DE4033714C2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- DE4033714C2 DE4033714C2 DE19904033714 DE4033714A DE4033714C2 DE 4033714 C2 DE4033714 C2 DE 4033714C2 DE 19904033714 DE19904033714 DE 19904033714 DE 4033714 A DE4033714 A DE 4033714A DE 4033714 C2 DE4033714 C2 DE 4033714C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- hapten
- spacer
- antibody
- conjugate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das in den Ansprüchen 1 bis 16 angegebene Hapten-
Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-
Reaktion. Weiterer Gegenstand der Erfindung sind
die zur Herstellung des Hapten-Analytikums geeigneten
Zwischenprodukte sowie
Verfahren zur Herstellung der Komponenten des Analytikums nach den Ansprüchen 17 bis 47.
Gegenstände der Erfindung sind schließlich auch die Verwendung
des Hapten-Protein-Konjugats zur Immunisierung gegen
Haptene und zur Markierung von Haptenen.
Unter Hapten versteht man bei der vorliegenden Erfindung
ein kleineres Molekül (Größenordnung 100 bis 500 Dalton),
das als isolierte Substanz nie oder lediglich marginal
immunogen wirkt. Ein Hapten fungiert in der Regel erst
nach Kopplung an ein Makromolekül als Epitop. Allerdings
ist das freie Molekül (Hapten) in der Lage, mit der
Antigen-Bindungsstelle eines spezifischen Antikörpers zu
reagieren.
Als Hapten-Analytikum, basierend auf dem Prinzip einer
Antigen-Antikörper-Reaktion, sind eine Reihe von Möglichkeiten
denkbar. Eine übersichtliche und verständliche
Darstellung entsprechender Methoden, wie z. B. RIA
oder ELISA findet sich in "Humane monoclonale Antikörper"
von D. Baron und U. Hartlaub, Stuttgart, New York:
Fischer, 1987, insbesondere Seiten 65-86. Im Zentrum
eines Hapten-Analytikums steht eine wirkungsvolle und
effektive Antigen-Antikörper-Reaktion. In der Regel wird
sich das Interesse auf die quantitative oder qualitative
Bestimmung des Haptens richten. Allerdings kann sehr wohl
auch eine entsprechende Bestimmung eines Hapten-Antikörpers
von großem Interesse sein. Häufig verhält es sich
auch so, daß gerade die Einzelkomponenten des Analytikums,
wie z. B. ein Hapten-Protein-Konjugat oder ein
anti-Hapten-Antikörper-Enzym-Konjugat wechselseitig für
die Herstellung derselben von Bedeutung sind. So wird z. B.
zur Produktion des anti-Hapten-Antikörpers in
erster Linie bereits ein Hapten-Protein-Konjugat benötigt.
Darüber hinaus ist das Hapten-Protein-Konjugat
möglicherweise wichtig bei der Aufarbeitung von, den
anti-Hapten-Antikörper produzierenden, Zellinien. Umgekehrt
kann wiederum das anti-Hapten-Antikörper-Enzym-
Konjugat wertvolle Dienste bei der Isolierung und Aufkonzentrierung
eines Hapten-Protein-Konjugats leisten.
In der Regel ist die Konjugation bzw. Kopplung eines
Haptens an ein Makromolekül, wie z. B. ein Protein,
nicht direkt möglich oder unerwünscht. Aus diesem Grunde
bedient man sich im Stand der Technik sogenannter Spacer.
Dabei handelt es sich um bifunktionale Moleküle kleineren
Molekulargewichts, die sowohl mit reaktiven Gruppen des
Haptens als auch des Proteins reagieren können. In der
Regel erweisen sich diese Kopplungen über Spacer als
unerwartet schwierig. Darüber hinaus besteht die Gefahr,
daß durch die Reaktionen mit einem Spacer das Epitop soweit
verändert wird, daß eine Eignung des Konjugats innerhalb
eines Analytikums oder zur Immunisierung (zwecks
Herstellung eines anti-Hapten-Antikörpers) nicht mehr
gegeben ist.
Ähnliche Überlegungen gelten auch für die Bereitstellung
eines anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugats. Von überwiegendem
Interesse sind solche Konjugate, bei denen das
Protein nicht nur als Träger, sondern vielmehr als radioaktiv
markiertes Tracer-Molekül oder Enzym wirksam werden
kann. Im ersteren Fall eignet sich das Konjugat dann eher
für einen RIA-, im letzteren eher für einen ELISA-Test.
Wichtig ist dabei z. B. auch, daß gegebenenfalls
die Enzymaktivität nicht infolge einer Kopplung verloren
gegangen ist.
Kleinere als Hapten bezeichnete Moleküle, die mit Trägerproteinen
konjugiert werden, können in vielfacher Weise
zum Einsatz gelangen. Hervorzuheben sind die Einsatzbereiche
Immunisierung, Herstellung von Festphasen-Matrizen,
Affinitätssäulen, sogenannten Tracer-Molekülen,
usw. Im allgemeinen sind solche Haptene von Interesse,
die innerhalb eines lebenden Organismus qualitativ und/
oder quantitativ erfaßt werden sollen. Wegen der Vielzahl
der möglichen Derivatisierung biochemischer Moleküle sei
hier nur die Phosphorylierung und Oxidation, sowie Reduktion,
erwähnt.
Es ist darüber hinaus generell möglich, synthetische Moleküle
(vor allem wasserlösliche) in gleicher Weise analytisch
zu bestimmen, wie das mit Substanzen der lebenden
Materie möglich ist. Analytisch interessant in diesem
Zusammenhang sind sicherlich auch kurzkettige Abbauprodukte
von Kunststoffen etc.
