mg, 1.0 mmol) in DMF (2 ml) wird bei 0 °C mit Chloressigsäureanhydrid (205 mg, 1.2 mmol) versetzt und auf RT erwärmt. Nach 6 h wird das Produkt durch Zugabe von kaltem Diethylether gefällt, abgesaugt und getrocknet. MS (ESI): m/z 256.3 (M+H)⁺.
Beispiel B11
Die Lösung von β-D-Glucopyranosylamin (179 mg, 1.0 mmol) in DMF (2 ml) wird bei 0 °C mit Bromessigsäureanhydrid (312 mg, 1.2 mmol) versetzt und auf RT erwärmt. Nach 6 h wird das Produkt durch Zugabe von kaltem Diethylether gefällt, abgesaugt und getrocknet. MS (ESI): m/z 300.3 und 302.3 (M+H)⁺.
Beispiel B12
Die Lösung von β-D-Glucopyranosylamin (179 mg, 1.0 mmol) in DMF (2 ml) wird bei 0 °C mit Iodessigsäureanhydrid (425 mg, 1.2 mmol) versetzt und auf RT erwärmt. Nach 6 h wird das Produkt durch Zugabe von kaltem Diethylether gefällt, abgesaugt und getrocknet. MS (ESI): m/z 348.3 (M+H)⁺.
Beispiel B13
Die Verbindung B13 wird hergestellt wie von Shin et al. beschrieben (Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1325).
Beispiel B14
Die Verbindung B14 wird hergestellt wie von Shin et al. beschrieben (Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1325).
Beispiel B15
Die Lösung von 2,6-Anhydro-1-azido-3,4,5,7-tetra-O-benzyl-1-desoxy-D-glycero-D-guloheptitol (Herstellung nach O. Lockhoff, EP 832898 , Bayer AG, 1998) (580 mg, 1.0 mmol) in Methanol (20 ml) und Eisessig (1 ml) wird in Gegenwart von Palladium-Kohle (10%, 100 mg) unter einer Wasserstoff-Atmosphäre bei Normaldruck hydriert. Der Katalysator wird abgesaugt und mit Methanol nachgewaschen. Die vereinigten flüssigen Phasen werden eingedampft und zweimal mit Ethanol coevaporiert. Der Rückstand wird in DMF (20 ml) gelöst und mit Triethylamin (101 mg, 1.0 mmol) und Maleinsäureanhydrid (98 mg, 1.0 mmol) vesetzt. Die Mischung wird 16 h bei RT gerührt. Es werden 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (203 mg, 1.5 mmol), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid (230 mg, 1.2 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (220 mg, 1.7 mmol) zugegeben. Die Mischung wird 2 Tage bei RT gerührt, eingeengt und durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluens Acetonitril/Wasser = 10:1). MS (ESI): m/z 274.3 (M+H)⁺.
Edukt-Serie C: ¹³C-markierte Kohlenhydrat-Derivate
Beispiel C1-1
Zu der Lösung von 1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-β-D-glucopyranose-¹³C₆ [213020-65-6] (3.54 g, 8.93 mmol) und 2-Bromethanol (2.23 g, 17.9 mmol) in abs. Dichlormethan (50 ml) wird bei 0°C Bortrifluorid-Diethylether-Komplex (1.8 ml) gegeben. Die Mischung wird 30 min bei 0°C, 30 min bei 20°C und 1 h bei 50°C gerührt. Der Ansatz wird auf Eiswasser gegeben, die organische Phase wird mit wässriger gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Kristallisation aus Dichlormethan/Diethylether/Hexan. Kristalle. MS (ESI): m/z 483.1, 485.1 (M + Na)⁺, 337.2 (M – O₂CCH₃)⁺; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 4.57 (1H, dd, J_1,2= 7.8 Hz, J_H,C= 160,8 Hz, H-1); ¹³C-NMR (100.6 MHz, CDCl₃): δ = 101.40 (d, J_1,2 = 48.3 Hz, C-1).
