DE2910998A1 - Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung

Info

Publication number
DE2910998A1
DE2910998A1 DE19792910998 DE2910998A DE2910998A1 DE 2910998 A1 DE2910998 A1 DE 2910998A1 DE 19792910998 DE19792910998 DE 19792910998 DE 2910998 A DE2910998 A DE 2910998A DE 2910998 A1 DE2910998 A1 DE 2910998A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
bound
groups
binding
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19792910998
Other languages
English (en)
Inventor
Joel Kenneth Weltman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of DE2910998A1 publication Critical patent/DE2910998A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/404—2,5-Pyrrolidine-diones with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. succinimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/961—Chemistry: molecular biology and microbiology including a step of forming, releasing, or exposing the antigen or forming the hapten-immunogenic carrier complex or the antigen per se
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/823—Immunogenic carrier or carrier per se
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Description

Beschreibung
An Makromoleküle gebundene Enzyme werden in typischer Weise für die Auffindung und Bestimmung von Substanzen verwendet, die in sehr geringen Mengen, zum Beispiel in Nanogramm-Mengen in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin und Serum enthalten sind. Zur Bindung an Makromoleküle kann eine Vielzahl von Enzymen verwendet werden. Häufig werden jedoch Enzyme ausgewählt, die sich mit großer Empfindlichkeit nachweisen lassen. Für den makromolekularen Anteil des Moleküls steht eine Vielzahl von Aminogruppen enthaltenden Verbindungen zur Verfügung, einschließlich Nucleinsäuren, Proteinen, Hormonen, Antigenen und Allergenen, die Aminogruppen enthalten.
Die an Makromoleküle gebundenen Enzyme werden in einer Bindungsreaktion mit einem polyfunktionellen Kupplungsreagenz hergestellt, welches das Enzym und das Makromolekül durch Reaktion an einer oder mehreren der reaktionsfähigen Gruppen der Reaktionsteilnehmer zusammen bindet. Die Produkte aus Enzym und Makromolekülen sollten hohe Stabilität besitzen, hoch spezifisch sein und sich in gut reproduzierbarer Weise herstellen lassen.
Bei einigen Bindungsreaktionen zur Herstellung dieser enzymhaltigen Produkte hat man vorgeschlagen, eine Konditionierverbinduncj zu verwenden, zum Beispiel ein Polyamin, um die Spezifität des Enzymproduktes zu verbessern und so aufgrund des geringen
909840/0674
Signal-zu-Geräusch Verhältnisses während der Auffindung im immunochemischen Test das Aufspürungsverfahren zu verbessern. Die Herstellung von an Makromoleküle gebundenen Enzymen unter Verwendung von Bindungsreagenzien und Konditionierverbxndungen ist in der US-Patentschrift 40 02 532, auf die vorliegend Bezug genommen wird, beschrieben.
Für die Anwendung bei der immunologischen Untersuchung von Insulin hat man für die Herstellung eines an ein insulinhaltiges Produkt gebundenen Enzyms ein neues Bindungsreagenz vorgeschlagen. Dieses besteht aus m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-ester (MBS), einem bifunktionellen Reagenz, das die Aminogruppen des Insulins durch Umsetzung mit der N-Hydroxysuccinimid-ester-Gruppe acyliert und mit dem Enzym durch Anlagerung der Thiol-Gruppen an die Maleimid-Gruppe Thioesterbindungen bildet. Dieses Bindungsreagenz wurde zur Herstellung eines enzymatisch wirksamen, immunoreaktionsfähigen /i-D-Galactosidase-MBS-Insulin verwendet, ver-. gleiche J. Biochem., Bd. 79, S. 233-236 (1976), "Enzyme Coupled Immunoassay of Insulin Using a Novel Coupling Reagent", Kitagawa T. und Aikawa T., worauf vorliegend ebenfalls Bezug genommen wird. Obgleich dieses MBS-Bindungsreagenz in mancherlei Hinsicht zufriedenstellend ist, sind Enzymprodukte mit größerer Beständigkeit und größerer Spezifität sowie Empfindlichkeit erwünscht.
Die Erfindung betrifft neue Bindungsreagenzien und deren Herstellung, die Herstellung von enzymhaltigen Produkten unter Verwendung
909840/0674
dieser Bindungsreagenzien sowie die Verwendung der enzymhaltigen Reaktionsprodukte in immunologischen Untersuchungen.
Die erfindungsgemäßen polyfunktionellen Bindungsreagenzien, die enzymhaltige Produkte mit spezifischer Wirkung in hoher Ausbeute ergeben, umfassen allgemein ausgedrückt ein Reagenz, das zuerst mit den Aminogruppen des Makromoleküls und dann mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms reagiert. Es hat die folgende Formel:
Γ*ττ I r* π
in der X ein Halogenatom, vorzugsweise Jod ist; η bedeutet eine ganze Zahl von etwa 1 bis 8, vorzugsv/eise von 1 bis 4 und R ist ein beliebiger Rest, der mit den Aminogruppen des Makromoleküls zu reagieren vermag. Solche Reste sind zum Beispiel:
a) Hydroxylgruppen -OH
Ii
b) N-Succinimidgruppen -0-N. I
Il ^
0
0
Il j j
c) Halogensäuregruppen -0-C- CH„ -X
insbesondere eine Jodacetylgruppe
0
-0-C-CH2-I
909840/0674
d) Aminobenzoat-N-succinimid Gruppen
RO" 1 C-CU
I I / ν Il y^* »-"ρ
-N-( 0 >-C-O-N tf I
C-CH0
Il *·
in der R1 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe, zum Beispiel die Methylgruppe ist.
R kann auch eine andere mit Aminogruppen reagierende Gruppe sein.
Als Bindungsreagenz wird am meisten N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB) bevorzugt, das die folgende Strukturformel
r- I 0 H 0 C ΓΗ
I I / ' " \ jr . j
T __ j ("1LT J C-TvJ-/ ΓΛ \ /""» 0""T4J 1
L 2Jn=1 ^C-CH0
11 ^
Das SIAB ergibt in unerwartet hoher Ausbeute enzymhaltige Produkte mit spezifischer immunochemischer, Enzym- und Konjugatwirkung. Mit SIAB hergestellte enzymhaltige Produkte weisen im Vergleich zu solchen, die mit bekannten Bindungsreagenzien, wie MBS hergestellt wurden, hohe Stabilität und hohe Spezifität auf.
Besonders brauchbare Bindungsreagenzien sind zum Beispiel Jodessigsäure, Jodessigsäureanhydrid und N-Hydroxysuccinimidester der Jodessigsäure.
Jodessigsäure reagiert in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimide, wie i-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid mit
909840/0 674
-NH-j-Gruppen. Jodessigsäureanhydrid reagiert direkt mit den -NH „-Gruppen. In anderen Fällen werden die Bindungsreagenzien durch Umsetzung der ausgewählten halogenierten organischen Säure oder des Säureanhydrids in einem Lösungsmittel mit dem mit Aminogruppen reagierenden Teil R des Moleküls hergestellt, worauf das Reagenz gewonnen wird. Zum Beispiel kann man SIAB durch Umsetzung von Jodessigsäureanhydrid mit p-Aminobenzosäure in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan herstellen. Das entstehende Zwischenprodukt wird kristallisiert und der aktive Ester durch Umsetzung des Zwischenprodukts mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines Carbodiimids in einem organischen Lösungsmittel hergestellt, zum Beispiel unter Verwendung von Dicyclohexylcorbodiimid in Tetrahydrofuran. Das gebildete Produkt, das kristallisiert werden kann, besteht aus SIAB.
Die erfindungsgemäßen enzymhaltigen Produkte werden durch eine Bindungsreaktion zwischen dem mit Aminogruppen reagierenden Substituenten des erfindungsgemäß verwendeten Bindungsreagenzes und dem Makromolekül und anschließend durch Umsetzung des Halogensubstituenten mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms hergestellt. Wesentlich bei der Herstellung der enzymhaltigen Produkte ist, daß erst die Umsetzung der mit den Aminogruppen des Proteins oder eines anderen Makromoleküls reagierenden Gruppe R, wie der Succinimidylgruppe, und dann die Umsetzung von X mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms durchgeführt wird. Anderenfalls würde die Gruppe R mit der Aminogruppe des "Enzyms reagieren, was zu geringeren
909840/0674
Ausbeuten und einer geringeren Spezifität des so hergestellten Enzymproduktes führen würde.
Das erfindungsgemäße Bindungsreagenz ermöglicht die Herstellung eines enzymhaltigen Produktes bei hoher Bindungsspezifität, wie das nachfolgende Reaktionsschema mit SIAB zeigt.
O OH 0 "
ι , ν it ,C-UH
0 >-C-O-N^. I
11 ^
NH?-Protein (z.B. Insulin)
0 H 0 H
I-CH„-C-O-N-/ 0 "/-C-N-Protein
Enzym-SH OH OH
Enzym-S-CH2-C-O-N-( Q )>-C-N-Protein
Im allgemeinen verläuft das Herstellungsverfahren wie folgt:
R + NH2-Protein
2jn o
- CH2 L-C-NH-Protein + SH-Enzym I—· J
Protein + HX
2 ^C-NH-
909840/0674
In typischer Weist wird SIAB in wäßriger Lösung unter milden Bedingungen mit den Aminogruppen der Makromoleküle umgesetzt. Zum Beispiel setzt man SIAB mit Immunoglobulin in O,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,0 um. Das gebildete Immunoglobulinderivat wird dann mit einem Enzym umgesetzt, das Sulfhydrylgruppen enthält. Ein solches Enzym ist aus E. coli isolierte ß-D-Galactosidase (BG). Die BG wird unter milden wäßrigen Bedingungen mit dem Immunoglobulinderivat umgesetzt. Das gebildete Produkt aus BG und Makromolekül besitzt hohe Enzymaktivität, immunologische Spezifität und wird in außerordentlich hoher Ausbeute erhalten. So werden zum Beispiel tatsächlich das gesamte Immunoglobulin oder ein anderes Makromolekül und die BG stöchiometrisch mit-einander verbunden. Die Ausbeute an so erhaltenem BG-Konjugat ist überraschend hoch. Die Produkte aus BG und entweder Antigenen oder Antikörpern, die mit SIAB hergestellt werden, sind für Enzym-Immunountersuchungen auf verschiedene Antigene oder Antikörper, einschließlich Hepatitis, Serumproteine, Hormone und Arzneimittel brauchbar.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes über SH-Gruppen reagierende Enzym eingesetzt werden, zum Beispiel saure und alkalische Phosphatasen, Alkohol-Dehydrogenase, Katalase, Glucose- und Galactose-Oxidasen, oC- und ß-Galactosidasen, Lactat-Dehydrogenase, Lysozym, Luciferase , Peroxidasen, Ribonuclease , Rodhanase und Esterasen.
909840/0674
Brauchbare über NH„-Gruppen reagierende Makromoleküle umfassen Desoxy- und Ribonucleinsäuren, Virusprotreine, Allergene, Immunogluboline, Blutgruppenstoffe, Transplantations-Antigene, carcinogenes embryonisches Antigen, c<--Fetoprotein und andere für Tumore spezifische Antigene, Wachstumshormone und andere Polypeptidhormone.
Das SIAB ist besonders wertvoll für die Herstellung von Produkten aus Immunoglobulin und bakteriellem Enzym yÖ-D-Galactosidase. Die erfindungsgemäß herstellbaren enzymhaltigen Produkte werden für die Auffindung von Antigenen, Antikörpern', Allergenen, Hormonen und anderen Makromolekülen in niedrigen Nanogramm-Mengen oder noch geringeren Mengen unter Anwendung immunologischer Untersuchungensmethoden verwendet.
Die erfindungsgemäßen Produkte sind insbesondere brauchbar für die Auffindung von Makromolekülen, vor allem für die Auffindung und Bestimmung von Nanogramm-Mengen an Substanzen in biologischen Flüssigkeiten, wie die Auffindung von Antikörpern, Antigenen, Allergenen, Hormonen und dergleichen. Die SIAB-Enzym Produkte finden insbesondere in immunologischen Untersuchungsverfahren auf Hepatitis Anwendung. Bei den bis jetzt hierfür bekannten Verfahren ist ein wiederholtes Waschen des Patientenserums auf dem festen Träger, d. h. einer Antigenscheibe erforderlich, um nicht spezifische absorbierte Serumproteine zu entfernen. Die erfindungsgemäßen SIAB-Enzym Produkte ermöglichen eine immunologische Untersuchung in einer Stufe. Da das gesamte oder im wesentlichen gesamte spezifische Enzym an den Antikörper gebunden
909940/0674
wird, ist bei den SIAB-Enzym Produkten nur ein begrenztes Waschen oder kein Waschen notwendig.
Die erfindungsgemäßen Produkte können in den bekannten Verfahren zur Auffindung von Antikörpern angewandt werden, wie sie zum Beispiel in der US-Patentschrift 40 02 532 beschrieben sind. Diese Verfahren besteher, darin, daß man die nachzuweisenden Antikörper oder andere Makromoleküle zum Beispiel durch Absorption an einen festen Träger oder ein absorbierendes Material, zum Beispiel eine Scheibe bindet. So kann man zu dem festen Träger eine Flüssigkeit, wie Serum oder Urin geben, um die darin enthaltenen Antikörper an das Trägermaterial zu binden, zum Beispiel das Serum mit der Scheibe inkubieren, das Trägermaterial zur Entfernung nicht gebundener Komponenten der Flüssigkeit, wie von nicht spezifisch gebundenen und absorbierten Serumproteinen von der Scheibe waschen, das enzymhaltige Produkt zu dem gewaschenen Träger geben, zum Beispiel durch Inkubieren der Scheibe mit einem Enzym-SIAB-Protein Produkt, so daß das spezifische Enzym im Verhältnis zur an die Scheibe gebundenen Menge Antikörper an den Träger gebunden wird und so ein Maß für das IgE des Patienten oder andere quantitativ zu bestimmende Makromoleküle darstellt. Gegebenenfalls kann man den Träger zur Entfernung nicht gebundenen unspezifischen Enzym-Produkts von der Trägerscheibe waschen und die enzymatisch^ Wirkung des gebundenen Enzym-Produkts als Maß der Menge der gebundenen Antikörper ermitteln.
9 0 9840/06
Bei einer solchen Bestiiranungsmethode führt die hohe spezifische Ausbeute an Enzym-Produkt im Vergleich zu den bekannten Verfahren zu einem hohen Bindungsgrad an das Trägermaterial, was sich zum Beispiel in einem unerwartet hohen Signal-zu-Geräusch Verhältnis der Bestimmungsmethode äußert. Mit anderen Worten, das erfindungsgemäße Enzym-Produkt erhöht die Empfindlichkeit und die Spezifität durch die spezifische Bindung des Enzym-Produkts an den festen Träger und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit bei der Aufspürung der Antikörper mit geringeren Mengen an Enzym-Produkt, und dies in Gegenwart beeinträchtigender Substanzen, was bei den bekannten Enzym-Produkten nicht möglich war. Wenn man zum Beispiel das SIAB-Bindungsreagenz bei menschlichem Serum anwendet, das eine bekannte Menge Antigen enthält, ist das Enzym-Produkt ziemlich beständig, und bei etwa der Hälfte der Menge an Enzym zur Bildung eines spezifischen Bindungsproduktes ist die ermittelte Menge an gebundenem Enzym etwa 3 1/2 mal so groß wie bei Verwendung des MBS-Bindungsreagenzes, was eine etwa 15fache ' Verbesserung darstellt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1:
Herstellung des SIAB-Bindungsreagenzes N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB), das bevorzugte
909840/0674
Bindungsmittel gemäß der Erfindung wurde gemäß folgendem Reaktionsschema hergestellt:
0 Il
1) (1-CH2-C2-Z-O + H2N- <_0> -C-OH >
(D Jodessigsäureanhydrid (ID
p-Aminobenzoessigsäure
O H Il I 1-CH2-C-N-
(III)
-COOH + 1-CH2-COOH
0 II
Il I
2) 1-CH2-C-N- ( 0 } -COOH + <U> -N=C=N
(III) Dicyclohexylcarbodiimxd
(IV)
+ OH
I
N
O=C OO
H2C-CH2
N-Hydroxysuccinimid (V)
Fällung und überstehende Flüssigkeit
0 II 0 H
Il ι ^^^ H /C-CH;
I-CHp-C-N- <0> -C-O-N ά V-^ NC-CH
!I 0 aus der überstehenden Flüssigkeit zur Trokkene eingedampft
(VI) SIAB
909840/0674 BAD
354 mg der Verbindung I (10 ,uMol)wurden in 5 ml üioxan gelost. Dazu wurden 68,6 mg der Verbindung II (500 ,uMol) in 2,5 ml Dioxan gegeben, worauf man das Ganze 5 Stunden bei Raumtemperatur (20
bis 25° C) unter Lichtausschluß und dann 2 Tage bei 4 C reagieren ließ. Es bildete sich eine weiße Fällung aus der Verbindung III, die abzentrifugiert und dreimal mit jeweils 0,5 ml Ether verrieben wurde. Das erhaltene weiße Pulver wurde mit heißer Luft getrocknet. Ausbeute 160 mg. 86,2 mg (4 " 10 Hol) der Verbin-
-4 dung IV wurden zu einer Lösung von 128 mg (4 ' 10 Mol) der
-4
Verbindung III und 48,5 mg (4 " 10 Mol) der Verbindung V gegeben und in 3,35 ml Tetrahydrofuran umgesetzt. Dann ließ man 20 Stunden bei 4 C stehen. Die ausgeschiedene Fällung wurde entfernt, die überstehende Flüssigkeit gewonnen, zur Trockene eingedampft und mit Ether verrieben. Man erhielt 135 mg (79,5 %) hellgelbe Kristalle aus unreinem SIAB (Verbindung VI); F = 172-175 ° C. Die unreine Verbindung VI wurde aus Methylalkohol umkristallisiert und zweimal mit Diäthylether gewaschen, worauf man weiße Kristalle aus SIAB vom Schmelzpunkt 194-196 C (Zersetzung) erhielt. Die Zusammensetzung des SIAB wurde durch Elementaranalyse bestätigt.
Beispiel 2;
Herstellung von SIAB-Enzym Reaktionsprodukt Kaninchen-Antikörper gegen Schaf-Immunoglobulin (RaShIg) wurden unter Verwendung von SIAB an ß-D-Galactosidase (BG) gebunden. Das gereinigte RaShIg und die BG waren nach dem Verfahren des Beispiels 1 der US-Patentschrift 40 02 532 hergestellt worden.
90984 0/0674
BAD ORIGINAL
Eine Mischung aus 3,9 mg (2,63 " 1O~ Mol) RaShIg und 30 J.
(3,6 mg/ml Tetrahydrofuran) SIAB (das SIAB wurde zum RaShIg gegeben) wurde in wäßriger 0,05m Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0) hergestellt. Die Mischung ließ man über Nacht bei Raumtemperatur reagieren, d. h. 12 Stunden in der Dunkelheit, um acyliertes RaShIg zu erhalten, von dem einige Aminogruppen der Antikörper mit den aktiven Succinimidylgruppen des SIAB-Bindungsmittels reagiert hatten. Die Umsetzung wurde
-2
durch Zugabe von 30 Λ (4,5 ' 10 Mol) Glycin zu dem acylierten RaShIg unterdrückt, worauf man 3 Stunden unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur hielt. Zu dem RaShIg wurde dann BG bei einem 25-fachen molaren Überschuß des RaShIg gegenüber dem BG gegeben, und die Lösung bei einem pH-Wert von 7,8 2 Tage bei 4 C gehalten. Anschließend wurde die Reaktion des Jodatoms mit den Sulfhydrylgruppen des Enzyms BG durch die Zugabe von 2-Mercaptoethanol (4 " 10 Mol) unterdrückt und die Mischung 3 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das so erhaltene RaShIg-BG Produkt wurde verdünnt, geklärt und gewonnen. Als Ergebnis dieser Bindungsreaktion ließ sich kein Verlust an Enzymwirksamkeit nachweisen.
Beispiel 3:
Herstellung von Jodacetyl-N-succinimid (INS)
0 Μ
Il C-CIl-j
1-CH0-U-OH + H-N'' I *~ +
ά C-ClI.,
(1) H
(266 m&)
(V) (IV) (291I mc)
mg) 0/0674
G I!
Il C-ClI9
Dioxan (3 ml) ^ i_CHp-C-0-< I
4° C über Nacht ^C-CH2
Il 0
(VII)
Beispiel 4:
Vergleich von RaShIg-BG Bindungsprodukten Das Bindungsprodukt wurde in einer gepufferten Enzymlösung mit 10.000 Standardeinheiten Enzymwirksamkeit je ml hergestellt und wie in der US-Patentschrift 40 02 532, Sp. 5, Z. 55 bis Sp. 6, Z. 1 angegeben untersucht, um nachzuweisen, daß es hohe Spezifität besitzt, wie das S/N-Verhältnis in der nachstehenden Tabelle anzeigt, wenn dieses Produkt mit den gleichen, in ähnlicher Weise aber unter Verwendung der bekannten Bindungsmittel MBS und W-R, siehe US-Patentschrift 40 02 532, Beispiel 1, hergestellten Enzymprodukten verglichen wird.
T A B E L L E 1
S/N Vergleich von Schaf-Immunoglobulin (ShIg) Bindungsprodukten
an ß-Galactosidase (BG) '
Zugegebene Einheiten
ShIg-BG je Scheibe CT7xn+ " micl+ W_R+
1 94-7 41-1 67-4
Bindungsreagenz M 3 S +
SIAB+ 41±1
94-7 58-1
63-2 18^0
32-2
10 63-2 58-1 52±2
100 32-2 18-0 2O+-I
Die Zahlen geben die S/N Werte - der Standardabweichung aus doppelten Messungen an. S stellt die Bindung an immunospezifische RaShIg Scheiben dar, N die Bindung an normale nichtspezifische Kaninchen-RIg Scheiben.
Das maximale S/N Verhältnis für SIAB ist nahezu zweimal so groß wie das S/N Verhältnis für das Bindungsmittel MBS. Für STAB stieg das Verhältnis S/N ständig an, während es für MBS einen maximalen Wert durchlief. Damit könnten die SIAB Bindungsprodukte sogar bei niedrigeren als Einheitskonzentrationen angewandt werden, um sogar bessere S/N Verhältnisse zu ergeben. Die1S/N Verhältnisse zeigen an, daß die SIAB Bindungsprodukte im Vergleich zu den bekannten Bindungsprodukten hochspezifisch sind. Dies geht aus einem Vergleich der SIAB und W-R Bindungsprodukte in einem Test auf HB Ag hervor, vergleiche Tabelle 2.
TABELLE 2
Vergleich der Bindungsprodukte von ß-Galactosidase (BG) in einem Test auf Hepatitis B-Oberflächenangiten (HB Ag)
HB3Ag (ng) SIAB++ W-R++ SIAB/W-R
O O 0 -
O 0 0 -
3,13 0,00462 0,00115 4,02
3,13 0,00322 0,00196 1 ,64
6,25 0,00815 O,QO226 3,61
6,25 0,00645 0,00156 4,13
12,50 0,01435 0,00786 1 ,83
12,50 0,01275 0,00766 1,66
25,00 0,02035 0,01376 1,55
25,00 0,02145 0,01396 1,54
Die Bindungsprodukte bestehen aus Kaninchen-Anti-Ziegen Ig, gebunden an ß-Galactosidase zur Feststellung von Ziegen-Anti-HB Ag.
Die Zahlen geben die Einheiten BG wieder, die an jede Immunoabsorptionsscheibe gebunden sind.
Das durchschnittliche Verhältnis SIAB/W-R ist 2,5, das heißt, es wurde durchschnittlich 2,5-mal mehr SIAB-Bindungsprodukt spezifisch gebunden. Es wurde das Verfahren nach Weltman und Mitarbeitern gemäß dem oben angegebenen Patent angewandt.
sch/ek

Claims (11)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von gebundenes Enzym enthaltenden Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminogruppen enthaltendes Makromolekül mit einem Reagenz der allgemeinen Formel
X CH,
It
C-R
umsetzt, in der X ein Halogenatom ist, η eine ganze Zahl von 1 bis 8 bedeutet und R eine mit den Aminogruppen des Makromoleküls reagierende Gruppe ist, und an das erhaltene Produkt durch Umsetzung des mit Sulfhydrylgruppen von Enzymen reagierenden Halogenatoms des Bindungsreagenzes ein enzymatisch wirksames Enzym bindet.
909840/0674
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Aminogruppen reagierende Gruppe des Reagenzes aus:
a) Hydroxylgruppen -OH _
Il
/"»ττ
*~ ΓΙ ,
b) N-Succinimidgruppen -O-N^ |
^C CH,
O c) Halogensäuregruppen -0-C —
R1 0
d) Aminobenzoat-N-succinimidgruppen -N-<0/-C-O-Nv I
XC-CH
besteht, in der R1 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsreagenz aus einer Halogenacetyl-N-succinimidyl-Verbindung besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsreagenz aus N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminogruppen enthaltende Makromolekül aus proteinhaltigen Makromolekülen, nämlich Antikörpern, Antigenen, Allergenen,
909840/0674
Hormonen, Immunoglobulin und Serumsubstanzen besteht, die keine Enzyme sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus ß-D-Galactosidase besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus ß-D-Galactosidase und das Makromolekül aus Immunoglobulin besteht.
8. Verfahren zur Feststellung von Antikörpern durch
a) Entfernung nicht gebundener Komponenten der Flüssigkeit vom festen Trägermaterial
b) Zugabe eines gebundenes Enzym enthaltenden Materials zu dem festen Träger, wodurch das Enzymmaterial im Verhältnis zu der an das Trägermaterial gebundenen Menge Antikörper gebunden wird
c) Entfernung ungebundenen Enzymmaterials vom Träger und
d) Feststellung der Gegenwart gebundener Antikörper durch die enzymatische Wirkung des Enzymmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gebundenes Enzym enthaltendes Produkt nach Anspruch 1 verwendet.
909840/0674
9. Für die Herstellung der gebundenes Enzym enthaltenden Produkte nach Anspruch 1 geeignetes Reagenz mit der allgemeinen Formel
ΟΗ,
-C-R
η
in der X ein Halogenatom ist, η eine ganze Zahl von 1 bis 8 bedeutet und R eine mit Aminogruppen reagierende Gruppe der allgemeinen Formel
oder
R.
Il
.C-CH
I 2
C-CH
II ^
NC-CH,
Il '
ist, in der R. Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet.
10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat besteht.
909840/0874
11. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Jodacetyl-N-succinimid besteht.
DE19792910998 1978-03-24 1979-03-21 Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung Withdrawn DE2910998A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/889,726 US4218539A (en) 1978-03-24 1978-03-24 Enzyme conjugates and method of preparation and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2910998A1 true DE2910998A1 (de) 1979-10-04

Family

ID=25395678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19792910998 Withdrawn DE2910998A1 (de) 1978-03-24 1979-03-21 Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4218539A (de)
JP (2) JPS5534087A (de)
AU (1) AU4534479A (de)
BE (1) BE875064A (de)
CA (1) CA1120398A (de)
DE (1) DE2910998A1 (de)
FR (1) FR2420543A1 (de)
GB (1) GB2017105B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0312212A1 (de) * 1987-09-21 1989-04-19 Kabushiki Kaisha Toshiba Immobilisierung einer bioaktiven Substanz an einer Lipidzusammensetzung, enthaltend eine modofizierte Lipidverbindung

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2432713A1 (fr) * 1978-08-02 1980-02-29 Inst Nat Sante Rech Med Application de la d5,3-ceto steroide isomerase dans les dosages immunoenzymatiques
JPS5539702A (en) * 1978-08-30 1980-03-19 Takeda Chem Ind Ltd Method of measuring enzyme immunity of pancreas glucagon
JPS5714748A (en) * 1980-07-01 1982-01-26 Dainippon Pharmaceut Co Ltd Kit for quantitative determination of valproic acid and its method for quantitative determination
IT1153912B (it) * 1982-01-20 1987-01-21 Erba Farmitalia Metodo e reagenti per l'uso di beta-galattosidasi come marcante in immunocitochimica
FR2523445A1 (fr) * 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4959309A (en) * 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4793993A (en) * 1987-07-06 1988-12-27 Chesebrough-Pond's Inc. Crosslinking of hair thiols
US4794189A (en) * 1987-12-07 1988-12-27 Akzo America Inc. Synthesis of N-succinimidyl haloacetyl aminobenzoates
DE3802060A1 (de) * 1988-01-25 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Hapten-protein-konjugate und ihre verwendung
US5322678A (en) * 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US5646242A (en) 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
EP0886681A1 (de) 1996-03-04 1998-12-30 Genetrace Systems, Inc. Verfahren zur suche von nukleinsäuren mit massenspektroskopie
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5856194A (en) 1996-09-19 1999-01-05 Abbott Laboratories Method for determination of item of interest in a sample
US5795784A (en) 1996-09-19 1998-08-18 Abbott Laboratories Method of performing a process for determining an item of interest in a sample
US7285422B1 (en) 1997-01-23 2007-10-23 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements
US6140053A (en) 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US6133436A (en) * 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
DK0937096T3 (da) 1996-11-06 2004-06-14 Sequenom Inc Fremgangsmåde til massespektrometri-analyse
US6024925A (en) * 1997-01-23 2000-02-15 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing low volume analyte array elements
CA2274587A1 (en) 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
US6268131B1 (en) 1997-12-15 2001-07-31 Sequenom, Inc. Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids
US6723564B2 (en) 1998-05-07 2004-04-20 Sequenom, Inc. IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices
WO2001096607A2 (en) 2000-06-13 2001-12-20 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
WO2002055199A2 (en) 2000-10-30 2002-07-18 Sequenom Inc Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate
US6991911B2 (en) * 2003-12-15 2006-01-31 Dade Behring Inc. Assay for entactogens
US7022492B2 (en) * 2003-12-15 2006-04-04 Dade Behring Inc. Ecstasy haptens and immunogens
US20050130243A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-16 Zheng Yi F. Assay for entactogens
US7037669B2 (en) * 2004-03-22 2006-05-02 Dade Behring Inc. Assays for amphetamine and methamphetamine using stereospecific reagents
US7115383B2 (en) * 2004-03-22 2006-10-03 Dade Behring Inc. Assays for amphetamine and methamphetamine
US7456000B2 (en) * 2004-08-26 2008-11-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Deactivation of linking moieties in antibody-enzyme conjugates
WO2006116742A2 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Ventana Medical Systems, Inc. Fluorescent nanoparticles conjugated to antibodies via a peg linker
CA2609702C (en) * 2005-04-28 2013-05-28 Ventana Medical Systems, Inc. Antibody conjugates via heterobifunctional peg linkers
JP5199880B2 (ja) * 2005-11-23 2013-05-15 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 分子コンジュゲート
US20090180931A1 (en) 2007-09-17 2009-07-16 Sequenom, Inc. Integrated robotic sample transfer device
CA2908475C (en) * 2013-04-08 2020-09-08 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1668723A1 (de) * 1966-09-16 1971-04-08 Toyo Jozo Kk Verfahren zum Herstellen von Verbindungen mit Saeureamid-Bindung
US4144131A (en) * 1974-05-23 1979-03-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Immobilization of enzymes on human tissue or erythrocytes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0312212A1 (de) * 1987-09-21 1989-04-19 Kabushiki Kaisha Toshiba Immobilisierung einer bioaktiven Substanz an einer Lipidzusammensetzung, enthaltend eine modofizierte Lipidverbindung

Also Published As

Publication number Publication date
JPS55120558A (en) 1980-09-17
CA1120398A (en) 1982-03-23
GB2017105A (en) 1979-10-03
AU4534479A (en) 1979-09-27
US4218539A (en) 1980-08-19
BE875064A (fr) 1979-09-24
JPS5534087A (en) 1980-03-10
FR2420543A1 (fr) 1979-10-19
GB2017105B (en) 1982-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2910998A1 (de) Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung
EP0371262B1 (de) Neue Digoxigenin-Derivate und ihre Verwendung
DE2661112C2 (de) Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Trägers
DE1815332C3 (de) Verfahren zur Bindung von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Hydroxyl- oder primären oder sekundären Aminogruppen
DE3003959C2 (de) Konjugate aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor und deren Verwendung zur Bestimmung von Liganden
DE2754086C3 (de) Spezifisches Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium
DE2656155C2 (de)
DE60111628T2 (de) Metallchelatisierende gemische
EP0073514B1 (de) Creatinin-Antikörper
DE2939165A1 (de) Cytotoxische produkte und verfahren zu ihrer herstellung
DE1816712A1 (de) Reaktive Teilchen fuer biologische Untersuchungen und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0451810B1 (de) Hapten-Biotin-Konjugate und ihre Verwendung
WO1990015798A1 (de) Aminoalkylmaleimide und davon abgeleitete hapten- und antigenderivate sowie konjugate mit peptiden oder proteinen
DE2805056A1 (de) Aktivierte grundmasse und verfahren zu ihrer herstellung
DE3000879C2 (de)
EP0084655B1 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Creatinin
DE3224217A1 (de) Enzymimmunoassay-methode zur qualitativen und quantitativen bestimmung von substanzen
DE3025226C2 (de) Pterinderivate und ihre Verwendung zur radioimmunologischen Bestimmung von Pterinen
DE3738721C2 (de) Immobilisierte Antikörper
US4360592A (en) Process for the detection of antibodies
DE69822446T2 (de) Cyclosporin derivate und deren verwendung
EP0322813A2 (de) Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz
US4251445A (en) N-succinimidyl haloacetyl aminobenzoates as coupling agents
DE4033714C2 (de)
DE3504406A1 (de) Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden globulins

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee