DE2433883A1 - Geschuetztes polypeptid, im wesentlichen nicht immunogene, enzymisch aktive substanz sowie verfahren zum weitgehenden unterdruekken der immunogenizitaet eines polypeptids - Google Patents

Geschuetztes polypeptid, im wesentlichen nicht immunogene, enzymisch aktive substanz sowie verfahren zum weitgehenden unterdruekken der immunogenizitaet eines polypeptids

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Description

Dipl.-lng. W. DaMke
DipUng. H.-]· LiPPert
Potentanwälte 12. Juli 1974
506 Refrath bei Köln Da. /K
Frankenforster Straße 137
Research Corporation New York, New York (V.Gt.A.)
Geschütztes Polypeptid, im wesentlichen nicht immunogene, enzymisch aktive Substanz sowie Verfahren zum weitgehenden Unterdrücken der Immunogenizität eines Polypeptids
Die Erfindung "betrifft ein geschütztes Polypeptid, eine im wesentlichen nicht immunogene, enzymisch aktive Substanz sowie ein Verfahren zum weitgehenden Unterdrücken der Immunogenizität eines Polypeptids.
Die Verwendung von Polypeptiden in Kreislafsystemen zum Zwecke des Hervorrufens einer bestimmten physiologischen Wirkung ist in der Medizin bekannt. Zu den bekanntesten Polypeptiden, die für diesen Zweck verwen-
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det werden, gehört Insulin, das für die Behandlung von Diabetes verwendet wird. Eine andere Gruppe Polypeptide, denen eine große therapeutische Fähigkeit zugeschrieben wird, ist die Gruppe der Enzyme der verschiedenen Klassen. Der wesentliche Faktor, der die Verwendung von Polypeptiden, insbesondere Enzymen,in der Therapie stark beschnitten hat, geht auf die Tatsache zurück, daß die meisten dieser Verbindungen ein immunogenes Ansprechen im Kreislaufsystem auslösen. Dieses Ansprechen ist die Folge der Produktion von Antikörpern zu den Polypeptiden durch das Kreislaufsystem, in das sie injiziert werden. Dieser Effekt hat die eine, wenn nicht beide der folgenden Sekundärkonsequenzen. Die .erste ist die Zerstörung von Polypeptiden durch die so hervorgerufenen Antikörper, die zweite, schwerwiegendere, ist das Auftreten einer allergischen ¥irkung.
Die Zerstörung des Polypeptides durch die Antikörper dürfte auf die recht kurze Yerweilzeit von Insulin im menschlichen Kreislaufsystem zurückzuführen sein, und deshalb müssen an Diabetes erkrankte Personen sich notwendigerweise recht häufig frische Dosen Insulin injizieren. Für den Fall von Enzymen tritt nicht nur das Problem der Zerstörung des Polypeptide und der anschließenden Aufhebung seiner physiologischen Aktivität auf, sondern auch das im höchsten Maße unerwünschte Auslösen einer allergischen Reaktion.
Wenn es sich als möglich herausstellen würde, Polypeptide so zu modifizieren, daß deren erwünschte physiologische Aktivität ganz oder zumindest in einem erheblichen Teil bewahrt würde und gleichzeitig kein
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immunogenes Ansprechen im Kreislaufsystem entstehen würde, wäre es möglich, diese äußerst wertvollen Verbindungen im Kreislaufsystem· von Mensch und Säugetier ohne die vorstehend genannten Nachteile anzuwenden, und zwar in weit geringeren Mengen, als das bisher möglich gewesen ist.
Die vorstehend genannten Nachteile sind durchaus bekannt, und es sind die verschiedensten Versuche unternommen worden, die Probleme zu lösen. Die Anfügung von Enzymen an unlösliche Träger ist Gegenstand umfangreicher Arbeiten gewesen. Abhandlungen, die sich mit dem Thema befassen, finden sich in Silman und Katchalski, Ann. Rev. Biochem. _3_5_, 873 (1966) und Goldstein, Fermentation Advances, Academic Press, New York (1969), Seite 391· Dieser Lösungsversuch ist zwar von akademischem Interesse, liefert aber keine injizierbaren langlebigen Polypeptide. Ein anderer Lösungsversuch, der unternommen worden ist, um Polypeptide verlängerter "in vivo"-Lebensdauer zu schaffen, sieht die Mikroeinkapselung von Enzymen vor, das in zahlreichen Artikeln von Chang und Mitarbeitern diskutiert worden ist, nämlich Science, 146, 524 (1964); Trans. Am. Soc. 12, 13 (1966); Nature, 2_18_, 243 (1968); Can. J. Physiol. Harmacol. 41, 1043 (1969); Canad. J. Physiol. Pharmacol., 4_5_, 705 (1967). Ein weiterer Lösungsweg lag in der Wärmestabilisierung von Enyzemen durch Anfügen von Carboxymethylcellulose an ein Enzym wie Trypsin (Mitz und Summaria, Nature, 189, 576 (I96I), und die Anfügung von Proteasen an hydrophile Träger (Brummer et al., Eur. J. Biochem., j25_, 129 (1972). Diese Lösungswege liefern die Polypeptide jedoch nicht in löslicher Form, was für die Injektion und die Dosierungskontrolle von injizier-
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baren Substanzen am stärksten erwünscht wird. Ein weiterer Lösungsweg ist das Anfügen von synthetischen Polymeren an polypeptide Proteine. Eine Abhandlung über diese Arbeit findet sich in SeIa "Advances in Immunolgy", jj_, 30 (I966), Acedemic Press, New York. In dieser Arbseit ist gezeigt worden, daß zwar Homopolymere von Aminosäuren fast alle nicht immunogen sind, aber wenn diese Polymere an immunogene Proteine angefügt werden, wird die immunogene Aktivität nicht abgeschirmt, und es werden Antikörper in Testkreislaufsystemen erzeugt. Beispielsweise ist zwar Polyglycin selbst nicht immunogen, wenn es aber an ein Protein angefügt wird, wird dieses "Verbundprotein ein Hapten. Entsprechend ist zwar Dextran selbst leicht immunogen, wenn es aber mit Insulin gekoppelt wird, wird das Insulin-Dextran-Koppelmaterial doch erheblich immunogen .