Beispiel C1-2
Die Lösung von (2-Bromethyl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid-¹³C₆ (0.53 g, 1.15 mmol) in abs. Methanol (10 ml) wird mit 1 N Natriummethanolat (0.03 ml) versetzt. Nach 1 h wird mit Ionenaustauscher Amberlite IR 120 (H⁺-Form) neutralisiert und eingeengt. Sirup. LC-MS (ESI): m/z 315.0, 317.0 (M + Na)⁺; ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ = 4.35 (1H, dd, J_1,2 = 7.7 Hz, J_H,C = 159.0 Hz, H-1); ¹³C-NMR (100.6 MHz, CD₃OD): δ = 104.54 (d, J_1,2 = 46.9 Hz, C-1).
Beispiel C1-3
Herstellung analog zu Beispiel C1-1 aus 1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-β-D-glucopyranose-¹³C₆[213020-65-6] und 2-Bromethanol-¹³C₂.
Beispiel C1-4
Herstellung analog zu Beispiel C1-2 aus C1-3.
Beispiel C2-1
Herstellung aus C1-2 und NaN₃ analog Beispiel B2
Beispiel C2-2
Herstellung aus C1-4 und NaN₃ analog Beispiel B2.
Beispiel C3-1
Herstellung aus C2-1 analog Beispiel B3.
Beispiel C3-2
Herstellung aus C2-2 analog Beispiel B3.
Beispiel C4-1
Herstellung aus C3-1 und Maleinsäureanhydrid analog Beispiel B4.
Beispiel C4-2
Herstellung aus C3-2 und Maleinsäureanhydrid analog Beispiel B4.
Beispiel C4-3
Herstellung aus C3-2 und Maleinsäure-2,3-¹³C₂-anhydrid analog Beispiel B4.
Beispiel C5-1
Herstellung aus C3-1 und Acrylsäureethylester analog Beispiel B5.
Beispiel C5-2
Herstellung aus C3-2 und Acrylsäureethylester analog Beispiel B5.
Beispiel C6-1
Herstellung aus 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose-¹³C₆ und Acrylnitril analog Beispiel B6.
Beispiel C6-2
Herstellung aus 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose-¹³C₆ und Acrylnitril-¹³C analog Beispiel B6.
Beispiel C7-1
Herstellung aus C6-1 analog Beispiel B7.
Beispiel C7-2
Herstellung aus C6-2 analog Beispiel B7.
Beispiel C8-1
Herstellung aus C7-1 und Maleinsäureanhydrid analog Beispiel B8.
Beispiel C8-2
Herstellung aus C7-2 und Maleinsäureanhydrid analog Beispiel B8.
Beispiel C8-3
Herstellung aus C7-2 und Maleinsäureanhydrid-2,3-¹³C₂ analog Beispiel B8.
Beispiel C9-1
Herstellung aus C3-1 und Thiophosgen analog Beispiel B9.
Beispiel C9-2
Herstellung aus C3-2 und Thiophosgen analog Beispiel B9.
Beispiel C10-1
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und Chloressigsäureanhydrid analog Beispiel B10.
Beispiel C10-2
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und Chloressigsäureanhydrid-¹³C₄ analog Beispiel B10.
Beispiel C11-1
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und Bromessigsäureanhydrid analog Beispiel B11.
Beispiel C11-2
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und Bromessigsäureanhydrid-¹³C₄ analog Beispiel B11.
Beispiel C12-1
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und Iodessigsäureanhydrid analog Beispiel B12.
Beispiel C12-2
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und Iodessigsäureanhydrid-¹³C₄ analog Beispiel B12.
Beispiel C13-1
Herstellung aus D-Glucose-¹³C₆ und Maleinsäureanhydrid analog Beispiel B13.
Beispiel C14-1
Herstellung aus β-D-Glucopyranosylamin-¹³C₆ und 2,5-Dihydro-2,5-dioxo-1H-pyrrol-1-essigsäure-pentafluorphenylester analog Beispiel B14.
Beispiel C15-1
Herstellung aus D-Glucose-13C6 analog Beispiel B15.
Beispiel C15-2
Herstellung aus D-Glucose-¹³C₆ und Maleinsäure-2,3-¹³C₂-anhydrid analog Beispiel B15.
Ausführungsbeispiele
Beispiel D1-1
Die Lösung der Verbindungen A1 (40.9 mg, 0.1 mmol) und B1 (28.7 mg, 0.1 mmol) in Dioxan (4.0 ml) wird in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure-Monohydrate (1.0 mg, 0.05 mmol) langsam azeotrop abdestilliert, wobei durch Zugabe von abs. Dioxan das Lösungsmittelvolumen konstant gehalten wird. Der Fortgang der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt (Eluens Toluol-Ethanol = 10:1). Nach Beendigung der Reaktion wird auf RT abgekühlt, mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel 60, Dichlormethan-Methanol = 30:1). MS (ESI): m/z 632.4 (M+H)⁺.
Beispiel D1-2
Herstellung aus A1 und C1-2 analog Beispiel D1-1
Beispiel D1-3
Herstellung aus A1 und C1-4 analog Beispiel D1-1
Beispiel D2-1
Herstellung aus A1 und B4 analog Beispiel D1-1
Beispiel D2-2
Herstellung aus A1 und C4-1 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D2-3
Herstellung aus A1 und C4-2 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D2-4
Herstellung aus A1 und C4-3 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D3-1
Die Mischung aus A2 (34.8 mg, 0.1 mmol) und B5 (27.7 mg, 0.1 mmol) in DMF (3 ml) wird mit p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat versetzt und 4 h auf 100 °C erwärmt. Nach Abkühlen auf RT wird mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatogaphie gereinigt (Kieselgel 60, Dichlormethan-Methanol = 30:1). MS (ESI): m/z 608.3 (M+H)⁺.
Beispiel D3-2
Herstellung aus A2 und C5-1 analog Beispiel D3-1.
Beispiel D3-3
Herstellung aus A2 und C5-2 analog Beispiel D3-1.
Beispiel D4-1
Zu der Lösung von B8 (31.7 mg, 0.1 mmol) und A3 (49.5 mg, 0.1 mmol) in DMF (3 ml) wird bei –20 °C eine Lösung von Trifluormethansulfonsäure in Dichlormethan (5%, 0.1 ml) gegeben. Nach 2 h wird langsam auf RT erwärmt und 16 h nachgerührt. Die Mischung wird mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel 60, Dichlormethan – Methanol = 20 : 1). MS (ESI): m/z 650.3 (M+H)⁺.
Beispiel D4-2
Herstellung aus A3 und C8-1 analog Beispiel D4-1.
Beispiel D4-3
Herstellung aus A3 und C8-2 analog Beispiel D4-1.
Beispiel D4-4
Herstellung aus A3 und C8-3 analog Beispiel D4-1.
Beispiel D5-1
Herstellung aus A1 und B9 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D5-2
Herstellung aus A1 und C9-1 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D5-3
Herstellung aus A1 und C9-2 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D6-1
Die Lösung der Verbindungen A4 (33 mg, 0.1 mmol) und B10 (25.6 mg, 0.1 mmol) in Dioxan (4.0 ml) wird in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure-Monohydrate (1.0 mg, 0.05 mmol) langsam azeotrop abdestilliert, wobei durch Zugabe von abs. Dioxan das Lösungsmittelvolumen konstant gehalten wird. Der Fortgang der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt (Eluens Dichlormethan – Methanol = 10:1). Nach Beendigung der Reaktion wird auf RT abgekühlt, mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel 60, Dichlormethan-Methanol = 50:1). MS (ESI): m/z 524.4 (M+H)⁺.
Beispiel D6-2
Herstellung aus A4 und C10-1 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D6-3
Herstellung aus A4 und C10-2 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D7-1
Herstellung aus A4 und B11 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D7-2
Herstellung aus A4 und C11-1 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D7-3
Herstellung aus A4 und C11-2 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D8-1
Herstellung aus A4 und B12 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D8-2
Herstellung aus A4 und C12-1 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D8-3
Herstellung aus A4 und C12-2 analog Beispiel D6-1.
Beispiel D9-1
Herstellung aus A1 und B13 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D9-2
Herstellung aus A1 und C13-1 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D9-3
Herstellung aus A1 und C13-2 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D10-1
Herstellung aus A1 und B14 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D10-2
Herstellung aus A1 und C14-1 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D11-1
Herstellung aus A1 und B15 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D11-2
Herstellung aus A1 und C15-1 analog Beispiel D1-1.
Beispiel D11-3
Herstellung aus A1 und C15-2 analog Beispiel D1-1.

Claims

Verbindung der Formel A-L-PRG (I),in der A für einen Affinitätsliganden-Rest, PRG für eine proteinreaktive Gruppe und L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker L mindestens eine Kohlenhydrat-Gruppe enthält.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Formel A-B-Z-E-PRG (II)entspricht, in der A für einen Affinitätsliganden-Rest steht, B für eine substituierte Schutzgruppe eines Kohlenhydrates mit bis zu 25 Nichtwasserstoff-Atomen steht, die über die Stelle ihrer Substitution direkt oder über eine Alkyleneinheit oder eine monomere oder oligomere Oxaalkyleneinheit eine kovalente Bindung zum Affinitätsliganden ausbildet, Z für eine monomere oder oligomere Kohlenhydrat-Gruppe oder deren Desoxy-Derivat steht, E für eine kovalente Brücke oder Bindung zwischen Z und PRG steht und PRG für eine proteinreaktive Gruppe steht.
Verbindung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass A für einen Affinitätsliganden-Rest steht, B für -NR¹-(CH₂)_m-R², -O-(CH₂)_n-R², -O-C₆H₄-CH₂-, -O-C₆H₄-CH₂-R² oder -O-CH₂-C₆H₄-R² steht, wobei R¹ für Wasserstoff, C₁_₃-Alkyl oder C_1-7-Acyl steht, R² für CH steht, wobei das Kohlenstoffatom an acetalisch an zwei Sauerstoffatome von Hydroxygruppen von Z gebunden ist, Z für eine Desoxy-Derivat einer Hexose-Gruppe aus der Reihe Glucose, Mannose oder Galactose steht, bei dem ein oder zwei Wasserstoffatome der primären oder sekundären Hydroxygruppen ersetzt sind durch ein Fragment B, E für ^@-O-(CH₂)_p- , ^@-NH-CO-(CH₂)_q-, ^@-(CH₂)_r- steht, deren mit gekennzeichneter Terminus an ein Desoxy-Kohlenstoffatom von Z gebunden ist, oder für eine direkte Bindung zwischen einem Desoxy-Kohlenstoffatom von Z und PRG steht, PRG für proteinreaktive Gruppe steht und m, n, p, q, r unabhängig voneinander jeweils für eine der Zahlen 0, 1, 2, 3, 4 und 5 stehen.
Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem oder mehreren, gleichen oder verschiedenen Isotopen markiert ist.
Verbindung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Z, E und/oder PRG isotopenmarkiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem i) Konjugate A-B' hergestellt werden, wobei B' für die substituierte Schutzgruppe B in einer zur Kopplung mit Hydroxygruppen der Kohlenhydrat-Gruppe Z geeigneten Form steht, ii) vor, während oder nach Schritt i) Konjugate H-Z-E-PRG hergestellt werden und iii) anschließend die erhaltenen Konjugate A-B' und H-Z-E-PRG miteinander umgesetzt werden, wobei A, B, Z, E und PRG die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) haben.
Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen.
Verwendung gemäß dem vorstehenden Anspruch zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
Verwendung gemäß einem der beiden vorstehenden Ansprüche zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
Kit zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, enthaltend als Reagenzien eine oder mehrere unterschiedlich isotopenmarkierte Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.