JPS63500035A

JPS63500035A - プソイドモナス　アエルギノサ　外毒素ａに対する保護用ヒトモノクロ−ナル抗体

Info

Publication number: JPS63500035A
Application number: JP61503371A
Authority: JP
Inventors: シアダク，アントニー　ダブリュ; ロストロム，マーク　イー
Original assignee: ジエネテイツク　システムズ　コ−ポレイシヨン
Priority date: 1985-06-06
Filing date: 1986-06-02
Publication date: 1988-01-07
Also published as: ZA864196B; FI870482A0; ES555741A0; NO174003B; EP0229107A4; HUT42135A; ES8707296A1; NO870457L; IE861494L; DK59387A; DK59387D0; EP0229107A1; WO1986007382A1; NO174003C; IL79010A0; AU6658390A; HU205630B; FI870482A; AU5991786A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１７、ハイブリット細胞系である請求の範囲第１６項記載の細胞系。

１８、エプスタイン−パールウィルスにより形質転換されたＢリンパ球である請求の範囲第１６項記載の細胞系。

１９、＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，取得番号ＣＲＬ　、８８３３又はＣＲＬ　８８３４の１つである請求の範囲第１８項記載の細胞系。

２０、プソイドモナス　アエルギノサ外毒素Ａに対して特異的な及びその毒素効果を阻止することができるヒトモノクローナル抗体を産生ずる方法であって、請求の範囲第１９項記載の細胞系の少なくとも１つを培養し、そして前記抗体を回収することを含んで成る方法。

２１、画面症及び／又は敗血症に感染しやすいヒトを治療するための方法であって、請求の範囲第２０項に従って産生されたモノクローナル抗体の予防量又は治療量を前記ヒトに投与することを含んで成イドモナス　７ｚルギノサ外毒素Ａの毒性効果を中和することができるヒトモノクローナル抗体の予防量又は治療量、並びに１又は複数の次の物質の量：すなわち、プソイドモナ衣アエルギノサのリボ多糖分子上で血清型抗原決定基と反応することができるヒトモノクローナル；ヒト血漿からのγグロブリン画分；フッイドモナス　アエルギノサ及び／又はその生成物と反応性の高レベルの免疫グロブリンを示すヒト血漿からのγグロブリン画分；又は殺菌剤の予防量又は治療量を前記ヒトに投与することを含んで成る方法。

明　細　書プソイドモナス　アエルギノサ　外毒素Ａに対する保護用ヒトモノクローナル抗体発明の分野本発明は、一般的に、ヒトにおける細菌感染に関連する問題へのモノクローナル抗体技法の適用；及びより詳しくは、プソイドモナス　アエルギ右むぜ？迎ｏｍｏｎａｓ　牲匡ｉ肥且）外毒素Ａに対して特異的な及びその毒性効果を中和することができるヒトモノクローナル抗体の産生のために適切な細胞系の単離に関する。

発明の背景過去３０年間にわたって、潜在的に致命的な、ヒトにおける細菌の感染の型が、新規の殺菌剤の発見及び広範囲にわたる使用と共に明らかに、劇的に変化して来た。プソイドモナみ　アエルギノサによって引き起こされる潜在的に致命的な感染度は、免疫化されたヒト患者、すなわち、血液悪性、固形腫瘍、広範な熱傷、等を有する患者のために特に問題である。実に、広範囲の抗体を受ける、又はコルチコステロイド、細胞毒性薬物又はヒト防御機構に有害的に影響を及ぼす他の原因物質による治療を受ける病院の患者は、プソイドモナスアエルギノサに感染しやすい。プソイドモナス感染の持続された流行及び重大さは、利用できる治療法の有効性を限定する〔＾ｎｄｒｉｏｌｅ　、　Ｖ、　、　Ｊ、Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｈｅｄ、（１９７９）　９４　：　１９６〜１９９を参照のこと〕。

プソイドモナス　アエルギノサに関連される毒性は、多くの細菌生成物の結果であると思われる。外側の細胞膜は、一連の毒性特性を示すリボ多糖（内毒素）を含む。また、細菌は、その病原性を付与することができる多くの細胞外生成物、並びに溶血素、プロテアーゼ及び他の細胞外酵素を産生ずる。

これらの細胞外酵素のうちの２種、すなわち外毒素Ａ及び細胞外酵素Ｓは、ジフテリア毒素フラグメントＡのために以前見出されたものに類似して、アデノシンジホスフェートリボシルトラスフェラーゼ活性を表わすことによって真核性タンパク質合成の阻害を表わすことが示された。特に、プソイドモナス　アエルギノサ外毒素Ａは、次の反応式：％式％〔式中、ＮＡＤはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであり、ＥＦ−２はタンパク質合成の延長因子２であり、そして八ＤＰＲはアデノシンジホスフェートリボシルである〕に従って延長因子２（ＥＦ−２）上へのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのアデノシン５′−ジホスフェートリボシル成分のトランスファーを触媒することが示されている。得られた＾ＤＰＲ−ＥＦ−２複合体は、もはや真核性タンパク質合成において正しく機能することはできない（すなわち、天然のＥＦ−２として）。ＥＦ−２は、ポリペプチドアセンブリーの延長段階で作用することによってタンパク質合成において決定的な役割を与えるので、真核性タンパク質合成は効果的に阻害される（　ＩｇｌｅＩＩＩｓｋｉ　、　Ｂ、ａｎｄ　Ｋａｂａｔ　、　Ｄ、　、“プソイドモナス　７−ｒ−ｔｖｗ毒素によるタンパク質合成のＮＡＤ−依存性阻害″（”ＨＡＤ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｒ＋ｔｈｅｓｉｓ　ｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｔｏｘｉｎ　、　”）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾９（１９７５）荏：　２２８４〜２２８８を参照のこと〕。

研究は、６０ｎｇはどの少量の精製された外毒素Ａがマウスに対して致死的であり、そして同様に少量が他の哺乳類に対しても致死的であることを示した（　Ｐｏｌ　１ａｃｋ　、　Ｍ、など、、′ヒト血清における７’／−４トモナス　アエルギノサ外毒素に対する中和性抗体：感染の間、インビボでの毒素産出についての形跡″（“ＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　７Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒａ　：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　ＴｏｘｉｎＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ＤｕｒｉｎＢ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　、”）、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ、（１９７６）１４　：　９４２〜９４７〕。また、外毒素Ａの産生が、ヒト感染から単離された臨床用プソイドモナス　アエルギノサ株の８５〜９０％に示された［　Ｂｊｏｒｎ　、　Ｍ、など、、“プソイドモナス種による外毒素産出度、”　（” Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｅｃ　ｉ　ｅｓ　、　”　）　狽ｔ、■ｒｎｍｕｎ、（１９７７）　１６　：　３６２ゝ３６６）　、さらに、抗−外毒素Ａ活性が、旦よ１手ルギノサ感染から回復したヒト及び他の動物の血清中に観察された（　Ｐｏｌ　１ａｃｋ　、　Ｍ、など、（１９７６））　、そして、高い急性血清抗毒素力価が旦ユアエルギノサ感染によるヒトの生存に関係した。

（Ｐｏｌｌａｃｋ　、　Ｍ、ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｌ、、”ヒトにおけるブソイドモナスアエルギノサ敗血症の徴候での外毒性Ａ及びリボ多糖に対する抗体の保護活性、　”（”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　八ｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｔ　ｔｈｅ　０ｎｓｅｔ　ｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ　ｉｎ　Ｍａｎ　、　”　）　Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、（１９７９）咬：２７６〜２８６）　。

これらの及び追加の理由のために、外毒素Ａは、ヒト互イードモナス　アエルギノサ感染において中心の役割を演じていると推定される。従って、４７　■での外毒素Ａの効果を中和する方法が、そのような感染を制御する可能な手段として研究されて来た。

外毒素Ａの中和の１つの方法は、特異的抗体の使用を通して行なわれる。ウサギ抗−外毒素Ａの受身保護効果が、ひどい火傷及び続く致死的なＰ、二三必ぞＡ力感染を行なうマウスモデルにおいて研究されて来た。外毒素Ａは火傷を与えられ、感染されたマウスの死亡率に影響を与え、そして生存率はウサギ抗毒素血清の受身投与によって増大されたことを、データは示した（Ｐａｖｌｏｖｓｋｉｓ　、　Ｏ，など、、“実験的なプソイドモナス　アエルギノサ火傷感染における抗 −外毒素Ａによる受身保護、″（“Ｐａ５ｓｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ａｎｔｉ−ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　７　Ｂｕｒｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　、　”＞Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋ｎｎｕｎ、（１９７７）１８　：　５９６〜６０７）　。

外毒素Ａと反応性のネズミモノクローナル抗体が゛また、調製され、そして動物に試験されて来た（Ｇａｌｌｏｕ＋ａｙ、Ｄ、など、。

“″プソイドモナス　アＡ謁に彦−仁丈一からの外毒素Ａに対するモノクローナル抗体の産生及び特徴化、′（“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ＾ｆｒｏｍ　Ｐｓｅｕｄｏｎｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、”）Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｍ、（１９８４）４４：２６２〜２６７）　、この報告において、いくらかのマウスモノクローナル抗体が、４＞　ヒドロで外毒素Ａを中和することができることが報告され、そして火傷を与えられ、旦ユテ毛七玉／？により感染されたマウスモデルにおいて、伝えられるところでは、生存率を上昇せしめた。

もちろん、マウスモノクローナル抗体は、マウスを処理するのに多分、有用であるが、ヒトへの適用のため鞍は主な問題を与える。ヒト免疫系は、外来性物質としていづれのマウスモノクローナル抗体をも一般的に認識すると思われ得る。

少なくとも、この認識は、促進されたマウス抗体の除去を導びき、その治療可能性を弱める（Ｌｅｖｙ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｒ，、“モノクローナル抗体による腫瘍治療、”（”Ｔｕｍｏｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈＮｏｎｏｃｌｏｎａＩ　八ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、”　）Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃバ１９８３）４２　二　２６５０〜２６５６を参照のこと〕、さらに詳しくは、ネズミタンパク質に対する免疫反応は、゛′血清病”に類似する、特にアレルギー反応によって引き起こされるショック及びさらに死をもたらす。臨床試験は、そのようなヒト免疫系反応が種々の腫瘍の治療のためにマウスモノクローナルを受ける患者のおよそ半分において、マウスモノクローナルの有効性を限定したことを示した（Ｓｅａｒｓ、Ｈ，など、、゛胃腸腫瘍の治療におけるモノクローナル抗体のフェースＩ臨床実＠”、　（”Ｐｈａｓｅ　Ｉ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｔｒｉａｌｏｆ　Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇａ５ｔｒｏ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＴｕｍｏｒ、”）Ｌａｎｃｅｔ（１９８２）１　：　７６２’〜７６４　：及びＭｉｌｌｅｒ　Ｒ，＾、など、。

“Ｔ−細胞リンパ腫を有する７人の患者におけるモノクローナル抗体治療試験、パ（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｙ　ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＴｒｉａｌｓ　ｉｎ　５ｅｖｅｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｕ＋ｉｔｈ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ、”　）　Ｂｌｏｏｄ（１９８３）牲：９８８〜９９５〕。従って、ネズミモノクローナルは、ヒトにおける受動免疫のために最小に有用であることが予期されるであろう。

従って、外毒素Ａに結合し、そしてそれを中和することができるモノクローナル抗体、及びヒトに対して最小に免疫原性である抗体のための必要性が存在する。

また、そのようなモノクローナル抗体及びＰ、７Ｘ）Ｉ、−／ｉ感染の治療に有用な組成物の製造方法が必要である０本発明はこれらの必要性を満たす。

発明の要約本発明は、プソイドモナス　１舌ルｊノ」フト毒素Ａの毒性効果を中和することができるヒトモノクローナル抗体、及びそのような抗体を製造する方法を提供する。これらのヒトモノクローナル抗体は、プソイドモナス　７Ｘｌｋ　／　、感染に対する受動免疫に有用である。

より詳しくは、本発明は、外毒性Ａと特異的に反応し、そしてそれを中和することができる、少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体を含んで成る組成物（該組成物はまた、好ましくは、生理学的に許容できる担体を含む）の予防量又は治療量の投与によって、画面症及び／又は敗血病に感染しやすいヒトを治療するための方法を提供する。前記組成物は、１又はそれよりも多くの次のものを含むが、但しそれだけには限定されないニブソイトモナス　アＪＪレギノサのリボ多糖上で血清型抗原決定基と反応することができる第二ヒトモノクローナル抗体；ヒト血漿からのγグロブリン画分；プソイドモナス　乙入必荒ｌ力及び／又はその生成物と反応性の高レベルの免疫グロブリンを示すヒトから得られた、ヒト血漿からのγグロブリン画分；及び１又はそれよりも多くの殺菌剤。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、細胞系、たとえばエプスタイン−バールウィルスによる形質転換によって不滅にされたヒトリンパ球細胞系によって産生され得る。次に、そのような細胞は、培養され、そして既知方法によってヒトモノクローナル抗体が回収され得る。

本発明の他の特徴及び利点は、本発明を例によって記載する次の詳しい説明から明らかにな゛るであろう。

図面の簡単な説明第１図は、本発明の２種の異なったヒトモノクローナル抗体のイムノプロット分析であり、そして特定のウサギ抗−外毒素Ａ抗体によって認識される７１．０００ドルトン分子の結合によって示されるように、これらの抗体が外毒素Ａを認識するイドモナス　アエルギノサの７種のフィシャー免疫型のそれぞれによって産生された外毒素Ａと反応することを示すイムノプロットである。

特定のＢ様の説明本発明に従って、プソイドモナス　アエルギノサ外毒素Ａに対して特異的且つ、その毒性効果を中和することができるヒトモノクローナル抗体の産生及び使用のための方法が提供される。今後使用する場合、用語“中和する”とは、たとえば細胞毒性阻害アッセイ、外毒素Ａの致死投与量に対しての哺乳類の保護、等によって明らかであるように、外毒素Ａの毒性効果の減少及び好ましくは除去をもたらすいづれかの反応（抗体、臨床的な、物理的な又は同様のもの）の結果に関する。

ヒトモノクローナル抗体は、画面症及び／又は敗血症に感染しやすい徴候を示すヒト宿主に受動免疫のために投与され得る。そのような治療のために補助療法として与えられる場合、モノクローナル抗体は、プソイドモナス　Ｉ」≧ヤＡ５々ブー又は他のグラム陰性細菌のリボ多糖分子上で血清型の抗原決定基に対して特異的ヒトモノクローナル抗体；ブソイドモナスアエルギノサと反応性の高レベルら免疫グロブリンを示すヒトのために得られた、ヒト血漿がらのγグロブリン画分；及び種々の殺菌剤と共に特定の実用性を有する。

ヒトモノクローナル抗体は、好ましくは、ブソイドモナスアエルギノサ怒染に暴露された、及びその感染に対する強い免疫反応を進展されたヒト供与体から得られたＢ−リンパ球細胞によって産生される。他方、ヒト宿主は既知の技法に従って、外毒素Ａ又は他の適切な抗原により感作され〔たとえ免疫グロブリン及びワクチンの制御試験、”（”Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｔｒｉａｌの血液が集められる。典型的には、その宿主は、１週間隔で皮下にワクチン投与され、そして最後の注射の後、３週目で放血される。所望により、宿主は追加免疫皮下注射により再ワクチン投与され、そして再び３週間後、放血される。

単核細胞を、末梢血管、膵臓、骨髄又はリンパ節から得、そして標準技法、たとえばフィコール−パーク（Ｆｉｃｏｌｌｐａｑｕｅ）と通してその中の他の成分から分離することができる。

Ｔ細胞を、便利な技法、たとえばマスＥ−ロゼッティング（ｍａｓｓ　Ｅ−ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）によって分離することができる。

続く不滅化のために単核細胞調製における変法は、分離されていない膵臓細胞対Ｔ細胞消耗の膵臓細胞、マイトジェンにより刺激された細胞対刺激されていない細胞、及び同様のものの使用を含む。もちろん、特別な技法は、使用される特定の不滅化法の成功に依存して変化するであろう。

好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、細胞由来のエプスタインパールウィルス（ＥＢＶ）により形質転換されたＢ−リンパ球細胞によって産生される。

そのようにして産生された、形質転換された細胞は、二倍体柱型を有するリンパ幼若化細胞を連続的に増殖するように特徴づけられ、エプスタインパール核抗原陽性であり、そしてＩｇＧ　、　ＩｇＨ、Ｉｇ＾又はＩｇＤアイソタンプのいづれか、及びＩｇＧ１　、　ＩｇＧ２　、１ｇＧ３及び１ｇＧ４　のサブタイプのモノクローナル抗体を分泌する。その細胞由来の形質転換法自体は、本発明の共同発明者、１４．Ｅ。

Ｌｏｓｔｒｏｍの発明であり、そしてアメリカ特許第４，４６４，４６５号に詳しく記載されていて、そしてこの開示を引用によりこの明細書中に組み入れる。

他方、リンパ球をＥＢＶにより形質転換し、融合パートナ−と共に次の融合において使用され得る、不滅化されたリンパ幼若化細胞を生成することができる〔たとえば、ＢｒｏＩＩＩｎａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８２）１ζ８：２４〜２９）　。

上記のヒト免疫グロブリンの種々のアイソタイプの分泌を提供する、広範囲の種類の融合パートナ−を使用することができる。その融合パートナ−は、マウス骨髄腫系、ヘテロ骨髄腫系又はヒト骨髄腫もしくは他の不滅化系であり、たとえばＰＣＴ出願第８１／　００９５．７　；　Ｓｃｌ＋Ｉｏｍなど、　、　Ｐｒｏｃ　、Ｎａ　ｔ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、＾、　（１９８０）７７　：　６８４１〜６８４５　、及びＣｒｏｃｅなど、　、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）翻旦：４８８〜４８９に記載されている。

融合パートナ−の目的とする特徴は、高い割合の免疫グロブリン産生ハイブリドーマ、個々の鎖又は対象の免疫グロブリンに関係しない免疫グロブリンの非産生、及び長期にわたっての目的の免疫グロブリンを連続的に分泌する能力の維持を提供するために、高い効率の融合体である。その融合は一般的に、短時間、非イオン性洗浄剤、通常ポリエチレングリコールの存在下で行なわれ、そしてその細胞は、パートナ−細胞に対して細胞毒性であるが、しかし融合された細胞（たとえば、ＨＡＴ　、　ＨＡＴ及びウヮバイン、等）に対して細胞毒性でない選択的条件下にゆだねられる。

選択的培地に増殖されたハイブリッド細胞を、個々のウェル中に接種し、そして対象のモノクローナル抗体のために、いづれか便利な技法によってスクリーンする。しかしながら、好ましくは、そのスクリーニングは、機能的アッセイ、たとえば細胞毒性阻害アッセイを使用して行なわれ、単離されたクローンが中和性抗体を産生ずることができるであろう可能性が増大される。

次に、適切なモノクローナル抗体を分泌する細胞を、制限希釈法によってクローンし、そして次に高レベルの特定の抗体を産生ずるクローンを増殖する。必要なら、その抗体を、さらにクラス及びサブクラスに特徴づけることができる。

抗体は、いづれか便利な技法、たとえばクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿及び抽出、又は同様なものによって精製され得る。

次に、その抗体を、精製の後、さらに変化せしめないで、使用することができ、又は種々のサイズのフラグメント、たとえばＦ（ａｂ’＞２．　Ｆａｂ　、　Ｆｖ又は同様のものに分解することによって変性することができる。ある場合、特別な結果を達成するために、該抗体と他の化合物（たとえば、細胞毒性剤、ラベル、等）とを接合することが好ましい。さらに詳しくは、その抗体を、ヒト宿主中への注入の後、血清中において接合体の半減期を制御することができる種々の成分に接合することができる。

本発明の細胞系は、ヒトモノクローナル抗体の直接的な産生のためによりも他に使用することができる。その細胞系を他の細胞と融合し、モノクローナル抗体の発現を提供する遺伝子をトランスファーし、そして従って新規のハイブリドーマを提供することができる。他方、その細胞系を、免疫グロブリンをコードする染色体の源として使用することができ、そしてそれは単離され、そして融合法よりも他の技法によって、細胞にトランスファーされ得る。さらに、モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、そして種々の宿主における特定の免疫グロブリン産生のために、組換え体ＤＮＡ技法に従って使用され得る。特に、ｐａ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡライブラリーを調製することによって、免疫グロブリンをコードし、そしてイントロンを含まない単個ｃＤＮＡクローンを単離し、そして適切な原核性又は真核性発現ベクター中に配置し、そして次に、最終的なバルク産生のなめに宿主中に形質転換することができる。

外毒素Ａに対して特異的なモノクローナル抗体はまた、既知の技法に従って、多くの研究、産生及び診断に使用される〔一般的に、”′免疫法“（“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ”）、Ｖｏｌｓ、　Ｉ　＆ＩＩ　、Ｅｄｓ、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、１．ａｎｄ　Ｐｅｒｎｉｓ、Ｂ、、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、（１９７９＆１９８１）　；及び“実験用免疫学の手引き”（Ｈａｎｄ−ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”）、ＥｄＪｌｅｉｒ、Ｄ、、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ（１９７８）を参照のこと〕。

たとえば、これらのモノクローナル抗体は、細胞系上清液がら精製され、そして特に、ワクチンのために変性され又は断片化される場合、外毒素Ａのアフィニティークロマトグラフィー精製に使用するために固形支持体（たとえば、臭化シンンにより活性化されたセファラーゼ４　Ｂ　；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、）に結合することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、医薬的に効果的な担体と共に少なくとも１つのそのような抗体の治療量又は予防量を含む医薬組成物の成分として導入され得る。医薬担体は、相容性であり、そして患者にモノクローナル抗体を運ぶために適切な非毒性物質である。消毒水、γルコール、脂肪、ワックス及び不活性固体が担体として使用され得る。医薬的に許容できるアジバント（緩衝剤、分散剤）がまた、医薬組成物に導入され得る。そのような組成物は、外毒素Ａのみに対して特異的になるために、単個のモノクローナル抗体を含むことができる。他方、医薬組成物は、“カクテル”を形成するために、複数のモノクローナル抗体を含むことができる。プソイドモナス　アエルギノサ感染のためには、ヒト疾患に最とも効果のある、リボ多糖の免疫型又は血清型に対する、１又はそれよりも多くのヒトモノクローナル抗体を含むカクテルが、外毒素Ａを中和することができる、１又はそれよりも多くのヒトモノクローナル抗体と混合される。そのことについて有用な、そのようなモノクローナル抗体（抗−ＬＰＳモノクローナル）を産生ずる典型的な細胞系の調製法は、アメリカ出願番号第６１４，１８４号及びアメリカ出願番号第７３４，６２４号に開示され、そして両者を、引用によりこの明細書中に組み入れる。

そのような組合せは、はとんどの細菌株に対する活性を増強するであろう。

本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、存在する血漿生成物、たとえばＰ、７互／ｌ、＝／力又は他のグラム陰性細菌によるヒトの疾患の予防処置又は治療上の処置に広く使用される、市販されているγグロブリン及び免疫グロブリン生成部と共に使用され得る。好ましくは、免疫グロブリンのためには、血漿が、Ｐユニー四四」ＬＬササ−たとえば、内毒素、外毒素、等）と反応性の高レベルの免疫グロブリンを示すヒト供与体から得られるであろう、一般的に、概論“静脈内免疫グロブリン及び処置された宿主”、（”Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｇｌｏｂａｌｉｎｅａｎｄ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ　）ｌｏｓｔ”、）＾ｍｅｒ、Ｊ、Ｈｅｄ、　、７６（３ａ）　、　３月３０日、１９８４、ページ１〜２３１を参照のこと。これを引用によりこの明細書中に組み入れる。

抗生物質又は殺菌剤と共に得られた組成物を別々に投与する場合、本発明のモノクローナル抗体が使用され得る。典型的には、殺菌剤は、抗−プソイトモナルペニシリン（たとえば、カルベニシリン）及びアミノグリコシド（たとえば、ゲンタミシン、トブラマイシン、等）を含むことができるが、しかし当業者に良く知られている、多くの添加剤（たとえば、セファラスボリン）を使用することもできる。可能性ある有効な組合せ処置又はカクテルは次のものを含むであろう：抗 −外毒素Ａ十抗−ＬＰＳモノクローナル士抗生物質抗−外毒素Ａ十抗−ＬＰＳモノクローナル抗−外毒素Ａ十抗生物質抗−外毒素Ａ＋γグロブリン＋抗生物質抗−外毒素Ａ十免疫グロブリン抗−外毒素Ａ十免疫グロブリン＋抗生物質抗−外毒素Ａ十γグロブリン。

本発明のヒトモノクローナル抗体は特に、経口、局部的な又は消化管外投与のために適切である。好ましくは、医薬組成物は、消化管外、すなわち皮下、筋肉内又は静脈内に投与され得る。従って、好ましい態様において、本発明は消化管外投与のための組成物を提供し、該組成物は許容できる担体、典型的には水性担体中に溶解している、１又はそれよりも多くのヒトモノクローナル抗体の溶液を含んで成る０種々の水性担体、たとえば水、緩衝水、０，４％生理食塩水、０．３％グリシン及び同様のものを使用することができる。これらの溶液は殺菌され、そして一般的に、粒状物質を含まない。これらの組成物は、便利な既知技法によって殺菌され得る。その組成物は、生理学的状態に近づけるために、必要な場合、医薬的に許容できる助剤、たとえばｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤及び同様のもの、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等を含むことができる。これらの製剤において、本発明の抗体の濃度は、広く変化することができ、すなわち１重量％以下から１５重量％〜２０重量％はどまで変化することができ、そして流体体積及び粘度、等に基づいて、好ましくは選択された特別な態様の投与のために、主として選択されるであろう。

従って、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、殺菌されたリンガ−溶液２５０社及びモノクローナル抗体５０ｍｇまでを含むように製造され得る。消化管外に投与できる組成物は潜在的に生命の危険な状態、特に画面症及び毒血症に使用を調製するための実際の方法は当業者に既知であり又は明らかであり、そしてたとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ＰｈａｒｍａｅｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｕ、Ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ　：　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、　ＨａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ（１９８０）　、に詳しく記載され、そしてこの開示を引用により、この明細書中に組み入れる。

モノクローナル抗体は、貯蔵のために凍結乾燥され、そして使用する前、適切な担体中で再構成され得る。この技法は、従来の免疫グロブリンにより有効であることが示され、そして種々の既知の凍結乾燥技法及び再構成技法が使用され得る。

凍結乾燥及び再構成は種々の抗体活性度損失を導びくことができ、そして使用レベルはそれを補うなめに調整され得ることが当業者によって認められるであろう。

本発明のヒトモノクローナル抗体又はそのカクテルを含む組成物は、プセイドモナス　アエルギノサ細菌疾患の予防処置及び／又は治療処置のために投与され得る。治療投与において、組成物は、感染及びその合併症を治し又は少なくとも一部その感染の進行を止めるのに十分な量で、ブセイドモナム　アエルギノサによりすでに感染された患者に投与される。

これを達成するのに十分な量は、゛治療上の有効投与量″として定義される。この使用のために有効な量は、感染度及び患者自身の免疫システムの一般状態に依存するが、しかし一般的な範囲は体重１ｋｇ当り抗体的１〜２００ｍｇであり、そして１ｋｇ当り５〜２５ｍｇの投与量がより一般的には使用される。本発明の物質は一般的に重い疾患状態、たとえば生命の危険な又Ａ−適４Ｊ１かトド婿肋の消ｆ路され得ることを心に留めるべきである。そのような場合、すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体によって達成される、“外来性物質”拒絶が実質的に存在しないという観点から、実質的に過剰のこれらの抗体を投与することは可能であり、そして治療を行なう医者によって所望され得る。

予防のための適用においては、本発明のモノクローナル抗体又はそのカクテルを含む組成物を、旦エアエルギノサによる重い感染を受ける危険があると思われる人、すなわちこの細菌によってまだ感染されていない人に投与される。そのような量は、“予防上の有効投与量”であると定義される。この使用において、正確な量が再び、患者の健康状態及び一般レベルの免疫性に依存するが、しかし一般的な範囲は１ｋｇ当り０、１〜２．５　ｍｇ、特に１ｋｇ当り０．５〜２．５１１１ｇである。

その組成物の１回又は複数回の投与を、治療を行なう医者によって選択される投与量レベル及びパターンにより行なうことができる。いずれにせよ、医薬製剤は、疾患を効果的に治療するのに十分な本発明の抗体の量を患者に提供すべきで次のことは、ブセイドモナス　アエルギノサ外毒素Ａに対するヒトモノクローナル抗体の分泌性細胞系の産生のための方法を例示し、そしてさらに、致死性挑戦の外毒素Ａに対する、瓜とり並での前記抗体の保護活性を例示する。

ブセイドモナス　アエルギノサによる慢性感染を有することが知られている嚢胞性線維症患者の末梢血管サンプルから単離した。Ｂ細胞を含む単核細胞画分を、フィコール−パークを通して標準遠心分離技法によって血液から分離した（　Ｂｏｙｕｍ　、＾、、パヒト血液から単核細胞及び顆粒球の単離、′。

（’ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍＨｕｍａｎ　Ｂｌｏｏｄ、”）Ｓｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、（１９６８）２１５ｕｐｐｌ。

９７　、７７〜８９〕。界面から得られた単核細胞を、増殖培地、すなわち加熱不活生化された１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭのし一グルタミン、１００μｇ／−のストレプトマイシン及び１００１、Ｕ、／ｍｆのペニシリンにより補充されたｌ５ｃｏｖｅ’ｓ　ＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ　＃４３０−２２００）中で２度洗浄した。

（この配合は、この後ｌ５ｃｏｖｅの培地として言及される。）洗浄された細胞を計数し、そして標準技法によって血球計数器上でトリズシンブルー生体染色により生存度を調べた。２種類の異なったヒト供与体からの細胞サンプルを、この方法で調ＩＡ２（Δ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ８１１９　）と称する形質転換性細胞系は、リンパ幼若化細胞系ＧＭ１５００のエチルメタスルホネー）（ＥＭＳ）突然変異誘発により、次に酵素、ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠き及び従ってＨＡＴ　（ヒボキサンチンＩ　Ｘ　１０−’Ｍ、アミノプテリン４×１０−’Ｍ及びチミジン１６Ｘ１０−５Ｍ）を補充した増殖培地に対して敏感な生存細胞を提供するために、３０μｇ／ｍ４の６−チオグアニンの存在下での継代培養により由来されたエプスタイン−パール核抗原（ＥＢＮ＾）陽性ヒトリンパ幼若化細胞系であった。

形質転換＃１対数増殖相のＩＡ２細胞を、（Ａ）からの洗浄された末梢血液の単核細胞と８：１の比で混合した。およそｉｏ、ｏｏｏの単核細胞及びｓｏ、ｏｏｏのＬＡ２細胞を、ＨＡＴ及び０．５μＦ：／Ｉ＋１１のシクロスポリンＡ　（Ｓａｎｄｏｚ　）により補充されたｌ５ｃｏｖｅ培地２００μＮを含む９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ　３７９９）の丸底ウェル当りにプレートした。シクロスポリンＡを用いて、Ｔリンパ球機能を阻害した。半分の培養物を６１目でいったん除去し、そしてＨＡＴ及びシクロスポリンＡＭ充物を含む新鮮なｌ５ｃｏｖｅ培地とその培養流体体積の半分を交換した。ｉｏ　、　１２及び１３日目で、ウェル当り培養流体体積のそれぞれカ、＋及び士を除去し、そしてＨＴ　（アミノプテリンを含まない）及びシクロスポリンＡにより補充された新鮮なｌ５ｃｏｖｅ培地の対応体積を充填した。ＥＢＶにより形質転換されたＢ−細胞の増殖は、この実験において１０個の９６−ウエルブＩ／−トのすべてのウェルで顕微鏡的に明らかであった。

形質転換＃２対数増殖相のＩＡ２細胞を、第二及び異なった供与体からの洗浄された末梢血液の単核細胞と約３＝１の比で混合した。

およそ７３，０００のＩＡ２細胞及び２４，０００のＰＢＬを、前の形質転換＃１で記載したように、ＨＡＴ及びシクロスポリンＡを補充したｌ５ｅｏｖｅ培地２００μｌを含む１０個の９６−ウェルプレートの丸底ウェル当りにプレートした。５０％の培養物を６゜８．１０及び１３日目で除去し、そしてＨＴ（アミノプテリンを含まない）及びシクロスポリンＡを含むｌ５ｃｏｖｅ培地とその培養流体体積の半分を交換しな。ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞の増殖は、プレートされたすべてのウェルで顕微鏡により明らかにされた。

Ｃ０特異的抗体　泌性細胞の一串一抗一外毒素Ａ抗体の存在のための、培養上清液のアッセイを、形質転換＃１のためには１５日目で及び形質転換＃２のためには１７日目で行なった。そのアッセイは、細胞毒性阻害アッセイであり、そして次のようにして行なわれた：指示細胞（マウス結合組織、Ｌ株のクローン、Δ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＣＬ１）を、加熱不活性化された１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのし一グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００１　、Ｕ、／　ｍｌのペニシリンにより補充されたＲＰＨ１１６４０（Ｇｉｂｃｏ）　（この配合は、この後ＲＰＭＩと呼ばれる。）中で、結合された細胞培養物として増殖した。アッセイのなめに、その指示細胞を、ＲＰ旧を含む９６−ウェルのフラット底プレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９６　’）のウェル当り１×１０４個をプレートし、そして６％ＣＯ□を補充した周囲空気下で湿潤チャンバー中においておよそ４８時間３７℃でインキュベーションした。

ＩｇＩｅｗｓｋｉ、Ｂ、など、、“タンパク質合成の毒素インヒビター：プソイドモナス　アエルギノサ毒素Ａの製造、精製及びアッセイ、”（”Ｔｏｘｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｔｓ　：　Ｐｒｏｄｕｃ−ｔｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ　Ａｓ５ａｙ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＴｏｘｉｎ　Ａ、”）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ□ヨｏｇｙ（１９７９）６０　：　７８０〜７９３゜＾ｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋによって記載された方法によって、外毒素Ａを、Ｐ、７Ｄ盈ｋ（、乙す−株Ｐ＾１０３（八、Ｔ、Ｃ，Ｃ，２９２６０）の使われた培養培地から一部精製した。ＲＰＭＩ中の一部精製された外毒素Ａの希釈物を、記載したようにして調製されたし細胞と共にウェル中でインキュベートした。この滴下から、外毒素調製物の希釈物を次のアッセイのために選択した。この希釈物は、Ｌ細胞に対して１００％の細胞毒性効果を再生的に生む、最とも低い外毒素濃度であった。

形質転換＃１及び＃２からのヒト抗体含有上清液のアッセイを次のようにして行なった。およそ１５０μりのＲＰＭ　Ｉ増殖培地を、指示細胞培養物のそれぞれのウェルから取り出し、そして捨てた。形質転換されたＢ細胞培養物（Ｂから）のウェルのそれぞれからの上清液流体（４０μＮ）を、上記のようにして、外毒素Ａの１回の１００％細胞毒性投与量（２０μｍ）と共に混合した。独立した混合物を、形質転換されたＢ細胞培養物のプレート当り９６個のウェルのそれぞれのために調製した。その得られた混合物を、移し、指示細胞のウェルを分け、そして次に６％Ｃ０２下で３７℃でインキュベートした。１時間後、１００μｌのｌ５ｃｏｖｅ培地を、それぞれのウェルに添加した。プレートを同じインキュベーション条件に戻し、そしてさらに４８〜７２時間後、観察した。

外毒素Ａ特異性の　中和性抗体が形質転換されたＢ細胞の培養流体中に存在する場合、指示し細胞は毒素投与によって影響されず、そして４８〜７２時間にわたって増殖された。しかしながら、試験上清液が毒素中和性抗体を含まない場合、その指示細胞は殺された。これらの結果は、対照、及び抗−外毒素Ａ抗血清又はｌ５ｃｏｖｅ自体を含むウェルと比較して、指示細胞の数及び／又は形態の変化によって細胞の増殖又は細胞の死の形跡についてのおのおののウェルの顕微鏡評価によって明らかであった。このアッセイを用いて、１つのウェルからの上清液（８Ｂつと命名された）を、形質転換＃１がらの毒素中和性活性を含むものとして同定し、そして第二ウェル（４Ａ４と命名された）を、類似した毒素中和性活性により形質転換＃２から同定した。

ウェル８Ｂ９及び４Ａ４がらの細胞を、アッセイされたすべてのクローン上滑液が陽性反応を与えるまで、数回（普通３回）の限界希釈クローニングにそれぞれゆだねた。クローニングを、支持細胞としてウェル当りｌＸｌ０’個の照射された（２４００ラツト）ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を含む９６−ウェル丸底プレート中で行なった。７日後、追加の１×１０５個の照射されたＰＢＬを、それぞれのウェルに添加した。抗−外毒素Ａヒトモノクローナル抗体を産生ずる、得られたクローン細胞系を、８Ｂ９及び４Ａ４と命名した。

この特許出願を提出する前、本明細書中の細胞系８Ｂ９及び細胞系４Ａ４を、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託し、そして次の名称を得た：８Ｂ９−八、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ８８３３及び４Δ４− 八、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ８８３４゜Ｅ、モノクローナル抗体４Ａ４　び８Ｂ９の特徴（ＩＩ。

モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９のアイソタイプ。

モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９のアイソタイプを、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ＾）の使用により決定した。一部精製された外毒素ＡをＰＢＳ中に１：５０で希釈し、そしてこの物質６０μｌを、９６−ウェルフラット底マイクロ力価プレートのウェル中に置いた。１晩インキユベーシヨンした後、吸収されなかった抗原をアスピレートし、そしてそのウェルを、洗浄緩衝液（０，９％ＮａＣｊ２＋０．０５％＜Ｖ／Ｖ＞Ｔｗｅｅｎ２０）により一度すすいだ、モノクローナル抗体４Ａ４又は８Ｂ９を含む古い培養土清液を、０．１％Ｔ切ｅｅｎ２０及び０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７，２）により１：１で希釈し、そして希釈された抗体５０μりを添加し、ウェルを分けた。そのプレートを２５℃で３０分間、インキュベートし、その後その上清液を除去し、そのウェルを、洗浄緩衝液により３度すすぎ、そして５０μｌのホースラディシュベルオキシダーゼ（ＨＲＰ　）接合のヤギ抗−ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　＃＾１１１４）又はＨＲＰ接合のヤギ抗−ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）　（ＡＱＩ＃＾１１２４）を、ウェルに添加した。ＨＲＰ−ヤギ抗＝■εＧ及びＨＲＰ−ヤギ抗−ｒｇｈを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐ）１７．２＞によりそれぞれ、１　：　５０００及び１　：　３０００に希釈した。２５℃で３０分間、インキュベーションした後、酵素接合のヤギ抗体を除去し、そのウェルを、洗浄緩衝液により３度すすぎ、１００μｌの基質（１００ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）中、０．８　＋１１ｇ／　ｍｌオルト−フェニレンジアミンジヒドロクロリド＋脱イオン化水中、０．０３％Ｉ＋　２０□、プレートｔ　ル’１−ぐ前に、同体積づつ混合された〕を、それぞれのウェルに添加した。そのプレートを、暗やみで３０分間インキュベートし、その後その反応を、５０μｌの３Ｎ　Ｈ２ＳＯ，をそれぞれのウェルに添加することによって停止した。これらの実験においては、陽性の発色が、抗−ヒト■ｇＧ試薬を第二段階の試薬として使用する場合にのみ、モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９により観察され、それによって、両モノクローナル抗体のためのＩｇＧアイソタイプを示した。

ＡＤＰ−リボシル化に対するモノクローナル抗体の効果。

外毒素ＡのＡＤＰ−リボシル化活性を阻止することに対する、モノクローナル抗 −外毒素Ａ含有性細胞上清液の効果を、次の反応スケム：外毒素ＡＮＡＤ”＋ＥＦ−２□へＤＰ−リボースーＥＦ−２＋ニコチンアミド＋Ｈ４に従って、〔アデニン−”Ｃ）ＨＡＤからの放射能のトリクロロ酢酸沈殿性物質中への取り込みを減じ又は阻害する該上清液の能力によって調べた。

ＥＦ−２及び外毒素の調製のための詳細な方法は、前にこの明ａｌ書に引用した。しかしながら、実質的な変法がこれらの成分の個々の調製の間に存在することができることは明らかであろう、理論上、〔アデニン−”Ｃ）ＮＡＤ及びＥＦ− ２は、外毒素Ａの存在下で右から左に進行するよう上の反応を促進するために過剰量で存在する。外毒素Ａ、ＥＦ−２及び〔アデニン−１’Ｃ）ＮＡＤの量を、接合形〔アデニン−１−Ｃ）＾ＤＰ−リボースーＥＦ−２への〔アデニン−１４ｃ）ＨＡＤの十分な転移（取り込み）を提供するために滴下し、そして合計取り込みは放射能１４Ｃの投入計数７分（ｃｐｍ）の４０〜６０％であった。

抗体−仲介の阻害アッセイのためには、毒素が陽性の対照抗−外毒素Ａ抗体によって阻害の検出を妨げるほど過剰に存在しないような外毒素Ａｆｉ度を、上の反応において調整することが重要である。

本発明の例においては、一部精製された外毒素Ａ調製物〔上のセクションＣで記載したようにして調製された（但し一２０℃で凍結保存された）〕を融解し、外毒素Ａの＾ＤＰＲ−トランスフェラーゼ活性を強化した（　Ｖａｓｉ　Ｉ　、Ｍ、　、など、、“プソイドモナス　アエルギノサの外毒素の構造−活性の関係、 ″（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−＾ｃｔｉｖｉｔｙ　Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　ｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　７．”）Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、（１９７７）１６　：　３５：３−３６１）０次に、この調製物を、緩衝液１　（５０ｍＭｃｒ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、ｐＨ７，５）により１：１３３に希釈し、そしてその２０μｌを２μ！の対照ウサギ抗−外毒素Ａ血清（Ｂｊｏｒｎ、　Ｎ肢）又はモノクローナル含有の上清液と共に、１ｍｌのポリプロピレン管中において２５℃で１時間、ブレインキュベートした。インキュベーションの後、小麦幼芽からの一部精製されたＥＦ−２（Ｃｈｕｎｇ、Ｄ、ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｅｒ、Ｒ，、”プソイドモナス　アエルギノサのアデノシン　ジホスフェート−リボシル化毒素からの酵素的活性のペプチド、”（”Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍｔｈｅ　Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ　Ｔｏｘｉｎ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ　ｇ力＋ｏｓａ、”）Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、（１９７７）１６　：　８３２〜８４１　）を、１００ｍＭ（７）Ｔｒｉｓ− ＨＣｊ！、０．２ｍＭのＥＤＴΔ、１００ｍＭのジチオトレイトール、ｐ）１８．２の溶液により２：３に希釈し、そしてその１５μｌを、前記反応管に添加した。この後、すぐに１μ！（０，０１μＣｉ）の〔アデニン−”Ｃ）ＨＡＤを添加し、そしてその管を２５℃で１時間、インキュベートした。第二インキュベーション段階の後、あらかじめ１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により含浸された１インチ平方のＷｈａｔｍａｎ　３８８紙上におのおのの反応混合物２０μｌを置くことによって、その反応を停止した［Ｂｏｌｌｕｍ、Ｆ、、“放射性マクロ分子をアッセイするためのフィルターペーパーディスク技法、”（”Ｆｉｌｔｅｒ　ＰａｐｅｒＤｉｓｋ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　Ａｓ５ａｙｉｒ＋ｇ　Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｈａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ−Ｉｅｓ、”）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、（１９６８）　１２Ｂ　：　１６！ｌｌ〜１７３）　、　Ｔ　ＣＡ溶解性物質を、１０％ＴＣＡによる連続的な３０分間の洗浄を３度行なうことによってその正方形紙から除去した。次に、その正方形紙を、簡単にアセトンにより１度洗浄し、空気乾燥せしめ、そしてシンチレーション液３ｔｎｌを含む個々のバイアル中に置いた。ＴＣＡ沈殿性放射能を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ７０００液体シンチレーションシステムにより測定し、そしてその結果を第１表に示した。

第１表３　ウサギ抗−毒素’＋　＋　＋　３２８４　ＨＡｂ６Ｆ１１ｅ＋　＋　＋　９１２０５　ＨＡｂ４＾４　＋　＋　−１−７７７０ａ二１分当りのＴＣＡ不溶性放射能計数。

ｂは最大の取り込みを表わす一抗体の代わりに２μ！の緩衝液１゜Ｃは最小の取り込みを表わす一抗体及び毒素の代わりに２２μｌの緩衝液１゜ｄ：ウサギ抗−外毒素Ａは緩衝液１により１：１０に希釈された。

ｅ　：　ヒ）−モ／　’７　ｏ　−−ｔ−ル抗体（ＨＡｂ）６Ｆ１１（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ８５６２）？、ｔ、は、旦エアエルギノサのフィシャー免疫型２のリボ多糖に対して指図される。

第１表に示された結果から、モノクローナル抗体８Ｂ９は血Ｚ　止上旦で外毒素ＡのＡＤＰ−リボシル化活性をひじように効果的に阻害し、そしてモノクローナル抗体４Ａ４は比較的陰性の効果を示したことが明らかである。２つの抗体の４ ’ｙ　ビトロでの阻害の相違点は、それぞれが外毒素へ分子上の異なったエピトープに向けられることを指摘する。外毒素ＡのＡＤＰ−リボシル化活性は、モノクローナル抗体８Ｂ９によって完全に阻害されるので、この抗体は外毒素Ａ分子の酵素部位内のエピトープ又は酵素部位にきわめて接近したエピトープで指図されることが可能である。後者の場合、抗体と毒素との間の結合は、分子の酵素機能を、立体化学的になお妨げる。それに比べて、モノクローナル抗体４Ａ４は、酵素部位から少々転移された分子上のエピトープに多分指図され、そして感染しやすい細胞表面上の毒素受容体に結合する外毒素Ａのその部分と反応することによって、その抗−毒素活性を行なうことができる（Ｖａｓｉｌ、庇証）。ヒトモノクローナル抗−外毒素Ａ抗体のイムノプロット分析。

抗−外毒素Ａ抗体としてモノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９の特異性の確認を、イムノプロット分析によって行なった。この目的のためには、旦ユアエルギノサの株Ｐ＾−１０３からの一部精製された外毒素Ａ（上記のようにして調製された）を、まずＰＢＳにより１：１５に希釈した。４個の同一サンプルを、次のようにして調製した：希釈された外毒素Ａ３０μｆを、解Ｍ）ＩＥ街液（０，３１２５ＭのＴｒｉｓ−塩酸塩、ｐＨ６，８，２５％ＳＤＳ及び０．７２Ｍのジチオトレイトール）５μ！と共に混合し、５分間１００℃で加熱し、室温に冷却し、そして２０μ！の７５％グリセロール／２５％ストック０．２５％ブロモフェノールブルーと共に混合した。次に、Ｌａｅｎ＋ｍｌｉ、Ｕ、、″バクテリオファージＴ４の頭のアセンブリイーの間での構造タンパク質の分解、”（”Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｆｒｕｃｔｕａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ ηヱニ６８０〜６８５に従って、１０％ゲル上でドデシルＫＭナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　）に、おのおののサンプルをかけた。Ｔｏｕ＋ｂｉｎ、Ｈ，、など、、“ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質のニトロセルロースシートへの電気泳動トランスファー：方法及びいくつかの適用、”（”Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｏ１ｙａｃｒｙトａｍｉｄｅ　Ｇｅ１ｓ　ｔｏ　Ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ　：　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｏｍｅ＾ｐｐ１ｉｃａｔｉｏｎｓ、”）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（１９７９）７６　：　４３５０〜４３５４に記載されているようにして、ゲルからの分離された分子種をニトロセルロースｆｉ（ＮＣＭ）にトランスファーし；そしてＮＣＭプロットを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で２時間阻止した（Ｂａｔｔｅｉ−ｇｅｒ　、　Ｂ　、など、、゛ニトロセルロース膜にトランスファーされたタンパク質の免疫学的検出における阻止剤としてのＴｗｅｅｎ２０の使用、′（“Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｔｗｅｅｎ　２０　ａｓ　ａ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ａｇｅｎｔ　１ｎｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔ。

Ｎ１ｔｒｏｃｅｌ　Ｉｕｌｏｓｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、”）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、Ｍｅｔｈ、（１９８２）５５　：２９７〜３０７］　、個々のトラックを、ＮＣＭプロットから切り、そしてあらかじめＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ中より１　：　１０００に希釈されたウサギ抗−外毒素Ａ　（Ｂ　ｊｏｒｎ　、　Ｍ　Ｂｅに記載しているようにして調製された）４０社又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより１：１０に希釈されたヒトモノクローナル抗体４０ｍ１中に２５℃で１時間、別々にインキュベートした。　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにおける５分間の洗浄を５度行なった後、それぞれのＮＣＭプロットを、アルカリホスファターゼ接合のヤギ抗− ヒトＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（注意：　Ｚｙｍｅｄからのこの試薬は明らかに、ウサギ免疫グロブリンに対する広範な交差反応性を有する）のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにおける１　：　１０００希釈溶液中において２５℃で１時間、インキュベートした。

これらのプロットを、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎにおける５分間の洗浄をそれぞれ５度行ない、その後、Ｌｅａｒｙ、Ｊ、、など２．“ニトロセルロース上で固定化されたＤＮＡ又はＲＮＡに対してハイブリダイズされた、ビオチンによりラベルされたＤＮＡプローブを見えるようにするための敏速且つ敏感な測色方法：Ｂｉｏ−Ｂｌｏｔｓ、”（”Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｈｅｃｈｏｄ　ｆｏｒＶｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　Ｂｉｏｔｉｎ −Ｌａｂｅｌｅｄ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｔ。

ＤＮＡ　ｏｒ　ＲＮＡ　Ｉｍｍａｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎ　Ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　：　Ｂｉｏ−Ｂｌｏｔｓ、”）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、八ｃａｄ、ｓｃｉ、（１９８３）　８０　：　４０４５〜４０５９によって記載しているようにして、ニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロロ−３−インドーリルホスフェート（ＮＢＴ　−ＢＣＩＰ）基質３０社中において、２５℃で２０〜３０分間、前記プロットをインキュベートすることによって、抗原−抗体の相互作用を見えるようにした。発色を、脱イオン水中で数回、前記プロットをすすぐことによって、停止した。

第１図に示されるように、モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９の反応パターンは、特異的ウサギ抗−外毒素Ａ抗体の反応パターンとほとんど同一であった。すべての３種の場合の反応パターンは、生来の外毒素Ａポリペプチドを示す７１．０００ドルトン分子の認識によって支配され（Ｖａｓ　ｉ　ｌ　、　ＨＭｅ　）、モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９が外毒素Ａに対して指図されていることを例示した。さらにこの特異性のための証拠が、外毒素Ａ調製物と対照のヒトモノクローナル抗体（Ｃ５Ｂ７）との非反応により提供された。

４Ａ４モノクローナル抗体によって明らかに認識されなかった、いくつかの低分子量外毒素分解生成物と８Ｂ９モノクローナル抗体との反応はまた、プロットにおいて注目に値した。これは、この２種のモノクローナル抗体が、外毒素Ａ分子上の異なったエピトープを認識するという提案をさらに支持する。

イムノプロット分析をまた使用して、モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９が、Ｐニア１し受ΔＬ乙父−の７種のフィシャー免疫型のそれぞれによって産生された外毒素Ａと反応しまたことを例示しな（Ｆｉｓｈｅｒ、ＭＪ、、など、、“保護性抗原に基づく乙ソイドモナ久　乙互火玉Ａ力のための新規免疫型スケム、” （”Ｎｅｗ　Ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ　Ｓｃｈｅｍｅ　ｆｏｒ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｎｇｉｎｏｓａＢａｓｅｄ　ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ＡｎｔｉＦｉｅｎｓ、”）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９６９）９８　：８３５〜８３６）　、これらの実験のために、外毒素Ａの粗調製物を、次のようにして旦ユアエルギノサの７種のフィシャー免疫型及び菌株Ｐ＾−１０３のそれぞれから調製した。旦ユアエルギノ力のそれぞれの免疫型及び菌株ＰＡ−１０３のブイヨン培養物からの細菌不含の培養上清液を、Ｂｊｏｒｎ、Ｈ，など、、“プソイドモー＋、１　アエルギノＩＡ−１０３の培養における外毒素Ａの収率に対する鉄の効果、”（”Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｉｒｏｎ　ｏｎ　Ｙｉｅｌｄｓ　ｏｒ　Ｅｘｏ−ｔｏｘｉｎ　Ａ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　７　ＰΔ−１０３，”）Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｎ＋ｍｕｎ、（１９７８）　！９　：　７８５〜７９１によって記載されたようにして調製した０次に、外毒素Ａ含有性上滑液（合計８種）のそれぞれの少量を、製造説明書に従って＾ｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０マイクロ濃縮器（Δｍ１ｃｏｎ　４２０８）の使用によりおよそ８倍に濃縮した。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥのためのサンプル調製を、次の変法により上に記載しているようにして行なった：それぞれ粗性毒素調製Ｗ＄ＩＪ１９０μｐを、解離緩衝液２０μ！と混合し、そして加熱処理した後、グリセロール、／染料緩衝液５０μｌを添加した。おのおのの調製物からのサンプル５０μｌを、電気泳動した。イムノプロット法の残りを、上に記載しているようにして行なった。但し、すべての８種の濃縮された粗性毒素上清液を、個々のトラックとしてよりもむしろ１つのＮ０Ｍプロット上で、適切な濃度でモノクローナル抗体４Ａ４又は８Ｂ９に暴露した。第２図に示されるように、モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９は、７種のフィシャー免疫型株及びＰ＾−１０３のすべてによって産生された、７１．０００ドルトンの外毒素Ａ分子と反応した。これらのデータは、８Ｂ９及び４Ａ４モノクローナル抗体が、毒素を産生ずる、実質的にすべてのＰユアエルギノサ株の外毒素Ａと反応するであろうことを−ｆ７ｔｌ？で外毒素Ａの毒性効果を中和する、モノクローナル抗体４Ａ４及び８Ｂ９の能力を調べるための実験を、次のようにして行なった。両抗体をまず、飽和硫酸アンモニウムにより沈殿せしめることによって、古い培養上滑液がら濃縮した（５０％の最終濃度）（Ｇｏｏｄ、＾、など、、“免疫グロブリンの精製及びそれらのフラグメント、”（”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌｏＢｙ、Ｍｉｓｈｅｌｌ、Ｂ、ａｎｄ　Ｓｈｉｇｉ、Ｓ、、ｅｄｓ、、ＩＩｌ、Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａ！１ｆｏｒｎｉａ、（１９８０）２７９〜２８６）　、沈殿された物質をＰＢＳ中で再構成し、ＰＢＳに対して広範囲にわたって透析し、そして無菌濾過した。

Ｐ、Ｕエルギノサのフィシャー免疫型１のリボ多糖に対して指図されているヒトモノクローナル抗体（Ｃ５Ｂ７）を、類似した方法で処理した。粗性毒素Ａｍ製物を、イムノプロット分析のために前もって記載したようにして調製した。但し、ブイヨン培養物からの細菌の除去の後、外毒素Ａ含有性上清液をまず、４℃で脱イオン水により１：４に希釈した。次に、それをおよそ１２０倍に次の方法によって濃縮した：ｉ）飽和硫酸アンモニウムによる沈殿（７５％の最終濃度）　：　ｉｉ　）　０．ＯＩＭのＴｒｉｓ−塩酸塩、ｐＨ９，０及び２ｍＭのβメルカプトエタノールにおける該沈殿物の可溶化；及びｉｉｉ　）同じ緩衝液に対する広範囲にわたる透析、この物質を一７０℃で凍結し、そして保護研究において新たに融解して使用した。

２０〜２２ｇの体重の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、それぞれ１０匹から成る３グループに分けた。１つのグループを、濃縮された８Ｂ９又は４Ａ４抗体０．５ｍｌにより腹膜内（ｉｐ）に接種し、そしてもう１つのグループは陰性対照とに濃縮されたＣ３Ｂ７抗体０．５社を腹膜内に受けた。最終のグループは何も受けなかった。４時間後、すべての動物は、２〜Ｂ　ＬＤ５゜投与量を示す、希釈された（生理的食塩水により）粗性毒素Ａ調製物０．３ｍｌを腹膜内に受けた。動物を５日間にわたって観察した。この実験において、抗体又はＣ３Ｂ７抗体を受けなかったすべての動物は、３６時間内で死んだ、８Ｂ９抗体を受けた動物のうち１匹を除く他のすべては３６時間生き、そして観察期間の最後までに完全に回復した。同様に、４Ａ４実験において、４Ａ４抗体を受けたすべての動物は３６時間生き、そして５日までに完全に回復した。これらの結果は、８Ｂ９及び４Ａ４抗−外毒素Ａ抗体の両者が外毒素Ａの致死的な挑戦を効果的に中和することができることを示した。

前に述べたことから、本発明のヒトモノクローナル抗体が外毒素Ａの毒性効果を中和するための実質的な手段を提供すると思われる。重要なことには、これらの抗体は、ヒトに対して最少の免疫原性であり、そしてそれのみ又は他の物質と共に、治療的な使用又は予防的な使用のために適切である。

さらに、これらの抗体は、細胞系から、たとえば組織培養により容易且つ経済的に製造され得る。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

８Ｂ９及び４Ａ４と命名された本発明の２種の永久的なヒトリンパ球細胞系を、１９８５年６月４日＾ＴＣＣに寄託し、そしてそれぞれ寄託番号ＣＲＬ８８３３及びＣＲＬ８８３４を得り。

ヒトモノクローナル抗−外毒素Ａ抗体のイムノプロット分析ＦｆＧ、ｆく国際調査報告１ｍ、＋ゆ〜ｌ　４９７＠１カ。）ｌｅ、ＰＣＴ１０Ｓ８６１０１２０４１８１（口Ｈ６３−５０００３５（１２）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ブソイドモナスアエルギノサ外毒素Ａと結合し、そしてその毒性効果を中和することができるヒトモノクローナル抗体を含んで成る組成物。
２．前記モノクローナル抗体が外毒素Ａの酵素活性を阻止する請求の範囲第１項記載の組成物。
３．前記モノクローナル抗体がＩｇＧ又はＩｇＭアイソタイプを示す請求の範囲第１項記載の組成物。
４．ブソイドモナスアエルギノサ外毒素Ａと特異的に反応し、そしてその毒性効果を中和することができるＩｇＧアイソタイプのヒトモノクローナル抗体を含んで成る組成物。
５．少なくとも２種のヒトモノクローナル抗体を含んで成る組成物であって、該モノクローナル抗体の少なくとも１つは、ブソイドモナスアエルギノサ外毒素Ａと反応し、そしてその毒性効果を中和することができる組成物。
６．前記モノクローナル抗体のもう１つがブソイドモナスアエルキノサのリポ多糖分子上で血清型抗原決定基と反応することができる請求の範囲第５項記載の組成物。
７．さらにヒト血漿からのγグロブリン画分を含んで成る請求の範囲第１，４又は５項のいづれか１項記載の組成物。
８．前記血漿を、ブソイドモナスアエルギノサ又はその生成物と反応性の高レベルの免疫グロブリンを示すヒトから得る請求の範囲第７項記載の組成物。
９．さらに殺菌剤を含んで成る請求の範囲第１，４又は５項のいづれか１項記載の組成物。
１０．請求の範囲第１，４又は５項のいづれか１項記載の組成物及び生理学的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
１１．ブソイドモナスアエルギノサ外毒素Ａと特異的に反応し、そしてその毒性効果を中和することができる、少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体、殺菌剤、ヒト血漿からのγグロブリン画分及び生理学的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
１２．前記ヒト血漿からのγグロブリン面分を、ブソイドモナスアエルギノサ殺菌及び／又はその生成物と反応性の高レベルの免疫グロブリンを示すヒトから得る請求の範囲第１１項記載の医薬組成物。
１３．ブソイドモナスアエルギノサ殺菌外毒素Ａと特異的に反応し、そしてその毒性効果を中和することができる、少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体、該殺菌のポリ多糖分子上で血清型抗原決定基と反応することができる、少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体、殺菌剤及び生理学的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
１４．菌血症及び／又は敗血症に感染しやすいヒトを治療するための方法であって、請求の範囲第１，４，５，１１，１２又は１３項のいづれか１項記載の組成物の予防量又は治療量を前記ヒトに投与することを含んで成る方法。
１５．ブソイドモナスアエルギノサと特異的に反応し、そしてその外毒素Ａを中和することができるヒトモノクローナル抗体を産生する細胞系。
１６．不死のヒトリンパ球細胞系である請求の範囲第１５項記載の細胞系。
１７．ハイブリット細胞系である請求の範囲第１６項記載の細胞系。
１８．エブスタイン−バールウィルスにより形質転換されたＢリンパ球である請求の範囲第１６項記載の細胞系。
１９．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．取得番号ＣＲＬ８８３３又はＣＲＬ８８３４の１つである請求の範囲第１８項記載の細胞系。
２０．ブソイドモナスアエルキノサ外毒素Ａに対して特異的な及びその毒素効果を阻止することができるヒトモノクローナル抗体を産生する方法であって、請求の範囲第１９項記載の細胞系の少なくとも１つを培養し、そして前記抗体を回収することを含んで成る方法。
２１．菌血症及び／又は敗血症に感染しやすいヒトを治療するための方法であって、請求の範囲第２０項に従って産生されたモノクローナル抗体の予防量又は治療量を前記ヒトに投与することを含んで成る方法。
２２．細菌感染しやすいヒトを治療する方法であって、ブソイドモナスアエルギノサ外毒素Ａの毒性効果を中和することができるヒトモノクローナル抗体の予防量又は治療量、並びに１又は複数の次の物質の量：すなわち、ブソイドモナスアエルギノサのリポ多糖分子上で血清型抗原決定基と反応することができるヒトモノクローナル；ヒト血漿からのγグロブリン画分；フソイドモナスアエルギノサ及び／又はその生成物と反応性の高レベルの免疫グロブリンを示すヒト血漿からのγグロブリン画分；又は殺菌剤の予防量又は治療量を前記ヒトに投与することを含んで成る方法。