Eine besondere Schwierigkeit bei der Bereitstellung von
Hapten-Protein-Konjugaten besteht häufig darin, daß das
Hapten bei den üblichen Kopplungsbedingungen, wie sie für
Trägerproteine empfehlenswert sind, nicht oder nur
schlecht löslich sind. Es versteht sich von selbst, daß
die dann unter eher drastischen Bedingungen hergestellten
Konjugate weder besonders gut zur Immunisierung noch als
Tracer (z. B.: Hapten-Enzym-Konjugat) zu
gebrauchen sind.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich in erster
Linie mit Haptenen, die über eine Aminogruppe, gegebenenfalls
unter Hinzuziehung eines weiteren Spacers, mit
einem Protein, Enzym und dergleichen konjugiert werden.
Im besonderen Maße haben sich die Erfinder mit Pteridinen
und Pterinen, wie Neopterin, Biopterin, etc. beschäftigt.
Diese Substanzklasse ist von besonderem Interesse, da die
Bestimmung ihrer Konzentration innerhalb des menschlichen
oder tierischen Organismus zur Früherkennung von malignen
Tumoren und/oder viralen Erkrankungen wichtig ist. Grundlage
der Bestimmung dieser Substanzen im Serum oder anderen
Körperflüssigkeiten ist in der Regel ein kompetitives
Testverfahren, bei dem die Testsubstanz in der
spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem gleichzeitig
im Test vorhandenen Substanz-Protein-Konjugat konkurriert.
Bei diesem Verfahren ist entweder der Antikörper
oder das Hapten, gegebenenfalls als Konjugat vorliegend,
an eine Oberfläche immobilisiert. Ein besonderes Problem
bei der Herstellung von Pteridin- oder Pterin-Protein-
Konjugaten besteht darin, daß Substanzen wie Neopterin,
Biopterin und dergleichen in Wasser nur geringfügig löslich
sind. Lediglich bei sehr hohem (12) bzw. sehr
niedrigem pH-Wert (pH2) ist eine ausreichende Löslichkeit
vorhanden. Dieses ungünstige Verhalten führt dazu,
daß Protein-Konjugate mit diesen Substanzen nur schwer
zugänglich sind. Führt man nämlich eine Konjugation bei
entsprechenden höheren oder niederen pH-Werten durch, so
resultiert eine Denaturierung oder Ausfällung der Proteine.
Hohe Ausbeuten lassen sich mit den üblichen Verfahren
zumindest nicht erzielen.
Aus der EP-B-00 12 444 sind ein Diagnostizierverfahren,
insbesondere zur Früherkennung von malignen Tumoren und/
oder viralen Erkrankungen und Mittel zu seiner Durchführung,
bekannt, wobei eine dem tierischen oder menschlichen
Organismus entnommene Körperflüssigkeit auf den
Gehalt bestimmter Pteridine untersucht wird. Diese Patentschrift
erwähnt verschiedene Möglichkeiten der Konjugation
von Pterinen mit Proteinen. Insbesondere wird auch die
Möglichkeit einer Verknüpfung des Xanthopterins mit einem
immunogenen Träger über die 2-Aminogruppe erwähnt. Durch
eine Umsetzung des Xanthopterins mit Bernsteinsäure-Anhydrid
in der Wärme ergibt sich zunächst ein Hemisuccinat,
das in üblicher Weise mittels Carbodiimid z. B. an
Rinderserumalbumin konjugiert werden kann.
Die DE-A-30 25 226 beschreibt einen Radioimmunoassay zur
Bestimmung von Pterinen und dafür verwendbare Pterinderivate.
Auch diese Literaturstelle erwähnt die Möglichkeit
einer Konjugation eines Pterins auf ähnlichem Wege.
Zusammengefaßt kann gesagt werden, daß im Stand der Technik
Konjugate unter Verwendung von Carbodiimiden und einem
weiteren Spacer, der in die Pterine eine Carboxyl-Funktion
einführt, erhalten werden.
Bekannt ist auch die Ausnutzung von
Antigen-Antikörper-Reaktionen bei der Herstellung von
Antiseren oder Immuntoxinen, die therapeutische
Verwendung finden sollen.
So werden im Journal of Immunological Methods, 120
(1989), Seiten 133 bis 143, Wege zur Herstellung von
Peptid-Protein-Konjugaten aufgezeigt, um die Immunogenität
kleiner Peptide zu steigern. Damit sollen
Antiseren gegen spezielle Peptid-Fragmente hergestellt
werden, um in der Therapie eingesetzt zu werden.
