DE2321951C2 - Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-VaccineInfo
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Description
Die bekannten Diphtherie-Vaccinen enthalten mn *5
Formaldehyd inaktiviertes Diphtherie-Toxin. Em Nachteil dieser Vaccinen ist, daß die Inaktivierung des
Toxins bis zu drei Monaten beansprucht. Auch läßt (die Verträglichkeit der Diphtherie-Impfstoffe bei älteren
Impflingen manchmal zu wünschen übrig.
Es wurde nun zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine mit verbesserter Verträglichkeit ein neuer Weg
zur Entgiftung des Toxins bcschritten, der im Prinzip daraus besteht, daß man das D«phtherie-Toxin (1) mit
«ineni Entgiftungsmittel aus ja) Nikotmamid-adenindinukleotid
oder Adenosin-monophosphat und (b) einem Perjodat, zur Reaktion bringt, (2) einen Überschuß
eines Borhydrids hinzufügt und (3) das Reaktionsprodukt reinigt und zu einer Vaccine aufarbeitet.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine, gekennzeichnet
durch die im Patentanspruch I angegebenen Maßnahmen.
Das eifindungsgemäße Verfahren ist neu. Es kann in
einem Tag ausgeführt werden. Das Verfahrensprodukt ist gut verträglich und frei von Agregatbildungen, die
bei den mit Formaldehyd inaktivierten Impfstoffen Ursache von Unverträglichkeiten sein können.
Als Ausgangsmaterial für die Ausführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens dient Diphtherie-Toxin, das durch Züchten von Diphtherie-Bakterien und
anschließende Isolierung aus dem Kulturfiltrat gewonnen wird.
Die spezifische Flockungsaklivität des als Ausgangsmaterial
dienenden Diphtherie-Toxins beträgt in der Regel 2500 bis 3400 Lf/mg Stickstoff-Toxin, wobei Lf
für Limes l'loculationis verwandt wird. Man versteht darunter diejenige Menge Antigen, die eine Einheit
»Standard Diphtherie Antitoxin for Flocculation Test« ausflockt (Bull. W. H. O. 12, 945, 1955). Das Molgewicht
des Toxins beträgt in der Regel etwa 62 000. Die Ausbeute des Verfahrens kann verbessert werden,
wenn das Toxin vor Umsetzung mit dem Entgiftungsmittel mit Reagenzien behandelt wird, welche
Disulfidbrückcn spalten. Als geeignete Reagenzien 6S
dieser Art kommen insbesondere Dithiothreitol oder Dithioerythritol (CH2SH-CHOH-CHoH-CH2SH) in
Betracht.
Zur Durchführung des Verfahrens wird zunächst eine wäßriue Lösung von Nikotinamid-adenin-dinukleotid
oder Adenosin-monophosphat mit einer - auf Ribose bezogen mindesten- äquivalenten Menge
Pcriodat oxydiert. (1 Mol Nikolinamid-adenin-dinukleotid
mit mindestens 2 Mol Perjodat. I Mol Adeno-Λη-monopluisphat
mit mindesten-. !Mol Perji-ljt). I .·,
empfiehlt sich, keinen sehr großen Uberschui Periode
/u verwenden. Überschüssiges PerjoiL* wird
zweckmäßigerweise vor dem Zusatz des Diphtherie-Toxins zum Entgiftungsmittel durch Umsetzung mit
Dialkoholen oder Polyalkoholen \i. B. Glycerin) oder auf andere ecciiincte Weise zerstört. Anschließend
wird das so erhaltene Entgiftungsmittel bei pH 8,5 bis 10 0 vorzugsweise9.5. mit Diphtherie-Toxin umgesetzt.
Um' eine ausreichende Wirkung zu gewährleisten, muH das mit Perjodat oxydierte Nikotinam.d-adenmdinukleolid
oder das Adenosin-monophosphat im Reakt.onsgemisch gegenüber D.phther.e-Tox.n im Überschuß
mindestens im Molverhällnis 20: 1, angewandt werden Höhere Molvcrhaltnisse, beispielsweise 100:1,
sind zulässig. Das Toxin w.rd zweckmäßig in I "„iger
Lösung bezogen auf Eiweiß dem I ntgiftungsmittel
zugesetzt. Bei dieser Konzentration ergeben sich etwa gleiche Volumen für beide Losungen.
Um dem Reaktionsgemiseh ausreichend Zeit zur
Umsetzung zu lassen, läßt man es zweckmäßig einige Zeit etwa 1^ Stunde bis 3 Stunden, vorzugsweise I
Stunde, bei Raumtemperatur (10 bis 30 C) stehen. Danach wird ein Borhydrid im Überschuß, z. B. in der
10- bis 20fachen molaren Menge. bezogen auf das
Entgiftungsmittel zugefügt. Wieder-im empfiehlt
es sich das Gemisch zur Umsetzung einige Ze.t stehen
zu lassen Nach etwa 12 bis 3G Stunden, vorzugsweise
15 Stunden, werden die Nebenprodukte durch geeignete Maßnahmen entfernt. Hierzu kann eine Dialyse,
ζ B gegen physiologische Kochsalzlosung, dienen oder eine Gelchromatographie, z. B. in einer Säule
(5-100 cm) mit unter dem geschützten Warenzeichen Seohadex G-100 erhältlichen vernetzten Dextran. Es
empfiehlt sich, das Produkt anschließend steril zu nitrieren. Nach Einstellung der Konzentration durch
Verdünnung mit steriler ph' siologischer Kochsalzlösung kann es als 1 luid.mpfstoff verwendet werden.
Das erfindungsgemäße inaktivierte Diphtherie-Toxin kann aber auch mit einem Adjuvans, ι. B. Aluminiumhydroxid,
versetzt und nach entsprechender Verdünnung als Adsorbatimpfstoff verwendet werden.
Als Perjodate eignen sich für die Durchfuhrung des
Verfahrens alle Salze der Perjodsäure, die wasserlöslich
sind und ein nicht-toxisches Kation besitzen. In erster I inie kommen die Alkalisalze der Perjodsäure
in Frage z. B. Natrium- oder Kaliumperjodat.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Borhydride müssen ebenfalls wasserlöslich und nicht-toxisch sein.
Auch hier eignen sich in erster Linie Alkali-Borhydnde
wie Natrium- oder Kaliumborhydrid.
Die Toxizität wird wie folgt geprüft: Gruppen von jeweils 5 Meerschweinchen erhalten 0,5 ml des Produktes
subkutan injiziert, und zwar in Verdünnungen
entsprechend 25 Lf, 50 Lf, 100 Lf, 200 Li und 300 Lf/ml.
Die Tiere werden 28 Tage beobachtet, sie bleiben gesund und zeigen eine normale Gewichtszunahme. Das
Produkt ist somit ungiftig und gut verträglich.
Für die Gewinnung der bekannten Diphtherie-Impfstoffe werden in der Regel bei der Züchtung der
Diphtherie-Bakterien Rinderbouillon enthaltende Nährböden verwendet, die bei der Inaktivierung mit
Formaldehyd Anaphylaxie hervorrufende Bestandteile erzeugen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entstehen
solche Produkte nicht.
Es wurden ein Diphtherietoxoid des Standes der
Technik in einer Dosierung von UM) 1 f und ein Verfahrensprodukt
in einer Dosierung von 4(K) Lf pro Tier an jeweils 10 Meerschweinchen auf Verträglichkeit
geprüft. Die Injektion wurde subkutan vorgenommen. Drei Wochen nach der Injektion erhielten
alle Tiere 0,25 ml Rinderserum intravenös. Dabei zeigten alle Tiere, die mit dem herkömmlichen Diphtherietoxoid
immunisiert worden waren, einen anaphylaktischen Schock. Demgegenüber wiesen die Tiere, die
mit dem Verfahrensprodukt immunisi"rt worden waren, keine Anaphylaxie-Erscheinungen auf.
Die Wirksamkeil des Produktes wird wie folgt bettimmt:
Fünf Meerschweinchen werden subkutan mit 25 If des erfindungsgemäü hergestellten Diphtherie-
i luid-lmpfstoffes immunisiert. In einem Parailel-Ansat/
werden fünf Meerschweinchen mit Al(OH)3 enthaltenden Adsorbatimpfstoff immunisiert. Nach
\ier Wochen erhalten alle immunisierten Meerschweinchen
eine Belastungsdosis von IO dim Diphtherie-Toxm,
wobei dim die Dosis letalis minima bedeutet. Sämtliche Tiere bleiben während der Beobaehtungsieit
von IO Tagen gesund, zwei Kontrolltiere, die nicht immunisiert waren, erhalten zur gleichen Zeit Diphtherie-T
oxin in einer Dosierung von I dim pro Tier. Sie
starben an Diphthericintoxnkation 'nnerhalh von vier
Tagen.
In einem zweiten Versuch wird die Wirksamkeit mit
einem bekannten Diphtherie-Impfstoff verglichen. Fine Gruppe -1 von zehn Meerschweinchen wird mit 25 I.f
des gemäß Beispiel 1 als Adsorbatim>ifstoff hergestellten
Produktes immunisiert. Gleichzeitig wird eine /weite Gruppe B mit 25 Lf eines im Handel erhältlichen,
herkömmlichen Diphtherie-Impfstoffes ebenfalls ein Adsorbatimpfstoff immunisiert. Nach vier
Wochen erhalten die Tiere der beiden Gruppen eine Boosterinjektion, und zwar jedes Tier der Gruppe Λ
5 Lf des gemäß der Erfindung ohne Adjuvansals Fluidimpfstoff
hergestellten Produktes und jedes Tier der Gruppe B 5 Lf Fluidimpfstoff herkömmlicher Art.
Nach weiteren 10 Tagen wird den Tieren Blut entnommen und im Serum werden die Antikörper ausgewertet.
Dabei ergeben die Tiere der Gruppe .4, die mit dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Produkt immunisiert worden waren, einen Diphtherieantitoxintiter von über 80 IE/ml Serum, während das
Serum in Tieren der Gruppe B einen Antitoxintiter zwischen 50 und 65 ΙΕ/ml enthält.
[Die Daten zeigen, daß die Wirksamkeit des nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkts derjenigen der bekannten Impfstoffe überlegen ist.
Eine Internationale Einheit (IE) entspricht der schützenden
Wirksamkeit, die in 0,0628 mg des Diphtherie-Antitoxin-Standards der World Health Organization
(WHO) enthalten ist (Ref. Biological Substances, WHO Publication, Genf [1972], S. 14).
102 mg Nikotinamid-adenin-dinukleotid und 60 mg Natriumperjodat werden in 10 ml destilliertem Wasser
gelöst. Nach 20 Minuten Stehen bei 20 C werden 5 ml eines Diphtherie-Toxins, das 20 000 Lf/ml enthält (somit
insgesamt 100 000 Lf), mit 10 ml einer 5 "„igen
wäßrigen Natriumcarbonatlösung vom pH-Wert 9,5 versetzt, hinzugefügt.
Nach 50 Minuten Stehen bei 20 C werden 100 mg Natriumborhydrid zugefügt. Nach weiterem Mstündigem
Stehen bei 4 C wird das Reaktionsgemisch gegen 0,15 molares Natriumchlorid dialysiert, auf 50 Lf/
ml verdünnt und mit Aluminiumhydroxid versetzt. Die
ίο Ausbeute beträgt 74 000 Lf, somit 74%. Die spezifische
Flockungsaktivität ist gleich der des Ausgangstoxins.
In einem Parallelversuch wird die Isolierung des Reaktionsproduktes anstatt durch Dialyse durch
Chromatographie auf einer Säule (5 · 100 cm) mit vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen
Sephadex G-100 erhältlich ist, vorgenommen. Die entgifteten, von Nebenprodukten befreiten Immunogene
werden auf 50 Lf/ml verdünnt, slerilfiltriert und
so mit soviel Aluminiumhydroxyid versetzt, daß dessen
Konzentration 0,2",, beträgt.
Zehn Meerschweinchen werden mit 0,5 ml (50 Lf/ml) der auf diese Weise hergestellten Vaccine immunisiert.
Nach vier Wochen werden sie mit 10 dim Diphtherie-Toxin belastet. Sämtliche Tiere blieben gesund.
Zur Kontrolle erhalten zehn nieht-immunisierte Meerschweinchen I dim Diphtherie-Toxin, sie starben
innerhalb von vier Tagen durch Diphtherie-Intoxikation.
50 mg Adenosin-monophosphat und 30 mg Natriumperjodat
werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach 20 Minuten Stehen bei Zimmertemperatur werden
5 ml eines Diphtherie-Toxins, das 20 000 Lf, ml enthält (somit insgesamt 100 000 Lf), mit 10 ml einer
5 "„igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung vom pH 9,5
versetzt, hinzugefügt.
Die Reduktion mit Natriumborhydrid, die Chromatographie
und anschließende Aufarbeitung zur Vaccine wird gemäß Beispiel 1 ausgeführt.
Die Ausbeute beträgt 74 000 Lf. Die spezifische Flockungsaktivität ist gleich der des Aujgangstoxins.
Zehn Meerschweinchen werden mit 0,5 ml (50 Lf/ml) der auf diese Weise hergestellten Vaccine immunisiert.
Nr.ch vier Wochen werden sie mit 10 dim Diphtherie-Toxin
belastet. Sämtliche Tiere blieben gesund. Zur Kontrolle erhalten zehn nieht-immunisierte Meerschweinchen
I dim Diphtherie-Toxin, sie starben innerha!b von vier Tagen durch Diphtherie-Intoxikation.
102 mg Nikotinamid-adenin-dinukleotid und 90 mg Natriumperjodat werden in 5 ml destilliertem Wasser
gelöst. Nach 20 Minuten Stehen bei 20 C werden 0,3 ml Glycerin zugesetzt. Nach weiteren 5 Minuten Stehen bei
20 C werden 10 ml eines Diphtherie-Toxins, das 10000 Lf/ml enthält (somit insgesamt 100 (X)O Lf) und das mit
200 mg Dithiothreitol während 30 Minuten bei Zimmertcmpcratur behandelt worden ist, mit 10 ml einer
5%igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung vom pH-Wert 9,5 versetzt und der Nukleotid-perjodatlöbung
hinzugefügt. Die weiteren Schritte erfolgen gemäß Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt 80 000 Lf, somit 80%.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung einer Diphlherie-Vaccine,
dadurch gekennzeichnet,
daß man bei einem pH-Wert, von 8.5 bis 10.0 das
Reaktuiniprodiikt aus einer wäßrigen Lösung \on
Nikotinamid-adcnin-dinukleotid oder Adenosinmonophosphat
und einer, auf die Ribose bezogenen, mindestens äquimolaren Menge Perjodat im
Molverhällnis von mindestens 20:1 mit Diphtherie-T(i\in
umsetzt, einen Überschuß an einem Borhydrid, bezogen auf das Uinsetzungsprodukt zufügt,
einige Zeit stehen läßt, das Produkt reinigt und zu einer Vaccine aufarbeitet.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Diphtherie-Toxin von tier L'rnset/ung
mit einem Disulfid-Brücken spaltenden Reagenz behandelt wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19732321951 DE2321951C2 (de) | 1973-05-02 | 1973-05-02 | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19732321951 DE2321951C2 (de) | 1973-05-02 | 1973-05-02 | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2321951B1 DE2321951B1 (de) | 1974-08-29 |
DE2321951C2 true DE2321951C2 (de) | 1975-05-07 |
Family
ID=5879754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19732321951 Expired DE2321951C2 (de) | 1973-05-02 | 1973-05-02 | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2321951C2 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9110808D0 (en) * | 1991-05-17 | 1991-07-10 | Retroscreen Ltd | Aids vaccine and method for its production |
-
1973
- 1973-05-02 DE DE19732321951 patent/DE2321951C2/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2321951B1 (de) | 1974-08-29 |
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