DE19529250C1 - Hapten-Träger-Konjugate mit hoher, definierter Kopplungsrate - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Hapten-Träger-Konjugate mit hohen und definier­ ten Kopplungsraten mit einer Polyaminosäure als Träger und einer Carboxy- und/oder Aminogruppen enthaltenden niedermolekularen or­ ganischen Substanz ausgewählt aus der Gruppe mit Bernsteinsäure derivatisertes Patulin, Ochratoxin A, Prostaglandin E2, 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure, 4-Chlor-2-methylphenoxyessigsäure, 4-(4- Chlor-2-methylphenoxy)buttersäure, N-Phenylharnstoff, O6-Methyl-2′- desoxyguanosin, Leucotrien als Hapten, ein Verfahren zu deren Herstel­ lung sowie deren Verwendung in einem Verfahren zur Antikörperpro­ duktion oder zur Beschichtung von in immunologischen Testsystemen eingesetzten Materialien. Niedermolekulare organische Substanzen, sogenannte Haptene, sind ihrer Molekülgröße wegen nicht immunogen. Um sie in Verfahren, bei denen die Erkennung durch einen Antikörper von Bedeutung ist, einsetzen zu können, muß ihre Molekülgröße in geeigneter Weise vergrößert werden. Solche Verfahren sind insbeson­ dere die Erzeugung von Antikörpern durch die Immunisierung eines Tieres oder die Durchführung von immunologischen Testsystemen. Bei solchen Verfahren müssen die Haptene an einen geeigneten Träger gekoppelt werden. Die Wahl des Trägers, sowie die Effizienz der Kopplung trägt entscheidend zum Erfolg der Antikörperproduktion bzw. des immunologischen Tests bei. So müssen Haptene, wenn sie zur Antikörperherstellung eingesetzt werden sollen, an Trägersubstanzen gebunden werden, um die Molekülgröße des Haptens so zu erhöhen, daß eine Immunantwort hervorgerufen werden kann.

Will man bei einem immunologischen Testsystem das Hapten an eine Matrix fixieren, muß das Molekül ebenfalls entsprechend vergrößert werden, um eine ausreichende adhäsive Bindung an das Material (Kunststoff von Mikrotiterplatten, Immunosticks oder Immunoröhrchen) zu erreichen. Die Haptene müssen zudem eine Mindestgröße besitzen, um zu verhindern, daß sie im Test durch die Proteine, mit denen auf der Matrix die unspezifischen Bindungsstellen abgeblockt werden, ste­ risch maskiert werden, und der Antikörper sie nicht mehr detektieren kann.

Die Wahl des Trägermoleküls ist von entscheidender Bedeutung für den Erfolg einer Antikörperherstellung, sowie für die Testqualität bei der Anwendung zur Beschichtung verschiedener Matrices. Entscheidend ist dabei nicht nur die Größe der Trägermoleküls, dessen Hydrophobie oder Hydrophilie, sondern auch die Anzahl und Beschaffenheit der möglichen Kopplungsstellen.

Eingesetzt werden dabei meistens Proteine.

Im bisherigen Stand der Technik werden dabei im allgemeinen z. B. Al­ bumine, Hemocyanin, Thyroglobulin oder Histone verwendet. Ein Bei­ spiel hierfür ist von M. Bonfanti, C. Magagnotti in Cancer Research 50, 6870-6875, Nov. 1, 1990 beschrieben. Die Proteine erfüllen die Voraus­ setzung der Löslichkeit in wäßrigen Puffern und verfügen über eine Reihe möglicher Kopplungsstellen durch das Vorhandensein von ent­ sprechenden Amino- und Carboxygruppen. Dabei werden Kopplungsra­ ten bis zu 20 erreicht, d. h. an einem Mol Trägerprotein sind 20 Mol Hapten konjugiert. Die Kopplungen erfolgen dabei nach etablierten Methoden, wie sie z. B. in Practice and Theory of Enzymeimmunoas­ says, P. Tÿssen, Elsevier Verlag 1985 (ISBN 0-444-80633-4) beschrie­ ben sind. Bei den Synthesen wird das Hapten meist im Überschuß zu­ gegeben, um zu höheren Kopplungsraten zu gelangen. Mit solchen Konjugaten können Immunisierungen und Beschichtungen geeigneter Matrices durchgeführt werden.