EP-01 69 111 beschreibt die Kopplung von Antikörpern mit
zelltoxischen Substanzen und gibt Hinweise auf die
therapeutische Verwendung dieser Immuntoxine.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines neuen Hapten-Analytikums basierend auf dem Prinzip
einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese Aufgabe kann
allerdings nicht gelöst werden, ohne daß die hier zugrunde
liegenden Probleme vorgängig gelöst werden. Demnach ist
es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein
Hapten-Protein-Konjugat bereitzustellen, das zum einen in
hoher Ausbeute und zum anderen unter Beachtung der aufgezeigten
Anforderungen anfällt. Weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist in der Folge dann auch die Bereitstellung
eines Hapten-Antikörpers und eines
entsprechenden Konjugats, wobei zum einen die Probleme
bei der Immunisierung und zum anderen bei der Markierung
des Haptens (in einem Testsystem oder
Diagnostizierverfahren) Beachtung finden sollen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Hapten-Analytikum
basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-
Reaktion, das umfaßt:
- 1. ein Hapten, das mindestens eine reaktive Aminofunktion aufweist, wobei das Hapten aus der Gruppe der Thyronine, Antibiotika wie Tetracyclin oder Neomycin, Pteridine und Pterine gewählt ist und
- 2. ein Hapten-Protein-Konjugat, wobei
- 2.1. zwischen dem Hapten und Protein mindestens
ein bifunktionaler Spacer der Formel I
wobei
a = Bindung zur Aminofunktion,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
b = Bindung an Protein bzw. weiteren an das Protein gebundenen Spacer bedeuten,vorhanden ist, der - 2.1.1. mit einer funktionellen Gruppe an die Aminogruppe des Haptens bindet und
- 2.1.2. mit einer anderen funktionellen Gruppe entweder direkt oder mittels eines weiteren bifunktionalen Spacers über Thiol- Gruppen an das Protein koppelt;
- 2.2. das Protein die Funktion eines Trägermoleküls, gegebenenfalls die eines Tracer- Moleküls, erfüllt und
- 2.3. das gebundene Hapten die Funktion eines Epitops erfüllt; und/oder
- 2.1. zwischen dem Hapten und Protein mindestens
ein bifunktionaler Spacer der Formel I
wobei
- 3. ein Konjugat aus einem Antikörper, der das Hapten
gemäß 1. bindet und einem Protein, wobei
- 3.1. zwischen dem anti-Hapten-Antikörper und
dem Protein mindestens ein bifunktioneller
Spacer der Formel III
wobei
c = Bindung zum Protein oder anti- Hapten-Antikörper,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
d = Bindung zum anti-Hapten-Antikörper oder Protein bedeuten,vorhanden ist, wobei der Spacer - 3.1.1. mit einer funktionellen Gruppe an eine Amino- oder Amidogruppe des Proteins oder anti-Hapten-Antikörpers gebunden ist und
- 3.1.2. mit einer anderen funktionellen Gruppe über Schwefel-Schwefel-Bindungen eine Verknüpfung zum jeweils anderen Teil des Konjugats, gegebenenfalls unter Verwendung eines weiteren bifunktionalen Spacers, herstellt;
- 3.2. das Protein die Funktion eines Tracer-Moleküls, erfüllt.
- 3.1. zwischen dem anti-Hapten-Antikörper und
dem Protein mindestens ein bifunktioneller
Spacer der Formel III
wobei
Zu den erfindungsgemäß verwendeten Haptenen mit reaktiven
Aminofunktionen zählen Tyronine, wie T4, T3, T2, etc.,
Antibiotika, wie Tetrazyklin, Neomycin, etc., Pteridine
und Pterine, wie Neopterin, Biopterin und dergleichen.
Besonders bevorzugt ist allerdings das Neopterin bzw.
dessen unmittelbare, in Organismen auftretenden biochemischen
Derivate.
Vorzugsweise ist b im Spacer der Formel I gleich der allgemeinen
Formel
wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
P = Amino- oder Amidogruppe des Proteins.
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
P = Amino- oder Amidogruppe des Proteins.
Das bevorzugte Molverhältnis Hapten zu Protein beträgt
1 : 1 bis 1 : 7.
Als Proteinkomponente wird vorzugsweise Rinderserumalbumin
(BSA), Schafserumprotein oder Immunglobulin G (IgG) verwendet.
Vorzugsweise ist das Molverhältnis anti-Hapten-Antikörper
zu Protein etwa 1 : 1.
Der anti-Hapten-Antikörper ist vorzugsweise ein Immunglobulin
G (IgG). Dieser Antikörper kann sowohl poly- als
auch monoclonal sein.
Die Proteinkomponente des anti-Hapten-Antikörper-Protein-
Konjugats ist vorzugsweise ein Enzym, wie Peroxidase,
Phosphatase, β-Galaktosidase oder Urease. Besonders bevorzugt
ist die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase).
Die einzelnen zuvor genannten Konjugate sind vorzugsweise
als Teil eines ELISA-Kits verwendet (enzyme-linked immunosorbent
assay). Bei einem Kit zur Bestimmung eines
Haptens wird ein kompetitiver ELISA bevorzugt.
Bei dem erfindungsgemäßen Analytikum wird vorzugsweise
das Hapten-Protein-Konjugat als Festphasenmatrix immobilisiert.
Alternativ kann der anti-Hapten-Antikörper an
eine feste Oberfläche immobilisiert werden. In beiden
Fällen ist als Kunststoffoberfläche ganz besonders
Polystyrol bevorzugt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
zur Herstellung eines Hapten-Analytikums geeignetes
Zwischenprodukt, wie es zuvor in Form des Hapten-Protein-
Konjugats beschrieben wurde. Ohne dieses Zwischenprodukt
wird es nämlich kaum möglich sein, entsprechende anti-
Hapten-Antikörper in ausreichender Konzentration und mit
den erfindungsgemäßen Vorteilen herzustellen. Dieses
Konjugat dient dann zunächst zur Immunisierung und später
zur Aufarbeitung der anti-Hapten-Antikörper mittels Affinitätschromatographie.
Als erfindungsgemäße Konjugate
haben sich insbesondere bewährt:
- - Neopterin-IgG-Konjugat (Kaninchen-IgG)
- - Neopterin-Rinderserumalbumin-Konjugat
- - Neopterin-Schafserumprotein-Konjugat.
