DE2805056A1

DE2805056A1 - Aktivierte grundmasse und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2805056A1
Application number: DE19782805056
Authority: DE
Inventors: John Stephen Ayers; Geoffrey Shaun Bethell; William Stephen Hancock; Milton Thomas William Hearn
Original assignee: Development Finance Corp of New Zealand
Current assignee: DFC New Zealand Ltd
Priority date: 1977-02-08
Filing date: 1978-02-07
Publication date: 1978-10-19
Also published as: SE7801355L; US4224439A; FR2379552B1; GB1598763A; SE447119B; FR2379552A1; AU3305778A; CA1106841A; AU515785B2

Description

COHAUSZ & FLGRACK

PATENTANWALTSBÜRO 2805 0 b

SCHUMANNSTR. 97 · D-4000 DÜSSELDORF

Telefon: (0211) 68 33 46 Telex: 0858 6513 cop d

PATENTANWÄLTE:
Dipl.-Ing. W. COHAUSZ · Dipl.-Ing. R. KNAUF · Dr.-Ing., Dipl.-Wirtsch.-Ing. A. GERBER · Dipl.-Ing. H. B. COHAUSZ

DEVELOPMENT FINANCE CORPORATION
OF NEW ZEALAND
Wellington 1 (Meuseeland)

Aktivierte Grundmasse und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft eine aktivierte Grundmasse und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Unter aktivierter Grundmasse soll in dieser Beschreibung und den Ansprüchen ein Polysaccharid verstanden werden, das mit Hilfe eines Carbonylierungsmittels carbonyliert worden ist. Ankoppeln eines Liganden oder "Leash" bedeutet die Substitution der Carbonylgruppe der aktivierten Grundmasse durch einen gut nukleophilen Liganden oder "Leash", wie eine aktive Aminogruppe. Ein Ligand ist hier ein Substituent mit besonderer Affinität zu einer Verbindung, die an die aktivierte Grundmasse gebunden werden soll. Eine derartige Bindung kann durch Ionenaustausch, Affinitätschromatographie, für einen Radioimmunversuch, zur hydrophoben Chromatographie, zur Bildung eines Enzymträgers od. dgl. stattfinden. Ein "Leash" ist ein Substituent. der leicht in die Carbonylgruppe der aktivierten Grundmasse eingeführt und dann seinerseits durch einen Liganden substituiert werden kann.

809842/0566

Affinitätschromatographie ist eine Trennmethode, bei der die einzigartige Spezifität biologischer Reaktionen zur Isolierung natürlich vorkommender Verbindungen, wie Proteine, Polysaccharide, Glykoproteine und Nucleinsäuren genutzt wird. Einem Bettmaterial werden spezifische Adsorptionseigenschaften dadurch erteilt, daß an eine unlösliche Grundmasse durch eine covalente Bindung ein geeigneter Ligand gebunden wird, d.h. durch Aktivieren der Grundmasse. Der Ligand adsorbiert aus einer Lösung die zu isolierende Substanz, die dann nach dem Auswaschen nicht gebundener Substanzen durch Änderung der Versuchsbedingungen wieder in Lösung gebracht werden kann. Die hohe Spezifität dieser Methode beruht auf der Ausnutzung natürlicher Spezifitäten, wie Antigen/Antikörper-, Enzym/Inhibitor- und Hormon/Träger-Reaktionen. Die Isolierung von Substanzen nach dieser Methode unterscheidet sich von der herkömmlichen Chromatographie, bei der die Trennung im wesentlichen von physikalischen und chemischen Unterschieden zwischen den Substanzen abhängt.

Grundmassen für die Affinitätschromatographie werden hergestellt, indem zuerst ein Polysaccharid aktiviert und dann, falls erforderlich, ein Ligand oder "Leash" angekoppelt wird. Bei einem derartigen Herstellungsverfahren wird beispielsweise Agarose in der nachstehend angegebenen Weise in zwei Stufen zur Reaktion gebracht. Die erste Stufe besteht aus einer Behandlung mit Bromcyan zur Bildung einer Imidcarbonat-Verbindung der Formel I und die zweite Stufe aus einer Behandlung mit einem primären Amin zur Bildung einer Isoharnstoff-Verbindung der Formel II:

(D

(II)

809842/0565

In diesen Formel ist R ein für die Affinitätschromatogra— phie geeigneter Ligand. Durch die Reaktion in der zweiten Stufe mit einer nukleophilen Stickstoffverbindung wird die Grundmasse zum Teil zu einem Ionenaustauscher mit einer positiv geladenen basischen Isoharnstoff-Gruppe. Die Ladung tritt bei pH 7 auf und stört die Spezifität der Verbindung, wenn Substanzen aus tierischen Körperflüssigkeiten isoliert werden sollen. Sie bleibt auch bei höheren pH-Werten erhalten, wenn auch in geringerem Grade. Es ist leicht einzusehen, daß die Spezifität des Liganden durch die Gegenwart geladener Gruppen erheblich verringert wird, so daß eine Aktivierung der Grundmasse nach diesem Verfahren fühlbare Nachteile bietet.

Es stellte sich daher die Aufgabe, eine aktivierte Grundmasse zur Verfügung zu stellen, die diese Nachteile nicht aufweist, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung anzugeben.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine aktivierte Grundmasse gelöst, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

G-O-C-Y , (III)

Il

in der G eine in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel unlösliche Polysaccharid-Grundmasse und Y eine gut abspaltbare Gruppe, die leicht durch ein Amin verdrängt wird.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zur Herstellung der aktivierten Grundmasse besteht darin, daß eine in Wasser und organischen Lösungsmitteln unlösliche Polysaccharid-Grundmasse mit einem Carbonylierungsmittel der allgemeinen Formel

O = C ) (IV)

- 8 809842/0565

in der Y entweder eine gut abspaltbare Gruppe, die leicht durch ein Amin verdrängt wird, oder ein Substituent ist, dessen C-Y-Bindung leicht aufgespalten wird, und X=Y oder eine andere leicht abspaltbare Gruppe ist, die sich beim Carbonylieren mit einem Wasserstoffatorn verbindet, carbonyliert wird.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den übrigen Unteransprüchen angegeben.

