DE102005051977A1

DE102005051977A1 - Neue 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate und deren Verwendung in diagnostischen und analytischen Nachweisverfahren

Info

Publication number: DE102005051977A1
Application number: DE102005051977A
Authority: DE
Inventors: Steffen Dr.rer.nat. Bade; Niels Dr.rer.nat. Röckendorf; Hans-Heiner Dr.rer.nat. Gorris; Andreas Dr.-Ing. Frey
Original assignee: Forschungszentrum Borstel Zentrum fuer Medizin und Biowissenschaften
Current assignee: Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2007-05-10
Also published as: WO2007051604A2; WO2007051604A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate zur Kopplung an Trägermoleküle und Festphasen. Die Verbindungen lassen sich unter anderem zur Markierung von Biomolekülen in bioanalytischen Anwendungen verwenden. Ein Teil der hier beschriebenen Verbindungen ermöglicht Markierungen ohne in situ Aktivierung und unter physiologischen Bedingungen. Außerdem erleichtert das Vorhandensein von Abstandshaltern innerhalb der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate die Bindung durch Antikörper. Die Derivate können löslichkeitsvermittelnde Gruppen enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate zur Kopplung an Trägermoleküle und Festphasen. Die Verbindungen lassen sich unter anderem zur Markierung von Biomolekülen in bioanalytischen Anwendungen verwenden. Ein Teil der hier beschriebenen Verbindungen ermöglicht Markierungen ohne in situ Aktivierung und unter physiologischen Bedingungen. Außerdem erleichtert das Vorhandensein von Abstandhaltern innerhalb der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate die Bindung durch Antikörper.
Die Derivate können löslichkeitsvermittelnde Gruppen enthalten.

Hintergrund der Erfindung:

Im Rahmen moderner analytischer und diagnostischer Verfahren hat die Markierung von Trägermolekülen eine zentrale Bedeutung. Markierungen können z.B. dazu dienen, Trägermoleküle im Verlauf analytischer Verfahren mit Hilfe spezifischer Liganden abzutrennen, nachzuweisen oder zu quantifizieren. Es existieren verschiedene Verfahren, um derartige Markierungen durchzuführen, z.B. mittels Biotin oder mit Hilfe des sogenannten Strep-Tags (Skerra A, Schmidt TG (1999). Applications of a peptide ligand for streptavidin: the Strep-tag. Biomol Eng. 16:79-86) oder auch mittels Digoxigenin. Wegen der großen praktischen Bedeutung der Markierung von Trägermolekülen und des Bedarfs für den Einsatz mehrerer verschiedener Markierungen im Verlauf analytischer Verfahren ist es notwendig, weitere zur Markierung geeignete Moleküle zu entwickeln.

Gegenüber dem Stand der Technik stellt sich daher die Aufgabe neue Verbindungen zur Markierung von Träger- bzw. Substratmolekülen, wie z.B. Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nukleotiden, Nukleinsäuren, Lipiden oder Sacchariden, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel (I)

die in Wasser stabil und löslich sind, wobei der Spacer 1 bis 25 gleiche oder verschiedene geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Saccharide, Polyole oder aus der folgenden Gruppe ausgewählte Reste umfasst:

wobei X -O- oder -S- ist und n eine ganze Zahl im Bereich zwischen 1 und 10 ist,
wobei RG aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

wobei R jeweils gleiche oder verschiedene Reste aus der folgenden Gruppe sind:
Wasserstoff, linearer, verzweigter oder cyclischer Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, linearer oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, geschütztes oder ungeschütztes Amin,
ausgenommen die folgenden Verbindungen (n = 1-10):

Als Aminosäuren kommen alle natürlichen Aminosäuren in Frage, vorzugsweise Alanin, beta-Alanin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin, Citrullin, Cystein, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Homoserin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Sarcosin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, und Valin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D-Konfigurationen, sowie auch nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, wie z.B. Phenylglycin, Penizillamin, Norvalin, Norleucin, Alpha-Aminobuttersäure, Diaminopropionsäure, Cyclohexylalanin, Butylglycin, Aminoisobuttersäure, Thienylalanin, Statin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D-Konfigurationen, sowie Amino-Oligoethylenglycol-Carbonsäuren oder Amino-Oligopropylenglycol-Carbonsäuren.

Unter geschützten Aminosäuren werden Aminosäuren verstanden, die eine Schutzgruppe tragen, wie z.B. S-Acetamidomethyl- (Acm), t-Butyloxycarbonyl- (Boc), t-Butyl- (tBu), Trityl- (Trt), 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl- (Pbf), Tosyl- (Ts), Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc), (1,1,-dioxobenzo[b]thiophene-2-yl-methyl)oxycarbonyl (Bsmoc), Benzyloxycarbonyl (CBz) oder beta-2-Adamantyl (Ada). Ungeschützte Aminosäuren sind demnach Aminosäuren, die eine solche Schutzgruppe nicht tragen.

Bei den Nukleosiden kann es sich um Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in syn- oder anti-Konfiguration, sowie um ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (Nukleotide) oder Derivate davon handeln, wie z.B. zyklische Formen, wie 3'-5'-zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP), oder ihre Deoxy- oder Dideoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie 6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5-Iod-2'-deoxyuridin, 6- Thioguanin, Azothymidin oder Dideoxyinosin und ihre Mono-, Di- oder Triphosphate (synthetische Nukleotid-Analoga).

Saccharide innerhalb des Spacers können erfindungsgemäß aus einer linearen oder verzweigten Kette aus 1 bis 10 gleichen oder verschiedenen Monosacchariden bestehen, z.B. aus Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Arabinose, N-Acetylglucosamin oder Fructose Untereinheiten, oder aus 1 bis 5 gleichen oder verschiedenen Disaccharidbausteinen wie Cellobiose, Lactose, Chitobiose, Lactosamin aufgebaut sein, die vorzugsweise, aber nicht zwangsläufig, beta-1,4-glycosidisch verknüpft sind oder aus Kombinationen oder Derivaten der genannten Strukturen bestehen. Außerdem kann der Spacer aus O-glycosylierten Serin, Threonin oder N-glycosylierten Asparagin- und/oder Glutaminsäure Untereinheiten aufgebaut sein oder diese enthalten. Der Spacer kann darüber hinaus aus linearen oder verzweigten Polyolen mit 3 bis 15 Hydroxylgruppen aufgebaut sein, die ganz oder teilweise mit den oben genannten Spacer-Komponenten, wie z.B. Saccharid- oder Polyolstrukturen, verknüpft sein können.

Unter 'linearer oder verzweigter Alkylrest' wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel C_nH_2n+1 verstanden. Es handelt sich insbesondere um Reste mit 1, 2, 3, 4, 5, ... 14 oder 15 Kohlenstoffatomen. Explizit eingeschlossen sind die Reste Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, und mit Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppen substituierte Heptyl, Octyl, Nonyl- oder Decyl-Reste, wie z.B. 6,7,8,9,10-Pentamethyldecyl oder 8-Methyl-9,10-diethyldecyl.

Nicht einschränkende Beispiele für ein erfindungsgemäßes lineares oder verzweigtes Alkenyl sind Kohlenwasserstoffreste mit 2, 3, 4, 5, ..., 14 oder 15 Kohlenstoffatomen sowie einer oder ggf. mehreren cis oder trans konfigurierten C-C-Doppelbindungen. Explizit eingeschlossen sind Propenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 1,3-Hexadienyl, 1,5-hexadienyl, Alkenylreste mit konjugierten C-C-Doppelbindungen, wie z.B. 1,3,5,7,9-Decapentenyl.

Bei den oben genannten Alkoxyresten handelt es sich um lineare oder verzweigte Alkylreste der obigen Definition, die über ein Sauerstoffatom an die in den obigen Formeln gezeigten C- oder N-Atome gebunden sind.

Das oben genannte Amin kann eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe sein, also -NH₂, NHR' oder NR'₂, wobei R' ein Alkylrest der obigen Definition sein kann.

Bevorzugte Verbindungen haben die Formel (II)

bei der Z1 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten

mit n1 = 1-15,
wobei Z2 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten

mit n2 = 1-15,
wobei M⁺ ein einwertiges, anorganisches oder organisches Kation ist,
wobei PG eine Amino-Schutzgruppe ist.

Gemäß der vorstehenden Definition kann n2 eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 15 sein, also 1, 2, 3, 4, ... 14 oder 15. Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit n1 = 5 oder n1 = 10 und/oder n2 = 5 oder n2 = 10,

Bei dem Kation handelt es sich insbesondere um Lithium, Kalium, Ammonium, Rubidium, Cäsium, vorzugsweise Natrium oder Tetraalkylammonium (insbesondere Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Tetrapropylammonium, Tetrabutylammonium, Tetrapentylammonium oder Tetrahexylammonium) handelt.

Die Amino-Schutzgruppe ist beispielsweise (1,1-Dioxobenzo[b]thiophen-2-yl-methyl)oxycarbonyl (Bsmoc), vorzugsweise t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (CBz) und insbesondere Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc).

