CH677362A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf humane monoklonale Antikörper und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche enthalten. Sie sind nützlich zur Diagnose und Behandlung von bakteriellen Infektionen. Die Antikörper können mehrere Serotypen von Pseudomonas aeruginosa erkennen. 



  Die durch gram-negative Bakterien verursachten Leiden und ihre schwerwiegenden Komplikationen, z.B. Bakteriämie und Indotoxämie sind die Ursache von ernsthaften Krankheiten und am Tod von humanen Patienten. Dies trifft im besonderen auf den gram-negativen Organismus pseudomonas aeruginosa zu, welcher zunehmend bei bakteriellen Infektionen, insbesondere bei Nosocomialinfektionen, während der letzten 50 Jahre, auftritt. 



  Für die Bekämpfung von gram-negativen Leiden waren in den letzten Jahrzehnten die Antibiotika die Therapie der Wahl. Die fortgesetzten schweren Erkrankungen und die hohe Mortalität, die im Zusammenhang mit Leiden, die durch gram-negative Bakterien hervorgerufen werden, zeigt jedoch die Grenzen der antibiotischen Therapie, insbesondere bezüglich p. aeruginosa (siehe z.B. Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94: 196-199). Dies hat die Suche nach alternativen Methoden der Prävention und der Behandlung bewirkt. 



  Ein Verfahren, welches in Betracht gezogen wurde, ist die Verbesserung des Immunsystems des Wirts durch aktive oder passive Immunisierung. Es ist beispielsweise beobachtet worden, dass die aktive Immunisierung von Menschen oder Versuchstieren mit Ganzellvaccinen oder gereinigten, bakteriellen Endotoxinen von p. aeruginosa zur Entwicklung von spezifischen, opsonischen Antikörpern führt, die in erster Linie gegen Determinanten der wiederholten Oligosaccharideinheiten der Lipopolysaccharid-(LPS)-Moleküle gerichtet sind, die an der äusseren Zellmembrane von p. aeruginosa lokalisiert sind (s. Pollack, M., Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B.M. und Finlayson, J.S., Herausgeber, Seiten 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979).

  Solche Antikörper, ob sie nun aktiv hervorgerufen wurden oder passiv transferiert wurden, zeigten sich als protektiv gegen die lethalen Effekte von p. aeruginosa-Infektion in zahlreichen Tiermodellen (Pollack, supra) und in einigen Voruntersuchungen mit Menschen (s. Young, L.S. und Pollack, M., pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., Herausgeber, Seiten 119-132, Hans Huber 1980). Von besonderer Wichtigkeit ist überdies bei der Rolle dieser Antikörper im Menschen die Erkenntnis, dass bei Patienten mit p. aeruginosa-Bakteriämie eine Verbindung zwischen dem Überleben und dem hochakuten Serumtiter der Antikörper gegen LPS-Moleküle des infiszierenden Stammes besteht (s. Pollack, M. und Young, L.S., J. Clin. Invest., 63: 276-286 (1979)). 



  Die obigen Berichte schildern, dass der immuno-therapeutische Zugang zur Prävention und Behandlung von bakteriellen Leiden, die durch p. aeruginosa verursacht werden, verwendet werden könnte, indem beispielsweise gepoolte, humane Immunoglobuline mit Antikörpern gegen den infis zierenden Stamm, bzw. die infiszierenden Stämme verabreicht würden. Die humanen Immunoglobuline sind in der vorliegenden Beschreibung so definiert, dass sie einen Teil des fraktionierten, humanen Plasmas umfassen, welches an Antikörpern, unter welchen sich ebenfalls die spezifischen Antikörper gegen p. aeruginosa befinden, angereichert ist. Wegen verschiedener Begrenzungen, die der Verwendung von humanen Immunoglobulin-Zusammensetzungen eigen sind, wird dieser Zugang für die Behandlung von p. aeruginosa-Leiden weiter erforscht (s. z.B. Collins, M.S. und Roby, R.E., Am. J.

  Med., 76 (3A): 168-174 (1984)) und so sind bis jetzt noch keine kommerziellen Produkte erhältlich, worin diese Komponenten verwendet werden. 



  Eine solche Einschränkung im Zusammenhang mit Immunoglobulin-Zusammensetzungen besteht darin, dass sie aus Pools von Proben von 1000 oder mehr Spendern zusammengesetzt sind, wobei die Proben aufgrund der Gegenwart von besonderen Anti-pseudomonas-Antikörpern vorselektioniert worden sind. Dieses Poolen führt zu Mittelwerten von einzelnen Antikörpertitern, wobei bestenfalls bescheidene Zunahmen des resultierenden Titers des gewünschten Antikörpers erhalten werden. 



  Eine andere Einschränkung besteht im Vorselektionsverfahren selbst, welches ein intensives, kontinuierliches Auswahlverfahren des Donorpools zur Sicherung der Konsistenz des Produktes verlangt. Ungeachtet dieser Anstrengungen können Immunoglobulinprodukte von Batch zu Batch und unter Produkten von verschiedenen geographischen Gegenden beträchtlich variieren. 



  Eine weitere Einschränkung, welche den Immunoglobulin-Zusammensetzungen noch eigen ist, besteht darin, dass ihre Ver wendung mit der gleichzeitigen Verabreichung von grossen Mengen von fremden, proteinhaltigen Substanzen verbunden sind (welche Viren enthalten können), wie diejenigen, wie kürzlich gezeigt wurde, die im Zusammenhang mit dem Acquired Immune Deficiency Syndrome oder AIDS stehen, welche möglicherweise schädliche biologische Wirkungen ausüben können. Die Kombination von niederen Titern der gewünschten Antikörper und des hohen Gehaltes von fremden Substanzen kann den Anteil des dem Patienten verabreichbaren, spezifischen und demzufolge heilsamen Immunoglobulins häufig auf Werte begrenzen, die unterhalb der optimalen Spiegel liegen. 



  Es gibt in der Literatur eine Anzahl von Schemen von Serotypen, die nützlich sind für die Analyse von pseudomonas aeruginosa-Infektionen. Die Schemen basieren in erster Linie auf den wichtigsten hitzestabilen, somatischen Antigenen dieser Organismen (s. Zierdt, C.H., in Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G.L., Herausgeber, CRC Press, Seiten 213-238 (1978). Das starke Wachstum des Serogruppen-Schemas macht die serologischen Studien von p. aeruginosa im Vergleich eher schwierig und demzufolge scheint die Wahl jedes vorgegebenen Systems zum Zweck der Auswahl der Überstände etwas willkürlich.

  Die Konfusion zwischen den verschiedenen Typenbestimmungsarten wurde kürzlich durch die Schaffung des International Antigenic Typing Scheme (IATS) system klargestellt, welches durch das Subkommitee für Pseudomonadaceae des Internationalen Kommitees für systematische Bakteriologie als Rückgrat für weitere serologische Studien von p. aeruginosa vorgeschlagen wurde. In diesem System sind 17 verschiedene Serotypen mit der Bezeichnung IATS-Typ 1, IATS-Typ 2, usw. vorgesehen, wobei sämtliche hitzestabile, somatische Hauptantigene umfasst werden, die nach früheren Sys temen identifiziert werden (s. Liu, P.V., Int. J. Syst. Bacteriol., 33: 256-264 (1983)). Bei der Entwicklung von protektiven, monoklonalen Antikörpern, die kreuzreaktiv gegenüber p. aeruginosa-Stämmen sind, ist es vorteilhaft ein Bestimmungsschema einzuschliessen, welches auf den protektiven Antigenen von p. aeruginosa beruht.

   Ein solches Schema ist mit der Absicht ausgedacht worden, eine Vaccine für den klinischen Gebrauch zu entwickeln, und ist im einzelnen in Fisher, M.W. et al., J. Bacteriol., 98: 835-836 (1969) beschrieben. Dieses System, welches normalerweise als Fisher-Bestimmungssystem (Fisher typing system) bezeichnet wird, klassifiziert die Mehrheit der bekannten p. aeruginosa in sieben Arten, die als Fisher-Immunotyp 1, Fisher-Immunotyp 2, usw. bezeichnet werden. Die Korrelation zwischen dem IATS und dem Fisher-Bestimmungssystem ist klargestellt worden (s. Liu, P.V., et al., supra) und ist in der Tabelle I angegeben. Wie in Tabelle I angegeben, bestehen keine entsprechenden Fisher-Immunotypen für gewisse IATS-Serotypen, obschon jeder Fisher-Immunotyp einem gewissen IATS-Serotyp entspricht.

  Im IATS- wie auch im Fisher-Bestimmungssystem wird angenommen, dass die für beide Bestimmungssysteme des Serotyps relevanten Antigen-Determinanten sich auf den Oberflächen-LPS-Molekülen von p. aeruginosa befinden (Liu, P.V. et al., supra; Hanessian, F., et al., Nature, 229: 209-210 (1979)). 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle I 
<tb>Head Col 01 to 02 AL=L: Vergleich und Korrelation des IATS- und des Fisher-Bestimmungsschemas für pseudomonas aeruginosa 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>IATS: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Fisher: 
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  1975 schilderten Köhler und Milstein in ihrer fruchtbaren Entdeckung, dass gewisse Mäusezellinien mit Mäusemilzzellen verschmelzen konnten, wobei die Hybridome geschaffen wurden, wobei jedes dieser Zellen Antikörper einer einzelnen Spezifi tät, d.h. monoklonale Antikörper ausschied (Köhler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495-497 (1975)). Mit der Ankunft dieser Technologie ist es möglich geworden, in einigen Fällen grosse Mengen von Mäuse-Antikörpern zu erhalten, die eine vorzügliche Spezifität zu einer oder mehreren Determinanten an Antigenen aufweisen.

  Solche monoklonalen Mäuseantikörper oder Zusammensetzungen von solchen Antikörpern können jedoch für den Gebrauch bei Menschen einen Hauptnachteil aufweisen, insbesondere im Licht der Erkenntnis, dass monoklonale Mäuseantikörper bei ihrer Verwendung in Versuchsstudien für die Behandlung von gewissen menschlichen Krankheiten eine Immunantwort hervorrufen, welche sie unwirksam macht (Levy, R.L. und Miller, R.A., Ann. Rev. Med. 34: 107-116 (1983)). 



  Sadoff et al. schilderten, dass bei der Verwendung der Hybridom-Technologie, die Produktion eines monoklonalen Mäuse-Antikörpers der IgM-Klasse beobachtet wurde, der gegen eine Determinante an der O-Seitenkette des LPS-Moleküls eines besonderen Serotyps von p. aeruginosa gerichtet war (Zusammenfassungen der Interscience Conference on Antimicrobial Agens and Chemotherapy, 1982, Nr. 253). Sie schilderten im weiteren, dass dieser Mäuse-Antikörper die Mäuse gegen die lethale Herausforderung von p. aeruginosa des gleichen Serotyps, wie derjenige, gegen welchen die Antikörper gerichtet waren (d.h. des homologen Serotyps) schützte. Verschiedene nachfolgende Artikel haben die Entwicklung von monoklonalen Anti-p.aeruginosa-LPS-Antikörpern von Mäusen und Menschen mit verschiedener Spezifität im einzelnen geschildert; z.B.: Sawada, S., et al., J. Inf.

  Dis., 150: 570-576, (1984); Sadoff, J., et al., Antibiot. Chemother., 36: 134-146 (1985). Hancock, R., et al., Infect. Immun. 37: 166-171 (1982); Siadak, A.W. und Lostrom, M.E., in Human Hybridomas  and Monoclonal Antibodies, Engleman, E.G., et al., Herausgeber, Seiten 167-185, Plenum Publishing Corp. (1985) und Sawada, S. et al., J. Inf. Dis., 152: 965-970 (1985). Die Herstellung und die immunotherapeutische Anwendung von humanen, monoklonalen serotypen-spezifischen Anti-p.aeruginosa-LPS-Antikörpern sind in den pendenten US-Anmeldungen 734 624 und 828 005 offenbart. 



  Während gewisse Vorteile für die Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen einen spezifischen IATS-Serotyp von p. aeruginosa in einigen Situationen, wie beispielsweise, wenn eine Infektion einem einzelnen Serotypen zugeschrieben wird, bestehen mögen, werden sie in vielen anderen Situationen nicht bevorzugt. Beispielsweise bei der prophylaktischen Behandlung für mögliche Infektionen bei Menschen ist es vorteilhaft, einen humanen Antikörper oder Antikörper zu verabreichen, die einen Schutz gegen eine Mehrzahl von IATS-Serotypen bewirken. In ähnlicher Weise wird bevorzugt, bei therapeutischer Anwendung, wo der Serotyp, bzw. die Serotypen, des Infektionsstammes, bzw. der Infektionsstämme, nicht bekannt ist, bzw. sind, einen oder mehrere humane Antikörper, die gegen die meisten, wenn nicht gegen alle der klinisch wichtigen p. aeruginosa-IATS-Serotypen gerichtet sind, zu verabreichen.

  Während theoretisch eine Kombination von monoklonalen, humanen Antikörpern, von denen jeder gegen einen einzelnen IATS-Serotyp von p. aeruginosa spezifisch wäre, zum Schutz gegen die verschiedenen Serotypen formuliert werden könnte, wäre eine solche Zusammensetzung schwierig zu entwickeln und vom Herstellerstandpunkt unökonomisch zu produzieren. 



  Demzufolge besteht ein deutliches Bedürfnis nach humanen, monoklonalen Anti-p. aeruginosa-Antikörpern, die fähig sind,  verschiedene IATS-Serotypen von p. aeruginosa zu erkennen und gegen sie zu schützen. Weiter sollten diese Antikörper für prophylaktische Verwendungen und therapeutische Behandlungen von p. aeruginosa-Infektionen zweckmässig sein. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderungen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein humaner, monoklonaler Antikörper oder ein Bindungsfragment davon gemäss der Definition im Anspruch 1. 



  Es werden auch neue Zellinien zur Verfügung gestellt, welche monoklonale, humane Antikörper herstellen können, welche spezifisch mit LPS-Molekülen einer Mehrzahl, jedoch nicht von allen, IATS-Serotypen von p. aeruginosa reagieren können. Diese Antikörper besitzen verschiedene Reaktivitäten mit Fisher-Immunotypen, Bindungen mit Null, einem oder mehreren von Immunotypen. Durch Anwendung einer Zusammensetzung, enthaltend mindestens einen humanen, monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon, welches fähig ist, mit p. aeruginosa IATS-Serotypen eine Kreuzreaktion einzugehen, können infektionsempfindliche Menschen oder schon bereits durch eine durch p. aeruginosa verursachte Infektion befallene Patienten prophylaktisch oder therapeutisch behandelt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise ebenfalls einen physiologisch annehmbaren Träger.

   Die Zusammensetzung kann einen oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten: zusätzliche humane, monoklonale Antikörper, welche fähig sind, mit p. aeruginosa flagella, Exotoxin A oder mit einem anderen Serotypen oder einen Immunotypen-Determinanten an der LPS von p. aeruginosa zu reagieren; eine  gamma -Globulinfraktion aus humanem Blutplasma; eine  gamma -Globulinfraktion von humanem Blutplasma, wobei das Plasma von Menschen gewonnen wurde, welche einen erhöhten Spiegel von gegen p. aeruginosa reaktiven Immunoglobulinen aufweisen und eines oder mehrere antimikrobielle Mittel. 



  Erfindungsgemäss werden neue Zellen zur Verfügung gestellt,  welche fähig sind, humane, monoklonale Antikörper zu produzieren, und Zusammensetzungen, welche solche Antikörper enthalten, wobei die Zusammensetzungen fähig sind, selektiv mindestens eine Mehrzahl und in einigen Fällen sämtliche p. aeruginosa-Stämme zu erkennen, wobei die individuellen Antikörper typischerweise mehrere IATS-Serotypen und Null, einen oder mehrere Fisher-Immunotypen von p. aeruginosa erkennen können. Die Hauptzellen besitzen identifizierbare Chromosomen, worin die Keimlinien DNA davon oder von Vorläuferzellen rearrangiert worden sind, um einen Antikörper zu decodieren, der ein Bindungszentrum für ein Epitop aufweist, welches gewissen p. aeruginosa-Serotypen gemein ist. Diese monoklonalen, humanen Antikörper können in einem breiten Gebiet angewandt werden, einschliesslich der Diagnose und Therapie (z.B.

  Schutz in vivo). Typischerweise sind die erfindungsgemässen Zellen transformierte, humane Lymphozyten, welche protektive, humane, monoklonale Antikörper produzieren zu erreichbaren LPS-Molekülen von p. aeruginosa. Durch "erreichbar" wird verstanden, dass die LPS-Moleküle in der Umgebung physikalisch für die direkte Wechselwirkung mit dem monoklonalen Antikörper zugänglich sind. Die monoklonalen Antikörper, welche auf diese Weise zur Verfügung gestellt werden, sind nützlich für die Behandlung oder Prophylaxe von ernsthaften Leiden, welche durch p. aeruginosa hervorgerufen werden. Die LPS-Moleküle von der äusseren Membrane der p. aeruginosa wären für den direkten Kontakt durch die Antikörpermoleküle erreichbar und würden demzufolge die komplement-vermittelte Lyse und/oder Phagocytose des Organismus erleichtern.

  Weiter wären diejenigen LPS-Moleküle, welche von der äusseren Membrane in die umliegende Umgebung abgegeben werden, ebenfalls zum Eingehen von direkten Wechselwirkungen mit den Antikörpermolekülen frei und würden durch das reticuloendotheliale System entfernt. 



  Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann durchgeführt werden, indem die Expression der Nukleinsäuresequenzen, welche die Antikörper spezifisch für ein Epitop an den LPS-Molekülen der verschiedenen Serotypen von p. aeruginosa codiert, immortalisiert wird. Typischerweise werden die monoklonalen Antikörper durch eine zellgetriebene Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformation von B-Lymphocytenzellen aus humanen Donoren erhalten, welche einen oder mehrere zweckmässige Serotypen von p. aeruginosa ausgesetzt waren, hergestellt. Die so erhaltenen Antikörper sekretierenden Zellinien sind durch kontinuierlich wachsende Lymphoblastoidzellen charakterisiert, welche einen diploiden Karyotyp besitzen und sind Epstein-Barr-Antigen-positiv und scheiden einen der Antikörper des IgG, IgM, IgA oder IgD-Isotyps aus, einschliesslich verschiedener Subtypen, wie IgGl, IgG2, IgG3 und IgG4.

  Die zellgetriebenen Transformationsverfahren selbst sind im einzelnen im US-A 4 464 465 beschrieben. Die monoklonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente, wie als Fv, Fab, F(ab min )2 verwendet werden, jedoch normalerweise intakt und hergestellt in Übereinstimmung mit dem bekannten Verfahren des Standes der Technik. Beispiele von humanen Lymphoblastoid-Zellen wurden am 11. August 1985, 8. August 1986 bzw. am 11. April 1986 bei der American Type Culture Collection, 12 301 Postlawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, USA, hinterlegt. Sie tragen die ATCC-Nrn. CRL 8941, 9171 bzw. 9258. 



  In alternativer Weise können Zellinien, welche die Antikörper herstellen durch Zellfusion zwischen zweckmässigen drogenmarkierten, humanen Myelomen, Mäusemyelomen, Human-Mäuseheteromyelomen oder humanen Lymphoblastoidzellen mit humanen B-Lymphocyten hergestellt werden, wobei Hybridzellinien erhalten werden. 



  Die erfindungsgemässen Zellinien können noch für andere Verwendungszwecke eingesetzt werden, als für die direkte Herstellung von humanen, monoklonalen Antikörpern. Die Zellinien können mit anderen Zellen verschmolzen werden (beispielsweise wie zweckmässige drogenmarkierte, humane Myelome, Mäusemyelome, Human-Mäuseheteromyelome oder humane Lymphoblastoidzellen), um Hybrodome herzustellen, welche demzufolge für den Transfer von Genen dienen können, welche die monoklonalen Antikörper codieren. Alternativ können die Zellinien als Quelle für Chromosomen verwendet werden, welche die Immunoglobuline codieren, die von der Fusion verschiedenen Techniken isoliert und zu Zellen transferiert werden können.

  Zusätzlich können die Gene, welche die monoklonalen Antikörper codieren, isoliert und gemäss der rekombinanten DNA-Technik für die Herstellung von spezifischen Immunoglobulinen in einer Vielzahl von Wirten eingesetzt werden. Insbesondere kann durch Herstellung von cDNA-Bibliotheken aus Messenger-RNA ein einzelnes cDNA-Klon, welches das Immunoglobulin codiert und frei von Intronen ist, isoliert werden und in zweckmässige prokaryotische oder eukaryotische Expressions-Vektoren verpflanzt und anschliessend in einem Wirt für eine letzte Massenproduktion transformiert werden kann. 



  Die Lymphoblastoid- oder Hybridzellinien können gemäss üblichen Techniken geklont und einem Screening unterworfen werden mit Anitkörpern, welche fähig sind, die Epitope von verschiedenen p. aeruginosa-IATS-Serotypen und Fisher-Immunotypen, welche in den Zellüberständen nachgewiesen werden, zu binden. Unter Verwendung der erfindungsgemässen Antikörper als Blockierungsantikörper beim Screening, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren, können zusätzliche monoklonale Antikörper, welche die gleichen Antigen-Determinanten oder Epitope erkennen, leicht isoliert werden. 



   Erfindungsgemäss werden  humane, monoklonale Antikörper zur Verfügung gestellt, welche fähig sind, Lipopolysaccharid-Determinanten, die an der Mehrzahl, jedoch nicht bei allen, der IATS-Serotypen von p. aeruginosa vorhanden sind, spezifisch zu binden. Diese Determinanten können beispielsweise an zwei oder drei IATS-Serotypen und bei keinen, bei einem oder mindestens zwei Fisher-Immunotypen vorhanden sein. Solche Antikörper können in vivo gegen einige oder sämtliche der bekannten Serotypen oder Immunotypen, typischerweise gegen zwei oder mehr Serotypen protektiv sein. 



  Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können ebenfalls eine grosse Vielfalt an Verwendungen in vitro finden. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur Identifizierung, zur Isolierung von spezifischen p. aeruginosa-Stämmen oder für die selektive Entfernung von p. aeruginosaZellen in heterogenen Zellmischungen verwendet werden. 



  Für diagnostische Zwecke können die monoklonalen Antikörper markiert oder unmarkiert eingesetzt werden. Typischerweise bringen es die diagnostischen Assays mit sich, dass die Bildung eines Komplexes durch Bindung des monoklonalen Antikörpers an das LPS des p. aeruginosa-Organismus nachgewiesen werden muss. In unmarkierter Form finden die Antikörper Verwendung im Agglutination-Assay. Zusätzlich können die unmarkierten Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern verwendet werden (zweite Antikörper), welche mit den monoklonalen Antikörpern reaktiv sind, wie spezifische Antikörper für Immunoglobulin. Alternativ können die monoklonalen Antikörper direkt markiert werden. Es kann ein grosser Bereich an Labels eingesetzt werden, wie z.B. Radionuklide, Fluoreszensfarbstoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren oder Liganden (insbesondere Haptene). 



  Zahlreiche Typen von Immuno-Assays sind bekannt, wobei beispielsweise auf diejenigen verweisen wird, welche in den folgenden Patentschriften beschrieben sind: US-A 3 817 827; US-A 3 850 752; USA-A 3 901 654; US-A 3 935 074; US-A 3 984 533; US-A 3 996 345; US-A 4 034 074; und US-A 4 098 876. 



  Im allgemeinen werden die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper in Enzym-Immuno-Assays verwendet, worin die Haupt-Antikörper oder die zweiten Antikörper einer anderen Art mit dem Enzym konjugiert werden. Enhält eine Probe p. aeruginosa eines bestimmten Serotyps, z.B. humanes Blut oder ein Lysat davon, wird dieses mit dem Haupt-Antikörper kombiniert, wobei eine Bindung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen, welche das gewünschte Epitop aufweisen, entsteht. Solche Zellen können dann von den ungebundenen Reagenzien abgetrennt werden, und es kann ein zweiter Antikörper (mit einem Enzym markiert) zugesetzt werden. Danach wird die Gegenwart des Antikörper-Enzymkonjugats, welches an die zu bestimmenden Zellen gebunden ist, bestimmt. Andere übliche Techniken sind in der Fachwelt wohlbekannt und können ebenfalls verwendet werden. 



  Es werden ebenfalls Reagenziensätze zur Verfügung gestellt für die Verwendung mit den Haupt-Antikörpern für den Nachweis von p. aeruginosa-Infektionen oder die Gegenwart von p. aeruginosa-Antigen. Demzufolge liegt die hauptsächliche erfindungsgemässe Antikörper-Zusammensetzung üblicherweise in lyophilisierter Form, entweder allein oder in Konjugation mit anderen Antikörpern, die gegen andere gram-negative Bakterien spezifisch sind, vor. Die Antikörper, welche mit einem Markierungsmittel konjugiert oder unkonjugiert sein können, sind in der Ausrüstung, zusammen mit Puffern, wie Tris-, Phosphat oder Carbonatpuffern, Stabilisatoren, Biociden, inerten Pro teinen, z.B. bovinem Serumalbumin oder ähnlichem enthalten.

  Im allgemeinen sind diese Materialien in einem Anteil von weniger als 5 Gew.-% auf Basis des aktiven Antikörpers vorhanden und üblicherweise in einem Anteil von mindestens etwa 0,001 Gew.-% wiederum auf Basis der Antikörper-Konzentration vorhanden. Häufig ist es wünschenswert, einen inerten Zuschlagstoff oder einen Excipienten zu verwenden, um die aktiven Bestandteile zu verdünnen, wobei die Excipienten in einem Anteil von 1-99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorhanden sein können. Falls ein zweiter Antikörper vorhanden ist, der fähig ist, den monoklonalen Antikörper zu binden, wird dieser üblicherweise in einer weiteren Ampulle beigegeben. Der zweite Antikörper ist typischerweise mit einem Markierungsmittel konjugiert und in analoger Weise formuliert, wie es oben für die Antikörper-Formulierungen angegeben ist. 


 Pharmazeutische Formulierungen und Verwendung 
 



  Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können als Komponenten von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, die einen therapeutischen oder prophylaktischen Anteil mindestens eines erfindungsgemässen Antikörpers zusammen mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Ein pharmazeutischer Träger sollte eine allgemein verträgliche, nichttoxische Substanz sein, die geeignet ist, die monoklonalen Antikörper dem Patienten zu übertragen. Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können als Träger verwendet werden. Pharmazeutisch annehmbare Zusätze (puffernde Mittel, Dispergiermittel) können ebenfalls der pharmazeutischen Zusammensetzung zugesetzt werden. Solche Zusammensetzungen können einen einzelnen monoklonalen Antikörper enthalten, welcher für zwei  oder mehr, jedoch nicht für alle IATS-Serotypen von p. aeruginosa spezifisch ist.

  In alternativer Weise kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zwei oder mehr monoklonale Antikörper enthalten, um ein "Cocktail" zu bilden. Ein Cocktail, welches beispielsweise einen humanen, monoklonalen Antikörper gegen Gruppen von verschiedenen p. aeruginosa-Serotypen und -Immunotypen enthält, wäre ein universelles Produkt, welches eine Aktivität gegen die grösste Mehrheit von klinischen Isolaten von diesem besonderen Bakterium besitzt. 



  Von Interesse sind prophylaktische und/oder therapeutische monoklonale Antikörper-Zusammensetzungen, welche fähig sind, mit mindestens drei IATS-Serotypen zu reagieren, normalerweise mit mindestens vier und mehr, üblicherweise mit mindestens fünf IATS-Serotypen. Von besonderem Interesse sind monoklonale Antikörper-Zusammensetzungen, die mit mindestens etwa sieben vorzugsweise mit mindestens etwa 10 bis 14 und bis zu den gesamten siebzehn IATS-Serotypen reagieren. In Konjugation mit diesen IATS-Serotypen reagieren die Zusammensetzungen gewünschtenfalls mit mindestens einer, normalerweise mit mindestens zwei und in der Regel mit mindestens drei oder vier und bis zu den gesamten sieben Immunotypen des Fisher-Immunobestimmungssystems. 



   Jede der Zusammensetzung umfasst mindestens einen, üblicherweise mindestens zwei und in der Regel mindestens drei Antikörper oder mehr, wobei jeder Antikörper mit mindestens zwei, drei, vier oder mehr, jedoch nicht mit allen IATS-Serotypen reagiert. Gewünschtenfalls bindet mindestens ein monoklonaler Antikörper mit mindestens zwei IATS-Serotypen und einem oder mehreren Fisher-Immunotypen, bevorzugt mit mindestens zwei Immunotypen. 



  Gewünschtenfalls ist die gesamte Anzahl der monoklonalen Antikörper in der Zusammensetzung mindestens eins und gleich oder weniger als etwa die Hälfte der gesamten Anzahl der IATS-Serotypen, mit welchen die Zusammensetzung reagiert, häufig ein Drittel dieser Anzahl. 



  Das Mol-Verhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörperkomponenten unterscheidet sich in der Regel nicht mehr als durch einen Faktor 10, üblicherweise durch nicht mehr als einen Faktor 5 und liegt in der Regel bei einem Mol-Verhältnis von etwa 1:1 bis 2 zu jeder der anderen Antikörper-Komponenten. 



  Die erfindungsgemässen humanen, monoklonalen Antikörper, können ebenfalls in Kombination mit anderen monoklonalen Antikörperzusammensetzungen oder mit existierenden Blutplasma-Produkten verwendet werden, wie beispielsweise kommerzielle  gamma -Globulin- und -Immunoglobulin-Produkte, welche zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von p. aeruginosa-Leiden bei Menschen verwendet werden. Vorzugsweise wird für Immunoglobuline das Plasma von Spendern gewonnen, die einen erhöhten Spiegel an Immunoglobulinen aufweisen, die reaktiv mit p. aeruginosa sind. Siehe hierzu das Compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med., 76 (3a), 30. März 1984, Seiten 1-231. 



  Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können als separat verabreichte Zusammensetzungen verwendet werden und zusammen mit Antibiotika oder antimikrobiellen Mitteln verabreicht werden. Typischerweise können die antimikrobiellen Mittel ein anti-pseudomonales Penicillin enthalten (z.B. Carbenicillin) zusammen mit einem Aminoglykosid (z.B. Gentami cin oder Tobramicin), es sind jedoch noch andere zahlreiche Mittel (z.B. Cephalosporine) bekannt, welche ebenfalls eingesetzt werden können. 



  Die humanen, monoklonalen Antikörper und die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche sie enthalten, sind insbesondere nützlich für die orale oder parenterale Verabreichung. Vorzugsweise können die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht werden, d.h. subcutan, intramuskulär oder intravenös. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung zur Verfügung, welche eine Lösung des humanen, monoklonalen Antikörpers oder ein Cocktail davon, das in einem annehmbaren Träger aufgelöst ist, vorzugsweise in einem wässrigen Träger, enthalten. Es kann eine Vielzahl von wässrigen Trägern verwendet werden, beispielsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung oder 0,3% Glycin. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von partikelförmigem Material.

  Die Zusammensetzungen können durch übliche Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, wie sie erforderlich sind zur Annäherung an physiologische Bedingungen, wie pH-Korrigenzien, Puffersubstanzen und Toxizitätseinstellungsmittel, wie beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid oder Natriumlactat. Die Konzentration von Antikörpern in diesen Formulierungen kann in einem weiten Bereich variieren, d.h. von weniger als 0,5% üblicherweise oder mindestens etwa 1% bis 15 oder 20 Gew.-% und wird in der Regel an das Flüssigkeitsvolumen, die Viskosität usw. und vorzugsweise an die besondere ausgewählte Verabreichungsart angepasst. 



  Demzufolge könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intramuskuläre Verabreichung bis zu 1 ml steriles, gepuffertes Wasser und 50 mg des monoklonalen Antikörpers enthalten. Eine typische Zusammensetzung für die intravenöse Infusion könnte 250 ml sterile Ringerlösung und 150 mg des monoklonalen Antikörpers enthalten. Die gegenwärtigen Verfahren für die Herstellung von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen ist den Fachleuten bekannt und ist im einzelnen beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Science", 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), beschrieben. 



  Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können für die Lagerung gefriergetrocknet werden und mittels eines zweckmässigen Trägers kurz vor dem Gebrauch rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich bei den konventionellen Immunoglobulin-Präparaten als wirksam erwiesen und es können die bekannten Lyophilisation- und Rekonstitutionstechniken angewandt werden. Es wird durch Fachleute darauf hingewiesen, dass die Lyophilisation und Rekonstitution zu einem Aktivitätsverlust des Antikörpers verschiedenen Grades führen kann (z.B. mit konventionellen Immunoglobulinen, IgM-Antikörper neigen zu einem grösseren Aktivitätsverlust als die IgG-Antikörper) und das die verwendeten Spiegel kompensiert werden müssen. 



  Die Zusammensetzungen, welche humane, monoklonale Antikörper oder ein Cocktail davon enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von p. aeruginosa-Infektionen eingesetzt werden. In der therapeutischen Anwendung werden die Zusammensetzungen einem Patienten verabreicht, der schon mit einem oder mehr p. aeruginosa-Serotypen infisziert ist, wobei eine genügende Menge verabreicht  wird, um die Infektion und ihre Komplikationen zu heilen oder mindestens zum Teil aufzuhalten. Eine zweckmässige solche Menge wird hier als "therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Wirksame solche Mengen hängen von der Ernsthaftigkeit der Infektion und vom allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten ab, bewegen sich jedoch im Bereich von 1 bis 200 mg Antikörper pro kg Körpergewicht, wobei Dosen von 5 bis 25 mg pro kg normalerweise verwendet werden.

  Es muss in Erinnerung behalten werden, dass die erfindungsgemässen Materialien für ernsthafte Krankheitszustände verwendet werden, d.h. lebensbedrohende oder potentielle lebensbedrohende Situationen, wie Bakteriämie und Endotoxämie, die durch p. aeruginosa verursacht werden. In Anbetracht der Abwesenheit von fremden Substanzen und der Abwesenheit einer Zurückweisung der fremden Substanzen, welche durch die erfindungsgemässen humanen, monoklonalen Antikörper bewirkt werden, ist es in solchen Fällen möglich und kann vom behandelnden Arzt gewünscht werden, dass wesentliche Überschüsse dieser Antikörper verabreicht werden. 



   In prophylaktischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen mit den Antikörpern oder einem Cocktail davon, dem Patienten zur Erhöhung seiner Widerstandskraft gegen solche möglichen Infektionen nicht erst bei einer Infektion von p. aeruginosa verabreicht. Eine solche prophylaktisch verabreichte Menge wird hier als "prophylaktisch wirksame Dosis" bezeichnet. Bei dieser Verwendung hängen die präzisen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand des Patienten und seinem Immunsystem ab, jedoch kann gesagt werden, dass in der Regel 0,1 bis 25 mg/kg, insbesondere 0,5 bis 2,5 mg/kg zweckmässige Dosen sind. 



  Einfache oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzung können nach einem Schema durchgeführt werden, das vom behandelnden Arzt bestimmt wird. In jedem Fall sollte durch die pharmazeutische Formulierung eine genügende Menge von erfindungsgemässen Antikörpern verabreicht werden, um den Patienten wirksam zu behandeln. 


 Experimentelles 
 


 Beispiel I 
 



  Das Beispiel I demonstriert Verfahren für die Herstellung von humanen, monoklonalen Antikörpern (IgM-Isotyp), welche mit den IATS-Serotypen 2, 5 und 16 und den Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagieren. 



  Eine periphere Blutprobe, welche von einem Patienten mit zystischer Fibrose, von welchem bekannt, dass er eine chronische Infektion von p. aeruginosa aufwies, erhalten wurde, diente als Quelle von humanen B-Zellen. Die mononuklearen Zellen wurden vom Blut durch übliche Zentrifugationstechniken abgetrennt, unter Verwendung von Ficoll-Paque (Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968), 21: Suppl. 97, 77-89) und zweimal mit kalzium-/magnesium-freier, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. 



  Die  mononuklearen Zellen  wurden  von  den T-Zellen  befreit,  unter Verwendung  eines modifizierten E-Rosettenbildungsverfahrens. Kurz geschildert, wurden die Zellen zuerst auf eine Konzentration von 1 x 10<7> Zellen/ml in PBS, welches 20% föta les Kälberserum (FCS) enthielt, bei 4 DEG C resuspendiert. 1 ml dieser Suspension  wurde  dann  in 17 x 100 mm Röhrchen  mit  rundem Boden  gegeben, zu  welchen 1 x 10<9> 2-Amino-isothiouroniumbromid (AET) behandelte, rote Blutkörperchen vom Schaf in einer 10% (v/v)-Lösung in Dulbecco Medium, welches nach Iscove modifiziert war (Iscove-Medium), zugegeben wurden (Madsen, M. und Johnson, H.E., J. Immun. Methods (1979) 27: 61-74). Die Mischung wurde während 5 bis 10 Min. bei 4 DEG C sehr sachte gerührt und die E-rosettenförmig ausgebildeten Zellen dann durch Zentrifugation auf Ficoll-Paque während 8 Min. mit 2500 x g bei 4 DEG C zentrifugiert.

  Die E-rosetten-negativen, peripheren, mononuklearen Blutzellen (E<->PBMC), welche sich in der Grenzschicht ansammelten, wurden  gewonnen  und  einmal  mit Iscove-Medium gewaschen und in demselben, das 15% (v/v) FCS, L-Glutamin (2 mmol/l), Penicillin (100 IU/ml), Streptomycin (100  mu g/ml), Hypoxanthin (1 x 10<-><4>M), Aminopterin (4 x 10<-><7>M) und Thymidin (1,6  x 10<-><5>M) enthielt, resuspendiert. Dieses Medium wird anschliessend als HAT-Medium bezeichnet. 



  Die zellgetriebene Transformation des E<->PBMC war durch die Mitkultivation dieser Zellen mit einer transformierenden Zellinie begleitet. Diese transformierende Zellinie war eine Epstein-Barr-Nuklearantigen (EBNA)-positive, humane Lymphoblastoidzellinie, die durch Ethylmethansulfonat (EMS) mutagenetisch von der GM 1500-Lymphoblastoidzellinie und durch anschliessende Selektion in Gegenwart von 30  mu g/ml 6-Thioguanin abgeleitet, um die Zellen mit einem Hypoxanthinguaninphosphoribosyl-Transferase (HGPRT)-Defekt zu verleihen und sie demzufolge HAT-empfindlich zu machen. Diese Zellinie wird als die 1A2-Zellinie bezeichnet und wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 29. März 1982 unter der ATCC-Nr. CRL 8119 hinterlegt.

  Die 1A2-Zellen wurden in  der logarithmischen Wachstumsphase im HAT-Medium suspendiert und dann mit den E<->PBMC in einem Verhältnis von acht 1A2-Zellen pro E<->PBMC kombiniert. Die Zellmischung wurde in acht Rundboden-Microtiterplatten mit 96 Löchern (Costar 3799) ausgestrichen mit einer Konzentration von 72 000 Zellen/Loch in einem Volumen von 200  mu l pro Loch und bei 37 DEG C in einer feuchten Atmosphäre, die 6% CO2 enthielt, inkubiert. Die Kulturen wurden an den Tagen 5 und 8 nach dem Ausstreichen durch Ersetzen des halben Überstandes mit frischem HAT-Medium versorgt.

  Die Löcher wurden jeden zweiten Tag an einem Inversionsmikroskop auf Zeichen der Zellwucherung untersucht. 12 Tage nach der Bestreichung wurde beobachtet, dass 100% der Löcher wuchernde Zellen enthielten und dass in den meisten Löchern die Zellen von genügender Dichte waren, damit die Überstände entfernt und auch Anti-p. aeruginosa-Antikörper untersucht werden konnten. 



  Die Überstände wurden einem Screening auf die Gegenwart von Anti-p. aeruginosa-Antikörper untersucht, unter Verwendung einer "Enzym linked immunosorbent assay" (ELISA)-Technik untersucht (Engvall, E., (1977), 55: 193-200). Die Antigenplatten bestanden aus Mikrotiterplatten mit flachem Boden und 96 Löchern (Immulon II, Dynatech), wobei jedes Loch davon verschiedene lebendige Bakterien enthielt, die unten am Loch adsorbiert waren. Zur Erleichterung der Adsorption der Bakterien am Kunststoff wurde 50  mu l/Loch Poly-L-Lysin (PLL) (1  mu g/ml in PBS, pH-Wert 7,2) während 30 Min. bei Zimmertemperatur inkubiert. Das unadsorbierte PLL wurde dann ausgeklopft, die Platten einmal mit PBS ausgewaschen, 50  mu l gewaschene bakterielle Suspension (OD660= 0,2) in PBS in jedes Loch zugegeben und die Platten während 1 Std. bei 37 DEG C inkubiert.

  Nicht adsorbierte Bakterien wurden durch dreimaliges Waschen der Plat ten mit Salzlösung/Tween entfernt (0,9% NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20). Zum Screening wurden verschiedene Antigenplatten verwendet: (1) eine Mischung von p. aeruginosa-Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4 (ATCC Nrs. 27312, 27313, 27315); (2) eine Mischung von p. aeruginosa-Fisher-Immunotypen 3, 5 6 und 7 (ATCC Nrs. 27314, 27316, 27317, bzw. 27318); und (3) eine Mikrotiterplatte ohne Bakterien. 



  Der ELISA wurde durch Blockierung der Platten mit 200  mu l/Loch eines Blockierungspuffers (PBS, pH 7,2, enthaltend 5% (w/v) fettfreie Pulvermilch, 0,01% (v/v) Antischaum A (Sigma) und 0,01% (w/v) Thimerosal) während 60 Min. bei Zimmertemperatur eingeleitet. Nach der Blockierung wurden die Platten dreimal mit Kochsalzlösung/Tween gewaschen. 50  mu l PBS, pH 7,2, das 0,1% Tween-20 und 0,2% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA) enthielt, wurde dann in sämtliche Löcher gegeben. Die Überstände der Löcher der Kulturplatten wurden in entsprechende Löcher der Antigenplatten (50  mu l/Loch) übergeführt (replica plated) und die Platten wurden während 30 Min. bei Zimmertemperatur inkubiert.

   Die Überstände wurden dann entfernt, die Vertiefungen dreimal mit Kochsalzlösung/Tween gewaschen und 50  mu l zweckmässig verdünnte Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertes Geissen-antihumanes IgG + IgM (American Qualex International A1114 + A1124) wurde in jede Vertiefung gegeben. In diesem Beispiel wurde das HRP-Geissen Anti-IgG und das HRP-Geissen anti-IgM in einer Schlussverdünnung von 1:5000, bzw. 1:3000 in PBS, pH 7,2, das 0,05% Tween-20 und 0,1% BSA enthielt, verwendet.

  Im Anschluss an eine 30-Min.-Inkubation bei Zimmertemperatur wurde der Überschuss an enzymkonjugierten Geissen-Antikörpern entfernt, dann wurden die Löcher dreimal mit Kochsalzlösung/Tween gewaschen. 100  mu l Substrat (0,8 mg/ml o-Phenylendiamin-dihydrochlorid in 100 mM Citratpuffer, pH 5,0, plus 0,03% H2O2 in ent ionisiertem Wasser, in gleichem Volumen unmittelbar vor dem Aufbringen gemischt) wurde dann in jedes Loch gegeben. Nach 30-Min.-Inkubation im Dunkeln (50  mu l 3N H2SO4 wurde zur Beendigung der Reaktionen in jedes Loch gegeben. Die Kulturüberstände, die mit dem Platten-Antigen umgesetzte Antikörper enthielten, wurden durch positive Farbentwicklung nachgewiesen, und die Stärke der Reaktion wurde quantifiziert, indem die Absorption bei 490 nm auf einem Bio-Tek EL-310 Mikro-ELISA-Reader gemessen wurde. 



  Die Analysen der Kulturüberstände gemäss der obenbeschriebenen Methode führten zur Identifikation von zwei Löchern (1C1 und 2H12), die Anti-p. aeruginosa-Antikörper enthielten, welche mit der Fisher-Immunotypen  3,  5,  6  und  7-Platte  reagierten, jedoch  nicht  mit der Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4-Platte und der Platte ohne Bakterien. Um den spezifischen Fisher-Immunotyp, bzw. Immunotypen, zu identifizieren, wurden Antigen-Platten hergestellt, die nur PLL-fixierte Bakterien eines einzigen Fisher-Immunotypes enthielten in gleicher Weise, wie oben beschrieben, für jeden Immunotyp. Die Durchführung des ELISA-Testes, wie oben dargestellt, mit den Kulturüberständen von den Löchern 1C1 und 2H12 auf den individuellen Immunotypplatten zeigte, dass diese zwei Löcher Antikörper enthielten, die spezifisch auf die beiden Fisher-Immunotypen 3 und 7 waren.

  Ein ähnlicher ELISA wurde auf der IATS-Platte mit p. aeruginosa-Stämmen (erhalten von ATCC mit den Hinterlegungsnrs. 33 348-33 364) zeigten, dass die Antikörper in den Löchern 1C1 und 2H12 spezifisch mit den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 reagierten. 



  Der Isotyp des bzw. der reaktiven Antikörper in den  Löchern 1C1 und 2H12 wurde durch einen ELISA-Test in ähnlicher Weise wie die oben beschriebenen Spezifitätstest durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das HRP-Geissen-Antihuman IgG und dass das HRP-Geissen-Antihuman IgM unabhängig als Reagenz in der zweiten Stufe verwendet wurde, anstelle ihrer Kombination. Positiv-Reaktionen des bzw. der Antikörper in den Vertiefungen 1C1 und 2H12 mit den Fisher-Immunotypen 3 und 7 wurde nur mit den Anti-IgM-Reagenzien beobachtet, was einen IgM-Isotypen für die relevanten Antikörper in jedem Loch demonstrierte. 



  Zur Bestimmung, ob die Anti-Fisher-Immunotypen 3 und 7 Reaktionsmuster aufgrund von einem oder mehreren Antikörpern in den Vertiefungen 1C1 und 2H12 entstanden, d.h. ob ein Antikörper mit beiden Fisher-Immunotypen 3 und 7 reaktiv war oder ob zwei Antikörper vorhanden waren, wobei der eine mit dem Fisher-Immunotypen 3 und der andere mit dem Fisher-Immotypen 7 reaktiv war, wurden Zellen von beiden Vertiefungen einer Subkultur bei niederer Dichte unterworfen, wobei die Vertiefungen wuchernde Zellen enthielten, die aus separaten Fisher-Immunotypen 3 und 7-Bakterien-Antigen-Platten getestet waren. Die Subkultur wurde in 96-Loch-Rundbodenplatten mit einer Dichte von 5 Zellen/Loch durchgeführt, in einem totalen Volumen von 100  mu l HAT-Medium, welchem die Aminopterin-Komponente fehlte (HT-Medium).

  Die nicht transformierenden HAT-empfindlichen Lymphoblastoid-Zellen wurden in alle Vertiefungen mit einer Dichte von 500 Zellen/Loch gegeben, als Nahrungszellen. Vier Tage nach dem Auftragen wurde 100  mu l HAT-Medium in alle Löcher zugegeben, um selektiv die Nahrungszellen abzutöten. Die Löcher wurden wiederum am Tag 9 nach der Auftragung als Ersatz für die Hälfte des Überstandes mit HAT-Medium versehen. Anschliessend wurden die Löcher in ähnlicher Weise alle  fünf Tage mit HAT-Medium versorgt, bis in den Vertiefungen eine genügende Lymphoblastoid-Zellendichte für Überstandsanalysen durch ELISA vorhanden war.

  Beim Test an den individuellen Fischer-Immunotyp-3 und Fisher-Immunotyp-7-Antigenplatten, reagierten alle Überstände, die mit dem Fisher-Immunotyp 3 reagierten, ebenfalls mit dem Fisher-Immunotyp 7, was anzeigte, dass ein Antikörper für die Aktivität an beiden Fisher-Immunotypen verantwortlich war. Zufällig ausgewählte Überstände wurden dann an den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 getestet, wobei gefunden wurde, dass alle 3 Stämme und nicht individuelle Stämme reagieren, wobei diese Schlussfolgerung dadurch unterstützt wurde, dass der Antikörper mit den Fisher-Immunotypen 3 und 7 sowie den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 eine Kreuzreaktion einging. 



  Das Klonen der spezifischen Antikörper-produzierenden Löcher 1C1 und 2H12 wurde durchgeführt, indem Zellen von jedem Loch verschiedenen Runden von begrenztem Verdünnungsklonen unterworfen wurden, bis alle klonalen Überstände beim oben beschriebenen ELISA-Test eine positive Reaktion auf die Fisher-Immunotypen 3 und 7 und die IATS-Stämme 2, 5 und 16 zeigten. Beim Klonen wurden ebenfalls Nahrungszellen verwendet, wie oben für die Subkultur beschrieben. Durch diese Mittel wurden zwei geklonte, transformierte, humane Zellinien (1C1 und 2H12) erhalten, welche kontinuierlich waren (immortal) und welche jede humane, monoklonale Antikörper ausschied die mit den Fisher-Immunotypen 3 und 7 und den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 reaktiv waren. In diesem Beispiel tragen die Zellinien die dadurch produzierten Antikörper die gleiche Bezeichnung. 


 Beispiel II 
 



  Beispiel II demonstriert Verfahren für die Herstellung von humanen, monoklonalen Antikörpern (IgG-Isotyp), die mit den IATS-Serotypen 2, 5 und 16 und den Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagieren. Die Herstellungsvorschriften sind im wesentlichen identisch mit Beispiel I. Kurz gesagt, diente eine peripherale Blutprobe, die von einem zystischen Fibrose-Patienten, von welchem bekannt war, dass er eine chronische p. aeruginosa-Infektion aufwies, erhalten wurde, als Quelle für humane B-Zellen. Die mononuklearen Zellen wurden, wie in Beispiel I beschrieben, abgetrennt, mit der Ausnahme, dass 1,6 ml der PBS-Suspension mit einer Suspension von 1,6 x 10<9> AET-behandelten roten Schafblutkörperchen verwendet wurde.

   Die zellgetriebene Transformation war ebenfalls die gleiche, mit der Ausnahme, dass der Anteil an 1A2-Zellen pro E<->PBMC 7,5 war; 15 Platten mit 17 000 Zellen pro Loch verwendet wurden; die Kulturen wurden am Tag 6 und 10 nach dem Ansatz genährt und am Tag 16 nach dem Ansatz enthielten praktisch alle Vertiefungen wuchernde Zellen. 



  Das Screening des Kulturüberstandes für die spezifischen Antikörper wurde, wie beschrieben durchgeführt, und resultierte in der Lokalisierung einer Vertiefung (9D1), welche einen Antikörper enthielt, der mit der Platte mit den Fisher-Immunotypen 3, 5, 6 und 7 reaktiv war, jedoch nicht mit der Platte mit den Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4 oder der Platte ohne Bakterien. Die Durchführung des beschriebenen ELISA-Tests mit Bakterien-Antigen-Platten mit individuellen Immunotypen oder Serotypen mit dem 9D1-Kulturüberstand zeigte einen Antikörper, welcher sowohl mit den beiden Fisher-Immunotypen 3 und 7, wie auch mit den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 reaktiv war. 



  Anschliessende Studien, welche in Übereinstimmung mit dem Beispiel I durchgeführt wurden, zeigten, dass die Antikörper-Spezifität im Loch 9D1 einem einzigen Klon zuzuschreiben ist, welches einen Antikörper vom IgG-Isotyp ausscheidet. 


 Beispiel III 
 



  Das Beispiel III demonstriert die Antigen-Spezifität von einigen der erfindungsgemässen Antikörper. 



  Zur Bestimmung, ob die monoklonalen Antikörper 1C1, 2H12 und 9D1 mit dem gleichen Ziel-Antigen reagieren und ob sie in der Spezifität identisch waren, wurden zusätzliche Tests durchgeführt. Zuerst wurden die Antikörper durch einen ELISA auf eine Platte mit Referenz-Stämmen und klinischen Isolaten von p. aeruginosa verglichen. Die ELISA-Vorschriften waren wie oben angegeben mit der Ausnahme der folgenden Änderungen: 
 
   1) Anstelle von Bakterien, die an PLL-beschichteten Platten adsorbiert waren, enthielten die Vertiefungen der Platten verschiedene ganze Bakterien, welche auf dem Boden der Vertiefung Ethanol-fixiert waren.

  Die Platten wurden durch Zugabe von 50  mu l einer gewaschenen Bakterien-Suspension (OD660 = 0,2) in PBS in die Vertiefungen gegeben, die Platten wurden 20 Min. bei 500 x g zentrifugiert, das PBS wurde abgesaugt, 75  mu l Ethanol während 10 Min. zugegeben, das Ethanol wurde entfernt und anschliessend wurde an der Luft getrocknet.

  Auf den Antigen-Platten waren die IATS-Stämme 2, 5, 11 und 16 (ATCC-Nrs. 33 349, 33 352, 33 358, bzw. 33 363) und sechzehn klinische Isolate, welche vorher sowohl durch die Agglutination mit Difco (Detroit, Michigan)-Bacto-pseudomonas aeruginosa-Antiseren gemäss den Herstellervorschriften und durch ELISA (wie hier an gegeben) als die Serotypen 2, 5 und 16 oder als eine Kombination solcher Serotypen identifiziert wurden; 
   2) es wurden Kaninchen-Bestimmungs-Antiseren in einer Verdünnung von 1:500 in PBS verwendet, mit der Ausnahme für Anti-IATS 16, welches im Verhältnis 1:250 verdünnt wurde.

  Die Kulturüberstände, die 1C1-, 2H12- und 9D1-Antikörper enthielten, wurden rein verwendet; 
   3) als Reagenzien für die zweite Stufe wurde biotinyliertes Protein A (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) das im Verhältnis 1:500 verdünnt war und biotinyliertes Geissen-Anti-Human-Ig (4703, Tago, Inc., Burlingame, CA), das im Verhältnis 1:500 verdünnt war, für den Nachweis von Kaninchen- bzw. Human-Antikörper verwendet. 50  mu l Reagenz wurden zu den zweckmässigen Vertiefungen gegeben und nach einer Inkubation von 30 Min. bei Zimmertemperatur wurde das nicht gebundene Reagenz entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal gewaschen. 50  mu l eines vorgebildeten Avidin: biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-Komplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) wurden dann in jede Vertiefung gegeben. Nach 30 Min.

  Inkubation bei Zimmertemperatur wurde der Überschuss an Vectastain ABC-Reagenz entfernt und vor der Substratzugabe wurden die Vertiefungen wiederum dreimal gewaschen. Wie in Tabelle II dargestellt, geht aus den Resultaten der Tests hervor, dass in den Fällen, wo die Antikörper 1C1, 9D1 mit jedem klinischen Isolat, welches als IATS 2, 5 oder 16 Serotyp charakterisiert wurde, der Antikörper 2H12 mit drei solchen Isolaten nicht reagierte.

  Daraus kann geschlossen werden, dass der Antikörper 2H12 ein Epitop erkannte, welches von den durch 1C1 oder 9D1 erkannten verschieden war, und dass die zwei Epitope offensichtlich koordiniert bei den meisten, jedoch nicht bei allen klinischen Isolaten, die den IATS-Serotypen 2, 5 und 16 entsprechenden, exprimiert wird. 
 
<tb><TABLE> Columns=8 
<tb>Title: Tabelle II 
<tb>Head Col 01 to 08 AL=L: Reaktivitätsmuster der Difco-Bacto-p. aeruginosa-Antiseren und der humanen, monoklonalen Antikörper 2H12, 1C1 und 9D1 an Typen, Stämmen und klinischen Isolaten von p. aeruginosa 
<tb>SubHead Col 02 to 05 AL=L: Kaninchen 
<tb>SubHead Col 06 to 08 AL=L:

  Mensch 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Typenstamm od. klinisches Isolat: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>IATS 2: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>IATS 5: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>IATS 16: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>IATS 11: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>MAb 2H12: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>MAb 1C1: 
<tb>SubHead Col 08 AL=L>MAb 9D1:

   
<tb> <SEP>IATS 2 <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>IATS 5 <SEP>(+)<a> <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>IATS 16 <SEP>(+)<a> <SEP>(+)<a> <SEP>+ <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>IATS 11 <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>- 
<tb> <SEP>A523 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>B406 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>(+)<a> <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>C27 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>D26 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F155 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F225 <SEP>+ <SEP>(+)<a> <SEP>+ <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F250 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F253 <SEP>- <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F255 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F256 

   <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>F396 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>H217 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>H218 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>H219 <SEP>- <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>H220 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ <SEP>+ 
<tb> <SEP>H221 <SEP>+ <SEP>+ <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>+ <SEP>+ 
 <a)<+) = ELISA-Reaktion sehr schwach positiv
  
<tb></TABLE> 



   Aus den Daten geht weiter hervor, dass die Ziel-Moleküle, die durch die Antikörper 1C1 und 9D1 erkannt werden, wahrscheinlich in allen klinischen Isolaten von p. aeruginosa, welche aus IATS-Serotypen 2, 5 oder 16 identifiziert worden sind, vorhanden sind, während das Ziel, welches durch den Antikörper 2H12 erkannt, an einer Subgruppe eines solchen Isolats exprimiert wurde. 



  Zur Bestimmung, ob die 1C1-, 2H12- und 9D1-Antikörper mit verschiedenen Antigenen oder alternativ mit verschiedenen Epitopen am gleichen Antigen reagierten, wobei solche Epitope an den meisten, jedoch nicht an allen IATS 2, 5 und 16-Serotypen exprimiert sind, reagierte, wurde eine Immunoblot-Analyse durchgeführt. Wegen der geteilten Antigenizität zwischen den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 ist offensichtlich, dass wegen hitzestabilen Antigenen (Liu, P.V. et al., supra) und dass die Tatsache berücksichtigt, dass die Hitzestabilität ein vorher bemerktes Merkmal von Lipopolysaccharidmolekülen ist, wurden LPS-Präparationen aus IATS-Stämmen 2, 5, 16 und 11 als Antigen-Präparationen für die Analyse ausgewählt. Das rohe LPS wurde aus Typenstämmen durch Extraktion in Kochsalzlösung bei 60 DEG C hergestellt (Orskov, F. et al., Acta. Path. Microbiol.

  Scand. (1971) Section B, 79: 142-152). 10 g LPS, wie durch den Gehalt an 2-Keto-3-deoxyoctonat (KDO) bestimmt (Karkhanis, Y.D., et al., Anal. Biochem. (1978) 85: 595-601) wurde von jedem Seroptyp einer Natriumdodecylsulfat-Polyamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (Hancock, R.E.W. und Carey, A.M., J. Bacteriol. (1977) 140: 901-910) auf einem 10 bis 20% Gradientengel durchgeführt. Separierte Molekul arten wurden vom Gel in bekannter Weise auf eine Nitrocellulose-Membrane (NCM) übergeführt (Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 4350-4354) und der NCM-Blot wurde während 1 Std. in PBS-Tween blockiert (Batteiger, B., et al., J. Immunol. Meth. (1982) 55: 297-307). Die Blots wurden dann während 1 Std. bei Zimmertemperatur in 20 ml von Kulturüberstand inkubiert, welcher entweder von den 1C1-, 2H12- oder 9D1-Zellinien stammte. Nach 5 Min.

  Spülen in PBS-Tween wurde jedes NCM-Blot während 1 Std. bei 25 DEG C in einer 1:1000- oder 1:1500-Verdünnung (in PBS-Tween) von alkalischem Phosphatase-konjugiertem Geissen-Anti-Human-IgG + IgA + IgM (Zymed) inkubiert. Die Blots wurden dann einem fünfminütigen Waschen in PBS-Tween unterworfen, wonach die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung durch Inkubation der Blots während 15 bis 20 Min. in 30 ml Nitrobluetetrazolium/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (NBT-BCIP)-Substrat sichtbar gemacht, wie beschrieben durch Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 4045-4049. Die Farbentwicklung wurde durch mehrmaliges Spülen des Blots in entionisiertem Wasser unterbrochen. 



  Die Blot-Profile, welche durch diese drei Antikörper erhalten wurden, waren bemerkenswert verschieden. Der Antikörper 2H12 erkannte eine kurze Serie von Molekülen mit einem niederen Molekulargewicht mit regelmässigen Abständen in den Antigen-Präparationen der Serotypen 2, 5 und 16. Einige Moleküle von höherem Molekulargewicht und regelmässigem Abstand wurden ebenfalls schwach erkannt. Vom Serotyp 11 wurde aus den LPS-Präparationen keine Reaktion festgestellt. Eine Wiederholung der Immunoblot-Analyse unter Verwendung von LPS-Präparationen, welche vorher mit Proteinase K bei 60 DEG C behandelt wurde, um das Protein-Antigen zu zerstören, bewirk te keine Änderungen der Profile.

  Die Niedermolekular-Banden entsprachen exakt den kleineren Formen von LPS-Molekülen, wie sie in ähnlicher Weise auf einem ähnlich behandelten SDS-PAGE-Gel erhalten wurden, worin die Antigene nicht auf NCM transformiert wurden, dafür aber spezifisch für die Gegenwart von LPS gefärbt wurden (Tsai, C.M. und Frasch, C.E., Anal. Biochem. (1982) 119: 115-119) mit der Ausnahme, dass die niederste Bande auf einem silbergefärbten Gel (welche die Kernregion plus das Lipid A des LPS darstellte) nicht festgestellt wurde. Der Antikörper 1C1 erkannte die gleiche Serie von Molekülen mit niederem Molekulargewicht von regelmässigem Abstand unter den Antigen-Präparaten des Serotyps 2, 5 und 16, jedoch nicht von 11, obschon die Intensität der Reaktion nicht so stark war, wie bei 2H12.

  Zusätzlich wurde bei diesem Antikörper jedoch eine vorherrschende Serie von Molekülen von höherem Molekulargewicht mit regelmässigem Abstand an den Serotypen 2, 5 und 16 festgestellt, welche in Kombination mit den festgestellten Banden mit niederem Molekulargewicht Anlass dazu gab, dass volle leiterartige Profile erkannt werden konnten. Diese Profile wurden durch die Vorbehandlung der Antigen-Präparate mit Proteinase K nicht verändert. Wiederum entsprachen die Profile dem leiterartigen Bandenmuster, welches in LPS-spezifisch, gefärbten Gelen beobachtet wurde (d.h. sie schienen Bande zu Bande einander zu entsprechen) mit der Ausnahme, dass die Bande, welche den Kern plus das Lipid A darstellte, nicht erkannt wurde.

  Wiederum wurde die unterste Bande der Leiter eines silbergefärbten Gels nicht erkannt und das gesamte Profil wurde durch die Vorbehandlung der LPS mit Proteinase K nicht geändert. Zusammen zeigten diese Feststellungen, dass das LPS der Serotypen 2, 5 und 16 das Zielmolekül war, welches durch die 2H12-, 1C1- und 9D1-Antikörper erkannt wurde. 


 Beispiel IV 
 



  Das Beispiel IV zeigt die protektive Aktivität eines der erfindungsgemässen Antikörper. 



  Zur Bestimmung der in vivo-Schutzkapazität des Antikörpers 1C1 wurden Tierversuche betreffend den Schutz an Mäusen durchgeführt. Der 1C1-Antikörper wurde zuerst von einem Kulturüberstand durch Ausfällen mit gesättigtem Ammoniumsulfat (50% Endkonzentrat) konzentriert (Good, A.H., et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. und Shiigi, S.M., Herausgeber, W.J. Freeman & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)). Das ausgefällte Material wurde in einem minimalen Volumen von sterilem Wasser rekonstruiert, intensiv gegen PBS dialysiert und steril-filtriert. Als Negativ-Probe diente der von der Kultur ausgeschiedene Überstand von einer anderen transformierten, humanen Zellinie (6F11-ATCC-Nr. CRL 8562), welche einen humanen, monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch gegen LPS des IATS-Stammes 11 ist, in ähnlicher Weise behandelt. 



   Weibliche BALB/c-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körpergewicht wurden in zwei Gruppen von je 30 Mäusen aufgeteilt. Alle Mäuse in jeder Gruppe wurden individuell intraperitoneal (ip) mit 0,5 ml konzentrierten 1C1- oder 6F11-Antikörpern inokuliert. 6 Std. später wurde jede der beiden Gruppen in drei Gruppen von 10 Mäusen unterteilt und Mitglieder jeder 10er Gruppe wurden unabhängig ip mit 0,3 ml einer Suspension mit lebenden Bakterien, die 5 LD50 der IATS-Stämme 2, 5, bzw. 11, enthielt, herausgefordert. Die Bakteriensuspensionen wurden aus einer Brühenkultur mit logarithmischer Wachstumsphase hergestellt, wobei die Bakterien zentrifugiert, zweimal in PBS gewaschen und  mit der richtigen Dichte in PBS resuspendiert wurden.

  Die Kontrollgruppen bestanden aus vier oder fünf Mäusen, welchen intraperitoneal 0,5 ml PBS eingespritzt wurde und die 6 Std. intraperitoneal mit 5 Ld50 des gleichen Serotypes herausgefordert wurden. Nach der bakteriellen Herausforderung wurden die Tiere während einer Zeitdauer von fünf Tagen beobachtet. 



  Wie in Tabelle III dargestellt, bewirkten die 1C1-Antikörper einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine lethale Herausforderung der beiden Serotypen IATS 2 und IATS 5, jedoch nicht gegen den Serotyp IATS 11. Der typische Gang nach der bakteriellen Herausforderung umfasste in allen ungeschützten Tieren unterschiedliche Perioden des endotoxischen Schocks wonach normalerweise der Tod folgte. Kontrolltiere, welchen nur PBS verabreicht wurde, waren dem akuten endotoxischen Schock unterworfen, wonach bei allen der schnelle Tod folgte. Die negativen Kontrolltiere, welchen ein nicht-homologer Antikörper (6F11) verabreicht wurde, wiesen eine verlängerte Schockperiode auf, welche durch die Symptome gekennzeichnet war, wie sie in der Fussnote "a" der Tabelle III aufgelistet sind.

  Einige dieser Tiere erholten sich schliesslich, möglicherweise wegen den Nicht-Antikörper-Komponenten, welche in den Antikörper-Präparaten mit konzentriert wurden. Die Tiere, welche den protektiven, homologen Antikörper erhielten, zeigten jedoch nur kleinere Symptome von Endotoxämie. Diese Symptome verschwanden innerhalb von 24 Std. der Inokulation und die Tiere schienen während der gesamten restlichen 5 Tage der Beobachtungsperiode gesund zu sein. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle III 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: In vivo-Demonstration des protektiven Effektes des humanen monoklonalen Antikörpers 1C1 gegen die IATS-Serotypen 2 und 5 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Humaner,
monoklonaler
Antikörper: 
<tb>SubHead Col 02 to 04 AL=L:

  Anzahl Überlebende/Anzahl der herausgeforderten Tiere
5 Tage nach der Herausforderung mit: 
<tb> <SEP>IATS 2 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>IATS 5: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>IATS 11: 
<tb> <SEP>1C1 <SEP>8/10 <SEP>10/10 <SEP>3/10<a> 
<tb> <SEP>6F11 <SEP>0/10 <SEP>1/10<a> <SEP>10/10 
<tb> <SEP>PBS <SEP>0/4 <SEP>0/4 <SEP>0/4 
 <a> In denjenigen Fällen, wo ein nicht-spezifischer Schutz bemerkt wurde, war die Erholung von der Infektion merklich verschieden von derjenigen, wie sie zwischen den homologen Antikörper und den infiszierenden Stämmen, d.h. 1C1 mit IATS 2 oder 5 und 6F11 mit IATS 11 beobachtet wurde. In den letztgenannten Fällen war die Erholung im wesentlichen vollständig, bei Tieren, welche 24 Std. nach der bakteriellen Herausforderung normal erschienen.

  In nicht-spezifischen Fällen zeigten die Mäuse während einiger Tage vor der Erholung zum normalen Status Zeichen einer akuten Infektion, d.h. Diarrhoe, verkrustete Augenlider, zerzaustes Fell, ein kauerndes Profil und langsame Bewegungen. Ein solcher nicht-spezifischer Schutz liegt offensichtlich wegen der Nicht-Antikörper-Komponenten vor, die mit konzentriert sind und die demzufolge den Tieren ebenfalls eingesprizt wurden, da sämtliche Tiere, welchen nur PBS verabreicht wurde, starben.
  
<tb></TABLE> 



  Unter Verwendung der gleichen Vorschrift wurde ein zweiter Versuch durchgeführt, worin Gruppen von Mäusen mit den Fisher-Stämmen 2, 3 oder 7 herausgefordert wurden und die Tiere während fünf Tagen beobachtet wurden. Wie in Tabelle IV dargestellt, zeigte der Antikörper 1C1 wiederum einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine sonst tödliche Infektion mit den Fisher-Immunotypen 3 und 7, während er sonst gegen den Fisher-Immunotyp 2 unwirksam war. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle IV 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: In vivo-Demonstration des protektiven Effektes des humanen, monoklonalen Antikörpers 1C1 gegen die Fisher-Immunotypen 3 und 7 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Humaner,
monoklonaler
Antikörper: 
<tb>SubHead Col 02 to 04 AL=L:

  Anzahl Überlebende/Anzahl der herausgeforderten Tiere
5 Tage nach der Herausforderung mit: 
<tb> <SEP>Fisher 3 <SEP>Fisher 7 <SEP>Fisher 2 
<tb> <SEP>1C1 <SEP>10/10 <SEP>10/10 <SEP>1/10<a> 
<tb> <SEP>6F11 <SEP>0/10 <SEP>7/10<a> <SEP>10/10 
<tb> <SEP>PBS <SEP>0/5 <SEP>0/5 <SEP>0/5 
 <a> Überlebende aufgrund eines nicht-spezifischen Schutzes wie in der Fussnote zur Tabelle III angegeben.
  
<tb></TABLE> 


 Beispiel V 
 



  Das Beispiel V demonstriert ein Verfahren für die Herstellung eines humanen, monoklonalen Antikörpers, welcher mit den IATS-Serotypen 4 und 11 und dem Fisher-Immunotyp 2 von p. aeruginosa reagiert. Das Verfahren, welches in den Beispielen I bis IV beschrieben ist, wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, gewisse Änderungen vorzunehmen, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper zu isolieren, zu charakterisieren und zu testen. Nachstehend sind die Änderungen im Verfahren und die erhaltenen Resultate mit dem dabei beschriebenen monoklonalen Antikörper angegeben. 



  Die Quelle der humanen B-Zellen war ein Individuum, welches vorher mit einem Polysaccharid-Präparat mit hohem Molekulargewicht immunisiert worden war, welches aus dem Fisher-Immunotyp 3 isoliert war (Pier, G.B., et al., Infec. Immun. (1984) 45: 309-313). 



  Die zellgetriebene Transformation des E<->PBMC war begleitet durch eine Mit-Kultivation dieser Zelle mit der transformierten Zellinie 1A2. Die 1A2-Zellen wurden in logarithmischer Wachstumsphase in einem HAT-Medium suspendiert und dann mit dem E<->PBMC kombiniert in einem Verhältnis von fünfzehn 1A2-Zellen pro E<->PBMC. Die Zellmischung wurde auf vierzehn Microtiter-Platten gegeben, mit einer Konzentration von 62 000 Zellen/Vertiefung in einem Volumen von 200  mu l pro Loch. Die Kulturen wurden am Tag 7 und 11 nach der Auftragung genährt und am Tag 15 wurde beobachtet, dass 100% der Vertiefungen wuchernde Zellen enthielten. 



   Für das Screening auf die Gegenwart von Anti-p. aeruginosa-Antikörper, wurden zwei Antigenplatten verwendet, welche bestanden aus: (1) einer Mischung von p. aeruginosa der Fisher-Immunotypen 1 bis 7 (ATCC-Nrs. 27 312, 27 313, 27 314, 27 315, 27 316, 27 317, bzw. 27 318); und (2) eine PLL-behandelte Microtiterplatte ohne Bakterien. 



  Die Analyse der Kulturüberstände gemäss den obigen Beispielen führte zur Identifikation von nahezu 100 Löchern, welche Anti-p. aeruginosa-Antikörper enthielten, welche mit den Platten mit den Fisher-Immunotypen 1 bis 7 reagierten, jedoch nicht mit der Platte, welche mit PLL behandelt war, worin keine Bakterien vorlagen. Zur Identifikation des spezifischen, erkannten Fisher-Immunotyps, bzw. der Immunotypen, wurden, wie vorher beschrieben, Antigen-Platten konstruiert, worin in jeder Reihe der Platten PLL-fixierte Bakterien nur eines Fisher-Immunotyps vorhanden waren. Ein ELISA wurde, wie vorher beschrieben, durchgeführt, wobei der Kulturüberstand jeder anti-p. aeruginosa-positiven Vertiefung in säulenartiger Anordnung auf die neuen Antigenplatten gebracht wurde, wobei eine Anzahl von Vertiefungen identifiziert wurde, welche Fisher-Immunotyp 2 spezifische Antikörper enthielten.

  Zur weiteren Analyse der serologischen Spezifität der Anti-Fisher-Immunotyp-2-Antikörper wurden die Überstände in einem ähnlichen ELISA getestet, auf Antigen-Platten, welche eine solche Konstruktion aufwiesen, dass jede der siebzehn IATS-Serotypen von p. aeruginosa in separaten Vertiefungen vorhanden war. Die Resultate dieses Tests zeigte, dass die grosse Mehrheit der Überstände gegen die IATS-Serotypen spezifisch war, obschon ein Überstand in der Vertiefung 6D6 ein kreuzreaktives Spezifitätsmuster gegen die IATS-Serotypen 4, 11, 13 und 14 zeigte. 



  Um zu bestimmen, ob das Anti-IATS-Serotypen 4, 11, 13 und 14-Reaktionsmuster das Resultat eines oder mehrerer Antikörper in der Vertiefung 6D6 darstellte, wurden zusätzliche aliquote Anteile des Überstandes der Vertiefung 6D6 unabhängig mit den IATS-Serotypen 4, 7 (Negativ-Kontrolle), 11, 13 und 14 adsorbiert und die adsorbierten Überstände dann an PLL-fixierten Bakterien jedes der fünf IATS-Serotypen in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen ELISA-Assay getestet. Die Adsorptionen wurden durchgeführt, indem ein gepacktes Bakterienzellkügelchen mit einem equivalenten Volumen des Überstandes während einer halben Stunde auf Eis wieder suspendiert wurde, wonach der Überstand von den Bakterien durch Zentrifugation abgetrennt wurde.

  Die Resultate dieses Tests zeigten, dass die IATS-Serotypen 4 und 11 die Antikörper-Aktivität gegen jeden anderen, jedoch nicht gegen die IATS-Serotypen 7, 13 oder 14 heraus adsorbierten. Dies demonstrierte die Gegenwart von mindestens zwei verschiedenen Anti-p. aeruginosa-Antikörper in der Vertiefung 6D6, wobei mindestens eine davon mit den IATS-Serotypen 4 und 11 eine Kreuzreaktion einging. 



  Die Isolierung und Klonung der zweckmässigen antikörperproduzierenden Zellen von der Vertiefung 6D6 wurde in drei Schritten durchgeführt. Der erste Schritt umfasste eine Subkultur (5 Zellen/Loch) von Zellen, welche aus einer Anti-IATS-Serotypen 4 und 11 positiven Vertiefung erhalten wurden, welche in der ersten 20 Zellen/Loch-Runde-Subkultur mit niederer Dichte erhalten wurden. Jede Subkultur-Runde wurde in 96-Loch-Rundbodenplatten durchgeführt in der angegeben Dichte und mit einem Volumen von 100  mu l HAT-Medium, welchem die Aminopterin-Komponente fehlte (HT-Medium). Nicht-transformierende HAT-empfindliche Lymphoblastoid-Zellen waren ebenfalls in sämtlichen Vertiefungen in einer Dichte von 500  Zellen/Loch als Nahrungszellen vorhanden. Vier Tage nach der Auftragung wurde 100  mu l HAT-Medium zu sämtlichen Vertiefungen zugegeben, um die Nahrungszellen selektiv abzutöten.

  Die Vertiefungen wurden wiederum am Tag 9 nach der Beschichtung durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit HAT-Medium versehen. Danach wurden die Vertiefungen in ähnlicher Weise alle 4 bis 5 Tage mit HT-Medium versehen, bis die Löcher eine genügende Lymphoblastoid-Zellen-Dichte für die Überstands-Analyse durch das oben beschriebene ELISA-Verfahren aufwiesen. 



  In jedem Assay waren diejenigen Überstände, welche mit dem IATS-Serotypen 4 reaktiv waren, ebenfalls mit den IATS-Serotypen 11 und dem Fisher-Immunotyp 2 reaktiv. Zusätzlich war die Antikörper-Aktivität gegen die IATS-Serotypen 13 und 14 verlorengegangen, was die früheren Spezifitätszuweisungen bestätigte. 



  Es wurde eine gewöhnliche Klonierung der spezifischen Antikörper-produzierenden Zellen durchgeführt, indem zuerst die Zellen mit einer sehr niederen Dichte (berechnet 1 Zelle/Loch) auf 72-Loch-Terasaki-Platten (Nunc 1-36 538) aufgetragen wurden mit einem Volumen mit 10  mu l/Loch. Die Platten wurden während 3 Std. in einen Inkubator gebracht, damit sich die Zellen am Boden der Platten ansetzen konnten und wurden dann durch zwei verschiedene Personen mikroskopisch auf Löcher untersucht, die nur einzelne Zellen enthielten. Jede dieser Zellen wurde dann unabhängig in Löcher einer 96-Loch-Rundbodenplatte gegeben mit Nahrungszellen und, wie früher für die Niederdichte-Subkultur angegeben, kultiviert. Die Überstände von allen entstandenen Klonen wurden durch die obige ELISA-Vorschrift getestet und waren positiv gegen die Anti-IATS-Serotypen 4 und 11. 



  Auf diese Weise wurde eine geklonte, transformierte, humane Zellinie erhalten, die kontinuierlich wuchs (d.h. immortal ist) und humane, monoklonale Antikörper ausschied, die gegen die Fisher-Immunotypen 2 reaktiv und gegen die IATS-Serotypen 4 und 11 kreuz-reaktiv waren. In diesem Beispiel tragen die Zellinie und die Antikörper, welche durch sie produziert werden, die gleiche Bezeichnung (d.h. 6D6). 



  Der Isotyp des Antikörpers in der Vertiefung 6D6 wurde in ähnlicher Weise, wie vorstehend für die Spezifitätstests einem ELISA-Assay unterworfen, jedoch mit der Ausnahme, dass das HRP-Geissen-Antihuman-IgG und das HRP-Geissen-Antihuman-IgM unabhängig als Zweistufen-Reagenzien verwendet werden, anstelle ihrer Kombination. Die Positiv-Reaktion der Antikörper in der Vertiefung 6D6 mit dem Fisher-Immunotyp 2 und den IATS-Serotypen 4 und 11 wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was für diesen Antikörper einen IgM-Isotyp demonstrierte. 



   Die biochemische Charakterisierung für die Molekülspezies, die durch den 6D6-Antikörper erkannt wurden, wurde durch eine Immunoblot-Analyse, wie sie im obigen Beispiel III beschrieben ist, ermittelt, jedoch mit der Ausnahme, dass die LPS-Präparate aus dem Fisher-Immunotyp 2 und den IATS-Serotypen 4 und 11 als Antigen-Präparate für die Analyse verwendet wurden. Als Negativ-Kontrolle diente LPS-Präparat aus dem Fisher-Immuntyp 1. 



  Vor der Analyse wurde jedes rohe LPS-Präparat im Verhältnis 1:1 mit Dissoziationspuffer (0,125M Tris, 4% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 20% (v/v) Glycerin, 10% (v/v) -Mercaptoethanol, 0,4% (w/v) Bromphenolblau, pH 6,8) verdünnt und das Bad während 5 Min. beschallt. Zum Abbau der Proteine wurde Proteinase K (1 mg/ml in H2O) zu jeder Probe zugegeben in einem Verhältnis von 40% (w/w) vom Enzym zum LPS und während 2 Std. bei 60 DEG C inkubiert, wobei nach 1 Std. das Bad während 5 Min. beschallt wurde. Diese Proben wurden dann auf 100 DEG C während 5 Min. erwärmt und in einer Micro-Zentrifuge während 2 Min. zentrifugiert. 



  Die geklärten Proben, die 10  mu g LPS von jedem der Bakterien-Stämme darstellten, wurden einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen (SDS-PAGE), wie oben beschrieben. Nach dem Übertragen der aufgetrennten Molekülspezies auf eine NCM wurden die NCM dann während 2 Std. bei Zimmertemperatur in 10 ml vom Kulturüberstand der 6D6-Zellinie inkubiert. Der Rest des Verfahrens wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt. 



  Es wurden nur positive Reaktionen auf denjenigen Spuren festgestellt, die LPS aus dem Fisher-Immunotyp 2 aus dem IATS-Serotyp 4 oder dem IATS-Serotyp 11 enthielten. In den Spuren des Fisher-Immunotyps 2 und des IATS-Serotyps 1 erkannte der Antikörper 6D6 eine kurze Serie von Molekülen mit niederem Molekulargewicht in regelmässigem Abstand (d.h. leiterartig angeordnet), welche präzise mit kleineren Formen den LPS-Molekülen entsprach, wie sie in ähnlicher Weise durch das SDS-PAGE-Gel sichtbar gemacht wurden, wobei jedoch die Antigene nicht auf eine NCM transferiert wurden, jedoch die LPS spezifisch gefärbt wurde, mit der Ausnahme, dass die niederste Bande auf dem silbergefärbten Gel nicht erkannt wurde (entspricht der zentralen Region plus Lipid A auf dem LPS).

  Im Gegensatz dazu erkannte der Antikörper 6D6 in der Spur, welche das LPS des IATS-Serotypen 4 eine ganze Serie von Banden mit regelmässigem Abstand, die nahezu die volle Länge des Gels überspannte, wobei die intensivste Reaktion unter den Banden der höheren Mo lekulargewichte festgestellt wurde. Wiederum entsprach das Profil dem leiterartigen Bandenmuster, welches auf dem Gel festgestellt wurde, welches mit dem LPS-spezifischen Farbstoff gefärbt wurde (d.h. sie schienen Bande für Bande zu entsprechen) mit der Ausnahme, dass die Bande, welche die zentrale Region plus Lipid A darstellte, nicht erkannt wurde. Diese Daten zeigen klar an, dass die O-Seitenkette des LPS das molekulare Ziel war, welches durch den Antikörper 6D6 am Fisher-Immunotyp 2 und an den IATS-Serotypen 4 und 11 erkannt wurde. 



  Zur Bestimmung der in vivo-protektiven Kapazität des Antikörpers 6D6 wurden Schutzstudien durch Tierversuche an Mäusen durchgeführt. Der 6D6-Antikörper wurde zuerst von dem kulturausgeschiedenen Überstand durch Ausfällung mit gesättigtem Ammoniumsulfat (Endkonzentration 50%) konzentriert. Das ausgefällte Material wurde in einem Minimum von sterilem Wasser rekonstituiert, extensiv gegen PBS dialysiert und steril filtriert. Als Negativ-Kontrolle diente ein Kulturüberstand einer anderen transformierten, humanen Zellinie (C5B7-ATCC-Nr. CRL 8753), welche einen humanen, monoklonalen Antikörper produziert, welcher spezifisch auf das LPS des Fisher-Immunotyps 1 ist und in gleicher Weise behandelt wurde. Ähnlich wurde als Positiv-Kontrolle der ausgeschiedene Kulturüberstand der transformierten, humanen Zellinie 6F11 (ATCC-Nr.

  CRL 8562), die einen humanen, monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch auf die LPS des Fisher-Immunotyps 2 und des IATS-Serotyps 11 ist, konzentriert. 



  Weibliche Swiss-Webster-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 22 g wurden in drei Gruppen von je zwanzig Mäusen auf geteilt. Alle Mäusen in jeder Gruppe wurden individuell über den intraperitonealen Weg (ip) mit 0,5 ml konzentriertem 6D6-, CSB7- oder 6F11-Antikörper inokuliert. Sechs Std. später wurde jede der drei Gruppen in vier Gruppen von fünf Mäusen aufgeteilt und Mitglieder jeder Mäuse-Fünfer-Gruppe wurden unabhängig ip mit 0,3 ml einer lebenden Bakterien-Suspension, die 8 LD50 Fisher-Immunotyp 1, Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4, bzw. IATS-Serotyp 11 enthielt, herausgefordert. Die Bakteriensuspensionen, wie im obigen Beispiel IV beschrieben, hergestellt. Nach der Bakterienherausforderung wurden die Tiere während einer Periode von fünf Tagen beobachtet.

  Die Resultate waren folgendermassen: 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Title: Tabelle V 
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: In vivo-Demonstration des protektiven Effektes des humanen, monoklonalen Antikörpers 6D6 gegen den Fisher-Immunotyp 2 und die IATS-Serotypen 4 und 11 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Humaner,
monoklonaler Antikörper: 
<tb>SubHead Col 02 to 05 AL=L: Anzahl Überlebende/Anzahl getestete Tiere
5 Tage nach der Herausforderung mit: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Fisher 1: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Fisher 2: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>IATS 4: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>IATS 11: 
<tb> <SEP>6D6 <SEP>0/5 <SEP>5/5 <SEP>4/5 <SEP>5/5 
<tb> <SEP>6F11 <SEP>0/5 <SEP>5/5 <SEP>0/5 <SEP>5/5 
<tb> <SEP>C5B7 <SEP>5/5 <SEP>1/5 <SEP>0/5 <SEP>0/5 
<tb></TABLE> 



  Wie in Tabelle V dargestellt, zeigte der Antikörper 6D6 eine spezifische und signifikante Schutzwirkung gegen eine lethale Herausforderung mit Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 und IATS-Serotyp 11, jedoch nicht mit dem Fisher-Immunotyp 1. 


 Beispiel VI 
 



  Das Beispiel VI zeigt ein Verfahren für die Herstellung eines humanen, monoklonalen Antikörpers, welcher mit den IATS-Serotypen 6 und 13 und dem Fisher-Immunotyp 1 von p. aeruginosa reagiert. Das in den Beispielen I bis V beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, gewisse Modifikationen bei der Isolierung, Charakterisierung und beim Testen der Antikörper, welche in diesem Beispiel beschrieben sind, vorzunehmen. Nachstehend sind die Änderungen im Verfahren und die Resultate, welche mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erhalten wurden, angeführt. 



   Als Quelle für die humanen B-Zellen diente ein Individuum, welches vorher mit einem Polysaccharid-Präparat immunisiert worden war, das aus dem Fisher-Immunotyp 2 (Pier et al., Infec. Immun., 34: 461 (1981)) isoliert worden war. Nach der Gewinnung von E<->PBMC, wie oben beschrieben, wurden die Zellen in FCS, das 10% (v/v) DMS0 enthielt, in einem Gefäss mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Diese Zellen wurden später schnell auf 37 DEG C aufgetaut, einmal in Iscove-Medium gewaschen und in HAT-Medium wieder suspendiert. Die zellgetriebene Transformation wurde in einer Geschwindigkeit von 15 1A2 Zellen pro E<->PBMC durchgeführt. Die Zellmischung wurde auf 20 Microtiter-Platten mit einer Konzentration von 78 500 Zellen/Vertiefung  aufgetragen.

  Die Kulturen wurden alle drei bis fünf Tage nach dem Auftragen genährt und am elften Tag wurde beobachtet, dass 100% der Vertiefungen wuchernde Zellen enthielten. 



  Zum Screening der Überstände nach der Gegenwart von Anti-p. aeruginosa-Antikörper unter Verwendung der ELISA-Technik, bestand die Antigen-Platte aus einer Mischung von p. aeruginosa-Fisher-Immunotypen 1 bis 7 (klinisches Isolat PSA I277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), ATCC 27 313, PSA G 98 (GSCOB), ATCC 27 315, PSA F 625 (GSCOB), ATCC 27 317, bzw. 27 318). Eine mit PLL behandelte Microtiter-Platte ohne Bakterien wurde beim Screening ebenfalls verwendet. 



  Die Analyse der Kulturüberstände durch die obige Methode führte zur Identifikation von ungefähr 20 Vertiefungen, welche Anti-p. aeruginosa-Antikörper enthielten, welche mit der Platte mit den Fisher-Immunotypen 1 bis 7 reagierten, jedoch nicht mit der PLL-behandelten Platte ohne Bakterien. Zur Identifikation derjenigen Vertiefungen, welche Antikörper enthielten, die mit zwei oder mehr IATS-Serotypen reaktiv waren, wurden Antigen-Platten konstruiert, wie oben, wobei eine Säule der Platten PLL-fixierte Bakterien eines einzigen IATS-Serotyps enthielt. Es wurde ein ELISA durchgeführt, wie oben angegeben, wobei der Überstand einer ausgedehnten Kultur jeder der anti-p. aeruginosa-positiven Löcher verwendet wurde.

  Die Überstände wurden in einer Reihe auf neuen Antigen-Platten angeordnet, wobei die Identifikation einer Anzahl Löcher erhalten wurde, welche Antikörper enthielten, die mit mehreren IATS-Serotypen reaktiv waren. Ein Loch mit 8H7 bezeichnet, enthielt Antikörper, die spezifisch auf die IATS-Serotypen 6 und 13 waren. Beim Test des Überstandes aus diesem Loch durch ELISA mit den 7 Fisher-Immunotypen, wie in Beispiel V,  wurde gefunden, dass die Antikörper von 8H7 spezifisch auf den Fisher-Immunotyp 1 waren. 



  Um zu bestimmen, ob das Anti-IATS-Serotypen 6 und 13-Reaktionsmuster das Resultat eines oder mehrerer Antikörper im Loch 8H7 war, wurden zusätzlich aliquote Anteile des Überstandes unabhängig voneinander mit den IATS-Serotypen 6, 13 und 17 (Negativ-Kontrolle) adsorbiert und die adsorbierten Überstände dann auf PLL-fixierten Bakterien auf jeden der beiden IATS-Serotypen gemäss den oben angeführten ELISA-Assay getestet. Die Resultate ergaben, dass die IATS-Serotypen 6 und 13 Antikörper-Aktivität adsorbierten gegen jeden anderen. Der IATS-Serotyp 17 adsorbierte keine Aktivität gegen IATS 6 oder 13. Diese Daten demonstrierten, dass das Reaktionsmuster der Anti-IATS-Serotypen 6 und 13 aufgrund eines einzigen Antikörpers aus der Vertiefung 8H7 entstanden. 



  Die Isolierung und Klonierung der Antikörper-produzierenden Zellen aus der Vertiefung 8H7 wurden in drei Schritten durchgeführt, im wesentlichen wie oben im Beispiel V beschrieben. Durch diese Mittel wurde eine klonierte, transformierte, humane Zellinie erhalten, welche kontinuierlich wächst (d.h. unsterblich ist) und einen humanen, monoklonalen Antikörper ausscheidet, welcher mit dem Fisher-Immunotyp reaktiv und mit den IATS-Serotypen 6 und 13 kreuz-reaktiv war. In diesem Beispiel tragen die Zelllinie und die Antikörper, die durch sie produziert werden, die gleiche Bezeichnung, nämlich 8H7. Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens, wie dasjenige, welches in Beispiel V beschrieben ist, wurde der Antikörper im Loch 8H7 als IgM bestimmt. 



  Die biochemische Charakterisierung der Molekülarten, wel che durch den 8H7-Antikörper erkannt werden, wurde durch Immunoblot-Analyse durchgeführt, wie dies in den Beispielen II und V beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, dass die LPS-Präparate aus Fisher-Immunotyp 1 und den IATS-Serotypen 6 und 13 auf Antigen-Präparate für die Analyse verwendet wurden. Als Negativ-Kontrolle wurden ein LPS-Präparat aus dem IATS-Serotyp 10 verwendet. 



  Die Analyse der erhaltenen Immunoblots zeigte nur positive Reaktionen auf den NCM-Spuren, welche einen LPS aus dem Fisher-Immunotyp 1, dem IATS-Serotyp 6 oder dem IATS-Serotyp 13 enthielten. In den Fisher-Immunotyp 1- und IATS-Serotyp 6-Spuren erkannte der Antikörper 8H7 eine Serie von regelmässig angeordneten (d.h. leiterartigen) Banden, welche nahezu die volle Länge des Gels überspannten. Diese Banden entsprachen genau Formen mit mehrfachem Molekulargewicht von LPS-Molekülen, wie dies durch ein in ähnlicher Weise hergestelltes SDS-PAGE-Gel visualisiert wurde, worin jedoch die Antigene nicht auf eine NCM transferiert wurden, jedoch LPS-spezifisch gefärbt wurden.

  In der Spur, welche das LPS vom IATS-Serotypen 13 enthielt, erkannte der Antikörper 8H7 eine abgekürztere Serie mit regelmässigen Zwischenräumen angeordneten Banden, welche einem mittleren bis höheren Molekulargewichtbereich auf dem Gel entsprachen. Wiederum wurden die entsprechenden Banden auf einem LPS-spezifisch gefärbten Gel erkannt, jedoch mit der Ausnahme, dass die LPS-Formen mit den höchsten und niedersten Molekulargewichten auf dem gefärbten Gel nicht erschienen, während sie im Westernblot gut erkennbar waren. Diese Daten zeigen klar, dass das LPS das Zielmolekül war, welches durch den Antikörper 8H7 auf dem Fisher-Immunotyp 1 und auf den IATS-Serotypen 6 und 13 erkannt wurde. 



  Zur Bestimmung der in vivo-Schutzkapazität des Antikörpers 8H7 wurden Schutzstudien mittels Tierversuchen an Mäusen durchgeführt, wie dies in den obigen Beispielen IV und V beschrieben ist. Als Negativ-Kontrolle diente ein ausgeschiedener Kulturüberstand einer anderen transformierten, humanen Zellinie (6F11-ATCC Nr. CRL 8652), welcher ein für das LPS des Fisher-Immunotyps 2 spezifischer monoklonaler Antikörper produziert und in gleicher Weise behandelt wurde. Als Positiv-Kontrolle diente ein Kulturüberstand der von einer transformierten, humanen Zellinie C5B7 (ATCC Nr. CRL 8753) ausgeschieden wurde und einen humanen, monoklonalen Antikörper für den Fisher-Immunotyp 1 und den IATS-Serotyp 6 ausscheidet. 



   Weibliche Swiss-Webster-Mäuse mit einem Körpergewicht von 20 bis 22 g wurden in drei Gruppen von je 30 Mäusen aufgeteilt. Alle Mäuse in jeder Gruppe wurden individuell intraperitoneal (ip) mit 0,5 ml konzentriertem 8H7, 6F11 oder C5B7-Antikörpern inokuliert. Fünf Stunden später wurde jede der drei Gruppen in drei Gruppen von zehn Mäusen aufgeteilt und Mitglieder jeder 10-Mäuse-Gruppe wurden, unabhängig voneinander, ip mit 0,3 ml einer Suspension mit lebenden Bakterien inokuliert, welche 9,4 LD50 eines klinisches Isolates (A522) eines repräsentativen Organismus von IATS-Serotyp 6 (equivalent mit Fisher-Immunotyp 1), 5 LD50 des IATS-13-Referenz-Serotyps oder 10 LD50 des IATS-LL-Referenz-Serotyps (equivalent mit dem Fisher-Immunotyp 2) enthielt. Die bakteriellen Suspensionen wurden, wie im obigen Beispiel IV beschrieben hergestellt.

  Nach der bakteriellen Herausforderung wurden die Tiere während einer Periode von fünf Tagen beobachtet. Die Resultate sind folgende: 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle VI 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: In vivo-Demonstration des protektiven Effektes des humanen, monoklonalen Antikörper 8H7 gegen die IATS-Serotypen 6 und 13 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Humaner,
monoklonaler Antikörper: 
<tb>SubHead Col 02 to 04 AL=L: Anzahl Überlebende/Anzahl getestete Tiere
5 Tage nach der Herausforderung mit: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>IATS 6: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>IATS 13: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>IATS 11: 
<tb> <SEP>8H7 <SEP>9/10 <SEP>6/10 <SEP>1/10 
<tb> <SEP>C5B7 <SEP>9/10 <SEP>0/10 <SEP>0/10 
<tb> <SEP>6F11 <SEP>0/10 <SEP>2/10 <SEP>10/10 
<tb></TABLE> 



  Wie in Tabelle VI dargestellt, bewirkte der Antikörper 8H7 einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine lethale Herausforderung des IATS-Serotyps 6, jedoch nicht gegen den IATS-Serotypen 11. Die Schutzwirkung gegen den IATS-Serotypen 13 war von geringerem Grad, kann aber durch die verhältnismässig hohe Anzahl von Organismen erklärt werden, welche erforderlich sind, um den LD50 für dieses Isolat zu erreichen, verglichen mit dem Isolat des Serotypen 6 (3 x 10<7> Kolonien-bildende Einheiten, bzw. 2,6 x 10<6> Kolonien-bildende Einheiten). In einem separaten Versuch schützte der Antikörper 8H7 fünf von fünf Mäusen, welche mit 3,5 LD50 eines IATS-13-Isolates herausgefordert wurden und fünf von fünf Mäusen, welche mit dem IATS-6-Isolat herausgefordert wurden. 



   Aus dem bisher Genannten geht hervor, dass die erfindungsgemässen Zellinien humane, monoklonale Antikörper und Frag mente davon zur Verfügung stellen, die kreuz-reaktiv für und kreuz-protektiv gegen verschiedene p. aeruginosa-IATS-Serotypen sind. Dies erlaubt die leichtere Entwicklung von prophylaktischen und therapeutischen Zusammensetzungen, welche wirksam gegen Infektionen, die durch die meisten, jedoch nicht von allen p. aeruginosa-Stämmen verursacht werden. Zusätzlich produzieren die Zellinien Antikörper, welche Verwendung in Immuno-Assays und anderen wohlbekannten Verfahren finden. 



  Trotzdem die vorliegende Erfindung zwecks Klarheit und zum besseren Verständnis im einzelnen durch Erläuterungen und Beispiele beschrieben worden ist, ist es naheliegend, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Definitionsbereiches der beiliegenden Ansprüche möglich sind. 

Claims (14)

1. Humaner, monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon, die eine Mehrzahl, jedoch nicht alle IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa spezifisch binden.

2. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er in vivo zumindest gegen zwei IATS-Serotypen protektiv ist.

3. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen jeden Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa nicht reaktiv ist.

4. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa reagiert.

5. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem oder zwei Fisher-Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert.

6.

Monoklonaler Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Bindungsfragment davon als Mittel für die Behandlung von humanen Patienten, die empfindlich sind auf Leiden, die durch Pseudomonas aeruginosa verursacht werden.

7. Immortale, transformierte Zellinie zur Herstellung eines humanen monoklonalen Antikörpers gemäss Anspruch 1, welcher nicht mit allen, jedoch mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa spezifisch reagiert.

8. Zellinie gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die ATCC-Nr. CRL 8941, 9171 oder 9258 besitzt.

9. Humaner, monoklonaler Antikörper, welcher gegen ein Epitop reaktiv ist, das mit einem monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1 reagiert.

10.

Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10 für die Behandlung oder Prävention einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen humanen, monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 2 in Kombination mit einem bakteriostatischen Mittel, einer gamma -Globulinfraktion aus humanem Blutplasma-Immunoglobulin und/oder einem physiologisch annehmbaren Träger enthält.

12.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10 für die Behandlung oder Prävention einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei humane, monoklonale Antikörper, wobei mindestens einer der Antikörper gegen mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa protektiv ist, ein bakteriostatisches Mittel, eine gamma -Globulinfraktion aus humanem Blutplasma und/oder einen physiologisch annehmbaren Träger enthält.

13. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Pseudomonas aeruginosa in Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1, welcher mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reaktiv ist, kombiniert wird und die Komplexbildung nachgewiesen wird.

14.

Reagenziensatz zum Nachweis der Gegenwart von Pseudomonas aeruginosa, enthaltend mindestens einen humanen, monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1, der nicht mit allen, jedoch mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert, und Markierungsmittel, die für ein nachweisbares Signal kovalent an die Antikörper oder an zweite Antikörper, welche mit dem monoklonalen Antikörper reaktiv sind, gebunden sind. 1. Humaner, monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon, die eine Mehrzahl, jedoch nicht alle IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa spezifisch binden. 2. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er in vivo zumindest gegen zwei IATS-Serotypen protektiv ist. 3. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen jeden Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa nicht reaktiv ist. 4. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa reagiert. 5. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem oder zwei Fisher-Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert. 6.

Monoklonaler Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Bindungsfragment davon als Mittel für die Behandlung von humanen Patienten, die empfindlich sind auf Leiden, die durch Pseudomonas aeruginosa verursacht werden. 7. Immortale, transformierte Zellinie zur Herstellung eines humanen monoklonalen Antikörpers gemäss Anspruch 1, welcher nicht mit allen, jedoch mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa spezifisch reagiert. 8. Zellinie gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die ATCC-Nr. CRL 8941, 9171 oder 9258 besitzt. 9. Humaner, monoklonaler Antikörper, welcher gegen ein Epitop reaktiv ist, das mit einem monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1 reagiert. 10.

Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. 11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10 für die Behandlung oder Prävention einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen humanen, monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 2 in Kombination mit einem bakteriostatischen Mittel, einer gamma -Globulinfraktion aus humanem Blutplasma-Immunoglobulin und/oder einem physiologisch annehmbaren Träger enthält. 12.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10 für die Behandlung oder Prävention einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei humane, monoklonale Antikörper, wobei mindestens einer der Antikörper gegen mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa protektiv ist, ein bakteriostatisches Mittel, eine gamma -Globulinfraktion aus humanem Blutplasma und/oder einen physiologisch annehmbaren Träger enthält. 13. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Pseudomonas aeruginosa in Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1, welcher mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reaktiv ist, kombiniert wird und die Komplexbildung nachgewiesen wird. 14.

Reagenziensatz zum Nachweis der Gegenwart von Pseudomonas aeruginosa, enthaltend mindestens einen humanen, monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1, der nicht mit allen, jedoch mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert, und Markierungsmittel, die für ein nachweisbares Signal kovalent an die Antikörper oder an zweite Antikörper, welche mit dem monoklonalen Antikörper reaktiv sind, gebunden sind.