FR2593826A1 - Anticorps monoclonaux a reactivite et a protectivite croisees vis-a-vis des serotypes de p. aeruginosa - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet des lignées cellulaires qui secrètent des anticorps monoclonaux humains capables de se lier aux molécules de lipopolysaccharide de souches sélectionnées de Pseudomonas aeruginosa. On a constaté que ces anticorps étant protecteurs contre les infections mortelles de P. aeruginosa. Des compositions pharmaceutiques contenant ces anticorps peuvent exister en combinaison avec d'autres anticorps monoclonaux, des fractions de plasma sanguin et des agents antimicrobiens et des utilisations prophylactiques et thérapeutiques de ces compositions dans le traitement des infections est également compris.

Description

ANTICORPS MONOCLONAUX A REACTIVITE ET A PROTECTIVITE CROISEES

VIS-A-VIS DES SEROTYPES DE P. AERUGINOSA

La présente invention a pour objet l'application de techniques

immunologiques à l'obtention de nouveaux matériaux utiles dans le diagnos-

tic et le traitement des infections bactériennes et notamment la production et l'utilisation des anticorps monoclonaux humains capables de reconnaltre

de multiples sérotypes multiples de Pseudomonas aeruginosa.

Les maladies gram-négatives et leur complication les plus sérieuses, c'est-a-dire la bactérémie et l'endotoxémie, sont la cause d'une morbidité et d'une mortalité importantes chez l'homme. Ceci est particulièrement vrai pour le germe gram-négatif Pseudomonas aeruginosa, qui a été de plus en plus associé à des infections bactériennes, notamment les infections

nosocomiaies, ces cinquante dernières années.

}5 Pendant les quelques dernières décennies, les antibiotiques ont

représenté la thérapeutique de choix pour combattre des maladies gram-

négatives. La morbidité et la mortalité élevées dues aux maladies causées par des bactéries gram-négatives indiquent cependant les limites de la thérapeutiqueste par les antibiotiques, nctamment en ce qui concerne le p. aeruginosa (voir par exemple Andriole, V.G., "Pseudomonas Dacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", 1. Lab. Clin. Red. (1978) 94, 196-199). Ceci a incité à la recherche d'autres méthodes de orévention et

de traitement.

L'une des méthodes envisagée consiste à renforcer le système immuni-

taire d'un hôte par immunisation active ou passive. On a par exemple

observé chez l'homme et chez des animaux d'expérimentation qu'une immuni-

sation active des vaccins à base de cellules bactériennes entières ou par

des endotoxines bactériennes purifiées provenant du P. aeruginosa condui-

sait au développement d'anticorps spécifiques de type opsonine dirigés contre les déterminants des motifs d'oligosaccharide qui se répètent dans les molécules de lipopolysaccharide (LPS) situés sur l'extérieur de la

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membrane cellulaire du P. aeruginosa (voir Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B.M. and Finlayson, J.S., eds., pages 73-78, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). On a démontré que ces anticorps, qu'ils soient créés de façon active ou transférés de façon passive, représentaient une protection contre les effets létaux de l'infection par le P. aeruginosa chez l'animal dans toute une série de modèles (Pollack, supra) et chez l'homme dans

quelques études préliminaires, (voir Young, L.S. et Pollack, M., Pseudomo-

nas aeruginosa, Sabath, L., ed., pages 119-132, Hans Huber, 1980). En outre, ce qui prît une importance particulière pour la détermination du rôle de ces anticorps chez l'homne, ce fut la constatation, chez les patients atteints d'une septicémie provoquée par le P. aeruginosa, d'une corrélation entre les taux de survie et les titres sériques élevés en anticorps dirigés contre les molécules LPS de la souche infectieuse (voir

Pollack, M., et Young, L.S., J. Clin. Invest. (1979) 63, 276-286).

Les références ci-dessus suggèrent que l'on pourrait aborder par des voies immunothérapeutiques la prévention et la guérison de la maladie bactérienne causée par le germe P. aeruginosa par exemple en administrant certaines immunoglobulines humaines contenant des anticorps dirigés contre la ou les souchets) infectieuses). Les inmmunoglobulines humaines sont définies ici comme étant la friction de plasma humain enrichie en anticorps parmi lesquels des anticorps figurent des anticorps dirigés spécifiquement contre les souches de P. aeruginosa. A cause de certaines limitations inhérentes à l'utilisation des composants des immunoglobulines humaines, cette approche du traitement la maladie causée par le P. aeruginosa fait l'objet de travaux de recherches (voir par exemple Collins, M.S. et Roby, R.E., Am. J. Med. (1984} 76(3A), 168-174), et jusqu'à maintenant il

n'existe pas de produits conmmnercialisés qui utilisent ces composants.

L'une des limitations liée à la composition des immunoglobulines

réside en ce qu'elles sont constituées d'un mélange d'échantillons prove-

nant d'un millier de donneurs ou d'avantage, ces échantillons ayant été

présélectionnés en raison de la présence d'anticorps particuliers anti-

Pseudomonas. Ce mélange conduit à l'obtention d'une moyenne de chacun des titres en anticorps, ce qui, au mieux, conduit à une modeste augmentation

du titre final en anticorps recherchés.

Un autre de ces limitations réside en ce que le processus de présé-

lection nécessite en lui-même un examen continuel et coûteux de l'ensemble

des donneurs pour garantir la constance de la qualité du produit.

En dépit de ces efforts, les immunoglobulines peuvent encore présenter des

variations considérables d'un lot à l'autre et selon leurs origines géogra-

phiques différentes.

Encore une autre encore de ces limitations inhérentes à la composi-

tion des immunoglobulines réside en ce que leur utilisation conduit à

l'administration simultanée de quantités importantes de substances protéi-

ques étrangères (qui peuvent comprendre des virus tels que ceux dont on a mis récemment en évidence qu'ils était associés au syndrome acquis de déficience immunitaire, ou SIDA), pouvant produire des effets biologiques néfastes. L'association de titres faibles en anticorps souhaités et d'une teneur élevée en substances étrangères peut souvent limiter, en-dessous de sa valeur optimale, la quantité d'immunoglobuline(s) spécifique et donc

bénéfique que l'on peut administrer aux patients.

En 1975 Kohler et Milstein ont publié leur découverte fondamentale selon laquelle certaines lignées de cellules de souris pouvaient être fusionnées avec des cellules de rates de souris pour créer des hybridomes dont chacun pourrait sécréter des anticorps d'une spécificité unique, c'est-à-dire des anticorps monoclonaux. (Kohler, G., et Milstein, C., Nature (1975) 256, 495-497). Avec cette nouvelle technologie, il est devenu possible de produire dans certains cas de grandes quantités d'anticorps de souris extrêmement spécifiques dirigés contre un ou plusieurs déterminants particuliers d'antigènes. Ces anticorps monoclonaux de souris ou des compositions à base de ces anticorps peuvent cependant présenter des inconvénients majeurs à être utilisés chez l'homme, surtout lorsque l'on sait que les anticorps monoclonaux de souris, utilisés dans des études expérimentales du traitement de certaines maladies humaines, déclenchent souvent, comme cela a été observe, une réponse immunitaire qui les rend inefficaces (Levy, R.L. et Miller, R.A., Ann. Rev. Med. (1983) 34,

107-116).

Sadoff et coll. ont indiqué que l'utilisation de la technique des hybridomes permettait de produire un anticorps monoclonal de souris de la classe des IgM dirigé contre un déterminant d'une chaîne latérale liée à un

0 des molécules de LPS d'un sérotype particulier de P. aeruginosa (Abs-

tracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,-n 253). Ils ont indiqué en outre que cet anticorps de souris les protégeait contre une menace mortelle du P. aeruginosa de sérotype identique à celui contre lequel les anticorps étaient dirigés (c'est-à-dire le sérotype homologue). Différents articles ultérieurs ont donné des détails sur la mise au point d'anticorps monoclonaux LPS anti-P. aeruginosa de souris et d'êtres humains de diverses spécificités (par exemple: Sawada, S., et coll., J. Inf. Dis., 150, 570-576 (1983); Sadoff, J., et coll.,

Antibiot. Chemother., 36, 134-146 (1985); Hancock, R., et coll., Infect.

Immun. 37, 166-177 (1982); Siadak, A.W. et Lostrom, M.E., in Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, E.G., et coll., eds. pages 167-185, Plenun Publishing Corp. (1985) et Sawada, S. et coll., J. Inf. Dis., 152,

965-970 (1985). La préparation et l'application immunothérapeutique d'anti-

corps monoclonaux d'êtres humains spécifiquement anti P. aeruginosa de sérotype LPS sont décrits dans les demandes de brevets aux Etats-Unis d'Amérique 734 684 et 828 005 en cours de traitement, incorporé ici à titre

de référence.

Bien qu'il puisse y avoir certains avantages à utiliser dans certains cas des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre un sérotype

unique de P. aeruginosa, par exemple lorsque l'infection peut être attri-

buée à un sérotype unique, ceci n'est certainement pas préférable dans de nombreux autres cas. Par exemple, dans les traitements prophylactiques des infections qui peuvent se produire chez l'homme, il serait préférable d'administrer un anticorps ou des anticorps d'êtres humains qui soient

dirigés contre toute une série de sérotypes. De meme, dans les applications -

thérapeutiques oQ l'on ne connait pas le ou les sérotype(s) de la ou des

souche(s) infectieuse(s), il serait préférable d'administrer un ou plu-

sieurs anticorps humains agissant sur la plupart, sinon sur la totalité les sérotypes de P. aeruginosa cliniquement importants. Bien que théoriquement l'on puisse formuler une association d'anticorps monoclonaux humains,

chacun d'eux étant dirigés spécifiquement contre sérotype unique de P. aeru-

ginosa, pour obtenir une protection contre ces divers sérotypes, cette composition serait difficile à mettre au point, et du point de vue du

fabriquant, peu rentable à préparer.

On a donc grand besoin d'anticorps monoclonaux humains anti P.aeru-

ginosa capables de reconnaître de multiples sérotypes de P. aeruginosa et

de protéger contre eux. En outre, ces anticorps doivent convenir à l'utili-

sation dans des traitements prophylactiques et thérapeutiques des infec-

tions par le P. aeruginosa. La présente invention répond à ces besoins.

On a créé des nouvelles lignées de cellules qui peuvent produire des anticorps monoclonaux capables de réagir de facon spécifique avec les molécules LPS de toute une série, mais non de la totalité des sérotypes IATS

de P. aeruginosa. Ces anticorps ont diverses réactivités avec des immuno-

types de Fisher et peuvent lier zéro, un ou une pluralité d'anticorps. En

outre, l'invention fournit un procédé de traitement chez l'homme suscepti-

ble d'être infecté ou déjà infecté par le P. aeruginosa qui consiste à administrer une quantité prophylactique ou thérapeutique d'une composition

comprenant au moins un anticorps monoclonal humain ou un fragment détermi-

nant de celui-ci capable d'une réaction croisée avec des sérotypes de P. aeruginosa, cette composition comprenant également de préférence un

support physiologiquement acceptable. La composition peut également conte-

nir un Ou plusieurs des éléments de: anticorps monoclonaux humains capables de réagir avec d'autres

déterminants de sérotypes ou immonotypes sur LPS, ou avec les flagel-

les ou Exotoxine A de P. aeruginosa; 15. une fraction de gammaglobuline provenant de plasma sanguin humain; une fraction de gammaglobuline provenant de plasma sanguin humain lorsque ce plasma est obtenu à partir d'un individu présentant des niveaux élevés d'immunoglobulines réagissant avec le P. aeruginosa;

et un ou plusieurs agents antimicrobiens.

La présente invention a donc pour objet des nouvelles cellules capables de produire des anticorps monoclonaux humains et des compositions comprenant ces anticorps, compositions capables de reconnaître de façon sélective au moins un certain nombre, et dans quelques cas, toutes les souches de P. aeruginosa, compositions dans lesquelles chacun anticorps reconnaissent de façon typique de nombreux sérotypes IATS et zéro, un ou plusieurs immunotypes de Fisher de P. aeruginosa. Les cellules en question comportent des chromosomes identifiables dans lesquels le DNA de leur lignée d'origine ou de celle d'une cellule précurseur a été réarrangé pour

encoder un anticorps présentant un site de liaison pour un groupe détermi-

nant commun à certains sÉrotypes de P. aerugincsa. On peut utiliser ces anticorps monoclonaux humains de toute une série de façons, y compris en

diagnostic et en thérapeutique (soit protecteurs in vivo).

Typiquement, les cellules selon la présente invention sont des lymphocytes humains transformes qui secrètent des anticorps monoclonaux

humains protecteurs vis-à-vis des molécules de LPS accessibles du P. aeru-

ginosa. Par "accessible", on veut dire que les molécules de LPS sont physiquement disponibles dans l'environnement pour être utilisées dans une

interaction directe avec les anticorps monoclonaux. Les anticorps mono-

clonaux ainsi créés sont utilisables dans le traitement ou la prophylaxie de maladies sérieuses dues au P. aeruginosa. Les molécules LPS de la membrane extérieure-du P. aeruginosa doivent pouvoir entrer directement en contact avec les molécules d'anticorps, ce qui facilite une lyse et/ou une phagocytose du germe d'origine complémentaire. En outre, les molécules de LPS qui ont quitté la membrane extérieure vers l'environnement immédiat doivent également être libres d'interagir directement avec les molécules

d'anticorps et pouvoir être phagocytées par le système réticuloendothélien.

La préparation des anticorps monoclonaux peut s'accomplir en perpé-

tuant l'expression des séquences de l'acide nucléique qui codent les anticorps spécifiques d'un groupe déterminant des molécules de LPS des sérotypes multiples du P. aeruginosa. Typiquement, on produit des anticorps

monoclonaux à l'aide d'une transformation cellulaire par le virus d'Epstein-

Barr (EBV) des cellules de lymphocytes B-provenant de donneurs humains qui

sont ou qui ont été exposés au(x) sérotype(s) approprié(s) de P. aeruginosa.

Les lignées de cellules sécrétrices d'anticorps ainsi produites se caracté-

risent parce qu'elles émettent en continu des cellules lymphoblastoides qui

possèdent un caryotype diploTde, qui sont des antigènes nucléaires d'Epstein-

Barr positifs et qui secrètent des anticorps monoclonaux de l'isotype soit IgG, soit IgM, soit IgA, soit IgD, y compris divers sous-types tels que par

exemple les sous-types IgGI, IgG2, IgG3 et IgG4. Le processus de transforma-

tion cellulaire en lui-même est décrit en détail dans le brevet des Etats-

Unis d'Amérique 4 464 465, incorporé ici à titre de référence. Les anti-

corps monoclonaux peuvent s'utiliser intacts ou sous forme de fragments, tels que par exemple Fv, Fab, F(ab')2, mais habituellement on les utilise

intacts.

Ou encore, on pourrait produire des lignées cellulaires de prépara-

tion d'anticorps par fusion cellulaire entre un myélome humain convenable-

ment marqué par un médicament, un myélome de souris, un hétéromyélome

humain/souris ou des cellules lymphoblastoides humaines avec des lymphocy-

tes B humains pour obtenir des lignées de cellules hybrides humaines.

- Les lignées de cellules selon la présente invention peuvent trouver une autre utilisation que celle de la production directe des anticorps monoclonaux humains. Les lignes de cellules peuvent être fusionnées avec d'autres cellules (par exemple avec des myélomes humains convenablement marqués par un médicament, des myélomes de souris, des hétéromyélomes humain/souris ou des cellules lymphoblastoides humaines), pour produire des hybridomes, et ainsi permettre de réaliser le transfert de gènes encodant les anticorps monoclonaux. En outre, les lignées de cellules peuvent être utilisées comme source de chromosomes en codant les immunoglobulines que l'on peut isoler et transférer à d'autres cellules par des techniques autres qu'une fusion. En outre, on peut isoler les gênes encodant les anticorps monoclonaux et les utiliser en selon les techniques de recombi- naison du DNA à la préparation de l'immunoglobuline spécifique de toute une série d'hôtes. En particulier, en préparant une bibliothèque de cDNA à partir d'un RNA messager, on peut isoler un clone de cDNA unique, codant l'immunoglobuline et qui soit exempt d'introns, et le placer dans des vecteurs d'expression procaryotique ou eucaryotique convenables et le

transformer ensuite en un hôte destiné à une production de masse finale.

On peut cloner les lignées de cellules lymphoblastoides ou hybrides et les trier par des méthodes classiques, à l'aide des anticorps capables

de se lier aux groupes détermiants des différents sérotypes de P. aerugi-

nosa que l'on a détecté dans les surnageants de cellules.

Il existe dans la littérature toute une série de schémas de séro-

typage que l'on pourrait utiliser pour rechercher dans les surnageants de cellules la présente d'anticorps anti-Pseudomonas. Ces schémas sont basés surtout sur les antigènes somatiques majeurs stables à la chaleur de ce germe (voir Zierdt, C.H., dans Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria

in Clinical Microbiology, Gilardi, G.L., ed., CRC Press, (1979), pages 213-

238). La prolifération des schémas de sérogroupage a rendu les études sérologiques du P. aeruginosa plutôt difficiles à comparer et le choix d'un système destiné à la recherche des surnageants pourrait ainsi sembler quelque peu arbitraire. La confusion entre les systèmes de typage a été récemment éclaircie par la création du système "International Antigenic

Typing Scheme (IATS)" proposé par la sous-commission sur les Pseudomonada-

cées de la Commission Internationale de Bactériologie Systématique comme fondement des études sérologiques ultérieures du P. aeruginosa. Ce système, qui prévoit dix sept sérotypes distincts désignés sous le nom de IATS Type 1, IATS Type 2, etc., englobe tous les antigènes somatiques majeurs stables à la chaleur identifiés par les systèmes précédents (voir Liu, P.V., Int. J.

Syst. Bacteriol., (1983) 33, 356-264) incorporé ici à titre de référence.

Dans la mise au point des anticorps monoclonaux protecteurs qui possèdent une réactivité croisée entre les souches de P. aeruginosa, il est

également avantageux d'incorporer un schéma de typage basé sur les anti-

gènes protecteurs du P. aeruginosa. Ce schéma a été conçu avec l'intention de mettre au point un vaccin à utilisation clinique et il est décrit en détail dans Fisher, M.W. et coll., J. Bacteriol., 98, 835-836 (1969). Ce système, auquel on se réfère communément sous le nom de système de typage de Fisher, classifie la majorité des P. aeruginosa connus en sept types désignés sous le nom de Immunotype de Fisher n l, Immunotype de Fisher n 2, etc. On a établi une corrélation claire entre les systèmes IATS et le système de typage de Fisher (voir Liu, P.V. et coll., comme ci-dessus) et elle est présentée dans le tableau 1. Comme cela est noté dans le tableau I, à certains sérotypes IATS, ne correspondent pas d'immunotypes de Fisher

bien que chaque immunotype de Fisher corresponde bien à certains séroty-

pes IATS. Pour les systèmes IATS et le système de typage de Fisher, on pense que les déterminants antigènes correspondant aux deux schémas de sérotypage résident à- la surface des molécules LPS du P. aeruginosa (Liu, P.V. et coll., comme ci-dessus; Hanessien, F. et coll., Nature (1979)

229, 209-210).

Comparaison

TABLEAU I

et corrélation des systèmes de typage IATS et Fisher destinés aux Pseudomonas aeruginosa IATS - Fisher

1 4

il I- Les anticorps monoclonaux humains, selon un des aspects de la présente

invention, sont capables de se lier spécifiquement aux déterminants poly-

saccharides présents sur une pluralité, mais non la totalité des séroty-

pes IATS de P. aeruginosa. Ces determinants peuvent être présents par exemple, sur deux ou trois sérotypes et sur zéro, un ou au moins deux immunotypes de Fisher. Ces anticorps peuvent être protecteurs in vivo visà-vis de certains ou de tous les sérotypes et immunotypes reconnus, de

façon typique deux ou plusieurs sérotypes.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent égale- ment trouver toute une série d'utilisations in vitro. A titre d'exemple, on peut utiliser les anticorps monoclonaux pour le typage, pour la séparation des souches spécifiques de P. aeruginosa, pour l'élimination sélective des cellules de P. aeruginosa dans un mélange hétérogène de cellules ou etc. Pour des fins de diagnostic, les anticorps monoclonaux peuvent atre marqués ou non marqués. Typiquement, les essais de diagnostic impliquent la détection de la formation d'un complexe par la liaison de l'anticorps monoclonal dirigé contre les LPS de l'organisme P. aeruginosa. Lorsqu'ils sont non marqués, les anticorps trouvent leur utilisation dans des essais d'agglutination. En outre, les anticorps non marqués peuvent s'utiliser en combinaison avec d'autres anticorps marqués (anticorps secondaires) qui réagissent avec l'anticorps monoclonal, par exemple des anticorps dirigés

spécifiquement contre une immunoglobuline. Ou encore, les anticorps mono-

clonaux peuvent être directement marqués. On peut employer toute une série de marqueurs, par exemple des radio-éléments, des éléments fluorescents,

des enzymes, des substrats d'enzymes, des cofacteurs d'enzymes, des inhibi-

teurs d'enzymes, des ligands (en particulier des haptènes), etc. De nombreux types d'immuno-essais sont disponibles et comprennent, à titre d'exemple, ceux décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074, et 4 098 876, qui

sont tous incorporés ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention sont couramment utilisés dans des immuno-essais enzymatiques dans lesquels les anticorps en référence ou les anticorps secondaires provenant d'une espèce différente

sont conjugués à une enzyme. Lorsqu'un échantillon contenant un P. aerugi-

nosa d'un certain sérotype, à base par exemple de sang humain ou de lysat de celui-ci, est combiné avec les anticorps en référence, il se produit une liaison entre les anticorps et les molécules qui présentent le groupe

déterminant recherché. Ces cellules peuvent alors être séparées des réac-

tifs non liés et l'on peut ajouter un anticorps secondaire (marqué par une enzyme). Après cela, on détermine la présence du conjugué anticorpsenzyme spécifiquement lié aux cellules. On peut également utiliser d'autres

techniques classiques bien connues des spécialistes.

On peut également fournir des kits à utiliser avec les anticorps selon l'invention dans la détection d'une infection par le P. aeruginosa ou dans la recherche de la présence d'un antigène de P. aeruginosa. Ainsi, la composition d'anticorps monoclonal selon l'invention peut être fournie, habituellement sous forme Iyophilisée, soit seule soit en conjugaison avec des anticorps supplémentaires spécifiques d'autres bactéries gramnégatives. Les anticorps qui peuvent Etre conjugués à un marqueur ou non conjugués sont inclus dans les kits en même temps que des tampons, tels que par exemple du Tris, du phosphate, du carbonate, etc., des agents de stabilisation, des biocides, des protéines inertes par exemple de l'albumine de sérum bovin, etc. Généralement, ces produits seront présent en quantité inférieure à 0,5% par rapport a la quantité d'anticorps actif et sont habituellement présents en quantité totale d'au moins 0,001% en poids encore par rapport à la concentration de l'anticorps. Fréquemment, il est souhaitable d'inclure un agent d'extension ou excipient inerte pour diluer les ingrédients actifs et l'excipient peut alors être présent en quantité d'environ 1 à 99% en poids par rapport au poids total de la composition. Lorsque l'on emploie un anticorps secondaire capable de se lier à l'anticorps monoclonal, celui-ci sera habituellement présent dans une fiole séparée. L'anticorps secondaire est conjugué typiquement à un marqueur et il est formulé d'une façon analogue à celle des formulations

d'anticorps décrites ci-dessus.

Formulations pharmaceutiques et leur utilisation

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent égale-

ment être incorporés sous la forme de compositions pharmaceutiques conte-

nant une quantité thérapeutique ou prophylactique d'au moins un des anti-

corps monoclonaux selon la présente invention en même temps qu'un support pharmaceutiquement efficace. Un support pharmaceutique peut être toute substance compatible non toxique convenant pour administrer les anticorps monoclonaux aux patients. On peut utiliser comme support l'eau stérile, l'alcool, les matières grasses, les cires et des solides inertes. On peut également incorporer des adjuvants pharmaceutiquement acceptables (agents tampons, agents de dispersion) dans la composition pharmaceutique. Ces compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique de façon à être spécifique de deux ou de plus de deux, mais non de tous les sérotypes de P. aeruginosa. Ou encore, une composition pharmaceutique peut contenir

deux ou plus de deux anticorps monoclonaux pour former un "cocktail". Par -

exemple, un cocktail contenant des anticorps monoclonaux humains contre des groupes de divers sérotypes de P. aeruginosa serait un produit universel présentant une activité contre la grande majorité des isolats cliniques de

cette bactérie particulière.

Sont intéressantes les compositions d'anticorps monoclonaux prophy-

lactiques et/ou thérapeutiques capables de réagir avec au moins trois sérotypes IATS, habituellement au moins quatre, et plus habituellement au

moins cinq sérotypes IATS. Sont particulièrement intéressantes, les compo-

sitions d'anticorps monoclonaux qui réagissent avec au moins, de préférence au moins dix à quatorze, et jusqu'à et y compris la totalité des dix sept sérotypes IATS. En conjugaison avec les sérotypes IATS, il est souhaitable que les compositions réagissent avec au moins deux, habituellement au moins trois, et plus habituellement au moins quatre, et jusqu'à et y compris

chacun des sept immunotypes du système d'immunotypage de Fisher.

Chacune des compositions comprend au moins un, habituellement au moins deux, et plus habituellement au moins trois anticorps, chacun de ces anticorps réagissant avec au moins deux, trois, quatre ou plus de quatre, mais pas tous les sérotypes IATS. Il est souhaitable qu'il y ait au moins un anticorps monoclonal qui se lie à au moins deux sérotypes IATS et un ou plusieurs immunotypes de Fisher, de préférence au moins à deux de ces

immunotypes.

Il est souhaitable que le nombre total d'anticorps monoclonaux

différents dans une composition soit au moins égal à un ou égal ou infé-

rieur à environ la moitié du nombre total de sérotypes IATS avec lesquels

les compositions réagissent, le plus souvent le tiers de ce nombre total.

Le rapport molaire des divers composants de l'anticorps monoclonal ne

diffère habituellement pas d'une facteur supérieur à 10, le plus habituel-

lement d'un facteur supérieur à 5 et il se trouvera habituellement dans un

rapport molaire d'environ 1/1 à 2 par rapport à chacun des autres compo-

sants de l'anticorps.

Les anticorps monoclonaux humains selon la présente invention peuventégalement s'utiliser en combinaison avec d'autres compositions d'anticorps monoclonaux ou avec des produits existants à base de plasma sanguin, tels que par exemple les produits " base de gammaglobulines et immunogiobulines

disponibles dans le commerce, que l'on utilise dans le traitement prophy-

lactique ou thérapeutique des maladies occasionnées chez par le P. aerugi-

nosa. De préférence, en ce qui concerne les immunoglobulines, le plasma sera obtenu à partir de donneurs humains qui présentent des niveaux élevés d'immunoglobulines r4actives au P. aeruginosa. Voir en général l'article

Z593826

"Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med.,

76(3a), 30 mars 1984, pages 1 à 231, incorporé ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent s'uti-

liser sous la forme de compositions administrées séparément en conjugaison avec des agents antibiotiques ou antimicrobiens. Typiquement, les agents antimicrobiens peuvent comprendre une pénicilline antipseudomonale (par exemple carbénicilline) en conjugaison avec un aminoglycoside (par exemple

gentamicine, tobramycine, etc.), mais on peut également utiliser de nom-

breux autres agents (par exemple céphalosporines) bien connus des spécia-

listes.

Les anticorps monoclonaux humains et les compositions pharmaceutiques à base de ceux-ci selon la présente invention sont particulièrement utiles pour l'administration orale ou parentérale. De préférence, les compositions

pharmaceutiques peuvent être administrées par voie parentérale, c'est-a-

dire par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Ainsi, la présente invention fournit des compositions pour administration parentérale quf comprennent une solution d'anticorps monoclonal humain ou un cocktail à base de celui-ci, dissous dans un support acceptable, de préférence un support aqueux. On peut utiliser toute une série de supports aqueux, prendre exemple l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline à 0,4%, la glycine à 0,3%, etc. Ces solutions sont stériles et généralement exemptes de matières particulaires. On peut stériliser ces compositions par des techniques de stérilisation classiques bien connues. Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables en tant que de besoin pour s'approcher des conditions physiologiques, par

exemple des agents d'ajustement du pH et des tampons, des agents d'ajuste-

ment de la toxicité, etc., par exemple acétate de sodium, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de calcium, lactate de sodium, etc. La concentration en anticorps de ces formulations peut varier largement,

c'est-à-dire par exemple une valeur inférieure a environ 0,5%, habituelle-

ment au moins égale à 1% et pouvant jusqu'à 15 ou 20% en poids, et on les choisit surtout d'après les volumes de fluide, les viscosités, etc., de

préférence en vue du mode particulier d'administration choisie.

Ainsi, une composition pharmaceutique typique pour injection intra-

musculaire pourrait être préparée de façon à contenir I mI d'eau tamponnée stérile et 50 mg d'anticorps monoclonal. Une composition typique pour injection intraveineuse pourrait être préparée de façon à contenir 250 ml de solution stérile de Ringer et 150 mg d'anticorps monoclonaux. Des méthodes effectives de préparation de compositions administrables par voie parentérale sont connues ou évidentes pour les spécialistes et elles sont décrites avec plus de détail, par exemple dans Remington's Pharmaceutical Science, 15ème édition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), incorporé ici à titre de référencé. Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent être lyophilisés pour le stockage et reconstitués dans un support convenable avant l'utilisation. Il apparaît que cette technique est efficace avec des

immunoglobulines classiques et l'on peut employer des techniques de lyophi-

lisation et de reconstitution connues dans l'état de la technique. Il sera apprécié par le spécialiste que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire dans une certaine à la perte d'activité de l'anticorps (par exemple avec des immunoglobulines classiques, les anticorps IgM tendent à présenter une perte d'activité plus importante que celle des

corps IgG) et qu'il peut être nécessaire d'ajuster les niveaux d'utilisa-

tion pour opérer une compensation.

Les compositions contenant les anticorps monoclonaux humains selon la présente invention ou un cocktail de ceux-ci peuvent être administrées pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des infections dues au

p. aeruginosa. Dans l'application thérapeutique, on administre les composi-

tions à un patient déjà infecté par un ou plusieurs des sérotypes de P. aeruginosa en quantité suffisante pour le guérir, ou tout au moins pour arrêter partiellement l'infection et ses complications. Une quantité adéquate pour y arriver est définie comme "une dose thérapeutiquement efficace". Des quantités efficaces à cet usage dépendent de la sévérité de l'infection et de l'état général du système immunitaire propre du patient mais elles sont en général comprises entre environ 1 et environ 200 mg d'anticorps par kg de poids du corps, les doses de 5 à 25 mg par kg étant les plus couramment utilisées. Il faut garder présent à l'esprit que les produits selon la présente invention peuvent généralement être employés dans des états pattologiques sérieux, c'est-à-dire dans des situations qui

menacent la vie ou qui peuvent représenter une menace pour la vie, notam-

ment lorsque l'on est confronté à une septicémie et à une endotoxémie dues au P. aeruginosa. Dans ces cas là, en raison de l'absence de substances étrangères et de l'absence de rejets de "substance étrangère" que l'on obtient avec les anticorps monoclonaux humains selon la présente invention, il est possible que le médecin peut souhaiter administrer ces anticorps en

excès important.

Dans les applications prophylactiques, les compositions qui contien-

nent l'anticorps selon la présente invention ou un cocktail à base de celui-ci, sont administrées à un patient qui n'est pas encore infecté par le P. aeruginosa pour améliorer la résistance du patient à cette infection

éventuelle. Cette quantité est définie comme représentant une "dose prophy-

lactiquement efficace". Dans cette utilisation, les quantités précises peuvent dépendre de l'état de santé du patient et de son niveau général d'immunité, mais elles sont en général comprises entre 0,1 et 25 mg/kg,

notamment 0,5 et 2,5 mg/kg.

On peut procéder à l'administration de ces compositions en une ou en plusieurs fois avec des doses et une posologie choisis par le médecin traitant. En tout cas, les formulations pharmaceutiques doivent apporter une quantité du ou des anticorps selon l'invention suffisante pour traiter

efficacement le patient.

PARTIE EXPERIMENTALE

EXEMPLE I

L'exemple I illustre des méthodes de préparation d'anticorps mono-

clonaux humains (isotype IgM) qui réagissent avec les sérotypes IATS n0 2, et 16 et les immunotypes de Fisher n 3 et n 7. Un échantillon de sang périphérique obtenu chez un patient souffrant d'une fibrose cystique connu pour avoir présenté une infection chronique par le P. aeruginosa sert comme source de cellules-B humaines. Les cellules mononucléaires sont séparées du sang par des techniques classiques de centrifugation sur un appareil de Ficoll-Paque (Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968) 21, suppl. 97, 77-89) et on les lave deux fois dans une solution saline tamponnée de phosphate de calcium exempte de magnésium

(STP).

Les cellules mononucléaires sont débarrassées des cellules-T en utilisant un mode opératoire modifié les transformant en rosettes-E. En

bref, les cellules sont tout d'abord remises en suspension à une concentra-

tion de 1 x 107 cellules/ml dans du (STP) contenant 20% de sérum de veau foetal (FCS) à 4 C. Un ml de cette suspension est alors placé dans un tube à fond rond en polystyrène de 17 x 100 mm auquel on ajoute I x 109 cellules de sang rouge de mouton traité par le bromure de 2-aminoisothiouronium (AET) provenant d'une solution à 10% (v/v) dans du milieu de Dubelcco modifié selon Iscove (Milieu de Iscove) (Madsen, M. et Johnson, H.E., J. Immun. Methods (1979) 27, 61-74). On mélange la suspension très modérément pendant 5 à 10 minutes à 4 C et les cellules en rosette-E sont ensuite éliminees par centrifugation sur un appareil de Ficoll-Paque pendant

8 minutes à 2 500 x g a 4 C. Les cellules mononucléaires de sang périphé-

rique négatives à rosette-E (E-PBMC) se rassemblant à l'interface, sont recueillies et lavées une fois dans du milieu Iscove et on les remet en suspension dans ce même milieu contenant 15% (v/v) de FCS, de la Lglutamine (2 mmoles/l), de la pénicilline (100 IU/ml), de la streptomycine (100 pg/ml), de l'hypoxanthine (1 x 10-4 M), de l'aminoptérine (4 x 10-7 M), et de la thymidine (1,6 x 10 5 M). Ce milieu est désigne dans ce qui suit sous le

nom de milieu HAT.

La transformation cellulaire des cellules E-PBMC s'accomplit par

cultures simultanées de ces cellules avec une lignée de cellules de trans-

formation. La lignée de cellules de transformation est une lignée cellu-

laire lymphoblastoide humaine positive à l'antigène nucléaire d'Epstein-

Barr (EBNA) dérivée par mutagénèse à l'éthylméthanesulfonate (EMS) de la lignée de cellules lymphoblastoide GM 1500 suivie d'une sélection en présence de 30 mg/ml de 6-thioguanine pour rendre les cellules déficientes en transférase d'hypoxanthine-guanine phosphoribosyle (HGPRT) et sensibles ainsi ou HAT. Cette lignée de cellules est désignée sous le nom de lignée de cellules 1A2 et elle a été déposée à l'American Type Culture Collection

(A.T.C.C.) le 29 mars 1982 sous le numéro A.T.C.C. CRL 8119. Les cellu-

les 1A2 en phase de croissance logarithmique sont mises en suspension dans

du milieu HAT et combinées ensuite aux cellules E-PBMC à raison de 8 cel-

lules 1A2 par cellule E-PBMC. Le mélange de cellules est déposé sur huit plaques de microtitrage comportant 96 creux à fond rond (Costar 3799) à raison de 200 pl soit 72000 cellules par cupule, et on incube à 37 C en atmosphère humidifiée contenant 6% de CO2. Les cultures sont alimentées les cinquième et huitième jours après le dépôt sur plaques, on remplace la moitié du surnageant par du milieu HAT neuf. On observe les cupules tous

les deux jours au microscope inversé pour déceler des signes de proliféra-

tion de cellules. Douze jours après la mise sur plaque, on observe que 100% des cupules contiennent des cellules de prolifération et que, dans la plupart des cupules, les cellules sont d'une densité suffisante pour être enlevées afin de tester la présence de l'anticorps anti-P. aeruginosa dans

le surnageant.

On examine les surnageants pour déceler la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa en utilisant une technique déterminant un immunosorbant lié a une enzyme (ELISA) (Engvall, E. (1977) 55, 193-200). Les plaques

d'antigènes sont constituées de plaques de microtitrage comportant 96 cupu-

les à fond plat (Immulon II, Dynatech) dont les puits contiennent diverses I6

bactéries vivantes adsorbées au fond de la cupule. Pour faciliter l'adsorp-

tion des bactéries sur la matière plastique, on dépose dans chaque rainure 111l de poly-L-lysine (PLL) (1 Pg/ml dans du (STP), pH 7,2) est incubé pendant 30 minutes à la température ambiante. La PLL non absorbée est éliminée, on lave les plaques une fois avec du STP, dans chaque cupule on ajoute 50 Vl de suspension bactérienne lavée (0D660 = 0,2) dans du STP et on incube les plaques pendant I heure à 37 C. Les bactéries non adsorbées

sont éliminées par lavage des plaques trois fois avec une solution saline-

Tween (0,9% de NaCl, 0,05% (v/v) de Tween-20). Les diverses plaques d'anti-

* - genes utilisées dans le test de sélection comprennent:

(1) un mélange d'immunotypes 1, 2 et 4 de Fisher de P. aeruginosa (A.T.C. C.

- n 27312, 27313, 27315); (2) un mélange d'immunotypes de Fisher de P. aeruginosa 3, 5, 6 et 7 (A.T.C.C. n 27314, 27316, 27317, 27318, respectivement); et

(3) une plaque de microtitrage ne contenant pas de bactéries.

On initie l'ELISA en bloquant tout d'abord les plaques à l'aide de Pl/cupule de tampon de blocage (STP, pH 7,2, contenant 5% (p/v) de lait écrémé en poudre, 0,01% (v/v) d'Antifoam A (Sigma), et 0,01% (p/vy) de thimérosal) pendant 60 minutes à la température ambiante. Apres blocage, on lave les plaques trois fois avec une solution saline-Tween. Cinquante fl de STP, pH 7,2, contenant 0,1% de Tween-20 et 0,2% (p/v) d'albumine de sérum bovin (BSA) sont alors placés dans toutes les cupules. Les surnageants des

cupules des plaques de culture sont transférés dans les cupules correspon-

dantes des plaques d'antigènes (50 Vl/cupules) et l'on incube les plaques

pendant 30 minutes à la température ambiante. On élimine alors les surna-

geants, on lave les cupules trois fois avec de la solution saline-Tween et l'on ajoute dans les cupules 50 Pl de peroxydase de raifort dilués de façon convenable (HRP) conjugués à de l'IgG + IgM de chèvre anti-humaine (American Qualex International eA1114 + -A1124). Dans cet exemple, on utilise du HRP de chèvre anti-IgG et du HRP de chèvre anti-IgM aux dilutions finales respectives de 1/5000 et 1/3000 dans du STP, pH 7,2, contenant 0,05% de Tween-20 et 0,1% de BSA. Après 30 minutes d'incubation à la température ambiante, les anticorps de chèvre conjugués à une enzyme en excès sont

éliminés et on lave les cupules trois fois avec une solution saline-Tween.

Cent El de substrat (0,8 mg/ml de dichlorhydrate de o-phénylènediamine dans

un tampon de citrate 100 mM, pH 5,0, plus 0,03% de H202 dans H20 déminé-

ralisée, mélangés à volumes -égaux juste avant la mise sur plaque) sont

alors ajoutés dans chaque cupule. Après 30 minutes d'incubation dans l'obs-

curité, on ajoute 50 pl de H2S04 3N à toutes les cupules pour mettre fin aux réactions. Les surnageants de culture contenant des anticorps qui réagissent avec l'antigène de la plaque sont détectés par l'apparition d'une couleur positive dans les cupules correspondantes et l'intensité de la réaction est chiffrée en mesurant l'indice d'absorption à 490 nm sur un

lecteur micro ELISA Bio-Tek EL-310.

L'analyse des surnageants de culture par la méthode ci-dessus conduit

a l'identification de deux cupules (iC1 et 2H12) qui contiennent des anti-

corps anti-P. aeruginosa qui réagissent avec les immunotypes de Fisher 3, , 6 et 7 mais non avec les immunotypes de Fisher 1, 2 et 4 ou la plaque

sans bactéries. Pour identifier le ou les immunotype(s) de Fisher spéci-

fique(s) reconnu(s), on prépare des plaques d'antigènes contenant des bactéries fixées sur le PLL d'un seul immunotype de Fisher comme décrit

ci-dessus pour chaque immunotype. Le résultat de l'essai ELISA, tel qu'ex-

posé ci-dessus avec des surnageants de culture provenant des cupules 1C1 et 2H12 sur les plaques individuelles d'immunotypes, indique que ces deux

cupules contiennent un anticorps spécifiquement dirigé contre chacun des -

deux immunotypes de Fisher 3 et 7. Un essai ELISA semblable, effectué sur

le panneau IATS des souches de typage de P. aeruginosa (obtenu de l'A.T.C. C.

et comprenant les n 33348 et 33364) démontre que les anticorps des cupu-

les 1C1 et 2H12 réagissent spécifiquement avec les souches IATS 2, 5 et 16.

L'isotype du ou des anticorps réactif(s) des cupules 1CI-et 2H12 est déterminé à l'aide d'un essai ELISA semblable aux tests de spécificité décrits ci-dessus, sauf que le HRP de chèvre anti-IgG humaine et le HRP de chèvre anti-IgM humaine sont utilisés indépendamment comme réactifs de seconde étape plutôt qu'en association. Une réaction positive du ou des anticorps des cupules lC1 et 2H12 avec les immunotypes de Fisher 3 et 7 ne s'observe qu'avec les réactifs anti-IgM, ce qui met en évidence l'existence d'un isotype IgM pour le ou les anticorps correspondant(s) de chaque cupule. Pour déterminer si le schéma de réaction des immunotypes 3 et 7 anti-Fisher est dû à un ou à plus d'un anticorps dans les cupules 1C1 et 2H12 (c'est-à-dire un anticorps réagit avec chacun des immunotypes de Fisher 3 et 7, ou deux anticorps l'un réactif avec l'immunotype de Fisher 3 et l'autre avec l'immunotype de Fisher 7) des cellules provenant des deux cupules sont mises en sub-culture à faible densité et des cupules contenant les cellules qui prolifèrent sont testées pour déceler l'activité anticorps sur des plaques d'antigènes séparées de bactéries d'inmmunotype de Fisher 3 et d'immunotype de Fisher 7. La sub-culture est effectuée sur des plaques de 96 cupules à fond rond à raison de 5 cellules par cupules dans un volume

total de 100 V1 de milieu de HAT dépourvu de composant aminoptérine (mi-

-lieu HT). Des cellules lymphoblastoides sensibles à l'HAT et nontransfor-

mantes sont incluses dans chacun des cupules à une raison de 500 cellu-

les/cupules comme cellules d'alimentation. Quatre jours après la mise sur plaque, on ajoute 100 Pm de milieu HAT dans toutes les cupules pour détruire sélectivement les cellules d'alimentation. Les cupules sont de nouveau alimentées le jour n 9 après la mise sur plaque on remplace la moitié du

surnageant des creux par du milieu HAT. Puis, les cupules sont simultané-

ment alimentées tous les 4 à 5 jours en milieu HT jusqu'à ce que les cupules contiennent des cellules lymphoblastoides en quantité suffisante pour l'analyse du surnageant par la méthode ELISA. Lorsque l'on fait des essais sur des plaques individuelles d'antigènes d'immunotype Fisher 3 et d'immunotype Fisher 7, tous les surnageants qui ont réagi avec l'immunotype Fisher 3 réagissent également avec l'inmmnunotype Fisher 7, ce qui indique qu'un seul anticorps est responsable de l'activité sur les deux immunotypes de Fisher. On trouve que des surnageants sélectionnés au hasard lorsqu'on les teste sur des souches IATS n 2, 5 et 16, réagissent avec chacune des trois souches pIutôt qu'avec des souches individuelles, ce qui confirme encore la conclusion qu'un seul anticorps est susceptible de réagir de façon croisée avec les immunotypes de Fisher 3 et 7 et les souches IATS

no 2, 5 et 16.

Le clonage des cellules spécifiques productrices d'anticorps prove-

nant des cupules 1C1 et 2H12 s'accomplit en soumettant indépendamment les cellules provenant de chaque cupules à plusieurs suites de clonage à dilution limitée jusqu'à ce que tous les surnageants clonaux testés par le protocole ELISA ci-dessus conduisent à une réaction positive avec les immunotypes de Fisher 3 et 7 et les souches IATS n 2, 5 et 16. Le clonage emploie des cellules d'alimentation, comme décrit ci-dessus, pour la sub-culture. Par ces moyens, on obtient deux lignées cellulaires humaines

transformées clonees (1C1 et 2H12) qui se perpétuent sans cesse (immortel-

les) et qui secrètent chacune un anticorps monoclonal humain susceptible de réagir avec les immunotypes de Fisher 3 et 7 et les souches IATS n 2, 5 et 16. Dans cet exemple, la lignée de cellules et l'anticorps qu'elle produit

la même désignation.

EXEMPLE II

L'exemple II illustre des méthodes de préparation d'anticorps mono-

clonal humain (isotype IgG) qui réagit avec les sérotypes IATS n 2, 5 et 16 et les immunotypes de Fisher 3 et 7. Les protocoles de préparation sont essentiellement identiques à celui de l'exemple I. En bref, un échantillon

de sang périphérique obtenu chez un patient souffrant d'une fibrose cys-

tique et connu pour avoir été infecté de façon chronique par le P. aerugi-

nosa sert de source de cellules humaines B. Les cellules mononucléaires sont séparées comme décrit dans l'exemple 1 sauf que l'on utilise 1,6 ml de la suspension de STP avec une suspension de 1,6 x 109 cellules de sang rouge de mouton traité à l'AET. La transformation cellulaire est également la même sauf: le rapport de cellules 1A2 par cellule E PBMC est de 7,5; on utilise quinze plaques comportant 17 000 cellules/cupules; les cultures sont alimentées les jours n 6 et n 10 après la mise sur plaque; et au sixième jour après la mise sur plaque, presque tous les cupules contiennent

des cellules proliférantes.

Un test de des surnageants de culture pour déceler les anticorps spécifiques est effectué comme on l'a décrit et il conduit à localiser un cupules (9D1) qui contient un anticorps réagissant avec la plaque des

immunotypes de Fisher 3, 5, 6 et 7 mais non pas avec la plaque des immuno-

types de Fisher 1, 2 et 4, ni avec la plaque sans bactéries. Le résultat de

l'essai ELISA décrit sur des plaques individuelles d'immunotypes ou d'anti-

gênes bactériens de sérotypes avec des surnageants de culture 9D1 met en

évidence un anticorps dirigé spécifiquement contre chacun des deux immuno-

types de Fisher 3 et 7 et aussi contre chacune des souches IATS n 2, 5 et 16. Des études ultérieures exécutées en accord avec l'exemple I démontrent que la spécificité anticorps de cupule 9D1 est attribuable à un clone

unique sécrétant un anticorps de l'isotype IgG.

EXEMPLE III

L'exemple III illustre la spécificité antigénique de quelques uns des

anticorps selon la présente invention.

Pour déterminer si des anticorps monoclonaux lC1, 2H12 et 9D1 réagis-

sent avec la même cible antigénique et sont donc identiques par leur spécificité, on exécute des essais supplémentaires. Tout d'abord, on compare les anticorps dans un essai ELISA sur un panneau de souches de référence et d'isolats cliniques de P. aeruginosa. Le protocole ELISA est le même que celui décrit ci-dessus sauf les modifications suivantes: 1) au lieu de bactéries adsorbées sur des plaques revêtues de PLL, les cupule de la plaque contiennent diverses bactéries entières qui ont été fixées à l'éthanol au fond du cupule. Les plaques sont préparées par addition de 50 Pl de suspension bactérienne lavée (OD660 = 0,2) dans du STP dans les cupules, centrifugation de la plaque pendant minutes à 500 x g, aspiration du STP, addition de 75 Pl d'éthanol pendant 10 minutes, élimination de l'éthanol que l'on fait suivre d'un séchage à l'air. Sont incluses sur les plaques d'antigènes des souches IATS n 2, 5, 11 et 16 (A.T.C.C. n 33349, 33352, 33358 et

33363 respectivement) et seize isolats cliniques dont on a préa-

lablement identifié les types à la fois par agglutination avec des antisérums Bacto-Pseudomonas aeruginosa de Difco (Detroit, Michigan) selon les directives du fabricant et par un protocole ELISA (tel que décrit ici) aux sérotypes 2, 5, 16 ou à une combinaison de ces - sérotypes; 2) des antisérums de typage de lapin sont utilisés à une dilution de 1/500 dans du STP sauf pour l'anti-IATS 17 qui est dilué 1/250. Les surnageants de culture contenant des anticorps ICI, 2H12 et 9D1 sont utilisés purs; 3) comme réactifs de seconde étape, on utilise une protéine A traitée au bio-étain (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) diluée 11500 et une Ig de chèvre anti-humaine traitée au bio-étain (4703,

Tago, Inc., Burlingame, CA) diluée au 1/500 pour détecter respec-

tivement des anticorps de lapin et des anticorps humains. Cinquante 1l

de réactif-sont ajoutés aux cupules appropriés et après une incuba-

tion de 30 minutes à la température ambiante, on élimine le réactif

qui ne s'est pas lié et les cupules sont lavées trois fois. Cinquan-

te Pl d'un complexe préformé avidine/peroxydase de raifort traité au bioétain (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) sont alors ajoutés à chaque cupule. Apres 30 minutes d'incubation

à la température ambiante, le réactif Vectastain ABC en excès est-

éliminé et les cupules sont à nouveau lavées trois fois avant l'addi-

tion de substrat.

Comme indiqué sur le tableau II, les résultats des essais indiquent que, bien que les anticorps IC1 et 9D1 réagissent avec chacun des isolats cliniques identifiés aux sérotypes IATS n 2, 5 ou 16, l'anticorps 2H12ne

réussit pas à réagir avec trois de ces isolats. Ceci suggère que l'anti-

corps 2H12 reconnaît un épitope différent de celui que reconnaissent le IC1 ou le 9D1 et que les deux épitopes sont apparemment exprimés également sur la plupart mais non sur tous les isolats cliniques correspondant aux

sérotypes IATS n 2, 5 ou 16.

l aAL4sod ZuawaLqle. saJ% VSI13 ULessa,L e UOLDeg = (+)e i i i i i i i i i i + i + i - i - i - i + i + i IZZX i i i i i i i i i i i +i + i + i - OZZH i S+ i i i i i i i - i + + i + i - - + i - I 61ZH i i i i i i i i i i i+ + i + i-i i + i + i 812ZH i i i i i *I i i i i i+ i + i + i + - + + i LIZH i ;i i i; i; i + +; +; + i+ 96úJ i O ii i i i i i ii + + + _- i SZ9 i i i i i i i i i i + + i - i - - i + i + SSZ i i + i +i i i i i I I I I I Ii i i S2 + + i +; - + + i +Z i i i i i i j i i + i+ - i + i + i + i 90)Z i i i i i i i i i i + + i + i - i + + + i s i i i i + i i i ii i ± i + i + i -; -; + + + i 9 s i -I j i i i; i OZ + + i + i +i LO i i i i i i i i i i + i + i - e(+)i + i i 90O8i i -16i13 i i i i iS Z i i + + i + i - i - j + i i;9ZSVi i i i i i i i i i i i i i i i i - - - - -i i St i ' i - ii- i + Sl - iI1VI ii i i i + i *()i e+ i 9SlI i i+ i + i + i S- Sl+i + { +)9ISúVI ii i i i i i i i + + i +i+i - +fi Z().S SlVIi i i i i i i j i i + + i + i - i - i + i 2SIVI i lG6 i 131 i Z IHZ i i i i i i qvw qVW i qVW i SlVI i SlVI i SlVI i SlVI i %1.OS1 i _________________; no a6edú3 i i aoL za i ap anos esouL6nJaP 'd ap sanbLuLID SZWLOSL SaL la a5edR; ap sapnos saL ans [06 la 131 'ZIHZ suLeWInq xnuoLoouoW sdioDLlue sap la oo03 ap esouL6njae ' d-o se snasLue sap).ALLD.ega ap wgqoDS II nV31SVI Ces données suggèrent en outre que la cible moléculaire reconnue par les anticorps IC1 et 9D1 doit être vraisemblablement présente sur tous les

isolats cliniques de P. aeruginosa dont les types pourraient Etre identi-

fiés aux sérotypes IATS Z, 5 ou 6, tandis que la cible reconnue par l'anti-

corps 2H12 s'exprime sur un sous-groupe de ces isolats. Pour déterminer si les anticorps ICI, 2H12 et 9D1 réagissent avec

différents antigènes ou encore avec différents épitopes sur le même anti-

gène les épitopes étant exprimés sur la plupart mais non sur la totalité

sérotypes IATS 2, 5 et 16, on effectue une analyse par immunotache. L'anti-

génicité commune aux souches IATS 2, 5 et 16 étant apparemment due aux antigènes résistant à la chaleur (Liu, P.V. et Coll., comme ci-dessus) et en notant que la stabilité à la chaleur est une caractéristique indiquée ci-dessus des molécules de lipopolysaccharide, on choisit des préparations de LPS provenant des souches IATS n 2, 5, 16 et 11 comme préparations d'antigènes pour l'analyse. Du LPS brut est préparé à partir des souches de typage par extraction dans une solution saline à 60 C (Orskov, F. et coll.,

Acta. Path. Microbiol. Scand. (1971) Section B 79, 142-152). Dix microgram-

mes de LPS, évalués d'après leur teneur en 2-céto-3-désoxyoctonate (KDO) (Karkhanis, Y.D. et coll., Anal. Biochem. (1978) 85, 595-601) provenant de chacun des sérotypes sont soumis à une électrophorèse sur le système -dodécylsulfate de sodium-gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) (Hancock, R.E.

W.

et Carey, A.M., J. Bacteriol (1977) 140, 901-910) avec un gradient de gel à 20%. Les espèces moléculaires séparées passent du gel sur une membrane de nitrocellulose (NCM) comme décrit ailleurs (Towbin, H. et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76, 4350-4354) et la tache de NCM est fixée pendant une heure dans du STP-Tween (Batteiger, B. et coll., J. Immunol. Meth. (1982) 55, 297-307). On fait alors incuber les taches pendant une heure à la température ambiante dans 20 ml de surnageant de culture usée provenant soit des lignées cellulaires de ICI, 2H12, soit des lignées

cellulaires 901. A la suite de cinq rincages de 5 minutes dans du STP-

Tween, on incube chacune des taches de NCM pendant I heure à 25 C dans une dilution au 1/1000 ou au 1/1500 des IgG + IgA + IgM (Zymed) (dans du

STP-Tween) antihumaines de chèvre conjuguées à de la phosphatase alcaline.

Les taches sont alors soumises à cinq lavages de 5 minutes dans du STP-

Tween, temps après lequel, on visualise les interactions antigèneanticorps

en incubant les taches pendant 15 à 20 minutes à 25 C dans 30 ml de subs-

trat de nitrobleutétrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (NBTBCIP), comme cela est décrit par Leary et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 4045-4049. On stoppe le développement de la

couleur par rinçage de la tache plusieurs fois à l'eau déminéralisée.

Les profils de taches obtenus avec les trois anticorps sont notable-

ment différents. L'anticorps 2H12 reconnaît en majorité une courte série de molécules de faible poids moléculaire régulièrement espacées (c'est-àdire

en échelle) dans les préparations d'antigènes des sérotypes 2, 5 et 16.

Quelques molécules de poids moléculaire plus élevé régulièrement espacées sont également faiblement reconnues. On n'observe pas de réaction sur la préparation LPS provenant du sérotype 11. Une répétition de l'analyse par immunotache en utilisant des préparations de LPS qui ont été au préalable traitées avec de la protéinase K A 60 C pour détruire les antigènes de protéine, ne conduit à aucune altération des profils. Les raies de faible poids moléculaire correspondent précisément à des formes plus petites de molécules LPS, tel que ceci est visualisé dans un essai sur gel SDS-PAGE

effectué de façon semblable dans lequel les antigènes ne sont pas transfé-

rés sur une NCM mais sont plutôt marqués de façon spécifique pour mettre en évidence la présence de LPS (Tsai, C.M. et Frasch, C.E., Anal. Biochem. (1982) 119, 115-119) sauf que la raie la plus basse sur gel marqué à l'argent (représentant la région centrale plus le lipide A de LPS) n'est pas reconnue. L'anticorps iCI reconnaît les mêmes séries de molécules de faible poids moléculaire régulièrement espacées parmi les préparations d'antigènes des sérotypes 2, 5 et 16 mais non pas 11, bien que l'intensité

de la réaction ne soit pas aussi forte qu'avec le 2H12. En outre, cepen-

dant, cet anticorps reconnaît également de façon évidente une série de molécules de poids moléculaire plus élevé régulièrement espacées sur les

sérotypes 2, 5 et 16 qui, en combinaison avec les raies de poids molécu-

laire plus faible reconnues, donne lieu à des profils distincts en forme d'échelle parfaite. Ces profils ne sont pas altérés par un prétraitement de les préparations d'antigène à la protéinase K. A nouveau, les profils correspondent aux schémas de disposition des raies en échelle observés dans les gels marqués spécifiques aux LPS (c'est-à-dire qu'ils semblent se correspondre raie à raie), sauf que la raie représentant le noyau plus le lipide A n'est pas reconnue. L'anticorps 9D1 présente le même profil de réaction que l'anticorps 1C1 sur les souches IATS 2, 5 et 16 mais pas sur la 11. A nouveau, la raie la plus proche du bas de l'échelle d'un gel marqué à l'argent des différentes préparations de LPS n'est pas reconnue et le profil d'ensemble n'est pas altéré par un prétraitement des préparations de LPS à la protéinase K. L'ensemble de ces observations indiquent que le LPS des sérotypes 2, 5 et 16 a-été la cible moléculaire reconnue par Jes

anticorps 2H12, iC1 et 9D1.

EXEMPLE IV

L'exemple IV illustre l'activité protectrice de l'un des anticorps selon la présente invention. Pour évaluer la capacité protectrice in vivo de l'anticorps ICI, on

effectue sur la souris des essais de -protection des animaux.

L'anticorps iC1 est tout d'abord concentré à partir d'un surnageant de culture usé par précipitation au sulfate d'ammonium saturé (concentration finale 50%) (Good, A.H. et coll., Selected Methods in Cellular Immunology, Mischel, B.B. et Shiigi, S.M., eds., W.J. Freeman & Co., San Francisco, CA, (1980) 279-286). Le matériau précipité est reconstitué dans un volume minimum d'eau stérile, dialysé extensivement en présence de STP et filtré de façon stérile. A titre de témoin négatif, on traite de façon semblable un surnageant de culture usé provenant d'une autre lignée cellulaire humaine transformée (6F11-A.T.C.C. n CRL 8562) produisant un anticorps

monoclonal humain spécifique du LPS de la souche IATS 11.

Des souris femelles BALB/c dont le-poids du corps estcompris entre et 22 g sont divisées en deux groupes de trente souris chacune. Toutes les souris de chaque groupe sont inoculées individuellement par voie intrapéritonéale (i.p.) à l'aide de 0,5 ml d'anticorps concentré ICI ou 6F11. Six heures plus -tard, chacun des deux groupes est subdivisé en trois groupes de dix souris et des membres de chacun des groupes de dix souris sont indépendamment traités par voie i.p. avec 0,3 ml d'une suspension de

bactéries vivantes contenant 5 LD50 de souches IATS 2, 5 ou 11 respective-

ment. Les suspensions bactériennes sont préparées à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique à partir duquel les bactéries sont centrifugées, lavées deux fois dans du STP et remises en suspension à la concentration appropriée dans le STP. Des groupes témoins constitués chacun de quatre ou cinq souris sont injectés par voie intrapéritonéale à l'aide de 0,5 ml de STP et traités six heures par voie intrapéritonéale avec une dose 5 LD50 des mêmes sérotypes. Apres traitement bactérien, on

observe alors les animaux pendant une période de cinq jours.

Comme indiqué sur le tableau III, l'anticorps IC1 apporte une protec-

tion spécifique et significative contre une dose létale des deux séroty-

pes IATS 2 et IATS 5 mais non contre une dose létale du sérotype IATS 11. A la suite de l'injection bactérienne chez tous les animaux non protégés Il se produit diverses périodes de chocs endotoxiques qui conduisent habituellement à la mort. Les animaux témoins auxquels on a administré du STP seul des chocs endotoxiques aigus et meurent tous rapidement. Les

animaux témoins négatifs auxquels on a administré un anticorps non homolo-

gue (6F11) subissent une période de chocs plus prolongée qui se caractérise par les symptômes énumérés sur la note "a" du tableau III. Quelques uns de ces animaux finissent par guérir, ceci étant peut être du aux composants non anticorps qui ont été concentrés simultanément dans les préparations d'anticorps. Cependant, les animaux qui ont reçu l'anticorps homologue protecteur ne présentent que des symptômes mineurs d'endotoxémie. Ces symptômes disparaissent dans les 24 heures après inoculation et les animaux apparaissent alors sains durant tout le reste de la période d'observation

de cinq jours.

TABLEAU III

Démonstration in vivo d'effet protecteur de l'anticorps monoclonal humain IC1 contre les sérotypes IATS n 2 et 5 !!! Anticorps! Nombre de survivants/nombre d'animaux infectés! monoclonal! cinq jours après l'infection par! humain!--------------------------------------------------------!

! IATS 2! IATS 5 IATS 11

I t I! t lCl! 8/10! 10/10 3/1,a ttI 6F11! 0/10! 1/10 a 10/10!

! TP 0/4!!!0!

STP! 0/4! 0/4! 0/4!

!!!! t

a Dans les cas o l'on a noté une protection non spécifique, le réta-

blissement après infection est notablement différent de celui que

l'on observe entre des anticorps homologues et des souches infec-

tieuses, c'est-à-dire iC1 avec IATS n 2 ou 5 et 6F11 avec l'IATS 11.

Dans ces derniers cas, la récupération est essentiellement complète,

les animaux apparaissant normaux 24 heures après l'infection bacté-

rienne. Dans les cas non spécifiques cependant, les souris présentent des signes d'infection aiguë (par exemple diarrhée, croûte sur les

paupières, fourrure ébouriffé, profil "bossu" et lenteur des mouve-

ments) pendant plusieurs jours avant de récupérer leur état normal.

Cette protection non spécifique est apparemment due à des composants non anticorps qui sont concentrés simultanément et ils sont ainsi I ZVI sa3uwuuo4sueuP ap salnLlaD ap aU6BL aun DBAa sainLLaD saD ap anfLnD-oD3 ued iLLdwo33e,s Md-3 saInLla3 sap a.LeLnLLa uo:eLuwjojsue.4 e1 À(aDuaJaJJ ap ailB 4 g a4uasgad eL suep aqodioDuL 'úIú-eO 'Sb (861) 'unuwwI D'a4UI ' LlOD la '"S- 'Jald) ú JaqstS ap adúountuuL, La p pLOSi aiteL SE -nzaLOw splod pua6 ap plaeqzoDeSúLOd ap uotLejdBJd aun aud àsLunwumL 4uaw alqueleJd npLAtpUL un,p aLlaB Zsa B sauLUWnq saLnLLaD ap aJinos el auasaJd el suep:L3ap Luol3Douow sdJo3L3ue,l DaAe snualqo s4eZ -Lnspa saL la apaDoJd al suep suo4e^LaA sap snssap-ID anbLpuL uo aLdwaxa 3aD suep ZlaDpp sdaODLIUe,l Ua.saB 3a UasIULD3eUe3 'BalOSt anod suoL 0ú -uDt_41pow sauLue3aD aaLeu ap aJessaDau Isa LL,nb.sa,u aD LS aB3daJ Isa AI I saudwaxa s suep 13map ?ppooad al esout5n.ae 'd Bp Z uaqst3 ap adKú - ounwLi,L Dea^ la 1i la t SV 4I sadRouass saB DaAe 1 eau Lnb ULtewnq l uoLD -ouow sdaozique un,p uoL3npoid ap apoq4?w aun aulsnLLL A aLdwaxa,l A 3ldW3X3 SZ 11I nealqe np.alou ua al3aDap aLlaD anb aLta. anbfLbt4ads uou uot34DaZod aun g anp f uawalqelqwastBSA sntd aL 3sa atAns el e i i i i i i SO /0 i S/O /0 i dIS i i i i i i i 01/01 i OI/L i OI/0 i 11J9 i i OI/I i Ol/OI i Ol/OI; I3I i i t i;; 01/01 01/01 i i - - i; iI i Z JqsBtS i L aB4sl i ú.SaqSLJ L i------------------------------------------------------ --- j ULeWn4 i i; Jed uo.ooajuL,l saade sanor buLD leuo[aouoW i i ssDaBul xnvmLue,p aJqwou/slueALAans ap aaqwoN i sdao3L4uV; i i i L a ú aaqsa 3 ap sadj ounuijL saL eaiuoD I13 utewnq LeUO3iOUOW sdjo3L;ue,L Bp fpnaZDa;oad aj4je,L op OALA UL UOLiJpiSUOWO AI fV3qlVI zatqSLJ ap sadi ounuWWL sap SLA-2-SLA aZ3DL4}4UL StLW ú a ú JaaIsLj ap sad3ounwuIuL sap Da^e aLea9L sanaLLLe aed 3l1aas Lnb UOt:larUL aun,p SLA-P-SLA BAale3DLJuiLs la anbL4LD3ds uoj4DaoaOd aun neaAnou g anssu I3! sdloD uL,-L 'L fAI neaLqpB al ans qnbipuL amuo3 sinoC buLz quppuad xneuLue sat aAaasqo.uo a j a ú 'z JLaqSLJ, ap saqoDnos sap aed sqB3ajut luos sfl.nos ap sadnoa6 SaL aLLanbuL suep a3uaLJadxa apuoDas aun anl3a44a uo 'aLoDo3iod awmu al uvsLj; n u3 atjnow ed M uaSSiuL Lnas dIS np UI3SULULWp2 e uo slanbxne xnewlue saL SnoZ anbsind 'xnpwtup saL suep s9DoaCuL Si O'

9Z8ú6SZ

Les cellules IA2 en phase de croissance logarithmique sont mises en suspen-

sion dans un milieu HAT puis combinées ensuite aux cellules E-PBMC à raison de cinquante cellules IA2 par cellule E-PBMC. Le mélange de cellules est déposé sur quatorze plaques de microtitrage à raison de 200 pl soit 62 000 cellules/cupules par cupule. En 7 et 11 jours apres le dépôt sur plaques, on rajoute du milieu HAT neuf puis, au quinzième jour, on observe

que 100% des cupules contiennent des cellules de proliférantion.

Pour déterminer la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa, deux plaques d'antigènes sont utilisées, lesquelles contiennent:

(1) un mélange des immunotypes de Fisher de P. aeruginosa 1, (A.T.C.C.

n 27312, 27313); un mélange d'immunotypes 3, 5, 6 et 7 de Fisher de P. aeruginosa (A.T.C.C. n 27314, 27315, 27316, 27317 et 27318, respectivement); et (2) une plaque de microtitrage traitée par PLL ne contenant aucune

bactérie.

L'analyse des surnageants de la culture selon la méthode relative aux exemples précités conduit à l'identification d'environ 100 cupules qui contiennent les anticorps anti-P. aeruginosa réagissant avec les plaques

d'immunotypes 1 à 7 de Fisher mais non avec plaques de microtitrage trai-

tées par PLL ne contenant pas de bactéries. Afin d'identifier l'immunotype

ou les immunotypes de Fisher spécifique(s) reconnu(s), les plaques d'anti-

gènes sont préparées selon la méthode indiquée ci-dessus et chacune des rainures de ces plaques contient des bactéries fixées sur PLL d'un seul des immunotypes de Fisher. On effectue une ELISA ainsi qu'il est indiqué

ci-dessus avec le surnageant de culture de chacune des cupules anti-P. aeru-

ginosa disposées en colonne sur les nouvelles plaques d'antigènes ce qui permet d'identifier plusieures rainures contenant un anticorps spécifique

de l'immunotype 2 de Fisher. Pour analyser en outre la spécificité sérolo-

gique de l'anticorps immunotype de Fisher 2, les surnageants sont testés dans un test ELISA similaire sur des plaques d'antigènes préparées de facon à contenir chacune les soixante dix sérotypes IATS de P. aeruginosa dans des cupules séparées. Les résultats de cet essai montrent que la grande majorité des surnageants sont spécifiques du sérotype IATS il bien Qu'un surnageant, dans la cupule 6D6, présente un spectre de spécificité croisé

avec les sérotypes IATS 4, 11, 13 et 14.

Afin de déterminer si les schémas de réaction des sérotypes antiIATS 4, 11, 13 et 14 sont dus à un ou à plusieurs anticorps présents dans la cupule 6D6, les parties aliquotes supplémentaires de surnageant provenant de la cupule 6D6 sont indépendamment adsorbées par les sérotypes IATS 4, 7

Z593826

(témoin négatif), 11, 13 et 14, et les surnageants adsorbés sont testés alors sur une bactérie fixée sur le PLL de chacun des cinq sérotypes IATS selon le test ELISA précité. Les adsorptions sont mises en oeuvre par remise en suspension du culot de cellules bactériennes avec un volume égal de surnageant pendant une demi-heure sur de la glace, suivie d'une séparation du surnageant et des bactéries par centrifugation. Les résultats de cet essai montrent que les sérotypes IATS 4 et 11 adsorbent l'activité

d'anticorps dirigés contre chacun des autres, mais pas contre les séro-

types IATS 7, 13 et 14. Ceci démontre la présence d'au moins deux anticorps anti-P. aeruginosa différents dans la cupule 6D6, au moins l'un d'entre eux

ayant une réaction croisée avec les sérotypes IATS 4 et 11.

L'isolement et le clonage des cellules productrices d'anticorps convenables de la cupule 6D6 sont effectués en trois étapes. La première

étape implique une sub-culture à faible concentration fixée à 20 cellu-

les/cupule et est suivie par une autre étape de sub-culture de faible concentration (5 cellules/cupule) des cellules obtenues à partir d'une cupule positive de sérotypes anti-IATS 4 + 11 provenant du premier test de cellules/cupule de la sub-culture à faible concentration. Chaque test de sub-culture est exécuté sur des plaques à fond plat de 96 cupules, à la concentration précitée, en utilisant un volume total de 100 Il de milieu HAT

exempt du constituant aminoptérine (milieu HT). Des cellules lymphoblastoi-

des sensibles à HAT et non transformantes sont introduites dans chaque cupule à une concentration de 500 cellules/cupule en tant que cellules d'alimentation. Quatre jours postérieurement à la mise sur plaque, 100 Vl de milieu HAT sont ajoutés dans toutes les cupules pour détruire de façon sélective les cellules d'alimentation. Les cupules sont à nouveau alimentées au neuvième jour postérieur à la mise sur plaque par emplacement de la moitié du surnageant par du milieu HAT. Ensuite, les cupule sont alimentées de façon similaire tous les quatre à cinq jours, par un milieu HT jusqu'à ce que les cupules présentent une concentration de cellules lymphoblastoides suffisante pour l'analyse du surnageant par la méthode d'ELISA telle que

décrite ci-dessus.

Dans cet essai, les surnageants qui réagissent avec le sérotype IATS 4 réagissent également avec le sérotype IATS 11 et avec l'immunotype de Fisher 2. En outre, l'activité d'anticorps vis-à-vis des sérotypes IATS 13 et 14 est perdue, ce qui confirme les indications de spécificité précitées. Le clonage classique des cellules productrices d'anticorps spécifiques est mis en oeuvre, tout d'abord, par formation de plaques sur lesquelles les cellules sont déposées à très faible concentration (une par cupule, déterminée par calcul) dans des plaques de Terasaki de 72 cupules (Nunc 21-36538) en un volume de 10 Pl/cupule. Les plaques sont placées dans un incubateur pendant 3 heures pour que les cellules précipitent au fond de la plaque, puis sont analysées au microscope par deux personnes différentes pour ce qui concerne les cupules contenant une seule cellule. Chacune de ces cellules est indépendamment placée dans les cupules d'une plaque à fond rond de 96 cupules, contenant des cellules d'alimentation, et cultivée,

ainsi qu'il est indiqué ci-dessus, pour les sub-cultures à faible concen-

tration. Les surnageants de tous les clones produits sont testés par le

protocole d'ELISA précité et contiennent les sérotypes anti-IATS 4 et 11.

Par ce moyen, on obtient une lignée de cellules humaines transformée

par clonage qui croÂt en continu (qui est immortelle) et secrète un anti-

corps monoclone humain réagissant avec l'immunotype de Fisher 2 et à réactivité croisée avec les sérotypes IATS 4 et 11. Dans cet exemple, la lignée de cellules et l'anticorps qui sont produits portent les mêmes

désignations 6D6.

L'isotype de l'anticorps de la cupule 606 est déterminé dans un test d'ELISA similaire au tests de spécificité décrits ci-dessus, si ce n'est que le IgG antihumain de chèvre-HRP et le IgM antihumain de chèvre-HRP sont utilisés indépendamment en tant que deuxième réactif plutôt que d'être

combinés. La réaction positive de l'anticorps de la cupule 6D6 avec l'im-

munotype de Fisher 2 et les sérotypes IATS 4 et 11, est observée uniquement pour le réactif anti-IgM, ce qui montre la présence de l'isotype IgM de cet anticorps. La caractérisation biochimique des espèces moléculaires reconnues par l'anticorps 6D6 est effectuée par une analyse immunotache ainsi que décrit dans l'exemple III ci-dessus, si ce n'est que les préparations LPS à partir de l'immunotype de Fisher 2 et des sérotypes IATS 4 et 11 sont choisies en tant que préparations antigènes pour l'analyse. Une préparation LPS à

partir de l'immunotype de Fisher 1 est prévue en tant que témoin négatif.

Préalablement à l'analyse, chacune des préparations LPS brutes est diluée 1/1 dans un tampon de dissociation [0,125M Tris, 4% (p/v) sodium

dodécyl sulfate de sodium (SDS), 20% (v/v) glycérol, 10% (v/v) S-mercapto-

éthanol, 0,4% (p/v) bleu bromophénol, pH 6,8] et traitée par des ultrasons dans un bain pendant 5 minutes. Afin de dégrader les protéines de ces échantillons, la protéinase K (1 mg/ml dans H20) est ajoutée à chaque échantillon en un rapport pondéral de 40% (p/p) d'enzyme par rapport à LPS

25938Z6

incubée à 60 C pendant 2 heures, une étape de traitement sonique en bain étant effectuée pendant 5 minutes toutes les heures. Les échantillons

seront chauffés à 100 C pendant 5 minutes et centrifugés dans un micro-

centrifugeuse pendant 2 minutes.

Les échantillons clarifiés représentant 100 Ig de LPS de chacune des

souches bactériennes sont soumis à une électrophorèse sur gel de poly-

acrylamide SOS (SDS-PAGE) ainsi que décrit ci-dessus. Apres transfert des espèces de molécules séparées en NCM, celles-ci sont incubées pendant 2 heures à température ambiante dans 10 ml d'un surnageant d'une culture perdue d'une lignée de cellules 6D6. Le reste du procédé est tel que cidessus. Les résultats positifs sont notés uniquement dans les zones qui

contiennent de l'immunotype de Fisher 2, le sérotype IATS 4 ou le séro-

type IATS 11 LPS. Dans les zones correspondant à l'immunotype de Fisher 2 et au sérotype IATS 11, l'anticorps 6D6 reconnaît une courte série de molécules régulièrement espacées de poids moléculaire faible (formant une échelle), qui correspond précisément à formes plus petites de molécules LPS que l'on visualise par électrophorèse sur un gel de SOS-PAGE réalisée de la même façon dans laquelle les antigènes ne sont pas transférés en NCM, mais sont par contre spécifiquement révélés pour tester la présence de LPS, si ce n'est que la raie la plus basse du gel traité par l'argent (représentant la région formant le noyau plus le lipide A de LPS) n'est pas reconnue. Au contraire, dans la zone contenant le sérotype IATS 4 LPS, l'anticorps 6D6 reconnaît une grande série de raies régulièrement espacées, pratiquement sur la longueur totale du gel la réaction la plus intense se produisant les raies correspondant à un poids moléculaire élevé. Là encore, ce profilé correspond à une structure ayant l'aspect d'une échelle, observée dans les gels révélés spécifiquement pour tester le LPS (c'est-à-dire qu'ils se correspondent raie à raie), à l'exception que la raie corresondant au le noyau plus lipide A n'est pas reconnue. Ces données montrent de façon claire que la chaîne latérale sur l'O du LPS est la cible moléculaire reconnu par l'anticorps 6D6 sur l'immunotype de Fisher 2 et les sérotypes

IATS 4 et 11.

Pour déterminer la capacité protectrice in vivo de l'anticorps 6D6,

des études sur la protection animale sont mises en oeuvre sur les souris.

L'anticorps 6D6 est tout d'abord concentré à partir d'un surnageant d'une culture perdue par précipitation avec une solution saturée de sulfate d'ammonium (concentration finale 50%). Le matériau précipité est repris dans un volume minimum d'eau stérile, dialysé de façon extensive contre du I aaqStLJ ap adú%ounuuwtL, ap S^LA--sLA s2d sL2w Il S1I adú%ouas la 7 S1VI ad%4oaas 'Z aaqsLA ap adúlou -nwuwL,L ap LerrL saZ un,p SLA-P-SLA aALBe3L}LU6LS la anbLjLods uoLt;aioud aun aBj uoD 9g9 sdiooue,L 'A neatqu aL suep a9JuoL;Isa L[,nb LsuLv i SE i S/O i S/O i S/l i S/S i LSSD i i i il i i -i i S/S i S/O i S/S i S/O i II:9 i i i i i i i i S/S i Sh i S/S i S/O i 909 i i 5/S_ _ _i_ _ _ _ _ i S/S_ _ i S/0_ _ i_ _ _ _ _ _ i i i i i i i i il SIVI i i SJ i Z aauk i O BSL i------------------------------------------------------ i uenq i iaae;sal s de sano buLs i leUOlDOUOW se-saa xnwuLue,p aquiou/sueA^L^Ans ap aqwoN i sdJoDLlu i i i II la t SiVI sad o; gas SZ sap 3a z.au4si ap adÀ3ounuouL,L 3p SLA-e-SLA 909 ULUWnq jeuoloouow sdioDiLupt ap Jna;Dazoud -4a;Ja,L ap OALA UL UOLIeUISUOWaQ - A nV3i8Vú SlUe^Lns sal Zuos seZlnspu Seal slnoC bULD ap apotaad aun quepuad s^aiesqo quos xnewLue saL 'uaLaieDq qsa; al sQady Oz AI aLdwaxaL suep snssap-l aDogpapnb Lsute saaedgad;uos sauuatdagleq suoLsuadsns sal 'uawa^LDadsa. Il SIV! adú^;oas np no S1VI adiC4oaas np z uaqsiA ap adúzounwwL,L ap 'I Jaq4sLJ ap adA-ounLuL,L ap 0SQl 8 ZueuaBuoD sau^ALA saLBaDeq ap uosuadsns aun,p Lu ú'0 jed aLeauoI4adeiZuL aLoA d saLed; 4uawwepuadapuL;uos stanos buLD ap adnoa6 anbeqD ap saqwaua sal la SI sLpnos buLD ap sadnou6 aj;enb ua sasL^Lp-snos;sa sadnoj6 sitou. sap unDeqD pel. snld sainaq4 XLS -sjuaDuoo Ilg no L993 '9Q9 sdaoDtLu2,p LUI S'O ap (dL) aLeUOqLJadeulUL aLoA ued 'seaLnDouL ZuaWaLLanp^ALput.uos adnoa6 anbuqD ap sLanos sal salnoú unDeqD sLanos 6uLA ap sadnofi sLoJ; ua saas -LALp;UOS saBuIue6 z ge Oz;uesad JaBsqaM-sstMs SaLLaaW sLJnos sea 01 agaluaDuoD lsa 'II S1VI addoias np;a z aaqsj5 ap adR3ounuuL,L ap Sdl np anbtflbU ds uLeulnq LeUOLDOUOW sdaoDL;ue un ZuesLnpoid (Z9S8 1M3 Ou *3'31V) 159 auuolJsueJ3 sauLewnq saLnLlaD ap BaUBLL aun,p u- ua6eujns un, p anpaad ain;Ln3 Bun 'uLOWgl anb bue% ua 'aULePLLLS UOOej aB Àuoie2 aBfl el ap aalleal 4sa LaqSLJ ap adúZounuluLL ap Sdl np anbLJL4Dds ULewnq LeUOLDOUOw sdaoo;ue un;uestnpojd (ESLS 1uD Ou ' 3'1-V-L3S3) aauuoIsueP; SauLeWnq saLnLLaD ap aaU6LL a4lne aun,p anpJad wuea6euins ap aJnlLnD aun '4L3e6qu uLowg 3sa3 anb que 3 usLaLl9s uoDeB ap Ba;la la 'dlS ap

9298ú6SZ

EXEMPLE VI

L'exemple VI illustre une méthode de production d'un anticorps

monoclonal humain qui réagit avec les sérotypes IATS 6 et 13 et l'immuno-

type de Fisher 1 de P. aeruginosa. Le procédé décrit dans les exemples I à V est répété, si ce n'est qu'il est nécessaire de faire certaines modifica- tions pour isoler, caractériser et tester l'anticorps décrit dans cet exemple. On donne ci-dessous les modifications du procédé et les résultats

obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit dans la présente invention.

Les cellules humaines B proviennent d'un individu immunisé au prêa-

lable par une préparation de polysacharride à grand poids moléculaire isolée de l'immunotype de Fisher 2 (Pier et coll., Infect. Immun. (1981)

34, 461). Apres récupération des cellules E-PBMC, ainsi que décrit ci-

dessus, les cellules sont réfrigérées dans FCS contenant 10% (en volume) de DMSO par un réfrigérant à vapeur d'azote liquide. Ces cellules sont alors traitées rapidement & 37 C, lavées une fois dans un milieu d'Iscove et remises en suspension dans le milieu de HAT. La transformation surveillée des cellules est accomplie pour un rapport de 15 IA2 par cellule E-PBMC. Le mélange de cellules déposé sur des plaques pour 20 microtitrations à une concentration de 78 000 cellules/cupule. Les cultures sont alimentées tous les trois à cinq jours postérieurement à la mise sur plaques et au onzième

jour, on observe que 100% des cupules contiennent des cellules de prolifé-

ration.

Pour vérifier les surnageants quant à la présence d'anticorps anti-

P. aeruginosa à l'aide des techniques ELISA, la plaque d'antigènes est formée d'un mélange des immunotypes 1 à 7 de Fisher P. aeruginosa [isolat clinique PSA 1277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC 27317 et ATCC 27318, respectivement]. Le plaque pour microtitration traitée par PLL

sans bactérie est utilisée à titre de témoin.

L'analyse des surnageants de culture par la méthode précitée conduit à l'identification d'environ 200 cupules qui contiennent les anticorps antiP. aeruginosa réagissant avec la plaque des immunotypes 1 à 7 de Fisher, mais non avec la plaque traitée par PLL exempte de bactéries. Afin d'identifier ces cupules qui contiennent les anticorps réactifs vis-a-vis

d'un ou de plusieurs sérotypes IATS, les plaques d'antigènes sont prépa-

rées, ainsi qu'indiqué ci-dessus, dans lesquelles une colonne des plaques contient une bactérie fixée sur le PLL d'un seul sérotype IATS. On effectue le protocole ELISA, ainsi qu'indiqué ci-dessus, avec un surnageant provenant

d'une culture développée dans chacun des cupules contenant l'anti-P. aeru-

ginosa. Les surnageants sont placés dans la zone d'une nouvelle plaque d'antigènes et conduisent à l'identification d'un certain nombre de cupules

qui contiennent un anticorps réactif vis-a-vis de plusieurs sérotypes IATS.

Une cupule, désigné 8H7, contient les anticorps spécifiques des sérotypes IATS 6 et 13. Lorsque le surnageant de cette cupule est testé par le protocole ELISA sur les immunotypes de Fisher 7, ainsi que dans l'exemple V, on démontre que les anticorps de 8H7 sont spécifiques de l'immunotype de

Fisher 1. Afin de déterminer si le schéma de réaction des sérotypes anti-IATS 6 et

13 est dû à un ou à plusieurs anticorps dans la cupule 8H7, les parties aliquotes supplémentaires du surnageant sont indépendamment adsorbées sur les sérotypes IATS 6, 13 et 17 (test témoin), et les surnageants adsorbes

sont testés sur des bactéries fixées sur le PLL de chacun des trois séro-

types IATS selon le protocole ELISA indiqué ci-dessus. Les résultats montrent que les sérotypes IATS 6 et 13 adsorbent l'activité anticorps

vis-à-vis des autres. Le sérotype IATS 17 n'adsorbe pas d'activité vis-a-

vis de l'IATS 6 ou 13. Ce résultat montre que le schéma de réaction du

sérotype anti-IATS 6 et 13 est dû à un simple anticorps de la cupule 8H7.

L'isolement et le clonage des cellules productrices d'anticorps de la cupule 8H7 sont effectués en trois étapes, essentiellement ainsi qu'il est décrit dans l'exemple 5 ci-dessus. Par ces moyens, on obtient une lignée de

cellules humaines transformée par clonage qui croit en continu, c'est-à-

dire qui est immortelle et secrète un anticorps monoclonal humain réactif vis-à-vis de l'immunotype de Fisher 1 et présentant une activité croisée

vis-à-vis des sérotypes IATS 6 et 13. Dans cet exemple, la lignée cellu-

laire et l'anticorps qu'il produit portent la même désignation 8H7. A l'aide d'un procédé similaire à celui qui est décrit dans l'exemple V,

l'isotype de l'anticorps de la cupule 8H7 est déterminé comme étant IgM.

La caractérisation biochimique des espèces moléculaires reconnues par l'anticorps 8H7 est effectuée par analyse immunotache, ainsi que décrit dans les exemples III et V ci-dessus, si ce n'est que les préparations LPS de l'immunotype de Fisher 1 et des sérotypes IATS 6 et 13 sont choisies en tant que préparations antigènes pour l'analyse. Une préparation LPS du

sérotype IATS-10 est incluse en tant que contrôle négatif.

* L'analyse des immunotaches résultantes montre des résultats positifs uniquement pour les zones NCM qui contiennent l'immunotype de Fisher 1, le sérotype IATS 6 ou le sérotype IATS 13 LPS. Dans les zones de l'immunotype de Fisher 1 et les sérotypes IATS 6, l'anticorps 8H7 reconnait une série de raies régulièrement espacees (c'est-à-dire ayant l'aspect d'une échelle) sous-tendant pratiquement la totale longueur du gel. Ces raies correspondent précisément aux divers poids moléculaires des molécules LPS, ainsi que visualisé par électrophorèse sur un gel de SDS-PAGE préparé de même façon dans lequel l'antigène n'est pas transféré dans un NCM, mais au lieu de cela est spécifiquement révélé pour tester la présence de LPS. Dans la zone contenant le sérotype IATS 13 LPS, l'anticorps 8H7 reconnaît une série plus courte de raies régulièrement espacées confinées au domaine de poids moléculaire de la partie moyenne supérieure du gel. Là encore, les raies qui sont reconnues correspondent en position à celles qui sont observées dans un gel révélé pour tester spécifiquement le LPS, si ce n'est que les formes. correspondant aux poids moléculaire les plus faibles et les plus élevés de LPS dans le gel révélé n'apparaissent pas comme susceptibles d'être aisément reconnaissables dans la tache Western. Ces données indiquent de façon significative que le LPS est la cible moléculaire reconnu par l'anticorps 8H7 de l'immunotype de Fisher 1 et les sérotypes

IATS 6 et 13.

Pour déterminer la capacité de protection in vivo de l'anticorps 8H7, des études de protection sur animaux sont mises en oeuvre sur les souris, ainsi que décrit dans les exemples IV et V ci-dessus. En tant que contrôle témoin, le surnageant de la culture usée d'une autre lignée de cellules humaines transformées (6F11, ATCC n CRL 8652), produisant un anticorps monoclonal humain spécifique de LPS de l'immunotype de Fisher 2, est traité de la même façon. En tant que contrôle positif, le surnageant de la culture usee de la lignée de cellules humaines transformées C5B7 (ATCC n0 CRL 8753), produisant un anticorps monoclonal humain spécifique de LPS de l'immunotype

de Fisher 1 et du sérotype IATS 6, est utilisé.

Des souris femelles Swiss-Webster pesant entre 20 et 22 grammes sont divisées en trois groupes de trente souris chacun, toutes les souris de chaque groupe sont individuellement inoculees par voie intrapéritoneale par 0,5 ml d'anticorps 8H7, 6F11 et C5B7 concentres. Quatre heures plus tard, chacun de ces groupes est subdivisé en trois groupes de dix souris et les membres de chaque groupe de dix souris sont indépendamment traités par voie

intrapéritoneale par 0,3 ml d'une suspension de bactéries vivantes conte-

nant 9,4LD50 d'un représentant (A522) isolé du point de vue clinique du sérotype IATS 6 (équivalent A l'immunotype de Fisher 1), 5LD50 du sérotype

de référence IATS 13, ou 1OLD50 du sérotype de référence IATS 11 (équiva-

lent à l'immunotype de Fisher 2). Des suspensions bactériennes sont prépa-

rées ainsi que décrits ci-dessus dans l'exemple IV. Apres traitement bactérien, les animaux sont observés pendant une période de cinq jours. Les résultats sont les suivants:

TABLEAU VI

Démonstration in vivo de l'effet protecteur de l'anticorps monoclonal humain 8H7 vis-à-vis des sérotypes IATS 6 et 13 !! Anticorp Nombre de survivants/nombre d'animaux traités ! Anticorps;cinq jours après test avec monoclonal; humain, , 8H7 C5B7 6F11 IATS 6 IATS 13 ' IATS11 i

9/10! 6/10! 1/10!

9/10! 0/10! 0/10

I I! '

0/10! 2/10! 10/10!

!!! Ainsi que montré dans le tableau VI, l'anticorps 8H7 conduit à une protection spécifique et significative vis-à-vis -du test létal du sérotype IATS 6 mais pas vis-à-vis du sérotype IATS 11. La protection visà-vis du sérotype IATS 13 est plus faible mais peut être expliquée par le nombre relativement élevé d'organismes requis pour obtenir la LD50 pour cet isolat lorsqu'on le compare à l'isolat de sérotype 6 (unité formant des colonies de 3 x 107 et unité formant des colonies de 2,6 x 106 respectivement). Dans un essai distinct, l'anticorps 8H7 protège cinq des cinq souris traitées

par 3,5LD50 de l'isolat IATS 13 et cinq de cinq souris traitées par l'iso-

lat IATS 6.

De ce qui précède, on pourra apprécier que les lignées cellulaires selon la présente invention procurent des anticorps monoclonaux humains et des fragments de ceux-ci qui présentent une réactivité croisée et une protection croisée vis-à-vis de divers sérotypes de P. aeruginosa. Ceci permet la mise au point plus facile de compositions prophylactiques et thérapeutiques qui peuvent être efficaces contre les infections dues à la plupart, sinon à la totalité des souches de P. aeruginosa. En outre, les lignées cellulaires apportent des anticorps oui trouvent leur utilisation

dans les immuno-essais et dans d'autres modes opératoires bien connus.

Bien que la présente invention ait été décrite avec quelques détails à titre d'illustration et d'exemple pour faciliter la compréhension, il est évident que certaines modifications peuvent être pratiquées et entrent dans

le cadre des revendications jointes.

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Claims (13)

REVENDICATIONS

1.- Une composition comprenant un anticorps monoclonal humain ou fragment liant de celui-ci, cet anticorps ou fragment étant capable-de se

lier de façon spécifique à un grand nombre mais non à tous les séroty-

pes IATS de Pseudomonas aeruginosa.

2.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle ledit anticorps est capable d'apporter une protection in vivo contre au moins

deux sérotypes IATS.

3.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle ledit

anticorps est incapable de réagir avec tout immonutype de Fisher de Pseu-

domonas aeruginosa.

4.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle ledit

anticorps réagit avec un immunotype de Fisher de Pseudomonas aeruginosa.

5.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle ledit

anticorps est capable de réagir avec au moins deux immunotypes de Pseudo-

monas aeruginosa.

6.- Une composition pharmaceutique comprenant une composition selon

une quelconque des revendications i à 5 en association avec un support

pharmaceutiquement acceptable.

7.- Une lignée de cellule immortelle transformée sécrétant un anti-

corps monoclonal humain réagissant de façon spécifique avec-une partie et

au moins deux sérotypes IATS de Pseudomonas aeruginosa.

8.- Une lignée de cellule selon la revendication 7, désignée par les

références A.T.C.C.: CRL 8941, 9171 ou 9528.

9.- Un anticorps monoclonal humain susceptible de réagir avec un groupe déterminant réagissant avec un anticorps monoclonal produit par une

lignée cellulaire selon la revendication 8.

10.- Un kit à utiliser dans la détection de la présence de Pseudomonas aeruginosa, ce kit comprenant une composition d'anticorps monoclonal comprenant au moins un anticorps monoclonal, dans lequel cet anticorps réagit avec une partie, mais au moins deux, sérotypes IATS de Pseudomonas

aeruginosa, et des marqueurs procurant un signal détectable lié par cova-

lence à ces anticorps ou liés à des anticorps secondaires réagissant avec

chacun de ces anticorps monoclonaux.

11.- Une composition pharmaceutique convenant au traitement ou à la prévention d'infections dues au Pseudomonas aeruginosa, cette composition comprenant un anticorps monoclonal humain protecteur vis-à-vis d'au moins deux sérotypes IATS de Pseudomonas aeruginosa en association avec un agent

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antimicrobien, une fraction de gamma globuline d'immunoglobine de plasma

sanguin humain et/ou un support physiologiquement acceptable.

12.- Un procédé pour déterminer la présence de Pseudomonas aeruginosa dans un échantillon, qui consiste à combiner ledit échantillon avec un anticorps monoclonal réagissant vis-à-vis d'au moins deux sérotypes IATS de

Pseudomonas aeruginosa et à détecter la formation de complexe.

13.- Un procédé pour produire une composition pharmaceutique permet-

tant de traiter ou d'éviter des infections de Pseudomonas aeruginosa, ce procédé consistant à mélanger au moins deux anticorps monoclonaux, au moins un desdits anticorps étant protecteurs vis-à-vis d'au moins deux sérotypes de Pseudomonas aeruginosa, avec un agent antimicrobien, une fraction de

gamma globuline de plasma sanguin humain et/ou un support pharmaceutique-

ment acceptable.