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden Verbindungen der Formel (III) bereitgestellt:

mit n = 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.

Der Rest R ist vorzugsweise Wasserstoff (-H), Succinimidyl, Sulfo-succinimidyl, Hydrazyl oder Fmoc-Lysinyl.

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Derivate der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), die hierin auch als „2,4-D-Derivate" bezeichnet werden. Die Substanz 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure sowie Ester- oder Amid- oder andere Derivate und Salze davon wurden ursprünglich als Herbizide entwickelt und genutzt. Konjugate, bei denen die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure kovalent an nieder- oder hochmolekulare Träger gebunden vorliegt, werden für eine Vielzahl von bioanalytischen Zwecken verwendet. Hauptsächlich werden derartige Derivate in kompetitiven Immunoassays eingesetzt, die der toxikologischen Analytik des Herbizides im Trinkwasser, in Nahrungsmitteln oder in Körperflüssigkeiten dienen sollen (vgl. z. B.: Kroger S, Setford SJ, Turner AP (1998). Immunosensor for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in aqueous/organic solvent soil extracts. Anal Chem. 70:5047-5053; Bier FF, Kleinjung F, Ehrentreich-Forster E, Scheller FW (1999). Changing functionality of surfaces by directed self-assembly using oligonucleotides-the Oligo-Tag. Biotechniques. 27:752-756; Halamek J, Hepel M, Skladal P (2001). Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Biosens Bioelectron. 16:253-260). In den beschriebenen Tests wird 2,4-D nach gängigen Methoden direkt in situ über die Carboxylfunktion kovalent an Trägermoleküle gebunden und in Kompetition mit freier 2,4-D durch spezifische Antikörper (vgl. Franek M, Kolar V, Granatova M, Nevorankova Z (1994). Monoclonal ELISA for 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid: Characterization of antibodies and assay optimization. J Agric Food Chem. 42:1369-1374; Franek M, Brichta J (2003). Identification of Monoclonal Antibodies against 2,4-D Herbicide by ELISA and DNA Sequencing. J Agric Food Chem. 51:6091-6097.) nachgewiesen. Die dazu erforderlichen Antikörper wurden durch Immunisierung von Versuchstieren mit 2,4-D-Protein- oder 2,9-D-Poly-L-Lysinkonjugaten gewonnen (vgl. z.B. Franek M (1989). CS 87 071 09 A1 , Immunogenes for production of antibodies against polychlorinated biphenyls and method of their preparation; Schecklies E (1995). DE 19 529 250 C1 , Preparation of hapten-carrier conjugates containing polyaminoacids as carriers.).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich sehr gut an Trägermoleküle, Festphasen und Substratmoleküle binden, die nachfolgend auch einfach als „Träger" oder „Substrate" be zeichnet werden. Dabei sind Träger(moleküle) und Substrate lösliche und Festphasen unlösliche Stoffe, an die die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate über die Einheit „RG" gekoppelt werden können. Substratmoleküle sind z.B. Makromoleküle (makromolekulare Substratmoleküle), wie biogene Makromoleküle, wobei Makromoleküle chemische Verbindungen mit einer molekularen Masse von mindestens 500 g/mol sind. Biogene Makromoleküle sind chemische Verbindungen, deren Strukturen Verbindungen entsprechen, die aus metabolischen Prozessen resultieren oder daran beteiligt sind. Biogene Makromoleküle, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind, müssen jedoch nicht zwangsläufig das Ergebnis metabolischer Vorgänge sein, sondern können anderen Quellen entstammen.

Die Begriffe "löslich" und "unlöslich" beziehen sich auf wässrige und/oder organische Flüssigkeiten. Vorzugsweise ist die Verbindung zwischen den Substraten und den Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine kovalente Bindung, jedoch können andere Verknüpfungen ebenso geeignet sein und sind somit ausdrücklich eingeschlossen.

Im Sinne der Erfindung bedeutet "in Wasser stabil", dass die entsprechende Verbindung in flüssigen Medien, die einen Wasseranteil von mindestens 80% besitzen, bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 9 und einer Temperatur von 0°C innerhalb von wenigen Minuten, vorzugsweise innerhalb von 5 Minuten, zu weniger als 50 % zerfällt, bzw. dass die entsprechende Verbindung in flüssigen Medien, die einen Wasseranteil von mindestens 80 % besitzen, bei einem pH-Wert von 7 und bei 4°C innerhalb von 1 Stunde zu weniger als 50 % zerfällt.

„In Wasser löslich" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass 100 μMol der erfindungsgemäßen 2,4-Dichlorphenoxyacetatderivate in 1 1 eines flüssigen Mediums mit einem Wasseranteil von mindestens 80 % bei 25°C aufgelöst werden können.

Die 2,4-Dichlorphenoxyacetyl-Gruppe stellt ein Hapten dar. Dabei bezeichnet der Begriff Hapten ein kleines organisches Molekül, das einen spezifischen Bindungspartner für einen gegen dieses Hapten gerichteten Antikörper darstellt. Hierbei besteht die Möglichkeit, dass bei der Bindung eines Antikörpers an die an ein Trägermolekül gebundene 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure angrenzende Regionen des Trägermoleküls die Bindung stören können. Andererseits könnte der Antikörper aber auch Strukturelemente des bei seiner Entwicklung verwendeten Hapten-Trägerproteinkonjugates, insbesondere die Struktur der Verknüpfung zwischen Hapten und Trägermolekül, zusammen mit dem Hapten erkennen und daher ein solches Trägermolekül für eine hochaffine Bindung benötigen. Die hier beanspruchten Verbindungen enthalten Spacer, um störende Effekte zu verringern und/oder um Strukturelemente der Hapten-Trägerproteinverknüpfung zu imitieren. In den erfindungsgemäßen Verbindungen liegen die Spacer in Form aliphatischer Kohlenstoffketten vor, so dass eine Steigerung der Affinität der Bindung zwischen Antikörper und Hapten erreicht werden kann. Die Affinität der Bindung zwischen 2,4-Dichlorphenoxyacetyl-Gruppe und Antikörper wird insbesonderedurch einen direkt an die Carboxylatfunktion der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure gebundenen, unverzweigten aliphatischen Spacer um ein Mehrfaches erhöht. Die erfindungsgemäßen 2,4-Dichlorphenoxyacetatderivate schließen vorzugsweise lineare Alkyl-Spacer entsprechend der Formel III ein, bei denen n eine ganze Zahl im Bereich von 1- 15 ist. Der Vorteil von Aminohexansäure (n=5) oder 11-Aminoundecansäure (n=10) umfassenden Spacern in einem ELISA ist beispielhaft in 2 gezeigt. In den erfindungsgemäßen Verbindungen können löslichkeitsvermittelnde Gruppen im Spacer oder der Gruppe (RG) aus Formel (I) enthalten sein. Diese Gruppen können aus Ladungsträgern oder Oligoethylenglycol-Substrukturen bestehen. Löslichkeitsvermittelnde Saccharid-Substrukturen innerhalb des Spacers können erfindungsgemäß aus einer linearen oder verzweigten Kette aus 1 bis 10 gleichen oder verschiedenen Monosacchariden bestehen, z.B. aus Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Arabinose, N-Acetylglucosamin oder Fructose Untereinheiten, oder aus 1 bis 5 gleichen oder verschiedenen Disaccharidbausteinen wie Cellobiose, Lactose, Chitobiose, Lactosamin aufgebaut sein, die vorzugsweise aber nicht zwangsläufig beta-1,4-glycosidisch verknüpft sind oder aus Kombinationen oder Derivaten der genannten Strukturen bestehen. Außerdem kann der Spacer aus O-glycosylierten Serin, Threonin oder N-glycosylierten Asparagin- und/oder Glutaminsäure Untereinheiten aufgebaut sein oder diese enthalten. Der Spacer kann darüber hinaus aus linearen oder verzweigten Polyolen mit 3 bis 15 Hydroxylgruppen aufgebaut sein, die ganz oder teilweise mit den oben genannten Spacer-Komponenten, wie z.B. Saccharid- oder Polyolstrukturen, verknüpft sein können. Die im Spacer enthaltenen Saccharid-Substrukturen können einerseits mit 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure oder einer Alkylspacer enthaltenden Variante der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, andererseits mit den für Struktur (I) definierten reaktiven Gruppen (RG) substituiert sein. „Löslichkeitsvermittelnd" im Sinne der Erfindung bedeutet eine Steigerung der Löslichkeit der beanspruchten Verbindungen in flüssigen Medien mit einem Wasseranteil von mindestens 80%.

Ladungsträger können beispielsweise die folgenden Elemente und chemischen Strukturen sein: Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Phosphatgruppen als negative Ladungsträger sowie Ammonium- oder Guanidylgruppen als positive Ladungsträger die sich als Substituenten am Spacer oder der Gruppe (RG) der generischen Formel (I) befinden.

