ES2261192T3 - Antigeno de estafilococo y vacuna. - Google Patents
Antigeno de estafilococo y vacuna.Info
- Publication number
- ES2261192T3 ES2261192T3 ES00916405T ES00916405T ES2261192T3 ES 2261192 T3 ES2261192 T3 ES 2261192T3 ES 00916405 T ES00916405 T ES 00916405T ES 00916405 T ES00916405 T ES 00916405T ES 2261192 T3 ES2261192 T3 ES 2261192T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antigen
- staphylococcus
- antibody
- antibodies
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 246
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 240
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 240
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 27
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims abstract description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 16
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 claims description 14
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 7
- 230000000941 anti-staphylcoccal effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 3
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Chemical class OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 3
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 claims description 2
- 101900161471 Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 2
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 14
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000192087 Staphylococcus hominis Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 4
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- -1 K73 polysaccharides Chemical class 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 3
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 241000751137 Staphylococcus epidermidis RP62A Species 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007382 columbia agar Substances 0.000 description 2
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPXVHIRIPLPOPT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-tris(2-hydroxyethyl)-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound OCCN1C(=O)N(CCO)C(=O)N(CCO)C1=O BPXVHIRIPLPOPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241001398967 Colonia Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010051017 Staphylococcal bacteraemia Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940059260 amidate Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N etomidate Chemical compound CCOC(=O)C1=CN=CN1[C@H](C)C1=CC=CC=C1 NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940093430 polyethylene glycol 1500 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/085—Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Abstract
Antígeno de estafilococo aislado que comprende (a) aminoácidos y hexosamina N-acetilada en una configuracióna, (b) no contiene ningún grupo O-acetilo detectable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear y (3) enlaza específicamente con anticuerpos de una cepa de estafilococos depositada con el número ATCC 202176.
Description
Antígeno de estafilococo y vacuna.
La presente invención se refiere a un nuevo
antígeno de estafilococo y a un método para obtener y utilizar el
antígeno.
El estafilococo es el causante de diversas
patologías debidas a varios mecanismos patógenos. La más frecuente
y grave de estas patologías es la bacteriemia y sus complicaciones
en los pacientes hospitalizados. En particular, el estafilococo
puede causar infecciones en heridas e infecciones asociadas con
catéteres y dispositivos protésicos. Como infecciones graves
asociadas con bacteriemia por estafilococo se puede citar la
osteomielitis, la endocarditis invasiva y la septicemia. El
problema consiste en la resistencia múltiple a antibióticos en
cepas de hospital, que limita gravemente la elección de una
terapia. En la mayoría de los casos, el organismo causante es una
cepa de S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus o S.
hominis, o una combinación de los mismos. El problema con el
estafilococo queda agravado por la resistencia múltiple a
antibióticos en cepas de hospital, lo cual limita gravemente la
elección de una terapia.
Una vacuna para el S. aureus
proporcionaría una solución al problema de la resistencia
antibiótica. Un antígeno común a múltiples especies de estafilococo
permitiría la producción de una vacuna que contuviese un solo
antígeno eficaz contra una amplia variedad de infecciones por
estafilococo.
Por lo tanto, uno de los objetos de la presente
invención es proporcionar un antígeno común a la mayoría de las
cepas clínicamente importantes de múltiples especies de
estafilococo.
Otro de los objetos es ofrecer una vacuna que
contenga un antígeno común a la mayoría de cepas clínicamente
importantes de especies múltiples de estafilococos.
Otro de los objetos consiste en ofrecer una
composición de globulina hiperinmune que contenga anticuerpos
dirigidos contra un antígeno común a una mayoría de cepas
clínicamente importantes de especies múltiples de estafilococos.
Otro de los objetos de la presente invención es
ofrecer una vacuna de células completas que lleve un antígeno
común a una mayoría de cepas clínicamente importantes de múltiples
cepas de estafilococo, particularmente uno que sea común a las
especies coagulasa-negativa de S. epidermidis,
S. haemolyticus y S. hominis.
Otro de los objetos consiste en proporcionar un
kit y un ensayo para diagnosticar la infección por
estafilococo.
De acuerdo con estos y otros objetos de la
invención, se presenta un antígeno de estafilococo aislado que (a)
comprende aminoácidos y una hexosamina N-acetilada
en una configuración \alpha, (b) no contiene ningún grupo
O-acetilo detectable por espectroscopia de
resonancia magnética nuclear, y (3) enlaza específicamente con
anticuerpos de una cepa de estafilococo depositada con el número
ATCC 202176.
También se presenta una composición que
comprende el antígeno de estafilococo, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable y estéril para el mismo. Un método de
inmunoterapia comprende una etapa de administración al individuo de
una cantidad inmunoestimulante de dicha composición.
También se presenta una vacuna de célula
completa que comprende células de una cepa de estafilococo que
lleva el antígeno.
También se presenta una composición que
comprende la vacuna de célula completa, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable y estéril para la misma.
La vacuna se puede administrar a un individuo
para proporcionar protección contra infección por estafilococo.
Un agente inmunoterapéutico contra la infección
por estafilococo se puede preparar inmunizando individuos con una
composición según la invención, recogiendo plasma de los individuos
inmunizados, y cosechando una globulina hiperinmune que contiene
anticuerpos dirigidos contra estafilococos del plasma recogido. La
globulina hiperinmune contiene anticuerpos dirigidos contra el
antígeno. Un método de inmunoterapia comprende una etapa de
administración de esta globulina hiperinmune a un individuo.
La presente invención también presenta un
catéter revestido con un antígeno según la invención, y un método
para evitar la adherencia de bacteria de estafilococo a un
catéter, que comprende el tratamiento de un catéter con antígeno
según la invención. En una realización preferida, el catéter es un
catéter intravenoso.
En la siguiente descripción detallada se podrán
apreciar otros objetos, características y ventajas de la presente
invención. Queda sin embargo entendido que la descripción detallada
y los ejemplos específicos, si bien presentan realizaciones
preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de
ilustración.
La figura 1 es un perfil cromatográfico en
Superose 6HR para el antígeno de estafilococo según la
invención.
Las figuras 2a y 2b son espectros NMR para el
antígeno de estafilococo según la invención.
Se ha descubierto que muchos aislados,
clínicamente importantes, de S. epidermidis, S.
haemolyticus, y S. hominis tienen en común un antígeno,
que recibe aquí el nombre de "el antígeno". El antígeno
representa la base para una vacuna, que ofrece protección contra la
infección por un gran número de aislados de estafilococo
clínicamente importantes. En este sentido, un aislado
"clínicamente importante" es un aislado patógeno.
En particular, los presentes inventores
observaron que la mayoría de los aislados clínicos de estafilococo
reaccionaban muy fuertemente con suero de anticuerpo
conjugado/antígeno, por lo que eran tipificables como cepas que
contienen el antígeno. Más particularmente, la tipificación de
aislados clínicos obtenidos de diversas fuentes ha mostrado que
aprox. el 60% de los aislados de S. epidermidis, el 50% de
los S. haemolyticus y el 40% de los S. hominis
expresan el antígeno, según se determina por aglutinación en placa.
Cuando se sometieron los digestos enzimáticos de los aislados de
S. haemolyticus y S. homini a un ensayo de
inmunodifusión, todos los aislados dieron un resultado positivo en
cuanto a la presencia del antígeno.
Los anticuerpos del antígeno no tienen reacción
cruzada con polisacáridos aislados de S. aureus tipo 5, tipo
8, tipo 4 o K73 (una cepa variante de tipo 5). El antígeno es por
lo tanto específico, es decir que produce una sola banda únicamente
con antisuero de cepas homólogas.
El antígeno se puede obtener en cantidad
recuperable, de ciertos aislados de estafilococo cultivados según
los protocolos aquí descritos, de forma prácticamente pura. En
particular, el antígeno purificado contiene menos del 1% de ácidos
nucléicos. Una cantidad "recuperable" en este sentido
significa que la cantidad aislada del antígeno se puede detectar
con una metodología menos sensible que el radio marcaje, como el
inmunoensayo, y se puede someter a manipulaciones ulteriores que
pueden suponer el paso a solución del antígeno per se.
Para obtener el antígeno, se fermenta primero un
aislado según la invención en un Caldo Columbia modificado,
suplementado con 4% NaCl. Tras la fermentación, se desactivan
células y luego se centrifugan para separar las células del
sobrenadante.
Se extrae el antígeno de la pasta celular. Algo
del antígeno se encuentra presente en el sobrenadante, pero la
cantidad es insignificante comparada con la cantidad encontrada en
la pasta celular. Debido al bajo rendimiento y al riesgo de
contaminación por hexosa del medio, no se considera preferible la
extracción del sobrenadante.
Una suspensión de la pasta celular se trata con
pronasa, lisostafina, DNasa y RNasa. La suspensión se hace de 10%
en ácido tricloroacético (TCA) y se incuba a 60ºC. Tras la
centrifugación, el sobrenadante se neutraliza con un NaOH a pH 7,0
seguido de precipitación secuencial con 25-75%
etanol frío/CaCl_{2} para eliminar los ácidos nucléicos y
proteínas de elevado peso molecular y luego se precipita el
material que contiene antígeno.