Erfindungsgemäß werden Polypeptide geschaffen, die mit Polymeren gekoppelt sind, welche im wesentlichen nicht immunogen sind und die einen erheblichen Teil der erwünschten physiologischen Aktivität des Grundpolypeptids bewahren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Polymer mit gerader Kette modifiziert, zweckmäßigerweise an einem Ende derselben, entweder durch Ändern der Endgruppe oder durch Anfügen einer Kopplungsgruppe daran, die Aktivität gegenüber einem Polypeptid hat, wobei eine Reaktion des aktivierten Polymers mit dem Polypeptid erfolgt. Die geschützten Polypeptide gemäß der Erfindung sind in wässriger Lösung in das Kreislaufsystem von Mensch und Säugetier oder auch intramuskulär injizierbar
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und rufen im wesentlichen kein immunogenes Ansprechen hervor.
Die zu Schutzzwecken im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polymere haben ein im wesentlichen lineares ätherales Rückgrat oder Kohlenstoff rückgrat. Es ist festgestellt worden, daß durhh Verwenden von Polymeren mit verzweigten Ketten Substanzen entstehen, die ein immuogenes Ansprechen entstehen lassen. Nichtsdestoweniger ist ein gewisses Map an Substitution im Rückgrat zulässig. Beispielsweise kann das Rückgrat durch Hydroxygruppen, Alkylgruppen oder Alkoxygruppen substituiert sein, vorausgesetzt, daß die Alkyl- oder Alkoxygruppen weniger als 5> vorzugsweise 2 oder weniger Kohlenstoffatome enthalten. Zu den brauchbaren Polymeren können genannt werden Polyäthylenglycol, Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol, und von diesen wird Polyäthylenglycol besonders bevorzugt.
Vorzugsweise wird ferner mit einer Polymerkettenlängenregion von zwischen 500 und 5.000 Dalton gearbeitet, wobei etwa 750 bis 2.000 Dalton besonders bevorzugt wird.
Es gibt mehrere Arten der Kopplung des Polymers mit dem Polypeptid, und diese werden im einzelnen nachstehend noch beschrieben. Man muß sich vor Augen halten, daß die Anteile irgendeiner bestimmten Polypeptidart, die eine erwünschte physiologische Wirkung hat, sich von einem Peptid zum anderen ändern können. In bestimmten Enzymen können also ein oder zwei Aminosäurereste hauptsächlich für diese erwünschte . physiologische Aktivität verantwortlich sein. Bei der Wahl eines Kopp-
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lungsmittels zum Koppeln eines Polymers mit dem Polypeptid ist es wünschenswert, mit Kopplungsmitteln zu arbeiten, die keine Affinität für diese besonderen aktiven Arten haben. Zwar ist das ein erstrebensx<rertes Ziel, es läßt sich aber nicht immer absolut einhalten. Es ist deshalb notwendig, in Einzelfällen einen Kompromiß zu schließen, d.h. einen bestimmten Teil der Aktivitätsbewahrung zu opfern und stattdessen einen erheblichen Teil an ITicht-Immunogenizität zu erhalten. Die Endergebnisse, die man erhält, hängen nicht nur von dem Kopplungsmittel ab, mit dem gearbeitet wird, sondern auch von den relativen Anteilen von Eeaktionsmitteln und dem Molekulargewicht des Polymers, nichtsdestoweniger hat es sich für die meisten Polypeptide als zweckmäßig erwiesen, mit zwischen 10 und 100, zweckmäßigerweise zwischen 15 und 50 Mol Polymer pro Mol Polypeptid zu arbeiten. Beim Arbeiten mit diesen relativen Anteilen ist festgestellt worden, daß mindestens 15$ der physiologischen Aktivität bewahrt bleibt. Zwar ist der Umfang der Erfindung nicht darauf beschränkt, vorzugsweise werden aber Bedingungen geschaffen, bei denen mindestens 40?£ der physiologischen Aktivität bewahrt bleibt.
Die erfindungsgen äßen Maßnahmen sind allgemein für Polypeptide anwendbar, sie sind aber von besonderem Interesse für Anwendungsfälle, bei denen Enzyme und Insulin vorkommen. Zu den Enzymkategorien, mit denen gearbeitet werden kann, gehören:
Oxidoreductase wie TJrate, nämlich Sauerstoffoxidoreductase (1.7·5·3j "TJricase"), Wasseerstoffperoxid, nämlich Wasserstoffperioxid-Oxido-
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reductase (1.11.1.6; "Catalase"), Cholesterol, reduziert - NADP, nämlich Sauerstoffoxidoreductase (20-Beta-Hydroxylierend) (1.14·1·9ϊ "Cholesterol-20-Hydroxylase").
Transferase wie UDP-Glucuronat-Glucuronyltransferase (Akzeptor unspezifisch) (2.4.1.17; "UDP-Glucuronyltransferase"), UDP-Glucose wie Alpha-D-Galactose-1-Phosphat-Uridylyltransferase 2.7.7.12).
Hydrolase wie Mucopeptide-N-Acetylmuramylhydrolase (5-2.1.17; Lysozym), Trypsin (3.4.4·4)» L-Asparaginaminohydrolase (3-5*1.1 ; "Asparaginase"). Lyase wie Fructose-1,o-Diphosphat-D-Glyceraldehyd-J-Phosphat-Lyase (4.1.2.12: "Aldolase").
Isomerase wie D-Xylose-Ketolisomerase (5·3·1·5» Xyloseisomerase). Ligase wie L-Citrullin, nämlich L-Asparatateligase (AMP)(6·3·4«5)·
Die Nichtimmunogenizität der erfindungsgemäßen Produkte kann durch Standard-Immunologietechniken demonstriert werden. Beispielsweise wird das nicht geschützte Polypeptid in ein Versuchstier injiziert, und das damit erzeugte Antiserum wird gegen das geschützte Polypeptid auf antigenes Ansprechen durch Techniken wie Geldiffusion, Komplementärfixierung oder dergleichen getestet. Intradermale Injektionen des geschützten Polypeptide zeigen ebenfalls keine sofortige oder verzögerte Hypersensitivität. Wenn umgekehrt Versuchstiere mit dem geschützten Polypeptid injiziert wurden, zeigten die erhaltenen "Antisera" von den Versuchstieren keine Reaktion im Geldiffusionstest oder im Komplementärfixierungstest, und die Injektion mit dem ungeschützten Polypeptid zeigte keine sofortige oder verzögerte Art Hypersensitivitätsreaktion.
