DE3642095A1 - Monoclonale antikoerper, die kreuzreaktiv und kreuzprotektiv gegen p. aeruginosa-serotypen sind - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Anwendung von immunologischen Techniken zur Schaffung neuer Materialien, die zur Diagnose und Behandlung von bakteriellen Infektionen brauchbar sind, und insbesondere auf die Herstellung und Anwendung von menschlichen monoclonalen Antikörpern, die zur Erkennung vielfacher Serotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig sind.

Gramnegative Erkrankungen und ihre sehr schweren Komplikationen wie Bakteriämie und Endotoxämie sind die Ursache für signifikante Morbidität und Mortalität bei menschlichen Patienten. Dies trifft insbesondere zu bei dem gramnegativen Organismus Pseudonomas aeruginosa, welcher über den Zeitraum der letzten 50 Jahre in zunehmendem Maße verbunden ist mit bakteriellen Infektionen, insbesondere Krankenhaus-Infektionen.

Während der letzten Dekaden waren Antibiotika das Mittel der Wahl zur Kontrolle von gramnegativen Erkrankungen. Die fortgesetzte hohe Morbidität und hohe Mortalität, die mit Erkrankungen mit gramnegativen Bakterien verbunden ist, ist jedoch ein Anzeichen für die Grenzen der antibiotischen Therapie, insbesondere soweit es P. aeruginsoa (siehe beispielsweise Andriole, V. G., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Surival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94: 196-199) betrifft. Dies hat die Forschung nach alternativen Methoden zur Verhütung und Behandlung veranlaßt.

Eine in Betracht gezogene Methode ist die Vermehrung des Immunsystems des Wirtes durch aktive oder passive Immunisierung. Beispielsweise wurde beobachtet, daß aktive Immunisierung von Menschen oder Versuchstieren mit bakteriellen Impfstoffen aus ganzen Zellen oder gereinigten bakteriellen Endotoxinen von P. aeruginosa zur Entwicklung von spezifischen opsonischen Antikörpern führt, die vorwiegend gegen Determinanten auf den sich wiederholenden Oligosaccharid-Einheiten der Lipopolysaccharid(LPS)-Moleküle gerichtet sind, die auf der äußeren Zellmembran von P. aeruginosa lokalisiert sind (vgl. Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B. M. and Finlayson, J. S., eds, pp. 73-79, U. S. Department of Health and Human Services, 1979). Solche Antikörper, die entweder aktiv erzeugt oder passiv transferiert sind, haben sich als schützend gegen die letalen Auswirkungen von P. aeruginosa-Infektion in einer Vielzahl von Tiermodellen (vgl. Pollack, oben) und in einigen vorläufigen Untersuchungen vom Menschen (siehe Young, L. S. und Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L. ed., pp. 119-132, Hans Huber, 1980) erwiesen. Darüber hinaus ist für die Rolle dieser Antikörper beim Menschen von besonderer Bedeutung, daß bei Patienten mit P. aeruginosa-Bakteriämie ein Zusammenhang zwischen Überleben und hohen akuten Serumtitern von Antikörpern gegen die LPS- Moleküle des infizierenden Stammes gefunden wurde (vgl. Pollack, M. und Young, L. S., J. Clin Invest., 63: 276-286, (1979)).

Die obigen Berichte lassen die Schlußfolgerung zu, daß immuntherapeutische Maßnahmen zur Verhinderung und Behandlung bakterieller Erkrankungen durch P. aeruginosa angewendet werden können, z. B. durch Verabreichung gepoolter menschlicher Immunglobuline, die Antikörper gegen den bzw. die infizierenden Stämme enthalten. Menschliche Immunglobuline wären hier als der Anteil eines fraktionierten menschlichen Plasmas definiert, der auf Antikörper angereichert ist, unter denen sich spezifische Antikörper gegen Stämme von P. aeruginosa befinden. Aufgrund gewisser inhärenter Beschränkungen in der Verwendung von menschlichen Immunglobulin-Komponenten verbleibt dieser Behandlungsweg von Erkrankungen durch P. aeruginosa im Untersuchungsstadium (vgl. beispielsweise Collins, M. S. und Roby, R. E., Am. J. Med., 76(3A): 168-174, (1984)), und bis heute sind keine handelsüblichen Produkte, die solche Komponenten anwenden, erhältlich.

Eine solche mit Immunglobulin-Zusammensetzungen verbundene Beschränkung liegt darin, daß sie aus Sammlungen von Proben von tausend oder mehr Spendern bestehen, wobei solche Proben zuvor anhand der Gegenwart von bestimmten Anti-Pseudomonas- Antikörpern ausgelesen wurden. Dieses sog. Poolen führt zu einem Mitteln der individuellen Antikörper-Titer, was bestenfalls zu einem mäßigen Anstieg des erhaltenen Titers der gewünschten Antikörper führt.

Eine weitere Beschränkung liegt darin, daß das Vorauswahlverfahren selbst ein aufwendiges kontinuierliches Aussieben des Spender-Pools erfordert, um die Konsistenz des Produktes zu sichern. Trotz dieser Bemühungen können Immunglobulin- Produkte immer noch eine erhebliche Variabilität und Charge zu Charge und unter Prdukten aus unterschiedlichen geographischen Regionen aufweisen.

Eine weitere Begrenzung bei den Immunglobulin-Zusammensetzungen liegt darin, daß ihre Anwendung mit einer Verabreichung von großen Mengen an fremden proteinartigen Substanzen zusammenfällt (welche auch Viren, z. B. solche, die kürzlich im Zusammenhang mit dem Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS genannt, gebracht wurden), und diese Substanzen schädliche biologische Auswirkungen verursachen können. Niedrige Titer der gewünschten Antikörper in Verbindung mit einem hohen Gehalt an Fremdsubstanzen kann die Menge an spezifischen und somit günstig wirkenden Immunglobulinen, die dem Patienten verabreicht werden sollen, auf nichtoptimale Werte begrenzen.

Es gibt in der Literatur eine Anzahl von Serotyp-Schemata, welche zum Analysieren von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen brauchbar sind. Die Schemata basieren hauptsächlich auf den wärmestabilen größeren somatischen Antigenen dieses Organismus (vgl. Zierdt, C. H., in Glucose Nonfermenting Gram- Negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G. L., ed., CRC Press, pp. 213-238 (1978)). Die Auswucherung der serogruppierenden Schemata hat es ziemlich schwer gemacht, serologische Studien von P. aeruginosa zu vergleichen, und so erscheint die Wahl eines gegebenen Systems für den Zweck des Untersuchens von Überständen ziemlich zufällig. Die Konfusion zwischen typisierenden Systemen wurde kürzlich durch die Schaffung des "International Antigenic Typing Scheme" (IATS)-Systems geklärt, welches vom Subkomitee für Pseudomonadaceae des "International Committee on Systematic Bacteriology" als Rückgrat für weitere serologische Studien an P. aeruginosa vorgeschlagen wurde. Dieses System, das siebzehn bestimmte Serotypen mit der Bezeichnung IATS Type 1, IATS Typ 2, usw. vorsieht, umfaßt alle wärmestabilen größeren somatischen Antigene, die in den früheren Systemen identifiziert wurden (vgl. Liu, P. V., Int. J. Syst. Bacteriol., 33: 256-264, (1983) worauf hier Bezug genommen wird).

Bei der Entwicklung schützender monoclonaler Antikörper, die kreuzreaktiv mit Stämmen von P. aeruginosa sind, ist es außerdem vorteilhaft, ein Typisierungsschema einzubringen, das auf den Schutz-Antigenen von P. aeruginosa basiert. Ein solches Schema wurde mit der Absicht der Entwicklung eines Impfstoffs für die klinische Anwendung ersonnen und ist detailliert beschrieben von Fisher, M. W. et al., J. Bacteriol., 98: 835-836, (1969). Dieses System, das gebräuchlicherweise als Fisher-Typisierungssystem bezeichnet wird, klassifiziert die Mehrzahl der bekannten P. aeruginosa in sieben Typen mit der Bezeichnung Fisher-Immunotyp 1, Fisher-Immunotyp 2, usw. Die Zusammenhänge zwischen den IATS- und Fisher-Typisierungssystemen sind geklärt (vgl. Liu, P. V., et al., wie oben angegeben) und ist in Tabelle I dargestellt. Wie in der Tabelle I vermerkt, gibt es keine entsprechenden Fisher-Immunotypen für bestimmte IATS-Serotypen, obwohl jeder Fisher-Immunotyp einem bestimmten IATS- Serotyp entspricht. Es wird angenommen, daß die antigenen Determinanten, die für beide Serotyp-Schemata relevant sind, also IATS- und Fisher-Typisierungssystemen, auf den Oberflächen- LPS-Molekülen von P. aeruginosa sitzen (Liu, P. V. et al., siehe oben; Hanessien, F., et al., Nature, 229: 209-210 (1979)).
IATSFisher  14  23  3-  4-  57  61  7-  86  9- 105 112 12- 13- 14- 15- 16- 17-

1975 berichteten Kohler und Milstein über ihre zukunftsträchtige Entdeckung, daß bestimmte Mäuse-Zellinien mit Mäuse- Milzzellen unter Schaffung von Hybridzellen verschmolzen werden konnten, von denen jede in der Lage war, Antikörper einer einzigen Spezifität auszuscheiden, d. h. monoclonale Antikörper (Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495- 497 (1975)). Mit der Ankündigung dieser Technologie wurde es möglich, in einzelnen Fällen große Mengen an hervorragend spezifischen Mäuse-Antikörpern gegen eine bestimmte Determinante oder Determinanten auf Antigenen zu schaffen. Solche von Mäusen gewonnenen monoclonalen Antikörper oder Zusammensetzungen von solchen Antikörpern haben jedoch schwerwiegende Nachteile bei der Behandlung von Menschen; dies insbesondere im Hinblick darauf, daß bei der Verwendung monoclonaler Antikörper aus Mäusen bei versuchsweisen Studien zur Behandlung bestimmter Krankheiten beim Menschen häufig beobachtet wurde, daß die monoclonalen Antikörper einen Immunrespons hervorrufen, der sie unwirksam macht (Levy, R. L. und Miller, R. A., Ann. Rev. Med., 34: 107-116, (1983)).

Sadoff et al. berichten über die Herstellung eines aus Mäusen gewonnenen monoclonalen Antikörpers der IgM-Klasse unter Anwendung der Hybridtechnik, der gegen eine O-Seitenketten- Determinante auf den LPS-Molekülen eines besonderen Serotyps von P. aeruginosa gerichtet war (Abstracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Nr. 253). Sie berichteten weiter, daß dieser Mäuse-Antikörper Mäuse gegen eine tödliche Herausforderung von P. aeruginosa desselben Serotyps wie der Typ, gegen den die Antikörper gerichtet waren (d. h. der homologe Serotyp) schützte. Mehrere nachfolgende Artikel beschrieben detailliert die Entwicklung von Mäuse- und Menschen-Anti-P. aeruginosa- LPS-monoclonalen Antikörpern unterschiedlicher Spezifität (vgl. beispielsweise Sawada, S., et al., J. Inf. Dis., 150: 570-576, (1984); Sadoff, J., et al., Antibiot. Chemother., 36: 134-146, (1985); Hancock, R., et al., Infect. Immun. 37: 166-171 (1982); Siadak, A. W. und Lostrom, M. E., in Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, E. G., et al., eds., pp. 167-185, Plenum Publishing Corp. (1985) und Sawada, S. et al., J. Inf. Dis., 152: 965-970, (1985). Die Herstellung und immuntherapeutische Anwendung von Anti-P. aeruginosa-LPS-Serotyp-spezifischen menschlichen monoclonalen Antikörpern sind in den US-Patentanmeldungen Nr. 7 34 624 und 8 28 005 beschrieben, auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird.

Während bestimmte Vorteile bei der Anwendung monoclonaler Antikörper, die gegenüber einem einzelnen IATS-Serotyp von P. aeruginosa spezifisch sind, in manchen Situationen gegeben sein können, so z. B. wenn die Infektion auf einen einzelnen Serotyp zurückgeführt werden kann, so sind diese in vielen anderen Fällen noch nicht bevorzugt. Zum Beispiel wäre es bei der prophylaktischen Behandlung gegen potentielle Infektionen beim Menschen bevorzugt, einen oder mehrere menschliche Antikörper zu verabreichen, die schützend gegen eine Vielzahl von IATS-Serotypen sind. Ähnlich ist dies bei der therapeutischen Anwendung, wenn der oder die Serotypen des oder der infizierenden Stämme nicht bekannt sind. Hier ist es bevorzugt, einen oder mehrere menschliche Antikörper zu verabreichen, die gegen die meisten, wenn nicht gegen alle der klinisch bedeutsamen P. aeruginosa-IATS-Serotypen sind. Es kann zwar eine Kombination von menschlichen monoclonalen Antikörpern, von denen jeder spezifisch gegen einen einzelnen IATS-Serotyp von P. aeruginosa ist, theoretisch formuliert werden, um einen Schutz gegen verschiedene Serotypen zu erreichen. Eine solche Zusammensetzung würde jedoch schwierig zu entwickeln sein und ist in der Herstellung auch unökonomisch.

Es besteht somit ein deutlicher Bedarf an menschlichen Anti-P. aeruginosa monoclonalen Antikörpern, die zum Erkennen von und zum Schutze gegen vielfältige IATS-Serotypen von P. aeruginosa geeignet sind. Weiterhin sollten diese Antikörper für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Infektionen mit P. aeruginosa geeignet sein. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung erfüllt.

Es wurden neue Zellinien geschaffen, die menschliche monoclonale Antikörper produzieren können, die zur spezifischen Reaktion mit den LPS-Molekülen einer Vielzahl, jedoch nicht aller IATS-Serotypen von P. aeruginosa fähig sind. Diese Antikörper besitzen unterschiedliche Reaktivitäten mit Fisher-Immunotypen, und binden an keinen, einen oder eine Mehrzahl von Immunotypen. Es wurde weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Menschen, die gegenüber einer Infektion mit P. aeruginosa anfällig oder bereits infiziert sind, geschaffen. Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung aus mindestens einem humanen monoclonalen Antikörper oder Bindungsfragment davon, der zur Kreuzreaktion mit P. aeruginosa IATS-Serotypen fähig ist, wobei die Zusammensetzung vorzugsweise auch einen physiologisch akzeptierbaren Träger enthält. Die Zusammensetzung kann auch einen oder mehrere der nachfolgenden Bestandteile enthalten: zusätzliche humane monoclonale Antikörper, die zur Reaktion mit P. aeruginosa Flagella, Exotoxin A oder mit anderen Serotyp- oder Immunotyp- Determinanten auf dem LPS von P. aeruginosa fähig sind; eine Gammagobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma, wobei das Plasma von solchen Menschen stammt, die erhöhte Immunglobulinspiegel zeigen, die gegen P. aeruginosa reaktiv sind; und ein oder mehrere antimikrobielle Mittel.

Durch die Erfindung wurden neue Zellen geschaffen, die zur Herstellung von menschlichen monoclonalen Antikörpern und solche Antikörper enthaltenden Zusammensetzungen fähig sind. Diese Zusammensetzungen sind in der Lage, mindestens eine Mehrzahl und in manchen Fällen alle P. aeruginosa-Stämme zu erkennen, wobei einzelne Antikörper typischerweise mehrfache IATS-Serotypen und Null, einen oder mehrere Fisher-Immunotypen von P. aeruginosa erkennen. Die entsprechenden Zellen haben identifizierbare Chromosomen, in denen die Keim-Linien DNA (germ-line DNA) aus ihnen oder aus Precursor-Zellen wieder geordnet ist, um einen Antikörper mit einer Bindungsstelle für ein Epitop, das gemeinsam unter bestimmten P. aeruginosa-Serotypen ist, zu kodieren. Diese menschlichen monoclonalen Antikörper können auf vielseitige Weise eingesetzt werden, einschließlich der Diagnose und Therapie, z. B. zum Schutze in vivo.

Typischerweise können die Zellen nach der vorliegenden Erfindung menschliche transformierte Lymphozyten sein, die schützende menschliche monoclonale Antikörper gegen zugängliche LPS-Moleküle von P. aeruginosa produzieren. Unter "zugänglich" ist hier zu verstehen, daß die LPS-Moleküle physikalisch im Anwendungsbereich verfügbar für eine direkte Zwischenreaktion mit den monoclonalen Antikörpern sind. Die so geschaffenen monoclonalen Antikörper sind brauchbar für die Behandlung oder Prophylaxe von schweren Krankheiten aufgrund von P. aeruginosa. Die LPS-Moleküle der äußeren Membran von P. aeruginosa stehen für einen direkten Kontakt mit den Antikörper- Molekülen zur Verfügung und erleichtern somit eine Komplement-Lyse und/oder eine Phagocytose des Organismus. Solche LPS-Moleküle, die von der äußeren Membran in die nähere Umgebung abgegeben werden, sind dann ebenfalls frei zu einer direkten Wechselwirkung mit den Antikörper-Molekülen und können über das Reticuloendothele-System geklärt werden.

Die Herstellung der monoclonalen Antikörper kann erreicht werden durch Unsterblichmachen der Expression von Nukleinsäure- Sequenzen, welche Antikörper kodiert enthalten, die für ein Epitop auf den LPS-Molekülen von multiplen Serotypen von P. aeruginosa spezifisch sind. Typischerweise werden die monoclonalen Antikörper durch zellgezogene Epstein-Barr- Virus (EBV) Transformation von B-Lymphozytenzellen hergestellt, die von menschlichen Spendern erhalten wurden, die dem oder den geeigneten Serotypen von P. aeruginosa ausgesetzt waren. Die so hergestellten, den Antikörper ausscheidenden Zellinie sind charakterisiert als kontinuierlich wachsende Lymphoblastoid-Zellen, welche einen Diploid-Karyotyp besitzen, Epstein-Barr-Kern-Antigen positiv sind und monoclonale Antikörper vom Isotyp, IgG, IgM, IgA oder IgD ausscheiden, einschließlich der verschiedenen Untertypen wie IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Das zellgeführte Transformationsverfahren selbst ist im einzelnen im Patent 44 64 465 beschrieben, auf dessen Inhalt hier Bezug genommen wird. Die monoclonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente wie z. B. als Fv, Fab, F(ab′)₂ verwendet werden, jedoch normalerweise intakt, wobei die Herstellung nach an sich bekannten Verfahren erfolgt.

Alternativ können Zellinien, die die Antikörper produzieren, hergestellt werden durch Zellfusion zwischen geeigneten, mit Präparaten markierten Humanmyelom-, Mäusemyelom-, Human-Mäuse- Heteromyelom- oder Humanlymphoblastoid-Zellen mit Human- B-Lymphozyten, um Human-Hybridzellinien zu erhalten.

Die Zellinien nach der vorliegenden Erfindung können auch eine andere Verwendung als die für die direkte Herstellung der humanen monoclonalen Antikörper finden. Die Zellinien können mit anderen Zellen (wie z. B. geeigneten mit Präparaten markierten Humanmyelom-, Mäusemyelom-, Human-Mäuse-Hetereomyelom- oder Human-Lymphoblastoid-Zellen) verschmolzen werden,, um Hybridome zu erhalten und somit einen Transfer der Gene vorzusehen, die die monoclonalen Antikörper kodiert enthalten. Alternativ können die Zellinien auch als eine Quelle von Chromosomen verwendet werden, die die Immunglobuline kodiert enthalten, welche isoliert und durch andere Techniken als durch Fusion in Zellen transferiert werden können. Zusätzlich können die Gene, die die monoclonalen Antikörper kodiert enthalten, auch isoliert werden und unter Anwendung der Rekombinations-DNA-Techniken zur Herstellung des spezifischen Immunglobulins in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden. Insbesondere durch Herstellen von cDNA- Büchereien (libraries) aus Messenger RNA kann ein einzelnes cDNA-Klon, das das Immunglobulin kodiert enthält und intron-frei ist, isoliert und in einen geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvector plaziert und danach in einen Wirt zur letztlichen Massenproduktion transformiert werden.

Die Lymphoblastoid- oder Hybridzellinien können geklont und ausgelesen werden in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken mit den Antikörpern, die in der Lage sind, an die Epitope von verschiedenen P. aeruginosa IATS-Serotypen und Fisher-Immunotypen zu binden und im Zell-Überstand gefunden wurden. Durch Verwenden von Antikörpern der vorliegenden Erfindung als Blockierungs-Antikörper bei der Auslese können nach an sich bekannten Verfahren zusätzliche monoclonale Antikörper isoliert werden, die dieselben Antigenen-Determinanten oder Epitope erkennen.

Nach einem Aspekt der Erfindung werden menschliche monoclonale Antikörper geschaffen, die zur spezifischen Bindung an die Liposaccharid-Determinanten in der Lage sind, die auf einer Vielzahl jedoch nicht allen IATS-Serotypen von P. aeruginosa vorhanden sind. Diese Determinanten können beispielsweise auf zwei oder drei IATS-Serotypen vorhanden sein und auf Null, einem oder mindestens zwei Fisher-Immunotypen. Solche Antikörper können in vivo gegen einige oder alle der erkannten Serotypen und Immunotypen, insbesondere zwei oder mehr Serotypen schützen.

Monclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung finden auch eine weitgefächerte Anwendung in vitro. Beispielsweise können die monoclonalen Antikörper zum Typisieren verwendet werden, zur Isolation spezifischer P. aeruginosa-Stämme, zum selektiven Entfernen von P. aeruginosa-Zellen in einer heterogenen Zellmischung oder dergleichen.

Für diagnostische Zwecke können die monoclonalen Antikörper entweder markiert oder unmarkiert sein. Typischerweise führen diagnostische Versuche zu einem Auffinden der Bildung eines Komplexes durch die Bindung der monoclonalen Antikörper an die LPS von P. aeruginosa-Organismen. Unmarkiert finden die Antikörper Verwendung in Agglutinations-Versuchen. Zusätzlich können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (zweite Antikörper) verwendet werden, die mit dem monoclonalen Antikörper reagieren, wie z. B. für immunglobulinspezifische Antikörper. Andererseits können die monoclonalen Antikörper auch direkt markiert sein. Eine weite Vielfalt von Markierungen kann angewendet werden, wie z. B. Radionuklide, Fluoreszenzbildner, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Kofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene), usw. Zahlreiche Typen von Immununtersuchungen sind verfügbar und einige davon beispielsweise in den nachfolgenden US-Patentschriften beschrieben, auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird: US-Patente Nr. 38 17 827; 38 50 752; 39 01 654; 39 35 074; 39 84 533; 39 96 345; 40 34 074 und 40 98 876.

Die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch für enzymatische Immununtersuchungen verwendet werden, bei denen die entsprechenden Antikörper oder zweite Antikörper as einer verschiedenen Spezies an ein Enzym konjugiert werden. Wird eine Probe die P. aeruginosa eines bestimmten Serotyps, wie z. B. menschliches Blut oder ein Lysat davon, enthält, mit den Antikörpern nach der Erfindung kombiniert, dann findet eine Bindng zwischen den Antikörpern und den Molekülen statt, die das gewünschte Epitop zeigen. Solche Zellen können von den nicht gebundenen Reagenzien abgetrennt werden, und es kann ein zweiter Antikörper, der mit einem Enzym markiert ist, zugegeben werden. Danach wird das Vorhandensein des Antikörper-Enzym-Konjugats, das spezifisch an die Zellen gebunden ist, bestimmt. Es können auch andere herkömmliche im Stand der Technik bekannte Techniken angewendet werden.

Es können auch Kits vorgesehen sein, bei denen die erfindungsgemäßen Antikörper zum Auffinden einer P. aeruginosa- Infektion oder des Vorhandenseins von P. aeruginosa-Antigen verwendet werden. So kann die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper entweder allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Antikörpern, die gegenüber anderen gramnegativen Bakterien spezifisch sind, vorliegen und zwar normalerweise in gefriergetrockneter Form. Die Antikörper, die an einen Marker konjugiert sein können oder auch unkonjugiert vorliegen können, sind im Kit normalerweise gemeinsam vorhanden mit Puffern, wie Tris, Phosphat, Carbonat u. dgl., Stabilisatoren, Biociden, inerten Proteinen, z. B. Rinderserumalbumin, o. dgl. Im allgemeinen sind diese Materialien in Mengen von weniger als ca. 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge an aktivem Antikörper und gewöhnlich in Gesamtmengen von mindestens 0,001 Gew.-%, wiederum bezogen auf die Antikörper-Konzentration, vorhanden. Häufig ist es wünschenswert, ein inertes Streckmittel oder Bindemittel zur Verdünnung der aktiven Bestandteile zu verwenden, wobei das Bindemittel bzw. Streckmittel in Mengen von ca. 1 bis 99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorliegen kann. Wird ein zweiter Antikörper verwendet, der mit dem monoclonalen Antikörper zur Bindung fähig ist, dann liegt dieser gewöhnlich in einem getrennten Gefäß vor. Der zweite Antikörper ist typischerweise an einen Marker konjugiert und in analoger Weise formuliert wie die oben beschriebene Antikörper- Formulierung.

Die monoclonalen Antikörper nach der Erfindung können auch als Bestandteile von pharmazeutischen Zusammensetzungen vorliegen, die eine therapeutische oder prophylaktische Menge von mindestens einem der monoclonalen Antikörpern nach der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutischen wirksamen Träger enthält. Ein pharmazeutischer Träger kann irgendeine verträgliche nichttoxische Substanz sein, die zum Überführen der monoclonalen Antikörper auf den Patienten geeignet ist.

Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können als Träger verwendet werden. Pharmazeutisch anerkannte Hilfsstoffe (Puffer, Dispergierungsmittel) können ebenfalls in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht werden. Solche Zusammensetzungen können einen einzelnen monoclonalen Antikörper, wie z. B. einen der gegen zwei oder mehr aber nicht alle IATS-Serotypen von P. aeruginosa spezifisch ist, enthalten. Andererseits kann eine pharmazeutische Zusammensetzung auch zwei oder mehr monoclonale Antikörper unter Bildung eines "Cocktails" enthalten. Beispielsweise kann ein Cocktail menschliche monoclonale Antikörper gegen Gruppen von verschiedenen P. aeruginosa-Serotypen und Immunotypen enthalten und so ein universelles Produkt mit Aktivität gegen die überwiegende Anzahl der klinischen Isolate des bestimmten Bakteriums darstellen.

Von Interesse sind prophylaktische und/oder therapeutische monoclonale Antikörper-Zusammensetzungen, die zur Reaktion mit mindetens drei IATS-Serotypen, normalerweise mindestens vier und insbesondere gewöhnlich mindestens fünf IATS-Serotypen fähig sind. Von besonderem Interesse sind monoclonale Antikörper-Zusammensetzungen, die mit mindestens ca. sieben, vorzugsweise mit mindestens zehn bis vierzehn und sogar mit bis zu allen siebzehn IATS-Serotypen reagieren können. In Verbindung mit den IATS-Serotypen ist es wünschenswert, daß die Zusammensetzungen auch mit mindestens einem, vorzugsweise mindestens zwei und insbesondere mindestens drei oder vier und bis zu einschließlich allen sieben Immunotypen des Fisher-Immunotyp-Systems reagieren können.

Jede der Zusammensetzungen kann mindestens einen, normalerweise mindestens zwei und insbesondere mindestens drei oder mehr Antikörper enthalten, wobei jeder Antikörper mit mindestens 2, 3, 4 oder mehr, jedoch nicht allen IATS-Serotypen reagt. Bevorzugt ist mindestens ein monoclonaler Antikörper vorgesehen, der an mindestens zwei IATS-Serotypen und einen oder mehr Fisher-Immunotypen, vorzugsweise mindestens zwei Immunotypen, bindet.

Vorzugsweise ist die Gesamtanzahl an verschiedenen monoclonalen Antikörpern in einer Zusammensetzung mindestens eins und gleich oder weniger als ca. einhalb der gesamten Anzahl von IATS-Serotypen, mit welchen die Zusammensetzungen reagieren, normalerweise ein Drittel dieser Gesamtzahl.

Das Mol-Verhältnis der verschiedenen monoclonalen Antikörper- Bestandteile ist normalerweise nicht mehr als um den Faktor 10, insbesondere nicht mehr als um den Faktor 5 verschieden. Das Mol-Verhältnis liegt normalerweise bei etwa 1 : 1-2 zu jedem der anderen Antikörper-Bestandteile.

Die erfindungsgemäßen humanen monoclonalen Antikörper können auch in Kombination mit anderen monoclonalen Antikörper-Zusammensetzungen oder mit existierenden Blutplasma-Produkten verwendet werden, wie im Handel erhältlichen Gammaglobulin- und Immunglobulin-Produkten, die zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von P. aeruginosa-Erkrankungen beim Menschen verwendet werden können. So wird für Immunglobuline das Plasma vorzugsweise von menschlichen Spendern erhalten, die erhöhte Spiegel von mit P. aeruginosa-reaktiven Immunglobulinen besitzen. Es sei hier generell auf das Compendium "Intravenous Immune Globulin and the Comprised Host", Amer. J. Med., 76(3a), März 30, 1984, Seiten 1-231, verwiesen, auf das hier Bezug genommen wird.

Die monoclonalen Antikörper nach der Erfindung können auch als getrennt zu verabreichende Zusammensetzungen verwendet werden, die in Verbindung mit Antibiotika oder antimikrobiellen Mitteln gegeben werden. Typischerweise können die antimikrobiellen Mittel ein anti-pseudomonales Penicillin (z. B. Carbenicillin) in Verbindung mit einem Aminoglycosid (z. B. Gentamicin, Tobramicin usw.) einschließen, es sind jedoch auch zahlreiche zusätzliche Mittel (wie z. B. Cephalosporine), die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, verwendbar.

Die erfindungsgemäßen humanen monoclonalen Antikörper und pharmazeutischen Zusammensetzungen davon sind besonders brauchbar für die orale oder parenterale Verabreichung. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, z. B. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die Erfindung schafft somit Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung, welche eine Lösung des humanen monoclonalen Antikörpers oder ein Cocktail davon in einem akzeptierbaren, als Lösungsmittel dienenden Träger, vorzugsweise einem wäßrigen Träger darstellen. Eine Vielzahl von wäßrigen Trägern kann verwendet werden, so z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%ige Glycinlösung u. dgl. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von nichtgelöstem Material. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptierbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie z. B. zum Erreichen physiologischer Bedingungen erforderlich sind, wie pH- einstellende und puffernde Mittel, die Toxidität einstellende Mittel u. dgl. Beispiele hierfür sind Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat u. dgl. Die Konzentration der Antikörper in diesen Formlierungen kann in weiten Grenzen variieren, d. h. von weniger als ca. 0,5%, normalerweise bei oder mindestens ca. 1% bis zu 15 oder 20% (als Gewichtsprozent), wobei sich die Konzentrationen vorwiegend nach den Flüssigkeitsvolumina den Viskositäten usw. und insbesondere nach der bestimmten Verabreichungsweise richten.

So kann eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intramuskuläre Injektion 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg monoclonalen Antikörper enthalten. Eine typische Zusammensetzung für die intravenöse Infusion kann 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg monoclonalen Antikörper enthalten. Aktuelle Methoden zur Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind bekannt und sind beispielsweise näher beschrieben in Remington′s Pharmaceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980), worauf hier Bezug genommen wird.

Die monoclonalen Antikörper nach der Erfindung können zur Lagerung gefriergetrocknet und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich als wirksam bei herkömmlichen Immunglobulinen erwiesen, und es können bekannte Lyophilisations- und Rekonstitutionstechniken angewendet werden. Es kann von den Fachleuten weiterhin berücksichtigt werden, daß die Lyophilisation und die Rekonstitution zu unterschiedlichen Maßen an Aktivitätsverlust des Antikörpers führen kann (z. B. neigen bei herkömmlichen Immunglobulinen die IgM-Antikörper zu stärkeren Aktivitätsverlusten als die IgG-Antikörper) und daß solche Aktivitätsverluste im Hinblick auf den anzuwendenden Spiegel kompensiert werden können.

Die Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen humanen monoclonalen Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten, können zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen verabreicht werden. Für die therapeutische Anwendung werden die Zusammensetzungen einem bereits mit einem oder mehreren P. aeruginosa-Serotypen infizierten Patienten in Mengen verabreicht, die zur Heilung oder mindestens zum teilweisen Abstoppen der Infektion und ihrer Komplikationen ausreicht. Eine entsprechende Menge, dies zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Die für diesen Zweck wirksamen Mengen hängen von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten ab, und liegen im allgemeinen im Bereich von ca. 1 bis ca. 200 mg Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht, wobei Dosismengen von 5 bis 25 mg pro Kilogramm gebräuchlicher sind. Es ist zu beachten, daß die Materialien nach der Erfindung im allgemeinen bei schweren Erkrankungszuständen, d. h. in lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen angewendet werden, insbesondere bei Bakteriämie und Endotoxämie aufgrund von P. aeruginosa. In solchen Fällen ist es im Hinblick auf die Abwesenheit von Fremdsubstanzen und die Abwesenheit einer Abwehr gegen Fremdsubstanzen, was durch die Bereitstellung der menschlichen monoclonalen Antikörper nach der Erfindung erzielt ist, möglich und für den behandelnden Arzt jedenfalls auch wünschenswert, erheblich höhere Mengen dieser Antikörper zu verabreichen.

Für prophylaktische Anwendungen werden Zusammensetzungen, die den erfindungsgemäßen Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten, einem Patienten verabreicht, der noch nicht durch P. aeruginosa infiziert ist, um die Widerstandskraft des Patienten gegen eine potentielle Infektion zu erhöhen. Eine solche Menge wird als "prophylaktisch wirksame Dosis" bezeichnet. Für diese Anwendung hängen die genauen Mengen wiederum von dem Gesundheitszustand des Patienten und seinem allgemeinen Immunitätsspiegel ab, jedoch liegen die Mengen gewöhnlich im Bereich von 0,1 bis 25 mg pro Kilogramm, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 2,5 mg pro Kilogramm.

Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosisspiegeln und Verabreichungsschemata durchgeführt werden, die vom behandelnden Arzt gewählt werden. Auf jeden Fall sollte die pharmazeutische Formulierung eine zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreichende Menge des bzw. der Antikörper nach der Erfindung bereitstellen.

Experimentelles Beispiel I

Beispiel I zeigt die Methoden für die Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (IgM-Isotyp), die mit IATS- Serotypen 2, 5 und 16 und Fisher-Immunotypen 3 und 7reagieren.

Eine periphere Blutprobe, erhalten von einem Patienten mit zystischer Fibrose, von dem bekannt ist, daß er chronische Infektionen mit P. aeruginosa hatte, diente als Quelle für Human-B-Zellen. Mononukleare Zellen wurden aus dem Blut durch übliche Zentrifugations-Techniken auf Ficoll-Paque (Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968) 21: Suppl. 97, 77-89) abgetrennt und zweimal mit calcium/magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.

Die mononuklearen Zellen wurden von T-Zellen unter Verwendung eines modifizierten E-Rosetten-Verfahrens befreit. Kurz gesagt wurden die Zellen zuerst bis zu einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS, das 20% fötales Kalbsserum (PCS) enthielt bei 4°C resuspendiert. Ein Milliliter dieser Suspension wurde dann in ein Polystyrol-Rohr mit rundem Boden mit den Maßen 17 × 100 mm gegeben, dem 1 × 10⁹ mit 2- Amino-isothiouronium-bromid(AET) behandelte rote Blutkörperchen vom Schaf aus einer 10%igen (V/V)-Lösung in Incove′s-modifizierten Dulbecco′s-Medium (Iscove′s Medium) zugegeben wurden (Madsen, M. und Johnson, H. E., J. Immun. Methods (1979) 27: 61-74). Die Suspension wurde 5-10 Minuten lang bei 4°C vorsichtig gemischt, wonach die E-rosettierten Zellen durch Zentrifugation auf Ficoll-Paque während 8 Minuten bei 2500 × g bei 4°C entfernt wurden. Die auf E- Rosetten negativen mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (E^-PBMC), die einen Streifen an der Grenzschicht bildeten, wurden gesammelt und einmal in Iscove′s-Medium gewaschen und im gleichen Medium resuspendiert, das 15% (V/V) FCS, L-Glutamin (2 mMol/l), Penicillin (100 IU/ml), Streptomycin (100 µg/ml), Hypoxanthin (1 × 10^-4M), Aminopterin (4 × 10^-7M) und Thymidin (1,6 × 10^-5M) enthielt. Dieses Medium wird nachfolgend als HAT-Medium bezeichnet.

Zellengeführte Transformation der E^-PBMC wurde durch Kokultivieren dieser Zellen mit einer transformierenden Zellinie durchgeführt. Diese transformierende Zellinie war eine Epstein- Barr-Kernantigen (EBNA) positive humane Lymphoblastoid- Zellinie, die durch Äthyl-methansulfonat(EMS)-mutagenese der GM 1500 Lymphoblastoid-Zellinie abgeleitet war, gefolgt durch Selektion in Gegenwart von 30 µg/ml 6-Thioguanin, um die Zellen in Bezug auf Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl- Transferase (HGPRT) defizient und somit HAT sensitiv zu machen. Diese Zellinie wurde als 1A2-Zellinie bezeichnet und beim American Type Culture Collection (A.T.C.C.) am 29. März 1982 unter der A.T.C.C.-Nr. CRL 8119 hinterlegt. 1A2-Zellen in der logarithmischen Waschtumsphase wurden in HAT-Medium suspendiert und dann mit den E^-PBMC bei einem Verhältnis von acht 1A2-Zellen pro E^-PBMC kombiniert. Die Zellmischung wurde in acht einen runden Boden aufweisende 96-Loch Mikrotiterplatten (Costar 3799) bei einer Konzentration von 72000 Zellen/Loch in einem Volumen von 200 µl/Loch gegeben und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre die 6% CO₂ enthielt, inkubiert. Die Kulturen wurden an den Tagen 5 und 8 nach dem Einbringen durch Ersatz der Hälfte des Überstandes mit frischem HAT-Medium gefüttert. Die Löcher wurden jeden Tag auf einem umgekehrten Mikroskop auf Anzeichen von Zellproliferation beobachtet. Zwölf Tage nach dem Einbringen in die Platte wurde beobachtet, daß 100% der Löcher proliferierende Zellen enthielten und daß in den meisten Löchern die Zellen eine ausreichende Dichte hatten, um entfernt werden zu können und den Überstand auf Anti-P. aeruginosa-Antikörper untersuchen zu können.

Die Überstände wurden auf das Vorhandensein von Anti-P. aeruginosa-Antikörper unter Anwendung einer Immunabsorptions- Untersuchungstechnik mit gebundenem Enzym (ELISA) geprüft (Engvall, E., (1977) 55: 193-200). Die Antigen-Platten bestanden aus 96-Loch Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Immulon II, Dynatech), deren Löcher verschiedene lebende Bakterien enthielten, die am Lochboden absorbiert waren. Um die Absorption der Bakterien an den Kunststoff zu erleichtern, wurden 50 µl/Loch Poly-L-Lysin (PLL) (1 µg/ml in PBS, pH 7,2) während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das nicht adsorbierte PLL wurde dann entfernt, die Platten einmal mit PBS gewaschen, und 50 µl der gewaschenen Bakteriensuspension (OD₆₆₀=0.2) in PBS wurden jedem Loch zugegeben und die Platten eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nicht adsorbierte Bakterien wurden entfernt, indem die Platten dreimal mit Kochsalz-Tween [0,9% NaCl, 0,05% (V/V) Tween-20] gewaschen wurden. Verschiedene Antigenplatten wurden in die Prüfung einbezogen: (1) eine Mischung von P. aeruginosa Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4 (A.T.C.C. Nrn. 27312, 27313, 27315); (2) eine Mischung von P. aeruginosa Fisher-Immunotypen 3, 5, 6 und 7 (A.T.C.C. Nrn. 27314, 27316, 27317 bzw. 27318); und (3) eine Mikrotiterplatte ohne Bakterien.

Die ELISA wurde eingeleitet, indem die Platten zuerst mit 200 µl/Loch Blockierungspuffer [PBS, pH 7,2, enthaltend 5% (Gew./V) nichtfette trockene Milch, 0,01% (V/V) Entschäumer (Antifoam A - Sigma) und 0,01% (Gew./V) Thimerosal] während 20 Minuten bei Raumtemperatur blockiert wurden. Nach dem Blockieren wurden die Platten dreimal mit Kochsalz-Tween gewaschen. 50 µl PBS, pH 7,2, enthaltend 0,1% Tween-20 und 0,2% (Gew./V) Rinderserum Albumin (BSA) wurden dann in alle Löcher gegeben. Die Überstände aus den Löchern der Kulturplatten wurden wiederum in die entsprechenden Löcher der Antigenplatten (50 µl/Loch) gegeben und die Platten wurden dann während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Überstände wurden dann entfernt, die Löcher dreimal mit Kochsalz-Tween gewaschen, und 50 µl geeignet verdünntes, mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziegenantihuman- IgG + IgM (American Qualax International ¢A1114 + ¢A1124) wurden zu den Löchern gegeben. In diesem Beispiel wurden HRP-Ziegenanti-IgG und HRP-Ziegenanti-IgM in einer letztlichen Verdünnung von 1 : 5000 bzw. 1 : 3000 in PBS, pH 7,2, das 0,05% Tween-20 und 0,1% BSA enthielt, verwendet. Im Anschluß an eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wurden überschüssige mit Enzym konjugierte Ziegen-Antikörper entfernt, und die Löcher wurden dreimal mit Kochsalz-Tween gewaschen. 100 µl Substrat (0,8 mg/ml o-Phenylendiamin-di- hydrochlorid in 100 mM Zitratpuffer, pH 5,0 und 0,03% H₂O₂ in entionisiertes Wasser, in gleichen Mengen kurz vor dem Eingeben gemischt) wurden dann jedem Loch zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation im Dunkeln wurden 50 µl 3N H₂SO₄ zu allen Löchern zugegeben, um die Reaktionen zu beenden. Die Kulturüberstände, die mit dem Antigen der Platten reagierende Antikörper enthielten, wurden durch positive Farbentwicklung in den entsprechenden Löchern untersucht, und die Stärke der Reaktion durch Messen der Absorption bei 490 nm auf einem Bio-Tek EL-310 Mikro-ELISA-Leser quantifiziert.

Eine Analyse der Kulturüberstände durch das obige Verfahren führte zu der Identifizierung von zwei Löchern (1C1 und 2H12), welche Anti-P. aeruginosa-Antikörper enthielten, die mit der Platte der Fisher-Immunotypen 3, 5, 5 und 7, aber nicht mit der Platte der Fisher-Immunotypen 1, 2 und 4 und nicht mit der bakterienfreien Platte reagierten. Um den bzw. die erkannten spezifischen Fisher-Immunotypen zu identifizieren, wurden Antigenplatten, die PLL-fixierte Bakterien von nur einem Fisher-Immunotyp enthielten, wie oben beschrieben, für jeden Immunotyp hergestellt. Die Durchführung des ELISA-Tests, wie oben beschrieben, mit Kulturüberständen aus den Löchern 1C1 und 2H12 auf den individuellen Immunotyp- Platten ergab, daß diese zwei Löcher Antikörper enthielten, der gegen beide Fisher-Immunotypen 3 und 7 spezifisch war. Ein ähnlicher ELISA-Test der an der IATS-Reihe von P. aeruginosa typisierenden Stämmen (erhalten vom A.T.C.C. und umfassend die Nrn. 33348-33364) durchgeführt wurde, zeigte, daß Antikörper in Löchern 1C1 und 2H12 spezifisch mit IATS- Stämmen 2, 5 und 16 regierten.

Die Isotypen des bzw. der reaktiven Antikörper in den Löchern 1C1 und 2H12 wurde in einem ELISA-Test in ähnlicher Weise wie in den oben beschriebenen Spezifitätstests bestimmt, mit der Ausnahme, daß das HPR-Ziegen-Antihuman-IgG und HRP-Ziegen-Antihuman-IGM unabhängig als Reagenzien der zweiten Stufe verwendet wurden, anstatt kombiniert zu werden. Positive Reaktion des bzw. der Antikörper in den Löchern 1C1 und 2H12 mit Fisher-Immunotypen 3 und 7 wurden nur mit den Anti-IgM-Reagenzien beobachtet als Hinweis auf einen IgM-Isotyp des bzw. der relevanten Antikörper in jedem Loch.

Um herauszufinden, ob das Anti-Fisher-Immunotyp 3 und 7- Reaktionsmuster auf einen oder auf mehrere Antikörper in den Löchern 1C1 und 2H12 zurückzuführen ist (d. h. ein Antikörper mit beiden Fisher-Immunotypen 3 und 7 reaktiv ist oder zwei Antikörper vorliegen, von denen einer mit Fisher-Immunotyp 3 und der andere mit Fisher-Immunotyp 7 reagiert), wurden Zellen aus beiden Löchern einer Subkultur bei geringer Dichte unterworfen, und die Löcher, die Proliferationszellen enthielten, wurden auf Antikörper-Aktivität auf getrennten Fisher-Immunotyp 3- und Fisher-Immunotyp 7-Bakterienantigenplatten untersucht. Die Subkultur wurde in 96-Loch-Platten mit mit rundem Boden bei einer Dichte von 5 Zellen/Loch in einem Gesamtvolumen von 100 µl HAT-Medium, dem die Aminopterin- Komponente fehlte (HT-Medium) durchgeführt. Nicht transformierende, HAT-sensitive Lymphoblastoid-Zellen wurden in alle Löcher mit einer Dichte von 500 Zellen/Loch als Fütterzellen eingegeben. Vier Tage nach dem Eingeben wurde 100 µl HAT-Medium allen Löchern zugegeben, um die Fütterzellen selektiv zu töten. Die Löcher wurden am neunten Tag nach dem Einsetzen durch Ersatz der Hälfte des Überstandes mit HAT-Medium erneut gefüttert. Danach wurden die Löcher in ähnlicher Weise alle 4-5 Tage mit HAT-Medium gefüttert, bis die Löcher eine ausreichende Lymphoblastoid-Zelldichte für eine Analyse des Überstandes durch ELISA besaßen. Bei der Prüfung auf individuellen Fisher-Immunotyp 3- und Fisher-Immunotyp 7-Antigenplatten reagierten alle Überstände, die mit Fisher-Immunotyp 3 reagierten, ebenfalls mit Fisher-Immunotyp 7, was anzeigt, daß ein Antikörper verantwortlich ist für die Aktivität mit beiden Fisher-Immunotypen. Zufällig ausgewählte Überstände zeigten bei der Prüfung auf IATS-Stämme 2, 5 und 16, daß sie mit allen drei Stämmen reagierten anstatt mit nur einzelnen Stämmen, was weiterhin die Schlußfolgerung stützt, daß ein Antikörper die Kreuzreaktion mit Fisher-Immunotypen 3 und 7 und IATS-Stämmen 2, 5 und 16 zeigt.

Das Klonen von spezifischen Antikörper produzierenden Zellen aus den Löchern 1C1 und 2H12 wurde durchgeführt, indem die Zellen aus jedem Loch unabhängig einigen Runden des begrenzenden Verdünnungs-Klonens unterworfen wurden bis alle klonalen Überstände, die durch das obige ELISA-Protokoll geprüft wurden, zur einer positiven Reaktion auf Fisher-Immunotypen 3 und 7 und IATS-Stämme 2, 5 und 16 führte. Beim Klonen wurden Fütterzellen verwendet, wie oben beschrieben für die Subkultur. Auf diese Weise wurden zwei geklonte transformierte Humanzellinien (1C1 und 2H12) erhalten, welche kontinuierlich (permanent, unsterblich) sind und welche jeweils humane monoclonale Antikörper, die mit Fisher-Immunotypen 3 und 7 und IATS-Stämmen 2, 5 und 16 reagieren, sekretieren. In diesem Beispiel tragen die Zellinien und ihr produzierter Antikörper dieselbe Bezeichnung.

Beispiel II

Beispiel II zeigt Methoden für die Herstellung von humanen monoclonalen Antikkörpern (IgG-Isotyp), welche mit IATS- Serotypen 2, 5 und 16 und Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagieren. Die Protokolle für die Herstellung sind im wesentlichen identisch mit Beispiel I. Kurz gesagt, eine Probe aus peripherem Blut, die von einem Patienten mit zystischer Fibrose erhalten war, von dem bekannt war, daß er eine chronische Infektion mit P. aeruginosa hatte, diente als Quelle für Human-B-Zellen. Mononukleare Zellen wurden, wie in Beispiel I beschrieben, abgetrennt mit der Ausnahme, daß 1,6 ml PBS- Suspension mit einer Suspension von 1,6 × 10⁹ AET-behandelten roten Blutzellen vom Schaf verwendet wurden. Die Zell-geführte Transformation war ebenfalls dieselbe mit folgender Ausnahme: das Verhältnis von 1A2 Zellen pro E^-PBMC war 7,5; fünfzehn Platten mit 17.000 Zellen/Loch wurden verwendet; die Kulturen wurden 6 und 10 Tage nach dem Einbringen gefüttert; und 16 Tage nach dem Einbringen enthielten im wesentlichen alle Löcher proliferierte Zellen.

Das Prüfen der Kultur-Überstände auf spezifische Antikörper wurde wie beschrieben durchgeführt und führte zur Lokalisierung eines Lochs (9D1), das einen Antikkörper enthielt, der mit der Fisher-Immunotyp 3-, 5-, 6- und 7-Platte jedoch nicht mit der Fisher-Immunotyp 1-, 2- und 4-Platte und nicht mit der bakterienfreien Platte reagierte. Die Durchführung der beschriebenen ELISA-Prüfung auf einzelnen Immunotyp- oder Serotyp-Bakterien-Antigenplatten mit 9D1-Kulturüberständen zeigte einen Antikörper, der sowohl gegen die beiden Fisher-Typen 3 und 7 als auch gegen die IATS-Stämme 2, 5 und 16 spezifisch war. Nachfolgende Untersuchungen entsprechend Beispiel I zeigten, daß die Antikörperspezifität in Loch 9D1 auf ein einzelnes Klon zurückzuführen war, das den IgG-Isotyp- Antikörper sekretiert.

Beispiel III

Beispiel III zeigt die antigene Spezifität von einigen der Antikörper der vorliegenden Erfindung. Um zu bestimmen, ob monoclonale Antikörper 1C1, 2H12 und 9D1 mit demselben antigenen Ziel reagierten und somit im Hinblick auf die Spezifität identisch sind, wurden zusätzliche Prüfungen durchgeführt. Zuerst wurden die Antikörper in einem ELISA-Test anhand einer Reihe von Referenz-Stämmen und klinischen Isolaten von P. aeruginosa verglichen. Das ELISA-Protokoll war wie oben beschrieben mit der Ausnahme der folgenden Abänderung: 1) Anstelle von Bakterien, die an mit PLL-beschichteten Platten adsorbiert waren, enthielten die Plattenlöcher verschiedene ganze Bakterien, die mit Äthanol an den Lochboden fixiert waren. Die Platten wurden bereitet durch Zugabe von 50 µl gewaschener Bakteriensuspension (OD₆₆₀ = 0,2) in PBS in die Löcher, Zentrifugation der Platten während 20 Minuten bei 500 × g, Aspiration von PBS, Zugabe von 75 µl Äthanol für 10 Minuten, Entfernen des Äthanols, gefolgt durch Lufttrocknung. Eingegeben in die Antigenplatten wurden IATS-Stämme 2, 5, 11 und 16 (A.T.T.C. Nrn. 33349, 33352, 33358 bzw. 33363) und sechzehn klinische Isolate, die zuvor typisiert wurden sowohl durch Agglutination mit Difco [Detroit, Michigan] Bacto-Pseudomonas aeruginosa-Antiseren entsprechend den Anweisungen des Herstellers als auch durch ELISA (wie hier beschrieben) und zwar als Serotypen 2, 5, 16 oder eine Kombination solcher Serotypen; 2) Kaninchen-Typ- Antiseren wurden verwendet in einer Verdünnung von 1 : 500 in PBS anstelle von Anti-IATS-16, welches 1 : 250 verdünnt war. Kultur-Überstände enthaltend 1C1, 2H12 und 9D1 Antikörper wurden als solche verwendet; 3) Als Reagenzien der zweiten Stufe wurden biotinyliertes Protein A (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 1 : 500 verdünnt und biotinyliertes Ziegenanti-Human-Ig (4703, Tago, Ic., Burlingame, CA) 1 : 500 verdünnt zum Aufspüren von Kaninchen- Antikörpern bzw. Human-Antikörpern verwendet. 50 µl Reagenz wurden den zugehörigen Löchern zugegeben, und nach eine 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden ungebundenes Reagenz entfernt und die Löcher dreimal gewaschen. 50 µl eines vorgeformten Avidin: biotinylierten Meerrettich- Peroxidase-Komplexes (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) wurden dann jedem Loch zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das überschüssige Vectastain ABC-Reagenz entfernt, und die Löcher vor Zugabe des Substrates erneut dreimal gewaschen.

Wie in Tabelle II zu sehen, zeigen die Ergebnisse der Prüfung, daß die Antikörper 1C1 und 9D1 mit jedem klinischen Isolat, das als ein IATS 2, 5 oder 16 Serotyp typisiert ist, reagierte, dagegen aber der Antikörper 2H12 mit diesen drei Isolaten nicht reagierte. Daraus kann geschlossen werden, daß Antikörper 2H12 ein Epitop erkennt, das verschieden ist von dem, den 1C1 oder 9D1 erkennen, und daß die beiden Epitope anscheinend auf den meisten aber nicht allen klinischen Isolaten, die den IATS-Serotypen 2, 5 oder 16 entsprechen, koordiniert ausgedrückt werden.

Tabelle II

Reaktivitätsmuster von Difco Bacto-P. aeruginosa-Antiseren und humanen monoclonalen Antikörpern 2H12, 1C1 und 9D1 auf typisierte Stämme und klinische Isolate von P. aeruginosa

Die Daten lassen weiterhin erkennen, daß das molekulare Ziel bzw. Muster das von den Antikörpern 1C1 und 9D1 erkannt wird in gleicher Weise vorhanden ist auf allen klinischen Isolaten von P. aeruginosa, welche als zu den IATS-Serotypen 2, 15 oder 16 gehörig typisiert werden konnten, wogegen das Ziel bzw. Muster, das vom Antikörper 2H12 erkannt wird, nur auf einer Untergruppe solcher Isolate ausgedrückt ist.

Zur Bestimmung, ob die 1C1, 2H12 und 9D1 Antikörper mit verschiedenen Antigenen reagierten oder alternativ mit verschiedenen Epitopen auf demselben Antigen, wobei solche Epitope auf den meisten, jedoch nicht allen IATS 2-, 5- und 16-Serotypen ausgedrückt sind, wurde eine Immunoblot-Analyse durchgeführt. Da die geteilte Antigenitität zwischen den IATS-Stämmen 2, 5 und 16 offensichtlich auf wärmestabile Antigene zurückzuführen ist (Liu, P. V. et al., supra) und in Anbetracht der Tatsache, daß die erwähnte Wärmestabilität charakteristisch für Lipopolysaccharid-Moleküle ist, wurden LPS-Präparationen aus IATS-Stämmen 2, 5, 16 und 11 als antigene Präparationen für die Analyse ausgewählt. Rohes LPS wurde aus den typisierten Stämmen durch Extraktion in Kochsalzlösung bei 60°C hergestellt (Orskov, F. et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. (1971) Section B 79: 142-152). 10 µg LPS, bestimmt durch den 2-Keto-3-deoxyoctonat-Gehalt (KDO) (Karkhanis, Y. D., et al., Anal. Biochem. (1978) 85: 595- 601), von jedem der Serotypen wurde einer Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (Hancock, R.E.W. und Carey, A. M., J. Bacteriol. (1977) 140: 901-910) auf einem 10-20%-Gradienten-Gel unterworfen. Getrennte Molekulararten wurden vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran (NCM) in bekannter Weise überführt (Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 4350-4354) und der NCM-Blot wurde eine Stunde lang in PBS-Tween blockiert (Batteiger, B., et al., J. Immunol. Meth. (1982) 55: 297-307). Die Blots wurden dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 20 ml erschöpftem Kulturüberstand der 1C1-, 2H12- oder 9D1-Zellinien inkubiert. Im Anschluß an ein 5-minütiges Spülen in PBS-Tween, wurde jeder der NCM-Blots eine Stunde lang bei 25°C in einer 1 : 1000 oder 1 : 1500-Verdünnung (in PBS- Tween) von mit alkalischer Phosphatase konugierten Ziegen- Antihuman-IgG + IgA + IgM (Zymed) inkubiert. Die Blots wurden dann 5-minütigen Waschungen in PBS-Tween unterworfen, wonach Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen durch Inkubieren der Blots während 15-20 Minuten bei 25°C in 30 ml Nitroblau- tetrazolium/5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBTBCIP) Substrat sichtbar gemacht wurden wie beschrieben von Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 4045-4049. Die Farbentwicklung wurde durch mehrmaliges Spülen der Blots in entionisiertem Wasser gestoppt.

Die mit den drei Antikörpern erhaltenen Blot-Profile waren merklich verschieden. Antikörper 2H12 erkannte vorwiegend eine kurze Reihe von leiterartig in regelmäßigen Abständen befindlichen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht in den Antigen-Präparationen der Serotypen 2, 5 und 16. Einige in regelmäßigen Abständen angeordnete Moleküle mit höherem Molekulargewicht wurden ebenfalls schwach erkannt. Keine Reaktion wurde beobachtet auf der LPS-Präparation von Serotyp 11. Eine Wiederholung der Immunoblot-Analyse unter Verwendung von LPS-Präparationen, die zuvor mit Proteinase K bei 60°C behandelt wurden, um Proteinantigene zu zerstören, führten zu keinen Änderungen im Profil. Die Banden mit niedrigem Molekulargewicht korrespondierten präzise mit den kleineren Formen von LPS-Molekülen, wie in einem ähnlich durchgeführten SDS-PAGE-Gel sichtbar gemacht wurde, wobei die Antigene nicht auf ein NCM überführt, statt dessen jedoch spezifisch auf das Vorhandensein von LPS angefärbt wurden (Tsai, C. M. und Frasch, C. E., Anal. Biochem. (1982) 119: 115-119), mit der Ausnahme, daß die niedrigste Bande auf dem silber-gefärbten Gel (die die Kernregion plus Lipid A von LPS repräsentiert) nicht erkannt wurde. Antikörper 1C1 erkannte dieselbe Reihe von regelmäßig im Abstand befindlichen Molekülen mit niederem Molekulargewicht unter den Antigen- Präparationen der Serotypen 2, 5 und 16, jedoch nicht 11, wenn auch die Intensität der Reaktion nicht so stark war wie mit 2H12. Zusätzlich erkannte dieser Antikörper jedoch hervorragend eine Reihe von in regelmäßigen Abständen angeordneten Molekülen mit höherem Molekulargewicht auf den Serotypen 2, 5 und 16, welche in Kombination mit den erkannten Banden mit niedrigem Molekulargewicht distinkte, voll leiterartige Profile ergaben. Diese Profile wurden durch Vorbehandlung der Antigen-Präparationen mit Proteinase K nicht geändert. Wiederum entsprachen die Profile den leiterartigen Bandmustern, die im LPS-spezifisch gefärbten Gel beobachtet wurden (d. h. sie entsprachen sich offensichtlich Bande für Bande), mit der Ausnahme, daß die den Kern plus Lipid A repräsentierende Bande nicht erkannt wurde. Antikörper 9D1 hatte dasselbe Reaktionsprofil wie Antikörper 1C1 auf den IATS 2-, 5- und 16- jedoch nicht 11-Stämmen. Wiederum wurde die bodennächste Bande der Leiter eines silber-gefärbten Gels der verschiedenen LPS-Präparationen nicht erkannt, und das Gesamtprofil wurde durch Vorbehandlung der LPS-Präparationen mit Proteinase K nicht geändert. Zusammenfassend zeigen diese Beobachtungen, daß die LPS der Serotypen 2, 5 und 16 das molekulare Muster ist, die von den Antikörpern 2H12, 1C1 und 9D1 erkannt werden.

Beispiel IV

Beispiel IV zeigt die Schutzwirkung eines der Antikörper nach der Erfindung.

Zum Einschätzen der in vivo-Schutzwirkung von Antikörper 1C1 wurden Tierschutzversuche an Mäusen durchgeführt. 1C1-Antikörper wurde zunächst aus dem Überstand einer erschöpften Kultur durch Präzipitation mit gesättigtem Amoniumsulfat (50% Endkonzentration) konzentriert (Good, A. H., et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B. B. und Shiigi, S. M., eds., W. J. Freeman & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)). Das ausgefällte Material wurde in einem minimalen Volumen sterilen Wassers rekonstituiert, extensiv gegen PBS dialysiert und steril-filtriert. Als Negativ-Kontrolle wurde der Überstand einer erschöpften Kultur einer anderen transformierten humanen Zellinie (6F11-A.T.C.C. Nr. CRL 8562), die einen gegen LPS von IATS-Stamm 11 spezifischen humanen monoclonalen Antikörper produziert, in ähnlicher Weise behandelt.

Weibliche BALB/c-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körpergewicht wurden in zwei Gruppen von je 30 Mäusen geteilt. Allen Mäusen jeder Gruppe wurden einzeln auf intraperitonealem Weg (ip) 0,5 ml konzetrierter 1C1- oder 6F11-Antikörper inokuliert. Sechs Stunden später wurde jede der zwei Gruppen in drei Gruppen von je 10 Mäusen unterteilt, und die Mitglieder jeder 10 Mäuse-Gruppe wurden unabhängig mit 0,3 ml einer lebenden Bakteriensuspension, die 5 LD₅₀ von IATS-Stamm 2, 5 bzw. 11 enthielt, intraperitoneal infiziert. Die Bakteriensuspensionen wurden aus einer Kulturbrühe im Wachstum der logarithmischen Phase gewonnen, von welcher die Bakterien zentrifugiert, danach zweimal in PBS gewaschen und in geeigneter Dichte in PBS resuspendiert wurden. Kontroll-Gruppen aus vier oder fünf Mäusen wurden jeweils durch intraperitoneale Injektion 0,5 ml PBS und sechs Stunden später intraperitoneal 5 LD₅₀ desselben Serotyps zugeführt. Nach der bakteriellen Herausforderung wurden die Tiere während einer Periode von fünf Tagen beobachtet.

Wie in Tabelle III gezeigt, bot der Antikörper 1C1 einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine letale Herausforderung durch sowohl IATS 2- als auch IATS 5-Serotypen, jedoch nicht durch IATS 11-Serotyp. Der typische Verlauf im Anschluß an die bakterielle Herausforderung zeigte bei allen nichtgeschützten Tieren verschiedene Perioden von endotoxischem Schock, gewöhnlich gefolgt vom Tod. Kontrolltiere, denen nur PBS gegeben wurde, gingen durch einen akuten endotoxischen Schock und alle starben schnell. Die Tiere der negativen Kontrolle, denen nichthomologer Antikörper (6F11) gegeben wurde, hatten eine Periode verlängerten Schocks, gekennzeichnet durch die Symptome, die in Fußnote "a" der Tabelle III aufgeführt sind. Einige dieser Tiere erholten sich schließlich, möglicherweise aufgrund von Komponenten, die keine Antikörper sind und bei der Bereitung der Antikörper mitkonzentriert wurden. Die Tiere, die den schützenden homologen Antikörper erhielten, zeigten jedoch nur geringere Symptome von Endotoxämie. Diese Symptome verschwanden innerhalb von 24 Stunden nach Inokultation, und die Tiere erschienen während der restlichen 5-tägigen Beobachtungszeit gesund.

Tabelle III

In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von humanem monoclonalem Antikörper 1C1 gegen IATS-Serotypen 2 und 5

Unter Anwendung desselben Protokolles wurde ein zweites Experiment durchgeführt, bei welchem Gruppen von Mäusen mit Fisher-Stämmen 2, 3 oder 5 infiziert wurden und die Tiere fünf Tage beobachtet wurden. Wie aus Tabelle IV ersichtlich, bot der Antikörper 1C1 wiederum einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen sonst letale Infektion mit Fisher-Immunotypen 3 und 7, er war jedoch unwirksam gegen Fisher-Immunotyp 2.

Tabelle IV

In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von humanem monoclonalem Antikörper 1C1 gegen Fisher-Immunotypen 3 und 7

Beispiel V

Beispiel V zeigt eine Methode zur Herstellung von humanem monoclonalem Antikörper, der mit IATS-Serotypen 4 und 11 und Fisher-Immunotyp 2 von P. aeruginosa reagiert. Das in den Beispielen I-IV beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß es erforderlich war, gewisse Modifikationen vorzunehmen, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper zu isolieren, zu charakterisieren und zu prüfen. Nachfolgend werden die Abänderungen im Verfahren und die mit dem hier beschriebenen monoclonalen Antikörper erhaltenen Ergebnisse geschildert.

Die Quelle für die Human-B-Zellen war eine Person, die zuvor mit einer Präparation von Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht immunisiert war, die aus Fisher-Immunotyp 3 isoliert war (Pier, G. B. et al., Infec. Immun. (1984) 45: 309-313, worauf hier Bezug genommen wird).

Die zellgeführte Transformation von E^-PBMC wurde durch Kokultivieren dieser Zellen mit der transformierenden Zellinie 1A2 durchgeführt. 1A2-Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden in HAT-Medium suspendiert und dann mit den E^-PBMC in einem Verhältnis von fünfzehn 1A2-Zellen pro E^-PBMC kombiniert. Die Zellmischung wurde in vierzehn Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 62.000 Zellen/Loch in einem Volumen von 200 µl/Loch eingegeben. Die Kulturen wurden am 7. und 11. Tag nach dem Eingeben gefüttert und am 15. Tag wurde beobachtet, daß 100% der Löcher proliferierte Zellen enthielten.

Um auf das Vorliegen von Anti-P. aeruginosa-Antikörpern zu prüfen, wurden zwei Antigenplatten mit folgender Vorbereitung verwendet: (1) eine Mischung von P. aeruginosa Fisher-Immunotypen 1 bis 7 (A.T.C.C. Nrn. 27312, 27313, 27314, 27315, 27316, 27317 bzw. 27318); und (2) eine mit PLL-behandelte Mikrotiterplatte ohne Bakterien.

Eine Analyse der Kulturüberstände nach der in den obigen Beispielen beschriebenen Methode führte zur Indentifizierung von annähernd 100 Löchern, welche Anti-P. aeruginosa-Antikörper enthielten, die reaktiv mit der Fisher-Immunotypen 1- bis 7-Platte waren, jedoch nicht mit der PLL-behandelten bakterienfreien Platte. Um den bzw. die erkannten spezifischen Fisher-Immunotypen identifizieren zu können, wurden Antigen- Platten wie oben beschrieben angefertigt, wobei jede Plattenreihe PLL-fixierte Bakterien von nur einem Fisher-Immunotyp enthielten. Ein ELISA-Test wurde durchgeführt wie oben beschrieben, wobei der Kulturüberstand von jedem anti-P. aeruginosa- positiven Loch in eine säulenartige Aneinanderreihung auf der neuen Antigen-Platten gegeben wurde, und zur Identifizierung einer Anzahl von Löchern führte, die gegen Fisher- Immunotyp 2 spezifischen Antikörper enthielten. Zur weiteren Analyse der serologischen Spezifität der AntiFisher-Immuntyp 2-Antikörper wurden die Überstände in ähnlichen ELISA- Tests auf Antigen-Platten geprüft, die so gefertigt wurden, daß jede der siebzehn IATS-Serotypen von P. aeruginosa in getrennten Löchern enthalten war. Die Ergebnisse dieser Prüfung zeigten, daß die überwiegende Anzahl der Überstände spezifisch auf IATS-Serotyp 11 war, wenn auch ein Überstand, nämlich in Loch 6D6, ein kreuzreaktives Spezifitätsmuster auf IATS-Serotypen 4, 11, 13 und 14 zeigte.

Um zu bestimmen, ob die Anti-IATS-Serotyp 4-, 11-, 13- und 14-Reaktionsmuster auf einen oder mehrere Antikörper in Loch 6D6 zurückzuführen waren, wurden zusätzliche gleiche Anteile von Überstand aus Loch 6D6 unabhängig mit IATS-Serotypen 4, 7 (Negativkontrolle), 11, 13 und 14 adsorbiert und die adsorbierten Überstände dann auf PLL-fixierte Bakterien von jedem der fünf IATS-Serotypen entsprechend dem oben beschriebenen ELISA-Test geprüft. Adsorptionen wurden durchgeführt durch Resuspendieren eines Pellets von gepackten Bakterienzellen mit einem gleichen Volumenüberstand während einer halben Stunde auf Eis, gefolgt von der Abtrennung des Überstandes von den Bakterien durch Zentrifugation. Die Ergebnisse dieser Prüfung zeigten, daß die IATS-Serotypen 4 und 11 Antikörperaktivität gegen einander ausadsorbierten, jedoch nicht gegen die IATS-Serotypen 7, 13 oder 14. Dies demonstriert die Gegenwart von mindestens zwei verschiedenen Anti-P.aeruginosa- Antikörpern in Loch 6D6, von denen mindestens einer Kreuzreaktion mit IATS-Serotypen 4 und 11 zeigt.

Die Isolation und das Klonen der geeigneten Antikörper produzierenden Zellen aus Loch 6D6 wurde in drei Stufen durchgeführt. Die erste Stufe umfaßt eine Subkultur der Zellen in niederer Dichte von 20 Zellen/Loch gefolgt von einer weiteren Runde einer Subkultur niederer Dichte (5 Zellen/Loch) von Zellen, die von einem Anti-IATS-Serotyp 4 und 11 positiven Loch erhalten wurden und in der ersten Runde der Subkultur niederer Dichte mit 20 Zellen/Loch produziert wurden. Jede Runde der Subkultur wurde in 96 Loch-Platten mit rundem Boden mit der angegeben Dichte in einem totalen Volumen von 100 µl HAT-Medium durchgeführt, dem die Aminopterin-Komponente fehlte (HT-Medium). Nicht transformierende HAT-sensitive Lymphoblastoid- Zellen wurden in alle Löcher mit einer Dichte von 500 Zellen/Loch als Fütterzellen gegeben. Vier Tage nach dem Eingeben wurden 100 µl HAT-Medium allen Löchern zum selektiven Abtöten der Fütterzellen gegeben. Die Löcher wurden wiederum am 9. Tag nach dem Eingeben durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit HAT-Medium gefüttert. Danach wurden die Löcher in ähnlicher Weise alle vier bis fünf Tage mit HAT-Medium gefüttert, bis die Löcher eine ausreichende Lymphoblastoidzellen- Dichte für eine Analyse des Überstandes durch ELISA, wie oben beschrieben, enthielten.

Bei jeder Prüfung waren die Überstände, die reaktiv mit IATS-Serotyp 4 waren, auch reaktiv mit IATS-Serotyp 11 und Fisher-Immunotyp 2. Zusätzlich fehlte eine Antikörperaktivität gegen IATS-Serotypen 13 und 14, wodurch die früheren Spezifitäts- Annahmen bestätigt werden.

Formales Klonen von spezifischen Antikörper produzierenden Zellen wurde durchgeführt, indem zuerst die Zellen mit sehr geringer Dichte (berechnet 1/Loch) in 72-Loch-Terasaki-Platten (Nunc ¢1-36538) in einem Volumen von 10 µl/Loch eingegeben wurden. Die Platten wurden dann in einen Inkubator während drei Stunden gehalten, um den Zellen ein Absetzen auf den Plattengrund zu ermöglichen, und dann durch zwei verschiedene Personen mikroskopisch auf Löcher, die eine einzelne Zelle enthielten, ausgezählt. Jede dieser Zellen wurde dann unabhängig in die Löcher einer 96-Loch-Platte mit rundem Boden mit Fütterzellen eingebracht und, wie oben für eine Subkultur mit niedriger Dichte beschrieben, kultiviert. Die Überstände von allen aufsteigenden Klonen waren bei der Prüfung durch das obige ELISA-Protokoll positiv gegen die Anti- IATS-Serotypen 4 und 11.

Auf diese Weise kann eine geklonte transformierte humane Zellinie erhalten werden, welche kontinuierlich wächst (unsterblich ist) und humanen monoclonalen Antikörper sekretiert, welcher reaktiv mit Fisher-Immunotyp 2 und kreuzreaktiv mit IATS-Serotypen 4 und 11 ist. In diesem Beispiel tragen die Zellinie und der von ihr produzierte Antikörper dieselbe Bezeichnung, nämlich 6D6.

Der Isotyp des Antikörpers in Loch 6D6 wurde in einem ELISA- Test ähnlich den oben beschriebenen Spezifitätstests bestimmt mit der Ausnahme, daß HRP-Ziegen Anti-human-IgG und HRP-Ziegen- Anti-human-IgM unabhängig als Reagenzien der zweiten Stufe verwendet wurden, anstatt kombiniert eingesetzt zu werden. Die positive Reaktion des Antikörpers in Loch 6D6 mit Fisher-Immunotyp 2 und IATS-Serotypen 4 und 11 wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was einen IgM-Isotyp für diesen Antikörper anzeigt.

Die biochemische Charakterisierung der molekularen Spezies, die vom 6D6-Antikörper erkannt wird, wurde durch Immunoblot- Analyse, wie oben in Beispiel III beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die IATS-Serotypen 3 und 11 als Antigen- Präparationen für die Analyse ausgewählt wurden. Eine LPS-Präparation von Fisher-Immunotyp 1 wurde als Negativkontrolle mit eingeschlossen.

Vor der Analyse wurde jede der rohen LPS-Präparationen 1 : 1 in Dissoziationspuffer [0,125M Tris, 4% (Gew./V) Natriumdodecylsulfat (SDS), 20% (V/V) Glycerin, 10% (V/V) β-Mercaptoethanol, 0,4% (Gew./V) Bromphenol-blau, pH 6,8] verdünnt und während 5 Minuten im Bad beschallt. Um Proteine in den Proben abzubauen, wurde Proteinase K (1 mg/ml in H₂O) jeder Probe in einen 40% (Gew./Gew.)-Verhältnis von Enzym zu LPS zugegeben und bei 60°C während zwei Stunden mit einer 5-minütigen Badbeschallungsstufe nach einer Stunde inkubiert. Die Proben wurden dann 5 Minuten lang auf 100°C erhitzt und in einer Mikrozentrifuge 2 Minuten lang zentrifugiert.

Geklärte Proben, entsprechend 10 µg eines jeden Bakterienstammes, wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wie oben beschrieben unterworfen. Nach dem Transferieren der abgetrennten Molekülspezies auf ein NCM, wurden die NCM′s 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 ml von erschöpftem Kulturüberstand der 6D6-Zellinie inkubiert. Das weitere Verfahren wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Positive Ergebnisse wurden nur in den Proben gefunden, die Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 oder IATS-Serotyp 11 LPS enthielten. In den Fisher-Immunotyp 2 und ITAS-Serotyp 11- Proben erkannte der Antikörper 6D6 eine kurze Reihe von in regelmäßigen Abständen, d. h. leiterartig angeordneten Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, welche genau den kleineren Formen der LPS-Moleküle entsprachen, wie in einem ähnlich durchgeführten SDS-PAGE-Gel, bei dem Antigene nicht auf ein NCM transferiert, sondern statt dessen spezifisch auf das Vorliegen von LPS gefärbt wurden, sichtbar wurde, mit der Ausnahme, daß die niedrigste Bande auf dem silber-gefärbten Gel (welche die Kernreaktion plus Lipid A von LPS repräsentiert) nicht erkannt wurde. Im Gegensatz dazu erkannte der Antikörper 6D6 in der IATS-Serotyp 4 LPS enthaltenden Probe eine volle Reihe von in regelmäßigen Abständen angeordneten Bande, die nahezu die volle Länge des Gels überspannten, wobei die intensivste Reaktion unter den Banden mit höherem Molekulargewicht auftrat. Wiederum entspricht dieses Profil dem leiterartigen Bandmuster, das auf dem LPS spezifisch gefärbten Gel beobachtet wurde (d. h. sie entsprechen sich offensichtlich Bande für Bande), mit der Ausnahme, daß die den Kern plus Lipid A repräsentierende Bande nicht erkannt wurde. Diese Daten zeigen klar, daß die O-Seitenkette von LPS das molekulare Muster ist, das vom Antikörper 6D6 auf dem Fisher-Immunotyp 2 und den IATS-Serotypen 4 und 11 erkannt wird.

Um die in vivo-Schutzwirkung von Antikörper 6D6 abschätzen zu können, wurden Tierschutzversuche an Mäusen durchgeführt. Der 6D6-Antikörper wurde zuerst aus erschöpftem Kulturüberstand durch Fällen mit gesättigtem Ammoniumsulfat (50%ige Endkonzentration) konzentriert. Das ausgefällte Material wurde in einem minimalen Volumen sterilen Wassers rekonstituiert, extensiv dialysiert gegen PBS und sterilfiltriert. Als Negativkontrolle wurde ein erschöpfte Kultur-Überstand einer anderen transformierten Humanzellinie (C5B7-A.T.C.C. Nr. CRL 7853), die einen humanen monoclonalen Antikörper der spezifisch für LPS von Fisher-Immunotyp 1 ist, in der gleichen Weise behandelt. In ähnlicher Weise wurde Überstand eine Kultur von transformierten Humanzellinie 6F11 (A.T.C.C. Nr. CRL 8562), die humanen monoclonalen Antikörper der spezifisch gegenüber LPS von Fisher-Immunotyp 2 und IATS-Serotyp 11 ist, als positive Kontrolle konzentriert.

Weibliche Swiss-Webster-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körpergewicht wurden in drei Gruppen von je 20 Mäusen eingeteilt. Allen Mäusen einer jeden Gruppe wurden individuell auf intraperitonealem Weg (ip) 0,5 ml konzentrierter 6D6, C5B7 oder 6F11-Antikörper inokuliert. Sechs Stunden später wurden jede der drei Gruppen in vier Gruppen von je 5 Mäusen unterteilt und jede fünf Mäuse-Gruppe wurde unabhängig ip mit 0,3 ml einer Suspension lebender Bakterien, die 8 LD₅₀ Fisher-Immunotyp 1, Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 bzw. IATS-Serotyp 11 enthielt, infiziert. Die bakteriellen Suspensionen wurden, wie oben in Beispiel IV beschrieben, hergestellt. Nach der bakteriellen Infektion wurden die Tiere über einen Zeitraum von fünf Tagen beobachtet. Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgeführt.

Tabelle V

In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von menschlichem monoclonalem Antikörper 6D6 gegen Fisher-Immunotyp 2 und IATS-Serotypen 4 und 11

Wie aus Tabelle V zu ersehen, schafft der Antikörper 6D6 einen spezifischen und signifikanten Schutz gegen eine letale Infektion von Fisher-Immunotyp 2, IATS-Serotyp 4 und IATS- Serotyp 11 aber nicht Fisher-Immunotyp 1.

Beispiel VI

Beispiel VI zeigt eine Methode zur Herstellung eines humanen monoclonalen Antikörpers, der mit IATS-Serotyp 6 und 13 und Fisher-Immunotyp 1 von P. aeruginosa reagiert. Das in den Beispielen I bis V beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß gewisse Modifikationen erforderlich waren, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper zu isolieren, charakterisieren und zu prüfen. Im folgenden werden die Änderungen in der Verfahrensweise und die mit dem hier beschriebenen monoclonalen Antikörper erhaltenen Ergebnisse erläutert.

Die Quelle für die Human-B-Zellen war eine Person, die zuvor mit einer aus Fisher-Immunotyp 2 isolierten Polysaccharid- Präparation mit hohem Molekulargewicht (Pier et al., Infec. Immun., 34: 461 (1981)) immunisiert war. Nach dem Sammeln der E^-PBMC, in der oben beschriebenen Weise, wurden die Zellen in FCS, das 10% (V/V) DMSO enthielt, in einen Flüssigstickstoff- Gastank gefroren. Diese Zellen wurden später schnell auf 37°C aufgetaut, einmal in Iscove′s-Medium gewaschen und in HAT-Medium suspendiert. Die Zell-geführte Transformation wurde bei einem Verhältnis von 15 1A2 Zellen pro E^-PBMC durchgeführt. Die Zellmischung wurde in 20 Mikrotiter-Platten in einer Konzentration von 78.500 Zellen/Loch eingegeben. Die Kulturen wurden alle 3-5 Tage nach dem Eingeben gefüttert und am 11. Tag wurde beobachtet, daß 100% der Löcher proliferierte Zellen enthielten.

Zur Prüfung des Überstandes auf das Vorliegen von Anti- P. aeruginosa-Antikörper unter Verwendung der ELISA-Technik bestand die Antigen-Platte aus einer Mischung von P. aeruginosa Fisher-Immunotypen 1 bis 7 [klinisches Isolat PSA I277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC 27317 bzw. ATCC 27318]. Eine PLL-behandelte Mikrotiterplatte ohne Bakterien wurde ebenfalls in der Prüfung verwendet.

Eine Analyse des Kulturüberstandes durch die obige Methode führte zu der Identifikation von annähernd 200 Löchern, welche Anti-P. aeruginosa-Antikörper enthielten, die reaktiv mit der Fisher-Immunotypen 1 bis 7-Platte aber nicht mit der PLL-behandelten und bakterienfreien Platte war. Um die Löcher zu identifizieren, die mit zwei oder mehr IATS-Serotypen reaktive Antikörper enthielten, wurden Antigen-Platten wie oben angefertigt, in denen eine Säule bzw. Reihe der Platten PLL-fixierte Bakterien von nur einem IATS-Serotyp enthielten. Ein ELISA-Test wurde wie oben durchgeführt mit dem Überstand einer expandierten Kultur von jedem der Anti-P. aeruginosa- positiven Löcher. Die Überstände wurden in einer Reihe auf den neuen Antigen-Platten plaziert und führten zu der Identifizierung einer Anzahl von Löchern, welche mit zahlreichen IATS-Serotypen reaktive Antikörper enthielten. Ein Loch, bezeichnet 8H7, enthielt Antikörper der spezifisch für IATS- Serotypen 6 und 13 war. Als der Überstand von diesem Loch durch ELISA auf die sieben Fisher-Immunotypen wie in Beispiel V geprüft wurde, zeigte sich, daß die Antikörper von 8H7 spezifisch auf Fisher-Immunotyp 1 sind.

Um herauszufinden, ob das Anti-IATS-Serotyp 6 und 13-Reaktionsmuster aufgrund von einem von mehreren Antikörpern in Loch 8H7 zurückzuführen war, wurden zusätzliche aliquote Mengen an Überstand unabhängig mit IATS-Serotypen 6, 13 und 17 (Negativkontrolle) adsorbiert, und die adsorbierten Überstände wurden dann auf PLL-fixierten Bakterien von jedem der drei IATS-Serotypen entsprechend der oben angegebenen ELISA-Prüfweise getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß IATS-Serotypen 6 und 13 Antikörperaktivität gegeneinander ausadsorbierten. IATS-Serotyp 17 adsorbierte keine Aktivität aus gegen IATS 6 oder 13. Diese Daten zeigen, daß das Anti-IATS-Serotyp 6 und 13-Reaktionsmuster durch einen einzelnen Antikörper aus Loch 8H7 bedingt ist.

Die Isolation und das Klonen der Antikörper produzierenden Zellen von Loch 8H7 wurde in drei Stufen durchgeführt, im wesentlichen wie in Beispiel V beschrieben. Auf diese Weise wurde eine geklonte transformierte Human-Zellinie erhalten, welche kontinuierlich wuchs (d. h. unsterblich ist) und humanen monoclonalen Antikörper ausscheidet, der reaktiv mit Fisher-Immunotyp 1 und kreuzreaktiv mit IATS-Serotypen 6 und 13 ist. In diesem Beispiel tragen die Zellinie und der von ihr produzierte Antikörper dieselbe Bezeichnung 8H7. Unter Verwendung einer ähnlichen Arbeitsweise, wie in Beispiel V beschrieben, wurde der Isotyp des Antikörpers in Loch 8H7 als IgM bestimmt. Die biochemische Charakterisierung der Molekularspezies, die vom 8H7-Antikörper erkannt wird, wurde durch Immunoblot-Analyse, wie in den Beispielen III und IV beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die LPS-Präparationen vom Fisher-Immunotyp 1 und den IATS-Serotypen 6 und 13 als Antigen-Präparationen für die Analyse ausgewählt wurden. Eine LPS-Präparation aus IATS-Serotyp 10 wurde als negative Kontrolle mit eingeschlossen.

Die Analyse der erhaltenen Immunoblots zeigte positive Ergebnisse nur in den NCM-Proben (tracks), welche Fisher-Immunotyp 1, IATS-Serotyp 6 oder IATS-Serotyp 13 LPS enthielten. In den Fisher-Immunotyp 1- und IATS-Serotyp 6-Proben (tracks) erkannte der Antikörper 8H7 eine Reihe von in regulären Abständen, d. h. leiterartig angeordneten Banden, die nahezu die volle Länge des Gels überspannten. Diese Bande korrespondierten genau mit den Formen von LPS-Molekülen mit mehrfach verschiedenem Molekulargewicht, wie in einem in ähnlicher Weise durchgeführten SDS-PAGE-Gel, bei welchem die Antigene nicht auf ein NCM transferiert, sondern statt dessen auf das Vorhandensein von LPS spezifisch gefärbt wurden, visualisiert werden konnten. In der Probe (lane), die das IATS-Serotyp 13 LPS enthielt erkannte der Antikörper 8H7 eine mehr abgekürzte Reihe von in regelmäßigen Abständen angeordneten Banden, die den mittleren bis oberen Molekulargewichtsbereich des Gels einschlossen.

Wiederum entsprachen die erkannten Bande in ihrer Lage denjenigen in einem LPS spezifisch gefärbten Gel mit der Ausnahme der Formen von LPS im gefärbten Gel mit dem höchsten und niedrigsten Molekulargewicht, die auf dem Western-Blot nicht als gut erkannt erschienen. Diese Daten zeigen deutlich, daß LPS das Molekularmuster ist, das vom Antikörper 8H7 auf den Fisher-Immunotyp 1 und IATS-Serotypen 6 und 13 erkannt wird.

Um die in vivo-Schutzwirkung von Antikörper 8H7 zu prüfen, wurden Tierschutzversuche an Mäusen wie in den Beispielen IV und V durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde der Überstand von der Kultur einer anderen transformierten Zellinie (6F11--ATCC Nr. CRL 8652), die einen für das LPS von Fisher- Immunotyp 2 spezifischen humanen monoclonalen Antikörper produziert, in derselben Weise behandelt wurden. Als positive Kontrolle wurde Überstand einer Kultur von transformierter Human-Zellinie C5B7 (ATCC Nr. CRL 8753), die einen humanen monoclonalen Antikörper produziert, der spezifisch für die LPS von Fisher-Immunotyp 1 und IATS-Serotyp 6 ist, verwendet.

Weibliche Swiss-Webster-Mäuse zwischen 20 und 22 g Körpergewicht wurden in drei Gruppen von je 30 Mäusen unterteilt. Allen Mäusen einer jeden Gruppe wurden individuell intraperitoneal (ip) 0,5 ml konzentrierter 8H7, 6F11 bzw. C5B7 Antikörper inokuliert. Vier Stunden später wurde jede der drei Gruppen in drei Gruppen von 10 Mäusen unterteilt, und die Mitglieder einer jeden 10 Mäuse-Gruppe wurden unabhängig ip mit 0,3 ml einer Suspension lebender Bakterien infiziert, die 9,4 LD₅₀ eines klinischen Isolats (A522), das repräsentativ für den IATS 6 Serotyp (äquivalent Fisher-Immunotyp 1) ist, 5 LD₅₀ des IATS 13 Referenz-Serotyps, oder 10 LD₅₀ des IATS 11 Referenz-Serotyps (äquivalent Fisher-Immunotyp 2) enthielt. Die Bakteriensuspensionen wurden, wie oben in Beispiel IV beschrieben, hergestellt. Nach der materiellen Infektion wurden die Tiere über einen Zeitraum von 5 Tagen beobachtet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten.

Tabelle VI

In Vivo-Demonstration der Schutzwirkung von humanem monoclonalem Antikörper 8H7 gegen IATS-Serotypen 6 und 13

Wie in Tabelle VI dargestellt, bietet der Antikörper 8H7 einen spezifischen signifikanten Schutz gegen eine letale Infektion von IATS-Serotyp 6 jedoch nicht IATS-Serotyp 11. Der Schutz gegen IATS-Serotyp 13 war von geringerem Grad, kann jedoch erklärt werden durch die relativ hohe Anzahl an Organismen, die zum Erreichen des LD₅₀ für dieses Isolat erforderlich sind im Vergleich zum Serotyp 7 Isolat (3 × 10⁷ koloniebildende Einheiten bzw. 2,6 × 10⁶ koloniebildende Einheiten). In einem getrennten Experiment schützte Antikörper 8H7 fünf von fünf Mäusen, die mit 3,5 LD₅₀ von IATS 13 Isolat infiziert waren und fünf von fünf Mäusen, die mit IATS 6 Isolat infiziert waren.

Aus dem Vorgehenden ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Zellinien humane monoclonale Antikörper und Fragmente davon liefern, die kreuzreaktiv für und kreuzprotektiv gegen verschiedene P. aeruginosa-IATS-Serotypen sind. Dies ermöglicht es, prophylaktische und therapeutische Zusammensetzung wesentlich leichter zu entwickeln, welche wirksam gegen Infektionen durch die meisten, wenn nicht alle P. aeruginosa-Stämme sind. Zusätzlich liefern die Zellinien Antikörper, welche Anwendung in Immunoassays und anderen gut bekannten Verfahren finden.

Wenn auch die vorliegende Erfindung im Detail erläutert und anhand von Beispielen beschrieben wurde, so ist es für den Fachmann doch klar, daß Änderungen und Abwandlungen hiervon möglich sind, ohne daß der Schutzumfang verlassen wird.

Claims (42)

1. Zusammensetzung, enthaltend einen humanen monoclonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon, der zu einer spezifischen Bindung mit einer Vielzahl, jedoch nicht allen IATS-Serotypen von Pseudonomas aeruginosa fähig ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend ist gegen mindestens zwei IATS-Serotypen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend ist gegen mindestens drei IATS-Serotypen.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Bindung an zwei oder drei IATS- Serotypen fähig ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend gegen mindestens zwei IATS-Serotypen ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper nichtreaktiv mit irgendeinem Fisher- Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa reagiert.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Reaktion mit zwei oder mehr Fisher-Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Reaktion mit drei IATS-Serotypen fähig ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend gegen mindestens zwei IATS-Serotypen und ein Fisher-Immunotyp ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend gegen mindestens zwei IATS-Serotypen und mindestens zwei Fisher-Immunotypen ist.

12. Zusammensetzung, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mindestens zwei monoclonalen Antikörpern vom Menschen, von denen mindestens einer zur spezifischen Reaktion mit zugänglichen Lipopolysaccharid- Determinanten ist, die auf weniger als allen aber auf mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa vorhanden sind.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Antikörper in vivo schützend gegen zwei oder mehr IATS-Serotypen ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend gegen drei IATS-Serotypen ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Bindung an drei IATS-Serotypen fähig ist.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper nichtreaktiv mit mit einem Fisher-Immunotyp ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Reaktion mit einem Fisher- Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Reaktion mit zwei oder mehr Fisher-Immunotypen fähig ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vivo schützend gegen reaktive IATS-Serotypen und Fisher-Immunotypen ist.

20. Zusammensetzung mit einem Antikörper oder einem Bindungsfragment davon, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon zur spezifischen Reaktion mit einer Vielzahl von aber nicht allen IATS-Serotypen und mehr oder weniger als einem Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon zur Reaktion mit mindestens drei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon zur Reaktion mit zwei Fisher-Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zum in vivo-Schutz gegen mindestens zwei IATS-Serotypen und mindestens zwei Fisher- Immunotypen fähig ist.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit IATS-Serotypen 2, 5 und 16 und Fisher-Immunotypen 3 und 7 reagiert.

25. Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Bindungsfragment davon zur spezifischen Bindung an eine Vielzahl von jedoch nicht allen IATS-Serotypen und ein Fisher-Immunotyp von Pseudomonas aeruginosa fähig ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon zur Bindung von zwei IATS-Serotypen fähig ist.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zum in vivo-Schutz gegen mindestens zwei IATS-Serotypen und ein Fisher-Immunotyp fähig ist.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit den IATS-Serotypen 4 und 11 und Fisher-Immunotyp 2 reagiert.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit IATS-Serotypen 6 und 13 und Fisher-Immunotyp 1 reagiert.

30. Pharmazeutikum, enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere in Verbindung mit einem physiologischen akzeptierbaren Träger.

31. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung menschlicher Patienten, die anfällig gegenüber Bakteriämie oder eine andere durch Pseudomonas aeruginosa verursachte Erkrankung sind, insbesondere durch Verabreichung von therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Dosen der Zusammensetzung.

32. Unsterbliche (permanente) transformierte Zellinie, welche einen menschlichen monoclonalen Antikörper, insbesondere einer solchen nach einem der Ansprüche 1 bis 29, ausscheidet, der spezifisch mit weniger als allen aber mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert.

33. Zellinie nach Anspruch 32, bezeichnet als A.T.C.C. Nr. CRL 8941, 9171 oder 9258.

34. Menschlicher monoclonaler Antikörper, der reaktiv ist mit einem Epitop, welches mit einem monoclonalen Antikörper reagiert, produziert von einer Zellinie nach Anspruch 33.

35. Kit zur Verwendung bei der Untersuchung des Vorliegens von Pseudomonas aeruginosa mit einer Monoclonalen-Antikörper- Zusammensetzung, die mindestens einen menschlichen monoclonalen Antikörper enthält, der mit weniger als allen aber mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reagiert und Markern zur Lieferung eines feststellbaren Signals, die kovalent mit den Antikörpern oder an zweite Antikörper gebunden sind, die ihrerseits mit jedem der monoclonalen Antikörper reaktiv sind.

36. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhütung von Pseudomonas aeruginosa-Infektion, enthaltend einen menschlichen monoclonalen Antikörper, der schützend ist gegen mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa, in Verbindung mit einem antimikrobiellen Mittel, einer Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma-Immunglobulin und/oder einem physiologisch akzeptierbaren Träger.

37. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma-Immunglobulin erhältlich ist von Menschen, die einen erhöhten Immunglobulinspiegel der reaktiv mit Pseudomonas aeruginosa-Bakterien und/oder antigenen Komponenten davon ist, zeigen.

38. Zusammensetzung nach Anspruch 36, zusätzlich enthaltend einen monoclonalen Antikörper, der reaktiv mit Pseudomonas aeruginosa Flagella oder Exotoxin A ist.

39. Verwendung einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines monoclonalen Antikörpers, der zur Bindung an Lipopolysaccharid-Determinanten von mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa fähig ist, in Kombination mit mindestens einem der nachfolgenden Bestandteile:

• - eine prophylaktische oder therapeutische Menge eines monoclonalen Antikörpers, der zur Reaktion mit Pseudomonas aeruginosa Flagella oder Exotoxin A fähig ist,
• - ein monoclonaler Antikörper, der zur Reaktion mit mindestens einer zusätzlichen serotypischen Determinanten oder einem Lipopolysaccharid-Molekül von Pseudomonas aeruginosa fähig ist,
• - eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma,
• - eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma, die erhöhte Spiegel an mit Pseudomonas aeruginosa und/oder deren Produkten reaktiven Immunglobulinen zeigt, und/oder
• - ein antimikrobielles Mittel,

zur Behandlung von Menschen, die anfällig gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen sind.

40. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von Pseudomonas aeruginosa in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem monoclonalen Antikörper, der mit mindestens zwei IATS-Serotypen von Pseudomonas aeruginosa reaktiv ist, insbesondere einem Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 23, kombiniert und die Komplexbildung feststellt.

41. Verfahren zur Herstellung einer zur Behandlung oder Verhütung von Pseudomonas aerugunisoa-Infektionen brauchbaren Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei humane monoclonale Antikörper, von denen mindestens einer schützend gegen mindestens zwei IATS- Serotypen von Pseudomonas areguinosa ist, mit einem antimikrobiellen Mittel, einer Gammaglobulinfraktion aus menschlichem Blutplasma und/oder einem physiologisch akzeptierbaren Träger vermischt.