Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Zellverschmelzung; insbesondere betrifft die Erfindung
einen Antikörper, der von einer verschmolzenen Zelle erzeugt wird, die ihrerseits aus einer Zelle, die den Antikörper zu
erzeugen vermag, und einer solchen Zelle, die sich dauerhaft durch Subkultur unter in vitro Bedingungen vermehren kann,
entstanden ist. Diese durch Zellverschmelzung entstandene Zelle, bzw. der resultierende Zellverband wird nachstehend
als "Hybridoma-Zellklon" bezeichnet. Mehr im einzelnen betrifft
diese Erfindung einen Antikörper, der gegen das Oberflächen-Antigen
eines zur Gattung Aspergillus gehörenden Pilzes gerichtet ist, welcher Antikörper eine hohe spezifische
(monoklonale) Wirksamkeit aufweist. Die Erfindung ist weiterhin auf einen Hybridoma-Zellklon gerichtet, welcher diesen
Antikörper erzeugt; weiterhin ist die Erfindung auf die Herstellung und Anwendung dieses Antikörpers gerichtet.
In jüngerer Zeit konnten durch die Entwicklung der vorbeugenden Medizin und die Verbreitung der Antibiotika die von Bakterien
verursachten Infektionskrankheiten verringert werden. Auf der anderen Seite zeigen die von Pilzen verursachten
Krankheiten, das heißt, die Mykosen, weltweit eine zunehmende Tendenz. Viele dieser Mykosen verursachenden Pilze sind üblicherweise
in der üblichen Umgebung vorhanden, z.B. im Mund, im Verdauungstrakt, im Rachenbereich, auf der Haut, oder in
der Vagina des gesunden Körpers. Unter diesen Mykosen ist insbesondere über Endokarditis, Pneumonia, Uropathy, Meningitis,
Osteopathy, Arthritis, Dermatosen und dgl. berichtet worden. Es ist weiterhin bekannt, daß Mykosen in Verbindung
mit schweren chronischen Krankheiten wie etwa Tuberkulose und Krebs auftreten können und die Symptome dieser Krankheiten
in erheblichem Ausmaß verschlimmern.
Zur Zeit sind einige wenige, zum Heilen von Mykosen wirksame Arzneimittel bekannt, welche jedoch ernsthafte Nebenwirkungen
verursachen. Weiterhin sind bislang Antibiotika mit antifungaler Wirkung, wie etwa Amphotericin B und 5-Fluorocytosin
zum Heilen von Mykosen eingesetzt worden. Deren Wirkung auf Pilze ist jedoch unzureichend, und beim Gebrauch dieser Mittel
treten Nebenwirkungen auf.
Auch eine Behandlung dieser Krankheiten mit einem Antikörper ist bereits versucht worden, nämlich beispielsweise durch Verabreichung
eines Human-Gamma-Globulin-Präparates gegen die In- |
fektion eines Patienten. Dieses Präparat enthielt jedoch offen- I
sichtlich einen geringen Gehalt an Antikörper, der spezifisch Ij
gegen den die Infektion verursachenden Pilz gerichtet ist, weil 1I
im Herstellungsverfahren dieses Präparates beispielsweise kein Ά
Λ Immunisierungsschritt vorgesehen ist, was insgesamt die Akti- -I
vitäten etwas einschränkt. Hinsichtlich einer Behandlung mit if
einem Antikörper, der aufgrund einer Immunisierungsbehandlung || einen erhöhten Titer aufweist, ist bereits die Serotherapie >|
bekannt, die bei einer akuten Vergiftung, beispielsweise durch -f Schlangengift, eingesetzt wird. Obwohl eine solche Therapie
einige bemerkenswerte Auswirkungen zeigt, kann eine Immunreaktion durch das fremde Antigen auftreten, und es können
weiterhin allergische Reaktionen auftreten, weil es sich bei dem Serum um ein Fremdserum handelt, beispielsweise um Pferdeserum,
das neben dem eigentlichen spezifischen Antikörper eine Anzahl von Begleitstoffen enthält. Eine solche Serotherapie
ist bislang zur Behandlung von Mykosen nicht eingesetzt worden.
Eine rasche Erkennung und Feststellung, sowie die genaue Identifizierung
solcher Pilze ist deshalb wichtig für eine klinische Diagnose; weiterhin besteht Bedarf nach einem wirksamen
Heilverfahren zur Behandlung der Mykosen. Hinsichtlich anderer Anwendungsgebiete, etwa bei Fermentierungsverfahren und im
Brauereiwesen ist die Erkennung und Abtrennung einer Ferment-
hefe von schädlichen Pilzen ebenfalls bedeutsam und notwendig. Pilze der Gattung Aspergillus, welche einen wesentlichen Gesichtspunkt
der vorliegenden Erfindung darstellen, bilden ein typisches Beispiel für solche Pilze.
Bis heute beruht die Klassifizierung und Identifizierung der
Pilze der Gattung Aspergillus auf der Bestimmung von deren morphologischen und biochemischen Eigenschaften. Diese Verfahrenerfordern
lange, mühsame experimentelle Analysen und sind deshalb für die praktische Anwendung ungeeignet. Weiterhin
ist ein serologisches Verfahren zur Identifizierung bekannt, das mit Serumfaktoren arbeitet, welche durch Immunisierung
eines Tieres, wie etwa eines Kaninchens, und anschließende Absorption mit einer Zelle, die sich von der zur Immunisierungsbehandlung verwendeten Zelle unterscheidet, erhalten worden sind,
Der Serumfaktor bildet ein Gemisch aus verschiedenen Antikörpern, die unterschiedliche Spezifität aufweisen, weswegen die
Spezifität bzw. der Titer notwendigerweise zwischen den einzelnen Ansätzen oder Partien in einem gewissen Ausmaß schwankt.
Weiterhin kann durch Begleitstoffe gelegentlich eine unerwartete Nebenreaktion auftreten. Andererseits ist der Titer des erhaltenen
Serumfaktors zumeist relativ niedrig, weil sich die zur gleichen Gattung gehörenden Pilze in ihren antigenen Eigenschaften
recht ähnlich sind. Weiterhin ist eine solche Immunisierung mit recht mühevollen Schritten und Maßnahmen verbunden.
Deshalb sind diese Verfahren zur Klassifizierung und/oder Identifizierung
von Pilzen im Hinblick auf die Zuverlässigkeit in einem gewissen Ausmaß beschränkt.
Die zur vorliegenden Erfindung benannten Erfinder haben ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers untersucht,
der spezifisch gegen einen Pilz der Gattung Aspergillus gerichtet bzw. wirksam ist, und haben auf diesem Wege einen
solchen Antikörper mit hoher Spezifität, mit hohem Titer und mit einem geringen Gehalt an Begleitstoffen gefunden, der aus
einem Hybridoma-Zellklon erhalten werden kann, welcher ZeIlklon
seinerseits aus einer Zelle, die den gegen einen Pilz der Gattung Aspergillus gerichteten Antikörper (diese Zelle
wird nachstehend kurz manchmal als "eine, den gegen Aspergillus gerichteten Antikörper erzeugende Zelle" bezeichnet) und einer
solchen Zelle erhalten worden ist, welche man dauerhaft in einer in vitro Subkultur (diese Zelle wird nachstehend kurz
manchmal als "eine, in Subkultur gehaltene Zelle" bezeichnet) halten kann. Die zur vorliegenden Erfindung benannten Erfinder
haben weiterhin festgestellt, daß dieser Antikörper zur Klassifizierung
und/oder Identifizierung eines zur Gattung Aspergillus gehörenden Pilzes brauchbar ist. Der Antikörper kann weiterhin
mit Erfolg bei der Heilung von Infektionen eingesetzt werden, welche durch diesen Pilz verursacht werden.
In der Fachwelt ist bereits bekannt, daß durch Zellverschmelzung einer Zelle, die einen Antikörper zu erzeugen vermag, mit
einer Myelomazelle ein Hybridoma-Zellklon erhalten werden kann, der einen spezifischen Antikörper zu erzeugen vermag; vgl. hierzu
beispielsweise Köhler et al, Nature, 256, 495-497 (1975) und Eur.J.Immunol., ^, 511-519 (1976). Bis zur vorliegenden Erfindung
ist jedoch ein Hybridoma-Zellklon, der einen gegen einen Pilz der Gattung Aspergillus gerichteten Antikörper zu erzeugen
vermag, nicht bekannt geworden.
Eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers
anzugeben, der spezifisch gegen das Oberflächen-Antigen eines zur Gattung Aspergillus gehörenden Pilzes gerichtet bzw. wirksam
ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen hochspezifischen, gegen Aspergillus gerichteten Antikörper
bereitzustellen, und ein auf Zellverschmelzungs-Maßnahmen
beruhendes Verfahren zur Herstellung dieses Antikörpers anzugeben.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Hybridoma-Zellklon bereitzustellen, der diesen
Antikörper zu erzeugen vermag.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Klassifizierung und/oder Identifizierung
eines Pilzes der Gattung Aspergillus mit Hilfe dieses Antikörpers anzugeben.
Weiterhin besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Heilmittel gegen Aspergillose bereitzustellen,
das diesen Antikörper als Wirkstoff enthält.
Schließlich besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein oder mehrere Derivate dieses Antikörpers
bereitzustellen, die zur Klassifizierung und/oder Identifizierung sowie zur Heilung der oben bezeichneten Krankheiten
brauchbar sind.
Weitere Aufgaben, Ziele und Besonderheiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich, für Fachleute aus dem Studium der
nachstehenden detaillierten Beschreibung von nicht-einschränkend gemeinten besonderen Ausführungsformen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des gegen
Aspergillus gerichteten Antikörpers besteht darin, einen Hybridoma-Zellklon herzustellen aus einer den gegen Aspergillus
gerichteten Antikörper erzeugenden Zelle und aus einer in Subkultur gehaltenen Zelle, insbesondere einer Myelomazelle,
und aus dem von dem Hybridoma-Zellklon ausgeschiedenen Sekret den Antikörper zu isolieren.
Nachstehend wird das erfindungsgemäße Verfahren mehr im einzelnen
beschrieben.
A. Herstellung einer den Antikörper erzeugenden Zelle
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind zwei verschiedene
Zellen erforderlich, um einen Hybridoma-Zellklon zu erhalten,
welcher den gegen Aspergillus gerichteten Antikörper zu erzeugen vermag und sich dauerhaft in einer in vitro Subkultur
zu vermehren vermag. Bei diesen verschiedenen Zellen handelt es sich einmal um eine Zelle, welche den gegen einen zur Gattung
Aspergillus gehörenden Pilz gerichteten Antikörper zu erzeugen vermag, und weiterhin um eine solche Zelle, die man
dauerhaft in einer in vitro Subkultur halten kann.
Diejenige Zelle, welche den gegen Aspergillus gerichteten Antikörper
zu erzeugen vermag, kann man aus irgendeiner Tierspezies sowie aus dem Menschen erhalten. Eine Immunisierung des Tieres
ist nicht erforderlich, obwohl eine solche vorhergehende Immunisierung die Bildung und Ausbeute des angestrebten Hybridoma-Zellklons
merklich verbessern kann.
Sofern eine solche Zelle menschlichen Ursprungs ist, kann jede Person, die in der Vergangenheit an Aspergillose erkrankt ist,
oder die einen hohen Titerwert des auf einen Pilz der Gattung Aspergillus hinweisenden Serums aufweist, ausgewählt werden.
