ES2198405T3 - Antigenos de superficie de tipo i asociados a staphylococcus epidermis. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN PROCESO PARA EL CULTIVO DE CELULAS DE STAFILOCOCCUS EPIDERMIDIS CLINICAS CUYA REPRODUCCION PERMITE LA IDENTIFICACION DE UN NUMERO LIMITADO DE SEROTIPOS PREDOMINANTES. SE HAN IDENTIFICADO LOS DOS SEROTIPOS PREDOMINANTES COMUNES A LA MAYORIA DE LOS CASOS CLINICOS DE S. EPIDERMIDIS Y SE LES HA DENOMINADO TIPO I Y TIPO II. HAY UN ANTIGENO TENSIOACTIVO DE POLISACARIDOS ASOCIADO A CADA UNO DE LOS SEROTIPOS TIPO I Y TIPO II. LOS ANTIGENOS TENSIOACTIVOS SE PUEDEN UTILIZAR PARA PROPORCIONAR UNA INMUNIZACION ACTIVA Y PASIVA CONTRA LAS INFECCIONES PROVOCADAS POR EL S. EPIDERMIDIS Y PARA PRODUCIR UNA INMUNOGLOBULINA HIPERINMUNE O ANTICUERPOS PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES PROVOCADAS POR EL S. EPIDERMIDIS.

Description

Antígenos de superficie de tipo I asociados a Staphylococcus epidermis.

La presente invención se refiere a serotipos particulares de Staphylococcus epidermidis, y a una vacuna producida usando estos antígenos de superficie asociados a estos serotipos. Las infecciones de Staphylococcus coagulasa negativos son causa la principal de bacteremia en pacientes hospitalizados. Se ha descubierto que en particular S. epidermidis, considerado formalmente como no patógeno, es un factor significativo en esta bacteremia. La morbilidad y mortalidad de una infección por S. epidermidis son especialmente altas entre los pacientes que requieren dispositivos médicos prostéticos. Se cree que esto es consecuencia de un mucus producido por S. epidermidis que permite la adherencia y colonización de estos dispositivos médicos, como por ejemplo catéteres y válvulas cardiacas.

Puesto que se cree que el mucus es el factor responsable de la infección por S. epidermidis, la atención se ha centrado en aquellos aspectos de la superficie que median la adhesión a cuerpos extraños. Varios investigadores han identificado un mucus extracelular, y se han usado condiciones de cultivo que potencian la producción de este mucus.

Además de centrarse en el mucus producido por S. epidermidis, las investigaciones hasta el momento se han dirigido mayormente a un número limitado de cepas específicas de las bacterias que han sido aisladas. Ichiman y col. estudiaron tres cepas de S. epidermidis que cultivaron en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Sin embargo, la inmunización de ratones con los polisacáridos de la superficie celular de estos microorganismos cultivados no fue efectiva proporcionando protección contra cepas heterólogas. La caracterización de los polisacáridos de superficie que se habían aislado mostró una heterogeneidad serológica. Ichiman y col., J. Appl. Bact. 51: 229-241 (1981). En la técnica anterior se describen los antígenos de la superficie celular de tipo I, II y III de las cepas ATCC31432, SE-360 y SE-10 de S. epidermidis (Ichiman y col., J. Appl. Bact. 63: 165-169, 1987; Ichiman y col., Can. J. Microbiol. 37/5, 05/1991, 404-407, Ichiman y col., J. Appl. Bact. 71: 176-181, 1991; y en el documento US-A-4 197 290), así como una adhesina aislada de la cepa RP-62A de S. epidermidis (documento US-A-5 055 455).

Según Ichiman, para ser una vacuna efectiva para un uso clínico debiera aislarse cada cepa infectiva y desarrollarse una vacuna contra cada sepa. Esto sería impracticable desde el punto de vista práctico.

Sumario de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar una vacuna efectiva para el uso clínico contra una infección por S. epidermidis.

Es aún otro objeto de la invención proporcionar una vacuna que sea efectiva contra la mayoría de las cepas clínicamente patógenas de S. epidermidis.

Un objeto más de la invención es preparar antisueros policlonales específicos de los antígenos de superficie asociados a los aislamientos clínicos de S. epidermidis.

Otro objeto de la invención es proporcionar anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie asociados a los serotipos clínicos predominantes de S. epidermidis, que se pueden usar para proteger o tratar frente a una infección por S. epidermidis.

Aún otro objeto de la invención es proporcionar IVIG hiperinmune para proteger o tratar frente a una infección por S. epidermidis.

Estos y otros objetos de acuerdo con la invención se consiguen mediante de una composición que consiste esencialmente en al menos uno de los antígenos de superficie de tipo I de S. epidermidis. También se proporciona una vacuna que comprende esta composición y un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable. Se puede administrar una cantidad inmunoestimulante de esta vacuna a un sujeto. Este sujeto puede estar ya infectado por S. epidermidis cuando se administre dicha vacuna. Alternativamente se puede administrar la vacuna a un donador de plasma, estimulando a ese donador a producir una globulina hiperinmune que contiene anticuerpos contra S. epidermidis. Después se puede administrar a un sujeto una cantidad inmunoestimulante de esta globulina hiperinmune.

De acuerdo con la presente invención también se proporciona una composición que consiste esencialmente en anticuerpos que se unen a los antígenos de superficie de tipo I. En una realización preferida estos anticuerpos no se obtienen por un procedimiento que comprende la etapa de proporcionar una muestra biológica de un sujeto humano infectado por S. epidermidis. La composición de anticuerpos de acuerdo con la invención podría ser una composición de anticuerpos monoclonales. Se pueden administrar a un sujeto cantidades inmunoestimulantes de las composiciones de anticuerpos de acuerdo con la invención, particularmente las composiciones de anticuerpos monoclonales, para prevenir o tratar las infecciones por S. epidermidis.

Otros objetos, aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se ha de entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las realizaciones preferidas de la invención, se dan sólo a modo de ilustración, ya a partir de esta descripción detallada serán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención para los expertos en la técnica.

Descripción detallada de la realización preferida

Sorprendentemente se ha descubierto, de acuerdo con la presente invención, que cultivando S. epidermidis en condiciones que minimizan la formación de mucus y fomentan la producción de los polisacáridos capsulares, se puede identificar un número limitado de serotipos comunes para la mayoría de los casos clínicos de S. epidermidis. Más en particular, se ha encontrado que más del 85% de los aislamientos clínicos presentan uno de los dos serotipos predominantes, denominados tipo I o tipo II respectivamente. Se ha determinado que los antígenos de superficie responsables de los dos serótipos son polisacáridos ácidos que contienen ácidos aminourónicos y otros aminoazúcares. Estos polisacáridos están cargados negativamente y se mueven hacia el polo positivo en una inmunoelectroforesis contracorriente. También son específicos de tipo, es decir, la inmunoprecipitación produce una única banda con sólo el antisuero de tipo homólogo.

Los antígenos polisacáridos ácidos asociados a cada serotipo se pueden obtener en cantidades recuperables a partir de los aislamientos de S. epidermidis cultivados, serotipados, purificados según los protocolos descritos en el presente documento, en una forma sustancialmente pura. En particular, el antígeno purificado contiene menos de un 1% de proteínas y menos de un 1% de ácidos nucleicos. Una cantidad ``recuperable'' en este sentido significa que la cantidad aislada de polisacárido ácido es detectable por medio de una metodología menos sensible que el marcado radioactivo, tal como un inmunoensayo, y puede ser sometida a manipulaciones adicionales, que implican la transferencia del polisacárido ácido per se en solución.

Una composición del antígeno polisacárido ácido consiste esencialmente en uno o ambos antígenos polisacáridos ácidos asociados al tipo I y al tipo II respectivamente. Esto es, tal composición no debe contener ninguna materia que interfiera con la producción de una respuesta inmunitaria a los epítopos de los polisacáridos ácidos cuando se administran como vacuna a un sujeto.

Los serotipos de S. epidermidis se pueden identificar en los aislamientos clínicos que se han hecho crecer en un medio que mimetiza lo más posible las condiciones in vivo. En particular, este medio debe proporcionar un ambiente con una cantidad baja de fosfato disponible. Tal medio minimiza la producción de mucus por parte de las bacterias y potencia la producción de polisacárido capsular, particularmente los polisacáridos ácidos correspondientes a la presente invención. Esto está en clara contraposición con el caldo de BHI y el caldo de soja tríptica (TSB), los medios comúnmente usados en estudios de S. epidermidis, y aquellos que tienen alto contenido en fosfato disponible, con 2,5 mg de fosfato por ml. Estos medios potencian la producción de mucus. Cuando se cultiva en un medio que simula las condiciones in vivo, S. epidermidis produce antígenos de superficie que no se adhieren al vidrio o al plástico. El medio preferido es, de acuerdo con la presente invención, un caldo Columbia modificado (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), un medio en el que el nivel de fosfato disponible es 76 \mug/ml. Tal medio simula el nivel de fosfato disponible in vivo en humanos, que es de aproximadamente 23-46 \mug/ml. Cuando se cultiva S. epidermidis en este medio se produce poco o ningún mucus.

Los polisacáridos se pueden extraer tanto a partir de las células como del sobrenadante de aislamientos clínicos de S. epidermidis crecidos en caldo Columbia. En una etapa inicial se centrifugan los cultivos, y las células y los sobrenadantes se reunen.

Se puede extraer el polisacárido a partir del sobrenadante concentrando el sobrenadante, lavándolo con agua y después concentrándolo secuencialmente. El precipitado final se disuelve en agua, se somete a diálisis y se liofiliza.

Para extraer el polisacárido a partir de las células primero se rompen con enzimas, lisoestafina o lisozima, y luego se centrifugan. El sobrenadante se precipita y luego se centrifuga. El sobrenadante se concentra secuencialmente, se incuba y luego se sedimenta por centrifugación. El sedimento se resuspende en agua, se dializa y se liofiliza.

Alternativamente el material liofilizado se extrae con ácido tricloroacético y luego se centrifuga. Tras precipitar secuencialmente con etanol se disuelve en agua destilada, se dializa y se liofiliza.

Los extractos brutos de las células y de los sobrenadantes se continúan procesando. En cada caso se disuelve en tampón el material liofilizado y se carga en una columna de separación equilibrada con el mismo tampón. La columna se lava con tampón de carga y luego se eluye con un gradiente salino. Las fracciones que contienen antígeno se reúnen, se concentran, se dializan y se liofilizan. Se puede repetir la separación para obtener una mejor purificación. Se puede determinar el tamaño del polisacárido purificado en una columna adecuada, y las fracciones se pueden entonces reunir, concentrar, dializar y liofilizar.

Los serotipos predominantes de S. epidermidis se identifican inicialmente seleccionando dos aislamientos a partir de un grupo de aproximadamente cinco a diez aislamientos de S. epidermidis obtenidos de hospitales de varias localizaciones geográficas. El antisuero de conejo se produce con cada uno de estos dos aislamientos usando un esquema de inmunización como el descrito en McCarty y Lancefield. J. Exp. Med. 102: 11-28, 1955. Se absorben los antisueros con una cepa no encapsulada de S. epidermidis. Si es necesario se pueden hacer absorciones adicionales para asegurar la eliminación de la actividad contra otros serotipos.

Los dos antisueros se usan para tipar los otros aislamientos no seleccionados de S. epidermidis. Si los primeros dos aislamientos seleccionados son del mismo tipo, como se puede evidenciar por patrones de reactividad idénticos a los otros aislamientos, se selecciona un aislamiento adicional a partir del grupo de aislamientos que no reacciona con los dos primeros aislamientos seleccionados. El antisuero de conejo se produce contra este aislamiento, cuya reacción con los demás aislamientos se prueba posteriormente. Se continúa este procedimiento hasta que se identifican los serotipos predominantes de S. epidermidis. Sorprendentemente se encontró que aproximadamente un 85% de los casos clínicos de S. epidermidis se encuentra dentro de uno de los dos serotipos, denominado tipo I.

Para determinar posteriormente el serotipo se preparan anticuerpos policlonales respectivamente específicos de tipo a partir de conejos inmunizados con una vacuna de células enteras producida a partir de un aislamiento de tipo I identificado. Los organismos representativos de S. epidermidis del tipo I se han depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo en Rockville, Md. el 19 de noviembre de 1991, y se les ha dado los números de acceso 55254 y 55253 respectivamente. La clasificación de los aislamientos en serotipos se puede llevar a cabo usando antisueros para los aislamientos de tipo I mediante ensayos de aglutinación bacteriana, según lo descrito previamente para S. aureus. (Nelles y col., Infect. Immun. 46:14-18 (1985)).

Para determinar el serotipo se hacen crecer las células en caldo Columbia en una atmósfera rica en CO_{2}. Las células se pasan de las placas a una solución salina de tampón de fosfato (PBS). Se añade proteasa para romper la suspensión resultante algo pegajosa, produciendo una suspensión uniforme de células. Tras la ruptura enzimática se fijan las cápsulas de polisacárido a la superficie celular para la preparación de los ensayos de aglutinación. Las células fijadas se centrifugan y se resuspenden en PBS fresco. Después se determina el serotipo con los antisueros para el tipo I en una placa de microtitulación o en un ensayo de aglutinación sobre un portaobjetos de vidrio. Cada serotipo de tipo I tiene un antígeno de superficie específico asociado. Este antígeno de superficie es reconocido por los antisueros de conejo. Un cierto porcentaje de los aislamientos no puede ser tipado con el subconjunto de antisueros producidos contra un aislamiento de tipo I.

Los antígenos de superficie asociados al tipo I y al tipo II no están presentes en los aislamientos no encapsulados, los cuales están cubiertos en su lugar por ácido teicoico. Éstos se pueden retirar o romper mediante autoclavado, ocasionando una pérdida de reactividad con los antisueros específicos. El antígeno de superficie para el tipo I no reacciona de forma cruzada con el antígeno de superficie para el tipo II y vice versa. Los ensayos de fagocitosis in vitro indican que los anticuerpos para cada uno de estos antígenos de superficie protegen contra la infección por las cepas de S. epidermidis de los correspondientes serotipos. Se puede usar una vacuna basada en estos dos serotipos para proteger contra la infección con la mayoría de las cepas clínicas de S. epidermidis.

En los humanos los polisacáridos por sí mismos son generalmente inmunógenos independientes de células T débiles, especialmente en pacientes con resistencia reducida. Por ello es preferible conjugar el polisacárido con un vehículo inmunológico, habitualmente un polipéptido o una proteína que sea crítico para una interacción eficiente entre células T y células B para la inducción de una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno débil. El vehículo inmunológico potencia de esta manera la inmunogenicidad tanto en una inmunización activa como en una inmunización pasiva para preparar antisueros de alta titulación en voluntarios. Los vehículos inmunológicos preferidos en particular según la presente invención incluyen la toxina tetánica, la toxina diftérica, la toxina A de Pseudomonas aeroginosa o sus derivados, y otras proteínas usadas comúnmente como vehículos inmunológicos. Los antígenos de superficie tanto del tipo I como del tipo II se pueden unir al mismo vehículo inmunológico.

La presente invención también se refiere al uso de los polisacáridos correspondientes al serotipo de tipo I para producir antisueros o anticuerpos monoclonales (de ratón o humano) que se unen o que neutralizan a las bacterias que presentan este serotipo. Los protocolos para produccir estos anticuerpos se describen en Ausubel y col. (editores), capítulo 11; en METHODS OF HYBRIDOMA FORMATION 257-71, Bartal y Hirshaut (editores), Humana Press, Clifton, NJ (1988); en Vitetta y col., Immunol. Rev. 62: 159-83 (1982); y en Raso, Immunol. Rev. 62:93-117 (1982).

Los inóculos para la producción de anticuerpos policlonales se preparan típicamente dispersando los vehículos inmunológicos de los polisacáridos en un diluyente fisiológicamente tolerable, tal como una solución salina u otros adyuvantes adecuados para el uso en humanos, para formar una composición acuosa. Se administra una cantidad inmunoestimulante de inóculo a un mamífero, y el mamífero inoculado se mantiene después durante un periodo de tiempo suficiente para que el antígeno polisacárido de superficie induzca anticuerpos protectores anti-tipo I.

Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de antisueros de una variedad de animales comúnmente usados, por ejemplo cabras, primates, burros, cerdos, conejos, caballos, gallinas, coballas, ratas o ratones, e incluso antisueros humanos después de una selección y purificación apropiadas. Los antisueros animales se provocan inoculando a los animales con S. epidermidis de tipo I matado con formalina, mediante métodos convencionales, desangrando a los animales y recuperando el suero.

Los anticuerpos inducidos de esta manera se pueden recoger y aislar en la cantidad deseada por medio de técnicas bien conocidas tales como la cromatografía de inmunoafinidad; esto es, uniendo el antígeno a una columna cromatográfica empaquetada de tipo Sephadex™, haciendo pasar los antisueros por la columna que retiene por tanto los anticuerpos específicos, y separando otras inmunoglobulinas y contaminantes, y recuperando después los anticuerpos purificados por elución con un agente caotrópico, seguida opcionalmente de más purificaciones, por ejemplo mediante paso por una columna con antígenos de grupos sanguíneos unidos, u otras especies no patógenas. Se puede preferir este procedimiento cuando se aíslan los anticuerpos deseados a partir del suero de pacientes que hayan desarrollado un título de anticuerpos contra el patógeno en cuestión, asegurando de esta forma la retención de los anticuerpos capaces de unirse a los antígenos de superficie. Éstos se pueden usar entonces en preparaciones para inmunización pasiva contra S. epidermidis.

Una composición de anticuerpos monoclonales contiene, dentro de los límites detectables, una sola especie de sitio de combinación del anticuerpo capaz de unirse al antígeno de superficie polisacárido asociado al tipo I. Los anticuerpos en forma monoclonal adecuados se pueden preparar usando la tecnología convencional del hibridoma.

Para formar hibridomas, a partir de los cuales se produce la composición de anticuerpos monoclonales de la presente invención, se fusiona un mieloma u otra línea celular que se perpetúa por sí misma con linfocitos obtenidos de sangre periférica, gánglios linfáticos o el bazo de un mamífero hiperinmunizado con un polipéptido de esta invención. Se prefiere que la línea celular de mieloma sea de la misma especie que los linfocitos. Típicamente los esplenocitos se fusionan con células de mieloma usando polietilenglicol 1500. Los híbridos resultantes fusionados se seleccionan según su sensibilidad a HAT. Los hibridomas secretores de moléculas de anticuerpo de esta invención se pueden identificar usando un ensayo ELISA.

Los materiales de uso preferido para preparar hibridomas humanos o murinos son el bazo de los ratones Balb/c, sangre humana periférica, ganglios linfáticos o esplenocitos. Los mielomas de ratón adecuados para uso en la presente invención incluyen las líneas celulares sensibles a hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT), prefiriéndose el mieloma P3X63-Ag8.653. La pareja de fusión preferida para la producción de anticuerpos monoclonales humanos es el mieloma SHM-D33, un heteromieloma disponible en la ATCC, Rockeville, Md., con la designación CRL 1668.

Una composición de anticuerpos monoclonales de la presente invención se puede producir iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo con una especificidad de polipéptido apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones suficientes y por un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo al medio. Después se recoge el medio, que contiene los anticuerpos. Posteriormente se pueden aislar aún más las moléculas de anticuerpo mediante técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son tanto bien conocidos en la técnica como disponibles comercialmente, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones portadores y semejantes. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial Minimal de Dulbecco suplementado con 4,5 g/l de glucosa, 20 mm de glutamina y suero fetal de ternera al 20%. Una cepa ejemplar de ratón portador es la Balb/c.

También se contemplan otros procedimientos para preparar las composiciones de anticuerpos monoclonales, tales como fusiones de especies distintas, ya que es esencialmente la especificidad antigénica de los anticuerpos la que afecta a su utilidad en la presente invención. Se pueden fusionar linfocitos humanos obtenidos de individuos infectados con una línea celular de mieloma humana para producir los hibridomas, los cuales se pueden seleccionar para la producción de anticuerpos que reconocen los antígenos de superficie de tipo I. Sin embargo, en este sentido se prefiere más un procedimiento que no implique el uso de una muestra biológica de un sujeto humano infectado. Por ejemplo, un sujeto inmunizado con una vacuna como se describe en el presente documento puede servir como fuente de anticuerpos adecuadamente usados en una composición de anticuerpos dentro de la presente invención.

En una realización particularmente preferida se producen anticuerpos monoclonales para los antígenos de superficie de tipo I usando procedimientos similares a los descritos para los anticuerpos monoclonales específicos de tipo frente a S. aureus. Los anticuerpos monoclonales purificados se caracterizan mediante ensayos de aglutinación bacteriana usando una colección de aislamientos clínicos.

Las composiciones de anticuerpos monoclonales y policlonales producidas de acuerdo con la presente descripción se pueden usar para inducir una respuesta inmunitaria para la prevención o el tratamiento de una infección por S.epidermidis de tipo I. En este sentido la preparación de anticuerpos puede ser una composición policlonal. Tal composición policlonal puede incluir anticuerpos que se unen tanto al tipo I como al tipo II, o puede incluir anticuerpos que se unen sólo al tipo I. El componente de anticuerpo policlonal puede ser un antisuero policlonal, preferiblemente purificado por afinidad, de un animal que haya expuesto a los antígenos de superficie tanto de tipo I como de tipo II, y de esta forma haya sido estimulado a producir anticuerpos específicos para los antígenos de superficie tanto de tipo I como de tipo II. Otra alternativa es usar una mezcla ``policlonal obtenida por ingeniería'', la cual es una mezcla de anticuerpos monoclonales para el antígeno de superficie de tipo I y anticuerpos monoclonales para el antígeno de superficie de tipo II.

En ambos tipos de mezclas policlonales puede ser ventajoso unir qímicamente anticuerpos poliespecíficos para formar una única molécula poliespecífica capaz de unirse a ambos antígenos de superficie. Una manera de efectuar tal unión es hacer fragmentos híbridos bivalentes F(ab')_{2} mezclando dos fragmentos F(ab')_{2} diferentes producidos, por ejemplo, por digestión con pepsina de dos anticuerpos diferentes, ruptura reductora para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguida de una nueva formación oxidativa de los puentes disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')_{2} que incluye fragmentos híbridos que contienen una porción Fab' específica de cada uno de los antígenos originales. En Feteanu, LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE 321-23, Mc Graw-Hill Int'l Book Co. (1978); Nisonoff y col., Arch. Biochem. Biophys. 93: 470 (1961); y Hammerling y col., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968); y en la patente de EE.UU. Nº 4.331.647 se describen procedimientos para preparar tales fragmentos de anticuerpos híbridos.

Un componente de anticuerpo producido de acuerdo con la presente invención puede incluir anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpo o subfragmentos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas (IgG) enteras de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con una especificidad dual a un antígeno de superficie; o fragmentos, por ejemplo F(ab')_{2}, Fab', Fab y similares, incluyendo fragmentos los híbridos, y además incluyendo cualquier inmunoglobulina o cualquier proteína natural, sintética o producida por ingeniería genética que actúa como anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo. En particular, las moléculas Fab se pueden expresar y ensamblar en un hospedador transformado genéticamente como E. coli. El sistema del vector lambda está disponible para expresar así una población de los Fab con una diversidad potencial igual o mayor a la del sujeto que genera el anticuerpo predecesor. Véase Huse, W.D. y col., Science 246: 1275-81 (1989).

El antígeno polisacárido ácido asociado al tipo I puede ser el ingrediente activo de la composición, la cual comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable para el ingrediente activo, que puede usarse como vacuna para inducir una respuesta inmunitaria celular y/o la producción in vivo de anticuerpos que combaten la infección por S. epidermidis. En este sentido, un vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia que se puede usar como excipiente para administrar un medicamento, ya que la sustancia es inerte o, por otro lado, médicamente aceptable, así como compatible con el agente activo polipeptídico en el contexto de una administración de vacuna. Además de un excipiente adecuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener los aditivos convencionales de vacuna, como los diluentes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y agentes solubilizantes.

Conforme a la presente invención, tal vacuna se puede administrar a un sujeto que aún no esté infectado con S. epidermidis, para de esta forma inducir en ese sujeto una respuesta (humoral o celular) a los serotipos correspondientes de la bacteria. Alternativamente, una vacuna dentro de la presente invención se puede administrar a un sujeto en el que ya haya ocurrido la infección por S. epidermidis, pero que está en una etapa suficientemente temprana para que los anticuerpos producidos en respuesta a la vacuna inhiban de forma efectiva la posterior propagación de la infección.

En otro enfoque, una vacuna de la presente invención se puede administrar a un sujeto que después actúa como fuente de globulina producida en respuesta a una exposición a la vacuna específica (``globulina hiperinmune''), que contiene anticuerpos dirigidos contra S. epidermidis. Un sujeto tratado de esta forma donaría plasma del que después sería obtenida la globulina hiperinmune mediante una metodología convencional de fraccionamiento del plasma, y se administraría a otro sujeto para conferirle resistencia o tratarle frente a una infección por S. epidermidis.

La inducción de bacteremia en mamíferos requiere un número extremadamente alto de organismos o alguna maniobra previa para bajar la resistencia del hospedador. Sin embargo, se puede estudiar la fagocitosis in vitro como una correlación de la inmunidad protectora in vivo. En este modelo se mide a través de la fagocitosis la capacidad de los anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de tipo de opsonizar in vitro a S. epidermidis, de acuerdo con el método descrito en Kojima y col., J. Infect. Dis. 162: 435-551, 1990 y Fattom y col., Infect. Immun. 58: 2367-2374, 1990. Los anticuerpos inducidos por vacunas de tipo I facilitan la fagocitosis específica de tipo.

La presente invención se describe aún más mediante referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplo 1 Recolección de cepas de S. epidermidis

Los aislamientos clínicos de S. epidermidis se obtuvieron de hospitales de varias localizaciones geográficas. Todos los aislamientos fueron aislados de sangre. La identificación de los aislamientos los como S. epidermidis. En la mayoría de los casos el hospital proporcionó una sinopsis del episodio de la infección y la evolución del tratamiento, así como de los resultados de la identificación bioquímica y de las determinaciones de sensibilidad antimicrobiana.

Ejemplo 2 Cultivo de las cepas de S. epidermidis

Los aislamientos se hicieron crecer en placas de agar Columbia (Difco) suplementado con NaCl al 4%, a 37ºC en una atmósfera rica en CO_{2}. Se traspasó una colonia aislada a un matraz de 500 ml que contenía caldo Columbia (Difco), suplementado con NaCl al 4%. Tras hacer crecer de tres a cinco horas se inocularon con 50 ml de la suspensión de inóculo cada uno de seis matraces Fernbach de dos litros que contenían 1,2 litros de caldo salino de Columbia. Los matraces Fernbach se hicieron crecer en un agitador New Brunswick a 37ºC durante una noche. Las células se recogieron mediante centrifugación a 10.000 xg durante 30 minutos y se reunieron los sobrenadantes y las células.

Ejemplo 3 Identificación de los serotipos predominantes de S. epidermidis

Se obtienen de cinco a diez aislamientos de S. epidermidis de varios hospitales, se hacen crecer en caldo Columbia y se recolectan como en el Ejemplo 2. Las células de dos de los aislamientos se fijan con formalina al 1%. Se sigue el esquema de inmunización de McCarty y Lancefield, según anteriormente, para producir los antisueros de conejo específicos de cada uno de los aislamientos seleccionados. Se absorben los antisueros con una cepa no encapsulada de S. epidermidis. Si es necesario se llevan a cabo absorciones adicionales para asegurar la eliminación de la actividad contra otros serotipos.

Se usan los dos antisueros para determinar el tipo de los otros aislamientos no seleccionados de S. epidermidis. Si los dos primeros aislamientos seleccionados son del mismo tipo, como se evidencia por los patrones de reactividad idénticos con los demás aislamientos, se selecciona un aislamiento adicional del grupo de aislamientos que no reaccionó con los dos primeros aislamientos seleccionados. Se producen antisueros de conejo contra estos aislamientos, cuya reacción con los aislamientos restantes se prueba posteriormente. Se continúa este procedimiento hasta que se identifican los dos serotipos más predominantes de S. epidermidis. Estos dos serotipos dan cuenta de aproximadamente el 85% de los aislamientos clínicos. (Véase la Tabla 1 del Ejemplo 7.)

Ejemplo 4 Preparación de los antisueros de conejo específicos de tipo I y de tipo II

Se obtuvieron antígenos polisacáridos ácidos purificados a partir de S. epidermidis identificados como de tipo I o de tipo II, y se hicieron crecer en caldo Columbia, y se recogieron como en el Ejemplo 2. Se fijaron las células con formalina al 1%. Se siguió el esquema de inmunización de McCarty y Lancefield, según anteriormente, para producir antisueros de conejo específicos de cada tipo I y tipo II. Los antisueros se absorbieron con una cepa no encapsulada de S. epidermidis.

Ejemplo 5 Extracción de los polisacáridos de tipo I y de tipo II. de S. epidermidis

A partir del sobrenadante:

El sobrenadante se concentró, se lavó con agua destilada y se precipitó secuencialmente con alcohol etílico al 25% suplementado con CaCl_{2} 5-10 mM a 4ºC durante 6 horas por la noche. Tras centrifugar se precipitó el sobrenadante en alcohol etílico al 75% suplementado con CaCl_{2} 5-10 mM. El precipitado de 75% se disolvió en agua destilada, se dializó en agua destilada durante una noche y después se liofilizó.

A partir de las células:

Las células se rompieron con enzimas, lisoestafina o lisozima, o se extrajeron con ácido tricloroacético al 5% a 4ºC durante dos o tres días. Después se centrifugaron las células a 10.000 xg durante 30 minutos. Se precipitó el sobrenadante con alcohol etílico al 25% suplementado con CaCl_{2} 5-10 mM. Tras una incubación a 4ºC durante una noche se sedimentó el precipitado mediante centrifugación a 10.000 xg durante 30 minutos, se disolvió de nuevo en agua destilada, se dializó en agua destilada durante una noche y después se liofilizó.

Ejemplo 6 Purificación de los antígenos de superficie de tipo I y de tipo II de S. epidermidis

Se disolvieron los extractos brutos liofilizados del Ejemplo 5 en tampón de acetato sódico 0,05 M a pH 6,0 hasta una concentración final de 50-100 mg/ml. Si el extracto bruto está altamente contaminado con ácidos nucleicos y/o proteínas puede ser tratado previamente con RNAsa, DNAsa y/o una proteasa antes de continuar su procesamiento. El extracto bruto disuelto se cargó en una columna de DEAE sefarosa con un gel de aproximadamente 10 mg/ml, equilibrada con el mismo tampón. Tras lavar la columna con tampón de carga hasta que no se observara ninguna absorción a 206 nm se eluyó la columna con un gradiente de NaCl de 0 a 0,3 M en tampón de acetato sódico 0,05 M a pH 6,0. Se aplicó una inmunoprecipitación utilizando antisueros específicos de tipo preparados según el Ejemplo 4 para identificar las fracciones que contenían antígeno. Los antígenos de tipo I y de tipo II eluyen a la misma molaridad que los polímeros conocidos de ácido aminourónico de Staphylococcus. La hidrólisis ácida de los antígenos purificados de tipo I y de tipo II también indica que éstos comprenden ácidos aminourónicos.

Las fracciones que contienen antígeno se reunieron, se concentraron sobre una membrana de ultracentrifugación Amicon, se dializaron en agua destilada cuatro veces y se liofilizaron. Este procedimiento se repitió cuando se deseaba obtener una mejor purificación del antígeno. El tamaño del polisacárido purificado se determinó mediante una columna de filtración en gel, tal como una columna de sefarosa 6B o una columna de Sefacril S-300. El antígeno eluye en la misma posición que el antígeno capsular de los antígenos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus. Las fracciones de polisacárido se reunieron, se concentraron sobre una membrana de ultracentrifugación Amicon, se dializaron en agua destilada y se liofilizaron. Esta purificación da como resultado un antígeno de tipo I o de tipo II en una forma sustancialmente pura.

El análisis de proteínas y ácidos nucleicos de los antígenos purificados de tipo I y de tipo II reveló que ningún antígeno contiene proteínas o ácidos nucleicos. La hidrólisis con tripsina reveló que los antígenos de tipo I y de tipo II son resistentes a la tripsina. Cuando se trataron las células con calor a 100ºC durante treinta minutos se eliminaron selectivamente los antígenos de superficie, es decir, no se eliminó el ácido tecoico. Antes del tratamiento con calor las células no reaccionaban con un antisuero contra el ácido tecoico, mientras que después del tratamiento sí que lo hicieron.

Ejemplo 7 Serotipado de los aislamientos clínicos

Los aislamientos clínicos que se hicieron crecer en caldo Columbia o en placas de agar Columbia, según se describe en el Ejemplo 2, se fijaron son formalina al 1%. Si los aislamientos se habían hecho crecer en placas de agar primero se levantaron las células de las placas, se suspendieron en PBS, y se suplementaron con 20 a 50 microgramos/ml de proteasa. Si las células se habían hecho crecer en caldo Columbia se resuspendían en PBS, y se suplementaban con 20 a 50 microgramos/ml de proteasa. Las células se diluyeron en PBS hasta una densidad óptica de 0,5. La mezcla se incubó durante una hora a 37ºC y luego se fijó con formalina al 1% a temperatura ambiente durante una noche. Se lavaron las células con PBS y se llevó a cabo un ensayo de aglutinación en portaobjetos en placas de microtitulación de 96 pocillos o sobre un portaobjetos de vidrio con la suspensión de células fijadas con formalina. Se mezclaron volúmenes iguales de células y antisuero preparado según el Ejemplo 4, y se dejó aglutinar en las placas de microtitulación. Alternativamente se mezclaron sobre un portaobjetos de vidrio volúmenes iguales de células y antisuero preparado según el Ejemplo 4, y se dejó rotando durante varios minutos. Se hizo una evaluación de la presencia o ausencia de aglutinación. Los serotipos resultantes para los aislamientos de bacteremia confirmada de diferentes localizaciones geográficas de los EE.UU. se muestran en la Tabla 1. Un cierto porcentaje de aislamientos no puede ser tipado (NT).

TABLA 1

Fuente	tipo I	tipo II	NT	Total
Wash. DC	16 (41%)	21 (54%)	2 (5%)	39 (100%)
Maryland	4 (8%)	28 (62%)	13 (29%)	45 (100%)
Tennessee	0 (0%)	12 (92%)	1 (8%)	13 (100%)
Londres	9 (23%)	27 (69%)	3 (7%)	39 (100%)
Mass.	1 (10%)	8 (80%)	1 (10%)	10 (100%)
Total	30 (20%)	96 (66%)	20 (14%)	146 (100%)

Ejemplo 8 Producción de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-S. Epidermidis

Se inmunizan ratones Balb/c con bacterias fijadas con formalina. Se obtienen los sueros y se seleccionan según su respuesta específica de tipo mediante un ensayo de aglutinación de bacterias como se describe en el Ejemplo 7. Ante la evidencia de una respuesta hiperinmune se inmunizan los ratones tres días antes de la fusión. Se fusionan células de bazo de los ratones inmunes con células de las líneas celulares AG653 o SHM D33 (ambas disponibles en la ATCC, Rockville, Md.), o un clon o subclón de una de estas líneas celulares usando el método descrito en Fuller y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nueva York: J. Wiley and sons (1989), capítulos 11.3.2 a 11.11.4. Los hibridomas se seleccionan según el anticuerpo específico de tipo mediante un ensayo de aglutinación bacteriana y un ensayo ELISA usando placas de microtitulación revestidas tanto con bacterias enteras fijadas con formalina, como con componentes purificados de la superficie celular. Se clonan las células de los pocillos positivos mediante dilución limitante. Se preparan cantidades en miligramos del anticuerpo en fluidos ascíticos y se purifican mediante cromatografía en columna de proteína A, proteína G o DEAE sefarosa.

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Ejemplo 9 Ensayo de fagocitosis in vitro

Se preparan neutrófilos polimorfonucleares (PMN) y monocitos a partir de sangre periférica humana. Los PMN y los monocitos se resuspenden en medio de cultivo RPMI (Gibco), o en un medio similar, con suero fetal de ternera inactivado por calor al 5%. Se lavan las células de S. epidermidis crecidas en caldo Columbia y se añaden bien a los PMN o bien a los monocitos con el anticuerpo a probar. Tras una incubación a 37ºC con agitación suave se retiran las muestras a los tiempos de 0, 60 y 120 minutos tras la incubación, y se reparten sobre placas de agar Columbia con sal. Tras una incubación a 37ºC durante una noche se determina el número de colonias.

Claims (20)

1. Una vacuna que comprende un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable y una composición que consiste esencialmente en un antígeno polisacárido que es obtenible mediante un procedimiento que comprende a etapas de:

hacer crecer células de un aislamientos de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254;

extraer el antígeno polisacárido de dichas células para producir un extracto bruto de antígeno polisacárido de

\hbox{tipo I;}

cargar dicho antígeno bruto en una columna de separación y eluirlo con un gradiente salino; e

identificar las fracciones que contienen el antígeno polisacárido de tipo I usando anticuerpos específicos de los aislamientos de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254.

2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichas células se hacen crecer en caldo Columbia.

3. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el procedimiento para preparar dicha composición comprende adicionalmente una etapa de precipitación de dicho extracto bruto con alcohol etílico.

4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la precipitación se lleva a cabo mediante precipitación secuencial con alcohol etílico.

5. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la precipitación secuencial se lleva a cabo mediante precipitación con alcohol etílico al 25% y al 75%.

6. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha etapa de extracción de dicho antígeno polisacárido en el procedimiento de preparación de dicha composición comprende un tratamiento con enzimas.

7. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha etapa de extracción de dicho antígeno polisacárido en el procedimiento de preparación de dicha composición comprende un tratamiento con lisoestafina o con lisozima.

8. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha etapa de extracción de dicho antígeno polisacárido en el procedimiento de preparación de dicha composición comprende un tratamiento con ácido tricloroacético.

9. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha etapa de extracción de dicho antígeno polisacárido en el procedimiento de preparación de dicha composición comprende un tratamiento con ácido tricloroacético al 5% a 4ºC.

10. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, que comprende adicionalmente una etapa de tratamiento de dicho extracto bruto con una proteasa.

11. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho gradiente salino es un gradiente de NaCl que varía de 0 a 0,3M.

12. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicha etapa de identificación de las fracciones que contienen dicho antígeno polisacárido en el procedimiento de preparación de dicha composición comprende la inmunoprecipitación.

13. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicha identificación comprende seleccionar y reunir las fracciones que producen una única banda tras la inmunoprecipitación con antisueros de tipo I.

14. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el procedimiento de preparación de dicha composición comprende adicionalmente una etapa de purificación de dicho extracto bruto para producir antígeno purificado que contiene menos de un 1% de proteína.

15. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicho polisacárido en dicha vacuna está conjugada con un vehículo inmunológico.

16. Una globulina hiperinmune aislada que contiene los anticuerpos dirigidos contra un antígeno polisacárido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Una globulina hiperinmune aislada que contiene los anticuerpos dirigidos contra un antígeno polisacárido según se define en la reivindicación 15.

18. Uso de una cantidad inmunoestimulante de un antígeno polisacárido que es obtenible mediante un procedimiento que comprende a etapas de:

hacer crecer células de un aislamientos de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254;

extraer antígenos polisacáridos de dichas células para producir un extracto bruto de antígeno polisacárido de

\hbox{tipo I;}

cargar dicho antígeno bruto en una columna de separación y eluirlo con un gradiente salino; e

identificar las fracciones que contienen el antígeno polisacárido de tipo I usando anticuerpos específicos de un aislamiento de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254

para la preparación de la vacuna.

19. Uso de una cantidad inmunoestimulante de un antígeno polisacárido que es obtenible mediante un procedimiento que comprende a etapas de:

hacer crecer células de un aislamientos de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254;

extraer antígenos polisacáridos de dichas células para producir un extracto bruto de antígeno polisacárido de

\hbox{tipo I;}

cargar dicho antígeno bruto en una columna de separación y eluirlo con un gradiente salino; e

identificar las fracciones que contienen el antígeno polisacárido de tipo I usando anticuerpos específicos de un aislamiento de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254

para la preparación de una globulina hiperinmune.

20. Uso de una cantidad inmunoestimulante de un antígeno polisacárido que es obtenible mediante un procedimiento que comprende a etapas de:

hacer crecer células de un aislamientos de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254;

extraer antígenos polisacáridos de dichas células para producir un extracto bruto de antígeno polisacárido de

\hbox{tipo I;}

cargar dicho antígeno bruto en una columna de separación y eluirlo con un gradiente salino; e

identificar las fracciones que contienen el antígeno polisacárido de tipo I usando anticuerpos específicos de un aislamiento de tipo I de S. epidermidis que aglutinan los antisueros contra ATCC 55254

para la preparación de una globulina hiperinmune para la administración a un sujeto que está infectado con S. epidermidis.