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Wie vorstehend erwähnt, kann die Art des Schutzes in zwei Kategorieren fallen. In der ersten Kategorie wird eine Kopplungsgruppe der Endgruppe des Polymers hinzugefügt. In der anderen bevorzugten Methode wird die Gruppe am Endkohlenstoffatom, beispielsweise an der Hydroxygruppe, durch Umwandlung beispielsweise in eine Aminogruppe modifiziert, die dann mit dem Polypeptid gekoppelt wird, indem mit Kopplungsmitteln gearbeitet wird, die für diesen Zweck bekannt sind.
In der ersten Kategorie können als geeignete Kopplungsgruppe Cyanurchlorid oder -fluorid genannt werden. Dabei wird Polyäthylenglycol (nachstehend PÄG) in einem geeigneten asaktionsinerten Lösungsmittel wie einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, zweckmäßigerweise wasserfreies Benzol mit einem geringen Anteil einer schwachen Base wie Natriumcarbonat und Cyanurchlorid in Zugabe dazu aufgenommen. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Wasser abgeschreckt, unlösliches Material wird entfernt, und daran schließt sich die Entfernung des Lösungsmittels an, vorzugsweise unter reduziertem Druck, damit 2-PÄG-4-Hydroxy-6-Chlor-1,3»5-Triazin entsteht. Die in dieser Weise hergestellten aktivierten Polymere werden dann mit einer Lösung von Polypeptid in einer geeigneten Pufferlösung zur Reaktion gebracht. Fach vollständiger Reaktion wird das keine Reaktion eingegangene aktivierte Polymer entfernt, vorzugsweise dadurch, daß ein Kontakt mit einem Gelpermeationsgel wie Sephadex G-50 hergestellt wird, und das geschützte Polypeptid wird entfernt und in der üblichen Weise gereinigt. Da diese Produkte als Polypeptide angesehen werden müssen, muß während des Reinigungsverfahrens darauf geachtet werden, daß sie nicht denaturiert werden. Es ist deshalb wün-
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sehenswert, sie entweder in einer gepufferten wässrigen Lösung zu belassen oder, wenn das als wichtig angesehen wird, sie im festen Zustand zu isolieren, wobei diese Isolierung durch das bekannte Verfahren wie die Lyophilisierung durchgeführt wird.
Eine andere geeignete Endgruppe ist die Acylazidendgruppe. Bei deren Herstellung wird das Endhydroxyl des Polymers mit Chloressigsäureanhydrid zur Reaktion gebracht, und anschließend mit Diazomethan, um das Methylester des Carbomethoxyäthers zu erhalten. Eine Behandlung mit Hydrazin führt zum entsprechenden Hydrazid, das bei Behandlung mit Nitrylsäure das gewünschte Acylazid ergibt.
Die Succinatgruppe kann ebenfalls als eine Kopplungsgruppe verwendet werden. In dieser Variante wird das Glycol, beispielsweise PÄG oder PPG (Polypropylenglycol) in einer geeigneten reaktionsinerten Lösung in Gegenwart einer milden Base wie Natriumbicarbonat aufgenommen und mit einem Dihalosuccinsäureanhydrid wie Dibromsuccinsäureanydrid behandelt. Das auf diese Veise hergestellte PÄG-Dihalosuccinat - als Beispiel - steht dann zur Reaktion mit einem Polypeptid zur Verfugung.
Ferner steht die Anthranilatart zur Verfügung. In dieser Variante wird das Glycol wieederum in einem reaktionsinerten Lösungsmittel aufgenommen und mit Isatoinsäureanhydrid behandelt, um das Anthranilatester zu erhalten, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet wird, bestehend aus der Diazotisierung. Die Diazotisierung wird in der
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üblichen Weise durchgeführt, "beispielsweise wird das Anthranilatester in Wasser aufgenommen, die Lösung wird sauer gemacht, zweckmäßigerweise mit Eisessigsäure, gekühlt, und es wird Natriumnitrat zugesetzt. Das in dieser Weise hergestellte Diazoniumsalz steht zur Reaktion mit Polypeptiden zur Verfügung.
Eine interessante andere Variante unter Verwendung von Azidogruppen sieht die petrochemische Anfügung einer Azid-Kopplungsgruppe vor. Beispielsweise wird das Glycol in einer Pufferlösung mit 4-I1IuOr-3-Mtrophenylazid behandelt, das unreagierte Azid wird dann entfernt, vorzugsweise durch Dialyse.
Das fragliche Enzym, beispielsweise Lysozym, wird in Wasser aufgenommen, mit dem Reaktionsmittel zur Reaktion gebracht und erneut bestrahlt, damit beispielsweise PÄG-2-Nitrophenyllysozym entsteht.
In der vorstehenden Erörterung ist der Kohlenstoffatom des Polymers, an dem die Kopplungsmittel angefügt wird, das, das die Endhydroxygruppe trägt. Im Falle beispielsweise von PPG und PÄG gibt es keine Probleme, bei PVA gibt es jedoch potentielle Probleme. Zu beachten ist, daß PVA sekundäre (Rückgrat-) Hydroxyle und primäre (End-) Hydroxyle enthält. Die Reaktivität der primären Hydroxyle ist wesentlich stärker als die der sekundären Hydroxyle. Vorsusgesetzt also, daß die Reaktion mit der aktivierenden Gruppe, beispielsweise Cyanurchlorid, in Gegenwart von überschüssigem Polymer vonstattengeht, erfolgt der größte Teil der Reaktion mit den Endhydroxylen. Das ist erstrebenswert. Wenn jedoch eine
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Rückgratreaktion erwünscht wird, kann das durch Erhöhen der Menge an Aktivierungsmittel erreicht werden (z.B. Cyanurchlorid^ mit dem.gearbeitet wird. Bas tatsächliche Verhältnis von primärer zu sekundärer Reaktion wird natürlich genauso durch die andere riReaktionsbedingungen bestimmt.
