DE2910998A1 - Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung

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DE2910998A1 DE19792910998 DE2910998A DE2910998A1 DE 2910998 A1 DE2910998 A1 DE 2910998A1 DE 19792910998 DE19792910998 DE 19792910998 DE 2910998 A DE2910998 A DE 2910998A DE 2910998 A1 DE2910998 A1 DE 2910998A1
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Description

Beschreibung
An Makromoleküle gebundene Enzyme werden in typischer Weise für die Auffindung und Bestimmung von Substanzen verwendet, die in sehr geringen Mengen, zum Beispiel in Nanogramm-Mengen in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin und Serum enthalten sind. Zur Bindung an Makromoleküle kann eine Vielzahl von Enzymen verwendet werden. Häufig werden jedoch Enzyme ausgewählt, die sich mit großer Empfindlichkeit nachweisen lassen. Für den makromolekularen Anteil des Moleküls steht eine Vielzahl von Aminogruppen enthaltenden Verbindungen zur Verfügung, einschließlich Nucleinsäuren, Proteinen, Hormonen, Antigenen und Allergenen, die Aminogruppen enthalten.
Die an Makromoleküle gebundenen Enzyme werden in einer Bindungsreaktion mit einem polyfunktionellen Kupplungsreagenz hergestellt, welches das Enzym und das Makromolekül durch Reaktion an einer oder mehreren der reaktionsfähigen Gruppen der Reaktionsteilnehmer zusammen bindet. Die Produkte aus Enzym und Makromolekülen sollten hohe Stabilität besitzen, hoch spezifisch sein und sich in gut reproduzierbarer Weise herstellen lassen.
Bei einigen Bindungsreaktionen zur Herstellung dieser enzymhaltigen Produkte hat man vorgeschlagen, eine Konditionierverbinduncj zu verwenden, zum Beispiel ein Polyamin, um die Spezifität des Enzymproduktes zu verbessern und so aufgrund des geringen
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Signal-zu-Geräusch Verhältnisses während der Auffindung im immunochemischen Test das Aufspürungsverfahren zu verbessern. Die Herstellung von an Makromoleküle gebundenen Enzymen unter Verwendung von Bindungsreagenzien und Konditionierverbxndungen ist in der US-Patentschrift 40 02 532, auf die vorliegend Bezug genommen wird, beschrieben.
Für die Anwendung bei der immunologischen Untersuchung von Insulin hat man für die Herstellung eines an ein insulinhaltiges Produkt gebundenen Enzyms ein neues Bindungsreagenz vorgeschlagen. Dieses besteht aus m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-ester (MBS), einem bifunktionellen Reagenz, das die Aminogruppen des Insulins durch Umsetzung mit der N-Hydroxysuccinimid-ester-Gruppe acyliert und mit dem Enzym durch Anlagerung der Thiol-Gruppen an die Maleimid-Gruppe Thioesterbindungen bildet. Dieses Bindungsreagenz wurde zur Herstellung eines enzymatisch wirksamen, immunoreaktionsfähigen /i-D-Galactosidase-MBS-Insulin verwendet, ver-. gleiche J. Biochem., Bd. 79, S. 233-236 (1976), "Enzyme Coupled Immunoassay of Insulin Using a Novel Coupling Reagent", Kitagawa T. und Aikawa T., worauf vorliegend ebenfalls Bezug genommen wird. Obgleich dieses MBS-Bindungsreagenz in mancherlei Hinsicht zufriedenstellend ist, sind Enzymprodukte mit größerer Beständigkeit und größerer Spezifität sowie Empfindlichkeit erwünscht.
Die Erfindung betrifft neue Bindungsreagenzien und deren Herstellung, die Herstellung von enzymhaltigen Produkten unter Verwendung
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dieser Bindungsreagenzien sowie die Verwendung der enzymhaltigen Reaktionsprodukte in immunologischen Untersuchungen.
Die erfindungsgemäßen polyfunktionellen Bindungsreagenzien, die enzymhaltige Produkte mit spezifischer Wirkung in hoher Ausbeute ergeben, umfassen allgemein ausgedrückt ein Reagenz, das zuerst mit den Aminogruppen des Makromoleküls und dann mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms reagiert. Es hat die folgende Formel:
Γ*ττ I r* π
in der X ein Halogenatom, vorzugsweise Jod ist; η bedeutet eine ganze Zahl von etwa 1 bis 8, vorzugsv/eise von 1 bis 4 und R ist ein beliebiger Rest, der mit den Aminogruppen des Makromoleküls zu reagieren vermag. Solche Reste sind zum Beispiel:
a) Hydroxylgruppen -OH
Ii
b) N-Succinimidgruppen -0-N. I
Il ^
0
0
Il j j
c) Halogensäuregruppen -0-C- CH„ -X
insbesondere eine Jodacetylgruppe
0
-0-C-CH2-I
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d) Aminobenzoat-N-succinimid Gruppen
RO" 1 C-CU
I I / ν Il y^* »-"ρ
-N-( 0 >-C-O-N tf I
C-CH0
Il *·
in der R1 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe, zum Beispiel die Methylgruppe ist.
R kann auch eine andere mit Aminogruppen reagierende Gruppe sein.
Als Bindungsreagenz wird am meisten N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB) bevorzugt, das die folgende Strukturformel
r- I 0 H 0 C ΓΗ
I I / ' " \ jr . j
T __ j ("1LT J C-TvJ-/ ΓΛ \ /""» 0""T4J 1
L 2Jn=1 ^C-CH0
11 ^
Das SIAB ergibt in unerwartet hoher Ausbeute enzymhaltige Produkte mit spezifischer immunochemischer, Enzym- und Konjugatwirkung. Mit SIAB hergestellte enzymhaltige Produkte weisen im Vergleich zu solchen, die mit bekannten Bindungsreagenzien, wie MBS hergestellt wurden, hohe Stabilität und hohe Spezifität auf.
Besonders brauchbare Bindungsreagenzien sind zum Beispiel Jodessigsäure, Jodessigsäureanhydrid und N-Hydroxysuccinimidester der Jodessigsäure.
Jodessigsäure reagiert in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimide, wie i-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid mit
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-NH-j-Gruppen. Jodessigsäureanhydrid reagiert direkt mit den -NH „-Gruppen. In anderen Fällen werden die Bindungsreagenzien durch Umsetzung der ausgewählten halogenierten organischen Säure oder des Säureanhydrids in einem Lösungsmittel mit dem mit Aminogruppen reagierenden Teil R des Moleküls hergestellt, worauf das Reagenz gewonnen wird. Zum Beispiel kann man SIAB durch Umsetzung von Jodessigsäureanhydrid mit p-Aminobenzosäure in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan herstellen. Das entstehende Zwischenprodukt wird kristallisiert und der aktive Ester durch Umsetzung des Zwischenprodukts mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines Carbodiimids in einem organischen Lösungsmittel hergestellt, zum Beispiel unter Verwendung von Dicyclohexylcorbodiimid in Tetrahydrofuran. Das gebildete Produkt, das kristallisiert werden kann, besteht aus SIAB.
Die erfindungsgemäßen enzymhaltigen Produkte werden durch eine Bindungsreaktion zwischen dem mit Aminogruppen reagierenden Substituenten des erfindungsgemäß verwendeten Bindungsreagenzes und dem Makromolekül und anschließend durch Umsetzung des Halogensubstituenten mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms hergestellt. Wesentlich bei der Herstellung der enzymhaltigen Produkte ist, daß erst die Umsetzung der mit den Aminogruppen des Proteins oder eines anderen Makromoleküls reagierenden Gruppe R, wie der Succinimidylgruppe, und dann die Umsetzung von X mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms durchgeführt wird. Anderenfalls würde die Gruppe R mit der Aminogruppe des "Enzyms reagieren, was zu geringeren
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Ausbeuten und einer geringeren Spezifität des so hergestellten Enzymproduktes führen würde.
Das erfindungsgemäße Bindungsreagenz ermöglicht die Herstellung eines enzymhaltigen Produktes bei hoher Bindungsspezifität, wie das nachfolgende Reaktionsschema mit SIAB zeigt.
O OH 0 "
ι , ν it ,C-UH
0 >-C-O-N^. I
11 ^
NH?-Protein (z.B. Insulin)
0 H 0 H
I-CH„-C-O-N-/ 0 "/-C-N-Protein
Enzym-SH OH OH
Enzym-S-CH2-C-O-N-( Q )>-C-N-Protein
Im allgemeinen verläuft das Herstellungsverfahren wie folgt:
R + NH2-Protein
2jn o
- CH2 L-C-NH-Protein + SH-Enzym I—· J
Protein + HX
2 ^C-NH-
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In typischer Weist wird SIAB in wäßriger Lösung unter milden Bedingungen mit den Aminogruppen der Makromoleküle umgesetzt. Zum Beispiel setzt man SIAB mit Immunoglobulin in O,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,0 um. Das gebildete Immunoglobulinderivat wird dann mit einem Enzym umgesetzt, das Sulfhydrylgruppen enthält. Ein solches Enzym ist aus E. coli isolierte ß-D-Galactosidase (BG). Die BG wird unter milden wäßrigen Bedingungen mit dem Immunoglobulinderivat umgesetzt. Das gebildete Produkt aus BG und Makromolekül besitzt hohe Enzymaktivität, immunologische Spezifität und wird in außerordentlich hoher Ausbeute erhalten. So werden zum Beispiel tatsächlich das gesamte Immunoglobulin oder ein anderes Makromolekül und die BG stöchiometrisch mit-einander verbunden. Die Ausbeute an so erhaltenem BG-Konjugat ist überraschend hoch. Die Produkte aus BG und entweder Antigenen oder Antikörpern, die mit SIAB hergestellt werden, sind für Enzym-Immunountersuchungen auf verschiedene Antigene oder Antikörper, einschließlich Hepatitis, Serumproteine, Hormone und Arzneimittel brauchbar.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes über SH-Gruppen reagierende Enzym eingesetzt werden, zum Beispiel saure und alkalische Phosphatasen, Alkohol-Dehydrogenase, Katalase, Glucose- und Galactose-Oxidasen, oC- und ß-Galactosidasen, Lactat-Dehydrogenase, Lysozym, Luciferase , Peroxidasen, Ribonuclease , Rodhanase und Esterasen.
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Brauchbare über NH„-Gruppen reagierende Makromoleküle umfassen Desoxy- und Ribonucleinsäuren, Virusprotreine, Allergene, Immunogluboline, Blutgruppenstoffe, Transplantations-Antigene, carcinogenes embryonisches Antigen, c<--Fetoprotein und andere für Tumore spezifische Antigene, Wachstumshormone und andere Polypeptidhormone.
Das SIAB ist besonders wertvoll für die Herstellung von Produkten aus Immunoglobulin und bakteriellem Enzym yÖ-D-Galactosidase. Die erfindungsgemäß herstellbaren enzymhaltigen Produkte werden für die Auffindung von Antigenen, Antikörpern', Allergenen, Hormonen und anderen Makromolekülen in niedrigen Nanogramm-Mengen oder noch geringeren Mengen unter Anwendung immunologischer Untersuchungensmethoden verwendet.
Die erfindungsgemäßen Produkte sind insbesondere brauchbar für die Auffindung von Makromolekülen, vor allem für die Auffindung und Bestimmung von Nanogramm-Mengen an Substanzen in biologischen Flüssigkeiten, wie die Auffindung von Antikörpern, Antigenen, Allergenen, Hormonen und dergleichen. Die SIAB-Enzym Produkte finden insbesondere in immunologischen Untersuchungsverfahren auf Hepatitis Anwendung. Bei den bis jetzt hierfür bekannten Verfahren ist ein wiederholtes Waschen des Patientenserums auf dem festen Träger, d. h. einer Antigenscheibe erforderlich, um nicht spezifische absorbierte Serumproteine zu entfernen. Die erfindungsgemäßen SIAB-Enzym Produkte ermöglichen eine immunologische Untersuchung in einer Stufe. Da das gesamte oder im wesentlichen gesamte spezifische Enzym an den Antikörper gebunden
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wird, ist bei den SIAB-Enzym Produkten nur ein begrenztes Waschen oder kein Waschen notwendig.
Die erfindungsgemäßen Produkte können in den bekannten Verfahren zur Auffindung von Antikörpern angewandt werden, wie sie zum Beispiel in der US-Patentschrift 40 02 532 beschrieben sind. Diese Verfahren besteher, darin, daß man die nachzuweisenden Antikörper oder andere Makromoleküle zum Beispiel durch Absorption an einen festen Träger oder ein absorbierendes Material, zum Beispiel eine Scheibe bindet. So kann man zu dem festen Träger eine Flüssigkeit, wie Serum oder Urin geben, um die darin enthaltenen Antikörper an das Trägermaterial zu binden, zum Beispiel das Serum mit der Scheibe inkubieren, das Trägermaterial zur Entfernung nicht gebundener Komponenten der Flüssigkeit, wie von nicht spezifisch gebundenen und absorbierten Serumproteinen von der Scheibe waschen, das enzymhaltige Produkt zu dem gewaschenen Träger geben, zum Beispiel durch Inkubieren der Scheibe mit einem Enzym-SIAB-Protein Produkt, so daß das spezifische Enzym im Verhältnis zur an die Scheibe gebundenen Menge Antikörper an den Träger gebunden wird und so ein Maß für das IgE des Patienten oder andere quantitativ zu bestimmende Makromoleküle darstellt. Gegebenenfalls kann man den Träger zur Entfernung nicht gebundenen unspezifischen Enzym-Produkts von der Trägerscheibe waschen und die enzymatisch^ Wirkung des gebundenen Enzym-Produkts als Maß der Menge der gebundenen Antikörper ermitteln.
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Bei einer solchen Bestiiranungsmethode führt die hohe spezifische Ausbeute an Enzym-Produkt im Vergleich zu den bekannten Verfahren zu einem hohen Bindungsgrad an das Trägermaterial, was sich zum Beispiel in einem unerwartet hohen Signal-zu-Geräusch Verhältnis der Bestimmungsmethode äußert. Mit anderen Worten, das erfindungsgemäße Enzym-Produkt erhöht die Empfindlichkeit und die Spezifität durch die spezifische Bindung des Enzym-Produkts an den festen Träger und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit bei der Aufspürung der Antikörper mit geringeren Mengen an Enzym-Produkt, und dies in Gegenwart beeinträchtigender Substanzen, was bei den bekannten Enzym-Produkten nicht möglich war. Wenn man zum Beispiel das SIAB-Bindungsreagenz bei menschlichem Serum anwendet, das eine bekannte Menge Antigen enthält, ist das Enzym-Produkt ziemlich beständig, und bei etwa der Hälfte der Menge an Enzym zur Bildung eines spezifischen Bindungsproduktes ist die ermittelte Menge an gebundenem Enzym etwa 3 1/2 mal so groß wie bei Verwendung des MBS-Bindungsreagenzes, was eine etwa 15fache ' Verbesserung darstellt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1:
Herstellung des SIAB-Bindungsreagenzes N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB), das bevorzugte
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Bindungsmittel gemäß der Erfindung wurde gemäß folgendem Reaktionsschema hergestellt:
0 Il
1) (1-CH2-C2-Z-O + H2N- <_0> -C-OH >
(D Jodessigsäureanhydrid (ID
p-Aminobenzoessigsäure
O H Il I 1-CH2-C-N-
(III)
-COOH + 1-CH2-COOH
0 II
Il I
2) 1-CH2-C-N- ( 0 } -COOH + <U> -N=C=N
(III) Dicyclohexylcarbodiimxd
(IV)
+ OH
I
N
O=C OO
H2C-CH2
N-Hydroxysuccinimid (V)
Fällung und überstehende Flüssigkeit
0 II 0 H
Il ι ^^^ H /C-CH;
I-CHp-C-N- <0> -C-O-N ά V-^ NC-CH
!I 0 aus der überstehenden Flüssigkeit zur Trokkene eingedampft
(VI) SIAB
909840/0674 BAD
354 mg der Verbindung I (10 ,uMol)wurden in 5 ml üioxan gelost. Dazu wurden 68,6 mg der Verbindung II (500 ,uMol) in 2,5 ml Dioxan gegeben, worauf man das Ganze 5 Stunden bei Raumtemperatur (20
bis 25° C) unter Lichtausschluß und dann 2 Tage bei 4 C reagieren ließ. Es bildete sich eine weiße Fällung aus der Verbindung III, die abzentrifugiert und dreimal mit jeweils 0,5 ml Ether verrieben wurde. Das erhaltene weiße Pulver wurde mit heißer Luft getrocknet. Ausbeute 160 mg. 86,2 mg (4 " 10 Hol) der Verbin-
-4 dung IV wurden zu einer Lösung von 128 mg (4 ' 10 Mol) der
-4
Verbindung III und 48,5 mg (4 " 10 Mol) der Verbindung V gegeben und in 3,35 ml Tetrahydrofuran umgesetzt. Dann ließ man 20 Stunden bei 4 C stehen. Die ausgeschiedene Fällung wurde entfernt, die überstehende Flüssigkeit gewonnen, zur Trockene eingedampft und mit Ether verrieben. Man erhielt 135 mg (79,5 %) hellgelbe Kristalle aus unreinem SIAB (Verbindung VI); F = 172-175 ° C. Die unreine Verbindung VI wurde aus Methylalkohol umkristallisiert und zweimal mit Diäthylether gewaschen, worauf man weiße Kristalle aus SIAB vom Schmelzpunkt 194-196 C (Zersetzung) erhielt. Die Zusammensetzung des SIAB wurde durch Elementaranalyse bestätigt.
Beispiel 2;
Herstellung von SIAB-Enzym Reaktionsprodukt Kaninchen-Antikörper gegen Schaf-Immunoglobulin (RaShIg) wurden unter Verwendung von SIAB an ß-D-Galactosidase (BG) gebunden. Das gereinigte RaShIg und die BG waren nach dem Verfahren des Beispiels 1 der US-Patentschrift 40 02 532 hergestellt worden.
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BAD ORIGINAL
Eine Mischung aus 3,9 mg (2,63 " 1O~ Mol) RaShIg und 30 J.
(3,6 mg/ml Tetrahydrofuran) SIAB (das SIAB wurde zum RaShIg gegeben) wurde in wäßriger 0,05m Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0) hergestellt. Die Mischung ließ man über Nacht bei Raumtemperatur reagieren, d. h. 12 Stunden in der Dunkelheit, um acyliertes RaShIg zu erhalten, von dem einige Aminogruppen der Antikörper mit den aktiven Succinimidylgruppen des SIAB-Bindungsmittels reagiert hatten. Die Umsetzung wurde
-2
durch Zugabe von 30 Λ (4,5 ' 10 Mol) Glycin zu dem acylierten RaShIg unterdrückt, worauf man 3 Stunden unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur hielt. Zu dem RaShIg wurde dann BG bei einem 25-fachen molaren Überschuß des RaShIg gegenüber dem BG gegeben, und die Lösung bei einem pH-Wert von 7,8 2 Tage bei 4 C gehalten. Anschließend wurde die Reaktion des Jodatoms mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms BG durch die Zugabe von 2-Mercaptoethanol (4 " 10 Mol) unterdrückt und die Mischung 3 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das so erhaltene RaShIg-BG Produkt wurde verdünnt, geklärt und gewonnen. Als Ergebnis dieser Bindungsreaktion ließ sich kein Verlust an Enzymwirksamkeit nachweisen.
Beispiel 3:
Herstellung von Jodacetyl-N-succinimid (INS)
0 Μ
Il C-CIl-j
1-CH0-U-OH + H-N'' I *~ +
ά C-ClI.,
(1) H
(266 m&)
(V) (IV) (291I mc)
mg) 0/0674
G I!
Il C-ClI9
Dioxan (3 ml) ^ i_CHp-C-0-< I
4° C über Nacht ^C-CH2
Il 0
(VII)
Beispiel 4:
Vergleich von RaShIg-BG Bindungsprodukten Das Bindungsprodukt wurde in einer gepufferten Enzymlösung mit 10.000 Standardeinheiten Enzymwirksamkeit je ml hergestellt und wie in der US-Patentschrift 40 02 532, Sp. 5, Z. 55 bis Sp. 6, Z. 1 angegeben untersucht, um nachzuweisen, daß es hohe Spezifität besitzt, wie das S/N-Verhältnis in der nachstehenden Tabelle anzeigt, wenn dieses Produkt mit den gleichen, in ähnlicher Weise aber unter Verwendung der bekannten Bindungsmittel MBS und W-R, siehe US-Patentschrift 40 02 532, Beispiel 1, hergestellten Enzymprodukten verglichen wird.
T A B E L L E 1
S/N Vergleich von Schaf-Immunoglobulin (ShIg) Bindungsprodukten
an ß-Galactosidase (BG) '
Zugegebene Einheiten
ShIg-BG je Scheibe CT7xn+ " micl+ W_R+
1 94-7 41-1 67-4
Bindungsreagenz M 3 S +
SIAB+ 41±1
94-7 58-1
63-2 18^0
32-2
10 63-2 58-1 52±2
100 32-2 18-0 2O+-I
Die Zahlen geben die S/N Werte - der Standardabweichung aus doppelten Messungen an. S stellt die Bindung an immunospezifische RaShIg Scheiben dar, N die Bindung an normale nichtspezifische Kaninchen-RIg Scheiben.
Das maximale S/N Verhältnis für SIAB ist nahezu zweimal so groß wie das S/N Verhältnis für das Bindungsmittel MBS. Für STAB stieg das Verhältnis S/N ständig an, während es für MBS einen maximalen Wert durchlief. Damit könnten die SIAB Bindungsprodukte sogar bei niedrigeren als Einheitskonzentrationen angewandt werden, um sogar bessere S/N Verhältnisse zu ergeben. Die1S/N Verhältnisse zeigen an, daß die SIAB Bindungsprodukte im Vergleich zu den bekannten Bindungsprodukten hochspezifisch sind. Dies geht aus einem Vergleich der SIAB und W-R Bindungsprodukte in einem Test auf HB Ag hervor, vergleiche Tabelle 2.
TABELLE 2
Vergleich der Bindungsprodukte von ß-Galactosidase (BG) in einem Test auf Hepatitis B-Oberflächenangiten (HB Ag)
HB3Ag (ng) SIAB++ W-R++ SIAB/W-R
O O 0 -
O 0 0 -
3,13 0,00462 0,00115 4,02
3,13 0,00322 0,00196 1 ,64
6,25 0,00815 O,QO226 3,61
6,25 0,00645 0,00156 4,13
12,50 0,01435 0,00786 1 ,83
12,50 0,01275 0,00766 1,66
25,00 0,02035 0,01376 1,55
25,00 0,02145 0,01396 1,54
Die Bindungsprodukte bestehen aus Kaninchen-Anti-Ziegen Ig, gebunden an ß-Galactosidase zur Feststellung von Ziegen-Anti-HB Ag.
Die Zahlen geben die Einheiten BG wieder, die an jede Immunoabsorptionsscheibe gebunden sind.
Das durchschnittliche Verhältnis SIAB/W-R ist 2,5, das heißt, es wurde durchschnittlich 2,5-mal mehr SIAB-Bindungsprodukt spezifisch gebunden. Es wurde das Verfahren nach Weltman und Mitarbeitern gemäß dem oben angegebenen Patent angewandt.
sch/ek

Claims (11)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von gebundenes Enzym enthaltenden Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminogruppen enthaltendes Makromolekül mit einem Reagenz der allgemeinen Formel
X CH,
It
C-R
umsetzt, in der X ein Halogenatom ist, η eine ganze Zahl von 1 bis 8 bedeutet und R eine mit den Aminogruppen des Makromoleküls reagierende Gruppe ist, und an das erhaltene Produkt durch Umsetzung des mit Sulfhydrylgruppen von Enzymen reagierenden Halogenatoms des Bindungsreagenzes ein enzymatisch wirksames Enzym bindet.
909840/0674
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Aminogruppen reagierende Gruppe des Reagenzes aus:
a) Hydroxylgruppen -OH _
Il
/"»ττ
*~ ΓΙ ,
b) N-Succinimidgruppen -O-N^ |
^C CH,
O c) Halogensäuregruppen -0-C —
R1 0
d) Aminobenzoat-N-succinimidgruppen -N-<0/-C-O-Nv I
XC-CH
besteht, in der R1 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsreagenz aus einer Halogenacetyl-N-succinimidyl-Verbindung besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsreagenz aus N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminogruppen enthaltende Makromolekül aus proteinhaltigen Makromolekülen, nämlich Antikörpern, Antigenen, Allergenen,
909840/0674
Hormonen, Immunoglobulin und Serumsubstanzen besteht, die keine Enzyme sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus ß-D-Galactosidase besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus ß-D-Galactosidase und das Makromolekül aus Immunoglobulin besteht.
8. Verfahren zur Feststellung von Antikörpern durch
a) Entfernung nicht gebundener Komponenten der Flüssigkeit vom festen Trägermaterial
b) Zugabe eines gebundenes Enzym enthaltenden Materials zu dem festen Träger, wodurch das Enzymmaterial im Verhältnis zu der an das Trägermaterial gebundenen Menge Antikörper gebunden wird
c) Entfernung ungebundenen Enzymmaterials vom Träger und
d) Feststellung der Gegenwart gebundener Antikörper durch die enzymatische Wirkung des Enzymmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gebundenes Enzym enthaltendes Produkt nach Anspruch 1 verwendet.
909840/0674
9. Für die Herstellung der gebundenes Enzym enthaltenden Produkte nach Anspruch 1 geeignetes Reagenz mit der allgemeinen Formel
ΟΗ,
-C-R
η
in der X ein Halogenatom ist, η eine ganze Zahl von 1 bis 8 bedeutet und R eine mit Aminogruppen reagierende Gruppe der allgemeinen Formel
oder
R.
Il
.C-CH
I 2
C-CH
II ^
NC-CH,
Il '
ist, in der R. Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet.
10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat besteht.
909840/0874
11. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Jodacetyl-N-succinimid besteht.
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