DE1617659A1 - Polynucleotide,welche als die Interferonerzeugung in lebenden tierischen Zellen induzierende Verbindungen wirksam sind - Google Patents

Description

Polynucleotide, welche als die Interferonerrsöugung in lebenden tierischen Zellen induzierende Verbindungen

•wirksam sind

Die Erfindimg betrifft Substanzen, welche lebende Zellen zur Erzeugung von Interferon induzieren, und macht sich, ins« besondere die Erkenntnis zunutze, daß aus vielen Fasern bestehend«» (raultistranded) Polynucleotide, Insbesondere Ribonucleinsäuren (RNS), ausgezeichnete Eigenschaften als Interferon induzierende Verbindungen besitzen.

Interferone sind Proteine mit relativ niedrigem Molekulargewicht, die durch Zellen erzeugt werden. Es ist bekannt, daß diese Erzeugung durch Viren, bestimmte andere mikrobielle Mittel und durch einige Substanzen verschiedenen Ursprungs stimuliert wird. Die Interferone verleihen nicht infizierten

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Zellen während längerer Zeitspannen eine Beständigkeit gegen Vireninfektionen, sofern die ZoUen vor der Einwirkung der Viren mit den Interferonen versehen werden. Die Interferone besitzen ein breites Spektrum gegenüber Virenarten,· sie sind jedoch relativ Wirtsar ten-sneziifisch.

Die erfindungsgenäßen Polynucleotide können als induzierende Verbindungen für die Interferonerzeugung entweder in vivo oder in vitro eingesetzt werden. Der hauptsächliche Verwendungszweck der erfindungsgemäßen Polynucleotide besteht in ihrer Ein· spritzung in einen tierischen oder menschlichen Körper, so daß in vivo Interferon in großen Mengen gebildet wird und dazu dient, den Wirtskörper gegen eine Infektion durch eine Vielzahl von Viren zu schützen. Die erfindungegeraäSen Polynucleotide sind ferner, wenn auoh in geringerem Ausmaß, als Zugabe zu einem Kulturmedium, das lebende tierische oder menschliche ZeI* len enthält, geeignet; da diese Verbindungen dazu dienen, die Bildung von Interferon in großen Mengen zu induzieren, so dad das Interferon abgetrennt und Tieren oder Menschen zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektionen, dl· durch ■ Viren erzeugt werden, eingespritzt werden kann.

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Die Interferone scheinen in- der Lage zu sein, Infektionen in den Anfangsstadien auskurieren zu können und schaffen zumindest einen Mechanismus für die Interferenzerscheinung, (interference phenomenon). Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Interferone induzierenden Verbindungen, die an Tiere und Menschen verabreicht werden können, wodurch der Körper dazu angeregt wird, sein eigenes Interferon zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß bestimmte Polynucleotide in hohem Maße zur Induzierung von Interferonen sowie zur Induzierung einer hohen Wirtswiderstands-Xähigkeit wirksam sind. Diese Wirksamkeiten hängen jedoch von 2 Bedingungen ab: (a) einem hohen Reinheitsgrad, d.h. daß die Verbindungen im wesentlichen frei von inhibierend wirkendem Protein und/oder anderen inhibierend wirkenden Substanzen sind, und (b) von einer Vielfaserigkeit der Polynucleotide. Bestimmte Ribonucleoproteine sowie einselfaserige Polynucleotide haben sich als inaktiv erwiesen«

Die erfindungsgeoiäßen vielfaserigen Polynucleotide können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, von denen folgende erwähnt seien:

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(A) Polynucleotide, die bei der Komplexbildung bestimmter synthetischer Polynucleotide anfallen und als Interferon induzierende Verbindungen wirksam werden.

(B) Eine Ribonucleinsäure, die nachstehend als HeI-RNS bezeichnet wird und durch Vermischen eines Extraktes von Penlcilliutn funiculosum mit Phenol erzeugt wird» wobei die Interferon induzierende RNS in Freiheit gesetzt wird, die anschließend in hochreiner Form abgetrennt wird.

(C) Eine Ribonucleinsäure, die aus 2 reovirusartigen Virionen hergestellt wird.

(D) Eine replikative Form von Ribonucleinsäuren die durch Infizierung lebender Zellen mit einem RNS-Virus erhalten wird.

Diese als Beispiele aufgezählten Quellen für die vielfaserige RNS sowie deren Gewinnung und Anwendung werden im folgenden beschrieben:

(A) Komplex aus synthetischen Polynuoleotiden

Dieses erfindungsgemäße Merkmal beruht auf der Erkenntnis, daß Interferone in ein Wirtstier durch Verabreichung komplexer

Ji

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Polymerisate, die chemisch definierte nicht-toxisch, nichtaktiven und nieht-replikativ (replicating) sind, eingeführt werden können, wobei 03 sich bei diesen Polymerisaten um synthetische Mittel handelt, die aus leioht verfügbaren Homopolynucleotiden hergestellt werden können. Die Art der Verabreichung des komplexen Polymerisats kann entweder auf parenteralem* beispielsweise subkutanem, intradermalem, intraperitonealsni, intravenösem oder intramuskulärem, oder auf toplachem Wege erfolgen, und zwar vorzugsweise auf eine Mukoaamembran» wie beispielsweise bei der Verabreichung auf Intranasalem Wege. Diese komplexen Polymerisate werden beim Vermischen von 2 verschiedenen Homopolynucleotide^ die selbst synthetisch und im Handel erhältlich sind und nach bekannten Methoden hergestellt v/erden können, erzeugt«

Im folgenden wird der Ausdruck "Homopolynucleotide" in dem Sinne verwendet, daß er'nioht nur die Homopolynucleotide, sondern auch die Homooligonuoleotide umfaßt, wobei der Unterschied nur in der Länge des Polymerisats besteht. Dies bedeutet, daß unter den genannten Ausdruck Polymerisate fallen, die 2 bis tausende von Nucleotideinheiten aufweisen. Diese bekannten Polymerisate werden durch enzymatische Behandlung von Nucleotiddiphosphäten oder -triphosphaten in vitro unter Bildung des gewünschten Polynucleotide mit einer wechselnden Anzahl von

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Nuoleotideinheiten gebildet; wobei die Zahl der Nuoleotideinheiten nloht mit Genauigkeit festgestellt -werden kann.

Die zur Herstellung der komplexen Polymerisate verwendeten synthetischen Homopolynueleotide besitzen ein Pentose-Phoaphat-QrundgerUst, wobei die Pentose vorzugsweise aus Ribose oder Desoxyribose besteht. Außerdem enthalten sie eine spezifische identifizierbare Pyrlmidin- oder Purlnbase, wie beispielsweise Adenin, Tnosin, Cytosin« Uraoil« Quanin o.dgl.. Es ist bekannt, daß beim Vermischen bestimmter Homopolynueleotide in einer wässrigen Lösung ein komplexes Polymerisat gebildet wird« das sich duroh verschiedene physikalische Tests identifizieren ISBt und von den beiden Homopolynucleotiden, aus welchen das komplexe Polymerisat gebildet wird, verschieden 1st. Das Verhältnis, in welchem die zwei Homopolynueleotide vermischt werden, ist normalerweise im Hinblick auf das Verhältnis der zwei in den Komplex eingearbeiteten Homopolynueleotide nicht bestimmend. Bine Mischung aus einem Molverhältnis von 1:1 kann ein komplexes Polymerisat zur Folge haben« das die zwei stiokstoffhaltigen Basen in einem Verhältnis von lsi, H2 und/oder 2:1 oder in einem anderen Verhältnis kleiner ganzer Zahlen enthält, d.h., daß das erhaltene Verhältnis keine Punktion des Verhältnisses 1st, in welchem die Komponenten vermisoht

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werden, sondern in gewissem MaBe durch die natürliche Neigung zur Vereinigung bestimmt wird«.welche den jeweils verwendeten Homopolynucleotiden zu eigen ist.

Die komplexen Polymerisate« welche erfindungsgemäS ale Inter-

feron induzierende Substanzen verwendet werden, können beispielsweise durch Vermischen von zwei voneinander verschiedenen Homopolynuoleotlden in einem Molverhältnis von 1:1 im Hinbliok auf ihre Basen bei Umgebungstemperatur in einem wässrigen Puffersystem, das einen breiten pH-Bereioh aufweist, d.h.« daß der pH-Bereich zwischen ungefähr 5,0 und 10,0 liegt, wobei sieh die Ionenstärke zwischen ungefähr 0,001 und 1,0 bewegt, hergestellt werden. Wie vorstehend bereits erwähnt, können auch andere Verhältnisse als 1:1 eingehalten werden· Puffersyeteme, die sich als geeignet erwiesen haben, sind 0,006m Natriumphosphat.in einer O,85£-igen Natriumchloridlöaung und 0,01m ulyoylglyoin in 0,59$-lgem Natriumchlorid. Ea kann jeder nicht-toxische Puffer verwendet werden. Es braucht auch überhaupt kein Puffer eingesetzt zu werden, da es eich herausgestellt hat, daß die Pufferkapazität des physiologischen Systems des Tieres, welchen die Mischung aus den Homopolynuoleotlden verabreicht wird, dazu ausreioht, um die gewünschte Komplexbildung nach der Verabreichung zu begünstigen und die gleiohe Induzierung der Erzeugung von Interferon sowie den Sohutz gegenüber einer Virus-

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Infektion su schaffen, wie· dies dann der Fall ist, wenn die zwei Homopolynueleotide vorher zu einem Komplex verarbeitet werden.

Eine andere Methode zur Herstellung der komplexen Polymerisate , welche angewendet werden kann, besteht darin, eine Mischung aus zwei Nuoleotiddiphosphaten oder Desoxynucleotidtriphosphaten in einem Phosphatpuffer mit einem pH von ungefähr 7 «nit der entsprechenden Nucleinsäurepolymerase oder Pesoxynucleinsäurepolymerase zu behandeln. Eine derartige Behandlung hat eine Polymerisation der zwei- Monomeren zu zwei Homopolynucleoticien unter gleichzeitiger Bildung des komplexen Polymerisats zur Folge.

Die in vitro gebildeten komplexen Polymerisate können durch eine hypochrqme Verschiebung im UV-Absorptionsspektrum, durch Rohrzuoker-Diehtegradient-Fraktionierung, Chromatographie sowie die Fähigkeit, die Erzeugung von Interferon zu induzJeren, eine Eigenschaft, die keiner der Homopolynuoleotide zu eigen ist, aus welchen der Komplex gebildet wird, charakterisiert werden. Die Erzeugung von Interferon dient hauptsächlich zur Charakterisierung der komplexen Polymerisate, welche ft^;r das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, da physikalische Methoden oft eine ausreichende Empfindlichkeit vermissen lassen.

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Die Herstellung von Interferon durch Verabreichung der komplexen Polymerisate geht aus dera Schutz von Wirtstieren sov;ie von ^ellkulturen gegen einen Virus-Angriff hervor. Das auf diese Weise erzeugte Interferon kann ferner durch die Isolierung des induzierten Interferons nach bekannten Methoden sowie die anschließende in vitro-Bestimmung von dessen Viren-inhibierenden Eigenschaften charakterisiert werden. Außerdem kommt eine Charakterisierung durch Bestimmung der Wirtsspezifität« der Trypsinempfindlichkeit, des Isoelektrischen Punktes sowie des Molekulargewichtes in Frage.

Die Induzierung der Interferonbildung in vivo und/oder die Induzierung der Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion durch Viren gemäß diesem Merkmal der vorliegenden Erfindung wird durch Verabreichung eines komplexen Polymerisats« das in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt wird, an ein Wirtstier, wie beispielsweise ein Kaninchen« eine Maus oder ein anderes Tier« erzielt. Die Verabreichung kann auf parenteralem oder durch die Hautoberfläche, insbesondere durch Aufbringung auf eine Mukosamembran, wie beispielsweise eine Verabreichung aif Intranasalem Wege« durchgeführt werden« wobei die wirksame Dosis von der Wirtsart und in gewissem Ausmaß von dem Virus abhängt« gegen welchen man Schutz suoht. Bei Mäusen liegt die Schwellwertsdosis bei ungefähr 0*5 rag/kg, während sie bei lianin-

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chen ungefähr O₃O5/tig/kg b»fcrlJgt. Bed diesen Dosen treten offensichtliche Zeichen einer Toxizität auf, auch nicht an der Eirispritseteile. Außerdem zeigt das Tier Anzeichen von Wohlbefinden. DiQ Wirksamkeit der komplexen Polymerisate Im Hinblick auf die Interferonbildung in dem Wirtstier kann u.a. durch parenterale Verabreichung des komplexen Polymerisats an ein Tier» wobei nach ungefähr 1 bis 5 Stunden Blutproben entnommen werden» bestimmt werden.

Das Serum wird von den geronnenen Blutproben abgetrennt» sterilisiert und bei verschiedenen Verdünnungen in Kulturgliteera·, die Zellen der gleichen Tierart wie die für den Wirt verwendeten enthalten, titriert. Nach einer Inkubation bei 35^eC während ungefMhr 18 bis 24 Stunden werden die Zellkulturen einem Xmaunitätetest unter Verwendung einer der bekannten oytopateh Viren unterzogen und erneut ungefähr 3 Tage lang bei 35*C inkubiert. Die Kulturen werden dann auf cytopat isctie Wirkungen untersucht. Außerdem wird der Interferontiter als reziproker Wert der Verdünnung» bei welcher 50£ der Qefäße keine pytopatiaohen Wirkungen zeigen» bestimmt.

Die nach der vorstehend beschriebenen Mathode erzeugten Interferone sind spezifisch für bestimmte Arten, wie ein Pleekver-

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minderungc-Xzifcerferontest zeigt, welcher darin besteht, daß ein Aliquot des Interferon-enthaltenden Serums mit einzelnen Zellkulturen verschiedener Arten inkubiert wire, wobei ein Isuaunitfitst©3t mit einem'Virus, beispielsweise mit einem vesikularem Stomatitisvirus oder einem anderen bekannten eytopathogenen Virus durchgeführt wird und zur Virusfleckenbildung Iakubiert wird. Die Anzahl der Flecken auf mit Interferon behandelten Kulturen v/ird mit der Anzahl Flecken nicht-behandelter, mit Viren infizierter Vergleichskulturen verglichen. Bei derartigen Tests 1st zu ersehen, daß die Interferonaktivit8t nur in den Fällen auftritt, in Vielehen die Zeilkulturen von der gleichen Tierart abstammen, von welcher das Interferon-enthaltende Serum isoliert worden ist. ⁽ . ■

Die nach diesem Merkmal der vorliegenden Erfindung induzierten Interferone, wobei komplexe Polymerisate verwendet werd-sin* sind, wie ein Fleckenverniinderungs-Intorffrontest saigt, tsypsin« empfindlich» ä.h., daß die IntsrfercnaktivitMt durch Behandlung mit Trypsin zerstört wird« .

Das in der vorstahead beschriebenen Weise induzierte Interferon wird ferner nach bekannten Methoden durch seinen Isolektri· sehen Punkt sowie durch sein Molekulargewicht charakterisiert

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(vgl. die Baispiele).

Die folgende Erörterung erliiutert ö.ie Herstellung der komplexen Polymerisate, welche bei dem er-finöungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Herstellung der komplexen Polymerisate

Substanz I: Herstellung eines Komplexes aus PolyinoainsKüre und PolyoytidyleSure, ^wPoly-{rtC)^w .

Eine Lösung aus Polyinoainsöure (I), di«;~550yug/ral 4ines Puffere, der aus 0,01 ta Olycy!glycin und 0,1» HatWufltoftlorid besteht, enthält, Wird hergestellt. Eine Lösung *W Polycyfcidy leäure (C), welohe 500 Aig/ml des gleichen Puffere ejrthiUt, wird außerdem zubereitet« Die Lösungen aus Polyinosinetture und Polyoytidyl* säure werden anschließend vermischt, wobei ein MolverhBltnis von 1:1 bezüglich der Basen eingehalten wird. Die erhaltene Lösung wird direkt als Quelle ftir die komplexen Polymerisate, und zwar "PoIy-(ItC)", verwendet.

Subetanz XI: Herstellung eines Komplexes aus PolyadenylsKure und Polyui'idy!säure, ¹¹ PoIy-(AtU)"

Unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise für die Herstellung der 3ubstaaz I, wobei Jedoch äquiraolare Mengen

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"Λ

(bezüglich der Basen) PolyadenylsKure (A) und Polyuriöylsäure (U) sui Stalle von Polyinosinsäure und Polyoytidyisäure verwendet werdsa, wird das komplexe Polymerisat "PoIy-(AsU)¹* hergestellt. ·

Substanz Ills Herstellung eines Komplexes aus Polyinosinsäure und Cytidyloytidln, "PoIy-(IiCpC)¹¹

Unter Einhaltung der vorstehend für die Herstellung der Sub« stanz I angewendeten Methode« wobei die verwendete Polyoytidylsäure duroh eine äqulmolare Menge an Cytidylyloytidin (CpC)₄ einem Oligonuoleotid, verwendet wird und ein Puf fereystam eingesetzt wird, das «loh aus Q,006m Natrtucephoaphat. in O,85Sf-igera NaCl bei einem pH von 7*0 zusammensetzt, wird das komplexe Polymerisat* und zwar "PoIy-(I:CpC)" hergestellt.

Verfährt man nach der für die Herstellung der Substanz I angewendeten Methode, wobei an Stelle der Polylncsinsäure und PoIycytlöylsUire Äquivalente Mengen anderer bekannter HomopolynuoleoticÄ einsssetzt Vierdon, dann erhält man beispielsweise folgend« Komplexe: PoIy-(A:l·.), Poly-(X:U), Poly-(Ai8U), PoIy-(OtC und FoIj-(UiBA)J wobei k» 2_f C und U die voi'stehend angegebenen Bedeuturi£;en besitzen, X für Polyxanthylsaur« steht, Q Polyguanylsüure bedeutet und 8A und 8ü PolyadenyIoMure bzw. Polyuridylbsöeuten, wobei jede Säure 3 Nucleotldelnheiten pro üv aufweisen.

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V I /

Substanz IV: Herstellung eines Komplexes aus yy

~ säure und Polydesoxyöytidylsäure_J ⁿPoly-(dI:dC)"

Stufe A: Herstellung von DesoxyinosIn-5'-trlphosphat

126 mg (20OaMoI) Desoxyinosin-5'-triphosphat (DITF) werden In 24 ml Wasser gelöst und auf 4^eC abgekUhlt. Dami vierden 9,6 g Natrluranitrit und 7*6 ml Eisessig zugesetzt, worauf die Mischung bei 4⁰C über Ne.oht stehen gelassen wird. Die Reaktionsraischung wird anschließend mit 50 ml Wasser verdünnt und mittels 4ia Lithiumhydroxyd auf einen pK von 9 eingestellt. Dann schließt sich die Zugabe von 166 ml lcalten Wassers an. 2,8 ml einer Im ölycinlösung (pH 9,2) und 8,4 ml In Bariumbromid warden s^gssetzt, worauf das Bariumsala mit 286 ml eines kai ten Xthanols ausgefällt, wii'd. Nach dem Stehenlassen von einigen Stunden bei 4⁰C wird das Salz abzertrlfugiert und einige Male mit kaltem Äthanol gewaschen, worauf es über Kaliumhydroxyd getrocknet wird. Das Pulver wird in 20 ml Wasser und 1 ml In Chior^asserstoffsäure suspendiert und anschließend durch eine Säule, die mit K&lium-Dowex-50 (ein Kationenaustauscherharze das von der J.T. Baker Co., Fhillipsburg, N.J. verkauft wird) gefüllt ist, wobei das Harz vorher von UV-absorbierenden Materialien mit Wasser freigew&3chen worden ist, geschickt. Der Abfluß aus der Kolonne enthält 160«lMol Deeoxyinosin-5^!-triphosphat (αΙΤΡ) und wird bei -20⁰C in gefrorenem Zustand gelagert.

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Stufe Βϊ Herstellung von Poly-(dI:dC)

Eine Reafctionsmisohung für die Synthese von Poly-(dI:dC) enthält jeweil» 3,5/uMol dITP und Desoxyoytidin-5'-trlphosphat (dCTP), 600/uMol Kaliurophosphatpuffer (pH 7**0 und 30>uMol Magnesiumchlorid sowie 40 bie 80 Einheiten DNS (Desoxynuoleinsäure)-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 10 ml« Nach einer Verzogerungsperiode von 2 bis 4 Stunden ist die Polymerisation naoh 6 bie 8 Stunden beendet. Der Verlauf der Umsetzung läßt sich durch Messungen der optisohen Diente bei beptirnratea Interyfilien bestiaoien.Hat die Hyp©ohromizit8t b©l 260oa/äi ein Maxiraun erreicht, dann wird die Umsetzung durch Einstellen der Mischung auf 0,2m Natriumchlorid und ö_elm Natriumcitrat abgestoppt. Die Dialyse wird, in uiafass©JÄr Welse'gegen den gleichen Puffer dur^efUhrt, um d&e ganse Material mit nied^i^is'Blolekulargewicht zu entfernen. Das ??©Silkt my&& bei '--20'O solange in gefrorenem Zustand gelagert« him ©ρ füi® dl© Interfaron^Induktion verwendet wird» .

Die folgenden Beispiele seig@ü die. Induktion ron Interferon .durch die Verabreiohisng von feestiasaten HoGKjpolynyeleotid-Komplexen, beispieleweioe von Koinple^en_s wi® sie vorstehend beschrieben wurden, und zwar sowohl an lebende Wirtstiere.als auch an isolierte Zellkulturen« D&raus sollte nicht des« Schluß ge-

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¹¹⁸⁵³ Λ

zogen werden, daß andere komplexe Polymerisatej die ebenfalls in den Rahmen der Erfindung fallen.» jedoch in den Beispielen nioht aufgeführt werden, nicht die Interferonerzeugung in ähnlicher Weise stimulieren.

Beispiel 1 Induzierung von Interferon in Kaninchen

Die vorstehend beschriebenen komplexen Polymerisate werden getrennt in Form von 0,5 ml-Aliquots an 2,0 Bis 2,? kg (4,5 -5*0 pounds) schwere Kaninchen durch intravenöse Einspritzung verabreicht. Naoh ungefähr 2 Stunden werden von jedem Kaninchen durch Herzpunktur Blutproben entnommen. Das Serum wird aus jeder der geronnenen Blutproben abgetrennt und getrennt durch Bestrahlung mit UV-Licht sterilisiert· Aliquote dieser sterilisierten Proben werden für die folgenden Tests verwendet.

Bestimmung der Interferontiter Das sterilisierte Kaninohenserum aus jedem Kaninohenwirtetier

wird getrennt durch reihenweise Zweifachverdünnungen von 1:5 bis It640 unter Verwendung eines Zallkulturwachstummediums als Verdünnungsmittel titriert. Eine 1 ml-Probe einer jeden Verdünnung wird in jeweils 4 Qefäßkultüren aus Kaninchennierenzellen, die von verbrauchtem Wachstumsmedium abgezogen worden

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sind* zugesetzt» Nach einer Inteuoxerung bei 55⁰P übgr Macht werden die Gefäßlculturen erneut abgesogen und rait IO bis 100 TCIBj-0 (Gewebekultur infizierende Dosis )j-q eines Virus, der in 1 ml eines Waohstumsmediums enthalten ist, infiziert« Jede GefaSkuitur wird, bei 35°C weitere 5 Tage inkubiert und anschließend im Hinblick auf das Auftreten von cytopaten Virenwirkungen untersucht, wobai ein positives Auftreten derartiger Wirkungen mit "ψ" und ©in Ausbleiben derartiger Wirkungen mit "O" bezeichnet wird. Der Interferontiter wird für jeder Serumprobe als reziproker Wert der SerümverdUnnung angegeben* bei welcher 5'0# der Gefäß© keine cytopat© Wirkungen zeigen. S©rum von nicht-behandelten Tieren (d.h. normalen Vergleichetieren) wird b@l jedem Versuch zur Bestimmung der normalen §©rumfaktos?ea titrierte Die auf diese W©is@ bestimmten Titer sind lh der Tabelle I zusammengefaßt.

₁₇ . BAD

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1135?

T a b e -1 1 a I

Interferon*; it er, die in Kanincheriniersn-Zeirikttltuz^en teatimrat

werden

Polynucleotid

Inserferontiter

PoIy-IiC	2 jjig	>6ίΟ
H	0,5 ug	20-40
Il	0,25 μ&
Poly-Ϊ allein	25 ug	< 3
PoIy-C allein	20 ug	< 3
Normale Vergleichs proben	keine	< 5
PoIy-ArU	200 μ&	10-20
I!	100 yg	10-20
It	50 >.tg	40-80
It	25 μβ	20-40
a	12,5 us	5-10
Il	6,25 ΪΛ5	5-10
Poly-Ä allein	200 jufe	< 5
PoIy-U allsin	200 μ?	5
Normale Vergleichs proben	keine	< 5
Poly-1: CpC	100 »Λ£	>c40
η	ίο ^s	< 5
Il	1 us	< 3
PoIy-CpG„alloin	50 us	< 5
Normale Varglciohs- proben	keine	' < ö

IiJ

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Die Tests werden unter Verwendung von Kaninchen durchgeführt, denen 1 ug I:C in einer einzigen intravenösen Dosis.zugesetzt worden ist, worauf das Blut bei aufeinander folgenden Intervallen zeigt, daß ein erheblicher Interferonapiegel in einer Stunde auftritt, der kurz danach einen Peak erreicht und 4 bis 6 Stunden lang, auf dieser Höhe verbleibt, worauf er abfällt.

Beispiel 2 . " '

Induktion von Interferon in Mäusen

Eine Lösung des PoIy-(IsC) (Substanz I) sowie Lösungen von PolyinosineSure und Polyeytldyleäur· werden getrennt als 0,2 al« Aliquote an 16 bis 18 g schwer» HMu** duroh intravenöse Sinsprit sung verabreicht« Jed® Lösung wlvu an 25 MSuse verabreicht. Nach ungefähr 2 Stunden werden von jeder Maug Blutproben ent· nommen. Das Serum wird von Jeder' der geronnenen Blutproben abgetrennt. Die Seren von solchen Tieren, in welche ein Aliquot des gleichen Polynucleotide oder der gleichen komplexen PoIymerlsatlösung eingespritzt worden ist, werden gesammelt und durch Bestrahlung mit UV-Licht sterilisiert, worauf sie durch die Fleokenverminderungsmethode auf Mäuseeabry©zellen gegen einen Angriff vesikularer Stomatitis-Viren titriert werden. Die gesammelten Seren der nlcht-behandelten Tiere. werden In ähnlicher Weise titriert.

" BAD OBiGIHAt

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T a	\0 belle '.	Dosis/Tier	Interferon-Titer
II	55*0 ug 50,0 jig 52*5 ug	<8 < 8 256 ' < 8
Stimulierung der Interferonerzeugung in Mäusen, ermittelt durch die Pleckenvermindorungsmethode		•
Komplexes Polymerisat	Induzierte Beständigkeit gegen eine durch Columbia	Infektion von MKusen SK-Viren
Poly-1 PoIy-C Poly-1:C Nom»les*gepuffertes Vergleiohsverdünnungs- mittel
Beispiel J

Eine Infektion durch Columbia SK-Viren hat bei Mtusen die Symptome eines zersausten Felles, einer Lethargie und einer schwachen Paralyse zur Folge, wobei die Hauptmenge der Tiere 3 bis 5 Tage nach der Einspritzung eingeht. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der komplexen Polymerisate hinsichtlich der Induzierung einer schützend wirkenden Menge an Interferon wird folgende experimentelle Methode angewendet:

0,5 ml der Testlösung der komplexen Homopolynuoleotid-Polymeri-3ate, wie sie in der Tabelle III angegeben sind, werden auf

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intraperitonealem Wege 18 Stunden lang vor der Infizierung an jeweils 15 Mäuse verabreicht« von denen jede zwischen 14 umd l6 g wiegt» Bann wird eine Menge an Columbia SK-Viras, die zum Abtüten von 9®& der Mäuse innerhalb von 5 Tagen nach der Infizierung ausreicht» auf subkutanere Wege in ein 0,5 ral-Aliqugt eingespritzt« worauf jede Maus mit 0,5 ml der auf intraperitonealem Wege > Stunden nach der Infektion eingeeprit*- ten Lösung behandelt wird. Tiere, die in Ähnlicher Weise mit komplexem Polymerisat oder üoaopolynuoleotid behandelt worden sind, jedoch nicht durch Viren infiziert worden sind, werden hinsichtlich des Auftretens einer duroh diese Chemikalien verursachten Toxizität untersucht. Bei keinem der behandelten« jedoch nicht Infizierten Tiere* wird ein Anzeichen von Toxizitö.t festgestellt« Die Tiere behalten ihre üblichen Frefigewohnhei· ten bei* wachsen welter und erscheinen im Hinblick auf ihr Süßeres Verhalten normal»

Täglich wird die Anzahl der !©banden und toten Tiere ermittelt. Die Tiere werden 14 Tage lang beobachtet.

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Tabelle III

Induzierte Widerstandsfähigkeit j	Segen eine Infektion von Mäusen	3is % Über	Durchschnitt-
	durch Columbia SK-Vlren	labende	. Hch pro Tag
Chemisches Mittel	Gesamt mg ^Doi	Tiere	überlebende
	pro Tier		Tiere
		3,3	4,7
		0,0	4,3
Phosphatpuffer		0,0 '	4,2
Polyinosinaäure	0,91	53,3	>14,O
PolyoytidylsKure	1,00.	60,0 .	>14,O
Poly-(I:C)	0,525	53,3	>14,O
η *	0,263	46,7	13,0
ti	0,131	33,3	8,0
n	0,065	40,2	7,0
It	0,033	2,2	5,0
!♦	0,017
Vergleichend t&@l

Bei Anwendung der gleichen Methode, mit der Ausnahme, daß die Nachinfizierungsdosis weggelassen wird, erhält nan Ergebnisse, die mit den in der Tabelle III zusammengefaßten Ergebnissen vergleichbar sind.

Bei einem anderen Versuch, "nai welchem an getrennte Gruppen von Mäusen 525, 263 und 131 ug Poly-1jC pro Maus verabreicht wird, wird ein Überleben von 86#, 93Ji bzw. 80# ermittelt, wenn ein Immunitätstest mit den Columbia SK-Vlren durchgeführt wird.

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I und C allein sind in Dosen von 550 ug bzw-. 500 ug Inaktiv. Beispiel »

Induzierte Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion von Mäusen duroh Pneumonia-Viren (FVM)

Eine Infizierung von Mäusen auf intranasalem Wege duroh Mäusepneumonia-Viren (PVM) hat eine Infektion der Atmungswege zur Folge» die ihren Höhepunkt in einer Pneumonia hat, wobei der Tod nach 6 bis 7 Tagen nach der Infizierung bei der Hauptmenge der Tiere eintritt·

Lösungen der komplexen Polymerisate sowie von Homopolynucleotiden werden auf ihr Vermögen getestet» einen Schutz gegen PVM-tnfektion sti verleihen» Indem 8 bis 10 g schwere Mäuse auf Intranasalem Wege mit 0,03 ml der Lösung,welche das in der Tabelle IV angegebene Testmaterial enthält» vor der intranasalen Einführung der Viren vorbehandelt werden. Es wird eine Virusmenge verwendet» die dazu ausreicht, 75S* der Mäuse 6 bis 7 Tage nach der Zuführung der Viren abzutöten. Nach Beendigung des Versuches (l4 Tage) sind 59 der 60 infizierten» jedoch nichtbehandelten Mäuse» an der Virusinfektion eingegangen«

Täglich wird die Anzahl der lebenden sowie der toten Mäuse

ermittelt. Die Tiere werden 14 Tage lang beobachtet.

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Tabelle IV

Induzierte Widerstandsfähigkeit	welche durch	gegenüber	einer Infektion von	wird
Mäusen,	(intranasal)	PneumoniamMuseviren	Durchschnittlieh
	Dosis in pg	verursacht	pro Tag.über
Chemisches Mittel	pro Maus	% über-	lebende Tiere
		lebende	>14,O
	15,75	Tiere	>14,O
PoIy-(I^C)	8	100	*>14,O
It	4	95.	>l*,0
M	2	95	■>14,O
N	1	82'	12,0
It	0,5	80	11,0
M	0,25	47,3	8,0
W	• 0,1?	40	8,0
W	0,06	5,3	8,0
N	0,0?	5,0	7*0
It		2,2
FhoephAtpufftfr		0,0	der komplexen Polymerisate als vlreninhibieren-
Beispiel 5
In-Vi tro -Akt ivi tat
de Substanzen

Zur Bestimmung der Kinetik der Interferon-Induktion durch Poly I:C in einem in vitro-System wird Poly IiC in einer Menge von 10 ug/ml mit Trypsin behandelten Milzzellen 6 Wochen alter Kaninchen, die In einem Eagle's Kulturmedium (Eagle's spinner

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cultur medium), das 10# Agarmaa-Kalbserum enthält« zugesetzt. Eine periodische Untersuchung hlnsiohtlioh der Erzeugung von Interferon zeigt ein allmähliches Ansteigen bis zu 7,5 Stunden und eine gleiche quantitative Menge bei 19 Stunden.

Zur Bestimmung der Wirksamkeit der komplexen Polymerisate in verschiedenen Zellkulturen wird jede der Zellkulturen, die In der Tabelle V angegeben sind, über Nacht mit· einem der komplexen Polymerisate inkubiert, welche in dem Wachstumsmediura verdünnt sind, von dem bekannt ist, d*S qs für die verwendete Zellkultur erforderlich 1st* Nach der Entfernung des Wachstums* mediums, das die komplexen Polymerisate enthält,wird jede Kultur mit vesikularen 3tomatltisviren*uspensionen infiziert, inkubiert und .im Hinblick auf die Flockenbildung beobachtet, wie ale bei dem Test beschrieben wurde, welcher die Artspezifitut zeigt.

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Tabelle V

jig-Doeis dee komplexen Polymerisats/na, die zur Induzierung einer Widerstandsfähigkeit gegenüber einer

VSV-Fleckenbildung erforderlich 1st Zellkultur Poly-1:C PoIy-AsU

Ursprüngliche Kaninchen- niere	< 0,00125	0,0015	•	>100	•	>100
Ursprüngliche menschliche
EmbryonalhUlle	0,04	26,25
Ursprüngliche menschliohe
Embryoniere	1,25
Ursprünglicher KUkeneribryo	0,33
Ursprüngliche Rinderniere	5,00
Ursprüngliche Hundeniere	1,25
Ursprünglicher MSusoembryo	>5,25

Die relativen Wirkungen der komplexen Polymerisate sowie ihrer getrennten Komponenten gehen aus der Tabelle VI hervor·

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¹¹⁸⁵³ tv

Tabelle VI

Konzentration des komplexen Polymerisats« das zur Induzierung einer Widerstandsfähigkeit gegenüber einer VSV-Fleokenbildung auf ursprünglichen Kaninohennierenzellen erforderlich 1st

Polymerisat ug/ml

Poly-1 >11

PoIy-C >10

Poly-1:C - ζ 0,00125

Poly-A * >11

PoIy-U >10

PoIy-A :ü 0,0015

Unter Einhai tune <tor in den Beispielen 1 bis 5 beschriebenen Methode· wobei die Substanz IV oder dl· komplexen Polymerisate,

1 I

welohe naoh der Besehreibung der Substanz III aufgeführt sind, an Stelle der Substanzen I, II und III verwendet werden, werden Ähnliche Ergebnisse erzielt·

Die Interferone werden als Proteinmoleküle mit relativ niedrigem Molekulargewicht identifiziert, wobei diese Verbindungen hur in Zellen der gleichen Art« aus welchen die Interferone herge- stellt werden, die durch Viren verursachten Folgen (viral replication) zu beeinfluöen vermögen. Zur Charakterisierung der Interferone bedient man sich des Nachweises der ArtspezifitHt, der Antivirusaktlvltät, der Trypslnempfindllohkeit (ein

- 27 -

109814/2002

Test für Proteine), des isoelektrischen Punktes sowie Methoden der Molekulargewichtsbestimmung.

Die folgenden Tests dienen zur Identifizierung der aktiven Vireninhibierenden Substanzen als Interferone.

Nachwei« der Artspezifität des induzierten Interferons

j5 ml-Proben von Zweifach-Reihenverdünnungen in dem Kulturmedium der Interferon-Proben gemäß Beispiel 1, die durch Bestrahlung mit UV-Licht sterilisiert worden sind, werden Monoschichten verschiedener Zelltypen zugesetzt, die getrennt In 30 ml-0ewebe-ZUohtungskolben gewachsen sind. Nach einer über Nacht erfolgten Inkubierung werden die Serumproben abgezogen und durch 0,5 ml einsr susnension vesicularer Stomatitis-Viren ersetzt, worauf die Kulturen erneut weitere 1,5 Stunden bei 25 "C inkubiert werden. Dann wird eine Deckschicht aus 5 ml des Aufrechterhaltungs-Xulturmediums (maintenance culture medium), das Methylcellulose als Verfeetigungsmittel enthält, zu jedem Kolben zugesetzt, worauf die Inkubation weitere 3 bis 4 Tage bei 35^eC zur Bildung von Virusflecken fortgesetzt wird. Das Deekmedium wird ansohliessend entfernt, worauf die Zellen mit Carbolfuchsin angefärbt wtrden. Die Fleckenzahlen der mit Interferon behandelten Monoschichten werden mit den Fleckenzahlen von nleht-behandelten,

' - 28 -

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mit Viren infizierten Vergleichsmonoschichten verglichen. Die reziproke InterferonveröUnnung, welche eine zumindest 50^-ige Verminderung der Fleckenanzahl ergeben* wird als der Interferon-Titer der betreffenden Probe betrachtet. Die auf diese Weise bestimmten Titer zeigen die Artspezififcät, d.h. daß ein in einem Tier einer gegebenen Art induziertes Interferon nur in Zellen -wirksam ist, die von einem Tier der gleichen Art abstammen. Diese Titer werden in der Tabelle VII gezeigt.

Tabelle VII

Artspezifität der induzierten Interferone bei Versuchen« bei welchen ein Ansriff unter Verwendung von vesikularen

Stomatitis-Viren durchgeführt wird

Komplexes Polymerisat	Serum quelle	Interferon-Titer, der auf der Zellkultur untersucht wird	Mäuse- Embryo	Kaninchen- BSC +) niere Affe
	■	Küken- Embryo	<16	> 2048 < 16
ι.c	Kanin chen		128	< 16
IxC	Maus	<8	< 8	512 -
A:U	Kanin chen		< 8	> 2048
I:CpC	η	-	<1«	< 16 <16
nicht- behandelt	N

⁺' BSC - eine nachgewiesene Zell-Leltun« (cell line), die

von Nierenzellen von afrikanischen Orünaffen abstammt.

- 29 1098U/2002

11853 30

Nachweis der Trypsinempflndlichkeit des induzierten Interferons

Ein Interferon-enthaltendes Serum aus Tieren, die mit- einem , komplexen Polymerisat induziert worden sind» wird durch Chromatographie an CM-Sephadex (ein Kationenaustauscherraaterial, das durch Einführung von Carboxymethylgruppen in Sephadex erhalten wird) isoliert. Eine Probe des isolierten Interferons wird mit einer kristallinen Trypsinlösung (50 ^g/ral Endkonzentration) 4 Stunden lang bei 35⁰C behandelt. Eine ähnliche nioht-behandelte Interferon-Probe wird ebenfalls 4 Stunden lang bei 35 °C Inkubiert. Nach der 4-stUndigen Inkubationsperiode wird ein Sojabohnen-Trypsininhibitor jeder Probe einschließlich der Kontrollprobe ziag@s@fes'G. Die Proben werden im Hinblick auf ihre Interferon-Aktivität nach der Fleckenverminderungsmethode titriert. Die Trypsinlösung« welcher der Sojabohnen-Trypsininhibitor zugesetzt worden ist, wird ebenfalls im Hinblick auf ihre Antiviren-Aktivität titriert. Die Ergebnisse des Trypsin-Empfindlichkeitstests sind in der Tabelle VIII zusammengefaßt.

109814/2002

Tabelle VIII , Trypsinempfindiichkeit des induzierten Interferons

Interferon-Behandlung Titer

Poly-1:C induziertes Interferon + Trypsin 16 Poly-1:C induziertes Interferon 256

Trypsin-Vergleiohsprobe l6

Poly-1:CpC induziertes Interferon + Trypsin 8 Poly-1:CpC induziertes Interferon , 1024 Trypsin-Vergleichsprobe . ζ 8

Bestimmung des Molekulargewichts des Induzierten Interferons

Die Molekulargewichte des durch die koraplex®n Polymerisate induzierten Interferons werden nach folgender Methode bestimmt* Säulen mit einer Größe von 2 χ 35 cm werden mit hydratisieren. Sephadex 0-200-Kugeln gepackt, worauf langsam 2 bis 3 Tage lang ein 0,006m Natriumphosphat/0,15m NaCl-Puffer (pH 7) zur Erzielung einer Oleichgewichtseinstellung durchsickern gelassen wird (Sephadex ist eine hydrophile unlösliche Substanz, die durch Vernetzen von Polysaccharidsdextran gebildet wird Die Bezeichnung "0-200" bezieht sieh auf das Ausmaß der Vernetzung und damit der PorositKt des hydratisieren

= 31 -109814/2002

1 ml-Mengen des Serums, welche induziertes Interferon» das gemäS Beispiel 1 hergestellt worden ist« enthalten* wird auf die Säulen aufgegeben. Die Fließgeschwindigkeit In. der Säule wird auf 20 bis 25 ml pro Stunde eingestellt, wobei Fraktionen in 3 ml* Mengen gesammelt werden. Die Fraktionen werden auf ihren Interferon-Gehalt nach der Pleokenverminderungeoiethode unter« sucht** wobei das Molekulargewicht einer jeden Probe nach der Formel M¹ ^⁵ * 146 [l,480 - VAo¹^⁵I berechnet wird, worin "M" für das Molekulargewicht steht, "V" das Eluierungsvolumen des getesteten Materials ist und "Vo" das Leervolumen der Säule darstellt. Diese Methode liefert Werte, die innerhalb 10$ der Molekulargewichte liegen, die beim Testen mit gereinigten Proteinen angegeben werden.

Die Ergebnisse der Molekulargewichte-Bestimmungen sind wie folgt:

Kaninchen-Interferon Molekulargewicht Poly-1:C, induziert 49 000 bis 52 000

Bestimmung des isoelektrischen Punktes von Interferon

Die Serum-Proben, welche Interferon enthalten, das nach der In Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt worden ist,

'werden Über Nacht gegen einen O₄Im Natriumphosphatpuffer (pH 6 oder einfach verdünnt auf IO mit Puffer) dlalyalert. 20 ml einer jeden Probe werden auf eine 1,5 χ 10 cm CM-Sephadex« Säule aufgebracht« die mittels des gleichen Puffers In einen Gleichgewichtszustand überführt worden ist. Das Interferon wird durch nacheinanderfolgende Zugabe von 5 ml-Mengen eines 0,1m Natriumphpsphats mit steigender Erhöhung des pH-Wertes um 0,2 Einheiten elulert. Der Abfluß wird in 5 ml-Fraktionen gesammelt· worauf der pH und die Interferon-Aktivität einer jeden Fraktion gemessen wird. Der pB der Fraktion mit einer Spitzenaktivltitt wird aufgezeichnet, worauf der isoelektrlsohe Punkt durch Zugabe einer 0,4 pH-Einheit berechnet wird. Der' auf diese Welse beetiatnte lsoelektrlsohe Punkt für Interferone» die in einem kaninohen durch Verabreichung von Poly-1 :C be- «tlmrat wird» betragt 6,8 bis 6,9.■ , »

Die vorstehende Beschreibung der Herstellung der komplexen Polymerisate sowie die Beispiele erläutern bestimmte Merkoaale der vorliegenden Erfindung. Dae erfindungagemKße Verfahren 1st Jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Vielmehr kann die vorliegende Erfindung mit komplexen Polymerisaten durchgeführt werden» die aus bekannten Homopolynuoleotiden, Homooilgonucleotiden oder deren Desoxyanaloga hergestellt wo??**

den sind und auf parenteralem oder topischem Wege verabreicht

- 35? -1088U/2002

worden sind. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung die Bildung der komplexen Polymerisate in der Wirtszelle eines Tieres oder des Menschen, nach lern die zwei ausgewählten Homopolynucleotide gleichzeitig dem Wirtskörper zur Bildung des Polymerisats verabreicht worden sind. Beispielsweise können die zwei Homopolynucleotide zusammen auf die oral-nasalen Mem- -branen aufgesprüht oder auf lntraparenteralem oder intravenösen Wege verabreicht werden. Eine Stütze für diese Behauptung ist die Tatsache, daß 26 pg einer einfachen Mischung aus Poly-1 und PoIy-C in destilliertem Wasser beim Einspritzen in Kaninchen Interferon Induziert« woraus hervorgeht, daß der Komplex IsC in dem Kanin@fä@nblut gebildet worden ist·

Physikalische und chemische Eigenschaften der I:C-Koeplex- Polymerlsate ν

Oben wurde bereits auf die hypoehroae Verschiebung In oma UV-Spektrum hingewiesen, die dann auftritt, wenn das komplexe Polymerisat aus seinen Monomeren gebildet wird. Andere Beweise für die IiC-Bildung sowie die Verhinderung der Komplexbildung wurden ermittelt. Diese Beweise erfassen auch die anderen komplexen Polymerisate, welche erfindungsgemfiß verwendet werden. Daß I- und C-Polymerisate leicht Komplexe bilden* geht aus einer¹ merkliohen hypoetiremsn Wirkung hervor, sofern man den Komplex mit einer Mlaohung mm Ρ,;1?;^Ξ ski SNaIy-C, die an einer Komplex- -.

IOetfli/7002 ^r^

bildung verhindert wird, vergleicht. Wird beispielsweise PoIy-C mit 0,4# Formaldehyd behandelt, so daß es keinen Komplex bilden kann, und anschließend mit Poly-1 vermischt, dann wird ein UV-Absorptionsspektrum erhalten, welches aus der Summe der Spektren von Poly-1 und PoIy-C in nicht-komplexem Zustand besteht. Eine ähnliche Lösung der I'.C-Komplexpolymerisate zeigt eine merkliche Abnahme der optischen Dichte in der Lösung in dem 240 bis 260 ιημ-Bereieh. Die Aminogruppen von C werden' vor der Behandlung mit 0,4# Formaldehyd (C-HCIK)) gebunden, so daß die vermischten Polynucleotide nicht langer in der Lage sind, Wasserstoff sat binden und ein tJV«Absorptionsspektrum ergeben, welches der Summe der einzelnen Absorptionen der swei Polynucleotide gleioh ist. Wahrend 26 pg Poly-1:C in einfacher Welse Interferon in Kaninchen 'Induzieren, tritt bei Verwendung von 26 ug einer Poly-1 + C-HCHO-Iiöeung keine Induzierung von Interferon auf.

Die Bestimmung von C wird unter Verwendung von 0,1m Natriumnitrat bei einem pH von 4,0 während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 0*C durchgeführt, überschüssige salpetrige Säure wird durch Zugabe von Harnstoff beseitigt, während Produkte mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse entfernt werden. Die Mischung aus Poly-1 + desaminiertem PoIy-C ist in einer Menge von 26 ug hinsichtlich einer Induzierung von Interferon unwirksam.

1099U/2002

Eine Vorbehandlung des C (50 jtig/ml) mit Rinderpankreas-RNase (1 με/ml) während einer Zeitspanne von 4 Stunden bei 25°C bewirkt einen Abbau des PoIy-C zu kürzeren Kettenlängen, wie aus einem Ansteigen der optischen Dichte während der Inkubierung hervorgeht. Das HNase-abgebaute PoIy-C tritt nicht mit I in Wechselwirkung» wie aus dem Fehlen einer Hypochromizität hervorgeht. 26 ug der Losung sind ale Interferon-induzierendes Mittel unwirksam.

Die Existenz des I:C-Komplexee geht.aus dem Abbau durch RNase hervor. Um diese Tatsache zu untermauern* wird Poly-1:C in einer Konzentration von 40 ug/ml in einer Quarz-Küvette bei 25*C mit Rinderpankreae-RNaee (0,4 ug/ml) bei einem pH von 7*0 inkubiert« wobei der auftretende Abbau des Komplexes durch Messen der Änderung der optischen Dichte mit einem Aufzeichnungs-Spektrophotometer, der mit einer regulierbaren Erhitzungskammer versehen ist, verfolgt wird« Ein merkllohes Ansteigen der optisohen Dichte, insbesondere in dem Bereich zwischen 220 und 260 mu, zeigt, daß PoIy-ItC duroh RNase abgebaut wird. Unter den gleichen Bedingungen wird eine doppol faserige RNS aus Reovirus Virionen (Typ 3) nicht in merklicher Weise beeinflußt. Das durch RNase abgebaute Poly-1:G besitzt eine verminderte Fähigkeit, Interferon in Kaninchen zu induzieren.