Unter Oligoethylenglycol-Substrukturen werden erfindungsgemäß folgende Strukturen verstanden: verzweigte oder unverzweigte, an einem oder mehreren Enden substituierte Ethylenglycol-Homopolymere oder Propylenglycol-Homopolymere, sowie gemischte Ethylenglycol-/Propylenglycol-Copolymere mit durchschnittlichen Molekulargewichten zwischen 100 und 5000 g/mol. Explizit eingeschlossen sind die Strukturelemente 1-Ethoxy-2-ethoxyethyl, 1-Ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)ethyl, 1-ethoxy-2-[2-(2-ethoxyethoxy)ethoxy]ethyl und deren höhere Homologe, die einerseits mit 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure oder einer Alkylspacer-enthaltenden Variante der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, andererseits mit den für Struktur (I) definierten reaktiven Gruppen (RG) substituiert sind.

Die Kopplung der hier beanspruchten Verbindungen an Träger ermöglicht ihre Verwendung als Markierung. Die Verknüpfung zwischen Träger und 2,4-Dichlorphenoxy-Derivat wird erfindungsgemäß durch die Gruppe RG vermittelt. Einige Gruppen RG können ohne weitere Aktivierung an Träger gekoppelt werden, bei anderen ist eine Aktivierung in situ notwendig. Carboxylate müssen in wässrigen Lösungen beispielsweise durch die Zugabe von Aktivierungsreagenzien wie N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDAC) aktiviert werden, um für eine Kopplung an Träger zur Verfügung zu stehen. Aminreaktive Aktivester wie Succinimidyl- oder Sulfosuccinimidylester reagieren direkt mit aminofunktionalisierten Trägern. Ähnliches gilt für Pentafluorphenylester sowie für Aldehyde, Aziridine und Epoxide. Aldehydreaktive Reagenzien wie Hydrazide werden nicht in situ aktiviert, ebenso bedürfen Sulfhydryl-reaktive Reagenzien wie Maleinimide, Vinylsulfone oder Pyridyldithiole in der Regel keiner in situ Aktivierung.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Kopplung an Trägermoleküle oder Festphasen. Erfindungsgemäß eingeschlossen ist auch die Verwendung der folgenden Verbindungen 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure und 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure

zur Kopplung an Trägermoleküle oder Festphasen.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure und 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure zur Kopplung an Substratmoleküle, insbesondere an Aminosäure(n), verzweigte oder unverzweigte Oligopeptide, Polypeptide, Proteine, Nukleinbasen, Oligonukleoside, Polynukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Glykoproteine oder Lipide. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Aminosäuren, Polypeptide mit 2 bis 25 Aminosäuren, Proteine mit einer Masse von mehr als 5 kDa, Nukleinbasen, Nukleotide oder Nukleoside, sowie Derivate davon, wie z.B. ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate oder zyklische Formen, Polynukleotide mit 2-75 Nukleotiden, Saccharide oder Polysaccharide aus 2 bis 25 Monosacchariden.

Saccharide mit 1 bis 25 Monosaccharideinheiten können aus folgenden Aldosen und Ketosen aufgebaut sein: D-Erythrose, D-Threose, D-Ribose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Lyxose, D-Allose, D-Altrose, D-Glucose, D-Mannose, D-Gulose, D-Idose, D-Galactose, D-Talose und D-Tetrulose, D-Ribulose, D-Xylulose, D-Psicose, D-Fructose, D-Sorbose, D-Tagatose sowie außerdem aus D-Glucosamin, N-Acetyl-D-Glucosamin (GlcNAc), D-Galactosamin, N-Acetyl-D-Galactosamin (GalNAc), D-Mannosamin, N-Acetyl-D-Mannosamin (ManNAc), L-Daunosamin, N-Acetyl-Daunosamin, L-Fucose, L-Rhamnose, D-Quinovose, D-Olivose, D-Digitoxose, D-Cymarose, D-Glucuronsäure, D-Mannuronsäure, D-Galacturonsäure, L-Iduronsäure, 2-Desoxy-D-Ribose, N-Acetyl-Muraminsäure (MurAc), 5-N-Acetyl-Neuraminsäure (Neu5Ac) und 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulopyranosonsäure (Kdo).

Nukleinbasen können Purin- oder Pyrimidinbasen, wie z.B. Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Uracil, Hypoxanthin oder Xanthin und Derivate davon sein.

Bei den Nukleosiden kann es sich um Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in syn- oder anti-Konfiguration, sowie um ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (Nukleotide) oder Derivate davon handeln, wie z.B. zyklische Formen, wie 3'-5'-zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP), oder ihre Deoxy- oder -Dideoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie 6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5-Iod-2'-deoxyuridin, 6-Thioguanin, Azothymidin oder Dideoxyinosin oder ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (synthetische Nukleotid-Analoga).

Bei Lipiden kann es sich um entweder zyklische, azyklische oder polyzyklische Verbindungen bestehend aus gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren (z.B. Buttersäure, Dodecansäure, oder Alpha-Linolensäure) handeln, oder um Triglyzeride, Wachse, oder membranbildende Lipide, wie z.B. Phospholipide, Glycerophospholipide, Glycolipide oder Sphingolipide (z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Diphosphatidylglycerol, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Sphingomyelin, Cerebroside, Ganglioside, Ceramide oder Sulfatide), oder um Terpenoide, wie z.B. Steroide, Retinoide oder Carotinoide (z.B. Cholesterol, Phytosterol, Ergosterol, Vitamin D, Digitalis, Strophantin, Testosteron oder Progesteron).

Erfindungsgemäß bevorzugte Festphasen sind beispielsweise funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen- oder Glasoberflächen, bevorzugterweise Amino-, Thiol-, Aldehyd- oder Epoxydfunktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen oder Glasoberflächen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich außerdem auf Trägermoleküle und/oder Festphasen, an die eine oder mehrere der er findungsgemäßen Verbindungen gekoppelt ist bzw. auf die erfindungsgemäßen Verbindungen, an die die genannten Trägermoleküle und/oder Festphasen gekoppelt sind. Bei der Kopplung handelt es sich vorzugsweise um eine chemische Bindung, wobei eine physikalische Bindung jedoch nicht ausgeschlossen ist.

Erfindungsgemäß werden diese Trägermoleküle, an die die erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt sind, für diagnostische oder analytische Assays verwendet. Erfindungsgemäß werden die Festphasen, an die die erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt sind, in analytischen Assays zum Nachweis und in präparativen Ansätzen zur Reinigung von anti-2,4-Dichlorphenoxyacetyl-Antikörpern oder -Antikörperfragmenten verwendet.

Dabei bezeichnet der Begriff „Assay" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein qualitatives oder quantitatives Nachweis-, Mess- oder Untersuchungsverfahren zum Nachweis oder zur Messung von Molekülen (Analyten). Insbesondere werden hierunter immunologische Assays, festphasengestützte diagnostische Anwendungen, enzymgekoppelte Immunosorbent Assays, Hybridisierungsassays, Polymerasekettenreaktionen und biologische Markierungs- und Aufnahmeexperimente verstanden.

Dabei bezeichnet der Begriff „immunologischer Assay" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung einen Assay, bei dem Antikörper als Liganden zur Bindung oder zum Nachweis eines Analyten eingesetzt werden. Diese immunologischen Assays schließen insbesondere enzymgekoppelte Immunosorbent Assays und Hybridisierungsassays ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Der Begriff „Hybridisierungsassay" schließt Assays ein, bei denen mit erfindungsgemäßen 2,4-D-Derivaten markierte Sonden in biologischen Standard-Assays verwendet werden, wie z.B. Polymerasekettenreaktionen, Genexpressionsanalysen und Blot-Analysen.

Dabei bezeichnet der Begriff „festphasengestützte diagnostische Anwendung" ein diagnostisches Verfahren, das sich einer festen Phase bedient, auf der für einen Analyten spezifische Fängermoleküle immobilisiert sind. Der Analyt wird selektiv aus der Probensubstanz auf der festen Phase zurückgehalten, ungebundene Komponenten werden durch Waschen der Festphase entfernt, und der Analyt wird anschließend mit markierten Sonden nachgewiesen.

Analyte sind dabei die bei der Analyse zu bestimmenden Komponenten. Analyte können dabei Moleküle sein, wie z.B. in dieser Erfindung definierte Substrat- oder Trägermoleküle, aber auch Aminosäuren, lineare oder verzweigte Oligopeptide, Polypeptide, Proteine, Nukleinbasen, Oligonukleoside, Polynukleotide, Nukleotide, Oligonukleotide, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide oder Lipide. Vorzugsweise umfassen die Oligo- und Polypeptide 2 bis 25 Aminosäuren, die Polynukleotide 2 bis 75 Nukleotide und die Polysaccharide 2 bis 25 Monosaccharide oder Lipide. Die Analyten können dabei optional mit zusätzlichen Markermolekülen, wie z.B. Biotin, Enzyme oder chromogene Substanzen bzw. Farbstoffen ausgestattet sein, die den Nachweis des Analyten über dem Fachmann bekannte Nachweisreaktionen ermöglichen.