In einem kompetitiven ELISA-System haben sich darüber
hinaus Konjugate des Haptens mit Peroxidase, insbesondere
HRP, bewährt.
Im Prinzip ist die Auswahl der Träger-Proteine für die
Konjugate kaum beschränkt. Ein wichtiger Parameter für
die Auswahl geeigneter Trägerproteine ist eine gute
Bindung an die Festphasenmatrix, wie z. B. eine
Polystyrol-Kunststoffoberfläche. Für die Auswahl des mit
dem Hapten (insbesondere Neopterin) vorgesehenen Enzyms
spielt die Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität
die entscheidende Rolle.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist als weiteres
zur Herstellung eines Hapten-Analytikums geeignetes
Zwischenprodukt ein anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugat,
wie zuvor beschrieben. Vorzugsweise wird der Antikörper
zunächst mittels des erfindungsgemäßen Hapten-Protein-
Konjugats bereitgestellt. Dabei kommt sowohl eine
monoclonale als auch eine polyclonale Präparation in
Frage. Bei der Herstellung des anti-Hapten-Antikörpers
sowie des anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugats sollte
jeweils berücksichtigt werden, daß die Proteinkomponente
von derselben Spezies abstammt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein
Verfahren zur Herstellung eines Hapten-Protein-Konjugats,
mit der Maßgabe, daß das Hapten mindestens eine reaktive
Aminofunktion aufweist, wobei das Hapten vorzugsweise aus
der Gruppe der Pteridine und Pterine gewählt ist, gekennzeichnet
durch folgende Verfahrensschritte:
- 1. Umsetzung des Haptens mit dem bifunktionellen Spacer der Formel I, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Aminogruppe des Haptens unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
- 2. weitere Umsetzung des gebildeten Produktes mit dem Protein zum Hapten-Protein-Konjugat, wobei Sulfhydrilgruppen des Proteins oder des in vorgeschaltetem/en Reaktionsschritt/en entsprechend durch weitere Spacer modifizierten Proteins mit einer anderen funktionellen Gruppe des Spacers reagieren.
Vorzugsweise wird die Reaktion zwischen
Hapten und Spacer bei einem pH-Wert von 8 bis 9 durchgeführt.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Dimethylformamid
(DMF) als zusätzliches Lösungsmittel.
Gegebenenfalls ist es erforderlich in das Protein durch
vorgelagerte Reaktionsschritte Sulfhydrilgruppen einzuführen.
Diese lassen sich in der Regel sehr leicht durch
Behandlung mit Reduktionsmitteln erhalten. Bevorzugtes
Reduktionsmittel ist ein Thiol. Besonders bevorzugt
werden Mercapthoethanol (ME), Dithiothreitol (DTT) oder
Dithioerythritol (DTE).
Die Reduktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7
bis 8 durchgeführt. Vorzugsweise werden 10 bis 15 mol
Sulfhydrilgruppen pro mol Protein eingeführt.
Alternativ ist es möglich, in dem/den vorgeschalteten
Reaktionsschritt/en Sulfhydrilgruppen mittels eines weiteren
Spacers in das Protein einzuführen. Vorzugsweise
kann dieser weitere Spacer zunächst eine -S-S- oder
-S-Gruppe enthalten, die erst durch eine weitere
Reaktion, vorzugsweise mit Reduktionsmitteln, in eine
Sulfhydrilgruppe umgebildet wird. Besonders bevorzugt ist
in einem solchen Fall ein Spacer der allgemeinen Formel
wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Als besonders bevorzugt gilt hierbei N-Succinimidyl-S-
Acetylthioacetat (SATA).
Ein weiterer bevorzugter Spacer hat die allgemeine Formel
wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenwasserstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenwasserstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Besonders bevorzugt ist als ein solcher Spacer Succinimidyl-
3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP).
Mittels der vorstehend genannten vorgeschalteten Reaktionsschritte
werden vorzugsweise 10 bis 15 mol weiterer
Spacer pro mol Protein eingeführt.
Die weitere Umsetzung des aus Hapten und bifunktionalem
Spacer gebildeten Produkts mit einem Protein zum Hapten-
Protein-Konjugat wird vorzugsweise in einer auf den
pH-Wert 7,5 bis 9 gepufferten Lösung ausgeführt. Es hat
sich als günstig erwiesen, die nicht umgesetzten Sulfhydrilgruppen
im Anschluß daran durch an sich bekannte
Reagenzien zu blocken.
Vorzugsweise wird das Molverhältnis Hapten zu Protein auf
Werte von 1 : 1 bis 1 : 7 eingestellt.
Die vorzugsweise eingesetzten Proteine sind Rinderserumalbumin
(BSA), Schafserumprotein oder Immunglobulin G
(IgG).
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren zur Herstellung eines anti-Hapten-Antikörper-
Protein-Konjugats, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
- 1. Umsetzung des anti-Hapten-Antikörpers oder des Proteins mit dem bifunktionellen Spacer der Formel III, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Amino- oder Amidogruppe des anti-Hapten-Antikörpers oder des Proteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
- 2. weitere Umsetzung des so gebildeten Produktes mit dem Protein oder dem anti-Hapten-Antikörper zum gewünschten Konjugat, wobei durch vorgeschaltete/n Reaktionsschritt/e in den noch nicht in Verfahrensschritt 1) umgesetzten Reaktionspartner weitere bifunktionale Spacer eingebracht wurden und eine andere funktionelle Gruppe des an den in Verfahrensschritt 1) an den einen Reaktionspartner gebundenen bifunktionalen Spacers mit dem/den weiteren bifunktionalen Spacer/n unter Ausbildung von -S-S- Gruppen reagiert.