In einigen Veröffentlichungen werden auch Polyaminosäuren als mögli­ che Trägermoleküle aufgeführt. So wird in der Patentschrift J5 8225- 028-A Interferon beschrieben, das aber in einem Beispiel an BSA kon­ jugiert wurde. Jedoch kann man davon ausgehen, daß das Interferon gekoppelt wurde, um das Molekül zur Vermeidung physiologischer Auswirkungen zu inaktivieren, zumal es aufgrund seiner Molekülgröße und Struktur selbst immunogen ist und nicht als eigentliches Hapten bezeichnet werden kann.

In einer weiteren Patenschrift (JO 1097-861-A) werden Polyglutamin­ säure und Polylysin als eventuell geeignete Makromoleküle erwähnt. Es ist jedoch keine entsprechende Konjugierung ausgeführt worden, zudem als niedermolekulare organische Substanz Myristicylglycin be­ schrieben ist, das z. B. nicht an Polyglutaminsäure gekoppelt werden kann, da das Molekül keine Aminogruppen besitzt.

Aus "Chem. Abstracts, Vol. 116, 1992, 171646h" ist ebenfalls die mög­ liche Verwendung von Polylysin als Träger bekannt, wobei die Veröf­ fentlichung sich auf 25 Haptene aus dem medizinischen Bereich wie Hormone und Arzneimittel beschränkt. Eine entsprechende Synthese­ durchführung wird jedoch nicht beschrieben.

In keiner der drei genannten Publikationen, die Polyaminosäuren als Makromoleküle aufführen, wird für die Verwendung als Träger eine Kopplungsreaktion beschrieben, die zu hohen und definierten Kopp­ lungsraten führt. Außerdem dienen dort Träger-Protein-Konjugate aus­ schließlich zum Zweck der Antikörperherstellung in Säugetieren, nicht jedoch zur Antikörperherstellung in Hühnern oder zum Einsatz bei Be­ schichtungen von in immunologischen Testsystemen eingesetzten Materialien.

Die Verwendung von Proteinen als Trägerproteine ist mit Nachteilen behaftet.

Diese liegen zum einen in der begrenzten Anzahl an funktionellen Gruppen im Molekül, die für eine Kopplung zur Verfügung stehen. Aber auch Unterschiede bei der Hydrophilie zwischen Träger und Hapten wirken sich negativ aus. Die Trägerproteine zeichnen sich durch eine große Hydrophilie aus. Konjugiert man nach dem heutigen Stand der Technik ein hydrophoberes Hapten, so werden erhebliche Anteile an Hapten im Inneren der Tertiärstruktur des Proteins maskiert, die hydro­ philen Stellen des Trägers befinden sich auf der Moleküloberfläche. Somit stehen diese Haptene bei einer Immunisierung nicht mehr für den Angriff des Immunsystems zu Verfügung, bei einer Beschichtung können die Haptene im Proteininneren vom im Test verwendeten Anti­ körper nicht erkannt werden. Dadurch verschlechtert sich im ersten Fall der Antikörpertiter im Serum, im zweiten Fall die Testqualität. Außerdem ist es oft schwierig, bei Hapten-Protein-Konjugaten definier­ te Kopplungsraten zu erreichen, da zum Einen die genaue Zahl der be­ nötigten funktionellen Gruppen nicht bekannt ist, zum Anderen geeig­ nete Funktionen durch die Tertiärstruktur des Trägers maskiert sein können und so für eine Konjugierung nicht zu Verfügung stehen.

Eine weitere Problematik besteht darin, daß in den bisher eingesetzten Proteinen verschiedene funktionelle Gruppen vorhanden sind, die chemisch reagieren können. Besitzt nun ein Hapten mehr als eine funktionelle Gruppe, die gekoppelt werden kann, so wird statistisch ge­ sehen auch über die anderen Gruppen konjugiert. Es soll jedoch bei den Haptenen nur über eine bestimmte Funktion, die für das Molekül von untergeordneter Bedeutung ist, gekoppelt werden, damit sowohl bei Immunisierungen als auch bei Beschichtungen die signifikanten Teile des Moleküls für den Antikörper zur Verfügung stehen.

