LU86711A1 - Anticorps monoclonaux a reaction croisee et protection croisee vis-a-vis des serotypes de p.aeruginosa - Google Patents

Description

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I rp____v Q A 7 I I GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

Brevet N° Ö ^ ' * - Monsieur le Ministre du 1.0. décembre 1986 de l’Économie et des Classes Moyennes _ , „ =^.ryf Service de la Propriété Intellectuelle

Titre délivré----------- | gp LUXEMBOURG .

Demande de Brevet d’invention ----------------------------------------------------------------------------------(1) I. Requête

La......société......dite : GSNETIC......SYSTEMS.......CORPORATION, 3 0 05......First__( 2)

Avenue, SEATTLE, WA .9812.1.,........Etats-Unis.......d'Amérique, représentée........

par.....Monsieur......Jacques -de- Muyser^.-agissant-en -qualité -de------------------------- mandataire_______________________________________________________________________________________________________________________________________*______________________ ( 3) déposent) ce dix décembre 1900 quatre-vingt six_________( 4) à 15_____________ heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: ”Anticorps..monoclonaux_à-..xëaction-c.ro.isée _et-p>rotection- ( 5) croisée.......visrlrvis.......des.-.sér.otypes-.....de......P.Aeruginasa^"..------- 2. la description en langue.........française.................................de l'invention en trois exemplaires; 3........//.................................... ................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 10 . déoglibre 1986...............; 5. la délégation de pouvoir, datée de______________________________________________________________________ le----------------------------—............; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeurs) est (sont): ( 6) 1. .......Anthonv.....W........SIADAK. 6210.....Ist Avenue. N.W. . SEATTLEf___________________________

Washington......98107 (Etats-Unis d'Amérique)____.

2. Mae.....I........ROSQK.,.....11337-a—1-7-fchN^E.·,—SEATTLE,—Washington-98125·,— ...................(Etats-Unis......d'Amérique)------------—-------- revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de brevet et ( CIP (Continuatlctn-in-part)appl.— déposée(s)*n (8) aux -Etats-Cnis-d -Amërique le (9)10 décembre 1985 et 2 4 .. novembre .19 86-------------- sous le N° (10) 807.394 et.....931.179 _______________________________________________ au nom de (il) s......inventeur s_____________________________________________________________________ élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg...............

______________35 boulevard Royal____________(12) sollicitent) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à---18---mois. (13) ,/I& déposant / mandataire: f,______.v-v------------------(14)

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\ \J\jv Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuelle à Luxembourg, en date du: 10 décembre 1986 A* . _ *>-\ Pr. leMimstre de l’Économie et des Qasses Moyennes, ic *\ a. ±3______heures / é’ £·\ P-ri.

I K I Le chef du service de la propriété intellectuelle, A 68007__ \^/__ EXPLICATIONS RELATIVES AU FOR$R±5äg£ (1) s’il y a lieu "Demande de œrtiScat daddiüb*4m5reTCrpn^<€. à la demande de brevet principal No............du............”-(2) inscrire les nom. prenoir proiessjon.

adresse du demandeur. lorsque celui-ci est uo psiucdiïSSVB tèfaênammsuott sociale, fonce juridique. adresse du siège social, lorsque le demandeur esi une personne morale - · 3 * inscrire lf*c πητη nrennrn. nômvse rin mandataire aerée. conseil en DiODiiété industrielle, muni d'urnouvoir sDedal. s*3 v a lieu: "représenté nar..----...... agissant en qualité de m^n&staire" " ; »

REVENDICATION DE LA PRIORITE

de la demande de brevet / âKÂK&lÈl&XKKÔÎRéC EK Aux Etats-Unis d'Amérique Du 10 décembre 1985 (No. 807.394) et du 24 novembre 1986 (No. 931.179) -CIP (Continuation-in-' part) applicatior ; i Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg

au nom de : GENETIC SYSTEMS CORPORATION

SEATTLE, WA 98121 (Etats-Unis d'Amérique) pour : "Anticorps monoclonaux à réaction croisée et protection croisée vis-à-vis des sérotypes de P.Aeruginosa." T \ /

ANTICORPS MONOCLONAUX A REACTION CROISEE ET PROTECTION CROISEE VIS-A-VIS

DES SEROTYPES DE P. AERUGINOSA

CADRE DE L'INVENTION

5 La présente invention concerne l'applica tion de techniques immunologiques fournissant de nouvelles substances utiles pour le diagnostic et le traitement des infections bactériennes et, plus particulièrement, l'invention concerne la production et 10 l'application d'anticorps monoclonaux humains qui sont capables de reconnaître les multiples sérotypes du Pseudomonas aeruginosa.

FONDEMENT DE L'INVENTION

Une maladie de type gram-négatif et ses 15 complications les plus sérieuses, p.ex. bactérémie et endotoxémie, sont la cause d'une morbidité et d'une mortalité significatives chez des patients humains.

Cela est particulièrement vrai pour l'organisme gram-négatif Pseudomonas aeruginosa qui, depuis les 20 dernières cinquante.: années, a été de manière croissante associé aux infections bactériennes, spécialement les infections nosocomiales.

Durant les dernières décennies, les antibiotiques ont été la thérapie de choix pour le contrôle 25 des maladies à caractère gram-négatif. Cependant, la morbidité et la mortalité continuellement élevées, associées aux maladies bactériennes de caractère gram-négatif.· sont l'indice des limitations de la thérapie par les antibiotiques, particulièrement en ce qui 30 concerne le P^ aeruginosa. (Voir, par exemple,

Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia : Can ' / î 2

Antibiotic Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med, (1978) 94:196-199). Ceci a suscité la recherche de méthodes alternatives pour la prévention et le traitement.

5 Une méthode qui a été prise en considéra tion est l'augmentation du système immunitaire de l'hôte par une immunisation active ou passive. Par exemple, il a été observé qu'une immunisation active d'humains ou d'animaux pour expériences avec des 10 vaccins de cellules bactériennes entières ou des endotoxines bactériennes purifiées provenant du P. aeruginosa, conduit au développement d'anticorps opsoniques spécifiques dirigés essentiellement contre des déterminants sur les unités oligosaccharides de 15 répétition des molécules de lipopolysaccharide (LPS) localisées sur la membrane cellulaire externe du P. aeruginosa (voir Pollack, M., Immunoglobulins : — Characteristics and Uses of Intravenous Préparations, Alving, B.M. and Finlayson, J.S., eds, p. 73-79, U.S. 20 Department of Health and Human Services, 1979). Ces anticorps, qu'ils soient engendrés de manière active ou transférés de manière passive, se sont révélés être une protection contre les effets létaux de l'infection par aeruginosa, chez divers types d'animaux 25 (Pollack, supra) et dans quelques investigations préliminaires sur des humains (voir Young, L.S. et. Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., ed., p. 119-132, Hans Huber, 1980). En outre, l'importance particulière du rôle de ces anticorps pour les humains 30 a été mise en évidence par la découverte, chez des patients souffrant de bactérémie par P_;_ aeruginosa, d'une association entre la survie et les titres de sérum aigu élevés d'anticorps vis-à-vis des molécules LPS de la souche infectante (voir Ppllack, M. et 35 Young, L.S., J. Clin. Invest., 63:276-286, (1979)).

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Les rapports ci-dessus suggèrent que des approches immunothérapeutiques peuvent être utilisées pour prévenir et traiter une maladie bactérienne due au P. aeruginosa, comme par exemple en administrant des 5 immunoglobulines humaines rassemblées et qui contiennent des anticorps contre la (les) souche(s) infec-tante(s). Les immunoglobulines humaines sont définies ici comme étant une portion de plasma humain fractionné qui est enrichi d'anticorps, parmi lesquels sont 10 représentés des anticorps spécifiques vis-à-vis des souches de aeruginosa. Du fait de certaines limitations inhérentes à l'utilisation de composants d'immunoglobuline humaine, cette approche du traitement de maladie engendrée par le Pj_ aeruginosa reste sous 15 investigations (voir, par exemple, Collins, M.S. et Roby, R.E., Am., J. Med., 76(3A): 168-174, (1984)) .et jusqu'à présent il n'y a encore aucun produit commercial disponible utilisant ces composants.

Une de ces limitations associée aux compo-20 sitions d'immunoglobuline est qu'elles consistent en rassemblement· d'échantillons provenant d'un millier de donneurs ou même plus, ces échantillons ayant été présélectionnés en fonction de la présence des anticorps anti-Pseudomonas spécifiques. Ce rassemblement 25 conduit à une valeur moyenne des titres des anticorps individuels, ce qui, au mieux, a pour résultat une faible augmentation du titre résultant des anticorps désirés.

Une autre limitation est que la méthode de 30 présélection exige un examen continu et onéreux du groupe de donneurs afin d'assurer la conformité du produit. Malgré tous ces efforts, les produits d'immunoglobuline peuvent varier encore considérablement de lot à lot et entre les produits provenant de· 35 régions géographiques différentes.

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De plus, une autre limitation inhérente aux compositions d’immunoglobuline est que leur utilisation implique l'administration simultanée de grandes quantités de substances protéinacées étrangères (qui 5 peuvent comprendre des virus tels que ceux récemment associés au Syndrome d'Immuno Déficience Acquise, ou SIDA), qui sont susceptibles de provoquer des effets biologiques néfastes. La combinaison de titres faibles des anticorps désirés et d'une teneur élevée des 10 substances supplémentaires peut souvent limiter, à des niveaux sous-optimaux, la quantité d'immunoglobuline(s) spécifique(s) et donc bénéfique(s) pouvant être administrée au patient.

En 1975, Köhler et Milstein ont rapporté 15 leur découverte selon laquelle certaines lignées de cellules de souris pouvaient être fusées avec des cellules de rates de souris pour créer des hybridomas dont chacun secrétait des anticorps ayant une spécificité unique, c.a.d. des anticorps monoclonaux (Köhler, 20 G., et Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)).

Avec l'avènement de cette technologie, il devenait possible, dans quelques cas, de produire de grandes quantités d'anticorps de murine particulièrement spécifiques vis-à-vis d'un déterminant particulier ou 25 de déterminants sur des antigènes. Ces anticorps monoclonaux de souris ou des compositions de ces anticorps peuvent, cependant, présenter des désavantages importants quand ils sont utilisés pour des humains : particulièrement lorsque des anticorps monoclonaux de 30 souris sont utilisés lors d'études de sondage pour le traitement de certaines maladies humaines, on a souvent observé qu'ils provoquent une réponse immunitaire qui les rend inefficaces (Levy, R.L. .et. Miller, R.A., Ann. Rev. Med., 34:107-116, (1983)).

35 En utilisant la technique avec hybridoma, T < 5

Sadoff et al. ont rapporté la production d'un anticorps monoclonal de souris, de la classe IgM dirigé contre un déterminant de la chaîne O-latérale sur les molécules LPS d'un sérotype spécifique de P^ aeruginosa 5 (Abstracts of the 1982 Interscience Conference on

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, no. 253). Ils rapportent en outre que cet anticorps de murine protégeait les souris contre une attaque létale du P. aeruginosa du même sérotype que le type contre lequel 10 les anticorps étaient dirigés (c.a.d. le sérotype homologue). Plusieurs articles ultérieurs ont détaillé le développement d'anticorps monoclonaux de LPS anti-P. aeruginosa de différentes spécificités chez l'homme et la souris; par exemple, Sawada, S., et al., J. Inf.

15 Dis., 150:570-576, (1984); Sadoff, J., et al.,

Antibiot. Chemother., 36:134-146, (1985); Hancock, R., et al., Infect. Immun. 37:166-171 (1982); Siadak, A.W. et Lostrom, M.E., dans Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, E.G., et al., eds., p. 167-185, 20 Plenum Publishing Corp. (1985) et Sawada, S. ert al., J. Inf. Dis., 152:965-970, (1985). La production et l'application immunothérapeutique d'anticorps monoclonaux humains sérotype-spécifiques du LPS anti-P. aeruginosa sont décrites dans les demandes de brevets 25 des E.U.A. en cours d'examen no. 734.624 et 828.005, qui sont mentionnées ici à titre de référence. Bien que certains avantages puissent exister quant à l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques pour un sérotype unique de P^ aeruginosa dans quelques situa-30 tions, comme dans le cas d'une infection pouvant être attribuée à un sérotype unique, dans beaucoup d'autres situations cette utilisation n'est pas indiquée. Par exemple, pour les traitements prophylactiques d'infections potentielles chez l'homme, il pourra être préfé- » 35 rable d'administrer un anticorps ou des anticorps r î 6 / humains assurant une protection contre plusieurs sérotypes. De la même manière, dans des applications thérapeutiques où le (les) sérotypes(s) de la (des) souche(s) infectante(s) est (sont) inconnu(s), il sera 5 préférable d'administrer un anticorps ou des anticorps humains actifs contre la plupart, sinon tous, des sérotypes de P^ aeruginosa cliniquement importants. Bien qu'une combinaison d'anticorps monoclonaux humains, chacun étant spécifique pour un sérotype unique de Ρ_^ 10 aeruginosa, puisse être théoriquement formulée pour protéger contre les divers sérotypes, une telle composition .sera difficile à développer et, du point de vue de la fabrication, sa production n'est pas économique.

Par conséquent, il existe une demande 15 significative d'anticorps monoclonaux humains anti-P. aeruginosa capables de reconnaître et d'assurer la protection contre les multiples sérotypes de P_^ aerugi nosa. En outre, ces anticorps devront être appropriés pour emploi dans les traitements prophylactiques et 20 thérapeutiques des infections par P^ aeruginosa. La présente invention répond à ces demandes.

RESUME DE L'INVENTION

On fournit des nouvelles lignées de cellules qui peuvent produire des anticorps monoclonaux 25 humains capables de réagir spécifiquement avec les molécules LPS de plusieurs (mais non tous) sérotypes IATS de P^ aeruginosa. Ces anticorps ont diverses réactivités vis-à-vis des immunotypes Fisher, se liant à zéro, un ou plusieurs immunotypes. De plus, on 30 fournit un procédé pour le traitement d'un humain susceptible d'être infecté ou déjà infecté par le P. aeruginosa, en administrant une quantité prophylactique ou thérapeutique d'une composition comprenant au moins un anticorps monoclonal humain ou son fragment liant, f ' t \ 7 capable de réaction croisée avec des sérotypes de P. aeruginosa/ la composition incluant aussi de préférence un porteur physiologiquement acceptable. La composition peut aussi contenir une ou plusieurs des substances 5 suivantes : anticorps monoclonaux humains supplémentaires/ capables de réagir avec le flagelle du P.aeruginosa, 1'Exotoxine A ou avec d'autres déterminants du sérotype ou de l'immuno-type sur le LPS du P.aeruginosa ; une fraction de gamma globuline provenant de plasma sanguin humain; une fraction de gamma globuline 10 provenant de plasma sanguin humain dans laquelle le plasma est obtenu à partir d'un sujet présentant des taux élevés d'immunoglobulines réagissant avec le aeruginosa ; et un ou plusieurs agents antimicrobiens.

15 DESCRIPTION DES APPLICATIONS SPECIFIQUES

Suivant la présente invention, on fournit des nouvelles cellules capables de produire des anticorps monoclonaux humains et des compositions compre-20 nant ces anticorps, ces compositions étant capables de reconnaître sélectivement au moins plusieurs, et dans quelques cas toutes les souches de P^_ aeruginosa, dans lesquelles les anticorps individuels reconnaissent de manière typique de multiples sérotypes IATS et 25 zéro, un ou plusieurs immunotypes Fisher de IV aeruginosa. Les cellules en question ont des chromosomes identifiables dans lesquels l'ADN germ-line qui en provient ou qui provient d'une cellule précurseur a été réarrangé pour encoder un anticorps ayant un site 30 liant pour un épitope commun parmi certains sérotypes de aeruginosa. Ces anticorps monoclonaux humains peuvent être utilisés d'une manière très large, incluant diagnostics et thérapies (p.ex. protection in vivo).

De manière caractéristique, les cellules 35 ï * 8 / de la présente invention seront des lymphocytes humains transformés qui fournissent des anticorps monoclonaux humains protecteurs vis-à-vis des molécules LPS accessibles de Ρ_^ aeruginosa. Par "accessible", 5 on entend que les molécules LPS sont physiquement disponibles dans l'environnement de l'utilisation pour interaction directe avec les anticorps monoclonaux.

Les anticorps monoclonaux ainsi fournis sont utiles dans le traitement ou la prophylaxie de maladies 10 graves dues au Ρ_^ aeruginosa. Les molécules LPS de la membrane externe du P_^ aeruginosa doivent être disponibles pour un contact direct avec les molécules d'anticorps, ce qui facilite ainsi la lyse aidée par complément et/ou la phagocytose de l'organisme. En outre, 15 les molécules LPS qui sont répandues hors de la membrane externe dans l'environnement proche devront aussi être libres pour interaction directe avec les molécules d'anticorps et être éliminées via le système réticuloendothélial.

20 La préparation des anticorps monoclonaux peut être accomplie en immortalisant l'expression des séquences de l'acide nucléique qui sont le code pour » des anticorps spécifiques pour un épitope sur les molécules LPS de multiples sérotypes de P_^ aeruginosa. 25 De manière caractéristique, les anticorps monoclonaux sont produits par transformation à entraînement de cellule avec virus Epstein-Barr (VEB) de cellules de lymphocyte B obtenues à partir de donneurs humains qui sont ou ont été exposés au(x) sérotype(s) appro-30 prié(s) de P^ aeruginosa. Les lignées de cellules secrétant l'anticorps ainsi produites sont caractérisées comme étant des cellules lymphoblastoïdes en croissance continue qui possèdent un caryotype diploïde, sont positives à l'antigène nucléaire 35 Epstein-Barr, et secrétent un anticorps monoclonal I » 9 d'isotype IgG, IgM, IgA ou IgD, y compris divers sous-types tels que IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4. Le procédé de transformation par entraînement de cellule est décrit en détails dans le brevet des E.U.A. no.

5 4.464.465, qui est ici mentionné à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux' peuvent être utilisés entiers ou sous forme de fragments, tels que Fv, Fab, F(ab')^, mais habituellement ils sont entiers.

D'une autre manière, des lignées de 10 cellules produisant les anticorps pourraient être obtenues par une fusion cellulaire entre des cellules appropriées, marquées par médicament, de myélome humain, myélome de souris, hétéromyélome homme-souris ou lymphoblastoïdes humains, et des lymphocytes B 15 humains pour produire des lignées de cèllules hybrides humaines.

Les lignées de cellules de la présente invention peuvent trouver d'autres utilisations que la production directe d'anticorps monoclonaux humains. 20 Les lignées de cellules peuvent être fusées avec d'autres cellules (telles des cellules appropriées et marquées par médicament de myélome humain, myélome de souris, hétéromyélome homme-souris ou lymphoblastoïdes humains) pour produire des hybridomas, et ainsi pour-25 voir au transfert des gènes encodant les anticorps monoclonaux. D'une autre manière, les lignées de cellules peuvent être utilisées en tant que source de chromosomes encodant les immunoglobulines, qui peuvent être isolées et transférées aux cellules par des 30 techniques autres que la fusion. De plus, les gènes encodant les anticorps monoclonaux peuvent être isolés et utilisés suivant des techniques de recombinaison de l'ADN, pour la production d'immunoglobuline spécifique chez divers hôtes. Plus particulièrement, en préparant 35 des librairies cADN à partir d'ARN*messager, un clone j i 10 unique de cADN, codant pour l'immunoglobuline et exempt d'introns, peut être isolé et placé dans des vecteurs appropriés à expression procariote ou euca-riote et être ultérieurement transformé en un hôte 5 pour une ultime production en masse.

Les lignées de cellules lymphoblastoïdes ou hybrides peuvent être clonées et triées suivant des techniques conventionnelles, avec les anticorps qui sont capables de se lier aux épitopes des divers 10 sérotypes de |\ aeruginosa iATS et immunotypes de Fisher détectes dans les surnageants cellulaires.

Il existe dans la littérature un certain nombre de schémas de sérotypage qui peuvent être utilisés pour examiner dans les surnageants cellulaires la 15 présence des anticorps anti-Pseudomonas. Le schéma est essentiellement basé sur les antigènes somatiques principaux stables à la chaleur de cet organisme (voir Zierdt, C.H., dans Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G.L., ed., 20 CRC press, p. 213-238 (1978)). La prolifération du schéma sérogroupant a fait l'objet1d'études sérologiques du aeruginosa assez difficiles à comparer et, par conséquenti. le choix d'un système donné quelconque . pour examiner les surnageants sera quelque peu arbi-25 traire. La confusion entre les systèmes de caractérisation a été récemment éclaircie par la création du système "International Antigenic Typing Scheme (IATS)" qui a été proposé par la sous-commission sur les P s eudomonadac e ae de 1'international Committee on 30 Systematic Bacteriology en tant que base pour l'étude sérologique ultérieure du P_j_ aeruginosa. Ce système, qui prévoit dix-sept sérotypes distincts, désignés par Type IATS 1, Type IATS 2, etc., englobe tous les antigènes somatiques principaux stables à la chaleur iden-35 tifiés dans les systèmes précédents. Voir Liu, P.V., / « 11

Int. J. Syst. Bacteriol., 33:256-264, (1983), qui est indiqué ici à titre de référence.

Dans le développement des anticorps monoclonaux protecteurs qui sont à réaction croisée parmi 5 les souches de IV aeruginosa, il est aussi avantageux d'incorporer un schéma de typage qui est basé sur les antigènes protecteurs du P_^ aeruginosa. Ce schéma a été élaboré avec l'intention de développer un vaccin à usage clinique et il est décrit en détails dans 10 Fisher, M.W. et al., J. Bacteriol., 98:835-836, (1969). Ce système, communément désigné par système de typage Fisher, classe la majorité des Ρ^_ aeruginosa connus en sept types, désignés par immunotype Fisher 1, immuno-type Fisher 2, etc. La corrélation entre les systèmes 15 de typage Fisher et IATS a été clarifiée (voir Liu, P.V., £t al., supra) et est présentée dans le Tableau I. Comme on le constate dans ce tableau, il n'y a pas d'immunotype Fisher correspondant à certains sérotypes IATS, bien que chaque immunotype Fisher corresponde à 20 un certain sérotype IATS. Dans les systèmes de typage Fisher et IATS, les déterminants antigènes correspondant aux deux schémas de sérotypage sont supposés se trouver sur les molécules de -surface LPS du P^ aeruginosa (Liu, P.V. et al., supra; Hanessien, F., et al., 25 Nature, 229:209-210 (1979)).

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1 TABLEAU I

Comparaison et corrélation entre les schémas de typage IATS et Fisher pour le Pseudomonas aeruginosa IATS Fisher 5 1 4 2 3 3 4 5 7 10 6 1 7 8 6 9 10 5 15 11 2 12 13 ~ 14 15 20 16 17

Dans un aspect de la présente invention, on obtient des anticorps monoclonaux humains qui sont capables de se lier spécifiquement aux déterminants 25 lipopolysaccharides présents sur plusieurs (mais pas tous) sérotypes IATS de aeruginosa. Ces déterminants peuvent être présents, par exemple, sur deux ou trois sérotypes IATS,· et sur zéro, un ou au moins deux immu-notypes Fisher. Ces anticorps peuvent avoir un carac-30 tère protecteur in vivo vis-à-vis de quelques uns ou de tous les sérotypes et immunotypes reconnus, typiquement deux ou plusieurs sérotypes.

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Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent aussi trouver une large variété d'emplois in vitro. A titre d'exemple, les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour le typage, pour 5 l'isolement de souches spécifiques de aeruginosa, pour l'enlèvement sélectif des cellules dé aeruginosa dans un mélange hétérogène de cellules, etc.

A des fins de diagnostics, les anticorps monoclonaux peuvent être soit- marqués ou soit non-10 marqués. De manière spécifique, des tests pour diagnostics comportent la détection de la formation d'un complexe par la liaison de l'anticorps monoclonal au LPS de l'organisme P^ aeruginosa. S'ils sont non-marqués, les anticorps peuvent être employés dans des 15 tests d'agglutination. De plus, des anticorps non-marqués peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres anticorps marqués (seconds anticorps) qui réagissent avec l'anticorps monoclonal, tels que des — anticorps spécifiques pour l'immunoglobuline. De 20 manière alternative, les anticorps monoclonaux peuvent être directement marqués. Une grande variété de marqueurs peuvent être employés, tels que radionucléides, fluorescents, enzymes, ‘substrats d'enzymes, co-facteurs d'enzymes, inhibiteurs d'enzymes, ligands 25 (particulièrement des produits de fixation), etc. De nombreux types d'immuno-tests sont disponibles et, à titre d'exemple, on peut citer ceux décrits dans les brevets des E.U.A. no. 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 et 30 4.098.876, qui sont tous indiqués ici à titre de réfé rence .

Usuellement, les anticorps monoclonaux de la présente invention sont utilisés dans des immuno-tests d'enzymes dans lesquels les anticorps en 35 question, ou les seconds anticorps provenant d'une i y Λ 14 espèce différente, sont conjugués à un enzyme. Quand un échantillon contenant du P_^ aeruginosa d'un sérotype déterminé, tel du sang humain ou son lysat, est combiné avec les anticorps en question, il se produit 5 une liaison entre les anticorps et les molécules présentant l'épitope désiré. Ces cellules peuvent ensuite être séparées des réactifs non-liés, et un second anticorps (marqué avec un enzyme) est ajouté. Ensuite, on détermine la présence du produit conjugué 10 anticorps-enzyme fixé spécifiquement aux cellules.

D'autres techniques conventionnelles bien connues par les experts en cette matière peuvent aussi être utilisées.

On peut également réaliser des kits à 15 utiliser avec les anticorps en question pour la détection d'une infection par P_^ aeruginosa ou pour détermi-' ner la présence de l'antigène du aeruginosa. Ainsi, la composition d'anticorps monoclonal en question suivant la présente invention peut être fournie habitu-20 ellement sous forme lyophilisée, soit seule ou soit en conjonction avec des anticorps supplémentaires spécifiques vis-à-vis d'autres bactéries gram-négatives. Ces anticorps qui peuvent être conjugues à un marqueur ou non-conjugués, sont inclus dansües kits avec des 25 agents tampons tels que Tris, phosphate, carbonate, etc., des stabilisants, des biocides, des protéines inertes, p.ex. albumine de sérum bovin, etc. Généralement, ces substances seront présentes à raison de moins d'environ 5 % en poids, sur base de la quantité 30 de l'anticorps actif, et habituellement présentes en une quantité totale d'au moins environ 0,001 % en poids, sur base de la concentration de l'anticorps. Fréquemment, il sera souhaitable d'inclure un diluant ou un excipient inerte pour diluer les ingrédients * 35 actifs, l'excipient pouvant être présent à raison J * 15 d'environ 1 à 99 % en poids de la composition totale. Quand on utilise un second anticorps capable de se lier à l'anticorps monoclonal, il sera habituellement présent dans un flacon séparé. Le second anticorps est 5 spécifiquement conjugué à un marqueur et est formulé d'une manière analogue à celle des formulations d'anticorps décrites ci-dessus.

Formulations pharmaceutiques et leur utilisation

Les anticorps monoclonaux de l'invention 10 peuvent aussi être incorporés en tant que composants de compositions pharmaceutiques contenant une quantité thérapeutique ou prophylactique d'au moins un des anticorps monoclonaux de l'invention, avec un porteur ' pharmaceutiquement efficace. Un porteur pharmaceutique 15 peut être toute substance compatible et non-toxique convenant pour administrer les anticorps monoclonaux au patient. Eau stérile, alcool, graisses, cires et solides inertes peuvent être utilisés comme porteurs. Des adjuvants pharmaceutiquement acceptables (agents 20 tampons, agents dispersants)'peuvent aussi être incorporés dans la composition pharmaceutique. Ces compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique afin d'être spécifique pour deux ou plusieurs (mais pas pour tous) sérotypes du Ρ_^_ aeruginosa. D'une autre 25 manière, une composition pharmaceutique peut contenir deux ou plusieurs anticorps monoclonaux pour former un mélange. Par exemple, un mélange contenant des anticorps monoclonaux humains contre des groupes de divers sérotypes de Ρ_^ aeruginosa pourrait être un produit 30 universel actif contre la grande majorité des produits isolés cliniques de cette bactérie déterminée.

Sont spécialement intéressantes des compositions d'anticorps monoclonaux prophylactiques et/ou thérapeutiques capables de réagir avec au moins trois 35 sérotypes IATS, habituellement avec au moins quatre, 7 « 16 / et plus souvent encore avec au moins cinq sérotypes IATS. Sont tout particulièrement intéressantes des compositions d'anticorps monoclonaux qui réagissent avec au moins environ sept, de préférence avec au 5 moins environ dix à quatorze et jusque et y compris les dix-sept sérotypes IATS. Conjointement aux sérotypes IATS, il est souhaitable que les compositions puissent réagir avec au moins deux, habituellement avec au moins trois, et plus souvent encore avec au 10 moins quatre et plus, jusque et y compris les sept immunotypes du système d'immunotypage de Fisher.

Chacune des compositions doit inclure au moins un, habituellement au moins deux, et plus .souvent encore au moins trois anticorps, chaque anti-15 corps réagissant avec au moins 2, 3, 4 sérotypes IATS ou plus, mais pas tous. Il est souhaitable qu'il y ait au moins un anticorps monoclonal qui se lie à au moins deux sérotypes IATS et un ou plusieurs immunotypes Fisher, de préférence au moins deux immunotypes.

20 De préférence, le nombre total d'anticorps monoclonaux différents dans une composition doit être d'au moins un et égal ou inférieur à environ la moitié du nombre total des sérotypes IATS avec lesquels les compositions réagissent, fréquemment un tiers de ce 25 nombre total.

Habituellement, le rapport molaire entre les divers composants anticorps monoclonaux ne doit pas différer de plus d'un facteur 10, usuellement de pas plus d'un facteur 5, et doit être normalement 30 dans un rapport molaire d'environ 1:1-2 relativement aux autres composants anticorps.

Les anticorps monoclonaux humains de la présente invention peuvent aussi être utilisés en combinaison avec d'autres compositions d'anticorps » 35 monoclonaux ou avec des produits de plasma sanguin ΐ * / 17 existants, comme des produits de gammaglobuline et d'immunoglobuline commercialement disponibles, utilisés dans le traitement prophylactique ou thérapeutique des maladies provoquées par le aeruginosa chez 5 l'homme. De préférence, pour les immunoglobulines, le plasma sera obtenu à partir de donneurs humains présentant des niveaux élevés d'immunoglobulines réactives vis-à-vis du P_;_ aeruginosa. Voir généralement l'abrégé "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", 10 Amer. J. Med., 76(3a), 30 mars 1984, p. 1-231, qui est indiqué ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être utilisés sous forme de compositions administrées séparément données en conjonction 15 avec des antibiotiques ou des agents antimicrobiens.

De manière caractéristique, les agents antimicrobiens peuvent inclure une pénicilline anti-pseudomonale (p.ex. carbénicilline) en conjugaison avec un amino-glycoside (p.ex. gentamicine, tobramycine, etc.), mais 20 de nombreux agents additionnels (p.ex. céphalosporines), bien connus par les experts en cette matière, peuvent aussi être utilisés.

Les anticorps morioclonaux humains et leurs compositions pharmaceutiques suivant 1'invention sont 25 particulièrement utiles pour une administration par voie orale ou parentérale. De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie parentérale, c.a.d. par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Ainsi, l'invention four-30 nit des compositions pour une administration par voie parentérale comprenant une solution de 1'anticorps monoclonal humain ou un de ses mélanges dissous dans un porteur acceptable, de préférence un porteur aqueux. Divers porteurs aqueux peuvent être utilisés, p.ex.

35 eau, eau tamponnée, salin à 0,4 %, glycine à 0,3 %, '7 » 18 etc. Ces solutions sont stériles et généralement exemptes de matières particulaires. Ces compositions peuvent être stérilisées par des techniques de stérilisation conventionnelles bien connues. Les compositions 5 peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceu-tiquement acceptables comme requis pour se rapprocher des conditions physiologiques, telles que des agents tampons et pour ajustement du pH, des agents pour ajustement de la toxicité, etc., par exemple acétate 10 de sodium, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de calcium, lactate de sodium, etc. La concentration de l'anticorps dans ces formulations peut varier largement, c.a.d. de moins d'environ 0,5 %, habituellement de ou d'au moins environ 1 % jusqu'à 15 15 à 20 % en poids, et doit être choisie essentielle ment sur base des volumes du fluide, des viscosités, etc., de préférence en fonction du mode d'administration particulier choisi.

Ainsi, une composition pharmaceutique 20 caractéristique pour injection intramusculaire peut être préparée de façon à contenir 1 ml d'eau tamponnée stérile et 50 mg d'anticorps monoclonal. Une composition caractéristique pour infusion intraveineuse peut être préparée de façon à contenir 250 ml d'une solu-25 tion de Ringer stérile et 150 mg d'anticorps monoclonal. Des méthodes actuelles pour la préparation de compositions pouvant être administrées par voie parentérale sont connues· ou sont< évidentes pour les experts en cette matière et sont décrites de manière plus 30 détaillée dans, par exemple, Remington's Pharmaceuti- cal Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), qui est indiqué ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux de cette inven-35 tion peuvent être lyophilisés pour conservation et * t * i 19 reconstitués dans un porteur approprié avant utilisation. Cette technique s'est révélée être efficace avec des immunoglobulines conventionnelles et des techniques de lyophilisation et de reconstitution connues 5 dans la pratique peuvent être employées. Il est appréciable, pour les experts en cette matière, que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire à des degrés variables de pertes d'activité de l'anticorps (p.ex. avec des immunoglobines conventionnelles, 10 les anticorps IgM tendent à avoir une plus grande perte d'activité que les anticorps IgG) et que les niveaux employés peuvent être ajustés pour compensation.

Les compositions contenant les anticorps 15 monoclonaux humains de l'invention ou un de leurs mélanges, peuvent être administrées pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des infections dues au Pj_ aeruginosa. Dans une application thérapeutique, des compositions ont été administrées à un patient 20 déjà infecté par un ou plusieurs sérotypes de P^_ aeruginosa, en une quantité suffisante pour guérir ou au moins partiellement arrêter l'infection et ses complications. Une quantité adéquate pour obtenir cet effet est défine comme "dose thérapeutiquement efficace".

25 Des quantités efficaces pour cet emploi dépendront de la gravité de l'infection et de l'état général du système immunitaire propre du patient, mais, généralement, on utilise une gamme d'environ 1 à environ 200 mg d'anticorps par kilogramme du poids du corps, 30 des doses de 5 à 25 mg par kilogramme étant le plus souvent employées. Il ne faut pas oublier que les produits de cette invention peuvent généralement être employés pour des états maladifs sérieux, c'est-à-dire des situations dans lesquelles.la vie est menacée ou 35 potentiellement menacée, particulièrement dans les cas i 20 ï * de bactérémie et d'endotoxémie dues au P^ aeruginosa. Dans de tels cas, eu égard à l'absence de substances extérieures et à l'absence de rejets de "substance étrangère", qui sont réalisés par les anticorps mono-5 clonaux humains de l'invention, il est possible et il peut s'avérer souhaitable que le médecin traitant administre des excès substantiels de ces anticorps.

Dans des applications prophylactiques, des compositions contenant l’anticorps de l'invention ou 10 un de ses mélanges sont administrées à un patient non encore infecté par le Ρ_^ aeruginosa, afin d'augmenter la résistance de ce patient à une infection potentielle. La quantité de cette composition est définie comme étant la "dose prophylactique efficace". Dans 15 cet emploi, les quantités exactes dépendent à nouveau de l'état de santé du patient et du niveau général d'immunité, mais elles sont généralement comprises dans une-gamme de 0,1 à 25 mg par kilogramme, spécialement de 0,5 à 2,5 mg par kilogramme.

20 Des administrations uniques ou multiples des compositions peuvent être effectuées avec des niveaux de doses et selon un schéma choisis par le médecin traitant. Dans chaque' cas, les formulations pharmaceutiques fournissent le ou les anticorps de 25 cette invention en une quantité suffisante pour traiter efficacement le patient.

EXPERIENCES

EXEMPLE I

L'Exemple I présente des méthodes pour la 30 production d'anticorps monoclonaux humains (isotype

IgM) qui réagissent avec des sérotypes IATS 2, 5 et 16 et des immunotypes Fisher 3 et 7.

Un échantillon de sang périphérique obtenu à partir d'un patient souffrant de fibrose cystique "f » 21 connu pour avoir eu une infection chronique par le P. aeruginosa a servi de source de cellules B humaines. Des cellules monocucléaires ont été séparées du sang par des techniques standards de centrifugation sur 5 Ficoll-Paque (Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968) 21_:Suppl. 97, 77-89) et elles ont été lavées deux fois dans un salin tamponné au phosphate exempt de calcium/magnésium (STP).

Les cellules mononucléaires ont-été déba-10 rassées des cellules T en utilisant un mode opératoire type E-rosette modifié. En bref, les cellules ont d'abord été remises en suspension jusqu'à une concen-tration de 1 x 10 cellules/ml dans du STP contenant 20 % de sérum de foetus de veau (SFV) à 4°C. Un ml de 15 cette suspension a été ensuite placé dans un tube à fond rond en polystyrène de 17 x 100 mm et on y a 9 ajouté 1 x 10 cellules de sang rouge de mouton traitées avec du bromure de 2-amino-isothiouronium (AET) à partir d'une solution à 10 % (v/v) dans un milieu 20 Dulbecco modifié par Iscove (milieu Iscove) (Madsen, M. et Johnson,H.E.,J.Immun. Methods (1979) 27:61-74)♦ La suspension a été mélangée légèrement durant 5-10 minutes à 4°C et les cellules en E-rosette ont été ensuite enlevées par centrifugation sur Ficoll-Paque 25 durant 8 minutes à 2.500xg à 4°C. Les cellules mononucléaires du sang périphérique E-rosette négatif (CMSPE ) se présentant en bandes sur l'interface ont été recueillies et lavées une fois dans un milieu Iscove et ont été remises en suspension dans le même 30 milieu contenant 15 % (v/v) de SFV, L-glutamine (2 mmole/1), pénicilline (100 IU/ml), streptomycine (100yug/ml), Hypoxanthine (l x 10_4M), aminoptérine (4 x 10-7M) et thymidine (1,6 x 10“5M). Ce milieu a été désigné ici par milieu HAT.

35 La transformation par entraînement de 22 f cellules du CMSPE- a été accomplie en co-cultivant ces cellules avec une lignée de cellules transformantes.

La lignée de cellules transformantes était une lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines positives anti-5 gène nucléaire Epstein-Barr (ANEB) dérivée par mutagé-nèse éthyl méthane-suifonate (EMS) de la lignée de cellules lymphoblastoïdes GM 1500 suivie d'une sélection en présence de 30 ^ug/ml de 6-thioguanine pour rendre les cellules déficientes en hypoxanthine-10 guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT) et donc sensibles à HAT. Cette lignée de cellules est dénommée lignée de cellules 1A2 et a été déposée à 1'American Type Culture Collection (A.T.C.C.) le 29 mars 1982 sous le no. CRL 8119 A.T.C.C. Les cellules 1A2 en 15 phase de croissance logarithmique ont été mises en suspension dans un milieu HAT et ensuite combinées avec le CMSPE avec un rapport de huit cellules 1A2 par CMSPE-. Le mélange de cellules a été placé sur huit plaques à 96 alvéoles à fond rond pour microti-20 trage (Costar 3799) avec une concentration de 72.000 cellules/alvéole, avec un volume de 20 μΐ par alvéole, et a été soumis à incubation à 37°C dans une atmosphère humide contenant 6 % de' C02· Les cultures ont été nourries 5 et 8 jours après la mise sur plaque, en 25 remplaçant la moitié de la matière surnageante par un milieu HAT frais. Les alvéoles ont été observées tous les autres jours sur un microscope à inversion pour suivre la prolifération des cellules. Douze jours après la mise sur plaque, on a observé que 100 % des 30 alvéoles contenaient des cellules proliférantes et que, dans la plupart des alvéoles, les cellules avaient une densité suffisante pour permettre le prélèvement et l'examen des matières surnageantes en ce qui concerne, l'anticorps P^ aeruginosa 35 Les surnageants ont été examinés pour la t * *.

23 présence des anticorps anti-P. aeruginosa en utilisant une technique de test avec immunosorbant lié à un enzyme (TISLE) (Engvall, E., (1977) 55:193-200). Les plaques d'antigènes consistaient en plaques pour 5 microtitrage avec. 96 alvéoles à fond plat (Immulon II, Dynatech), et ces alvéoles contenaient diverses bactéries vivantes absorbées sur le fond de l'alvéole. Pour faciliter l'adsorption de la bactérie sur le plastique, 50 jul/alvéole de poly-L-lysine (PLL) (l pg/ml dans STP, 10 pH 7,2) ont été soumis à incubation durant 30 minutes à température ambiante. La PLL non-adsorbée a été ensuite enlevée, les plaques ont été lavées une fois avec du STP, 50 μΐ d'une suspension de bactéries lavées (0DggQ=0,2) dans STP ont été ajoutés à chaque 15 alvéole , et les plaques ont été soumises à incubation durant une heure à 37°C. Les bactéries non-adsorbées ont été éliminées par lavage des plaques trois fois avec dp Tween salin (0,9 % de NaCl, 0,05 % (v/v) de Tween-20). Les diverses plaques d'antigènes utilisées 20 dans l'examen incluaient : (l) un mélange d'immuno- types Fisher de P^ aeruginosa 1, 2 et 4 (A.T.C.C. no. 27312, 27313, 27315); (2) un mélange d'immunotypes Fisher de aeruginosa 3, 5,· 6 et 7 (A.T.C.C. no. 27314, 27316, 27317, 27318, respectivement); et (3) 25 une plaque pour microtitrage avec aucune bactérie.

Le TISLE a été initié en bloquant d'abord les plaques avec 20 jul/plaque d'agent tampon de blocage (STP, pH 7,2, contenant 5 % (p/v) de lait maigre anhydre, 0,01 % (v/v) d'antifoam A (Sigma), et 30 0,01 % (p/v.) de thimerosal) durant 60 minutes à tempé rature ambiante. Après blocage, les plaques ont été lavées trois fois avec du Tween salin. Cinquante μΐ de STP, pH 7,2, contenant 0,1 % de Tween 20 et 0,2 % (p/v) d'albumine de sérum bovin (ASB) ont été ensuite » 35 , placés dans toutes les alvéoles. Les surnageants * ï * 24 provenant des alvéoles des plaques de culture ont été déposés avec réplication dans les alvéoles correspondantes des plaques d'antigènes (50 pl/alvéole) et les plaques ont été soumises à incubation durant 30 minu-5 tes à température ambiante. Les surnageants ont été. ensuite enlevés, les cellules ont été lavées trois fois avec du Tween salin et 50 jul, dilués de manière adéquate, de raifort peroxydase (RP) conjugué chèvre anti-IgG + IgM humain (American Qualex International 10 #A1114 + fA1124) ont été ajoutés dans les alvéoles.

Dans cet exemple, du RP-chèvre anti-IgG et du RP-chèvre anti-IgM ont été utilisés en une dilution finale de 1:5.000 et 1:3.000, respectivement, dans du STP, pH 7,2, contenant 0,05 % de Tween-20. et 0,1 % 15 d'ASB. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, l'excès d'anticorps de chèvre conjugué à l'enzyme a été enlevé et les alvéoles ont été lavées trois fois avec du Tween salin. Cent (ul de substrat (0,8 mg/ml de dihydrochlorure de o-phénylènediamine 20 dans du citrate 100 mM comme agent tampon, pH 5,0, plus 0,03 % de H^Og dans Η,,Ο désionisée, mélangés en volumes égaux juste avant le dépôt sur plaque) ont été ensuite ajoutés dans chaque alvéole. Après 30 minutes d'incubation dans l'obscurité, 50 μΐ de H^SO^ 3N ont 25 été ajoutés à toutes les alvéoles afin de terminer les réactions. Les surnageants de culture contenant des anticorps réagissant avec l'antigène des plaques ont été mis en évidence par développement de couleur positif dans les alvéoles correspondantes et 1'inten-30 site de la réaction a été quantifiée, en mesurant l'absorbance à 490 nm sur un lecteur micro TISLE Bio-tek EL-310.

L'analyse des surnageants de culture par la méthode ci-dessus conduit à l'identification de 35 deux alvéoles (ICI et 2H12)qui contenaient des 25 I > y l anticorps anti-P. aeruginosa qui réagissaient avec la plaque des immunotypes Fisher 3, 5, 6 et 7, mais non avec la plaque des immunotypes Fisher 1, 2 et 4 ou la plaque sans bactéries. Afin d'identifier le (ou les) • 5 immunotype(s) Fisher spécifique(s), des plaques d'antigènes reconnues contenant la bactérie PLL-fixée d'un seul immunotype Fisher ont été préparées comme décrit ci-dessus pour chaque immunotype. Le résultat du test TISLE comme présenté ci-dessus, avec les surnageants 10 de culture provenant des alvéoles ICI et 2H12 sur les plaques des immunotypes individuels indiquait que ces deux alvéoles contenaient l'anticorps spécifique des deux immunotypes Fisher 3 et 7. Un TISLE similaire effectué sur la gamme IATS des souches typant le P^ 15 aeruginosa (obtenues à partir de l'A.T.C.C. et incluant les no. 33348-33364) démontrait que l'anticorps dans les alvéoles ICI et 2H12 réagissait spécifiquement avec les souches IATS 2, 5 et 16.

L'isotype de (ou des) anticorps réactif(s) 20 dans les alvéoles ICI et 2H12 a été déterminé par un test TISLE similaire aux tests de spécificité décrits ci-dessus, sauf que le RP-chèvre anti-IgG humain et le RP-chèvre anti-IgM humain ont été utilisés indépendamment en tant que réactifs de la seconde étape, plutôt 25 que d'être combinés. Une réaction positive du (des) anticorps dans les alvéoles ICI et 2H12 avec les immunotypes Fisher 3 et 7 a été observée uniquement avec les réactifs anti-IgM, démontrant ainsi un iso-/p type IgM pour le (ou les) anticorps correspondant(s) 30 dans chaque alvéole.

Afin de déterminer si le schéma réactionnel anti-immunotypes Fisher 3 et 7 était dû à un ou plusieurs anticorps dans les alvéoles ICI et 2H12 (c.a.d. un anticorps réactif avec les deux immunotypes 35 Fisher 3 et 7 ou deux anticorps, l'un réactif avec 1 > i 26 l'immunotype Fisher 3 et l'autre avec l'immunotype Fisher 7) des cellules provenant des deux alvéoles ont été sous-cultivées avec une faible densité et les alvéoles contenant des cellules proliférantes ont été 5 examinées relativement à l'activité de l'anticorps sur des plaques d'antigènes de bactéries d'immunotype Fisher 3 et d'immunotype Fisher 7 séparées. La sous-culture a été effectuée sur des plaques présentant 96 alvéoles à fond rond avec une densité de 5 cellules/ 10 alvéole, danè un volume total de 100 μΐ d'un milieu HAT privé du composant aminoptérine (milieu HT). Des cellules lymphoblastoïdes HAT-sensibles non-transformantes ont été introduites dans toutes les alvéoles à une densité de 500 cellules/alvéole, en 15 tant que cellules d'alimentation. Quatre jours après le dépôt sur plaques, 100 μΐ du milieu HAT ont été ajoutés dans toutes les alvéoles pour tuer sélectivement les cellules d'alimentation. Les alvéoles ont à nouveau été remplies 9 jours après le dépôt sur 20 plaques en remplaçant la moitié du surnageant par du milieu HAT. Ensuite, les alvéoles ont été alimentées de la même manière tous les 4 à 5 jours avec du milieu HT jusqu'à ce que les alvéoles aient une densité cellulaire en lymphoblastoïdes suffisante pour analy-25 ser le surnageant par TISLE. L'examen des plaques individuelles des antigènes de l'immunotype Fisher 3 et de 1'immunotype Fisher 7 montre que tous les surnageants qui réagissaient avec 1'immunotype Fisher 3 réagissaient aussi avec l'immunotype Fisher 7, indi-30 quant ainsi qu'un anticorps était responsable de l'activité sur les deux immunotypes Fisher. Des surnageants choisis au hasard ont été examinés en ce qui concerne les souches IATS 2, 5 et 16 et on a constaté qu'il y avait réaction avec les trois souches plutôt 35 qu'avec des souches individuelles, ceci renforçant la

A A

i 27 conclusion qu'un anticorps avait une réaction croisée avec les immunotypes Fisher 3 et 7 et les souches IATS 2, 5 et 16.

Le clonage de cellules produisant des anti-5 corps spécifiques à partir des alvéoles ICI et 2H12 a été accompli en soumettant indépendamment les cellules de- chaque alvéole à plusieurs étapes de clonage par dilution avec limitation jusqu'à ce que tous les surnageants clonaux, testés par le mode opératoire TISLE 10 ci-dessus, présentent une réaction positive sur les immunotypes Fisher 3 et 7 et sur les souches IATS 2, 5 et 16. Le clonage utilisait des cellules d'alimentation décrites ci-dessus pour la sous-culture. Par ces moyens, deux lignées de cellules humaines transformées 15 clonées (ICI et 2H12) ont été obtenues, celles-ci étant continues (immortelles) et secrétant chacune un anticorps monoclonal humain réagissant avec les immunotypes Fisher 3 et -7 et avec les souches IATS 2, 5 et 16. Dans cet exemple, la lignée de cellules et l'anti-20 corps qu'elle produit portent la même désignation.

EXEMPLE II

L'Exemple II décrit des méthodes de production d'un anticorps monoclonal humain (isotype IgG), qui réagit avec des sérotypes IATS 2, 5 et 16 et des 25 immunotypes Fisher 3 et 7. Les modes opératoires pour la production sont essentiellement identiques à ceux de l'Exemple I. En quelques mots, un échantillon de sang périphérique, obtenu à partir d'un patient ayant une fibrose cystique, et ayant souffert d'une infec-30 tion chronique due au P^ aeruginosa, a servi de source pour les cellules B humaines. Des cellules mononucléaires ont été séparées comme décrit dans l'Exemple I, sauf que l'on a utilisé 1,6 ml de la suspension de STP avec une suspension de 1,6 x 10^ cellules de sang 35 rouge de mouton traitées avec AET. La transformation *r i 28 par entraînement de cellules était également la même, sauf que : le rapport entre les cellules 1A2 et le CMSPE- était 7,5; quinze plaques comportant 17.000 cellules/alvéole ont été utilisées; les cultures ont 5 été' alimentées '6 et 10 jours après le dépôt sur plaque; et seize jours après le dépôt sur plaque, presque toutes les alvéoles contenaient des cellules proliférantes.

L'examen des surnageants de la culture en 10 ce qui concerne les anticorps spécifiques a été effectué comme décrit et a permis de localiser une alvéole (9D1) qui contenait un anticorps réactif avec les plaques des immunotypes Fisher 3, 5, 6 et 7 mais pas avec les plaques des immunotypes Fisher 1, 2 et 4, ni 15 avec la plaque sans bactéries. Les résultats du test TISLE déjà décrit effectué sur les plaques d'immunotypes individuels ou d'antigènes bactériens de sérotypes avec des surnageants de culture 9D1 indiquaient un anticorps spécifique des deux immunotypes Fisher 3 20 et 7 ainsi que des souches IATS 2, 5 et 16. Des études ultérieures effectuées suivant l'Exemple I démontraient que la spécificité de l'anticorps dans l'alvéole 9D1 était attribuable à un clone unique secrétant un anticorps de l'is'otype IgG.

25 EXEMPLE III

L'Exemple III démontre la spécificité antigène de quelques anticorps de la présente invention.

Afin de déterminer si les anticorps monoclonaux ICI, 2H12 et 9D1 réagissaient avec la même 30 cible antigène et possédaient donc une spécificité identique, des tests supplémentaires ont été effectués.

Tout d'abord, les anticorps ont été comparés dans un test TISLE sur une gamme de souches de référence et » sur des produits isolés cliniques de P. aeruginosa. Le 35 mode opératoire du TISLE était comme décrit ci-dessus

- V

i 29 sauf en ce qui concerne les points suivants : l) Au lieu d'une bactérie adsorbée sur des plaques revêtues de PLL, les alvéoles de la plaque contenaient diverses bactéries entières qui avaient été fixées par de 5 l'éthanol au fond de l'alvéole. Les plaques ont été préparées en ajoutant dans les alvéoles 50 μΐ d'une suspension bactérienne lavée (0Dg6O = O»2) dans du STP, en effectuant une centrifugation des plaques durant 20 minutes à 500 x g, une aspiration du STP, une addition 10 de 75 jul d'éthanol durant 10 minutes, une élimination de l'éthanol puis un séchage à l'air. Les plaques d'antigènes incluaient des souches IATS 2, 5, 11 et 16 (A.T.C.C. no. 33349, 33352, 33358, 33363, respectivement) et seize produits isolés cliniques qui avaient 15 été au préalable typés à la fois par agglutination avec des antisérums Bacto-Pseudomonas aeruginosa de Difco (Detroit Michigan) suivant les instructions du fabriquant et par te-st TISLE (comme décrit ici), comme étant les sérotypes 2, 5, 16 ou une combinaison de ces 20 sérotypes; 2) Des antisérums de typage de lapin ont été utilisés en une dilution de 1:500 dans du STP, sauf 1'anti-IATS 16 qui a été dilué à 1:250. Les surnageants de culture contenant les anticorps ICI, 2H12 et 9D1 ont été utilisés de manière nette; 3) Comme réac-25 tifs pour la seconde étape, une protéine A biotinylée (B-2001, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) diluée 1:500 et l'anti-Ig humain chèvre biotinylé (4703, Tago, Inc. Burlingame, CA) dilué - 1:500 ont été utilisés pour la détection des anticorps humains et de 30 lapin, respectivement. Cinquante μΐ de réactif ont été ajoutés aux alvéoles appropriées et, après une incubation de 30 minutes à température ambiante, le réactif non fixé a été éliminé et les alvéoles ont été lavées trois fois. Cinquante pl d'un complexe préformé 35 d'avidine-peroxydase de raifort biotinylé (Vectastain

A W

30 ABC Kit, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) ont été ensuite ajoutés dans chaque alvéole. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, le réactif Vectastain ABC en excès a été éliminé et les alvé-5 oies ont été à nouveau lavées trois fois avant addition du substrat.

Comme indiqué dans le Tableau II, les résultats du test indiquaient que tandis que les anticorps ICI et 9D1 réagissaient avec chaque produit 10 isolé clinique typé en tant que sérotypes IATS 2, 5 ou 16, l'anticorps 2H12 ne réagissait pas avec trois de ces produits isolés. Ceci suggère que l'anticorps 2H12 reconnaissait un épitope différent de celui reconnu par ICI ou 9D1 et que les deux épitopes sont apparem-15 ment exprimés de manière coordonnée sur la plupart mais non sur tous les produits isolés cliniques correspondant aux sérotypes IATS 2, 5 ou 16.

» λ ► 31 ι

TABLEAU II

SCHEMAS DE REACTIVITE DES ANTISERUMS BACTO-E\ AERUGINOSA DIFCO ET DES ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS 2H12, ICI ET 9D1 SUR 5 DES SOUCHES TYPEES ET DES PRODUITS

ISOLES CLINIQUES DE P_;_ AERUGINOSA

Souche typée _Lapin _ Homme_ ou produit IATS IATS IATS IATS MAb MAb MAb isolé clinique ql2 ci 5 <*-16 ixll 2H12 ICI 9D1 10 IATS 2 + --- + + + IATS 5 ( + )a + -- + + + IATS 16 (+)a (+)a + - + + + IATS 11 A523 + + - - + + + 15 B406 + + ( + ) + + + C27 + + — — + + + D26 + + -- + + + F155 + + + — + + + F225 + ( + )a + - + + + 20 F250 . + + - - — + + + F253 - + -- + + + F255 + + ---+ + F256 +----+ + F396 + + + - + + + 25 H217 + + + - + + + H218 + + — — + + + H219 - + -- + + + H220 + + -- + + + H221 + + ---+ + 30 a(+) = réaction au test TISLE très faiblement positive.

Les résultats suggéraient en outre que la cible moléculaire reconnue par les anticorps ICI et 91 9D1 devait être probablement présente sur tous les 35 produits,isolés cliniques du Ph_ aeruginosa qui pouvaient être typés comme appartenant aux sérotypes IATS 2, 5 ou 16 tandis que la cible reconnue par l'anticorps 2H12 était exprimée sur un sous-groupe de ces produits isolés.

- Jr 32 /

Afin de déterminer si les anticorps ICI, 2H12 et 9D1 réagissaient avec des antigènes différents ou, d'une autre manière, des épitopes différents sur le même antigène, ces épitopes étant exprimés sur la 5 plupart mais non sur tous les sérotypes IATS 2, 5 et.

16, une analyse par immuno-taches a été effectuée..

Parce que l'antigénicité partagée entre les souches IATS 2, 5 et 16 est apparemment due aux antigènes stables à la chaleur (Liu, P.V. et al., supra) et vu 10 que la stabilité thermique est une caractéristique déjà mentionnée des molécules de lipopolysaccharide, des préparations LPS provenant des souches IATS 2, 5, 16 et 11 ont été choisies comme préparations d'antigènes pour analyse. Le LPS brut a été préparé à partir 15 de souches types par extraction dans un salin à 60°C (Orskov, F. et al., Acta, Path. Microbiol. Scand.

(1971) Section B 79:142-152). Dix microgrammes de LPS, comme déterminé à partir de chaque sérotype par teneur — de 2-céto-3-déoxyoctonate (CDO) (Karkhanis, Y.D., et 20 al., Anal. Biochem. (1978) 8E>: 595-601), ont été soumis à électrophorèse sur gel de polyacrylamide - dodécyl sulfate de sodium (EGPA-DSS) (Hancock, R.E.W. et Carey, A.M. J. Bacteriol. (1977) 140:901-910), sur un gel à gradient 10-20 %. Les espèces moléculaires séparées 25 ont été transférées du gel sur une membrane de nitro-cellulose (MNC) comme décrit ailleurs (Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1979) 76:4350-4354) et la tache sur MNC a été bloquée durant 1 heure dans du STP-Tween (Batteiger, B., et al., J. Immuno1. Meth.

30 (1982) 55_: 297-307). Les taches ont été ensuite soumi ses à incubation durant 1 heure à température ambiante dans 20 ml d'un surnageant de culture usée provenant de l'une des lignées de cellules ICI, 2H12 ou 9D1.

Après rinçage durant 5 minutes dans du STP-Tween, 35 chacune des taches sur MNC a été incubée durant 1 i A > 33 heure à 25°C dans une dilution 1:1000 ou 1:1500 (dans STP-Tween) de phosphatase alcalin-conjugué chèvre anti-IgG + IgA + IgM humain (Zymed). Les taches ont été ensuite soumises à un lavage durant 5 minutes dans du 5 STP-Tween après -quoi les interactions antigène-anticorps ont été visualisées par incubation des taches durant 15-20 minutes à 25°C dans un substrat consistant en nitrobleutétrazolium/5-bromo—4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT-BCIP) comme décrit par Leary et 10 al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80:4045-4049.

Le développement de couleur a été stoppé en rinçant la tache plusieurs fois dans de l'eau désionisée.

Les profils des taches obtenus avec les trois anticorps étaient notablemant différents. L'anti-15 corps 2H12 reconnaissait essentiellement une courte série de molécules à bas poids moléculaire régulièrement espacées (c.a.d. pareilles à une échelle) dans les préparations d'antigènes des sérotypes 2, 5 et 16. Quelques molécules à poids moléculaire plus élevé 20 régulièrement espacées étaient aussi faiblement reconnues. Aucun... réaction n'a été observée sur la préparation LPS à partir du sérotype. 11. Une répétition de l'analyse des immunotaches en utilisant les préparations LPS qui avaient été précédemment traitées avec 25 la protéinase K à 60°C pour détruire les antigènes de protéines n'avait pour résultat aucune, altération dans les profils. Les bandes à bas poids moléculaire correspondaient exactement à des formes plus petites de molécules LPS, comme visualisé dans une EGPA-DSS sur gel 30 pareillement effectuée et dans laquelle les antigènes n'étaient pas transférés sur une MNC mais étaient à la place colorés spécifiquement par la présence de LPS (Tsai, C.M. et Frasch, C.E., Anal. Biochem. (1982) 119:115-119), sauf que la bande la plus basse sur le 35 gel coloré par de l'argent (représentant la région * > 34 f centrale plus lipide A du LPS) n'était pas reconnue. L'anticorps ICI reconnaissait la même série de molécules à bas poids moléculaire régulièrement espacées parmi les préparations d'antigènes des sérotypes 2, 5 5 et 16 mais pas 11·, bien que l'intensité de la réaction n'était pas aussi forte que celle avec le 2H12. De plus, cet anticorps reconnaissait également cependant de manière prédominante une série de molécules à poids moléculaire plus élevé régulièrement espacées sur les 10 sérotypes 2, 5 et 16, ce qui, en combinaison avec les bandes à bas poids moléculaire reconnues, donnait naissance à des profils en échelle, entiers et distincts. Ces profils n'étaient pas altérés par un prétraitement des préparations d'antigènes par le 15 protéinase K. A nouveau, les profils correspondaient aux schémas de bandes en échelle observés dans des gels colorés LPS-spécifiques (c.a.d., ils apparais--.

_ saient correspondre bande à bande) sauf que la bande représentant le centre plus lipide A n'était pas 20 reconnue. L'anticorps 9D1 avait le même profil de réaction que les souches d'anticorps ICI sur les souches IATS 2, 5 et 16 mais pas 11. A nouveau, la bande la plus au bas de l'échelle d'un gel coloré à l'argent des différentes préparations LPS n'était pas 25 reconnue et le profil global n'était pas altéré par un prétraitement des préparations LPS avec le. protéinase K. Dans 1'ensemble, ces observations indiquaient que le LPS des sérotypes 2, 5 et 16 était la cible moléculaire reconnue par les anticorps 2H12, ICI et 9D1. ·

30 EXEMPLE IV

L'Exemple IV démontre 1'activité protectrice de l'un des anticorps de la présente invention.

Pour déterminer la capacité protectrice in vivo de l'anticorps ICI, des études· de protection 35 animale ont été effectuées sur des souris. L'anticorps * * 35 y ICI a été d'abord concentré à partir d’un surnageant de culture usée par précipitation avec du sulfate d'ammonium saturé (concentration finale de 50 %) (Good, A.H., et al., Selected Methods in Cellular •5 Immunology, Mishell, B.B. et Shiigi, S.M.,„eds, W.J.

Freeman & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)). La substance précipitée a été reconstituée dans un volume minimum d'eau stérile, dialysée de manière accentuée en présence de STP et filtrée de façon stérile. En 10 tant que témoin négatif, un surnageant de culture usée provenant d'une autre lignée de cellules humaines transformées (6F11-A.T.C.C. no. CRL 8562) produisant un anticorps monoclonal humain spécifique pour le LPS de la souche IATS 11 .a'été traité de la même manière.

15 Des souris femelles BALB/c pesant entre 20 et 22 grammes ont été divisées en deux groupes de trente souris chacun. A toutes les souris de chaque groupe, on a individuellement inoculé par voie intrapéritonéale (ip) 0,5 ml de l'anticorps ICI ou 6F11 20 concentré. Six heures plus tard, chacun des deux groupes a été subdivisé en trois groupes de dix souris et les membres de chacun des groupes de dix souris ont indépendamment subi 1 ' inoculation par voie ip de .

0,3 ml d'une suspension bactérienne vivante contenant 25 5 LD^q des souches 2,5 ou 11, respectivement. Les suspensions bactériennes ont été préparées à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique, à partir duquel les bactéries ont été centrifugées, lavées deux fois avec du STP et remises 30 en suspension dans du STP jusqu'à obtention de la , densité appropriée. A des groupes témoins consistant chacun en quatre à cinq souris on a injecté par voie intrapéritonéale 0,5 ml de STP et six heures après, on leur a injecté par voie intrapéritonéale 5 LD5Q des * 35 mêmes sérotypes. Après l'attaque bactérienne, les 36 · i ~ ψ animaux ont été ensuite observés durant une période de cinq jours.

Comme indiqué dans le Tableau III, l'anticorps ICI fournissait une protection spécifique et 5 significative contre une attaque létale à la fois des deux sérotypes IATS 2 et IATS 5, mais pas du sérotype IAT S 11. L'évolution caractéristique après l'attaque bactérienne chez tous les animaux non-protégés impliquait des périodes variables de choc endotoxique qui 10 étaient habituellement suivies par la mort. Les animaux témoins ayant reçu uniquement du STP développaient un choc endotoxique aigu et tous mouraient rapidement. Les animaux témoins négatifs ayant reçu un anticorps non-homologue (6F11) présentaient une période de 15 choc plus prolongée caractérisée par les symptômes repris dans la note "a" du Tableau III. Quelques animaux guérissaient vraisemblablement à cause des composants non-anticorps qui étaient co-concentrés dans les préparations d'anticorps. Cependant, les animaux qui 20 avaient reçu l'anticorps homologue protecteur présentaient seulement des symptômes mineurs d'endotoxémie. Ces symptômes disparaissaient endéans les 24 heures suivant l'inoculation et les ‘animaux paraissaient ensuite sains durant le reste de la période d'observation de cinq jours.

i X

37 t

TABLEAU III

Démonstration in vivo de l'effet protecteur de l'anticorps monoclonal humain ICI contre les sérotypes IATS 2 et 5 « 5 Anticorps Nbre de survivants/nbre d'animaux attaqués monoclonal cinq jours après attaque par : humain_IATS 2_IATS 5_IATS 11 ICI 8/10 10/10 3/10a 6F11 0/10 1/I0a 10/10 10 PBS 0/4 0/4 0/4 ^ans ces cas, où aucune protection spécifique n'a été décelée, la guérison de l'infection était nettement différente de celle observée entre les anticorps homologues et les souches infectantes, c.a.d. ICI avec 15 IATS 2 ou 5 et 6F11 avec IATS 11. Dans les derniers cas, la guérison était essentiellement complète, les animaux paraissant normaux 24 heures après l'attaque bactérienne. Dans des cas non-spécifiques, cependant, des souris présentaient des signes d'une infection 20 aigüe (c.a.d. diarrhée, paupières encroûtées, poil ébouriffé, profil "voûté et mouvements lents) durant plusieurs jours avant récupération d'un état normal.

Cette protection non-spécifique est apparemment due aux composants non-anticorps qui sont co-concentrés et 25 donc injectés aux animaux, puisque tous les animaux ayant reçu uniquement du STP mouraient..

En utilisant le même mode opératoire, une seconde expérience a été effectuée dans laquelle des groupes de souris ont été attaqués par les souches 30 Fisher 2, 3 ou 7, et les animaux ont été observés durant cinq jours. Comme indiqué dans le Tableau IV, l'anticorps ICI fournissait à nouveau une protection spécifique et significative contre une infection par ailleurs létale avec les immunotypes Fisher 3 et 7, 35 mais était inefficace contre l'immunotype Fisher 2.

i. 4 i 38

TABLEAU IV

Démonstration in vivo de 1'effet protecteur de 1'anticorps monoclonal humain ICI contre les immunotypes Fisher 3 et 7 5 Anticorps Nbre de survivants/nbre d'animaux attaqués monoclonal cinq jours après attaque par : humain_Fisher 3_Fisher 7_Fisher 2 ICI 10/10 10/10 1/I0a 6F11 0/10 7/10a 10/10 10 PBS 0/5 0/5 0/5

Survivance le plus vraisemblablement due à une protection non-spécifique comme décrit dans la note du Tableau III.

EXEMPLE V

15 L’Exemple V décrit un procédé pour la production d'un .anticorps, monoclonal humain .qui réagit avec les sérotypes IATS 4 et 11 et 1'immunotype Fisher 2 du Ρ_^ aeruginosa. Le procédé décrit dans les Exemples I-IV a été répété sauf qu'il a été nécessaire 20 de procéder à certaines modifications pour isoler, caractériser et contrôler l'anticorps décrit dans cet exemple. Les points suivants concernent les changements dans le mode opératoire, et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici.

25 La source des cellules B humaines était un ' individu précédemment immunisé avec une préparation de ’ polysaccharide à haut poids moléculaire, isolée à partir de 1'immunotype Fisher 3 (Pier, G.B., et al., Infec.. Immun. (1984) 45:309-313, qui est inséré ici à 30 titre de référence).

La transformation par entraînement de cellules du CMSPE a été réalisée par co-culture de ces cellules avec la lignée de cellules transformantes ψ 39 Λ Μ ι 1Α2. Les cellules 1Α2 en phase de croissance logarithmique ont été mises en suspension dans un milieu HAT et ensuite combinées avec le CMSPE- en un rapport de 15 cellules 1A2 par CMSPE-. Le mélange de cellules a 5 été placé dans 14 plaques pour microtitrage à une concentration de 62.000 cellules/alvéole dans un volume de 200 jil par alvéole. Les cellules ont été nourries 7 et 11 jours après le dépôt sur plaque et après 15 jours on a observé que 100 % des alvéoles 10 contenaient des cellules proliférantes.

Pour déceler la présence des anticorps anti-P. aeruginosa, on a utilisé deux plaques d'antigènes qui consistaient en : (1) un mélange d'immuno-types Fisher du P_^ aeruginosa 1 à 7 (A.T.C.C. no.

15 27312, 27313, 27314, 27315, 27316, 27317, 27318, respectivement); et (2) une plaque pour microtitrage traitée par PPL sans bactérie.

L'analyse des surnageants de culture par la méthode des exemples décrits plus haut conduisait à 20 l'identification d'environ 100 alvéoles qui contenaient des anticorps anti-P. aeruginosa réactifs vis-à-vis de la plaque avec les immunotypes Fisher 1-7, mais pas avec la plaque traitée au PLL qui était sans bactérie. Afin d'identifier le ou les immunotype(s) 25 Fisher reconnu(s), des plaques d'antigènes ont été réalisées comme ci-dessus et chaque rangée de ces plaques contenait des bactéries fixées par PLL d'un seul immunotype Fisher. Un TISLE a été réalisé comme décrit plus haut avec le surnageant de culture de 30 chacune des alvéoles positives d'anti-P. aeruginosa, disposées en forme d'une colonne sur les nouvelles plaques d'antigènes et il en a résulté l'identification d'un nombre d'alvéoles qui contenaient l'anticorps spécifique de 1'immunotype Fisher 2. Pour pour-35 suivre l'analyse de la spécificité sérologique des i r. i 40 anticorps anti-immunotype Fisher 2, les surnageants ont été testés dans un TISLE similaire sur des plaques d'antigènes réalisées pour contenir chacun des dix-sept sérotypes IATS du aeruginosa dans des alvéoles 5 séparées. Les résultats de ce test indiquaient que la grande majorité des surnageants était spécifique du sérotype IATS 11 bien qu'un surnageant, dans l'alvéole 6D6,présentait un schéma de réaction croisée spécifique sur les sérotypes IATS 4, 11, 13 et 14.

10 Afin de déterminer si le schéma réaction nel des anti-sérotypes IATS 4, 11, 13 et 14 était dû à un ou plusieurs anticorps dans l'alvéole 6D6, des fractions additionnelles du surnageant de l'alvéole 6D6 ont été indépendamment adsorbées avec des séro-15 types IATS 4, 7 (témoin négatif), 11, 13 et 14 et les surnageants adsorbés ont été ensuite testés sur des bactéries fixées par PLL de chacun des 5 sérotypes IATS suivant le test TISLE décrit ci-dessus. Les — adsorptions ont été réalisées en remettant en suspen-20 sion une boulette de cellules bactériennes agglomérées avec un volume égal de surnageant durant une demi heure sur de la glace, puis en séparant le surnageant des bactéries par centrifugation. Les résultats de ce test indiquaient que les sérotypes IATS 4 et 11 25 perdaient par adsorption l'activité anticorps l'un vis-à-vis de l'autre mais non vis-à-vis des sérotypes IATS 7, 13 ou 14. Ce fait démontrait la présence d'au moins deux anticorps anti-P. .aeruginosa différents dans l'alvéole 6D6, l'un d'entre eux au moins présen-30 tant une réaction croisée avec les sérotypes IATS 4 et 11.

L'isolement et le clonage des cellules appropriées produisant des anticorps hors de l'alvéole 6D6 ont été réalisés en trois étapes. La première 35 étape impliquait une sous-culture à faible densité de * % t 41 cellules à raison de 20 cellules/alvéole, et était suivie par une nouvelle étape de sous-culture à faible densité (5 cellules/alvéole), de cellules obtenues à partir d'une alvéole positive des anti-sérotypes IATS 5 4+11 qui avaient été générées dans la première étape à 20 cellules/alvéole de sous-culture à faible densité. Chaque étape de sous-culture a été réalisée sur des plaques comportant 96 alvéoles à fond rond à la densité mentionnée dans un volume total de 100 jul de HAT 10 exempt de composant aminoptérine (milieu HT). Des cellules lymphoblastoïdes HAT-sensibles, non-transfornantes, ont été introduites dans toutes les alvéoles à une densité de 500 cellules/alvéole, en tant que cellules d'alimentation. Quatre jours après 15 le dépôt sur plaque, 100 jul du milieu HAT ont été ajoutés dans toutes les alvéoles pour supprimer sélectivement les cellules d'alimentation. Les alvéoles ont ~ à nouveau été alimentées 9 jours après le dépôt sur plaque en remplaçant la moitié du surnageant par du 20 milieu HAT. Ensuite, les alvéoles ont été nourries de la même manière tous les 4-5 jours avec du milieu HT jusqu'à ce qu'il y ait une densité de cellules lympho-blastoïdes suffisante pour l'analyse du surnageant par TISLE comme décrit précédemment.

25 Dans chaque test, les surnageants qui étaient réactifs avec le sérotype IATS 4 étaient également réactifs avec le sérotype IATS 11 et l'immunotype Fisher 2. En outre, l'activité anticorps vis-à-vis des sérotypes IATS 13 et 14 avait disparu, confirmant 0: = : 30 ainsi les caractéristiques de spécificité déjà signalées .

Le clonage effectif des cellules produisant des anticorps spécifiques était réalisé en déposant d'abord les cellules à une très faible densité 35 (calculée 1/alvéole) dans des plaques à 72 alvéoles i * 42 /

Terasaki (Nunc #1-36538) dans un volume de 10 μΐ par alvéole. Les plaques ont été placées dans un incubateur pendant 3 heures pour permettre aux cellules de décanter sur le fond de la plaque, et ont été ensuite 5 évaluées microscopiquement par deux personnes différentes en ce qui concerne les alvéoles contenant une seule cellule. Chacune de ces cellules a été ensuite placée indépendamment dans les alvéoles d'une plaque à 96 alvéoles à fond rond en même temps que des cellu-10 les d'alimentation et a été cultivée comme décrit précédemment en ce qui concerne la sous-culture à faible densité. L'examen selon le mode opératoire TISLE ci-dessus a montré que les surnageants des clones produits étaient positifs en tant qu'anti-15 sérotypes IATS 4 et 11.

Par ces moyens, on a obtenu une lignée de cellules humaines transformées clonées qui présente une croissance continue (immortelle) et qui secrète un anticorps monoclonal humain réactif vis-à-vis de 20 1'immunotype Fisher 2 et présentant une réaction croisée avec les sérotypes IATS 4 et il. Dans cet exemple, la lignée de cellules et l'anticorps qu'elle produit portent la même dénomination (c.a.d. 16D6).

L'isotype de l'anticorps dans l'alvéole: 25 6D6 a été déterminé dans un test TISLE similaire aux tests de spécificité décrits plus hauts sauf que le RP-chèvre anti-IgG humain et le RP-chèvre anti-IgM humain ont été utilisés indépendamment comme réactifs de la seconde étape plutôt que d'être recombinés. La réac-30 tion positive de l'anticorps dans l'alvéole 6D6 avec 1'immunotype Fisher 2 et les sérotypes IATS 4 et 11 a été observée seulement avec le réactif anti-IgM, ce qui met.: en évidence un isotype IgM pour cet anticorps.

La caractérisation biochimique de l'espèce 35 moléculaire reconnue par l'anticorps 6D6 a été 43 accomplie au moyen d'une analyse par immuno-tache comme décrit dans l'Exemple III ci-dessus, sauf que les préparations de LPS à partir de 1'immunotype Fisher 2 et les sérotypes IATS 4 et 11 ont été choi-5 sies comme préparations d'antigènes pour l'analyse.

Une préparation LPS à partir de 1'immunotype Fisher 1 a été ajoutée en tant que témoin négatif.

Avant l'analyse, chacune des préparations LPS brutes a été diluée 1:1 dans un tampon de dissocia-10 tion (Tris 0,125M, dodécyl sulfate de sodium (DSS) à 4 % (p/v), glycérol à 20 % (v/v), ß -mercaptoéthanol à 10 % (v/v), bleu de bromophénol à 0,4 % (p/v), pH 6,8) et a été traitée dans un bain sonique durant 5 minutes. En vue de dégrader les protéines dans les échantillons, 15 du protéinase K (l mg/ml dans H^O) a été ajouté à chacun des échantillons dans un rapport enzyme à LPS de 40 % (p/p) et soumis à incubation à 60°C durant 2 heures avec une étape de traitement dans un bain sonique durant 5 minutes après 1 heure. Les échantil-20 Ions ont été ensuite chauffés à 100°C durant 5 minutes et puis centrifugés dans une microcentrifugeuse durant 2 minutes.

Des échantillons clarifiés représentant 10 μg de LPS provenant de chacune des souches bacté-25 riennes ont été soumis à électrophorèse sur gel poly-acrylamide DSS (EGPA-DSS) comme décrit ci-dessus.

Après transfert des espèces moléculaires séparées sur une MNC, les MNC ont ^été incubées durant 2 heures à température ambiante dans 10 ml de surnageant de cultu-30 re usée provenant de la lignée de cellules 6D6. Le reste du mode opératoire était comme décrit plus haut.

Des résultats positifs ont été observés seulement dans les traces qui contenaient 1'immunotype Fisher 2, le sérotype IATS 4 ou le sérotype. IATS 11 / .. 35 LPS. Dans les traces de l'immunotype Fisher 2 44 et du sérotype IATS 11, l'anticorps 6D6 reconnaissait une courte série de molécules à faible poids moléculaire régulièrement espacées (c.a.d. en forme d'échelle) qui correspondaient précisément aux formes courtes 5 des molécules LPS visualisées dans une EGPA-DSS sur gel effectuée de la même manière et dans laquelle les antigènes n'étaient pas transférés sur une MNC, mais étaient en fait spécifiquement colorés par la présence de LPS, sauf que la bande inférieure sur le gel coloré 10 à l'argent (représentant la région centrale plus : lipide A de LPS) n'était pas reconnue. Par contre, dans la bande contenant le sérotype IATS 4 LPS, l'anticorps 6D6 reconnaissait une série complète de bandes régulièrement espacées occupant pratiquement toute la 15 longueur du gel, avec la réaction la plus intense se produisant parmi les bandes à haut poids moléculaire.

A nouveau, ce profil correspondait à un réseau de __bandes en forme d'échelle observé sur le gel coloré spécifique pour le LPS (c.a.d. qu'ils apparaissaient 20 correspondre bande pour bande) sauf que la bande représentant le centre plus le lipide A n'était pas reconnue. Ces données indiquaient clairement que la chaîne 0-latérale du LPS était la cible moléculaire reconnue par l'anticorps 6D6 sur l'immunotype Fisher 25 2 et les sérotypes IATS 4 et 11.

Pour mettre en évidence la capacité de protection in vivo de l'anticorps 6D6, des études de protection animale ont été réalisées sur des souris.

L'anticorps 6D6 a d'abord été concentré à partir d'un 30 surnageant de culture usée par précipitation avec du sulfate d'ammonium saturé (50 % de concentration finale). La matière précipitée a été reconstituée dans un volume minimum d'eau stérile, dialysée de manière extensive en présence de PBS et filtrée de * 35 manière stérile. Comme témoin négatif, on a traité de 45 la même manière le surnageant d'une culture usée d'une autre lignée de cellules humaines transformées (C5B7-ATCC no. CRL 8753) produisant un anticorps monoclonal humain spécifique pour le LPS de 1'immunotype Fisher 1.

5 De la même manière, comme témoin positif, on a concentré le surnageant de culture usée d'une lignée de cellules humaines transformées 6F11 (A.T.C.C. no. CRL 8562) produisant un anticorps monoclonal humain spécifique pour le LPS de 1'immunotype Fisher 2 et le séro-10 type IATS 11. ·

Des souris femelles Swiss-Webster pesant entre 20 et 22 grammes ont été réparties en trois groupes de 20 souris chacun. A toutes les souris de chaque groupe, on a inoculé individuellement par voie 15 intrapéritonéale (ip) 0,5 ml d'anticorps concentrés 6D6, C5B7, 6F11. Après 6 heures, chacun des trois groupes a été subdivisé en quatre groupes de 5 souris et on a inoculé individuellement par voie ip à chacun des groupes de 5 souris 0,3 ml d'une suspension bacté-20 rienne vivante contenant 8 LD^ d'immunotype Fisher 1, immunotype Fisher 2, sérotype IATS 4 ou sérotype IATS 11, respectivement. Les suspensions bactériennes ont été préparées comme décrit dans l'Exemple IV. Après l'attaque bactérienne, les animaux ont été observés 25 durant une période de 5 jours. Les résultats étaient l les suivants : * 46

' TABLEAU V

Démonstration in vivo de l'effet protecteur de l'anticorps monoclonal humain 6D6 contre l'immunotype Fisher 2 et les sérotypes IATS 4 et 11 5 Anticorps Nombre de survivants/nombre d'animaux monoclonal testés 5 jours après attaque par : humain_Fisher 1_Fisher 2_IATS 4_IATS 11 6D6 0/5 5/5 4/5 5/5 6F11 0/5 5/5 0/5 5/5 10 C5B7 5/5 1/5 0/5 0/5

Comme indiqué au Tableau V, l'anticorps 6D6 fournissait une protection spécifique et significative contre une attaque létale de l'immunotype Fisher 2, le sérotype IATS 4 et le sérotype IATS 11, mais pas 15 contre l'immunotype Fisher 1.

EXEMPLE VI

L'ExempleVI présente un procédé pour la production d'un anticorps monoclonal humain réagissant avec les sérotypes IATS 6 et 13 et 1'immunotype Fisher 20 1 du Pj_ aeruginosa. On a répété le procédé décrit dans les Exemples I à V, sauf qu'il a été nécessaire : .

d'apporter certaines modifications pour isoler, caractériser et tester l'anticorps décrit dans cet Exemple. Ce qui suit concerne les changements dans les modes 25 opératoires et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal décrit ici.

La source des cellules B humaines était un individu précédemment immunisé par une préparation de polysaccharide à haut poids moléculaire isolée à 30 partir de l'immunotype Fisher 2 (Pier et al., Infec. Immun., 34:461 (1981)). Après avoir recueilli le CMSPE-, comme décrit plus haut, les> cellules ont été congêlées dans du SFV contenant 10 % de DMSO (v/v) 1 -. * 47 dans un réservoir à vapeur à azote liquide. Ces cellules ont été ensuite dégelées rapidement jusqu'à 37°C, lavées une fois dans un milieu Iscove et remises en suspension dans un milieu HAT. La transformation par 5 entraînement de cellules a été effectuée avec un rapport de 15 cellules 1A2 par CMSPE-. Le mélange de cellules a été déposé dans 20 plaques de microtitrage avec une concentration de 78.500 cellules/alvéole. Les cultures ont été nourries tous les 3-5 jours après le 10 dépôt sur plaque et au onzième jour on a observé que 100 % des alvéoles contenaient des cellules proliférantes .

Pour analyser les surnageants du point de vue de la présence des anticorps anti-P. aeruginosa 15 en utilisant la technique TISLE, la plaque d'antigène consistait en un mélange d'immunotypes Fisher 1-7 de P. aeruginosa (produit isolé clinique PSA 1277 (Gene-tic Systems Corporation Organism Bank ("GSC0B")), ATCC 27313, PSA G98 (GSC0B), ATCC 27315, PSA F625 20 (GSC0B), ATCC 27317 et ATCC 27318, respectivement).

Une plaque pour microtitrage traitée par PLL sans bactérie a également été utilisée pour l'analyse.

L'analyse des surnageants de culture par la méthode ci-dessus a conduit .à l'identification 25 d'approximativement 200 alvéoles qui contenaient des anticorps anti-P. aeruginosa réactifs avec la plaque d'immunotypes Fisher 1-7, mais pas avec la plaque traitée avec PLL et exempte de bactérie. Afin d'identifier les alvéoles qui contenaient un anticorps réactif 30 avec deux sérotypes IATS ou plus, des plaques d'antigènes ont été préparées,comme plus haut, dans lesquelles une colonne de plaques contenait des bactéries fixées par PLL d'un seul sérotype IATS. Un TISLE a été réalisé, comme présenté plus haut, avec le surnageant 35 de culture étendue de chacune des alvéoles positives i 48 * , * anti-P. aeruginosa. Les surnageants ont été disposés en une rangée sur les nouvelles plaques d'antigènes ce qui a permis l'identification d'un certain nombre d'alvéoles qui contenaient un anticorps réactif avec' 5 de multiples sérotypes IATS. Une alvéole, désignée par 8H7, contenait des anticorps spécifiques pour les sérotypes IATS 6 et 13. Quand le surnageant de cette alvéole a été testé par TISLE sur les 7 immunotypes Fisher, comme dans l'Exemple V, on a démontré que les 10 anticorps de 8H7 étaient spécifiques pour 1'immunotype Fisher 1.

Afin de déterminer si le schéma réactionnel des sérotypes 6 et 13 anti-IATS était dü à un ou plusieurs anticorps dans l'alvéole 8H7, des fractions 15 additionnelles de surnageant ont été adsorbées indépendamment avec des sérotypes IATS 6, 13 et 17 (témoin négatif), et les surnageants adsorbés ont été ensuite testés sur des bactéries fixées par PLL de chacun des trois sérotypes IATS suivant le test TISLE décrit plus 20 haut. Les résultats indiquaient que les sérotypes IATS 6 et 13 perdaient par adsorption 1'activité anticorps l'un vis-à-vis de l'autre. Le sérotype IATS 17 ne perdait par adsorption aucune activité vis-à-vis des IATS soit 6 ou 13. Ces.données démontraient que le 25 schéma réactionnel des anti-sérotypes IATS 6 et 13 était dû à un seul anticorps de l'alvéole 8H7.'. .

L'isolement et le clonage des cellules produisant l'anticorps à partir de l'alvéole 8H7 ont été accomplis en trois étapes, essentiellement comme 30 décrit dans l'Exemple V plus haut. Par ces moyens, on a produit une lignée de cellules humaines transformées clonées qui croît continuellement (immortelle) et qui secrète un anticorps monoclonal humain réactif avec 1'immunotype Fisher 1 et à réaction croisée avec les » 35 sérotypes IATS 6 et 13. Dans cet exemple, la lignée 1 , * 49 de cellules et l'anticorps qu'elle produit portent la même désignation 8H7. En utilisant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'Exemple V, l'isotype de l'anticorps dans l'alvéole 8H7 a été déterminé 5 comme étant IgM.

La caractérisation biochimique de l'espèce moléculaire reconnue par l'anticorps 8H7 a été effectuée par une analyse d'immuno-taches comme décrit dans les Exemples III et V ci-dessus, sauf que les préparait) tions LPS à partir de 1'immunotype Fisher 1 et des sérotypes IATS 6 et 13 ont été choisies comme préparations d'antigènes pour l'analyse. Une préparation LPS à partir du sérotype IATS 10 a été incluse en tant que témoin négatif.

15 L'analyse des immuno-taches résultantes montrait des résultats positifs uniquement dans les traces de MNC qui contenaient 1'immunotype Fisher 1, le sérotype IATS 6 ou le sérotype IATS 13 LPS. Dans les traces de 1'immunotype Fisher 1 et du sérotype 20 IATS 6, l'anticorps 8H7 reconnaissait une série de bandes régulièrement espacées (c.a.d. en forme d'échelle), s'étendant pratiquement sur toute la longueur du gel. Ces bandes correspondaient précisément avec les formes à poids moléculaires multiples des molécules 25 LPS, comme visualisé dans une EGPA-DSS sur gel effectuée de la même manière et dans laquelle les antigènes n'étaient pas transférés sur une MNC, mais étaient en fait spécifiquement colorés par la présence de LPS.

Dans la bande contenant le sérotype IATS 13 LPS, 30 l'anticorps 8H7 reconnaissait une série plus courte de bandes régulièrement espacées confinées dans la zone des poids moléculaires moyens à supérieurs du gel. A nouveau, les bandes qui étaient reconnues correspondaient par leur position à celles observées sur un gel 35 coloré spécifique pour le LPS, sauf que les formes de ' Μ 50 ι poids moléculaires les plus faibles et les plus élevés du LPS dans le gel coloré ne semblaient pas être bien reconnues dans la tache Western. Ces données indiquaient clairement que le LPS était la cible moléculaire 5 reconnue par l'anticorps 8H7 sur l'immunotype Fisher 1 et les sérotypes IATS 6 et 13.

Pour mettre en évidence la capacité de protection in vivo de l'anticorps 8H7, des études de protection animale ont été réalisées sur des souris, 10 comme décrit dans les Exemples IV et V plus haut. En tant que témoin négatif, on a traité de la meme manière le surnageant d'une culture usée provenant d'une autre lignée de cellules humaines transformées (6F11-ATCC no. CRL 8652), produisant un anticorps monoclonal 15 humain spécifique pour le LPS de l'immunotype Fisher 2. En tant que contrôle positif, on a utilisé le surnageant d'une culture usée provenant d'une lignée C5B7 de cellules humaines transformées (ATCC no. CRL 8753), produisant un anticorps monoclonal humain spécifique 20 pour le LPS de 1'immunotype Fisher 1 et le sérotype IATS 6.

Des souris femelles Swiss-Webster pesant entre 20 et 22 grammes ont été réparties en trois groupes de 30 souris chacun. A toutes les souris de 25 chaque groupe, on a inoculé individuellement par voie intrapéritonéale (ip) 0,5 ml d'anticorps concentrés 8H7, 6F11 ou C5B7. Après quatre heures, chacun des trois groupes a été subdivisé en trois groupes de 10 souris et on a inoculé individuellement par voie ip 30 à chaque membre de chaque groupe de 10 souris 0,3 ml d'une suspension bactérienne vivante contenant 9,4 LDgQ d'un produit isolé clinique (A522) représentant le sérotype IATS 6 (équivalent à l'immunotype Fisher l), 5 LDj-q du sérotype de référence* IATS 13 ou 10 LD5q 35 du sérotype de référence IATS 11 (équivalent à *· , ^ 51 l'immunotype Fisher 2). Les suspensions bactériennes ont été préparées comme décrit plus haut dans l'Exemple IV. Après l'attaque bactérienne, les animaux ont été observés durant une période de 5 jours. Les 5 résultats étaient les suivants.

TABLEAU VI

Démonstration in vivo de l'effet protecteur de l'anticorps monoclonal humain 8H7 contre les sérotypes IATS 6 et 13 10 Anticorps Nombre de survivants/nombre testés monoclonal cinq jours après attaque avec : humain_IATS 6 IATS 13 IATS 1,1_ 8H7 9/10 6/10 1/10 C5B7 9/10 0/10 0/10 15 6F11 0/10 2/10 10/10

Comme indiqué au Tableau VI, l'anticorps 8H7 fournissait une protection spécifique et significative contre une attaque létale du sérotype IATS 6, mais pas contre le sérotype IATS 11. La protection contre le sérotype 20 IATS 13 existait à un degré moindre mais peut être expliquée par le nombre relativement élevé d'organismes requis pour atteindre la LD^-q pour ce produit isolé par comparaison au produit isolé sérotype 6 (3 x ÎO unités de formation de colonie et 2,6 x 10 unités 25 de formation de colonie, respectivement). Dans une ; expérience distincte, l'anticorps 8H7 protégeait cinq souris sur cinq attaquées par 3,5 LD5Q de produit isolé IATS 13 et cinq souris sur cinq attaquées par le produit isolé IATS 6.

30 De ce qui précède, on notera que les lignées de cellules de la présente invention fournissent des anticorps monoclonaux humains et leurs fragments à réaction croisée pour et à protection croisée *' * 52 contre divers sérotypes IATS_-.de aeruginosa. Ceci permet un développement plus aisé de compositions prophylactiques et thérapeutiques qui peuvent être efficaces contre des infections dues à la plupart, 5 sinon toutes, des souches de aeruginosa. De plus, les lignées de cellules fournissent des anticorps qui peuvent être utilisés dans des immuno-tests et dans d'autres modes opératoires bien connus.

Bien que la présente invention ait été 10 décrite de manière détaillée au moyen d'illustrations et d'exemples, à des fins de clarté et de compréhension, il est bien évident que certains changements et modifications peuvent être apportés dans le cadre des revendications en annexe.

15 En utilisant les anticorps selon la présente invention comme anticorps bloquants dans les opérations de tri, selon des procédures bien connues des spécialistes, on parvient à isoler facilement des anticorps mono-clonaux supplémentaires qui reconnaissent les mêmes 20 épitopes ou déterminants antigènes.

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Claims (42)

1. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal humain ou un de ses fragments liants capables de se lier spécifiquement à plusieurs (mais non à tous les) sérotypes IATS du

2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps est protecteur in vivo contre au moins deux sérotypes IATS

3. Composition suivant la revendication 1, 10 caractérisée en ce que l'anticorps est non-réactif avec chacun des immunotypes Fisher du Pseudomonas aeruginosa.

4. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps réagit avec un 15 immunotype Fisher du Pseudomonas aeruginosa.

5. Composition suivant la revendication 1, caractérisée-on ce que l'anticorps est capable de réagir avec deux ou plusieurs immunotypes Fisher du Pseudomonas aeruginosa.

5 Pseudomonas aeruginosa.

6. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une composition suivant n'importe laquelle des revendications 1-5 et un porteur physiologiquement acceptable.

7. Procédé pour le traitement d'un patient 25 humain sujet à bactérémie ou à tout autre état maladif provoqué par le Pseudomonas aeruginosa, caractérisé en ce qu'on administre à ce patient une dose thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'une composition suivant les revendications 1-5. 30

'8. Lignée de cellules transformée immortelle, caractérisée en ce qu'elle secrète un anticorps monoclonal humain réagissant spécifiquement avec moins que tous les sérotypes IATS du Pseudomonas aeruginosa, mais avec au moins deux. - 1 » 54

9 Lignée de cellules suivant la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est désignée par A.T.C.C. no. CRL 8941, 9171 ou 9258.

10. Anticorps monoclonal humain caractérisé en 5 ce qu'il est réactif avec un épitope qui réagit avec un anticorps monoclonal produit par une lignée de cellules suivant la revendication 8.

11. Kit pour utilisation dans la détection de la présence du Pseudomonas aeruginosa, caractérisé en 10 ce qu'il comprend une composition d'anticorps monoclonaux contenant au moins un anticorps monoclonal humain, cet anticorps réagissant avec moins que tous les sérotypes IATS du Pseudomonas aeruginosa, mais avec au moins deux, et des marqueurs fournissant un signal 15 détectable liés par covalence aux anticorps ou liés à des seconds anticorps réagissant avec chacun des anticorps monoclonaux.

12. Composition pharmaceutique utile pour le traitement ou la prévention d'infection par Pseudomo- 20 nas aeruginosa, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal humain protecteur contre au moins deux sérotypes IATS du -Pseudomonas aeruginosa en combinaison avec un agent antimicrobien, une fraction de gamma globuline provenant d'immunoglobuline de 25 plasma sanguin humain et/ou un porteur physiologiquement acceptable.

13. Procédé de détermination de la présence du Pseudomonas aeruginosa dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on combine l'échantillon avec un anticorps monoclonal réactif avec au moins deux sérotypes IATS du Pseudomonas aeruginosa et détecte la formation diun complexe. V . ' » 55

14. Procédé de fabrication d'une composition 1 pharmaceutique utile pour le traitement ou la prévention d'une infection par Pseudomonas aeruginosa, caractérisé en ce qu'on mélange au moins deux anti- 5 corps monoclonaux humains, au moins l'un de ces anticorps étant protecteur contre au moins deux sérotypes IATS du Pseudomonas aeruginosa, avec un agent antimicrobien, une fraction de gamma globuline provenant de plasma sanguin humain, et/ou un porteur physiologi-10 quement acceptable.

15. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que l'anticorps est protecteur in vivo contre trois sérotypes IATS.

16. Composition suivant la revendication 1, 15 caractérisée en ce que l'anticorps est capable de se lier à deux ou trois sérotypes IATS.

17. Composition suivant la revendication 16, caractérisée en ce que l'anticorps est protecteur in vivo contre au moins deux sérotypes IATS.

18. Composition suivant la revendication 5, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de réagir avec trois sérotypes IATS.

•19. Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce que l'anticorps est protecteur 25 in vivo contre au moins deux sérotypes IATS et un immu-notype Fisher.

20. Composition suivant la revendication 5, caractérisée en ce que l’anticorps est protecteur in vivo contre au moins deux sérotypes IATS et au moins 30 deux immunotypes Fisher.

21. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps monoclonaux humains, au moins un de ces anticorps étant capable de réagir de manière spécifique avec les déterminants de lipopoly- t*· ^ V. 56 ! saccharides accessibles présents sur moins que tous, mais sur au moins deux sérotypes IATS du Pseudomonas aeruginosa.

22. Composition suivant la revendication 21, 5 caractérisée en ce qu'au moins un des anticorps est protecteur in vivo contre deux ou plusieurs sérotypes IATS.

23. Composition suivant la revendication 21, caractérisée en ce que l’anticorps est protecteur in 10 vivo contre trois sérotypes IATS.

24. Composition suivant la revendication 21, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de se lier à trois sérotypes IATS.

25. Composition suivant la revendication 21, 15 caractérisée en ce que l'anticorps est non-réactif avec chacun des immunotypes Fisher.

26. Composition suivant la revendication 21, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de réagir avec un immunotype Fisher du Pseudomonas 20 aeruginosa.

27. Composition suivant la revendication 21, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de réagir avec deux ou plusieurs immunotypes Fisher.

28. Composition suivant l'une quelconque des 25 revendications 25, 26 ou 27, caractérisée en ce que l'anticorps est protecteur in vivo contre les sérotypes IATS et les immunotypes Fisher.

29. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps ou un de ses fragments 30 liants, cet anticorps ou son fragment étant capable de réagir de manière spécifique avec plusieurs (mais non tous les) sérotypes IATS et moins ou plus d'un immunotype Fisher du Pseudomonas aeruginosa.

30. Composition suivant la revendication 29, » 35 caractérisée en ce que l'anticorps ou son fragment est - * * 57 / capable de réagir avec au moins trois sérotypes IATS du Fseudomonas aeruginosa.

31. Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que l'anticorps ou son fragment est 5 capable de réagir avec au moins deux immunotypes Fisher du Pseudomonas aeruginosa.

32. Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de fournir une protection In vivo contre au moins deux 10 sérotypes IATS et au moins deux immunotypes Fisher.

33. Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que l'anticorps réagit avec des sérotypes IATS 2, 5 et 16 et des immunotypes Fisher 3 et 7.

34. Composition caractérisée en ce qu'elle com prend un anticorps ou un de ses fragments, cet anticorps ou son fragment étant capable de se lier de manière spécifique avec plusieurs (mais non tous les) sérotypes IATS et un immunotype Fisher du' Pseudomonas 20 aeruginosa.

35. Composition suivant la revendication 34, caractérisée en ce que l'anticorps ou son fragment est capable de se lier à deux sérotypes IATS.

36. Composition suivant la revendication 34, 25 caractérisée en ce que l'anticorps est capable de protection in vivo contre au moins deux sérotypes IATS et un immunotype Fisher.

37. Composition suivant la revendication 34, caractérisée en ce que l'anticorps réagit avec les 30 sérotypes IATS 4 et 11 et 1'immunotype Fisher 2.

38. Composition suivant la revendication 34, caractérisée en ce que l'anticorps réagit avec les sérotypes IATS 6 et 13 et 1'immunotype Fisher 1.

39. Composition pharmaceutique caractérisée 35 en ce qu'elle comprend une composition suivant l'une t * ► * 58 quelconque des revendication^ 15 à 38 et un porteur physiologiquement acceptable.

40. Composition pharmaceutique suivant la revendication 12, caractérisée en ce que la fraction 5 de gamma globuline provenant d'immunoglobuline de plasma sanguin humain est obtenue à partir d'êtres humains présentant des taux élevés d'immunoglobulines réactives avec la bactérie Pseudomonas aeruginosa et/ou ses composants antigènes.

41. Composition suivant la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un anticorps monoclonal réagissant avec le flagelle du Pseudomonas aeruginosa ou.1'Exotoxine A.

42. Procédé de traitement d'un être humain 15 sensible aux infections du Pseudomonas aeruginosa, caractérisé en ce qu'il comprend; l'administration a cet être humain d'une quantité prophylactique ou thérapeutique d'un anticorps monoclonal capable de se lier aux déterminants de lipo-20 polysaccharides d'au moins deux sérotypes IATS du Pseudomonas aeruginosa en combinaison avec un ou plusieurs des constituants suivants : une quantité prophylactique ou thérapeutique d'un anticorps monoclonal capable de réagir avec le flagelle du Pseudomonas aeruginosa ou 25 1'Exotoxine A ; un anticorps monoclonal capable de réagir avec au moins un déterminant de sérotype supplémentaire sur une molécule de lipopolysaccharide du Pseudomonas aeruginosa ; une fraction de gamma globuline de plasma de sang humain ; une fraction de gamma globu-30 line d'un plasma de sang humain présentant des taux élevés d'immunoglobuline capable de réagir avec le Pseudomonas aeruginosa et/ou ses produits ; ou un agent antimicrobien. *