Die Grundmasse ist am besten eine vernetzte Agarose, eine vernetzte Stärke, vernetztes Dextran, vernetzte Cellulose oder regenerierte Cellulose oder vernetzte Hydroxy-C„-C₄-alkylcellulose bzw. regenerierte vernetzte Hydroxy-C„-C₄-alky!cellulose, und Y ist Imidazoyl, 1,2,4-Triazoyl, 1,2,3-Benzotriazoyl, Chlor oder eine andere gut abspaltbare Gruppe.

Bevorzugte Carbonylierungsmittel sind N,N'-Carbonyldidiimidazol, N,N'-Carbonyldi-1,2,3-benzotriazol, Ν,Ν'-Carbonyldi-1,2,4-triazol und Phosgen.

Wenn als Carbonylierungsmittel N,N'-Carbonyldi-1,2,4-triazol oder Ν,Ν'-Carbonyldiimid verwendet wird, führt man die Reaktion am besten in einem organischen Lösungsmittel während einer Dauer von mindestens 5 Minuten bei einer Temperatur zwischen 0 und 80 ⁰C aus, wobei die obere Grenze von der Temperatur abhängt, bei der sich die Grundmasse zu zersetzen beginnt.

Eine besonders vorteilhafte Grundmasse hat die allgemeine Formel

G-O-C- NR¹R², (V)

Il

in der G die bereits definierte Bedeutung hat und von den

809842/0565

" ⁹ " 28050S6

R , R ein Substituent Wasserstoff oder eine Alkylgruppe und der andere ein Ligand oder ein "Leash" ist.

Am besten ist R¹ oder R² -(CH₉) NH₉, -(CH₉) NHR³, -(CH₉) COR oder -(CH₉) COOH, worin η eine ganze Zahl von

/. η 2 ^{z n} 4

2 bis 12 ist und R sowie R , die gleich oder verschieden

ι sein können, die Reste organischer Verbindungen sind. R

2
und R können aber auch die Reste eines Peptids, Proteins, Steroids, einer Aminosäure oder eines Kohlenhydrats sein.

Die Verbindung der vorstehenden Formel (V) wird dadurch

1 2 hergestellt, daß ein Amin der allgemeinen Formel NHR R ,

1 2
in der R und R die oben definierte Bedeutung haben, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (III) umgesetzt wird.

An Hand der Zeichnungen wird die Erfindung veranschaulicht. Es zeigen:

Fig. 1 Titrationskurven von n-Butylamin-SEPHAROSE

in Wasser, wobei Kurve 1 Werte für SEPHAROSE CL-6B allein. Kurve 2 Werte für n-Butylamin-SEPHAROSE CL-6B, gekoppelt nach der Carbonyldiimidazol-(CDI)-Methode, und Kurve 3 Werte für n-Butylamin-SEPHAROSE CL-6B, gekoppelt nach der Bromcyan-Methode, wiedergibt;

Fig. 2 Titrationskurven von 6-Aminohexansäure-SEPHA-ROSE CL-6B in 0,5-m NaCl-Lösung, wobei Kurve Werte für 6-Aminohexansäure-SEPHAROSE CL-6B, gekoppelt nach der CDI-Methode (103 μΐηθΐ/g) , Kurve 2 Werte für 6-Aminohexansäure-SEPHAR0SE CL-6B, gekoppelt nach der Bromcyan-Methode, und Kurve 3 Werte für 6-Aminohexansäure-SEPHAROSE CL-6B, gekoppelt nach der CDI-Methode (825 μκιοΐ/g) wiedergibt?

- 10 -

809842/0565

Fig. 3 Vergleichskurven der Ausbeute bei der Kopplung von Glycin, wobei die Kurve 1 Werte für eine mit CDI aktivierte Grundmasse und Kurve 2 Werte für eine mit CNBr aktivierte Grundmasse wiedergibt; und

Fig. 4 Vergleichskurven der Ausbeute an aktiven

Gruppen bei verschiedenen Grundmassen, wobei die Kurve 1 die Ausbeute bei Verwendung von vernetzter regenerierter Hydroxypropy!cellulose und Kurve 2 die Ausbeute bei Verwendung von vernetzter Agarose als Grundmasse wiedergibt.

Auf diese Kurven wird bei der Beschreibung der folgenden Beispiele Bezug genommen.

BEISPIEL 1

Aktivierung einer Grundmasse aus SEPHAROSE CL-6B mit Carbonyldiiirtidazol

3 g SEPHAROSE CL-6B (Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals für vernetzte Agarose) in Form eines feuchten Kuchens wurde nacheinander mit jeweils 50 ml Wasser, Wasser/ Dioxan 7:3, Wasser/Dioxan 3:7 und Dioxan gewaschen und in 5 ml Dioxan suspendiert. Die Suspension wurde mit 0,12 g Carbonyldiimidazol (CDI) versetzt und bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde die aktivierte Agarose mit 100 ml Dioxan gewaschen und sofort verwendet. Der Versuch wurde mit Reaktionszeiten zwischen 1/4 Stunde und 6 Stunden wiederholt, und die Produkte wurden in der nachstehend beschriebenen Weise analysiert.

- 11 -

809842/üS

BEISPIEL 2

Aktivierung verschiedener Grundmassen mit Carbonyldiimidazol

a) Y§rnetzung_von_Cellulose_und_re2enerierter_Cellulose

10g Cellulose WHATMAN CC-31 (Warenzeichen der W & R Baiston Ltd.) wurde mit 1 ml Epichlorhydrin in 30%iger Natronlauge bei 65 ⁰C zwei Stunden zur Reaktion gebracht. 10g regenerierte ENKA-Cellulose wurde in gleicher Weise behandelt.

rierterCellulose

Cellulose und regenerierte Cellulose der gleichen Art, wie unter a) angegeben, wurden unter identischen Bedingungen, jedoch in einem geschlossenen Gefäß behandelt, wobei 0,2 ml Epichlorhydrin für die regenerierte Cellulose und 1 ml Epichlorhydrin für die Cellulose verwendet und in beiden Fällen 5 ml Propylenoxid zugesetzt wurde.

c) Aktivierung

SEPHAROSE CL-6B und die Produkte der Verfahren der Beispiele 2a) und 2b) wurden nach dem Verfahrens des Beispiels 1 aktiviert. Reagenzien und Ausbeuten sind in Tabelle 1 aufgeführt .

- 12 -

809842/0565

	Ge wicht g	Tabelle 1	Reaktions- Lösungs zeit mittel h	Dioxan Dioxan DMF⁴	Ausbeute	bez. auf Reagenz %
	3¹ 0,2		0,25 2 0,5	DMF⁴	mmol	43 42 8,6
Grundmasse	0,2	CDI- Menge mmol	0,5	DMF⁴	0,400 0,875 0,080	7,7
SEPHAROSE CL-6B SEPHAROSE CL-6B Whatman- Cellulose	0,2	0,93 2,07 0,93	0,5	DMF⁴	0,074	69
Cellulose³'⁵	0,2	0,93	0,5		0,636	69
Modifizierte Cellulose ²>⁷	0,93		0,644
Regenerierte modifizierte Cellulose⁵»⁸	0,93

Gewicht eines feuchten Kuchens.
Mit Methanol getrocknet.

Mikrogranulare Cellulose Whatman CC-31.
4
Dimethylformamid, über Nacht eingeweicht.

Gefriergetrocknet.

Cellulose CC-31 (10 g) nach der Reaktion mit Epichlorhydrin (1 ml) in 30%iger Natronlauge.

Gleiches Produkt wie unter 6, wobei jedoch noch 5 ml Propylenoxid zugesetzt worden waren.

Aus regenerierter ENKA-Cellulose (10 g) durch Umsetzung mit 0,2 ml Epichlorhydrin und 5 ml Propylenoxid in 30%iger NaOH erhalten.

Aus Figur 4 ist ferner ersichtlich, daß die Ausbeute bei regenerierter vernetzter Hydroxypropylcellulose höher als bei SEPHAROSE CL-6B ist, wenn beide mit CDI aktiviert werden.

BEISPIEL 3

Ankopplung von Liganden oder "Leashes" an die aktivierte Grundmasse

a) Das nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltene Pro-

- 13 -

809842/0565

dukt wurde bei 4 ⁰C über Nacht mit 1,4 g n-Butylamin in 9 ml Wasser bei pH 10 behandelt und dann nacheinander mit 200 ml Wasser, 100 ml 1-m NaCl-Lösung und 200 ml Wasser gewaschen. Zur Titration vorgesehenes Material wurde ferner noch mit 200 ml 0,005-m Salzsäure gewaschen.

b) Nach dem Verfahren des Beispiels 3a) wurde die Kopplung mit 1,6-Diaminohexan wiederholt. Zur Titration bestimmtes Material wurde behandelt, wie vorstehend beschrieben.

c) In gleicher Weise wurde eine nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellte Grundmasse mit 6-Aminohexansäure gekoppelt.

3 g der nach dem Verfahren des Beispiels 3c) gekoppelten SEPHAROSE CL-6B in Form eines feuchten Kuchens wurden über Nacht bei pH 6 und Raumtemperatur mit 0,5 g Äthanolamin und 0,5 g 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinäthyl)-metho-p-toluolsulfonat (CMC) behandelt. Das Produkt wurde wie nach der Kopplungsbehandlung gewaschen.

e) 3 g vernetzte Agarose in Form eines feuchten Kuchens ergaben nach zweistündiger Aktivierung mit 333 mg CDI 875 μΐηοΐ aktive Gruppen (bestimmt durch Titration) und nach dem Koppeln mit 1,4 g 6-Aminohexansäure bei pH 10 (12stündiges Stehen) 390 μΐηοΐ titrierbare Carboxylgruppen (pK 4,7). Dies ergab eine Kapazität von 1,95 mmol/g Trokkengewicht.

BEISPIEL 4 Analyse einer aktivierten Grundmasse

0,2 g der nach dem Verfahren der Beispiele 1 und 2c) erhaltenen aktivierten Grundmassen wurden über Nacht bei Raumtemperatur in 50 ml 0,15-m Natronlauge hydrolysiert.

809842/0565

Von der überstehenden Flüssigkeit wurden sodann 20-ml-Anteile unter Stickstoff in Gegenwart von Hydroxyl-Ionen auf Carbonat titriert. Nach dem Vertreiben allen Kohlendioxids durch Spülen mit Stickstoff bei pH 2,5 wurden die Lösungen über den gleichen pH-Bereich zurücktitriert. Aus dem zweiten Wert ergab sich der Imidazoyl-Gehalt der Probe. Aus der Differenz der beiden Werte ergab sich der Carbonat-Gehalt der Probe.

Eine Elementaranalyse von Proben derselben aktivierten Grundmasse lieferte 6,92 und 6,99% Stickstoff. Der aus den Titrationswerten berechnete Stickstoffgehalt betrug 6,48%.