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Pie Existenz des liC-Koraplexes geht ferner aus seiner pH» Empfindlichkeit hervor. Um dies zu zeigen» werden Poly-1 (27*5 ^»s/ral)* PoIy-C (24,0 ug/tnl) und Poly-1: C (52,5 ug/ml) in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung mit einem pH von 7,0 mit steigenden Mengen Alkali titriert· Eine Erhöhung der Alkalinität von einem pH von 7 auf einen pH von 10,3 zeigt, daS etne abrupte hyperohrome Wirkung bei einem pH von 9,5 bis 10,0 bei PoIy-IsC, jedoch nicht bei Poly-1 und PoIy-C allein auftritt. Zm Gegensatz zu dem Absorptionspektrum bei einem neutralen pH.ist das Abeorptionsspektrum der Lösung aus Poly-1 und PoIy-C bei einem pH von 10,8 mit dem Spektrum identisch, welches aus dem nicht-komplex gebundenen Poly-1 und PoIy-C bei einem pH von 10,8 errechnet wird. Bei einem pH von 9,5 bis 10,0 unterliegt das PoIy-IsC einer Dissoziation unter Bildung einer Lösung aus nlcht-koiapleac gebundenen Poly-1 und PoIy-C.

Mischungen aus Poly-1 und aus PoIy-C mit den gleichen Konzentrationen, Jedoch einem pH von 7,5 und 10,8 werden im Hinblick auf die Interferon-Induzierung In Kaninchen titriert. Das Material liefert bei einem pH von 7,5 eine Interferon-Induzierung von 0,33 μβ* während das auf einem pH von 10,8 gehaltene Material 1,31 ug benötigt, um in dem Kaninchen eine Induzierung zu erzeugen. Diese Tatsache kann dahingehend Interpretiert

Γ/

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11853 3«

werden, daß eine Komplexbildung aus Poly-1 und PoIy-C in der Umgebung des Kaninohenblutstromes stattfindet, Jedoch nur bis zu einem geringeren Ausmaß als uies dann der Fall ist, wenn die 2 Substanzen bei einem optimalen pH vorvermisoht werden. Diese Interpretierung findet ihre Stütze in dem Beweis« daß Poly-1 und PoIy-C in niohtfestelibarer Form In destilliertem Wasser %lnen Komplex bilden. Noch 26 ug der gemischten Polynucleotide in destilliertem Wasser Induzieren Interferon in Kaninchen, so daß der Schluß naheliegt, daß In dem Kaninohenblut eine Komplexbildung stattfindet·

(B) NuoielnEtoe aus P.-Funiculo*uro

Di© vorliegende Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, daß eine bestimmte doppelfaserige RibonucleinsHure (nachfolgend als HeI-RNS bezeichnet) aus einem bekannten Fungus, der unter künstlichen Bedingungen gewachsen ist und als Induziewmgemlttel wirkt, um die Erzeugung einer außergewöhnlich großen Menge an Interferon zu verursachen, isoliert werden kann· Diese Jeweilige NuoleinsXure kann aus einer der vielen Nucleinsäuren ausgewählt werden, die In dem Myoelium von P.-funiouloaura vor-* kommen. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in den synthetischen WaohetuuBsbedingungen, der Isolierung sowie der Gewinnung in. reiß@r Fora« Man lalnat an, daß dies« Nuoleinslure

109814/2002 ^⁰

617.659

vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt oder nicht identifiziert war. Es ist durchaus möglich, daß die Methoden zur Isolierung dieser Nucleinsäure sowie deren Gewinnung eine chemische Umwandlung aus der inaktiven Form« in welcher diese Säure durch den Fungus während ihres gesteuerten Wachstums erzeugt wird« zur Folge haben.

Der Schimmelpilz P.-funioulosum ist bekannt« da seine charakteristischen Eigenschaften in überall erhältlichen Büchern beschrieben sind« Dieser Schimmelpilz wird aus verschiedenen

ZUohtungsmedlen erhalten« beispielsweise aus den mit einer A.T.T.C.-Nummer versehenen Kulturen· Es scheint« daß alle Arten« welche der allgemeinen Beschreibung für diese Arten entsprechen« Muoleinsäure au erzeugen vermögen.

Im allgemeinen wÄchst dieser Fungus in einem üblichen Nährmittel-ZUohtungamedium« das zur Untarstützung des Wachstums von Schimmel· pilzen bekannt ist. Das tfyoelium wird gesammelt und zur Entfernung der erfindungsgemäßen Nucleinstture Isolierungsmaßnehmen unterzogen. Diese Nucleinsäure wird als induzierende Verbindung verwendet« um eine erhöhte Produktion der Wirtszellen des Interferons zu verursachen.

1098U/2002

Die erfindungsgemäße Nucleinsäure wird gemäß nachfolgendem repräsentativem Beispiel erzeugt, isoliert und goreinigt:

a) Ein herkömmliches Kulturmedium, welshes zur Unterstützung des Wachstum« von Schimmelpilzen oder Fungi bekannt 1st« kann zum Züchten des P.-funioulosum verwendet werden. Ein repräsentative» Kulturmedium enthält folgende Bestandteile pro Liter: 66,6 g Dextrose» 3,3 g NaNO., 16,2 g Hefeautolysat, 1,1 g K₂HPO₄, 0,55 g MgSO^.7M₂O, 0,55 g KCl, 0,011 g Rochelle-Salze, 0,011 g FeSO^. 7HgO, 0,0011 g ZnSO^. 7HgO sowie'vorzugsweise, Jedooh nicht in obligater Welse, einen Entschäumer sowie Wasser, um ein Volumen von insgesamt 1 1 aufzufüllen. Die Kultur wird 72 Stunden lang bei 26⁹C unter kontinuierlicher Belüftung und unter Rühren.inkubiert. Diese Gärung wird hinsichtlich des pH-Bereiches, der Verwendung von Dextrose sowie In Hinblick auf die Herstellung des Myoeliums überwacht. 379 1 (100 gallons) dieser Fermentationsbrühe werden filtriert, worauf der Rückstand, der aus Myceliumkuohen (l6,3 kg (36 pounds)) besteht, gesammelt wird.

b) Dieser Kuchen wird mit einem leicht alkalischen Phosphatpuffer (pH zwischen 7,5 und 9,0) vereinigt. Beispielsweise wird der ffyoeliumkuohen in 125 1 (33 gallons) eines Phosphatpuffers

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HI

(pH 8,0) suspendiert und kräftig bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang gerührt. Die Puffermischung wird wie folgt hergestellt:

20 1 Phosphatpuffer (pH 8,0)

- 92,58 g )

) verdünnt auf 20 1 ,- 5,52 g )

Die Myoeliumkuohen-Suspenslon wird filtriert, worauf das klare Filtrate oder der Extrakt (117.1 (31 gallons)) behalten werden.

ο) Zu dem klaren Piltrat wird ungefähr eine gleiche Menge eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, von dem bekannt ist, da8 es die Ausfällung von Proteinen bewirkt, bei« spieleweise Aceton, Methanol oder Äthanol, zugesetzt. Indes Beispiel werden 106 1 (28 gallons) Aceton langsam unter Rühren dem Mycisliuta-Extrakt zugesetzt. Die Mischung wird Über Njtoht bei Zimmertemperatur zur Ausfällung der gebildeten Feststoffe stehen gelassen« worauf der lösliche Anteil sorgfältig von der unlöslichen Fraktion abdekantiert wird.

d) Der Niederschlag wird anschließend 30 Minuten lang bei 65OO Upm zentrifugiert, worauf die Überstehend® Flüssigkeit verworfen wird.

- 41 -

BAD

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11853 «H

e) Der Niederschlag wird mit so viel Wasser zersetzt, daß der Nuo leinsäure komplex extrahiert wird. In dem Beispiel werden 2,5 1 Wasser verwendet. Der Wasg«rsxtrakt wird anschließend klar zentrifugiert, worauf der unlösliche Anteil verworfen wird.

f) Der klare wässrige Extrakt wird ansohlieflend in einem 20/32-DlalyeeJehKuee gegen 28 1 (10 gallons) destilliertes Wasser bei 4° C während einer Zeitspanne von 24 Stunden zur Entfernung von dlalyslerbaren Materialien dialy eiert. Der Extrakt kann weitere 24 Stunden dlalyslert werden, wobei das Wasser ausgetauscht wird.

g) Γ* nloht-dlalysierbare Fraktion (Ret'entat ) wird bei 65OO Upm zentrifugiert, worauf der klare löellohe Anteil durch 18 ständiges Zentrifugleren bei 35 000 χ 0 zur Herstellung eine· Pellets um das 25-Faobe konzentriert wird.

h) Das 25-fache Konzentrat wird in eine« neutralen verdünnten Natrlumphosphatpuffer, wie beispielsweise 0,01m Natriumphosphat (pH 7) suspendiert.

1) Diese Suspension wird durch 10 Minuten dauerndes Zentrifugieren bei 2000 Upü -klart, worauf die Überstehend· Flüssigkeit

109IU/2002

11853 abgetrennt wird,

j) Anschließend wird unter Verwendung eines 88#-igen flüssigen Phenols eine Phenolextraktion bei einer Temperatur von 35 bia 40⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten durongeführt, wobei ungefähr ein gleiohes Volumen en Phenol eingesetzt wird. Man nirajgt an« daß die Behandlung mit Phenol den Komplex» in

welchem die erfindungsgemäße Nucleinsäure gebunden ist» aufbricht.

Ic) Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 5°0 zur Abtrennung der wässrigen Schicht von der Phenolschicht bei 2000 üpm zentrifugiert, worauf das Phenol verworfen wird.

1 und m) Die Phenolextraktiori sowie d&s Zentrifugieren werden. weitere zweimal bei Zimmertemperatur jeweils während einer Zeitspanne von 30 Minuten durchgeführt·

n) Die wässrige Schicht.wird gegen ein großes Volumen (50 bis 100 Volumina) eines 0,01m Natriumphosphatpuffers (pH 7) zur Entfernung von restlichem Phenol dialysiert.

o) Bine weitere Reinigung wird durch Chromatographie an Eeteola-Cellulose [ Die Synthese dieses Materials wird von Peterson et al in "JACS", 78, 751 - 756 (1956)] beschrieben]

φι

erzielt, wobei bei dieser Chromatographie eine große Menge inaktives Polysaccharid entfernt wird , das nach der- Phenolextraktion zurückbleibt.

Eine SSuIe (1,5 x 10 cm), die mit Eoteola-Cellulose gefüllt

■τ

ist, wird durch Suependierung des lonenaustausohermateriale, und zwa? nacheinander folgend in 0,5n NaQH, destilliertem Wasser, 0,5m NaHgPO* und anschließend in 0,01m Natriumphosphat (pH 7) präpariert. Diese Aufschlämmung wird in eine Glassäule gegossen und mit ungefKhr 200 ml eines 0,01m Natriumphosphatpuffers (pH 7) durchgewaschen. Ungefähr 100 bis 120 ml des dialysierten, mit Phenol extrahierten 25-faoh konzentrierten Konzentrats werden auf die ,Säule aufgegeben.

p) Die SSuIe wird mit einem stufenweisen NaCl-Oradienten von 0,1m bis 0,5m in 0,05m Stufen eluiert, da auf diese Weise die Verunreinigungen entfernt werden.

q) Anschließend wird die Säule stufenweise von 0,5m bis 0,8a in 0,1m Stufen eluiert, wobei in jeder Stufe 20 ml eingesetzt werden. Der NaCl-Oradient wird in beiden Pail en in 20 ml-Fraktionen gesammelt. Der Interferon induzierende Aktivltäta-Peak wird In den Traktionen erhalten, welche sich eine 0,5m - und 0,6m- Na<5l-Zugaben anschließen.

200 2

Erneute. Chromatographie. Die Aktivlt&ts-Peak-Fraktionen« die bei den 0_#5m* und 0,6m- NaCl-Stufen eluiert worden sind« werden gesammelt und gegen 0,01m Natriumphosphat (pH 7) dialysiert. Von diesem bereits chromatographierten Material werden 100 ml auf eine mit Eoteola-Cellulose gefüllte Säule mit einer Abmessung von 1,5 χ 6 om aufgegeben. Unter Bedingungen, die mit denjenigen der ersten Chromatographie identisch sind« wird die Chromatographie durchgeführt. Die Interferon-induzierende Aktivität wird erneut bei den 0,5m- und 0,6m- NaCl-Zusätzen eluiert. Bis auf eine Spurenmenge wird Inaktives Folysaooharid während der zweiten Chromatographie beseitigt.

Da« folgende Fließschema sseigt die Stufen« welche vorstehend für die Isolierung der doppelfaserigen HeI-RNS gemäß einem Merkmal der Erfindung beschrieben werden.

BAD OBlOlNAL

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11853 ··

(a) Wachstum von P.-funiculosum in einem Kulturmedium

Kulturmedium (verworfen)

Myeeliumkuchen (verworfen)

MyceliumkuGhen

b) suspendiert in einem leicht alkalischen Phosphatpuffer

Myceliumextrakt

c) Ausfällung mit einer mit Wasser

mischbaren Lösung d) Zentrifugleren

Überstehende · Flüssig-Niederschiag keit (verworfen) ^^ e) extrahiert mit Wasser und

zentrifugiert

Niederschlag (verworfen)

Überstehende Flüssigkeit (verworfen)

Überstehende Flüssigkeit

f) dlalysiert gegen Wasser

g) 18 Stunden lang zentrifugiert __^ bei 35 000 χ Q

•Pellet

h) erneut in 0,01m Natriumphosphat (pH 7)

suspendiert 1} geklärt durch 10 Minuten dauerndes

Zentrifugleren bei 2000 Upm.

Pellet (verworfen]

Phenol-Bodenschicht (verworfen)

Überstehende Flüssigkeit

) 30 Minuten lang bei 35-¹W⁰C mit

einen gleiohen Volumen eines 88£- lgen Phenols verrührt

30 Minuten bei 2000 Upm bei 5"C zentrifugiert ■.

Obere Schicht (wässrig)

1) erneut zweimal mit Phenol während einer Zeitspanne von 30 Minuten

bei 25*C extrahiert ra) 30 Minuten lang bei 2000 Upm

und 5*C zentrifugiert

Phenol-Bodenschicht Obere Schidh't (wässrig)

(verworfen) n) gegen 50 bis 100 Volumina 0,01m

NaPO₂. (pH 7) dialysiert o) zu Eoteola-Cellulose zugesetzt

(verworfen)

p) Verunreinigungen werden mit bis zu 0,5m NaCl eluiert

q) Nuoleinsäure induzierende Verbindung wird mit 0,5 bis 0,5« NaCl eluiert

(o*PfQ) werden für eine weitere Rein!· gung wiederholt

HeI-RNS

109114/2002

Anwesenheit eines Inhibitors für die Interferon-änduzierenden Verbindungen in den Rohextrakten

Die Bedeutung der Phenolzugabe-Stufe zur Freisetzung oder anderweitigen VerfUgbaroiaohung der RNS der vorliegenden Erfindung geht aus folgenden Ausführungen hervors Die Erhöhung der Ihduzierungskapazität der Rohextrakte» welche durch Zentrlfugieren konzentriert worden sind, bei der Verdünnung oder anschließenden Phenolextraktion legt die Vermutung nahe« daß ein Proteininhibitor zugegen ist» der teilweise oder vollständig die rAnwesenheit der Interferon-induzierenden Verbindungen in den verschiedenen Chargen maskiert« Die folgenden-Werte .zeigen diese Erscheinung: .

- 47 - ·

BAD ORiGtNAL

10*814/2002

Aktivierung der Interferon-ihduzlerenden Verbindung durch Phenolextraktion

Induzierende Verbindung Ver- Durohsehnittli- .s

dünnung eher Interferon-Titer '

Konzentrierter P.-Funloulosu m«

Extrakt 1:2 j>

η rf _lt4 40

¹¹ " 1116 5

Konzentrierter P.-Funiculosura- Extrakt nach der Behandlung

mit Phenol 1:2 640

" " 1** 640

. * - " li8 160

ⁿ " .Ul6 40

normal 5

⁺' Das Interferon wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise In Kaninchen Induziert.

Eigenschaften der Nuoleinsäure

Die gereinigte Induzierend· Verbindung für Interferon wird als RlbonuclelneKur· _ν(ΗΝβ) an Hand folgender Kriterien oharak· terislert: (1) Das UV-Spektrum ist typisch für eine Nucleinslure« da es beispielsweise ein Maximum bei 257»5 und ein Mini" mum bei 230 mu aufweist. Das DlohteverhKltnls (max./min.) betrXgt 0,72/0,31 = 2,^0, wahrend das 260/280-Dichteverhältnis zu 0,72/0,33 s 9,18 ermittelt wird. (2) Anschließend an die

Inkubation bei 37 bis 56^eC mit Ribonuclease erfolgt eine Verminderung der Interferon-induzierenden Aktivität. (3) Es wird eine Widerstandsfähigkeit gegen Disoxyribonuclease, Natriumperjodat und Formalin festgestellt.(4) Pie chemische Analyse zeigt, daß Bestandteile, wie sie normalerweise in RNS gefunden werden, zugegen sind. (5) Andere chemische Analysen sowie (6) eine thermische Zersetzung lassen ebenfalls den Schluß zu, daß es sich-um RNS handelt*

(1) UV-Absorptionsspektrum.

Das UV-Absorptionsspektrum wird in einem Beckman DU oder DB-O-Spektrometer bestimmt und ähnelt demjenigen bekannter Nucleinsäuren, die aus verschiedenen Quellen erhalten werden.

(2) Nachweis der Ribonuclease-Empfindlichkeit der Interferon induzierenden Verbindung

Das von P.-Puniculosum isolierte gereinigte Interferon-induzierende Mittel wird inkubiert, wobei bei jeder Temperatur eine zusätzliche Probe verwendet wird, die Pancreas ribonuclease (chromatographisoh rein) enthält. Die inkubierten Ribonuoleasebehandelten und -nichtbehandelten Proben werden im Hinblick auf die Induktion von Interferon in Kaninchen getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IX zusammengefaßt.

- 49 1Q98U/2Q02

	50	e IX	induzierenden	Mittels	1617659	640
11853	T a b e 1 1	Nachweis der Ribonucleaee-Empfindlichteeit des	Temperatur der	Inkubations		< 5
			Inkubation	zeit
		RibonuQlease«		30 min.	Interferon-
Kenzentration	35 C	30 min.
	37*C	2 Stunden	Interferon-
0,2 ug/ml	370C	2 Stunden	Titer
	56eC	2 Stunden	320,640
2,0 μβ/ral	56·σ	2 Stunden	320
	320,640
2,0 ug/ml	<5

Die Tabelle IX zeigt, daß die Hel-iUIS gegenüber einem Abbau durch RNase bei 0,2 ug/ml bei einer Inkubation wahrend einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 25*C vollständig unempfindlich ist. Diese Stabilität geht auch aus einer Messung des Anstieges der optischen Dichte, gemessen, bei 260 au, hervor, wobei der Anstieg in % ermittelt wird. Unter den in der Tabelle IX angegebenen Bedingungen wird in den folgenden Tabellen X und XI sun Vergleioh der Anstieg der optischen Dichte einer vorher denaturierten HeI-RKS und einer Hefe-RNS gezeigt.

-50-.

1098U/2002

11855

Tabelle X

Erhöhung der optischen Dichte Infolge eines Abbaus einer 20 ug/ml· RNS-Lösung unter Verwendung von Pankreas-RNase (0,2 ug/ral bei

25⁰C und einem pH von 7)

Substanz

Zelt in Minuten

Erhöhung der optischen Dichte bei 260 χφ In %

Nichtdenaturierte HeI-RNS η • *■:■ m	O 10 20 50	1	XI	0 0
Denaturierte HeI-RNS N η η	0 10 20 50		0 10 11 12
Hefe-RNS Il η η	0 10 20 50		0 12 it
	Tabelle

Erhöhung der optischen Dlohte Infolge des Abbaus einer 20 ug/ml« RMS-Lösung unter Verwendung von Panitreae-RNaee (10 ug/al bei

56*C und «inen pH von 7)

Substanz

Zelt in Minuten

Erhöhung der optischen Dlohte bei 260 mp in *

Niohtdenaturiert· HeX-RMS M K ti	0 40 80 120	0 I 8,5
Hefe-RNS M M Il *	0 40 80 120	0 if·5 14
	- 51 -
	1Ö98U/2002	BAD DBiGiHAL

(3) Naohwel· dee Fehlens einer Desoxyrlbonuclease-, Formalin- und Perjodat-Eiipfindliohiceit .

Eine LÖJBung, die 16 ug der gereinigten HeI-RNS pro al enthält, wird auf einen pH von 6 eingestellt, worauf Natriumperjodat zugesetzt wird und nach Beendigung dee Teste das übereohüssige Perjodat durch Zugabt von IjSGlycerin »erstort wird. Ansohlie** send erfolgt »Ine Dialyse gegen eine Phosphat-gepufferte 3alzlusung. Eine andere ähnliche LOeung des Interferon-lnduzierenden Mittel« wird mit elektrophoretlsoh gereinigter Desoxyrlbonuo lease inkubiert · Ein· weitere Vhnllohe * Lösung der HeI-RNS wird mit Formalin inkubiert. Die vorstehend behandelten Lösungen werden im Hinbliolc auf die Induzierung von Interferon In Kaninehen getestet· Die Ergebnisse sind in der Tabelle XII «ueamaengefa^t. .

Tabelle XII

Naohwels des Fehlens einer Ptorjodat-, Formalin- und Desoxyribonuclease-Eovfindllohkeit des induzierenden Mittels

Behandlungs- Konzen» Substanz tration

Temperatur Zeit

•c

Interferon-Titer

Matrlumperjodat O₉CXLm

Desoxyrlbonuolease

Formalin

5 /ig/ml

25 25	1 α	Stunde Stunde	40-320 40-640
25	1	Stunde	40-320
25	1	Stunde	40-640
35 35	4 4	Stunden Stunden	320-640 640

- 52 -109814/2002

^o

Die Tabelle XII zeigt, daß Hel/RNS gegenüber Formalin voll« ständig unempfindlich ist» Dies gehtauch aus einer Vergleichsanalyse der optischen Dichte einer 20 jAg/ml-Lösung der Hel/BNS vor und nach der Inkubierung mit einer l,S#-igen Formaldehyd·* lösung bei 35°C während einer Zeitspanne von 4 Stunden hervor. Ein derartiger Test zeigt keine merkliche Änderung der opti= sehen Dichte _s sofern die Messung bei 260 mu erfolgt. Eine Mhn~ liehe Analyse unter Verwendung von Hefe-RNS (yeast ribosomal RNA) ergibt eine Erhöhung der optischen Diohte bei 260 mu von 0,5 bis 0,6. Die Analyse zeigt ferner eine Verschiebung des Sxtinktions (absorbanoy)«Maximums von 255 bis 260 mu. Dies kann als ein Hinweis für die Anwesenheit einiger freier Aminogruppen in der HeI-RNS anstatt in der Hefe-RNS sowie für die Anwesenheit einer doppelfaserigen Schraubenspirale gedeutet werden.

(4) Auswertung der chemischen Analyse der Basen-Zusammensetzung des Interferon-lnduzierenden Mittels

Die Basen-Zusammeneetzung (Purin und Pyrlmidin) wird duroh Hydrolyse einer getrockneten Probe des Interferon-induzierenden Mittels mit 12n Perchlorsäure während einer Zeltepanne von 2 Stunden bei 100°C bestimmt. Das saure Hydrolysat wird auf einen Whatman Filterpapier (Nr. 1) zusammen mit den 4 Bauen (Adenin, Guanin« Cytosin und Uracil), die sich normalerweise in Ribonucleinsäuren finden, chromatographiert. Die Basen werden

■■"- ^J·? - 53 -

109814/2002

11855

als Flecken auf dem Papier mittels UV-Licht lokalisiert« ausgeschnitten und mit O,ln Chlorwasserstoffsäure eluiert. Aus den Rf-Werten (Entfernung einer Base von dem Startpunkt dividiert durch die durch das Lösungsmittel zurückgelegte Entfernung) wird die Identität der UV-Licht Absorbierenden Flecken auf dem Filterpapier bestimmt. Aus dem Absorptions-Spektrum der eluler· ten Flecken werden die Basen identifiziert, die sich In dem - sauren Hydrolysat des Interferon-induzierenden Mittels befinden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XlII zusammengefaßt.

Tabelle XZZI

Basen-Zusammensetzung des Interferon-induzierenden Mittels Identifizierte Base Rf' Rf (Literatur)

Adenin Öuanln Cytosin Uraoil

Das bei der Papierohromatographle der Purin- und Pyrimldin- Baeen verwendete Löaungemlttelsyatem besteht aus Isopropanol- HCl-Waeser (vgl· K. Pink und W. J. Adame, J. of Chromatography, 22. (1966), Seite Il8).

0,24	0,25
0,3*	0.16
0,46	0,47
0,66	0,68

ioiriu/2002

Si

(5) Andere chemische Analysen des Interferoh-induzierenden Mittels

T a b e	lie XIV	■·	-	% Theorie
Chemische Komponente	% Gefunden	36,5
Rlbose ,	38,0	8,6
Phosphor	8,4
Protein.	<1	• *
Polysaeoharid	<1
Desoxyribose	keines	•
(6) Sedimentationsanalyse

Der Sedinentationskoeffizient (Sg₀,W) wird bestimmt und zu durchschnittlich 12,1 ermittelt.

(7) Thermische Denaturierung

Die thermische Denaturierung der HeI-RNS wird an Hand von Experimenten gemessen, die unter Verwendung eines Beokman DB-O-Spektrophotometers, der mit einem Tm-Katalysator und einer Aufzeichnungsvorrichtung versehen ist, zur Messung der Temperatur und optischen Dichte bei 260 mu durchgeführt werden« Die Erhöhung der Extinktion der doppelfaserigen HeI-RNS bei 260 mu ^: wird als eine Punktion der Temperatur bei 2 verschiedenen Salzkonzentrationen ermittelt. In SSC (0,15m NaCl - 0,015m Natriumeitrat, pH 7,0) wird nur eine kleine Erhöhung der Extinktion,

1Ο98Ί¥/1ΟΟ2

d.h. eine Erhöhung um ungefähr 8& ermittelt« sogar bei 100⁰C, was darauf hindeutet« daß der Tm (thermische UbergangsmeJSpunkt) höher als dieser Wert ist. Bei der unteren IonenstärKe (0,1 SSC) tritt eine Hyperohromizität von jS2# hauptsächlich im Bereich zwischen 85 und 10O⁰C mit einem Tm von 95 ⁰C auf. Aue Einzelfasern bestehende HNS aus Hefe-Ribosomen zeigt eine geringere HperchroadzltKt (20Ji), wobei diese HyperchromizitMt über einen breiten Temperaturbereich zwischen 40 und 75*0 (Tm 55^eC) in SdC hinweg besteht* Diese Ergebnisse, zeigen, daß HeI-RNS in hohem Mate thermisch stabil 1st« Wird die HeI-RNS in SSC mit Formaldehyd in einer Konzentratloh von 2,76# erhitzt« dann tritt eine 44#«ige Erhöhung der Extinktion der HeI-RNS in SSC beim Erhitzen auf. 95°C auf. Haselkorn und Coty haben gezeigt» daß Formaldehyd den Tm von wasserstoff gebundenen spiralenartigen Polynucleotide» fterabaetzt.

Die folgenden Beiepiele zeigen die Verwendung der erfindungsgemäßen RNS als induzierendes Mittel für die Erzeugung von

Λ' Λ

Interferon. Beispiel 6 Induzierung von Interferon in Kaninchen

Die gereinigte RNS-Fraktlon aus P.-Funloulosum wird durch intravenöse injektion an Kanlnohen verabreicht, und zwar naoh der

109*1 ase/1002

sr

Methode, wie sie oben bei dan komplexen I:C~FoIyiaerisaten beschrieben wurde. Die auf diese Weise bestiisnaton Titer sind in der Tabelle XV zusammengefaßt.

Tabelle XV

Interferon-Titer, die mittels Kaninchennieren-Zellkulturen, welche in rohrförmigen Gefäßen gezüchtet werden, bestimmt werden

Dosis pro Tier Interferon-Titer des Serums

8 ug 80 - > 640

2 ug 80 -t 160

0,125 pg 5 - 10

keine { 5

Wie vorstehend erläutert, kann das auf diese Weise in vivo erzeugte Interferon isoliert und nach den bekannten beschriebenen Methoden charakterisiert werden. Diese Methoden setzen sich wie folgt zusammen:

(a) Nachweis der Artspezifität des Induzierten Interferons

Die auf diese Weise unter Verwendung von HeI-RNS bestimmten Titer zeigen die Artspezifität, d.h., dafl Interferon, das.In einem Tier einer gegebenen Art induziert wird, nur In Zellen wirksam ist, die von einem Tier dieser Art abstammen. Diese Titer sind in der Tabelle XVI gezeigt.

-57 -

109814/2002

11853 ς*

Tabelle XVI

Artspezifität von induziertem Interferon in Immunitätstesta unter Verwendung von vesikularen Stomatitia-Viren

In der Zellkultur ermittelter Interferon-Titer

Bei- Serum- Küken- Mäuse·= Kaninchenniere spiel quelle Embryo Embryo Nr.

1 Kaninchen - ζ 20

2 Kaninchen <6 <¹² S⁶

(b) Nachweis der Trypsin-Empfindliohkeit des induzierten Interferons

Ein Interferon-enthaltendes Serum-von Tieren, das mit einer gereinigten RNS-Fraktion aus P.-Funiculoeum induziert worden ist, wird in der oben geschilderten Weise isoliert. Die Ergebnisse

des Trypsin-Empfindlichfceitstests sind in der Tabelle XVII zusammengefaßt.

Tabelle XVII Trypsin-Eopfindliohkeit von induziertem Interferon

Interferon-Titer Interferon allein Interferon + Trypsin <

Trypsin-Vergleiohsprobe ζ

- 58 -1Ö98U/2002

¹¹⁸⁵³ ■ a -. ,

(ο) Bestimmung des Molekulargewichts von Induziertem Interferon

Das Molekulargewicht von Interferone^ die mittels P.-Punlculosum-RNS induziert worden sind, wird nach der oben beschriebenen Methode bestimmt. Diese Methode liefert Werte« welche innerhalb von 10$ der angegebenen Molekulargewichte liegen, wenn Teste mit gereinigten Proteinen durchgeführt werden,

Die Ergebnisse der Molekulargewiohtsbestlmmung sind wie folgt: Tabelle XVIII, Kaninchen-Interferone . Molekulargewichte

Mit P.-Funiouloeum-RNS induziert 60 000 und IJO 000 (d) Bestlnaung dsf iaoelektriaohsn Punktes von Interferon

Dl· Serum-Proben« welche duroh ΗβΙ-ÄHß induziertes Interferon enthalten» werden In der oben beschriebenen Weise analysiert. Der auf diese Welse für ein Interferon« welches in Kaninchenserum durch Verabreichung von P. «Puniculoeum-TlNS bestimmt wird, betragt 6,9 bis 7,1.

Beispiel 7

Induzierte Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion von Mäusen duroh Columbia 3K-Viren .

Die oben erläuterte experimentelle Methode %$Χτύ

Tiere, die in ähnlicher Weise mit P.-Funiculosum-RNS behandelt worden sind« jedoch nicht mit dem Virus infiziert worden aind, werden beobachtet., um eine durch diese Chemikalie eventuell erzeugte ToxizitKt festzustellen·Es wird jedoch keine Toxizität bei irgendeinen der behandelten, jedoch nioht-infizierten Tiere beobachtet. Pie Tiere behalten ihre normalen Freßgewohnheiten bei« fahren fort zu wachsen und erscheinen hinsichtlich ihrer äußeren Eigenschaften normal.

Es werden täglich Zählungen vorgenommen, um die Anzahl der lebenden sowie die Anzahl der toten Tiere zu ermitteln. Die Tiere werden 10 Tage lang beobachtet. Die Ergebnisse sind In der Tabelle XIX zueanaengefaßt.

Tabelle Induzierte Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion von Mäusen

durch Columbia 3K-Viren

Chemisches Gesamtdosis % der über- Mittelwert der pro ' Mittel pro Tier lebenden Tiere Tag überlebenden Tiere

P.-Funioulosufll·· .\

RHS 50ug^+; 73,3 12,0

Phosphatpuffer - 0,0

' Probe enthält 50 ug RNS/ml. 0,5 ml werden 18 Stunden vor dem Virue-Immunitätstest verabreicht, während 0,5 ml 3 Stunden nach dem Virus-Immunltätstest gegeben werden.

. - 60 1098U/2002

Beispiel 8 .