Deshalb ist es notwendig, funktionelle Gruppen, die ebenfalls reagieren könnten, vor der Konjugierung mit Schutzgruppen zu versehen, die nach erfolgter Reaktion wieder entfernt werden müssen. Dies bedeutet einen zusätzlichen Material- und Arbeitsaufwand.

Verwendet man Hapten-Protein-Konjugate für eine Immunisierung, so werden Antikörper gegen das Hapten, aber auch gegen den Träger gebildet. Je größer der Träger dabei ist, umso größer ist auch der Anteil an produziertem Immunoglobulin, der gegen determinante Gruppen des Proteins gerichtet ist. Dadurch verringert sich prozentual gesehen der Anteil an Antikörpern gegen das Hapten, die ja eigentlich produziert werden sollten.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Hapten-Träger- Konjugate bereit zu stellen, die definierte, möglichst hohe, Kopplungs­ raten erreichen. Dabei sollen die Haptene im Konjugat so liegen, daß sie bei Verwendung in entsprechenden Verfahren, z. B. bei der Immu­ nisierung und bei Beschichtungen in Testsystemen von den Antikör­ pern erkannt werden können und nicht im Inneren des Trägers mas­ kiert sind. Außerdem soll der Anteil an Träger im Konjugat minimiert sein und nur eine Art funktioneller Gruppe für die Kopplung zur Verfü­ gung stehen, so daß beim Vorhandensein verschiedener Gruppen im Hapten keine Schutzgruppen verwendet werden müssen. Ferner sollen die Konjugate leicht und kostengünstig herzustellen sein.

Diese Aufgabe wird durch ein Träger-Hapten-Konjugat mit hoher, defi­ nierter Kopplungsrate, gemäß Anspruch 1 gelöst.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Hapten-Träger-Konjugate, die eine Polyaminosäure als Träger enthalten, entsprechende Konjuga­ te mit hoher und definierter Kopplungsrate sind und mit Vorteil in Ver­ fahren, bei denen die Erkennung durch einen Antikörper von Bedeu­ tung ist, eingesetzt werden können. Bevorzugt sind solche Verfahren die Erzeugung von Antikörpern oder die Durchführung von immunolo­ gischen Tests.

Die erfindungsgemäß hergestellten Hapten-Polyaminosäure-Konjugate sind Moleküle mit definierten und hohen Kopplungsraten, wodurch bei einer Immunisierung die Antikörpertiter bei gleicher Ausgangsmenge an Hapten verbessert, bei Verwendung zur Beschichtung in immuno­ logischen Testsystemen bessere Ergebnisse erzielt werden. Geeignete funktionelle Gruppen der Haptene-Carboxy- und Amino­ gruppen - sind entweder als solche im Molekül vorhanden oder können durch eine einfache Derivatisierung eingeführt werden. Dies trifft auf folgende Haptene zu: mit Bernsteinsäure derivatisiertes Patulin, Ochratoxin A, Prostaglandin E2, 2,4-Dichlor-phenoxyessigsäure (2,4- D), 4-Chlor-2-methyl-phenoxyessigsäure (MCPA), 4-(4-Chlor-2- methylphenoxy)buttersäure (MCPB), sowie Haptene mit Aminogruppen wie N-Phenylharnstoff, O6-Methyl-2′-desoxyguanosin und Leucotrien. Es können beliebige Polyaminosäuren verwendet werden. Bevorzugt besitzen sie ein Molekulargewicht über 5000. Diese Größe ist für eine Antikörperproduktion und für Beschichtungen durchaus ausreichend, und erhöht prozentual den Anteil an Haptenen im Konjugat. Bevorzugte funktionelle Gruppen für die Konjugierung sind dabei Amino- bzw. Car­ boxygruppen im Hapten. Besonders bevorzugte Polyaminosäuren zur Herstellung der Konjugate ist dabei Poly-L-Glutaminsäure oder Poly-L- Lysin. Ist in einem Molekül die Aminogruppe zu koppeln, so setzt man eine Poly-L-Glutaminsäure als Trägermolekül ein. Im umgekehrten Fall konjugiert man die Carboxygruppe im Hapten mit einem Poly-L-Lysin entsprechender Größe.

Die Konjugierung erfolgt mit einem geeigneten Kopplungsreagenz nach an sich bekannten Verfahren z. B. mit Carbodiimid, wobei zwischen Amino- und Carboxyfunktionen eine kovalente Säureamidbindung her­ gestellt wird.

Soll im einem Hapten über eine OH-Gruppe konjugiert werden, so ve­ restert man die Hydroxyfunktion mit Bernsteinsäureanhydrid in wasser­ freiem Pyridin. Die eine Carboxygruppe der Bernsteinsäure ist dann mit der OH-Gruppe verestert, die zweite steht für die Bindung an eine Ami­ nogruppe eines Trägers zur Verfügung. Dies ist eine gängige Methode, um über Hydroxygruppen konjugieren zu können und wird auch bei der Herstellung von Protein-Konjugaten eingesetzt.

Die erfindungsgemäßen Hapten-Träger-Konjugate können nun für im­ munologische Tests an die Oberfläche z. B. von Mikrotiterplatten, Im­ munoröhrchen oder Immunosticks gekoppelt und so zur Ausbildung einer Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet werden.

Die Konjugate können aber auch als solche - nach Solubilisierung in einer geeigneten Pufferlösung - zur Immunisierung eines Tieres mit dem Ziel der Antikörperproduktion eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Hapten-Poly-Aminosäure-Konjugate haben den Vorteil, daß sich definierte Kopplungsraten erstellen lassen. Es ist hier nicht notwendig, einen Überschuß an Hapten für die Konjugierung einzusetzen. Es hat sich dabei bewährt, jede dritte bis vierte Aminosäu­ re des Trägers mit dem Hapten zu koppeln. Verwendet man höhere Kopplungsraten besteht die Gefahr, daß sich Antikörper und Hapten bei der Immunisierung bzw. Beschichtung gegenseitig sterisch behindern. Außerdem können sich bei Verwendung der erfindungsgemäßen Kon­ jugate die gebundenen Haptene nicht im Inneren der Molekülkette ver­ bergen, und so sind diese für die Immunoglobuline zugänglich. Weil der prozentuale Anteil an Hapten im Konjugat relativ hoch ist und nicht zu erwarten ist, daß die Haptene im Inneren des Moleküls maskiert sind, benötigt man insgesamt sowohl für Beschichtungen von Mikrotiterplat­ ten, Immunoröhrchen und Immunosticks, als auch für Immunisierungen zur Antikörperherstellung weniger Konjugat als bei der Verwendung von Hapten-Protein-Verbindungen. Außerdem ist es von Vorteil für das immunisierte Tier, dessen Organismus durch die geringere Menge an Konjugat, die appliziert werden muß, weniger belastet wird.

Besitzt ein Hapten sowohl Amino- als auch Carboxygruppen gleicher Reaktivität, ist das Anbringen einer Schutzgruppe für die Funktion, über die nicht gekoppelt werden soll, meist überflüssig, da im Träger mit Ausnahme einer endständigen Aminosäure am C-Atom 1 nur eine Art funktioneller Gruppe zur Verfügung steht.

Die erfindungsgemäße Herstellung der Konjugate wird durch die im Folgenden aufgeführten Beispiele näher erläutert.

Als Poly-L-Glutaminsäure, bzw. Poly-L-Lysin, wurden im Handel übliche Produkte eingesetzt. Das für die Kopplungsreaktion eingesetzte 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) wurde von Sigma Chemie GmbH (Nr. E-7750) bezogen, jedoch kann auch das Reagenz eines anderen Herstellers bei vergleichbarer Qualität verwendet wer­ den.

Sämtliche verwendeten Reagenzien sollten dem Reinheitsgrad p.a. entsprechen.

Das Wasser zur Herstellung der Puffer sollte höchsten Reinheitsgraden entsprechen.