El precipitado crudo se disuelve en agua y el
etanol residual se elimina por diálisis. El ácido teicóico residual
se elimina por cromatografía de intercambio de anión. Se testan
las precipitaciones por precipitación capilar con anticuerpos
específicos del antígeno para determinar las fracciones que
contienen antígeno, que se agrupan, dializan, liofilizan y tratan
con lisozima para digerir el péptido glucano residual. La fracción
que contiene antígeno crudo tratado con enzima se vuelve a
suspender y se vuelve a cromatografiar en una columna de
intercambio de aniones en un gradiente lineal
0,1-0,25 M NaCl en tampón de
tris-HCl, pH 7,0. Las fracciones positivas de
antígeno y negativas de fósforo, según se determina en el ensayo
colorimétrico de la precipitación capilar con antisuero
monoespecífico respectivamente, se agrupan, se dializan con agua y
se liofilizan. La mayoría del antígeno eluye a 0,2 M NaCl. El
antígeno crudo se sigue purificando por cromatografía en columna y
las fracciones que contienen antígeno se agrupan para producir
antígeno prácticamente puro.
El antígeno purificado produce una sola banda de
precipitina cuando reacciona con antisuero de célula completa en
un ensayo de doble inmunodifusión. La inmunoelectrofóresis de
antígeno purificado y el modelo de elución en la columna de
intercambio fónico durante el proceso de purificación indican una
molécula cargada negativamen-
te.
te.
El antígeno prácticamente puro y el antígeno
repurificado por cromatografía de fase inversa en una columna C18
muestran un perfil polidisperso en una columna Superose 6HR (figura
1). Ambos contienen menos de 1% de ácidos nucléicos. En los ensayos
colorimétricos no se detecta ninguna hexosa, ni fósforo ni grupos
O-acetilo. El antígeno purificado no tiñe en
SDS-PAGE Coomasie azul.
El análisis de antígeno purificado por
espectrografía de masas-cromatografía líquido gas
(GLC-MS) muestra la presencia de GlcNAc como
componente glicósilo principal. Es sensible a ácido suave, lo cual
indica que los residuos de GlcNAc no están ligados por enlaces
glucosídicos. El antígeno es resistente a la acción de enzimas
proteolíticas.
La presencia de GlcNAc se confirma por
espectrografía 1H-NMR y 13C-NMR, que
indica una señal anomérica a \delta 4,88 y \delta 100,48 ppm,
respectivamente (ver fig. 2a y 2b). La espectrografía NMR confirma
también la ausencia de grupos O-acetilo. Esta
ausencia de acetilación O se encuentra en claro contraste con otros
antígenos de estafilococo, como el tipo 5 y el tipo 8 que contienen
de 20 a 80% de acetilación O.
Un pequeño valor de JH1, H2 (<1,0 Hz) indica
una configuración \alpha para la glucosamina que se confirma con
la medida de c=173 Hz para la constante de acoplamiento JC,H. Las
señales en \delta 24,860 ppm (NAac-CH_{3}) y
\delta 176,814 ppm (Nac-CO) en el espectro 13 NMR
sugieren que la glucosamina está N-acetilada, por
lo que se postula que la porción de carbohidrato del antígeno es
2-acetamido-2-desoí-\alpha-D-glucopiranosida.
El análisis de aminoácidos del antígeno muestra
la presencia de serina, alanina, ácido aspártico/asparagina,
valina y treonina en proporciones molares de aproximadamente
39:25:16:10:7. Los aminoácidos constituyen aproximadamente el 32%
en peso de la molécula de antígeno.
Una comparación de los espectros NMR para el
antígeno con los espectros NMR para cada uno de los antígenos de
S. aureus tipo 5 y tipo 8 y con los espectros NMR para los
antígenos 336 descritos en el documento US 5,770,208 muestra que
es químicamente diferente de estos antígenos. Las estructuras de
los antígenos de polisacárido de tipo 5 y 8 han sido puestas de
manifiesto por Moreau et al., Carbohydr. Res. 201:285
(1990); y Fournier et al., Infect. Imm. 45:87 (1984). Ambos
tienen FucNAcp en su unidad repetidora así como ManNAcA que se
puede utilizar para introducir un grupo sulfidrilo. Las estructuras
son las siguientes:
Tipo 5:
Tipo 8:
Por el contrario, el antígeno según la presente
invención tiene glucosamina como componente de carbohidrato
principal. A diferencia de los antígenos de S. aureus tipo 5
y tipo 8, contiene aminoácidos.
La inducción de bacteriemia en mamíferos
requiere un número extremadamente elevados de organismos o alguna
maniobra previa para reducir la resistencia del anfitrión. No
obstante, la fagocitosis in vitro se puede estudiar como
correlato de inmunidad protectora in vivo. En este modelo,
se mide por fagocitosis, según el método descrito en Kojima et
al., Infect. Dis. Immun. 58: 2367-2374 (1990).
La aptitud de los anticuerpos policlonales y monoclonales
específicos del antígeno, de los aislados de estafilococo opsonize
in vitro. Los ensayos in vitro de opsonofagocitosis
son reconocidos en el sector como pronóstico de eficacia como
vacuna. Por ejemplo, Fischer et al. describe una correlación
entre el anticuerpo funcional determinado con un ensayo opsónico y
la actividad in vivo. J. Inf. Dis. 169: 324-9
(1994).
Los anticuerpos inducidos por una vacuna que
contiene el antígeno facilitan la fagocitosis específica de tipo.
Los ensayos de fagocitosis in vitro indican por lo tanto que
los anticuerpos del antígeno protegen contra infección por cepas de
estafilococos que llevan el antígeno. Una vacuna basada en el
antígeno se puede utilizar para proteger contra infección
procedente de una mayoría de cepas de estafilococos clínicos. Los
resultados obtenidos in vivo con el modelo de letalidad del
ratón y el modelo de bacteriemia del ratón se corresponden con los
resultados de los ensayos de opsonofagocitosis in vitro y
muestran que los anticuerpos de conjugados de antígenos reducen la
mortalidad y la bacteriemia en ratones expuestos a cepas de
estafilococos que llevan el antígeno.
De preferencia, una composición del antígeno o
de células completas que contienen el antígeno según la presente
invención, "consta esencialmente de" antígeno o células que
contienen el antígeno. Dentro de este contexto, la expresión
"consta esencialmente de" significa que la composición no
contiene ningún material que interfiere con la provocación de una
respuesta inmune al antígeno (y a otros antígenos, si se hallan
presentes) si la composición se administra a un individuo como
vacuna o con la característica de acoplamiento
antígeno-anticuerpo de un ensayo diagnóstico si el
antígeno se utiliza en diagnóstico.
El antígeno según la invención resulta útil en
la producción de ensayos diagnósticos para detectar la presencia
de antígeno de estafilococo y/o anticuerpo
anti-estafilococo en una muestra. El antígeno o el
antígeno específico del antígeno, solo o en combinación con otros
antígenos de estafilococo o anticuerpos, se mezcla con una muestra
que se sospecha contiene antígeno de estafilococo o anticuerpo y
se controla y se sigue la unión antígeno-anticuerpo.
El antígeno o anticuerpo se marca con una marca radioactiva o
enzima. En una realización preferida, el antígeno o anticuerpo se
inmoviliza en una matriz sólida de modo que el antígeno o
anticuerpo tiene acceso al anticuerpo o antígeno complementario que
entra en contacto con una superficie de la matriz. Se pone entonces
en contacto la muestra con la superficie de la matriz y se controla
y se sigue la unión antígeno-anticuerpo en la
superficie.
Por ejemplo, el antígeno o anticuerpo se puede
utilizar en un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), en
el cual el antígeno o anticuerpo se fija a una fase sólida y se
utiliza un conjugado enzima-anticuerpo o
enzima-antígeno para detectar y/o cuantificar el
anticuerpo o antígeno presente en una muestra. Alternativamente, se
puede utilizar un ensayo de transferencia western en el que el o
los antígenos solubilizados y separados están unidos a papel de
nitrocelulosa. El anticuerpo se detecta entonces mediante una
anti-inmunoglobulina (Ig),
marca-conjugada o enzima como conjugado
Ig-peroxidasa rábano picante incubando el papel de
filtro en presencia de un sustrato precipitable o detectable. Los
ensayos de transferencia western tienen la ventaja de no requerir
una pureza superior al 50% para el o los antígenos deseados. Se
pueden encontrar descripciones de ELISA y técnicas de transferencia
western en los Cap. 10 y 11 de Ausubel, et al. (eds),
Current PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1988),
incorporándose aquí, como referencia, el contenido completo de los
mismos.
Para utilizarlo en una vacuna, es preferible
conjugar el antígeno con un inmunoportador, por lo general un
polipéptido o proteína, para mejorar la interacción entre células
T y B para inducir una respuesta inmune contra el antígeno. Esto
resulta particularmente importante para vacunas que se pretenden
utilizar en pacientes con existencia reducida. Un inmunoportador
potencia la inmunogenecidad tanto para la inmunización activa como
para la preparación de antisueros de valor elevado en voluntarios
para inmunización pasiva. Como inmunoportadores adecuados según la
presente invención se pueden citar el tetanus toxoide, difteria
toxoide, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A o sus derivados,
cepas mutantes no tóxicas producidas de modo recombinante, de
exotoxin A, según se describe por ejemplo en Fattom et al.,
Inf. Imm. 61:1023-1032 (1993), así como otras
proteínas habitualmente utilizadas como inmunoportadores.
Con el objeto de conjugar el antígeno a una
proteína portadora, el antígeno se tiene que derivar primero. Se
pueden utilizar diversos métodos para derivar antígeno y enlazarlo
de modo covalente a un inmunoportador. Los grupos carboxilato
activados del antígeno se pueden derivar con ADH, cistamina o PDP y
entonces el antígeno se puede acoplar a una proteína portadora
mediante una reacción en la que interviene carbodiimida del
antígeno parcialmente amidato a un grupo carboxilato en la proteína
portadora o por intercambio de disulfuro antígeno tiolatado con una
proteína portadora SPDP-derivada.
Se pueden activar grupos hidroxilo en el
antígeno utilizando bromuro de cianógeno o
1-ciano-4-dimetilamino-piridinio-tetrafluorborato,
y luego el antígeno se puede derivar con la hidridazida de ácido
adípico espaciadora bifuncional de 6 carbonos (ADH) según técnicas
conocidas en el estado de la técnica, siguiendo el método de Kohn
et al. FEBS Lett. 154:209:210 (1993). Este material se liga
entonces a difteria toxoide (Dtd), exoproteína recombinante A de
Pseudomonas aeruginosa (rEPA), toxoide de tétanos (TTd) u
otra proteína portadora adecuada por medio de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida
(EDAC). Los conjugados resultantes se pueden separar del antígeno
que no ha reaccionado por cromatografía de exclusión por tamaño.
Independientemente del método utilizado para conjugar el antígeno
a la proteína portadora, el enlace covalente del antígeno a la
proteína portadora potencia notablemente la inmunogenecidad del
antígeno y se obtienen por lo tanto niveles más elevados de
anticuerpos para el antígeno después de haber realizado el primer y
segundo refuerzo en ratones.
De preferencia, el antígeno o conjugado de
antígeno se administra sin adyuvante con el fin de evitar la
toxicidad inducida por el adyuvante. Si se utiliza un adyuvante,
se preferirá utilizar uno que promueva los anticuerpos protectores
IgG subtipo 2. Entre los adyuvantes habituales se puede citar el
hidróxido de aluminio, adyuvante completo de Freund (CFA) y
adyuvante incompleto de Freund (IFA). El sulfato de dextrano ha
resultado ser un potente estimulador de anticuerpo IgG_{2} contra
antígenos de superficie celular de estafilococos y resulta también
adecuado como adyuvante.
La presente invención también se refiere a la
utilización del antígeno para producir anticuerpos policlonales o
monoclonales (ratón o humano) que interaccionan con o neutralizan
las cepas de estafilococo que llevan el antígeno. En Ausubel, et
al., (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY., Capitulo 11; en
Methods OF HYBRIDOMA FORMATION 257-271, Bartal
& Hirshaut (eds.) Humana Press, Clifton, NJ (1998); en Vitetta
et al., Immunol. Rev. 62: 159-83 (1982) y en
Raso, Immunol. Rev. 62:93-117 (1982). Se describen
protocolos para producir estos anticuerpos.
El inóculo para la producción de anticuerpo
policlonal se suele preparar dispersando el inmunoportador de
antígeno en un diluyente fisiológicamente tolerable como un salino,
par formar una composición acuosa. Se administra una cantidad
inmunoestimulante de inóculo, con o sin adyuvante a un mamífero y
el mamífero inoculado se mantiene entonces durante un período de
tiempo suficiente para que el antígeno proceda a la inducción de
anticuerpos protectores anti-antígeno. Se pueden
utilizar dosis de refuerzo del inmunoportador de antígeno en
individuos que no han sido todavía sensibilizados para responder al
antígeno.
Se pueden citar como anticuerpos las
preparaciones de anticuerpos de una variedad de animales
habitualmente utilizados como por ejemplo cabras, primates, asnos,
cerdos, conejos, caballos, gallinas, conejillos de indias, ratas y
ratones e incluso anticuerpos humanos tras una selección adecuada,
fraccionamiento y purificación. Los antisueros animales también se
pueden producir inoculando los animales con cepas inactivadas con
formalina de estafilococos que llevan el antígeno, utilizando
métodos convencionales, sangrando los animales y recuperando suero
o plasma para su procesamiento ulterior.
Los anticuerpos inducidos de este modo se pueden
cosechar y aislar en la forma de deseada utilizando técnicas bien
conocidas como fraccionamiento de alcohol y cromatografía en
columna o cromatografía por inmunoafinidad, es decir, ligando
antígeno a un "packing" de columna cromatográfica como
Sephadex^{TM}, haciendo pasar el antisuero a través de la
columna, reteniendo de este modo anticuerpos específicos y
separando otras inmunoglobulina (IgGs) y contaminantes, y luego
recuperando anticuerpos purificados por elución con un agente
caotrópico, seguido opcionalmente de purificación ulterior, por
ejemplo haciendo pasar a través de una columna de antígenos de
grupo sanguíneo "bound" u otras especies no patógenas. Este
procedimiento puede ser el preferido cuando se aislan los
anticuerpos deseados del suero o del plasma de humanos que han
desarrollado un valor de anticuerpo contra el patógeno en cuestión,
garantizando por lo tanto la retención de anticuerpos capaces de
interactuar con el antígeno. Se pueden utilizar entonces en
preparaciones para inmunización pasiva contra cepas de estafilococo
que llevan el antígeno.
Una composición de anticuerpo monoclonal
contiene, dentro de límites detectables, únicamente una especie de
zona de combinación de anticuerpo capaz de interactuar efectivamente
con el antígeno. Los anticuerpos adecuados en forma monoclonal se
pueden preparar utilizando tecnología convencional de hibridoma.
Para formar hibridomas a partir de los cuales se produce una
composición de anticuerpo monoclonal de la presente invención, se
condensa un mieloma u otra línea celular
auto-perpetuante con linfocitos obtenidos de sangre
periférica, nodos linfáticos o el bazo de un mamífero
hiperinmunizado con el antígeno. Se prefiere que la línea celular
del mieloma sea de la misma especie que los linfocitos. Los
esplenocitos se suelen condensar con células de mieloma utilizando
polietilenglicol 1500. Se eligen híbridos condensados por su
sensibilidad a HAT. Los hibridomas que se secretan las moléculas de
anticuerpo de esta invención se pueden identificar utilizando una
ELISA.
Los materiales preferidos que se usan en la
preparación de hibridomas humanos o de murino son el bazo de un
ratón Balb/C, sangre periférica humana, nodos linfáticos o
esplenocitos. Como mielomas de ratón adecuados que se usan la
presente invención se pueden citar las líneas celulares sensible a
hipoxantina-aminopterina-timidina
(HAT), y un mieloma preferido es P3X63-Ag8.653. El
partner de fusión preferido para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos es SHM-D33, un heteromieloma
que se puede adquirir en ATCC, Rockville, Md y cuya denominación es
CRL1668.
Se puede producir una composición de anticuerpos
monoclonales de la presente invención iniciando un cultivo de
hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene
un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo de la
especificidad adecuada. El cultivo se mantiene en condiciones y
durante un período de tiempo suficiente para que el hibridoma
secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. El medio que
contiene anticuerpo se recoge entonces y entonces las moléculas
de,anticuerpo se pueden seguir aislando utilizando técnicas bien
conocidas. Los medios útiles para la preparación de estas
composiciones son bien conocidos en el estado de la técnica y se
encuentran en el mercado; estos medios pueden ser medios de cultivo
sintético, ratones endógamos y similares. Un medio sintético
ejemplar es el medio esencial Mínimo de Dulbecco suplementado con
20% de suero de ternera fetal. Como ejemplo de cepa de ratón
endógamo se puede citar el Balb/C.
Se contemplan también otros métodos de
preparación de composiciones de anticuerpos monoclonales tales como
fusiones Inter-especies, ya que es principalmente
la especificidad antigénica de los anticuerpos lo que supone su
utilidad en la presente invención. Se pueden condensar linfocitos
humanos obtenidos de personas infectadas con una línea celular de
mieloma humano para producir hibridomas que se criban entonces para
observar la producción de anticuerpos que reconocen el antígeno. No
obstante, resulta preferible en este sentido un proceso que no
supone la utilización de una muestra biológica de un paciente
humano infectado. Por ejemplo, un individuo inmunizado con una
vacuna como la descrita aquí puede servir de fuente de anticuerpos
que se pueden utilizar adecuadamente en una composición anticuerpo
dentro de la presente invención.
En una realización particularmente preferida, se
producen anticuerpos monoclonales del antígeno utilizando métodos
similares a los descritos para anticuerpos específicos de S.
aureus tipo 5 y tipo 8. Los anticuerpos monoclonales
purificados se caracterizan por ensayos de aglutinación bacteriana
usando una colección de aislados clínicos.
Las composiciones de anticuerpo monoclonal y
policlonal producidas según la presente descripción se pueden
utilizar mediante inmunización pasiva para inducir una respuesta
inmune para la prevención o tratamiento de infección por cepas de
estafilococos que llevan el antígeno. En este sentido, la
preparación de anticuerpo puede ser una composición policlonal.
Esta composición policlonal comprende anticuerpos que interactúan
con el antígeno, y puede incluir además anticuerpos que interactúan
con los antígenos que caracterizan otras cepas de estafilococo. El
componente de anticuerpo policlonal puede ser un suero policlonal,
de preferencia purificado por afinidad, de un animal que ha sido
expuesto al antígeno, y posiblemente también a otros antígenos de
estafilococo. Alternativamente, se puede utilizar una mezcla
"oligoclonal diseñada" que es una mezcla de anticuerpos
monoclonales del antígeno y anticuerpos monoclonales de otros
antígenos de estafilococo.
En ambos tipos de mezclas, puede resultar
ventajoso ligar juntos anticuerpos químicamente para formar una
sola molécula poliespecífica capaz de interactuar con el antígeno y
con antígenos característicos de otras cepas de estafilococos. Una
forma de realizar dicho enlace consiste en hacer bivalente
fragmentos híbridos F(ab')_{2} mezclando dos fragmentos
F(ab')_{2} diferentes producidos, por ejemplo por
digestión de pepsina de dos anticuerpos diferentes, división
reductiva para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguido de
reformación oxidativa de los enlaces disulfuro para producir una
mezcla de fragmentos F(ab')_{2} que comprende fragmentos
híbridos que contienen una parte Fab' específica de cada uno de los
antígenos originales. En Feteanu, LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND
MEDICINE 321-23, McGraw-Hill Int'l
Book Co. (1978); Nisonoff, et al., Arch Biochem. Biophys.
93: 470 (1961); and Hámmerling, et al., J. Exp. Med. 128:
1461 (1968); y en la patente US 4,331,47, se describen métodos para
preparar estos fragmentos de anticuerpo híbridos.
En el estado de la técnica se conocen otros
métodos para hacer bivalentes fragmentos enteramente
heteroespecíficos, por ejemplo utilizando ligantes bifuncionales
para unir fragmentos divididos. Se conocen moléculas recombinantes
que incorporan la cadena ligera y pesada de un anticuerpo, por
ejemplo según el método de Boss et al., patente US
4,816,397. En la presente invención se incluyen métodos análogos de
producción de moléculas de fijación sintética o recombinante que
tiene las características de anticuerpos. Utilizando diversos
ligantes conocidos en el estado de la técnica se pueden unir más de
dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo monoespecíficos
diferentes.
Un componente de anticuerpo producido de acuerdo
con la presente invención puede incluir anticuerpos enteros,
fragmentos de anticuerpos o subfragmentos. Los anticuerpos pueden
ser inmunoglobulina completa de cualquier clase, por ejemplo IgG,
IgM, IgA, IgD, IgE, anticuerpos mixtos o híbridos con
especificidades de epítopo o antígeno múltiple o dual, o
fragmentos, por ejemplo F(ab')_{2}, Fab', Fab y similares,
inclusive fragmentos híbridos y comprende además cualquier
inmunoglobulina o cualquier proteína natural sintética o
genéticamente diseñada que actúe como un anticuerpo interactuando
con un antígeno específico para formar un complejo. En particular,
las moléculas Fab se pueden expresar y ensamblar en un anfitrión
transformado genéticamente como E. coli. Se dispone por lo
tanto de un sistema de vector lambda para expresar una población de
Fab's con una diversidad potencial igual a o superior a la del
sujeto que genera el anticuerpo predecesor. Véase Huse, W.D. et
al., Science 246: 1275-81 (1989).
El antígeno según la presente invención puede
ser el ingrediente activo en una composición, que comprende además
un portador farmacéuticamente aceptable para el ingrediente activo,
que se puede utilizar como vacuna para inducir una respuesta inmune
celular y/o la producción in vivo de anticuerpos que
combaten la infección por estafilococos. En este sentido, un
portador farmacéuticamente aceptable es un material que se puede
utilizar como vehículo para la administración de un medicamento ya
que el material es inerte o médicamente aceptable de alguna otra
forma, así como compatible con el agente activo, en el contexto de
la administración de vacuna. Además de un excipiente adecuado, un
portador farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos de
vacuna convencionales como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes,
conservantes y agentes de solubilización.
En una realización alternativa, se utilizan
células que llevan el antígeno en una vacuna de célula completa.
Las células que llevan el antígeno se pueden identificar y
seleccionar para utilizarlas en la vacuna de célula completa
utilizando anticuerpos de una cepa conocida por llevar el antígeno,
y todavía mejor utilizando anticuerpos monoclonales de antígeno
aislado tal como se describe aquí. En este sentido, se puede
utilizar un simple experimento de glutinación en placa en el que se
mezclan con células anticuerpos del antígeno.
La cepa depositada ATCC 202176 es una cepa
representativa de estafilococos que llevan el antígeno y se pueden
utilizar para producir anticuerpos útiles para identificar otras
cepas que llevan el antígeno. No obstante, no es necesario utilizar
la cepa depositada para producir el antígeno, la vacuna de célula
completa o anticuerpos útiles para identificar otras células que
llevan el antígeno. ATCC 202176 únicamente proporciona un medio
inmunológico de identificar dichas células.
Tal como se ha descrito anteriormente para la
vacuna de antígeno purificado, la vacuna de célula completa
comprende también un portador farmacéuticamente aceptable. La
vacuna de célula completa puede contener también opcionalmente
aditivos de vacuna convencionales como diluyentes, adyuvantes,
antioxidantes, conservantes y agentes de solubilización. En una
realización preferida, la vacuna de célula completa contiene
solamente células que llevan el antígeno y no incluye células de
cepa de estafilococo que no llevan el antígeno.
Se pueden administrar vacunas según la invención
a un sujeto no infectado todavía con estafilococo, para inducir de
este modo una respuesta inmune protectora a los estafilococos
(humoral o celular) en dicho sujeto. Alternativamente, se pueden
administrar, vacunas, dentro de la presente invención, a un sujeto
en el que ya se ha presentado la infección por estafilococo aunque
se encuentra en un estadio suficientemente temprano para que la
respuesta inmune producida a la vacuna siga inhibiendo de forma
eficaz la extensión de la infección.
En otra aproximación, se puede administrar una
vacuna de la presente invención a un sujeto que actúa entonces como
fuente de globulina, producida en respuesta a la exposición a la
vacuna específica ("globulina hiperinmune"), que contiene
anticuerpos dirigidos contra estafilococos. Un sujeto así tratado
donaría plasma del que se obtendría globulina hiperinmune,
utilizando una metodología convencional de
fraccionamiento-plasma y se administraría a otro
sujeto para proporcionarle resistencia contra o tratar la infección
por estafilococos. Las globulinas hiperinmunes según la invención
resultan particularmente útiles para individuos inmunodeprimidos,
para individuos sometidos a procedimientos invasivos o cuando el
tiempo disponible no permite al individuo producir sus propios
anticuerpos en respuesta a la vacunación.
De forma similar, se pueden conjugar con una
inmunotoxina anticuerpos anti-estafilococos
monoclonales o policlonales según la presente invención y
administrarlos a un sujeto en el que la infección por estafilococos
ya se ha producido pero que no se ha extendido todavía mucho. Para
ello, se administrará el material de anticuerpo producido según la
presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable,
según se define en el presente documento.
La presente invención se describe a continuación
más ampliamente con referencia a los siguientes ejemplos
ilustrativos.
Se fermentó ATCC 202176, una cepa de S.
epidermidis que lleva el antígeno, en un fermentador de 50
litros en Caldo de Columbia, suplementado con 4% NaCl. La
fermentación se inició con un litro de cultivo de semilla de 16
horas. Se fermentaron las células durante 24 horas con baja
aireación (1 v.v.m.) y agitando suavemente (200 rpm) a 37ºC. Tras
la fermentación, se inactivaron las células con 2% de concentración
final de fenol a etanol (1:1) y luego se centrifugó para separar
las células del sobrenadante.
Las células que se iban a utilizar como vacuna
para preparar antisuero de célula completa se fijaron en formalina
3% durante la noche a temperatura ambiente. Se desactivaron células
para la purificación de antígeno añadiendo
fenol-etanol (1:1, vol/vol) al fermentador hasta una
concentración final de 2% y mezclando lentamente durante 2 horas a
15-20ºC. Se detectaron las células no viables
después de este tratamiento. Se cosecharon entonces las células
por centrifugación a 14.500 x g y se almacenaron a -70ºC hasta su
utilización.
Se ajustaron células fijadas por formalina del
ejemplo 1 a OD_{540 \ nm} = 1 y se inyectaron por vía intravenosa
a unos conejos. No se utilizó ningún adyuvante. Se sangraron los
conejos semanalmente y se recogió y agrupó el suero de célula
completa positivo. Se purificó IgG a partir del suero de célula
completa mediante una columna de afinidad proteína G.
Se extrajo antígeno de la pasta celular. Se
trató durante 4 horas a 37ºC una suspensión de la pasta celular
(0,5 g/ml) con pronasa (1 mg/g de célula) y luego con lisostafina
(175 U/g de célula), DNase y RNase (0,1 mg/g de cada) y luego se
almacenó durante la noche a 4ºC. Se hizo la suspensión 10% en ácido
tricloroacético (TCA) y se incubó durante 4 horas a 60ºC. Tras la
centrifugación, el sobrenadante se neutralizó con 1 M NaOH hasta un
pH de 7,0 seguido de precipitación secuencial con
25-75% etanol frío en presencia de 10 mM CaCl_{2}.
Se precipitaron ácidos nucléicos y proteínas de alto peso molecular
del sobrenadante neutralizo ajustándolo a 25% de etanol e incubando
a 4ºC durante 4 horas. Después de la centrifugación, se ajustó el
sobrenadante a 75% de etanol y se incubó a 4ºC durante
4-12 horas para precipitar el material que contenía
antígeno.
El precipitado que contenía el antígeno crudo se
disolvió en agua y se eliminó por diálisis en etanol residual. El
material dializado se ajustó a 0,01 M Tris-HCl pH
7,0, 0,3 M NaCl y se eliminó el ácido teicoide residual por
cromatografía de cambio de aniones en una columna
Q-Sepharose en modo de paso con 0,01
Tris-HCl pH 7,0, 0,3 M NaCl. Se testaron fracciones
por precipitación capilar con anticuerpos específicos del antígeno
para determinar las fracciones que contenían antígeno. Las
fracciones que contenían antígeno se dializaron contra agua (3 x
5L), se liofilizaron y trataron con lisozima (0,5 mg/g pasta
celular) durante 3 horas a 37ºC para digerir el péptido glucano
residual. La fracción que contenía antígeno crudo, tratado con
enzima se volvió a suspender en 0,01 M en Tris-HCl
pH 7,0 y se recromatografió en una columna
Q-Sepharose en gradiente lineal
0,1-0,25 M NaCl. Las fracciones positivas de
antígeno y negativas de fósforo, determinadas mediante el ensayo
colorimétrico y precipitación capilar con antisuero monoespecífico
del ejemplo 2, respectivamente se agruparon, se dializaron contra
agua y se liofilizaron. La mayoría de los antígenos eluyeron a 0,2
M NaCl. El antígeno crudo se siguió purificando en una columna CL6B
Sepharose para obtener antígeno prácticamente puro. Se agruparon
las fracciones que contenían antígeno, se dializaron contra agua y
se secaron por congelación.
El análisis de antígeno purificado por
GLC-MS mostró la presencia de GlcNAc como componente
glucosilo principal. Esto se confirmó mediante espectroscopia
1H-NMR y 13C-NMR del antígeno, lo
cual indicó una señal anomérica a \delta 4,88 y \delta 100,48
ppm, respectivamente. La presencia de una sola señal anomérica
connota la presencia de monosacárido como componente principal. No
se encontraron señales correspondientes a grupos
O-acetilo.
Un pequeño valor de JH1,H2 (<1,0 Hz) indicó
una configuración \alpha para el carbohidrato, que fue confirmada
por una medida de c=173 Hz para la constante de acoplamiento JC,H.
Las señales en \alpha 24,860 ppm (NAc-CH_{3}) y
\alpha 176,814 ppm (NAc-CO) en 13C NMR indicaron
que la glucosamida estaba N-acetilada,
constituyendo la porción carbohidrato del antígeno
2-acetamido-2-deoxi-\alpha-D-glucopiranosida.
Otras señales de espectro C13-NMR aparecen en 6
75,122, 73,953, 73,865, 73,807, 72,939, 69,847, 69,638, 69,585,
63,515 y 56,321 respectivamen-
te.
te.
El análisis de aminoácidos del antígeno mostró
la presencia de serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina
y treonina en proporciones molares de aproximadamente
39:25:16:10:7. Los aminoácidos constituían aproximadamente el 32%
en peso de la molécula de antígeno.
La movilidad del antígeno purificado tras la
inmunoelectrofóresis (IEF) indicó la presencia de grupos cargados
negativamente. El antígeno purificado no contenía azucares neutros
como se detectó en el ensayo fenol sulfúri-
co.
co.
Se despolimerizó parcialmente antígeno
purificado por hidrólisis en 50 mM ácido acético a 100ºC durante 30
minutos, o a 80ºC durante 90 minutos. La mezcla de reacción se
liofilizó y se eliminó el ácido acético por liofilización.
Se disolvió un antígeno parcialmente hidrolizado
en 0,5 M ADH hasta su concentración final de 5 mg/mL y el pH se
ajustó a 5,6 con 0,1 M HCl. Se obtuvo una solución de antígeno 100
mM EDAC añadiendo EDAC (como polvo) y se mantuvo el pH a 5,6 con
0,1 M HCl durante 1 hora. La mezcla de reacción se dializó entonces
contra 0,2 M NaCl (1X), luego se desaló sobre una columna Sephadex
G25 (2,6 x 30 cm) y se liofilizó. La cantidad de ADH incorporada al
antígeno se determinó colorimétricamente mediante un ensayo de
ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS) usando ADH como
standard.
Se disolvió antígeno derivado de ADH (10 mg) en
1795 \muL de 0,1 M MES tampón pH 5,6 y se añadió 205 \muL de
solución rEPA (48 mg/mL) que representa 10 mg de rEPA. La mezcla de
reacción pasó a ser de 100 mM EDAC añadiendo EDAC (en polvo) y se
agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se
detuvo la reacción llevando el pH a 7,0 con sal sádica MES 1 M (pH
9,21). Se obtuvo conjugado puro por cromatografía de exclusión de
tamaño en columna Sephacryl S-300 eluido con PBS.
La cantidad de antígeno y proteína en el conjugado se determinó por
ensayo competitivo ELISA y Coomasie Blue (Pierce) utilizando el
antígeno correspondiente o BSA como standard. Se utilizó el
procedimiento similar para preparar conjugado
antígeno-Dtd.
Se inmunizaron conejos blancos hembras de Nueva
Zelanda mediante inyección subcutánea con 50 \mug de conjugado
inmunoportador-antígeno preparado según el ejemplo 5
los días 0, 14 y 28. La primera inyección se dio con un volumen
igual de adyuvante completo de Freund (CFA) y se dieron unas
inyecciones ulteriores con adyuvante incompleto de Freund (IFA).
Las muestras de prueba tomadas de los conejos se analizaron para
comprobar la presencia de precipitación de anticuerpos de conejo
específicos del antígeno con el que fueron inmunizados. Se
realizaron más inyecciones, en la medida de lo necesario, para
reforzar el valor.
Se sangraron conejos para obtener antisueros de
conejo de alto valor que contenía anticuerpos específicos del
antígeno con el que fueron inmunizados. Los anticuerpos pudieron
mediar en la desactivación de células que llevaban el antígeno
mediante HL 60 en presencia de complemento. Los conejos inmunizados
con conjugados de rEPA-antígeno o
Dtd-antígeno también podían producir anticuerpos
específicos del antígeno. Estos anticuerpos dieron precipitados con
el antígeno en capilares.
Se vio que los sueros conjugados purificados IgG
contenían 16,0 mg/ml de IgG total en ELISA y 1,54 mg/ml IgG
específico-antígeno con ELISA. Se utilizó IgG
conjugado en ensayos de opsonofagocitosis para evaluar la aptitud
de los anticuerpos específicos para mediar en la opsonofagocitosis
de bacterias estafilococos correspondientes mediante células
HL-60 en ensayos in vitro y en modelos
animales para evaluar la eficacia in vivo.
Se transfirieron bacterias de ATCC 202176, una
cepa de estafilococo que lleva el antígeno, desde perlas a una
nueva placa agar soja tripsínica. Se incubó la placa durante
18-20 horas a 37ºC en 5% CO_{2}. Las bacterias se
rasparon de la placa y se utilizaron para la inoculación de 200 mL
de Caldo Columbia suplementado con 4% NaCl. Se incubaron las
bacterias durante 18-20 horas a 27ºC, luego se
centrifugaron a 200 rpm durante 10 minutos a
25-35ºC y se quitó el sobrenadante. La bacteria
granulada se volvió a suspender en dos mililitros de salino estéril
y se preparó para utilizar una suspensión de bacterias de una
densidad óptica de 0,1 a 650 nm.
Se utilizó como material de trabajo de solución
bacteriana una muestra diluida 1:200 preparada a partir de la
suspensión bacteriana antes descrita en medio MEM suplementado con
0,1% de gelatina. Esta preparación bacteriana se probó con los
antisueros correspondientes para aglutinación en placa positiva. El
material de trabajo bacteriano se cargó en pocillos de placa de
microvaloración con la dilución adecuada de medio MEM.
Se obtuvieron PMNs de células
HL-60 ajustados a una concentración de 1,0 x
10^{6} células por ml en MEM suplementado con 0,1% de gelatina.
Las células PMN se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos a
30-35ºC. Las células granuladas se volvieron a
suspender en 5 ml de medio MEM suplementado con 0,1% de gelatina y
se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos. Las células
granuladas se volvieron a suspender en 1 ml de medio MEM
suplementado con 0,1% gelatina para obtener concentración de
trabajo de 1 x 10^{6}/ml.
Se diluyó hasta 1:80 en medio MEM suplementado
con 0,1% gelatina un complemento humano preparado a partir de
suero humano. La mezcla de reacción en los pocillos de la placa de
microvaloración contenía 50 \mul de bacterias [10^{6}
célula/ml], 50 \mul de suero diluido, 50 \mul de PMN [10 x
10^{6} células/ml] y 50 \mul de complemento [1:80], lo cual
daba un volumen total de 200 \mul. En el momento cero, se diluyó
en serie 1:5, 1:10, y 1:50 una muestra de 10 \mul de la placa de
reacción. Se preparó en placas Petri una muestra de 10 \mul de
cada disolución sobre una placa de agar soja tripsínica (TSA). Las
placas TSA se incubaron durante la noche a 37ºC, 5% CO_{2}. Tras
la dilución de la hora cero, la placa de reacción se incubó a 37ºC
durante 90 minutos. Las muestras se volvieron a mezclar. Se diluyó
en serie 1:5, 1:10 y 1:50 una muestra de 10 \mul de la placa de
reacción. Se preparó en placas de Petri una muestra de 10 \mul de
cada dilución sobre placas TSA que se incubaron luego durante la
noche a 37ºC, 5% CO_{2}.
Las colonias bacterianas se recontaron para cada
dilución/muestra/placa y se calculó el porcentaje de desactivación
de bacterias mediante la fórmula:
% \
desactivación \ = \frac{n^{o} \ de \ colonias \ a \ T_{0} - n^{o} \
de \ colonias \ a \ T_{90} \ x \ 100}{número \ de \ colonias \ a \
T_{0}}
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos antisueros de célula completa de conejos
inmunizados con ATCC 202176 y anticuerpos de conejos producidos
por conjugados antígeno-Dtd intervinieron en la
opsonofagocitosis de estafilococo por HL-60 en
presencia de complemento humano. La actividad opsónica tanto del
antisuero de célula completa como de los anticuerpos de conejo de
conjugado anti-antígeno-rEPA fue
absorbida completamente por el antígeno.
Se dividieron en tres grupos un total de 24
ratones, con 8 ratones en cada grupo. Los ratones en el primer
grupo se inmunizaron con una inyección intraperitoneal de 2,5
\mug de conjugado antígeno-rEPA purificado
producido según el ejemplo 5 e IFA. Los ratones en el segundo grupo
se inyectaron con PBS más IFA, mientras que los ratones del tercer
grupo se inyectaron con PBS. Los ratones se revacunaron dos veces a
dos semanas de intervalo con la misma vacuna o dosis de
control.
Una semana después de la tercera inyección
(segundo refuerzo), se expusieron los ratones a 1,15 x 10^{8} cfu
de cepa #V01048, una cepa productora de limo de S.
epidermidis que lleva el antígeno en 5% hog mucin. Se controló
la morbidez y mortalidad de los ratones expuestos. Los resultados
mostraron que el 75% (2/8) de los ratones del primer grupo
sobrevivieron a la exposición letal y estaban todavía vivos y 216
después de la exposición mientras que todos los ratones de los
grupos segundo y tercero murieron a los 41 días de la
exposición.
Se evaluó el efecto profiláctico de anticuerpo
monoclonal antígeno-específico en el mismo modelo
de ratón utilizando cepa S. epidermidis productora de limo
#977 que lleva el antígeno para la exposición. Se inmunizaron
subcutáneamente grupos de ratones con 0,5 mg ó 1,0 mg de anticuerpo
monoclonal antígeno-específico de S.
epidermidis, 1 mg de anticuerpo monoclonal E.
Coli-específico, o 1 mg de anticuerpo monoclonal específico de
limo de S. epidermidis, respectivamente. Veinticuatro horas
después de la inmunización, los ratones se expusieron
intraperitonealmente a 1 x 10^{8} CFU de bacterias en 6% hog
mucin y se controló la morbidez y mortalidad de los ratones. Los
resultados mostraron protección en función de la dosis por
anticuerpo monoclonal específico de antígeno según la invención.
Ningún anticuerpo específico del limo ni específico de E.
coli ofreció protección contra la exposición.
Se dividió un total de 80 ratones en dos grupos,
con 40 ratones en cada grupo. Los ratones del primer grupo se
inmunizaron con una inyección subcutánea de 2,5 \mug de conjugado
antígeno-Dtd purificado según el ejemplo 5 e IFA.
Los ratones del segundo grupo se inyectaron con conjugado MEP (un
conjugado de exopolisacárido mucoide de Pseudomonas
aeruginosa y Dtd) más IFA. Se revacunaron dos veces los ratones
a dos semanas de intervalo, con la misma vacuna o dosis de
control.
\newpage
Una semana después de la tercera inyección se
expusieron intraperitonealmente los ratones a una dosis
sub-letal (5,0 x 10^{7} cfu) de capa #V01048, una
cepa productora de limo de S. epidermidis que lleva el
antígeno en 5% hog mucin. Los ratones expuestos se exsanguinaron y
se comprobó si había cultivos bacterianos positivos a las 6 horas,
24 horas, 30 horas y 48 horas (diez ratones en cada uno de estos
periodos). Los resultados mostraron que la inmunización con
conjugado antígeno-rEPA reducía notablemente la
bacteriemia en los ratones expuestos, facilitando la depuración de
bacterias de la sangre. El grupo de control inmunizado con el
conjugado MEP no quedó protegido contra bacteriemia.
Se evaluó en un ensayo de adherencia in
vitro la aptitud del antígeno para propiciar la adherencia de
la cepa #977 de S. epidermidis productora de limo que lleva
el antígeno y la cepa de S. haemolyticus 4162 que lleva el
antígeno (determinado por doble inmunodifusión de extracto
bacteriano crudo) a catéteres intravenosos. Se cultivaron las
bacterias durante la noche a 37ºC en una placa agar Columbia
suplementada con cloruro sódico 4%. A la mañana siguiente se
inoculó una colonia aislada de esta placa en 5 ml de Caldo Columbia
suplementado con cloruro sódico 4%. Este cultivo se dejó en cultivo
durante 4 horas agitando a 37ºC y luego se ajustó a un OD de 0,12 a
650 nM.
Se incubó un solo catéter 1¼'' IV Insyte
[Material de Radiopaque Vialon®, Becton Dickinson Vascular Access,
Sandy, Utah] a 37ºC durante 30 minutos en un volumen de 1 ml de
una solución de antígeno 0,5 mg/ml en PBS. Los catéteres se lavaron
entonces con cuidado con PBS frío, se sumergieron en 1 ml de
suspensión bacteriana y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC sin
agitar. Los catéteres se lavaron entonces con cuidado nuevamente
con una solución PBS fría y se cortaron en tres trozos iguales. Los
catéteres cortados se sumergieron en 500 \mul de PBS y se
expusieron a ultrasonidos durante 1 minuto sobre hielo para
desprender mediante ultrasonidos las células bacterianas fijadas en
el catéter. Esta suspensión se diluyó a 1:10, 1:100 y 1:1000 en PBS
y se preparó sobre placas TSA y se incubó durante
18-20 horas a 37ºC. Se recontaron las colonias
bacterianas y se determinaron las diferencias en cuanto a
recuperación bacteriana de diferentes catéteres revestidos con
antígeno.
Los resultados mostraron que la preincubación de
los catéteres intravenosos con antígeno aislado de S.
epidermidis 202176 reducía en 97,5% la adherencia de la cepa
#977 de S. epidermidis productora de limo que lleva el
antígeno y redujo en 92% la adherencia de S. haemolyticus.
Se detectó el antígeno idéntico al antígeno purificado de S.
epidermidis 202176 en extractos de pared celular cruda de S.
haemolyticus y S. hominis, lo cual sugiere que el
antígeno de S. epidermidis es responsable de la adherencia de
estafilococos coagulasa-negativos a catéteres
intravenosos.
Se evaluó en un ensayo de adherencia in
vitro la aptitud de los fragmentos Fab preparados a partir de
anticuerpos antígeno-específicos para bloquear la
adherencia de la cepa RP62A de S. epidermidis productora de
limo, una cepa que lleva el antígeno, al catéter intravenoso
preincubado en plasma humano. Se cultivaron las bacterias durante
la noche a 37ºC en una placa agar Columbia suplementada con cloruro
sódico 4%. A la mañana siguiente, se inoculó una colonia aislada de
esta placa en 5 ml de Caldo Columbia suplementado con cloruro
sódico 4%. Este cultivo se dejó en cultivo durante 4 horas agitando
a 37ºC y luego se ajustó a un OD de 0,12 a 650 nm. Se centrífugo la
suspensión bacteriana (1 ml) a 300 rpm y el gránulo se volvió a
suspender en 1 ml de solución Fab (1 mg/mi) y se incubó durante 30
minutos a 37ºC.
Se incubó un solo catéter 1¼'' IV Insyte
[Material de Radiopaque Vialon®, Becton Dickinson Vascular Access,
Sandy, Utah] a 37ºC durante 30 minutos en un volumen de 1 ml de una
solución de antígeno 0,5 mg/ml en PBS. Los catéteres se lavaron
entonces con cuidado con PBS frío, se sumergieron en 1 ml de
suspensión bacteriana y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC sin
agitar. Los catéteres se lavaron entonces con cuidado nuevamente
con una solución PBS fría y se cortaron en tres trozos iguales. Los
catéteres cortados se sumergieron en 500 \mul de PBS y se
expusieron a ultrasonidos durante 1 minuto sobre hielo para
desprender mediante ultrasonidos las células bacterianas fijadas en
el catéter. Esta suspensión se diluyó a 1:10, 1:100 y 1:1000 en PBS
y se preparó sobre placas TSA y se incubó durante
18-20 horas a 37ºC. Se recontaron las colonias
bacterianas y se determinaron las diferencias en cuanto a
recuperación bacteriana de diferentes catéteres revestidos con
antígeno.
Los resultados mostraron que la adherencia de la
cepa RP62A de S. epidermidis productora de limo que lleva el
antígeno no se veía afectada por el tratamiento previo de catéteres
con fragmentos Fab preparados a partir de anticuerpos de conejo
normales. El tratamiento previo de las mismas bacterias con
fragmentos Fab preparados a partir de anticuerpos de conejo
antígeno-específicos inhibió de modo eficaz la
adherencia de las bacterias a los catéteres intravenosos. Estos
datos y los datos del ejemplo 11 sugieren que el antígeno desempeña
un papel importante en la adherencia de estafilococos
coagulasa-negativos a biomateriales. La inhibición
de la adherencia mediante antígenos y anticuerpos
antígeno-específicos puede jugar un papel importante
en la prevención de infecciones relacionadas con cuerpos extraños
causadas por estafilococos coagulasa-negativos.
Claims (29)
1. Antígeno de estafilococo aislado que
comprende (a) aminoácidos y hexosamina N-acetilada
en una configuración \alpha, (b) no contiene ningún grupo
O-acetilo detectable por espectroscopia de
resonancia magnética nuclear y (3) enlaza específicamente con
anticuerpos de una cepa de estafilococos depositada con el número
ATCC 202176.
2. Antígeno según la reivindicación 1, donde la
mencionada hexosamina N-acetilada es
2-acetamido-2-deoxi-\alpha-D-glucopiranosida.
3. Antígeno según la reivindicación 2, en el
que los mencionados aminoácidos comprenden serina, alanina, ácido
aspártico/asparagina, valina y treonina.
4. Antígeno según la reivindicación 3, en el
que la mencionada serina, alanina, ácido aspártico/asparagina,
valina y treonina se encuentran en relación molar
39:25:16:10:7.
5. Conjugado portador de antígeno que comprende
un antígeno según la reivindicación 1 ligado a un
inmunoportador.
6. Conjugado portador de antígeno según la
reivindicación 5, en el que el mencionado inmunoportador es una
cepa mutante no tóxica, producida de forma recombinante, de
exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.
7. Composición que comprende un antígeno según
la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable y
estéril para el mismo.
8. Composición que comprende un conjugado
inmunoportador de antígeno según la reivindicación 5, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable y estéril para el mismo.
9. Composición según la reivindicación 5, en la
que el citado inmunoportador es un mutante no toxico producido de
forma recombinante, de exotoxina A de Pseudomonas
aeruginosa.
10. Composición según la reivindicación 9, que
se utiliza en un método de inmunoterapia que comprende una etapa de
administración a un individuo de una cantidad inmunoestimulante de
la citada composición.
11. Método de preparación de un agente
inmunoterapéutico contra infección por estafilococo, que comprende
la cosecha de una globulina hiperinmune que contiene anticuerpos
dirigidos contra estafilococo de plasma recogido de individuos
inmunizados con una composición según la reivindicación 9.
12. Globulina hiperinmune que contiene
anticuerpos dirigidos contra un antígeno como el de la
reivindicación 1.
13. Anticuerpo monoclonal dirigido contra un
antígeno según la reivindicación 1.
14. Globulina hiperinmune según la
reivindicación 12, que se utiliza en un método de inmunoterapia que
comprende una etapa de administración de dicha globulina a un
individuo.
15. Vacuna que comprende células de estafilococo
que llevan un antígeno que enlaza específicamente con anticuerpos
de una cepa de estafilococos depositada con el número ATCC 202176 y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Composición según la reivindicación 15, que
se utiliza en un método de inmunoterapia que comprende la
administración a un individuo de una cantidad inmunoestimulante de
la citada composición.
17. Método de preparación de un agente
inmunoterapéutico contra la infección por estafilococo, que
comprende:
la cosecha de anticuerpos dirigidos contra
estafilococos de plasma recogido de individuos inmunizados con una
composición según la reivindicación 15.
18. Agente inmunoterapéutico contra infección
por estafilococos que comprende anticuerpos preparados con el
método de la reivindicación 15 en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
19. Ensayo diagnóstico para detectar la
presencia de un anticuerpo anti-estafilococo en una
muestra, que comprende:
la mezcla de un antígeno de estafilococo según
la reivindicación, con una muestra sospechosa de contener
anticuerpo específico de estafilococo; y
el control y seguimiento de dicha mezcla para
observar el enlace entre dicho antígeno y el anticuerpo específico
de estafilococo en la citada muestra.
20. Ensayo diagnóstico según la reivindicación
19, en el que el mencionado antígeno se inmoviliza sobre una matriz
sólida.
21. Kit para detectar la presencia de un
anticuerpo anti-estafilococo en una muestra, que
comprende:
un antígeno de estafilococo según la
reivindicación 1.
22. Kit según la reivindicación 21, en el que
dicho antígeno se inmoviliza sobre una matriz sólida.
23. Ensayo diagnóstico para detectar la
presencia de un antígeno anti-estafilococo en una
muestra que comprende:
la mezcla de un anticuerpo monoclonal de un
antígeno de estafilococo según la reivindicación 1, con una muestra
sospechosa de contener antígeno de estafilococo; y
el control y seguimiento de dicha mezcla para
comprobar el enlace entre dicho antígeno y el mencionado anticuerpo
monoclonal de estafilococo.
24. Ensayo diagnóstico según la reivindicación
23, en el que el citado anticuerpo se inmoviliza sobre una matriz
sólida.
25. Kit para detectar la presencia de un
anticuerpo anti-estafilococo en una muestra que
comprende:
un anticuerpo monoclonal de un antígeno de
estafilococo según la reivindicación 1.
26. Kit según la reivindicación 25, en el que
dicho anticuerpo monoclonal se inmoviliza sobre una matriz
sólida.
27. Método para evitar la adherencia de
bacterias de estafilococo a un catéter, que comprende el
tratamiento de dicho catéter con antígeno según la reivindicación
1.
28. Catéter revestido con un antígeno según la
reivindicación 1.
