DE2430356A1 - Verfahren zur markierung von immunoglobulin oder dessen fc-fragment und mittel zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur markierung von immunoglobulin oder dessen fc-fragment und mittel zur durchfuehrung des verfahrens

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Description

RECHTSANWÄLTE 24. JUHI 1974
DR. JUR. DJPL-CHEAA. WALTER BEIL " l3'*
ALFRED HOEPPENER
DR. JUR. DJPL-CHEM. H.-l WOLFP
DH JUR. HANS CHR. BEIL
Ott FIANKFURTAM AAAiN-HOCHST ADaONSTJCASSfcSe
Unsere Nr. 19 355
Pharmacia Aktiebolag Uppsala, Schweden
Verfahren zur Markierung von Iminunoglobulin oder dessen J?G-Fragment und Mittel zur Durchführung des Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment mit ein oder mehreren analytisch feststellbaren Gruppen, wobei das Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment in freier oder gebundener Form vorliegt, durch Kontakt eines mit dem analytisch feststellbaren Gruppen markierten Polypeptide mit dem freien oder"gebundenen Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment. Die Bezeichnung ^Polypeptid" umfaiit in vorliegender Beschreibung und den Ansprüchen auch Proteine.
Ein Verfahren der geschilderten Art ist bekannt. Beispielsweise ist es bekannt, einen markierten Antikörper als PoIypeptid zu verwenden. Das Verfahren zur Herstellung von
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Antikörpern ist jedoch kompliziert. Außerdem stellen Antikörper ein inhomogenes Material mit verschiedener Bindungsfähigkeit dar. wird ein Antikörper gegen ein Immunoglobulin hergestellt, z.B. bei der Herstellung von Antikörpern in einer Ziege gegen Kaninchen-Immunoglobulin, so binden, diese Antikörper nur Immunoglobuline von Kaninchen, im allgemeinen jedoch keine Immunoglobuline anderer Tiere. Jj1Ur jedes zu markierende Immunoglobulin muß man einen besonderen Antikörper herstellen, der zur Reaktion mit dem fraglichen Immunoglobulin befähigt ist. Außerdem führt in den meisten fällen die liiarkierung der Antikörper durch -analvt „ feststellbare Gruppen zu einem Verlust an Immunoaktivität. Ein Ziel der Erfindung ist die weitgehende .Beseitigung dieser Nachteile.
Die vorliegende Erfindung ist im wesentlichen dadurch charakterisiert, äaii man im eingangs beschriebenen Verfahren ein Polypeptid verwendet, welches aus Mikroorganismen erhalten wurde und zur Bindung mit dem iTc-'i'eil des Immunoglobulins befähigt ist, wobei das Polypeptid mit ein mehreren fluoreszierenden oder enzymatisch wirksamen G-ruppen als analytisch feststellbaren Gruppen markiert ist.
Polypeptide mit den genannten Eigenschaften, die aus Mikroorganismen stammen, werden relativ leicht erhalten und können in guten Ausbeuten mit fluoreszierenden oder enzymatisch wirksamen G-ruppen markiert werden.
Ein wesentlicher Vorteil eines markierten Polypeptids mit den genannten Eigenschaften besteht darin, daLS es sich bei Verwendung zum Markieren von Immunoglobulin mit Icimunoglobulinen verschiedener i'ierarten am .b'c-ieil des Immunoglobulins verbinden kann, so daü der J'ab-i'eil frei und zur Bindung von Antigen und Hapten befähigt bleibt. iPrühere Methoden zum Markieren von Antikörpern gegen den. JFc-l'eil von Immunoglobulinen erforderten die üeinigung. des ic-Fragments
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des betreffenden Immunoglobulins, was schwierig ist, und die nachfolgende Immunisierung der Tiere mit diesen J?c-Fragmenten mit jedem Immunoglobulin für jede Tierart.
Ein weiterer Vorteil der Markierungsmethode besteht darin, daß das betreffende Polypeptid, im Gegensatz zu Antikörpern, eine homogene Substanz darstellt, die zu einer .Bindung an das betreffende Immunoglobulin in gleichmäßiger und definierter "weise befähigt ist.
Methoden zum Markieren von Polypeptiden mit fluoreszierenden Gruppen sind in der Literatur ausgiebig beschrieben und können auf Polypeptide aus kikroorganismen, die erfindungsgemäß gefordert werden, angewandt werden, διπθ einfache inethode zur Markierung des Polypeptide besteht in der Einführung einer fluoreszierenden Gruppe, z.B. mithilfe von JTluoreszein-isothioc.yanat. Enzyme (z.B. eine Peroxydase oder eine Hydrolase wie Phosphatase) können an Polypeptide mithilfe" von Bromcyan oder Glutaraldehyd oder nach anderen bekannten Methoden gebunden werden. Die fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppe, mit v/elcher das Polypeptid und daher auch das Icniunoglobulin (oder dessen Fc-Fragment) markiert wird, kann nach konventionellen Verfahren leicht festgestellt und bestimmt werden.
Das Polypeptid aus Mikroorganismen, das gemäß vorliegender ■ Erfindung verwendet wird, kann sogenanntes Protein A aus staphylococcus aureus oder ein Fragment dieses Proteins sein, wobei derartige Fragmente polypeptidartig sind und die Fähigkeit zur Bindung mindestens eines Immunoglobulins am tfc-Teil besitzen. Das vorstehend genannte Protein,· d.h. Protein A und dessen Fragmente aus Staphylococcus aureus^, kann .Immunoglobuline der IgG-Klasse am Fc-Teil binden, «'eitere Beispiele für Polypeptide sind solche aus otaphylococcus epidermis und aus anderen Bakterienarten.
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Die Markierung des Immunoglobulins oder seiner Fc-Fraginente durch, das mit einem fluoreszierenden Mittel oder einer enzymatisch wirksamen Gruppe markierte Polypeptid kann mit Vorteil zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Immunoglobulins oder seines Fc-Fragments oder eines Antigens oder Haptens verwendet werden, wobei das Antigen oder Hapten an den JPab-IDeil des Immunoglobulins gebunden ist oder daran gebunden werden kann.
Die Markierung des Immunoglobulins (oder seines Fc-Fragments) durch das mit einer fluoreszierenden oder enzymatisch, wirksamen Gruppe markierte Polypeptid erfolgt zweckmäßig in flüssigem Milieu, in welchem das markierte Polypeptid ebenfalls löslich ist, vorzugsweise in wässriger Flüssigkeit, unter .Bedingungen, unter denen das Polypeptid an den Fc-ieil des Immunoglobulins gebunden wird. Der pH-wert wird dementsprechend zweckmäßig in der Nähe des Neutralpunkts gewählt, beispielsweise im Bereich von 5 bis 9 oder insbesondere von 6 bis 8.
Falls erwünscht, kann das markierte Immunoglobulin oder sein Fc-Fragment in Lösung durch Gelfiltration oder spezifische Adsorption, oder in ungelöster Form, z.B. gebunden an unlösliches oder unlöslich gemachtes Antigen oder Hapten oder bei direkter oder indirekter Bindung an ein unlösliches Polymer durch Waschen gereinigt werden. Überschuß an freiem markiertem Polypeptid kann während dieser fieinigungsoperation entfernt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Hilfsmittel zur Markierung von Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment in freier oder gebundener Form durch ein oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, das ein mit den analytisch feststellbaren Gruppen markiertes Polypeptid enthält oder aus diesem besteht. Das Hilfsmittel ist dadurch gekennzeichnet, daßjdas Polypeptid aus einem Mikroorganismus stammt und zur Bindung
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an den Jj1C-TeIl des Immunoglobulins befähigt ist, ferner durch ein oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert ist. Das Hilfsmittel wird im vorstehend beschriebenen Verfahren mit Erfolg eingesetzt. Es kann in Lösung, vorzugsweise in wässriger Lösung vorliegen, aber auch in fester Form, z.B. in gefriergetrockneter Form, die leicht vor der Verwendung in Lösung gebracht werden kann.
Die erfindungsgemäße Markierungsmethode kann als wichtige Stufe in die qualitative oder quantitative J3estimmung eines Immunoglobulins in freier oder gebundener Form eingefügt werden, z.B. in Verbindung mit immunochemischen Reaktionen, bei denen das -Immune-globulin z.B. an ein Antigen oder Hapten gebunden vorliegt oder an ein Antigen oder Hapten gebunden-wird.
Das erfindungsgemäße Markierungsverfahren kann auch angewandt werden zur Herstellung eines Eeagenses zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung von Antigenen oder Haptenen in freier oder gebundener Form. Ein derartiges Reagens kann aus einem Reaktionsprodukt aus einem mit ein oder mehreren analytisch feststellbaren Gruppen markierten Polypeptid und einem Immunoglobulin bestehen oder dieses enthalten. Erfindungsgemäß ist das Reagens dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid aus Mikroorganismen erhalten worden und zur Bindung des JPc-Teils des Immunoglobulins befähigt ist, derart, daß der antikörper-aktive Fab-Teil des Immunoglobulins zur Bindung von Antigenen oder Haptenen befähigt ist, wobei die Polypeptide durch ein oder mehrere fluoreszierende oder "enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert sind.
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Das .Reagens kann in i*'orm einer Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, vorliegen. Es kann auch feste -ö'orai besitzen, beispielsweise in gefriergetrockneter -b'orm sein, die vor der Verwendung leicht in Lösung zu bringen ist. Das Reagens wird zweckmäßig in flüssigem Milieu, vorzugsweise einer wässrigen Flüssigkeit, unter solchen -Bedingungen verwendet, daii der antikörper-aktive JTab-i'eil des Immunoglobulins zur .Bindung an Antigene oder Haptene fähig ist. Das Antigen oder Hapten kann in freier oder gebundener J?orm vorliegenbeispielsweise an eine Zelloberfläche oder ein Polymer,zum Beispiel ein unlösliches Polymer, gebunden sein. Das Antigen kann auch an einen anderen Antikörper gebunden sein.
Beispiel 1 Herstellung von Protein A aus S. aureus für Markierungszwecke.
A. Herstellung von Protein A-Rohextrakt aus S. aureus. S. aureus Spezies Cowan I wurde nach der Vorschrift von Sjöquist et al., European J. Biochem. _29 (1972) 572 gezüchtet.
Das Protein A wurde aus den Bakterien mithilfe des Enzympräparats Lysostaphin freigesetzt. Unlösliches Material wurde abzentrifugiert, die flüssige Phase wurde gesammelt. Der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 3,5 eingestellt, dann vvurde unlösliches Material abzentrifugiert und die flüssigkeit wurde gesammelt, ihr pH-Wert wurde mit Natriumhydroxydlösung auf 7,o eingestellt (entsprechend der vorstehend zitierten VorsOhrift). Die so erhaltene flüssigkeit stellt einen Rohextrakt dar, welcher Protein A im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen enthält.
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B. Herstellung von Agarose, an die IgG gebunden ist.
Die Agarose wurde in diesem Jj'all in ü'orm des Handelsprodukts "Sepharose 4 B" (Pharmacia JPine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) verwendet.
Die Agarose lag in Form kleiner Teilchen (40 bis 19o Mikrometer) vor, die in 1/iasser gequollen wurden. Die x'eilchenmasse enthielt 4 Gew.-$ Agarose. Sie wurde zunächst mit Wasser gewaschen. Zu I00 ml gepackter Teilchenmasse und 5o ml Wasser wurden 1o g Sromcyan in 5o ml Wasser bei 2o 0 unter Rühren zugesetzt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5n-Natriumhydroxydlösung bei 1o bis 11 gehalten wurde. Nach 1o Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit o,2-molarer wässriger Natriumcarbonat/ Natriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9»ο bei 4°C gewaschen.
Die mit Bromcyan aktivierte Teilchenmasse wurde in 12ο ml des obigen Puffers von pH 9»o, der 3>o g menschliches IgG (Hersteller Kabi AB, Stockholm, Schweden) enthielt, bei 4°G unter Rühren aufgesch-iämmt. Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse abfiltriert und mit dem obigen Puffer von pH 9,0 gewaschen und dann unter 18-stündigem Hühren bei 4 C in 1,5 1 einer wässrigen Lösung suspendiert, die o,o5M 2-Aminoäthanol und o,2M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat enthielt(pH 9,o). Dann wurde die Teilchenmasse mit einer wässrigen o,1-molaren Natriumphosphatpufferlösung von pH 6,0, die 4M Harnstoff enthielt, danach mit o,1-molarer wässriger Natriump'hosphatpufferlösung vom pH 7,0 gewaschen, bis die OD der Waschflüssigkeit bei 28o Nanometer weniger als o,o1 betrug. Die Gelmasse wurde sodann mit einem o,1M Glycin-HGl-Puffer in Wasser von pH 3,0 gewaschen, danach wurde nochmals mit dem obigen o,1-molaren Natriumphosphatpuffer vom pH 7,0 gewaschen. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 3o mg gebundenes IgG pro ml gepackte Teilchenmasse.
C. Abtrennung des Protein A aus dem Rohextrakt.
Eine Ghromatographiersäule wurde mit I00 ml der gepackten
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Teilchenmasse mit gebundenem IgG und dem pH 7* ο (siehe Stufe -B) gefüllt. 5oo ml des Protein A-Hohextrakts aus btufe A mit pH 7, ο wurden langsam bei 2oo(J durch, die Säule geleitet, wobei die Durchschnittsgeschwindigkeit .auf 5o ml pro Stunde eingestellt wurde. Die i'eilchenmasse der Säule wurde dann sorgfältig mit o,1-molarer Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,ο gewaschen, bis die UD der Waschflüssigkeit bei 28o Nanometer weniger als o,o2 betrug. Das so erhaltene Produkt enthielt ca. 3 mg gebundenes Protein A pro ml gepackte Teilchenmasse.
D. Abtrennung des Protein A von der Teilchenmasse. Das an die gemäß Stufe G erhaltene Teilchenmasse gebundene Protein A wurde durch Bluieren der Säule bei saurem pH beispielsweise mit 1oo ml O,1M Glycin/HCl-Puffer in Wasser bei pH 3,o freigesetzt. Die das Protein A enthaltende aufgefangene Glycin/HCl-Pufferlösung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, worauf das Protein A durch Gefriertrockung in fester ü'orm erhalten wurde. Man erhielt etwa 25o mg Protein A in reiner .Form (anstelle der Dialyse kann eine Entsalzung auch durch Gelfiltration durchgeführt werden). Durch immunologische Tests wurde festgestellt, daß das so erhaltene Protein A keine verunreinigenden Substanzen enthielt.
Da so erhaltene Protein A kann zur Markierung durch ein oder mehrere fluoreszierende Gruppen (z.B. mit ^luoreszeinisothiocyanat) oder mit Enzymen (siehe unten) verwendet werden.
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Beispiel 2
Herstellung von Pol.ypeptidfragmenten des Protein A aua S. Aureus für Markierungszwecke.
A. Herstellung eines Hohextrakts von Polypeptid-.B'raktionen des Proteins A aus S. aureus.
S. aureus der Spezies Uowan I wurde nach der in European J. Biochem. 29 (1972) 572 (Sjöquist et al.) beschriebenen Vorschrift gezüchtet.
Die Bakterien wurden abzentrifugiert und dann mit wässriger o,9$iger Natriumchloridlösung gewaschen. 1oo g Bakterien (Naßgewicht) wurden in 15o ml physiologischer Kochsalzlösung aufgeschlämmt. Hierzu werden 1o mg Trypsin (von Chymotrypsin frei) bei pH 7,2 zugegeben. Die Enzymbehandlung erfolgt bei 3o°C und pH 7,2 während 3o Minuten, worauf 2o mg eines Trypsin/- Inhibitors aus Sojabohnen zugesetzt werden. Dann wird die Suspension zentrifugiert, die überstehende .Flüssigkeit wird aufgefangen und einer öterilfiltration durch Milliporenfilter unterworfen.
Die sterile filtrierte Flüssigkeit enthielt Protein A-ü'ragmente von Polypeptidcharakter im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen. Zum Reinigen der zur Bindung an den ic-Teil .von IgG--Molekülen befähigten .Fragmente werden diese mit Hilfe von Agarose, an welche IgG gebunden ist, isoliert.
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B. Herstellung von Agarose mit gebundener IgG.
Agarose, an die IgG gebunden ist, wird nach der Vorschrift von .Beispiel 1, Teil B hergestellt. Das Produkt enthielt ca. 3o mg gebundenes IgG pro ml gepackte Teilchenmasse.
C. Abtrennung der Polypeptidfragmente des Protein A aus S. aureuso
Eine ühromatographiersäule wurde mit 1oo ml der gepackten Teilchenmasse mit gebundenem IgG vom pH 7»o, die nach otufe -B hergestellt worden war, gefüllt. 1oo ml des iiohextrakts aus Stufe A vom pH 7»o, welcher die Protein A-Polypeptidfragmente enthält, werden langsam bei 2o°C durch die die Teilchenmasse enthaltende Säule geleitet, wobei die Durchflußgeschwindigkeit auf 5o ml pro Stunde eingestellt wird. Die Teilchenmasse in der Säule wird dann sorgfältig mit wässriger o,1-molarer Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7»ο gewaschen, bis die OD der Waschflüssigkeit bei 28o Nanometer weniger als o,o2 beträgt. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 1 mg gebundenes Polypeptid pro ml gepackte Teilchenmasse.
D. Abtrennung der Protein A-Polypeptidfragmente von der Teilchenmasse.
Die an die Teilchenmasse gebundenen Polypeptide werden dann freigesetzt, indem man die Säule bei sujarem pH-Wert, beispielsweise mit 1oo ml o,1-M Glycin/HCl-Puffer in Wasser von pH 3,o, eluiert.
Die hierbei aufgefangene Glycin/HCl-Pufferlösung,■die die zur Bindung des IPc-Teils von IgG-Molekülen befähigten Polypeptide enthält, wird durch Gelfiltration mit Hilfe von "Sephadex G 25" (eingetragenes Warenzeichen, mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran) entsalzt. Beim Gefriertrocknen werden ca. 1oo mg Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 7ooo isoliert. Chromatographisch kann gezeigt werden, daß die Polypeptidfraktion aus mehreren sehr ähnlichen
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Polypeptiden besteht, die sämtliche zur Bindung des Fc-Teils von IgGr-MoIekülen befähigt sind. Unter anderem konnte auch durch immunologische Tests gezeigt werden, daß die Polypeptidf raktion von verunreinigenden Substanzen frei ist.
In entsprechender Weise ist es möglich, zur Bindung mit dem Fc-1I1 eil von IgG--Molekülen befähigte polypeptidf ragmente zu isolieren, indem man zunächst das Protein A gemäß der DOS 2 322 552 isoliert und dann das Protein A in Lösung, z.B. bei pH 8,2, mit Trypsin analog obiger Vorschrift behandelt, worauf man die Polypeptidfragmente mit den entsprechenden Eigenschaften gemäß vorstehender Arbeitsweise absondert durch Bindung an Agarose, die IgG gebunden aufweist, worauf die Polypeptidfragmente abgetrennt werden. Das Polypeptidprodukt kann zu Markierungen verwendet werden.
Beispiel 3 Markierung mit fluoreszierenden Gruppen.
Das nach der Vorschrift von Beispiel 1 oder 2 erhaltene Polypeptidprodukt kann mit fluoreszierenden Gruppen markiert werden. Das Polypeptidprodukt gemäß Beispiel 2 oder Protein A gemäß Beispiel 1 können z.B. mit tfluoreszeinisothiocyanat in konventioneller weise markiert werden. Das mit Hilfe von Fluoreszein-isothiocyanat markierte -Produkt Wird mit Vorteil zur Markierung von Immunoglobulin (oder dessen Fc-Fragment) aus der IgG-KIasserverwendet. Es kann zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Immunoglobulins (oder seines JPc-Fragments) oder eines Antigens oder Haptens verwendet werden, welches an den Fab-Teil des Immunoglobulins gebunden ist oder an diesen gebunden werden kann.
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Die Markierung mit Fluoreszein-isothiocyanat kann beispielsweise v/ie folgt durchgeführt werden: Io mg des Polype'ptidprodukts werden in 1 ml o,25-molarer wässriger Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Pufferlösung vom pH 9j die noch o,45^ Natriumchlorid enthält, gelöst und mit 1 mg Fluoreszein-isothiocyanat vermischt, worauf das Gemisch einige Iviinuten geschüttelt und dann 12 stunden bei 4 C stehen gelassen wird. Dann wird zentrifugiert. Zum Heinigen der das markierte Polypeptid enthaltenden Lösung von nicht umgesetztem Fluoreszein-isothiocyanat wird eine Gelfiltration in einer Säule durchgeführt, die mit Gelteilchen aus Epichlorhydrin vernetzten! Dextran ("Sephadex G-25" eingetragenes Warenzeichen), welche in o,9';aiger wässriger Natriumchloridlösung gequollen sind, gefüllt ist; die Eluierung erfolgt mit der gleichen Lösung. Die das markierte Polypeptid enthaltende Eluatfraktion wird aufgefangen, der pH-Wert wird auf 7 eingestellt. Die Lösung wird in gefrorenem Zustand gelagert. Das Produkt kann auch gefriergetrocknet werden. Es fluoresziert im W-Licht.
Die Markierung kann auch auf analoge weise z.B. mit Tetramethylrhodamin-isothiocyanat durchgeführt werden.
Das markierte Polypeptid kann sich mit dem JTc-Teil des IgG-Moleküls verbinden. Dies kann beispielsweise durch folgende Tests bewiesen werden, bei welchen auf Zellen befindliches IgG markiert und bestimmt wird.
Lymphoide Zellen (Seraphinazellen), auf welchen sich IgG befindet, werden in einer Konzentration von 5 x 1o pro ml eines Phosphatpuffers vom pH 7,2 (sogenannter PB3-Puffer) verwendet. Zu 5o/ul der Zellsuspension werden 5o/ul einer Lösung von mit Fluoreszein markiertem Protein A im PBS-Puffer (o,6 mg markiertes Protein A pro ml) zugegeben, ■^ach einer Stunde werden die Zellen 3 x bei 4°C mit kaltem
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PBS-Puffer (4°C) gewaschen. Danach ergab die Untersuchung mit einem UV-Mikroskop, daß das mit Fluoreszein-isothiocyanat markierte Protein A sich an das IgG- an den Zellen gebunden hatte. Bei Vergleichsversuchen mit Zellen, auf deren Oberfläche sich kein IgG- befand, oder bei denen das IgG durch Trypsin be hand lung entfernt worden Vv ar oder bei denen der Fc-Teil des IgG durch unmarkiertes Protein a blockiert worden war, erhielt man von der Zelloberfläche keine Fluoreszenz.
Beispiel 4 Mit Peroxydase markiertes Protein A.
Peroxydase wurde an Protein A aus 3. aureus (siehe Beispiel 1) in folgender"Weise gekuppelt: 15 mg Peroxydase (aus Meerettich, Hersteller Sigma) wurden in o,2 ml einer 1,25^igen Lösung von Glutaraldehyd in o,1-molarer wässriger Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 gelöst. Die Lösung wurde bei 2o°C 18 Std. stehen gelassen und dann durch eine Säule (Länge 5o cm, Durchmesser 1 cm) geleitet, welche mit gequollenen Teilchen aus mit Spichlorhydrin vernetztem Dextran (Sephadex G-25, eingetragenes Warenzeichen, Hersteller Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und 0,1-molarer wässriger Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 gefüllt war. Zum Eluieren der Säule wurde die gleiche Phosphatpufferlösungverwendet. Die im Hohlraumvolumen eluierten gefärbten Fraktionen wurden bei dieser Gelchromatographie gewonnen. Die aufgefangenen gefärbten Fraktionen wurden durch Ultrafiltration (PM-10-Membran, hält Proteine vom Molekulargewicht oberhalb 1o 000zurück) auf 1 ml eingeengt. Zu der mit Glutaraldehyd aktivierten Peroxydaselösung (1 ml) werden 5 mg Protein A in 1 ml des obigen Phosphatpuffers gelöst, zugegeben. Dann erfolgt Zusatz von o,2 ml einer
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wässrigen 1-molaren Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Purferlöeu sung vom pH 9,5, dann wird das G-emiscn 24 Stunden bei 4 C stehen gelassen, oodann werden o,2 ml einer o,2-molaren wässrigen Lysinlösung zugegeben (der pH-Wert der Lysinlösung war mit 5-molarer wässriger Natriumhydroxydlösung auf 7,ο eingestellt worden). Nach dem Lysinzusatz wird das Gemisch 2 Stunden bei 2o 0 stehen gelassen, dann wird die Lösung durch eine Säule von 1o cm Länge und 1 cm Durchmesser geleitet, die mit gequollenen I.gG—Agarose-'i'eilchen und o,1-molarer wässriger Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 gefüllt ist (Herstellung der IgG--Agarose analog der Vorschrift von Beispiel 1). Das mit Peroxydase gekuppelte Protein A haftet an der IgG- auf den Agaroseteilchen. Durch die Säule wird o,1-molare Natriumphosphatlösung vom pH 6,8 geleitet, die nicht gebundene Substanzen auswäscht. Dann wird die Säule mit einem wässrigen o,1-molaren Glycin/HCl-Puffer vom pH 3,o eluiert. Die gefärbten Fraktionen werden aufgefangen und vereinigt. Die Lösung wird mit 5-molarer wässriger Natriumhydroxydlösung neutralisiert und dann durch Ultrafiltration (TJliii-2-Membran, hält Substanzen vom Molekulargewicht oberhalb ca. 2ooo zurück) auf 1 ml eingeengt. Die Lösung wird dann 12 Stunden gegen einen Puffer vom pH 7>2 dialysiert (Herstellung des Puffers aus 8,ο g NaOl, o,2 g KGl, 1,15 g Na3HPU4 und o,2 g KH2PO4 pro Liter Lösung in Wasser). Die Lösung des mit Peroxydase markierten Protein A kann durch filtration durch einen Milliporenfilter sterilisiert werden, sie wird zweckmäßig bei 40G gelagert.
Protein A mit daran gebundener Peroxydase kann in dem erfindungsgemäiien Verfahren verwendet werden, wobei man die Peroxydase-Aktivität in konventioneller »»eise bestimmt. Entsprechend dem Beispiel 3 konnte aufgrund der Anwesenheit von Peroxydase gezeigt werden, äad das obige Protein A mit daran gebunder Peroxydase an das IgG auf Zelloberflächen gebunden wird.
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Claims (3)

  1. Patentansprüc tie
    1 J Verfahren zur Markierung von Immunoglobulin oder dessen ^c-Fragment durch ein oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, wobei das Immunoglobulin oder sein U1C-Fragment in freier oder gebunder Form vorliegen, indem man das mit den analytisch feststellbaren Gruppen markierte Polypeptid mit dem freien oder gebundenen Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein aus Mikroorganismen erhaltenes Polypeptid, welches zur Bindung an den Fc-rüeil des Immunoglobulins befähigt ist, verwendet und das Polypeptid durch ein oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Markierung des Immunoglobulins oder seines Fc-Fragments zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Immunoglobulins oder seines Fc-Fragments oder eines Antigens oder Haptens verwendet, wobei das Antigen oder ■tiapten an den Fab-Teil des Immunoglobulins gebunden ist oder daran gebunden wird.
  3. 3. Mittel zum Markieren von Immunoglobulin oder seinem Fc-Fragment in freier oder gebundener Form durch ein oder mehrere analytisch feststellbare Gruppen, das aus einem mit den analytisch feststellbaren Gruppen markierten Polypeptid besteht oder dieses enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid aus Mikroorganismen stammt und zur Bindung an den Fc-Teil des Immunoglobulins befähigt und durch ein oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert ist.
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    4· iteagens zur quantitativen odei qualitativen Bestimmung von Antigenen oder Haptenen in freier oder gebundener iOrm, welches aus einem iteaktionsprodukt aus einem durch ein oder mehrere... analytisch feststellbare ■ Gruppen markierten Polypeptid und einem Immunoglobulin besteht, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid aus Mikroorganismen stammt und zur .Bindung an den iTc-l'eil des Immunoglobulins befähigt ist, derart, daß der öntikörper-aktive J?ab-Teil des Immunoglobulins das Antigen oder Hapten binden kann, wobei das Polypeptid durch ein oder mehrere fluoreszierende oder enzymatisch wirksame Gruppen als analytisch feststellbare Gruppen markiert ist.
    Ji1Ur: Pharmacia Aktiebolag,
    Uppsala, Schweden
    Dr.H.J.Wolff
    (Rechtsanwalt)
    409883/1370
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