Induzierte Widerstandsfähigkeit gegen eine Pneumonia-Viren Infektion von Mäusen (FVM)

·,„■ .,·- _|r||| ι - ι, , -_T n — 1-11- ι ι, ,,ι, ,η . |f ι, _- ,ι, ■ -T, in |_Ί I ι. ι III m ι ι I I III 111. ..BI IMIIIIJHB-Ii

Lösungen der gereinigten RNS werden im Hinblick auf ihre Fähig· keit, gegen eine PVM-Infektion zu schützen, nach der oben beschriebenen Methode untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XX zusammengefaßt.

Tabelle XX

Induzierte Widerstandsfähigkeit gegenüber einer durch Pneumonia-Viren verursachten Infektion von Mausen

Oesamtdosis % der über- durchschnittliche Chemisches Mittel pro Tier lebenden Tiere Zahl der pro Tag

überlebenden Tiere

P.-Funioulosum 20 ug in 90,0 ) 14 RNS 2,0> ml

Phosphat-gepufferte Salzlösung 0,03 ° 7

(C) Ribonucleinsäur· aus Reovirus-VIrionen (Typ 3)

QeraÄfl einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine RNS aus Reovirus-Virionen (Typ 3) erhalten, die eine Doppel faser besitzt und ein ausgezeichnetes Stimulanz für die Interferon-Erzeugung ist. Diese RNS wird nachstehend als Reo-3«-RNS bezeichnet. ■

Zur Gewinnung öJGiior-.Reo-^-RKS werfen (^yP 3) in priiiiürGn EglJkulUiren ouß MtsGrlrcikTieroiioren necb liehen Httthodcn gcEllehket. untf nftoh oJner 3- t».is 4*tKgijg8n XRteubRtiora bei 35°C ©eeifisnelt. ßio Rf>ovlr-en»Vlrlc«KHi (Typ B) in der ZellkulturflUseigkelt werden mittels der SMuremuefällungß- methodej wie sie von Charney et al (J. Charney, R. Machlowitz, ' A. Tyte 11, J. Sagin und D.3. Spioer, Virology, 15 269 (196I)) besonrilben wird, auf das 50-?aohe konzentriert.

• *

Der Niederschlag wird gesanraelt und erneut in einen Natrium-Phosphatpuffer (pH 8) suspendiert. Diese Suspension ist einem 50-fachen Konzentrat der ursprünglichen Virusmenge äquivalent· Sie wird duroh 10 Minuten dauernde· Zentrifugieren bei 3OOO Upm (oder 15 Minuten bei 1500 Upm) geklärt. Die überstehende Flüssigkeit wird bei" 78 000 χ g drei Stunden lang zentrifugiert. Das Pellet, welches den Virus enthält, wird erneut in einer mit Natrlunphosphat-gepufferten Salzlösung (pH 7)« dl· 0,005b Magnesiumchlorid enthält, zur Gewinnung eine· 500-faohen Konsentrats des Ausgangsiaaterlals erneut suspendiert. Eine weitere Reinigung des Virus und die Extraktion und Reinigung der Reo*2«RNS werden nach der oben erwähnten Methode von Oomatos und Tann durchgeführt·.

Diese RNS 1st nloht-inflzlerend, wie aus Tests zur Bestlmnung der Xnflzlerbarkeit von empfindlichen Affennierenzellen und

10*814/2002

L-Zellen hervorgeht. Das Fehlen einer Infizlerbarkeit bei einer derartigen RNS wurde wiederholt gezeigt, beispielsweise von Oomatos et al (P. J. Gomatoe und W. Stoeckenius, Proe. Natl. Acad. Sei., 55, 1**9 (1964)).

Oomatos und Tann beschreiben die Reovirus-Ribosonuoleinsäure als elnMöppelfaserlges Molekül, wobei Tests der vorstehend besohriebenen Art, die zur Untersuchung dieser RNS herangezogen werden, diese Tatsache bestätigen. Werte, die hlnslohtlioh der Interferoh-Induzierung bei Tieren durch diese'Reovirus-RNS erhalten werden, stutzen das erfindungsgeinäee Merkmal, daß eine Doppelfaseriglceit der RNS erforderlich ist, um Interferon induzieren zu können.

Diese Reo-5-RNS ist bei einer intravenösen Injektion sur Indu-Eierung von Interferon in Kaninchen, wobei nur eine 0,5 ug-Dosis RNS pro Kaninchen eingesetzt wird, sehr wirksam. Innerhalb •iner Stunde nach der Injektion von 8 ug pro einer 0,$ ml-Dosis (Menge, die von 8 χ 10 Virionen erhalten wird) tritt ein hoher Interferonspiegel auf. Die Reo-3-RNS erreicht nach 2 Stun· den eine Spitze und fällt langsam 4 Stunden später auf eine Höhe ab, die weniger als l/l6 der Spitze beträgt. Infizierende Reovirus-Vlrionen (Typ J) in einer äquivalenten Dosis vermögen keine merkliche Menge an Interferon vor einer Zeitspanne

10981 ft ro 02

ft

5 Stunden zu Induzieren, wobei der maximale Spiegel nicht mehr als l/l6 desjenigen Spiegels beträgt, welcher durch RNS induziert wird. Dies legt die Vermutung nahe« daß der ganze Virus nioht solange als Interferon-induzierendea Mittel wirksam wird, bis die doppelfaserige RNS In Freiheit gesetzt wird, d.h. daß die Zeit erforderlich 1st, welche für die Beseitigung der Hülle von dem ganzen Virus erforderlioh let. Es let ferner darauf hinzuweisen, daß die nackte RNS als Induzierendes Mittel weit wirksamer 1st als der ganze Virus«Die kurze Induktlonsperlode der Reo-3-RNS entspricht derjenigen zur Induzierung durch die oben diskutierten komplexen synthetischen Polynucleotide.

Die Identifizierung der Viren-inhlbierenden Substanz In den Kanlnohtnseren, welche mit Reo-3-RNS eingespritzt werden, beruht auf den biologischen und biochemischen Eigenschaften, auf die welter oben Bezug genommen wurde. Diese Eigenschaften sind folgende: (a) Wirtsart-SpezifitKt* die Inhibierend wirken· de Titer von 128 bis 256 In homologen Kaninchennierenzellen und < 32 in heterologen Mäueeembryonen- und Kükeneabryonen» zellen beim züchten zeigt, (b) Herabsetzung des Titers von 32 auf< 2 durch Behandlung während einer Zeitspanne von 4 Stunden bei 35"C mit 50 ug/ml Trypsin, (c) Molekulargewicht von 40 000, bezogen auf eine Sephadex O-200-Oelflltration und (d) isoelektrisoher Punkt von 7,0, gemessen durch Chromatogra-

11853

phie auf CM-Sephadex.

Tests« die in primären Monosohioht-Zellkultüren aus Kaninchen». nieren in der oben beschriebenen Weise durchgeführt·werden» zeigen« daß ζ 0,04 ug Reo-3-RNS erforderlich sind, um die Bildung von Fleoken dureh einen veeikularen Stomatitis-Virus zu verhindern· A- '

Das UV-Absorptionsspektrum von Reo-3-RNS ist typisch für eine Nuoleinsäure mit einem Minimum bei 232 und einem Maximum bei 260 mu. Das 260i230-Verhältnis betragt 2,08, während dae 260s280-Verhältnis zu 2,30 ermittelt wird. Diese Werte ähneln den Werten, welche für Reovirue-3-Virion-RNS von Oomatos und Tamm berlohtet werden. ].

Der thermische Überfangsmeßpunkt (Tm) wird bestimmt, indem der

Anstieg in % der optischen Diohte bei 260 au zusammen mit dem Temperaturanstieg notiert wird. Der Tm für Reo-3-RNS wird in einer 20 ug/ml-Lösung aus 0,15m MaCl- - 0,015m Natrlumoitrat (pH 7,0) gemessen und zu ungefähr 110*C ermittelt. Beim Erhitzen der Reo-3-RNS in Oegenwart von 2,76$ Formaldehyd wird der Tm auf 86*C herabgedrückt, so wie dies für wasserstoffgebundene •piralenartlge Polynucleotide erwartet wird. Die Fähigkeit, Inter« feron in .Kaninchen zu Induzieren, wird zerstört.

10Ö8U/2Ö0 2 WJ .(«*«.

Die Reo-5-RNS wird nioht durch RNase unter Bedingungen, unter welchen einfaserige Hefe-RNS zerstört wird, d.h. duroh O₄2 jig RNase/ml bei 25^eC, abgebaut. Reo-3-RNS wird sehr langsam bei der Behandlung mit RNase bei 10 ug/ml und bei einer Temperatur von 56⁰C abgebaut. Die Fähigkeit, Interferon zu induzieren, wird nicht duroh eine Behandlung bei 25*C mit der geringeren Konzentration von RNase verschlechtert. Die ReOO¹⁹RNS wird Jedoch bei 24 ug/ml durch Behandlung «it einer RNase von 10 ug/ml bei einer erhöhten Temperatur von 56*C und einer lungeren Znkubationszelt von 2 Stunden inaktiv.

Der vorstehend beschriebene Nachweis des Fehlens der niohtinfizierenden und nicht-replikttiven Fora von einwlfaaerigen Ribonucleinsäuren, die von Viren abataonen, einschllefllioh des Newoastle-Dlsease-Vlrus, des Influenza-A-Vlrus sowie des Tabak-Mosaik-Virus« sowie das Unvermögen von einzelfaserigen Polynucleotiden» Interferon zu Induzieren« trügt welter zur Stützung des erflndungsgemttäen Konzepts bei« daß ein wesentliches Erfordernis für eine Interferon-Induzierung eine Doppel· oder Vielfaserigkelt der RNS Voraussetzung 1st. Ferner muß darauf hingewiesen werden, daß kein Inhibierendes Protein oder keine anderen inhibierenden Substanzen, wie an Hand von PfI-RNS gezeigt wurde, sowie kein Capsidproteln zusammen mit den Reovirus-"Vlrlonen*(Typ 3) vorhanden sein darf.

' - 66 -1098U/2002

(D) Replikative Form von RNS und D¹NS

Die Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, daß replikative Formen von RNS und DNS Interferon-lnduzlerende Mittel sind. Sie sollten in völlig reiner Form vorliegen und insbesondere frei von inhibierendem Protein und/oder anderen Inhibierenden Substanzen sein·

Die repiklatlve Form (RF) von RNS let eine einzigartige Struktur« die in Zellen gefunden wird, welche mit RNS-Viren infiziert sind. Bakteriophagen (Bakterienviren) und Viren« welohe Pflanzen befallen (einsohliefllich Algen und andere einzellige Glieder des Pflanzenreiches) sowie Viren, welohe tierische Zellen befallen, fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Beispiele für Bakteriophagen sind die Collphagen MS2, M12 und RI7. Bei einigen Tier- und Pf lanzenviren können die replikative Form und die RNS des Viruspartlkels (Virion) synonym sein, wie dies beispielsweise bei Reoviren, gewundenen Tunorviren (Pflanzen) und Reiszwergviren (Pflanzen) der Fall ist. Die Erfindung umfaßt ferner die r«pllkatlve Form von DNS, (kUrzllob an Hand der Bakteriophagen T4 gezeigt) sowie die replikatlven Formen anderer Tier·, Bakterien- und Pflanzen-DNS-Vlren.

BmD ORIGINAL

• - 67 -

1098U/2002

In den Rahmen der Erfindung fallen tierische Viren von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren bis herab zu den einfachen, aus einer Zelle bestehenden Arten, wie beispielsweise Protozoen. Außerdem umfaßt die Erfindung komplexe Polynucleotide, die aus Polynucleotiden hergestellt werden, welche Ribose enthalten. Außerdem kommen Polynucleotide in Frage, die Kohlehydrate (beispielsweise Desoxyribcse, Arabinose, andere Pentosen, Hexosen oder irgendeinen Kohlenhydratanteil) enthalten. Daraus ist ersichtlich, daß die Quelle der replikatlven Form von DNS oder RNS nicht von Bedeutung ist, so daQ die Verwendung von DNS oder RNS als Interferon-induzierendes Mittel nicht von dem Material abhängt, aus welchem diese Säuren abgetrennt wurden.

Die identifizierenden Eigenschaften der (ffe) von RNS wurden bereits veröffentlicht. Eine Serie aus 3 Artikeln erschien in den "Bacteriological Reviews", Band 30, Nr. 2, Seite 267-307 unter dem Titel "Symposium on Replication of Viral Nucleic Acids" von Erikson und Franklin, Shapiro und August bzw. Plagemann und Swim. Wichtige Eigenschaften der replikativen Formen sind:

1. Beständigkeit gegenüber einer Digestion durch Pankreas ribonuclease bei 25°C in 0,15m Natriumchlorid.

« 68 1098U/2002

11853 -

2. Hohe thermische Stabilität. Innerhalb eines sehr engen Temperaturbereichs erfolgt ein Wärmeübergänge

3. Beständigkeit gegen die Zugabe von Formaldehyd, wie aus physikalischen und biologischen Werten erkennbar 1st.

Weitej oben wurde erwähnt, daß HF-RNS praktisch immer in solchen Zellen gefunden wird, die mit einem RNS-Virus infiziert worden sind. Aus diesem Grunde dient die Herstellung und Reinigung einer dieser replikatlven Form als Erläuterung für die Verwendung anderer Quellen dieser Form von RNS. Ein geeignetes Bei* spiel für ein derartiges Wirts-Viruseystem ist dasjenige von £. COÜ-MS2. Die Komponenten diese« Systems können aus zahlreichen Speioherungsquellen erhalten werden. Dieser Virus wird den E. ooli-Zellen, welche inkubiert werden, zugesetzt, so daß der Virus in die Zellen eindringt und sich in den Zellen fortpflanzt.

Diese infizierten E. coli-Zellen werden anschließend aus der Kulturbrühe entfernt, beispielsweise durch Zentrifugleren, worauf sie durch Verwendung eines Detergens zur Freisetzung der RF, die erzeugt worden 1st, aufgelöst werden. Die RF wird anschließend nach Nethoden isoliert, welche den oben für die Gewinnung der RNS aus P.-Funiculosum beschriebenen Methoden ent»

- 69 -T098U/2002

11853 ' ¹IO

sprechen. Ins allgemeinen besteht diese Isolierung aus einer Sntproteinisierung unter Verwendung von Phenol sowie aus einer Entfernung des Phenols durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthyl&ther» Die NucleinsKure wird anschliessend mittels eines bekannten Mittel· ausgefällt, beispielsweise unter Verwendung von* Äthanol, worauf der Niederschlag beispielsweise djirch Zentrifugieren abgetrennt wird. DNase und RNase werden zur Auflösung unerwünschter Fraktionen zugesetzt, worauf, erneut Äthanol zur Gewinnung eines Niederschlags zugegeben wird« Dieser Niederschlag kann für eine weitere Reinigung erneut verarbeitet werden, worauf er anschließend durch Chromatographie einer Feinreinigung unterzogen wird. Geeignete chromatographische Materialien sind Sephadex und Seteola-tCellulose.

Die auf diese fcfei'se erhaltene gereinigte RF wird zur Induzierung einer Erzeugung von Interferon nach bekannten Methoden, beispielsweise nach den vorstehend beschriebenen Methoden, verwendet. Das auf diese Weise erzeugte Interferon wird nach bekannten Methoden, beispielsweise nach den oben beschriebenen Methoden, .

ermittelt. '

Die gereinigte RP wird selbst bekannten Analyseafcthoden unterzogen, um ihre repllkative Form der RNS zu bestimmen. Geeignete Untereuohungamethoden werden in folgenden Artikeln beschrieben ι

1θ'9·"ΐΖ/ίθΟ2

■'Μ

Weissmann, C, Borst_s P₈ Burden, R.Η« Billeter, M.S.» Ochosa, 3., Proc. Natl. A©ad. Sei.:, 51:682 (1964).

Haselkorn, R., und Defc^J?·* J« Biol. Chem., 265.· 2738 (1901).

Billeter, M.A., Welssmann^ C, Warner, R.C, J. Mol. Biol. 17ϊ 145 (1966).

Oeiduschek, E. P., J.Vf, Moohr, und S.B₀ WeIgSS₁, Proe Natl. Acad. Sei., 48s IO78 (1962).