Vorzugsweise entstammt der Antikörper selber einer Immunisierung
mittels des erfindungsgemäßen Hapten-Protein-
Konjugats.
Der weitere bifunktionale Spacer
hat vorzugsweise die allgemeine Formel
wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Besonders bevorzugt ist hierbei der Spacer N-Succinimidyl-
S-Acetylthioacetat (SATA).
Vorzugsweise kann der weitere bifunktionale
Spacer auch die allgemeine Formel
haben, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Hierbei ist als Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithioacetat)
propionat (SPDP) bevorzugt.
In an sich bekannter Weise kann der im Verfahrensschritt
1) umgesetzte Spacer mit Sulfhydrilgruppen versehen
werden. Hierzu bietet sich insbesondere eine Umsetzung
mit Hydroxylamin (im Falle, daß SATA der Spacer ist) oder
Thiolen (im Falle, daß SPDP der Spacer ist) an.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren soll das Molverhältnis
anti-Hapten-Antikörper zu Protein so gewählt werden, daß
im Konjugat weder der Antikörper noch das Protein - im
Falle, daß das Protein ein Enzym ist - seine Aktivität
verliert.
Bevorzugte Enzyme innerhalb des Konjugats sind Peroxidase,
Phosphatase, ß-Galaktosidase oder Urease. Besonders bevorzugt
ist als Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase).
Das bevorzugte Molverhältnis anti-Hapten-Antikörper zu
Protein beträgt etwa 1 : 1.
Der anti-Hapten-Antikörper kann vorzugsweise poly- oder
monoclonal sein.
In bevorzugter Weise läßt sich im erfindungsgemäßen Verfahren
als anti-Hapten-Antikörper eine Immunglobulin G-
Fraktion verwenden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des
erfindungsgemäßen Zwischenproduktes Hapten-Protein-Konjugat
zur Immunisierung.
Darüber hinaus ist die Verwendung des Zwischenproduktes
anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugat zur Markierung
von Haptenen Gegenstand der Erfindung.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.
Als Modellsubstanz der Erfindung dient im folgenden
Neopterin (2-Amino-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)-4(3H)-
pteridinon).
In einer ersten Reaktion wird ein Spacer mit dem
Neopterin bei einem pH-Wert von 8 bis 9 umgesetzt.
Die Löslichkeit des Neopterins bei diesem pH-Wert
ist allerdings sehr gering. Deshalb wird Neopterin
zunächst einmal bei einem höheren pH-Wert gelöst. Im
Anschluß daran wird Dimethylformamid zugegeben und
der pH-Wert auf die gewünschte Größe eingestellt.
Schließlich wird zu dieser Lösung eine Lösung des
Spacers (hier: GMBS) in DMF zugegeben. Bei der
Reaktion liegt das Neopterin im Überschuß vor. Nach
etwa 4stündiger Reaktionsdauer bei Raumtemperatur
ist die Reaktion so gut wie abgeschlossen.
Als Trägerproteine für das Neopterin kommen eine
Reihe von Substanzen, wie
- Kaninchen-IgG
- (HRP)
- (HRP)
in Frage. In Abhängigkeit von dem gewählten Trägerprotein
ist es entweder möglich, aus diesem Sulfhydrilgruppen
freizusetzen oder durch Umsetzung mit
weiteren Spacern entsprechende Gruppen in das Protein
einzuführen.
Freie Sulfhydrilgruppen können relativ leicht durch
Reduktion von Disulfidbrücken mittels Reagenzien,
wie Dithiothreitol und dergleichen, in Proteine eingeführt
werden. Diese Reduktion wird in der Regel in
einer Pufferlösung bei einem pH-Wert zwischen 7 und
8 durchgeführt. Die Generierung von SH-Gruppen läßt
sich dadurch steuern, daß das Reduktionsmittel
mittels Gelfiltrationschromatographie und dergleichen
aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird. Bei den angegebenen
Bedingungen wurden etwa 10 bis 15 mol SH-
Gruppen pro mol IgG oder BSA erzeugt.
Alternativ lassen sich auch mittels bekannter
Methoden SH-Gruppen dadurch in das Trägerprotein
einführen, daß Spacer, wie SATA oder SPDP, eingeführt
werden. Auch bei dieser Reaktion, die in an
sich bekannter Weise durchgeführt wird, sollen 10
bis 15 mol Spacer pro Trägerprotein eingeführt
werden. In der Regel reagieren bei den oben genannten
Spacern die Aminogruppen der Proteine mit den zuletzt
genannten. Die freien SH-Gruppen werden in der
Regel durch Umsetzung mit Reduktionsmitteln (s.
zuvor) gewonnen.
Diese Kopplungsreaktion wird bei pH-Werten zwischen
7,5 und 9 durchgeführt. Hierbei ist es sinnvoll,
zunächst einen Teil des Dimethylformamids zu entfernen
und schließlich die Neopterin-Spacer-Lösung
in eine verdünnende Pufferlösung aufzunehmen. Nach
Zugabe einer Lösung des modifizierten Proteins läßt
man die Lösung über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden
inkubieren. Nach Abschluß der Reaktion werden
die nicht abreagierten SH-Gruppen mit z. B. Jodacetamid
blockiert. Die übrigen Reaktionsteilnehmer
werden im Anschluß daran nach an sich bekannten
Methoden aus der Lösung entfernt.
