SE468831B - Monoklonala antikroppar som aer korsreaktiva och korsprotektiva mot p aeruginosa-sero-typer - Google Patents

Description

468 851 2 renade bakteriella endotoxiner från E. aeruginosa leder till utvecklingen av specifika opsoniska antikroppar rik- tade primärt mot determinanter på de återkommande oligo- sackaridenheterna i de lipopolysackarid-(LPS)-molekyler som är lokaliserade på det yttre cellmembranet av 2. ae- ruginosa (se Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving B.M. och Fin- layson, J.S., eds, sid. 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). Dylika antikroppar har, vare sig de har alstrats aktivt eller överförts passivt, visat sig skydda mot de letala verkningarna av en 2. aeruginosa- -infektion i en mångfald djurmodeller (Pollack, supra) och vid vissa preliminära undersökningar med människa (se Young, L.S. och Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, Sa- bath, L., ed., sid. 119-132, Hans Huber, 1980). Av speci- ell betydelse för dessa antikroppars roll vad beträffar människa har vidare varit upptäckten hos patienter med 2. aeruginosa-bakteremi av en association mellan överlevnad och höga akuta serumtitrar av antikroppar mot LPS-moleky- lerna hos den infekterande stammen (se Pollack, M. och Young, L.S., J. Clin. Invest., §§:276-286, (1979)).

Ovan angivna rapporter visar att immunoterapeutiska metoder skulle kunna utnyttjas för att förebygga och behandla bak- teriesjukdomar orsakade av 2. aeruginosa, såsom genom ad- ministrering av poolade humanimmunglobuliner som innehål- ler antikroppar mot den infekterande stammen eller de in- fekterande stammarna. Humanimmunglobuliner definieras i fö- religgande sammanhang som den del av fraktionerad humanplas- ma som är anrikad på antikroppar, bland vilka finns repre- senterade specifika antikroppar mot stammar av 2. aerugino- sa. Till följd av vissa inneboende begränsningar vid an- vändning av humanimmunglobulinkomponenter är fortfarande denna metod för behandling av sjukdomar orsakade av 2. ag- ruginosa föremål för undersökning (se exempelvis Collins, M.s. och Roby, R.E., Am. J. Med., l6_(3A)=168-174, (1984)), (K un... -- -..~1».~.---@.--.-....-......- ...___ _... . .sv-...H 8 851 ON 3 4 och för närvarande finns icke nâgra kommersiella produkter tillgängliga som utnyttjar dessa komponenter.

En sådan begränsning förknippad med immunglobulinberedning- ar är att de utgörs av pooler av prov från ett tusental el- ler flera donatorer, vilka prover har valts ut i förväg med avseende på närvaron av speciella anti-Pseudomonas-antikrop- par. Denna poolning leder till en medelvärdestiter av indi- viduella antikroppstitrar, vilket som bäst resulterar i måttliga ökningar i den resulterande titern av de önskade antikropparna.

En annan begränsning är att själva preselektionsprocessen kräver dyrbar kontinuerlig "screening" av donatorpoolen för att ombesörja jämn produktkvalitet. Trots dessa ansträng- ningar kan immunglobulinprodukter fortfarande uppvisa av- sevärda variationer från sats till sats och bland produk- ter från olika geografiska områden.

Ytterligare en sådan begränsning som är inneboende hos immun- globulinberedningar är att deras användning resulterar i samtidig administrering av stora mängder av främmande pro- teinartade substanser (som kan innefatta virus såsom de vi- rus som nyligen har visat sig vara associerade med förvärvat immunbristsyndrom (Acquired Immune Deficiency Syndrome) el- ler AIDS) med potential att åstadkomma ogynnsamma biologiska verkningar. Kombinationen av låga titrar av önskade anti- kroppar och en hög halt av främmande substanser kan ofta be- gränsa, till suboptimala nivåer, den mängd av specifika och således gynnsamma immunglobuliner som kan administreras till patienten.

Det föreligger i litteraturen ett antal serotypningsscheman som är användbara för analys av Pseudomonas aeruginosa-infek- tioner. Dessa scheman är primärt baserade på de värmestabila somatiska huvudangigenerna hos denna organism (se Zierdt, C.H. i Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical 468 831 4 Microbiology, Gilardi, G.L., red., CRC Press, sid. 213-238 (1978)). Proliferationen av serogrupperingsschemat har gjort det relativt svårt att jämföra serologiska under- sökningar av 2. aeruginosa och således kommer valet av ett givet system i syfte att underkasta överliggande vätskor "screening" att bli någotgodtyckligt.Förvirringen mellan typningssystem har nyligen eliminerats genom tillkomsten av: "the International Antigenic Typing Scheme (IATS)"-systemet, som har föreslagits av underkommitten för Pseudomonadaceae i “the International Committee on Systematic Bacteriology som grundval för ytterligare serologiska undersökningar av 2. aeruginosa. Detta system, som tillhandahåller sjutton distinkta serotyper betecknade IATS typ 1, IATS typ 2 etc., innefattar alla de värmestabila somatiska huvudantigener som har identifierats i tidigare system. Se Liu, P.V., Int. J.

Syst. Bacteriol., §â:256-264, na beskrivning genom hänvisning därtill. (1983), som införlivas med den- Vid utveckling av skyddande monoklonala antikroppar, som är korsreaktiva bland stammar av Q. aeruginosa, är det även för- delaktigt att inkorporera ett typningsschema, som är baserat på skyddsantigenerna av 2. aeruginosa. Ett sådant schema har föreslagits med syftet att utveckla ett vaccin för kliniskt bruk och beskrivs i detalj i Fisher, M.W. et al., J. Bacteri- ol., 2§:835-836, (1969). Detta system, som vanligen beteck- nas som Fisher-typningssystemet, klassificerar huvuddelen av känd 2. aeruginosa i sju typer, som betecknas Fisher immuno- typ 1, Fisher immunotyp 2 etc. Korrelationen mellan IATS- och Fisher-typningssystemen har klarlagts (se Liu, P.V., gt al., sgpša) och återges i tabell I nedan. Såsom framgår av tabell I finns det för vissa IATS-serotyper icke några mot- svarande Fisher-immunotyper ehuru varje Fisher-immunotyp mot- svarar en viss IATS-serotyp. För IATS- och Fisher-typnings- systemen antages de antigena determinanter som är relevanta för båda serotypningsschemana vara lokaliserade på yt-LPS- -molekylerna av Q. aeruginosa (Liu, P.V. et al., supra; Han- essien, F., gt al., Nature, 222:209-210 (1979)). fu Tabell I Jämförelse och korrelation mellan IATS- och Fisher-typnings- scheman för Pseudomonas aeruginosa IATS Fisher 1 2 3 .- 4 _. 7 6 1 7 _ 8 6 9 .- 5 11 2 12 - 13 - 14 - 17 - År 1975 rapporterade Kohler och Milstein sin seminalupptäckt att vissa muscellinjer kunde sammansmältas med musmjält- celler för skapande av hypridom, som vart och ett skulle kunna utsöndra antikroppar med en enda specificitet, d.v.s. monoklonala antikroppar (Kohler, G. och Milstein, C., Nature, §5§:495-497 (1975)). Med tillkomsten av denna teknologi är det möjligt att i vissa fall framställa stora mängder av ytterst specifika murinantikroppar mot en speciell determi- nant eller determinanter på antigener. Dylika monoklonala musantikroppar eller beredningar av dylika antikroppar kan 468 831 6 emellertid uppvisa stora olägenheter vid användning på män- niska, speciellt mot bakgrund av den upptäckten att mono- klonala musantikroppar vid användning i undersökningar av behandlingen av vissa humansjukdomar ofta har konstaterats framkalla ett immunsvar som gör dem ineffektiva (Levy, R.L. och Miller, R.A., Ann. Rev. Med., §g:107-116, (1983)).

Under användning hybridomteknik har Sadoff gt al. rappor- terat framställningen av en monoklonal musantikropp av IgM- -klass riktad mot en O-sidokedjedeterminant på LPS-moleky- lerna från en speciell serotyp av 2. aeruginosa (Abstracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, nr. 253). De har vidare rapporterat att denna murinantikropp skyddade möss mot en letal infekteran- de dos av Q. aeruginosa av samma serotyp som den typ mot vilken antikropparna var riktade (d.v.s. den homologa sero- typen). Flera efterföljande artiklar har i detalj beskrivit framställningen av monoklonala mus- och human-anti-2. äggu- ginosa-LPS-antikroppar av olika specificiteter; se exempel- vis Sawada, S., et al., J. Inf. Dis., l§Q:570-576, (1984); Sadoff, J., gt al., Antibiot. Chemoter., §§:134-146, (1985); Hancock, R., et al., Infect. Immun. åZ:166-171 (1982): Sia- dak, A.W. och Lostrom, M.E., i Human Hybridomas and Mono- clonal Antibodies, Engleman, E.G., et al., eds., sid. 167- -185, Plenum Publishing Corp. (1985) och Sawada, S. gt al., Inf. Dis., l§å:965-970, (1985). Framställning och immunote- rapeutisk användning av humana monoklonala anti-3. aerugino- ga-LPS-serotypspecifika antikroppar avslöjas i de samtidigt anhängiga amerikanska patentansökningarna 734 624 och 828 005, vars innehåll införlivas med denna beskrivning genom hänvis- ning därtill.

Ehuru vissa fördelar kan uppnås genom användning av monoklo- nala antikroppar, som är specifika för en enda IATS-serotyp av Q. aeruginosa, i vissa situationer, såsom när infektionen kan spåras till en enda serotyp, är det i många andra situa- tioner icke föredraget att använda den. Så exempelvis skulle 'u _.. ___-a... . . . _ ..... .a-.u-q-q-fl-fi _..._..-.,..................._-_............. ._ 7 468 851 det vid profylaktisk behandling av potentiella infektioner hos människa vara föredraget att administrera en humananti- kropp eller humanantikroppar, som skyddar mot en mångfald IATS-serotyper. Vid terapeutiska användningar där seroty- pen eller serotyperna av den infekterande stammen eller de infekterande stammarna ej är känd (a) skulle det likaledes vara föredraget att administrera en humanantikropp eller hu- manantikroppar, som är effektiva mot de flesta, om ej alla, av de kliniskt viktiga 2. aeruginosa-IATS-serotyperna. Me- dan en kombination av monoklonala humanantikroppar, som var och en är specifik med avseende på en enda IATS-serotyp av 2. aeruginosa, teoretiskt skulle kunna beredas för att skyd- da mot de olika serotyperna skulle en dylik beredning vara svår att utveckla och ur tillverkningssynpunkt oekonomisk att framställa.

Följaktligen föreligger ett signifikant behov av monoklonala anti-Q. aeruginosa-humanantikroppar med förmåga att känna igen och tillhandahålla skydd mot multipla IATS-serotyper av 2. aeruginosa. Vidare skulle dessa antikroppar vara lämpliga för användning vid profylaktisk och terapeutisk behandling av 2.aeruginosa-infektioner. Föreliggande uppfinning fyller dessa behov.

Sammanfattning av uppfinningen Nya cellinjer tillhandahålles, vilka kan producera monoklo- nala humanantikroppar med förmåga att specifikt reagera med LPS-molekylerna hos en mångfald av, men ej alla, IATS-sero- typerna av 2. aeruginosa. Dessa antikroppar har olika reak- tiviteter med Fisher-immunotyper och binder till noll, en eller en mångfald immunotyper. Vidare tillhandahålles ett sätt att behandla en människa, som är utsatt för infektion av eller redan infekterad med 2. aeruginosa, genom adminis- trering av en profylaktisk eller terapeutisk mängd av en be- redning innefattande minst en human monoklonal antikropp el- ler bindningsfragment därav med förmåga att korsreagera med 468 851 s 2. aeruginosa-IATS-serotyper, varvid beredningen företrädes- vis även innefattar en fysiologiskt godtagbar bärare. Bered- ningen kan även innehålla en eller flera av följande: ytter- ligare monoklonala humanantikroppar med förmåga att reagera med 2. aeruginosa flagella, exotoxin A eller med andra sero- typ- eller immunotypdeterminanter på LPS av 2. aeruginosa; en gammaglobulinfraktion från humanblodplasma; en gammaglo- bulinfraktion från humanblodplasma där plasman erhålles från människor, som uppvisar förhöjda nivåer av immunoglobuliner reaktiva med 2. aeruginosa; och ett eller flera antimikro- biella medel.

Beskrivning av de föredragna utföringsformerna I enlighet med föreliggande uppfinning tillhandahållas nya celler med förmåga att producera monoklonala humanantikrop- par och beredningar innefattande dylika antikroppar, vilka beredningar selektivt kan känna igen åtminstone en mångfald av och i vissa fall samtliga E. aeruginosa-stammar, där in- dividuella antikroppar typiskt känner igen multipla IATS-se- rotyper och noll, en eller flera Fisher-immunotyper av 2. aeruginosa. Föreliggande celler har identifierbara kromoso- mer, där mikroblinje-DNA från dem eller förstadieceller har omlagrats för kodning av en antikropp med ett bindningsstäl- le för en epitop som är gemensam för vissa 2. aeruginosa- -serotyper. Dessa monoklonala humanantikroppar kan användas på en mångfald olika sätt innefattande diagnos och terapi (d.v.s. skydd in vivo).

Typiskt är cellerna enligt föreliggande uppfinning transfor- merade humanlymfocyter, som ger skyddande monoklonala human- antikroppar mot tillgängliga LPS-molekyler av 2. aeruginosa.

Med "tillgänglig" avses att LPS-molekylerna är fysikaliskt tillgängliga i användningsmiljön för direkt växelverkan med de monoklonala antikropparna. De på så sätt tillhandahållna monoklonala antikropparna är användbara vid behandling el- ler profylax av allvarliga sjukdomar orsakade av Q. aerugi- "vB-n- i _..

N. 9 468 831 gosa. LPS-molekylerna i det yttre membranet av 2. aeruginosa är tillgängliga för direkt kontakt med antikroppsmolekyler- na, vilket således underlättar komplementmedierad lys och/ eller fagocytos av organismen. De LPS-molekyler som utsönd- ras från det yttre membranet till den omgivande miljön är även fria att växelverka direkt med antikroppsmolekylerna och avlägsnas via det retikuloendoteliala systemet.

Framställningen av monoklonala antikroppar kan åstadkommas genom immortalisering av expressionen av nukleinsyrasekven- ser som kodar för antikroppar specifika för en epitop på LPS-molekylerna av multipla serotyper av 2. aeruginosa. Ty- piskt produceras de monoklonala antikropparna genom cell- styrd Epstein-Barr-virus (EBV)-transformation av B-lymfo- cytceller erhållna från humandonatorer, som har exponerats för serotypen eller serotyperna ifråga av 2. aeruginosa. De på så sätt framställda antikroppsutsöndrande cellinjerna karakteriseras som kontinuerligt växande lymfoblastoida cel- ler som uppvisar en diploid karyotyp, är Epstein-Barr-kärn- antigenpositiva och utsöndrar monoklonal antikropp av anting- en IgG-, IgM-, IgA- eller IgD-isotyp innefattande olika sub- typer såsom IgG1, IgG2, IgG3 och IgG4. Själva den cellstyrda transformationsprocessen beskrivs i detalj i den amerikanska patentskriften 4 464 465, vars innehåll införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. De monoklonala anti- kropparna kan användas intakta eller som fragment, såsom Fv, Fab, F(ab')2, men vanligen intakta och framställs i enlig- het med inom tekniken välkända förfaranden.

Alternativt kan de cellinjer som producerar antikropparna framställas genom cellfusion mellan lämpligt läkemedelsmärkt humanmyelom, musmyelom, human-musheteromyelom eller lymfoblas- toida humanceller med human-B-lymfocyter för erhållande av humanhybridcellinjer.

Cellinjerna enligt föreliggande uppfinning kan finna annan användning än för direkt framställning av de monoklonala 468 851 10 humanantikropparna. Cellinjerna kan sammansmältas med andra celler (såsom på lämpligt sätt läkemedelsmärkt humanmyelom, musmyelom, human-musheteromyelom eller lymfoblastoida hu- manceller) för framställning av hybridom och således till- handahålla transferering av de gener som kodar för de mono- klonala antikropparna. Alternativt kan cellinjerna använ- das som en källa till de kromosomer som kodar för immunoglo- bulinerna, vilka kan isoleras och överföras till celler me- delst annan teknik än fusion. Vidare kan de gener som kodar för de monoklonala antikropparna isoleras och användas i en- lighet med rekombinerande DNA-teknik för produktion av den specifika immunoglobulinen i en mångfald värddjur. Genom pre- parering av cDNA-bibliotek från budbärar-RNA kan speciellt en enda CDNA-klon, som kodar för immunoglobulinen och är fri från introner, isoleras och införas i lämpliga prokaryotiska eller eukaryotiska expressionsvektorer och därefter transfor- meras till ett värddjur för slutlig bulkframställning.

De lymfoblastoida eller hybrida cellinjerna kan klonas och "screenas" i enlighet med konventionell teknik med de anti- kroppar som har förmåga att bindas till epitoperna av olika 2. aeruginosa-IATS-serotyper och Fisher-immunotyper, som pâ- visas i de överliggande cellvätskorna. Genom att utnyttja antikroppar enligt föreliggande uppfinning som blockerande antikroppar vid "screening" i enlighet med förfaranden, som är välkända för fackmannen, kan man lätt isolera ytterligare monoklonala antikroppar, som känner igen samma antigeniska de- terminanter eller epitoper.

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahàlles monoklonala humanantikroppar med förmåga att specifikt binda till de lipopolysackariddeterminanter som är närvarande på en mångfald av, men ej alla, IATS-serotyper av 2. aeruginosa.

Dessa determinanter kan exempelvis vara närvarande på två eller tre IATS-serotyper och på noll, en eller minst två Fisher-immunctyper. Dylika antikroppar kan skydda in yiyg mot vissa av eller samtliga de igenkända serotyperna och im- 11 468 831 munotyperna, typiskt två eller flera serotyper.

Monoklonala antikroppar enligt föreliggande uppfinning kan även finna vidsträckt användning in yitrg. Så exempelvis kan de monoklonala antikropparna användas för typning, för isolering av specifika 2. aeruginosa-stammar, för att se- lektivt avlägsna E. aeruginosa-celler i en heterogen bland- ning av celler eller liknande.

För diagnostiska ändamål kan de monoklonala antikropparna antingen vara märkta eller omärkta. Typiskt innefattar di- agnostiska analysmetoder detektering av bildningen av ett komplex genom bindning av den monoklonala antikroppen till LPS av 2. aeruginosa-organismen. I omärkt form finner an- tikropparna användning vid agglutinationsanalyser. Vidare kan omärkta antikroppar användas i kombination med andra märkta antikroppar (sekundära antikroppar), som är reakti- va med den monoklonala antikroppen, såsom antikroppar spe- cifika för immunoglobulin. Alternativt kan de monoklonala antikropparna direkt märkas. En mångfald markörer kan an- vändas såsom radionuklider, fluorescerande medel, enzymer, enzymsubstrat, enzym-cofaktorer, enzyminhibitorer, ligander (speciellt haptener) etc. Olika typer av immunoanalysmeto- der finns tillgängliga och som exempel härpâ hänvisas till de amerikanska patentskrifterna 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 och 4 098 876, vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.

Vanligen utnyttjas de monoklonala antikropparna enligt före- liggande uppfinning vid enzymimmunoanalys, där föreliggande antikroppar, eller sekundära antikroppar från en annan art, konjugeras till ett enzym. När ett prov innehållande 2. ae- ruginosa av en viss serotyp, såsom humanblod eller lysat därav, kombineras med föreliggande antikroppar inträder bindning mellan antikropparna och de molekyler som uppvisar den önskade epitopen. Dylika celler kan därefter separeras 46.. 8:51 12 från icke-bundna reagens och en sekundär antikroPP (märkt med ett enzym) tillsättes. Därefter bestämmes närvaron av det antikropp-enzym-konjugat som är specifikt bundet till cellen. Annan konventionell teknik, som är välkänd för fack- mannen, kan även utnyttjas.

Testsatser kan även tillhandahållas för användning med före- liggande antikroppar vid påvisande av Q. aeruginosa-infek- tion eller för pâvisande av närvaron av Q. aeruginosa-anti- gen. Således kan föreliggande monoklonala antikroppsbered- ning enligt föreliggande uppfinning tillhandahâllas, vanli- gen i lyofiliserad form, antingen separat eller tillsammans med ytterligare antikroppar, som är specifika med avseende på andra gramnegativa bakterier. Antikropparna, som kan va- ra konjugerade till en markör eller okunjugerade, ingår i testsatserna med buffertämnen, såsom Tris, fosfat, karbonat etc., stabiliseringsmedel, biocider, inerta proteiner, exem- pelvis bovinserumalbumin eller liknande. I allmänhet är dessa material närvarande i en mängd mindre än ca. 5 vikt%, räknat på mängden av aktiv antikropp, och är vanligen när- varande i en total mängd av minst ca. 0,001 vikt%, ånyo räk- nat på antikroppskoncentrationen. Ofta är det önskvärt att införliva ett inert utdrygningsmedel eller excipient för ut- spädning av de aktiva beståndsdelarna, varvid excipienten kan vara närvarande i en mängd av från ca. 1 till 99 vikt% av den totala beredningen. När en sekundär antikropp med för- måga att binda till den monoklonala antikroppen användes, är denna vanligen närvarande i en separat ampull. Den sekundära antikroppen är typsikt konjugerad till en markör och bereds på ett sätt analogt med ovan beskrivna antikroppsberedning- ar.

Farmaceutiska beredningar och användning De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan även införlivas som komponenter i farmaceutiska beredning- ar, som innehåller en terapeutisk eller profylaktisk mängd _ Sh 13 46 CCI Afx .lv LN _å av minst en av de monoklonala antikropparna enligt denna upp- finning och en farmaceutiskt effektiv bärare. En farmaceutisk bärare bör vara en kompatibel ogiftig substans, som är lämp- lig för administrering av de monoklonala antikropparna till patienten. Sterilt vatten, alkohol, fetter, vaxer och inerta fasta ämnen kan användas som bärare. Farmaceutiskt godtagba- ra adjuvantia (buffertmedel, dispergeringsmedel) kan även in- förlivas med den farmaceutiska beredningen. Dylika beredning- ar kan innehålla en enda monoklonal antikropp, som är speci- fik för tvâ eller flera, men icke samtliga, IATS-serotyper av 2. aeruginosa. Alternativt kan en farmaceutisk beredning in- nehålla två eller flera monoklonala antikroppar för bildning av en "cocktail". Så exempelvis är en cocktail, som innehål- ler monoklonala humanantikroppar mot grupper av de olika g. aeruginosa-serotyperna och -immunotyperna, en universalpro- dukt med aktivitet mot det stora flertalet av de kliniska iso- laten av denna speciella bakterie.

Av intresse är profylaktiska och/eller terapeutiska monoklo- nala antikroppsberedningar, som kan reagera med minst tre IATS-serotyper, vanligen minst fyra och i synnerhet minst fem IATS-serotyper. Av speciellt intresse är monoklonala anti- kroppsberedningar, som reagerar med minst ca. sju, företrä- desvis minst ca. tio till fjorton och upp till och innefat- tande samtliga sjutton IATS-serotyper. Jämte IATS-serotyper- na reagerar lämpligen beredningarna med minst en, vanligen minst två och i synnerhet minst tre eller fyra och upp till och innefattande samtliga sju immunotyper i Fisher-immunotyp- ningssystemet.

Var och en av beredningarna innefattar minst en, vanligen minst två och isynnerhet minst tre antikroppar eller däröver, varvid varje antikropp reagerar med minst två, tre, fyra el- ler flera, men icke samtliga, IATS-serotyper. Med fördel fö- religger minst en monoklonal antikropp, som binder till minst två IATS-serotyper och en eller flera Fisher-immunotyper, fö- reträdesvis minst två immunotyper.

Det är önskvärt att det totala antalet olika monoklonala an- GD »-ø. æ-.f LN' __.\ 14 tikroppar i en beredning är minst ett och lika med eller mindre än ca. hälften av det totala antalet IATS-serotyper med vilka beredningarna reagerar, ofta en tredjedel av ett dylikt totalt antal.

Molförhållandet mellan de olika monoklonala antikroppskompo- nenterna skiljer sig vanligen icke åt med mer än en faktor , vanligare icke med mer än en faktor 5 och föreligger van- ligen i ett molförhållande av ca. 1:1 - 2 med avseende på de övriga antikroppskomponenterna.

De monoklonala humanantikropparna enligt föreliggande uppfin- ning kan även användas i kombination med andra monoklonala antikroppsberedningar eller med existerande blodplasmapro- dukter, såsom kommersiellt tillgängliga gammaglobulin- och immunglobulinprodukter, som användes vid profylaktisk eller terapeutisk behandling av 2. aeruginosa-sjukdomar hos män- niska. För immunglobuliner erhålles företrädesvis plasman från humandonatorer, som uppvisar förhöjda nivåer av immuno- globuliner, som är reaktiva med avseende på 2. aeruginosa.

För allmän information hänvisas till kompendiet "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host,“ Amer. J. Med., Z§(3a), 30 mars 1984, sid. 1-231, vars innehåll införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.

De monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning kan användas som separat administrerade beredningar, som till- förs jämte antibiotika eller antimikrobiella medel. Typiskt kan de antimikrobiella medlen innefatta ett anti-pseudomonalt penicillin (exempelvis karbenicillin) jämte en aminoglykosid (exempelvis gentamycin, tobramycin etc.), men talrika ytter- ligare medel (exempelvis cefalosporiner), som är välkända för fackmannen, kan även användas.

De monoklonala humanantikropparna och farmaceutiska beredning- arna därav enligt denna uppfinning är speciellt användbara för oral eller parenteral administrering. Företrädesvis kan 468- de farmaceutiska beredningarna administreras parenteralt, d.v.s. subkutant, intramuskulärt eller intravenöst. Således tillhandahåller denna uppfinning beredningar för parenteral administrering, vilka innefattar en lösning av den monoklo- nala humanantikroppen eller en cocktail därav upplöst i en godtagbar bärare, företrädesvis en vattenhaltig bärare. En mångfald vattenhaltiga bärare kan användas, exempelvis vat- ten, buffrat vatten, 0,4 % saltlösning, 0,3 % glycin och lik- nande. Dessa lösningar är sterila och i allmänhet fria från partikelformigt material. Dessa beredningar kan steriliseras medelst konventionell välkänd steriliseringsteknik. Bered- ningarna kan innehålla sådana farmaceutiskt godtagbara hjälpsubstanser som krävs för att approximera fysiologiska betingelser, såsom pH-reglerande medel och buffertmedel, toxi- citetsreglerande medel och liknande, exempelvis natriumacetat, natriumklorid, kaliumklorid, kalciumklorid, natriumlaktat etc.

Koncentrationen av antikropp i dessa beredningar kan variera inom vida gränser, d.v.s. från mindre än ca. 0,5 vikt%, van- ligen minst ca. 1 vikt% till så mycket som 15 eller 20 vikt%, och valet därav baserar sig primärt på vätskevolymer, viskosi- teter etc., alltefter det valda administreringssättet.

Således kan en typiskt farmaceutisk beredning för intramusku- lär injektion framställas innehållande 1 ml sterilt buffrat vatten och 50 mg monoklonal antikropp. En typisk beredning för intravenös infusion kan framställas innehållande 250 ml ste- ril Ringers lösning och 150 mg monoklonal antikropp. Aktuella metoder för framställning av parenteralt administrerbara be- redningar är kända eller uppenbara för fackmannen och beskrivs närmare i detalj exempelvis i Remington's Pharmaceutical Science, 15:e uppl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsyl- vania (1980), som införlivas med denna beskrivning genom hän- visning därtill.

De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan lyo- filiseras för lagring och rekonstitueras i en lämplig bärare före användning. Denna teknik har visat sig vara effektiv med konventionella immunglobuliner och inom tekniken känd lyofi- fïfi v .- o -. n ~._: ...Å 16 liserings- och rekonstitueringsteknik kan användas. Det är uppenbart för fackmannen att lyofilisering och rekonstitue- ring kan leda till varierande grad av förlust av antikropps- aktivitet (exempelvis med konventionella immunglobuliner tenderar IgM-antikroppar att uppvisa större aktivitetsför- lust än IgG-antikroppar) och att användningsnivåerna måste justeras för kompensation därav.

Beredningarna, som innehåller föreliggande monoklonala hu- manantikroppar eller en cocktail därav, kan administreras för profylaktisk och/eller terapeutisk behandling av 2. äggu- ginosa-infektioner. För terapeutiskt bruk administreras be- redningarna tillenpatient, som redan har infekterats med en eller flera 2. aeruginosa-serotyper, i en mängd som är till- räcklig för att hårda eller åtminstone partiellt hindra in- fektionen och dess komplikationer. En mängd som är adekvat för att åstadkomma detta definieras som en "terapeutiskt ef- fektiv dos". Mängder, som är effektiva för detta ändamål, beror på infektionens svårighetsgrad och det allmänna till- ståndet hos patientens eget immunsystem men varierar i all- mänhet från ca. 1 till ca. 200 mg antikropp per kg kropps- vikt, varvid doser av 5 - 25 mg per kg vanligen användes. Man måste hålla i minnet att materialen enligt denna uppfinning allmänt kan användas för allvarliga sjukdomstillstånd, d.v.s. livshotande eller potentiellt livshotande situationer, spe- ciellt bakteremi och endotoxemi till följd av 2. aeruginosa.

I dylika fall är det, mot bakgrund av frånvaron av främman- de substanser och frånvaron av bortstötande av “främmande substans", vilket uppnås medelst föreliggande monoklonala humanantikroppar, möjligt och kan vara önskvärt av den be- handlande läkaren att administrera väsentliga överskott av dessa antikroppar.

Vid profylaktiska tillämpningar administreras beredningar, som innehåller föreliggande antikropp eller cocktail därav, till en patient som ej redan har infekterats av 2. aeruginosa i syfte att förstärka patientens resistens mot en dylik po- 17 4-68 9 »l tentiell infektion. En sådan mängd definieras som en "profy- laktiskt effektiv dos". Vid denna användning beror även här de exakta mängderna på patientens hälsotillstånd och allmän- na immunitetsnivâ men varierar i allmänhet från 0,1 till 25 mg/kg, speciellt 0,5 - 2,5 mg/kg.

Enkel- eller multipeladministreringar av beredningarna kan ut- föras med dosnivâer och doseringsmönster som bestämmes av den behandlande läkaren. Under alla omständigheter bör de farma- ceutiska beredningarna tillhandahålla en mängd av antikroppen eller antikropparna enligt denna uppfinning som är tillräck- lig för att effektivt behandla patienten.

FÖRSÖKSBESKRIVNING Exempel I Exempel I visar metoder för produktion av monoklonala human- antikroppar (IgM-isotyp), som reagerar med IATS-serotyper 2, och 16 och Fisher-immunotyper 3 och 7.

Ett perifert blodprov erhållet från en patient med cystisk fibros och känd för kronisk infektion av 2. aeruginosa tjä- nade som källa till humana B-celler. Mononukleära celler se- parerades från blodet genom standardcentrifugeringsteknik på Ficoll-Paque (Boyum, A;, Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968) glzsuppl. 97, 77-89) och tvättades två gånger i kalcium/mag- nesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS).

De mononukleära cellerna utarmades på T-celler under använd- ning av ett modifierat E-rosetteringsförfarande. I korthet innebär detta att cellerna först återsuspenderades till en kon- centration av 1 x 107 celler/ml i PBS innehållande 20 % kalv- fosterserum (FCS) vid 4oC. 1 ml av denna suspension infördes därefter i ett 17 x 100 mm rundbottnat polystyrenrör, till vilket sattes 1 x 109 2-aminoisotiouroniumbromid (AET)- be- handlade röda blodceller från får från en 10%-ig (volym%) lös- CO CA! ._._:. 18 ning i Iscoves modifierade Dulbecco-medium (Iscoves medium) (Madsen, M, och Johnson, H.E., J. Immun. Methods (1979) 21:61-74). Suspensionen omblandades mycket försiktigt un- der 5-10 minuter vid 4°C och därefter avlägsnades de E-roset- terade cellerna genom centrifugering på Sicoll-Paque under 8 minuter vid 2500 x G vid 4°C. E-rosettnegativa perifera mononukleära blodceller (E-PBMC), som hade samlats vid gränsytan, tillvaratogs och tvättades en gång i Iscoves me- dium och âtersuspenderades i detsamma innehållande 15 % (v/v) FCS, L-glutamin (2 mmol/1), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 ug/ml), hypoxantin (1 x 10-4M), aminop- terin (4 x 104m) och tymidin (1,6 x 104m) . Detta medium betecknas i det följande HAT-medium.

Cellstyrd transformation av E_PBMC âstadkommes genom samod- ling av dessa celler med en transformerande cellinje. Den transformerande cellinjen var en positiv lymfoblastoid hu- man Epstein-Barr-kärnantigen (EBNA)-cellinje härrörande från etylmetansulfonat (EMS)-mutagenes av GM 1500 lymfoblastoid cellinje, följt av selektion i närvaro av 30 pg/ml 6-tiogua- nin för att förläna cellerna brist på hypoxantinguanin-fos- foribosyltransferas (HGPRT) och således göra cellerna HAT- -känsliga. Denna cellinje betecknas som 1A2-cellinjen och har deponerats vid the American Type Culture Collection (ATCC) den 29 mars 1982 under ATCC-beteckningen nummer CRL 8119. 1A2-celler i logaritmisk tillväxtfas suspenderades i HAT-medium och kombinerades därefter med E_PBMC i ett för- hållande av åtta 1A2-celler per E-PBMC. Cellblandningen ut- ströks på åtta rundbottnade mikrotiterplattor med 96 fack (COSt&r3799) i en koncentration av 72 000 celler/fack i en vo- lym av 200 Pl per fack och inkuberades vid 37°C i en fuktig atmosfär innehållande 6 % C02. Kulturer matades på dagarna och 8 efter utstrykning genom ersättning av halva den över- liggande vätskan med färskt HAT-medium. Facken observerades varannan dag i ett inverterat miksoskop med avseende på tecken på cellproliferation. Tolv dagar efter utstrykning konstatera- des att 100 % av facken innehöll prolifererande celler och att i de flesta av facken mfllanm hadetillräcklig densitet för av- 19 läsnande och analys av de överliggande vätskorna med avseen- de på anti-2. aeruginosa-antikropp.

De överliggande vätskorna underkastades screening med avseen- de på närvaron av anti-2. aeruginosa-antikroppar under an- vändning av tekniken med enzymlänkningsimmunosorbensanalys (ELISA) (Engvall, E., (1977) §§:193-200). Antigenplattorna bestod av flatbottnade mikrotiterplattor med 96 fack (immu- lon II, Dynatech), vars väggar innehöll.olika levande bakte- rier adsorberade på fackens botten. För att underlätta ad- sorption av bakterierna till plasten inkuberades 50 pl/fack av poly-L-lysin (PLL) (1 pg/ml i PBS, pH 7,2) under 30 mi- nuter vid rumstemperatur. Oadsorberad PLL slogs därefter av, plattorna tvättades en gång med PBS, 50 pl av tvättad bakte- riesuspension (OD660=0,2) i PBS sattes till varje fack och plattorna inkuberades under 1 timme vid 37oC. Oadsorberade bakterier avlägsnades genom tvättning av plattorna tre gång- er med saltlösning-Tween (0,9% NaCl, 0,05% (v/v) Tween-20).

Olika antigenplattor, som användes vid screeningen, inklude- rade: (1) en blandning av 2.aeruginosa-Fisher-immunotyperna 1, 2 och 4 (ATCC-nummer 27312, 27313, 27315); (2) en bland- ning av 2. aeruginosa-Fisher-immunotyper 3, 5, 6 och 7 (ATCC- nummer27314,27316,27317 respektive 27318); och (3) en mikro- titerplatta utan nâgra bakterier.

ELISA initierades genom att man först blockerade plattorna med 200 pl/fack av blockerande buffert (PBS) pH 7,2, innehål- lande 5% (vikt/volym) fettfri torrmjölk, 0,01% (v/v) Anti- foam A (Sigma) och 0,01 % (vikt/volym) thimerosal) under 60 minuter vid rumstemperatur. Efter blockering tvättades plat- torna tre gånger med saltlösning-Tween. 50 pl PBS, pH 7,2, innehållande 0,1 % Tween-20 och 0,2 % (vikt/volym) bovinserum- albumin (BSA) infördes därefter i samtliga fack. överliggande vätskor från facken i odlingsplattorna replikatutströks i mot- svarande fack på antigenplattorna (50 pl/fack) och plattorna inkuberades 30 minuter vid rumstemperatur. överliggande vät- skor avlägsnades därefter, facken tvättades tre gånger med saltlösning-Tween och 50 Pl av på lämpligt sätt utspätt pep- 851 20 parrotsperoxidas (HRP)-konjugerat get-anti-humant IgG+IgM (American Qualex International1ÉA1114 +1FA1124) sattes till facken. I detta exempel användes HRP-get-anti-IgG och HRP- -get-anti-IgM i en slututspädning av 1:5000 respektive 1:3000 i PBS, pH 7,2 innehållande 0,05 % Tween-20 och 0,1 % BSA. Ef- ter 30 minuters inkubering vid rumstemperatur av lägsnades överskottet av enzymkonjugerade getantikroppar och facken tvättades tre gånger med saltlösning-Tween. 100 ml substrat (0,8 mg/ml o-fenylendiamindihydroklorid i 100 mM citratbuffert, pH 5,0, plus 0,03 % H2O2 ka stora volymer strax före utstrykning) och sattes därefter i avjoniserat vatten blandades i li- till varje fack. Efter 30 minuters inkubering i mörker sattes 50 pl 3N svavelsyra till samtliga fack för att avbryta reak- tionerna. överliggande vätskor på odlingarna innehållande anti- kroppar, som reagerade med plattans antigen, detekterades ge- nom positiv färgutveckling i motsvarande fack och reaktionens styrka kvantifierades genom mätning av adsorbensen vid 490 nM på en Bio-Tek EL-310 mikro ELISA läsare.

Analys av de överliggande vätskorna från odlingen medelst ovannämnda metod ledde till identifiering av två fack (1C1 och 2H12), som innehöll anti-2. aeruginosa-antikroppar, som rea- gerade med Fisher-immunotypplattorna 3, 5, 6 och 7 men ej med Fisher-immunotypplattorna 1, 2 och 4 eller den bakteriefria plattan. För att identifiera den specifika Fisher-immunotypen eller de specifika Fisher-immunotyper som kändes igen, prepa- rerades antigenplattor innehållande PLL-fixerade bakterier av endast en Fisher-immunotyp som beskrivits ovan för varje im- munotyp. Utförande av ELISA-analys såsom angivits ovan med överliggande vätskor från odlingarna i facken 1C1 och 2H12 på de individuella immunotypplattorna visade att dessa två fack innehöll antikropp, som var specifik mot både Fisher-im- munotyp 3 och 7. En liknande ELISA-analys utförd på IATS-pa- nelen av 2. aeruginosa-typande stammar (erhållna från ATCC och innefattande numren 33348 - 33364) visade att antikropp i facken 1C1 och 2H12 reagerade specifikt med IATS-stammarna 2, 5 och 16. ... ...__.-_..-.__.._......... .. ..._ 21 N38 åšfšl Isotypen av den reaktiva antikroppen eller reaktiva antikrop- parna i facken 1C1 och 2H12 bestämdes medelst en ELISA-ana- lys liknande de specificitetstester som har beskrivits ovan med undantag av att HRP-get-anti-human-IgG och HRP-get-an- ti-human-IgM användes oberoende som andrastegsreagens istäl- let för att kombineras. Positiv reaktion av antikroppen el- ler antikropparna i facken 1C1 och ZH12 med Fisher-immuno- typerna 3 och 7 konstaterades endast med anti-IgM-reagensen, vilket âskådliggjorde en IgM-isotyp för den relevanta anti- kroppen eller de relevanta antikropparna i varje fack.

I syfte att fastställa om reaktionsmönstren för anti-Fisher- -immunotyperna 3 och 7 var en följd av en eller flera anti- kroppar i facken 1C1 och 2H12 (d.v.s. en antikropp reaktiv med avseende på båda Fisher-immunotyperna 3 och 7 eller två antikroppar, en reaktiv med avseende pâ Fisher-immunotypen 3 och den andra med avseende på Fisher-immunotypen 7) efter- odlades celler från båda facken vid låg densitet och fack innehållande prolifererande celler analyserades med avseen- de på antikroppsaktivitet på separata plattor med bakterie- antigen av Fisher-immunotyp 3 och Fisher-immunotyp 7. Efter- odling utfördes i rundbottnade plattor med 96 fack vid en densitet av fem celler/fack i en total volym av 100 pl av HAT-medium, som saknade iminopterin-komponenten (HT-medium).

Icke-transformerande HAT-känsliga lymfoblastoida celler in- förlivades med samtliga fack vid en densitet av 500 celler/ fack som matarceller. Fyra dagar efter utstrykning sattes 100 pl HAT-medium till samtliga fack för att selektivt döda matarcellerna. Facken matades ånyo på dag 9 efter utstrykning- en genom ersättning av hälften av den överliggande vätskan med HAT-medium. Därefter matades facken på liknande var 4 - 5:e dag med HT-medium till dess facken hade tillräcklig lymfo- blastoid celldensitet för analys av den överliggande vätskan medelst ELISA. Vid analys på individuella Fisher-immunotyp-3- och Fisher-immunotyp-7-antigenplattor reagerade alla sådana överliggande vätskor som reagerade med Fisher-immunotyp 3 även 8:.§ 22 med Fisher-immunotyp 7, vilket visade att en antikropp var ansvarig för aktiviteten med avseende på båda Fisher-immu- notyperna. Slumpvis utvalda överliggande vätskor visade sig vid analys på IATS-stammarna 2, 5 och 16 reagera med alla tre stammarna och ej med individuella stammar, vilket ytter- ligare underbyggda slutsatsen att en antikropp korsreagerade med Fisher-immunotyperna 3 och 7 och IATS-stammarna 2, 5 och 16.

Kloning av specifika antikroppsproducerande celler från facken 1C1 och 2H12 âstadkommes genom att man oberoende underkastade cellerna från varje fack flera omgångar begränsande spädnings- kloning till dess samtliga klonala överliggande vätskor ana- lyserade medelst i enlighet med ovan angivna ELISA-protokoll resulterade i en positiv reaktion på Fisher-immunotyperna 3 och 7 och IATS-stammarna 2, 5 och 16. Kloning utnyttjade ma- tarceller såsom beskrivits ovan för efterodling. Pâ detta sätt erhöllstvà klonade transformerade humancellinjer (1C1 och 2H12), som är kontinuerliga (odödliga) och som var och en av- söndrar monoklonala humanantikroppar reaktiva med avseende pâ Fisher-immunotyperna 3 och 7 och IATS-stammarna 2, 5 och 16.

I detta exempel har cellinjen och den antikropp den produce- rar samma beteckning.

Exempel II Exempel II visar metoder för produktion av monoklonal human- antikropp (IgG-isotyp), som reagerar med IATS-serotyperna 2, och 16 och Fisher-immunotyperna 3 och 7. Protokollen för produktionen är i huvudsak identiska med exempel I. I kort- het innebär detta att ett perifert blodprov, erhållet från en patient med cystisk fibros och som var känd att ha kronisk infektion av 2. aeruginosa, tjänade som källa till humana B- -celler. Mononukleära celler separerades såsom beskrivits i exempel I med undantag av att 1,6 ml av PBS-suspensionen an- 9 vändes med 1,6 x 10 AET-behandlad suspension av röda blodcel- ler från får. Den cellstyrda transformationen var även den- OD (N . ...à- 23 4 6 f) samma med undantag av att: förhållande 1A2-celler per E_PBMC var 7,5; femton plattor med 17 000 celler/fack an- vändes; odlingarna matades på dagarna 6 och 10 efter ut- strykning; och på den sextonde dagen efter utstrykning näranog samtliga fack innehöll prolifererande celler.

Screening av de överliggande odlingsvätskorna med avseende på specifika antikroppar utfördes såsom beskrivits ovan och resulterade i att man lokaliserade ett fack (9D1), som inne- höll en antikropp, som var reaktiv med avseende på plattorna med Fisher-immunotyperna 3, 5, 6 och 7 men ej med plattorna med Fisher-immunotyperna 1, 2 och 4 och ej med den bakterie- fria plattan. Utförande av den beskrivna ELISA-analysen på individuella plattor med bakterieantigen av imminotyp eller serotyp med överliggande odlingsvätska från 9D1 visade på en antikropp, som var specifik mot båda Fisher-immunotyperna 3 och 7 liksom mot IATS-stammarna 2, 5 och 16. Efterföljande undersökningar utförda i enlighet med exempel I visade att antikroppsspecificiteten i facket 9D1 var att hänföra till en enda klonutsöndrande antikropp av IgG-isotyp.

Exempel III Exempel III åskådliggör den antigena specificiteten hos vissa av antikropparna enligt föreliggande uppfinning.

I syfte att fastställa huruvida monoklonala antikroppar 1C1, 2H12 och 9B1 reagerade med samma antigeniska målobjekt och således var identiska i specificitet utfördes ytterligare ana- lyser. Först jämfördes antikropparna vid ett ELISA-test på en panel av referensstammar och kliniska isolat av 2. aeru- ginosa. ELISA-protokollet var det som har beskrivits ovan med undantag av följande modifikationer: 1) istället för bakterier adsorberade på PLL-belagda plattor innehöll plattans fack oli- ka helbakterier, som hade etanolfixerats på bottnen av facket.

Plattorna preparerades genom tillsats av 50 pl tvättad bakte- riesuspension (OD66O=O,2) i PBS till facken, centrifugering -h- ON CD ÛÛ* QNI ...à 24 av plattorna under 20 minuter vid 500 x G, avsugning av PBS, tillsats av 75 pl etanol under 10 minuter och avlägsnande av etanolen följt av lufttorkning. På antigenplattorna tillför- des IATS-stammarna 2, 5, 11 och 16 (ATCC-nummer 33349, 33352, 33358 respektive 33363) och sexton kliniska isolat, som tidi- gare hade typats både genom agglutination med Difco (Detroit, Michigan)-Bacto-Pseudomonas aeruginosa-antisera enligt till- verkarens anvisningar och genom ELISA (såsom har beskrivits ovan) som serotyper 2, 5, 16 eller en kombination av dylika serotyper; 2) kanintypningsantisera användes i en utspädning av 1:5000 i PBS med undantag av anti-IATS 16, som späddes 1:250. Överliggande odlingsvätskor innehållande 1C1-, 2H12- och 9D1-antikroppar användes outspädda; 3) som reagens i an- dra steget användes biotinylerat protein A (B-2001, Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) utspätt 1:500 och biotinyl- erat get-antidnmantlg (4703, Tago, Inc., Burlingame, CA) ut- spätt 1:500 för detektering av kanin- respektive humananti- kroppar. 50 Pl reagens sattes till de lämpliga facken ifråga och efter 30 minuters inkubering vid rumstemperatur avlägsna- des obundet reagens och facket tvättades tre gånger. 50 Pl av ett i förväg bildat avidin: biotinylerat pepparrotsperoxi- daskomplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) sattes därefter till varje fack. Efter 30 mi- nuters inkubering vid rumstemperatur avlägsnades överskottet Vectastain ABC-reagens och facken tvättades ånyo tre gånger före tillsats av substratet. Såsom framgår av tabell II visar resultaten av analysen att medan antikropparna 1C1 och 9D1 reagerade med varje kliniskt isolat typat som en IATS 2-, 5- eller 16-serotyp, reagerade icke antikroppen på H12 med tre sådana isolat. Detta antyder att antikroppen 2H12 kände igen en epitop, som skiljer sig från den som 1C1 och 9D1 känner igen, och att de två epitoperna uppenbarligen är koordinerat uttryckta på de flesta av men icke på samtliga kliniska iso- lat motsvarande IATS-serotyperna 2, 15 eller 16. Ö\ Po C f' 'Ü._;\I __ \ 4 Tabell II REAKTIVITETSMÖNSTER HOS DIFCO'BACTO-2. AERUGINOSA-ANTISERA OCH HUMANA MONOKLONALA ANTIKROPPAR 2H12, 1C1 OCh 9D1 PÅ TYP- STAMMAR OCH KLINISKA ISOLAT AV E. AERUGINOSA Typstam Kanin Människa eller lfliïiskt un» m, .m 1s° at az as ale =11 2n12 1c1 9n1 :Ars 2 + a - :ATS 5 (+)a + a IATs 16 (+) (+) :ATS 11 - - I l+ll I +|Il l+++ l+++ l+++ A523 B406 C27 D26 F155 F225 F2S0 F253 F255 F256 F396 H217 H2l8 H219 H220 H221 ma W II++IIII++I I llllll I++++++++ ++l+++++l+++++++ ++++++l+++++++++ I I I l+++++l ++++++++++++++++ ++++++++++++f+++ a(+) = ELISA-reaktion mycket svagt positiv Data antyder vidare att det molekylära mâlobjekt som kändes igen av antikropparna 1C1 och 9B1 sannolikt var närvarande på alla kliniska isolat av 2. aeruginosa som kunde typas som tillhörande IATS-serotyperna 2, 5 eller 16 medan det målob- jekt som kändes igen av antikroppen 2H12 uttrycktes på en under- grupp av dylika isolat.

För att bestämma huruvida 1C1-, 2H12- och 9D1-antikropparna reagerade med olika antigener eller alternativt olika epito- per på samma antigen med dylika epitoper uttryckta på de fles- ta av men ej samtliga IATS 2-, 5- och 16-serotyper, utfördes immunoblottinganalys. Eftersom den delade antigeniciteten _ (h. (ÛW CCD CD LJ 26 mellan IATS-stammarna 2, 15 och 16 uppenbarligen är att hän- föra till de värmestabila antigenerna (Liu, P.V. gt al., su - ra) och under beaktande av det faktum att värmestabiliteten är en tidigare konstaterad egenskap hos lipopolysackaridmo- lekyler, utvaldes LPS-preparationer från IATS-stammarna 2, 5, 16 och 11 som antigenpreparationer för analys. Rå LPS prepa- rerades från typstammarna genom extraktion i saltlösning vid 60°C (Orskov, F. gt al., Acta. Path. Microbiol. Scand. (1971) Section B 12:142-152). Tio mikrogram LPS, bestämd genom 2-keto-3-deoxioktonat (KDO)-halten (Karkhanis, Y.D., gt al., Anal. Biochem.(1978) §§:595-601)frân var och en av serotyper- na underkastades natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektro- fores (SDS-PAGE) (Hancock, R.E.W. och Carey, A.M., J. Bacteri- gl. (1977) lgQ:901-910) på en 10-20%-ig gradientgel. Separe- rade molekylfragment överfördes från gelen till ett mikrocel- lulosamembran (NCM) såsom beskrivits tidigare (Towbin, H., gt al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) Z§:4350-4354) och NCM- fläcken blockerades under 1 timme i PBS-Tween (Batteiger, B., gt al., J. Immunol. Meth. (1982) §§:297-307). Fläckarna in- kuberades därefter under 1 timme vid rumstemperatur i 20 ml förbrukad överliggande odlingsvätska från antingen 1C1-, 2H12- eller 9D1-cellinjerna. Efter 5 minuters sköljning i PBS-Tween inkuberades var och en av NCM-fläckarna under 1 timme vid °C i en 1:1000- eller 1:1500-spädning (i PBS-Tween) av al- kaliskt fosfataskonjugerat get-anti-human IgG+IgA+IgM (zymed).

Fläckarna underkastades därefter fem 5-minuterstvättningar i PBS-Tween, varefter antigen-antikropp-interaktioner visuali- serades genom inkubering av fläckarna under 15-20 minuter vid °c i 30 m1 nitroblåtetrazo1ium/s-brQm-4-kior-s-inaølylfos- fat (NBT-BCIP)-substrat såsom beskrives av Leary gt al., Ergo.

Natl. Acad. Sci. USA (1983) §Q:4045-4049. Färgutvecklingen avbröts genom sköljning av fläcken flera gånger i avjoniserat vatten.

De fläckprofiler som erhölls med de tre antikropparna skiljde sig påtagligt från varandra. Antikropp 2H12 igenkände huvud- sakligen en kort serie av regelbundet anordnade (d.v.s. steg- m-l...

O 27 4š58 Q á i (JJ liknande) lågmolekylära molekyler i antigenpreparationerna av serotyperna 2, 5 och 16. Vissa regelbundet anordnade högmole- kylära molekyler kunde även svagt igenkännas. Någon reaktion konstaterades ej pâ LPS-preparationen från serotyp 11. En uppräkning av immublottingsanalysen under användning av LPS- -preparationer, som tidigare hade behandlats med proteinas K vid 60°C för att förstöra proteinantigenen, resulterade icke i några profiländringar. De lågmolekylära banden motsvarade exakt mindre former av LPS-molekyler såsom de visualiserades i en likaledes utförd SDS-PAGE-gelanalys, där antigenerna ej överfördes till ett NCM utan istället specfikt färgades med avseende på närvaron av LPS (Tsai, C.M. och Frasch, C.E., Anal. Biochem. (1982) ll2:115-119), med undantag av att det lägsta bandet på den silverfärgade gelen (representerande kärnregionen plus lipid A i LPS) ej kändes igen. Antikroppen 1C1 igenkände samma serie av regelbundet anordnade lâgmoleky- lära molekyler bland antigenpreparationer av serotyperna 2, 5 och 16 men ej 11, ehuru reaktionens intensitet ej var så kraftig som med ZH12. Vidare igenkände även denna antikropp huvudsakligen en serie regelbundet anordnade högmolekylära mo- lekyler på serotyperna 2, 5 och 16, vilka i kombination med de igenkända lågmolekylära banden gav upphov till distinkta full- ständiga stegliknande profiler. Desssa profiler ändrades ej genom förbehandling av antigenprepparationerna med proteinas K. Anyo observerades de profiler som motsvarade de stegliknan- de bandmönstren i LPS-specifika färgade geler (d.v.s. de syn- tes motsvara band för band) med undantag av att det band som representerade kärnan plus lipid A ej igenkändes. Antikropp 9D1 hade samma reaktionsprofil som antkropp 1C1 pâ IATS 2-, - och 16-stammarna men ej på 11-stammen. Även här igenkändes ej det lägsta bandet på stegen av en silverfärgad gel av de olika LPS-preparationerna och den totala profilen ändrades ej genom förbehandling av LPS-preparationerna med proteinas K.

Sammantaget visade dessa observationer att LPS av serotyperna 2, 5 och 16 var de molekylära mâlobjekt som igenkändes av ZH12-, 1C1- och 9D1-antikropparna. l> ox CO CU LN ..__\. 28 Exempel IV Exempel IV åskådliggör den skyddande aktiviteten hos en av antikropparna enligt föreliggande uppfinning.

För att utvärdera skyddsförmågan in Ziyg av antikropp 1C1 utfördes djurskyddsstudier på möss. 1C1-antikroppen koncen- trerades först ur en förbrukad överliggande odlingsvätska genom fällning med mättat ammoniumsulfat (50 % slutkoncen- tration) (Good, A.H., et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. och Shiigi, S.M., Red. W.J. Free- man & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)).Utfällt mate- rial rekonstituerades i minsta möjliga volym sterilt vatten, dialyserades omfattande mot PBS och sterilfiltrerades. Som negativ kontroll behandlades likaledes en förbrukad överlig- gande odlingsvätska från en annan transformerad humancell- linje (6F11-ATCC nummer CRL 8562), som producerade en mono- klonal humanantikropp, som var specifik med avseende på LPS i IATS-stammen 11.

BALB/c-möss av honkön med en kroppsvikt av mellan 20 och 22 g uppdelades i två grupper innehållande 30 möss vardera. Samt- liga möss i varje grupp ympades individuellt på intraperito- neal (ip) väg med 0,5 ml koncentrerad 1C1- eller 6F11-anti- kropp. Sex timmar senare underindelades var och en av de två grupperna i tre grupper om 10 möss och medlemmar tillhörande varje grupp om 10 möss infekterades oberoende intraperitone- alt med 0,3 ml av en levande bakteriesuspension innehållande fem LD 50 pensionerna framställdes från ett odlingsmedium i logaritmisk av IATS-stammarna 2, 5 respektive 11. Bakteriesus- fastillväxt, från vilket bakterierna centrifugerades, tvätta- des två gånger i PBS och återsuspenderades till lämplig den- sitet i PBS. Kontrollgrupper bestående av fyra eller fem möss vardera injicerades intraperitonealt med 0,5 ml PBS och in- fekterades 6 timmar senare intraperitonealt med fem LD50 av samma serotyper. Efter bakterieinjektionen observerades dju- ren under en tidsrymd av 5 dagar. . ...- -...~. .. .~ ...wah-.Q-...p W. ._........_......-... ___... . ..._ 40 29 468 831 Såsom visas i tabell III tillhandahöll antikropp 1C1 speci- fikt och signifikant skydd mot en letal dos av både IATS 2- och IATS 5-serotyperna men ej av IATS 11-serotypen. Det ty- piska förloppet efter bakterieinfektionen i samtliga oskyd- dade djur innefattade varierande perioder av endotoxisk chock och följdes vanligen av döden. Kontrolldjur, som en- dast tillfördes PBS, genomgick akut endotoxisk chock och av- led samtliga snabbt. Negativa kontrolldjur, som tillfördes icke-homolog antikropp (6F11), uppvisade en period av mera förlängd chock, som karakteriseras av de symptom som är an- givna i fotnoten "a" till tabell III. Vissa av dessa djur tillfrisknade gradvis, möjligen till följd av de icke-anti- kroppskomponenter som även samkoncentrerades i antikropps- preparationerna. De djur som erhöll den skyddande homologa antikroppen uppvisade emellertid endast mindre symptom på endotoxemi. Dessa symptom försvann inom 24 timmar efter in- ympning och djuren föreföll därefter friska under återsto- den av den 5 dagar långa observationsperioden.

Tabell III Påvisande in vivo av skyddseffekten av monokonal humananti- kropp 1C1 mot IATS-serotyperna 2 och 5 Monoklonal Antal överlevande/antal infekterade djur human 5 dagar efter infektion med: antikropp IATS 2 IATS 5 IATS 11 1c1 8/10 10/10 3/10a eF11 0/10 1/1oa 10/10 PBS 0/4 0/4 0/4 ai sådana fall där icke-specifikt skydd kdneteteredee skiljde sig tillfrisknandet från infektionen markant från det som kun- de konstateras mellan homologa antikroppar och infekterande stammar, d.v.s. 1C1 med IATS 2 eller 5 och 6F11 med IATS 11.

I sistnämnda fall var tillfrisknandet i huvudsak fullständigt, varvid djuren uppträdde normalt 24 timmar efter bakterieinfek- tion. I icke-specifika fall uppvisade emellertid mössen tecken på akut infektion (d.v.s. diarré, skorpartade ögonlock, upp- burrad päls, "kutig" profil och långsam rörelse) under flera dagar innan återgång till normal status inträdde. Dylikt icke- -specifikt skydd är uppenbarligen att hänföra till icke-anti- kroppskomponenter, som samkoncentreras och således injiceras i djuren, eftersom samtliga djur som endast fick PBS dog. 468 Sa? 30 Under användning av samma protokoll utfördes ett andra för- sök, där grupper av möss smittades med Fisher-stammarna 2, 3 eller 7 och djuren observerades under 5 dagar. Såsom visas i tabell IV tillhandahöll ånyo antikropp 1C1 specifikt och signifikant skydd mot en annars letal infektion med Fisher- -immunotyperna 3 och 7 men var ineffektiv mot Fisher immuno- typ 2.

Tabell IV Påvisande in vivo av skyddseffekten av monoklonal humananti- kropp 1C1 mot Fisher-immunotyperna 3 och 7 Monoklonal Antal överlevande/antal infekterade djur human 5 dagar efter infektion med: antikropp Fisher 3 Fisher 7 Fisher 2 1c1 10/10 10/10 1/1oa 6F11 o/10 7/1oa 1o/10 Pßs o/s o/5 o/5 aöverlevnad mest sannolikt till följd av icke-specifikt skydd såsom beskrives i fotnoten till tabell III.

Exempel 5 Exempel 5 åskådliggör en metod för produktion av monoklonal humanantikropp, som reagerar med IATS-serotyperna 4 och 11 och Fisher-immunotypen 2 av 2. aeruginosa. Det i exemplen 1 - 4 beskrivna förfarandet upprepades med undantag av att det var nödvändigt att utföra vissa modifikationer för att isolera, karakterisera och analysera den i detta exempel be- skrivna antikroppen. Nedan följer angivande av ändringarna vid förfarandet och de resultat som erhölls med den i detta exempel beskrivna monoklonala antikroppen.

Källan till humana B-celler var en individuell, tidigare med en högmolekylär polysackarid immuniserad preparation isole- rad från Fisher-immunotypen 3 (Pier, G.B., et al., Infeg.

ImmEn.(1984) g§:309-313, som införlivas med denna beskriv- ning genom hänvisning därtill). ...mm O\ CO CO f.) J ...x 31 4 Cellstyrd transformation av E_PBMC åstadkommes genom sam- odling av dessa celler med den transformerande cellinjen 1A2. 1A2-celler i logaritmisk tillväxtfas suspenderades i HAT-me- dium och kombinerades därefter med E_PBMC i ett förhållande av femton 1A2-celler per E_PBMC. Cellblandningen utströks på fjorton mikrotiterplattor i en koncentration av 62 000 cel- ler/fack i en volym av 200 pl per fack. Kulturer matades på dagarna 7 och 11 efter utstrykning och på dag 15 konstatera- des att 100 % av facken innehöll prolifererande celler.

För screening av närvaron av anti-2. aeruginosa-antikroppar användes tvâ antigenplattor, som bestod av: (1) en blandning av 2. aeruginosa-Fisher-immunotyperna 1 och 7 (ATCC nummer 27312, 27313, 27314, 27315, 27316, 27317 respektive 27318); och (2) en PLL-behandlad mikrotiterplatta utan nâgra bakte- rier.

Analys av de överliggande odlingsvätskorna medelst den i ex- emplen ovan angivna metoden ledde till identifiering av ca. 100 fack, som innehöll anti-2.aeruginosa-antikroppar, som var reaktiva med plattan med Fisher-immunotyperna 1-7 men ej med den PLL-behandlade platta som saknade bakterier. I syfte att identifiera den specifika Fisher-immunotyp eller de specifika Fisher-immunotyper som igenkändes arrangerades antigenplat- torna såsom ovan, där varje rad av plattor innehöll PLL-fixe- rade bakterier av endast en Fisher-immunotyp. Ett ELISA-test utfördes såsom angivits ovan, varvid den överliggande odlings- vätskan från var och en av de anti-2. aeruginosa-positiva facken anordnades i kolumnuppställning på de nya antigenplat- torna, vilket resulterade i identifieringen av ett antal fack som innehöll antikropp, som var specifik med avseende på Fisher-immunotyp 2. För att ytterligare analysera den serolo- giska specificiteten hos anti-Fisher-immunotyp-2-antikroppar- na, testades de överliggande vätskorna vid ett liknande ELISA- -test på antigenplattor, som var anordnade att innehålla var och en av de sjutton IATS-serotyperna av 2. aeruginosa i se- parata fack. Resultaten av denna analys visade att den stora á. l CO CN ,....> 32 majoriteten av de överliggande vätskorna var specifik med avseende på IATS-serotypen 11, ehuru en överliggande vätska, i fack 6D6, uppvisade ett korsreaktivt specificitetsmönster på IATS-serotyperna 4, 11, 13 och 14.

I syfte att bestämma huruvida anti-reaktionsmönstret för IATS- -serotyperna 4, 11, 13 och 14 var att hänföra till en eller flera antikroppar i fack 6D6, adsorberades ytterligare ali- kvoter av överliggande vätska från fack 6D6 oberoende med IATS-serotyperna 4, 7 (negativ kontroll), 11, 13 och 14 och de överliggande vätskorna testades därefter med avseende på PLL-fixerade bakterier av var och en av de fem IATS-seroty- perna enligt den ELISA-analysmetod som har skisserats ovan.

Adsorptionerna utfördes genom återsuspendering av en packad bakteriecelltablett med en lika stor volym överliggande vät- _ ..._..-..._. _... _. - ,.. ska under 0,5 timmar i is, följt av separation av den över- liggande vätskan från bakterierna genom centrifugering. Re- sultaten av denna analys visade att IATS-serotyperna 4 och 11 g adsorberade ut antikroppaktivitet mot varandra men ej mot É IATS-serotyperna 7, 13 eller 14. Detta visade närvaron av minst två olika anti-2.aeruginosa-antikroppar i fack 6D6, var- av minst en korsreagerade med IATS-serotyperna 4 och 11.

Isolering och kloning av de lämpliga antikroppsproducerande cellerna från fack 6D6 åstadkommes i tre steg. Det första steget innefattade lågdensitetssubodling av cellerna vid celler/fack och följdes av en ytterligare omgång av låg- densitetssubodling (5 celler/fack) av celler erhållna från ett anti-IATS-serotyp 4 + 11 - positivt fack, som hade alst- rats i den första omgången av lågdensitetssubodling med celler/fack. Varje subodlingsomgång utfördes i rundbott- nade plattor med 96 fack vid den angivna densiteten i total volym 100 pl HAT-medium, som saknade aminopterin-komponenten (HT-medium). Icke-transformerande, HAT-känsliga lymfoblas- i toida celler införlivades med samtliga fack i en densitet av 500 celler/fack som foderceller. Fyra dagar efter utstryk- ning sattes 100 Fl HAT-medium till samtliga fack för att se- lektivt döda fodercellerna. Facken matades ånyo på dag 9 ef- -IÄ C\ CS: C13 CA! _.. .s 33 ter utstrykning genom ersättning av hälften av den överliggan- de vätskan med HAT-medium. Därefter matades facken på samma sätt var fjärde-femte dag med HT-medium till dess facken ha- de tillräcklig densitet av lymfoblastoida celler för ana- lys av den överliggande vätskan medelst ELISA såsom beskri- vits tidigare.

Vid varje analys var de överliggande vätskor som var reaktiva med avseende på IATS-serotypen 4 även reaktiva med avseende på IATS-serotypen 11 och Fisher-immunotypen 2. Vidare hade an- tikroppsaktiviteten mot IATS-serotyperna 13 och 14 gått förlo- rad, vilket således bekräftade de tidigare tillskrivna speci- ficiteterna.

Formell kloning av specifika antikroppsproducerande celler utfördes genom att man först utströk cellerna i mycket låg densitet (beräknat 1/fack) pâ Terasaki-plattor (Nunc##1-36538) med 72 fack i en volym av 10 Pl/fack. Plattorna placerades i en inkubator under 3 timmar för att medge cellerna att avsät- ta sig på bottnen av plattan och indelades mikroskopiskt ef- ter tvà olika individer för fack innehållande en enda cell.

Var och en av dessa celler infördes därefter oberoende i fack- en till en rundbottnad platta försedd med 96 fack och med fo- derceller och odlades såsom skisserades tidigare för lâgden- sitetssubkultur. överliggande vätskor från samtliga erhåll- na kloner var vid analys medelst ovan angivna ELISA-protokoll positiva med avseende på anti-IATS-serotyperna 4 och 11.

På detta sätt erhölls en klonad transformerad humancellinje, som växer kontinuerligt (är odödlig) och avsöndrar monoklonal humanantikropp, som är reaktiv med avseende på Fisher-immuno- typ 2 och korsreaktiv med avseende på IATS-serotyper 4 och 11.

I detta exempel har cellinjen och den antikropp den produce- rar samma beteckning (d.v.s. 6D6).

Isotypen av antikroppen i fack 6D6 bestämdes vid ett ELISA- -test liknande de specificitetstests som har beskrivits ovan, -l-X 0\ Co 31 CD 34 med undantag av att HRP-get-anti-human IgG och HRP-get-anti- -human IgM användes oberoende som reagens i det andra steget istället för att kombineras. Positiv reaktion av antikroppen i fack 6D6 med Fisher-immunotyp 2 och IATS-serotyp 4 och 11 konstaterades endast med anti-IgM-reagenset, vilket visade en IgM-isotyp för denna antikropp.

Biokemisk karakterisering av de molekylfragment som igenkän- nes av 6D6-antikroppen utfördes medelst immunoblottinganalys såsom beskrivits i exempel 3 ovan, med undantag av att LPS- -preparationer från Fisher-immunotyp 2 och IATS-serotyp 4 och 11 valdes som antigenpreparation för analys. En LPS-pre- paration från Fisher-immunotyp 1 införlivades som negativ kontroll.

Före analys späddes var och en av de råa LPS-preparationer- na i förhållandet 1:1 med dissociationsbuffert ¿D,125 TRIS, 4 % (vikt/volym) natriumdodecylsulfat (SDS), 20 volym% glyce- rol, 10 volym% ß-merkaptoetanol, 0,4 % (vikt/volym) bromfen- olblått, pH 6,8] och underkastades ultraljuabehanaiing i ett bad under 5 minuter. I syfte att nedbryta proteinerna i pro- ven sattes proteinas K (1 mg/ml i vatten) till varje prov i ett 40-viktprocentigt förhållande av enzym till LPS och inku- berades vid 60°C under 2 timmar med ett 5-minuters ultraljud- behandlingssteg efter 1 timme. Proverna upphettades därefter till 100°C under 5 minuter och centrifugerades i en mikro- fug under 2 minuter.

Klarade prover representerande 10 pg LPS från var och en av bakteriestammarna underkastades SDS-polyakrylamidgelelektro- fores (SDS-PAGE) såsom beskrivits ovan. Efter överföring av de separerade molekylfragmenten till ett NCM inkuberades det- ta under 2 timmar vid rumstemperatur i 10 ml förbrukad över- liggande odlingsvätska från 6D6-cellinjen. Återstoden av för- farandet utfördes såsom beskrivits ovan.

Positiva resultat konstaterades endast i spår som innehöll 468 8.11 Fisher-immunotyp 2, IATS-serotyp 4 eller IATS-serotyp 11 LPS.

I spåren med Fisher-immunotyp 2 och IATS-serotyp 11 igenkän- de antikropp 6D6 en kort serie av regelbundet anordnade (d. v.s. stegliknande) lågmolekylära molekyler, som exakt motsva- rade mindre former av LPS-molekyler såsom de visualiserades i en på liknande sätt utförd SDS-PAGE-analys, där antigenerna ej överfördes till ett NCM utan istället specifikt färgades med avseende på närvaron av LPS, med undantag av att det läg- sta bandet på den silverfärgade gelen (representerande kärn- regionen plus lipid A i LPS) ej igenkändes. I motsats härtill igenkände antikropp 6D6 i det spår som innehöll IATS-serotyp 4 LPS en fullständig serie av regelbundet anordnade band, som näranog omspände gelens hela längd, varvid den mest intensi- va reaktionen inträdde bland de högmolekylära banden. Anyo motsvarade denna profil det stegliknande bandmönster som ob- serverades i den LPS-specifika färgade gelen (d.v.s. de visa- de motsvarighet band för band), med undantag av att det band som representerade kärna plus lipid A ej igenkändes. Dessa data visar klart att O-sidokedjan i LPS var det molekylära målobjekt som igenkändes av antikropp 6D6 på Fisher-immunotyp 2 och IATS-sertotyperna 4 och 11.

För att utvärdera skyddsförmâgan in yizo hos antikropp 6D6 utfördes djurskyddsstudier på möss. 6D6-äntikroppen koncentre- rades först från en förbrukad överliggande odlingsvätska ge- nom fällning med mättat ammoniumsulfat (50 % slutkoncentra- tion). Utfällt material rekonstituerades i en minsta möjliga mängd sterilt vatten, dialyserades intensivt mot PBS och ste- rilfiltrerades. Som negativ kontroll behandlades på samma sätt en förbrukad överliggande odlingsvätska från en annan trans- formerad humancellinje (C5B7-ATCC nummer CRL 8753), som pro- ducerade en monoklonal humanantikropp, som var specifik med avseende på LPS i Fisher-immunotyp 1. Likaledes koncentrerades som positiv kontroll förbrukad överliggande odlingsvätska från transformerad humancellinje 6F11 (ATCC nummer CRL 8562), som producerade en monoklonal humanantikropp, som var speci- fik med avseende på LPS i Fisher-immunotyp 2 och IATS-serotyp 11I 46 Q U 831 36 Swiss-Webster-möss av honkön med en kroppsvikt av mellan 20 och 22 g indelades i tre grupper om 20 möss vardera. Samtli- ga möss i varje grupp ympades individuellt på intraperitone- al väg med 0,5 ml koncentrerad 6D6-, C5B7- eller 6F11-anti- kropp. Sex timmar senare indelades var och en av de tre grup- perna i ytterligare fyra grupper om fem möss vardera och med- lemmar av varje grupp om fem möss infekterades oberoende in- traperitonealt med 0,3 ml av en levande bakteriesuspension in- nehållande 8 LD50 IATS-serotyp 4 respektive IATS-serotyp 11. Bakteriesuspensio- av Fisher-immunotyp 1, Fisher-immunotyp 2, nerna framställdes såsom beskrivits ovan i exempel 4. Efter bakterieinfektionen observerades djuren under en tidsrymd av dagar. Resultaten var följande: Tabell V Pâvisande in vivo av skyddseffekten av monoklonal humananti- kropp 6D6 mot Fisher-immunotyp 2 och IATS-serotyp 4 och 11 Monoklonal Antal överlevande/antal testade 5 dagar efter human infektion med: antikropp Fisher 1 Fisher 2 IATS 4 IATS 11 6D6 0/5 5/5 4/5 5/5 6F11 0/5 5/5 0/5 5/5 CSB7 5/5 1/5 0/5 0/5 Såsom visas i tabell V tillhandahöll antikropp 6D6 specifikt och signifikant skydd mot en letal infektion av Fisher-immu- notyp 2, IATS-serotyp 4 och IATS-serotyp 11 men ej Fisher-im- munotyp 1.

Exempel 6 Exempel 6 åskådliggör en metod för framställning av en monoklo- nal humanantikropp, som reagerar med IATS-serotyperna 6 och 13 och Fisher-immunotyp 1 av 2. aeruginosa. Det i exemplen 1 - 5 beskrivna förfarandet upprepades med undantag av att det var ...w- -«»....... . ..~._-.-u_-_w_-uu- _.. ...H4 . ......~.---_..-».-- . 37 llö j GW C2- C. _.. A nödvändigt att göra vissa modifikationer för att isolera, ka- rakterisera och analysera den i detta exempel beskrivna anti- kroppen. Nedan följer ett angivande av ändringarna vid för- farandena och de resultat som erhölls med den i detta exempel beskrivna monoklonala antikroppen.

Källan till humana B-celler var en individuell, i förväg med en högmolekylär polysackarid immuniserad preparation isolerad från Fisher-immunotyp 2 (Pier et al., šnfeg. lmmun., 3í:461 (1981)). Efter tillvaratagande av E-PBMC, såsom beskrivits ovan, frystes cellerna i FCS innehållande 10 volym% DMSO i en behållare med flytande kväve. Dessa celler tinades däref- ter snabbt vid 37°C, tvättades en gång i Iscoves medium och âtersuspenderades i HAT-medium. Cellstyrd transformation ut- fördes 1 ett förhållande av 15 1A2-celler per E'PBMc. ce11- blandningen utströks på 20 mikrotiterplattor i en koncentra- tion av 78500 celler/fack. Kulturerna matades var 3 - 5 dag efter utstrykning och på dag 11 konstaterades att 100 % av facken innehöll prolifererande celler.

För screening av de överliggande vätskorna i syfte att påvisa närvaron av anti-2. aeruginosa-antikroppar under användning av ELISA-tekniken utgjordes antigenplattan av en blandning av 2. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 - 7 [kliniskt isolat PSA I277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank ("GSCOB")), ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC 27317 respektive ATCC 2731S]. En PLL-behandlad mikrotiterplat- ta utan några bakterier användes även vid screeningen.

Analys av de överliggande odlingsvätskorna medelst ovan angiv- na metod ledde till identifieringen av ca. 200 fack, som inne- höll anti-Q. aeruginosa-antikroppar, som var reaktiva med plattan med Fisher-immunotyperna 1 - 7 men ej med den PLL-be- handlade platta som saknade bakterier. I syfte att identifie- ra de fack som innehöll antikropp, som var reaktiv med avseen- de på två eller flera IATS-serotyper, konstruerades antigen- plattor såsom beskrivits ovan, där en kolumn av plattorna in- -ïä OC* CT! (JJ ...å 38 nehöll PLL-fixerade bakterier av endast en IATS-serotyp.

Ett ELISA-test utfördes, såsom beskrivits ovan, med överlig- gande vätska från en expanderad kultur från vart och ett av de anti-2. aeruginosa-positiva facken. överliggande vätskor placerades i en rad pâ de nya antigenplattorna och resulte- rade i identifieringen av ett antal fack, som innehöll anti- kropp, som var reaktiv med avseende på multipla IATS-seroty- per. Ett fack, med beteckningen 8H7, innehöll antikroppar, som var specifika med avseende på IATS-serotyperna 6 och 13.

När den överliggande vätskan från detta fack testades medelst ELISA på de sju Fisher-immunotyperna, såsom i exempel 5, visa- de det sig att antikropparna från 8H7 var specifika med av- seende på Fisher-immunotyp 1.

I syfte att fastställa om anti-IATS-serotyp 6 och 13-reak- tionsmönstren var att hänföra till en eller flera antikrop- par i fack 8H7, adsorberades ytterligare alikvoter av över- liggande Vätska Obeflmïfiß HV IATS-serotyper 6, 13 och 17 (nega- tiv kontroll) och de adsorberade överliggande vätskorna tes- tades därefter på PLL-fixerade bakterier av var och en av de tre IATS-serotyperna enligt ovan beskrivna ELISA-analysmetod.

Resultaten visade att IATS-serotyperna 6 och 13 adsorberade ut antikroppsaktivitet mot varandra. IATS-serotypen 17 adsor- berade icke ut någon aktivitet mot varken IATS 6 eller 13.

Dessa data visade att anti-IATS-serotyp 6 och 13-reaktions- mönstret var att hänföra till en enda antikropp från fack 8H7.

Isolering och kloning av de antikroppsproducerande cellerna från facket 8H7 åstadkommes i tre steg, i huvudsak såsom be- skrivits i exempel 5 ovan. På detta sätt erhölls en klonad transformerad humancellinje, som växer kontinuerligt (d.v.s. är odödlig) och avsöndrar monoklonal humanantikropp, som är reaktiv med avseende på Fisher-immunotyp 1 och korsreaktiv med avseende på IATS-serotyperna 6 och 13. I detta exempel har cellinjen och den antikropp den producerar samma beteckning, 8H7. Under användning av ett förfarande liknande det som har beskrivits i exempel 5 bestämdes isotypen av antikroppen i WI Q\ OO OZ'- Q/ n ...._\ 39 4 fack 8H7 vara IgM.

Biokemisk karakterisering av de molekylfragment som igenkän- nes av 8H7-antikroppen utfördes medelst immunoblottinganalys såsom beskrivits i exemplen 3 och 5 ovan, med undantag av att LPS-preparationerna från Fisher-immunotyp 1 och IATS-seroty- perna 6 och 13 valdes som antigenpreparationer för analys. En LPS-preparation från IATS-serotyp 10 införlivades som negativ kontroll.

Analys av de erhållna immunofläckarna visade positiva resul- tat endast i de NCM-spår som innehöll Fisher-immunotyp 1, IATS-serotyp 6 eller IATS-serotyp 13 LPS. I spåren med Fisher- - -immunotyp 1 och IATS-serotyp 6 igenkände antikroppen BH7 en serie regelbundet anordnade (stegliknande) band, som omspände näranog gelens hela längd. Dessa band motsvarade exakt de multipla molekylviktsformerna av LPS-molekyler, såsom de vi- sualiserades i en på liknande sätt utförd SDS-PAGE-analys, där antigenerna ej överfördes till ett NCM utan i stället spe- cifikt färgades för att påvisa närvaron av LPS. I det spår som innehöll IATS-serotyp 13 LPS igenkända antikroppen 8H7 en mera förkortad serie av regelbundet åtskilda band begrän- sade till gelens medel-övre molekylviktsintervall. Ånyo mot- svarade de band som igenkändes till positionen de som observe- rades i en LPS-specifik färgad gel, med undantag av att de högsta och lägsta molekylviktsformerna av LPS i den färgade ge- len ej syntes väl igenkännas i Western-blottingen. Dessa data visar klart att LPS var det molekylära målobjekt som igenkän- des av antikropp 8H7 på Fisher-immunotyp 1 och IATS-serotyper- na 6 och 13.

För att utvärdera skyddsförmågan in yiyg hos antikropp 8H7 utfördes djurskyddsstudier på möss, såsom beskrivits i exemp- len 4 och 5 ovan. Som negativ kontroll behandlades på samma sätt en förbrukad överliggande odlingsvätska från en annan transformerad humancellinje (6F11 - ATCC nummer CRL 8652), som producerade en monoklonal humanantikroppf Som var specifik med 468 851 40 avseende på LPS från Fisher-immunotyp 2. Som positiv kontroll användes en förbrukad överliggande odlingsvätska från trans- formerad humancellinje C5B7 (ATCC nummer CRL 8753), som pro- ducerade en monoklonal humanantikropp, som var specifik med avseende på LPS från Fisher-immunotyp 1 och IATS-serotyp 6.

Swiss-Webster-möss av honkön med en kroppsvikt av mellan 20 och 22 g indelades i tre grupper om 30 möss vardera. Samtli- ga möss i varje grupp ympades individuellt på intraperitone- al väg (ip) med 0,5 ml koncentrerad 8H7, 6F11- eller C5B7-an- tikropp. Fyra timmar senare indelades var och en av de tre grupperna ånyo i tre nya grupper om 10 möss vardera och med- lemmar tillhörande var och en av grupperna om 10 möss infek- terades oberoende intraperitonealt med 0,3 ml av en levande bakteriesuspension innehållande 9,4 LDSO av ett kliniskt iso- lat (A522) som var representativt för IATS-serotypen 6 (ekvi- valent med Fisher-immunotyp 1), 5LD50 av IATS-referenssero- typen 13 eller 10LD50 av IATS-referensserotypen 11 (ekvivalent med Fisher-immunotyp 2). Bakteriesuspensioner framställdes så- som beskrivits ovan i exempel 4. Efter bakterieinfektion ob- serverades djuren under en tidsrymd av fem dagar. Resultaten var följande: Tabell VI Påvisande in vivo av skyddseffekten av monoklonal humananti- kropp 8H7 mot IATS-serotyperna 6 och 13 Monoklonal Antal överlevande/antal testade, 5 dagar human- efter infektion med: antikropp IATs 6 IATs 13 IATs 11 8H7 9/10 6/10 1/10 C5B7 9/10 0/10 O/10 6F11 0/10 2/10 10/10 8H7 specifikt och signifikant skydd mot en letal infektion av IATS-serotyp Såsom visas i tabell VI tillhandahöll antikropp 1.4) CI ....-.-....._...»..--~ 1-.1 OD (PJ ...à M 463 6 men ej IATS-serotyp 11. Skyddet mot IATS-serotyp 13 var i mindre utsträckning men kan förklaras av det relativt höga antal organismer som krävdes för uppnående av LD50 för dessa isolat jämfört med serotyp 6-siolatet (3 x 107 kolonibildan- de enheter respektive 2,6 X 106 kolonibildande enheter). Vid ett separat försök skyddade antikropp 8H7 fem av fem möss in- fekterade med 3,5LD50 av IATS 13-isolatet och fem av fem möss infekterade med IATS-isolatet.

Av det föregående framgår att cellinjerna enligt föreliggande uppfinning tillhandahåller monoklonala humanantikroppar och fragment därav, som är korsreaktiva för och korsprotektiva mot olika 2. aeruginosa-IATS-serotyper. Detta medger att profylak- tiska och terapeutiska beredningar lättare kan framställas, vilka kan vara effektiva mot infektioner härrörande från de flesta, om ej alla 2. aeruginosa-stammar. Vidare tillhanda- håller cellinjerna antikroppar, som finner användning vid im- munoanalys och andra välkända förfaranden.

Claims (33)

'F Ci*- CO 10 15 20 25 30 4% P A T E N T K R A V

1. Beredning innefattande en monoklonal humanantikropp eller bindningsfragment därav med förmåga att specifikt binda till tillgängliga lipopolysackariddeterminanter på en mångfald av, men ej alla IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, och skyddande in vivo mot minst .två IATS-serotyper.

2. Beredning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen skyddar in vivo mot tre IATS- serotyper.

3. Beredning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen är icke-reaktiv med avseende på alla Fisher-immunotyper av Pseüdomonas aeruginosa.

4. Beredning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen reagerar med en Fisher-immunotyp av Pseudomonas aeruginosa.

5. Beredning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan reagera med två eller flera Fisher-immunotyper av Pseudomonas aeruginosa.

6. Beredning enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan reagera med tre IATS- serotyper.

7. Beredning enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen skyddar in vivo mot minst två IATS-serotyper och en Fisher-immunotyp. nu u fn 10 15 20 25 30 43 468 82%!

8. Beredning enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen skyddar in vivo mot minst två IATS-serotyper och minst två Fisher-immunotyper.

9. Beredning innefattande minst två monoklonala humanantikropper, k ä n n e t e c k n a d därav, att minst en av antikropparna kan specifikt reagera med -tillgängliga lipopolysackariddeterminanter närvarande på icke alla men minst två IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa och skyddande in vivo mot minst två IATS- serotyper.

10. Beredning enligt krav 9, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan binda till tre IATS- serotyper.

11. Beredning enligt krav 9, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen är ickefreaktiv med avseende på alla Fisher-immunotyper.

12. Beredning enligt krav 9, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan reagera med en Fisher- immunotyp av Pseudomonas aeruginosa.

13. Beredning enligt krav 9, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan reagera med två eller flera Fisher-immunotyper.

14. Beredning enligt krav 11, 12 eller 13, k ä n n e- t e c k n a d därav, att antikroppen skyddar in vivo mot reaktiva IATS-serotyper och Fisher-immunotyper. -ïh CIÄ CI) 10 15 20 25 30 CI! CN

15. Beredning innefattande en antikropp eller bindfragment därav, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen eller fragmentet därav kan specifikt reagera med en mångfald av men ej alla IATS-serotyper och färre ' E eller mer än en Fisher-immunotyp av Pseudomgnas aeruginosa och skyddande in vivo mot minst två IATS-serotyper.

16. Beredning enligt krav 15, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen eller fragmentet därav kan reagera med minst tre IATS-serotyper av Pseudomonas aerugigosa.

17. Beredning enligt krav 15, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen eller fragmentet därav kan reagera med två Fisher-immunotyper av Pseudomonas aerugigosa.

18. Beredning enligt krav 15, knä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan skydda in vivo mot minst två IATS-serotyper och minst två Fisher-immunotyper.

19. Beredning enligt krav 15, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen reagerar med IATS-serotyperna 2, 5 och 16 och Fisher-immunotyperna 3 och 7.

20. Beredning innefattande en antikropp eller ett bindningsfragment därav, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen eller fragmentet kan specifikt binda till tillgängliga 1ipopolysackariddeterminanter som föreligger på en mångfald av men ej alla IATS-serotyper och en Fisher-immunotyp av Pseudomonas ae u i osa, och som skyddar in vivo mot två eller flera av nämnda IATS- serotyper, och en fysiologiskt acceptabel bärare. .M \Y 10 15 20 25 30 HS få 2J\ ”O CCI (W

21. Beredning enligt krav 20, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen eller fragmentet därav kan binda till två IATS-serotyper.

22. Beredning enligt krav 20, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen kan skydda in vivo mot minst två IATS-serotyper och en Fisher-immunotyp.

23. Beredning enligt krav 20, k ä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen reagerar med IATS-serotyperna 4 och 11 och Fisher-immunotypen 2.

24. Beredning enligt krav 20, klä n n e t e c k n a d därav, att antikroppen reagerar med IATS-serotyperna 6 och 13 och Fisher-immunotypen 1.

25. Farmaceutisk beredning innefattande en beredning enligt något av kraven 1, 9, 15 eller 20 och en fysiologiskt godtagbar bärare.

26. Odödlig transformerad cellinje, som avsöndrar en monoklonal humanantikropp, som specifikt reagerar med färre än alla men minst två IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa och skyddande in vivo mot minst två IATS- serotyper. Cellinje enligt krav 26 med beteckningen ATCC nummer 9171 eller 9258.

27. cRL s941,

28. Monoklonal humanantikropp, som är reaktiv med avseende på en epitop, vilken reagerar med en monoklonal antikropp producerad av en cellinje enligt krav 27. .. -JL 4 fi 10 15 20 25 30 46 Ü Tf 'E U\.)|

29. Testsats för användning vid påvisande av närvaron av Pseudomonas aeruginosa, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar en monoklonal antikroppberedning innehållande minst en monoklonal humanantikropp, som binds till tillgängliga 1ipopolysackariddeterminanter på färre än alla, men minst två, IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, och skyddande in vivo mot minst två IATS- serotyper, och markörer som tillhandahåller en detekterbar signal, vilka är kovalent bundna till antikropparna eller bundna till sekundära antikroppar, som är reaktiva med avseende på var och en av de monoklonala antikropparna. vi

30. Farmaceutisk beredning användbar för behandling eller profylax av en infektion av Pseudomonas aeru inosa, k ä n n e t e o k n a d därav, att den innefattar en monoklonal humanantikropp, som skyddar mot minst två IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa genom att specifikt reagera med tillgängliga lipopolysackariddeterminanter av färre än alla, men åtminstone två IATS-serotyper av Pseudomonas aeruginosa, i kombination med ett antimikrobiellt medel, en gammaglobulinfraktion från immunoglobulin av humanblodplasma och/eller en fysiologiskt godtagbar bärare.

31. Farmaceutisk beredning enligt krav 30, k ä n n e- t e c k n a d därav, att gammaglobulinfraktionen från humanblodplasmaimmunoglobulinet har erhållits från människor, som uppvisar förhöjda nivåer av immuno- globuliner, vilka är reaktiva med Pseudomonas aeruginosa- bakterier och/eller antigeniska komponenter därav.

32. Beredning enligt krav 30, k ä n n e t e c k n a d därav, att den dessutom innefattar en monoklonal U 10 4? 468 Sïfâ antikropp, som är reaktiv med Pseudomonas aeruginosa- flagella eller exotoxin A.

33. Sätt att påvisa närvaron av Pseudomonas aeruginosa i ett prov, k ä n n e t e c k n a t därav, att man kombinerar provet med en monoklonal antikropp, som är reaktiv med avseende på minst två IATS-serotyper av .Pseudomonas aeruginosa genom att specifikt reagera med tillgängliga 1ipopolysackariddeterminanter av färre än alla, men åtminstone två IATS-serotyper och som skyddar in vivo mot minst två IATS-serotyper, och att man detekterar komplexbildning.