DE3642095C2 - Monoclonale Antikörper, die kreuzreaktiv und kreuzprotektiv gegen P. AERUGINOSA-Serotypen sind - Google Patents
Monoclonale Antikörper, die kreuzreaktiv und kreuzprotektiv gegen P. AERUGINOSA-Serotypen sindInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die Anwendung von immunologi
schen Techniken zur Schaffung neuer Materialien, die zur
Diagnose und Behandlung von bakteriellen Infektionen brauch
bar sind, und insbesondere auf die Herstellung und Anwendung
von menschlichen monoklonalen Antikörpern, die zur Erkennung
vielfacher Serotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig sind.
Gramnegative Erkrankungen und ihre sehr schweren Komplikatio
nen wie Bakteriämie und Endotoxämie sind die Ursache für sig
nifikante Morbidität und Mortalität bei menschlichen Patien
ten. Dies trifft insbesondere zu bei dem gramnegativen Orga
nismus Pseudomonas aeruginosa, welcher über den Zeitraum der
letzten 50 Jahre in zunehmendem Maße verbunden ist mit bakte
riellen Infektionen, insbesondere Krankenhaus-Infektionen.
Während der letzten Dekaden waren Antibiotika das Mittel der
Wahl zur Kontrolle von gramnegativen Erkrankungen. Die fort
gesetzte hohe Morbidität und hohe Mortalität, die mit Erkran
kungen mit gramnegativen Bakterien verbunden ist, ist jedoch
ein Anzeichen für die Grenzen der antibiotischen Therapie,
insbesondere soweit es P. aeruginosa (siehe beispielsweise
Andriole, V. G., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic The
rapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94: 196-
199) betrifft. Dies hat die Forschung nach alternativen Me
thoden zur Verhütung und Behandlung veranlaßt.
Eine in Betracht gezogene Methode ist die Vermehrung des
Immunsystems des Wirtes durch aktive oder passive Immunisie
rung. Beispielsweise wurde beobachtet, daß aktive Immunisie
rung von Menschen oder Versuchstieren mit bakteriellen Impf
stoffen aus ganzen Zellen oder gereinigten bakteriellen Endo
toxinen von P. aeruginosa zur Entwicklung von spezifischen
opsonischen Antikörpern führt, die vorwiegend gegen Determi
nanten auf den sich wiederholenden Oligosaccharid-Einheiten
der Lipopolysaccharid-Moleküle (LPS) gerichtet sind, die auf
der äußeren Zellmembran von P. aeruginosa lokalisiert sind
(vgl. Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses
of Intravenous Preparations, Alving, B. M. and Finlayson,
J. S. , Hrsg., S. 73-79, U. S. Department of Health and Human
Services, 1979).
Die Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen mono
klonalen Antikörpern gegen Antigene der äußeren Membran von
Pseudomonas aeruginosa wird von Hancock, R. E. W. et al. in:
Infection and Immunity, Band 37 (1982), S. 166-171 beschrie
ben.
Solche Antikörper, die entweder aktiv erzeugt oder passiv
transferiert sind, haben sich als schützend gegen die letalen
Auswirkungen von P. aeruginosa-Infektionen in einer Vielzahl
von Tiermodellen (vgl. Pollack, oben) und in einigen vorläu
figen Untersuchungen vom Menschen (siehe Young, L. S. und
Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L. Hrsg., S.
119-132, Hans Huber, 1980) erwiesen.
Darüber hinaus ist für die Rolle dieser Antikörper beim Men
schen von besonderer Bedeutung, daß bei Patienten mit P.
aeruginosa-Bakteriämie ein Zusammenhang zwischen Überleben
und hohen akuten Serumtitern von Antikörpern gegen die LPS-
Moleküle des infizierenden Stammes gefunden wurde (vgl.
Pollack, M. und Young, L. S., J. Clin. Invest., 63: 276-286,
(1979)).
WO86/03754 offenbart einen menschlichen monoklonalen Antikör
per gegen Pseudomonas aeruginosa, der das Lipopolysaccharid
von P. aeruginosa erkennen kann, sowie Hybridome von Mäusen
und Menschen und Zellinien, die solche monoklonalen Antikör
per herstellen.
Die obigen Berichte lassen die Schlußfolgerung zu, daß immun
therapeutische Maßnahmen zur Verhinderung und Behandlung bak
terieller Erkrankungen durch P. aeruginosa angewendet werden
können, z. B. durch Verabreichung gepoolter menschlicher Im
munglobuline, die Antikörper gegen den bzw. die infizieren
den Stämme enthalten. Menschliche Immunglobuline wären hier
als der Anteil eines fraktionierten menschlichen Plasmas de
finiert, der auf Antikörper angereichert ist, unter denen
sich spezifische Antikörper gegen Stämme von P. aeruginosa
befinden. Aufgrund gewisser inhärenter Beschränkungen in der
Verwendung von menschlichen Immunglobulin-Komponenten ver
bleibt dieser Behandlungsweg von Erkrankungen durch P.
aeruginosa im Untersuchungsstadium (vgl. beispielsweise Col
lins, M. S. und Roby, R. E., Am. J. Med., 76 (3A): 168-174,
(1984)), und bis heute sind keine handelsüblichen Produkte,
die solche Komponenten anwenden, erhältlich.
Eine solche mit Immunglobulin-Zusammensetzungen verbundene
Beschränkung liegt darin, daß sie aus Sammlungen von Proben
von tausend und mehr Spendern bestehen, wobei solche Proben
zuvor anhand der Gegenwart von bestimmten Anti-Pseudomonas-
Antikörpern ausgelesen wurden. Dieses sog. Poolen führt zu
einem Mitteln der individuellen Antikörper-Titer, was besten
falls zu einem mäßigen Anstieg des erhaltenen Titers der ge
wünschten Antikörper führt.
Eine weitere Beschränkung liegt darin, daß das Vorauswahlver
fahren selbst ein aufwendiges kontinuierliches Aussieben des
Spender-Pools erfordert, um die Konsistenz des Produktes zu
sichern. Trotz dieser Bemühungen können Immunglobulin-
Produkte immer noch eine erhebliche Variabilität von Charge
zu Charge und unter Prdukten aus unterschiedlichen geogra
phischen Regionen aufweisen.
Eine weitere Begrenzung bei den Immunglobulin-Zusammenset
zungen liegt darin, daß ihre Anwendung mit einer Verabrei
chung von großen Mengen an fremden proteinartigen Substanzen
zusammenfällt (welche auch Viren, z. B. solche, die kürzlich
im Zusammenhang mit dem Acquired Immune Deficiency Syndrome,
AIDS genannt, gebracht wurden), und diese Substanzen schäd
liche biologische Auswirkungen verursachen können. Niedrige
Titer der gewünschten Antikörper in Verbindung mit einem
hohen Gehalt an Fremdsubstanzen kann die Menge an spezifi
schen und somit günstig wirkenden Immunglobulinen, die dem
Patienten verabreicht werden sollen, auf nichtoptimale Werte
begrenzen.
Es gibt in der Literatur eine Anzahl von Serotyp-Schemata,
welche zum Analysieren von Pseudomonas aeruginosa-Infektio
nen brauchbar sind. Die Schemata basieren hauptsächlich auf
den wärmestabilen größeren somatischen Antigenen dieses Or
ganismus (vgl. Zierdt, C. H., in Glucose Nonfermenting Gram-
Negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G. L.,
ed., CRC Press, pp. 213-238 (1978)). Die Auswucherung der
serogruppierenden Schemata hat es ziemlich schwer gemacht,
serologische Studien von P. aeruginosa zu vergleichen, und
so erscheint die Wahl eines gegebenen Systems für den Zweck
des Untersuchens von Überständen ziemlich zufällig. Die Kon
fusion zwischen typisierenden Systemen wurde kürzlich durch
die Schaffung des 'International Antigenic Typing Scheme'
(IATS)-Systems geklärt, welches vom Subkomitee für Pseudo
monadaceae des 'International Committee on Systematic Bacte
riology' als Rückgrat für weitere serologische Studien an P.
aeruginosa vorgeschlagen wurde. Dieses System, das siebzehn
bestimmte Serotypen mit der Bezeichnung IATS Type 1, IATS
Typ 2, usw. vorsieht, umfaßt alle wärmestabilen größeren
somatischen Antigene, die in den früheren Systemen identifi
ziert wurden (vgl. Liu, P. V., Int. J. Syst. Bacteriol., 33:
256-264, (1983) worauf hier Bezug genommen wird).
Bei der Entwicklung schützender monoclonaler Antikörper, die
kreuzreaktiv mit Stämmen von P. aeruginosa sind, ist es au
ßerdem vorteilhaft, ein Typisierungsschema einzubringen, das
auf den Schutz-Antigenen von P. aeruginosa basiert. Ein sol
ches Schema wurde mit der Absicht der Entwicklung eines
Impfstoffs für die klinische Anwendung ersonnen und ist de
tailliert beschrieben von Fisher, M. W. et al., J. Bacte
riol., 98: 835-836, (1969). Dieses System, das gebräuchli
cherweise als Fisher-Typisierungssystem bezeichnet wird,
klassifiziert die Mehrzahl der bekannten P. aeruginosa in
sieben Typen mit der Bezeichnung Fisher-Immunotyp 1,
Fisher-Immunotyp 2, usw. Die Zusammenhänge zwischen den
IATS- und Fisher-Typisierungssystemen sind geklärt (vgl.
Liu, P. V., et al., wie oben angegeben) und ist in Tabelle I
dargestellt. Wie in der Tabelle I vermerkt, gibt es keine
entsprechenden Fisher-Immunotypen für bestimmte IATS-Sero
typen, obwohl jeder Fisher-Immunotyp einem bestimmen IATS-
Serotyp entspricht. Es wird angenommen, daß die antigenen
Determinanten, die für beide Serotyp-Schemata relevant sind,
also IATS- und Fisher-Typisierungssystemen, auf den Oberflä
chen-LPS-Molekülen von P. aeruginosa sitzen (Liu, P. V. et
al., siehe oben; Hanessien, F., et al., Nature, 229: 209-210
(1979)).
Vergleich und Korrelation der IATS- und Fisher- Typisierungs-Schemata für Pseudomonas aeruginosa | |
IATS | |
Fisher | |
1 | 4 |
2 | 3 |
3 | - |
4 | - |
5 | 7 |
6 | 1 |
7 | - |
8 | 6 |
9 | - |
10 | 5 |
11 | 2 |
12 | - |
13 | - |
14 | - |
15 | - |
16 | - |
17 | - |
1975 berichteten Kohler und Milstein über ihre zukunfts
trächtige Entdeckung, daß bestimmte Mäuse-Zellinien mit Mäu
se-Milzzellen unter Schaffung von Hybridzellen verschmolzen
werden konnten, von denen jede in der Lage war, Antikörper
einer einzigen Spezifität auszuscheiden, d. h. monoclonale
Antikörper (Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495-
497 (1975)). Mit der Ankündigung dieser Technologie wurde es
möglich, in einzelnen Fällen große Mengen an hervorragend
spezifischen Mäuse-Antikörpern gegen eine bestimmte Determi
nante oder Determinanten auf Antigenen zu schaffen. Solche
von Mäusen gewonnenen monoclonalen Antikörper oder Zusammen
setzungen von solchen Antikörpern haben jedoch schwerwiegen
de Nachteile bei der Behandlung von Menschen; dies insbeson
dere im Hinblick darauf, daß bei der Verwendung monoclonaler
Antikörper aus Mäusen bei versuchsweisen Studien zur Behand
lung bestimmter Krankheiten beim Menschen häufig beobachtet
wurde, daß die monoclonalen Antikörper einen Immunrespons
hervorrufen, der sie unwirksam macht (Levy, R. L. und Miller,
R. A., Ann. Rev. Med., 34: 107-116, (1983)).
Sadoff et al. berichten über die Herstellung eines aus Mäu
sen gewonnenen monoclonalen Antikörpers der IgM-Klasse unter
Anwendung der Hybridtechnik, der gegen eine O-Seitenketten-
Determinante auf den LPS-Molekülen eines besonderen Serotyps
von P. aeruginosa gerichtet war (Abstracts of the 1982 In
terscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemo
therapy, Nr. 253). Sie berichteten weiter, daß dieser
Mäuse-Antikörper Mäuse gegen eine tödliche Herausforderung
von P. aeruginosa desselben Serotyps wie der Typ, gegen den
die Antikörper gerichtet waren (d. h. der homologe Serotyp)
schützte. Mehrere nachfolgende Artikel beschrieben detail
liert die Entwicklung von Mäuse- und Menschen-Anti-P. aeru
ginosa-LPS-monoclonalen Antikörpern unterschiedlicher Spezi
fität (vgl. beispielsweise Sawada, S., et al., J. Inf. Dis.,
150: 570-576, (1984); Sadoff, J., et al., Antibiot. Chemo
ther., 36: 134-146, (1985); Hancock, R., et al., Infect.
Immun. 37: 166-171 (1982); Siadak, A. W. und Lostrom, M. E.,
in Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman,
E. G., et al., eds., pp. 167-185, Plenum Publishing Corp.
(1985) und Sawada, S. et al., J. Inf. Dis., 152: 965-970,
(1985). Die Herstellung und immuntherapeutische Anwendung
von Anti-P. aeruginosa-LPS-Serotyp-spezifischen menschlichen
monoclonalen Antikörpern sind in den US-Patentanmeldungen
Nr. 734, 624 und 828, 005 beschrieben, auf deren Inhalt hier
Bezug genommen wird.
Während bestimmte Vorteile bei der Anwendung monoclonaler
Antikörper, die gegenüber einem einzelnen IATS-Serotyp von
P. aeruginosa spezifisch sind, in manchen Situationen gege
ben sein können, so z. B. wenn die Infektion auf einen ein
zelnen Serotyp zurückgeführt werden kann, so sind diese in
vielen anderen Fällen noch nicht bevorzugt. Zum Beispiel
wäre es bei der prophylaktischen Behandlung gegen potentiel
le Infektionen beim Menschen bevorzugt, einen oder mehrere
menschliche Antikörper zu verabreichen, die schützend gegen
eine Vielzahl von IATS-Serotypen sind. Ähnlich ist dies bei
der therapeutischen Anwendung, wenn der oder die Serotypen
des oder der infizierenden Stämme nicht bekannt sind. Hier
ist es bevorzugt, einen oder mehrere menschliche Antikörper
zu verabreichen, die gegen die meisten, wenn nicht gegen
alle der klinisch bedeutsamen P. aeruginosa-IATS-Serotypen
sind. Es kann zwar eine Kombination von menschlichen mono
clonalen Antikörpern, von denen jeder spezifisch gegen einen
einzelnen IATS-Serotyp von P. aeruginosa ist, theoretisch
formuliert werden, um einen Schutz gegen verschiedene Sero
typen zu erreichen. Eine solche Zusammensetzung würde jedoch
schwierig zu entwickeln sein und ist in der Herstellung auch
unökonomisch.
Es besteht somit ein deutlicher Bedarf an menschlichen
Anti-P. aeruginosa monoclonalen Antikörpern, die zum Erken
nen von und zum Schutze gegen vielfältige IATS-Serotypen von
P. aeruginosa geeignet sind. Weiterhin sollten diese Anti
körper für die prophylaktische und therapeutische Behandlung
von Infektionen mit P. aeruginosa geeignet sein. Diese Auf
gabe wird durch die Erfindung erfüllt.
Es wurden neue Zellinien geschaffen, die menschliche mono
clonale Antikörper produzieren können, die zur spezifischen
Reaktion mit den LPS-Molekülen einer Vielzahl, jedoch nicht
aller IATS-Serotypen von P. aeruginosa fähig sind. Diese
Antikörper besitzen unterschiedliche Reaktivitäten mit
Fisher-Immunotypen, und binden an keinen, einen oder eine
Mehrzahl von Immunotypen.
Gemäß der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung
gestellt, enthaltend einen humanen monoklonalen Antikörper
oder ein Bindungsfragment davon, der zu einer spezifischen
Bindung mit einer Vielzahl, jedoch nicht allen IATS-Serotypen
von Pseudomonas aeruginosa fähig und in vivo gegen mindestens
zwei IATS-Serotypen schützend ist.
Die Erfindung stellt auch eine unsterbliche (permanente)
transformierte Zellinie zur Verfügung, welche einen humanen
monoklonalen Antikörper ausscheidet, der spezifisch mit
weniger als allen, aber mindestens zwei IATS-Serotypen von
Pseudomonas aeruginosa reagiert.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer zur Behandlung oder Verhütung von Pseudomonas aerugi
nosa-Infektionen brauchbaren Zusammensetzung zur Verfügung,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens zwei
humane monoklonale Antikörper, von denen mindestens einer
schützend gegen mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomo
nas aeruginosa ist, mit einem antimikrobiellen Mittel, einer
Gammaglobulinfraktion aus menschlichem Blutplasma und/oder
einem physiologisch akzeptierbaren Träger vermischt.
Es wurde weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Menschen,
die gegenüber einer Infektion mit P. aeruginosa anfällig oder
bereits infiziert sind, geschaffen. Die Erfindung betrifft
somit auch die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge
einer Zusammensetzung aus mindestens einem humanen monoklona
len Antikörper oder Bindungsfragment davon, der zur Kreuz
reaktion mit P. aeruginosa IATS-Serotypen fähig ist, wobei
die Zusammensetzung vorzugsweise auch einen physiologisch
akzeptierbaren Träger enthält. Die Zusammensetzung kann auch
einen oder mehrere der nachfolgenden Bestandteile enthalten:
zusätzliche humane monoklonale Antikörper, die zur Reaktion
mit P. aeruginosa Flagella, Exotoxin A oder mit anderen Sero
typ- oder Immunotyp-Determinanten auf dem LPS von P. aerugi
nosa fähig sind; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem
Blutplasma; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem
Blutplasma, wobei das Plasma von solchen Menschen stammt, die
erhöhte Immunglobulinspiegel zeigen, die gegen P. aeruginosa
reaktiv sind; und ein oder mehrere antimikrobielle Mittel.
Durch die Erfindung wurden neue Zellen geschaffen, die zur
Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern und
solche Antikörper enthaltenden Zusammensetzungen fähig sind.
Diese Zusammensetzungen sind in der Lage, mindestens eine
Mehrzahl und in manchen Fällen alle P. aeruginosa-Stämme zu
erkennen, wobei einzelne Antikörper typischerweise mehrfache
IATS-Serotypen und null, einen oder mehrere Fisher-Immuno
typen von P. aeruginosa erkennen. Die entsprechenden Zellen
haben identifizierbare Chromosomen, in denen die Keim-Linien-
DNA (germ-line DNA) aus ihnen oder aus Precursor-Zellen wie
der geordnet ist, um einen Antikörper mit einer Bindungs
stelle für ein Epitop, das gemeinsam unter bestimmten P.
aeruginosa-Serotypen ist, zu kodieren. Diese menschlichen
monoclonalen Antikörper können auf vielseitige Weise einge
setzt werden, einschließlich der Diagnose und Therapie, z. B.
zum Schutze in vivo.
Typischerweise können die Zellen nach der vorliegenden Er
findung menschliche transformierte Lymphozyten sein, die
schützende menschliche monoclonale Antikörper gegen zugäng
liche LPS-Moleküle von P. aeruginosa produzieren. Unter 'zu
gänglich' ist hier zu verstehen, daß die LPS-Moleküle physi
kalisch im Anwendungsbereich verfügbar für eine direkte Zwi
schenreaktion mit den monoclonalen Antikörpern sind. Die so
geschaffenen monoclonalen Antikörper sind brauchbar für die
Behandlung oder Prophylaxe von schweren Krankheiten aufgrund
von P. aeruginosa. Die LPS-Moleküle der äußeren Membran von
P. aeruginosa stehen für einen direkten Kontakt mit den An
tikörper-Molekülen zur Verfügung und erleichtern somit eine
Komplement-Lyse und/oder eine Phagocytose des Organismus.
Solche LPS-Moleküle, die von der äußeren Membran in die nä
here Umgebung abgegeben werden, sind dann ebenfalls frei zu
einer direkten Wechselwirkung mit den Antikörper-Molekülen
und können über das Reticuloendothele-System geklärt werden.
Die Herstellung der monoclonalen Antikörper kann erreicht
werden durch Unsterblichmachen der Expression von Nuklein
säure-Sequenzen, welche Antikörper kodiert enthalten, die
für ein Epitop auf den LPS-Molekülen von multiplen Serotypen
von P. aeruginosa spezifisch sind. Typischerweise werden die
monoclonalen Antikörper durch zellgezogene Epstein-Barr-
Virus (EBV) Transformation von B-Lymphozytenzellen herge
stellt, die von menschlichen Spendern erhalten wurden, die
dem oder den geeigneten Serotypen von P. aeruginosa ausge
setzt waren. Die so hergestellten, den Antikörper ausschei
denden Zellinie sind charakterisiert als kontinuierlich
wachsende Lymphoblastoid-Zellen, welche einen Diploid-Karyo
typ besitzen, Epstein-Barr-Kern-Antigen positiv sind und
monoclonale Antikörper vom Isotyp, IgG, IgM, IgA oder IgD
ausscheiden, einschließlich der verschiedenen Untertypen wie
IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Das zellgeführte Transformations
verfahren selbst ist im einzelnen im Patent 4,464,465 be
schrieben, auf dessen Inhalt hier Bezug genommen wird. Die
monoclonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente wie
z. B. als Fv, Fab, F(ab')2 verwendet werden, jedoch normaler
weise intakt, wobei die Herstellung nach an sich bekannten
Verfahren erfolgt.
Alternativ können Zellinien, die die Antikörper produzieren,
hergestellt werden durch Zellfusion zwischen geeigneten, mit
Präparaten markierten Humanmyelom-, Mäusemyelom-, Human-Mäu
se-Heteromyelom- oder Humanlymphoblastoid-Zellen mit Human-
B-Lymphozyten, um Human-Hybridzellinien zu erhalten.
Die Zellinien nach der vorliegenden Erfindung können auch
eine andere Verwendung als die für die direkte Herstellung
der humanen monoclonalen Antikörper finden. Die Zellinien
können mit anderen Zellen (wie z. B. geeigneten mit Präpara
ten markierten Humanmyelom-, Mäusemyelom-, Human-Mäuse-He
tereomyelom- oder Human-Lymphoblastoid-Zellen) verschmolzen
werden,, um Hybridome zu erhalten und somit einen Transfer
der Gene vorzusehen, die die monoclonalen Antikörper kodiert
enthalten. Alternativ können die Zellinien auch als eine
Quelle von Chromosomen verwendet werden, die die Immunglobu
line kodiert enthalten, welche isoliert und durch andere
Techniken als durch Fusion in Zellen transferiert werden
können. Zusätzlich können die Gene, die die monoclonalen
Antikörper kodiert enthalten, auch isoliert werden und unter
Anwendung der Rekombinations-DNA-Techniken zur Herstellung
des spezifischen Immunglobulins in einer Vielzahl von Wirten
verwendet werden. Insbesondere durch Herstellen von cDNA-
Büchereien (libraries) aus Messenger RNA kann ein einzelnes
cDNA-Klon, das das Immunglobulin kodiert enthält und
intron-frei ist, isoliert und in einen geeigneten prokaryo
tischen oder eukaryotischen Expressionsvector plaziert und
danach in einen Wirt zur letztlichen Massenproduktion trans
formiert werden.
Die Lymphoblastoid- oder Hybridzellinien können geklont und
ausgelesen werden in Übereinstimmung mit konventionellen
Techniken mit den Antikörpern, die in der Lage sind, an die
Epitope von verschiedenen P. aeruginosa IATS-Serotypen und
Fisher-Immunotypen zu binden und im Zell-Überstand gefunden
wurden. Durch Verwenden von Antikörpern der vorliegenden
Erfindung als Blockierungs-Antikörper bei der Auslese können
nach an sich bekannten Verfahren zusätzliche monoklonale
Antikörper isoliert werden, die dieselben Antigenen-Determi
nanten oder Epitope erkennen.
Erfindungsgemäß ist eine unsterbliche (permanente) transfor
mierte Zellinie, welche einen humanen monoklonalen Antikörper
ausscheidet, der spezifisch mit weniger als allen, aber min
destens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa rea
giert. Solche Zellinien sind bezeichnet als ATCC Nr. CRL
8941, 9171 oder 9258.
Nach einem Aspekt der Erfindung werden menschliche monoklona
le Antikörper geschaffen, die zur spezifischen Bindung an die
Liposaccharid-Determinanten in der Lage sind, die auf einer
Vielzahl jedoch nicht allen IATS-Serotypen von P. aeruginosa
vorhanden sind. Diese Determinanten können beispielsweise auf
zwei oder drei IATS-Serotypen vorhanden sein und auf Null,
einem oder mindestens zwei Fisher-Immunotypen. Solche Anti
körper können in vivo gegen einige oder alle der erkannten
Serotypen und Immunotypen, insbesondere zwei oder mehr Sero
typen schützen.
Monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung finden auch
eine weitgefächerte Anwendung in vitro. Beispielsweise können
die monoklonalen Antikörper zum Typisieren verwendet werden,
zur Isolation spezifischer P. aeruginosa-Stämme, zum selekti
ven Entfernen von P. aeruginosa-Zellen in einer heterogenen
Zellmischung oder dergleichen.
Für diagnostische Zwecke können die monoklonalen Antikörper
entweder markiert oder unmarkiert sein. Typischerweise führen
diagnostische Versuche zu einem Auffinden der Bildung
eines Komplexes durch die Bindung der monoclonalen Antikör
per an die LPS von P. aeruginosa-Organismen. Unmarkiert fin
den die Antikörper Verwendung in Agglutinations-Versuchen.
Zusätzlich können unmarkierte Antikörper in Kombination mit
anderen markierten Antikörpern (zweite Antikörper) verwendet
werden, die mit dem monoclonalen Antikörper reagieren, wie
z. B. für immunglobulinspezifische Antikörper. Andererseits
können die monoclonalen Antikörper auch direkt markiert
sein. Eine weite Vielfalt von Markierungen kann angewendet
werden, wie z. B. Radionuklide, Fluoreszenzbildner, Enzyme,
Enzymsubstrate, Enzym-Kofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden
(insbesondere Haptene), usw. Zahlreiche Typen von Immunun
tersuchungen sind verfügbar und einige davon beispielsweise
in den nachfolgenden US-Patentschriften beschrieben, auf
deren Inhalt hier Bezug genommen wird: US-Patente Nr.
3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533;
3 996 345; 4 034 074 und 4 098 876.
Die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung kön
nen auch für enzymatische Immununtersuchungen verwendet wer
den, bei denen die entsprechenden Antikörper oder zweite
Antikörper as einer verschiedenen Spezies an ein Enzym kon
jugiert werden. Wird eine Probe die P. aeruginosa eines be
stimmten Serotyps, wie z. B. menschliches Blut oder ein Lysat
davon, enthält, mit den Antikörpern nach der Erfindung kom
biniert, dann findet eine Bindng zwischen den Antikörpern
und den Molekülen statt, die das gewünschte Epitop zeigen.
Solche Zellen können von den nicht gebundenen Reagenzien
abgetrennt werden, und es kann ein zweiter Antikörper, der
mit einem Enzym markiert ist, zugegeben werden. Danach wird
das Vorhandensein des Antikörper-Enzym-Konjugats, das spezi
fisch an die Zellen gebunden ist, bestimmt. Es können auch
andere herkömmliche im Stand der Technik bekannte Techniken
angewendet werden.
Es können auch Kits vorgesehen sein, bei denen die erfin
dungsgemäßen Antikörper zum Auffinden einer P. aeruginosa-
Infektion oder des Vorhandenseins von P. aeruginosa-Antigen
verwendet werden. So kann die Zusammensetzung der erfin
dungsgemäßen monoclonalen Antikörper entweder allein oder in
Verbindung mit zusätzlichen Antikörpern, die gegenüber ande
ren gramnegativen Bakterien spezifisch sind, vorliegen und
zwar normalerweise in gefriergetrockneter Form. Die Antikör
per, die an einen Marker konjugiert sein können oder auch
unkonjugiert vorliegen können, sind im Kit normalerweise
gemeinsam vorhanden mit Puffern, wie Tris, Phosphat, Carbo
nat u. dgl., Stabilisatoren, Biociden, inerten Proteinen,
z. B. Rinderserumalbumin, o. dgl. Im allgemeinen sind diese
Materialien in Mengen von weniger als ca. 5 Gew.-%, bezogen
auf die Menge an aktivem Antikörper und gewöhnlich in Ge
samtmengen von mindestens 0,001 Gew.-%, wiederum bezogen auf
die Antikörper-Konzentration, vorhanden. Häufig ist es wün
schenswert, ein inertes Streckmittel oder Bindemittel zur
Verdünnung der aktiven Bestandteile zu verwenden, wobei das
Bindemittel bzw. Streckmittel in Mengen von ca. 1 bis
99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorliegen kann. Wird
ein zweiter Antikörper verwendet, der mit dem monoclonalen
Antikörper zur Bindung fähig ist, dann liegt dieser gewöhn
lich in einem getrennten Gefäß vor. Der zweite Antikörper
ist typischerweise an einen Marker konjugiert und in analo
ger Weise formuliert wie die oben beschriebene Antikörper-
Formulierung.
Die monoclonalen Antikörper nach der Erfindung können auch
als Bestandteile von pharmazeutischen Zusammensetzungen vor
liegen, die eine therapeutische oder prophylaktische Menge
von mindestens einem der monoclonalen Antikörpern nach der
Erfindung zusammen mit einem pharmazeutischen wirksamen Trä
ger enthält. Ein pharmazeutischer Träger kann irgendeine
verträgliche nichttoxische Substanz sein, die zum Überführen
der monoclonalen Antikörper auf den Patienten geeignet ist.
Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststof
fe können als Träger verwendet werden. Pharmazeutisch aner
kannte Hilfsstoffe (Puffer, Dispergierungsmittel) können
ebenfalls in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht
werden. Solche Zusammensetzungen können einen einzelnen mo
noclonalen Antikörper, wie z. B. einen der gegen zwei oder
mehr aber nicht alle IATS-Serotypen von P. aeruginosa spezi
fisch ist, enthalten. Andererseits kann eine pharmazeutische
Zusammensetzung auch zwei oder mehr monoclonale Antikörper
unter Bildung eines "Cocktails" enthalten. Beispielsweise
kann ein Cocktail menschliche monoclonale Antikörper gegen
Gruppen von verschiedenen P. aeruginosa-Serotypen und Immu
notypen enthalten und so ein universelles Produkt mit Akti
vität gegen die überwiegende Anzahl der klinischen Isolate
des bestimmten Bakteriums darstellen.
Von Interesse sind prophylaktische und/oder therapeutische
monoclonale Antikörper-Zusammensetzungen, die zur Reaktion
mit mindetens drei IATS-Serotypen, normalerweise mindestens
vier und insbesondere gewöhnlich mindestens fünf IATS-Sero
typen fähig sind. Von besonderem Interesse sind monoclonale
Antikörper-Zusammensetzungen, die mit mindestens ca. sieben,
vorzugsweise mit mindestens zehn bis vierzehn und sogar mit
bis zu allen siebzehn IATS-Serotypen reagieren können. In
Verbindung mit den IATS-Serotypen ist es wünschenswert, daß
die Zusammensetzungen auch mit mindestens einem, vorzugs
weise mindestens zwei und insbesondere mindestens drei oder
vier und bis zu einschließlich allen sieben Immunotypen des
Fisher-Immunotyp-Systems reagieren können.
Jede der Zusammensetzungen kann mindestens einen, normaler
weise mindestens zwei und insbesondere mindestens drei oder
mehr Antikörper enthalten, wobei jeder Antikörper mit minde
stens 2, 3, 4 oder mehr, jedoch nicht allen IATS-Serotypen
reagt. Bevorzugt ist mindestens ein monoclonaler Antikörper
vorgesehen, der an mindestens zwei IATS-Serotypen und einen
oder mehr Fisher-Immunotypen, vorzugsweise mindestens zwei
Immunotypen, bindet.
Vorzugsweise ist die Gesamtanzahl an verschiedenen monoclo
nalen Antikörpern in einer Zusammensetzung mindestens eins
und gleich oder weniger als ca. einhalb der gesamten Anzahl
von IATS-Serotypen, mit welchen die Zusammensetzungen rea
gieren, normalerweise ein Drittel dieser Gesamtzahl.
Das Mol-Verhältnis der verschiedenen monoclonalen Antikör
per-Bestandteile ist normalerweise nicht mehr als um den
Faktor 10, insbesondere nicht mehr als um den Faktor 5 ver
schieden. Das Mol-Verhältnis liegt normalerweise bei etwa
1 : 1-2 zu jedem der anderen Antikörper-Bestandteile.
Die erfindungsgemäßen humanen monoclonalen Antikörper können
auch in Kombination mit anderen monoclonalen Antikörper-Zu
sammensetzungen oder mit existierenden Blutplasma-Produkten
verwendet werden, wie im Handel erhältlichen Gammaglobulin-
und Immunglobulin-Produkten, die zur prophylaktischen oder
therapeutischen Behandlung von P. aeruginosa-Erkrankungen
beim Menschen verwendet werden können. So wird für Immunglo
buline das Plasma vorzugsweise von menschlichen Spendern
erhalten, die erhöhte Spiegel von mit P, aeruginosa-reakti
ven Immunglobulinen besitzen. Es sei hier generell auf das
Compendium "Intravenous Immune Globulin and the Comprised
Host," Amer. J. Med., 76(3a), März 30, 1984, Seiten 1-231,
verwiesen, auf das hier Bezug genommen wird.
Die monoclonalen Antikörper nach der Erfindung können auch
als getrennt zu verabreichende Zusammensetzungen verwendet
werden, die in Verbindung mit Antibiotika oder antimikro
biellen Mitteln gegeben werden. Typischerweise können die
antimikrobiellen Mittel ein anti-pseudomonales Penicillin
(z. B. Carbenicillin) in Verbindung mit einem Aminoglycosid
(z. B. Gentamicin, Tobramicin usw.) einschließen, es sind
jedoch auch zahlreiche zusätzliche Mittel (wie z. B. Cephalo
sporine), die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind,
verwendbar.
Die erfindungsgemäßen humanen monoclonalen Antikörper und
pharmazeutischen Zusammensetzungen davon sind besonders
brauchbar für die orale oder parenterale Verabreichung. Vor
zugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen pa
renteral verabreicht, z. B. subkutan, intramuskulär oder
intravenös. Die Erfindung schafft somit Zusammensetzungen
für die parenterale Verabreichung, welche eine Lösung des
humanen monoclonalen Antikörpers oder ein Cocktail davon in
einem akzeptierbaren, als Lösungsmittel dienenden Träger,
vorzugsweise einem wäßrigen Träger darstellen. Eine Vielzahl
von wäßrigen Trägern kann verwendet werden, so z. B. Wasser,
gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%ige Gly
cinlösung u. dgl. Diese Lösungen sind steril und im allge
meinen frei von nichtgelöstem Material. Die Zusammensetzun
gen können durch herkömmliche Sterilisationstechniken steri
lisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch
akzeptierbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie z. B. zum Errei
chen physiologischer Bedingungen erforderlich sind, wie pH-
einstellende und puffernde Mittel, die Toxidität einstellen
de Mittel u. dgl. Beispiele hierfür sind Natriumacetat, Na
triumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat
u. dgl. Die Konzentration der Antikörper in diesen Formlie
rungen kann in weiten Grenzen variieren, d. h. von weniger
als ca. 0,5%, normalerweise bei oder mindestens ca. 1% bis
zu 15 oder 20% (als Gewichtsprozent), wobei sich die Kon
zentrationen vorwiegend nach den Flüssigkeitsvolumina den
Viskositäten usw. und insbesondere nach der bestimmten Ver
abreichungsweise richten.
So kann eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für
die intramuskuläre Injektion 1 ml steriles gepuffertes Was
ser und 50 mg monoclonalen Antikörper enthalten. Eine typi
sche Zusammensetzung für die intravenöse Infusion kann
250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg monoclonalen
Antikörper enthalten. Aktuelle Methoden zur Herstellung pa
renteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind bekannt und
sind beispielsweise näher beschrieben in Remington's Pharma
ceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company,
Easton Pennsylvania (1980), worauf hier Bezug genommen wird.
Die monoclonalen Antikörper nach der Erfindung können zur
Lagerung gefriergetrocknet und in einem geeigneten Träger
vor der Verwendung rekonstituiert werden. Diese Technik hat
sich als wirksam bei herkömmlichen Immunglobulinen erwiesen,
und es können bekannte Lyophilisations- und Rekonstitutions
techniken angewendet werden. Es kann von den Fachleuten wei
terhin berücksichtigt werden, daß die Lyophilisation und die
Rekonstitution zu unterschiedlichen Maßen an Aktivitätsver
lust des Antikörpers führen kann (z. B. neigen bei herkömmli
chen Immunglobulinen die IgM-Antikörper zu stärkeren Aktivi
tätsverlusten als die IgG-Antikörper) und daß solche Aktivi
tätsverluste im Hinblick auf den anzuwendenden Spiegel kom
pensiert werden können.
Die Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen humanen
monoclonalen Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten,
können zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behand
lung von P. aeruginosa-Infektionen verabreicht werden. Für
die therapeutische Anwendung werden die Zusammensetzungen
einem bereits mit einem oder mehreren P. aeruginosa-Sero
typen infizierten Patienten in Mengen verabreicht, die zur
Heilung oder mindestens zum teilweisen Abstoppen der Infek
tion und ihrer Komplikationen ausreicht. Eine entsprechende
Menge, dies zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame
Dosis" bezeichnet. Die für diesen Zweck wirksamen Mengen
hängen von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen
Zustand des Immunsystems des Patienten ab, und liegen im
allgemeinen im Bereich von ca. 1 bis ca. 200 mg Antikörper
pro Kilogramm Körpergewicht, wobei Dosismengen von 5 bis
25 mg pro Kilogramm gebräuchlicher sind. Es ist zu beachten,
daß die Materialien nach der Erfindung im allgemeinen bei
schweren Erkrankungszuständen, d. h. in lebensbedrohlichen
oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen angewendet
werden, insbesondere bei Bakteriämie und Endotoxämie auf
grund von P. aeruginosa. In solchen Fällen ist es im Hin
blick auf die Abwesenheit von Fremdsubstanzen und die Abwe
senheit einer Abwehr gegen Fremdsubstanzen, was durch die
Bereitstellung der menschlichen monoclonalen Antikörper nach
der Erfindung erzielt ist, möglich und für den behandelnden
Arzt jedenfalls auch wünschenswert, erheblich höhere Mengen
dieser Antikörper zu verabreichen.
Für prophylaktische Anwendungen werden Zusammensetzungen,
die den erfindungsgemäßen Antikörper oder einen Cocktail
davon enthalten, einem Patienten verabreicht, der noch nicht
durch P. aeruginosa infiziert ist, um die Widerstandskraft
des Patienten gegen eine potentielle Infektion zu erhöhen.
Eine solche Menge wird als "prophylaktisch wirksame Dosis"
bezeichnet. Für diese Anwendung hängen die genauen Mengen
wiederum von dem Gesundheitszustand des Patienten und seinem
allgemeinen Immunitätsspiegel ab, jedoch liegen die Mengen
gewöhnlich im Bereich von 0,1 bis 25 mg pro Kilogramm, ins
besondere im Bereich von 0,5 bis 2,5 mg pro Kilogramm.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzun
gen können mit Dosisspiegeln und Verabreichungsschemata
durchgeführt werden, die vom behandelnden Arzt gewählt wer
den. Auf jeden Fall sollte die pharmazeutische Formulierung
eine zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreichende
Menge des bzw. der Antikörper nach der Erfindung bereit
stellen.
Beispiel 1 zeigt die Methoden für die Herstellung menschli
cher monoclonaler Antikörper (IgM-Isotyp), die mit IATS-
Serotypen 2, 5 und 16 und Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagie
ren.
Eine periphere Blutprobe, erhalten von einem Patienten mit
zystischer Fibrose, von dem bekannt ist, daß er chronische
Infektionen mit P. aeruginosa hatte, diente als Quelle für
Human-B-Zellen. Mononukleare Zellen wurden aus dem Blut
durch übliche Zentrifugations-Techniken auf Ficoll-Paque
(Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968) 21: Suppl.
97, 77-89) abgetrennt und zweimal mit calcium/magnesium
freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
Die mononuklearen Zellen wurden von T-Zellen unter Verwen
dung eines modifizierten E-Rosetten-Verfahrens befreit. Kurz
gesagt wurden die Zellen zuerst bis zu einer Konzentration
von 1 × 107 Zellen/ml in PBS, das 20% fötales Kalbsserum
(PCS) enthielt bei 4°C resuspendiert. Ein Milliliter dieser
Suspension wurde dann in ein Polystyrol-Rohr mit rundem Bo
den mit den Maßen 17 × 100 mm gegeben, dem 1 × 109 mit 2-
Amino-isothiouronium-bromid(AET) behandelte rote Blutkör
perchen vom Schafaus einer 10%igen (V/V)-Lösung in
Incove's-modifizierten Dulbecco's-Medium (Iscove's Medium)
zugegeben wurden (Madsen, M. und Johnson, H. E., J. Immun.
Methods (1979) 27: 61-74). Die Suspension wurde 5-10 Minu
ten lang bei 4°C vorsichtig gemischt, wonach die E-roset
tierten Zellen durch Zentrifugation auf Ficoll-Paque während
8 Minuten bei 2500 xg bei 4°C entfernt wurden. Die auf E-
Rosetten negativen mononuklearen Zellen des peripheren Blu
tes (E-PBMC), die einen Streifen an der Grenzschicht bilde
ten, wurden gesammelt und einmal in Iscove's-Medium gewa
schen und im gleichen Medium resuspendiert, das 15% (V/V)
FCS, L-Glutamin (2mMol/l), Penicillin (100 IU/ml), Strepto
mycin (100 µg/ml), Hypoxanthin (1 × 10-4 M), Aminopterin
(4 × 10-7 M) und Thymidin (1,6 × 10-5 M) enthielt. Dieses Me
dium wird nachfolgend als HAT-Medium bezeichnet.
Zellengeführte Transformation der E-PBMC wurde durch Kokul
tivieren dieser Zellen mit einer transformierenden Zellinie
durchgeführt. Diese transformierende Zellinie war eine Ep
stein-Barr-Kernantigen (EBNA) positive humane Lymphoblasto
id-Zellinie, die durch Äthyl-methansulfonat(EMS)-mutagenese
der GM 1500 Lymphoblastoid-Zellinie abgeleitet war, gefolgt
durch Selektion in Gegenwart von 30 µg/ml 6-Thioguanin, um
die Zellen in Bezug auf Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-
Transferase (HGPRT) defizient und somit HAT sensitiv zu
machen. Diese Zellinie wurde als 1A2-Zellinie bezeichnet und
beim American Type Culture Collection (A.T.C.C.) am 29. März
1982 unter der A.T.C.C.-Nr. CRL 8119 hinterlegt. 1A2-Zellen
in der logarithmischen Waschtumsphase wurden in HAT-Medium
suspendiert und dann mit den E-PBMC bei einem Verhältnis von
acht 1A2-Zellen pro E PBPiC kombiniert. Die Zellmischung wur
de in acht einen runden Boden aufweisende 96-Loch Mikroti
terplatten (Costar 3799) bei einer Konzentration von 72000
Zellen/Loch in einem Volumen von 200 µl/Loch gegeben und bei
37°C in einer befeuchteten Atmosphäre die 6% CO2 enthielt,
inkubiert. Die Kulturen wurden an den Tagen 5 und 8 nach dem
Einbringen durch Ersatz der Hälfte des Überstandes mit fri
schem HAT-Medium gefüttert. Die Löcher wurden jeden Tag auf
einem umgekehrten Mikroskop auf Anzeichen von Zellprolifera
tion beobachtet. Zwölf Tage nach dem Einbringen in die Plat
te wurde beobachtet, daß 100% der Löcher proliferierende
Zellen enthielten und daß in den meisten Löchern die Zellen
eine ausreichende Dichte hatten, um entfernt werden zu kön
nen und den Überstand auf Anti-P. aeruginosa-Antikörper
untersuchen zu können.
Die Überstände wurden auf das Vorhandensein von Anti-P.
aeruginosa-Antikörper unter Anwendung einer Immunabsorp
tions-Untersuchungstechnik mit gebundenem Enzym (ELISA) ge
prüft (Engvall, E., (1977) 55: 193-200). Die Antigen-Platten
bestanden aus 96-Loch Mikrotiterplatten mit flachem Boden
(Immulon II, Dynatech), deren Löcher verschiedene lebende
Bakterien enthielten, die am Lochboden adsorbiert waren. Um
die Adsorption der Bakterien an den Kunststoff zu erleich
tern, wurden 50 µl/Loch Poly-L-Lysin (PLL) (1 µg/ml in PBS,
pH 7,2) während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das
nicht adsorbierte PLL wurde dann entfernt, die Platten ein
mal mit PBS gewaschen, und 50 µl der gewaschenen Bakterien
suspension (OD660 = 0.2) in PBS wurden jedem Loch zugegeben
und die Platten eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nicht
adsorbierte Bakterien wurden entfernt, indem die Platten
dreimal mit Kochsalz-Tween [0,9% NaCl, 0,05% (V/V)
Tween-20] gewaschen wurden. Verschiedene Antigenplatten
wurden in die Prüfung einbezogen: (1) eine Mischung von P.
aeruginosa Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4 (A.T.C.C. Nrn.
27312, 27313, 27315); (2) eine Mischung von P. aeruginosa
Fisher-Immunotypen 3, 5, 6 und 7 (A.T.C.C. Nrn. 27314,
27316, 27317 bzw. 27318); und (3) eine Mikrotiterplatte
ohne Bakterien.
Die ELISA wurde eingeleitet, indem die Platten zuerst mit
200 µl/Loch Blockierungspuffer [PBS, pH 7,2, enthaltend 5%
(Gew./V) nichtfette trockene Milch, 0,01% (ViV) Entschäumer
(Antifoam A - Sigma) und 0,01% (Gew./V) Thimerosal] wäh
rend 20 Minuten bei Raumtemperatur blockiert wurden. Nach
dem Blockieren wurden die Platten dreimal mit Kochsalz-Tween
gewaschen. 50 µl PBS, pH 7,2, enthaltend 0,1% Tween-20 und
0,2% (Gew./V) Rinderserum Albumin (BSA) wurden dann in alle
Löcher gegeben. Die Überstände aus den Löchern der Kultur
platten wurden wiederum in die entsprechenden Löcher der
Antigenplatten (50 µl/Loch) gegeben und die Platten wurden
dann während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Überstände wurden dann entfernt, die Löcher dreimal mit
Kochsalz-Tween gewaschen, und 50 µl geeignet verdünntes, mit
Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziegenantihuman-
IgG + IgM (American Qualax International #A1114 + #A1124)
wurden zu den Löchern gegeben. In diesem Beispiel wurden
HRP-Ziegenanti-IgG und HRP-Ziegenanti-IgM in einer letztli
chen Verdünnung von 1 : 5000 bzw. 1 : 3000 in PBS, pH 7,2,
das 0,05% Tween-20 und 0,1% BSA enthielt, verwendet. Im
Anschluß an eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur
wurden überschüssige mit Enzym konjugierte Ziegen-Antikörper
entfernt, und die Löcher wurden dreimal mit Kochsalz-Tween
gewaschen. 100 µl Substrat (0,8 mg/ml o-Phenylendiamin-di
hydrochlorid in 100 mM Zitratpuffer, pH 5,0 und 0,03% H2O2
in entionisiertes Wasser, in gleichen Mengen kurz vor dem
Eingeben gemischt) wurden dann jedem Loch zugegeben. Nach
einer 30-minütigen Inkubation im Dunkeln wurden 50 µl 3 N
H2SO4 zu allen Löchern zugegeben, um die Reaktionen zu been
den. Die Kulturüberstände, die mit dem Antigen der Platten
reagierende Antikörper enthielten, wurden durch positive
Farbentwicklung in den entsprechenden Löchern untersucht,
und die Stärke der Reaktion durch Messen der Absorption bei
490 nm auf einem Bio-Tek EL-310 Mikro-ELISA-Leser quantifi
ziert.
Eine Analyse der Kulturüberstände durch das obige Verfahren
führte zu der Identifizierung von zwei Löchern (1C1 und
2H12), welche Anti-P. aeruginosa-Antikörper enthielten, die
mit der Platte der Fisher-Immunotypen 3, 5, 6 und 7, aber
nicht mit der Platte der Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4 und
nicht mit der bakterienfreien Platte reagierten. Um den bzw.
die erkannten spezifischen Fisher-Immunotypen zu identifi
zieren, wurden Antigenplatten, die PLL-fixierte Bakterien
von nur einem Fisher-Immunotyp enthielten, wie oben be
schrieben, für jeden Immunotyp hergestellt. Die Durchführung
des ELISA-Tests, wie oben beschrieben, mit Kulturüberständen
aus den Löchern 1C1 und 2H12 auf den individuellen Immuno
typ-Platten ergab, daß diese zwei Löcher Antikörper enthiel
ten, der gegen beide Fisher-Immunotypen 3 und 7 spezifisch
war. Ein ähnlicher ELISA-Test der an der IATS-Reihe von P.
aeruginosa typisierenden Stämmen (erhalten vom A.T.C.C. und
umfassend die Nrn. 33348-33364) durchgeführt wurde, zeigte,
daß Antikörper in Löchern 1C1 und 2H12 spezifisch mit IATS-
Stämmen 2, 5 und 16 regierten.
Die Isotypen des bzw. der reaktiven Antikörper in den Lö
chern 1C1 und 2H12 wurde in einem ELISA-Test in ähnlicher
Weise wie in den oben beschriebenen Spezifitätstests be
stimmt, mit der Ausnahme, daß das HPR-Ziegen-Antihuman-IgG
und HRP-Ziegen-Antihuman-IGM unabhängig als Reagenzien der
zweiten Stufe verwendet wurden, anstatt kombiniert zu wer
den. Positive Reaktion des bzw. der Antikörper in den Lö
chern 1C1 und 2H12 mit Fisher-Immunotypen 3 und 7 wurden nur
mit den Anti-IgM-Reagenzien beobachtet als Hinweis auf einen
IgM-Isotyp des bzw. der relevanten Antikörper in jedem Loch.
Um herauszufinden, ob das Anti-Fisher-Immunotyp 3 und 7-
Reaktionsmuster auf einen oder auf mehrere Antikörper in den
Löchern 1 C1 und 2H12 zurückzuführen ist (d. h. ein Antikörper
mit beiden Fisher-Immunotypen 3 und 7 reaktiv ist oder zwei
Antikörper vorliegen, von denen einer mit Fisher-Immunotyp 3
und der andere mit Fisher-Immunotyp 7 reagiert), wurden Zel
len aus beiden Löchern einer Subkultur bei geringer Dichte
unterworfen, und die Löcher, die Proliferationszellen ent
hielten, wurden auf Antikörper-Aktivität auf getrennten
Fisher-Immunotyp 3- und Fisher-Immunotyp 7-Bakterienantigen
platten untersucht. Die Subkultur wurde in 96-Loch-Platten
mit mit rundem Boden bei einer Dichte von 5 Zellen/Loch in
einem Gesamtvolumen von 100 µl HAT-Medium, dem die Amino
pterin-Komponente fehlte (HT-Medium) durchgeführt. Nicht
transformierende, HAT-sensitive Lymphoblastoid-Zellen wurden
in alle Löcher mit einer Dichte von 500 Zellen/Loch als Füt
terzellen eingegeben. Vier Tage nach dem Eingeben wurde
100 µl HAT-Medium allen Löchern zugegeben, um die Fütterzel
len selektiv zu töten. Die Löcher wurden am neunten Tag nach
dem Einsetzen durch Ersatz der Hälfte des Überstandes mit
HAT-Medium erneut gefüttert. Danach wurden die Löcher in
ähnlicher Weise alle 4-5 Tage mit HAT-Medium gefüttert,
bis die Löcher eine ausreichende Lymphoblastoid-Zelldichte
für eine Analyse des Überstandes durch ELISA besaßen. Bei
der Prüfung auf individuellen Fisher-Immunotyp 3- und
Fisher-Immunotyp 7-Antigenplatten reagierten alle Überstän
de, die mit Fisher-Immunotyp 3 reagierten, ebenfalls mit
Fisher-Immunotyp 7, was anzeigt, daß ein Antikörper verant
wortlich ist für die Aktivität mit beiden Fisher-Immuno
typen. Zufällig ausgewählte Überstände zeigten bei der Prü
fung auf IATS-Stämme 2, 5 und 16, daß sie mit allen drei
Stämmen reagierten anstatt mit nur einzelnen Stämmen, was
weiterhin die Schlußfolgerung stützt, daß ein Antikörper die
Kreuzreaktion mit Fisher-Immunotypen 3 und 7 und IATS-Stäm
men 2, 5 und 16 zeigt.
Das Klonen von spezifischen Antikörper produzierenden Zellen
aus den Löchern 1C1 und 2H12 wurde durchgeführt, indem die
Zellen aus jedem Loch unabhängig einigen Runden des begren
zenden Verdünnungs-Klonens unterworfen wurden bis alle klo
nalen Überstände, die durch das obige ELISA-Protokoll ge
prüft wurden, zur einer positiven Reaktion auf Fisher-Immu
notypen 3 und 7 und IATS-Stämme 2, 5 und 16 führte. Beim
Klonen wurden Fütterzellen verwendet, wie oben beschrieben
für die Subkultur. Auf diese Weise wurden zwei geklonte
transformierte Humanzellinien (1C1 und 2H12) erhalten, wel
che kontinuierlich (permanent, unsterblich) sind und welche
jeweils humane monoclonale Antikörper, die mit Fisher-Im
munotypen 3 und 7 und IATS-Stämmen 2, 5 und 16 reagieren,
sekretieren. In diesem Beispiel tragen die Zellinien und ihr
produzierter Antikörper dieselbe Bezeichnung.
Beispiel II zeigt Methoden für die Herstellung von humanen
monoclonalen Antikkörpern (IgG-Isotyp), welche mit IATS-
Serotypen 2, 5 und 16 und Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagie
ren. Die Protokolle für die Herstellung sind im wesentlichen
identisch mit Beispiel 1. Kurz gesagt, eine Probe aus peri
pherem Blut, die von einem Patienten mit zystischer Fibrose
erhalten war, von dem bekannt war, daß er eine chronische
Infektion mit P. aeruginosa hatte, diente als Quelle für
Human-B-Zellen. Mononukleare Zellen wurden, wie in Beispiel
I beschrieben, abgetrennt mit der Ausnahme, daß 1,6 ml PBS-
Suspension mit einer Suspension von 1,6 × 109 AET-behandel
ten roten Blutzellen vom Schaf verwendet wurden. Die Zell
geführte Transformation war ebenfalls dieselbe mit folgender
Ausnahme: das Verhältnis von 1A2 Zellen pro E-PBMC war 7,5;
fünfzehn Platten mit 17.000 Zellen/Loch wurden verwendet;
die Kulturen wurden 6 und 10 Tage nach dem Einbringen gefüt
tert; und 16 Tage nach dem Einbringen enthielten im wesent
lichen alle Löcher proliferierte Zellen.
Das Prüfen der Kultur-Überstände auf spezifische Antikörper
wurde wie beschrieben durchgeführt und führte zur Lokalisie
rung eines Lochs (9D1), das einen Antikkörper enthielt, der
mit der Fisher-Immunotyp 3-, 5-, 6- und 7-Platte jedoch
nicht mit der Fisher-Immunotyp 1-, 2- und 4-Platte und nicht
mit der bakterienfreien Platte reagierte. Die Durchführung
der beschriebenen ELISA-Prüfung auf einzelnen Immunotyp-
oder Serotyp-Bakterien-Antigenplatten mit 9D1-Kulturüber
ständen zeigte einen Antikörper, der sowohl gegen die beiden
Fisher-Typen 3 und 7 als auch gegen die IATS-Stämme 2, 5 und
16 spezifisch war. Nachfolgende Untersuchungen entsprechend
Beispiel 1 zeigten, daß die Antikörperspezifität in Loch 9D1
auf ein einzelnes Klon zurückzuführen war, das den IgG-Iso
typ-Antikörper sekretiert.
Beispiel III zeigt die antigene Spezifität von einigen der
Antikörper der vorliegenden Erfindung. Um zu bestimmen, ob
monoclonale Antikörper 1C1, 2H12 und 9D1 mit demselben anti
genen Ziel reagierten und somit im Hinblick auf die Spezifi
tät identisch sind, wurden zusätzliche Prüfungen durchge
führt. Zuerst wurden die Antikörper in einem ELISA-Test an
hand einer Reihe von Referenz-Stämmen und klinischen Isola
ten von P. aeruginosa verglichen. Das ELISA-Protokoll war
wie oben beschrieben mit der Ausnahme der folgenden Abände
rung: 1) Anstelle von Bakterien, die an mit PLL-beschichte
ten Platten adsorbiert waren, enthielten die Plattenlöcher
verschiedene ganze Bakterien, die mit Äthanol an den Lochbo
den fixiert waren. Die Platten wurden bereitet durch Zugabe
von 50 µl gewaschener Bakteriensuspension (OD660 = 0,2) in
PBS in die Löcher, Zentrifugation der Platten während 20 Mi
nuten bei 500 × g, Aspiration von PBS, Zugabe von 75 µl
Äthanol für 10 Minuten, Entfernen des Äthanols, gefolgt
durch Lufttrocknung. Eingegeben in die Antigenplatten wurden
IATS-Stämme 2, 5, 11 und 16 (A.T.C.C. Nrn. 33349, 33352,
33358 bzw. 33363) und sechzehn klinische Isolate, die zuvor
typisiert wurden sowohl durch Agglutination mit Difco
[Detroit, Michigan] Bacto-Pseudomonas aeruginosa-Antiseren
entsprechend den Anweisungen des Herstellers als auch durch
ELISA (wie hier beschrieben) und zwar als Serotypen 2, 5, 16
oder eine Kombination solcher Serotypen; 2) Kaninchen-Typ-
Antiseren wurden verwendet in einer Verdünnung von 1 : 500
in PBS anstelle von Anti-IATS-16, welches 1 : 250 verdünnt
war. Kultur-Überstände enthaltend 1C1, 2H12 und 9D1 Antikör
per wurden als solche verwendet; 3) Als Reagenzien der
zweiten Stufe wurden biotinyliertes Protein A (B-2001,
Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 1 : 500 verdünnt
und biotinyliertes Ziegenanti-Human-Ig (4703, Tago, Ic.,
Burlingame, CA) 1 : 500 verdünnt zum Aufspüren von Kanin
chen-Antikörpern bzw. Human-Antikörpern verwendet. 50 µl
Reagenz wurden den zugehörigen Löchern zugegeben, und nach
eine 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden unge
bundenes Reagenz entfernt und die Löcher dreimal gewaschen.
50 µl eines vorgeformten Avidin: biotinylierten Meerrettich-
Peroxidase-Komplexes (Vectastain ABC Kit, Vector Laborato
ries, Inc., Burlingame, CA) wurden dann jedem Loch zugege
ben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde
das überschüssige Vectastain ABC-Reagenz entfernt, und die
Löcher vor Zugabe des Substrates erneut dreimal gewaschen.
Wie in Tabelle II zu sehen, zeigen die Ergebnisse der Prü
fung, daß die Antikörper 1C1 und 9D1 mit jedem klinischen
Isolat, das als ein IATS 2, 5 oder 16 Serotyp typisiert ist,
reagierte, dagegen aber der Antikörper 2H12 mit diesen drei
Isolaten nicht reagierte. Daraus kann geschlossen werden,
daß Antikörper 2H12 ein Epitop erkennt, das verschieden ist
von dem, den 1C1 oder 9D1 erkennen, und daß die beiden Epi
tope anscheinend auf den meisten aber nicht allen klinischen
Isolaten, die den IATS-Serotypen 2, 5 oder 16 entsprechen,
koordiniert ausgedrückt werden.
TABELLE II
Reaktivitätsmuster von Difco Bacto-P. aeruginosa-Antiseren
und humanen monoclonalen Antikörpern 2H12, 1C1 und 9D1 auf
typisierte Stämme und klinische Isolate von P. aeruginosa
Die Daten lassen weiterhin erkennen, daß das molekulare Ziel
bzw. Muster das von den Antikörpern 1C1 und 9D1 erkannt wird
in gleicher Weise vorhanden ist auf allen klinischen Isola
ten von P. aeruginosa, welche als zu den IATS-Serotypen 2,
15 oder 16 gehörig typisiert werden konnten, wogegen das
Ziel bzw. Muster, das vom Antikörper 2H12 erkannt wird, nur
auf einer Untergruppe solcher Isolate ausgedrückt ist.
Zur Bestimmung, ob die 1C1, 2H12 und 9D1 Antikörper mit ver
schiedenen Antigenen reagierten oder alternativ mit ver
schiedenen Epitopen auf demselben Antigen, wobei solche Epi
tope auf den meisten, jedoch nicht allen IATS 2-, 5- und
16-Serotypen ausgedrückt sind, wurde eine Immunoblot-Analyse
durchgeführt. Da die geteilte Antigenitität zwischen den
IATS-Stämmem 2, 5 und 16 offensichtlich auf wärmestabile
Antigene zurückzuführen ist (Liu, P. V. et al., supra) und in
Anbetracht der Tatsache, daß die erwähnte Wärmestabilität
charakteristisch für Lipopolysaccharid-Moleküle ist, wurden
LPS-Präparationen aus IATS-Stämmen 2, 5, 16 und 11 als anti
gene Präparationen für die Analyse ausgewählt. Rohes LPS
wurde aus den typisierten Stämmen durch Extraktion in Koch
salzlösung bei 60°C hergestellt (Orskov, F. et al., Acta.
Path. Microbiol. Scand. (1971) Section B 79: 142-152). 10 µg
LPS, bestimmt durch den 2-Keto-3-deoxyoctonat-Gehalt (KDO)
(Karkhanis, Y. D., et al., Anal. Biochem. (1978) 85: 595-
601), von jedem der Serotypen wurde einer Natriumdodecylsul
fat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (Hancock,
R. E. W. und Carey, A. M., J. Bacteriol. (1977) 140: 901-910)
auf einem 10-20%-Gradienten-Gel unterworfen. Getrennte
Molekulararten wurden vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran
(NCM) in bekannter Weise überführt (Towbin, H. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 4350-4354) und der NCM-Blot
wurde eine Stunde lang in PBS-Tween blockiert (Batteiger,
B., et al., J. Immunol. Meth. (1982) 55: 297-307). Die Blots
wurden dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 20 ml
erschöpftem Kulturüberstand der 1C1-, 2H12- oder 9D1-Zelli
nien inkubiert. Im Anschluß an ein 5-minütiges Spülen in
PBS-Tween, wurde jeder der NCM-Blots eine Stunde lang bei
25°C in einer 1 : 1000 oder 1 : 1500-Verdünnung (in PBS-
Tween) von mit alkalischer Phosphatase konugierten Ziegen-
Antihuman-IgG + IgA + IgM (Zymed) inkubiert. Die Blots wur
den dann 5-minütigen Waschungen in PBS-Tween unterworfen,
wonach Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen durch Inkubieren
der Blots während 15-20 Minuten bei 25°C in 30 ml Nitro
blau-tetrazolium/5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBTBCIP)
Substrat sichtbar gemacht wurden wie beschrieben von Leary
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 4045-4049. Die
Farbentwicklung wurde durch mehrmaliges Spülen der Blots in
entionisiertem Wasser gestoppt.
Die mit den drei Antikörpern erhaltenen Blot-Profile waren
merklich verschieden. Antikörper 2H12 erkannte vorwiegend
eine kurze Reihe von leiterartig in regelmäßigen Abständen
befindlichen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht in den
Antigen-Präparationen der Serotypen 2, 5 und 16. Einige in
regelmäßigen Abständen angeordnete Moleküle mit höherem Mo
lekulargewicht wurden ebenfalls schwach erkannt. Keine Reak
tion wurde beobachtet auf der LPS-Präparation von Serotyp
11. Eine Wiederholung der Immunoblot-Analyse unter Verwen
dung von LPS-Präparationen, die zuvor mit Proteinase K bei
60°C behandelt wurden, um Proteinantigene zu zerstören,
führten zu keinen Änderungen im Profil. Die Banden mit nied
rigem Molekulargewicht korrespondierten präzise mit den
kleineren Formen von LPS-Molekülen, wie in einem ähnlich
durchgeführten SDS-PAGE-Gel sichtbar gemacht wurde, wobei
die Antigene nicht auf ein NCM überführt, statt dessen je
doch spezifisch auf das Vorhandensein von LPS angefärbt wur
den (Tsai, C. M. und Frasch, C. E., Anal. Biochem. (1982) 119:
115-119), mit der Ausnahme, daß die niedrigste Bande auf dem
silber-gefärbten Gel (die die Kernregion plus Lipid A von
LPS repräsentiert) nicht erkannt wurde. Antikörper 1C1 er
kannte dieselbe Reihe von regelmäßig im Abstand befindlichen
Molekülen mit niederem Molekulargewicht unter den Antigen-
Präparationen der Serotypen 2, 5 und 16, jedoch nicht 11,
wenn auch die Intensität der Reaktion nicht so stark war wie
mit 2H12. Zusätzlich erkannte dieser Antikörper jedoch her
vorragend eine Reihe von in regelmäßigen Abständen angeord
neten Molekülen mit höherem Molekulargewicht auf den Sero
typen 2, 5 und 16, welche in Kombination mit den erkannten
Banden mit niedrigem Molekulargewicht distinkte, voll lei
terartige Profile ergaben. Diese Profile wurden durch Vorbe
handlung der Antigen-Präparationen mit Proteinase K nicht
geändert. Wiederum entsprachen die Profile den leiterartigen
Bandmustern, die im LPS spezifisch gefärbten Gel beobachtet
wurden (d. h. sie entsprachen sich offensichtlich Bande für
Bande), mit der Ausnahme, daß die den Kern plus Lipid A re
präsentierende Bande nicht erkannt wurde. Antikörper 9D1
hatte dasselbe Reaktionsprofil wie Antikörper 1C1 auf den
IATS 2-, 5- und 16- jedoch nicht 11-Stämmen. Wiederum wurde
die bodennächste Bande der Leiter eines silber-gefärbten
Gels der verschiedenen LPS-Präparationen nicht erkannt, und
das Gesamtprofil wurde durch Vorbehandlung der LPS-Präpara
tionen mit Proteinase K nicht geändert. Zusammenfassend zei
gen diese Beobachtungen, daß die LPS der Serotypen 2, 5 und
16 das molekulare Muster ist, die von den Antikörpern 2H12,
1C1 und 9D1 erkannt werden.
Beispiel IV zeigt die Schutzwirkung eines der Antikörper
nach der Erfindung.
Zum Einschätzen der in vivo-Schutzwirkung von Antikörper 1C1
wurden Tierschutzversuche an Mäusen durchgeführt. 1C1-Anti
körper wurde zunächst aus dem Überstand einer erschöpften
Kultur durch Präzipitation mit gesättigtem Amoniumsulfat
(50% Endkonzentration) konzentriert (Good, A. H., et al.,
Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B. B. und
Shiigi, S. M., eds., W. J. Freeman & Co., San Francisco, CA,
279-286 (1980)). Das ausgefällte Material wurde in einem
minimalen Volumen sterilen Wassers rekonstituiert, extensiv
gegen PBS dialysiert und steril-filtriert. Als Negativ-Kon
trolle wurde der Überstand einer erschöpften Kultur einer
anderen transformierten humanen Zellinie (6F11-A.T.C.C.
Nr. CRL 8562), die einen gegen LPS von IATS-Stamm 11 spezifi
schen humanen monoclonalen Antikörper produziert, in ähnli
cher Weise behandelt.
Weibliche BALB/c-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körpergewicht
wurden in zwei Gruppen von je 30 Mäusen geteilt. Allen Mäu
sen jeder Gruppe wurden einzeln auf intraperitonealem Weg
(ip) 0,5 ml konzetrierter 1C1- oder 6F11-Antikörper inoku
liert. Sechs Stunden später wurde jede der zwei Gruppen in
drei Gruppen von je 10 Mäusen unterteilt, und die Mitglieder
jeder 10 Mäuse-Gruppe wurden unabhängig mit 0,3 ml einer
lebenden Bakteriensuspension, die 5 LD50 von IATS-Stamm 2, 5
bzw. 11 enthielt, intraperitoneal infiziert. Die Bakterien
suspensionen wurden aus einer Kulturbrühe im Wachstum der
logarithmischen Phase gewonnen, von welcher die Bakterien
zentrifugiert, danach zweimal in PBS gewaschen und in geeig
neter Dichte in PBS resuspendiert wurden. Kontroll-Gruppen
aus vier oder fünf Mäusen wurden jeweils durch intraperito
neale Injektion 0,5 ml PBS und sechs Stunden später intra
peritoneal 5 LD50 desselben Serotyps zugeführt. Nach der
bakteriellen Herausforderung wurden die Tiere während einer
Periode von fünf Tagen beobachtet.
Wie in Tabelle III gezeigt, bot der Antikörper 1C1 einen
spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine letale Her
ausforderung durch sowohl IATS 2- als auch IATS 5-Serotypen,
jedoch nicht durch IATS 11-Serotyp. Der typische Verlauf im
Anschluß an die bakterielle Herausforderung zeigte bei allen
nichtgeschützten Tieren verschiedene Perioden von endotoxi
schem Schock, gewöhnlich gefolgt vom Tod. Kontrolltiere,
denen nur PBS gegeben wurde, gingen durch einen akuten endo
toxischen Schock und alle starben schnell. Die Tiere der
negativen Kontrolle, denen nichthomologer Antikörper (6F11)
gegeben wurde, hatten eine Periode verlängerten Schocks,
gekennzeichnet durch die Symptome, die in Fußnote "a" der
Tabelle III aufgeführt sind. Einige dieser Tiere erholten
sich schließlich, möglicherweise aufgrund von Komponenten,
die keine Antikörper sind und bei der Bereitung der Antikör
per mitkonzentriert wurden. Die Tiere, die den schützenden
homologen Antikörper erhielten, zeigten jedoch nur geringere
Symptome von Endotoxämie. Diese Symptome verschwanden inner
halb von 24 Stunden nach Inokultation, und die Tiere er
schienen während der restlichen 5-tägigen Beobachtungszeit
gesund.
Tabelle III
In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von
humanem monoclonalem Antikörper 1C1 gegen
IATS-Serotypen 2 und 5
Unter Anwendung desselben Protokolles wurde ein zweites Ex
periment durchgeführt, bei welchem Gruppen von Mäusen mit
Fisher-Stämmen 2, 3 oder 5 infiziert wurden und die Tiere
fünf Tage beobachtet wurden. Wie aus Tabelle IV ersichtlich,
bot der Antikörper 1C1 wiederum einen spezifischen und signi
fikanten Schutz gegen sonst letale Infektion mit Fisher-Im
munotypen 3 und 7, er war jedoch unwirksam gegen Fisher-Im
munotyp 2.
TABELLE IV
In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von
humanem monoclonalem Antikörper 1C1 gegen
Fisher-Immunotypen 3 und 7
Beispiel V zeigt eine Methode zur Herstellung von humanem
monoclonalem Antikörper, der mit IATS-Serotypen 4 und 11 und
Fisher-Immunotyp 2 von P. aeruginosa reagiert. Das in den
Beispielen I-IV beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit
der Ausnahme, daß es erforderlich war, gewisse Modifikationen
vorzunehmen, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikör
per zu isolieren, zu charakterisieren und zu prüfen. Nachfol
gend werden die Abänderungen im Verfahren und die mit dem
hier beschriebenen monoclonalen Antikörper erhaltenen Ergeb
nisse geschildert.
Die Quelle für die Human-B-Zellen war eine Person, die zuvor
mit einer Präparation von Polysaccharid mit hohem Molekular
gewicht immunisiert war, die aus Fisher-Immunotyp 3 isoliert
war (Pier, G. B. et al., Infec. Immun. (1984) 45: 309-313,
worauf hier Bezug genommen wird).
Die zellgeführte Transformation von E-PBMC wurde durch Ko
kultivieren dieser Zellen mit der transformierenden Zellinie
1A2 durchgeführt. 1A2-Zellen in logarithmischer Wachstums
phase wurden in HAT-Medium suspendiert und dann mit den
E-PBMC in einem Verhältnis von fünfzehn 1A2-Zellen pro E-PBMC
kombiniert. Die Zellmischung wurde in vierzehn Mikrotiter
platten mit einer Konzentration von 62.000 Zellen/Loch in
einem Volumen von 200 µl/Loch eingegeben. Die Kulturen wurden
am 7. und 11. Tag nach dem Eingeben gefüttert und am 15. Tag
wurde beobachtet, daß 100% der Löcher proliferierte Zellen
enthielten.
Um auf das Vorliegen von Anti-P. aeruginosa-Antikörpern zu
prüfen, wurden zwei Antigenplatten mit folgender Vorbereitung
verwendet: (1) eine Mischung von P, aeruginosa Fisher-Immu
notypen 1 bis 7 (A.T.C.C. Nrn. 27312, 27313, 27314, 27315,
27316, 27317 bzw. 27318); und (2) eine mit PLL-behandelte
Mikrotiterplatte ohne Bakterien.
Eine Analyse der Kulturüberstände nach der in den obigen Bei
spielen beschriebenen Methode führte zur Indentifizierung von
annähernd 100 Löchern, welche Anti-P. aeruginosa-Antikörper
enthielten, die reaktiv mit der Fisher-Immunotypen 1- bis
7-Platte waren, jedoch nicht mit der PPL-behandelten bakte
rienfreien Platte. Um den bzw. die erkannten spezifischen
Fisher-Immunotypen identifizieren zu können, wurden Antigen-
Platten wie oben beschrieben angefertigt, wobei jede Platten
reihe PLL-fixierte Bakterien von nur einem Fisher-Immunotyp
enthielten. Ein ELISA-Test wurde durchgeführt wie oben be
schrieben, wobei der Kulturüberstand von jedem anti-P. aeru
ginosa-positiven Loch in eine säulenartige Aneinanderreihung
auf den neuen Antigen-Platten gegeben wurde, und zur Identi
fizierung einer Anzahl von Löchern führte, die gegen Fisher-
Immunotyp 2 spezifischen Antikörper enthielten. Zur weiteren
Analyse der serologischen Spezifität der Anti-Fisher-Immun
typ 2-Antikörper wurden die Überstände in ähnlichen ELISA-
Tests auf Antigen-Platten geprüft, die so gefertigt wurden,
daß jede der siebzehn IATS-Serotypen von P. aeruginosa in
getrennten Löchern enthalten war. Die Ergebnisse dieser Prü
fung zeigten, daß die überwiegende Anzahl der Überstände spe
zifisch auf IATS-Serotyp 11 war, wenn auch ein Überstand,
nämlich in Loch 6D6, ein kreuzreaktives Spezifitätsmuster auf
IATS-Serotypen 4, 11, 13 und 14 zeigte.
Um zu bestimmen, ob die Anti-IATS-Serotyp 4-, 11-, 13- und
14-Reaktionsmuster auf einen oder mehrere Antikörper in Loch
6D6 zurückzuführen waren, wurden zusätzliche gleiche Anteile
von Überstand aus Loch 6D6 unabhängig mit IATS-Serotypen 4, 7
(Negativkontrolle), 11, 13 und 14 adsorbiert und die adsor
bierten Überstände dann auf PLL-fixierte Bakterien von jedem
der fünf IATS-Serotypen entsprechend dem oben beschriebenen
ELISA-Test geprüft. Adsorptionen wurden durchgeführt durch
Resuspendieren eines Pellets von gepackten Bakterienzellen
mit einem gleichen Volumenüberstand während einer halben
Stunde auf Eis, gefolgt von der Abtrennung des Überstandes
von den Bakterien durch Zentrifugation. Die Ergebnisse dieser
Prüfung zeigten, daß die IATS-Serotypen 4 und 11 Antikörper
aktivität gegen einander ausadsorbierten, jedoch nicht gegen
die IATS-Serotypen 7, 13 oder 14. Dies demonstriert die Ge
genwart von mindestens zwei verschiedenen Anti-P. aeruginosa-
Antikörpern in Loch 6D6, von denen mindestens einer Kreuz
reaktion mit IATS-Serotypen 4 und 11 zeigt.
Die Isolation und das Klonen der geeigneten Antikörper produ
zierenden Zellen aus Loch 6D6 wurde in drei Stufen durchge
führt. Die erste Stufe umfaßt eine Subkultur der Zellen in
niederer Dichte von 20 Zellen/Loch gefolgt von einer weiteren
Runde einer Subkultur niederer Dichte (5 Zellen/Loch) von
Zellen, die von einem Anti-IATS-Serotyp 4 und 11 positiven
Loch erhalten wurden und in der ersten Runde der Subkultur
niederer Dichte mit 20 Zellen/Loch produziert wurden. Jede
Runde der Subkultur wurde in 96 Loch-Platten mit rundem Boden
mit der angegeben Dichte in einem totalen Volumen von 100 µl
HAT-Medium durchgeführt, dem die Aminopterin-Komponente fehl
te (HT-Medium). Nicht transformierende HAT-sensitive Lympho
blastoid-Zellen wurden in alle Löcher mit einer Dichte von
500 Zellen/Loch als Fütterzellen gegeben. Vier Tage nach dem
Eingeben wurden 100 µl HAT-Medium allen Löchern zum selekti
ven Abtöten der Fütterzellen gegeben. Die Löcher wurden wie
derum am 9. Tag nach dem Eingeben durch Ersetzen der Hälfte
des Überstandes mit HAT-Medium gefüttert. Danach wurden die
Löcher in ähnlicher Weise alle vier bis fünf Tage mit HAT-Me
dium gefüttert, bis die Löcher eine ausreichende Lympho
blastoidzellen-Dichte für eine Analyse des Überstandes durch
ELISA, wie oben beschrieben, enthielten.
Bei jeder Prüfung waren die Überstände, die reaktiv mit
IATS-Serotyp 4 waren, auch reaktiv mit IATS-Serotyp 11 und
Fisher-Immunotyp 2. Zusätzlich fehlte eine Antikörperaktivi
tät gegen IATS-Serotypen 13 und 14, wodurch die früheren Spe
zifitäts-Annahmen bestätigt werden.
Formales Klonen von spezifischen Antikörper produzierenden
Zellen wurde durchgeführt, indem zuerst die Zellen mit sehr
geringer Dichte (berechnet 1/Loch) in 72-Loch-Terasaki-Plat
ten (Nunc #1-36538) in einem Volumen von 10 µl/Loch eingege
ben wurden. Die Platten wurden dann in einen Inkubator wäh
rend drei Stunden gehalten, um den Zellen ein Absetzen auf
den Plattengrund zu ermöglichen, und dann durch zwei ver
schiedene Personen mikroskopisch auf Löcher, die eine einzel
ne Zelle enthielten, ausgezählt. Jede dieser Zellen wurde
dann unabhängig in die Löcher einer 96-Loch-Platte mit rundem
Boden mit Fütterzellen eingebracht und, wie oben für eine
Subkultur mit niedriger Dichte beschrieben, kultiviert. Die
Überstände von allen aufsteigenden Klonen waren bei der Prü
fung durch das obige ELISA-Protokoll positiv gegen die Anti-
IATS-Serotypen 4 und 11.
Auf diese Weise kann eine geklonte transformierte humane
Zellinie erhalten werden, welche kontinuierlich wächst (un
sterblich ist) und humanen monoclonalen Antikörper sekre
tiert, welcher reaktiv mit Fisher-Immunotyp 2 und kreuzreak
tiv mit IATS-Serotypen 4 und 11 ist. In diesem Beispiel tra
gen die Zellinie und der von ihr produzierte Antikörper die
selbe Bezeichnung, nämlich 6D6.
Der Isotyp des Antikörpers in Loch 6D6 wurde in einem ELISA-
Test ähnlich den oben beschriebenen Spezifitätstests bestimmt
mit der Ausnahme, daß HRP-Ziegen Anti-human-IgG und HRP-Zie
gen-Anti-human-IgM unabhängig als Reagenzien der zweiten Stu
fe verwendet wurden, anstatt kombiniert eingesetzt zu werden.
Die positive Reaktion des Antikörpers in Loch 6D6 mit
Fisher-Immunotyp 2 und IATS-Serotypen 4 und 11 wurde nur mit
dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was einen IgM-Isotyp für
diesen Antikörper anzeigt.
Die biochemische Charakterisierung der molekularen Spezies,
die vom 6D6-Antikörper erkannt wird, wurde durch Immunoblot-
Analyse, wie oben in Beispiel III beschrieben, durchgeführt,
mit der Ausnahme, daß die IATS-Serotypen 3 und 11 als Anti
gen-Präparationen für die Analyse ausgewählt wurden. Eine
LPS-Präparation von Fisher-Immunotyp 1 wurde als Negativkon
trolle mit eingeschlossen.
Vor der Analyse wurde jede der rohen LPS-Präparationen 1 : 1
in Dissoziationspuffer [0,125 M Tris, 4% (Gew./V) Natrium
dodecylsulfat (SDS), 20% (V/V) Glycerin, 10% (V/V) β-Mer
captoethanol, 0,4% (Gew./V) Bromphenol-blau, pH 6,8] ver
dünnt und während 5 Minuten im Bad beschallt. Um Proteine in
den Proben abzubauen, wurde Proteinase K (1 mg/ml in H2O)
jeder Probe in einen 40% (Gew./Gew.)-Verhältnis von Enzym zu
LPS zugegeben und bei 60°C während zwei Stunden mit einer
5-minütigen Badbeschallungsstufe nach einer Stunde inkubiert.
Die Proben wurden dann 5 Minuten lang auf 100°C erhitzt und
in einer Mikrozentrifuge 2 Minuten lang zentrifugiert.
Geklärte Proben, entsprechend 10 µg eines jeden Bakterien
stammes, wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) wie oben beschrieben unterworfen. Nach dem Trans
ferieren der abgetrennten Molekülspezies auf ein NCM, wurden
die NCM's 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 ml von er
schöpftem Kulturüberstand der 6D6-Zellinie inkubiert. Das
weitere Verfahren wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Positive Ergebnisse wurden nur in den Proben gefunden, die
Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 oder IATS-Serotyp 11 LPS
enthielten. In den Fisher-Immunotyp 2 und ITAS-Serotyp 11-
Proben erkannte der Antikörper 6D6 eine kurze Reihe von in
regelmäßigen Abständen, d. h. leiterartig angeordneten Molekü
len mit niedrigem Molekulargewicht, welche genau den kleine
ren Formen der LPS-Moleküle entsprachen, wie in einem ähnlich
durchgeführten SDS-PAGE-Gel, bei dem Antigene nicht auf ein
NCM transferiert, sondern statt dessen spezifisch auf das
Vorliegen von LPS gefärbt wurden, sichtbar wurde, mit der
Ausnahme, daß die niedrigste Bande auf dem silber-gefärbten
Gel (welche die Kernreaktion plus Lipid A von LPS repräsen
tiert) nicht erkannt wurde. Im Gegensatz dazu erkannte der
Antikörper 6D6 in der IATS-Serotyp 4 LPS enthaltenden Probe
eine volle Reihe von in regelmäßigen Abständen angeordneten
Bande, die nahezu die volle Länge des Gels überspannten, wo
bei die intensivste Reaktion unter den Banden mit höherem
Molekulargewicht auftrat. Wiederum entspricht dieses Profil
dem leiterartigen Bandmuster, das auf dem LPS spezifisch ge
färbten Gel beobachtet wurde (d. h. sie entsprechen sich of
fensichtlich Bande für Bande), mit der Ausnahme, daß die den
Kern plus Lipid A repräsentierende Bande nicht erkannt wurde.
Diese Daten zeigen klar, daß die O-Seitenkette von LPS das
molekulare Muster ist, das vom Antikörper 6D6 auf dem
Fisher-Immunotyp 2 und den IATS-Serotypen 4 und 11 erkannt
wird.
Um die in vivo-Schutzwirkung von Antikörper 6D6 abschätzen zu
können, wurden Tierschutzversuche an Mäusen durchgeführt. Der
6D6-Antikörper wurde zuerst aus erschöpftem Kulturüberstand
durch Fällen mit gesättigtem Ammoniumsulfat (50%ige Endkon
zentration) konzentriert. Das ausgefällte Material wurde in
einem minimalen Volumen sterilen Wassers rekonstituiert, ex
tensiv dialysiert gegen PBS und sterilfiltriert. Als Negativ
kontrolle wurde ein erschöpfte Kultur-Überstand einer anderen
transformierten Humanzellinie (C5B7-A.T.C.C. Nr. CRL 7853),
die einen humanen monoclonalen Antikörper der spezifisch für
LPS von Fisher-Immunotyp 1 ist, in der gleichen Weise behan
delt. In ähnlicher Weise wurde Überstand eine Kultur von
transformierten Humanzellinie 6F11 (A.T.C.C. Nr. CRL 8562),
die humanen monoclonalen Antikörper der spezifisch gegenüber
LPS von Fisher-Immunotyp 2 und IATS-Serotyp 11 ist, als posi
tive Kontrolle konzentriert.
Weibliche Swiss-Webster-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körperge
wicht wurden in drei Gruppen von je 20 Mäusen eingeteilt.
Allen Mäusen einer jeden Gruppe wurden individuell auf intra
peritonealem Weg (ip) 0,5 ml konzentrierter 6D6, C5B7 oder
6F11-Antikörper inokuliert. Sechs Stunden später wurden jede
der drei Gruppen in vier Gruppen von je 5 Mäusen unterteilt
und jede fünf Mäuse-Gruppe wurde unabhängig ip mit 0,3 ml
einer Suspension lebender Bakterien, die 8 LD50 Fisher-Immu
notyp 1, Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 bzw. IATS-Serotyp
11 enthielt, infiziert. Die bakteriellen Suspensionen wurden,
wie oben in Beispiel IV beschrieben, hergestellt. Nach der
bakteriellen Infektion wurden die Tiere über einen Zeitraum
von fünf Tagen beobachtet. Die Ergebnisse sind nachfolgend
aufgeführt.
TABELLE V
In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung
von menschlichem monoclonalem Antikörper 6D6 gegen
Fisher-Immunotyp 2 und IATS-Serotypen 4 und 11
Wie aus Tabelle V zu ersehen, schafft der Antikörper 6D6
einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine letale
Infektion von Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 und IATS-
Serotyp 11 aber nicht Fisher-Immunotyp 1.
Beispiel VI zeigt eine Methode zur Herstellung eines humanen
monoclonalen Antikörpers, der mit IATS-Serotyp 6 und 13 und
Fisher-Immunotyp 1 von P. aeruginosa reagiert. Das in den
Beispielen I bis V beschriebene Verfahren wurde wiederholt
mit der Ausnahme, daß gewisse Modifikationen erforderlich
waren, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper zu
isolieren, charakterisieren und zu prüfen. Im folgenden wer
den die Änderungen in der Verfahrensweise und die mit dem
hier beschriebenen monoclonalen Antikörper erhaltenen Ergeb
nisse erläutert.
Die Quelle für die Human-B-Zellen war eine Person, die zuvor
mit einer aus Fisher-Immunotyp 2 isolierten Polysaccharid-
Präparation mit hohem Molekulargewicht (Pier et al., Infec.
Immun., 34: 461 (1981)) immunisiert war. Nach dem Sammeln der
E-PBMC, in der oben beschriebenen Weise, wurden die Zellen in
FCS, das 10% (V/V) DMSO enthielt, in einen Flüssigstick
stoff-Gastank gefroren. Diese Zellen wurden später schnell
auf 37°C aufgetaut, einmal in Iscove's-Medium gewaschen und
in HAT-Medium suspendiert. Die Zellgeführte Transformation
wurde bei einem Verhältnis von 15 1A2 Zellen pro E-PBMC
durchgeführt. Die Zellmischung wurde in 20 Mikrotiter-Platten
in einer Konzentration von 78.500 Zellen/Loch eingegeben. Die
Kulturen wurden alle 3-5 Tage nach dem Eingeben gefüttert
und am 11. Tag wurde beobachtet, daß 100% der Löcher proli
ferierte Zellen enthielten.
Zur Prüfung des Überstandes auf das Vorliegen von Anti-
P. aeruginosa-Antikörper unter Verwendung der ELISA-Technik
bestand die Antigen-Platte aus einer Mischung von P. aerugi
nosa Fisher-Immunotypen 1 bis 7 [klinisches Isolat PSA I277
(Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), ATCC
27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC
27317 bzw. ATCC 27318]. Eine PLL-behandelte Mikrotiterplatte
ohne Bakterien wurde ebenfalls in der Prüfung verwendet.
Eine Analyse des Kulturüberstandes durch die obige Methode
führte zu der Identifikation von annähernd 200 Löchern, wel
che Anti-P. aeruginosa-Antikörper enthielten, die reaktiv mit
der Fisher-Immunotypen 1 bis 7-Platte aber nicht mit der
PLL-behandelten und bakterienfreien Platte war. Um die Löcher
zu identifizieren, die mit zwei oder mehr IATS-Serotypen
reaktive Antikörper enthielten, wurden Antigen-Platten wie
oben angefertigt, in denen eine Säule bzw. Reihe der Platten
PLI-fixierte Bakterien von nur einem IATS-Serotyp enthielten.
Ein ELISA-Test wurde wie oben durchgeführt mit dem Überstand
einer expandierten Kultur von jedem der Anti-P. aeruginosa-
positiven Löcher. Die Überstände wurden in einer Reihe auf
den neuen Antigen-Platten plaziert und führten zu der Identi
fizierung einer Anzahl von Löchern, welche mit zahlreichen
IATS-Serotypen reaktive Antikörper enthielten. Ein Loch, be
zeichnet 8H7, enthielt Antikörper der spezifisch für IATS-
Serotypen 6 und 13 war. Als der Überstand von diesem Loch
durch ELISA auf die sieben Fisher-Immunotypen wie in Beispiel
V geprüft wurde, zeigte sich, daß die Antikörper von 8H7 spe
zifisch auf Fisher-Immunotyp 1 sind.
Um herauszufinden, ob das Anti-IATS-Serotyp 6 und 13-Reak
tionsmuster aufgrund von einem von mehreren Antikörpern in
Loch 8H7 zurückzuführen war, wurden zusätzliche aliquote Men
gen an Überstand unabhängig mit IATS-Serotypen 6, 13 und 17
(Negativkontrolle) adsorbiert, und die adsorbierten Überstän
de wurden dann auf PLL-fixierten Bakterien von jedem der drei
IATS-Serotypen entsprechend der oben angegebenen ELISA-Prüf
weise getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß IATS-Serotypen 6
und 13 Antikörperaktivität gegeneinander ausadsorbierten.
IATS-Serotyp 17 adsorbierte keine Aktivität aus gegen IATS 6
oder 13. Diese Daten zeigen, daß das Anti-IATS-Serotyp 6 und
13-Reaktionsmuster durch einen einzelnen Antikörper aus Loch
8H7 bedingt ist.
Die Isolation und das Klonen der Antikörper produzierenden
Zellen von Loch 8H7 wurde in drei Stufen durchgeführt, im
wesentlichen wie in Beispiel V beschrieben. Auf diese Weise
wurde eine geklonte transformierte Human-Zellinie erhalten,
welche kontinuierlich wuchs (d. h. unsterblich ist) und huma
nen monoclonalen Antikörper ausscheidet, der reaktiv mit
Fisher-Immunotyp 1 und kreuzreaktiv mit IATS-Serotypen 6 und
13 ist. In diesem Beispiel tragen die Zellinie und der von
ihr produzierte Antikörper dieselbe Bezeichnung 8 H7. Unter
Verwendung einer ähnlichen Arbeitsweise, wie in Beispiel V
beschrieben, wurde der Isotyp des Antikörpers in Loch 8H7 als
IgM bestimmt. Die biochemische Charakterisierung der Moleku
larspezies, die vom 8H7-Antikörper erkannt wird, wurde durch
Immunoblot-Analyse, wie in den Beispielen III und IV be
schrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die LPS-Präpa
rationen vom Fisher-Immunotyp 1 und den IATS-Serotypen 6 und
13 als Antigen-Präparationen für die Analyse ausgewählt wur
den. Eine LPS-Präparation aus IATS-Serotyp 10 wurde als nega
tive Kontrolle mit eingeschlossen.
Die Analyse der erhaltenen Immunoblots zeigte positive Ergeb
nisse nur in den NCM-Proben (tracks), welche Fisher-Immunotyp
1, IATS-Serotyp 6 oder IATS-Serotyp 13 LPS enthielten. In den
Fisher-Immunotyp 1- und IATS-Serotyp 6-Proben (tracks) er
kannte der Antikörper 8H7 eine Reihe von in regulären Abstän
den, d. h. leiterartig angeordneten Banden, die nahezu die
volle Länge des Gels überspannten. Diese Bande korrespondier
ten genau mit den Formen von LPS-Molekülen mit mehrfach ver
schiedenem Molekulargewicht, wie in einem in ähnlicher Weise
durchgeführten SDS-PAGE-Gel, bei welchem die Antigene nicht
auf ein NCM transferiert, sondern statt dessen auf das Vor
handensein von LPS spezifisch gefärbt wurden, visualisiert
werden konnte. In der Probe (lane), die das IATS-Serotyp 13
LPS enthielt erkannte der Antikörper 8H7 eine mehr abgekürzte
Reihe von in regelmäßigen Abständen angeordneten Banden, die
den mittleren bis oberen Molekulargewichtsbereich des Gels
einschlossen.
Wiederum entsprachen die erkannten Bande in ihrer Lage den
jenigen in einem LPS spezifisch gefärbten Gel mit der Ausnah
me der Formen von LPS im gefärbten Gel mit dem höchsten und
niedrigsten Molekulargewicht, die auf dem Western-Blot nicht
als gut erkannt erschienen. Diese Daten zeigen deutlich, daß
LPS das Molekularmuster ist, das vom Antikörper 8H7 auf den
Fisher-Immunotyp 1 und IATS-Serotypen 6 und 13 erkannt wird.
Um die in vivo-Schutzwirkung von Antikörper 8H7 zu prüfen,
wurden Tierschutzversuche an Mäusen wie in den Beispielen IV
und V durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde der Überstand
von der Kultur einer anderen transformierten Zellinie
(6F11-ATCC Nr. CRL 8652), die einen für das LPS von Fisher-
Immunotyp 2 spezifischen humanen monoclonalen Antikörper pro
duziert, in derselben Weise behandelt wurden. Als positive
Kontrolle wurde Überstand einer Kultur von transformierter
Human-Zellinie C5B7 (ATCC Nr. CRL 8753), die einen humanen
monoclonalen Antikörper produziert, der spezifisch für die
LPS von Fisher-Immunotyp 1 und IATS-Serotyp 6 ist, verwendet.
Weibliche Swiss-Webster-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körperge
wicht wurden in drei Gruppen von je 30 Mäusen unterteilt.
Allen Mäusen einer jeden Gruppe wurden individuell intra
peritoneal (ip) 0,5 ml konzentrierter 8H7, 6F11 bzw. C5B7
Antikörper inokuliert. Vier Stunden später wurde jede der
drei Gruppen in drei Gruppen von 10 Mäusen unterteilt, und
die Mitglieder einer jeden 10 Mäuse-Gruppe wurden unabhängig
ip mit 0,3 ml einer Suspension lebender Bakterien infiziert,
die 9,4 LD50 eines klinischen Isolats (A522), das repräsenta
tiv für den IATS 6 Serotyp (äquivalent Fisher-Immunotyp 1)
ist, 5 LD50 des IATS 13 Referenz-Serotyps, oder 10 LD50 des
IATS 11 Referenz-Serotyps (äquivalent Fisher-Immunotyp 2)
enthielt. Die Bakteriensuspensionen wurden, wie oben in Bei
spiel IV beschrieben, hergestellt. Nach der materiellen In
fektion wurden die Tiere über einen Zeitraum von 5 Tagen be
obachtet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten.
TABELLE VI
In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von humanem mono
clonalem Antikörper 8H7 gegen IATS-Serotypen 6 und 13
Wie in Tabelle VI dargestellt, bietet der Antikörper 8H7
einen spezifischen signifikanten Schutz gegen eine letale
Infektion von IATS-Serotyp 6 jedoch nicht IATS-Serotyp 11.
Der Schutz gegen IATS-Serotyp 13 war von geringerem Grad,
kann jedoch erklärt werden durch die relativ hohe Anzahl an
Organismen, die zum Erreichen des LD50 für dieses Isolat er
forderlich sind im Vergleich zum Serotyp 7 Isolat (3 × 107
koloniebildende Einheiten bzw. 2,6 × 106 koloniebildende Ein
heiten). In einem getrennten Experiment schützte Antikörper
8H7 fünf von fünf Mäusen, die mit 3,5 LD50 von IATS 13 Isolat
infiziert waren und fünf von fünf Mäusen, die mit IATS 6 Iso
lat infiziert waren.
Aus dem Vorgehenden ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen
Zellinien humane monoclonale Antikörper und Fragmente davon
liefern, die kreuzreaktiv für und kreuzprotektiv gegen ver
schiedene P. aeruginosa-IATS-Serotypen sind. Dies ermöglicht
es, prophylaktische und therapeutische Zusammensetzung we
sentlich leichter zu entwickeln, welche wirksam gegen Infek
tionen durch die meisten, wenn nicht alle P. aeruginosa-Stäm
me sind. Zusätzlich liefern die Zellinien Antikörper, welche
Anwendung in Immunoassays und anderen gut bekannten Verfahren
finden.
Wenn auch die vorliegende Erfindung im Detail erläutert und
anhand von Beispielen beschrieben wurde, so ist es für den
Fachmann doch klar, daß Änderungen und Abwandlungen hiervon
möglich sind, ohne daß der Schutzumfang verlassen wird.
Claims (24)
1. Zusammensetzung, enthaltend einen humanen monoklonalen
Antikörper oder ein Bindungsfragment davon, der zu einer
spezifischen Bindung mit einer Vielzahl, jedoch nicht
allen IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig
und in vivo gegen mindestens zwei IATS-Serotypen
schützend ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper in vivo gegen mindestens drei IATS-
Serotypen schützend ist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper nichtreaktiv mit irgendeinem Fisher-
Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa ist.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper mit einem Fisher-Immunotyp von
Pseudomonas aeruginosa reagiert.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper zur Reaktion mit zwei oder mehr
Fisher-Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper zur Reaktion mit drei IATS-Serotypen
fähig ist.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper in vivo gegen mindestens zwei IATS-
Serotypen und ein Fisher-Immunotyp schützend ist.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper in vivo gegen mindestens zwei IATS-
Serotypen und mindestens zwei Fisher-Immunotypen schüt
zend ist.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit mindestens zwei
humanen monoklonalen Antikörpern, von denen mindestens
einer zur spezifischen Reaktion mit zugänglichen Lipo
polysaccharid-Determinanten fähig ist, die auf weniger
als allen, aber auf mindestens zwei IATS-Serotypen von
Pseudomonas aeruginosa vorhanden sind, und mindestens
einer der Antikörper in vivo gegen zwei oder mehr der
IATS-Serotypen schützend ist.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper in vivo gegen drei IATS-Serotypen
schützend ist.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper nichtreaktiv mit einem Fisher-Immuno
typ ist.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper zur Reaktion mit einem Fisher-Immuno
typ von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper zur Reaktion mit zwei oder mehr
Fisher-Immunotypen fähig ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch
gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo gegen reak
tive IATS-Serotypen und Fisher-Immunotypen schützend
ist.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper oder das Fragment davon zur Reaktion
mit mindestens drei IATS-Serotypen von Pseudomonas
aeruginosa fähig ist.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper mit IATS-Serotypen 2, 5 und 16 und
Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagiert.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 4 oder 5, dadurch ge
kennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper oder ein
Bindungsfragment davon auch zur Reaktion mit drei oder
vier und bis zu einschließlich allen sieben Immunotypen
des Fisher-Immunotyp-Systems fähig ist.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper mit den IATS-Serotypen 4 und 11 und
Fisher-Immunotyp 2 reagiert.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Antikörper mit den IATS-Serotypen 6 und 13 und
Fisher-Immunotyp 1 reagiert.
20. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
in Verbindung mit einem physiologisch akzeptierbaren
Träger als Pharmazeutikum.
21. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
die mindestens einen humanen monoklonalen Antikörper
enthält, der mit weniger als allen, aber mindestens zwei
IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert, und
Markern zur Lieferung eines feststellbaren Signals, die
kovalent mit den Antikörpern oder an zweite Antikörper
gebunden sind, die ihrerseits mit jedem der monoklonalen
Antikörper reaktiv sind, in Form eines Kits zur Verwen
dung bei der Untersuchung des Vorliegens von Pseudomonas
aeruginosa.
22. Unsterbliche (permanente) transformierte Zellinie, wel
che einen humanen monoklonalen Antikörper ausscheidet,
der spezifisch mit weniger als allen, aber mindestens
zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert.
23. Zellinie nach Anspruch 22, zur Produktion eines humanen
monoklonalen Antikörpers, der mit einem Epitop reaktiv
ist, welches mit einem monoklonalen Antikörper reagiert.
24. Verfahren zur Herstellung einer zur Behandlung oder Ver
hütung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen brauchba
ren Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man
mindestens zwei humane monoklonale Antikörper, von denen
mindestens einer schützend gegen mindestens zwei IATS-
Serotypen von Pseudomonas aeruginosa ist, mit einem
antimikrobiellen Mittel, einer Gammaglobulinfraktion aus
menschlichem Blutplasma und/oder einem physiologisch
akzeptierbaren Träger vermischt.
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Legal Events
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8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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Owner name: BRISTOL-MYERS SQUIBB CO. (N.D.GES.D.STAATES DELAWA |
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