Nach einem alternativen Vorschlag kann diese Zelle einem lebenden Körper entnommen werden, der mit einem Immunogen immunisiert
worden ist. Das Immunogen kann eine lebensfähige Zelle sein,
weiterhin eine Zelle, die mit Glutaraldehyd, Mitomycin behandelt worden ist, oder einer Wärmebehandlung unterworfen "ord°r. ic~-
1 so daß sich diese Zelle nicht vermehren kann, oder es kann sich
I um das Oberflächen-Antigen handeln, das aus einer Zelle mittels !
einer entsprechenden Behandlung, beispielsweise mittels eines Enzyms, abgetrennt und daraufhin gereinigt worden ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung^kann irgendeine Spezies
aus der Gattung Aspergillus verwendet werden, und hierzu ist
irgendeine morphologische Gestalt aktzeptierbar, beispielsweise
Pilzhyphen, Sporen und dgl.. Zu Beispielen für solche Spezien gehören Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus
flavus oder Aspergillus oryzae.
Das zur Immunisierung verwendete Immunogen kann mit einem Adjuvants, wie etwa Freund1ε komplettem Adjuvants oder mit
einem nicht-vollständigen Adjuvants vermischt werden. Das Immunogen kann mittels irgendeiner üblichen Maßnahme verabreicht
werden, etwa durch subkutane, intraperitoneale, intravenöse, intradermale und intramuskuläre Injektionen. Vorzugsweise
wird eine subkutane oder intraperitoneale Injektion angewandt. Bereits eine einzige Immunisierungsbehandlung kann
ausreichend sein, obwohl die Immunisierung auch wiederholt durchgeführt werden kann, wobei zweckmäßigerweise ein angemessenes
Zeitintervall von beispielsweise 1 bis 5 Wochen zwischen aufeinanderfolgenden Immunisierungsbehandlungen vorgesehen
wird. Durch iMessung des Antikörpertiters im Serum des
immunisierten Tieres können solche Tiere ausgewählt werden, deren Titer ausreichend hoch ist; wird solchen Tieren die
Antikörper produzierende Zelle entnommen, so läßt sich eine
Verbesserung hinsichtlich Ausbeute und Effektivität der nachstehenden Verfahrensschritte erzielen. Vorzugsweise wird die
Zelle dem Tier am dritten oder fünften Tag nach der abschliessenden
Immunisierungsbehandlung entnommen. Diese den Antikörper erzeugende Zelle bildet einen Plasmozyten oder einen Lymphozyten,
welche als Vorgänger für die, den Antikörper erzeugende Zelle anzusehen sind; die Zelle kann jeder beliebigen Stelle des
Körpers entnommen werden, zumeist stammt sie aus der Milz, den Lymphknoten, dem peripheren Blut oder einer Kombination
dieser Ausgangsmaterialien.
- 17 B. Die Zellverschmelzung
Diejenige Zelle, die man dauerhaft in einer in vitro Subkultur halten kann, kann irgendeine geeignete Zelle sein, welche mit
der, den Antikörper erzeugenden Zelle verschmelzbar ist, um einen Hybridoma-Zellklon zu ergeben, der seinerseits in der
Lage ist, den angestrebten Antikörper zu erzeugen. Zu einer bevorzugten Sorte für solche Zellen gehören die Leukämie-Zellen,
wie etwa Myelomazellen. Solch eine Zelle kann irgendeiner
geeigneten Spezies entnommen werden, wie etwa dem Menschen, der Ratte, der Maus und dgl.. Vorzugsweise werden solche Zellen
verwendet, die einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
(HGPRT) oder an Thymidin-Kinase (TK) aufweisen, weil solche Stammzellen in dem ausgewählten Medium nicht
wachsen können.
Zu Beispielen für bevorzugte Zell-Linien gehören GM-1500,
6TG-A1-2 oder RPMI8226 menschlichen Ursprungs oder P3-X63-Ag8,
P3-NSI/l-Ag4-l, Sp2/0-Agl4, X63-Ag8.653 und dgl. von der Maus.
Vorzugsweise ist vorgesehen,daß sowohl die den Antikörper erzeugende
Zelle wie die in Subkultur haltbare Zelle der gleichen Spezies entstammen, obwohl das im Hinblick auf die Fähigkeit
zur Zellverschmelzung, im Hinblick auf die Stabilität der Eigenschaften der verschmolzenen Zellen und im Hinblick auf
die Durchführung der in vivo Kultivierung keine wesentliche •Voraussetzung darstellt. Insbesondere wenn die in Subkultur
haltbare Zelle den Zell-Linien P3-X63-Ag8, P3-NSI/l-Ag4-l, Sp2/0-Agl4 oder X63-Ag8.653 entstammt, dann wird als Spezies
vorzugsweise eine Inzucht-Balb/c-Maus oder eine Hybrid-Maus
davon vorgesehen.
Es kann ein Beschleuniger zur Durchführung der Verschmelzungsreaktion vorgesehen werden; zu geeigneten Beschleunigern gehören
das Sendai Virus (HVJ) und Polyathylenglykol; Vorzugs-
CÖPY
weise wird insbesondere Polyathylenglykol 1000, 1540, 2000, 4000 oder 6000 verwendet. Die Zellverschmelzungsreaktion kann
in einer Lösung durchgeführt werden, die angenähert 30 bis 55 % an solchem Polyathylenglykol enthält. Weiterhin kann in dieser
Lösung Dimethylsulfoxid enthalten sein.
C. Selektion des Hybridoma-Zellklons
Nach Durchführung der Zellverschmelzung sind in der Lösung zusätzlich zu den verschmolzenen Zellen die restlichen, den
Antikörper erzeugenden Stammzellen, und die in Subkultur haltbaren
Stammzellen vorhanden. Die ersteren können in der nachfolgenden
in vitro Kultur nicht .überleben, während sich die letzteren, zusammen mit den Zellen des angestrebten Hybridoma-Zellklons,
vermehren können.
Es ist deshalb vorzugsweise vorgesehen oder im Einzelfall sogar notwendig, die in Subkultur haltbaren Zellen aus der Lösung
zu entfernen, welche das Zellengemisch enthält. Zu diesem Zweck wird vorzugsweise als Stammzelle für die in Subkultur haltbare
Zelle eine Zelle mit einem Mangel an HGPRT oder TK eingesetzt, und das Zellengemisch, das auch diese Stammzellen enthält,
wird in einem ausgewählten Medium kultiviert, das nach der Zellverschmelzung Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält,
welche lediglich das ausgewählte Wachstum der angestrebten Hybridoma-Zellen zulassen. Nach einem alternativen Vorschlag
können die Stammzellen für die in Subkultur haltbaren Zellen, sofern sie keinen Mangel an HGPRT oder TK aufweisen, vor der
Zellverschmelzung mit Emetin und Actinomycin D behandelt werden. Nach einer solchen Behandlung kann sich die Stammzelle nicht
länger vermehren, und deshalb können die angestrebten Hybridoma-Zellen leicht aus dem Zellengemisch isoliert und abgetrennt
werden.
Die auf diese Weise erhaltenen Hybridoma-Zeilklone enthalten
zumeist zwei oder mehr Klone, die hinsichtlich der Gesamtheit ihrer Eigenschaften nicht übereinstimmen. Zur Auftrennung
in einzelne individuelle Klone ist Klonieren erforderlich und sogar wünschenswert/ wenn ein monoklonaler Antikörper angestrebt
wird. Das Klonieren ist auch zweckmäßig, um eine Änderung der Population zu verhindern, welche häufig in einer
Langzeit-Kultur auftreten kann, sofern in dem System eine Anzahl Klone vermischt ist. Das Klonieren kann auf verschiedene
Weise durchgeführt werden, etwa in einer Kultur mit beschränkter Verdünnung, in einer Weichagar-Kultur, oder in einer Fibringel-Kultur.
Weiterhin kann eine Vorrichtung zum Aussortieren von mittels Fluoreszenz-Marker aktivierten Zellen verwendet
werden, um die Zellen nach dem Klonieren aufzutrennen. Das
Klonieren kann weiterhin zweckmäßig sein, um mögliche Zellenvarianten
aufzutrennen, die im Verlauf der Langzeit-Kultur auftreten können, um zu gewährleisten, daß die Zellen die
gleichen Eigenschaften aufweisen, wie die ursprünglichen
Hybridoma-Zellen.
Der auf diese Weise erhaltene Hybridoma-Zellklon kann in einer in vitro Subkultur oder in einer in vivo Subkultur gehalten
werden, oder nach irgendwelchen bekannten Verfahren in Form von tiefgefrorenen Zellen aufbewahrt werden.
D. Erzeugung und Isolierung des Antikörpers
Zur Erzeugung des Antikörpers wird der, einen gegen Aspergillus
gerichteten Antikörper erzeugende Hybridoma-Zellklon in vitro oder in vivo kultiviert.
Zur in vitro Kultur wird eine geeignete Nährmittelbrühe für
den erfindungsgemäßen Hybridoma-Zellklon ausgewählt; hierfür
kann beispielsweise das Nährmedium RPMI 1640 dienen mit einem
Gehalt an 10 Vol.-% fetalem Rinderserum, mit 5 χ 10 M
ß-Mercaptoäthanol, 1 mM Natriumpyruvat und mit Antibiotika;
oder es kann anstelle von RPMI 1640 das nach Dulbecco modifizierte
Nährmedium Eagle's MEM (nachstehend kurz als Dulbecco1 s
MEM bezeichnet) vorgesehen werden, mit einem Gehalt an 4,5 g/L
Glukose. Eine geeignete Anfangs-Zellkonzentration für die Vermehrung
kann zumeist bei angenähert 10 Zellen/ml liegen, obwohl dieser Wert in Abhängigkeit von dem jeweiligen Hybridoma-Zellklon
schwanken kann; im Verlauf der Kultivierung kann die Zellkonzentration vorzugsweise bis zu einem Wert von etwa
2 x 10, Zellen/ml gesteigert werden.
Zur Durchführung der in vivo Kultur wird der Hybridoma-Zellklon
in einen lebenden Körper transplantiert und wächst dort in fester Form oder in der Aszites-Flüssigkeit. Dem lebenden Körper
wird daraufhin Körperflüssigkeit, vorzugsweise Serum oder Aszites-Flüssigkeit entnommen, um den von den Hybridoma-Zellen
ausgeschiedenen Antikörper zu isolieren. Die daraufhin erhaltene Rohlösung des Antikörpers kann als Verunreinigungen (Begleitstoffe)
verschiedene Substanzen enthalten, die aus dem lebenden Wirtskörper stammen; trotzdem verdient dieses Verfahren
die größere Aufmerksamkeit, weil eine höhere Konzentration an dem angestrebten Antikörper gegenüber der in vitro erhaltenen
Antikörperlösung erhältlich ist. Sofern die Hybridoma-Zellen in den Bauchraum des Wirtstieres, also intraperitoneal transplantiert
werden, kann vor dieser Transplantation, vorzugsweise
3 bis 9 Wochen vor dieser Transplantation, intraperitoneal Pristan(2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) verabreicht werden.
Diese Behandlung kann die Ausbeute an roher Antikörperlösung erhöhen, obwohl sie keine wesentliche Voraussetzung darstellt.