Nach den Verfahren der Beispiele 3a) bis 3e) hergestellte Grundmassen (0,2 g Trockengewicht) wurden potentiometrisch unter Stickstoff mit Ι-μΙ-Aliquoten 2-m Kalilauge über einen pH-Bereich von 3 bis 11,7 in insgesamt 8 ml Wasser titriert. Die Titrationen wurden mit einem automatischen Titriergerät "Radiometer TTT2" ausgeführt.

BEISPIEL 5 Vergleich mit CNBr-aktivierter SEPHAROSE

Zum Vergleich der in einer Affinitätsgrundmasse aus CDI-aktivierter SEPHAROSE bestehenden Bindung mit derjenigen einer Grundmasse aus CNBr-aktivierter SEPHAROSE [hergestellt nach dem in Analytical Biochemistry (j£, 149—152 (1974) beschriebenen Verfahren] wurde n-Butylamin mit jeder aktivierten SEPHAROSE gekoppelt.

Die Titrationskurven der beiden aktivierten Grundmassen und einer aus unaktivierter SEPHAROSE bestehenden Vergleichsprobe sind in Figur 1 wiedergegeben. Wie ersichtlich, ist die Titrationskurve der nach dem CDI-Verfahren aktivierten n-Butylamin-SEPHAROSE mit derjenigen der unbe-

- 15 -

809842/0565

handelten SEPHAROSE praktisch identisch. Die Titrationskurve der Grundmasse aus CNBr-aktivierter n-Butylamin-SE-PHAROSE zeigt dagegen deutlich die Gegenwart geladener

Gruppen (pK 8; 240 μΐηοΐ/g Trockengewicht) , vermutlich a

Isoharnstoff-Gruppen.

Sodann wurden nach jedem Verfahren 6-Aminohexansäure-SE-PHAROSEN hergestellt und titriert, um zu zeigen, daß Amine nach diesem neuen Verfahren tatsächlich koppeln. Die Titrationskurven der beiden Produkte sind in Figur 2 wiedergegeben. Die Titrationskurven lassen die Gegenwart von Carboxylgruppen erkennen (pK 4,7; 103 und 825 μΐηοΐ/g

Trockengewicht), aber die Kurve der nach dem CDI-Verfahren aktivierten 6-Aminohexansäure-SEPHAROSE ist im alkalischen pH-Bereich mit derjenigen unbehandelter SEPHAROSE CL-6B identisch. Die Titrationskurve der nach dem CNBr-Verfahren aktivierten 6-Aminohexansäure-SEPHAROSE zeigt dagegen die Anwesenheit zweier geladener Gruppen (pK 4,7, Carboxyl,

390 μΐηοΐ/g Trockengewicht j und pK 9,5, Isoharnstoff) in

einem ungefähren Verhältnis von 1,2:1,0. Dies liegt nahe bei dem Erwartungswert von 1:1 für den Fall, daß bei der Anlagerung eines jeden Säuremoleküls eine Isoharnstoff-Gruppe gebildet wird.

Die nach dem CDI-Verfahren aktivierte 6-Aminohexansäure-SEPHAROSE wurde dann mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimids mit Äthanolamin blockiert, und es wurde eine weitere Titrationskurve aufgenommen. Diese ergab die Abwesentheit geladener Gruppen im pH-Bereich von 3 bis 10, woraus hervorgeht, daß nach diesem Verfahren ein "Leash" und ein Ligand eingeführt werden können, ohne daß zusätzlich geladene Gruppen eingeführt oder nicht blockierte Carboxylgruppen abgespalten werden.

Diese Versuche zeigen, daß durch die Aktivierung mit 1,1'-Carbonyldiimidazol und die anschließende Behandlung mit einfachen Aminen keine geladenen Gruppen in die SEPHAROSE CL-6B eingeführt werden.

809842/0566 CR/:,.,-■ ,*.,-..

2805036

BEISPIEL 6

Vergleich der Aktivierungsreagenzien Folgende Aktivierungsreagenzien wurden untersucht:

a) Ν,Ν'-Carbonyldiimidanzol (CDI) in Dioxan;

b) Ν,Ν'-Carbonyldi-I,2,4-triazol (CDT) in Dioxan;

c) N,N'-Carbonyldi-1,2,3-benzotriazol (CDB) in Dioxan;

d) Phosgen in Dioxan (COCl₂);

e) Bromcyan in 1-iti Sodalösung mit nachfolgender Hydrolyse in 1-m Salzsäure für die Dauer 1/2 Stunde (CNBr/HCl);

f) Bromcyan in 1-m Sodalösung zu Vergleichszwecken (CNBr).

Behandelt wurden 3 g eines feuchten Kuchens von SEPHAROSE in 5—6 ml Dioxan oder 12 ml 1-m Sodalösung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

	Reaktions zeit	Tabelle	2	Ausbeute bez. auf Reagenzmenge %
Reagenz	15 min	Reagenz menge mmol	Aktivierungs ausbeute μΐηοΙ/Probe	43
CDI	15 min	0,93	400	35
CDT	7 d	0,93	315	12,7
CDB	30 min	0,63	80	7
COCl₂	4 min	4,45	310	2
CNRr	4+30 min	ca. 6	105	2
CNBr/HCl	ca. 6	105

Bei den beiden ersten vier Reagenzien wurden die Aktivierungsausbeuten durch Hydrolyse des mit Dioxan gewaschenen Produktes über Nacht bei Raumtemperatur in 0,15-m Alkalilösung und Titrieren der überstehenden Flüssigkeit auf Carbonat-Ionen erhalten. Die Ausbeuten bei dem CNBr-Reagenz beruhen auf der Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl gemäß der Reaktion:

809842/0565

ORiGiNAL !NSPECTbD

28050 ο_χ

^ C = NH

( ^ C NH

Somit ergab die Differenz des Stickstoffgehaltes vor und nach der Hydrolyse mit 1-m Salzsäure die Anzahl der gebildeten aktiven Imidcarbonat-Gruppen. Aus diesem Wert ergab sich auch die Anzahl der bei der Hydrolyse erzeugten aktiven cyclischen Carbonatgruppen. Eine Probe des bei der Säurehydrolyse erhaltenen Produktes wurde auch nach der Carbonat-Titrationsmethode analysiert und ergab einen Wert von 150 μΐηοΙ/Probe· Dieser Wert ist höher als der Kjeldahl-Wert, was aber nicht überrascht, da auch die langsame Reaktion

j-

0 - C - NH₂ » l·- OH + CO₃ + NH₃

Il «2 U

stattfindet und daher ein Teil der inaktiven Carbamat-Gruppen ebenfalls "gezählt" werden.

Die Reaktionen zwischen SEPHAROSE und CDI sowie CDT konnten aufgeschoben werden, bis die Aufarbeitung zweckmäßig war; die Aktivierungsausbeuten waren bei Reaktionszeiten zwischen 1/4 Stunde und 6 Stunden identisch» Dies steht in direktem Gegensatz zur CNBr-Methode, bei der die Aufarbeitung so schnell wie möglich vorgenommen werden muß Darüber hinaus konnte bei der Aktivierung mit CDI die Aktivierungsausbeute durch Verwendung von mehr CDI erhöht werden, während bei der CNBr-Methode die aktiven Gruppen nur um 10% vermehrt wurden, selbst wenn die Reagenzmenge vervierfacht wurde.

Bei der Aktivierung der SEPHAROSE mit CDB verlief die Reaktion sehr langsam. Selbst nach 7 Tagen betrug die Ausbeute nur 80 μΐηοΐ, und nur 13% des Reagenzes waren verbraucht worden. Dies ist vermutlich auf einen sterischen

809842/0565 .-.,,.

Hinderungseffekt zurückzuführen. Wie im Falle des CDI wurde gefunden, daS die aktiven Gruppen acyclisch waren. Das Benzotriazol wurde durch Titratxonsanalvse bestimmt.

Die Aktivierung der SEPHAROSE mit Phosgen wurde zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten mit einem großen Überschuß von Phosgen ausgeführt.

Cyclische Carbonate wurden an der SEPHAROSE mit Hilfe des bekannten Verfahrens der Hydrolyse eines nach der CNBr-Methode hergestellten Imidocarbonates in saurer Lösung gebildet. Die Behandlung des Imidocarbonates mit 1-m Salzsäure während 1/2 Stunde ergab ein Produkt mit durchschnittlich 105 nmol Gruppen je 3 g feuchte Agarose. Eine ähnliche Hydrolyse mit 0,001-m Säure ergab 92 μΐηοΐ cyclische Carbonate. In der Regel wurde 1-m Säure verwendet, da festgestellt wurde, daß sie die Grundmasse nicht wesentlich nachteilig verändert, auch nicht bei einer Reaktionszeit von 1/2 Stunde.

BEISPIEL 7 Bestimmung der Kopplungszeiten

Die vorstehend beschriebenen aktivierten Grundmassen wurden bei verschiedenen pH-Werten der Hydrolyse unterworfen. Die Reaktionen wurden durch Messung der zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes erforderlichen Alkalimenge — bzw. der Säuremenge im Falle von pH 5 — überwacht. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionen nicht Reaktionen erster Ordnung waren, da aufeinanderfolgende Halbwertszeiten zunahmen. In Tabelle 3 sind die Gesamtzeiten für die bei Raumtemperatur ausgeführten Reaktionen wiedergegeben.

809842/0565

2805ÖS6

	pH 5	Tabelle	3	Reaktionszeit (h)	pH 11
Aktivierungs-	20		8,5-9 pH 10	1,5
methode	PH	30 10 4 1,5 1 1
CDI CDT CDB

Diese Werte geben ein Maß für die Länge der Zeitspanne, während der man eine Kopplungsreaktion ablaufen lassen sollte, um alle aktiven Gruppen völlig zu entfernen. Auf Grund dieser Feststellungen wurden Reaktionen der mit CDI aktivierten Grundmasse in der Regel über Nacht bei pH 10 und über das Wochenende bei pH 9 ausgeführt, oder die aktivierte Grundmasse wurde mit einem Überschuß Äthanolamin behandelt, um nicht umgesetzte reaktive Gruppen zu blockieren. Die höhere Stabilität der mit CDI aktivierten Grundmasse gegenüber einer mit CNBr aktivierten Grundmasse vereinfacht das Filtrieren und Waschen vor der Addition des Liganden oder "Leashs".

Die mit CDT aktivierte Grundmasse erwies sich als erheblich reaktionsfähiger denn die mit CDI aktivierte Grundmasse und konnte in Fällen verwendet werden, bei denen rasche Kopplungsreaktionen erforderlich waren.

BEISPIEL 8 Vergleich der Kopplungsausbeuten

Zum Vergleich der Reaktionsfähigkeit der aktiven Gruppen einer jeden Grundmasse gegenüber Aminen und Wasser wurde eine Reihe von Kopplungen mit drei Aminen mit unterschiedlichen pK-Werten ausgeführt. Die gewählten Amine waren 6-Aminohexansäure (pK w11), Glycin (pK 9,8) und Glycylglycin (pK 8,1). Außerdem wurde in einem Fall 1,6-Di-

el

aminohexan (pK « 11) versucht. Die Amine waren in einem

el

- 20 -

809842/0565 ORIGINAL INSPECTED

28050-36

großen Überschuß (5,4 mmol) zugegen, und die Gemische wurden entweder durch pH-Messung oder durch Puffern mit 1-m Natriumcarbonat-Lösung bei pH 10 oder einer 1-m Lösung von N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin bei pH 9 auf dem erforderlichen pH-Wert gehalten. Bei pH 11 wurde 6-Aminohexansäure ohne zusätzlichen Puffer verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

	Tabelle 4	6-Amino- hexansäure pH 9 10 11	(umol/Probe)	Glycin pH 9 10	194	Glycyl- gycin pH 9 10	80
	Kopplungsausbeuten	64 130 162	1,6- Diaminohexan pH 10 Dioxan	122	198	224	70
Verfahren	Aktive Gruppen (jjmol/Probe)	86 155 -	130 280	149	—	154	—
CDI	400*	- 43 -	— —	—	38	—	20
CDT	315	- 28⁺-	— —	—	50	—	30
CBD	70	64 65 -	— —	49	39	34	14
COCl₂	80	31 44 -	— —	30		30
CNBr	105		— —
CNBr/HCl	105

* Vor der Reaktion mit Wasser gewaschen.

Bei einer Aktivierung über 2 1/2 Tage wurde ein Wert von 174 erhalten. Alle Werte wurden durch Titration der Grundmasse-Endgruppen mit einer Alkali-Normallösung erhalten.

Bei einem gegebenen Amin waren unter gleichen Bedingungen die Kopplungsausbeuten bei jeder aktivierten Grundmasse sehr ähnlich. Beispielsweise standen bei Verwendung von 6-Aminohexansäure bei pH 10 bei jeder Grundmasse 45—60% der aktiven Gruppen zur Kopplung zur Verfügung. Jedes Amin schien am besten bei einem pH-Wert zu koppeln, der um etwa eine Einheit oberhalb des pK -Wertes lag. Dies ist der

Punkt, bei dem eine weitere Erhöhung des pH-Wertes nicht mehr die Konzentration des freien Amins, sondern die Konzentration der Hydroxyl-Ionen und damit die Hydrolysegeschwindigkeit. Umgekehrt verringert eine Erniedrigung des pH-Wertes zwar die Konzentration der Hydroxyl-Ionen, aber

- 21 -

809842/056S

ORfGiNAL [NSPECTED

auch die Konzentration des freien Amins, so daß ein grösserer Anteil in der protonierten Form vorliegt.

Zusammenfassend läßt sich also feststellen, daß aus Kosten- und Kapazitätsgründen die mit CDT und CDB aktivierten
Grundmassen anscheinend keine Vorteile gegenüber den nach der billigeren CDI-Methode hergestellten aktivierten Grundmassen bieten, außer daß die CDT-Methode größere Kopplungsgeschwindigkeiten ermöglicht. Das CDI-Verfahren scheint
mit der Standard-CNBr-Methode vergleichbar zu sein, bietet jedoch den Vorteil, daß das Reagenz gefahrloser zu
handhaben ist. Phosgen zeigt ebenfalls eine gewisse Eignung zum Ankoppeln von Aminen, ist aber ein ebenso gefährlicher Stoff wie das Bromcyan, so daß seine Anwendung auf die Industrie beschränkt sein dürfte, wo man die niedrigen Kosten des Reagenzes zweifellos schätzen wird.

Es kann jedoch kaum ein Zweifel darüber bestehen, daß der größte Vorteil der mit Carbonylreagenzien arbeitenden Verfahren gegenüber der CNBr-Methode darin besteht, daß bei
der Kopplungsreaktion keine geladenen Gruppen in die Grundmasse eingeführt werden.

BEISPIEL 9

Verwendung von aktivierter Grundmasse als Trypsin-Affinitätsträger

Herstellung ^v22_Tr^£sin-Affinitätsträgern

a) Aktivierte SEPHAROSE CL-6B aus 3 g feuchtem Kuchen und 50 mg CDI wurde über Nacht bei 4 ⁰C mit 0,7 g 6-Aminohexansäure in 9 ml Wasser bei pH 10 behandelt. Sie wurde dann, wie im Beispiel 3a) beschrieben, gewaschen. Zwei 1-ml-Anteile dieses Materials xvurden 24 Stunden bei Raumtemperatur und pH 4,7 mit 0,12 g CMC sowie 5 oder 10 mg p-Aminobenzamidin-hydrochlorid behandelt und danach der gleichen

- 22 -

809842/0566

Waschbehandlung unterworfen.

b) Sojabohnen-Trypsininhibitor als Ligand (CDI-Methode)

1 g SEPHAROSE CL-6B in Form eines feuchten Kuchens wurde mit 0,15 σ CDI aktiviert und in zwei gleiche Portionen geteilt. Jede wurde zwei Tage bei 4 ⁰C mit 15 mg Sojabohnen-Trypsininhibitor in 1 ml Pufferlösung behandelt. Die Portion (1) war 1-molar in Natriumcarbonat-Lösung von pH 10. Die Portion (2) war 1-molar in einer Lösung von Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin mit einem pH-Wert von 9. Die Produkte wurden fünfmal mit 0,1-m Natriumhydrogencarbonat- und 0,1-m Natriumacetat-Lösung (pH 4) gewaschen, die jeweils 0,5 mol Salz enthielten.

c) Anbindung von Sojabohnen-Trypsinhibitor über ein "Leash" (CDI-Methode)

Nach dem Verfahren des Beispiels 9a) wurde die Hälfte der dort angegebenen Menge 6-Aminohexansäure-SSPHAROSE CL-6B hergestellt und 24 Stunden bei Raumtemperatur und pH 4,7 mit 15 mg Sojabohnen-Trypsininhibitor sowie 0,12 mg CMC behandelt. Das Produkt wurde wie im Beispiel 9b) gewaschen.

d) Sojabohnen-Trypsininhibitor als Ligand (C N Br- Methode)

1 g SEPHAROSE CL-6B in Form eines feuchten Kuchens wurde mit Bromcyan aktiviert. Das Produkt wurde in zwei gleiche Portionen geteilt, die wie im Beispiel 9b) mit Sojabohnen-Trypsininhibitor behandelt wurden. Mit Proben von 0,4 bis 1 ml, die in Pasteur-Pipetten gefüllt waren, wurde eine Affinitätschromatographie ausgeführt. Als Ausgleichs-, Auftrags- und Waschpuffer wurde eine 0,05-m Tris-Lösung (pH 8) verwendet; die Desorption wurde mit 3-mm Salzsäure ausgeführt. Alle Lösungen enthielten 0,5 mol/1 NaCl. Auf-

- 23 -

809842/0565

getragen wurden im Falle der Beispiele 9a, 9b und 9d 20 mg Trypsin in 16 ml Pufferlösung und im Falle des Beispiels 9c 1O mg Trypsin in 8 ml Pufferlösung.

Das Trypsin wurde direkt durch UV-Spektroskopie bei 280 nm analysiert.

Die vorstehend beschriebenen Affinitätsträger hatte die in Tabelle 5 angegebenen Trypsinkapazitäten. Bei Kontrollversuchen zeigte sowohl nach der CDI- als auch der CNBr-Methode hergestellte 6-Aminohexansäure-SEPHAROSE keine Affinität für Trypsin. In allen Fällen war die Entfernung des nicht gebundenen Trypsins vollständig (UV-Kontrolle bei 280 nm), und die nachfolgende pH-Verschiebung führte zur raschen Elution des gebundenen Trypsins.

Die mit CDI aktivierten Äffinitätssäulen hatte alle eine hohe Trypsinkapazität, die durchaus den Normen entsprach, die für eine gute präparative Methode gefordert werden. Die Kapazitäten der Grundmassen III und V, bei denen der Sojabohnen-Trypsininhibitor direkt an die mit CDI aktivierte Grundmasse gekoppelt worden war, waren etwas geringer als diejenigen der entsprechenden Säulen IV und VI, die nach der Bromcyan-Methode hergestellt worden waren. Das Fehler geladener Isoharnstoff-Gruppen, die bei der Kopplungsreaktion nach dem neuen Verfahren nicht eingeführt werden, dürfte jedoch der wesentlichste Unterschied gegenüber der Bromcyan-Methode sein. Die höhere Bindungskapazizät des Bromcyan-Produktes könnte sogar mindestens zum Teil auf eine nicht spezifische Bindung zurückzuführen sein.

Die Trypsinkapazitäten der Säulen I und II (Tabelle 5), bei denen der Ligand an eine 6-Aminohexansäure-Trenngruppe gekoppelt war, waren ebenfalls eindrucksvoll.

- 24 -

8098A2/0565

Darüber hinaus bietet die CDI-Aktivierung von Polysaccharid-Grundmassen die Möglichkeit, eine Reihe organischer Moleküle, die Aminogruppen enthalten, unlöslich zu machen. Solche Produkte sind bei der Herstellung unlöslich gemachter Rezeptoren für Radioimmunversuche, unlöslich gemachter Enzyme und von Ionenaustauschgruppen von Wert, die direkt oder über "Leashes" gebunden sind.

Tabelle 5 Kapazitäten von Trypsin-Affinitätsträgern

Affinitätssäule

Trypsinkapazität der Säule

(Beispiele 9a—d) Je ml Je Probe

p-Aminobenzamidin-SEPHAROSE, CDI-Methode

II

Tryρ s in inh ib i to r-6-Aminohexansäure-SEPHAROSE, CDI-Methode

III

Trypsininhibitor-SEPHAROSE, CDI-Methode, Kopplung bei pH

IV

Trypsininhibitor-SEPHAROSE, CNBr-Methode, Kopplung bei pH

Trypsininhibitor-SEPHAROSE, CDI-Methode, Kopplung bei pH

VI

Trypsininhibitor-SEPHAROSE, CNBr-Methode, Kopplung bei pH

12,4; 12,4* 12,2; 13,0* 3,6 2,4 3,8 5,5 8,9

6,4

1,0

2,62

2,10

6,42

* Die beiden. Werte gelten für 5 bzw. 10 mg p-Aminobenzamidin.

- 25 -

809842/0565

BEISPIEL 10

Verwendung von aktivierter Grundmasse zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen

Die in Tabelle 6 aufgeführten Beispiele wurden ausgewählt, um zu zeigen, daß mit Hilfe des CDI-Verfahrens biologisch aktive Moleküle an eine Polysaccharid-Grundmasse unter Bedingungen gebunden werden können, die die Erhaltung ihrer Aktivität ermöglichen (Beispiele b, c und g). Ändere Beispiele ergeben brauchbare Produkte für Radioimmunversuche und Radiorezeptorversuche (Beipiele a, f und g).

Tabelle 6

Weitere Beispiele organischer Moleküle mit Aminogruppen;, die mit Hilfe von CDI

ι an SEPHAROSE CL-6B gebunden wurden

Protein	Kopplungs ausbeute	Proteinkonzentration auf dem unlösl. Träger (μΐηοΐ/g)
a) Sulfanilsäure- azobovalbutnin b) Bovines Thyreoglobulin	90² 94²	0,6³
c) Bovines Thyrotropin (TSH)⁶	88²	3,6³
d) Schweineinsulin	100²	4,5³
e) Humanimmunglobulin	87²	1,5³
f) Kreatinin	—	18⁴
g) 3,3',5-Thyronin⁷	7S²	52⁴

Hergestellt nach dem gleichen Verfahren, das bei der Bindung des Sojabohnen-Trypsininhibitors benutzt wurde. Jede Probe wurde an 2 g (Feuchtkuchen-Gewicht) CDI-aktivierter SEPHAROSE angekoppelt, die mit 50 mg CDI bei pH 5 (0,1-ra Boratlösung) umgesetzt worden war.

Geschätzt aus der Abnahme der optischen Dichte (bei Xniax der Probe) der Waschflüssigkeit nach der Kopplungsreaktion.

- 26 -

809842/0565

Bestimmt aus der Aminosäure-Analyse einer Probe von 0,6 g, die mit 6-n Salzsäure 24 Stunden bei 110 ⁰C hydrolysiert worden war.

Bestimmt aus der Stickstoff-Elementaranalyse.

Bindet erhebliche Mengen von Humanthyroglobulin-Autoantikörpern; das Bindungsvermögen ist demjenigen einer entsprechenden CNBr-aktivierten Grundmasse gleich.

Bindet Antibovin-TSH-Antiköroer von Kaninchen, und 1 ml Gel neutralisierte eine 1:32-Verdünnung eines Standard-Antikörperpräparates völlig.

1 ml Gel neutralisierte eine 1:100-Verdimnung von Kaninchen-Antithyronin-Antikörper völlig.

809842/0565

Leerseite

Claims

COHAUSZ & FLORACK PATENTANWALTSBÜRO SCHUMANNSTR. 97 · D-4000 DÜSSELDORF Telefon: (0211) 68 33 46 Telex: 0858 6513 cop d PATENTANWÄLTE: Dipl.-Ing. W. COHAUSZ · Dipl.-Ing. R. KNAUF · Dr.-Ing., Dipl.-Wirtsch.-lng. A. GERBER · Dipl.-Ing. H. B. COHAUSZ Patentansprüche

1./Aktivierte Grundmasse, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

G-O-C-Y,

Il

in der G eine in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel unlösliche Polysaccharid-Grundmasse und Y eine gut abspaltbare Gruppe ist, die leicht durch ein Amin verdrängt wird.

2. Grundmasse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Grundmasse G vernetzt ist.

3. Grundmasse nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

. gekennzeichnet , daß die Grundmasse G Agarose, Stärke, Dextran, Cellulose, regenerierte Cellulose, Hydroxy-Cp-C.-alkylcellulose oder regenerierte Hydroxy-C^-C.-alkylcellulose ist.

4. Grundmasse nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y Imidazoyl, 1,2,4-Triazoyl, 1,2,3-Benzotriazoyl oder Chlor ist.

32 026

U/-

_ 2 —

809842/058

9 -

5. Grundmasse nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

G-O-C- NR¹R², Ö

in der G die im Anspruch 1 definierte Bedeutung hat

1 2

und von den R , R ein Substituent Wasserstoff oder eine Alkylgruppe und der andere ein Ligand oder ein "Leash" (wie in der Beschreibung definiert) ist.

6. Grundmasse nach Anspruch 5, dadurch g e -

1 2 kennzeichnet , daß R oder R -(CH₀) NH₃, -(CH₉) NHR³, -(CH₀) COR⁴ oder -(CH₀) COOH ist, worin η eine ganze Zahl von 2 bis 12 ist und R und R , die gleich oder verschieden sein können, Reste organischer Verb indungen s ind.

7. Grundmasse nach Anspruch 5, dadurch g e -

1 2

kennzeichnet , daß R und R die Reste eines Peptids, eines Proteins, eines Steroids, einer Aminosäure oder eines Kohlenhydrates sind.

8. Verfahren zur Herstellung einer aktivierten Grundmasse nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß eine in Wasser und organischen Lösungsmitteln unlösliche Polysaccharid-Grundmasse mit einem Carbonylierungsmittel der allgemeinen Formel

0 = Cv ,
Y

in der Y entweder eine gut abspaltbare Gruppe, die leicht durch ein Amin verdrängt wird, oder ein Substi-

809842/0565

2805058

tuent ist, dessen C-Y-Bindung leicht aufgespalten wird, und X=Y oder eine andere leicht abspaltbare Gruppe ist, die sich beim Carbonylieren mit einem Wasserstoffatom verbindet, carbonyliert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß als Carbonylierungsmittel N,N'-Carbonyldiimidazol, N,N'-Carbonyldi-1,2,3-benzotriazol, N,N'-Carbonyldi-1,2,4-triazol oder Phosgen verwendet wird. .

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Carbonylierung in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, Dioxan oder Aceton, ausgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Carbonylierung bei einer Temperatur zwischen 0 und 80 ⁰C, jedoch unterhalb der Zersetzungstemperatür der Grundmasse, ausgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Carbonylierung während eines Zeitraums von 5 Minuten bis 7 Tagen ausgeführt wird.

13. Verfahren zur Herstellung der Grundmasse nach Anspruch oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierte Grundmasse nach einem der Ansprüche

1 2

1 bis 4 mit einem Amin der allgemeinen Formel NHR R ,

1 2
in der R und R dieselbe Bedeutung wie in Anspruch 5 oder 6 haben, umgesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch g e -

kennzeichnet , daß in dem Fall, daß R' oder

2
R -(CH₂) COOH ist, das Produkt weiter mit einem pri-

809842/0566

ι η

NACHOi-HaCHTj

280505R

mären oder sekundären Amin umgesetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß in dem Fall, daß R oder

2
R -(CH₉) NH₉ ist, das Produkt weiter mit einer Carbon-

säure umgesetzt wird.

809842/0565