NL8603132A - Monoklonale antilichamen kruis-reactief en kruis-beschermend tegen p. aeruginosa serotypen. - Google Patents

Description

VO 8472

Monoklonale antilichamen kruis-reactief en kruis-beschermend tegen P. aeruginosa serotypen.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de toepassing van immunologische technieken om te voorzien in nieuwe materialen die bruikbaar zijn voor de diagnose en voor het behandelen van bacteriële infecties en meer in het bijzonder op de produktie en toepassing van humane 5 monoklonale antilichamen die in staat zijn veelvoudige serotypen van Pseudomona aeruginosa te onderscheiden.

Gram-negatieve ziektes en bijzonder ernstige complicaties daarvan, bijvoorbeeld bacteremie en endotoxemie, zijn de oorzaken van aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij humane patiënten. Dit geldt in 10 het bijzonder voor het gram-negatieve organisme Pseudomonas aeruginosa, dat gedurende de laatste 50 jaar steeds meer wordt geassocieerd met bacteriële infecties, in het bijzonder nosocomiale infecties.

Gedurende de laatste paar decennia zijn antibiotica het therapeutische middel bij uitstek geweest voor het bestrijden van gram-15 negatieve ziektes. De voortgezette hoge morbiditeit en mortaliteit die aan door gram-negatieve bacteriën veroorzaakte ziektes zijn verbonden zijn echter een aanwijzing van de beperkingen van de antibiotica-therapie, in het bijzonder met betrekking tot P. aeruginoa (zie bijvoorbeeld V.G. Andriole, "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic 20 Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94:196-199). Dit heeft aanleiding gegeven tot het zoeken naar andere methoden van preventie en behandeling. Een methode die men heeft beschouwd is de versterking van het immuunsysteem van de gastheer door aktieve en passieve immunisering.

25 Er is bijvoorbeeld waargenomen dat de actieve immunisering van mensen of experimentele dieren met gehele celbacteriële vaccins of gezuiverde bacteriële endotoxinen uit P. aeruginosa tot de ontwikkeling van specifieke opsonische antilichamen leidt die in hoofdzaak zijn gericht tegen determinanten aan de zich herhalende oligosaccharide-eenheden 30 van de lipopolysaccharide (LPS)moleculen die aan de buitenste celmem-braan van P. aeruginosa zijn gelokaliseerd (zie M. Pollack, Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, B.M. Alving en J.S. Finlayson, uitg. biz.73-79, U.S. Department of Health and Hunan Services, 1979). Deze antilichamen, hetzij actief ont- 8603132 I' ή -2- staan of passief overgebracht, blijken bescherming te geven tegen de lethale effecten van P. aeruginosa infectie bij een aantal diermodellen (Pollack, supra) en in sommige voorlopige onderzoeksmodellen bij mensen (zie L.S. Young en M. Pollack, Pseudomonas aeruginosa, L. Sabath uitg.

5 blz. 119-132, Hans Huber 1980). Bovendien is voor de rol van deze anti-lichamen in mensen van bijzonder belang geweest dat gevonden is dat in patiënten met P. aeruginosa bacteremie - een associatie tussen overleving en hoge acute serumtiters van antilichamen ten opzichte van de LPS moleculen van de infecterende stam optreedt (zie M. Pollack en 10 L.S. Young, J. Clin Invest. 63:276-286 (1979).

De bovengenoemde rapporten suggereren dat men immunotherapeu-tische benaderingen zou kunnen gebruiken voor depreventie en behandeling van bacteriële ziekte te wijten aan P. aeruginosa, zoals door het toedienen van samengevoegde humane immuun-globulines die antilichamen tegen 15 de infecterende stam (of stammen) bevatten. Humane immuunglobulines worden hierin gedefinieerd als dat deel van gefractioneerd humaan plasma dat verrijkt is aan antilichamen, waaronder specifieke antilichamen ten opzichte van stammen van P. aeruginosa vertegenwoordigd zijn. Als gevolg van bepaalde inherente beperkingen bij het gebruik van humane immuun-20 globulinecomponenten, blijft deze benadering voor de behandeling van ziekte te wijten aan P. aeruginosa onder onderzoek (zie bijvoorbeeld M.S. Collins en R.E. Roby, Am. J. Med. 76(3A):168-174, (1984) en tot dusver zijn nog geen commerciële produkten verkrijgbaar waarbij gebruik wordt gemaakt van deze componenten.

25 Eén beperking die verbonden is met immuunglobuline-preparaten is dat zij bestaan uit samenvloeiingen van monsters uit 1000 of meer donors, welke monsters zijn vóórgeselecteerd op de aanwezigheid van bepaalde anti-Pseudomonas antilichamen.

Deze samenvoeging leidt tot een middeling van individuele anti-30 lichaamstiters, hetgeen op zijn hoogst resulteert in bescheiden verbeteringen in de resulterende titer van de gewenste antilichamen.

Een andere beperking is dat het vóórselectieproces zelf een dure, voortdurende uitsortering van de donorsamenvoeging vereist om produkt-consistentie te verzekeren. Ondanks deze pogingen kunnen de immuunglo-35 bulineprodukten nog steeds van partij tot partij en onder produkten uit verschillende geografische gebieden aanzienlijk variëren.

8603132 -3-

Nog een andere beperking die inherent is aan immuunglobuline-preparaten is dat hun toepassing ertoe leidt dat gelijktijdig grote hoeveelheden uitwendige eiwitachtige stoffen (die virussen kunnen omvatten, zoals die welke onlangs zijn geassocieerd met Acquired Immune Deficiency 5 Syndrome, of AIDS) worden toegediend, die nadelige biologische effecten kunnen veroorzaken. De combinatie van lage titers van gewenste anti-lichamen en een hoog gehalte aan uitwendige stoffen kan dikwijls op suboptimale niveaus de hoeveelheid specifiek en aldus gunstig(e) immuun-globuline(s) die aan de patiënt toedienbaar zijn beperken.

10 In 1975 hebben Kohier en Milstein hun baanbrekende ontdekking gerapporteerd dat bepaalde muizecellijnen gefuseerd konden worden met muizemiltcellen onder creëring van hybridomas, waarvan elk antilichamen met een enkele specificiteit konden afgeven, dat wil zeggen monoklonale antilichamen (G. Kohier en C. Milstein, Nature, 256;495-497 (1975)). Met 15 de komst van deze technologie werd het mogelijk in sommige gevallen grote hoeveelheden van uitstekend specifieke murine-antilichamen ten opzichte van een bepaalde determinant (of determinanten) aan antigenen te produceren. Dergelijke muizemonoklonale antilichamen of preparaten van dergelijke antilichamen hebben echter voor gebruik bij mensen belangrijke 20 nadelen, in het bijzonder in het licht van de vondst dat muizemonoklonale antilichamen wanneer toegepast in proefonderzoek voor de behandeling van bepaalde humane ziektes dikwijls een immuunreactie oproepen die hen ineffectief maakt. (R.L. Levy en R.A. Miller, Ann. Rev. Med., 34:107-116 (1983)).

25 Sadoff et al. rapporteerden, terwijl zij hybridoma-technologie toepasten, de produktie van een muizemonoklonaal antilichaam van de IgM-klasse gericht tegen een 0-zijde ketendeterminant aan de LPS moleculen van een bepaald serotype van P. aeruginosa (Abstracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents 30 and Chemotherapy, No. 253). Zij vermeldden verder dat dit murine-anti-lichaam muizen beschermde tegen een lethale infectie van P. aeruginosa van hetzelfde serotype als het type waartegen de antilichamen waren gericht (d.w.z. het homologe serotype). In verschillende verdere artikelen is de ontwikkeling van muize- en humane anti-P. aeruginosa LPS 35 monoklonale antilichamen met verschillende specificiteit in detail toegelicht; bijvoorbeeld: S. Sawada et al., J. Inf. Dis., 150:570:576 (1984); 8603132 ϊ ΐ -4- J. Sadoff et al., Antibiot. Chemother., 16:134-146 (1985); R. Hancock et al., Infect. Immun. 37:166-171 (1982); A.W. Siadak en M.E. Lostrom, in Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, E.G. Engleman et al., uitg. blz. 167-185, Plenum Publishing Corp. (1985) en S. Sawada et al., 5 J. Inf. Dis., 152:965-970 (1985). De produktie en de immunotherapeu-tische toediening van anti-P. aeruginosa LPS serotype-specifieke humane monoklonale antilichamen worden beschreven in de hangende Amerikaanse octrooiaanvragen 734.624 en 828.005, die hierin als referentie worden opgenomen. Hoewel er bepaalde voordelen kunnen bestaan in het gebruik 10 van monoklonale antilichamen die in bepaalde situaties specifiek zijn voor een enkel serotype van P. aeruginosa, zoals wanneer de infectie kan worden teruggevoerd op een enkele serotype, hebben zij in vele andere situaties geen voorkeur. Bij profylactische behandelingen voor mogelijke infecties bij mensen zal het bijvoorbeeld de voorkeur hebben 15 een humaan antilichaam (of antilichamen) dat bescherming biedt tegen een veelvoud van serotypen toe te dienen. Bij therapeutische toepassingen waarbij het serotype of de serotypes van de infecterende stam (stammen) niet bekend is zal het eveneens meer de voorkeur hebben een humaan antilichaam (of antilichamen) toe te dienen dat effectief is tegen de meeste, 20 zo niet alle, van de klinisch belangrijke P. aeruginosa serotypes. Hoewel een combinatie van humane monoklonale antilichamen die elk specifiek zijn voor een enkel serotype van P. aeruginosa theoretisch zou kunnen worden samengesteld als bescherming tegen de verschillende serotypes, zou men een dergelijk preparaat moeilijk kunnen ontwikkelen en uit 25 economisch standpunt niet economisch kunnen produceren.

Er bestaat aldus een duidelijke behoefte aan humane anti- P. aeruginosa monoklonale antilichamen die in staat zijn veelvoudige serotypes van P. aeruginosa te herkennen en daartegen bescherming te leveren. Verder zouden deze antilichamen geschikt moeten zijn ten ge-30 bruike als profylactica en voor de therapeutische behandeling van P. aeruginosa infecties. De onderhavige uitvinding voldoet aan deze behoefte.

Er wordt voorzien in nieuwe cellijnen die humane monoklonale antilichamen kunnen produceren die in staat zijn tot een specifieke 35 reactie met de LPS moleculen van een veelvoud van, zo niet alle IATS serotypes van P. aeruginosa. Deze antilichamen hebben verschillende 8603132 * * -5- reactiviteiten met Fisher immunotypes en binden zich met nul, één of een veelvoud van immunotypes. Tevens wordt voorzien in een werkwijze voor het behandelen van een persoon die vatbaar is voor infecties of reeds is geïnfecteerd met P. aeruginosa door een profylactische of thera-5 peutische hoeveelheid van een preparaat toe te dienen bestaande uit tenminste één humaan monoklonaal antilichaam of bindingsfragment daarvan, dat in staat is tot kruisreactie met P. aeruginosa serotypes, welk preparaat bij voorkeur tevens een fysiologisch aanvaardbare drager omvat.

Het preparaat kan tevens één of meer van de volgende stoffen bevatten: 10 extra humane monoklonale antilichamen die in staat zijn tot reactie met andere serotype of immunotype determinanten aan de LPS of met de flagella of exotoxine A van P. aeruginosa; een gamma-globulinefractie uit humaan bloedplasma; een gamma-globulinefractie uit humaan bloedplasma waarin het plasma is verkregen van een persoon die verhoogde niveaus van 15 immunoglobulines reactief tegen P. aeruginosa vertoont; en een of meer antimicrobiële middelen.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt voorzien in nieuwe cellen die in staat zijn humane monoklonale antilichamen te produceren alsmede preparaten die dergelijke antilichamen omvatten, welke prepa-20 raten in staat zijn selectief tenminste een veelvoud van, en in sommige gevallen allé, P. aeruginosa stammen te herkennen, waarbij individuele antilichamen typerend veelvoudige IATS serotypes herkennen en nul, één of een veelvoud van Fisher immunotypes van P. aeruginosa. De onderhavige cellen hebben identificeerbare chromosomen waarin de kiemlijn DNA hier-25 uit of een voorlopercel opnieuw is gerangschikt en codeert voor een antilichaam met een bindplaats voor een epitoop dat gemeenschappelijk is onder bepaalde P. aeruginosa serotypes. Deze humane monoklonale antilichamen kan men op diverse wijzen gebruiken, met inbegrip van diagnose en therapie (b.v. beschermend in vivo).

30 Typerend zullen de cellen van de onderhavige uitvinding humane getransformeerde lymfocyten zijn die beschermende humane monoklonale antilichamen ten opzichte van toegankelijke LPS moleculen van P. aeruginosa produceren. Onder "toegankelijk" verstaat men dat de LPS moleculen fysisch in de gebruiksomgeving beschikbaar zijn voor directe 35 interactie met de monoklonale antilichamen. De aldus geleverde monoklonale antilichamen zijn bruikbaar voor de behandeling of preventie van 8603132 ï ï -6- ernstige ziektes te wijten aan P. aeruginosa. De LPS moleculen van de buitenmembraan van P. aeruginosa zullen voor direct contact door de antilichaammoleculen beschikbaar zijn en aldus de via het complement lopende lycis en/of fagocytosis van het organisme vergemakkelijken. Verder 5 zouden de LPS moleculen die uit het buitenmembraan in de omgeving worden afgegeven tevens vrij zijn om direct in interactie te treden met de antilichaammoleculen en via het reticuloendothele systeem worden verwijderd.

De bereiding van de monoklonale antilichamen kan men tot stand 10 brengen door de expressie van kernzuursequenties, die coderen voor antilichamen specifiek voor een epitoop op de LPS moleculen van veelvoudige serotypen van P. aeruginosa, onsterfelijk te maken. Typerend worden de monoklonale antilichamen geproduceerd door cel-gestuurde Epstein-Barr virus (EBV) transformatie van B-lymfocytcellen verkregen uit humane 15 donors die worden of zijn blootgesteld aan de geschikte serotypes van P. aeruginosa. De aldus geproduceerde antilichamen afscheidende cellijnen hebben het karakter van voortdurend groeiende lymfoblastolde cellen die een diploïde karyotype bezitten, Epstein-Barr nucleair anti-geen positief zijn en een monoklonaal antilichaam van hetzij IgG, IgM, 20 IgA, igD isotype afscheiden, met inbegrip van verschillende subtypen zoals IgGl, XgG2, IgG3 en IgG4. Het cel-gekiemde transformatieproces zelf wordt in detail beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.464.465 dat hierin als referentie wordt opgenomen. De monoklonale antilichamen kunnen intact of als fragmenten worden gebruikt, zoals 25 Fv, Fab, F(ab')2 maar zij zijn gewoonlijk intact.

Naar keuze kunnen cellijnen die de antilichamen produceren door celfusie tussen geschikte met geneesmiddelgemerkte humane myeloma, muizemyeloma, humane muizeheteromyeloma of humane lymfoblastolde cellen met humane B-lymfocyten worden geproduceerd om humane hybride cellijnen 30 te leveren.

De cellijnen van de onderhavige uitvinding kunnen ook anders worden toegepast dan alleen voor de directe produktie van de humane monoklonale antilichamen. De cellijnen kunnen met andere cellen worden gefuseerd (zoals geschikte geneesmiddelgemerkte humane myeloma, muize-35 myeloma, humane muizeheteromyeloma of humane lymfoblastolde cellen) onder produktie van hybridoma aldus voorzien in de overdracht van de 8603132 è i -7- genen die coderen voor de monoklonale antilichamen. Naar keuze kunnen de cellijnen wordt toegepast als bron van de chromosomen die coderen voor het immunoglobuline en die kunnen worden geïsoleerd of overgebracht naar cellen door andere technieken dan fusie. Tevens kunnen de genen die 5 coderen voor de monoklonale antilichamen wordt geïsoleerd en toegepast volgens de recombinant DNA-technieken voor de produktie van het specifieke immunoglobuline in diverse gastheren. In het bijzonder kan men door cDNA bibliotheken uit boodschapper RNA te maken, een enkel cDNA kloon, dat codeert voor het immunoglobuline en vrij is van introns iso-10 leren en in geschikte prokaryotische of eukaryotische expressievêctoren worden gebracht en vervolgens in een gastheer getransformeerd voor de uiteindelijke massaproduktie.

De lymfoblastoïde of hybride cellijnen kunnen volgens gebruikelijke technieken warden gekloneerd en uitgesorteerd, met de antilichamen 15 die in staat zijn tot binding aan de epitopen van verschillende P. aeruginosa serotypen die in de cel worden gedetecteerd.

Er bestaat in de literatuur een aantal serotyperende systemen die bruikbaar zijn voor het uitsorteren van de celbovenlagen op de aanwezigheid van anti-Pseudomonas antilichamen. Het systeem is in hoofd-20 zaak gebaseerd op de warmtestabiele hoofdsomatische antigenen van dit organisme. (C.H. Zierdt, in Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, G.L. Gilardi, uitg., CRC Press, biz. 213-238 (1978)). Door de uitbreiding van het serogroeperingssysteem is het nogal moeilijk gebleken serologische onderzoekingen van P. aeruginosa te ver-25 gelijken waardoor aldus de keuze van een bepaald systeem met het doel bovenlagen uit te sorteren enigszins willekeurig lijkt. De verwarring tussen typerende systemen werd onlangs opgehelderd door de creatie van het Internationale Antigene Typeringsschema (IATS)systeem dat werd voorgesteld door subcommissie betreffende Pseudomonadaceae van de Interna-30 tionale Commissie betreffende Systematische Bacteriologie als de rugge-graat voor verder serologisch onderzoek van P. aeruginosa. Dit systeem dat 17 onderscheiden serotypen levert aangeduid als IATS type 1, IATS type 2 enz., omvat alle warmtestabiele hoofdsomatische antigenen geïdentificeerd in vroegere systemen. (Zie P.V. Liu, Int. J. Syst.

35 Bacteriol., 33:256-264 (1983), hetgeen hierin als referentie wordt opgenomen.

8603132 i * -8-

Bij de ontwikkeling van beschermende monoklonale antilichamen die kruis-reactief zijn onder stammen van P. aeruginosa, is het tevens voordelig een typeringsschema op te nemen dat gebaseerd is op de beschermende antigenen van P. aeruginosa. Een dergelijk schema is ont-5 worpen met de bedoeling een vaccin voor klinisch gebruik te ontwikkelen en dat wordt in detail beschreven in M.W. Fisher. et al., J. Bacteriol., 98:835-836 (1969). Dit systeem, dat algemeen wordt aangeduid als het Fisher typeringssysteem, klasseert de meeste bekende P. aeruginosa in zeven typen, aangeduid als Fisher immunotype 1, Fisher immunotype 2, 10 enz. Correlatie tussen de IATS en Fisher typeringssystemen is opgehel-derd (zie P.V. Liu et al., supra) en wordt in tabel A aangegeven.

Zoals blijkt uit tabel A zijn er geen overeenkomstige Fisher immunotypes voor bepaalde IATS serotypes, hoewel wel elk Fisher immunotype correspondeert met een bepaald IATS serotype. Voor de IATS 15 en Fisher typeringssystemen wordt aangenomen dat de antigene determinanten die relevant zijn voor beide serotyperingsschema1s zetelen op het oppervlak van de LPS moleculen van P. aeruginosa (P.V. Liu et al., supra; F. Hanessien et al., Nature, 229:209-210 (1979)).

TABEL A

20 Vergelijken en correlatie van de IATS en Fisher typeringsschema's voor Pseudomonas aeruginosa IATS Fisher 1 4 2 3 3 4 5 . 7 6 1 7 8 6 9 10 5 11 2 12 13 14 15 16 17

In één aspect van de onderhavige uitvinding wordt voorzien in humane monoklonale antilichamen die in staat zijn zich specifiek te 25 binden aan de liposaccharidedeterminanten die op een veelvoud, maar niet 8603132 -9- alle IATS serotypes van P. aeruginosa aanwezig zijn. Deze determinanten kunnen bijvoorbeeld aanwezig zijn op twee of drie IATS serotypes, en op nul, één of ten minste twee Fisher immunotypes. Dergelijke antilichamen kunnen in vivo bescherming bieden tegen sommige of alle van de herkende 5 serotypes en immunotypes, typerend twee of meer serotypes.

De monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen tevens diverse toepassingen in vitro vinden. Bij wijze van voorbeeld kunnen de monoklonale antilichamen worden toegepast voor het typeren, voor het isoleren van specifieke P. aeruginosa stammen, voor het selec-10 tieve verwijderen van P. aeruginosa cellen in een heterogeen mengsel van cellen en dergelijke.

Voor diagnostische doeleinden kunnen de monoklonale antilichamen hetzij worden gemerkt of ongemerkt blijven. Typerend brengt een diagnostische analyse het detecteren van de formatie van een complex via de 15 binding van het monoklonale antilichaam aan de LPS van het P. aeruginosa organisme met zich mee. Wanneer ongemerkt, vinden de antilichamen toepassing in agglutineringsanalyses. Tevens kunnen ongemerkte antilichamen wordt gebruikt in combinatie met andere gemerkte antilichamen (tweede antilichamen) die reactief zijn met het monoklonale antilichaam, zoals 20 antilichamen specifiek voor immunoglobuline. Naar keuze kunnen de monoklonale antilichamen direct worden gemerkt. Men kan diverse merkstoffen toepassen zoals radionucliden, fluorescentiemiddelen, enzymen, enzym-substraten, enzymcofactoren, enzymremstoffen, liganden (in het bijzonder haptenen), enz. Er zijn talrijke typen immunoanalyses beschikbaar en 25 bij wijze van voorbeeld omvatten sommige daarvan die als beschreven in de volgende Amerikaanse octrooischriften No.'s 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 en 4.098.876, die hierin alle als referentie worden opgenomen.

Gewoonlijk worden de monoklonale antilichamen van de onderhavige 30 uitvinding in enzymimmunoanalyses toegepast, waarbij de onderhavige antilichamen, of tweede antilichamen uit een andere soort, aan een enzym worden geconjugeerd. Wanneer een monster dat P. aeruginosa van een bepaald serotype bevat, zoals humaan bloed of een lysaat daarvan, wordt gecombineerd met de onderhavige antilichamen, vindt binding tussen de 35 antilichamen en die moleculen die de gewenste epitoop vertonen plaats. Dergelijke cellen kunnen dan van de niet gebonden reactanten worden gescheiden en een tweede antilichaam (gemerkt met een enzym) worden toe- 8603132 * % -10- gevoegd. Daarna wordt de aanwezigheid van het antilichaam-enzymconjugaat dat specifiek aan de cellen is gebonden vastgesteld. Men kan ook andere gebruikelijke technieken die aan de vakman welbekend zijn toepassen.

Men kan tevens kits leveren ten gebruike met de onderhavige anti-5 lichamen bij de detectie van P. aeruginosa infectie of op de aanwezigheid van P. aeruginosa antigeen. Aldus kan het onderhavige monoklonale anti-lichaampreparaat van de onderhavige uitvinding worden voorzien, gewoonlijk in een gevriesdroogde vorm, hetzij alleen of in samenhang met extra antilichamen die specifiek zijn voor andere gram-negatieve bacteriën.

10 De antilichamen die aan een merk geconjugeerd kunnen worden of ongeconjugeerd zijn, worden in de kit opgenomen met buffers zoals Tris, fosfaat, carbonaat, enz., stabilisatoren, biociden, inerte proteïnen, bijvoor-' beeld runderserumalbumine en dergelijke. Deze materialen zijn in het algemeen in minder dan ongeveer 5 gew.%, gebaseerd op de hoeveelheid 15 actief antilichaam aanwezig en zijn gewoonlijk in een totale hoeveelheid van tenminste ongeveer 0,001 gew.%, opnieuw gebaseerd op de antilichaam-concentratie aanwezig. Het zou dikwijls wenselijk zijn een inerte verdunner of een excipiëns op te nemen om de actieve componenten te verdunnen, waarbij het excipiëns aanwezig kan zijn in ongeveer 1-99 gew.% 20 van het totale preparaat. Wanneer een tweede antilichaam dat in staat is tot binding met het monoklonale antilichaam wordt toegepast zal dit gewoonlijk in een afzonderlijk flesje aanwezig zijn. Het tweede antilichaam wordt typerend aan een merk geconjugeerd en op analoge wijze als de antilichaam-samenstellingen als boven beschreven samengesteld.

25 Farmaceutische samenstellingen en toepassing

De monoklonale antilichamen van deze uitvinding kunnen tevens als componenten van farmaceutische preparaten, die een therapeutische of profylactische hoeveelheid van ten minste één van de monoklonale antilichamen van deze uitvinding bevatten tesamen met een farmaceutisch 30 effectieve drager worden opgenomen. De farmaceutische drager dient elke verenigbare, niet-giftige stof die geschikt is voor het afleveren van de monoklonale antilichaam aan de patiënt, te zijn. Bruikbaar zijn steriel water, alkohol, vetten, wassen en inerte vaste stoffen als drager. Farmaceutisch aanvaardbare hulpmiddelen (buffermiddelen, disper-35 siemiddel) kunnen tevens aan het farmaceutische preparaat worden opgenomen. Dergelijke preparaten kunnen een enkel monoklonaal antilichaam 8603132 * * -11- bevatten zodat dit specifiek is voor twee of meer maar niet alle serotypes P. aeruginosa. Naar keuze kan een farmaceutisch preparaat twee of meer monoklonale antilichamen bevatten en een "cocktail" vormen. Bijvoorbeeld een cocktail die humane monoklonale antilichamen tegen groepen 5 van verschillende P. aeruginosa serotypen bevat zou een universeel pro-dukt zijn met activiteit tegen de meeste van de klinische isolaten van dat bepaalde bacterie.

Vein belang zijn profylactische en/of therapeutische monoklonale antilichaam-preparaten die in staat zijn tot reactie met ten minste drie 10 IATS serotypes, gewoon ten minste vier en meestal ten minste vijf IATS serotypes. Van bijzonder belang zijn monoklonale antilichaam-preparaten die met ten minste ongeveer zeven, bij voorkeur ten minste ongeveer tien tot veertien en tot aan alle zeventien IATS serotypes reageren. Tesamen met de IATS serotypes, zullen de preparaten waar gewenst in reactie 15 treden met ten minste twee, gewoonlijk ten minste drie en meestal ten minste vier en tot en met inbegrip van alle zeven immunotypes van het Fisher iramunotyperingssysteem.

Elk van de preparaten omvat ten minste één, gewoonlijk ten minste twee en meestal ten minste drie antilichamen, waarbij elk anti-20 lichaam met ten minste 2, 3, 4 of meer maar niet alle IATS serotypes in reactie treedt. Het is gewenst dat er ten minste één monoklonaal anti-lichaam is dat zich bindt aan ten minste twee IATS serotypes en één of meer dan één Fisher immunotype, bij voorkeur ten minste twee immuno-types.

25 Het is gewenst dat het totale aantal verschillende monoklonale antilichaam in een preparaat ten minste één is en gelijk aan of minder dan ongeveer de helft van het totale aantal IATS serotypes waarmee de preparaten in reactie treden, meestal êên-derde van een dergelijk totaal aantal. De molverhouding van de verschillende monoklonale antilichaam-30 componenten verschilt gewoonlijk net niet meer dan een factor tien, meestal met niet meer dan factor vijf en zal gewoonlijk een molverhou-ding van ongeveer 1:1-2 op elk van de andere antilichaam^componenten zijn.

De humane monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvin-35 ding zijn tevens bruikbaar in combinatie met andere monoklonale antilichaam-preparaten of met bestaande bloedsplasmaprodukten, zoals in de 8603132 -12-

j V

handel verkrijgbare gamma-globuline en immuunglobulineprodukten die bij de profylactische of therapeutische behandeling van P. aeruginosa ziekten bij mensen worden toegepast. Bij voorkeur wordt voor immuunglobu-lines het plasma verkregen uit humane donors die verhoogde niveaus van 5 immunoglobulines reactief met P. aeruginosa vertonen. Zie algemeen het compendium "intravenous Immune Globulin and the Compromised Host",

Amer. J. Med., 76(3a), 30 maart 1984, blz. 1-231, dat hierin als referentie wordt opgenomen.

De monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding zijn 10 bruikbaar als afzonderlijk toegediende preparaten gegeven in samenhang met antibiotica of antimicrobiële middelen. Typerend kunnen de antimicro-biële middelen een anti-pseudomonaal penicilline (b.v. carbenicilline) tesamen met een aminoglycoside (b.v. gentamicine, tobramycine, enz.) omvatten, maar tevens kunnen talrijke extra middelen (b.v. cefalosporinen), 15 die aan de vakman welbekend zijn, worden toegepast.

De humane monoklonale antilichamen en farmaceutische preparaten daarvan van deze uitvinding zijn bijzonder geschikt voor orale of paren-terale toediening. Bij voorkeur zullen de farmaceutische preparaten paren-teraal worden toegediend, dat wil zeggen subcutaan, intramusculair of 20 intraveneus. Aldus voorziet deze uitvinding in preparaten voor parente-rale toediening bestaande uit een oplossing van het humane monoklonale antilichaam of een cocktail daarvan, opgelost in een aanvaardbare drager, bij voorkeur een waterige drager. Diverse waterige dragers zijn bruikbaar, bijvoorbeeld water, gebufferd water, 0,4% pekel, 0,3% glycine 25 en dergelijke. Deze oplossingen zijn steriel en in het algemeen vrij van fijnverdeelde materialen. Deze preparaten kunnen door gebruikelijke welbekende sterilisatietechnieken worden gesteriliseerd. De preparaten kunnen zonodig farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen bevatten voor het benaderen van fysiologische omstandigheden, zoals pH-instel- en buffer-30 middelen, toxiciteitsinstellende middelen en dergelijke, bijvoorbeeld natriumacetaat, natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride, na-triumlactaat, enz. De concentratie van antilichaam in deze samenstellingen kan algemeen ruim variëren, dat wil zeggen van minder dan ongeveer 0,5%, gewoonlijk bij of tenminste ongeveer 1% tot zelfs 15 of 20 gew.% 35 en deze wordt gekozen in hoofdzaak gebaseerd op vloeiende volumes, vis-cositeiten, enz., bij voorkeur voor de gekozen bepaalde toedieningswijze.

8603132 -13- r t

Aldus kan een typerend farmaceutisch preparaat voor intramus-culaire injectie zodanig zijn samengesteld dat dit 1 ml steriel gebufferd water en 50 mg monoklonaal antilichaam bevat. Een typerend preparaat voor intraveneuze infusie kan worden samengesteld met 250 ml ste-5 riele Ringer's oplossing en 150 mg monoklonaal antilichaam. Actuele methoden ter bereiding van parenteraal toedienbare preparaten zijn welbekend voor de vakman en worden in meer details beschreven in, bijvoorbeeld, Remington's Pharmaceutical Science, 15e druk, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), dat hierin als referentie wordt 10 opgenomen.

De monoklonale antilichamen van deze uitvinding kunnen voor opslag worden gevriesdroogd en in een geschikte drager vóór gebruik worden gereconstitueerd. Deze techniek blijkt effectief te zijn voor gebruikelijke immuunglobulinen en in de techniek bekende vriesdroging-15 en reconstitutietechnieken zijn bruikbaar. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat vriesdrogen en reconstitutie tot verschillende graden van antilichaam-activiteitsverlies kunnen leiden (b.v. voor gebruikelijke immuunglobulinen hebben IgM antilichamen meestal een groter activiteits-verlies dan voor IgG antilichamen) en dat toepassingsniveaus soms moeten 20 worden bijgesteld ter compensatie daarvan.

De preparaten, die de onderhavige humane monoklonale antilichamen of een cocktail daarvan bevatten, kunnen voor de profylactische en/of therapeutische behandeling van P. aeruginosa infecties worden toegediend. Bij therapeutische toediening worden de preparaten aan de 25 patiënt die reeds is geïnfecteerd met één of meer P. aeruginosa serotypes toegediend in een hoeveelheid die voldoende is om de infectie en de complicaties daarvan te genezen of tenminste gedeeltelijk tot staan te brengen. Een adequate hoeveelheid om dit te bereiken wordt gedefinieerd als een "therapeutisch effectieve dosis". Effectieve hoeveel-30 heden voor dit doel hangen af van de ernst van de infectie en de algemene toestand van het eigen immuunsysteem van de patiënt, maar zij variëren in het algemeen van ongeveer 1 tot ongeveer 200 mg antilichaam per kg lichaamsgewicht, waarbij meestal doseringen van 5 tot 25 mg per kg worden gebruikt. Men dient in gedachten te houden dat de materialen 35 van deze uitvinding algemeen toepasbaar zijn voor ernstige ziektetoestanden, dat wil zeggen situaties gevaarlijk of potentieel gevaarlijk 8603132 -14- voor het leven zijn, in het bijzonder bacteremie en endotoxemie te wijten aan p. aeruginosa. In dergelijke gevallen is het mogelijk, met het oog op de afwezigheid van uitwendige stoffen en de afwezigheid van "vreemde stof" afstotingen die met de onderhavige humane monoklonale 5 antilichamen van deze uitvinding worden bereikt, dat het de behandelende arts wenselijk lijkt om een eventuele overmaat van deze antilichamen toe te dienen. Bij profylactische toedieningen worden preparaten, die het onderhavige antilichaam of een cocktail daarvan bevatten aan een patiënt die niet reeds is geïnfecteerd door P. aeruginosa toegediend om de weer-10 stand van de patiënt tegen een eventuele dergelijke infectie te verhogen. Een dergelijke hoeveelheid wordt gedefinieerd als een "profylactisch effectieve dosis". Bij deze toepassing hangt de juiste hoeveelheid tevens af van de gezondheidstoestand van de patiënt en het algemene niveau van immuniteit, maar deze varieert in het algemeen van 0,1 tot 25 mg 15 per kg, in het bijzonder van 0,5 tot 2,5 mg per kg.

Enkele of veelvoudige toedieningen van de preparaten kunnen bij dosisniveaus en volgens een patroon dat door de behandelende arts gekozen wordt worden uitgevoerd. Steeds dienen de farmaceutische samenstellingen een hoeveelheid antilichaam of antilichamen van deze uitvinding 20 te leveren voldoende om de patiënt effectief te behandelen.

EXPERIMENTEEL

Voorbeeld I

Voorbeeld I demonstreert methoden voor de produktie van humane monoklonale antilichamen (IgM isotype) die reageren met IATS serotypen 25 2, 5 en 16 en Fisher immunotypes 3 en 7.

Een periferaal bloedmonster verkregen uit een patiënt met cyst- fibrose waarvan bekend was dat deze een chronische infectie met P. aeruginosa had diende als een bron van humane B cellen. Er werden mononucleaire cellen uit het bloed volgens standaardcentrifugerings- 30 technieken op Ficoll-Paque (A. Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest.

(1968) 21:Suppl. 97, 77-89) afgescheiden en tweemaal gewassen in calcium/ magnesiumvrij fosfaat-gebufferd pekel (PBS).

De mononuclaire cellen werden ontdaan van T-cellen met behulp van een gemodificeerde E-rosetvormingsprocedure. In het kort werden de 7 35 cellen eerst opnieuw gesuspendeerd tot een concentratie van 1 x 10 cel-len/ml in PBS dat 20% faetaal kalfserum (FCS) bij 4°C bevat. Eén ml van 1603132 -15- deze suspensie werd daarna in een 17 x 100 mm polystyreen rondbodembuis 9 gebracht waaraan 1 x 10 2-amino-isothiouroniumbromide (AET)-behandelde schaperode bloedcellen uit een 10% (v/v) oplossing in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (Iscove's medium) (M. Madsen en H.E. Johnson, 5 J. Immun. Methods (1979) 27:61-74) was toegevoegd. De suspensie werd zeer zachtjes gedurende 5-10 minuten bij 4°C gemengd en de E-rosetvormige cellen daarna door centrifugering op Ficoll-Paque gedurende 8 minuten bij 2500xg bij 4°C verwijderd. E-roset negatieve periferale mononucleaire bloedcellen (E PBMC) die zich aan het grensvlak binden werden verzameld 10 en eenmaal gewassen in Iscove's medium en daarna opnieuw daarin gsuspen-deerd, welk medium 15% (v/v) FCS, L-glutamine (2 mmol/1), penicilline 4 (100 IU/ml), streptomycine (100 jig/mL), hypoxanthine (1 x 10 M), amino-pterine (4 x 10~7M) en thymidine (1,6 x 1θ""5Μ) bevatte. Dit medium wordt hierna aangeduid als HAT medium.

15 Cel-gestuurde transformatie van het E PBMC werd tot stand ge bracht door het gelijktijdig kweken van deze cellen met een transformerende cellijn. De transformerende cellijn was een Epstein-Barr nucleaire antigeen (EBNA) positieve humane lymfoblastolde cellijn afgeleid door ethylmethaan-sulfonaat (EMS) mutagenese van de GM 1500 lymfoblastolde 20 cellijn gevolgd door selectie in aanwezigheid van 30 jiq/ml 6-thioguanine om de cellen hypoxantine-guaninefosforidocyl transferase (HGPRT) deficiënt te maken en aldus HAT gevoelig. Deze cellijn werd de 1A2 cellijn genoemd en gedoponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC) op 29 maart 1982, onder A.T.C.C. No. CEL 8119. 1A2 cellen in de logarit-25 mische groeifase werden in HAT medium gesuspendeerd en daarna gecombineerd met het E PBMC in een verhouding van acht 1A2 cellen per E PBMC.

Het celmengsel werd aangebracht op acht rondbodem microtiterplaten met 96 cupjes (Costar 3799) bij een concentratie van 72.000 cellen/cupje in een volume van 200 microliter per cupje, en bij 37°C in een vochtige 30 atmosfeer die 6% C02 bevatte geïncubeerd. De kweken werden op dagen 5 en 8 na het op de plaat brengen gevoed door de helft van de bovenstaande laag te vervangen door vers HAT medium. De cupjes werden om de andere dag op een omgekeerde microscoop waargenomen op rekenen van celwoeke-ring. 12 dagen na het op de plaat brengen werd waargenomen dat 100% van 35 de cupjes woekerende cellen bevatte en dat bij de meeste van de cupjes de cellen een voldoende dichtheid hadden om de bovenlagen te verwijderen en te onderzoeken op anti-P. aeruginosa antilichaam.

8503132 « i.

-16-

De bovenlagen werden uitgesorteerd op de aanwezigheid van antipa aeruginosa antilichamen met een enzymgekoppelde immunosorbens-analyse (ELISA)-techniek (E. Engvall (1977) 55:193-200). Antigeenplaten bestonden uit microtiterplaten met vlakke bodem met 96 cupjes (Immulon II, Dynatech, 5 waarvan de cupjes verschillende levende bacteriën geadsorbeerd aan de bodem van het cupje bevatte. Om de adsorptie van de bacteriën aan de kunststof te vergemakkelijken werd 50 microliter/cupje poly-L-lysine (PLL) (1 ^ig/ml in PBS, pH 7,2) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het niet-geadsorbeerde PLL werd er daarna uitgehaald, de 10 platen eenmaal gewassen met PBS, 50 microliter van gewassen bacteriële suspensie (0OC. =0,2) in PBS aan elk cupje toegevoegd en de platen ge- o60 durende 1 uur bij 27°C geïncubeerd. Niet-geadsorbeerde bacteriën werden verwijderd door de platen driemaal met pekel-Tween (0,9% NaCl, 0,05% (v/v) Tween-20) te wassen. Verschillende antigeenplaten die bij de uit-15 sortering werden toegepast omvatten: (1) een mengsel van P. aeruginosa Fisher immunotypes 1, 2 en 4 (A.T.C.C. No.'s 27312, 27313, 27315); (2) een mengsel van P. aeruginosa Fisher immunotypes 3, 5, 6 en 7 (A.T.C.C. No.'s 27314, 27316m 27317, 27318); en (3) een microtiterplaat zonder bacteriën.

20 De ELISA werd ingeleid door eerst de platen te blokkeren met 200 microliter/cupje blokkerende buffer [PBS, pH 7,2 met 5% (w/v) niet-vette droge melk, 0,01% (v/v) antischuim A (Sigma) en 0,01% (w/v) thime-rosal] gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Na het blokkeren werden de platen driemaal gewassen met pekel-Tween. 50 microliter PBS, 25 pH 7,2, met 0,1% Tween-20 en 0,2% (w/v) runderserumalbumine (BSA) werden in alle cupjes gebracht. De bovenlagen uit cupjes van de kweekplaten werden als replica aangebracht op platen in overeenkomstige cupjes van de antigeenplaten (50 microliter/cupje) en de platen werden 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De bovenlagen werden daarna verwijderd, 30 de cupjes driemaal gewassen met pekel-Tween en 50 microliter geschikt verdunde mieriksperoxidase (HRP) geconjugeerde geiten-anti-humaan IgG + IgM (American Qualex International #A1114 + #A1124) aan de cupjes toegevoegd. In dit voorbeeld werden HRP-geiten-anti-IgG en HRP-geiten-anti-IgM in een eindverdunning van respectievelijk 1:5000 en 1:3000 in 35 PBS, pH 7,2 dat 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA bevatte, toegepast. Na een 30 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur werd overmaat enzym- 8603132 -17- geconjugeerde geiten-antilichamen verwijderd en werden de cupjes driemaal met pekel-Tween gewassen. 100 Microliter substraat (0,8 mg/ml o-fenyleendiamine-dihydrochloride in 100 mM citraatbuffer, pH 5,0, plus 0,03% H202 in gedexoniseerd H20, gemengd in gelijke volumes juist vóór 5 het op de plaat brengen) werd daarna aan elk cupje toegevoegd. Na 30 minuten incubatie in het donker werd 50 microliter van 3N H2SC>4 aan alle cupjes toegevoegd om de reacties te beëindigen. Kweekbovenlagen met antilichamen die reageerden met het antigeen van de plaat werden gedetecteerd door een positieve kleurontwikkeling in de overeenkomstige 10 cupjes en de sterkte van de reactie werd gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij 490 nm met een Bio-Tek El-310 micro-ELISA-uitlezer.

Analyse van de kweekbovenlagen door de voomoemde methode leidde tot de identificatie van twee cupjes (1C1 en 2H12) die anti-P. aeruginosa antilichamen bevatten die reageerden met de Fisher immunotypes 3, 5, 6 15 en 6 plaat, maar niet met de Fisher immunotypes 1, 2 en 4 plaat of de niet-bacterieplaat. Teneinde het specifieke Fisher immunotype(s) te identificeren werden antigeenplaten die PPL-gefixeerde bacteriën van slechts één Fisher immunotype bevatten voor elk immunotype als bovenbeschreven klaargemaakt. De prestatie van de ELISA analyse als boven 20 vermeld met kweekbovenlagen uit cupjes 1C1 en 2H12 betreffende de individuele immunotypeplaten toonde aan dat deze twee cupjes antilichaam bevatten dat specifiek was voor zowel Fisher immunotype 3 en 7. Een soortgelijke ELISA uitgevoerd aan het IATS panel van P. aeruginosa-typerende stammen (verkregen van A.T.C.C. en omvattende No.'s 33348-25 33364) demonstreerde dat antilichaam in cupjes 1C1 en 2H12 specifiek reageerde met IATS stammen 2, 5 en 16.

Het isotype van het reactieve antilichaam (antilichamen) in cupjes 1CI en 2H12 werd vastgesteld in een ELISA analyse gelijk aan de specificiteitsproeven als boven beschreven met uitzondering dat het 30 HPR-geiten-anti-huaaan IgG en HRP-geiten-anti-humaan IgM onafhankelijk als tweede trapsreactanten werden toegepast in plaats van te worden gecombineerd. De positieve reactie van de antilichamen in cupjes 1C1 en 2H12 met Fisher immunotypen 3 en 7 werd alleen waargenomen met de anti-IgM reactanten hetgeen een IgM isotype voor de relevante antilichamen 35 in elk cupje demonstreert.

8803132 --.— ..

-18-

Teneinde vast te stellen of het anti-Fisher immunotypes 3 en 7 reactiepatroon veroorzaakt werd door één of meer antilichamen in cupjes 1C1 en 2H12 (d.w.z. één antilichaam reactief met beide Fisher immunotypes 3 en 7 of twee antilichamen, één reactief met Fisher immunotype 3 5 en het andere met Fisher immunotype 7) werden cellen uit de beide cupjes bij lage dichtheid subgekweekt en cupjes die woekerende cellen bevatten geanalyseerd op antilichaamsactiviteit op verschillende Fisher immunotype 3 en Fisher immunotype 7 bacteriën-antigeenplaten. De subkweek werd uitgevoerd in rondbodemplaten met 96 cupjes bij een dichtheid van 10 5 cellen/cup je in een totaal volume van 100 microliter HAT medium zonder de aminopterinecomponent (HT medium). Niet-trans formerende HAT-gevoelige lymfoblastoïde cellen werden in alle cupjes bij een dichtheid van 500 cellen/cupje als toevoercellen opgenomen. Vier dagen na de plaat-vorming werd aan alle cupjes 100 microliter HAT medium toegevoegd om de 15 toevoercellen selectief te doden. De cupjes werden opnieuw op dag 9 na het aanbrengen op de plaat gevoed door de helft van de bovenlaag te vervangen door HAT medium. Daarna werden de cupjes op gelijke wijze elke 4-5 dagen gevoed met HT medium totdat de cupjes voldoende lymfoblastoïde celdichtheid bezaten voor een bovenlaaganalyse door ELXSA. Na analyse op 20 individuele Fisher immunotype 3 en Fisher immunotype 7 antigeenplaten, reageerden al die bovenlagen die reageerden met Fisher immunotype 3 tevens met Fisher immunotype 7, hetgeen erop wijst dat een antilichaam verantwoordelijk was voor de activiteit aan beide Fisher immunotypes. Willekeurig gekozen bovenlagen na analyse op IATS stammen 2, 5 en 16 25 bleken met alle drie stammen te reageren in plaats van met de individuele stammen, hetgeen verder de conclusie ondersteunt dat een antilichaam een kruisreactie aanging met Fisherimmunotype 3 en 7 en IATS stammen 2, 5 en 16. Het kloneren van specifieke antilichaam-producerende cellen uit cupjes 1C1 en 2H12 werd tot stand gebracht door onafhankelijk de cellen 30 uit elk cupje aan verschillende keren beperkende verdunningsklonering te onderwerpen, totdat alle klonale bovenlagen geanalyseerd volgens het bovengenoemde ELISA protocol resulteerden in een positieve reactie op Fisher immunotypes 3 en 7 en IATS stammen 2, 5 en 16. Bij het kloneren werden toevoercellen toegepast als bovenbeschreven voor de subkweek.

35 Hierdoor werden twee gekloneerde getransformeerde humane cellijnen (1C1 en 2H12) geprepareerd, die continu (onsterfelijk) waren en die elk 8603132 -19- humaan monoklonaal antilichaam afscheiden dat reactief was met Fisher immunotypes 3 en 7 en IATS stammen 2, 5 en 16. In dit voorbeeld dragen de cellijn en het geproduceerde antilichaam dezelfde aanduiding.

Voorbeeld II

5 Voorbeeld II demonstreert methoden voor de produktie van humane

monoklonale antilichamen (IgG isotype) die reageren met IATS serotypes 2, 5 en 16 en Fisher immunotypes 3 en 7. De protocollen voor de produktie zijn in wezen identiek aan voorbeeld I. In het kort diende een peri-feraal bloedmonster verkregen uit een cystische fybrose-patiënt, waarvan 10 bekend was dat deze een chronische infectie met P. aeruginosa had, als bron voor humane B cellen. Er werden mononucleaire cellen afgescheiden als beschreven in voorbeeld I, met uitzondering dat 1,6 ml van de PBS

9 suspensie wordt toegepast met 1,6 x 10 AET-behandelde schapen rode bloedcellen als suspensie. De celgestuurde transformatie was tevens dezelfde 15 met uitzondering dat: de verhouding van 1A2 cellen per E PBMC 7,5 was; er werden 15 platen met 17.000 cellen/cupje toegepast; op 6 en 10 dagen na het op de plaat brengen werden de kweken toegevoegd en na 16 dagen na het op de plaat brengen bevatten bijna alle cupjes woekerende cellen.

Het uitsorteren van de kweekbovenlagen op specifieke antilichamen 20 werd uitgevoerd als beschreven en resulteerde in de lokalisering van een cupje (9D1) dat een antilichaam reactief met de Fisher immunotypes 3, 5, 6 en 7 plaat maar niet met de Fisher immunotypes 1, 2 en 4 plaat of de niet-bacteriënplaat bevatte. De capaciteit van de beschreven ELISA analyse op individuele immunotype of serotype bacteriële antigeenplaten met 25 9D1 kweekbovenlagen toonde een antilichaam aan dat specifiek was voor zowel Fisher immunotypes 3 en 7 als IATS stammen 2, 5 en 16. Latere studie uitgevoerd volgens voorbeeld I demonstreerdden dat de antilichaam-specificiteit in cupjes 9D1 was toe te schrijven aan een enkele kloon dat een IgG isotype antilichaam produceerde.

30 Voorbeeld III

Voorbeeld III demonstreert de antigene specificiteit van sommige van de antilichamen van de onderhavige uitvinding.

Ter bepaling of monoklonale antilichamen 1C1, 2H12 en 9D1 met hetzelfde antigene doel reageerden en aldus een identieke specificiteit 35 hadden werden extra proeven uitgevoerd. Eerst werden de antilichamen vergeleken in een ELISA ten opzichte van een panel van referentiestammen 8603132 -20- en klinische isolaten van P. aeruginosa. Het ELISA protocol was als bovenbeschreven met uitzondering van de volgende modificaties: 1) in plaats van aan PAL beklede-platen geadsorbeerde bacteriën, bevatten de cupjes van de plaat verschillende gehele bacteriën die met etha- 5 nol waren gefixeerd aan de bodem van het cupje. De platen werden geprepareerd door toevoeging van 50 microliter gewassen bacteriële suspensie (0D-.. =0,2) in PBS aan de cupjes, de platen gedurende 20 minuten bij

OOU

500 x g te centrifugeren, PBS te aspireren, 75 microliter ethanol gedurende 10 minuten toe te voegen, ethanol te verwijderen, gevolgd door 10 luchtdroging. Op de antigeenplaten waren IATS stammen 2, 5, 11 en 16 (A.T.C.C. resp. No.'s 33349, 33352, 33358 en 33363) en 16 klinische isolaten, die eerder werden getypeerd door zowel agglutinering met Difco' (Detroit, Michigan) Bacto-Pseudomonas aeruginosa antisera volgens de aanwijzingen van de producent en door ELISA (als hierin beschreven) als 15 serotypes 2, 5, 16 of een combinatie van dergelijke serotypes opgenomen; 2) konijnen-typerende antisera werden toegepast bij een verdunning van 1:500 in PBS met uitzondering van*anti-IATS 16 1:250 was verdund. Kweek-bovenlagen die 1C1, 2H12 en 9D1 antilichamen bevatten werden als zodanig toegepast; 3) als tweede trapsreagentia werden gebiotinyleerd pro- 20 teïne A (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 1:500 verdund en gebiotinyleerd geiten-anti-humaan IgG (4703, Tago, Ine,

Burlingame, CA) 1:500 verdund, voor de detectie van respectievelijk konijnen- en humane antilichamen gebruikt. Er werd 50 microliter reagens aan geschikte cupjes toegevoegd en na een 30 minuten incubatie bij kamer-25 temperatuur werd het ongebonden reagens verwijderd en werden de cupjes driemaal gewassen. Vervolgens werd 50 microliter van een voorgevormd avidine:gebiotinyleerd mierikswortelperoxidasecomplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) aan elk cupje toegevoegd. Na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur werd overmaat Vectastain ABC 30 reagens verwijderd en werden de cupjes opnieuw driemaal gewassen voordat substraat werd toegevoegd. Zoals blijkt uit tabel II toonden de resultaten van de analyse aan dat terwijl antilichamen 1C1 en 9D1 met elk klinische isolaat getypeerd als een IATS 2,5 of 16 serotype reageerden, antilichaam 2H12 niet met drue vab dergelijke isolaten reageerden. Dit 35 wijst erop dat antilichaam 2H12 een ander epitoop herkende dan dat herkend door 1C1 of 9D1 en dat de twee epitopen kennelijk gecoördineerd 8803132 -21- tot expressie kwamen op de meeste maar niet alle klinische isolaten die overeenkomen met IATS serotypes 2, 5 of 16.

TABEL B

Reactiviteitspatronen van Difco Bacto-P. aeruginosa 5 antisera en humane monoklonale antilichamen 2H12, 1C1, 9D1 op type stammen en klinische isolaten van P. aeruginosa

Type stam 1 Konijn_ _Mens _.

klinisch χΑΤ3 χΑΤ3 IATS IATS Mab Mab Mab 10 1SOlaat_o2_a5_al6_all_2H12 1C1 9D1 IATS 2- - - + + + IATS 5 (+)d + - - + + + IATS 16 (+)a (+)a + - + + + IATS 11 - - - + ~ IS A523 + + - + + + B406 + + (+)a - + + + C27 + + - + + + D26 + + - + + + F155 + + + - + + + 20 F225 + (-l-)a + + + + F250 + + - - + + + F253 - + - - + + + F255 + + - - + + F256 + - - - + + 25 F396 + + + + + + H217 + + + + + + H218 + + - + + + H219 + - + + + H220 + + - + + + 30 H221 + + - - + +

3L

(+) * ELISA reactie zeer zwak positief 8503132 -22-

De gegevens suggereren verder dat het moleculaire doel dat door de antilichamen 1C1 en 9D1 wordt herkend blijkbaar op alle klinische iso-laten van P. aeruginosa, die als behorende tot 1ATS serotypen 2, 5 of 16 konden worden getypeerd, aanwezig was, terwijl het doel herkend door 5 antilichaam 2H12 tot expressie werd gebracht op een subgroep van dergelijke isolaten.

Ter bepaling of de 1C1, 2H12 en 9D1 antilichamen reageerden met verschillende antigenen of naar keuze verschillende epitopen aan hetzelfde antigeen, waarbij dergelijke epitopen tot expressie waren gebracht 10 op de meeste maar niet alle IATS 2, 5 en 16 serotypen, werd een immuno-afdrukanalyse uitgevoerd. Omdat de gemeenschappelijke antigeniciteit tussen IATS stammen 2, 5 en 16 blijkbaar te danken is aan warmtestabiele antigenen (P.V. Liu, et al., supra) en rekening houdende met het feit dat de warmtestabiliteit een eerder opgemerkte eigenschap van lipoly-15 saccharidemoleculen is, werden LPS preparaten uit IATS stammen 2, 5, 16 en 11 als antigeenpreparaten voor analyse gekozen. Een ruw LPS werd uit het type stammen bereid door extractie in pekel bij 60°C (F. Orskov et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. (1971) Hoofdstuk B 79:142-152).

Tien microgram LPS, bepaald door het 2-keto-3-deoxyoctonaat (KDO) gehalte 20 · (Y.D. Karkhanis et al., Anal. Biochem. (1978) 85:595-601) met elk van de serotypen werden onderworpen aan natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelectroforese (SDS-page) (r.e.w. Hancock en A.M. Carey, J. Bacteriol. (1977) 140:901-910) op een 10-20% gradiënt gel. Afzonderlijke moleculaire verbindingssoorten werden van de gel naar een nitrocellulosemem-25 braan (NCM) als elders beschreven overgebracht (H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 2É:4350-4354) en het NCM afdruk gedurende 1 uur in PBS-Tween geblokkeerd (B. Batteiger et al., J. Immunol. Meth. (1982) 55:297-307). De afdrukken werden daarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 20 ml gebruikte kweekbovenlaag van één van de 1C1, 2H12, 30 9D1 cellijnen geïncubeerd. Na vijf 5 minuten durende spoelingen in PBS-

Tween werd elk van de NCM-afdrukken gedurende 1 uur bij 25°C in een 1:1000 verdunning (in PBS-Tween) van alkalische fosfatase-geconjugeerde geiten-anti-humaan IgG + IgA + igM (Zymed) geïncubeerd. De afdrukken werden daarna onderworpen aan vijf 5 minuten durende wassingen in PBS-35 Tween, na welke periode antigeenantilichaam interacties zichtbaar werden gemaakt door de afdrukken gedurende 15-20 minuten bij 25°C in 30 ml nitro- 8603132 -23- blauw tetrazolium 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT-BCIP) substraat als beschreven door Leary et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 4045-4049 te incuberen. De kleurontwikkeling werd gestopt door de afdruk verscheidene malen in gedeloniseerd water te spoelen. De afdrukprofielen 5 verkregen met de drie antilichamen waren opmerkelijk verschillend. Anti-lichaam 2H12 herkende overwegend een korte reeks van regelmatig op afstand staande (d.w.z. ladderachtige) lagermoleculaire moleculen in de antigeenpreparaten van serotypes 2, 5 en 16. Tevens werden sommige regelmatig op afstand staande hogermoleculaire moleculen zwak herkend. Er werd 10 geen reactie waargenomen op het LPS preparaat uit serotype 11. Herhaling van de immunoafdrukanalyse onder toepassing van LPS preparaten, die eerder waren behandeld met proteinase K bij 60°C ter vernietiging van proteïne antigenen gaf geen wijzigingen in de profielen. De laagmole-culaire banden kwamen exact overeen met kleinere vormen van LPS molecu-15 len zoals zichtbaar gemaakt in een op soortgelijke wijze uitgevoerde SDS-PAGE gel waarin de antigenen niet naar een NCM waren overgebracht maar in plaats daarvan specifiek werden gekleurd op de aanwezigheid van LPS (C.M. Tsai en C.E. Frasch, Anal. Biochem. (1982) 119:115-119) met uitzondering dat de laagste band kan de zilvergekleurde gel (dat het 20 kerngebied plus lipide A van LPS voorstelde) niet werd herkend. Door antilichaam 1C1 werd dezelfde reeks van regelmatig op afstand staande laagmoleculaire moleculen herkend onder antigeenpreparaten van serotypes 2, 5 en 16 maar niet 11, hoewel de intensiteit van de reactie niet even sterk was als die met 2H12. Tevens werd door dit antilichaam tevens 25 uitstekend een reeks van regelmatige gescheiden hogermoleculaire moleculen op serotypen 2, 5 en 16 herkend die in combinatie met de herkende lagermoleculaire banden, aanleiding gaven tot duidelijk onderscheiden, volledige ladderachtige profielen. Deze profielen werden niet gewijzigd door vóórbehandeling van de antigeenpreparaten met proteinase K. Opnieuw 30 kwamen de profielen overeen met de ladderachtige bandvormende patronen als waargenomen in LPS-specifiek gekleurde gels (d.w.z. zij bleken band voor band over te komen) met uitzondering dat de band die kern plus lipide A voorstelt niet werd herkend. Antilichaam 9D1 had hetzelfde reactieprofiel als antilichaam 1C1 op de IATS 2, 5 en 16 maar niet 11, 35 stammen. Opnieuw werd de onderste band van de ladder van een zilvergekleurde gel van de verschillende LPS preparaten niet herkend en werd het 8603132 -24- totale profiel niet gewijzigd door voorbehandeling van de LPS preparaten met proteinase K. Deze waarnemingen gaven collectief aan dat de LPS serotypen 2, 5 en 16 het moleculaire doelwit vormde bekend door de 2H12, 1C1 en 9D1 antilichamen.

5 Voorbeeld IV

Voorbeeld IV demonstreert de beschermende activiteit van één van de antilichamen van de onderhavige uitvinding. Om het in vivo beschermende vermogen van antilichaam 1C1 te beoordelen werden dierbe-schermingsstudies bij muizen uitgevoerd. 1C1 antilichaam werd eerst uit 10 gebruikte kweekbovenlaag geconcentreerd door neerslaan met verzadigd ammoniumsulfaat (50% eindconcentratie) (A.H. Good et al., Selected Methods in Cellular Immunology, B.B. Mishell en S.M. Shiigi, uitg.

W.J. Freeman & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)). Neergeslagen materiaal werd gereconstitueerd in een minimaal volume steriel water, 15 intensief tegen PBS gedialyseerd en steriel gefiltreerd. Als negatieve controle werd een gebruikte kweekbovenlaag uit een andere getransformeerde humane cellijn (6F11-A.T.C.C. No. CRI 8562) die een humaan mono-klonaal antilichaam specifiek voor de LPS of IATS stam 11 produceerde soortgelijk behandeld.

20 Vrouwtjes BALB/c muizen met tussen 20 en 22 g lichaamsgewicht werden in twee groepen van 30 muizen elk verdeeld. Alle muizen in elke groep werden via de intraperitoneale (ip)route individueel gelncubeerd met 0,5 ml geconcentreerd 1C1 of 6F11 antilichaam. Zes uur later werd elke groep onderverdeeld in drie groepen van 10 muizen en leden van elke 25 groep van 10 muizen werden onafhankelijk geïnfecteerd ip met 0,3 ml van een levende bacteriële suspensie die respectievelijk 5 LD^ van resp. IATS stammen 2, 5 of 11 bevatte. Bacteriële suspensies werden uit een beslagcultuur in de logaritmische groeifase verkregen, waaruit de bacteriën werden gecentrifugeerd, tweemaal gewassen in PBS en opnieuw tot 30 de geschikte dichtheid in PBS gesuspendeerd. Controlegroepen bestaande uit vier of vijf muzien elk werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 0,5 ml PBS en zes uur later intraperitoneaal besmet met 5 LD5Q van dezelfde serotypes. Na de bacteriële besmetting werden de dieren gedurende een periode van vijf dagen geobserveerd.

35 Zoals blijkt uit tabel C gaf antilichaam 1C1 een specifieke en significante bescherming tegen een lethale besmetting van zowel IATS 2 8803132 -25- en IATS 5 serotypes, maar niet tegen IATS 11 serotype. De gebruikelijke loop die de bacteriële besmetting in alle onbeschermde dieren volgde hield variërende perioden van een endotoxische schok in en leidde gewoonlijk tot de dood. Controledieren waaraan alleen PBS was toegediend ver-5 toonden een acute endotoxische schok terwijl alle snel daarna stierven. Negatieve controledieren waaraan niet-homoloog antilichaam (6F11) was toegediend hadden een periode van een meer langdurige schok gekenmerkt door de symtomen als samengevat in voetnoet "a” bij tabel C. Sommige van deze dieren herstelden uiteindelijk, waarschijnlijk door de niet-10 antilichaam-componenten die tesamen in de antilichaam-preparaten waren geconcentreerd. De dieren die het beschermende homologe antilichaam ontvingen vertoonden echter slechts ondergeschikte symptomen van endo-toxemie. Deze symptomen verdwenen binnen 24 uur na de inoculatie en de dieren bleken daarna gedurende de rest van de observantieperiode van 15 5 dagen gezond te zijn.

TABEL C

In vivo demonstratie van het beschermende effect van humane monoklonale antilichaam 1C1 tegen IATS serotypes 2 en 5

Humaan Aantal overlevende/aantal besmette dieren 20 monoklonaal 5 dagen na besmetting met: antilichaam_IATS 2_IATS 5_IATS 11_ 1C1 8/10 10/10 3/10a 6F11 0/10 l/10a 10/10 PBS 0/4 0/4 0/4 25 In die gevallen dat geen specifieke bescherming werd opgemerkt, was het herstel van de infectie aanmerkelijk verschillend van dat waargenomen tussen homologe antilichamen en infecterende stammen, d.w.z. 1C1 met IATS 2 of 5 en 6F11 met IATS 11. In de laatste gevallen was het herstel praktisch volledig waarbij de dieren 24 uur na de bacteriële besmet-30 ting normaal bleken te zijn. In niet-specifieke gevallen vertoonden de muizen echter gedurende verschillende dagen tekenen van acute infectie (d.w.z. diarree, gezwollen oogleden, opgezette vacht, "ineen-gedogen" profiel en langzame beweging) alvorens zij tot de normale toestand terugkeerden. Een dergelijke niet-specifieke bescherming is 35 blijkbaar te danken aan niet-antilichaam-componenten die zij meegeconcentreerd en aldus in de dieren zijn geïnjecteerd, aangezien alle dieren die alleen PBS ontvingen stierven.

8803132 -26-

Onder toepassing van hetzelfde protocol werd een tweede experiment uitgevoerd, waarbij groepen muizen werden besmet met Fisher stammen 2, 3 of 7 en de dieren gedurende vijf dagen werden geobserveerd. Zoals blijkt uit tabel D leverde antilichaam 1C1 anderszins lethale infectie 5 met Fisher immunotypes 3 en 7 maar was het ineffectief tegen Fisher immumotype 2.

TABEL D

In vivo demonstratie van het beschermende effect van humaan monoklonaal antilichaam 1C1 tegen Fisher immuno-10 types 3 en 7.

Humaan Aantal overlevende/aantal bemette dieren monoklonaal 5 dagen na besmetting met: antilichaam_Fisher 3_Fisher 7_Fisher 2_ 1C1 10/10 10/10 l/10a 15 6F11 0/10 7/10a 10/10 PBS 0/5 0/5 0/5 aOverleving is kennelijk te danken aan niet-specifieke bescherming als beschreven in de voetnoot bij tabel C.

Voorbeeld V

20 Voorbeeld V demonstreert een methode voor het produceren van een humaan monoklonaal antilichaam dat reageert met IATS serotypes 4 en 11 en Fisher immunotype 2 van P. aeruginosa. De werkwijze als beschreven in voorbeelden I-IV werd herhaald met de uitzondering dat het noodzakelijk was bepaalde modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld 25 beschreven antilichaam te isoleren, te karakeriseren en te onderzoeken. Hierna volgen de wijzigingen in de procedure en de resultaten die met het hierin beschreven monoklonale antilichaam zijn verkregen.

De bron van de humane B cellen van een individu dat eerder was geïmmuniseerd met een hoogmoleculair polysaccharide preparaat geïso-30 leerd uit Fisher immunotype 3 (G.B. Pier et al., Infec. Immun. (1984) 45:309-313, dat hierin als referentie wordt opgenomen).

8503132 -27-

De celbestuurde transformatie van het E PBMC werd tot stand gebracht door deze cellen tegelijk te kweken met de transformerende cellijn 1A2. 1A2 cellen in de logaritmische groeifase werden in HAT medium gesuspendeerd en daarna gecombineerd met de E PBMC in een verhou-5 ding van vijftien 1A2 cellen per E PBMC. Het celmengsel werd op veertien microtiterplaten aangebracht in een concentratie van 62.000 cellen/cupje in een volume van 200 microliter/cupje. De kweken werden op de 7e en 11e dag na het op de plaat brengen gevoed en tegen de 15e dag werd waargenomen dat 100% van de cupjes zich uitbreidende cellen bevatten.

10 Om de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen op te sporen werden twee antigeenplaten toegepast die bestonden uit: (1) een mengsel van P. aeruginosa Fisher immunotypes 1-7 (A.T.C.C.

No.'s 27312, 27313, 27314, 27315, 27316, 27317 en 27318); en (2) een PLL-behandelde microtiterplaat zonder bacteriën.

15 Een analyse van de kweekbovenlagen volgens de methode van de voorbeelden als boven leidde tot de identificatie van bij benadering 100 cupjes die anti-P. aeruginosa antilichamen bevatten die reactief waren met de Fisher immunotypes 1-7 plaat, maar niet met de PLL-behandelde plaat zonder bacteriën. Teneinde de herkende specifieke Fisher iramuno-20 types te identificeren werden antigeenplaten als boven opgebouwd waarin elke rij van de platen PLL-gefixeerde bacteriën van slechts êên Fisher immunotype bevatte. Er werd een ELISA als boven vermeld uitgevoerd, waarbij de kweekbovenlaag uit elk van de anti-P. aeruginosa positieve cupjes in een kolomvormige reeks op de nieuwe antigeenplaten werd ge-25 plaatst hetgeen leidde tot de identificatie van een aantal cupjes die antilichaam specifiek voor Fisher immunotype 2 bevatten. Voor het verder analyseren van de serologische specificiteit van de anti-Fisher immunotype 2 antilichamen werden de bovenlagen onderzocht in een soortgelijke ELISA op antigeenplaten zodanig opgebouwd dat elk van de zeventien IATS 30 serotypes van P. aeruginosa in afzonderlijke cupjes aanwezig waren. De resultaten van dit onderzoek toonden aan dat het merendeel van de bovenlagen specifiek was voor IATS serotype 11 hoewel één bovenlaag, in cupje 6D6 een kruisreactief specificiteitspatroon ten opzichte van IATS serotypes 4, 11, 13 en 14 demonstreerde. Teneinde te bepalen of het anti-35 IATS serotypes 4, 11, 13 en 14 reactiepatroon afkomstig was van één- of meervoudige antilichamen in cupje 6D6, werden extra aliquots van de 8503132 -28- bovenlaag uit cupje 6D6 onafhankelijk geadsorbeerd met IATS serotypes 4, 7 (negatieve controle), 11/ 13 en 14 en werden de geadsorbeerde bovenlagen daarna onderzocht op PLL-gefixeerde bacteriën van elk van de vijf IATS serotypes volgens de boven geschetste ELISA analyse. De adsorpties 5 weren uitgevoerd door een gepakte bacteriêle celpellet met een gelijke volumebovenlaag gedurende een half uur op ijs opnieuw te suspenderen gevolgd door isolering van de bovenlaag uit de bacteriën door centrifugering. De resultaten van deze analyse wijzen aan dat IATS serotypes 4 en 11 antilichaam-activiteit ten opzichte van elkaar adsorbeerden, maar 10 niet ten opzichte van IATS serotypes 7, 13 of 14. Dit demonstreerde de aanwezigheid van ten minste twee verschillende anti-P. aeruginosa anti-lichamen in cupje 6D6, waarvan ten minste één een kruisreactie vertoonde met IATS serotypes 4 en 11.

Het isoleren en kloneren van de geschikte antilichaam-produce-15 rende cellen uit cupje 6D6 werd in drie trappen uitgevoerd. De eerste trap betrof een lage dichtheid subkweek van de cellen met 20 cellen/cupje die werd gevolgd door een andere ronde van lage dichtheid subkweek (5 cellen/cupje) van cellen verkregen uit een anti-IATS serotypes 4+11 positief cupje, dat in de eerste 20 cellen/cupje ronde van lage dicht-20 heid subkweek was gevormd. Elke ronde van de subkweek werd in 96 cupjes-bevattende rondbodemplaten bij de aangegeven dichtheid in een totaal volume van 100 microliter HAT medium, waarin geen aminopterinecomponent aanwezig was (HT medium), uitgevoerd. Niet-transformerende, HAT-gevoelige lymfoblastoide cellen werden in alle cupjes opgenomen in een dichtheid 25 van 500 cellen/cupje als voedingscellen. 4 dagen na het op de plaat kweken werd 100 microliter HAT medium aan alle cupjes toegevoegd om de voedingscellen selectief te doden. De cupjes werden opnieuw op de negende dag na het op de plaat brengen gevoed door de helft van de bovenlaag te vervangen door HAT medium. Daarna werden de cupjes op gelijke wijze 30 om de 4-5 dagen gevoed met HAT medium tot alle cupjes een voldoende lymfoblastoide celdichtheid hadden voor een bovenlaaganalyse volgens ELISA als eerder beschreven.

In elke analyse waren die bovenlagen die reactief waren met IATS serotype 4 tevens reactief met IATS serotype 11 en Fisher immunotype 2.

35 Tevens ging de antilichaam-activiteit tegen IATS serotypes 13 en 14 verloren, hetgeen aldus de vroegere specificiteitstoekenningen bevestigde.

8603132 * > -29-

Er werd een formele klonering van specifieke antilichaam-produ-cerende cellen uitgevoerd door eerst de cellen op platen te brengen bij zeer lage dichtheid (berekend 1/cupje) in Terasaki platen met 72 cupjes (Nunc #1-36538) in een volume van 10 microliter/cupj e. De platen werden 5 gedurende 3 uur in een incubator geplaatst om de cellen de gelegenheid te geven zich op de bodem van de plaat vast te zetten waarna zij microscopisch door twee verschillende individuen werden gewaardeerd op cupjes die een enkele cel bevatten. Elk van deze cellen werd daarna onafhankelijk in de cupjes van een rondbodemplaat met 96 cupjes geplaatst met 10 toevoercellen en als eerder beschreven voor de lage-dichtheid subkweek gekweekt. Bovenlagen uit alle gevormde klonen/· na analyse volgens het bovengenoemde ELISA protocol, waren positief ten opzichte van anti-IATS serotypes 4 en 11. Op deze wijze werd een gekloneerde getransformeerde humane cellijn verkregen die continu groeit (onsterfelijk is) en humaan 15 monoklonaal antilichaam afgeeft reactief met Fisher immunotype 2 en kruisreactief met IATS serotypes 4 en 11. in dit voorbeeld dragen de cellijn en het erdoor geproduceerde antilichaam dezelfde aanduiding (d.w.z. 6D6).

Het isotype van het antilichaam in cupje 6D6 werd in een ELISA analyse vastgesteld gelijk aan de specificiteitsproeven als boven be-20 schreven met uitzondering dat HRP-geite antihumaan igG en HRP-geite anti-humaan IgM onafhankelijk als tweede trapsreagentia werden toegepast in plaats van te worden gecombineerd. Een positieve reactie van het antilichaam in cupje 6D6 met Fisher immunotype 2 en IATS serotypes 4 en 11 werd alleen waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen een IgM isotype 25 voor dit antilichaam demonstreert.

Een biochemische karakterisering van het moleculaire verbindings-type herkend door het 6D6 antilichaam werd uitgevoerd door immuno-afdrukanalyse als beschreven in bovenstaand voorbeeld III, met uitzondering dat LPS preparaten uit Fisher immunotype 2 en IATS serotypes 4 en 30 11 als antigeenpreparaat voor analyse werden gekozen. Er werd een LPS

preparaat uit Fisher immunotype 1 als een negatieve controle opgenomen.

Voor de analyse werd elk van de ruwe LPS preparaten 1:1 in dissociatie-buffer [0,125M Tris, 4% (w/v natriumdodecylsulfaat (SDS), 20% (v/v) glycerol, 10% (v/v) $-mercaptoëthanol, 0,4% (w/v) broomfenol blauw, pH 6,8] 35 verdund en het bad gedurende 5 minuten aan geluidsgolven blootgesteld.

8603132 -30-

Teneinde de proteïnen in de monsters af te breken werd proteinase K (1 mg/ml in H^O) aan elk monster in een 40% (w/w) verhouding van enzym tot LPS toegevoegd en gedurende 2 uur bij 60 °C met een 5 minuten durende bad-geluidsgolftrap na 1 uur gelncubeerd. De monsters werden daarna ge-5 durende 5 minuten tot 100°C verhit en in een microcentrifuge gedurende 2 minuten gecentrifugeerd.

Geklaarde monsters die 10 microgram LPS uit elk van de bacteriêle stammen voorstelden werden aan SDS polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE) als boven bechreven onderworpen. Nadat de afgescheiden mole-10 culaire verbindingstypen in een NCM waren overgebracht werden de NCM's vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gelncubeerd in 10 ml van een verbruikte kweekbovenlaag uit de 6D6 cellijn. De rest van de procedure was als boven beschreven.

Er werden alleen positieve resultaten opgemerkt in de sporen die 15 Fisher immunotype 2, IATS serotype 4 of IATS serotype 11 LPS bevatten.

In de Fisher immunotype 2 en IATS serotype 11 sporen werd door anti-lichaam 6D6 een korte reeks van regelmatig op afstand staande (d.w.z. ladder-achtige) laagmoleculaire moleculen herkend die exact overeenkwamen met kleinere vormen van LPS moleculen zoals zichtbaar gemaakt in 20 een op soortgelijke wijze uitgevoerde SDS-PAGE gel waarin de antigenen niet naar een NCM waren overgebracht, maar in plaats daarvan specifiek waren gekleurd op aanwezigheid van LPS, met uitzondering dat de laagste band van de zilvergekleurde gel (die het kerngebied + lipide A van LPS voorsteld) niet werd herkend. In tegenstelling daarmede herkende anti-25 lichaam 6D6 in de strook die IATS serotype 4 LPS bevatte een volledige reeks van regelmatig op afstand staande banden hetgeen nagenoeg de totale lengte van de gel omspande, waarbij de meest intensieve reactie plaatsvond onder de hogermoleculaire banden. Opnieuw kwam dit profiel overeen met het ladderachtige bandvormende patroon waargenomen in de 30 LPS specifiek gekleurde gel (d.w.z. zij blijken band voor band overeen te komen), met uitzondering dat de band die de kern plus lipide A voorstelde niet werd herkend. Deze gegevens toonden duidelijk dat de 0-zijde keten van LPS het moleculaire doelwit was dat door antilichaam 6D6 op Fisher immunotype 2 en IATS serotypes 4 en 11 werd herkend.

35 Om de in vivo beschermende capaciteit van antilichaam 6D6 te bepalen werden vier beschermingsonderzoeken bij muizen uitgevoerd.

8603132 -31-

Het 6D6 antilichaam werd eerst uit een gebruikte kweekbovenlaag geconcentreerd door neerslaan met verzadigd ammoniumsulfaat (50% einconcen-tratie). Het neergeslagen materiaal werd opnieuw in een minimaal volume steriel water aangemaakt, en intensief gedialyseerd tegen PBS en steriel 5 afgefiltreerd. Als een negatieve controle werd gebruikte kweekbovenlaag uit een andere getransformeerde humane cellijn (C5B7-A.T.C.C. No. CRL 8753) die een humaan monoklonaal antilichaam specifiek voor het LPS van Fisher immunotype 1 produceerde op dezelfde wijze behandeld. Eveneens werd als positieve controle gebruikte kweekbovenlaag uit getransfor-10 meerde humane cellijn 6F11 (A.T.C.C. No. CRL 8562) die een humaan monoklonaal antilichaam specifiek voor de LPS van Fisher immunotype 2 en IATS serotype 11 produceerde geconcentreerd.

Vrouwtjes Swiss-Webster muizen tussen 20 en 22 g lichaamsgewicht werden in drie groepen van elk 20 muizen verdeeld. Alle muizen in elke 15 groep werden individueel beent door intraperitoneale (ip) route met 0,5 ml geconcentreerd 6D6, C5B7 of 6F11 antilichaam. 6 uur later werd elk van de drie groepen onderverdeeld in vier groepen van vijf muizen en leden van elke groep van vijf muizen werden onafhankelijk ip besmet met 0,3 ml van een levende bacteriesuspensie die 8 LD5Q Fisher immuno-20 type 1, Fisher immunotype 2, IATS serotype 4 of IATS serotype 11 bevatte. Er werden bacteriële suspensies als boven beschreven in voorbeeld IV bereid. Na bacteriële besmetting werden de dieren gedurende een periode van vijf dagen waargenomen. De resultaten waren als volgt:

TABEL E

25 In vivo demonstratie van het beschermende effect van humaan monoklonaal antilichaam 6D6 tegen Fisher immunotype 2 en IATS serotypes 4 en 11

Humaan Aantal overlevenden/aantal onderzochten monoklonaal vijf dagen na besmetting met: 30 antilichaam_Fisher 1_Fisher 2_IATS 4_IATS 11_ 6D6 0/5 5/5 4/5 5/5 6F11 0/5 0/5 0/5 5/5 C5B7 5/5 0/5 0/5 0/5

Zoals blijkt uit tabel E leverde antilichaam 6D6 een specifieke 35 en significante bescherming tegen een lethale besmetting van Fisher 3603132 -32- immunotype 2, IATS serotype 4 en IATS serotype 11 maar niet tegen Fisher immunotype 1.

Voorbeeld VI

Voorbeeld VI demonstreert een methode voor het produceren van 5 een humaan monoklonaal antilichaam dat in reactie treedt met IATS sero-type 6 en 13 en Fisher immunotype 1 van P. aeruginosa. De in voorbeelden I-V beschreven werkwijze werd herhaald met de uitzondering dat het noodzakelijk was bepaalde modificaties aan te brengen om het antilichaam als beschreven in dit voorbeeld te isoleren, te karakteriseren en te analy-10 seren. Hierna volgen de wijzigingen in de procedure en de resultaten die werden verkregen met het alhier beschreven monoklonale antilichaam.

De bron van humane B cellen was een individu dat van tevoren was geïmmuniseerd met een hoogmoleculair polysaccharidepreparaat geïsoleerd uit Fisher immunotype 2 (Pier et al, Infec. Immun., 34:461 (1981). Na verza-15 meling van de E PBMC als boven beschreven werden de cellen in een vloeibare stikstoftank ingevroren in FCS dat 10% (v/v) DMSO bevatte. Deze cellen werden later snel bij 37°C ontdooid, éénmaal gewassen in Iscove's medium en opnieuw gesuspendeerd in HAT medium. De celbestuurde transformatie werd tot stand gebracht bij een verhouding van 15 1A2 tot cellen 20 per Ξ PBMC. Het celmengsel werd op 20 microtiterplaten in een concentratie van 78.5000 cellen/cupje aangebracht. De kweken werden elke 3-5 dagen na het aanbrengen op de plaat gevoed en na 11 dagen werd waargenomen dat 100% van de cupjes zich uitbreidende cellen bevatte.

Om de bovenlagen te sorteren op aanwezigheid van anti-P. aeru-25 ginosa antilichamen met behulp van de ELISA techniek, bestond de antigeen-plaat uit een mengsel van P. aeruginosa Fisher immunotypes 1-7 [klinisch isolaat PSA 1277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), resp. ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC 27317 en ATCC 27318]. Er werd tevens een PLL-behandelde microtiterplaat 30 zonder bacteriën bij de sortering toegepast.

De analyse van de kweekbovenlagen volgens de bovengenoemde methode leidde tot de identificatie van bij benadering 200 cupjes met anti-P. aeruginosa antilichamen reactief met de Fisher immunotypes 1-7 plaat, maar niet met de PLL-behandelde plaat die geen bacteriën bevatte.

35 Teneinde die cupjes te identificeren die antilichaam reactief met 2 of meer IATS serotypes bevatten, werden als boven antigeenplaten opgebouwd, SS 0 313 2 -33- waarin een kolom van de platen PLL-gefixeerde bacteriën van slechts één IATS serotype bevatte. Er werd een ELISA uitgevoerd, als boven vermeld, met de bovenlaag uit een uitgebreide kweek van elk van de anti-P. aeruginosa positieve cupjes. De bovenlagen werden in een rij op de nieuwe 5 antigeenplaten geplaatst en dit leidde tot de identificatie van een aantal cupjes die antilichaam reactief met meervoudige IATS serotypes bevatte. Een cupje aangeduid als 8H7, bevatte antilichamen specifiek voor IATS serotypes 6 en 13. Bij onderzoek door ELISA op de 7 Fisher immuno-types, zoals in voorbeeld V, van de bovenlaag uit dit cupje, werd gedemon-10 streerd dat de antilichamen van 8H7 specifiek voor Fisher immunotype 1 waren.

Teneinde te bepalen of het anti-IATS serotype 6 en 13 reactiepatroon was toe te schrijven aan een van de veelvoudige antilichamen in cupje 8H7, werden extra aliquots van de bovenlaag onafhankelijk geadsor-15 beerd met IATS serotypes 6, 13 en 17 (negatieve controle), en werden de geadsorbeerde bovenlagen daarna onderzocht op PLL-gefixeerde bacteriën van elk van de drie IATS serotypes volgens de boven geschetste ELISA analyse. De resultaten tonen aan dat de IATS serotype 6 en 13 antilichaam-activiteit ten opzichte van elkaar adsorbeerden. IATS serotype 17 adsor-20 beerde geen activiteit ten opzichte van hetzij IATS 6 of 13. Deze gegevens demonstreerden dat het anti-IATS serotype 6 en 13 reactiepatroon was toe te schrijven aan een enkel antilichaam uit cupje 8H7.

De isolering en klonering van de antilichaam-producerende cellen uit cupje 8H7 werd in drie trappen tot stand gebracht, in wezen als be-25 schreven in bovenstaand voorbeel V. Op deze wijze werd een gekloneerde getransformeerde humane cellijn bereikt die continu groeit (d.w.z. onsterfelijk is) en humaan monoklonaal antilichaam afgeeft dat reactief is met Fisher immunotype 1 en kruis-reactief met IATS serotypes 6 en 13.

In dit voorbeeld dragen de cellijn en het antilichaam dat dit produceert 30 dezelfde aanduiding 8H7. Met een procedure gelijk aan die beschreven in voorbeeld V werd vastgesteld dat het isotype van het antilichaam in cupje 8H7 IgM was.

Een biochemische karakterisering van de moleculaire verbindings-types die door het 8H7 antilichaam worden herkend werd tot stand ge-35 bracht door immuno-afdrukanalyse als beschreven in voorbeelden III en V als boven, met uitzondering dat de LPS preparaten uit Fisher immunotype 1 8603132 -34- en IATS serotypes 6 en 13 als antigeenpreparaten voor de analyse werden gekozen. Een LPS preparaat uit IATS serotype 10 werd als een negatieve controle opgenomen.

Analyse van de verkregen immuno-afdrukken toonde alleen posi-5 tieve resultaten in de NCM sporen die Fisher immunotype 1, IATS serotype 6 of IATS serotype 13 LPS bevatten. In de Fisher immunotype 1 en IATS serotype 6 sporen herkende het antilichaam 8H7 een reeks van regelmatige op afstand staande (d.w.z. ladderachtige) banden die bijna de gehele lengte van de gel overspanden. Deze banden kwamen exact overeen met 10 de veelvoudige molecuulgewichtsvormen van LPS moleculen, zoals zichtbaar gemaakt in een op soortgelijke wijze uitgevoerde SDS-PAGE gel waarin de antigenen niet naar een NCM waren overgebracht, maar in plaats daarvan specifiek op de aanwezigheid van LPS waren gekleurd. In de strook die IATS serotype 13 LPS bevatte, herkende antilichaam 8H7 een meer afgekorte 15 reeks van regelmatig op afstand staande banden beperkt tot het midden-tot-boven molecuulgewichtstraject van de gel. Opnieuw kwamen de banden die werden herkend overeen wat plaats betreft met die waargenomen in een LPS-specifiek gekleurde gel, met de uitzondering dat de hoogste en laagste molecuulgewichtsvormen van LPS in de gekleurde gel niet duidelijk 20 bleken te worden herkend in de Western-afdruk. Deze gegevens toonden duidelijk aan dat LPS het moleculaire doelwit was dat door antilichaam 8H7 op Fisher immunotype 1 en IATS serotypes 6 en 13 werd herkend.

Voor het beoordelen van de in vivo beschermende capaciteit van antilichaam 8H7 werden dierbeschermingsstudies uitgevoerd bij muizen, 25 als beschreven in bovenstaande voorbeelden IV en V. Als negatieve controle werd een gebruikte kweekbovenlaag van een andere getransformeerde humane cellijn (6F11—ATCC No. CRL 8652), die een humaan monoklonaal antilichaam produceerde specifiek voor het LPS van Fisher immunotype 2, op dezelfde wijze behandeld. Als positieve controle werd een gebruikte 30 kweekbovenlaag uit een getransformeerde humane cellijn C5B7 (ATCC No.

CRL 8753), die een humaan monoklonaal antilichaam specifiek voor de LPS van Fisher immunotype 1 en IATS serotype 6 produceerde toegepast.

Vrouwtjes Swiss-Webster muizen tussen 20 en 22 g lichaamsgewicht werden in drie groepen van elk 30 muizen verdeeld. Alle muizen in elke 35· groep werden individueel intraperitoneaal (ip) beent met 0,5 ml geconcentreerd 8H7, 6F11 of C5B7 antilichaam. Vier uur later werd elk van de 8503132 -35- groepen onderverdeel in drie groepen van 10 muizen en leden van elke groep van 10 muizen werden onafhankelijk ip besmet met 0,3 ml van een levende bacteriêle suspensie die9,4LD50 van een klinisch isolaat (A522) representatief voor het IATS 6 serotype (Fisher immunotype 1 equivalent), 5 5 LD50 van het IATS 13 referentie-serotype, of 10 LD5Q van het IATS 11 (Fisher immunotype 2 equivalent) referentie-serotype bevatte. Er werden bacteriêle suspensies als boven beschreven in voorbeeld IV bereid. Na bacteriêle besmetting werden de dieren gedurende een periode van 5 dagen waargenomen. De resultaten zijn als volgt:

10 TABEL F

In vivo demonstratie van het beschermende effect van humaan monoklonaal antilichaam 8H7 tegen IATS serotypes 6 en 13

Humaan Aantal overlevenden/aantals onderzochten 15 monoklonaal vijf dagen na besmetting met: antilichaam_IATS 6_IATS 13_IATS 11_ 8H7 9/10 6/10 1/10 C5B7 9/10 0/10 0/10 6F11 0/10 2/10 10/10 20 Zoals blijkt uit tabel F leverde antilichaam 8H7 een specifieke en significante bescherming tegen een lethale besmetting van IATS serotype 6, maar niet IATS serotype 11. De bescherming tegen IATS serotype 13 was van mindere graad maar dit kan worden verklaard door het betrekkelijk grote aantal organismen dat nodig was om de LD voor dit isolaat 5U 7 25 te bereiken vergeleken met het serotype 6 isolaat (resp. 3 x 10 kolonie- g vormende eenheden en 2,6 x 10 kolonievormende eenheden). In een afzonderlijke proef werden door antilichaam 8H7 vijf van vijf muizen, besmet met 3,5 LD,_0 van het IATS 13 isolaat en vijf van de vijf muizen besmet met het IATS 6 isolaat, beschermd.

30 Uit het voorgaande zal het duidelijk zijn dat de cellijnen van de onderhavige uitvinding humane monoklonale antilichamen en fragmenten daarvan leveren die kruis-reactief en kruis-beschermend tegen verschillende P. aeruginosa serotypen zijn. Hierdoor kan men gemakkelijker profylactysche en therapeutische preparaten ontwikkelen die effectief 8503132 -36- zullen zijn tegen infecties te wijten aan de meeste, zo niet alle, P. aeruginosa stammen. Bovendien leveren de cellijnen antilichamen die bruikbaar zijn voor immuno-analyses en andere welbekende procedures.

8603132

Claims (40)

1. Preparaat bestaande uit ten minste een humaan monoklonaal anti- lichaam of bindingsfragment daarvan in staat tot specifieke binding aan een veelvoud van, maar niet alle IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa.

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in vivo beschermt tegen ten minste twee IATS serotypes.

3. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in vivo beschermt tegen drie IATS serotypes.

4. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat genoemd 10 antilichaam in staat is tot binding aan twee of drie IATS serotypes.

5. Preparaat volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in vivo beschermt tegen ten minste twee IATS serotypes.

6. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam niet-reactief is met elk Fisher immunotype van Pseudomonas 15 aeruginosa.

7. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam met één Fisher immunotype van Pseudomonas aeruginosa reageert.

8. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat genoemd 20 antilichaam in staat is tot reactie met twee of meer Fisher immuno- types van Pseudomonas aeruginosa.

9. Preparaat volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in staat is tot reactie met drie IATS serotypes.

10. Preparaat volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat genoemd 25 antilichaam in vivo beschermt tegen ten minste twee IATS serotypes en één Fisher immunotype.

11. Preparaat volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in vivo beschermt tegen ten minste twee IATS serotypes en ten minste twee Fisher immunotypes.

12. Preparaat bestaande uit ten minste twee humane monoklonale anti- lichamen, waarbij ten minste één van genoemde antilichamen in staat is tot specifieke reactie met toegankelijke lipopolysaccharide determinanten die aanwezig zijn op minder dan alle, maar ten minste twee, IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa. 8603132 -38-

13. Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat ten minste één van de antilichamen in vivo beschermt tegen twee of meer 'IATS serotypes .

14. Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat genoemd 5 antilichaam in vivo beschermt tegen drie IATS serotypes.

15. Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in staat is tot binding aan drie IATS serotypes.

16. Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam niet-reactief is met Fisher immunotypes.

17. Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in staat is tot reactie met een Fisher immunotype van Pseudomonas aeruginosa.

18. Preparaat volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in staat is tot reactie met twee of meer Fisher immuno- 15 types.

19. Preparaat volgens conclusie 16, 17 of 18, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in vivo beschermt tegen reactieve IATS serotypes en Fisher immunotypes.

20 Pseudomonas aeruginosa in combinatie met éën of meer van: een profylactische of therapeutische hoeveelheid van een monoklonaal antilichaam dat in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa flagella of exotoxine A; een monoklonaal antilichaam in staat tot reactie met ten minste één extra serotypische determinant aan een lipo- 25 polysaccharidemplecuul van Pseudomonas aeriginosa? een gamma-globulinefractie uit humaan bloedplasma; een gamma-globulinefractie uit een humaan bloedplasma dat verhoogde niveaus van immunoglobulines reactief met Pseudomonas aeruginosa en/of produkten daarvan vertoont; of een antimicrobieel middel.

20. Preparaat omvattende een antilichaam of bindingsfragment daar-20 van, welk antilichaam of fragment daarvan in staat is tot specifieke reactie met een veelvoud van, maar niet alle IATS serotypes en minder of meer dan één Fisher immunotype van Pseudomonas aeruginosa.

21. Preparaat volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam of fragment daarvan in staat is tot reactie met ten minste 25 drie IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa.

22. Preparaat volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam of fragment daarvan in staat is tot reactie met twee Fisher immunotypes van Pseudomonas aeruginosa.

23. Preparaat volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat genoemd 30 antilichaam in staat is tot in vivo bescherming tegen ten minste twee IATS serotypes en ten minste twee Fisher immunotypes.

24. Preparaat volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam reageert met IATS serotypes 2, 5 en 16 en Fisher immunotypes 3 en 7.

25. Preparaat omvattende een antilichaam of bindingsfragment daar van, welk antilichaam of bindingsfragment in staat is tot een speci- 8603132 -39- fieke binding aan een veelvoud van, maar niet alle IATS serotypes en één Fisher immunotype van Pseudomonas aeruginosa.

26. Preparaat volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam of fragment daarvan in staat is tot binding aan twee IATS 5 serotypes.

27. Preparaat volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam in staat is tot in vivo bescherming tegen ten minste twee IATS serotypes en één Fisher immunotype.

28. Preparaat volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat genoemd 10 antilichaam reageert met IATS serotypes 4 en 11 en Fisher immunotype 2.

29. Preparaat volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat genoemd antilichaam reageert met IATS serotypes 6 en 13 en Fisher immunotype 1.

30 Pseudomonas aeruginosa, welke kit een monoklonaal antilichaam-preparaat omvat met ten minste één humaan monoklonaal antilichaam, waarbij genoemd antilichaam reageert met minder dan alle, maar ten minste twee, IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa, alsmede een detecteerbaar signaal leverende merkstoffen covalent gebonden aan genoemde antilichamen of 35 gebonden aan tweede antilichamen die reactief zijn met elk van genoemd monoklonaal antilichaam. 8503132 -40-

30. Farmaceutisch preparaat omvattende een preparaat volgens één van de conclusies 1, 12, 20 of 25 en een fysiologisch aanvaardbare 15 drager.

31. Werkwijze voor het behandelen van een humane patiënt die vatbaar is voor bacteremie of een andere ziektetoestand veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa, welke werkwijze omvat het aan genoemde gastheer toedienen van een therapeutisch of profylactisch effectieve dosis van 20 een preparaat volgens conclusie 1, 12, 20 of 25.

32. Onsterfelijke getreinsformeerde cellijn die een humaan mono-klonaal antilichaam af geeft dat specifiek reageert met minder dan alle, maar met ten minste twee, IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa.

33. Cellijn volgens conclusie 32, aangeduid als ATCC No.'s CRL 25 8941, 9171 en 9258.

34. Humaan nonoklonaal antilichaam reactief met een epitoop die reageert met een monoklonaal antilichaam geproduceerd door een cellijn volgens conclusie 33.

35. Kit ten gebruike voor het detecteren van de aanwezigheid van

36. Farmaceutisch preparaat ten gebruike voor het behandelen of voorkomen van een Pseudomonas aeruginosa infectie, welk preparaat een humaan monoklonaal antilichaam dat beschermt tegen ten minste twee IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa in combinatie met een antimicro- 5 bieel middel, een gamma-globulinefractie uit humaan bloedplasma-immuno-globuline en/of een fysiologisch aanvaardbare drager, omvat.

37. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 36, met het kenmerk, dat de gamma-globulinefractie uit humaan bloedplasma-immunoglobuline is verkregen uit mensen die verhoogde niveaus van immunoglobulinen reac- 10 tief met Pseudomonas aeruginosa bacteriën en/of antigene componenten daarvan vertonen.

38. Preparaat volgens conclusie 36, met het kenmerk, dat dit verder een monoklonaal antilichaam dat reactief is met Pseudomonas aeruginosa flagella of exotoxine A omvat.

39. Werkwijze voor het behandelen van een individu dat vatbaar is voor Pseudomonas aeruginosa infecties, omvattende het aan genoemd individu toedienen van een profylactische of therapeutische hoeveelheid van een monoklonaal antilichaam dat in staat is tot binding aan lipo-polysaccharide determinanten van ten minste twee IATS serotypes van

40. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid van Pseudomonas aeriginosa in een monster, omvattende het combineren van genoemde monster met een monoklonaal antilichaam'. dat reactief is met ten minste twee IATS serotypes van Pseudomonas aeruginosa; en het detecteren van complex-vorming. 8803132