Als Wirt ist vorzugsweise ein Tier der gleichen Spezies und der gleichen Inzucht-Linie vorgesehen, wie dasjenige Tier,
aus welchem die Stammzelle oder die Stammzellen stammen; in einem solchen Falle können die Hybridoma-Zellen in dem Tier
selbst dann wachsen, wenn keine besondere Behandlung vorgenommen worden ist. Sofern die Serotypen der histologischen
Kompatibilität des Antigens zwischen den Hybridoma-Zellen und den Wirtszellen nicht miteinander übereinstimmen, dann
ist es erforderlich, den Wirt einer Vorbehandlung zu unterziehen,
beispielsweise durch Verabreichung von Antilymphozyten-Antikörpern
oder durch Röntgenbestrahlung. Die Zellen beginnen 1 bis 3 Wochen nach der Transplantation zu wachsen.
Zu den erhaltenen Antikörpern gehören solche Antikörper, die mit Aspergillus fumigatus reagieren; ferner solche Antikörper,
die mit anderen Stämmen der Gattung Aspergillus reagieren, wie etwa Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae und Aspergillus
niger, sowie mit Aspergillus fumigatus; ferner können auch Antikörper auftreten, die mit anderen Pilzen reagieren.
So ist beispielsweise festgestellt worden, daß solche Antikörper, die durch Absorption des aus mit Aspergillus fumigatus
immunisierten Kaninchen erhaltenen Antiserums mit Aspergillus flavus erhalten wurden, sowohl mit Aspergillus fumigatus wie
mit den anderen Stämmen der Gattung Aspergillus reagieren. Weiterhin ist festgestellt worden, daß solche Antikörper, die
durch Absorption des Antiserums durch Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger erhalten wurden, einen
sehr niedrigen Titer aufweisen und selten mit Aspergillus fumigatus reagieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können so, wie sie in der
rohen Antikörperlösung enthalten sind, verwendet werden; oder diese Antikörper können gereinigt werden, wozu irgendwelche
für Immunoglobulin geeigneten Verfahren brauchbar sind, zum Beispiel die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat oder die Ionenaustausch-Chromatographie,
oder die Affinitäts-Chromatographie mit Protein A oder mit einem Antigen. Solche gereinigten Antikörper
können unabhängig voneinander verwendet werden, oder es kann ein Gemisch solcher Antikörper eingesetzt werden.
Dank des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des
gegen Aspergillus gerichteten Antikörpers können die den bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile im wesentlichen über-
wunden werden. So kann der erfindungsgemäße Hybridoma-Zellklon
in Subkultur gehalten werden, so daß sich die Hybridoma-Zellen
im wesentlichen dauerhaft sowohl in vitro wie in vivo vermehren. Weiterhin kann der Hybridoma-Zellklon einen Antikörper erzeugen,
der eine spezifische als Antigen wirkende Determinante darstellt. Der erzeugte Antikörper kann deshalb monoklonale
Spezifität aufweisen und bildet einen gegen einen Pilz der Gattung Aspergillus gerichteten bzw. wirksamen Antikörper und
besteht im wesentlichen aus einer einzigen molekularen Spezies. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Erzeugung einer
notwendigen Menge des Antikörpers in Abhängigkeit von dem Bedarf und vermeidet Schwankungen zwischen einzelnen Partien
bzw. Ansätzen; weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung einer Lösung, welche den Antikörper in hohem
Titer enthält. Zusätzlich erfordert das Verfahren keine mühsamen Absorptionsschritte, die bei den bekannten Verfahren
unausweichlich waren. Auf der anderen Seite kann das nichtgereinigte Antigen als solches, etwa der zur Gattung Aspergillus
gehörende Pilz als solcher verwendet werden, und auch in einem solchen Falle kann ein hochspezifischer Antikörper erhalten
werden. Diese hohe Reaktivität des Antikörpers mit einem Antigen erlaubt eine rasche Identifizierung eines zur Gattung Aspergillus
gehörenden Pilzes mit hoher Zuverlässigkeit, ohne die bekannten mühsamen Verfahrensmaßnahmen. Darüberhinaus ist die
Reinheit des Antikörpers so hoch, daß allergische Reaktionen aufgrund der in den herkömmlichen Präparaten unausweichlich
enthaltenen Begleitstoffe selten auftreten, so daß entsprechende Präparate als Heilmittel-gegen Aspergillose eingesetzt
werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klassifizierung und/oder
Identifizierung kann auf ein Subjekt irgendwelchen Ursprungs angewandt werden. Zum Beispiel können die Pilzzellen aus klinischen
Materialien wie etwa Sputum und dgl. vom Gewebe abgetrennt werden, das einem Patienten entstammt, der aus medi-
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zinischer Sicht möglicherweise an Aspergillose erkrankt ist;
entsprechende Pilzzellen werden daraufhin kultiviert.
Zur Identifizierung wird ein Reagenz, das den erfindungsgemäßen
Antikörper enthält, in Berührung mit einem Subjekt gebracht, das seinerseits Zellen von Pilzender Gattung Aspergillus
enthält. Üblicherweise erfolgt der Nachweis mittels der Immunofluoreszenzmikroskopie, der Immuno-Elektronenmikroskopie,
durch einen Assay auf der Basis der Kopplung mit einer radioaktiven Substanz, durch Enzym-Immuno-Assay, durch einen
Komplement-Fixierungs-Test und dgl.. Beim direkten Arbeiten mit dem Immunofluoreszenz-Mikroskop wird der erfindungsgemäße
Antikörper zweckmäßigerweise eingesetzt, nachdem er mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie etwa Fluoreszin oder Rhodamin
markiert worden ist. Nach einem anderen einfachen Verfahren kann der erfindungsgemäße Antikörper eingesetzt werden, nachdem
er mit einem Marker für die Immuno-Elektronenmikroskopie wie
etwa Ferritin markiert worden ist; oder der Antikörper kann mit einem Radioisotop wie Jod-125 oder Jod-138 markiert werden,
um den Assay auf der Basis radioaktiver Kopplung durchzuführen; oder der Antikörper kann mit einem Enzym wie etwa Peroxidase,
Alkali-Phosphatase oder ß-Galactosidase markiert werden,
um einen Enzym-Immuno-Assay durchzuführen. Weiterhin kann
ein indirekt arbeitendes Verfahren mit Hilfe eines sekundären Antikörpers oder dessen Kopplungsprodukt als Substitut vorgesehen
werden; z.B. kann ein mit Biotin gekennzeichneter, gegen Aspergillus gerichteter Antikörper zusammen mit Avidin als
sekundärer Antikörper eingesetzt werden. Weiterhin kann anstelle der Verwendung des Antikörpers an sich lediglich ein Bestandteil
des Antikörpers verwendet werden, der durch restriktive Spaltung nach Behandlung mit einer chemischen Substanz und/
oder mittels eines Enzyms wie etwa F(ab')2 erhalten worden
ist. Derartige verschiedene Derivate oder Restriktionsprodukte sind ebenfalls brauchbar zur Durchführung der erfindungsgemäßen
Klassifizierungs- oder/oder Identifizierungs-Verfahren, und sollen deshalb ebenfalls von der vorliegenden Erfindung
umfaßt sein.
Sofern das erforderlich ist, kann der Antikörper, dessen Derivate und Restriktionsprodukte zur Anwendung vermischt
werden. Weiterhin kann das zur Durchführung der Klassifizierung und/oder Identifizierung vorgesehene Reagenz einen
Träger oder ein übliches Lösungsmittel enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Keilmittel
gegen die Aspergillose irgendeines Körperteiles, z.B. der Lunge, wenn diese mit einem Pilz der Gattung- Aspergillus
wie etwa Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus und Aspergilluos oryzae infiziert ist.
Die Heilwirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels kann
abgeschätzt und so eingestellt werden, um Schutz vor einer tödlichen Infektion mit einem Pilz der Gattung Aspergillus
zu gewährleisten, wie das nachstehend in den Beispielen beschrieben ist. Es wird vermutet, daß der Mechanismus der
Schutzwirkung darauf beruht, daß eine Beschleunigung der Komplement-Fixierungs-Reaktion und ein Angriff der Makrophagen
und/oder anderen Immunozyten auf den Pilz der Gattung Aspergillus stattfindet, nachdem der verabreichte Antikörper an das Oberflächen-Antigen
des Pilzes gebunden ist. Diese Reaktionen können selbst unter in vitro Bedingungen bestätigt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können unabhängig voneinander
als solche verabreicht werden, oder es kann ein Gemisch dieser erfindungsgemäßen Antikörper verabreicht werden. Vorzugsweise
wird der Antikörper verabreicht, nachdem er chemisch mit einem keimtötenden Mittel oder einem Antipilzmittel wie
etwa Amphotericin B, 5-Fluorocytosin, Nystatin oder Griseofulvin kombiniert worden ist, weil die Verwendung nur des
Antikörpers als solchem eine etwas geringere Wirkung hat. Weiterhin kann als das erfindungsgemäße Heil- bzw. Arzneimittel
anstelle des Antikörpers selbst ein Bestandteil dieses Antikörpers verwendet werden, der aus dem Antikörper durch
restriktive Spaltung durch Behandlung mit einer chemischen
Copy
BAD ORIGINAL
Substanz oder mit einem Enzym, beispielsweise Fiab.')- erhalten
worden ist. In diesem Falle kann die Gefahr vermieden
werden, daß das Wirtsgewebe durch eine nicht-spezif i schc-Komplement-Fixierungs-Reaktion
oder dgl. beeinträchtigt oder geschädigt wird. Auch diese Derivate (sowie Kombinationspräparate mit einem Antipilzmittel oder mit einem keimtötenden
Mittel) und die entsprechenden Restriktionsprodukte können entweder unabhängig voneinander als solche eingesetzt werden,
oder sie können als ein Gemisch verschiedener Derivate und/ oder Spaltungsprodukte eingesetzt werden, um das erfindungsgemäße
Heilmittel 2u ergeben.
Zur Abschätzung der akuten Toxizität der Antikörper, ihrer Derivate und Restriktionsprodukte wurde das erfindungsgemäße
Heilmittel drei Gruppen (bestehend aus jeweils 10 Tieren) von ICR-Mäusen verabreicht; der ersten Gruppe wurde das Heilmittel
in einer Menge von 2 g/kg peroral verabreicht; der zweiten Gruppe wurde das Heilmittel in einer Menge von 400 mg/kg intraperitoneal
verabreicht, und der dritten Gruppe wurde das Heilmittel in einer Menge von 200 mg/kg intravenös verabreicht;
in keinem Falle wurde innerhalb von 14 Tagen ein Todesfall festgestellt. Aufgrund dieser Ergebnisse kann das erfindungsgemäße
Heilmittel als sicheres Heilmittel bzw. Arzneimittel zur Behandlung von Infektionskrankheiten angesehen werden, die
von Pilzen der Gattung Aspergillus verursacht werden.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann subkutan, intramuskulär
oder intravenös verabreicht werden; vorzugsweise wird die subkutane oder intramuskulöse Injektion angewandt. Das Arzneimittel
kann sogar peroral verabreicht werden, da ein Teil des verabreichten Mittels im Verdauungstrakt absorbiert werden
.kann und trotzdem seine Struktur als Antikörper beibehält, wie entsprechende Untersuchungen durch die zur vorliegenden Erfindung
benannten Erfinder bestätigt haben. Ein Injektions-
Präparat kann beispielsweise dadurch erhalten werden, das
10 mg des Antikörper ε (..<.·■ r dessen Derivat zusammen mit 50 mg
Mannitol, in 10 ml destilliertem Kasser gelöst oder suspendiert
werden, gefolgt von einer üblichen Sterilisierungsbehandlung;
daraufhin wird in Ampullen von je 2 ml abgefüllt und gefriergetrocknet. Zur Anwendung wird das erhaltene
Produkt in Salzlösung gelöst oder suspendiert. Ein solches Injektions-Präparat kann zusätzlich zu dem Antikörper einen
Träger, ein Verdünnungsmittel, eine Puffersubstanz, einen
Stabilisator, ein isotonisches Mittel und dgl. enthalten; diese Mittel und Zusätze sind in der Fachwelt bekannt. Das
Injektions-Präparat kann zur subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektion konfektioniert werden. Ein
oral verabreichbares Mittel kann nach bekannten Verfahren zur Herstellung von im Darm löslicher Präparate hergestellt
werden. Die Dosis des erfindungsgemäßen Heilmittels kann hauptsächlich in Abhängigkeit von den Symptomen ausgewählt
werden und liegt zumeist im Bereich von 0,001 mg bis 10 g. pro Tag und pro kg Körpergewicht bei einem Tier wie etwa
der Maus, und liegt zur Behandlung des Menschen etwa im Bereich von 0,01 bis 3 000 mg pro Tag und kg Körpergewicht.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken.
Beispiel 1:
(1) Herstellung des Immunogens
Aspergillus fumigatus IAM 3006 wurde auf eine Kartoffeldextrose-Medium
enthaltende Schräg-Agarkultur übertragen und dort 2 Wochen lang bei 25°C inkubiert. Anschließend
wurden Hyphen und Sporen mittels einer Platindrahtschleife gesammelt und in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS,
pH 7,2) (die 0,01 % Tween 80 enthielt) suspendiert. Nach
BAD ORIGINAL
Entfernung der Zellen wurde bei 4°C 10 min lang bei 1000 χ g
zentrifugiert, um ein Pellet aus Sporen zu erhalten. Dieses
Waschverfahren wurde 4 mal wiederholt, und daraufhin die
Konzentration mit PBS auf 5 χ 10 Sporen/ml eingestellt; diese Immunogensuspension wurde für die nachfolgenden Untersuchungen
verwendet.
(2) Herstellung einer Antikörper erzeugenden Zelle
Weiblichen, 8 Wochen alten Balb/c-Mäusen (Nihon Charles
Liver, Japan) wurden jeweils 0,2 ml dieser Immunogensuspension intravenös verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren.
Die Immunisierung wurde alle 14 Tage wiederholt, und am 42. Tag nach Beginn der Immunisierungsbehandlung erfolgte eine
Booster-Immunisierung durch intravenöse Verabreichung von 0,2 ml Immunogensuspension. 3 Tage nach der Booster-Immunisierung
wurde den durch Blutentzug zu Tode gebrachten Mäusen auf einer sauberen Bank (Hitachi Ltd., Japan) die Milz unter
aseptischen Bedingungen entfernt. Die Milz wurde in eine Petrischale gegeben, welche RPMI 1640-Medium enthielt, und mittels
einer Pinzette in feine Teilchen zerteilt; diese wurden mild pipettiert und durch ein rostfreies Sieb filtriert, um eine
Suspension der Milzzellen zu erhalten. Im Anschluß an die Zentrifugierbehandlung
(10 min lang bei 500 χ g) wurden 1,7 mM tris-HCL-Puffer-Lösung (pH 7,65) zugesetzt, welche 0,747 %
Ammoniumchlorid enthielt, um das gebildete Zellpellet zu suspendieren, und um Erythrozyten zu lysieren und zu entfernen.
Die zurückbleibende Suspension der Milzzellen wurde erneut 3 min lang bei 500 χ g zentrifugiert. Nachdem das Zellpellet
3 mal mit RPMI 1640 gewaschen worden war, wurde die Zellkonzentrat
stellt.
zentration durch Zusatz von RPMI 1640 auf 10 Zellen/ml einge-
BAD ORfGIlSJAL
(3) Zellverschmelzung zur Bildung des Hybridoma-Zcllklons
1 xlO Zellen der nach (2) erzeugten Zellsuspension wurden
mit 1 χ 10 Mäuse-Myelomazellen der Zeil-Linie Sp2/0-Agl4
vermischt, welche vorher in vitro kultiviert worden sind. Nachdem das Zellengemisch 5 min lang bei 500 χ g zentrifugiert
worden war, wurde der Überstand verworfen, um ein Zellpellet zu erhalten. Nachdem das Zellpellet durch vorsichtiges
Benetzen des Gefäßbodens gelöst worden war, wurde in das Gefäß 1 ml RPMI 1640 gegeben, das 50 Vol.-% Polyäthylenglykol
4000 (bei 37°C) enthielt; daraufhin ließ man den Ansatz 1 min lang stehen. Das Gefäß wurde daraufhin in einen
thermostatisierten, bei 37°C gehaltenen Ofen gebracht und
1 min lang sanft gedreht, um die Polyäthylenglykol-Lösung mit dem Zellpellet zu vermischen. Insgesamt 10 ml bei 37 C
gehaltenes RPMI 1640 wurde dem Gemisch zugesetzt (jeweils
1 ml in 30 see) und das erhaltene Gemisch 5 min lang bei
500 χ g zentrifugiert. Der überstand wurde verworfen, und
daraufhin das Zellpellet in RPMI 1640 erneut suspendiert und 5 min lang bei 500 χ g zentrifugiert. Dieses Waschverfahren
wurde noch einmal wiederholt. Daraufhin wurde das gebildete Zellpellet in 20 ml HAT-Medium (das ist RPMI
1640-Medium mit einem Gehalt an 20 % fetalem Rinderserum,
2 mM Glutamin, 1 mM Brenzt^-Tjraubensäure, 4,5 g/L Glukose,
5 χ 10~5 M ß-Mercaptoäthanol, 1 χ 10~4 M Hypoxanthin, 4 χ 10~7 M
Aminopterin, 1,6 χ 10 M Thymidin und 50 mg/L Kanamycin-Sulfat)
suspendiert, das bei 37°C gehalten war. Die erhaltene Zellsuspension wird auf die 96 Näpfchen einer Kulturplatte (Nunc
167008, Nunc Inc., Dänemark) verteilt, wobei in jedes Näpfchen 100 ul gelangten; daraufhin wurde bei 37 C in einem 5 %
C0? enthaltenden Inkubator inkubiert. 24 h nach Aufnahme der
Inkubierung wurden in-jedes Näpfchen 100 μΐ HAT-Medium gefüllt.
Die Inkubierung wurde fortgesetzt, wobei nach jeweils 2 bis
3 Tagen aus jedem Näpfchen 100 ^jI Medium entfernt und durch
. 100 pl frisches HAT ersetzt wurden; daraufhin wurden die in
dem HAT vermehrungsfähigen Hybridoma-Zellklone ausgewählt.
2 Wochen nach Aufnahme der Inkubierung wurde Wachstum der Hybridoma-Zellen festgestellt,und die Bildung der Antikörper
in dem Überstand jedes Näpfchens wurde entsprechend dem nachstehend beschriebenen Verfahrensschritt (4) geprüft.
(4) Selektieren und Klonieren der Antikörper erzeugenden Hybridoma-Zellen
Zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern im Überstand jedes Näpfchens wurde ein Enzym-Immuno-Assay angewandt. Im
einzelnen wurde Aspergillus fumigatus IAM 3006 auf Sabouraud's
Dextrose-Kulturbrühe übertragen und unter Schütteln 3 Wochen lang bei 25°C inkubiert. Nachdem man 15 min lang
bei 1000 χ g zentrifugiert hatte, wurde der gebildete Überstand
durch-ein Membranfilter (0,45 um) filtriert, und das
Filtrat in ein Dialyserohr gegeben; es wurde 4 Tage lang bei 4°C gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei die
Dialyse-Flüssigkeit 1 mal pro Tag gegen frisches destilliertes Wasser ausgetauscht wurde. Nach Abschluß der Dialyse
wurde das gebildete Dialysat gefriergetrocknet, um ein rohes
Antikörperpulver zu erhalten, das wiederum in PBS gelöst und auf eine Konzentration von 100 ug/ml eingestellt wurde. 50 μΐ
der erhaltenen Lösung wurden in jedes Näpfchen einer 96 Näpfchen umfassenden Kulturplatte (Nunc-Immunoplate I, Nunc Inc.,
Dänemark) gegeben; daraufhin ließ man über Nacht bei 4°C ruhen. Nachdem man 3 mal mit PBS (das 0,05 % Tween 20 enthielt)
gewaschen hatte, wurde eine Antigen-Platte erhalten.
Zu jedem Näpfchen dieser gewaschenen Antigenplatte wurden 100 jil der Subjekt-Lösung (das ist der Überstand in jedem
Näpfchen) hinzugefügt; daraufhin ließ man 1 h lang bei 37°C reagieren. Nachdem man jedes Näpfchen 3 mal mit PBS (das
0,05 % Tween 20 enthielt) gewaschen hatte, wurden 50 ^jI
einer Lösung von Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper, der
an aus Meerrettich isolierter Peroxidase (Cappel Corp., USA) gebunden war, in 1000-fach verdünntem Pferdeserum in jedes
Näpfchen gegossen; man ließ 1 h lang bei 37oc reagieren.
Im Anschluß an diese Umsetzung wurde jedes Näpfchen 5 mal
mit PBS (das 0,05 % Tween 20 enthielt) gewaschen; daraufhin wurde in jedes Näpfchen 100 ul einer 0,1 M Citrat-Pufferlösung
(pH 4,5) gegeben, die 1 mg/ml o-Phenylendiamin und
0,04 Vol.-% einer 31 %-igen wässrigen Wasserstoffperoxid-Lösung
enthielt; anschließend ließ man 30 min lang bei
Raumtemperatur reagieren. Durch Zugabe von 50 ul 12,5 %-iger Schwefelsäure in jedes Näpfchen wurde die Enzymreaktion gestoppt';
die Messung der Absorption bei 492 nm bestätigte
eine Antikörperbildung in 15 Näpfchen der insgesamt 192
Näpfchen.
Daraufhin wurden die Hybridoma-Zellen in solchen Näpfchen, für welche Antikörperbildung festgestellt worden war, kloniert.
Im einzelnen wurden als Nährzellen dienende Milzzellen
in gleicher Weise, wie oben unter (2) beschrieben, der Milz von nicht-behandelten (als Kontrolle dienenden)
weiblichen Balb/c-Mäusen entnommen, und die Zellkonzentra-'tion
mit HAT auf 5 χ 10 Zellen eingestellt. Die oben bezeichneten Hybridoma-Zellen wurden der erhaltenen Milzzellensuspension
in einem Anteil von 2 Zellen/ml zugesetzt und
sorgfältig umgerührt. Daraufhin wurden 100 ul des Zellengemisches in jedes Näpfchen einer 96 Näpfchen umfassenden
Kulturplatte (Nunc 167008, Nunc Inc., Dänemark) übertragen. Nach 24 h gibt man in jedes Näpfchen 100 ul HAT und inkubiert
bei 37 C in einem 5 % CO^ enthaltenden Inkubator.
Nach 2 Wochen langem Klonieren wurde Wachstum der Hybridoma-Zellen
festgestellt; die Anwesenheit von Antikörpern im
Überstand jedes Näpfchens wurde in der oben angegebenen
Weise geprüft. Durch dieses Klonieren wurden aus jedem Näpfchen 2 bis 70 Antikörper erzeugende Hybridoma-Zellklone erhalten.
Aus diesen Hybridoma-Zellklonen wurden beständige Klone ausgewählt, die eine große Menge Antikörper zu erzeugen
vermochten und die eine hohe Vermehrungsrate aufwiesen; diese
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ausgewählten Hybridoma-Zellklone wurden in der oben angegebenen
Weise erneut kloniert, um die Antikörper erzeugenden Hybridoma-Zellklone
mit den Bezeichnungen AS-I, AS-2 und AS-3
zu erhalten.
(5) Erzeugung des Antikörpers (in vitro Kulturen)
Die Hybridoma-Zellklone AS-I, AS-2, oder AS-3 wurden in
RPMI 1640-Medium suspendiert, das 20 % fetales Rinderserum, 2 inM Glutamin, ImM Brenztraubensäure, 4,5 g/L Glukose,
5 χ 10 M ß-Mercaptoäthanol und 50 mg/L Kanamycinsulfat
enthielt; es wurde eine Zellkonzentration von 1 χ 10 Zellen/ml eingestellt. Die erhaltene Suspension (25 ml) wurde in
einen 75 ml Kulturkolben (Corning Glass Works, USA) gegeben und bei 37°C in einem 5 % CO2 enthaltenden Inkubator inkubiert.
Am 4. Tag'wurde die Kultur, die unter angenähert stationärem
Zustand gewachsen war, und der Überstand dem Kolben entnommen. Die Zahl der gezüchteten Zellen betrug angenähert
2 χ 10 /ml, und der Antikörper-Gehalt des ÜberStandes betrug
2,5 jig/ml (für AS-I), bzw. 3,1 jag/ml (für AS-2) und 1,4 ug/ml
(für AS-3).
(5') Erzeugung des Antikörpers (in vivo Kultur)
Balb/c-Mäusen wurde Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpendadecan)
in einer Menge von 0,5 ml intraperitoneal injiziert; am 10. bis 30. Tag nach dieser Injektion wurde diesen Mäusen 5 χ 10 Zellen
des Hybridoma-Zellklons AS-I, AS-2, oder AS-3, die in vitro Kultur vermehrt worden waren, intraperitoneal verabreicht.
Nach Verlauf von 2 bis 3 Wochen wurde die Aszites-Flüssigkeit
der Mäuse gesammelt und bei 4°C 15 min lang bei 1000 χ g zentrifugiert, wobei ein Aszites-Überstand erhalten wurde. Pro Hybridoma-Zellklon
wurden aus 10 Mäusen angenähert 30 ml Aszites-Überstand gewonnen, dessen Antikörper-Gehalt 1,5 mg/ml (für
AS-I), bzw. 3,1 mg/ml (für AS-2) und 2,7 mg/ml (für AS-3) betrug.
BAD ORIGINAL
- 32 (6) Spezifität und Eigenschaften des Antikörpers
Spez i fität:
Jeweils ein Stamm von Aspergillus fumigatus IAM 3006, Aspergillus
fumigatus IFO 5840, Aspergillus fumigatus IFO 4057, Aspergillus flavus IAM 3003, Aspergillus niger IAM 2093, und
Aspergillus oryzae IAM 2600 wurde auf ein Kartoffeldextrose-Mediun
übertragen und unter Schütteln 3 Wochen lang bei 25 C m-kubiert, um einen jeweiligen Überstand zu erzeugen.
Entsprechend dem oben unter (4) angegebenen Verfahren wurde eine A.ntigen-Platte präpariert; in den Näpfchen dieser Platte
wurde die Umsetzung mit den Antikörpern durchgeführt, die in
den Überständen der in vitro Kulturen der Hybridoma-Zellklone AS-I, AS-2, und AS-3 enthalten waren. Die dabei erhaltenen
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt.
Eigenschaften;
50 ul einer Lösung von Antimaus-IgG-Antikörpern, Antimaus-IgA-Antikörpern
und Antimaus-IgM-Antikörpern (Miles, USA) wurden mit 0,1 M Natriumbicarbonat-Lösung auf das 100-fache
verdünnt und daraufhin in jedes Näpfchen einer 96 Näpfchen ■
umfassenden Kulturplatte (Nunc-Immunoplate I, Nunc, Dänemark)
gegeben; daraufhin ließ man 24 h lang bei 4°C ruhen. Anschliessend wurde jedes Näpfchen sorgfältig mit PBS (das 0,05 %
Tween 20 enthielt) gewaschen; daraufhin wurden in jedes Näpfchen 100 pl des Überstandes der Hybridoma-Kulturen AS-I,
AS-2 oder AS-3 gegeben, die man entsprechend obigem Verfahrensschritt (5) erhalten hatte; daraufhin wurde 1 h lang bei
37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde jedes Näpfchen 3 mal mit PBS, das 0,05 % Tween 20 enthielt, gewaschen;
daraufhin wurde in jedes Näpfchen 50 ul einer Lösung
von Antimaus-Immunoglobulin-Antikörpern, der an aus Meerrettich isolierter Peroxidase gebunden war (Cappel, USA)
in 1000-fach verdünntem Pferdeserum gegeben; daraufhin wurde
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1 h lang bei 37 C inkubiert. Nachdem man jedes Näpfchen
5 mal mit PBS (das 0,05 % Tween 20 enthielt) gewaschen hatte, wurde in jedes Näpfchen 100 μλ 0,1 M Citrat-Puffer-Lösung
(pH 4,5) gegeben, die 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,04 Vol.-% einer 31 %-igen wässrigen Wasserstoffperoxid-Lösung
enthielt; daraufhin wurde 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 12,5 %-iger Schwefelsäure
wurde die Enzymreaktion in jedem .Näpfchen gestoppt; daraufhin wurde die Absorption bei 492 nm gemessen, um den gebildeten
Antikörper zu identifizieren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Beispiel 2:
(1) Herstellung des Immunogens
Aspergillus fumigatus IAM 3006 wurde auf Czapek-docks-Kulturbrühe
übertragen und unter Schütteln 3 Wochen lang bei 25 C kultiviert. Nachdem man 15 min lang bei 1000 χ g
zentrifugiert hatte, wurde der Überstand gesammelt und durch ein Membranfilter (0,45 um) filtriert. Das Filtrat wurde in
ein Dialyserohr gegeben, und es wurde bei 4 C 4 Tage lang gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei man die Dialyseflüssigkeit
an jedem Tag gegen frisches destilliertes Wasser austauschte. Nach Beendigung der Dialyse wurde das Dialysat
lyophilisert, wonach man ein rohes Antigenpulver erhielt, das anschließend erneut in PBS gelöst wurde; mit PBS wurde auf
eine Zellkonzentration von 100 jag/ml eingestellt. Die erhaltene Lösung diente für die nachstehenden Untersuchungen als Immunogen-Lösung.
- 34 - \2) Herstellung der Antikörper erzeugenden Zelle
Ein Gemisch aus dieser Ir.munogen-Lösung und Freund's
komplettem Adjuvant wurde 8 Wochen alten, weiblichen CDF,-Mäusen
(Nippon Krea, Japan) in einem Anteil von 0,2 ml pro Maus subkutan verabreicht, um die Tiere zu immunisieren.
Nach jeweils 2 Wochen wurde diese Immunisierungsbehandlung der Mäuse zweimal wiederholt. Am 70. Tag nach Beginn der
Immunisierungsbehandlung erfolgte eine Booster-Immunisierung durch intravenöse Verabreichung von 0,2 ml Lösung. Am 3. Tag
nach der Booster-Immunisierung wurde den durch Blutentzug zu Tode gebrachten Mäusen auf einer sauberen Bank (Hitachi Ltd.,
Japan) die Milz und die mesenterischen Lymphknoten unter
aseptischen Bedingungen entnommen. Die Milz und die mesenterischen Lymphknoten wurden in eine, Dulbecco's MEM-Medium
enthaltende Petrischale gegeben und zerkleinert; analog zu den Angaben in Beispiel 1 (2) wurde eine Milzzellensuspension
in einer Konzentration von 1 χ 10 Zellen/ml erzeugt.
(3) Zellverschmelzung zur Herstellung eines Hybridoma-Zellklons
1 χ 10? Mäuse-Myeloma-Zellen aus der Zeil-Linie P3-X63-Ag8,
die vorher in vitro gezüchtet worden waren, wurden mit 1 χ
Zellen aus dieser Milzzellensuspension vermischt, das Zellengemisch
5 min lang bei 500 χ g zentrifugiert, und der Überstand
verworfen, um ein Zellpellet zu erhalten. Nachdem das Pellet durch vorsichtiges Benetzen des Gefäßbodens gelöst worden
war, wurde auf eine Temperatur von 37 C eingestellt. Im Verlauf von angenähert 1 min wurde allmählich 1 ml Dulbecco's
MEM-Medium zugesetzt, das 45 % Polyäthylenglykol 4000 (37°C) enthielt. Es wurde 7 min lang bei 37°C gehalten, und daraufhin
wurden im Verlauf von angenähert 5 min weitere 15 ml Dulbecco's MEM (37°C) hinzugefügt, während das Gefäß langsam gedreht
wurde. Daraufhin wurden nochmals angenähert 25 ml Dulbecco's MEM hinzugefügt, und 5 min lang bei 500 χ g zentrifugiert;
daraufhin wurde der Überstand verworfen.
BAD ORIGINAL
Dem gebildeten Zellpellet wurde Dulbecco's MEM zugesetzt,
das 10 % fetales Rinderserum (37°C) enthielt; nachdem au? eine Zellkonzentration von 1 χ 10 Zellen/ml eingestellt
worden war, wurde in einer Pipette sanft vermischt; jeweils 1 χ 10 Zellen wurden in jedes Näpfchen einer 24 Näpfchen
umfassenden Kulturplatte (Nunclon, Nunc, Dänemark) gegeben und bei 37 C in einem 5 % C0„ enthaltenden Inkubator
inlcubiert. 24 h nach Beginn der Inkubation wurde in jedes Näpfchen 1 ml HAT gegeben. Im Verlauf der Kultivierung
wurde an jedem zweiten oder dritten Tag 1 ml Medium aus jedem Näpfchen entfernt und durch 1 ml frisches HAT ersetzt.
Auf diese Weise wurde ein Hybridoma-Zellklon selektiert, der sich in HAT-Medium vermehren konnte.
Nach Verlauf von 2 Wochen nach Beginn der Inkubation konnte ein Wachstum der Hybridoma-Zellen festgestellt werden; die
im Überstand jedes Näpfchens enthaltenen Antikörper wurden entsprechend dem in Beispiel 1 (4) angegebenen Verfahren
untersucht; unter den insgesamt 48 Näpfchen konnte in 21 Näpfchen die Bildung von Antikörpern bestätigt werden.
(4) Nachweis des Antikörper bildenden Hybridoma-Zellklons
Mittels einer Schräg-Agarkultur wurden die Antikörper bildenden Hybridoma-Zellklone aus den 21 Näpfchen kloniert.
Im einzelnen wurden bei 45°C 30 ml 2,5 %-iger Agar (Difco, Deutschland) und 3 ml Dulbecco's MEM von 10-facher Konzentration
miteinander vermischt, und diesem Gemisch 117 ml Dulbecco's MEM (ebenfalls von 45°C) zugesetzt. Dieser Agar-Lösung
wurden die Milzzellen von nicht-behandelten (zur Kontrolle eingesetzten) 8 Wochen alten, weiblichen CDF1-Mäusen
5
in einer Menge von 5 χ 10 Zellen/ml als Nährzellen zugesetzt-In jeweils eine Petrischale (Durchmesser 10 cm, Falcon 3003,
COPY
Becton-Dickinson, USA) wurden jeweils 10 ml dieser Agar-
Lös-jr.g eingebracht; daraufhin ließ man 15 min lana bei
i
j Raumtemperatur zur Gelbildung stehen. Etwa 2 ml Hybridoma-
Zellensuspension aus jedem Näpfchen, das eine positive
ι Antikörperbildung gezeigt hatte, und die gleiche Menge
Dulbecco's MEM, das 0,5 % Agar enthielt, wurden miteinander
j vermischt, und jeweils 2 ml .dieses Gemisches wurden auf
j das nach obiger Vorschrift erhaltene Gel gegeben, wobei
die Zellen gleichmäßig auf der Gelschicht verteilt wurden. Das Inkubieren erfolgte bei 37°C in einem 5 % C0~ enthaltenden
Inkubator. Am 10. Tag nach Beginn der Inkubierung wurden die auf der Schräg-Agarkultur wachsenden Kolonnien mittels
einer Pasteur-Pipette gesammelt und auf die 96 Näpfchen mit flachem Boden einer Kulturplatte verteilt; in jedes Näpfchen
wurden 0,2 ml Dulbecco's MEM gegeben, und daraufhin wurde bei 37°C in einem 5 % CO2 enthaltenden Inkubator inkubiert.
Das Wachstum der Hybridoma-Zellen wurde überwacht, und die Anwesenheit von Antikörpern in dem Überstand jedes Näpfchens
wurde gleichzeitig entsprechend dem in Beispiel 1 (4) angegebenen Verfahren geprüft.
Unter den positiven Hybridoma-Zellklonen wurden beständige
Klone ausgewählt, die eine große Menge Antikörper erzeugten und sich gut vermehrten; diese beständigen Klone wurden erneut
in der oben angegebenen Weise kloniert, und daraufhin die Antikörper bildenden Hybridoma-Zellklone mit den Bezeichnungen
AS-4 und AS-5 erhalten.
(5) Bildung der Antikörper
in vitro Kultur
Die Hybridoma-Zellklone AS-4 und AS-5 wurden entsprechend dem
in Beispiel 1 (5) angegebenen Verfahren kultiviert, um entsprechende
Überstände zu erhalten.
in vivo Kultur
Entsprechend dem in Beispiel 1 (5) angegebenen Verfahren
wurden die Hybridoma-Zellklone AS-4 und AS-5 intraperitoneal
auf CDF-j-Mäuse transplantiert, nach 2 bis 3 Wochen Aszites-Flüssigkeit
der Mäuse gewonnen und auf den aszitischen Überstand hin verarbeitet. Aus 10 Mäusen wurden angenähert 30 ml
dieses Überstandes gewonnen.
(6) Spezifität und Eigenschaften des Antikörpers
Die Spezifitaten und die Klassen des Immunoglobulins der
Antikörper, die in den AS-4- bzw. AS-5-Hybridoma-Überständen enthalten waren, wurden entsprechend dem Verfahren nach Beispiel
1 (6) untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Spezifitäten und Iimmoglobulin-Klassen der erfindungsgemäßen, gegen Aspergillus gerichteten Antikörper
Aspergillus fumigatus IAM3006 gleiche Aspergillus fumigatus IF05840
Spe- Spezies Aspergillus fumigatus IFO4057 zifi-
tät gleiche Aspergillus flavus IAM3003 Gattung Aspergillus niger IAM2093
Aspergillus oryzae IAM2600
Antikörper bildender Hybridcma-Zellklon
AS-I AS-2 AS-3 AS-4 AS-5
Eigenschaften
Immuncglobulin^Klassen
IgM IgM
IgG
IgG
+; positive,
-; negative
Beispiel 3:
Die nach den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Antikörper wurden ICR-Mäusen verabreicht; jede Versuchsgruppe umfaßte 10 Mäuse;
in den einzelnen Gruppen wurden 2 g/kg Antikörper peroral, bzw. 400 mg/kg Antikörper intraperitoneal bzw. 200 mg/kg
Antikörper intravenös verabreicht; die Mäuse wurden 14 Tage lang beobachtet. Innerhalb des Beobachtungszeitraumes trat
kein Todesfall auf die Verabreichung der Antikörper hin auf.
Die Gestalt der Zellen der Hybridoma-Zellklone AS-I bis AS-5
war angenähert kugelförmig; die Abmessungen schwankten von 10 bis 20 um und betrugen zumeist angenähert 15 um; die Zellen
der Hybridoma-Zellklone AS-I bis AS-5 schwammen in den
entsprechenden Kulturmedien und zeigten nur eine schwache Haftung an der Gefäßwand.
Beispiel 4:
Identifizierung eines Pilzes der Gattung Aspergillus
mittels eines Antikörpers
(a) Subjekt:
Als Subjekt diente Sputum, der drei Patienten entnommen
wurde, bei denen Zweifel hinsichtlich einer Erkrankung an Aspergillose-Lungenentzündung bestand. Das Material wurde in
eine Petrischale geschmiert, die Sabouraud's Dextrose Agarmedium
enthielt. Es wurde 2 Wochen lang bei 25°C inkubiert. Die auf der Agarplatte erscheinenden, Schimmel-artigen Kolonien
dienten für die weiteren Untersuchungen als Subjekt.
BAD ORIGHSIAL
(b) Identifizierung:
Zur Identifizierung wurde die Kopplung mit fluoreszierendem
Antikörper benutzt, welche Antikörper wiederum aus dem aszitischen
Überstand der Hybridoma-Zellklone AS-I oder AS-4 stammten. Im einzelnen wurden die zu prüfenden Zellen mit einer
Platindrahtschleife von den Kolonien entnommen und auf einen Objektträger geschmiert, dort mit 1,0 %-iger Formalin-Lösung
über Kacht bei 4 C fixiert; daraufhin wurde sorgfältig mit PBS (pH 7,2) gewaschen, und daraufhin ein Tropfen der oben
genannten Antikörperlösung zugesetzt; daraufhin wurde 1 h lang bei 37 C inkubiert. Nachdem man sorgfältig mit PBS (pH 7,2)
gewaschen hatte, um nicht-reagiert habende Antikörper zu entfernen, wurde 1 Tropfen an Fluoreszin gebundenes Antimaus-Immunoglobulin
(Cappel, USA) hinzugefügt und erneut 1 h lang bei 37°C inkubiert. Nachdem man nicht umgesetzte, an Fluoreszin
gebundene Antikörper durch Auswaschen mit PBS (pH 7,2) entfernt hatte, wurde die Fluoreszenz mittels eines Fluoreszenz-Mikroskopes
(Olympus Vanox, Olympus. Japan) an jeder Subjektzelle auf dem Objektträger untersucht.
Gleichzeitig wurden die Subjekte morphologisch untersucht, im einzelnen die Formen der Konidienfäden, die Zahl der schlanken
Pilzstiele und die Farbe der Subjekt-Kolonnien bestimmt.
(c) Ergebnisse:
Wie aus der nachstehenden Tabelle 2 ersichtlich, stimmen die bei der Identifizierung mittels der erfindungsgemäßen
Antikörper erhaltenen Ergebnisse vollständig mit den Ergebnissen der morphologischen Untersuchung überein. Diese Ergebnisse
sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle
Subjekt Identifizierung durch
fluoreszierende Antikörper Antikörper aus
AS-I
AS-4 Morphologische Indentifizierung
Ergebnis:
Konidienfaden
identifizierter Farbe der Kolonnie Stamm
Sputum (Patient A) lang, zylindrisch
ein Stiel blau oder grün
Aspergillus fumigatus
Sputum (Patient B) lang, zylindrisch
ein Stiel
blau oder
bläulich grün
Aspergillus fumigatus
Sputum (Patient C) dünn, lang
keine übereinstimmende Länge,
(speichenförmig)
rosa
Pusarium sp.
+: positiv;
-: negativ
Beispiel 5:
(1) Kennzeichnung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-5
ausgeschiedenen Antikörper mit Peroxidase
In 1 ml destilliertem Wasser wurden 4 mg Meerrettich-Peroxidase
(Sigma Typ VI, Sigma, USA) gelöst; dieser Lösung wurden 60 μΐ einer 0,1 M NaJO.-Lösung zugesetzt, die unmittelbar
vorher bereitet worden war; die Lösungen wurden bei Raumtemperatur 20 min lang vermischt. Die gebildete Lösung wurde
über Nacht gegen 1 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 4,4) dialysiert; anschließend wurden 20 ml 0,2 M Natriumcarbonat-Lösung
zugesetzt. Bald darauf wurden die von den Hybridoma-Zellklonen AS-I oder AS-4 ausgeschiedenen Antikörper zugesetzt?
im einzelnen wurden diese Antikörper in Form der gereinigten Überstände mit einem Proteingehalt von 10 mg
zugesetzt, welche in 1 ml 0,01 M Carbonat-Pufferlösung
(pH 9,5) gelöst waren; das Gemisch wurde 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Umsetzung wurden 0,1 ml
frisch zubereiteter, wässriger NaBH.-Lösung (in 1 ml destilliertem
Wasser wurden 4 mg NaBH4 gelöst) zugesetzt; man ließ den Ansatz 2 h lang bei 4°C stehen, und dialysierte dann über
Nacht gegen PBS.
Das danach erhaltene Lösungsgemisch wurde auf eine mit Sephadex G-100 (Pharmacia, Schweden) gefüllte Säule gegeben
und mit PBS eluiert. Die erste Fraktion, deren Absorptionen bei 280 nm und 403 nm einander entsprachen, wurde aufgefangen.
Zu 1 ml dieser, das Enzym/Antikörper-Kopplungsprodukt enthaltenden Lösung wurden 10 mg Kaninchenserumalbumin zugesetzt und
gelöst; der Ansatz wurde daraufhin bei -70 C bis zur Verwendung aufbewahrt.
BAD ORIGINAL
(2) Kennzeichnung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper mit Alkali-Phosphatase
5 mg Alkali-Phosphatase vom Typ VII (Sigma, USA), die vorher
gegen PBS dialysiert worden war, um den Ammoniumsulfat-Gehalt
vollständig zu entfernen, und 17 mg der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I oder AS-4 ausgeschiedenen Antikörper (in
Form des gereinigten, aszitischen Überstandes) wurden in P3S gelöst und auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gebracht.
Der erhaltenen Lösung wurden 10 ul 20 %-iger Glutaraldehyd-Lösung
zugesetzt, und das Gemisch 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch auf
eine mit Sephadex G-200 (Pharmacia, Schweden) gefüllte Säule gegeben, mit Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,6) equillibriert und
daraufhin mit dem gleichen Puffer eluiert. Es wurde eine hochmolekulare
Fraktion aufgefangen, die vom Beginn bis zum IgG-Punkt eluiert wurde; diese Fraktion wurde mit 5 %-igem Rinderserumalbumin
versetzt, steril filtriert (0,22 pm Milliporefilter,
Millipore, USA) um
ren Verwendung aufbewahrt.
filter, Millipore, USA) und im Dunklen bei 4°C bis zur weite-
(3) Kennzeichnung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper mit ß-Galaktosidase
Entsprechend dem oben unter Ziff. (.2) angegebenen Verfahren wurden die von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4 ausgeschiedenen
Antikörper mit ß-Galaktosidase gekennzeichnet. Zu dieser Kennzeichnung wurde ß-Galaktosidase der Firma Sigma,
Typ IV (Sigma, USA) verwendet.
(4) Markierung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper mit Jod-125
nor
Zu 10 μΐ Lösung von 100 mCi/ml Na J (Träger-frei, Amersham,
USA) wurden 50 ul Antikörper-Lösung hinzugefügt, die von den
Hybridoma-Zellklonen AS-I oder AS-4 ausgeschieden worden war;
im einzelnen handelte es sich um den gereinigten, aszitischen Überstand mit einem Protein-Gehalt von 1,0 mg/ml; weiterhin
wurden 30 μΐ 0,5 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) hinzugefügt,
die 0,30 mg/ml Chloramin T enthielt; die Komponenten wurden gut miteinander vermischt. Nach Ablauf von 15 see wurden 100 ul
PBS hinzugefügt, das mit L-Tyrosin gesättigt war; daraufhin wurden die Komponenten sofort miteinander vermischt, und
das gebildete Gemisch an einer Säule chromatographiert, die
mit Amberlite IRA 400 gefüllt war; es wurde mit PBS eluiert, das 1 % Rinderserumalbumin enthielt. Die eluierte Fraktion
wurde aufgefangen und bis zur Verwendung bei 4 C aufbewahrt. Die spezifische Aktivität des markierten Produktes betrug 1,0
uCi/mg Antikörperprotein.
(5) Markierung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper mit Fluoreszin
1 ml Lösung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper (in Form des gereinigten aszitischen Überstandes) mit einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml
wurden 0,1 ml 0,5 M Carbonat-Pufferlösung (pH 9,3) zugesetzt;
weiterhin wurden 0,1 mg Fluoreszin-Isothiocyanat-Pulver hinzugefügt, und der Ansatz ohne Blasenbildung 6 h lang bei 4°C
gerührt. Unmittelbar nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch auf eine mit Sephadex G-25..(Pharmacia, Schweden) gefüllte
Säule gegeben, um die nicht-reagiert habenden, niedermolekularen Substanzen zu entfernen. Die hochmolekulare Fraktion
wurde aufgefangen, und im Dunklen bei 4 C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
(6) Markierung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper mit Tetramethylrhodamin
Zu 1 ml einer Lösung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I
oder AS-4 ausgeschiedenen Antikörper (in Form des gereinig-
COPY j
ten aszitischen Überstandes mit einem Proteingehalt von 10 mg/ml) wurden 0,1 ml 0,5 M Carbonat-Puffer lösung (pK
9,3) hinzugefügt; weiterhin wurden 0,2 mg Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat-Pulver
hinzugesetzt, und der Ansatz ohne Blasenbildung 20 h lang bei 4°C gerührt. Im Anschluß
an die Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch sofort auf eine mit Sephadex G-25 (Pharmacia, Schweden) gefüllte Säule gegeben;
die nicht-reagiert habenden niedermolekularen Substanzen wurden entfernt, und die hochmolekulare Fraktion
wurde aufgefangen. Das Produkt wurde im Dunklen bei 4 C aufbewahrt.
(7) Kennzeichnung der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I und AS-4
ausgeschiedenen Antikörper mit Biotin
1 mM d-Biotin (= 244 mg, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) und 1,5 mM N-Hydroxysuccinimid (= 173 mg, Eastman
Kodak, USA) wurden in einem Gemisch aus 8 ml Dimethylsulfoxid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 5 ml 1,2-Dimethoxyäthan
(Nakarai Chemical, Japan) gelöst. Der erhaltenen Lösung wurde eine Lösung aus 1 mM N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid ( =
= 206 mg, Kanto Chemical, Japan) in 0,5 ml 1,2-Dimethoxyäthan
zugesetzt; anschließend ließ man das Reaktionsgemisch bei 4°C über Nacht reagieren. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert,
und das Filtrat zur weiteren Verwendung gesammelt. Das im Filtrat enthaltene Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt,
und der gebildete ölartige Rückstand wurde in 10 ml Dichlormethan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan)
gelöst und auf 4°C abgekühlt. Daraufhin wurden 10 ml 0,1 M NaHC03-Lösung (4°C) zugesetzt, und der ganze Ansatz zum Vermischen
gut geschüttelt. Die gebildete Dichlormethan-Phase wurde zur weiteren Verwendung abgetrennt, die zurückbleibende
Phase wurde mit 10 ml 0,1 M NaHC03-Lösung und daraufhin mit
10 ml destilliertem Wasser (beide von 4°C) versetzt; erneut
BAD ORIGINAL
wurde die Dichlormethan-Phase abgetrennt; diese Verfahrensschritte wurden nochmals wiederholt. Die vereinigten Dichlormethan-Phasen
wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat-Pulver (Koizumi Chemical, Japan) entwässert. Das Pulver wurde abfiltriert,
und dem gesammelten Filtrat η-Hexan zugesetzt, bis eine Trübung auftrat. Daraufhin wurde das Gemisch auf
-200C abgekühlt, die ausgeschiedenen Kristalle abgetrennt
und in einen Trockner gegeben, um das Lösungsmittel zu entfernen, und um das kristalline Material zu trocknen. Das Produkt
wurde als der Biotin-N-Hydroxysuccinimid-Ester charakterisiert.
Dieser Biotin-N-Hydroxysuccinimid-Ester wurde in Dimethylsulfoxid
gelöst, und auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. 60 ül dieser Lösung wurden mit 1 ml Lösung
der von den Hybridoma-Zellklonen AS-I oder AS-4 ausgeschiedenen Antikörper (in Form des gereinigten, aszitischen Überstandes
mit einem Proteingehalt von 1 mg/ml) versetzt; anschließend ließ man 4 h lang bei Raumtemperatur reagieren.
Im Anschluß an die Umsetzung wurde die Lösung 3 Tage lang bei 4°C gegen PBS dialysiert. Im Verlauf der Dialyse wurde
die Dialyseflüssigkeit 3mal ausgetauscht. Das Dialysat, d.h. die im Dialyserohr befindliche Lösung, wurde bis zum Gebrauch
bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 6;
Sputum von drei Patienten, die möglicherweise an Aspergillose-Lungenentzündung
erkrankt waren, und Aspergillus fumigatus IAM 3006 wurde jeweils auf Sabouraud's Dextrose-Agarmedium übertragen
und 2 Wochen lang bei 25°C in einem Inkubator inkubiert. Die auf der Agarplatte gebildeten, Schimmel-ähnlichen Kolonien
wurden mit einer Platindrahtschleife entnommen, in 3 ml PBS (das 0,05 % Tween 20 enthielt) suspendiert und in einem
COPY
Homogenisator homogenisiert; die erhaltene Zellsuspension
diente als Subjekt für die nachstehenden Untersuchungen.
(1) Identifizierung durch Enzym-Immuno-Assay
0,3 ml der Zellsuspension wurden in ein Silikon-behandeltes
Reagenzglas (Durchmesser 1,2 cm) gegeben und 5 min lang bei 1000 χ g zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden
0,5 ml einer Lösung des nach Beispiel 5 (1), (2) oder (3) erhaltenen, mit Peroxidase oder mit Alkali-Phosphatase oder
mit ß-Galaktosidase gekennzeichneten Antikörpers in 100-fach verdünntem Pferdeserum hinzugefügt; daraufhin ließ man 1 h
lang bei 37°C reagieren. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch
5 mal mit PBS (das 0,05 % Tween 20 enthielt) gewaschen. Daraufhin wurde 1 ml Substratlösung hinzugefügt.
Im einzelnen wurde dem mit Peroxidase gekennzeichneten Antikörper 1 ml 9,1 M Citrat-Pufferlösung (pH 4,5) zugesetzt,
die 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,04 Vol.-% 31 %-iger wässriger Wasserstoffperoxid-Lösung enthielt; man ließ 30 min
lang bei Raumtemperatur reagieren und fügte daraufhin 0,5 ml
12,5-iger Schwefelsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen;
daraufhin wurde die Absorption bei 492 nm bestimmt.
Im Falle des mit Alkali-Phosphatase gekennzeichneten Antikörpers wurde 1 ml einer Substrat-Lösung (pH 9,8) hinzugefügt,
die 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma, USA), 9,7 Vol.-% Diäthanolamin und 0,01 % MgCl2*6H2O enthielt; man ließ 30 min
lang bei Raumtemperatur reagieren und fügte daraufhin 0,5 ml
5 M Natriumhydroxid-Lösung hinzu, um die Reaktion zu stoppen; anschließend wurde die Reaktion bei 405 nm bestimmt.
Im Falle des mit ß-Galaktosidase gekennzeichneten Antikörpers wurde 1 ml Borat-Pufferlösung (pH 8,5) hinzugefügt, die 1 mg/ml
4-Methylutnbelliferyl-ß-Galaktosid enthielt; man ließ Io min
lang bei 300C reagieren und fügte daraufhin 0,5 ml 0,1 M
Glycin-Natriumhydroxid-Pufferlösung (pH 10,3) hinzu, um
die Reaktion zu stoppen; daraufhin wurde die Menge an freigesetztem 4-Methylumbelliferon mit einem HITACHI-Spektralfluorometer
(bei einer Anregungs-Wellenlänge von 360 nm und bei einer Emissions-Wellenlänge von 450 nm) bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
(2) Identifizierung durch den fluoreszierenden Antikörper
Die Zellsuspension wurde auf einen Objektträger geschmiert, dort über Nacht mit 1,0 %-iger Formalin-Lösung fixiert, und
daraufhin mit PBS gewaschen. Danach wurde 1 Tropfen einer
Lösung des mit Fluoreszin oder mit Rhodamin oder mit Biotin gekennzeichneten Antikörpers ( hergestellt nach Beispiel 5
(5), (6) oder (7)) in 100-fach verdünntem Pferdeserum zugesetzt; man ließ 1 h lang bei 37°C reagieren und wusch sorgfältig
mit PBS, um nicht-reagiert habende Antikörper zu entfernen.
Im Falle des mit Fluoreszin oder mit Rhodamin gekennzeichneten
Antikörpers wurde die Anwesenheit von Fluoreszenz an dem Subjekt-Pilz mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus Vanox,
Olympus, Japan) auf dem Objektträger bestimmt.
Im Falle des mit Biotin gekennzeichneten Antikörpers wurde
1 Tropfen einer Lösung von 5 yjg/ml an Fluoreszin gebundenes
Avidin D (Funakoshi Yakuhin, Japan) zugesetzt; daraufhin
ließ man 1 h lang bei Raumtemperatur reagieren und wusch
sorgfältig mit PBS. Die Anwesenheit von Fluoreszenz auf
dem Objektträger wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroskop bestimmt.
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführt.
Unabhängig davon wurden die aus dem Sputum der Patienten D und E erhaltenen Kolonnien mittels morphologischer Untersuchungen
als Aspergillus fumigatus identifiziert; im einzelnen wurden hierzu die Formen der Konidienfäden,
die Anzahl der Stiele und die Farbe der Subjekt-Kolonien ausgewertet. Das dabei erhaltene Ergebnis stimmte völlig
mit den Resultaten.der Untersuchungen mit gekennzeichneten
Antikörpern überein. Weiterhin wurde die aus dem Sputum des Patienten F gebildete Kolonie als Fusarium sp. identifiziert,
Tabel 1 e 3
Verfahren |
benutztes Reagenz |
Herkunft des
Antikörpers |
AS-I
AS-4 |
Patient
Sputum |
D |
Subjekt |
Patient
Sputum |
F |
■ |
\
|
+ |
|
Harkierungs-
raittel |
AS-I
AS-4 |
AS-I
AS-4 |
+ (492
+ (492 |
nm)
nm) |
Patient E
Sputum |
- (492
- (492 |
nm)
nm) |
Aspergillus fumigatus
IAM 3006 |
|
|
Peroxidase |
AS-I
AS-4 |
AS-I
AS-4 |
+ (405
+ (405 |
nm)
nm) |
+ (492 nm)
+ (492 nm) |
- (405
- (405 |
nm)
nm) |
+ (492 nm)
+ (492 nm) |
Enzyiir-
Immuno- |
Alkali-
Phosphatase |
ß-Galaktosidase AS-I
AS-4 |
|
|
|
+ (405 nm)
+ (405 nm) |
- |
|
+ (405 nm)
+ (405 nm) |
Assay |
Fluoreszin |
|
|
|
- |
|
t
|
mit |
Rhodamin |
|
|
t
|
— |
|
fluoresz.
Anti |
Biotin |
|
|
+ |
- |
|
körper |
|
|
|
|
+: positive Absorption oder Fluoreszenz;
-: negative Absorption oder Fluoreszenz.
- 51 Beispiel 7:
Sputunr, von 2 Patienten, die möglicherweise an Aspergillose-Lungenentzündung
erkrankt waren, und eine mit der Platindre-htschlinge
entnommene Menge von Aspergillus fumigatus IAM 3006 wurden in PBS suspendiert, das 0,05 % Tween 20 enthielt. 1 ml
dieser Suspension wurde in ein Silikon-behandeltes Reagenzglas (Durchmesser 1,2 cm) gegossen und nach Zugabe von 4 ml PBS
(das 0,05 % Tween 20 enthielt) gut geschüttelt; die dabei gebildete Suspension wurde anschließend 20 min lang bei
1500 χ g zentrifugiert, um ein Zeil-Pellet zu erhalten.
Nachdem das Zeil-Pellet 2mal mit PBS (das 0,05 % Tween 20 enthielt) gewaschen worden war, wurden 50 ul des mit Jod-125
markierten Antikörpers nach Beispiel 5 (4) (mit einer spezifischen Aktivität von 1 uCi/mg Antikörper) oder Jod-125 markiertes
Maus-Immunoglobulin hinzugefügt; danach ließ man 1 h
lang bei 37°C reagieren. Nachdem man 5 mal mit PBS (das 0,05 % Tween 20 -enthielt) gewaschen hatte, wurde die Radioaktivität
mittels eines ^-Strahlenzählers (Beckman Gamma 8500, Beckman,
USA) bestimmt. Gleichzeitig wurde die Subjekt-Zelle auf Sabouraud's
Dextroseagar-Medium übertragen und bei 25°C inkubiert. Die dabei gebildete Kolonie wurde morphologisch untersucht.
Die dabei erhaltenen Ergebnise sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt.
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, wurden die Subjekt-Zellen an die mit Jod-125 markierten Antikörper gebunden, was darauf
hinweist, daß diese Zellen Aspergillus fumigatus entsprachen. Die gleichzeitig durchgeführten morphologischen Untersuchungen
bestätigten an der blauen oder bläulichen Farbe der Kolonien und anhand der zylindrischen Konidienfäden mit einem Pilzstiel,
daß es sich bei den Subjekt-Zellen um Aspergillus fumigatus handelte.
COPY
Tabelle
Subjekt
benutzter Antikörper/Radioaktivität (Imp./min)
125.
125_ . . ^ 125_ . . .
J-markierter J-markiertes
J-markierter
AS-1-Antikörper AS-4-Antikörper Maus-Immunoglobulin
Sputum
Patient G |
461 |
Sputum
Patient H |
308 |
Aspergillus
fumigatus
IAM 3006 |
679 |
217
437
911
188 162
115
Beispiel 8:
(1) Herstellung eines Kopplungsproduktes aus Antikörper mit Antipilzmittel
Durch Zugabe von destilliertem Wasser zu dem gereinigten aszitischen Überstand wurde der Gehalt an Antikörper aus den
Hybridoma-Zellklonen AS-I, AS-2, AS-3, AS-4 oder AS-5 auf
10,4 mg/ml eingestellt; der danach erhaltenen Lösung wurden 13,0 mg/ml Amphotericin B-Dimethylsulfoxid-Lösung zugesetzt;
daraufhin wurde unter Rühren Salzsäure zugesetzt, um den pH-Wert der Lösung auf 4,75 einzustellen; gleichzeitig wurden
3,7 mg l-Äthyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid
zugesetzt. Nach einer Reaktionsdauer von 1, 3 oder 4 h wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Acetat-Pufferlösung
(pH 4,70) gestoppt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde daraufhin bei 4°C 72 h lang gegen 5 L destilliertes
Wasser dialysiert, wobei.die Dialyse-Lösung 3 mal
COPY
ausgetauscht wurde. Nach Aufkonzentrierung des Dialysates
wurde das Reaktionsgemisch auf eine Saulv. (Durchmesser 1,5 er,
Höhe 55 cm, gefüllt mit Sephadex G-25 (Pharmacia, Schweden)) gegeben, und die niedermolekularen Substanzen vollständig
entfernt. Die verbleibende Lösung wurde bei 20 C gefriergetrocknet, um ein Amphotericin B-Antikörper-Kopplungsprodukt
zu erhalten. Die im Kopplungsprodukt enthaltenen Anteile an Amphotericin B pro mg Antikörper sind in der
nachstehenden Tabelle 5 aufgeführt.
Die Kopplungsprodukte von 5-Fluorocytosin mit den genannten
Antikörpern wurden in gleicher Weise hergestellt. Die in diesen Kopplungsprodukten enthaltenen Anteile an 5-Fluorocytosin
pro mg Antikörper sind ebenfalls in Tabelle 5 aufgeführt.
(2) Bestimmung der Toxizität
Diese Kopplungsprodukte der Antipilzmittel mit den Antikörpern
wurden ICR-Mäusen (jeweils 10 Tiere pro Versuchsgruppe) verabreicht; im einzelnen wurden den Tieren einer
Versuchsgruppe 2 g/kg peroral verabreicht; den Tieren der weiteren Versuchsgruppe wurden 400 mg/kg intraperitoneal
verabreicht; und den Tieren der dritten Versuchsgruppe wurden 200 mg/kg intravenös verabreicht. In keiner Versuchsgruppe wurde innerhalb der folgenden 14 Tage ein Todesfall
festgestellt.
BAD ORIGINAL
- 54 Tabelle 5
Antipilzmittel Antikörper Kopplungsverhältnis pg/mg
lh 3 h 4 h
aus AS-I 1,0 1,5 2,5
Amphotericin B aus AS-2 1,3 1,5 2,8
aus AS-3 1,0 2,0 . 2,5
aus AS-4 1,0 2,0 2,5
aus AS-5 1,0 1,8 2,3
aus AS-I 1,0 1,5 2,5
aus AS-2 1,3 2,0 3,3
5-Fluorccytosin aus AS-3 1,3 2,0 2,8
aus AS-4 1,3 2,0 2,5
aus AS-5 1,0 2,0 2,5
1,0 |
1,5 |
1,3 |
1,5 |
1,0 |
2,0 |
1,0 |
2,0 |
1,0 |
1,8 |
1,0 |
1,5 |
1,3 |
2,0 |
1,3 |
2,0 |
1,3 |
2,0 |
1,0 |
2,0 |
Beispiel 9;
Es wurde die Heilwirkung der erfindungsgemäßen Antikörper
sowie der nach Beispiel 8 erhaltenen Kopplungsprodukte aus Antipilzmittel und Antikörper gegen Infektionskrankheiten
geprüft. Hierzu wurden 5 χ 10 CFU Aspergillus fumigatus IAM 3006 weiblichen, 8 Wochen alten Balb/c-Mäusen (Nihon
Charles Liver, Japan) (15 Tiere je Versuchsgruppe) intravenös verabreicht. 1,24 oder 48 h nach dieser Infektion
wurde den Tieren der aus den Hybridoma-Zellklonen AS-I, AS-2, AS-3, AS-4 oder AS-5. oder jedes der nach Beispiel 8
nach 4 h langer Reaktionsdauer erhaltenen Antipilzmittel/ Antikörper-Kopplungs-Produkte intravenös verabreicht. Zu
Vergleichszwecken wurden die Verbindungen Amphotericin B und 5-Fluorocytosin intravenös bzw. peroral verabreicht.
Jedes Tier erhielt das Kopplungsprodukt in einer Menge von 5 yag, bezogen auf Amphotericin B bzw. von 20 ug, bezogen
auf 5-Fluorocytosin. Innerhalb der darauffolgenden
BAD ORIGINAL
14 Tage wurden die Todesfälle als Folge dieser Infektion
erfaßt.
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 6 aufgeführt.
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich, zeigen die erfindungsgemäßen
Kopplungsprodukte aus Antipilzmittel und Antikörper einen deutlichen, ausgeprägten Heilungseffekt auf von
Aspergillus fumigatus verursachte Infektionskrankheiten. Auch in jenen Versuchsgruppen, deren Tieren die aus den
Hybridoma-Zellklonen AS-I, AS-3 oder AS-4 isolierten Antikörper
für sich verabreicht worden waren, überlebten einige Tiere. Auch dies muß als Hinweis auf eine Heilwirkung gewertet
werden, obwohl diese offensichtlich etwas geringer ist.
BAD ORIGINAL
3*13342
Tabelle 6
Üherlebende*/Gesamtanzahl
Kontrollgruppe (unbehandelt) 0/15
Antikörper aus AS-I (i.V.) 1/15
aus AS-2 0/15
aus AS-3 2/15
aus AS-4 1/15
, ' aus AS-5 0/15
Amphotericin B 5 pg (i.v.) 4/15
Kopplungsprodukt aus
Amphotericin B + Antikörper aus AS-I (i.v.) 9/15
aus AS-2 8/15
aus AS-3 9/15
aus AS-4 10/10
aus AS-5 11/15
5-Fluorocytosin 2000 ug(p.o.) 3/15
Kopplungsprodukt aus
5-Fluorocytosin + Antikörper aus AS-I (i.p.) 6/15
aus AS-2 5/15
aus AS-3 5/15
aus AS-4 7/15
aus AS-5 4/15
*Anzahl der Tiere, welche die folgenden 14 Tage im Anschluß an die Verabreichung von Aspergillus fumigatus
überlebt haben.