Das folgende Beispiel beschreibt eine repräsentative Methode: Beispiel 9 Herstellung von MS2-infizierten Eecherichia-coli-Zellen

E. Coil Hfr 3OOO wird Über Nacht bei 37^eC in 200 ml einer Brühe, wie sie von Weissmann et al (vgl* weiter oben) beschrieben wird, gezüchtet. Die Kulturbrühe wird mittels einer sieh hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung geschüttelt. 100 au dieser KuI-tür werden zu 1 1 einer frischen Brühe zugesetzt und 2 Stunden lang bei 37⁰C geschüttelt. Zu diesem Zeltpunkt wird eine ausreichende Menge MS2-Virus zur Infizierung der Hauptmenge der E. ooli-Zellen zugegeben. Die infizierte Kultur wird durch Schütteln bei 37*C während einer weiteren Zeitspann· (gewöhnlich 1 Stunde) vor der Zugabe von 2 ml Chloroform und Abkühlen in einem Eisbad inkubiert. Die infizierten Zellen werden durch Zentrifugieren mit 4000 Uptn in einer PR2-Zentrifuge wKhrend

- 71 -

_Λ, BADORiGIMAL

1098Ü/2002

einer Zeitspanne von 15 Minuten gesammelt und einmal In einem sterilen 0,06m Phosphatpuffer bei einem: pH von 7,0 gewaschen. Die gewaschenen E. coli^Zellen werden bei -20^eC gelagert.

Isolierung und Reinigung von MS2RNS (RF) Zur Isolierung wird die Methode von Billeter et al (J.Mol.

% ■ ■
Biol., 17, 145 (1966) In folgender Weise angewendet:

1· Die gesammelten« zusammengepreßten E. coli-Zellen aus einer

1 1-Charge werden In 16 ml 0,05m TRI3-0,lm NaCl - 0,005m Xthylendlamintetraaoetat (XDTA) (diese Zusammensetzung ist als TSE bekannt) suspendiert und durch Zugabe von 2 ml eines 1OjK-igen liatriumdodecylsulfats (KDS ) aufgelöst. Nach ungefähr 5 Minuten dauerndem Stehen -bei 30*C ist; die Auflösung beendet.

2. Die aufgelösten Zellen werden mit einem gleichen Volumen eines 88£-lgen Phenols (das vorher dreimal mit TSE-Puffer ge-..waschen worden ist) bei Zimmertemperatur während einer Zeltspanne von 5 Minuten extrahiert. Naoh einen 5 Minuten dauernden Zentrifugleren bei 15OO Upm wird die dioke viskose-wässrige Schicht mittels einer Pasteur-Plpette entfernt. Die Phenolextraktion wird 2 weitere Male wiederholt. Das Phenol wird von der wässrigen Schicht durch 5-malige Extraktion mit Äther

- 72 -1098U/2002

bei 5^eC entfernt, überschüssiger Äther wird durch Vakuum entfernt. Die Nucleinsäurefraktion wird durch Zugabe von 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Nach einem Stehen während einer Zeitspanne von wenigstens 2 Stunden bei -20⁰C wird der Niederschlag zentrifugiert und in 18 ml O₄02m TRIS - 0,005m MgCl₂ (pH 7,2) gelöst.

3. DNase wird in einer Konzentration von 20 ug/ml zugesetzt, worauf die Digestion der DNS-Fraktion bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 30 Minuten durchgeführt wird. Nach der Zugabe von 2 ml 1OX SSC wird Pankreas ftNaae in einer Konsentration von 5 jag/ml zugesetzt» worauf die Digestion der RNS 30 Minuten fortgeführt wird. Die Enzymwirkung wird durch Zugabe von O₃033%. HDN abgestoppt. 2 Volumina Äthanol wird zugesetzt, worauf die Ausfällung durch Stehenlassen ls©i -20*C über Naoht beendet wird. '

4. Der Niederschlag wird in 3 ml 0,015m NaCl und 0,015m Natriumoltrat (pH 7,O₅SSC) aufgelöst, worauf 0,1 mg gereinigtes Maoaloid zugesetzt wird. Die Extraktion mit 2 Volumina Phenol (ins Gleichgewicht gebracht ®ä>% SSC) wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 5 Minuten durchgeführt» Die Phenolextraktion isnter Zusatz von Ma©al@id bei j@d@s! Mal wird dreimal .wiederholt s worauf &m ^Qstli&he Phenol von der wässrigen Schicht

. JJ _m BAD ORIGINAL

109814/2002

durch 4 Ätherextraktionen entfernt wird· Überschüssiger Äther wird im Vakuum entfernt, worauf 2 Volumina Äthanol zugesetzt werden. Die Ausfällung erfolgt bei -20⁰C Über Nacht.

5, Ausschluß-Chromatographie an Sephadex 0-200»

Der Niederschlag wird in 0,6 ml 3SC gelöst und durch Zentrifugieren bei 2500 'Upm während einer Zeltepanne von 20 Minuten geklärt. Di· Lösung wird auf eine mit Sephajdex 0-200 gefüllte Säule mit einer Abmessung von 1,5 χ 25 cm aufgegeben und mit einem 33C-Puffer ins Oleiohgewicht gebracht· Das Leervolumen wird vorher durch Durchleiten von 0,5 ml einer 0,2£-lgen Lösung von Dextranblau durch die Säule bestimmt*. Die MS2RNS{RP) wird elulert und erscheint in der Blutfraktion an dem Leeryolumen. Die einfaserigen BlIS- und DHS-Dlgestioneprodukte bleiben auf der Sephadex-Säule zurück,

6. Chromatographie an Ecteola-Cellulose

Die gesammelten Fraktionen, welch· M32RNS (RP) aus der unter Verwendung von Sephadex 0-200 durchgeführten Aueeohlui-ÖteoeMo· graphle enthalten, werden gegen einen 0,01« Natriunphoephatpuffer (pH 7) dialysiert. Pas dialysierte Material wird auf eine 0,9 χ 3 cm SHuIe, die mit Ecteola-Cellulose gefüllt ist« gegeben. Die SXuIe wird nacheinanderfolgend mit 10 al O₄OIn

fO98U/2002

11853

Natriumphosphat -.0,2m NaCl und 40 ml 0,01m Phosphat - 0,4m NaCl gewaschen. Die MS2RNS(HF) wird in 10 ml 0,01m Natriumphosphat - 0,6m NaCl eluiert.

Die Methoden zur Interferon-Induzierung, Interferon-Untersuchung

und Interferon-Charakterisierung entsprechen den oben beschriebenen, «le werden Im vorliegenden Falle unter Erzielung folgende Ergebnisse angewendet:

Charakterisierung der H32RNS(RF) *

. A. Relative Beständigkeit von MS2RNS(RF) gegenüber Ribonuclease

Die vorstehend erhaltene !432RNS(RF) wird mit RNase bei einem pH von 7,0 behandelt, worauf anschließend an den Abbau der RNS die Steigerung der optischen Dichte mit dem Aufzeiohnur.gs-Spektrophotometer gemessen wird, weloher mit einer regulierten Aufheizungszelle zur Aufrechterhaltung der Temperatur versehen ist.

Die MS2RNS(Rpy 1st bei 25 ug/nu. gegenüber RNase bei 0,25 ug/nl bei 25⁶C und 56"C bestandig. Jedoch wird mit RNase bei 10 ug/ml und 56⁰C ein langsamer.linearer Abbau von M32(RNS) erzielt. Eine ribosome Einzelfaserhefe-RNS (single-stranded yeast ribosomal RNA) in einer Menge von 20 pg/ml wird als Vergleichs-

11853

probe verwendet. Diese Säure wird in 3 bis k Minuten sehr sohnell mit 0,25 pg/ml RNase/ml bei 25⁰C abgebaut.

Das Vermögen der MS2RNS(RP) nach einer Behandlung mit RNase unter verschiedenen Umständen Interferon in Kaninchen zu induzieren, geht aus der Tabelle XXI hervor.

'Tabelle XXI

Empfindlichkeit der biologischen Wirksamkeit von M32RNS(RF)

gegenüber verschiedenen Behandlungen

M32RN3(RP) (10 ug/ml)

Behandlung Konzentration Temp. Zeit

(⁰C) (min.)

Interferon-Titer, induziert ¹In Kaninchen

Ribonuclease 0,25 με/ml Nichtbehandel te Vergleichs- probe - - -	25 25	30 30	160, 10,	640 oder/ 640 oder)
Ribonuolease' 10 ug/ral Nichtbehandel te Vergleichs- probe · -.-	56 56	2 Std. 2 Std.	<5, 10,	<5 80
Formaldehyd 2,7$£ Nichtbehandel- te Vergleichs- probe - —	100 100	i#/ain. 3tei- ■»■) gerung N	<5. 40,	<5 l60
Hohe Temperatur - - - Niohtbehandelte Vergleichsprobe - - -	110	5«lnt+>	<5, 320,	<5 320
keine (Vergleich) - -			<5,	<5

1'/Minute Steigerung bis 100⁰C.

Es schließt sich eine schnelle Abkühlung zur Verhinderung einer Denaturierung an.

- 76 -1098U/2002

Während MS2RNS(RP), die mit 0,25 Ug RNase/ml behandelt worden ist, keine Verminderung des Induktionsvermögens für Interferon zeigt, verliert eine ähnliche Probe nach einer Behandlung mit 10 ug, RNase/ml bei einer höheren Temperatur während einer längeren Zeitspanne die InduzierungsfShigkeit. Wie aus der Tabelle XXI hervorgeht, wird die biologische Aktivität durch Behandlung mit 10 ug/ml Ribonuclease bei 56"C, jedoch niaht mit 0*25 ug/ml bei 25^eC zerstört. Ein Erhitzen auf 100^eC in einer 2,76^-igen Formaldehydlösung zerstört in Irreversibler Weise die Interferon-induzierende Aktivität. Dap Induktionsvermögen wird ferner durch Erhitzen der RNS auf 11O⁹C zur Bewirkung eines Übergangs der Spirale In eine willkürlich angeordnete Schlange sowie durch ein schnelles Abkühlen zur Verhinderung einer erneuten Bildung der Spirale' zerstört, wie aus der Tatsache zu erkennen ist, daß die Hy per ehr omie wirkung nicht reversibel ist« Diese Eigenschaften ähneln den Elgansohaften, welche bei doppelfaeeriger HeI-RNS und Reo-3-RNS gefunden werden. ·

B. UV-Absorptionsspektrum

Das UV-Absorptionsspektrum.der gereinigten KSSRNS(RF) wird unter Verwendung eines Beckman DB-Q-Aufzeichnungsspektrophotometers bestimmt»Die Kurve 1st typisch für eine Nucleinsäure

109IU/20-Q2

mit einem Minimum bei 23O rau und einem Maximum bei 257.,5 mu. Das 257i230-Verhältnis betrögt 2,36, wahrend das 260:280-Verhältnis zu 2,36 ermittelt wird.

C. Thermische Stabilität

Die thermische Denaturierung von M32RN3(RF) wird bei Versuchen gemessen, bei welchen ein Beckraan DB-G-Spektrophotometer,

welcher mit einem Tm-Analysator und einer Aufzeichnungsvorrichtung versehen ist, verwendet wird. In dem SSC-Puffer unterliegt die MS2RNS(RF) einem scharfen thermischen übergang alt dem MeQpunkt (Tm) bei HO⁰C. Dieser scharfe thermische Übergang sowie der hohe Tm sind charalcteristisohe Eigenschaften, wie sie gewöhnlich bei doppelfaserlgen Molekülen mit relativ hoher thermischer Stabilität festgestellt werden.

Das Erhitzen von M32RNS(R?) in Gegenwart einer 2,76£*»lgen Porraaldehydlösung bewirkt eine 60£-lge Steigerung der Extinktion mit einem Tm bei 86*C. Nach Haaelkorn und Doty (J.Biol. Chem., 236, 2738, I96I) liefert die Zugabe von Formaldehyd zu einer doppelfaserigen RNS ein Produkt mit einer sohleohteren thermischen Stabilität. Es wird keine Abnahne der Extinktion bei einem erneuten Erhitzen festgestellt, was darauf hindeutet/ daß eine Spiralenbildung inhibiert wird.

_t - 78 -109114/2002

D. Wirksamkeit als Interferon-induzierendes Mittel

Die Fähigkeit der MS2RN3(RF)_t die Herstellung von Interferon in Tieren zu induzieren, wird bei ihrer Verabreichung an Kaninchen ersiehtlioh. Die Kaninchen werden getötet, worauf das Serum den vorstehend beschriebenen Tests, die für diesen Zweck anerkannt sind, unterzogen wird. Die Tests sowie die bei ihrer Durchführung erhaltenen Ergebnisse sind in den· Tabellen XXII, XXIII und XXIV zusammengefaßt.

Tabelle XXII Artspezifität -von MS2RNS(RF)-induziertem Kaninchenserum-Interferon

Interferon-Titer, ermittelt in Zellkulturen. Homologe Zellen Heterologe Zellen Primäre Kaninohennlere Mause-Embryo * Küken-Embryo

640 640 320 512

ND = nicht durchgeführt.

ND	<20
ND	<20
ND	< 10
< 8	ND

-79 -1098U/2002

Tabelle XXIII

Trypein-Empfindliohkeit von MS2RNS(RF)-induziertem Kaninchen-

serum-Interferon +)

Beispiel Behandlung Interferon-Titer an RK-l} Nr. Zellmonosohichten

1 . keine 8

kristallines Trypsin (50 ug/rnl, 4 Stunden

. . * bei ?5°C) < 2

2 keine 128

kristallines

Trypsin (50 ug/ml 4 Stunden bei 35*'

35*0) <2

Teilweise durch Chromatographie an CM-Sephadex gereinigt,

'RK-l^-Zellen stellen eine stabile Auskleidung von Kaninchennlerenzellen dar»

Tabelle XXIV

Physikalische Blgenschaften von. MS2RNS(RF)-induziertem Kaninchenserum-Interferon.

Induzierendes isoelektrlsoher Molekularinterferonquelle Mittel Punkt gewicht +)

Kaninohenserum MS2RNS(RP) 6,56 - 7*20 52 000 +

16 700

⁺' Molekulargewicht, bestimmt durch Gel-Filtration durch 0-100-Sephadex. Diese Methode ermöglicht eine Molekulargewichtsbestimmung mit einer Genauigkeit von + 10$.

Um zu zeigen, daß Tiere, welchen die Interferon-induzlerende MS2RNS(RP) verabreicht worden 1st, tatsächlich gegen eine an-

1185:3

schließende Virusinfektion geschützt sind, wird ein Standardtest durchgeführt. Einzelheiten dieses Tests sind in der Tabelle XXV zusammengefaßt.

Tabelle XXV

Induktion der Widerstandsfähigkeit' gegen" eine Mäuse Pneumonia-Vireninf#ktion (PVM) in Mäusen duroh

Gesamt- Zahl der Über- Überschuß- mittlere über·

.dosis lebenden Tiere, £ Über- eige % der lebenszeit

M32RNS(HF) Qesamtzahl der lebende überleben» in Tagen

pro Tier infizierten Tiere den Tiere

Tiere ·..-'

18 ug 17/20 85,0 73,6 >

0 (Vergleich) 4/55 \ U#4 0,0 8

Die zum Vergleich angegebene Interferon-lnduzierende Fähigkeit von MS2RNS(RF) und anderen Substanjccn ist in der Tabelle XXVX angegeben. . ■

BAD ORIGINAL - 81 -

10SS14/2002

Tabelle XXVI

Inter feron-lnduktionsvertnogen bei Kaninchen von-MSSRNS(RP) und anderen Präparaten, die von E, Coli-M32-Coliphagen-3ystemen abstammen	Intravenöse Dosis pro Kaninchen	Nioht-lnfUlert· B.coil-h·)	100 ug	Interferon-Titer des Kaninoheneerums
In die Kaninchen eingespritztes s Material	8u45 Ifug.	RIiS		160; 40 2Ö, 1Ό
MS2RNS(RF) (doppel- faserlg, replikative Form)	8 ug l.lxlO11 PFU/el+)	keines (Vergleich) » ■	inten Methoden	{ 10«^10 • 10, ^10
MS2-VP-RNS (einfaserig, abgeleitete« Virion ++) M32-Vlrione ++)	4' gereinigter Virus, **)h«rft«at»llt nach bekai
<10,Λ0
<ιο,αο

- 82 -

1098U/2002

11 855 J3

Bei Verwendung der anderen vorstehend beschriebenen RNS-induzierenden Mittel ist ungefähr 1 Stunde nach der RNS-Injektion ein Seruminterferon feststellbar, dessen Menge nach 2 bis 4 Stunden * ein Maximum erreicht und nach 6 Stunden abfüllt.

Die vorstehenden Beispiele beschreiben ein E. ooli-MS2-Systeni. Dieses System kann als Beispiel für viele andere Systeme angesehen werden* bei welchen verschiedene Wirtszellen verwendet werden, die mit unterschiedlichen RNS-Viren infiziert werden". Dasselbe gilt auch für die doppelfaserige DHS der repiikativen Form.

• -

Bs wird eine Untersuchung durchgeführt, um die Fähigkeit der MS2-RNS(RF) zu bestimmen, Interferon in Monosohiohten primärerKaninchennieren-Zellkulturen zu induzieren. Die Zellkultur-Monoschichten werden 18 Stunden lang mit einem Medium inkubiert, das MS2-RHS(RNF) enthalt. Mittel« eines Fleokenvermlnderungsversuohs wird eine eventuelle Beeinträchtigung durch veaikulare Stomatitis-Virus-Replikation ermittelt. Nur 0,04 jug der RNS bewirken eine 50£ige Fleokenverninderung.

In der .Tabelle XXVlI sind in vergleichender Übersicht die biologischen Aktivitäten der verschiedenen vielfaserigen Polynukleotide und RNS verschiedenen Ursprungs zusammengefafit. Alle diese Verbindungen sind in Mengen von weniger als 1 /ug zur Ihduzierung von Interferon 'in Kaninchen sowie zur Verleihung einer Widerstands-

- 83 -1098U

/2002

11

fähigkeit gegen Vireninfektionen in Zellkulturen wirksam. Die bei den Versuchen zum Schützen von Mäusen verwendeten größeren Mengen der verschiedenen RNS üben eine starke Wirkung hinsichtlich der Induzierung einer Widerstandsfähigkeit von Mäusen aus, stellen jedoch nicht die minimal erforderlich Dosi3 für eine Stimulierung einer derartigen Wirksamkeit dar.

Tabelle XXYII

Zusammenfassung der biologischen Wirksamkeiten doppelfase* rijger HNS verschiedenen Ursprungs

Minimal wirksame Wirkung Interferon- beeinflussung induktion in der VSV in Kaninchen Kaninchennierenzellkultüren

Schützende Dosis für Mäuse gegen Viren +)

Singaspritzter RNS

PVM Col. Sk- Sendai

■Synthetisch

Polyinosin- polycytidyl (I:C-Kompl8x)	0,
Von Viren ab stammend
Reovirua 3 (Reo 3-RNS)
Goiiphage (MS2-RF-RNS)
Von Pilzen ab stammend

Penicillium funiculoaum {Hel-RNS)

0,00125/Ug 7,9/Ug

0,04/Ug

16

0,04yUg 18/Ug

ND

0,125/Ug

20/Ug

16/Ug"

ND

ND

_ - 84 -109814/2002

COPV

BAD ORfGiNAL

11 853

niohtbestlmmte minimal erforderliche Dosis

Sendai-Stammparainfluanza-1-virus wird bei einem nasalen Immunitätstest verabreicht

bisher nicht veröffentlicht ND * nicht durchgeführt.

Die Tabelle XXVII zeigt die relativ« Wirksamkeit der erfindungsgemKäen Induzierenden Mittel. Aus der folgenden Tabelle ΧΧ7ΣΖΙ ist die auflergewöhnliohe Wirksamkeit des IsC-Komplexea zum Schutz von Mäusen gegen wechselnde Mengen einer in einem Immunität st eet verwendeten PVH-Dosis zu ersehen..

Tabelle XXVIII

Wirksaakei&3gra4 eine? Induzierten WlrtsbestSadlgkelt gegen-

XiC-Dosis intranasal

Virusimaunitäte-. . % überlebende

in LDr~

50-

Jiere

dureheohnitt- -liehe Tagesgihl

15,7 g /ug

keine *

10 000

3 150 1 000

315 100

31,5 10 000 3 150 1 000

315 100

31,5

100 93*3 100 0

, .85-

109314/20Q2

BAD

14,0

14,0

14,0

14,0

14,0

,14,0

5*0

6,0

6.0

7,0 7,0

copy

11 855 ■ .

b). Anwendbarkeit bai Menschen

Die vorstehend geschilderten Tierexperimente zeigen die Wirksam» keit der erfindungsgemäßen Mittel zur Induzierung von Interferon in Tieren für einen prophylaktischen und therapeutischen Sohutz gegen Infektion. Die Wirksamkeit der komplexen Polymerisate I:C zur Induzierung von Interferon in Gewebekulturen aus menschlichen Zellen tfurde erforscht. Bewegte Kulturen menschlicher embryonaler Nierenzellen werden über Nacht bei 35⁰C mit einem Medium inkubiert, das I:C enthält. Nach der Entfernung dieses Mediums werden die behandelten Kulturen mit einer ausreichenden Virusmenge einem Immunitätstests zur Infizierung aller Kulturen behandelt« bei 23⁹C inkubiert und hinsichtlich des Auftretens cytopather Wirkungen während einer Zeltspanne bis zu 7 Tagen beobachtet. Die minimal wirksame Konzentration an IsC ist diejenige Konzentration, welche .eine 100£-lge Unterdrückung der cytopathen Virenwirkung in 50£ oder mehr der bewegten Kulturen zeigt.

I-

Die mit I:C behandelten bewegten Kulturen« dl« jedoch nicht mit dem Virus einen IramunitHtetest unterzogen worden sind* werden auf Anzeichen einer Toxlzltät beobachtet. Bs wird jedoch kein An* zeichen einer Toxizität festgestellt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XXIX zusammengefaßt.

-86-109*14/2002

	ft	*	XXIX
	Tabelle
Immunitätstest- Virus
Rhino 1		Minimal wirksame Konzentration ( Aig/ml)
" 11		2,6 ■
rt 20
« 42
" 47 ·
- 5,24
3*25 oder weniger
3,25 oder weniger
0,8 oder weniger
0,8 oder weniger

Als Beweis, daß die erfindungsgemUß* interferoninduzierenden Mittel zur Erhöhung der Interferonerzeugung in Menschen dienen können, seien folgende Beispiele angeführt;

Beispiel 10 .

Oral-naeales Präparat

Als prophylaktisches intranasales Präparat gegen die Atmungswege befallende Viren, beispielsweise Erkältungsviren, wird eine Dosis aus 1 bis 100 mg eines komplexen I:C-Polymerisats alle 2 bis 3 Tage auf die nasalen und oralen Membranen aufgebracht. Diese Verabroichungsperiode kann infolge der längeren Dauerhaftigkeit des induzierten Interferons eingehalten werden.

Die Verabreichung kann in Form einer wäßrigen Suspension in einem Aspirator-Spray durchgeführt werden« wobei durch ©in© oder zwei

an/2002

Sprühungen ungefähr 5 bis 10 mg verabreicht werden. Ferner können Aerosolpräparate unter Verwendung üblicher Fluorchlorkohlenwasserstoffe als Treibmittel hergestellt und verwendet werden. Zusätzlich kann das Präparat in Form einer pharmazeutischen Nasentropfen flüssigkeit verabreicht werden.

Dieses Präparat kann auch in Fällen einer tatsächlichen Infektion der Atemwege ungefähr alle 2 bis 3 Tage auf therapeutischen Wege verwendet werden« Ein behandelnder Arzt kann entscheiden, ob eine häufigere (beispielsweise tägliche) oder weniger häufigere (beispielsweise alle 4 Tage) erfolgende Verabreichung erforderlich 1st.

Bines der anderen erfindungegemäßen induzierend wirkenden Mittel

• ■ ■■ »

kann das in diesem Beispiel verwendete I:C ersetzen» wobei die vorstehend geschilderten Wirksamkeiten, die auch in der Tabelle XXVXZ zusammengefaßt sind, zur Geltung kommen. ■

1f

Augenpräparat

FUr eine prophylaktische und therapeutische Verwendung für die Augen wird ein übliches Augentropfenpräparat, beispielsweise aus einem sterilen Erdnußöl, derart hergestellt, daß ein einziger Tropfen

1 bis 100 mg des komplexen Polymerisats I:C oder eines der anderen induziererfd wirkenden Mittel enthält. Ein einziger Tropfen wird all·

2 bis 2 Tage auf die Augen aufgebracht.

109J14 £20.02

11 855

Die Tropfen werden aufgebracht, um ihre therapeutische Wirksam« keit gegen Augen zu entfalten, die mit Herpes, Adenovirus und Vaccinia sowie mit Trachoma infiziert sind. Außerdem können die Tropfen auf nichtinfizierte Augen als prophylaktischer Schuts während des gleichen Zeitintervalls aufgebracht werden.

Eine übliche Augensalbe wird in der Weise hergestellt, daß eine kleine Menge, wie sie normalerweise aufgebracht wird, 1 bis 100 mg des ItC enthält. Diese Salbe kann beispielsweise aus einem Poly-

äthylen/Petrolatum (flüssig)-Gel bestehen. Beispiel 12

Hautpräparat

PUr die Aufbringung auf die Haut an abgeschürften Stellen.feann das Interferon-dnduzierende Mittel üblichen Grundlagen für Salben, Cremes, Lotions oder flüssige Präparate in der Weise zugesetzt werden, daß 1 g beispielsweise 1 bis 100 mg ItC enthält» Ein derartiges Präparat wird alle 2 bis 5 Tage aufgebracht.

Beispiel 1J Sterile Injektion

Als Beispiel für ein Präparat für eine parenterale Verabreichung sei eine Übliche sterile ölige oder vHßrige Lösung oder Suspension« beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, erwähnt. 1 ecm

1Q98U/2Q02

3o

einer derartigen Lösung oder Suspension enthält 1 bis 100 mg eines der erfindungsgemäßen Interferon-induzierenden Mittel und wird im Falle einer Vireninfektion alle 2 bis JJ Tage eingespritzt.

- 90 -109814/2002

Claims (1)

1. IT--

   11 852 21. Dezember

   1611659

   er }9o7

   Patent a η s ρ r ti c h e

   1. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats für die Verabreichung an lebende tierische Zellen, um in diesen eine germizld -resistente Substanz zu induzieren, dadurch gekennzeichnet, daß einem pharmazeutischen Träger ein aus vielen Fasern bestehendes Polynukleotld zugesetzt wird, ohne daS dabei nennenswerte Mengen inhibierender Substanzen vorliegen.

   2. Verfahr«n nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« daS der Saccharidanteil des Polynucleotide aus Ribose, Desoxyrlbose, Arablnose oder Xylose besteht*

   5, Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, dafi als Polynukleotid «in Polymerieat verwendetwird, das bei der Komplexbildung von 2 aus PolyadenyletLure, UrldylsKure, InoslnsKure, CytidylsHure oder Cytidylyloytldln bestehenden Honlopolynukleotiden erhalten wird, verwendet wird.

   4. Verfahren nach Anspruoh 1, daduroh gekennseichnetf daß als Polynukleotid ein Polymerisat verwendet wird, das bei der Komplexbildung von Polyinoeineäure und PolycytidyleKure erhalten wird.

   1098U/2002

   5· Verfahren nach Anspruch 1« dadurch gekennzeichnet« daß als Polynukleotid eine Ribonukleinsäure verwendet wird« die durch Phenol aus einem Ribonukleinsäurekomplex, der beim Wachsen von P. Funicuiosum erhalten worden ist, in Freiheit gesetzt worden

   ■φ

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« daß ein Polynukleotid verwendet wird, das durch Phenol aus Reovirus-Typ-3-virionen in Freiheit gesetzt worden 1st..

   7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polynukleotid verwendet wird« welches die isolierte repllkative Zwleohenforo darstellt, die aus lebenden Zellen erhalten wird« welche mit tinea DWS-Virue oder RNS-Virus infiziert worden sind.

   8. Verfahren nach Anspruch 1; dadurch gekennzeichnet« dafi «in Träger für eine intravenöse Injektion verwendet wird.

   9. Verfahren nach Anspruch 1·, dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger für eine intraderaale Injektion verwendet wird.

   10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dafi ein Träger für eine oral-nasale-Verabreichung verwendet wird.

   11. Verfahren nach Anspruch 1« dadurch gekennzeichnet, daß ale Träger ein» sprühbare Flüssigkeit verwendet wird.

   12. Verfahren zur Stimulierung der Erzeugung von Interferon in lebenden tierischen Zellen, so daß diese Zellen einer germiziden Infektion zu widerstehen vermögen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen der Interferon-induzierenden Wirkung eines aus vielen Fasern bestehenden Polymikleotids unterzogen werden, wobei im wesentlichen keine inhibierenden Substanzen vorliegen.

   15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem Nährkulturmedium enthalten sind.

   14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen eines lebenden Tieres oder menschliche Zellen behandelt werden.

   15« Verfahren naoh Anepnich 12, dadurch gekennzeichnet, daß der SacoharidanteiX dee Po!ymS£le@feids aus Rlbose* .Deeex^ibose» Ära« binose oder XgXoze besteht. ··

   16. Terfahr&n nach Mspruch 1g, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymikle&tid «in PoA^srisat verwendet wird, das bei der Xomplexbildung aus zwei aus PolyadenylsMur«, Polyuridylsäure, Polyinoainßäure« PolycytldyliÄuro oder Cytidylyloytldin bestehenden Homopolvnuklsotiden erhalten

   17 a ¥@rf®hr®a a&oh ABgpruch'IS, d&diar@i3 @©k@miug©i@^net, dmfl als

   Polynukleotld ein polymerisat verwendet wird, welches bei der Komplexbildung aus Polyinosinsäure und PolyoytldylsÄure erhalten wird.

   18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Polynukleotld eine Ribonukleinsäure verwendet wird« die duroh Phenol aus einem MbonukleinaJturekomplex, der bein Hachsen von P. Jualoulosum erhalten wird, in Freiheit gesetst worden ist.

   19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daf das verwendete Polynukleotld durch phenol aus Reovirua-Typ-3-virionen in Freiheit gesetzt worden ist»

   20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendet« Polymikleotld die isolierte replikative Zwiiohenfor· ist, die «we lebenden Zellen erhalten wird, welch· mit einen DWS-Virus oder RNS-Virue infiziert worden sind.

   21. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch' gekennzeichnet, daf das Polynukleotid in einem Träger für eine intravenöse Injektion enthalten ist.

   22. Verfahren nach Anspruch 2_t dadurch gekennzeichnet, daJ das Polynukleotid in einem Träger für eine Intradermale Injektion enthalten J,at.

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   . Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß dae Polynukleotld In einem Träger für eine oral-naeale Verabreichung enthalten let.

   24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet» daß das Polynukleotid In einem Träger für eine versprühbare Flüssigkeit enthalten let. .> .

   25. Pharmazeutisches Präparat, das für eine Verabreichung an Personen und Tiere bestimmt 1st, um in diesen die Bildung von Interferon ale germizidreslstente Substanz zu'erzeugen, gekennzeichnet durch einen pharmazeutischen Trager und ein aus vielen Fasern bestehendes Polynukleotld, wobei im wesentlichen keine inhibierenden Substanzen zugegen sind.

   26. Präparat nach Anayruoh S5# dadurch gekennzeichnet, daß der

   flacoharidanteil des Polynukleotids cos Bibose, Deaoxyribose, . Arabinose oder Xylose besteht.

   27. Präparat naoh Anspruch 25, dadurch gekennselchnet, dafl das Polynukleotid ein Polymerieat ist, das bei der Koeplexblldung von zwei aus Polyadenylsäura, üridylsäure, Inosinsäure, Cytidylsäure oder Cytidylylcytidin bestehenden Homopolynukleotiden erhalten worden ist. '

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   28. Präparat nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotld ein Polymerisat 1st, das bei der Komplexbildung aus Polyinosinsäure und Polycytidylsäure erhalten worden. 1st.

   29« Präparat nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotld eine Ribonukleinsäure 1st, die durch Phenol aus einem Ribonukleinsäurekomplex, der beim Wachsen von P.Funlculosum anfällt, In Freiheit gesetzt worden ist.

   20. Präparat naoh Anspruoh 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid durch Phenol aus Reovirus-Typ-2.-virionen in Freiheit gesetzt worden ist.

   21. Präparat naoh Anspruoh 25, daduroh gekennzeichnet, daß das Polynukleotid die isolierte repllkatlve Zwlschenform ist, die aus lebenden Zeilen erhalten wird, welohe mit einem DNS-Virus oder RNS-Virus infiziert worden sind.

   32. Präparat naoh Anspruch 25, daduroh gekennzeichnet, dad der Träger für eine intravenöse Injektion geeignet ist.

   Präparat naoh Anspruoh 25, daduroh gekennzeichnet, daß der Träger für eine intradermale Injektion geeignet ist.

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   5¹J-. Präparat nach Anspruch 25» dadurch gekennzeichnet« daß der Träger für eine oral-nasale Verabreichung geeignet ist.

   35. Präparat nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet;, daß der Träger eine versprühbare Flüssigkeit ist.

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