Beispiel 1 Herstellung eines Patulin-Poly-L-Lysin-Konjugats

5 mg Patulin werden mit 3 mg Bernsteinsäureanhydrid in Pyridin abs. gelöst. Der Ansatz rührt 15 Stunden bei Raumtemperatur. Dann wird das Pyridin im Vakuum abgezogen.

Den Rückstand nimmt man in 1 ml 0,1 n Phosphatpuffer, pH 7,5, auf. Dazu gibt man 20 mg EDC. Zu diesem Ansatz pipettiert man eine Lö­ sung von 10 mg Poly-L-Lysin in 0,1 n NaCl. Die Kopplung erfolgt durch 15stündiges Rühren bei Raumtemperatur.

Anschließend wird das Reaktionsprodukt durch Dialyse gegen phos­ phatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS) gereinigt. Das Kopplungsprodukt wird aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung als Immunogen oder Beschichtungskonjugat bei -20 Grad C aufbewahrt.

Beispiel 2 Herstellung eines Ochratoxin A-Poly-L-Lysin-Konjugats

Bei der Herstellung dieses Konjugats kann direkt die Carboxygruppe des Ochratoxin A verwendet werden.

5 mg Ochratoxin A werden in 1 ml 0,1 n Phosphatpuffer pH 7 + 0,2 ml Ethanol aufgenommen. Dazu gibt man 20 mg EDC. Man stellt eine Lö­ sung von 5 mg Poly-L-Lysin her und pipettiert diese zu der Ochratoxin A-Lösung. Der Reaktionsansatz rührt 48 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird das Konjugat durch Dialyse gegen PBS gereinigt, aliquotiert, und bis zur weiteren Verwendung bei -20 Grad C aufbe­ wahrt.

Beispiel 3 Herstellung eines Prostaglandin E2-Poly-L-Lysin-Konjugats

5 mg Prostaglandin in 0,5 ml Ethanol werden in 2 ml 0,1 n Phosphat­ puffer pH 7 aufgenommen und mit 20 mg EDC versetzt. Zu dieser Lö­ sung gibt man 4 mg Poly-L-Lysin in 0,1 n NaCl und rührt 15 Stunden bei Raumtemperatur. Da das Prostaglandin sehr oxidationsanfällig ist, ist es zweckmäßig, diese Reaktion unter Stickstoffgas durchzuführen. Im Anschluß erfolgt eine Dialyse gegen PBS. Die Konjugatlösung wird aliquotiert und, um das Produkt vor Oxidation zu schützen, unter Argon bei -80 Grad C aufbewahrt.

Beispiel 4 Herstellung eines 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Poly-L-Lysin- Konjugats

2 mg 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) werden in 2 ml Ethanol und 0,5 ml 0,1 n Phosphatpuffer pH 7 angelöst. Dazu gibt man zunächst 10 mg EDC und anschließend eine Lösung von 5 mg Poly-L-Lysin in 1 ml 0,1 n NaCl. Der Ansatz rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur. An­ schließend reinigt man das Reaktionsprodukt durch Dialyse gegen Et­ hanol, um nicht gebundenes 2,4-D zu entfernen. Daran schließt sich eine Dialyse gegen PBS an. Unlösliche Bestandteile werden durch Fil­ tration entfernt. Dann aliquotiert man und lagert bis zum Verbrauch bei -20 Grad C.

Beispiel 5 Herstellung eines MCPA-Poly-L-Lysin-Konjugats

Zu 2 mg MCPB in 2 ml Ethanol, 0,5 ml Phosphatpuffer pH 7 und 10 mg EDC pipettiert man eine Lösung von 4 mg Poly-L-Lysin in 1 ml 0,1 n NaCl. Man rührt die Lösung 20 Stunden bei Raumtemperatur. Danach dialysiert man zur Reinigung des Reaktionsprodukts zunächst gegen Ethanol und anschließend gegen PBS. Die Konjugatlösung wird bei Bedarf filtriert, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 Grad C gelagert.

Beispiel 6 Herstellung eines MCPB-Poly-L-Lysin-Konjugats

2 mg MCPB werden in 2 ml Ethanol und 0,5 ml 0,1 n Phosphatpuffer gelöst. Dazu gibt man 10 mg EDC. Man stellt eine Lösung von 4 mg Poly-L-Lysin in 1 ml 0,1 n NaCl her und pipettiert diese zur MCPB- Lösung. Anschließend wird 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Unlösliche Bestandteile werden durch Filtration entfernt. Danach reinigt man das Reaktionsprodukt durch Dialyse zunächst gegen Ethanol, dann gegen PBS. Zur weiteren Aufbewahrung wird das gereinigte Konjugat aliquotiert und bei -20 Grad C eingefroren.

Beispiel 7 Herstellung eines N-Phenylharnstoff-Poly-L-Glutaminsäurekonjugats

5mg N-Phenylharnstoff werden in 0,5 ml Ethanol und 1 ml 0,1 n Phos­ phatpuffer gelöst. Dazu gibt man 20 mg EDC. Zu diesem Ansatz gibt man dann eine Lösung von 3 mg Poly-L-Glutaminsäure in 0,1 n NaCl. Nach 20 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur ist die Reaktion be­ endet, das Konjugat wird durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Anschlie­ ßend aliquotiert man die Konjugatlösung und lagert sie bei -20 Grad C.

Beispiel 8 Herstellung eines O6-Methyl-2′-desoxyguanosin-Poly-L-Glutaminsäure- Konjugats

Man löst 1 mg O6-Methyl-2′-desoxyguanosin in 1 ml 0,1 n Phosphatpuf­ fer und gibt 5 mg EDC dazu. Zu dieser Lösung werden 2 mg Poly-L- Glutaminsäure in 0,1 n NaCl pipettiert. Der Ansatz rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird das Reaktionsprodukt durch Dialyse gegen PBS gereinigt und dem Bedarf entsprechend aliquotiert. Das Konjugat kann dann bei -20 Grad C gelagert werden.

Beispiel 9 Herstellung eines Leucotrien-Poly-L-Glutaminsäure-Konjugates

Zu 0,2 g Leucotrien in 2 ml Ethanol gibt man 2 ml 0,1 n Phosphatpuffer und 1 g EDC. Dazu pipettiert man eine Lösung von 0,2 g Poly-L- Glutaminsäure in 0,5 ml 0,1 n NaCl. Der Ansatz inkubiert 12 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur. Da das Leukotrien sehr oxidati­ onsempfindlich ist, ist es zweckmäßig, die Reaktion unter Stickstoffgas durchzuführen.

Anschließend wird das Konjugat durch Dialyse gegen PBS aufgereinigt und aliquotiert. Die Aliquots lagert man bis zum Verbrauch unter Argon bei -80 Grad C.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate erreicht man so, daß etwa jede vierte funktionelle Gruppe der jeweiligen Polyaminosäu­ re konjugiert wird.

Wie sich dies auf die Kopplungsraten im Vergleich zu Rinderserumal­ bumin (BSA) als Träger auswirkt, zeigt sich am deutlichsten, wenn man die Anzahl der konjugierten Haptene pro Trägermolekulargewichtsein­ heit von 10 000 berechnet. Je nach Reaktionsbedingungen können die Werte geringfügig variieren. Folgende Tabelle stellt diesen Vergleich für die aufgeführten Beispiele dar.

Der Vorteil der hohen, definierten Kopplungsraten der erfindungsge­ mäßen Hapten-Polyaminosäurekonjugaten zeigt sich bei der Verwen­ dung in immunologischen Testsystemen bei der Beschichtung von Mi­ krotiterplatten, Immunosticks und Immunoröhrchen. Das Material der zu beschichtenden Matrices ist dabei entweder Polystyrol oder Polyethy­ len, wobei sich für die verwendeten Tests Polystyrol aufgrund seiner besseren Proteinbindungskapazität bewährt hat. So wurden die für die Beschichtung geeigneten Materialien mit unterschiedlichen Konzentra­ tionen von Ochratoxin A-BSA-Konjugat und parallel dazu mit Ochra­ toxin A-Poly-L-Lysin-Konjugat jeweils in 0,1 n Bicarbonatpuffer pH 9,5 über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Die Konjugate binden sich adhäsiv an die Materialoberfläche. Freie Bindungsstellen werden dann nach an sich bekannten Verfahren abgeblockt.

Anschließend wurde durch Zugabe eines Anti-Ochratoxin A-Antikörpers eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen den fixierten Konjugaten und dem Antikörper in Gang gesetzt. Der an die Hapten-Träger- Konjugate gebundene Antikörper wurde dann mit an sich bekannten Verfahren detektiert. Dabei zeigte sich, daß für eine positive Reaktion, d. h. eine ausreichende Bindung des Antikörpers an das Konjugat, bei dem Ochratoxin A-BSA-Konjugat eine Beschichtungskonzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter notwendig war, während beim Ochratoxin A- Poly-L-Lysin-Konjugat bereits 0,5 Mikrogramm pro Milliliter ausreichten. Das beschichtete Material sowie der Antikörper und dessen Konzentra­ tion waren in beiden Fällen identisch.

Die praktische Anwendung der erfindungsgemäßen Konjugate besteht z. B. im Fall des Ochratoxin A darin, daß zunächst Mikrotiterplatten, Immunosticks oder -röhrchen mit konstanten Konzentrationen an Ochratoxin A-Poly-L-Lysin-Konjugaten beschichtet werden. Freie Bin­ dungskapazitäten werden nach an sich bekannten Verfahren abge­ blockt. Die beschichteten Materialien werden mit konstanten Mengen an Anti-Ochratoxin A-Antikörper und den Ochratoxin A-haltigen Stan­ dards und Proben eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit findet eine Antigen-Antikörper-Reaktion statt, wobei der Antikörper sowohl an beschichtetes Konjugat als auch an das Hapten in Standard oder Probe bindet. Je mehr Ochratoxin A sich im Standard oder in der Probe befindet, desto weniger Antikörper wird sich an die beschichteten Konjugate binden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wäscht man die Mikrotiterplatten, Immunosticks oder -röhrchen mit dest. Wasser. Der am erfindungsgemäßen Konjugat gebundene Antikörper wird nach an sich bekannten Verfahren nachgewiesen. Die Konzentration an einge­ setztem Antikörper betrug dabei 10 µg/ml, die Nachweisgrenze des Tests lag bei 10 ng Ochratoxin A/ml. Diese Werte sind abhängig vom jeweiligen eingesetzten Antikörper und können bei Verwendung eines anderen Anti-Ochratoxin A-Antikörpers variieren.

Führte man denselben Testablauf mit einer Ochratoxin A-BSA- Konjugat-Beschichtung durch, beläßt aber alle anderen Faktoren iden­ tisch, so zeigte sich, daß dreimal soviel Konjugat für die Beschichtung benötigt wurde als bei dem erfindungsgemäßen Konjugat. Außerdem ist die Extinktionsdifferenz der Standardkurve bei Verwendung des Ochratoxin A-Poly-L-Lysin-Konjugats größer als beim Ochratoxin A- BSA-Konjugat. Dies führt zu einer exakteren quantitativen Bestimmung der Proben und somit zu einer Verbesserung des Tests. Vergleich bei­ der Standardkurven: s. Fig. 1.

Das immunologische Verfahren, das hier beispielhaft am Ochratoxin A aufgezeigt wurde, kann analog auch für andere Hapten- Polyaminosäure-Konjugate eingesetzt werden.

Auch der Einsatz von erfindungsgemäßen Konjugaten bei Immunisie­ rungen von Tieren mit dem Ziel der Antikörperherstellung ist von Vor­ teil. Bei jeder Antikörperherstellung sollte im Interesse des Tieres und um die Haptenvorräte zu schonen das Ziel eine "low-dose­ immunisation" sein, d. h. man verwendet soviel Konjugat wie nötig und so wenig wie möglich. So wurde zum Beispiel für die Antikörpergewin­ nung gegen Ochratoxin A eine Immunisierung mit einem Ochratoxin A- BSA-Konjugat, sowie eine mit einem Ochratoxin A-Poly-L-Lysin- Konjugat durchgeführt. Die Herstellung der Konjugat-Adjuvans- Emulsionen für die Immunisierung sowie die Art und Weise der Appli­ kation erfolgte nach an sich bekannten Methoden. Als Antikörperprodu­ zenten wurden Kaninchen eingesetzt. Zu Beginn der Immunisierung wurde bei beiden Konjugaten im Abstand von zwei Wochen je 0,1 mg verabreicht. Nach der dritten Woche kann eine positive Immunreaktion erwartet werden, und der Titer wurde kontrolliert. Dabei zeigte sich, daß das Tier, das das erfindungsgemäße Konjugat erhalten hat, einen hö­ heren Antikörpertiter aufwies. Für die weiteren Injektionen konnte hier die Konjugatkonzentration bei 0,1 mg/Applikation belassen werden. Beim Tier mit dem Ochratoxin A-BSA-Konjugat mußte die Konzentrati­ on auf 0,2 mg/Injektion erhöht werden. Im Folgenden wurde der Titer laufend überprüft und nur bei schlechtem Titer oder Absinken der Anti­ körperproduktion nachimmunisiert. Es konnte festgestellt werden, daß bei Verwendung des Ochratoxin A-Poly-L-Lysin-Konjugats der Titer trotz geringerer verabreichter Menge schneller anstieg und länger auf­ recht erhalten wurde. Den Vergleich beider Titerkurven zeigt Fig. 2. Diese Beobachtung läßt sich im Wesentlichen auch auf andere Hap­ ten- Polyaminosäure-Konjugate übertragen. Die applizierten Konjugat­ konzentrationen können jedoch aufgrund der unterschiedlichen Immu­ nogenität der Haptene differieren.

Prinzipiell ist es möglich, Hapten-Polyaminosäure-Konjugate auch in anderen Bereichen, in denen bis jetzt andere Trägermaterialien einge­ setzt wurden, zu verwenden.

Claims (9)

1. Hapten-Träger-Konjugate mit hohen und definierten Kopplungsraten, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Polyaminosäure als Träger und eine Carboxy- und/oder Aminogruppe(n) enthaltende niedermolekulare organische Substanz ausgewählt aus der Gruppe mit Bernsteinsäure derivatisiertes Patulin, Ochratoxin A, Prostaglandin E2, 2,4-Dichlor­ phenoxyessigsäure, 4-Chlor-2-methylphenoxyessigsäure, 4-(4-Chlor- 2-methylphenoxy)buttersäure, N-Phenylharnstoff, O6-Methyl-2′-desoxy­ guanosin, Leucotrien als Hapten umfaßt.

2. Hapten-Träger-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyaminosäure ein Molekulargewicht von mindestens 5000 besitzt.

3. Hapten-Träger-Konjugat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Polyaminosäure Poly-L-Lysin oder Poly-L- Glutaminsäure ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Hapten-Träger-Konjugats mit hoher und definierter Kopplungsrate, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Carboxy- und/oder eine Aminogruppe(n) enthaltende niedermolekulare organische Substanz ausgewählt aus der Gruppe mit Bernsteinsäure derivatisiertes Patulin, Ochratoxin A, Prostaglandin E2, 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure, 4-Chlor-2-methyl-phenoxyessigsäure, 4-(4-Chlor-2-methylphenoxy)buttersäure, N-Phenylharnstoff, O6-Methyl-2′- desoxyguanosin, Leucotrien unter Verwendung eines Kopplungsreagenzes mit einer Polyaminosäure unter Erhalt eines Säureamids umsetzt und das Säureamid nach an sich bekannten Verfahren isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyaminosäure eine Polyaminosäure mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000 verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyaminosäure Poly-L-Lysin oder Poly-L-Glutaminsäure verwendet.

7. Verwendung eines Hapten-Träger-Konjugats nach einem der Ansprüche 1-3 in einem Verfahren, bei dem eine Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Ver­ fahren die Immunisierung eines Tieres zur Gewinnung von Antikörpern ist.

9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Ver­ fahren die Beschichtung von in immunologischen Testsystemen einge­ setzten Materialien ist.