Dabei bezeichnet der Begriff „biologisches Markierungsexperiment" ein Experiment, bei dem ein Trägermolekül, an welches eine der erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt ist, zur Markierung von biologischen Proben verwendet wird. Solche biologische Proben können beispielsweise Mikroorganismen, Gewebe, Körperflüssigkeiten, lebende Zellen, Plasmamembranen und intrazelluläre Membranen, künstliche Membranen und Liposomen, Zellkerne, Organellen und subzelluläre Strukturen, Rezeptoren und extrazelluläre Matrix-Komponenten einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein.

Dabei bezeichnet der Begriff „biologisches Aufnahmeexperiment" ein Experiment, bei dem einem Versuchstier in vivo ein Trägermolekül, an welches eine der erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt ist, beispielsweise durch Verfüttern oder durch Injektion verabreicht wird, wobei der Verbleib des Trägermoleküls in unterschiedlichen Zell- und/oder Gewebetypen nach Tötung des Tieres mit Hilfe des Nachweises der Diphenoxyessigsäuremarkierung untersucht wird. Alternativ zu einem in vivo Experiment kann ein entsprechendes markiertes Trägermolekül auf ein Gewebeexplantat oder auf kultivierte Zellen aufgebracht und nach entsprechender Inkubation der Verbleib des Trägermoleküls in unterschiedlichen Zelltypen oder subzellulären Kompartimenten analysiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung und zur Identifizierung und Charakterisierung von Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten gegen 2,4-Dichlorphenoxyacetyl-Verbindungen. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Zwecke der Gewinnung polyklonaler oder monokonaler Antikörper sowie zur Herstellung von "single chain" variablen Antikörperfragmenten (scFv) und Antigen-bindenden Antikörperfragmenten (Fab) eingesetzt. Monoklonale Antikörper werden dabei bevorzugt von Hybridomen produziert, die nach der Methode von Franek et al. (Franek M, Kolar V, Granatova M, Nevorankova Z (1994). Monoclonal ELISA for 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid: Characterization of Antibodies and Assay Optimization. J Agric Food Chem. 42:1369-1374.) erhältlich sind. Antigen-bindende Antikörper-Fragmente, wie monovalentes Fab und divalentes (Fab)₂ sind von diesen monoclonalen anti-2,4-D-Antikörpern durch dem Fachmann bekannte Methoden ableitbar.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und Figuren beschrieben, wobei es sich um bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren handelt, die die Erfindung jedoch nicht einschränken.

Beschreibung der Figuren:

1: Reaktionsschema. Überblick über die in den Beispielen beschriebene Synthese einiger erfindungsgemäßer 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate.

2: 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate in der Peptidsynthese und ihr Nachweis im Immunoverfahren (ELISA). Ein 15mer Peptid aus Ovalbumin(NH₂-(I)-GSIGAASMEFCFDCFCOOH, oder NH₂-GSIGAAS-(II)-MEFCFDCFCOOH, oder NH₂-GSIGAASMEFCFDCF-(III)-COOH) wurde im SPOT-Maßstab auf einer Zellulosemembran synthetisiert. Epsilon-amino 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivat-markierte Lysine (Verbindungen (2c), (4b), (4d)) mit unterschiedlichen Abstandhaltern (-, C6 und C11) wurden amino- (I) oder carboxyterminal (III) aufgebracht oder innerhalb der 15mer Sequenz (II) eingefügt. Zum Nachweis im Immunoverfahren wurden terminal markierte Peptide am jeweils gegenüber liegenden Ende und in der Sequenz markierte Peptide carboxyterminal mit Biotin versehen. Nach Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen wurden die Peptide von der Zellulosemembran abgelöst, gefriergetrocknet und in physiologischer Salzlösung aufgenommen. Seriell verdünnte markierte Peptide wurden auf mit monoklonalem anti-2,4-D-Antikörper (Klon E2/G2) beschichteten und mit Casein abgesättigten Mikrotitrationsplatten gebunden. Der Nachweis der gebundenen Peptide erfolgte mit Meerrettichperoxidase gekoppeltem Streptavidin gefolgt von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxid. Nach Anpassung einer 4-Parameterkurve an die Messwerte als Maß für das Bindungsverhalten der jeweiligen Peptide die maximale optische Dichte (OD) bei 450 nm und der EC₅₀-Wert der Verdünnungsreihe bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. * = signifikant höhere OD als nach Markierung an Position I, II, III- oder IIIC6 (P<0, 05; One-way ANOVA, Bonferroni Post hoc test).

3: Reversible Markierung von Peptiden mit 2-(2-(2,4-dichlorophenoxy)-1-hydroxyethyliden)-5,5-dimethylcyclohexan-1,3-dion (2,4-D-Dimedon). Ein 15mer Peptid aus Ovalbumin (NH₂-GSIGAASMEFCFDCF-COOH) wurde im SPOT-Maßstab auf einer Zellulosemembran synthetisiert und nachfolgend aminoterminal mit 2,4-D-Dimedon derivatisiert. Nach Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen wurde die Membran mit 1 % (w/v) Casein in Phosphatpuffer (D-PBS) geblockt. Der Nachweis der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivat-Markierung erfolgte mit biotinyliertem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2) und AlexaFluor680 markiertem Streptavidin. Die Fluoreszenzsignale wurden wie beschrieben quantifiziert. Anschließend wurde das 2,4-D-Dimedon durch Einwirken von 5 % (v/v) Hydrazinhydrat in D-PBS abgespalten und die Fluoreszenzsignale nach 5, 20, 60 und 100 min Hydrazinexposition erneut bestimmt.

Die Beispiele 1 bis 7 erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Beispiele 8 bis 11 ihre Anwendung als Markierung. Das in 1 gezeigte Reaktionsschema gibt einen Überblick über die in den Beispielen beschriebene Synthese der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 zur Synthese von Alkylaminosäurederivaten von (1b)
Die entsprechende Alkylaminosäure wurde bei 37 °C in einer äquimolaren Menge Tetrabutylammoniumhydroxidlösung (25 % (w/v) in Wasser) gelöst. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der ölige Rückstand über Phosphorpentoxid (P₂O₅) getrocknet. 0,05 Mol der erhaltenen Alkylaminosäuresalze wurden mit 0,05 Mol der Verbindung (1b) in 200 ml absolutem Dioxan gelöst, 0,07 Mol Triethylamin wurden zugesetzt und der Ansatz anschließend über Nacht bei RT gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und der Rückstand in 40 ml ammoniakalischem Wasser gelöst (resultierender pH: 10). Die Emulsion wurde zu 250 ml 10 (w/v) Zitronensäure in Wasser gegeben (resultierender pH: 5). Es bildete sich ein weißer Niederschlag. Dieser wurde abfiltriert und mit 50 ml 10 % (w/v) Zitronensäure und 40 ml Wasser gewaschen. Die Rohausbeute wurde bestimmt und das Produkt in Dioxan gelöst. Mit einem Überschuss an Kationenaustauscherharz (Amberlite IR-120) wurde unter vorsichtigem Schwenken 30 Minuten bei RT entsalzt. Der Überstand wurde abgenommen und das Lösemittel eingeengt. Der Rückstand wurde am Ölpumpenvakuum getrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 zur Synthese von Succinimidylestern der Derivate (2a) und (2b)
1 mMol des entsprechenden Carbonsäurederivates der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurde in 20 ml absolutem Dioxan gelöst. 1,1 mMol Pyridin wurden zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Zusatz eines zweifachen Überschusses an Di-(N-succinimidyl)-carbonat (DSC) initiiert und der Ansatz anschließend 48 Stunden bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml eiskaltem Wasser suspendiert und nachfolgend 60 Minuten bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen, am Ölpumpenvakuum getrocknet und trocken gelagert.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 zur Synthese von Sulfosuccinimidylestern der Verbindungen (2a) und (2b)
1 mMol des entsprechenden Carbonsäurederivates der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurde in 3 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Eine äquimolare Menge N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz und 1,15 mMol N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Kiese1gel60; Laufmittel Essigsäureethylester >95 %). Nachdem 30 Minuten auf Eis weitergerührt wurde, wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde in vacuo eingeengt und der Rückstand in 25 ml eiskaltem Ethanol suspendiert. Es wurde 40 Minuten bei RT gerührt, das Produkt abfiltriert und mit wenig Ethanol gewaschen. Das Produkt wurde am Ölpumpenvakuum getrocknet und trocken gelagert.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 zur Synthese von N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin-derivaten der Verbindungen (1b), (3a) und (3c)
0,3 mMol des entsprechenden aktivierten Carbonsäurederivates der 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden äquimolar mit N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. 0,36 mMol Triethylamin wurden hinzugefügt und der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Laufmittel: Cyclohexan:Aceton (1:1), 1 % Trifluoressigsäure). Die Rohprodukte wurden isoliert und anschließend säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Laufmittel: Cyclohexan:Aceton (1:1), 1 % Trifluoressigsäure) gereinigt. Produktfraktionen wurden isoliert, das Lösungsmittel entfernt und die gereinigten Produkte trocken gelagert.
Beispiel 1
Herstellung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-N-Hydroxysuccinimidyl-Ester (1b)
0,08 Mol 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (17,6 g) und 0,08 Mol N-Hydroxysuccinimid (9,2 g) gelöst in 180 ml absolutem Dioxan wurden durch Zusatz einer äquimolaren Menge an N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,08 Mol; 16,5 g) zur Reaktion gebracht. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und nach Waschen mit wenig absolutem Dioxan verworfen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und eingeengt. Der Rückstand wurde mit 60 ml Methanol:Ethanol (1:1) und anschließend mit Diethylether gewaschen, abfiltriert und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Das Produkt wurde trocken gelagert. Die Ausbeute betrug 73 % (R_f (Kieselgel/Ethylacetat) = 0.86).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.86 (s, 4H), 5.02 (s, 2H), 6.91 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.40 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 25.6, 64.5, 115.5, 124.6, 127.8, 128.1, 130.5, 151.8, 164.0, 168.5
Beispiel 2
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure (2a)
0,05 Mol (18,67 g) 6-Aminohexansäure-tetrabutylammoniumsalz wurden mit 0,05 Mol (15,05 g) (1b) in 200 ml absolutem Dioxan und 0,07 Mol (10 ml) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt. Die Rohausbeute wurde bestimmt (90 %) und die Verbindung aus Toluol rekristallisiert (Reinheit (RP-HPLC, Jupiter C18) >98 %).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.41 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 2.36 (t, 2H), 3.38 (q, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.84 (d, 1H), 7.23 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.2, 26.2, 29.1, 33.7, 38.9, 68.3, 114.7, 123.7, 127.5, 128.1, 130.2, 151.6, 167.3, 178.4 MS-ESI m/z: 332, 045 [M] (berechnet für C₁₄Cl₂H₁₇NO₄ = 333, 053 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure (2b)
0,05 Mol (22,17 g) 11-Aminoundecansäure-tetrabutylammoniumsalz wurden mit 0,05 Mol der Verbindung (1b) (6,34 g) in 200 ml absolutem Dioxan und 0,07 Mol (10 ml) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt. Die Rohausbeute wurde bestimmt (81 %) und die Verbindung mit Toluol:Aceton (1:1) als Laufmittel säulenchromatographisch (Kieselgel 60) gereinigt (Reinheit (RP-HPLC, Jupiter C18) >98 %).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.31 (m, 12H), 1.56 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 2.34 (t, 2H), 3.36 (q, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.84 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.7, 26.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 33.9, 39.1, 68.3, 114.7, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 167.2, 178.8
MS-ESI m/z: 403,129 [M] (berechnet für C₁₉Cl₂H₂₇NO₄ = 403,132 g/mol)
Beispiel 3
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure-N-hydroxysuccinimid (3a)
1 mMol (0,33 g) 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetyl)aminohexansäure wurde mit 2 mMol Di-(N-succinimidyl)-carbonat (DSC) (0,51 g) in 20 ml absolutem Dioxan und 1,1 mMol (82 μl) Pyridin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 2 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 90%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.48 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 2.62 (t, 2H), 2.81 (s, 4H), 3.39 (q, 2H), 4.51 (s, 2H), 6. 85 (d, 1H), 7.24 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.2, 25.6, 25.9, 28.9, 30.8, 38.8, 68.3, 114.7, 123.8, 127.4, 128.0, 130.2, 151.7, 167.1, 168.4, 169.1
MS-ESI m/z: 430, 063 [M] (berechnet für C₁₈Cl₂H₂₀N₂O₆ = 430, 070 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure-N-hydroxysuccinimid (3c)
1 mMol (0,40 g) 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure wurde mit 2 mMol Di-(N-succinimidyl)-carbonat (DSC) (0, 51 g) in 20 ml absolutem Dioxan und 1, 1 mMol (82 μl) Pyridin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 2 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 90%.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.29 (m, 10H), 1.40 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.83 (s, 4H), 3.36 (q, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.84 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.5, 25.6, 26.8, 28.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 30.9, 39.1, 68.3, 114.6, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 167.0, 168.6, 169.1
MS-ESI m/z: 500, 142 [M] (berechnet für C₂₃Cl₂H₃₀N₂O₆ = 500, 148 g/mol)
Beispiel 4
Herstellung von 2-(2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure-hydrazid (1a)
50 mMol (11 g) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden in 25fachem molarem Überschuss an Thionylchlorid (90 ml) unter zweistündigem Refluxieren zum Säurechlorid umgesetzt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde abdestilliert. Das 2,4-Dichlorphenoxyacetylchlorid wurde in 50 ml absolutem Dioxan aufgenommen und äquimolar mit Hydrazin-Monohydrat über Nacht bei RT umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde eingeengt. Die Ausbeute betrug >90 %.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO/CDCl₃ (1:1)) δ 4.60 (d, 2H), 7.01 (d, 1H), 7.23 (dd, 1H), 7.39 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO/CDCl₃ (1:1)) δ 66.2, 113.8, 121.9, 124.7, 126.3, 128.1, 151.0, 165.0
MS-ESI m/z: 234, 005 [M] (berechnet für C₈Cl₂H₈N₂O₂ = 233,996 g/mol)
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure-hydrazid (4a)
0,5 mMol (215 mg) der Verbindung (3a) wurden in 10 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren zu einer Hydrazin-Monohydratlösung (5 mMol in 60 ml Dioxan) getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT weiter gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wurde 10 Minuten in 30 ml kaltem Wasser gerührt, der sich bildende Niederschlag wurde abfiltriert und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 66 %.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.36 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 2.24, 2.55 (t, 2H), 3.35 (m, 2H), 4.51 (d, 2H), 6.86 (m, 1H), 7.21 (m, 1H), 7.38, 7.41 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.7, 24.9, 26.0, 26.2, 29.0, 29.1, 33.9, 38.8, 67.1, 68.3, 114.7, 114.9, 123.7, 127.4, 128.1, 130.1, 130.2, 151.6, 167.5, 173.3
MS-ESI m/z: 347,079 [M] (berechnet für C₁₄Cl₂H₁₉N₃O₃ = 347,080 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure-hydrazid (4c)
0,5 mMol (250 mg) der Verbindung (3c) wurden in 10 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren zu einer Hydrazin-Monohydratlösung (5 mMol in 60 ml Dioxan) getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, der Niederschlag mit eiskaltem Wasser gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 90 %.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.24 (m, 12H), 1.43 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 2.01, 2,20 (t, 2H), 3.13 (q, 2H), 4.61 (s, 2H), 7.06 (d, 1H), 7.37 (dd, 1H), 7.60 (d, 1H).
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 24.4, 25.1, 26.2, 28.4, 28.5, 28.6, 28.7, 28.8, 28.9, 33.3, 33.6, 38.1, 38.2, 66.2, 67.9, 115.3, 122.4, 125.0, 127.9, 129.2, 152.4, 166.4, 166.5, 171.5
MS-ESI m/z : 417, 156 [M] (berechnet für C₁₉Cl₂H₂₉N₃O₃ = 417,159 g/mol)
Beispiel 5
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexansäure-N-hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (3b)
1 mMol (333 mg) der Verbindung (2a) wurde mit 1 mMol (218 mg) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz in 3 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) durch Zusatz von 1,15 mMol (237 mg) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 53 %.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.39 (m, 2H), 1.46 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 2.64 (t, 2H), 2,86 (dd, 1H), 3.12 (q, 2H), 3.16 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 4.60 (s, 2H), 7.04 (d, 1H), 7.36 (dd, 1H), 7.58 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO) δ 23.8, 25.2, 28.3, 30.0, 30.8, 37.8, 38.0, 56.2, 67.8, 115.3, 122.5, 124.9, 127.9, 129.2, 152.5, 165.3, 166.5, 166.6, 168.7
MS-ESI m/z: 509,017 [M] (berechnet für C₁₈Cl₂H₁₉N₂O₉S = 509, 019 g/mol)
Herstellung von 11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecansäure-N-hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (3d)
1 mMol (404 mg) der Verbindung (2b) wurde mit 1 mMol (218 mg) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz in 3 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) durch Zusatz von 1,15 mMol (237 mg) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 76 %.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.24 (m, 10H), 1.34 (m, 2H), 1.41 (m, 2H), 1.61 (m, 2H), 2.63 (t, 2H), 2.85 (dd, 1H), 3.11 (q, 2H), 3.15 (m, 1H), 3.93 (m, 1H), 4.60 (s, 2H), 7.04 (d, 1H), 7.35 (dd, 1H), 7. 58 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO) δ 24.2, 26.2, 27.9, 28.4, 28.6, 28.7, 28.8, 30.1, 30.8, 38.1, 56.2, 67.8, 115.3, 122.4, 124.9, 127.9, 129.2, 152.4, 165.2, 166.4, 166.5, 168.7
MS-ESI m/z: 579,096 [M] (berechnet für C₂₃Cl₂H₂₉N₂O₉S = 579,097 g/mol)
Beispiel 6
Herstellung von 6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)-2-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)hexansäure (2c)
0,3 mMol (100 mg) der Verbindung (1b) wurden zusammen mit 0, 3 mMol (110 mg) N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 76 %.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.35 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 3.12 (q, 2H), 3.91 (m, 1H), 4.25 (m, 3H), 4.58 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 7.36 (m, 4H), 7.66 (m, 2H), 7.88 (m, 5H), 7.95 (m, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 22.9; 28.4, 30.3, 38.1, 46.6, 53.6, 65.5, 67.8, 115.3, 120.0, 122.5, 125.0, 125.1, 125.2, 126.9, 127.5, 127.9, 128.5, 129.2, 131.4, 140.6, 143.7, 152.4, 156.1, 166.5, 166.8, 172.6, 173.8
MS-ESI m/z: 570,131 [M] (berechnet für C₂₉Cl₂H₂₈N₂O₆ = 570,132 g/mol)
Herstellung von 6-(6-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)hexanoylamino)-2-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)hexansäure (4b)
0,3 mMol (130 mg) der Verbindung (3a) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 72 %.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.40 (m, 8H), 1.65 (m, 2H), 2.03 (m, 4H), 3.11 (m, 4H), 3.89 (m, 1H), 4.23 (m, 3H), 4.59 (s, 2H), 7.05 (d, 1H), 7.32 (m, 3H), 7.41 (t, 2H), 7.53 (d, 1H), 7.75 (d, 2H), 7.85 (d, 2H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 23.1, 25.0, 26.0, 28.7, 28.8, 29.5, 30.5, 35.3, 35.7, 38.2, 38.3, 46.7, 53.8, 65.6, 67.9, 113.0, 115.4, 120.0, 122.6, 125.1, 125.2, 125.3, 127.0, 127.6, 128.0, 129.3, 140.7, 143.8, 152.5, 156.2, 162.3, 166.6, 171.9, 173.9
MS-ESI m/z: 683,202 [M] (berechnet für C₃₅Cl₂H₃₉N₃O₇ = 683,217 g/mol)
Herstellung von 6-(11-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)acetylamino)undecanoylamino)-2-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)hexansäure(4d)
0,3 mMol (150 mg) der Verbindung (3c) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin in 6 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 61 %.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.18 (m, 12H), 1.41 (m, 8H), 1.62 (m, 2H), 2.02 (t, 2H), 3.02 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.87 (m, 1H), 4.26 (m, 3H), 4.58 (s, 2H), 7.05 (d, 1H), 7.32 (m, 3H), 7.41 (t, 2H), 7.58 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.87 (d, 2H)
¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ23.1, 25.2, 25.3, 26.3, 28.7, 28.8, 28.9, 29.0, 30.4, 30.7, 35.4, 35.5, 38.0, 38.1, 38.3, 46.7, 53.8, 65.6, 68.0, 115.4, 120.1, 122.6, 125.1, 125.3, 125.3, 127.1, 127.6, 128.0, 140.7, 143.8, 143.9, 152.5, 156.2, 157.9, 158.2, 166.5, 166.6, 171.9, 172.0, 172.7, 173.9
MS-ESI m/z : 753, 301 [M] (berechnet für C₄₀Cl₂H₄₉N₃O₇ = 753,295 g/mol)
Beispiel 7
Herstellung von 2-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)-1-hydroxyethyliden)-5,5-dimethylcyclohexan-1,3-dion (1c)
15 mMol (3,3 g) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden in 150 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. 16,5 mMol (2,3 g) 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion (Dimedon), 15 mMol (3,1 g) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 15 mMol (1,8 g) 4-Dimethylaminopyridin wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde 48 Stunden bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Der Syntheserückstand wurde mit 50 ml Essigsäureethylester extrahiert und filtriert. Das Filtrat wurde mit 1 M Kaliumhydrogensulfat- und anschließend mit 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand mit Di ethylether gewaschen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 19 % (Smp. 170-175°C, R_f (Kieselgel, Essigsäureethylester) = 0.8). Erneutes Extrahieren des Syntheserückstandes mit Essigsäureethylester erhöhte die Ausbeute um 5-10 %.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 0.95 (s, 6H), 2.11 (s, 4H), 5.06 (s, 2H), 6.69 (d, 1H), 7.24 (d, 1H), 7.47 (d, 1H)
¹³C-NMR (300 MHz, DMSO) δ 28.2, 29.8, 52.7, 74.2, 112.4, 114.9, 121.6, 123.2, 127.6, 128.7, 153.6, 189.3, 194.2
MS-ESI m/z: 341, 035 [M] (berechnet für C₁₆Cl₂H₁₅O₄ = 341, 035 g/mol)
Beispiel 8
Markierung mit 2,4-Dichlorphenoxy-Aktivesterderivaten und ihr Nachweis
Ovalbumin (Merck Biosciences, Bad Soden, DE), wurde in einer Konzentration von 135 mg/ml (3 mM) in 100 mM Natriumtetraboratpuffer pH 8,2 gelöst, portioniert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Zur Markierungsreaktion wurden 100 nMol Ovalbumin aus der Stammlösung vorgelegt und soviel Natriumtetraboratpuffer zugesetzt, dass sich nach Zugabe der Aktivesterlösung ein Endvolumen von 300 μl ergab. Schließlich wurde die Markierungsreaktion durch Zugabe von 1,5 μMol einer frisch bereiteten Lösung (65-100 mg/ml; 120-330 mM) des jeweiligen Aktivesters (s. Tabelle 1) in Dimethylsulfoxid (DMSO) gestartet. Der Volumenanteil an Dimethylsulfoxid (DMSO) im Reaktionsansatz war dabei <5 % (v/v).
Der Reaktionsansatz wurde bei RT durch Invertieren gemischt, bevor nach einer Reaktionszeit von 180 min die Umsetzung durch Zugabe von 200 μl (1,5 mMol) Glycin in Natriumtetraboratpuffer gestoppt wurde. Der Reaktionsansatz wurde in dieser Form über Nacht bei 4°C weiter über Kopf geschwenkt und anschließend gegen Natriumtetraboratpuffer dialysiert. Die Konzentration des dialysierten, markierten Proteins wurde nach Standardverfahren bestimmt. Das markierte Protein wurde seriell in Natriumtetraboratpuffer verdünnt, und in geometrisch absteigender Menge auf Nitrocellulose (4,8 × 3 cm, 0,2 μm Porengröße, Schleicher & Schuell, Dassel, DE) immobilisiert (16000-3,12 pg/Dot bzw. 16000-3,12 ng/Dot). Die Membran wurde luftgetrocknet und trocken bei –20°C gelagert.
Vor Gebrauch wurde die eingelagerte Membran aufgetaut, dreimal mit D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gewaschen und für 30 min bei RT mit 1 % (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS (Blocking-Lösung) abgesättigt.
Die derart geblockte Membran wurde unter Schwenken für 90 min bei RT mit 4 ml (0,28 ml/cm² Membran) einer Erstantikörperlösung aus monoklonalem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2; 1 μg/ml) in Blocking-Lösung inkubiert. Erneut wurde dreimal mit D-PBS gewaschen und die Membran wurde 90 min bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm² Membran) Zweitantikörperlösung (Ziege anti-Maus AlexaFluor680 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); 2 μg/ml in Blocking-Lösung) inkubiert. Nach weiterem ausgiebigem Waschen der Membran in D-PBS wurden die Nachweisgrenzen für die Markierung mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) und eines ent sprechenden Bildauswerteprogramms (Odyssey-Software V1.2, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) bestimmt. Die Rohdaten wurden mit Hilfe eines Statistikprogramms (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ausgewertet. Eine Übersicht der Nachweisgrenzen ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 1: Verwendete Markierungs-Aktivester
Beispiel 9
Markierung mit 2,4-Dichlorphenoxy-Hydrazidderivaten und ihr Nachweis
Das Glykoprotein Mucin aus Schweinemagen (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, DE), wurde in D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gelöst, seriell in D-PBS verdünnt, und in geometrisch absteigender Menge auf Nitrocellulose (4,8 × 3 cm, 0,2 μm Porengröße, Schleicher & Schuell, Dassel, DE) immobilisiert (2000-1 pg/Dot). Die Membran wurde luftgetrocknet und trocken bei –20°C gelagert.
Vor Gebrauch wurde die eingelagerte Membran dreimal mit D-PBS gewaschen. Anschließend wurden die vicinalen Diole in den Zuckerresten des Mucins mit Periodat oxidiert. Dazu wurde die Membran 20 min bei RT mit 10 mM Natrium-m-Periodat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, DE) in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) behandelt. Anschließend wurde dreimal mit D-PBS gewaschen, bevor die Membran mit 2,5 nMol/ml Markierungs-Hydrazid (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-(2,4-D)-derivate (s. Tabelle 2)) in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) für 60 min bei RT inkubiert wurde. Erneut wurde dreimal mit D-PBS gewaschen und die Membran für 30 min bei RT mit 1 % (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS abgesättigt.
Die derart geblockte Membran wurde unter Schwenken für 90 min bei RT mit 4 ml (0,28 ml/cm² Membran) einer Erstantikörperlösung aus monoklonalem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2; 1 μg/ml) in Blocking-Lösung inkubiert. Erneut wurde dreimal mit D-PBS gewaschen und die Membran wurde 90 min bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm² Membran) Zweitantikörperlösung (Ziege anti-Maus AlexaFluor680 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); 2 μg/ml in Blocking-Lösung) inkubiert. Nach weiterem ausgiebigem Waschen der Membran in D-PBS wurden die Nachweisgrenzen für die Markierung mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) und eines entsprechenden Bildauswerteprogramms (Odyssey-Software V1.2, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) bestimmt. Die Rohdaten wurden mit Hilfe eines Statistikprogramms (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ausgewertet. Eine Übersicht der Nachweisgrenzen ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 2: Verwendete Markierungs-Hydrazide
Tabelle 3: Nachweisgrenzen nach Markierung mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Derivaten.
(a) Ein polypeptidisches Zielmolekül, das Protein Ovalbumin, wurde mit verschiedenen Aktivestern markiert und in serieller Verdünnung auf Nitrocellulose immobilisiert. (b) Ein Glykoprotein, Mucin, wurde seriell verdünnt, auf Nitrocellulose immobilisiert, mit Periodat oxidiert und mit verschiedenen Hydraziden markiert. Die verwendeten Markierungsreagenzien trugen 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) als Markierung und entweder keinen (-) oder die aliphatischen Abstandhalter (c) Aminohexansäure (C6) oder (f) Aminoundecansäure (C11). Der Nachweis der markierten Proteine wurde mit 2,4-D-spezifischem Erstantikörper (Klon E4/C2) und AlexaFluor680 markiertem Zweitantikörper erbracht. Die Nachweisgrenze (Mittelwert ± Standardfehler) über dem Schwellenwert ist in pg angegeben. Der Schwellenwert wurde nach der Methode von Frey et al. bestimmt (Frey A, Di Canzio J, Zurakowski D (1998). A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J Immunol Methods. 221:35-41.). (d) Signifikant geringere Nachweisgrenze als nach Markierung mit 2,4-D, das einen C11-Abstandhalter trägt, bzw. (e) als nach Markierung mit 2,4-D, welches keinen Abstandhalter trägt (P<0,05; One-way ANOVA, Bonferroni Post hoc test).
Beispiel 10
Markierung mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-markierten N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin-Derivaten und ihr Nachweis
18mer Oligopeptide wurden nach dem SPOT-Syntheseverfahren für Zellulosefilter-immobilisierte Peptidbibliotheken (Frank R (1992). Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48: 9217-9232) hergestellt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei RT. Zellulosefilter wurden mit 0,02 ml/cm² Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-geschützter Aminosäure Prolin (0,2 M Fmoc-Prolin, 0,96 M 1-Methylimidazol und 0,26 M Diisopropylcarbodiimid (DICD) in DMF) behandelt. Nach der Veresterung wurden die nicht reagierten Hydroxylgruppen der Zellulose für 24 h mit 15 ml (0,13 ml/cm²) 2 % (v/v) Essigsäureanhydrid in N,N-Dimethylformamid (DMF) abgesättigt und die Membran dreimal mit DMF gewaschen. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen erfolgte für 5 min durch 10 ml (0,09 ml/cm²) 20 (v/v) Piperidin in DMF. Danach wurde fünfmal mit DMF gewaschen. Als Nachweis für die gekuppelte Aminosäure wurden die freien Aminogruppen auf dem Zellulosefilter für 10 min mit 15 ml (0,13 ml/cm²) einer Bromphenolblaulösung (0,01 % (w/v) in DMF) angefärbt. Anschließend wurde dreimal mit 100 % Ethanol gewaschen und die Membran im Kaltluftstrom getrocknet. Dieser Inkubations-Zyklus, bestehend aus 1x Essigsäureanhydrid, 3x DMF, 1x Piperidin, 5x DMF, 1x Bromphenolblau und 3x Ethanol, wurde auch zwischen den einzelnen Syntheseschritten durchgeführt. Ab dem dritten Syntheseschritt wurde die Inkubationszeit mit der Essigsäureanhydridlösung, die dann nur noch zum Absättigen der nicht reagierten Aminofunktionen dient, auf 20 min verkürzt.
Die Synthese erfolgte mit einer automatischen Pipettiermaschine (ASP 222, Intavis Bioanalytical Instruments AG, Köln, DE). Zunächst wurde eine Lösung aus 0,2 M tert-Butyloxycarbonyl-(Boc)-lysin-(Fmoc)-OH und 0,35 M 1-Hydroxybenzotriazol (HoBt) sowie 0,25 M Diisopropylcarbodiimid (DICD) in 1-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) 30 min vor ihrem Einsatz hergestellt und bei RT inkubiert. Nach 30 min Reaktionszeit wurde die Lösung zentrifugiert, um aufgetretene Präzipitate zu entfernen, und jeweils 0,1 μl der Kupplungslösung wurden mit Hilfe der automatischen Pipettiermaschine auf definierte Areale der Zellulosemembran pipettiert. Diese Areale werden als SPOTs bezeichnet und stellen die Syntheseorte für die einzelnen Peptide dar. In allen nachfolgenden Syntheseschritten wurden zur Verlängerung der Peptidkette für jedes Peptid jeweils 0,2 μl einer 0,2 M Aminosäureaktivesterlösung appliziert, die täglich frisch zubereitet wurde. Zur Herstellung der Aminosäureaktivesterlösung wurde eine Lösung von 0,2 M Fmoc-geschützter Aminosäure, deren Seitenkette, falls erforderlich, orthogonal geschützt war (tert.-Butyl (tBu) für Serin, Threonin, Tyrosin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; Trityl für Asparagin, Glutamin, Histidin; t-Butyloxycarbonyl (Boc) für Lysin und Tryptophan; 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) für Arginin und Acetamidomethyl (Acm) für Cystein) und 0,35 M 1-Hydroxy-benzotriazol (HoBt) in trockenem, entsalztem N-Methylpyrrolidon mit 1,25 Mol DICD pro Mol Aminosäure versetzt und 30 min bei RT reagieren gelassen. Anschliessend wurden entstandene Präzipitate durch Zentrifugation entfernt. Für jeden Syntheseschritt wurde die Aminosäureaktivesterlösung dreimal aufgebracht und jeweils mindestens 40 min bei RT rea gieren gelassen. Auf diese Weise wurden 18mer Peptide synthetisiert, die amino- oder carboxyterminal oder innerhalb einer 16mer Sequenz (abgeleitet aus dem Protein Ovalbumin) mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-markierten N-alpha-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-lysin-Derivaten (Verbindungen 2c, 4b und 4d) markiert wurden.
Die Seitenkettenschutzgruppen (außer Acm) wurden durch zwei einstündige Inkubationen mit 10 ml (0,09 ml/cm²) einer Lösung aus 50 % (v/v) Trifluoressigsäure, 2 % (v/v) destilliertem Wasser und 3 % (v/v) Triisobutylsilan in Dichlormethan abgespalten. Anschließend wurden die zellulosegebundenen Peptide zunächst viermal mit Dichlormethan, dann viermal mit 0,1 (v/v) HCl, 50 % (v/v) Methanol in zweifach destilliertem Wasser und schließlich viermal in 1 M Essigsäure, pH 1,9 gewaschen. Die Membran wurde über Nacht im Vakuum getrocknet. Die SPOTs wurden ausgestanzt und in 2 ml-Mikroreaktionsgefäße transferiert. Um die Peptide von den Membranschnipseln abzuspalten, wurden 500 μl einer Lösung aus 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA), 20 % (v/v) Ethanol, pH 7,5 in zweifach destilliertem Wasser zu jedem Membranschnipsel zugegeben. In dieser Form wurde über Nacht inkubiert, die Überstände wurden anschließend in ein frisches 2 ml-Mikroreaktionsgefäß gegeben und die Abspaltungsreaktion wurde für 2 h wiederholt. Beide Peptidlösungen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die so getrockneten Peptide wurden in 1,5 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM NaCl (L-PBS) × 0,005 (w/v) Tween 20 gelöst, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80° C gelagert. Schema a-c gibt eine Übersicht über die synthetisierten Peptide:

a) NH₂-Terminus: Ac-x-GSIGAASMEFCFDVFK-y-z :Carboxy-Terminus
b) NH₂-Terminus: Ac-y-GSIGAASMEFCFDVFK-x-z :Carboxy-Terminus
c) NH₂-Terminus: Ac-GSIGAAS-y-MEFCFDVFK-x-z :Carboxy-Terminus (Ac = Acetyl, x = Lysin-(Biotin), y = Verbindungen 2c, 4b oder 4d, z = Diketopiperazinrest, Aminosäuren sind im Ein-Buchstabencode angegeben)

Zum Nachweis der markierten Peptide in einem Immunoverfahren wurden hochbindende Mikrotitrationsplatten mit 96 Vertiefungen (Corning, Corning, NY, USA) mit einem Volumen von 75 μl/Vertiefung einer Erstantikörperlösung (anti-2,4-D, Klon E2/G2, 50 ng/ml in L-PBS) beladen und so über Nacht bei 4°C mit Antikörper beschichtet. Die Vertiefungen der Mikrotitrationsplatte wurden mit einer Waschlösung (D-PBS) dreimal gewaschen und anschließend für 3-4 h bei RT mit einer Absättigungslösung (1 % (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2, 7 mM KCl, 1, 5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8, 1 mM Na₂HPO₄) (Blocking-Lösung) gefüllt. Es wurde viermal mit D-PBS gewaschen, und 75 μl einer Lösung aus seriell in D-PBS verdünnten markierten Peptiden (1:750-1:1536000) wurden in jede Kavität gegeben. In dieser Form wurde die Mikrotitrationsplatte 2,5 Stunden bei RT inkubiert und danach nicht gebundene Peptide durch viermaliges Waschen mit D-PBS entfernt. Zum Nachweis der über die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Derivat-Markierung gebundenen, biotinylierten Peptide wurde mit 75 μl/Vertiefung einer 1 μg/ml Lösung aus peroxidase-markiertem Streptavidin (SA-HRP, 1 μg/ml in Casein/PBS, 60 min RT) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) in Blocking-Lösung für 60 min bei RT inkubiert. Die Mikrotitrationsplatte wurde sechsmal mit DPBS gewaschen und das Entwickeln des Farbsignals erfolgte durch Zugabe von 75 μl/Vertiefung eines 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin-Wasserstoffperoxid Substrats und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln (Frey A, Meckelein B, Externest D, Schmidt MA (2000). A stable and highly sensitive 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods. 233:47-56). 125 μl 1 M Schwefelsäure wurden in jede Vertiefung gegeben und die Absorption wurde mit einem Mikrotitrationsplattenlesegerät (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt. Die Bindungs- bzw. Titrationskurven wurden an eine 4-Parameterlogistikfunktion angepasst (SoftMax Pro V4.7, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) und die daraus gewonnenen Werte zur maximalen Signalhöhe und zum Titrationswendepunkt statistisch ausgewertet (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Eine Übersicht ist in 2 gezeigt.
Beispiel 11
Markierung mit und Nachweis von 2-(2-(2,4-Dichlorphenoxy)-1-hydroxyethyliden)-5,5-dimethylcyclohexan-1,3-dion (2,4-D Dimedon)
Ein 15mer Fragment aus Ovalbumin (NH₂-GSIGAASMEFCFDCF-COOH), wurde wie in Beispiel 10 beschrieben im SPOT-Maßstab auf Zellulosemembran synthetisiert. Im Unterschied zu Beispiel 10 wurde das Peptid aber über den nicht abspaltbaren Anker, beta-Alanylalanin (beta-A) an der Membran verankert (NH₂-Peptid-CONH-beta-A-Membran). Nach der Fmoc-Entschützung des N-Terminus des Peptides wurde das Peptid mit 0,2 μl einer Lösung aus 0,2 M 2,4-D-Dimedon (1c) in 1-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) derivatisiert. Die Seitenkettenschutzgruppen wurden wie beschrieben entfernt, die Membran dreimal 10 Minuten in D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) gewaschen und nachfolgend 5 Stunden in Blocking-Lösung (1 % (w/v) Casein Hammarsten grade, BDH, Poole, UK in D-PBS) abgesättigt. Um die Markierung nachzuweisen, wurde die derart geblockte Membran über Nacht bei 4°C mit 4 ml (2 ml/cm² Membran) einer Lösung aus biotinyliertem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2; 1 μg/ml; biotinyliert nach Herstellerangaben mit 15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecansäure-N-hydroxysuccinimidylester (NHS-PEO4-Biotin) (Uptima über KMF Laborchemie Handels GmbH, Lohmar, DE) in Blocking-Lösung inkubiert und anschließend sechsmal für 10 min mit D-PBS gewaschen. Es folgte eine Inkubation mit 3 ml (1,5 ml/cm² Membran) einer Lösung aus 250 μg/ml AlexaFluor680 markiertem Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in Blocking-Lösung für 90 min bei RT. Die Membran wurde abschließend dreimal für 10 min bei RT mit D-PBS gewaschen und die Fluoreszenzsignale wurden quantifiziert (Odyssey Infrared Imager und Odyssey Software V1.2, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA). Anschließend wurde die Markierung durch Einwirken von 4 ml (2 ml/cm² Membran) 5 % (v/v) Hydrazin-Monohydrat in D-PBS für 5, 20, 60 oder 100 min bei RT entfernt, die Membran dreimal mit D-PBS gewaschen und die Fluoreszenzsignale erneut quantifiziert. 2 stellt die Reversibilität der Markierung mit 2,4-D-Dimedon dar.

Claims

Verbindung, gekennzeichnet durch Formel (I)
die in Wasser stabil und löslich sind, wobei der Spacer 1 bis 25 gleiche oder verschiedene geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Saccharide oder aus der folgenden Gruppe ausgewählte Reste umfasst:
wobei X -O- oder -S- ist und n eine ganze Zahl im Bereich zwischen 1 und 10 ist, wobei RG aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist
wobei R gleiche oder verschiedene Reste aus der folgenden Gruppe sind: Wasserstoff, linearer, verzweigter oder cyclischer Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, linearer oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, geschütztes oder ungeschütztes Amin ausgenommen die folgenden Verbindungen (n = 1-10):
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Formel (II)
bei der Z1 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten
mit n1 = 1-15, wobei Z2 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten
mit n2 = 1-15, wobei M⁺ ein einwertiges, anorganisches oder organisches Kation ist, wobei PG eine Amino-Schutzgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Formel (III)
mit n = 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei M⁺ ein Lithium-, Kalium, Ammonium-, Rubidium-, Cäsium-, Natrium- oder Tetraalkylammoniumion ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Amino-Schutzgruppe S-Acetamidomethyl- (Acm), t-Butyloxycarbonyl- (Boc), t-Butyl- (tBu), Trityl- (Trt), 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl- (Pbf), Tosyl- (Ts), Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc), (1,1,-dioxobenzo[b]thiophene-2-yl-methyl)oxycarbonyl (Bsmoc), Benzyloxycarbonyl (CBz) oder beta-2-Adamantyl (Ada) ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei n1 = 5 oder n1 = 10 und/oder n2 = 5 oder n2 = 10 sind.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie der folgenden Verbindungen
zur Kopplung an Substratmoleküle.
Verwendung nach Anspruch 7, bei der das Substratmolekül ein Makromolekül ist.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Makromolekül ein biogenes Makromolekül ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 7 bis 9, bei der das Trägermolekül eine Aminosäure, ein verzweigtes oder unverzweigtes Oligopeptid, Polypeptid, Protein, Nukleinbase, Oligonukleosid, Polynukleosid, Nukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotid, Nukleinsäure, Monosaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid, Lipid oder Glykoprotein ist.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der das Polypeptid ein Polypeptid mit 2 bis 25 Aminosäuren ist.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der das Protein eine Masse von mehr als 5 kDa hat.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der das Oligosaccharid 2 bis 25 Monosaccharide umfasst.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Kopplung an eine Festphase.
Verwendung nach Anspruch 14, bei der die Festphase eine funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen- oder Glasoberfläche, eine Amino-, Thiol-, Aldehyd-, Epoxid-, Maleinimid- Vinylsulfon-, Hydrazin- oder Hydrazid funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen- oder Glasoberfläche ist.
Trägermolekül, an das eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gekoppelt ist.
Festphase, an die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gekoppelt ist.
Festphase nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase eine funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen- oder Glasoberfläche, eine Amino-, Thiol-, Aldehyd- oder Epoxyd-funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen- oder Glasoberfläche ist.
Verwendung eines Trägermoleküls nach Anspruch 16 oder einer Festphase nach Anspruch 17 oder 18 für einen diagnostischen oder analytischen Assay.
Verwendung nach Anspruch 19 bei dem der Assay ein immunologischer Assay ist.
Verwendung nach Anspruch 19 bei dem der Assay eine festphasengestützte diagnostische Anwendung, ein enzymgekoppelter Immunosorbent Assay, ein Hybridisierungsassay, eine Polymerasekettenreaktion, ein biologisches Markierung- oder Aufnahmeexperiment ist.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten.