FI111336B - Menetelmä Staphylococcus epidermidis tyyppi I:n polysakkaridiantigeenin sisältävän rokotteen ja antigeeninvastaisen hyperimmunoglobuliinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

η ΐόό0

Menetelmä Staphylococcus epidermidis tyyppi I: n polysakka-ridiantigeenin sisältävän rokotteen ja antigeeninvastäisen hyperimmunoglobuliinin valmistamiseksi 5 Keksinnön taustaa Tämä keksintö koskee menetelmää rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää Staphylococcus epidermis -bakteerin polysakkaridiantigeenin.

Keksintö koskee myös menetelmää hyperimmunoglobu-10 liinin valmistamiseksi, joka sisältää vasta-aineita Staphylococcus epidermis -bakteerin polysakkaridiantigeenia vastaan, joka on saatu menetelmällä, jossa kasvatetaan sellaisen eristetyn S. epidermis tyyppi I:n soluja, joka agglutinoi ATCC 55254:n antiseerumia; 15 uutetaan polysakkaridiantigeeni soluista raa'an tyyppi I polysakkaridiantigeeniuutteen tuottamiseksi; puhdistetaan raakauute puhdistetun antigeenin tuottamiseksi, joka sisältää vähemmän kuin 1 % proteiinia; viedään puhdistettu antigeeni erotuspylvääseen ja 20 eluoidaan se NaCl-gradientilla; ja tunnistetaan ja eristetään fraktiot, jotka sisältävät tyyppi I polysakkaridiantigeenia käyttäen vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä tyyppi I isolaatille.

Koagulaasinegatiiviset stafylokokkitartunnat ovat 25 johtava bakteeriverisyyden syy sairaalaan sijoitetuissa potilaissa. Erityisesti lajin s. epidermidis, jonka ei muodollisesti ajatella olevan taudinaiheuttaja, on havaittu olevan merkittävä tekijä tässä bakteeriverisyydessä. s. epidermidis -tartunnasta johtuva sairastaminen ja kuollei-30 suus on erikoisen huomattavaa lääketieteellisiä proteesi-laitteita tarvitsevien potilaiden keskuudessa. Tämän ajatellaan johtuvan lajin s. epidermidis tuottamasta limasta, joka sallii kiinnittymisen ja asumaan asettumisen näihin lääketieteellisiin esimerkkeihin, esim. katetreihin ja sy-35 dänläppiin.

BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 2 111336

Koska liman ajatellaan olevan s. epidermidis -infektiosta vastuussa oleva tekijä, on huomio keskittynyt sellaisiin pinnan puoliin, jotka välittävät kiinnittymistä vieraisiin kappaleisiin. Useat eri tutkijat ovat identifi-5 oineet solunulkoisen liman, ja on käytetty viljelyolosuhteita, jotka edistävät tämän liman tuottamista.

S. epidermidis -bakteerin tuottamaan limaan keskittymisen lisäksi tutkimus on tähän mennessä suureksi osaksi kohdistunut rajalliseen määrään spesifisiä bakteerikantoja, 10 jotka on eristetty. Ichiman et ai. ovat tutkineet kolmea S. epidermidis -kantaa, joita he viljelivät aivo-sydäninfuusio (BHI) -liemessä. Hiirten immunoinnit näiltä viljellyiltä mikro-organismeilta saaduilla solunpintapolysakkarideilla eivät olleet kuitenkaan tehokkaita suojauksen antamisessa 15 heterologisia kantoja vastaan. Eristettyjen pintapolysakka-ridien karakterisointi osoitti serologista heterogeenisyyttä. Ichiman et ai., J. Appi. Bact. 51 (1981) 229 - 241.

Ichimanin mukaan tehokkaan rokotteen saamiseksi kliinistä käyttöä varten pitäisi kukin tarttuva kanta eris-20 tää ja rokote kehittää kutakin kantaa vastaan. Tämä olisi käytännön kannalta katsoen puolustamatonta.

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön tarkoitus on valmistaa tehokas rokote kliinistä käyttöä varten S. epidermidis -tartuntaa vastaan. 25 Keksinnön vielä eräs tarkoitus on tarjota rokote, joka on tehokas kliinisesti tautia aiheuttavia S. epidermidis -kantoja vastaan.

Keksinnön lisätarkoitus on valmistaa polyklonaali-sia vastaseerumeja, jotka ovat spesifisiä kliinisiin S. 30 epidermidis -isolaatteihin liittyville pinta-antigeeneille.

Keksinnön vielä eräs tarkoitus on tarjota monoklo-naalisia vasta-aineita kliinisen s. epidermidiksen vallitseviin serotyyppeihin liittyviä pinta-antigeenejä vastaan, joita vasta-aineita voidaan käyttää suojaamaan s. epidermi-35 dis -tartunnalta tai sen hoitamiseksi.

BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 3 111336

Keksinnön vielä eräs tarkoitus on tarjota hyperim-muuni IVIG S. epidermidis -tartunnalta suojaamista tai sen hoitamista varten.

Nämä ja muut keksinnön tarkoitukset saavutetaan 5 valmistamalla rokote, joka sisältää S. epidermidis tyyppi I -pinta-antigeeniä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Valmistettava rokote sisältää lisäksi steriiliä, farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-10 ainetta. Immunostimuloiva määrä tätä rokotetta voidaan antaa kohteelle. Tämä kohde on jo saattanut saada S. epidermidis -tartunnan, kun mainittu rokote annetaan. Vaihtoehtoisesti rokote voidaan antaa plasman luovuttajalle, stimuloiden tuo luovuttaja tuottamaan hyperimmuuniglobuliinia, 15 joka sisältää S. epidermidistä vastaan suunnattuja vasta-aineita. Immunostimuloiva määrä tätä hyperimmuuniglobuliinia voidaan sitten antaa kohteelle. Keksinnön mukaiselle menetelmälle S. epidermis -bakteerin polysakkaridiantigee-nin vastaisia vasta-aineita sisältävän hyperimmunoglobulii-20 nin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 13 esitetään.

Tässä yhteydessä kuvataan myös koostumus, joka koostuu oleellisesti vasta-aineista, jotka sitovat tyyppi I tai tyyppi II -pinta-antigeenejä. Edullisessa suoritusmuo-25 dossa näitä vasta-aineita ei hankita menetelmällä, joka sisältää biologisen näytteen s. epidermidis -tartunnan saaneelta ihmiseltä hankkimisen vaiheen. Vasta-ainekoostumus voi olla monoklonaalinen vasta-aine -koostumus. Immunosti-muloivia määriä vasta-ainekoostumuksia, erityisesti mono-30 klonaalisen vasta-aineen koostumuksia, voidaan antaa kohteelle S. epidermidis -tartunnan ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi .

Lisäksi täällä kuvataan serotyypitystarvikkeet S. epidermidis -viljelmiä varten, jotka tarvikkeet sisältävät 35 tyyppi I -pinta-antigeenille spesifisiä vasta-aineita ja tyyppi II -pinta-antigeenille spesifisiä vasta-aineita.

gNSDOCID: <FI 111336B1 I > 4 111336

Edullisessa toteutusmuodossa vasta-aineet ovat monoklonaa-lisia vasta-aineita. Tarjotaan myös menetelmä S. epidermi-dis -isolaattien serotyypitystä varten, joka menetelmä sisältää vaiheet, joissa kasvatetaan S. epidermidis -isolaa-5 tin soluja ympäristössä, jossa käytettävissä olevan fosfaatin taso jäljittelee käytettävissä olevan fosfaatin tasoa in vivo; ja sekoitetaan solut tyyppispesifisten vasta-aineiden kanssa, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu tyyppiä I vastaan spesifisistä vasta-aineista ja tyyppiä II 10 vastaan spesifisistä vasta-aineista; ja tarkkaillaan solujen ja vasta-aineiden seosta agglutinaation suhteen.

Muita tämän keksinnön tarkoituksia, puolia ja etuja selviää seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta. Tarkoitus on kuitenkin, että vaikka yksityiskohtainen kuvaus 15 ja erityiset esimerkit osoittavat keksinnön edullisia suoritusmuotoja, ne on annettu ainoastaan havainnollistamista varten, koska erilaisia keksinnön henkeen ja piiriin kuuluvia muutoksia ja modifiointeja selviää alan ammatti-ihmisille tämän yksityiskohtaisen kuvauksen perusteella.

20 Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus Tässä on yllättäen havaittu, että viljelemällä bakteeria S. epidermidis olosuhteissa, jotka minimoivat liman muodostuksen ja lisäävät kapselipolysakkaridien tuotantoa, voidaan identifioida rajoitettu lukumäärä serotyyppejä, 25 jotka ovat yhteisiä useimmille kliinisille s. epidermidis -tapauksille. Tarkemmin sanoen on havaittu, että yli 85 % kliinisistä isolaateista osoittaa toista kahdesta vallitsevasta serotyypistä, joita nimitetään vastaavasti tyypiksi 1 ja tyypiksi 2. On määritetty, että kyseisistä kahdesta se-30 rotyypistä vastuussa olevat pinta-antigeenit ovat happamia polysakkarideja, jotka sisältävät aminouronihappoja ja muita aminosokereita. Nämä polysakkaridit ovat negatiivisesti varautuneita, liikkuen positiivista napaa kohti vastavir-taimmunoelektroforeesissa. Ne ovat myös tyyppispesifisiä, 35 toisin sanoen immunosaostus tuottaa yhden ainoan vyöhykkeen ainoastaan homologisen tyypin vastaseerumin kanssa.

BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 5 111336

Kuhunkin serotyyppiin liittyviä hapan polysakkaridi -antigeenejä voidaan hankkia hyödynnettävissä olevina määrinä S. epidermidis -isolaateilta, joita viljellään, sero-tyypitetään ja puhdistetaan noudattaen tässä kuvattuja oh-5 jeita, oleellisesti puhtaassa muodossa. Erityisesti puhdistettu antigeeni sisältää vähemmän kuin 1 % proteiinia ja vähemmän kuin 1 % nukleiinihappoja. "Hyödynnettävissä oleva" määrä tarkoittaa tässä yhteydessä, että eristetty happaman polysakkaridin määrä on todettavissa sellaisen meto-10 dologian avulla, joka on vähemmän herkkä kuin radioaktiivisuudella merkitseminen, kuten immunoanalyysi, ja sille voidaan suorittaa lisäkäsittelyjä, joihin sisältyy itse happaman polysakkaridin siirtäminen liuokseen.

Tässä esitetty hapan polysakkaridi -antigeeni-koos-15 tumus koostuu oleellisesti toisesta tai kummastakin hapan polysakkaridi -antigeeneistä, jotka liityvät vastaavasti tyyppiin I ja tyyppiin II. Toisin sanoen tällainen koostumus ei saa sisältää mitään ainetta, joka häiritsee immuunivasteen tuottamista hapan polysakkaridi -epitooppeja 20 vastaan, kun ne on annettu kohteelle rokotteena. Edullisessa toteutusmuodossa koostumus sisältää kumpaakin hapan polysakkaridi -antigeeniä.

S. epidermidis -serotyyppejä voidaan identifioida kliinisissä isolaateissa, joita kasvatetaan kasvualustalla, 25 joka jäljittelee mahdollisimman läheisesti in vivo : -olosuhteita. Erityisesti tämän kasvualustan tulisi tarjota ympäristö, jossa käytettävissä olevan fosfaatin määrä on pieni. Tällainen kasvualusta minimoi bakteerien limantuo-tannon ja lisää kapselipolysakkaridin, erityisesti happami-30 en polysakkaridien, tuotantoa. Tämä on selvästi päinvastoin kuin BHI-liemen ja trypsiinin avulla valmistetun soijalie-men (TSP) tapauksessa, joita elatusaineita tavallisesti käytetään S. epidermidis -tutkimuksissa ja joissa on runsaasti käytettävissä olevaa fosfaattia, noin 2,5 mg fos-35 faattia ml:aa kohti. Nämä elatusaineet lisäävät limantuo-tantoa. Kun S. epidermidis -bakteeria kasvatetaan kasvu- 0NSDOCID:<FI 111336B1 I > 6 111336 alustalla, joka jäljittelee in vivo -olosuhteita, se tuottaa pinta-antigeenejä, jotka eivät takerru lasiin tai muoviin. Tämän keksinnön yhteydessä edullinen elatusaine on muunnettu Columbia-liemi (Difco Laboratories, Detroit, 5 Michigan), jossa elatusaineessa käytettävissä olevan fosfaatin taso on 76 pg/ml. Tällainen elatusaine jäljittelee käytettävissä olevan fosfaatin in vivo -tasoa ihmisissä, joka on noin 23 - 46 pg/ml. Vähän tai ei ollenkaan limaa muodostuu, kun s. epidermidis kasvatetaan tässä elatusai-10 neessa.

Polysakkarideja voidaan eristää Columbia-liemessä kasvatettujen kliinisten S. epidermidis -isolaattien sekä soluista että supernatantista. Alkuvaiheessa viljelmät sentrifugoidaan ja solut ja supernatantit yhdistetään.

15 Polysakkaridi voidaan eristää supernatantista kon sentroimalla supernatantti, pesemällä se vedellä ja sitten peräkkäisessä järjestyksessä konsentroimalla se. Lopullinen saostuma liuotetaan veteen, dialysoidaan ja lyofilisoidaan.

Polysakkaridin eristämiseksi soluista ne hajotetaan 20 ensin entsyymien, lysostafiinin tai lysotsyymin avulla ja sitten sentrifugoidaan. Supernatantti saostetaan ja sitten sentrifugoidaan. Supernatantti peräkkäisessä järjestyksessä konsentroidaan, inkuboidaan ja sitten pelletoidaan sentri-fugoimalla. Pelletti liuotetaan uudelleen veteen, dialysoi-25 daan ja lyofilisoidaan.

Vaihtoehtoisesti lyofilisoitua ainetta uutetaan trikloorietikkahapolla ja sitten sentrifugoidaan. Peräkkäistä saostamista etanolilla seuraa liuottaminen tislattuun veteen, dialyysi ja lyofilisointi.

30 Soluista ja supernatanteista saatuja raakoja uut teita käsitellään edelleen. Kummassakin tapauksessa lyofi-lisoitu aine liuotetaan puskuriliuokseen ja syötetään ero-tuspylvääseen, joka on tasapainotettu samalla puskuriliuoksella. Pylvästä pestään syöttöpuskuriliuoksella ja eluoi-35 daan sitten suolagradientin avulla. Antigeeniä sisältävät fraktiot yhdistetään, konsentroidaan, dialysoidaan ja lyo- BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 7 111336 filisoidaan. Erottaminen voidaan toistaa paremman puhdistuksen aikaansaamiseksi. Puhdistettu polysakkaridi voidaan erotella koon mukaan sopivassa pylväässä ja fraktiot sitten yhdistää, konsentroida, dialysoida ja lyofilisoida.

5 Vallitsevat serotyypit S. epidermidikselle identi fioidaan alkuaan valitsemalla kaksi isolaattia ryhmästä, jossa on noin viidestä kymmeneen erilaisissa maantieteellisissä paikoissa sijaitsevista sairaaloista saatua s. epidermidis -isolaattia. Kanin vastaseerumeja tuotetaan kurnit) mailakin näistä kahdesta isolaatista käyttäen sellaista im-munointiohjetta kuin on kuvattu käytettävän julkaisussa McCarty ja Lancefield, J. Exp. Med. 102 (1955) 11 - 28. Vastaseerumeja absorboidaan kapseloitumattoman s. epidermidis -kannan kanssa. Mikäli tarpeellista, voidaan suorittaa li-15 säabsorptioita, jotta varmistettaisiin aktiivisuuden muita serotyyppejä vastaan poistaminen.

Kyseistä kahta vastaseerumia käytetään muiden, valitsemattomien S. epidermidis -isolaattien tyypitykseen. Jos valitut kaksi ensimmäistä isolaattia ovat samaa tyyp-20 piä, mitä osoittaa reaktiivisuuden muiden isolaattien kanssa identtinen esiintymismalli, valitaan lisäisolaatti niiden isolaattien ryhmästä, jotka eivät reagoineet kahden ensimmäisen valitun isolaatin kanssa. Tätä isolaattia vastaan tuotetaan kanin vastaseerumia, jota testataan sitten jäl-25 jellä olevien isolaattien kanssa reagoinnin suhteen. Tätä prosessia jatketaan, kunnes vallitsevat serotyypit s. epidermidikselle on identifioitu. Yllättäen on todettu, että kliinisistä s. epidermidis -tapauksista noin 85 % kuuluu toiseen kahdesta serotyypistä, joita nimitetään tyypiksi I 30 ja tyypiksi II.

Myöhempää serotyypitystä varten valmistetaan tyyp-pispesifisiä polyklonaalisia vasta-aineita kaneista, jotka on immunisoitu vastaavasti identifioidusta tyyppi I tai tyyppi II -isolaatista tuotetulla kokosolurokotteella. 35 Edustavia tyyppiä I ja tyyppiä II olevia S. epidermidis -organismeja on talletettu 19. marraskuuta 1991 kokoelmaan BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 8 111336 the American Type Culture Collection, Rockville, Md. ja niille on annettu vastaavasti talletusnumerot 55 254 ja 55 253. Isolaattien luokittelu serotyyppeihin voidaan suorittaa käyttäen vastaseerumeja tyyppi I ja tyyppi II -5 isolaatteja vastaan bakteeriagglutinaatioanalyysien avulla kuten on aikaisemmin kuvattu bakteeria s. aureus varten. Nelles et ai., Infect. Immun. 46 (1985) 14-18.

Serologista tyypitystä varten soluja kasvatetaan Columbia-liemikasvualustalla C02~paineessa. Solut poiste-10 taan maljoilta fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS). Lisätään proteaasia tulokseksi saadun jonkin verran tahmean suspension hajottamiseksi, aikaansaaden tasainen solususpensio. Entsymaattisen hajotuksen jälkeen polysakka-ridikapselit kiinnitetään solujen pinnalle agglutinaatio-15 analyysejä varten. Kiinnityskäsitellyt solut sentrifugoi-daan ja uudelleensuspendoidaan tuoreeseen PBS:seen. Ne se-rotyypitetään sitten tyypin I tai tyypin II vastaisilla vastaseerumeilla mikrotiitterilevyllä tai agglutinaatiotes-tissä objektilasilla.

20 Kumpaankin tyyppi I ja tyyppi II -serotyypeistä liittyy spesifinen pinta-antigeeni. Kanien vastaseerumit tunnistavat nämä pinta-antigeenit. Tietty prosenttiosuus isolaateista ei ole tyypitettävissä tyyppi I ja tyyppi II -isolaatteja vastaan tuotettujen vastaseerumien osajoukon 25 suhteen.

Tyyppiin I ja tyyppiin II liittyviä pinta-antigeenejä ei ole läsnä kapseloitumattomissa isolaateissa, jotka on sen sijaan päällystetty teikohapolla. Ne voidaan poistaa tai hajottaa autoklaavikäsittelyn avulla, aiheutta-30 en reaktiokyvyn spesifisten vastaseerumien kanssa menetys. Pinta-antigeeni, joka on tyyppiä I ei ristireagoi pinta-antigeenin kanssa, joka on tyyppiä II ja päinvastoin.

In. vitro -fagosytoosianalyysit osoittavat, että kummankin näistä pinta-antigeeneistä vastaiset vasta-aineet 35 suojaavat vastaavaa serotyyppiä olevien S. epidermidis -kantojen tartunnalta. Näihin kahteen serotyyppiin perustu- BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 9 111336 vaa rokotetta voidaan käyttää suojaamaan enemmistön kliinisistä S. epidermidis -kannoista tartunnalta.

Polysakkaridit itse ovat yleensä heikkoja T-soluista riippumattomia immunogeenejä ihmisillä, erityisest 5 potilailla, joilla on pienentynyt vastustuskyky. On sen vuoksi edullista konjugoida polysakkaridi immunokantajaan, tavallisesti polypeptidiin tai proteiiniin, joka on ratkaisevan tärkeä T- ja B-solujen väliselle tehokkaalle vuorovaikutukselle immuunivasteen aiheuttamiseksi heikkoa immu-10 nogeeniä vastaan. Immunokantaja lisää siten immunogeeni-syyttä sekä aktiivista immunointia varten että korkeatiit-teristen vastaseerumien valmistamiseksi vapaaehtoisissa passiivista immunointia varten. Erityisen edullisia immuno-kantajia tämän keksinnön mukaan ovat tetanustoksoidi, dif-15 teriatoksoidi, Pseudomonas aeruginosa - eksotoksiini A tai sen johdannaiset ja muut proteiinit, joita yleisesti käytetään immunokantajina. Sekä tyyppi I että tyyppi II -pinta-antigeenejä voidaan sitoa samaan immunokantajaan.

Edelleen tässä esitetään kyseistä kahta serotyyppiä 20 vastaavien polysakkaridien käyttöä sellaisten vastaseerumien tai monoklonaalisten vasta-aineiden (hiiren tai ihmisen) tuottamiseksi, jotka sitoutuvat sellaisiin bakteereihin tai neutraloivat bakteereja, joilla on nämä serotyypit. Ohjeita näiden vasta-aineiden tuottamiseksi on kuvattu julkaisuissa 25 Ausubel et ai. (toimittajat), kappale 11; Methods of hybri-doma formation 257 - 271, Bartal & Hirshaut (toimittajat), Humana Press, Clifton, NJ (1988); Vitetta et ai., Immunol. Rev. 62 (1982) 159 - 183 ja Raso, Immunol. Rev. 62 (1982) 93 - 117.

30 Rokotteita polyklonaalisten vasta-aineiden tuotta mista varten valmistetaan tyypillisesti dispergoimalla po-lysakkaridi-immunokantaja fysiologisesti siedettävään lai-mennusaineeseen kuten suolaliuokseen tai muihin adjuvant-teihin, jotka sopivat ihmiskäyttöön, vesivalmisteen muodos-35 tamiseksi. Immunostimuloiva määrä rokotetta annetaan nisäkkäälle ja rokotettua nisäkästä pidetään riittävän pitkän BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 10 111336 ajan verran, jotta polysakkaridipinta-antigeeni aiheuttaa suojaavia anti- tyyppi I tai anti- tyyppi II -vasta-aineita .

Vasta-aineet voivat käsittää vastaseerumivalmistei-5 ta, jotka ovat peräisin monenlaisista yleisesti käytetyistä eläimistä, esim. vuohista, kädellisistä, aaseista, sioista, kaneista, hevosista, kanoista, marsuista, rotista tai hiiristä, ja ihmisenkin vastaseerumeja sopivan valinnan ja puhdistuksen jälkeen. Eläinten vastaseerumit tuotetaan ro-10 kottamalla eläimet formaliinilla tapetulla tyyppi I tai tyyppi II - s. epidermidiksellä, käyttäen tavanomaisia menetelmiä, vuodattamalla verta eläimistä ja ottamalla talteen seerumi.

Tällä tavalla aiheutetut vasta-aineet voidaan koota 15 ja eristää halutun asteisesti käyttäen tunnettuja tekniikkoja kuten immunoaffiniteettikromatografiaa; toisin sanoen sitomalla antigeeni sellaiseen kromatografiapylväspakkauk-seen kuin Sephadex™, antamalla vastaseerumin kulkea pylvään läpi pidättäen siten spesifiset vasta-aineet ja erot-20 taen pois muut immunoglobuliinit ja epäpuhtaudet ja ottamalla sitten puhdistetut vasta-aineet talteen eluoimalla kaotrooppisen aineen avulla, mitä valinnaisesti seuraa li-säpuhdistus, esimerkiksi antamalla kulkea sellaisen pylvään läpi, jossa on sidottuja veriryhmäantigeenejä tai muita 25 tautia aiheuttamattomia lajeja. Tämä menetelmä voi olla edullinen eristettäessä haluttuja vasta-aineita sellaisten potilaiden seerumista, jotka ovat kehittäneet vasta-ainetiitterin kysymyksessä olevaa taudinaiheuttajaa vastaan, taaten siten sellaisten vasta-aineiden pidättäminen, 30 jotka kykenevät sitoutumaan pinta-antigeeneihin. Niitä voidaan sitten käyttää valmisteissa passiiviseen immunointiin S. epidermidistä vastaan.

Monoklonaalinen vasta-aine -valmiste sisältää, to-dettavuuden rajoissa, ainoastaan yhtä vasta-aineen yhdisty-35 miskohtalajia, joka kykenee tehokkaasti sitoutumaan po-lysakkaridipinta-antigeeniin, joka liittyy joko tyyppiin I

BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 11 111336 tai tyyppiin II. Sopivia vasta-aineita monoklonaalisessa muodossa voidaan valmistaa käyttäen tavanomaista hybridoo-mateknologiaa.

Sellaisten hybridoomien muodostamiseksi, joista 5 tuotetaan monoklonaalinen vasta-aine -valmiste, myelooma-tai muu itsensä ikuistava solulinja fuusioidaan sellaisten imusolujen kanssa, jotka on saatu tässä kuvatulla polypep-tidillä hyperimmunisoidun nisäkkään periferisestä verestä, imusolmukkeista tai pernasta. On edullista, että myeloo-10 masolulinja on samasta lajista kuin imusolut. Pernasoluja fuusioidaan tyypillisesti myeloomasolujen kanssa käyttäen polyeteeniglykoli 1500:aa. Fuusioituja hybridejä valitaan niiden herkkyyden HAT:lie avulla. Tässä kuvattuja vasta-ainemolekyylejä erittäviä hybridoomia voidaan identifioida 15 käyttäen ELISA-analyysiä.

Balb/C-hiiren perna, ihmisen periferinen veri, imusolmukkeet tai pernasolut ovat edullisia materiaaleja käytettäväksi valmistettaessa hiiren tai ihmisen hybridoomia. Sopivia hiiren myeloomia tässä käytettäväksi ovat hy-20 poksantiini-aminpteriini-tymidiiniherkät (HAT) -solulinjat, ja edullinen myelooma on P3X63-Ag8.653. Edullinen fuu-siopartneri ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamista varten on SHM-D33, heteromyelooma, joka on saatavissa kokoelmasta ATCC, Rockville, Md. nimityksellä CRL 1668.

25 Tässä kuvattu monoklonaalinen vasta-aine -valmiste voidaan tuottaa aloittamalla monoklonaalinen hybridoomavil-jelmä, joka käsittää sellaisen hybridooman sisältävän ela-tusaineen, joka erittää sopivan polypeptidispesifisyyden omaavia vasta-ainemolekyylejä. Viljelmää ylläpidetään sel-30 laisissa olosuhteissa ja riittävän pitkän ajan, että hybri-dooma erittää vasta-ainemolekyylejä elatusaineeseen. Vasta-ainetta sisältävä elatusaine kootaan sitten. Vasta-ainemolekyylit voidaan sitten lisäksi eristää tunnettujen tekniikkojen avulla.

35 Materiaaleja, jotka ovat hyödyllisiä näiden valmis teiden aikaansaamista varten, sekä tunnetaan alalla että on gfjSDOCID: <FI 111336B1 I > 12 111336 kaupallisesti saatavissa ja ne käsittävät synteettisiä vil-jelyaineita, sisäsiitettyjä hiiriä ja vastaavia. Esimerkillinen synteettinen elatusaine on Dulbeccon vähimmäiselatus-aine, johon on lisätty 4,5 g/1 glukoosia, 20 mm glutamiinia 5 ja 20 % sikiökautisen vasikan seerumia. Esimerkillinen si-säsiitetty hiirikanta on Balb/c.

Muut menetelmät monoklonaalinen vasta-aine -valmisteiden tuottamiseksi ovat myös mahdollisia kuten lajienvä-liset fuusiot, koska vasta-aineiden antigeenispesifisyys 10 pääasiallisesti vaikuttaa niiden hyödyllisyyteen tässä yhteydessä. Ihmisen imusoluja, jotka on saatu tartunnan saaneilta henkilöiltä, voidaan fuusioida ihmisen myeloomasolu-linjan kanssa hybridoomien tuottamiseksi, jotka hybridoomat voidaan seuloa tyyppi I ja tyyppi II -pinta-antigeenejä 15 tunnistavien vasta-aineiden tuottamisen suhteen. Edullisempi on tässä yhteydessä kuitenkin menetelmä, johon ei sisälly tartunnan saaneelta ihmiseltä peräisin olevan biologisen näytteen käyttöä. Esimerkiksi kohde, joka on immunisoitu tässä kuvatun mukaisella rokotteella, voi toimia sellaisten 20 vasta-aineiden lähteenä, jotka sopivat käytettäviksi vasta-ainevalmisteessa tässä keksinnössä.

Erityisen edullisessa suoritusmuodossa tuotetaan monoklonaalisia vasta-aineita tyyppi I ja tyyppi II -pinta-antigeenejä vastaan käyttäen samanlaisia menetelmiä kuin on 25 kuvattu bakteerin S. aureus vastaisia tyyppispesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita varten. Puhdistetut monoklonaaliset vasta-aineet karakterisoidaan bakteeriagglutinaatio-analyysien avulla käyttäen kliinisten isolaattien kokoelmaa .

30 Tämän kuvauksen mukaan tuotettuja monoklonaalisten ja polyklonaalisten vasta-aineiden valmisteita voidaan käyttää immuunivasteen aiheuttamiseksi tyyppi I tai tyyppi II - S. epidermidis -tartunnan ehkäisemistä tai hoitoa varten. Tässä yhteydessä vasta-ainevalmiste voi olla polyklo-35 naalinen valmiste. Tällainen polyklonaalinen valmiste voi käsittää vasta-aineita jotka sitoutuvat sekä tyyppiin I et- BNSOOCID: <FI 111336B1 I > 13 111336 tä tyyppiin II, tai se voi käsittää vasta-aineita, jotka sitoutuvat ainoastaan toiseen kahdesta tyypistä. Polyklo-naalinen vasta-ainekomponentti voi olla polyklonaalinen vastaseerumi, edullisesti affiniteettipuhdistettu, eläimes-5 tä, jota on ärsytetty sekä tyyppi I että tyyppi II -pinta-antigeeneillä ja siten stimuloitu tuottamaan spesifisiä vasta-aineita sekä tyyppi I että tyyppi II -pinta-antigeenejä vastaan. Toinen vaihtoehto on käyttää "järjestettyä polyklonaalista" seosta, joka on seos, jossa on 10 tyyppi I -pinta-antigeenin vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita ja tyyppi II -pinta-antigeenin vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita.

Kummassakin polyklonaalisten seosten tyypissä voi olla edullista yhdistää polyspesifisiä vasta-aineita toi-15 siinsa kemiallisesti sellaisen yhden ainoan polyspesifisen molekyylin muodostamiseksi, joka kykenee sitoutumaan kumpaan tahansa pinta-antigeeniin. Yksi tapa suorittaa tällainen yhdistäminen on valmistaa kahdenarvoisia F(ab’)2~hyb-ridifragmentteja sekoittamalla kahta erilaista F(ab')2-20 fragmenttia, jotka on tuotettu esim. pilkkomalla pepsiinin avulla kahta erilaista vasta-ainetta, halkaisemalla pelkis-tävästi Fab'-fragmenttien seoksen muodostamiseksi ja uudel-leenmuodostamalla sen jälkeen hapettavasti disulfidisidok-set sellaisen F(ab')2-fragmenttien seoksen tuottamiseksi, 25 joka sisältää kummallekin alkuperäisistä antigeeneistä spesifisen Fab'-osan sisältäviä hybridifragmentteja. Menetelmiä tällaisten hybridivasta-ainefragmenttien valmistamiseksi on esitelty julkaisuissa Feteanu, Labeled antibodies in biology and medicine 321 - 323, McGraw-Hill Int'l Book Co. 30 (1978); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 93 (1961) 470 ja Hammerling et al., J. Exp. Med. 128 (1968) 1461 ja US-patentissa 4 331 647.

Tämän kuvauksen mukaan tuotettu vasta-ainekomponentti voi käsittää kokonaisia vasta-aineita, vasta-35 ainefragmentteja tai alafragmentteja. Vasta-aineet voivat olla minkä tahansa luokan kokonainen immunoglobuliini 0NSOOCID:<FI 111336B1 I > 14 111336 (IgG), esim. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, kimeerisiä vasta-aineita tai hybridivasta-aineita, joilla on kahtalainen pinta-antigeenispesifisyys, tai fragmentteja, esim. F(ab')2, Fab', Fab ja vastaavia, mukaan lukien hybridifrag-5 mentteja, ja lisäksi käsittävät minkä tahansa immunoglobu-liinin tai minkä tahansa luonnollisen, synteettisen tai geenimanipulaation avulla tuotetun proteiinin, joka toimii kuten vasta-aine sitoutumalla spesifiseen antigeeniin muodostaakseen kompleksin. Erityisesti Fab-molekyylejä voidaan 10 ilmentää ja koota geneettisesti transformoidussa isännässä kuten E. coli-bakteerissa. On saatavissa lambdavektorijärjestelmä sellaisten Fab:ien joukon ilmentämiseksi, joiden mahdollinen erilaisuus on yhtä suuri tai suurempi kuin edeltäjävasta-aineen aikaansaavalla henkilöllä. Katso Huse, 15 W.D. et ai., Science 246 (1989) 1275 - 1281.

Tyyppiin I ja/tai tyyppiin II liittyvä hapan polysakkaridi -antigeeni voi olla aktiivinen aines koostumuksessa, joka lisäksi sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen aktiivista ainesta varten ja jota voidaan 20 käyttää rokotteena solusidonnaisen immuunivasteen ja/tai sellaisten vasta-aineiden tuotannon in vivo aiheuttamiseksi, jotka taistelevat S. epidermidis -tartuntaa vastaan. Tässä yhteydessä farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine on aine, jota voidaan käyttää vehikkelinä lääkkeen antami-25 seksi, koska aine on inertti tai muuten lääketieteellisesti hyväksyttävä sekä polypeptidi- aktiivisen aineen kanssa yhteen sopiva rokotteen antamisen yhteydessä. Sopivan täyteaineen lisäksi farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine voi sisältää tavanomaisia rokotteen lisäaineita kuten lai-30 mennusaineita, adjuvantteja, antioksidantteja, säilytysai-neita ja liuottavia aineita.

Keksinnön mukaisesti valmistettava rokote voidaan antaa kohteelle, joka ei ole vielä saanut S. epidermidis -tartuntaa, jotta siten aiheutettaisiin vaste (humoraalinen 35 tai solusidonnainen) vastaavia bakteerien serotyyppejä vastaan tuossa kohteessa. Vaihtoehtoisesti tämän keksinnön mu- BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 15 111336 kaisesti valmistettava rokote voidaan antaa kohteelle, jossa S. epidermidis -tartunta on jo tapahtunut mutta on riittävän varhaisessa vaiheessa, niin että vasteena rokotetta vastaan tuotetut vasta-aineet tehokkaasti estävät tartunnan 5 lisäleviämistä.

Toisen lähestymistavan mukaan keksinnön mukaisesti valmistettava rokote voidaan antaa kohteelle, joka sitten toimii spesifisen rokotteen aiheuttamaan ärsytykseen vasteena tuotetun globuliinin ("hyperimmuuniglobuliini") läh-10 teenä, joka globuliini sisältää S. epidermidistä vastaan suunnattuja vasta-aineita. Siten käsitelty kohde luovuttaisi plasmaa, josta hyperimmuuniglobuliini saataisiin sitten tavanomaisen plasmaniraktiointimetodologian avulla ja annettaisiin toiselle kohteelle vastustuskyvyn antamiseksi s. 15 epidermidis -tartuntaa vastaan tai tartunnan hoitamiseksi.

Bakteeriverisyyden aiheuttaminen nisäkkäillä vaatii erittäin suuria määriä organismeja tai jonkin edeltävän menettelyn isännän vastustuskyvyn heikentämiseksi. In vitro -fagosytoosia voidaan kuitenkin tutkia suojaavan immunitee-20 tin in vivo korrelaattina. Tässä mallissa tyyppispesifisten monoklonaalisten ja polyklonaalisten vasta-aineiden kyky opsonisoida S. epidermidis in vitro mitataan fagosytoosin avulla noudattaen menetelmää, joka on kuvattu julkaisuissa Kojima et ai., J. Infect. Dis. 162 (1990) 435 - 551 ja Fat-25 tom et ai., Infect. Immun. 58 (1990) 2367 - 2374. Tyyppi I ja tyyppi II -rokotteiden avulla aiheutetut vasta-aineet helpottavat tyyppispesifistä fagosytoosia.

Tätä keksintöä kuvataan lisää seuraavien havainnollisten esimerkkien yhteydessä.

30 Esimerkki 1 S. eoidermiri-i.a -kantojen kokoaminen Kliinisiä S. epidermidis -isolaatteja saatiin erilaisilla maantieteellisillä sijaintipaikoilla olevista sairaaloista. Isolaatit olivat kaikki veri-isolaatteja. Iso-35 laattien identifiointi lajiksi S. epidermidis varmistettiin. Useimmissa tapauksissa sairaala toimitti synopsiksen pNSDOCID: <FI 111336B1 I > 16 111336 tartuntatapauksesta ja hoidon tuloksesta sekä biokemiallisen identifioinnin ja herkkyyttä mikrobienvastaisille aineille koskevien määritysten tuloksia.

Esimerkki 2 5 Sh. epidermidis -kantojen viljely

Isolaatteja kasvatettiin maljoilla, joissa oli Co-lumbia-agaria (Difco) täydennettynä 4 %:lla NaCl, 37 °C:ssa C02~paineessa. Eristetty bakteeripesäke poistettiin 500 ml:n kolviin, joka sisälsi Columbia-lientä (Difco) täyden-10 nettynä 4 %:lla NaCl. Sen jälkeen kun oli kasvatettu kolmesta viiteen tuntia, kuhunkin kuudesta kahden litran Fern-bach-kolvista, jotka sisälsivät 1,2 litraa Columbia-suolalientä, istutettiin 50 ml siemenviljelmää. Fernbach-kolveja kasvatettiin New Brunswick -ravistimella yön ajan 15 37 °C:ssa. Solut koottiin sentrifugoimalla nopeudella 10 000 g 30 minuutin ajan ja supernatantit ja solut yhdistettiin .

Esimerkki 3

Lajin S. epidermidis vallitsevien serotyyppien 20 identifiointi

Viidestä kymmeneen S. epidermidis -isolaattia hankitaan eri sairaaloista, kasvatetaan Columbia-liemessä ja kootaan kuten esimerkissä 2. Kahdesta isolaatista peräisin olevia soluja kiinnitetään 1 % formaliinin avulla. Käyte-25 tään julkaisun McCarty ja Lancefield, yllä, immunointisuun-nitelmaa kullekin valituista isolaateista spesifisten kanin vastaseerumien tuottamiseksi. Vastaseerumeja absorboidaan kapseloitumattoman S. epidermidis -kannan kanssa. Mikäli tarpeellista, suoritetaan lisäabsorptioita aktiivisuuden 30 muita serotyyppejä vastaan poistamisen varmistamiseksi.

Kyseistä kahta vastaseerumia käytetään muiden, valitsemattomien S. epidermidis -isolaattien tyypitykseen. Jos ensimmäiset kaksi valittua isolaattia ovat samaa tyyppiä, minkä osoittaa identtinen reaktiivisuuden muiden iso-35 laattien kanssa esiintymismalli, valitaan lisäisolaatti sellaisten isolaattien ryhmästä, jotka eivät reagoineet BNSDOCID: <FI 111336B1 | > 17 111336 kahden ensimmäisen valitun isolaatin kanssa. Kanin vas-taseerumia tuotetaan tätä isolaattia vastaan, joka testataan sitten jäljellä olevien isolaattien kanssa reagoinnin suhteen. Tätä menettelyä jatketaan, kunnes on identifioitu 5 kaksi vallitsevinta serotyyppiä lajille S. epidermidis. Nämä kaksi serotyyppiä vastaavat noin 85 %:sta kliinisistä isolaateista. (Katso taulukko 1 esimerkissä 7.)

Esimerkki 4

Tyyppi I ja tyyppi II -spesifisten kanin vastasee-10 rumien valmistus

Puhdistettuja hapan polysakkaridi -antigeenejä saatiin s. epidermidiksestä, joka oli identifioitu joko tyyppiä I tai tyyppiä II olevaksi ja joka oli kasvatettu Colum-bia-liemessä ja koottu kuten esimerkissä 2. Solut kiinni-15 tettiin 1 % formaliinin avulla. Käytettiin julkaisun Mac-Carty ja Lancefield, yllä, immunointisuunnitelmaa kummallekin tyypeistä tyyppi I ja tyyppi II spesifisten kanin vas-taseerumien tuottamiseksi. Vastaseerumeja absorboitiin kap-seloitumattoman s. epidermidis -kannan kanssa.

20 Esimerkki 5 S. epidermidis - tyyppi I ja tyyppi II -polysakkaridien eristäminen

Supernatantista:

Supernatantti konsentroitiin, pestiin tislatulla 25 vedellä ja peräkkäisessä järjestyksessä saostettiin 25 % etyylialkoholin avulla, johon oli lisätty 5 - 10 mM CaCl2, 4 °C:ssa kuuden tunnin ajan yön aikana. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti saostettiin 75 % etyylialkoholissa, johon oli lisätty 5 - 10 mM CaCl2- 75 %:n saostuma liuotet-30 tiin tislattuun veteen, dialysoitiin tislattua vettä vastaan yön ajan ja sitten lyofilisoitiin.

Soluista:

Solut hajotettiin entsyymien, lysostafiinin tai ly-sotsyymin, avulla tai niitä uutettiin 5 % trikloorietikka-35 hapolla 4 °C:ssa kahdesta kolmeen päivän ajan. Soluja sent-rifugoitiin sitten nopeudella 10 000 g 30 minuutin ajan.

BNSDOCID:<FI 111336B1 I > 111336 18

Supernatanttia saostettiin 25 % etyylialkoholin avulla, johon oli lisätty 5 - 10 mM CaCl2, 4 °C:ssa yön ajan. Sentri-fugoinnin jälkeen supernatantti saostettiin 75 % etyylialkoholin avulla, johon oli lisätty 5-10 mM CaCl2 - Sen jäl-5 keen kun oli inkuboitu 4 °C:ssa yön ajan, saostuma pelle-toitiin sentrifugoimalla nopeudella 10 000 g 30 minuutin ajan, liuotettiin uudelleen tislattuun veteen, sitä dialy-soitiin tislattua vettä vastaan yön ajan ja se lyofilisoi-tiin sitten.

10 Esimerkki 6 S. epidermidis - tyyppi I ja tyyppi II -pinta-antigeenien puhdistus

Raa'at lyofilisoidut uutteet esimerkistä 5 liuotettiin 0,05 natriumasetaattipuskuriliuokseen pH-arvossa 6,0, 15 niin että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 50 - 100 mg/ml. Jos raa'assa uutteessa on epäpuhtauksina runsaasti nukleiinihappoja ja/tai proteiineja, sitä voidaan esikäsitellä RNAsen, DNAsen ja/tai proteaasin avulla ennen lisäkäsitte-lyä. Liuotettu raaka uute syötettiin DEAE-sefaroosipyl-20 vääseen, joka oli taspainotettu samalla puskuriliuoksella, määränä noin 10 mg/ml geeliä. Sen jälkeen kun pylvästä oli pesty syöttöpuskuriliuoksella, kunnes ei havaittu absorptiota aallonpituudella 206 nm, pylvästä eluoitiin gradien-tilla, joka käsittää 0 - 0,3 M NaCl 0,05 M natriumasetaat-25 tipuskuriliuoksessa pH-arvossa 6,0. Immunosaostusta käyttäen esimerkin 4 mukaan valmistettuja tyyppispesifisiä vas-taseerumeja käytettiin antigeeniä sisältävien fraktioiden identifiointiin. Tyyppi I ja tyyppi II -antigeenit eluoitu-vat samalla molaarisuudella kuin tunnetut stafylokokki-30 aminouronihappopolymeerit. Puhdistettujen tyyppi I ja tyyppi II -antigeenien hapan hydrolyysi osoittaa myös, että ne sisältävät aminouronihappoja.

Antigeeniä sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ultrasuodatus-Amicon-kalvon avulla, dialysoi-35 tiin tislattua vettä vastaan neljä kertaa ja lyofilisoi-tiin. Tämä menetelmä toistettiin, kun haluttiin antigeenin BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 111336 19 parempaa puhdistusta. Puhdistettu polysakkaridi eroteltiin koon mukaan käyttäen geelisuodatuspylvästä kuten sefaroosi 6B -pylvästä tai Sephacryl S-300 -pylvästä. Antigeeni elu-oituu samalla kohdalla kuin lajilta S. aureus peräisin ole-5 vien tyyppi 5 ja tyyppi 8 -antigeenien kapseliantigeeni. Polysakkaridifraktiot yhdistettiin, konsentroitiin käyttäen ultrasuodatus-Amicon-kalvoa, dialysoitiin tislattua vettä vastaan ja lyofilisoitiin. Tämän puhdistuksen tulos on tyyppi I tai tyyppi II -antigeeni oleellisesti puhtaassa 10 muodossa.

Puhdistettujen tyyppi I ja tyyppi II -antigeenien proteiini- ja nukleiinihappoanalyysi paljasti, ettei kumpikaan antigeeni sisällä proteiinia tai nukleiinihappoja. Trypsiinihydrolyysi paljasti, että tyyppi I ja tyyppi II 15 -antigeenit ovat trypsiiniä vastaan kestäviä. Kun soluja lämpökäsiteltiin 100 °C:ssa kolmenkymmenen minuutin ajan, poistettiin selektiivisesti pinta-antigeenit, toisin sanoen teikohappo ei poistunut. Ennen lämpökäsittelyä solut eivät reagoineet antiteikohappovastaseerumin kanssa, kun taas 20 lämpökäsittelyn jälkeen solut reagoivat.

Esimerkki 7

Kliinisten isolaattien serotyypitys

Kliinisiä isolaatteja, jotka oli kasvatettu Colum-bia-liemessä tai Columbia-agarmaljoilla kuten on kuvattu 25 esimerkissä 2, kiinnityskäsiteltiin 1 % formaliinin avulla. Jos isolaatit oli kasvatettu agarmaljoilla, solut ensin kaavittiin maljoilta, suspendoitiin PBS-liuokseen ja lisättiin 20 - 50 mikrogrammaa/ml proteaasia. Jos solut oli kasvatettu Columbia-liemessä, ne uudelleensuspendoitiin PBS-30 liuokseen ja lisättiin 20 - 50 mikrogrammaa/ml proteaasia. Solut laimennettiin PBS:lla optisen tiheyden arvoon 0,5. Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa yhden tunnin ajan ja niille suoritettiin sitten kiinnitystä 1 % formaliinin avulla huoneenlämpötilassa yön ajan. Solut pestiin PBSrlla ja levyag-35 glutinaatio suoritettiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterile-vyillä tai objektilasilla käyttäen formaliinilla kiinnitys- BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 111336 20 käsiteltyjen solujen suspensiota. Yhtä suuret tilavuudet soluja ja vastaseerumia, joka oli valmistettu esimerkin 4 mukaan, sekoitettiin ja niiden annettiin agglutinoitua mik-rotiitterilevyllä. Vaihtoehtoisesti soluja ja esimerkin 4 5 mukaan valmistettua vastaseerumia sekoitettiin yhtä suurina tilavuuksina objektilasilla ja pyöritettiin useiden minuuttien ajan. Agglutinaation läsnäolo tai puuttuminen arvioitiin. Serotyypitystuloksia varmistetuille bakteeriveri-isolaateille, jotka ovat peräisin erilaisista maantieteelle) lisistä sijaintipaikoista Yhdysvalloissa, on esitetty taulukossa 1. Tietty prosenttiosuus isolaateista ei ole tyypitettävissä (NT) .

Taulukko 1 Lähde Tyyppi I Tyyppi II NT Kokonais- 15 määrä

Wash. DC 16 (41 %) 21 (54 %) 2 (5 %) 39 (100 %)

Maryland 4 (8 %) 28 (62 %) 13 (29 %) 45 (100 %)

Tennessee 0 (0 %) 12 (92 %) 1 (8 %) 13 (100 %) 20 London 9 (23 %) 27 (69 %) 3 (7 %) 39 (100 %)

Mass. 1 (10 %) 8 (80 %) 1 (10 %) 10 (100 %) kokonaismäärä 30 (20 %) 96 (66 %) 20 (14 %) 146 (100 %)

Esimerkki 8 25 Polyklonaalisten ja monolonaalisten anti- S_i. epi- dermidis -vasta-aineiden tuottaminen BALB/c-hiiriä immunisoidaan formaliinin avulla kiinnityskäsitellyillä bakteereilla. Hankitaan seerumit ja ne seulotaan tyyppispesifisen vasteen suhteen bakteeriag-30 glutinaatioanalyysin avulla kuten on kuvattu esimerkissä 7. Kun on saatu osoitus hyperimmuunivasteesta, hiiret immunisoidaan kolme päivää ennen fuusiota. Immuuneilta hiiriltä saatuja pernasoluja fuusioidaan soluihin, jotka ovat peräisin AG653-solulinjasta tai SHM D33:sta (kummatkin saatavis-35 sa kokoelmasta ATCC, Rockville, Md.) tai toisen näistä so-lulinjoista kloonista tai alakloonista, käyttäen menetel- BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 21 111336 mää, joka on kuvattu teoksessa Fuller et ai., Current protocols in molecular biology, New York: J. Wiley and Sons (1989), kappaleet 11.3.2 - 11.11.4. Hybridoomia seulotaan tyyppispesifisen vasta-aineen suhteen bakteeriagglutinaa-5 tioanalyysin ja ELISAin avulla käyttäen mikrotiitterilevy-jä, jotka on päällystetty joko formaliinin avulla kiinni-tyskäsitellyillä kokonaisilla bakteereilla tai puhdistetuilla solunpintakomponenteilla. Positiivisista kuopista saatuja soluja kloonataan rajoittavan laimennuksen avulla. 10 Milligrammamääriä vasta-ainetta valmistetaan vesivatsanes-teissä ja puhdistetaan proteiini A, proteiini G tai DEAE-sefaroosipylväskromatografiän avulla.

Esimerkki 9

In vitro -fagosytoosikoe 15 Liuskatumaisia neutrofiilejä (PMN) ja monosyyttejä valmistetaan periferisestä ihmisverestä. PMN:t ja monosyy-tit uudelleensuspendoidaan RPMI- (Gibco) tai samankaltaiseen soluviljelyaineeseen, jossa on 5 % lämmöllä inaktivoi-tua sikiökautisen vasikan seerumia, s. epidermidis -soluja, 20 jotka on kasvatettu Columbia-liemessä, pestään ja lisätään joko PMN:en tai monosyyttien joukkoon yhdessä koevasta-aineen kanssa. Sen jälkeen kun on inkuboitu 37 °C:ssa varovaisesti pyörittäen, näytteitä poistetaan ajankohtina 0, 60 ja 120 minuuttia inkuboinnin jälkeen ja levitetään Colum-25 bia-suola-agarmaljoille. Sen jälkeen kun on inkuboitu yön ajan 37 °C:ssa, määritetään pesäkkeiden lukumäärä.

BNSDOCID: <FI 111336B1 i >

Claims (13)

111336 22

1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää Staphylococcus epidermis -bakteerin polysakkari- 5 diantigeenin, tunnettu siitä, että kasvatetaan sellaisen eristetyn S. epidermis tyyp-pi I:n soluja, joka agglutinoi ATCC 55254:n antiseerumia; uutetaan polysakkaridiantigeeni soluista raa'an tyyppi I polysakkaridiantigeeniuutteen tuottamiseksi; 10 puhdistetaan raakauute puhdistetun antigeenin tuottamiseksi, joka sisältää vähemmän kuin 1 % proteiinia; viedään puhdistettu antigeeni erotuspylvääseen ja eluoidaan se NaCl-gradientilla; ja tunnistetaan ja eristetään fraktiot, jotka sisällä tävät tyyppi I polysakkaridiantigeenia käyttäen vasta- aineita, jotka ovat spesifisiä tyyppi I isolaatille; ja sekoitetaan antigeeni steriilin farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että NaCl gradientti on 0 - 0,3 M.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridiantigeenin uute-vaiheeseen kuuluu käsittely trikloorietikkahapolla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että polysakkaridiantigeenin uute- vaiheeseen kuuluu käsittely 5 %:lla trikloorietikkahapolla 4 °C:ssa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridiantigeenin uute- 30 vaiheeseen kuuluu käsittely entsyymeillä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridiantigeenin uute-vaiheeseen kuuluu käsittely lysostafiinilla tai lysotsyy-millä. BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 111336 23

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa raakauute käsitellään proteaasilla.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että solut kasvatetaan Columbia- ravintoliemessä.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe, jossa tunnistetaan fraktiot, jotka sisältävät polysakkaridiantigeenin, käsit- 10 tää immunosaostuksen.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa raakauute saostetaan perättäin 25 - 75 %:lla etyylialkoholia .

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tunnistaminen käsittää sellaisten fraktioiden valitsemisen ja yhdistämisen, jotka antavat yhden ainoan vyöhykkeen immunosaostuksessa tyyppi I vastaisen antiseerumin kanssa.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridiantigeeni konju-goidaan immunokantajaan.

13. Menetelmä hyperimmunoglobuliinin valmistamiseksi, joka sisältää vasta-aineita Staphylococcus epxder-25 mis-bakteerin polysakkaridiantigeenia vastaan, joka on saatu menetelmällä, jossa kasvatetaan sellaisen eristetyn s. epidermis tyyppi I:n soluja, joka agglutinoi ATCC 55254:n antiseerumia; uutetaan polysakkaridiantigeeni soluista raa'an 30 tyyppi I polysakkaridiantigeeniuutteen tuottamiseksi; puhdistetaan raakauute puhdistetun antigeenin tuottamiseksi, joka sisältää vähemmän kuin 1 % proteiinia; viedään puhdistettu antigeeni erotuspylvääseen ja eluoidaan se NaCl-gradientilla; ja 35 tunnistetaan ja eristetään fraktiot, jotka sisäl tävät tyyppi I polysakkaridiantigeenia käyttäen vasta- BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 111336 24 aineita, jotka ovat spesifisiä tyyppi I isolaatille; tunnettu siitä, että hyperimmunoglobuliini saadaan plasmasta, joka sisältää kyseisiä vasta-aineita. BNSDOCID: <FI 111336B1 I > 25 111336