Bei der eben beschriebenen Methode, insbesondere bei
Verwendung von IgG, BSA, Neopterin und GMBS als
Spacer, wird ein Neopterin-Protein-Verhältnis von 1
bis 7 mol zu 1 mol erreicht.
Mono- bzw. polyclonale anti-Neopterin-Antikörper werden
in an sich bekannter Weise durch Verwendung der erfindungsgemäßen
Neopterin-Protein-Konjugate gewonnen.
Gereinigte IgG-Fraktionen (anti-Neopterin-Antikörper)
werden nach bekannten Methoden leicht mit Spacern
versehen (beispielsweise SATA, SPDP). Aus diesen
Spacern werden dann auch leicht, durch z. B.
reduktive Umsetzung mit Mercapthoethanol, SH-Gruppen
freigesetzt.
In der zuvor beschriebenen Weise gelingt auch die
Umsetzung von Horse Radish Peroxidase (HRP) mit SPDP
oder SATA.
HRP-SPDP koppelt unter milden Bedingungen an IgG-
(SPDP oder SATA). Typische Reaktionsausbeuten betragen
1 bis 3 mol HRP pro mol IgG.
Claims (49)
1. Hapten-Analytikum, basierend auf dem Prinzip einer
Antigen-Antikörper-Reaktion, das umfaßt
- 1. ein Hapten, das mindestens eine reaktive Aminofunktion aufweist, wobei das Hapten aus der Gruppe der Thyronine, Antibiotika wie Tetracyclin oder Neomycin, Pteridine und Pterine gewählt ist und
- 2. ein Hapten-Protein-Konjugat, wobei
- 2.1. zwischen dem Hapten und Protein mindestens
ein bifunktioneller Spacer
der Formel I
wobei
a = Bindung zur Aminofunktion,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
b = Bindung an Protein bzw. weiteren an das Protein gebundenen Spacer bedeuten,
vorhanden ist, der - 2.1.1. mit einer funktionellen Gruppe an die Aminogruppe des Haptens bindet und
- 2.1.2. mit einer anderen funktionellen Gruppe entweder direkt oder mittels eines weiteren bifunktionalen Spacers über Thiol-Gruppen an das Protein koppelt;
- 2.2. das Protein die Funktion eines Trägermoleküls, gegebenenfalls die eines Tracer-Moleküls, erfüllt und
- 2.3. das gebundene Hapten die Funktion eines Epitops erfüllt; und/oder
- 2.1. zwischen dem Hapten und Protein mindestens
ein bifunktioneller Spacer
der Formel I
wobei
- 3. ein Konjugat aus einem Antikörper, der das
Hapten gemäß Anspruch 1, 1. bindet und einem
Protein, wobei
- 3.1. zwischen dem anti-Hapten-Antikörper
und dem Protein mindestens ein bifunktioneller
Spacer der Formel III
wobei
c = Bindung zum Protein oder anti- Hapten-Antikörper,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
d = Bindung zum anti-Hapten-Antikörper oder Protein bedeuten,
vorhanden ist, wobei der Spacer - 3.1.1. mit einer funktionellen Gruppe an eine Amino- oder Amidogruppe des Proteins oder anti-Hapten-Antikörpers gebunden ist und
- 3.1.2. mit einer anderen funktionellen Gruppe über Schwefel-Schwefel-Bindungen eine Verknüpfung zum jeweils anderen Teil des Konjugats, gegebenenfalls unter Verwendung eines weiteren bifunktionalen Spacer, herstellt;
- 3.2. das Protein die Funktion eines Tracer- Moleküls erfüllt.
- 3.1. zwischen dem anti-Hapten-Antikörper
und dem Protein mindestens ein bifunktioneller
Spacer der Formel III
wobei
2. Analytikum gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß b der Formel I gleich der allgemeinen Formel
ist, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
P = Amino- oder Amidogruppe des Proteins.
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
P = Amino- oder Amidogruppe des Proteins.
3. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis Hapten
zu Protein 1 : 1 bis 1 : 7 beträgt.
4. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin
(BSA), Schafserumprotein oder Immunglobulin
G (IgG) ist.
5. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Molverhältnis anti-
Hapten-Antikörper zu Protein etwa 1 : 1 ist.
6. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper
ein Immunglobulin G (IgG) ist.
7. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper
poly- oder monoclonal ist.
8. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein ein Enzym, wie
Peroxidase, Phosphatase, β-Galaktosidase oder Urease,
ist.
9. Analytikum gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Peroxidase HRP
ist.
10. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß es Teil eines ELISA-Kits
ist.
11. Analytikum gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß das Kit für einen kompetitiven ELISA zusammengestellt
ist.
12. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hapten-Protein-
Konjugat immobilisiert als Festphasenmatrix
vorliegt.
13. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper
immobilisiert als Festphasenmatrix vorliegt.
14. Analytikum gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die Festphasenmatrix eine Kunststoffoberfläche
aus Polystyrol ist.
15. Hapten-Protein-Konjugat, wie in 1. und 2. im Anspruch 1
bezeichnet, geeignet zur Herstellung eines Hapten-
Analytikums nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
16. Anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugat, wie in 3.
im Anspruch 1 bezeichnet, geeignet zur Herstellung
eines Hapten-Analytikums nach einem der Ansprüche 1
bis 14.
17. Verfahren zur Herstellung eines Hapten-Protein-Konjugats,
wie in 1. und 2. des Anspruchs 1 bezeichnet,
gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
- 1. Umsetzung des Haptens mit dem bifunktionellen Spacer der Formel I, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Aminofunktion des Haptens unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
- 2. weitere Umsetzung des gebildeten Produkts mit dem Protein zum Hapten-Protein-Konjugat, wobei Sulfhydrilgruppen des Proteins oder des in vorgeschaltetem/en Reaktionsschritt/en entsprechend durch weitere Spacer modifizierten Proteins mit einer anderen funktionellen Gruppe des Spacers reagieren.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reaktion zwischen
Hapten und Spacer bei einem pH-Wert von 8 bis 9
durchgeführt wird.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß als zusätzliches Lösungsmittel Dimethylformamid
(DMF) zugegeben wird.
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem/den vorgeschaltetem/en
Reaktionsschritt/en in das Protein Sulfhydrilgruppen
eingeführt werden.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
daß die Sulfhydrilgruppen durch Reduktion erzeugt
werden.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Reduktion Thiol eingesetzt wird.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,
daß das Thiol Mercapthoethanol (ME), Dithiothreitol
(DTT) oder Dithioerythritol (DTE) ist.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reduktion bei einem
pH-Wert von 7 bis 8 durchgeführt wird.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, daß 10 bis 15 mol Sulfhydrilgruppen
pro mol Protein eingeführt werden.
26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem/den vorgeschaltetem/en
Reaktionsschritt/en Sulfhydrilgruppen mittels
eines weiteren Spacers in das Protein eingeführt
werden.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere Spacer zunächst eine -S-S- oder -S-
Gruppe enthält, die erst durch eine weitere Reaktion,
vorzugsweise mit Reduktionsmitteln, in eine Sulfhydrilgruppe
umgebildet wird.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere Spacer die allgemeine Formel
hat, wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere Spacer N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetat
(SATA) ist.
30. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere Spacer die allgemeine Formel
hat, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)
propionat (SPDP) ist.
32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 31, dadurch
gekennzeichnet, daß das Protein durch Einführung
von 10 bis 15 mol weiterer Spacer pro mol
Protein modifiziert wird.
33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 32, dadurch
gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt 2)
in einer auf den pH-Wert 7,5 bis 9 gepufferten
Lösung ausgeführt wird.
34. Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet,
daß die nicht umgesetzten Sulfhydrilgruppen durch an
sich bekannte Reagenzien geblockt werden.
35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 34, dadurch
gekennzeichnet, daß das Molverhältnis Hapten
zu Protein auf Werte von 1 : 1 bis 1 : 7 eingestellt
wird.
36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 35, dadurch
gekennzeichnet, daß als Protein Rinderserumalbumin
(BSA), Schafserumalbumin oder Immunglobulin
G (IgG) eingesetzt wird.
37. Verfahren zur Herstellung eines anti-Hapten-Antikörper-
Protein-Konjugats gemäß 3. des Anspruchs 1,
gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
- 1. Umsetzung des anti-Hapten-Antikörpers oder des Proteins mit dem bifunktionellen Spacer der Formel III, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Amino- oder Amidogruppe des anti-Hapten-Antikörpers oder des Proteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
- 2. weitere Umsetzung des so gebildeten Produktes mit dem Protein oder dem anti-Hapten-Antikörper zum gewünschten Konjugat, wobei durch vorgeschaltete/n Reaktionsschritt/e in den noch nicht in Verfahrensschritt 1) umgesetzten Reaktionspartner weitere bifunktionale Spacer eingebracht wurden und eine andere funktionelle Gruppe des an den in Verfahrensschritt 1) an den einen Reaktionspartner gebundenen bifunktionalen Spacers mit den/dem weiteren bifunktionalen Spacer/n unter Ausbildung von -S-S-Gruppen reagiert.
38. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere bifunktionale
Spacer die allgemeine Formel
hat, wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
39. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet,
daß der Spacer N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetat
(SATA) ist.
40. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,
daß der weitere bifunktionale
Spacer die allgemeine Formel
hat, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
41. Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet,
daß der Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithioacetat)
propionat (SPDP) ist.
42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 41, dadurch
gekennzeichnet, daß das Molverhältnis anti-
Hapten-Antikörper zu Protein so gewählt wird, daß im
Konjugat weder der Antikörper noch das Protein seine
Aktivität verliert.
43. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 42, dadurch
gekennzeichnet, daß als Proteine Enzyme, nämlich Peroxidase,
Phosphatase, β-Galaktosidase oder Urease eingesetzt
werden.
44. Verfahren gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet,
daß die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase)
ist.
45. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 44, dadurch
gekennzeichnet, daß das Molverhältnis anti-
Hapten-Antikörper zu Protein etwa 1 : 1 beträgt.
46. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 45, dadurch
gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper
poly- oder monoclonal ist.
47. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 46, dadurch
gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper
ein Immunglobulin G (IgG) ist.
48. Verwendung des Hapten-Protein-Konjugates gemäß Anspruch 15
zur Immunisierung.
49. Verwendung des Anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugats gemäß Anspruch 16
zur Markierung von Haptenen.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904033714 DE4033714C3 (de) | 1990-10-24 | 1990-10-24 | Neues Hapten-Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion |
PCT/EP1991/002005 WO1992007876A1 (de) | 1990-10-24 | 1991-10-23 | Ligand-carrierprotein-konjugat |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904033714 DE4033714C3 (de) | 1990-10-24 | 1990-10-24 | Neues Hapten-Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4033714A1 DE4033714A1 (de) | 1992-04-30 |
DE4033714C2 true DE4033714C2 (de) | 1993-01-21 |
DE4033714C3 DE4033714C3 (de) | 1995-09-07 |
Family
ID=6416896
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19904033714 Expired - Fee Related DE4033714C3 (de) | 1990-10-24 | 1990-10-24 | Neues Hapten-Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4033714C3 (de) |
WO (1) | WO1992007876A1 (de) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL98845A0 (en) * | 1990-07-19 | 1992-07-15 | Merck & Co Inc | Coconjugate vaccines comprising immunogenic protein,hiv related peptides,and anionic moieties,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
US5274122A (en) * | 1992-10-15 | 1993-12-28 | Merck & Co., Inc. | Acidic derivatives of homocysteine thiolactone |
CA2141739A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Alfons M. Verbruggen | Method for preparing a metal-radionuclide-labelled protein |
AU2206701A (en) * | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Acambis Research Limited | A reversible linkage technology for controlled conjugation |
US7902332B2 (en) | 2006-11-30 | 2011-03-08 | General Electric Company | Fluorine-labeled compounds |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4529712A (en) * | 1981-09-18 | 1985-07-16 | Research Corporation | Coated cells and their use |
JPH06100601B2 (ja) * | 1983-11-30 | 1994-12-12 | 株式会社東芝 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
FR2566271B1 (fr) * | 1984-06-20 | 1986-11-07 | Sanofi Sa | Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention |
CA1340387C (en) * | 1987-10-30 | 1999-02-09 | Carol A. Schlesinger | Heterobifunctional coupling agents |
ES2099699T3 (es) * | 1989-05-02 | 1997-06-01 | Abbott Lab | Fijacion covalente de los miembros de union especificos a las fases solidas. |
DE3919923A1 (de) * | 1989-06-19 | 1990-12-20 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
DE3922608A1 (de) * | 1989-07-10 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Verbindungen aus biopolymeren und effektorsubstanzen, die ueber optisch aktive aminosaeurederivate verknuepft sind, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
-
1990
- 1990-10-24 DE DE19904033714 patent/DE4033714C3/de not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-10-23 WO PCT/EP1991/002005 patent/WO1992007876A1/de active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE4033714A1 (de) | 1992-04-30 |
WO1992007876A1 (de) | 1992-05-14 |
DE4033714C3 (de) | 1995-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69213240T2 (de) | Wasserlösliche reagenzien und konjugate auf polymerbasis, die vom divinylsulfon abgeleitete reste enthalten | |
DE2808523C2 (de) | ||
DE3650513T2 (de) | Verzögerter immunologischer Test in fester Phase | |
DE2323467A1 (de) | Verfahren zum nachweis und zur bestimmung von haptenen | |
DE2430357C2 (de) | Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Feststellung von Immunoglobulin der IgG-Klasse | |
DE2951678A1 (de) | Immunologische bestimmung mit hilfe von lectin | |
DD209578A5 (de) | Verfahren zur herstellung von immunoenzymatischen konjugaten | |
DE2651680A1 (de) | Neue traeger mit seitenketten, verfahren zu ihrer herstellung sowie verfahren zur fixierung organischer verbindungen mit einem glucid-rest auf diesen traegern und die darauf resultierenden produkte | |
DE2902400A1 (de) | Verbesserter, spezifischer doppelrezeptor-bindetest fuer einen probenliganden | |
DE3850931T2 (de) | Heterobifunktionelle Kupplungsmittel. | |
EP0451810B1 (de) | Hapten-Biotin-Konjugate und ihre Verwendung | |
DE3006709A1 (de) | Homogenes verfahren zur kompetitiven bestimmung von liganden | |
DD201447A5 (de) | Verfahren zur herstellung von als antikrebsmittel wirksamen immunoglobulin-konjugaten | |
DE4033714C2 (de) | ||
EP0183901B1 (de) | Bifunktionelle Haptene, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
DE2755008A1 (de) | Verfahren zur immunologischen bestimmung mit hilfe von enzym-markierungen | |
DE3224217A1 (de) | Enzymimmunoassay-methode zur qualitativen und quantitativen bestimmung von substanzen | |
DE69219913T2 (de) | Ergänzung von Oberflächenrezeptoren | |
DE3525911A1 (de) | Konjugat fuer die enzymimmunobestimmung | |
DE4218257A1 (de) | Verfahren zur immunchemischen Bestimmung eines Analyten | |
DE3806431A1 (de) | Verfahren zur herstellung einer festphasenmatrix | |
DE19529250C1 (de) | Hapten-Träger-Konjugate mit hoher, definierter Kopplungsrate | |
DE3883145T2 (de) | Verfahren zur Messung von humanen Insulin. | |
DE3114362C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums, Verwendung dieses Verfahrens zur Gewinnung von Säugetierzellen, welche fähig sind, einen solchen Antikörper zu erzeugen und Verwendung des so hergestellten Antikörpers bzw. Antiserums zur Immunoprüfung | |
EP0289003B1 (de) | Immunchemisches Verfahren und Reagenz zur Bestimmung eines polyvalenten Antigens in einer flüssigen Probe |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
D2 | Grant after examination | ||
8363 | Opposition against the patent | ||
8366 | Restricted maintained after opposition proceedings | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: HENNING BERLIN ANLAGEN GMBH, 12099 BERLIN, DE |
|
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: B.R.A.H.M.S DIAGNOSTICA GMBH, 12099 BERLIN, DE |
|
8305 | Restricted maintenance of patent after opposition | ||
D4 | Patent maintained restricted | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: KORNFELD, SHAUL, DR., 14167 BERLIN, DE |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |