NO178718B - Preparat for anvendelse in vitro, udödelig, transformert cellelinje og humant, monoklonalt antistoff, samt sett eller utstyr for anvendelse ved påvisning in vitro av tilstedeværelse av Pseudomonas aeruginosa - Google Patents

Abstract

Cellelinjer som utskiller humane, monoklonale antistoffer som er i stand til å bindes til utvalgte Pseudomonas aeruginosa IATS-serotypers lipopolysaccharidmolekyler, er fremstilt. Farmasøytiske preparater inneholdende disse antistoffer som kan være i kombinasjon med andre monoklonale antistoffer, blodplasmafrak-sjoner og antimikrobielle midler, og den profylaktiske og terapeutiske anvendelse av slike preparater ved lindring av infeksjoner, beskrives.De kontinuerlige, transformerte, humane cellelinjer ICI, 6D6 og 8H7 som beskrives, er forut for søknadens innlevering, deponert ved American Type Culture Collection under nr.CRL 8941, 9171 og 9258.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av immuno-logiske teknikker for tilveiebringelse av hittil ukjente materialer som kan anvendes ved diagnose av bakterieinfek-sjoner, og nærmere bestemt preparat for anvendelse in vitro og anvendelse av humane, monoklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne multiple serotyper av Pseudomonas aeruglnosa in vitro.

Gramnegativ sykdom og dens mest alvorlige komplika-sjoner, f.eks. bakteremia og endotoxemia, er årsak til betydelig morbiditet og mortalitet hos humane pasienter. Dette gjelder særlig for den gramnegative organisme Pseudomonas aeruglnosa som i stigende grad har vært satt i forbindelse med bakterie-infeksjoner, spesielt nosocomielle infeksjoner, i de siste 50 år.

I løpet av de siste få tiår har antibiotika vært den foretrukne terapi for bekjempelse av gramnegativ sykdom. Den fortsatt høye morbiditet og høye mortalitet i forbindelse med sykdom fremkalt av gramnegative bakterier, er imidlertid en indikasjon på antibiotikaterapiens begrensninger, spesielt med hensyn til P. aeruginosa. (Se f.eks. Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94:196-199). Dette har forårsaket en forskning etter alternative metoder til forebygg-else og behandling.

En metode som har vært overveiet, er styrkning av vertens immunsystem ved aktiv eller passiv immunisering. Eksempelvis er det blitt observert at aktiv immunisering av mennesker eller forsøksdyr med helcellebakterievaksiner eller rensede bakterieendotoxiner fra P. aeruginosa fører til utvikling av spesifikke opsoniske antistoffer primært rettet mot determinanter på de gjentatte oligosaccharidenheter i lipopoly-saccharid(LPS)molekylene som befinner seg på den ytre celle-membran av P. aeruginosa (se Pollack, M. Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B.M. og Finlayson, J.S., red., side 73-79, US Department of Health and Human Services, 1979). Slike antistoffer er, enten de er fremkalt aktivt eller overført passivt, blitt påvist å være beskyttende overfor de letale virkninger av P. aeruginosa-infeksjon ved forskjellige dyremodeller (Pollack, supra) og ved enkelte preliminære undersøkelser på mennesker (se Young, L.S. og Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., red., side 119-132, Hans Huber, 1980). Av særlig betydning for disse antistoffers rolle i mennesker har enn videre vært kon-stateringen av en forbindelse mellom overlevelse og høye akutte serumtitere av antistoffer overfor LPS-molekylene av den infiserende stamme i pasienter med P. aeruginosa bakteremia (se Pollack, M., og Young, L.S., J. Clin. Invest., 63:276-286,

(1979)) .

Ovennevnte rapporter antyder at immunoterapeutiske metoder kunne anvendes for å forebygge og behandle bakeriesykdom som skyldes P. aeruginosa, slik som ved administrering av sammenblandede, humane immunoglobuliner som inneholder antistoffer mot den eller de infiserende stammer. Humane immunoglobuliner defineres her som den del av fraksjonert, humant plasma som er beriket med antistoffer, blant hvilke spesifikke antistoffer overfor stammer av P. aeruginosa er representert.

På grunn av visse iboende begrensninger ved anvendelse av humane immunoglobulinkomponenter er denne metode for behandling av sykdom på grunn av P. aeruginosa fortsatt under undersøkelse (se f.eks. Collins, M.S. og Roby, R.E., Am. J. Med., 76(3A):168-174, (1984)), og det finnes ennå ikke noen kommersi-elle produkter hvor disse komponenter anvendes.

En slik begrensning i forbindelse med immunoglobulin-preparater er at de består av oppsamlinger av prøver fra tusen donorer eller fler, og hvori slike prøver på forhånd er ut-valgt etter tilstedeværelsen av visse anti-Pseudomonas antistoffer. Denne sammenblanding fører til et gjennomsnitt av individuelle antistofftitere som i beste fall resulterer i beskjedne økninger av den resulterende titer av de ønskede antistoffer.

En annen begrensning er at forhåndsutvelgelsesprosessen i seg selv krever kostbar, kontinuerlig screening av donor-ansamlingen for å sikre produktensartethet. Til tross for disse anstrengelser kan det fortsatt være betydelige variasjoner i immunoglobulinproduktene fra parti til parti, og blant prod-

ukter fra forskjellige geografiske områder.

En ytterligere slik begrensning som ligger i immuno-globulinpreparater, er at bruk av disse resulterer i samtidig administrering av store mengder fremmede proteinsubstanser (som kan innbefatte virus slik som de som nylig er blitt vist å være forbundet med Acquired Immune Deficiency Syndrome eller AIDS) med risiko for å fremkalle ugunstige biologiske virkninger. Kombinasjonen av lave titere av ønskede antistoffer og høye innhold av fremmede substanser kan ofte begrense mengden av spesifikke, og dermed gunstige immunoglobuliner som kan adminis-treres til pasienten til suboptimale konsentrasjoner.

I litteraturen finnes en rekke serotypebestemmelses-systemer som kan anvendes for analyse av Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner. Systemene er primært basert på de. varmestabile/ større somatiske antigener for denne organisme (se Zierdt, C.H., i Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G.L., red., CRC Press, side 213-238

(1978)). Den hurtige formering av serogruppesystemene har gjort serologiske undersøkelser av P. aeruginosa meget vanskelige å sammenligne, og valg av et gitt system med henblikk på å screene supernatanter kan forekomme noe skjønnsmessig. Forvirringen på typebestemmelsessystemområdet er nylig blitt avklart ved dannelse av det såkalte International Antigenic Typing Scheme (IATS) system som er blitt foreslått av underkomitéen vedrørende Pseudomonadaceae under International Committee on Systematic Bacteriology som grunnlag for ytterligere serologisk undersøk-else av P. aeruginosa. Dette system som regner med 17 distinkte serotyper betegnet IATS Type 1, IATS Type 2 etc, omfatter alle de varmestabile, større somatiske antigener som er iden-tifisert i tidligere systemer. Se Liu, P.V., Int. J. Syst. Bacteriol., 33:256-264, (1983).

Ved utvikling av beskyttende monoklonale antistoffer som er kryssbeskyttende blant stammer av P. aeruginosa, er det også fordelaktig å inkorporere et typebestemmeIsessystem som er basert på de beskyttende antigener av P. aeruginosa. Et slikt system er blitt utarbeidet i den hensikt å utvikle en vaksine til klinisk bruk, og beskrives nærmere i Fisher, M.W. et al., J. Bacteriol., 98:835-836, (1969). Dette system som generelt omtales som Fisher-typebestemmelsessystemet, klassi-fiserer størsteparten av kjente P. aeruginosa i 7 typer betegnet Fisher-immunotype 1, Fisher —immunotype 2, etc. Korrelasjonen mellom IATS- og Fisher-typebestemmelsessystemene er blitt klar-lagt (se Liu, P.V., et al., supra) og er vist i tabell I. Som angitt i tabell I, er det ikke noen tilsvarende Fisher-immunotyper til visse IATS-serotyper, selv om hver Fisher-immunotype svarer til en bestemt IATS-serotype. For IATS- og Fisher-typebestemmelsessystemene er de antigeniske determinanter som er relevante for begge serotypebestemmelsessystemene, antatt å ligge i overflate LPS-molekylene av P. aeruginosa (Liu, P.V. et al., supra; Hanessien, F., et al., Nature, 229:209-210

(1979)).

I 1975 beskrev Kohler og Milstein deres epokegjørende iakttagelse at visse musecellelinjer kunne fusjoneres med musemiltceller under dannelse av hybridomaer som hver især ville utskille antistoffer av en enkelt spesifisitet, dvs. monoklonale antistoffer (Kohler, G. og Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)). Med denne teknologi ble det mulig i visse tilfeller å produsere store mengder av utsøkt spesifikke museantistoffer mot én eller flere spesielle determinanter på antigener. Slike monoklonale museantistoffer eller preparater av slike antistoffer kan imidlertid medføre vesentlige ulemper med hensyn til bruk på mennesker, særlig i lys av den iakttagelse at monoklonale museantistoffer ved anvendelse ved for-søksvise undersøkelser for behandling av visse humane sykdommer ofte er blitt iakttatt å fremkalle en immunreaksjon som gjør dem ineffektive (Levy, R.L. og Miller, R.A., Ann. Rev. Med., 34:107-116, (1983)).

Sadoff et al. har rapportert om fremstilling av et monoklonalt museantistoff av IgM-klasse rettet mot en 0-side-kjededeterminant på LPS-molekyler av en bestemt serotype av P. aeruginosa under anvendelse av hybridomateknologi (Abstracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, nr. 2 53). De har enn videre rapportert at dette museantistoff beskyttet mus mot en letal smitte med P. aeruginosa av samme serotype som den type overfor hvilken antistoffene var rettet (dvs. den homologe serotype). Adskillige etterfølgende artikler har utdypet utviklingen av muse- og humane anti-P. aeruginosa LPS monoklonale antistoffer av forskjellig spesifisitet, f.eks. Sawada, S., et al.,

J. Inf. Dis., 150:570-576, (1984); Sadoff, J., et al., Antibiot. Chemother., 36:134-146, (1985); Hancock, R., et al., Infect. Immun. 37:166-171 (1982); Siadak, A.W. og Lostrom, M.E., i Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, E.G.,

et al., red., side 167-185, Plenum Publishing Corp. (1985) og Sawada, S. et al., J. Inf. Dis., 152:965-970, (1985). Fremstilling og immunoterapeutisk anvendelse av anti-P. aeruginosa LPS serotypespesifikke, humane, monoklonale antistoffer er beksrevet i US patentsøknad 734 624 og 828 005.

Selv om det kan være visse fordeler ved å anvende monoklonale antistoffer som er spesifikke overfor en enkelt IATS-serotype av P. aeruginosa i visse situasjoner, slik som når infeksjonen kan spores til en enkelt serotype, vil det i mange andre situasjoner ikke være fordelaktig. Eksempelvis vil det ved profylaktisk behandling mot potensielle infeksjoner hos mennesker være fordelaktig å administrere ett eller flere humane antistoffer som er beskyttende mot et større antall IATS-serotyper. Ved terapeutiske anvendelser hvor den eller de infiserende stammers serotyper ikke er kjent, vil det på lignende måte være fordelaktig å administrere ett eller flere humane antistoffer som er virksomme mot de fleste, om ikke alle, de klinisk viktige P. aeruginosa IATS-serotyper. Selv om en kombinasjon av humane, monoklonale antistoffer som hvert især er spesifikt for en enkel IATS-serotype av P. aeruginosa teoretisk kunne formuleres til å beskytte mot de forskjellige serotyper, vil et slikt preparat være vanskelig å utvikle og vil ut fra et produksjonsmessig synspunkt være uøkonomisk å fremstille.

Det er følgelig et betydelig behov for humane anti-

P. aeruginosa monoklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne multiple IATS-serotyper av P. aeruglnosa.

Det tilveiebringes således hittil ukjente cellelinjer som kan fremstille humane, monoklonale antistoffer som er i stand til spesifikt å reagere med LPS-molekylene fra flere,

men ikke alle IATS-serotyper av P. aeruginosa. Disse antistoffer har forskjellige reaktiviteter med Fisher-immunotyper, idet de bindes til 0, 1 eller flere immunotyper.

Oppfinnelsen angår et preparat for anvendelse in vitro, hvilket preparat er kjennetegnet ved at det omfatter et humant, monoklonalt antistoff eller et bindingsfragment derav, som er i stand til spesifikt å bindes til flere IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa., men ikke alle, hvilket antistoff vanligvis er i lyofilisert form, enten alene eller i forbindelse med andre antistoffer som er spesifikke for andre gram-negative bakterier, og eventuelt er konjugert til en markør,

og om ønsket er kombinert med mindre enn 5 vekt%, basert på antistoffmengden, av buffere, stabiliseringsmidler, biocider og inerte proteiner, foruten inerte ekstendere eller

eksipienser i en mengde på 1-99 vekt% av det samlede preparat.

Oppfinnelsen angår også en udødelig, transformert cellelinje, hvilken cellelinje er kjennetegnet ved at den utskiller et humant, monoklonalt antistoff som spesifikt reagerer med færre enn alle, men minst to IATS-serotyper av Pseudomonas aeruglnosa.

De omhandlede celler har identifiserbare kromosomer hvori kimlinje DNA fra disse eller forløperceller er blitt omleiret til å kode et antistoff med et bindingssted for en epitope som er felles for visse P. aeruginosa-serotyper. Disse humane, monoklonale antistoffer kan anvendes til diagnose in vitro.

Cellene vil typisk være humane, transformerte lymfo-cytter som produserer beskyttende humane, monoklonale antistoffer mot tilgjengelige LPS-molekyler av P. aeruginosa. Med "tilgjengelige" menes at LPS-molekylene er fysisk tilgjengelige i bruksmiljøet for direkte interaksjon med de monoklonale antistoffer. LPS-molekylene på den ytre membran av P. aeruginosa vil være tilgjengelige for direkte kontakt med antistoffmolekylene, og således lette komplementformidlet lyse og/eller fagocytose av organismen. Enn videre vil de LPS-molekyler som er avgitt fra den ytre membran til det omgivende miljø, også være frie for direkte interaksjon med antistoffmolekylene og bli utrenset via det retikuloendoteliale system.

Fremstillingen av de monoklonale antistoffer kan ut-føres ved udødeliggjørelse av ekspresjonen av nucleinsyresek-venser som koder for antistoffer som er spesifikke for en epitope på LPS-molekylene av multiple serotyper av P. aeruginosa. De monoklonale antistoffer produseres typisk ved celledrevet Epstein-Barr-virus(EBV)transformasjon av B-lymfocyttceller erholdt fra humane donorer som har vært utsatt for den eller de passende serotyper av P. aeruginosa. Således fremstilte antistoff utskillende cellelinjer er karakterisert som kontinuerlig voksende lymfoblastoidceller som har en diploid karyotype, er Epstein-Barr-kjerneantigenpositive og utskiller monoklonalt antistoff av enten IgG, IgM, IgA eller IgD isotype, herunder forskjellige subtyper slik som IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4. Selve den celledrevne transformasjonsprosess beskrives i detalj i

US patentskrift nr. 4 464 465. De monoklonale antistoffer kan anvendes intakte eller som fragmenter slik som Fv, Fab, F(ab')2/ men vanligvis intakte fremstilt i henhold til prosedyrer som er velkjente innen faget.

Cellelinjer som produserer antistoffene, vil alternativt kunne fremstilles ved cellefusjon mellom passende medikamentmerkede, humane myeloma-, musemyeloma-, human-musehetero-myeloma- eller humane lymfoblastoidceller med humane B-lymfo-cytter under dannelse av humane hybridcellelinjer.

Cellelinjene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til annet enn til direkte produksjon av de humane, monoklonale antistoffer. Cellelinjene kan fusjoneres med andre celler (slik som passende medikamentmerkede/ humane myeloma-, musemyeloma-, humane-museheteromyeloma- eller humane lymfoblastoidceller), under dannelse av hybridomer, og således sørge for overføringen av genene som koder for de monoklonale antistoffer. Cellelinjene kan også anvendes som kilde for de kromosomer som koder for immunoglobulinene som kan isoleres og overføres til celler ved andre teknikker enn fusjon. Dessuten kan genene som koder for de monoklonale antistoffer, isoleres og anvendes i henhold til rekombinante DNA-teknikker for fremstilling av det spesifikke immunoglobulin i forskjellige verter. Spesielt kan ved fremstilling av cDNA-biblioteker ut fra budbringer-RNA, et enkelt cDNA-klon som koder for immunoglobulinet og som er fritt for introner, isoleres og anbringes i passende prokaryotiske eller eukaryotiske ekspresjonsvektorer, og deretter transformeres til en vert for endelig masseproduksjon.

Lymfoblastoid- eller hybridcellelinjene kan klones og screenes i henhold til konvensjonelle teknikker med de antistoffer som er i stand til å bindes til epitopene av forskjellige P. aeruginosa IATS-serotyper og Fisher-immunotyper påvist i cellesupernatantene. Ved anvendelse av antistoffer som blokkerende antistoffer ved screening i henhold til prosedyrer som er velkjente for fagmannen, kan ytterligere monoklonale antistoffer som gjenkjenner de samme antigeniske determinanter eller epitoper, lett isoleres.

Som et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes et humant, monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, hvilket antistoff er kjennetegnet ved at det er kryssreaktivt og kryssbeskyttende overfor Pseudomonas aeruginosa IATS-serotyper, og i visse tilfeller Fisher-immunotyper, og at det kan reagere med en epitop som reagerer med et monoklonalt antistoff fremstilt av en cellelinje ifølge krav 5.

De monoklonale antistoffer anvendes til typebestem-melse for isolering av spesifikke P. aeruginosa-stammer, til selektiv fjerning av P. aeruginosa-celler i en heterogen blanding av celler eller lignende in vitro.

Til diagnostiske formål in vitro kan de monoklonale antistoffer enten være merket eller umerket. Diagnostiske analyser medfører typisk påvisning av dannelse av et kompleks ved binding av det monoklonale antistoff til P. aeruginosa-organismens LPS. I umerket form finner antistoffene anvendelse ved agglutineringsanalyser. Dessuten kan umerkede antistoffer anvendes i kombinasjon med andre merkede antistoffer (andre antistoffer) som er reaktive med det monoklonale antistoff, slik som antistoffer som er spesifikke for immunoglobulin. Alternativt kan de monoklonale antistoffer merkes direkte. Vidt forskjellige markører kan anvendes slik som radio-nuclider, fluorescensfremkallende midler, enzymer, enzymsub-strater enzymcofaktorer, enzyminhibitorer, ligander (i sær-deleshet haptener), etc. Tallrike typer av immunoanalyser er tilgjengelige, og eksempelvis kan nevnes de som er beskrevet i US patentskrift 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 og 4 098 876.

Vanligvis anvendes de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen ved enzymimmunoanalyser in vitro hvor de omhandlede antistoffer eller sekundære antistoffer fra en annen art, konjugeres til et enzym. Når en prøve inneholdende P. aeruginosa av en viss serotype, slik som humant blod eller lysat derav, kombineres med foreliggende antistoffer, finner det sted en binding mellom antistoffene og de molekyler som utviser den ønskede epitope. Slike celler kan deretter adskil-les fra de ubundne reagenser, og et annet antistoff (merket med et enzym) tilsettes. Deretter påvises tilstedeværelsen av antistoff-enzymkonjugatet som spesifikt er bundet til cellene. Andre konvensjonelle teknikker som er velkjente for fagmannen.

kan også anvendes.

Oppfinnelsen angår således også et sett eller utstyr for anvendelse ved påvisning in vitro av tilstedeværelse av Pseudomonas aeruginosa, hvilket sett er kjennetegnet ved at det omfatter et monoklonalt antistoffpreparat inneholdende minst ett humant, monoklonalt antistoff som reagerer med færre enn alle, men minst to IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, samt markører som tilveiebringer et påviselig signal og er kovalent bundet til antistoffene, eller bundet til andre antistoffer som er reaktive med hvert slikt monoklonalt antistoff.

Sluttelig angår oppfinnelsen anvendelse av et monoklonalt antistoff til påvisning in vitro av tilstedeværelse av Pseudomonas aeruginosa i en prøve, som er kjennetegnet ved at prøven kombineres med det monoklonale antistoff som er reaktivt med minst to IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, hvoretter kompleksdannelsen påvises.

Antistoffene som kan være konjugert til en markør eller være ukonjugerte, innbefattes i settene sammen med buffere slik som Tris, fosfat, carbonat, etc, stabiliseringsmidler, biocider, inerte proteiner, f.eks. okseserumalbumin eller lignende. Generelt vil disse materialer være til stede i en mengde på mindre enn 5 vekt%, basert på mengden av aktivt antistoff, og vanligvis til stede i en samlet mengde på minst 0,001 vekt%, igjen basert på antistoffkonsentrasjonen. Det vil hyppig være ønskelig å innbefatte et inert fordrøyningsmiddel eller eksipient for å fortynne de aktive bestanddeler, hvori eksipienten kan foreligge i en mengde fra 1 til 99 vekt% av det samlede preparat. Når et annet antistoff som er i stand til å bindes til det monoklonale antistoff, anvendes, vil dette vanligvis forefinnes i en separat flaske. Det andre antistoff konjugeres typisk til en markør og formuleres på analog måte med de ovenfor beskrevne antistofformuleringer.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for oppbevaring og rekonstitueres i en passende bærer før bruk. Denne teknikk har vist seg å være effektiv i forbindelse med konvensjonelle immunoglobuliner, og i og for seg kjente lyofiliserings- og rekonstitueringsteknikker kan anvendes. Som kjent for fagmannen, kan lyofilisering og rekon-stituering føre til varierende grader av antistoffaktivitets-tap (f.eks. er for konvensjonelle immunoglobuliners vedkommende IgM-antistoffer tilbøyelige til å gjennomgå større aktivitets-tap enn IgG-antistoffer) slik at det kan være nødvendig å justere anvendelsesnivåene for å kompensere for dette.

Oppfinnelsen beskrives nærmere i de etterfølgende eksempler .

Eksempel 1

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling

av humane, monoklonale antistoffer (IgM isotype) som reagerer med IATS-serotype 2, 5 og 16 og Fisher-immunotype 3 og 7.

En prøve av perifert blod oppnådd fra en pasient med cystisk fibrose som ble vist å ha kronisk infeksjon med P. aeruginosa, tjente som kilde for humane B-celler. Enkeltkjernede celler ble separert fra blodet ved standardsentrifuger-ingsteknikker på "Ficoll-Paque" (Boyum, A., Scand. J. Clin.

Lab. Invest. (1968) 21:Suppl. 97, 77-89) og ble vasket to ganger i calcium/magnesium-fritt fosfatbufret saltvann (PBS).

De enkeltkjernede celler ble befridd for T-celler ved anvendelse av en modifisert E-rosettprosedyre. I korte trekk ble cellene først resuspendert til en konsentrasjon på 1 x 10 7 celler/ml i PBS inneholdende 20% kalvefosterserum (FCS) ved 4°C. 1 ml av denne suspensjon ble deretter anbragt i et

17 x 100 mm avrundet polystyrenrør, hvortil det ble tilsatt

1 x 10 9 2-amino-isothiouroniumbromid(AET)-behandlede røde saue-blodceller fra en 10 vekt/vol% løsning i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (Iscove's medium) (Madsen, M. og Johnson, H.E., J. Immun. Methods (1979) 27:61-74). Suspensjonen ble blandet meget forsiktig i 5-10 minutter ved 4°C, og E-rosett-cellene ble deretter fjernet ved sentrifugering "Ficoll-Paque"

i 8 minutter ved 2500 x g og 4°C. E-rosettnegative enkeltkjernede celler fra perifert blod (E PBMC) som dannet bånd ved

grenseflaten, ble oppsamlet og vasket en gang i Iscoves medium og ble resuspendert i samme inneholdende 15 vol/vol% FCS, L-glutamin (2 mmol/1), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 ug/ml), hypoxanthin (1 x 10 -4 M, aminopterin (4 x 10 -7 M)

og thymidin (1,6 x 10 M). Dette medium omtales i det etter-følgende som HAT medium.

Celledrevet transformasjon på E PBMC ble oppnådd ved codyrkning av disse celler med en transformert cellelinje.

Den transformerte cellelinje var en Epstein-Barr kjerneantigen-(EBNA) positiv human lymfoblastoidcellelinje avledet fra ethyl-methansulfonat-(EMS) mutagenese av GM 1500 lymfoblastoidcelle-lin jen, etterfulgt av utvelgelse i nærvær av 30 ug/ml 6-thio-guanin for å gi cellene hypoxanthinguanin-fosforibosyltrans-ferase-(HGPRT) mangel, og således gjøre dem HAT-følsomme. Denne cellelinje betegnes lA2-cellelinjen og er deponert ved Americal Type Culture Collection (A.T.C.C.) den 29. mars 1982 under A.T.C.C. nr. CRL 8119. lA2-celler i logaritmisk vekstfase ble suspendert i HAT-medium og ble deretter kombinert med E~PBMC i et forhold på 8 lA2-celler pr. E~PBMC . Celleblandingen ble plettert i 8 rundbunnede 96-brønnmikrotiterplater

(Costar<®>3799") i en konsentrasjon på 72.000 celler/brønn i et volum på 200 ul pr. brønn, og ble inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære inneholdende 6% CO2. Kulturer ble foret på dag 5 og 8 etter plettering ved utskiftning av halvparten av supernatanten med friskt HAT-medium. Brønnene ble i akttatt hver annen dag i et omvendt mikroskop med hensyn til tegn på celle-deling. 12 dager etter plettering ble det iakttatt at 100% av brønnene inneholdt celledelende celler, og at cellene i de fleste av brønnene var av tilstrekkelig densitet til fjerning og testing av supernatantene med hensyn til anti-P. aeruginosa antistoff.

Supernatantene ble screenet for tilstedeværelse av anti-P. aeruginosa antistoffer under anvendelse av en enzym-kjedet immunosorbentanalyseteknikk (ELISA) (Engvall, E.,

(1977), 55:193-200). Antigenplater besto av flatbunnede 96-brønnmikrotiterplater ("Immulon II", Dynatech), hvor hver brønn inneholdt forskjellige levende bakterier adsorbert til brønnens bunn. For å lette bakterienes adsorpsjon til plasten ble 50 ul/brønn poly-L-lysin (PLL) (1 ug/ml i PBS, pH 7,2) inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Det uadsorberte PLL ble deretter fjernet ved en rask bevegelse, platene ble vasket en gang med PBS, 50 ul vasket bakteriesuspensjon (ODg60=0,2) i PBS ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert ved 37°C i 1 time. Uadsorberte bakterier ble fjernet ved at platene ble vasket tre ganger med saltvann-Tween<®> [0,9% NaCl, 0,05 vekt/ vol%) Tween<®->20]. Blant forskjellige antigenplater som ble anvendt ved screeningen, var: (1) en blanding av P. aeruginosa Fisher-immunotype 1, 2 og 4 (A.T.C.C. nr. 27312, 27313,

27315), (2) en blanding av P. aeruginosa Fisher-immunotype 3,

5, 6 og 7, hhv. A.T.C.C. nr. 27314, 27316, 27317 og 27318) og (3) en mikrotiterplate uten noen bakterier.

ELISA ble innledet ved først å blokkere platene med

200 ul/brønn blokkeringsbuffer [PBS, pH 7,2, inneholdende 5 vekt/vol% fettfri tørrmelk, 0,01 vekt/vol% "Antifoam A"

(Sigma) og 0,01 vekt/vol% thimerosal] i 60 minutter ved romtemperatur. Etter blokkering ble platene vasket tre ganger med saltvann-Tween<®>. 50 pl PBS, pH 7,2, inneholdende 0,1% Tween<®->20 og 0,2 vekt/vol% okseserumalbumin (BSA) ble deretter anbragt i alle brønner. Supernatanter fra brønner i kultur-platene ble replikaplettert i de tilsvarende brønner i anti-genplatene (50 pl/brønn), og platene ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Supernatantene ble deretter fjernet, brønnene ble vasket tre ganger med saltvann-Tween<®>, og 50 ul passende fortynnet pepperrotperoxydase-(HRP)konjugert geiteanti-humant IgG + IgM (American Qualex International nr. A1114 + A1124) ble tilsatt til brønnene. I dette eksempel ble det anvendt HRP-geiteanti-IgG og HRP-geiteanti-IgM i en sluttfor-tynning på hhv. 1:5000 og 1:3000 i PBS, pH 7,2, inneholdende 0,05% Tween<®->20 og 0,1% BSA. Etter 30 minutters inkubering ved romtemperatur ble overskudd av enzymkonjugerte geiteanti-stoffer fjernet, og brønnene ble vasket tre ganger med saltvann-Tween<®>. 100 ul substrat (0,8 mg/ml o-fenylendiamin-dihydro-klorid i 100 mM citratbuffer, pH 5,0, pluss 0,03% H2°2 1 av~ ionisert J^O, ble blandet i like store volumer umiddelbart før plettering) ble deretter tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutters inkubering i mørket ble 50 ul 3N I^SO^ tilsatt til alle brønner for å avslutte reaksjonene. Kultursupernatantene inneholdende antistoffer som reagerte med platens antigen, ble påvist ved positiv farveutvikling i de tilsvarende brønner, og styrken av reaksjonen ble bestemt kvantitativt ved måling av absorpsjonen ved 490 nm på en mikro-ELISA-avleser av type "Bio-Tek EL-310".

Analyse av kultursupernatantene ved den ovenstående metode førte til identifisering av to brønner (ICI og 2H12) som inneholdt anti-P. aeruginosa antistoffer som reagerte med Fisher-immunotype 3-, 5-, 6- og 7-platen, men ikke med Fisher-immunotype 1-, 2- og 4-platen eller platen uten bakterier.

For å identifisere den eller de spesifikke gjenkjente Fisher-immunotyper ble det fremstilt antigenplater inneholdende PLL-fikserte bakterier av bare én Fisher-immunotype som ovenfor beskrevet for hver immunotype. Oppførselen ved ELISA-analysen som ovenfor beskrevet med kultursupernatanter fra brønnene ICI og 2H12 på de individuelle immunotypeplater, indikerte at disse to brønner inneholdt antistoff som var spesifikt for både Fisher-immunotype 3 og 7. En lignende ELISA utført på IATS-panelet av P. aeruginosa-typebestemmelsesstammer (erholdt fra A.T.C.C. og innbefattende nr. 33348-33364), viste at antistoff i brønn ICI og 2H12 reagerte spesifikt med IATS-stammene 2, 5 og 16.

Isotypen av det eller de reaktive antistoffer i brønn ICI og 2H12 ble bestemt ved en ELISA-analyse i likhet med de ovenfor beskrevne spesifisitetstester bortsett fra at HRP-geiteanti-humant IgG og HRP-geiteanti-humant IgM ble anvendt uavhengig som reagenser i det annet trinn istedenfor kombinert. Positiv reaksjon av antistoffet eller antistoffene i brønn ICI og 2H12 med Fisher-immunotype 3 og 7 ble iakttatt bare med anti-IgM-reagensene, hvilket viser en IgM-isotype for det eller de relevante antistoffer i hver brønn.

For å påvise om anti-Fisher-immunotype 3- og 7-reak-sjonsmønsteret skyldtes ett eller flere antistoffer i brønn ICI og 2H12 (dvs. et antistoff som var reaktivt med både Fisher-immunotype 3 og 7, eller to antistoffer, et reaktivt med Fisher-immunotype 3 og et annet med Fisher-immunotype 7), ble celler fra begge brønner subdyrket ved lav densitet, og brønner inneholdende celledelende celler, ble analysert med hensyn til antistoffaktivitet på separate Fisher-immunotype 3 og Fisher-immunotype 7 bakterieantigenplater. Subkulturer ble påført i 9 6-brønns rundbunnede plater ved en densitet på 5 celler/brønn i et samlet volum på 100 ul HAT-medium uten aminopterinkomponenten (HT-medium). Ikke-transformerte HAT-følsomme lymfoblastoidceller ble innbefattet i alle brønner ved en densitet på 500 celler/brønn som mateceller. 4 dager etter plettering ble tilsatt 100 ul HAT-medium til alle brønner for selektivt å drepe matecellene. Brønnene ble igjen matet på dag 9 etter plettering ved utskiftning av halvparten av supernatanten med HAT-medium. Deretter ble brønner matet på lignende måte hver 4. - 5. dag med HT-medium inntil de hadde tilstrekkelig lymfoblastoidcelledensitet til supernatantanalyse ved ELISA. Ved analyse på individuelle Fisher-immunotype 3 og Fisher-immunotype 7 antigenplater reagerte alle de supernatanter som reagerte med Fisher-immunotype 8 også med Fisher-immunotype 7, hvilket indikerer at et antistoff var ansvarlig for aktiviteten på begge Fisher-immunotyper. Når tilfeldig utvalgte supernatanter ble analysert på IATS-stamme 2, 5 og 16, ble de funnet å reagere med alle tre stammer fremfor med individuelle stammer, hvilket ytterligere underbygger den konklu-sjon at et antistoff kryssreagerte med Fisher-immunotype 3 og 7 og IATS-stamme 2, 5 og 16.

Kloning av spesifikke antistoffproduserende celler fra brønn ICI og 2H12 ble utført ved uavhengig å underkaste cellene fra hver brønn adskillige runder grensefortynnings-kloning inntil alle klonale supernatanter analysert etter ovenstående ELISA-system resulterte i en positiv reaksjon på Fisher-immunotype 3 og 7 og IATS-stamme 2, 5 og 16. Til kloning ble det anvendt mateceller som ovenfor beskrevet, til sub-dyrkning. På denne måte ble det oppnådd to klonede transformerte humane cellelinjer (ICI og 2H12) som er kontinuerlige (udødelige) og som hver især utskiller humant, monoklonalt antistoff som er reaktivt med Fisher-immunotype 3 og 7 og IATS-stamme 2, 5 og 16. I dette eksempel bærer cellelinjen og antistoffet som den produserer, samme betegnelse.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer fremgangsmåter for fremstilling av et humant, monoklonalt antistoff (IgG isotype) som reagerer med IATS-serotype 2, 5 og 16 og Fisher-immunotype 3 og 7. Fremstillingsprosedyren er i det vesentlige identisk med eksempel 1. I korte trekk tjente en prøve av perifert blod erholdt fra en pasient med cystisk fibrose, som var vist å ha kronisk infeksjon med P. aeruginosa, som kilde for humane B-celler. Enkelkjernede celler ble fraskilt som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at 1,6 ml PBS-suspensjon ble anvendt sammen med 1,6 x 10 9 AET-behandlet rød blodcellesuspensjon fra sau. Den celledrevne transformasjon var også den samme, bortsett fra at forholdet mellom'lA2-celler og E~PBMC var 7,5, at det ble anvendt 15 plater med 17.000 celler/brønn, at kulturer ble matet ved dag 6 og 10 etter plettering, og at nesten alle brønnene inneholdt celledelende celler 16 dager etter plettering.

Screening av kultursupernatantene for spesifikke antistoffer ble utført som beskrevet, og resulterte i lokalisering av en brønn (9D1) som inneholdt et antistoff som var reaktivt med Fisher-immunotype 3-, 5-, 6- og 7-plate, men ikke med Fisher-immunotype 1-, 2- og 4-plate eller platen uten bakterier. Den beskrevne ELISA-analyses oppførsel på individuelle immunotype- eller serotypebakterieantigenplater med 9D1 supernatanter viste et antistoff som var spesifikt for både Fisher-immunotype 3 og 7 og IATS-stammene 2, 5 og 16. Etterfølgende undersøkelser utført i overensstemmelse med eksempel 1, viste at antistoff-spesifisiteten i brønn 9D1 kunne tilskrives et enkelt klon som utskilte IgG isotypeantistoff.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer den antigeniske spesifisitet av visse av antistoffene ifølge oppfinnelsen.

For å påvise om monoklonale antistoffer ICI, 2H12 og 9D1 reagerte med samme antigenmål og således var identiske med hensyn til spesifisitet, ble det utført ytterligere analyser. Først ble antistoffene sammenlignet ved en ELISA på

et panel av referansestammer og kliniske isolater av P. aeruginosa. ELISA-prosedyren var som beskrevet ovenfor, bortsett fra følgende modifikasjoner: 1) Istedenfor bakterier adsorbert til PLL-belagte plater, inneholdt platens brønner forskjellige hele bakterier som var blitt ethanolfiksert til brønnens bunn. Platene ble fremstilt ved tilsetning av 50 ul vasket bakteriesuspensjon (0Dgg0=0,2) i PBS til brønnene, sentrifugering av platene i 20 minutter ved 500 x g, oppsug-ing av PBS, tilsetning av 75 ul ethanol i 10 minutter og fjerning av ethanolen, etterfulgt av lufttørkning. På antigen-platene ble det inkludert IATS-stamme 2, 5, 11 og 16 (hhv. A.T.C.C. nr. 33349, 33352, 33358 og 33363) og 16 kliniske isolater som tidligere var blitt typebestemt både ved agglutin-ering med "Difco" [Detroit, Michigan] Bacto-Pseudomonas aeruginosa antisera i henhold til produsentens anvisninger, og ved ELISA (som her beskrevet) som serotype 2, 5, 16 eller en kombinasjon av slike serotyper; 2) kanintypebestemmelses-antisera ble anvendt ved en fortynning på 1:500 i PBS, bortsett fra anti-IATS 16 som ble fortynnet til 1:250. Kultursupernatanter inneholdende ICI, 2H12 og 9D1 antistoffer; ble anvendt rent; 3) som reagenser i annet trinn ble anvendt biotinylert protein A ("B-2001", Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) fortynnet 1:500 og biotinylert geiteanti-humant lg ("4703", Tago, Inc., Burlingame, CA) fortynnet 1:500 til påvisning av hhv. kanin- og humane antistoffer.

50 ul reagens ble tilsatt til passende brønner, og etter

30 minutters inkubering ved romtemperatur ble ubundet reagens fjernet, og brønnene ble vasket tre ganger. 50 ul på forhånd fremstilt avidin:biotinylert pepperrotperoxydasekompleks ("Vectastain ABC Kit", Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ble deretter tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutters inkubering ved romtemperatur ble det overskytende "Vectastain ABC" reagens fjernet, og brønnene ble igjen vasket 3 ganger før tilsetning av substrat.

Som vist i tabell II, viste analyseresultatene at mens antistoff ICI og 9D1 reagerte med hvert klinisk isolat typebestemt som en IATS-serotype 2, 5 eller 16, reagerte antistoff 2H12 ikke med tre slike isolater. Dette gir en indikasjon på at antistoff 2H12 gjenkjente en annen epitope enn den som ble gjenkjent at ICI eller 9D1, og at de to epitoper tilsynelatende ble uttrykt koordinert på de fleste av de kliniske isolater svarende til IATS-serotype 2, 5 eller 16, men ikke alle.

Dataene gir enn videre en antydning om at det molekylære mål som ble gjenkjent at antistoff ICI og 9D1, sannsynlig-vis var til stede på alle kliniske isolater av P. aeruginosa som kunne typebestemmes som tilhørende IATS-serotype 2, 5 eller 16, mens det mål som ble gjenkjent av antistoff 2H12, ble uttrykt på en undergruppe av slike isolater.

For å påvise om ICI, 2H12 og 9D1 antistoffer reagerte med forskjellige antigener eller alternativt forskjellige epitoper på samme antigen med slike epitoper uttrykt på de fleste, men ikke alle IATS 2, 5 og 16 serotyper, ble immunoavtrykksanalyse utført. I betraktning av at den felles antigenisitet mellom IATS-stamme 2, 5 og 6 tilsynelatende skyldtes de varmestabile antigener (Liu, P.V. et al., supra) og i overensstemmelse med den kjensgjerning at varmestabilitet er en tidligere bemerket egenskap ved lipopolysaccharidmolekyler, ble det valgt LPS-preparater fra IATS stamme 2, 5, 16 og 11 som antigenpreparater for analyse. Urent LPS ble fremstilt fra typestammene ved ekstraksjon i saltvann ved 60°C (Orskov, F. et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. (1971), seksjon B 79:142-152). 10 mikrogram LPS bestemt ved 2-keto-3-deoxy-octonat(KDO)innhold (Karkhanis, Y.D., et al., Anal. Biochem.

(1978) 85:595-601) fra hver av serotypene ble underkastet natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)

(Hancock, R.E.W. og Carey, A.M., J. Bacteriol. (1977) 140:901-910) på en 10-20% gradientgel. Adskilte molekyltyper ble overført fra gelen til en nitrocellulosemembran (NCM) som beskrevet av (Towbin, H., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1979) 76:4350-4354), og NCM-avtrykket ble blokkert i 1 time i

PBS— Tween<®> (Batteiger, B., et al., J. Immunol. Meth. (1982) 55:297-307). Deretter ble avtrykkene inkubert ved romtemperatur i 1 time i 20 ml brukt kultursupernatant, enten fra ICI, 2H12 eller 9Dl-cellelinjen. Etter fem 5-minutters skyllinger i PBS— Tween® ble hvert av NCM-avtrykkene inkubert ved 25°C i 1 time i en 1:1000 eller 1:1500 fortynning (i PBS—Tween®) av alkalisk fosfatase-konjugert geiteanti-humant IgG + IgA + IgM (Zymed). Avtrykkene ble deretter underkastet fem 5-minutters skyllinger i PBS— Tween®, hvoretter antigen-antistoffinterak-sjoner ble visualisert ved inkubering av avtrykkene ved 25°C i 15-20 minutter i 30 ml nitrobluetetrazolium/5-brom-4-klor-3-indolylfosfat(NBT-BCIP)substrat som beskrevet av Leary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1983) 80:4045-4049. Farveutvik-lingen ble stanset ved skylling av avtrykket flere ganger i avionisert vann.

De avtrykksprofiler som ble oppnådd med de tre antistoffer, var bemerkelsesverdig forskjellige. Antistoff 2H12 gjenkjente i overveiende grad en kort serie molekyler med lav molekylvekt i regelmessig avstand (dvs. stige-lignende) i antigenpreparatene av serotype 2, 5 og 16. Enkelte molekyler med høyere molekylvekt i regelmessig avstand ble også gjenkjent svakt. Det ble ikke iaktatt noen reaksjon på LPS-preparatet fra serotype 11. En gjentagelse av immunoavtrykksanalysen under anvendlese av LPS-preparater som på forhånd var behandlet med proteinase K ved 60°C for å ødelegge proteinantigener, resulterte ikke i noen endring av profilene. Lavmolekylær-båndene svarte presist til mindre former for LPS-molekyler visualisert i en lignende utført SDS-PAGE-gel hvori antigenene ikke ble overført til en NCM, men i stedet ble farvet spesifikt med hensyn til tilstedeværelse av LPS (Tsai, CM. og Frasch, C.E., Anal. Biochem. (1982) 119:115-119), bortsett

fra at det laveste bånd på den sølvfarvede gel (representerende kjerneområdet pluss lipid A av LPS) ikke ble gjenkjent. Antistoff ICI gjenkjente samme serie molekyler av lav molekylvekt i regelmessig avstand blant antigenpreparater av serotype 2,

5 og 16, men ikke 11, selv om reaksjonens intensitet ikke var så sterk som med 2H12. Dette antistoff gjenkjente imidlertid ytterligere fremragende en rekke molekyler med høyere molekylvekt i regelmessig avstand på serotype 2, 5 og 16, som i kombinasjon med de gjenkjente bånd ved lavere molekylvekt, ga anledning til distinkte, fullstendige stige-lignende profiler. Disse profiler ble ikke endret ved forbehandling av antigenpreparatene med proteinase K. Igjen svarte profilene til de stige-lignende båndmønstre som ble iakttatt i LPS-spesifikke, farvede geler (dvs. at de viste seg å svare til hverandre bånd for bånd), fortsett fra at det bånd som representerte kjerne pluss lipid A, ikke ble gjenkjent. Antistoff 9D1 hadde samme reaksjonsprofil som antistoff ICI på IATS 2, 5 og 16, men ikke 11-stammene. Igjen ble det nederste bånd på stigen av en sølv-farvet gel ikke gjenkjent av de forskjellige LPS-preparater,

og den samlede profil ble ikke endret ved forbehandling av LPS-preparatene med proteinase K. Tilsammen indikerer disse iakttagelser at LPS av serotype 2, 5 og 16 var det molekylære mål som ble gjenkjent av 2H12, ICI og 9Dl-antistoffene.

Eksempel 4

Dette eksempel viser en fremgangsmåte for fremstilling av et humant, monoklonalt antistoff som reagerer med IATS serotype 4 og 11 og Fisher-immunotype 2 av P. aeruginosa. Den i eksempel 1-3 beskrevne fremgangsmåte, ble gjentatt, bortsett fra at det var nødvendig å foreta visse modifikasjoner for å isolere, karakterisere og analysere det i dette eksempel beskrevne antistoff. Endringene i prosedyren og de oppnådde resultater med det her beskrevne, monoklonale antistoff var som følger.

Kilden for humane B-celler var et individ som på forhånd var immunisert med et polysaccharidpreparat med høy molekylvekt isolert fra Fisher-immunotype 3 (Pier, G.B., et al., Infec. Immun. [1984] 45:309-313).

Celledrevet transformasjon av E PBMC ble oppnådd ved co-dyrkning av disse celler med den transformerende cellelinje 1A2. 1A2 celler i logaritmisk vekstfase ble suspendert i HAT-medium og ble deretter kombinert med E~PBMC i et forhold på

15 1A2 celler pr. E~PBMC. Celleblandingen ble plettert i

14 mikrotiterplater i en konsentrasjon på 62.000 celler/brønn i et volum på 200 ul pr. brønn. Kulturer ble matet på dag 7 og 11 etter plettering, og ved dag 15 ble det iakttatt at 100% av brønnene inneholdt celledelende celler.

For å screene tilstedeværelsen av anti-P. aeruginosa antistoffer ble det anvendt to antigenplater som besto av: (1) en blanding av P. aeruginosa Fisher-immunotype 1 til 7 .(hhv. A.T.C.C. nr. 27312, 27313, 27314, 27315, 27316, 27317 og 27318) og (2) en PLL-behandlet mikrotiterplate uten bakterier.

Analyse av kultursupernatantene ved fremgangsmåten ifølge de tidligere eksempler førte til identifikasjon av ca. 100 brønner som inneholdt anti-P. aeruginosa antistoffer som var reaktive med Fisher-immunotype 1-7-platen, men ikke den PLL-behandlede plate som manglet bakterier. For å identifisere den eller de spesifikke gjenkjente Fisher-immunotyper ble antigenplater konstruert som ovenfor angitt, og i hvilke hver rekke i platene inneholdt PLL-fikserte bakterier av bare én Fisher-immunotype. En ELISA ble utført som ovenfor beskrevet med kultursupernatant fra hver av de anti-P. aeruginosa positive brønner anbragt i et søylearrangement på de nye antigenplater som resulterte i identifikasjon av et antall brønner som inneholdt antistoff spesifikt for Fisher-immunotype 2. For ytterligere å analysere den serologiske spesifisitet av anti-Fisher-immunotype 2 antistoffene ble supernatantene testet ved en lignende ELISA på antigenplater konstruert til å inneholde hver av de 17 IATS-serotyper av P. aeruginosa i separate brønner. Resultatene av denne analyse viste at langt den største del av supernatantene var spesifikke for IATS-serotype 11 selv om en supernatant i brønn 6D6 viste et kryssreaktivt spesifisitetsmønster på IATS-serotype 4, 11, 13 og 14.

For å påvise om anti-IATS-serotype 4, 11, 13 og 14-reaksjonsmønsteret skyldtes ett eller flere antistoffer i brønn 6D6, ble det adsorbert ytterligere porsjoner av supernatant fra brønn 6D6 uavhengig av IATS-serotype 4, 7 (negativ kontroll), 11, 13 og 14, og de adsorberte supernatanter ble deretter testet på PLL-fikserte bakterier av hver av de fem IATS-serotyper i henhold til den ovenfor skisserte ELISA-analyse. Adsorpsjoner ble utført ved å resuspendere en pakket bakteriecellepille med et like stort volum supernatant i en halv time på is etterfulgt av separering av supernatanten fra bakteriene ved sentrifugering. Resultatene av denne analyse viste at IATS-serotype 4 og 11 adsorberte antistoffaktivitet ut overfor hverandre, men ikke overfor IATS-serotype 7, 13 eller 14. Dette viste tilstedeværelse av minst to forskjellige anti-P. aeruginosa antistoffer i brønn 6D6, hvorav minst ett kryssreagerte med IATS-serotype 4 og 11.

Isolering og kloning av de passende antistoffproduserende celler fra brønn 6D6 ble utført i tre trinn. Det første trinn involverte lavdensitetssubkultur av cellene ved 20 celler/brønn og ble etterfulgt av enda en runde lavdensitetssubkultur (5 celler/brønn) av celler oppnådd fra en anti-IATS-serotype 4+11 positiv brønn som var blitt utviklet ved den første 20 celler/brønnrunde av lavdensitetssubkultur.

Hver runde subkultur ble utført i rundbunnede 9 6-brønns plater ved den anførte densitet i et samlet volum HAT-medium uten aminopterinkomponent (HT-medium) på 100 ul. Ikke-transformerende HAT-følsomme lymfoblastoidceller ble innbefattet i alle brønner ved en densitet på 500 celler/brønn som mateceller. 4 dager etter plettering ble 100 ul HAT-medium tilsatt til alle brønner for selektivt å drepe matecellene. Brønnene ble matet igjen på dag 9 etter plettering ved utskiftning av halvparten av supernatanten med HAT-medium. Deretter ble brønnene matet på lignende måte hver 4. - 5. dag med HT-medium inntil brønnene hadde tilstrekkelig lymfoblastoidcelledensitet til supernatantanalyse ved ELISA som tidligere beskrevet.

Ved hver analyse var de supernatanter som var reaktive med IATS-serotype 4, også reaktive med IATS-serotype 11 og Fisher-immunotype 2. Dessuten ble antistoffaktivitet overfor IATS-serotype 13 og 14 mistet, hvilket bekrefter de tidligere spesifisitetstildelinger.

Formell kloning av spesifikke antistoffproduserende celler ble utført ved først å plettere cellene ved meget lav densitet (beregnet l/brønn) i 72-brønns "Terasaki"-plater (Nunc nr. 1-36538) i et volum på 10 ul/brønn. Platene ble anbragt i en inkubator i 3 timer for å gi cellene anledning til å synke til platens bunn og ble deretter vurdert mikro-skopisk av to forskjellige personer med hensyn til brønner inneholdende en enkelt celle. Hver av disse celler ble deretter anbragt i brønnene i en 96-brønns rundbunnst plate med mateceller og ble dyrket som tidligere skissert for lavdensitetssubkultur. Supernatanter fra alle oppståtte kloner ved analyse etter den ovenfor angitte ELISA-prosedyre var positive for anti-IATS-serotype 4 og 11.

På denne måte ble det oppnådd en klonet, transformert, human cellelinje som vokser kontinuerlig (er udødelig) og utskiller humant, monoklonalt antistoff som er reaktivt med Fisher-immunotype 2 og kryssreaktivt med IATS-serotype 4 og 11. I dette eksempel bærer cellelinjen og det antistoff den produserer, samme betegnelse (dvs. 6D6).

Isotypen av antistoffet i brønn 6D6 ble bestemt ved

en ELISA-analyse i likhet med de ovenfor beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at HRP-geiteanti-humant IgG og HRP-geiteanti-humant IgM ble anvendt hver for seg som reagenser i annet trinn istedenfor å kombineres. Positiv reaksjon av antistoffet i brønn 6D6 med Fisher-immunotype 2 og IATS-serotype 4 og 11 ble iakttatt bare med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM-isotype for dette antistoffs vedkommende.

Biokjemisk karakterisering av de molekylære typer som ble gjenkjent med 6D6-antistoffet, ble oppnådd ved immunoavtrykksanalyse som beskrevet ovenfor i eksempel 3, bortsett fra at LPS-preparater av Fisher-immunotype 2 og IATS-serotype 4 og 11 ble valgt som antigenpreparater for analyse. Et LPS-preparat av Fisher-immunotype 1 ble innbefattet som negativ kontroll.

Forut for analysen ble hvert av de urene LPS-preparater fortynnet i forholdet 1:1 i dissosiasjonsbuffer [0,125M Tris, 4 vekt/vol% natriumdodecylsulfat (SDS),

20 vol/vol% glycerol, 10 vol/vol% 3-mercaptoethanol,

0,4 vekt/vol% bromfenolblått, pH 6,8] og badet ble behandlet sonisk i 5 minutter. For å nedbryte proteiner i prøvene ble det tilsatt proteinase K (1 mg/ml i 1^0) til hver prøve i et 40 vekt/vekt% forhold av enzym til LPS, og prøvene ble inkubert

ved 60°C i 2 timer med 5-minutters sonisk behandling av badet etter 1 time. Prøvene ble deretter oppvarmet til 100°C i 5 minutter og ble sentrifugert i en mikrofuge i 2 minutter.

Klarede prøver, som representerte 10 ug LPS fra hver av bakteriestammene, ble underkastet SDS polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) som ovenfor beskrevet. Etter å ha overført de fraskilte molekyltyper til en NCM, ble NCM'ene inkubert deretter i 2 timer ved romtemperatur i 10 ml brukt kultursupernatant fra 6D6-cellelinjen. Resten av prosedyren var som ovenfor beskrevet.

Positive resultater ble iakttatt bare i de spor som inneholdt Fisher-immunotype 2, IATS-serotype 4 eller IATS-serotype 11 LPS. I Fisher-immunotype 2 og IATS-serotype 11-sporene gjenkjente antistoff 6D6 en kort rekke molekyler med lav molekylvekt i regelmessig avstand (dvs. stige-lignende) som svarer nøyaktig til mindre former for LPS-molekyler visualisert ved en på lignende måte utført SDS-PAGE-gel hvori antigenene ikke ble overført til en NCM, men i stedet ble farvet spesifikt for tilstedeværelse av LPS, bortsett fra at det nederste bånd på den sølvfarvede gel (som representerer kjerneområdet pluss lipid A av LPS) ikke ble erkjent. I mot-setning til dette gjenkjente antistoff 6D6 i sporet inneholdende IATS-serotype 4 LPS en komplett rekke bånd med regelmessig avstand som nesten strakte seg over hele gelens lengde med den mest intense reaksjon omkring båndene med høyere molekylvekt. Igjen svarte denne profil til det stige-lignende båndmønster som ble iakttatt i den LPS-spesifikke, farvede gel (dvs. at de viste seg å svare til hverandre bånd for bånd), bortsett fra at båndene som representerer kjerne pluss lipid A, ikke ble erkjent. Disse data viste klart at O-sidekjeden av LPS var det molekylære mål som antistoff 6D6 gjenkjente på Fisher-immunotype 2 og IATS-serotype 4 og 11.

Eksempel 5

Dette eksempel viser en fremgangsmåte for fremstilling av et humant, monoklonalt antistoff som reagerer med IATS-serotype 6 og 13 og Fisher-immunotype 1 av P. aeruginosa. Den i eksempel 1 til 4 beskrevne fremgangsmåte, ble gjentatt, bortsett fra at det var nødvendig å foreta visse modifikasjoner for å isolere, karakterisere og analysere det i dette eksempel beskrevne antistoff. Endringene i prosedyrene og oppnådde resultater med det her beskrevne monoklonale antistoff, var som følger: Kilden for humane B-celler var et individ som tidligere var immunisert med et polysaccharidpreparat med høy molekylvekt isolert fra Fisher-immunotype 2 (Pier et al., Infec. Immun., 34:461 (1981). Etter oppsamling av E~PBMC som ovenfor beskrevet, ble cellene fryst i FCS inneholdende 10 vol/vol% DMSO i en damptank med flytende nitrogen. Disse celler ble senere hurtig opptinet ved 3 7°C, ble vasket en gang i Iscoves medium og resuspendert i HAT-medium. Celledrevet transformasjon ble utført ved et forhold på 15 1A2 til celler pr. E~PBMC. Celleblandingen ble plettert i 20 mikrotiterplater ved en konsentrasjon på 78.500 celler/brønn. Kulturene ble matet hver 3. - 5. dag etter plettering, og etter den 11. dag ble det iakttatt at 100% av brønnene inneholdt celledelende celler.

For å screene supernatantene for tilstedeværelse av anti-P. aeruginosa antistoffer under anvendelse av ELISA-teknikken besto antigenplaten av en blanding av P. aeruginosa Fisher-immunotype 1-7 [klinisk isolat PSA 1277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), hhv. ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC 27317 og ATCC 27318]. En PLL-behandlet mikrotiterplate uten noen bakterier ble også anvendt til screeningen.

Analyse av kultursupernatantene ved ovennevnte metode førte til identifisering av ca. 200 brønner som inneholdt anti-P. aeruginosa antistoffer som var reaktive med Fisher-immunotype 1-7-platen, men ikke den PLL-behandlede plate som manglet bakterier. For å identifisere de brønner som inneholdt antistoff som var reaktivt med to eller flere IATS-serotyper, ble antigenplater konstruert som ovenfor angitt, i hvilke en søyle av platene inneholdt PLL-fikserte bakterier av bare én IATS-serotype. En ELISA ble utført som ovenfor angitt med supernatant fra en ekspandert kultur av hver av de anti-

P. aeruginosa positive brønner. Supernatanter ble anbragt i en rekke på de nye antigenplater og resulterte i identifisering av et antall brønner som inneholdt antistoff som var reaktivt med multiple IATS-serotyper. En brønn betegnet 8H7, inneholdt antistoffer som var spesifikke for IATS-serotype 6 og 13. Når supernatanten fra denne brønn ble testet ved ELISA på de 7 Fisher-immunotyper som i eksempel V, ble det vist at antistoffene av 8H7 var spesifikke for Fisher-immunotype 1.

For å påvise om anti-IATS-serotype 6 og 13 reaksjons-mønstre skyldtes ett eller flere antistoffer i brønn 8H7, ble ytterligere porsjoner av supernatant adsorbert hver for seg med IATS-serotype 6, 13 og 17 (negativ kontroll), og de adsorberte supernatanter ble deretter testet på PLL-fikserte bakterier av hver av de tre IATS-serotyper i henhold til den ovenfor skisserte ELISA-analyse. Resultatene viste at IATS-serotype 6 og 13 adsorberte ut antistoffaktivitet overfor hverandre. IATS-serotype 17 adsorberte ikke noen aktivitet ut overfor hverken IATS 6 eller 13. Disse data viste at anti-IATS-serotype 6 og 13-reaksjonsmønsteret skyldtes et enkelt antistoff fra brønn 8H7.

Isolering og kloning av de antistoffproduserende celler fra brønn 8H7 ble utført i tre trinn i det vesentlige som beskrevet ovenfor i eksempel 4. På denne måte ble dét oppnådd en klonet, transformert, human cellelinje som vokser kontinuerlig (dvs. er udødelig) og utskiller humant, monoklonalt antistoff som er reaktivt med Fisher-immunotype 1 og kryssreaktivt med IATS-serotype 6 og 13. I dette eksempel bærer cellelinjen og det antistoff den produserer, samme betegnelse, 8H7. Ved anvendelse av en prosedyre lik den i eksempel 5, ble isotypen av antistoffet i brønn 8H7 bestemt til å være IgM.

Biokjemisk karakterisering av de med 8H7-antistoffet gjenkjente molekyltyper ble utført ved immunoavtrykksanalyse som beskrevet i eksempel 3 og 5, bortsett fra at LPS-prepar-atene fra Fisher-immunotype 1 og IATS-serotype 6 og 13 ble ut-valgt som antigenpreparater for analyse. Et LPS-preparat av IATS-serotype 10 ble inkludert som negativ kontroll.

Analyse av de resulterende immunoavtrykk viste bare positive resultater i de NCM-spor som inneholdt Fisher-immunotype 1, IATS-serotype 6 eller IATS-serotype 13 LPS. I Fisher-immunotype 1 og IATS-serotype 6-sporene gjenkjente antistoff 8H7 en rekke bånd i regelmessig avstand (dvs. stige-lignende) som strakte seg over nesten hele gelens fulle lengde. Disse bånd svarer nøyaktig til de multiple molekylvektsformer av LPS-molekyler som ble visualisert i en lignende utført SDS-PAGE-gel hvori antigenene ikke ble overført til en NCM, men

i stedet farvet spesifikt for tilstedeværelse av LPS. I det spor som inneholdt IATS-serotype 13 LPS, gjenkjente antistoff 8H7 en mer forkortet rekke bånd i regelmessig avstand begrenset til gelens midtre-til-øvre molekylvektsintervall. Igjen svarte de bånd som ble erkjent, i posisjon til de som ble observert i en LPS-spesifikk farvet gel, bortsett fra at de høyeste og laveste molekylvektsformer av LPS i den farvede gel ikke viste seg å være vel erkjent ved Western-avtrykket.

Disse data viste klart at LPS var det molekylmål som ble gjenkjent av antistoff 8H7 på Fisher-immunotype 1 og IATS-serotype 6 og 13..

Claims (10)

1. Preparat for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det omfatter et humant, monoklonalt antistoff eller et bindingsfragment derav, som er i stand til spesifikt å bindes til flere IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, men ikke alle, hvilket antistoff vanligvis er i lyofilisert form, enten alene eller i forbindelse med andre antistoffer som er spesifikke for andre gram-negative bakterier, og eventuelt er konjugert til en markør, og om ønsket er kombinert med mindre enn 5 vekt%, basert på antistoffmengden, av buffere, stabiliseringsmidler, biocider og inerte proteiner, foruten inerte ekstendere eller eksipienser i en mengde på 1-99 vekt% av det samlede preparat.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet er ikke-reaktivt med alle Fisher-immunotyper av Pseudomonas aeruginosa.

3. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet reagerer med en Fisher-immunotype av Pseudomonas aeruginosa.

4. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet er i stand til å reagere med Fisher-immunotypene 3 og 7 av Pseudomonas aeruginosa.

5. Udødelig, transformert cellelinje, karakterisert ved at den utskiller et humant, monoklonalt antistoff som spesifikt reagerer med færre enn alle, men minst to IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa.

6. Udødelig, transformert cellelinje ifølge krav 5, karakterisert ved at den er i form av den ved American Type Culture Collection under nr. CRL 8941, 9171 eller 9258 deponerte cellelinje.

7. Humant, monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det er kryssreaktivt og kryssbeskyttende overfor Pseudomonas aeruginosa IATS-serotyper, og i visse tilfeller Fisher-immunotyper, og at det kan reagere med en epitop som reagerer med et monoklonalt antistoff fremstilt av en cellelinje ifølge krav 5.

8. Humant, monoklonalt antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at det kan reagere med en epitop som reagerer med et monoklonalt antistoff fremstilt fra en cellelinje ifølge krav 6.

9. Sett eller utstyr for anvendelse ved påvisning in vitro av tilstedeværelse av Pseudomonas aeruginosa, karakterisert ved at det omfatter et monoklonalt antistoffpreparat inneholdende minst ett humant, monoklonalt antistoff som reagerer med færre enn alle, men minst to IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, samt markører som tilveiebringer et påviselig signal og er kovalent bundet til antistoffene, eller bundet til andre antistoffer som er reaktive med hvert slikt monoklonalt antistoff.

10. Anvendelse av et monoklonalt antistoff til påvisning in vitro av tilstedeværelse av Pseudomonas aeruginosa i en prøve, karakterisert ved at prøven kombineres med det monoklonale antistoff som er reaktivt med minst to IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, hvoretter kompleksdannelsen påvises.