Alternativ kann die Endhydroxylgruppe in eine Aminogruppe umgewandelt werden. Bei diesem Verfahren wird das Polymer an seiner Endhydruxylgruppe entweder mit einem SuIfonierungsmittel wie Toluolsulfonylchlorid oder mit einem Halogenisierungsmittel wie Triphenylphosphin in Kohlenstofftetrachlorid oder Triphenylphosphin und einem geeigneten N-HaIosuccimid zur Reaktion gebracht. Das auf diese Weise hergestellte Halid oder Tosylat wird dann mit Natriumazid behandelt und mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert, um die entsprechende Endaminoverbindung zu liefern.
Das Polymer, das die Endaminogruppe trägt, wird dann mit einer Carboxygruppe des Polypeptide unter Anwendung bekannter Verfahren gekoppelt. Die Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids wie i-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinäthyl)-Carboiimid, wobei Metho-p-Toluol besonders bevorzugt wird, kommt dabei in Betracht. Es entsteht damit eine Amidoverbindung, bestehend aus dem Stickstoff des Polymers und der entsprechenden Carbonylgruppe des Enzyms.
Anstelle einer direkten Kopplung der Aminogruppe zur Bildung einer Amidobindung mit dem Polypeptid kann die Kopplung über eine Maleimidgruppe
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vonstattengehien. In dieser Variante wird Omega-Amino-PÄG mit Maleinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht, und das entstehende N-PÄG-Maleimid wird mit dem gewünschten Polypeptid zur Reaktion gebracht.
Nachstehend bezeichnet die angefügte Zahl (z.B. PÄG 750) das Molekulargewicht in Dalton des in Frage stehenden Polymers.
BEISPIEL I
Urat: Sauerstoffoxidoreducatase (Uricase)(i.7·3·3)-PÄG—Carbomethyl-Konjugation
a) Herstellung von PÄG
1. Herstellung von PÄG-Methyl-Carbomethoxyester
PÄG 750 (2,0 g) wird in flüssigem Ammoniak (50 ml) aufgelöst, und die Lösung wird mit Natrium behandelt, bis die blaue Farbe 5 Minuten lang bestehen bleibt. Das Ammoniak läßt man mit einem Strom trockenen Stickstoffs verdampfen. Der Rest wird mit Methylchloracetat (5 ml) behandelt, und das Gemisch läßt man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, und schließelich wird es eine Stunde lang bei 100 erhitzt. Das überschüssige Reaktionsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt, um PÄG-Methylcarbomethoxyester zu erhalten.
2. Herstellung von PÄG-Methoxycarbohydrazid
PÄG-Methylcarbomethoxyester (2,0 g), Methanol (300 ml) und Hydrazinhydrat (15 ml) werden über Nacht in Rücklauf versetzt, und die Lösung
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wird unter reduziertem Druck verdampft, um PÄG-Methoxycarbohydrazid zu erhalten.
3· Herstellung von PÄG-Carboxymethylazid
Das vorstehende Hydrazid (1,0 g) wird in 2$dger Salzsäure (150 ml) aufgelöst, und ^fcige Natriumnitritlösung ( 9 ml) wird langsam unter Eühren zugesetzt, und man läßt die Lösung 2o Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, um eine Lösung aus PÄG-Carbcxymethylazid zu erhalten, da in der Kopplungsphase verwendet wird.
b) Kopplung von Urat: Sauerstoffoxidoreductase mit PÄG-Carboxymethylazid
Die das Azid enthaltende Lösung (16 ml, wie in Teil 3 vorstehend hergestellt) wird auf einen pH-Vert von 8,7 durch das Zusetzen von Natriumphosphat eingestellt. Uricase (25 mg) wird zugesetzt, und die Lösung wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur umgerührt. Die Lösung wird dialysiertund das modifizierte Enzym wird durch Chromatographie mit Sephadex G-50 isoliert. Gegebenenfalls ergibt die Lyophilisierung das geschützte Enzym in trockener Form.
Entsprechend den vorstehenden Yerfahrensschritten, jedoch unter Verwendung von Asparaginase anstelle von Uricase, erhält man die entsprechende PÄG-Asparaginase-Konjugation. Entsprechend kann PPG anstelle von PAG verwendet werden, um das entsprechende PPG-Uricase- und -Asparaginase-Konjugat zu erhalten.
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BEISPIEL II
Wasserstoffperoxid: Wasserstroffperoxid-Oxidoreducta.se (1.11.1.6; "Catalase")-2-PÄG-4-Hydroxy-1,5,5-Triazin-6-yl-Konjugation
a) Herstellung von PÄG-4-Hydroxy-6-Ghlor-1,5»5-^riaHzin
PÄG 750 (50 g, 0,04 Mol) oder PAG 2.000 (80 g, 0,04 Mol) wird in 150 ml wasserfreies Benzol aufgelöst, das 8 g Na2CO enthält. Die Lösung wird auf 10 abgekühlt, und es wird Cyanurchlorid (7»38 g, 0,04 Mol) zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 10 umgerührt. Wasser (5 ml) wird zugesetzt, und die Lösung wird dann auf Raumtemperatur für mehrere Stunden gebracht, und dem schließlich sich eine Erwärmung auf 40 über Nacht an. Unlösliches Material wird abgeschleudert, und Lösungsmittel wird durch reduzierten Druck in einem Drehverdampfer bei 40 entfernt. Ein kleiner Anteil Niederschlag, der mitunter während der Konzentration erscheint, wird durch das Zusetzen einer kleinen Menge Benzol entfernt, um die Viskosität zu senken, gefolgt von einem Schleudern und einer Wiederkonzentrierung. Das PÄG-4-Hydroxy-6-Chlor-1»3»5-Triazin, eine viskose Flüssigkeit bei 40 , wird im Gefrierfach gelagert.
b) Herstellung von PAG-HTA-Catalase-Eonjugation
Catalase (60 mg, 8,7 χ 10 Mol) wird in 3 ml 0,05-M-Boratpufferlösung aufgelöst, die einen pH-Wert von 9,0 hat. PÄG 750 (470 mg) wird zugesetzt. Nach drei Stunden wird der pH-Wert auf 9»0 mit Natriumhydroxid
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erneut eingestellt, und die Lösung wird bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Der pH-Wert wird erneut auf 9>0 eingestellt. Nicht in Reaktion getretenes PÄG wird entfernt, indem die Lösung durch eine Säule Sephadex G-50 geleitet wird. Die PÄG-HTA-Catalase-Konjugation wird in einem Rotationsverdampfer bis auf 1 mg Protein/ml konzentriert und im Gefrierfach gelagert (HTA = -4-Hydroxy-1,3,5-Triazin-6-yl).
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren, jedoch unter Verwendung von
Carbowax 2000 wird ein ähnlich gekoppeltes Produkt erhalten. Wenn entsprechend nach dem vorstehenden Verfahren, jedoch anstelle von Catalase, D-Xyloseketolisomerase (Xyloseisomerase) oder Insulin verwendet wird, erhält man die entsprechenden PÄG-HTA-Xyloseisomerase- und PÄG-HTA-Insulin-Konugationen.
BEISPIEL III
Cholesterol, reduziert - NADP: Sauerstoffoxidoreductase (20-Beta-hydroxylierend) (1.14.1.9; Cholesterol-20-Hyxroxylase)-N-PÄG-Maleimid-Konjugation
a) Herstellung von N-PÄG-Maleimid
Maleinsäureanhydrid (1,0g, 1/100 Mol), Benzol (50 ml) und Omega-Amino-PÄG (1/200 Mol) werden zwei Stunden lang in Rückfluß versetzt. Die Lösung wird unter reduziertem Druck verdampft und bei 2000C in einem
Strom trockenen Stickstoffs für die Dauer von zwei Stunden erhitzt.
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b) Reaktion von H-PÄG-Maleimid mit ChJesterol-20-Hydroxylase
Das Enzxm (25 mg) wird einer Lösung H-PÄ*G-Maleimid (70 mg) in 0,1M-Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7>0, 10 ml) zugesetzt. Die Lösung läßt man bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehen. Die Lösung wird dialysiert, und das gewünschte Produkt wird von dem Dialysat durch Chromatographie auf Sephadex G-50 isoliert, um eine Lösung der Enzym-PÄG-Konjugation zu erhalten, die gegebenenfalls lyophilisiert werden kann.
BEISPIEL IV
TJDP-Glucuronat-Glycuronyltransferase (Akzeptor unspezifisch)(2.4.1.17; "UDP-Glycuronyltransferase")-PÄG-Succinat-Konjugation
a) Herstellung des PÄG-Dibromsuccinat
PÄ'G (1,0 g) wird in trockenem Benzol (10 ml) aufgelöst, das Natriumbicarbonat (1,0 g) enthält. Dibromsuccinsäureanhydrid (0,5 s) wird zugesetzt, und die Lösung wird über Nacht umgerührt. Die Lösung wird gefiltert, und das Filtrat wird unter reduziertem Druck konzentriert, um das PÄG-Dibrom-Succinat zu erhalten.
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren wird bei Verwendung von Diodoseuccinsäureanhydrid anstelle von Dibromsuccinsäureanhydrid das entsprechende PÄG-Diodosuccinat erhalten.
b) TJDP-Glucuronyltransferase-PÄG-Succinat
Das Enzym (50 mg) in einer Pufferlösung (10 ml, pH-Wert 7»0) wird langsam mit PÄG-Dibromsuccinat (IOO mg) in Wasser (5 ml) bei Raumtemperatur
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behandelt. Der pH-Vert wird zwischen 7-8 gehalten. Die gewünschte PÄG-Enzym-Konjugation wird durch Chromatographie auf Sephadex G-50 isoliert. Gegebenenfalls kann das Produkt durch Lyophilisierung isoliert werden.
BEISPIEL V
UDP-Glucose: Alpha-D-Galactose-1-Phosphat-Uridylytransferase (2.7.7.12)-PÄG-Anthranilat-Konjugation
a) Herstellung von PÄG-Anthranilatester
PÄG (1,0 g) wird in trockenem Benzol,(10 ml) aufgelöst, das Natriumbicarbonat (1,0 g) enthält. Isatoinsäureanhydrid (0,25 g) wird zugesetzt, und die Lösung wird über Nacht umgerührt. Die Lösung wird gefiltert, und das Filtrat wird bei 40 C unter reduziertem Druck verdampft, um PÄG-Anthranilatester zu erhalten, der im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wird.
1) Herstellung von PÄG-Anthranilatester-Diazoniumsalz
Der wie vorstehend hergestellte PÄG-Anthranilatester wird in Wasser (5,0 ml) aufgelöst, und Eisessigsäure (0,5 ml) wird zugesetzt, wobei die Lösung auf 0-2 gekühlt wird und eine konzentrierte Lösung Natriumnitrit tropfenweise unter Umrühren zugesetzt wird. Das Zusetzen von Natriumnitrit hört auf, wenn Nitrylsäure vorhanden ist.
b) Kopplung von UDP-Glucose: Alpha-D-Galactose-1-Phosphat-Uridylyltransferase mit PÄG-Anthranilatesterdiazoniumsalz
Das Enzym (25 mg) wird in einer Pufferlösung (5 ml, pH-Wert 7-7»5) auf-
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gelöst, und die Lösung wird auf 0-2 gekühlt. Diese Lösung wird tropfenweise der diazotisierten Lösung zugesetzt, die wie vorstehend hergestellt worden ist. Der pH-Wert wird auf 7-7»5 gehalten. Nach zwei Stunden läßt man die Lösung auf Raumtemperatur kommen, und man filtert sie. Die gewünschte "Verbindung wird durch Sephadex-Chromatographie isoliert. Gegebenenfalls kann die Konjugation in fester Form durch Lyophilisierung isoliert werden.
BEISPIEL VI Kucopeptid-N-Acetylmuramylhydrolase (3.2.1.17)-4-Azido-2-gitrophenyl-PÄG
a) 4-Azido-2-gritrophenyl-PÄG·
PAG (1,0 g) wird in einer Boratpufferlösung mit einem pH-Wert von 9,8 (100 ml) aufgelöst, und die Lösung wird mit 4-Fluor-3-Nitrophenylazid (1,0 g) in Aceton (10 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird bei 40° über Nacht umgerührt und gefiltert. Das Filtrat wird gegen Wasser dialysiert, gefiltert und gefriergetrocknet.
b) Photochmemische Bindung von Lysozym mit 4-Azido-2-Nitrophenyl-PÄG
Lysozym (60 mg) wird in J> ml Wasser aufgelöst, und es wird 4-Azido-2-Nitrophenyl-PÄG (50 mg) zugesetzt. Die Lösung wurde 18 Stunden lang bei 40 C mit zwei 125-Waatt-Wolframlampen bestrahlt, die in einer Lösung Natriumnitrit eingetaucht waren (um alle Strahlen aufzufangen, die eine kürzere Wellelänge als 400 nm haben). Das Präparat wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-50 gereinigt, um PÄG-2-Nitrophenyllysozym-Konjugation bei Eluierung zu erhalten. Gegebenenfalls kann die
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feste Konugation durch Lysophilisierung isoliert werden.
BEISPIEL VII Trypsin-PÄG-Amid-Konjugation
Omega-Amino-PÄG (siehe Beispiel IX) (100 mg) wird in einer Pufferlösung (10 ml, pH-Wert 6,0) aufgelöst. Trypsin (50 mg) wird zugesetzt, gefolgt von Äthyldimethylaminopropylcarbodiimid (200 mg). Der pH-Wert wird auf 6 gehalten. Nach einer Stunde wird die Reaktion durch Zugabe von Überschußacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 gestoppt. Die Konjugation wird durch Chromatographie auf Sephadex G-50 isoliert.
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren wird anstelle von Trypsin bei Verwendung von L-Citrullin-L-Aspartatligase (AMP) L-Citrullin-L-Aspartat· ligase (AMP)-(6,5.4.5)-PÄG-Amid-Konjugatinn erhalten.
BEISPIEL VIII
Herstellung von Omega-Amino-PÄG
a) Verfahren (1) Tosylation
PÄG (Molekulargew. 6000) (50 g) wird in Toluol (400 ml) aufgelöst. Toluol (60 ml) wird aus dem Gemisch destilliert, um Spuren von Feuchtigkeit zu entfernen. Die Lösung wird gekühlt und wasserfreies Triethylamin (5» 5 ml) wird zugesetzt, gefolgt von p-ToluolsuTfonylchlorid (3,4 g) > Die Lösung wird über Nacht auf Raumtemperatur gehalten und dann gefiltert. Das Filtrat wird auf 5 gekühlt, und der Niederschlag wird gesammelt. Das Polymer wird in absolutem Äthanol (200 ml) aufgelöst, und
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Natriumazid (1,0 g) wird zugesetzt. Die Lösung wird unter Rückfluß für die Dauer von 36 Stunden gekocht, um PÄG-Omegä-Azid zu erhalten.
Verfahren (2) Halogenierung
Das vorstehende Verfahren wird für PÄG-Tosylat angewendet, außer daß Thionylbromid (2,5 ml) anstelle von p-Toluolsulfonylchlorid verwendet wird. Die Lösung wird I5 Minuten lang im Rückfluß gehalten, nachdem das Thionylbromid zugesetzt worden ist, um PÄG-Omega-Bromid zu erhalten, das wiederum entsprechend in PÄG-Omega-Azid umgewandelt wird.
b) Umwandlung in Omega-Amino-PÄG
Der äthanolischen Lösung des Omega-Azido-PÄG wird Adams-Katalysator zugesetzt, und die Lösung wird mit Wasserstoff behandelt, bis kein Wasserstoff mehr aufgenommen wird. Die Lösung wird gefiltert und unter reduziertem Druck auf ein kleines "Volumen kenzentriert. Trockener Äther (150 ml) wird zugegeben, und das Polymer läßt man über Nacht bei 3 niederschlagen. Das Polymer wird durch Filtrierung aufgefangen.
BEISPIEL IX
Fructose-1 , o-Diphosphat-D-Glyceraldehyd^-Phosphatlyase (4«1.2.12; Aldolase")-PÄG-Amid
Das Enzym (30 mg) wird in 2M-Natriumacetat (3 ml), 0,1M-Natriumglyoxylat (1,5 ml) und 10MM-Kupfersulfat (1 ml) aufgelöst. Es wird genug 0,4M-Essigsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 5>5 zu bringen. Die Lösung wird eine Stunde lang auf 20° gehalten. Das modifizierte Protein wird durch Gelfiltrierung auf Sephadex isoliert. Das modifizierte Perotein
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mit 2M-Natriumacetat (3 ml) und 2M-Essigsäure (1 ml) und Omega-Amino-PÄG (100 mg) bei 37 über Nacht zur Inkubation gebracht. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatograph!er auf Sephadex G-50 isoliert.
BEISPIEL X Insulin-PÄG-4-Hydroxy-1,3» 5-Triazin-6-yl-Konugation
a) Herstellung von PÄG-4-Hydroxy-6-Chlor-1,3t5-Triazin
PÄG 750 (30 g, 0,04 Mol) oder PÄG 2.000 (80 g, 0,04 Mol) wird in 150 ml wasserfreien Benzols aufgelöst, das 8 g Na9CO enthält. Die Lösung wird auf 10 gekühlt, und Cyanurchlorid (7,38 g, 0,04 Mol) wird zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 10 gerührt. Wasser (5 ml) wird zugesetzt, und die Lösung wird dann auf Raumtemperatur für die Dauer einiger Stunden gebracht, gefolgt von einer Erhitzung bei 40° über Nacht. Unlösliches Material wird abgeschleudert, und das Lösungsmittel wird durch Unterdruck in einem Rotationsverdampfer bei 40 entfernt. Eine kleine Menge Niederschlag, der mitunter während der Konzentration erscheint, wird durch Zugabe einer kleinen Menge Benzol entfernt, um die Viskosität zu senken, gefolgt von einem Schleudern und einer Wiederkonzentration. Das PiG-3-Hydroxy-6-Chlor-1,33» 5-TJCiazin, eine viskose Flüssigkeit bei 40 , wird im Gefrierfach gelagert.
b) Herstellung von PÄG-HTA-Insulin-Kon.jugation
Esulin(i0 mg) wird in 1 ml 0,1M-Borat-Pufferlösung aufgelöst, deren pH-Wert 9»2 beträgt. PÄG'2.000 ( mg) wird zugesetzt. Nach zwei Stunden wird nicht in Reaktion getretenes PÄG dadurch entfernt, daß die Lö-
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sung durch eine Säule Sephadex G-10 geleitet und eingestellt wird. Die PÄG-HTA-Insulin-Konjugation wird in einem Rotationsverdampfer auf Protein/ml konzentriert und in dem Gefrierfach gelagert. (HTA = -4-Hydroxy-1,3,5,Triazin-6-Yl).
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren wird bei Verwendung von PÄG ein entsprechendes Produkt erhalten.
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren, jedoch bei Durchführung der Reaktion bei einem pH-Wert von 8,5 und bei einem pH-Wert von 10 werden entsprechende Produkte erhalten.
Enzymatische Aktivitäten von PÄG-Catalase
Catalase - getestet durch die Kethode nach Beers und Sizer (J. Biol. Chem., 195, 153 (1952)). Sowohl PÄG 750-Catalase als auch PÄG 2.000-Catalase war etwas stärker aktiv als nicht modifizierte Catalase: Nicht modifizierte Catalase: 41*500 Einheiten/mg Protein PÄG 750-Catalase: 43-750 Einheiten/mg Protein
PÄG 2.000-Catalase: 43.500 Einheiten/mg Protein
Die Wärmestabilitäten von unmodifizierter und PAG-75O-Catalase waren bei 37 und 60 ähnlich.
Antigenprüfung von PÄG-Catalase
Immunisierung - Weiße ausgewachsene weibliche Newseeland-Kanichen wurden durch den intravenösen Weg mit einer 1,5mg/ml-Lagerlösung Rindleber-
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catalase für die Dauer von vier Wochen immunisiert, und bis zu dieser
Zeit erhielten sie insgesamt 55 mg Catalase. Den Kaninchen wurden
durch Herzpunktur sieben und vierzehn Tage nach Abschluß des Immunissierungszeitplans Blut abgezapft. Etwa einen Monat später wurde den Kaninchen 5 mg des entsprechenden Antigens injiziert, und ihnen wurde
durch Herzpunktur eine Woche nach Empfang der Stütz-injektion Blut abgezapft.
In-vivo- und in-vitro-Tests
In Anschluß an die letzte Blutentnahme - ein Bereich am Rücken der Kaninchen wurde mit elektrischen Scheren rasiert, und der Rest wurde mit einem Haarentfernungsmittel entfernt. Am nächsten Tag wurde den Kaninchen intradermisch 0,1 ml des entsprechenden Antigens und der boratgepufferten Sole (Verdünnung) injiziert, um auf die mögliche Entwicklung von sofortigen - und/oder verzögerten - Hypersensitivitäten zu prüfen. Alle Tiere wurden für eine Dauer von 96 Stunden nach der Injektion auf Hautreaktionen beobachtet.
Nach der ersten bzw. stützenden Immunisierung erhaltene Kaninchen-Antisera wurde in vitro auf Niederschlag (1) und auf Komplementärfixierungsaktivitäten (2,3) hin untersucht. Jedes Antiserum (unverdünnt, 1/10,
1/50) wurde in Geldiffusionsplatten (1,0$ Nobel Agar in physiologischer Sole mit Zugabe von 1,0$ Azid als Konservierungsmittel) sowohl gegen
Catalase- als auch gegen PÄG-HTA-Catalase-Lösungen gestellt (wobei die Konzentrationen von 1000 γ/ml bis 5 Y/ml gingen). Die Platten wurde die
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Möglichkeit zur Inkubation für die Dauer von 48 Stunden.bei Raumtemperatur unf bei 40C für die Dauer.von J bis 4.Tagen gegeben. Die Komplementärfixierungsaktivität der wärmeinaktivierten, schaf-rotblutzellenabsorbierten Antisera wurde unter Arbeiten nach dem Microtiter-Complement-Fixation-Test bestimmt (Cooke Engineering Co., Alexandria, Virginia, USA). Die Antisera wurden in Verdünnungen von 1:1 und 1:10 gegen Catalase- und PÄG-HTA-Catalase-Verdünnungen gefahren, die von 1000 γ/ml bis zu 15 ay/ml gingen. Die Platten wurden auf Vorhandensein oder Fehlen einer Hämolyse in Anschluß an eine Inkubation bei 37°C für die Dauer von Minuten geprüft.
Intravenöse Immunisierung mit Catalase
a) Analyse von Kaninchen-Antiserum nach Immunisierung mit Catalase
Geldiffusion - Antiserum, unverdünnt und I/IO getestet, war positiv zum Ausfällen von Antikörpern gegen Catalase. Wichtig war, daß bei der Prüfung dieses Antiserums, herges-fellt gegen natives Enzym, gegen das Enzym, das durch Polyoxyäthylenreste modifiziert war, kein Nachweis irgendwelcher Querreaktionen vorhanden war.
Komplementärfixierung - Sowohl die ersten als auch die stützenden Sera waren positiv für Komplementärfixierungsaktivität bei der Prüfung gegen native Catalase. Bei Verwendung der modifizierten Catalase als das reagierende Antigen waren die Ergebnisse negativ.
PÄG-Insulin-Immunoprüfung
PÄG-ΞΤΑ-Insulin wurde entsprechend Beispiel II hergestellt und auf anti-
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gene Aktivität durch das Verfahren nach
(1) (2)
Insulin- Insulin-
Aktivität Antikörper
u Einheiten/ml Aktivität
(Tierprüfung) u Einheiten/ml
Probe (Radiοimmunprüfung)
Unmodifiziertes Insulin 137 127
PÄG-HTA-Insulin (750) 72 0
PÄG-HTA-Insulin (2.000) *
90		 0
geprüft.
* Diese Zahlen erhält man als eine Verdünnungszahl, und es handelt sich dabei nicht um tatsächliche Prüfungszahlen.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das PiG-HTA-Insulin keine Antigenaktivität gegenüber Insulin-Antiserum hat.
PÄG-HTA-Insulin-Prüfung
Präliminär-Insulin und PÄG-HTA-Insulin, das die gleiche Menge Insulin enthielt, wurden in Testkaninchen injiziert, und es wurden die Blutzukkerwerte durch die "Glucostaf'-Methode gemessen (Worthington Biochemical
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Corporation, Freehold, TT.J.).
Nach 5 Stunden Blutglucosewert
PÄG-HTA-Insulin 50$ von Normal
Insulin 20^ von Formal
Diese Tests zeigen an, daß das PÄG-HTA-Insulin eine Insulinaktivität bei etwa 50/t von Insulin hat, bezogen auf das Gewicht konjugierten Insulins, das verabreicht wird.
P&G-Insulin-Rattenprüfung
Formale Laborratten (220/225g) wurden nach dem Verfahren nach Goldner diabetisch gemacht (Bull. K.Y. Acad. Med. 2_1_, 44 (1945)» indem Alloxan-Injektionen verwendet wurden. Den Testtieren wurden während der Testzeit keine Nahrung gegeben. Insulin- und pIG-2000-HTA-Insulinrezepturen, die bei einem pH-Wert von 9»2 und 10,5 hergestellt wurden, wurden den Testratten verabreicht. Das Produkt mit dem pH-Wert 10,5 zeigte keine Senkung der Blutglucosespiegel.
Die Ergebnisse sind tabellarisch nachstehend angegeben und in der Figur zusammengefaßt.
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δ 0 9 8 86/1210
Insulin (ir rtramuskulär) 520 Abfall gegen i> Abfall
Blutglucose- 510 Anfangsspiegel gegenüber
spiegel 490 mg/100 ml Kontrolle
Zeit mg/100 ml 470
(Std.) 410 395 135 32,9
O 295 ulin (ph-Wert 9,i 140 34,1
1 270 305 120 29,2
2 290 72,5 10 2,4
4 400 101,5 md der Testzeit)
6 iontrolle (kein Putter währe 0 0
0 23O 10 1,9
2 30 5,7
4 50 9,6
6 125 24,0
10 l)(intravenös)
3AG-HTA-InS —
0 232 76,2
2 203,5 66,7
4 —
5* 75 24,6
8
* Tiere wurden nach diesem Punkt gefüttert.
Ansprüche
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Claims (1)

  1. - 28 Patentansprüche
    1. Geschütztes Polypeptid, gekennzeichnetdurch
    einen Polypeptidteil, im wesentlichen lineare Polyalkyl- oder PoIyalkoxypolymerteile, die mit dem Polypeptidteil gekoppelt sind, und
    einen zwischen dem Polypeptidteil.und jeden der Polymerteile sitzenden Kopplungsteil, wobei der Polymerteil unsubstituiert ist oder durch
    Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkylgruppen substituiert ist, wobei die Alkoxy- oder Alkylgruppe weniger als 5 Kohlenstoffatome hat.
    2. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Polymerteil ein Molekulargeiwcht
    von zwischen etwa 500 und etwa 5.000 Dalton hat.
    3· Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen 10 und 100 Polymerteile pro Molekül Polypeptid vorhanden sind.
    4· Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Polymerteil Polyäthylenglycol ist.
    5. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß der Polymerteil Polyäthylenglycol ist.
    6. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Peptid aus der Gruppe stammt, die aus Oxido-
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    reductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen und Insulin besteht.
    7· Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Peptidteil ein Enzym ist und daß das geschützte Enzym mindestens 40^ der Enzymaktivität des ungeschützten Teils pro Mol desselben besitzt.
    8. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Peptidteil eine Hydrolase und der Polymerteil Polyäthylenglycol ist.
    9. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Peptidteil Asparaginase und der Polymerteil Polyäthylenglycol ist.
    10. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Peptidteil Insulin und der Polymerteil Polyäthylenglycol ist.
    11. Geschütztes Polypeptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß der Peptidteil ein Enzym ist und das geschützte Enzym mindestens 4O/6 der Enzymaktivität des ungeschützten Teils pro Mol desselben besitzt.
    12. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    - 30 -
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    daß der Kopplungsteil aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
    0 ^ FV011 Λ
    OCH2C -. , f Jf · -< J-.
    Ύ Ι
    "0C"CH- <^Ä ο- T2 l ^o -OC-Ch-. ' ' Ο. > "Q-. . -imlc-ot
    ο 2" ι
    besteht, wobei die mit -. bezeichneten Bindungen an das Polypeptid angefügt sind, vorausgesetzt, daß dann, wenn der Kopplungsteil
    -NH.C-O
    ist, der Teil .C-O- ein Teil der Polypeptidcarboxygruppe ist.
    Eine im wesentlichen nicht immunogen enzymisch aktive Substanz, gekennzeichnet durch ein geschütztes Enzym nach Anspruch 6 und einen pharmazeutisch akzeptaolen injizierbaren Träger.
    14· Eine im wesentlichen nicht immunogene insulin-aktive Substanz, gekennzeichnet durch geschütztes Insulin nach Anspruch und einen pharmazeutisch akzeptablen injizierbaren Träger.
    15. Verfahren zum weitgehenden Unterdrücken der Immunogenizität eines Polypeptide mit physiologischer Aktivität zusätzlich zu einer Immunogenizität bei weitgehender Bewahrung der physiologischen Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Endkoh-
    509886/1210
    lenstoffatom eines im wesentlichen geradkettigen Polyalkyle- oder PoIyalkoxypolymers aktiviert wird, wobei das Polymer unsubstituiert ist
    und durch Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkylgruppen substituiert ist und
    die Alkoxy- oder Alkylgruppen weniger als fünf Kohlenstoffatome haben, dadurch, daß der EndkohTenstoffatom mit einem bindenden Reaktionsmittel zur Schaffung einer Endgruppe in Reaktion gebracht wird, die mit einem im wesentlichen phsysiologisch inaktiven Teil in einer Polypeptidkette reagiert, und daß das Polypeptid mit dem aktivierten Polymer zur Reaktion gebracht wird.
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    Leerseite
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