DE3504940C2

DE3504940C2 - Multipotente Paramunitätsmediatoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Mediatoren enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE3504940C2
Application number: DE3504940A
Authority: DE
Inventors: Anton Prof Dr Med Mayr; Mathias Dr Med Buettner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1984-02-17
Filing date: 1985-02-13
Publication date: 1997-11-06
Anticipated expiration: 2005-02-14
Also published as: DE3504940A1

Description

Die Erfindung betrifft multipotente Paramunitätsmediatoren (PM-Cocktails), Verfah ren zu ihrer Herstellung und diese Mediatoren enthaltende Arzneimittel.

Hintergrund der Erfindung

Als "Paramunität" wird der Zustand eines schnell entstande nen, unterschiedlich lange anhaltenden, Nichterreger- und Nichtantigen-spezifischen Schutzes eines Individuums gegen über einer Mehrzahl verschiedenartiger Infektionen bezeich net; vgl. A. Mayr et al., Fortschritte der Medizin, Bd. 97 (1979), 1159-1165 und 1205-1210, und A. Mayr et al., Hand buch der Schutzimpfung in der Tiermedizin (1984), Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, S. 82-101.

Die funktionellen Grundlagen einer Paramunität sind komplex und beruhen hauptsächlich auf einer Steigerung der Phagozy tose-Leistung, der Stimulierung humoraler Abwehrfaktoren, insbesondere des Opsonin-Properdin-Komplement-Systems, auf einer Aktivierung des lymphopoetischen Zellsystems und auf einer Interferonisierung. Die für eine Paramunität verant wortlichen Aktivitäten können dabei je nach Art ihrer Sti mulierung unterschiedlich vorherrschen.

Paramunität wird auf natürliche Weise im Verlaufe eines In fektionsgeschehens oder auch künstlich, d. h. medikamentös, erworben, und zwar sowohl systemisch als auch lokal über die Schleimhäute des Respirations-, Digestions- und Uroge nitaltraktes. Für diesen Vorgang wird der Begriff "Paramu nisierung in Anlehnung an die paraspezifische Wirkung ganz unterschiedlicher Infektionen und Schutzimpfungen vorgeschla gen.

Paramunitätsinducer sind Arzneistoffe, die dazu bestimmt sind, bei Mensch und Tier zur Erzeugung von Abwehr- und Schutzstoffen im Sinne einer Paramunisierung angewendet zu werden; vgl. A. Mayr, a. a. O., 1984, S. 97-99. Man unter scheidet zwischen biologischen und chemischen Inducern.

Die medikamentöse Paramunisierung ist die Methode der Wahl bei all den Fällen, in denen die klassischen Methoden der Prophylaxe und der Therapie von Infektionskrankheiten durch den Panoramawechsel in der Infektiologie nicht mehr ausrei chen. Im wesentlichen handelt es sich dabei um die Bekämpfung von infektiösen Faktorenkrankheiten, Mischinfektionen, in fektiösem Hospitalismus, chronischen Verlaufsformen von In fektionskrankheiten, persistierenden Infektionen und ihren immunpathogenen Folgen, Chemotherapie-resistenten Bakterien- und Virusinfektionen, Therapieversagen bei immunsupprimier ten oder sonst in ihrer Abwehr geschädigten Patienten und schließlich um eine zusätzliche Hilfe bei der Bekämpfung von Tumoren, speziell Virus-bedingten Tumorkrankheiten.

Die Induktion einer breit ausgelegten Paramunität kann Neu infektionen der vorstehend erwähnten Art in ihrer Entstehung und Ausbreitung verhindern und bestehende Infektionen heilen oder günstig beeinflussen.

Paramunität ist ein sehr variabler Schutzzustand, bei dem je nach Art der Stimulierung verschiedene Systeme, z. B. die Phagozytose, die Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und die Makrophagenaktivität, humorale Mechanismen, die T- und B-Zellstimulierung oder andere Zellaktivitäten dominieren. Dementsprechend ist die Schutzwirkung einer Paramunität ge genüber verschiedenen Infektionen abhängig von der Art der induzierten Aktivitäten. Die Induktion einer breit ausge legten Paramunität kann somit kurzfristig Infektionen un terschiedlichster Art günstig für den Patienten beeinflus sen.

Auf natürliche Weise ist Paramunität zu Beginn einer Infek tion, noch vor Ausbildung einer spezifischen Immunität, die sich entwickelnde "Sofort"-Abwehr eines Organismus. Quali tät und Quantität der paramunisierenden Wirkung einer In fektion oder einer Schutzimpfung werden von der Art des be teiligten Infektionserregers bestimmt. Sie kann sehr stark sein, aber auch so gering, daß sie nicht nachweisbar bzw. durch andere Vorgänge neutralisierbar ist (z. B. bei Tumoren, BVD/MD-Infektionen).

Paramunität entwickelt sich innerhalb weniger Stunden und hält unterschiedlich lange an - je nachdem, welche Abwehr mechanismen bevorzugt stimuliert wurden. Paramunität kann innerhalb weniger Tage verschwinden, aber auch über mehrere Wochen anhalten, wie Tierversuche beweisen. Von der spezi fischen Immunität unterscheidet sie sich aber dadurch, daß außer einem Trainingseffekt des Abwehrapparates nach Absin ken der erhöhten Körperfunktion keine spezifische Gedächt nisreaktion zurückbleibt.

Als Paramunitätsinducer eignen sich die unterschiedlichsten Präparate. Nach bisherigen Erfahrungen lassen sie sich in folgende Gruppen einteilen:

1. Impfstoffe mit paraspezifischer Wirkung z. B. gegen Pocken, Influenza, Parainfluenza-3, Newcastle, Polio, IBR/IPV.
2. Präparate, die zur erregerunspezifischen Steigerung der Infektabwehr führen: Organ- und Blutextrakte (z. B. von Thymus und Milz; Embryonalextrakte), Viruspräparationen (z. B. aus Pocken-, Paramyxo-, Herpesviren), pyrogenfreie Bakterien- und Pilzextrakte (z. B. aus BCG, Brucellen, Diphtherie-Tetanus, Salmonellen, E. coli, Mycobacterium bovis, Corynebacterium parvum, Toxoplasma gondii), Endoto xine, bakterielle Ribosomen, Pflanzenextrakte, Dextrane, Hormone und hormonähnliche Substanzen, Lipide, Proteine und Protein-Spaltprodukte, anorganische Substanzen, tieri sche Gift- und Kampfstoffe.
3. Interferon-Inducer: Bestimmte Viren und Polyribonukleo tide, synthetische Polyanionen, Lymphozyten-stimulierende Agentien u. a.m.
4. Lymphozytenstimulantien: Nicht-spezifische Mitogene (Phythämagglutinin, Concanavalin A, usw.), biologische und chemische Antigene, Thymosin, Lymphokine.
5. Sonstige Substanzen: z. B. Kombinationspräparate aus den vorstehenden Gruppen.
6. Synthetische Substanzen: 2-Cyan-aziridine, isotaktische Polyacrylsäuren, Levamisol, Tiloron.

In der Tabelle I sind als Beispiel Präparate zusammenge stellt, die derzeit unter verschiedenen Bezeichnungen im Handel sind, im Prinzip aber als Paramunitätsinducer wir ken.

Tabelle I Beispiele für im Handel befindliche Präparate mit paramunisierender Wirksamkeit

Humanmedizin:
Pflanzenextrakte:	Echinacin-Präparate
	Esberitox
	Aristolochiasäure-Präparate (in der BRD nicht mehr im Handel)
	Iscador®
Organextrakte:	Resistocell®
	Thymusextrakte
bakterielle Präparate:	I. R. S. 19®
	Symbioflor®
	Broncho-Vaxom®
	Diribiotin®
Viruspräparate:	Carts® (Bakteriophagen)
chemische Präparate:	Tiloron
	Delimmun
	1-(Dimethylamino)-2-propanol-(4-acetaminobenzoat) (Isoprinosine®)
	Levamisol
Veterinärmedizin	(zusätzlich zu den oben genannten Präparaten, die auch ad us. vet. erhältlich sind)
bakterielle Präparate:	BSK-Kolb®
	Farmetan® (zusätzlich pflanzl. Extrakte enthaltend)
Viruspräparate:	Bayferon® (IBR-Virus, Herpesvirus)
	Parainfluenza 3-Präparate (Paramyxovirus)
	Duphapind®, Duphamun®,
	Domavac-Inducer® (Avipoxvirus)

Wie dieser kurze Überblick zeigt, sind es überwiegend bio logische Präparate, denen eine paramunisierende Wirksamkeit zugesprochen werden kann. Viele biologische Paramunitäts inducer haben den großen Nachteil, daß sie schwer standar disierbar sind und ihre Verabreichung häufig mit unange nehmen Nebenerscheinungen, wie Toxizität oder mit einer "negativen Initialphase", verbunden ist.

Nach ihrer Wirkung unterscheidet man multipotente und uni potente Paramunitätsinducer.

Unipotente Paramunitätsinducer stimulieren nur einzelne, für die nichterregerspezifische Abwehr notwendige Fakto ren, z. B. die Interferonbildung oder die Phagozytose.

Durch multipotente Paramunitätsinducer werden dagegen gleichzeitig stets mehrere Faktoren oder Reaktionsketten stimuliert. Man kann deshalb davon ausgehen, daß die Wirk samkeit eines multipotenten Inducers davon abhängt, wie breit das Spektrum der durch ihn stimulierten Abwehrvor gänge ist.

Da das Abwehrsystem auch an der Verarbeitung und Beseitigung von anderweitig geschädigten, körpereigenen oder körperfrem den Materialien beteiligt ist (z. B. durch Phagozytose oder enzymatische Aktivitäten) kann die Paramunisierung mit einem hochwirksamen, multipotenten Paramunitätsinducer auch bei anderen Lebensvorgängen positive Auswirkungen haben. Paramu nisierungen können z. B. im Rahmen der Leberschutztherapie, zur Steigerung des Leistungsvermögens, zur Verbesserung der Gewichtszunahmen in der Mast eingesetzt werden.

Voraussetzung für die bisher übliche Paramunisierung ist ne ben der Verfügbarkeit geeigneter multipotenter Paramunitäts inducer das Vorhandensein von funktionstüchtigen Zellen im Empfänger, die für unspezifische Abwehrreaktionen verant wortlich sind. Eine Paramunisierung läuft in einer Mehrstu fenreaktion ab. In der Anfangsphase stimuliert ein Inducer diese Zellen zur Bildung und Freisetzung von Mediatoren.

Je nach Art des Inducers können Makrophagen, NK-Zellen oder Lymphozyten zur Mediatorproduktion angeregt werden; sie fungieren in diesem Stadium als Induktorzellen. Die freige setzten Mediatoren veranlassen nun in einer weiteren Reak tionsstufe noch nicht stimulierte Zellen des Abwehrsystems zu Aktivitäten, die zur Vernichtung oder Beseitigung vorhan dener Erreger körperfremder bzw. transformierter Zellen Noxen fühlen (Lysis, Phagozytose). Auch hierbei handelt es sich wieder um die obengenannten Zelltypen, die aber auf Grund ihrer Funktion in diesem Stadium als Effektorzellen bezeichnet werden. Alle diese Vorgänge sind unspezifisch und richten sich deshalb, wenn sie einmal in Gang gesetzt wurden, ganz allgemein gegen körperfremde Elemente.

Es sind bereits unspezifisch wirksame Mediatoren nachgewie sen worden. Inwieweit diese Mediatoren, die anhand ihrer biologischen Eigenschaften charakterisiert wurden, sich che misch untereinander ähneln bzw. vielleicht sogar identisch sind, ist nicht bekannt. Bekannt ist lediglich, daß diese Mediatoren in der Regel lösliche Glykoproteine mit Moleku largewichten nicht höher als 100 000 Dalton sind, die für relativ kurze Zeitintervalle von unterschiedlichen Zellar ten verschiedenster Spezies in vitro und in vivo gebildet werden, wobei die Sekretion spontan ablaufen oder durch Reize (Antigene, Mitogene, Toxine u. a. m.) ausgelöst oder verstärkt werden kann. Diese bekannten Mediatoren werden mit dem Überbegriff "Cytokine" bezeichnet und je nach synthe tisierender Zellart z. B. "Monokine, Lymphokine" ge nannt. Sie sind befähigt, Zielzellen- bzw. mechanismen des Abwehrsystems sowie andere eng damit verbundene funktio nelle Systeme zu bestimmten Reaktionen, Interaktionen oder zur Synthese von reaktiven Verbindungen anzuregen. Gleich zeitig sind sie auch für die Kooperation und Regulation dieser Vorgänge verantwortlich. In der sehr umfangreichen Literatur werden generell antigenspezifische und antigen unspezifische Mediatoren unterschieden. Antigenunspezifische Mediatoren steuern im synergistischen Zusammenwirken Para munitätsvorgänge.

Die bekannten Mediatoren sind keine Immunglobuline und zei gen auch keine strukturellen Ähnlichkeiten mit ihnen. Daß sie keine präformierten Bestandteile von Zellen sind, son dern erst nach Reiz synthetisiert und abgegeben werden, unterscheidet sie auch grundsätzlich von den Mediatoren der Anaphylaxie und von Enzymen phagozytierender Zellen, die in Form von Granula in der Zelle schon gestapelt vorliegen und lediglich als Folge eines Reizzustandes abgegeben wer den; vgl. E. Pick et al., Biology of the Lymphokines, Aca demic Press, N. Y. 1979, Bd. 1, S. 1-12. In genannter Arbeit wird zusammenfassend über Mediatoren berichtet.

Im klinischen Bereich sind bisher vereinzelt Versuche mit in vitro-hergestellten Mediatoren durchgeführt worden. Sie ent hielten stets nur bestimmte Mediatoren (z. B. Lymphokine, Interferon, Leukin), welche durch die Stimulierung mit einem unipotenten Paramunitätsinducer gewonnen wurden.

Aufgabenstellung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, multipotente Pa ramunitätsmediatoren zu entwickeln, d. h. Präparate, die mög lichst viele unterschiedliche Mediatorsubstanzen enthalten, die durch ihre synergistischen und antagonistischen Inter aktionen nicht nur optimale Reaktionen der Effektorzellen, sondern auch die Kontrolle dieses Geschehens garantieren. Der Vorteil gegenüber einer direkten Paramunisierung eines Patienten mittels Paramunitätsinducer liegt darin, daß un abhängig davon, ob geeignete Induktorzellen vorhanden sind, durch die Verabreichung derartiger multipotenter Paramuni tätsmediatoren (PM-Cocktail) die verschiedensten verfügba ren Effektorzellen- bzw. mechanismen direkt zu Abwehrreak tionen stimuliert werden können. Ein derartiger PM-Cocktail ist um so wirksamer, je mehr synergistisch wirksame Paramu nitätsmediatoren er enthält.

Die direkte Stimulierung entsprechender Abwehrmechanismen bei Mensch und Tier über multipotente Paramunitätsmediato toren aus Zellen des Abwehrsystems hat entscheidende Vor teile. Die wesentlichen sind:

1. Schnelle und gezielte, direkte Stimulierung der Effektor zellen, z. B. endogene Interferon-Synthese, Erhöhung der NK-Aktivität, Verstärkung der Phagozytose. Hierdurch kann zusätzlich ein Zeitgewinn gegenüber der Verabreichung von Paramunitätsinducern entstehen, da die Stimulierung der In duktorzellen und die Bildung der Paramunitätsmediatoren entfällt. Dadurch können inaktive oder geschädigte Induktor zellen umgangen und Mediatorendefizite ausgeglichen werden.
2. Die Paramunitätsmediatoren lassen sich leicht reinigen und anreichern (Entfernung von unnötigen Ballaststoffen,wie Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und sonstige Substanzen). Im Gegensatz dazu bestehen die bisher gebräuchlichen Para munitätsinducer aus komplexem biologischen Material (z. B. Vollbakterien bzw. deren Spaltprodukte, Bakterienextrakte, inaktivierte Viren). Bei ihrer Verwendung werden dem Patienten neben den für die Stimulierung der Induktorzellen notwendigen Bestandteilen eine Vielzahl anderer biologisch aktiver Stoffe einverleibt, bei Viren z. B. Nukleinsäuren, über deren genetische Interaktionen im Organismus noch nichts Genaues bekannt ist.
3. Die Verabreichung gereinigter und konzentrierter multi potenter Paramunitätsmediatoren erhöht die Sicherheit einer Prophylaxe oder Therapie (keine Teratogenität, keine akute Toxizität in der Babymaus bzw. der trächtigen Maus nachge wiesen).
4. Eine Immunisierung, wie sie bei Verwendung von Paramuni tätsinducern aus Viren oder Bakterien bei mehrmaliger An wendung möglich sein kann, ist bei der Anwendung von multi potenten Paramunitätsmediatoren nicht zu erwarten.
5. Die Stimulierung von Induktorzellen in einem Makroorga nismus durch die Verabreichung von Paramunitätsinducern ist ein sehr variables Geschehen und immer abhängig vom Aktivitätszustand bzw. der Stimulierbarkeit der entsprechen den Effektorzellen. Nach dem Prinzip "ein Organ kann nur soviel leisten, wie seine Induktorzellen" wirkt sich die Paramunisierung mit Paramunitätsinducern deshalb von Indi viduum zu Individuum ganz unterschiedlich aus. Die Verab reichung von standardisierten multipotenten Paramunitätsme diatorpräparaten kann diesen Unsicherheitsfaktor zumindest teilweise ausschalten.
6. Mit der Herstellung von multipotenten Paramunitätsmedia toren unter einheitlichen Laborbedingungen lassen sich Schwan kungen im biologischen Material, wie sie bei der Herstellung, z. B. von Paramunitätsinducern bakterieller oder viraler Her kunft, manchmal auftreten können (Probleme bei der Virusver mehrung, Gefahr einer Viruskontamination durch die verwende ten Organzellkulturen) praktisch ausschließen. Unter anderem kann die Verwendung permanenter Induktor-Zell-Linien eine Standardisierung der Paramunitätsmediatorproduktion er möglichen, die in einem geschlossenen System (Großfermenter zur Zellproduktion, Gradienten-Ultrazentrifuge zur Auftren nung und Reinigung) weitgehend von mikrobiellen Konta minationen unbeeinflußt bleibt.

Gegenstand der Erfindung sind somit multipotente Paramuni tätsmediatoren, die aus einem Gemisch verschieden wirksamer Paramunitätsmediatoren mit einer breiten Molekulargewichts verteilung von 10 000 bis 100 000 Dalton bestehen und des halb als Paramunitätsmediator-Cocktail (PM-Cocktail) bezeich net werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser multipotenten PM-Cocktails in Zellen des Abwehrsystems, beispielsweise Lymphozyten, Hybridomazellen oder anderen zur Bildung von Paramunitäts mediatoren geeigneten Zellen bzw. Zellkulturen. Ein weite rer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, die eine wirksame Menge eines multipotenten PM-Cocktails der Erfin dung enthalten und zur Erhöhung der unspezifischen Abwehr bei Vertebraten geeignet sind. Diese Arzneimittel dienen somit zur Prophylaxe und Therapie von Infektionen verschie denster Art, speziell von Virusinfektionen, Chemotherapie resistenten bakteriellen Infektionen, von infektiösen Kom plexkrankheiten, Mischinfektionen, infektiösen Faktorenkrank heiten, infektiösem Hospitalismus, von hartnäckig rezidi vierenden sowie chronischen Infektionen, von stressbedingten Abwehrschwächen und ihren Folgen, von erworbenen (z. B. durch energiereiche Strahlen, Chemotherapeutika, AIDS-Syndrom) Immunsuppressionen und deren Folgen, von altersbe dingten Ausfallserscheinungen (z. B. verminderte T-Lymphozy tenaktivität), zur Entgiftung (z. B. Leberschutztherapie), zur Substitutionstherapie bei Tumoren und zur Unterstützung der Wirksamkeit und Unschädlichkeit einer Chemotherapie bzw. Im munprophylaxe sowie zur Bekämpfung neonataler Krankheiten, die durch einen ungenügenden maternalen Schutz gegenüber der keimhaltigen Umwelt bedingt sind.

Die Lösung dieser Aufgaben ergibt sich aus den Patentan sprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.

Beschreibung der Erfindung

Die Herstellung der multipotenten Paramunitätsmediatoren (PM-Cocktail) wird durch folgendes Fließschema erläutert:

1. Kultivierung von Induktorzellen, z. B. in Monolayer- oder Suspensionskultur;
2. Stimulierung dieser Induktorzellen durch multipotente Paramunitätsinducer;
3. Gewinnung des "rohen" PM-Cocktail-haltigen Kulturme diums;
4. Gewinnung des reinen PM-Cocktails durch Ultrafiltra tion des Kulturmediums;
5. Lagerung des PM-Cocktails bei + 4°C bis -20°C oder Lyophilisation;
6. Nachweis der Reinheit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit.

Stufe 1:
Für die Herstellung der Induktor-Zellkulturen wer den Zellen des Abwehrsystems, vorzugsweise Lymphozyten, Monozyten und/oder Makrophagen "ex vivo" oder "post mortem" gewonnen und zur Stimulation "in vitro" kultiviert.

Transformierte Abwehrzellen, wie z. B. Burkitt-Lymphomzellen "Raji" des Menschen, die permanent in vitro kultivierbar sind, können ebenfalls zur Stimulation verwendet werden.

Vorzugsweise werden funktionelle Intra- oder Interspezies- Hybridomazellen, z. B. gewonnen durch Fusion von Milzzellen und Myelomzellen (P3-X63-Ag8) nach der Methode von Köhler und Milstein, als Induktorzellen benutzt (vgl. G. Köhler und C. Milstein, Nature Bd. 256 (1975), S. 495-497).

Diese Hybridomazellen können nach gezielter Fusion spontan oder nach Stimulation mit multipotenten Paramunitätsindu cern Paramunitätsmediatoren produzieren. Die Induktorzel len werden in an sich bekannter Weise in Monolayer- oder Suspensionskulturen gezüchtet, vorzugsweise als Suspen sionskulturen in Spinnergefäßen oder im Fermenter, unter Verwendung üblicher Zellkulturmedien, beispielsweise MEM (minimal essential medium) +5% fetales Kälberserum + 1,5% NaHCO₃. Bevorzugt werden aber serumfreie Medien. Alle verwendeten Zellkulturmedien enthalten die üblichen Anti biotikazusätze. Die Teilungsrate der Induktor-Zellkultu ren wird ihrer Vermehrungsgeschwindigkeit angepaßt, z. B. 2-3mal pro Woche eine 1 : 3 Teilung.

Stufe 2:
Zur Stimulierung der PM-Cocktail-Produktion wird den ausgewachsenen Induktor-Zellkulturen (z. B. Monolayer 100% dichter Zellrasen, Suspensionskulturen 1 × 10⁶ Zellen/ml evtl. Einstellung der Zelldichte) ein multipotenter Paramu nitätsinducer zugesetzt. Als Paramunitätsinducer eignen sich grundsätzlich alle in Tabelle I genannten Präparate, be sonders aber Präparate aus inaktivierten Viren (Pocken-, Parapocken-, Paramyxoviren), Bakterien (Corynebakterien, Mycobakterien, Pasteurellen, Clostridien, Brucellen) und Pilzen (Hefen, Sproßpilze), sowie chemische Verbindungen. Besonders bevorzugt sind Präparate aus inaktiviertem Orf virus (Parapoxvirus) und aus inaktiviertem Hühnerpocken virus (Avipoxvirus). Beide Präparate sind in der DE-OS 27 14 665 beschrieben. Es können auch Gemische dieser Prä parate verwendet werden. Für die Wahl und Menge geeigneter multipotenter Paramunitätsinducer ist maßgebend, daß der entstandene PM-Cocktail eine multipotente Wirksamkeit be sitzt. Die Wirksamkeit eines PM-Cocktails kann durch die folgenden in vivo- und in vitro-Tests nachgewiesen werden.

a) In vivo-Verfahren

Nachweis der antiinfektiösen Wirksamkeit in Virus- Belastungsmodellen (VSV-Test mit Babymäusen, Aujeszky- Test mit adulten Mäusen) und bakteriellen Belastungs modellen (Pseudomonas, E. coli u. a., vgl. H. H. Sedlacek, Behring Inst. Mitt., No. 74 (1984), S. 122-131).

b) in vitro-Verfahren

Lymphozytenstimulationstest, Latex-Inkorporationstest (Phagozytose), ⁵¹Cr-Freisetzungstest (natürliche (spon tane) zellvermittelte Zytotoxizität), Interferonnach weis im Plaquereduktionstest. Diese Teste dienen dem Nachweis, daß die wichtigsten Reaktionssysteme der un spezifischen Abwehr durch den PM-Cocktail stimuliert werden. Der Nachweis der Wirksamkeit eines PM-Cocktails kann auch mit anderen geeigneten in vitro-Testmethoden durchgeführt werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten multipoten ten Paramunitätsinducer können als Flüssigkeit oder als Lyophilisat vorliegen. In letzterem Falle werden sie vor ihrer Verwendung in einer entsprechenden Flüssigkeitsmenge aufgelöst, z. B. in Tris-Puffer pH 10, MEM pH 7,4 oder Aqua dest. Die Stimulationsdosis beträgt 0,5-10 ml pro 100 ml Kulturmedium, vorzugsweise 1 ml/100 ml. Die Inkubationsdauer beträgt etwa 18 bis 96 Stunden, vorzugsweise etwa 36 Stunden, bei etwa 33° bis 39°C, vorzugsweise bei etwa 37°C. Sofern die Inkubation in einem offenen Kultur-System durchgeführt wird, muß zusätzlich CO₂ bis zu einer Konzentration von etwa 5% zugesetzt werden (CO₂-Brutschrank). Während der Inkuba tion werden die Induktorzellen lichtmikroskopisch auf cyto pathische oder cytotoxische Veränderungen regelmäßig kontrol liert.

Beim Auftreten von derartigen Veränderungen werden die Zellkultur-Überstände sofort gewonnen, filtriert, konzentriert und auf eventuellen Mediatorengehalt geprüft. Fällt diese Wirksamkeitsprüfung negativ aus, werden sie verworfen.

Stufe 3:
Die Induktorzellen werden vom Kulturmedium abge trennt, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Alle fol genden Arbeitsgänge werden vorzugsweise bei Raumtemperatur und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Das den PM- Cocktail enthaltende Zellkulturmedium kann bei +4°C bis -20°C oder darunter aufbewahrt werden.

Stufe 4:
Aus dem von den Zellen befreiten Kulturmedium wird der PM-Cocktail isoliert, der nur Bestandteile enthal ten soll, deren Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000 Dalton liegt. Wichtig ist dabei, daß die hierfür nötige Ul trafiltration schonend (Vermeidung von Scherkräften) durch geführt wird, um die Paramunitätsmediatoren in nativem Zu stand zu halten. Hierfür eignen sich z. B. Geräte der Fa. Amicon, Witten, BRD (Stirred Ultrafiltration Cell, Modell 402 für Mengen bis 2000 ml) oder für größere Mengen das Pellicon- Kassetten-System der Fa. Millipore, Neu-Isenburg, BRD. Bei diesen Geräten wird der Flüssigkeitsstrom tangential über das Membran- bzw. Kassettensystem geführt, so daß die be kannten Nachteile konventioneller Filtration entfallen. Durch die Verwendung von Membranen bzw. Kassetten mit einer nominalen Molekulargewichtstrenngrenze (NMGG) von 100 000 Dalton werden zunächst alle höhermolekularen Be standteile des Rohpräparates abgetrennt. Das gewonnene Fil trat wird dann durch Membranen bzw. Membrankassetten mit einer NMGG von 10 000 geleitet. Das Filtrat wird verworfen. Das Retentat enthält den PM-Cocktail der Erfindung in kon zentrierter Form, da gleichzeitig eine Einengung auf das 10- bis 20-fache des Ausgangsvolumens erfolgt ist. Die Ab trennung des PM-Cocktails kann selbstverständlich auch nach anderen Verfahren erfolgen, sofern sie eine schonende Be handlung garantieren, so z. B. durch Gelchromatographie oder Dichtegradienten-Zentrifugation.

Stufe 5:
Der gewonnene PM-Cocktail kann bis zur Verwendung bei +4°C bis -20°C oder bei tieferen Temperaturen gela gert werden. Er kann auch in bekannter Weise gefrierge trocknet werden.

Stufe 6:

A) Nachweis der Reinheit

Es werden folgende Kontrolluntersuchungen durchgeführt:

1. elektronenmikroskopische Untersuchung auf das Fehlen von größeren Partikeln, zur Überprüfung der Filtra tionssysteme;
2. mikrobiologische Untersuchung auf das Fehlen von Kontaminationen durch Bakterien, Viren oder Pilze nach den Vorschriften des Europ. Arzneibuches;
3. serologische Untersuchung auf das Fehlen von Antikörpern (sofern zur Antikörper-Bildung befähigte Zellen durch virale oder mikrobielle Paramunitätsinducer in Stufe 2 zur Stimulierung verwendet worden sind) mittels Neutra lisations- oder ELISA-Test oder anderen bekannten sero logischen Verfahren.
B) Nachweis der Unschädlichkeit
(Pyrogenität, Toxizität, Teratogenität) nach den Vorschriften des DAB 6 bzw. des Europ. Arzneibuches.
C) Nachweis der Wirksamkeit

Es werden folgende Untersuchungen durchgeführt:

1. Der Infektionsbelastungsversuch mit dem Stomatitis vesicularis-Virus in der Babymaus (VSV-Modell),
2. der Infektionsbelastungsversuch mit dem Aujeszky-Virus in der adulten Maus (AV-Modell).

Im VSV-Modell werden 30 NMRI-Babymäuse (gleichmäßige Mi schung aus verschiedenen Würfen) mit 0,1 ml des PM-Cocktails subcutan vorbehandelt und 16-24 Stunden später mit 20-50 LD₅₀ des hochvirulenten Stomatitis vesicularis-Virus (VSV) intraperitoneal infiziert. Die Infektion führt ab dem 4. Tag p. inf. zum Tod. Die Infektionsdodis ist so einge stellt, daß ca. 80-100% der Tiere sterben.

Das zweite Modell beinhaltet die Vorbehandlung von je 20 adulten NMRI-Mäusen (weibl., 20 g schwer) mit 0,2 ml des PM-Cocktails intraperitoneal (oder 0,5 ml subcutan) und 16-24 Stunden später die Infektion dieser Mäuse mit 20-50 LD₅₀ des Aujeszky-Virus ebenfalls intraperitoneal. Die In fektionsdosis wird so eingestellt, daß ab dem 3. Tag p. inf. 80-100% der Mäuse sterben.

Als Kontrollen werden bei beiden Modellen entsprechende Tierzahlen mit einem Placebopräparat vorbehandelt. Das Placebopräparat wird gemäß den Stufen 1, 3-5, d. h. ohne Stimulierung der Induktorzellen, hergestellt. Die Morbidi tät und Mortalität wird über einen Zeitraum von 14 Tagen ausgewertet. Es wird der Wirkungsindex (WI) nach der fol genden Formel errechnet:

b = % Mortalität der Kontrollgruppe
a = % Mortalität der Versuchsgruppe

Beispiel:
Mortalität bei der Kontrolle 88,8%
Mortalität bei der zu testen den Substanz 7,1%

Diese beiden Infektionsmodelle wurden ausgewählt, weil sie mit zwei völlig unterschiedlichen Virusarten mit unter schiedlichen pathogenetischen Verlaufsformen und einmal im neugeborenen Tier mit unreifem Abwehrsystem (VSV-Modell) und im anderen Fall im adulten Tier (AV-Modell) durchgeführt werden. Beide Infektionsmodelle stellen höchste Ansprüche an die Infektabwehr, da die Infektionsdosis so hoch einge stellt wird, daß die Gesamtmortalität von Placebo-behandel ten Kontrolltieren innerhalb der Beobachtungszeit zwischen 80% und 100% liegt, wobei die Mehrzahl der Todesfälle be reits in der 1. Woche auftritt. Zur Bewertung der Wirksam keit wird der Wirkungsindex berechnet. Ein Wirkungsindex von größer 20 ist signifikant.

Die in vitro-Tests sind so ausgewählt, daß ein möglichst breites Spektrum der körpereigenen Abwehrreaktionen erfaßt werden kann. Hierzu gehören

1. der Lymphozytenstimulationstest zum Nachweis der Stimu lierbarkeit von vorbehandelten Lymphozyten über die Mes sung des Einbaus von ¹⁴C oder ³H-Thymidin in die DNA; vgl. H.-P. Lohrmann et al., J. exp. Med., Bd. 139 (1974), 1037-1048;
2. der Latex-Inkorporationstest, die erhöhte Phagozytose von Mikroorganismen, die erhöhte Chemoluminiszenz zum Nachweis der Mikro- bzw. Makrophagenaktivität; vgl. R. D. Nelson et al., Infection and Immunity, Bd. 17 (1977), S. 513-520; J. R. David u. H. G. Remold, in: Biology of the Lymphokines, by S. Cohen et al., 1979, Academic Press, New York.
3. der ⁵¹Chrom-Freisetzungstest zum Nachweis der Erhöhung der natürlichen (spontanen) zellvermittelten Zytotoxi zität; vgl. R. B. Herberman, NK cells and other Natural Effector Cells, 1982, Academic Press, New York.
4. der direkte und indirekte Interferonnachweis im VSV- Plaquereduktionstest zum Nachweis der Interferonpro duktion; vgl. J. Vilcek, Virology Monographs, Springer Verlag, Wien-New York, Band 6 (1969), S. 13-15.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Hybridomazellen (permanenter Zellstamm, gewonnen durch Fu sion von Mäusemyelomzellen (P3-X63-Ag8) und Mäusemilzzellen BALB/c Mäuse) werden entsprechend ihrer Vermehrungsrate 1 : 3 geteilt und als Suspensionskulturen in ein Nährmedium (MEM (minimal essential medium) +5% fetales Kälberserum +1,5% NaHCO₃ sowie 100 I. E. Penicillin, 100 µg Strepto mycin und 2 µg Amphotericin B) verbracht. Bei Verwendung von halboffenen Kulturgefäßen wird die atmosphärische Luft durch 5% CO₂ angereichert. Größere Mengen werden günstiger in Spinnerkulturgefäßen bzw. im Laborfermenter angezüchtet. Die Bebrütungstemperatur beträgt stets 37°C. Nach 2-3 Ta gen ist die Kultur optimal ausgewachsen. Das Nährmedium wird entfernt und durch Erhaltungsmedium ersetzt. Als Erhaltungs medium dient das gleiche Medium ohne Serumzusatz. Der pH- Wert des Mediums wird mit Hilfe von HCl/NaHCO₃ oder HEPES- Puffer auf 7,2 bis 7,4 eingestellt. Die Zelldichte wird gleichzeitig auf 1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Der Zell kultur wird nun zur Stimulierung der Paramunitätsmediato ren-Produktion als Paramunitätsinducer inaktiviertes Orf virus in einer Dosis von 1 ml pro 100 ml (0,01 ml/ml) Zell kulturmedium zugesetzt und die Kultur anschließend 24 bis 96 Stunden bei 37°C bebrütet. Der Paramunitätsinducer liegt als gefriergetrocknetes Präparat vor und wird kurz vor der Verwendung in Tris-Puffer (pH 10,0) entsprechend dem Aus gangsvolumen aufgelöst.

Die Hybridomazellen werden während der Inkubierung regel mäßig lichtmikroskopisch auf cytopathische und cytotoxische Veränderungen kontrolliert. In diesem Sinne veränderte Zell kulturen werden sofort in der Inkubation gestoppt, ihre Überstände gewonnen, filtriert und konzentriert und auf eventuellen Mediatorgehalt überprüft. Fällt dieser Wirksam keitstest negativ aus, werden sie verworfen. Die Inkuba tions- bzw. Stimulationszeit wird durch die Trennung der Zellen vom Kulturmedium beendet. Dies geschieht z. B. durch Zentrifugieren (ca. 2000 g) während 20-30 Minuten oder durch Filtrieren durch Membranen mit einer Porengröße von 0,22 µm - 0,45 µm. Der gewonnene Überstand bzw. das Filtrat enthält den ungereinigten PM-Cocktail. Dieser kann bis zur Weiterverarbeitung bei +4°C bis -20°C oder tieferen Tem peraturen aufbewahrt werden.

Zur Gewinnung des reinen PM-Cocktails wird eine zweistufige schonende Ultrafiltration durchgeführt. Hierfür eignen sich z. B. Geräte der Fa. Amicon, Witten bzw. für größere Mengen das Pellicon-Kassetten-System der Fa. Millipore, Neu-Isen burg. In der 1. Ultrafiltrationsstufe werden Membranen bzw. Membran-Kassetten mit einer NMGG von 100 000 Dalton verwen det. Das Filtrat, das nunmehr von allen höhermolekularen Verbindungen befreit ist, wird in der zweiten Stufe durch Membranen bzw. Membran-Kassetten mit einer NMGG von 10 000 Dalton geleitet. Das Filtrat dieser 2. Stufe wird verworfen, es enthält alle niedermolekularen Verbindungen. Das Reten tat, das gleichzeitig eine Einengung auf das 10-15-fache des Ausgangsvolumens erfahren hat, wird gewonnen. Es enthält nur noch Verbindungen, deren Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000 Dalton liegt und stellt somit ein Kon zentrat aller gebildeten Paramunitätsmediatoren dar. Es wird deshalb als Paramunitätsmediator-Cocktail (PM-Cocktail) bezeichnet. Der gewonnene PM-Cocktail wird bei Temperaturen von +4°C bis -20°C oder tieferen Temperaturen aufbewahrt. Er kann auch in gefriergetrockneter Form aufbewahrt werden. Die Reinheit, Spezifität und Wirksamkeit des erfindungsge mäßen PM-Cocktails wird durch entsprechende Kontrollunter suchungen überprüft.

Die Prüfungen auf Reinheit, Unschädlichkeit und Spezifität umfassen folgende Untersuchungen, die nach den bekannten Verfahren durchgeführt werden:

1. Elektronenmikroskopische Kontrolle mit den üblichen Methoden auf das Fehlen des PM-Cocktails von größe ren Partikeln;
2. übliche Kontrollen auf mikrobielle Kontaminationen nach den Richtlinien des Europ. Arzneibuches;
3. die Unschädlichkeit wird nach den Richtlinien des Europ. Arzneibuches vorgenommen (Toxizität, Terato genität, Pyrogenität);
4. eine Überprüfung des PM-Cocktails auf vorhandene Anti körper gegen das Inducer-Virus wird nur vorgenommen, wenn zur Antikörperbildung befähigte Zellen (B-Lympho zyten, Plasmazellen) stimuliert wurden. Sie wird aller dings durch eine ausreichende Filtration überflüssig.

Zum Nachweis der Wirksamkeit wird der PM-Cocktail nach den vorstehend beschriebenen Methoden untersucht.

Als in vivo-Nachweis werden immer die beiden Infektionsmo delle in der Maus (NMRI-Stamm) verwendet, nämlich 1. die VSV-Infektion der Babymaus und 2. die Aujeszky-Infektion der adulten Maus. In den Tabellen II und III sind typische Ergebnisse aus diesen Tests zusammengestellt.

Tabelle II

VSV-Infektionsmodell

Tabelle III

Aujeszky-Infektionsmodell

Die Signifikanz liegt bei diesen beiden Testmodellen bei einem Wirkungsindex von größer 20. Als brauchbar werden nur solche Chargen bewertet, deren Wirkungsindex mindestens 50 beträgt. Zur Standardisierung gewonnener PM-Cocktails wer den die Wirkungseinheiten, bezogen auf das VSV-Modell, be rechnet. Hierzu wird der PM-Cocktail in log 2 Verdünnungen im VSV-Modell getestet. 1 Wirkungseinheit (WE) pro appli zierte Dosismenge (= 0,1 ml) ist bei der Verdünnungsstufe erreicht, bei der noch ein Wirkungsindex von 20 erzielt wird. In der unverdünnten Ausgangssubstanz ist dementspre chend die Anzahl der WE um das Vielfache der Endverdünnung höher. Im vorliegenden Beispiel enthält die Verdünnung 1 : 16 1 WE; der PM-Cocktail enthält demnach 160 WE pro ml (16 WE/0,1 ml).

Nur PM-Cocktails, die sich in den in vivo Tests als ausrei chend wirksam erweisen, werden den vorstehend beschriebenen in vitro-Tests unterzogen. Mit Hilfe des Lymphozytenstimula tionstestes wird überprüft, ob ein in vivo applizierter PM-Cocktail die Lymphozytenaktivität zu stimulieren vermag. Dabei werden die homologe und heterologe Wirksamkeit gete stet. In der Tabelle IV sind typische Ergebnisse des Lympho zytenstimulationstests mit Lymphozyten von drei verschiede nen Species zusammengestellt.

Tabelle IV

Lymphozytenstimulationstest

Signifikant positiv sind nach dem t-Test Präparate, deren Stimulationsindex mindestens 3-fach höher als der der ent sprechenden Zellkontrolle ist (Irrtumswahrscheinlichkeit χ = 4,015 bei einer Vertrauensgrenze von 0,001). Die ge testete Charge war demnach mit allen 3 Lymphozytenarten positiv.

Im Latex-Inkorporationstest wird überprüft, inwieweit ein PM-Cocktail den zur Phagozytose befähigten Zellanteil des peripheren Blutes verschiedener Species in vitro zu erhö hen vermag. In der Tabelle V sind typische Ergebnisse eines Tests zusammengestellt.

Tabelle V

Latex-Inkorporationstest

Der Phagozytose-Prozentsatz, der den Anteil der zur Phago zytose befähigten Zellen widergibt, ist bei allen 3 geteste ten Tierarten deutlich höher als der der Kontrollen. Gleich zeitig wird deutlich, daß das Phythämagglutinin (PHA) zwar die Lymphozyten-, nicht aber die Makrophagentätigkeit zu stimulieren vermag.

Bei der Bewertung der natürlichen (spontanen) zellvermit telten Zytotoxizität wird die Erhöhung der spezifischen Lysis von Zielzellen durch zuvor in vivo oder in vitro mit PM-Cocktail stimulierte homologe oder heterologe NK-Zellen registriert. In der Tabelle VI sind typische Ergebnisse eines ⁵¹Cr-Freisetzungstestes nach in vivo-Stimulierung von Mäusen zusammengestellt. Den Mäusen wurde hierfür 24 Stun den vor der NK-Zellgewinnung aus der Milz 0,2 ml PM-Cocktail intraperitoneal verabreicht.

Tabelle VI

⁵¹Cr-Freisetzungstest

Die spezifische Lysis der Zielzellen ist bei den mit PM- Cocktail vorbehandelten Mäusen signifikant höher als bei un behandelten Kontrollmäusen.

Für den Nachweis, daß durch die Applikation des PM-Cocktails die Interferonproduktion stimuliert wird, werden Seren von vorbehandelten Mäusen im indirekten VSV-Plaquereduktionstest untersucht. Die Seren werden hierfür 8 Stunden nach der Applikation des PM-Cocktails gewonnen. In der Tabelle VII sind typische Ergebnisse eines indirekten VSV-Plaquereduk tionstestes zusammengestellt.

Mit dem direkten Plaquereduktionstest kann daneben auch der Interferongehalt eines PM-Cocktails geprüft werden.

Tabelle VII

VSV-Plaquereduktionstest

Der Interferontiter des untersuchten Mäuseserums beträgt 1 : 64.

Als konstante Bezugsgröße für die Bewertung und Einstellung standardisierter PM-Cocktails dient der Gehalt an Wirkungs einheiten im VSV-Infektionsmodell in der Babymaus. Der Min destgehalt des PM-Cocktails sollte 100 WE/ml betragen.

Beispiel 2

"Ex vivo" oder "post mortem" gewonnene Abwehrzellen aus dem Blut (z. B. Blutlymphozyten, Monozyten) oder aus zur Ab wehr befähigten Organen (z. B. Milz, Thymus) werden gemäß Beispiel 1 kultiviert. Die Stimulierung der Zellkulturen (Induktorzellen) erfolgt mit einem der in Beispiel 3-5 genannten multipotenten Paramunitätsinducer. Die weitere Aufarbeitung sowie die Prüfung auf Reinheit und Wirksamkeit erfolgt gemäß Beispiel 1.

Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 3

Die Herstellung des PM-Cocktails erfolgt gemäß Beispiel 1 oder 2, anstelle des inaktivierten Orfvirus wird jedoch inak tiviertes Hühnerpockenvirus als Paramunitätsinducer verwen det. Man erhält einen multipotenten PM-Cocktail, dessen Rein heit und Wirksamkeit gemäß den im Beispiel 1 genannten Ver fahren nachgewiesen werden. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 4

Die Herstellung des PM-Cocktails sowie dessen Prüfung auf Reinheit und Wirksamkeit erfolgt gemäß Beispiel 1, jedoch mit einem inaktivierten Mykobakterium bovis als bakteriel lem Paramunitätsinducer. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Anstelle der Mykobakterien können beispielsweise auch Bru cellen, Salmonellen, Corynebakterien, Clostridien und ande re Bakterienspezies verwendet werden.

Beispiel 5

Die Herstellung des PM-Cocktails sowie dessen Prüfung auf Reinheit und Wirksamkeit erfolgt gemäß Beispiel 1, jedoch mit Levamisol als chemischem Paramunitätsinducer. Es wer den im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Anstelle von Levamisol können auch Tiloron, Delimmun oder Isoprinosine verwendet werden.

Beispiel 6

Die gemäß Beispiel 1 bis 5 hergestellten PM-Cocktails wer den lyophilisiert und dienen in dieser Form als Ausgangs produkt zur Herstellung entsprechender Arzneimittel. Vor der Verwendung wird das Lyophilisat entsprechend dem Aus gangsvolumen mit üblichen pharmazeutischen Trägern versetzt, beispielsweise sterilem, pyrogenfreien Aqua dest. In dieser Zubereitungsform eignet es sich sowohl für die parenterale (z. B. intramuskuläre) als auch für die lokale (beispiels weise Gurgeln, Aufschnupfen, Nasenspray) Verabreichung.

Der erfindungsgemäße PM-Cocktail kann auch in andere phar mazeutische Träger eingearbeitet werden. Hierbei muß berück sichtigt werden, daß die Sterilität und Haltbarkeit, z. B. durch proteolytische Bestandteile des Trägers, nicht beein trächtigt werden.

In der Humanmedizin empfiehlt sich bei der parenteralen Applikation eine Dosis von 1-2 ml pro Injektion. Bei akuten Infektionen wird beispielsweise 1-3 mal täglich je 1-2 ml intramuskulär verabreicht. Je nach Schwere der Erkrankung werden die Injektionen 3 bis 5 Tage gegeben. Diese Behand lung kann nach 2-4 Wochen, bzw. bei erneutem Auftreten von klinischen Symptomen auch früher, wiederholt werden. Für die Prophylaxe genügt in der Regel 1 Injektion pro Tag über 3 Tage. Zur Behandlung von chronischen Infektionen oder anderen, länger bestehenden Beschwerden (z. B. in der Geria trie), wird der Behandlungsrhythmus den individuellen Be dürfnissen angepaßt.

Für den Einsatz in der Tiermedizin gelten grundsätzlich die gleichen Regeln. Die Dosierung wird hier lediglich der Größe der betreffenden Tierart und der Schwere der Erkrankung an gepaßt (z. B. Rind: 4 ml; neugeborene Welpen: 0,5 ml).

Beispiel 7

Um die Verwendungsmöglichkeiten und die Wirksamkeit des PM- Cocktails der Erfindung zu zeigen, sind einige Beispiele von prophylaktischen und therapeutischen Anwendungen bei Mensch und Tier in den Tabellen VIII bis X zusammengestellt. Wie aus den Daten hervorgeht, können durch den Einsatz des PM-Cock tails Infektionskrankheiten unterschiedlicher Genese in ihrem Verlauf gestoppt, gemildert oder überhaupt am Ausbruch gehin dert werden.

Tabelle IX

Einsatz von PM-Cocktail zur Prophylaxe des infektiösen Welpensterbens

Die Verwendung des PM-Cocktails in einem Doppelblindversuch bei neugeborenen Welpen verdeutlicht, daß durch die prophy laktische Anwendung dieses Präparates eine infektiöse Welpen erkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate wirksam unter Kontrolle gebracht werden kann.

Tabelle X

Einsatz von PM-Cocktail zur Prophylaxe der Crowding Disease in der Kälbermast

Auch dieser Doppelblindversuch in einem Kälbermastbetrieb, in dem die Behandlung mit PM-Cocktail sofort nach dem Ein treffen der Kälber in den Bestand durchgeführt worden ist, verdeutlicht, daß das Präparat eine ausgezeichnete prophy laktische Wirksamkeit gegen Infektionen unterschiedlicher Genese besitzt.

Die aufgeführten Beispiele beweisen die Wirksamkeit des PM-Cocktails der Erfindung bei Mensch und Tier. Sie bewei sen ferner ihre Unschädlichkeit. Es wurden keine Nebenreak tionen beobachtet.

Claims

1. Multipotente Paramunitätsmediatoren mit einem Molekular gewicht von etwa 10 000 bis 100 000 Dalton, erhältlich durch Stimulieren von Zellen des Abwehrsystems mit einem multi potenten Paramunitätsinducer in einem Zellkulturmedium, In kubieren während etwa 18 bis 96 Stunden bei etwa 33 bis 39°C, anschließendes Abtrennen der Zellen aus dem Zellkul turmedium und Gewinnung der Fraktion mit einem Molekularge wicht von etwa 10 000 bis 100 000 Dalton durch Ultrafiltra tion des Zellkulturmediums, und mit folgenden Eigenschaften:

a) antiinfektiöse Wirksamkeit in vivo gegen die Stomatitis vesicularis der Babymaus und gegen die Aujeszky-Infektion der adulten Maus sowie die endogene Interferonproduktion;
b) erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten, erhöhte Makro phagentätigkeit und erhöhte natürliche (spontane) zell vermittelte Zytotoxizität.

2. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem vira len multipotenten Paramunitätsinducer durchgeführt worden ist.

3. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 2, da durch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem inakti vierten Virus der Familie Poxviridae durchgeführt worden ist.

4. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem bakte riellen multipotenten Paramunitätsinducer durchgeführt wor den ist.

5. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 4, da durch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit inaktivier ten Bakterien der Gattung Mykobakterium durchgeführt worden ist.

6. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem multi potenten chemischen Paramunitätsinducer durchgeführt worden ist.

7. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 6, da durch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit Levamisol durchgeführt worden ist.

8. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach einem der An sprüche 1-7 dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem Gemisch von multipotenten Paramunitätsinducern durch geführt worden ist.

9. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach einem der An sprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellkulturen Hybridoma-Zellklone verwendet worden sind.

10. Verfahren zur Herstellung von multipotenten Paramuni tätsmediatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen des Abwehrsystems mit einem multipotenten Para munitätsinducer in einer zur Stimulierung der Paramunitäts mediatoren-Produktion ausreichenden Menge versetzt und etwa 18 bis 96 Stunden bei etwa 33 bis 39°C inkubiert, anschlie ßend die Zellen aus dem Zellkulturmedium abtrennt und durch Ultrafiltration des Zellkulturmediums die Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 100 000 Dalton gewinnt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem viralen multipotenten Paramunitätsinducer durchführt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem inaktivierten Virus der Familie Poxviridae durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem bakteriellen multi potenten Paramunitätsinducer durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit inaktivierten Bakterien der Gattung Mykobakterium durchführt.

15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem multipotenten chemi schen Paramunitätsinducer durchführt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit Levamisol durchführt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem Gemisch von multipotenten Paramunitätsinducern durchführt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch ge kennzeichnet, daß man nach der Ultrafiltration die erhal tene Fraktion gefriertrocknet.

19. Arzneimittel zur Erhöhung der nicht-erregerspezifi schen Abwehr von Vertebraten, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an multipotenten Paramunitätsmediatoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9.