29. Vacuna según la reivindicación 15, que se
utiliza en un método de inmunoterapia que comprende una etapa de
administración a un individuo de una cantidad inmunoestimulante de
la citada composición.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US272359 | 1999-03-19 | ||
US09/272,359 US6936258B1 (en) | 1999-03-19 | 1999-03-19 | Staphylococcus antigen and vaccine |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2261192T3 true ES2261192T3 (es) | 2006-11-16 |
Family
ID=23039462
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00916405T Expired - Lifetime ES2261192T3 (es) | 1999-03-19 | 2000-03-17 | Antigeno de estafilococo y vacuna. |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6936258B1 (es) |
EP (1) | EP1162997B1 (es) |
JP (1) | JP4656728B2 (es) |
AT (1) | ATE320265T1 (es) |
AU (1) | AU773226B2 (es) |
BR (1) | BR0009157B1 (es) |
CA (1) | CA2366433C (es) |
CY (1) | CY1105500T1 (es) |
DE (1) | DE60026691T2 (es) |
DK (1) | DK1162997T3 (es) |
ES (1) | ES2261192T3 (es) |
MX (1) | MXPA01009476A (es) |
NZ (1) | NZ514455A (es) |
PT (1) | PT1162997E (es) |
WO (1) | WO2000056357A2 (es) |
Families Citing this family (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6294177B1 (en) | 1996-09-11 | 2001-09-25 | Nabi | Staphylococcus aureus antigen-containing whole cell vaccine |
US6936258B1 (en) * | 1999-03-19 | 2005-08-30 | Nabi Biopharmaceuticals | Staphylococcus antigen and vaccine |
AT410798B (de) | 2001-01-26 | 2003-07-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen |
WO2003059259A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Biosynexus Incorporated | Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria |
US20060134141A1 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Nabi Biopharmaceuticals | Glycoconjugate vaccines containing peptidoglycan |
EP1850867A1 (en) * | 2005-01-10 | 2007-11-07 | Nabi Biopharmaceuticals | Method of treating staphylococcus aureus infection |
AR055580A1 (es) | 2005-06-13 | 2007-08-29 | Nabi Biopharmaceuticals | Uso de leucocidina de panton valentine para el tratamiento y prevencion de infecciones por estafilococos |
US20080206276A1 (en) | 2005-07-08 | 2008-08-28 | Michael Otto | Targeting Poly-Gamma-Glutamic Acid to Treat Staphylococcus Epidermidis and Related Infections |
WO2008019162A2 (en) | 2006-01-18 | 2008-02-14 | University Of Chicago | Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins |
CA2647441C (en) | 2006-03-30 | 2021-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition comprising staphylococcus aureus saccharides |
CN102743747A (zh) | 2006-06-12 | 2012-10-24 | 葛兰素史密斯克蓝生物品公司 | α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途 |
WO2009029831A1 (en) | 2007-08-31 | 2009-03-05 | University Of Chicago | Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions |
US20110262477A1 (en) | 2008-10-06 | 2011-10-27 | University Of Chicago | Compositions and Methods Related to Bacterial EAP, EMP, and/or ADSA Proteins |
US8101190B2 (en) * | 2009-03-03 | 2012-01-24 | Ingen Biosciences | Method for diagnosing staphylococcal infections |
CN102612523B (zh) | 2009-04-03 | 2016-01-20 | 芝加哥大学 | 与蛋白a(spa)变体相关的组合物和方法 |
WO2011127032A1 (en) | 2010-04-05 | 2011-10-13 | University Of Chicago | Compositions and methods related to protein a (spa) antibodies as an enhancer of immune response |
EP2445522B1 (en) | 2009-06-22 | 2017-08-09 | Wyeth LLC | Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens |
ES2959890T3 (es) | 2009-06-22 | 2024-02-28 | Wyeth Llc | Composiciones y procedimientos para preparar composiciones inmunogénicas de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8 de Staphylococcus aureus |
GB0913681D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
US10266585B2 (en) | 2009-08-28 | 2019-04-23 | The Board Of Regents Of The Univerity Of Texas System | Methods of treating brain injury |
US8974799B2 (en) | 2009-09-30 | 2015-03-10 | Novartis Ag | Conjugation of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides |
WO2011051917A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Novartis Ag | Purification of staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular saccharides |
CA2803298C (en) | 2010-07-02 | 2020-07-14 | The University Of Chicago | Compositions and methods related to protein a (spa) variants |
US9095540B2 (en) | 2010-09-09 | 2015-08-04 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens |
WO2012051498A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Antibodies that bind amyloid oligomers |
AU2011346535B2 (en) | 2010-12-22 | 2015-09-24 | Wyeth Llc | Stable immunogenic compositions of Staphylococcus aureus antigens |
US8945588B2 (en) | 2011-05-06 | 2015-02-03 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides |
EP2729178A1 (en) | 2011-07-08 | 2014-05-14 | Novartis AG | Tyrosine ligation process |
AU2012296576B2 (en) | 2011-08-15 | 2017-09-07 | The University Of Chicago | Compositions and methods related to antibodies to staphylococcal protein a |
JP6170932B2 (ja) | 2011-11-07 | 2017-07-26 | ノバルティス アーゲー | spr0096抗原およびspr2021抗原を含むキャリア分子 |
EP2814803A4 (en) | 2011-12-14 | 2015-11-11 | Indicator Systems International Inc | TRISUBSTITUTED METHYL ALCOHOLS AND POLYMERIZABLE DERIVATIVES THEREOF |
CA2910319C (en) | 2012-04-26 | 2022-06-14 | University Of Chicago | Staphylococcal coagulase antigens and methods of their use |
WO2013162751A1 (en) | 2012-04-26 | 2013-10-31 | University Of Chicago | Compositions and methods related to antibodies that neutralize coagulase activity during staphylococcus aureus disease |
NZ704490A (en) | 2012-08-16 | 2017-07-28 | Pfizer | Glycoconjugation processes and compositions |
CA2893343C (en) | 2012-12-20 | 2019-05-14 | Pfizer Inc. | Glycoconjugation process |
WO2014116721A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Geminiviral vector for expression of rituximab |
GB201310008D0 (en) | 2013-06-05 | 2013-07-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition for use in therapy |
MX2016000393A (es) | 2013-07-11 | 2016-10-26 | Novartis Ag | Modificaciones de proteinas quimioenzimaticas de lisina utilizando transglutaminasa microbiana. |
CA2937190A1 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof |
RU2771293C2 (ru) | 2014-01-21 | 2022-04-29 | Пфайзер Инк. | Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные капсульные сахаридные антигены, и их применение |
AU2015208820B2 (en) | 2014-01-21 | 2020-05-14 | Pfizer Inc. | Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof |
US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
JP2017505792A (ja) | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
EP3229833A1 (en) | 2014-12-10 | 2017-10-18 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Method of treatment |
AU2016207820B2 (en) | 2015-01-15 | 2020-12-17 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
SG10202101887WA (en) | 2015-05-04 | 2021-03-30 | Pfizer | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
TWI684460B (zh) | 2015-07-21 | 2020-02-11 | 美商輝瑞股份有限公司 | 包含經共軛之莢膜糖抗原的致免疫性組成物、包含該致免疫性組成物之套組及彼等之用途 |
EP3377098A1 (en) | 2015-11-20 | 2018-09-26 | Pfizer Inc | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
WO2017173398A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Duke University | Alpha-helical peptide nanofibers as a self-adjuvanting vaccine platform |
US10751402B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-08-25 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions and uses thereof |
BR112019014833A2 (pt) | 2017-01-20 | 2020-04-14 | Pfizer | composições imunogênicas para uso em vacinas pneumococais |
US11413336B2 (en) | 2018-03-23 | 2022-08-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Coccidioides antigens and methods of their use |
EP3893926A1 (en) | 2018-12-12 | 2021-10-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof |
WO2020208502A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
WO2022043855A1 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Pfizer Inc. | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
IL302413A (en) | 2020-11-04 | 2023-06-01 | Pfizer | Immunogenic preparations for use in pneumococcal vaccines |
CA3218544A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections |
WO2022234416A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2619122B1 (fr) | 1987-08-03 | 1990-03-09 | Pasteur Institut | Procede d'obtention de polyosides capsulaires de staphylocoques, polyosides obtenus, applications de ces polyosides et souches pour la mise en oeuvre du procede |
US7279162B1 (en) * | 1990-10-22 | 2007-10-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Isolated broadly reactive opsonic immunoglobulin for treating a pathogenic coagulase-negative staphylococcus infection |
FR2682388B1 (fr) * | 1991-10-10 | 1995-06-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal. |
ATE237351T1 (de) * | 1991-11-22 | 2003-05-15 | Univax Biolog Inc | Mit staphylococcus epidermidis assoziierte oberflächenantigene des typs i |
US5770208A (en) * | 1996-09-11 | 1998-06-23 | Nabi | Staphylococcus aureus B-linked hexosamine antigen |
US6294177B1 (en) * | 1996-09-11 | 2001-09-25 | Nabi | Staphylococcus aureus antigen-containing whole cell vaccine |
AU5804198A (en) | 1996-12-20 | 1998-07-17 | Research Foundation Of The City University Of New York | A novel pathogenic coccoid organism, (staphylococcus leei), with trophism for gastric mucin |
US5965374A (en) * | 1997-10-16 | 1999-10-12 | Biowhittaker Technologies, Inc. | Glucan-specific assay |
EP1121135B1 (en) * | 1998-09-14 | 2009-01-28 | Nabi Biopharmaceuticals | Compositions of beta-glucans and specific immunoglobulins |
US7030101B2 (en) * | 1998-09-14 | 2006-04-18 | Nabi Biopharmaceuticals | Compositions of β-glucans and specific antibodies |
US6936258B1 (en) * | 1999-03-19 | 2005-08-30 | Nabi Biopharmaceuticals | Staphylococcus antigen and vaccine |
US20030113350A1 (en) * | 2001-09-19 | 2003-06-19 | Fattom Ali I. | Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations |
-
1999
- 1999-03-19 US US09/272,359 patent/US6936258B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-17 ES ES00916405T patent/ES2261192T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-17 PT PT00916405T patent/PT1162997E/pt unknown
- 2000-03-17 DK DK00916405T patent/DK1162997T3/da active
- 2000-03-17 MX MXPA01009476A patent/MXPA01009476A/es active IP Right Grant
- 2000-03-17 NZ NZ514455A patent/NZ514455A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-17 AT AT00916405T patent/ATE320265T1/de active
- 2000-03-17 BR BRPI0009157-0B1A patent/BR0009157B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-17 EP EP00916405A patent/EP1162997B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-17 JP JP2000606261A patent/JP4656728B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-17 AU AU37513/00A patent/AU773226B2/en not_active Ceased
- 2000-03-17 WO PCT/US2000/006922 patent/WO2000056357A2/en active IP Right Grant
- 2000-03-17 CA CA2366433A patent/CA2366433C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-17 DE DE60026691T patent/DE60026691T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-12-20 US US11/014,997 patent/US7531633B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-05-12 CY CY20061100620T patent/CY1105500T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2366433C (en) | 2012-01-03 |
US7531633B2 (en) | 2009-05-12 |
EP1162997A2 (en) | 2001-12-19 |
DE60026691D1 (de) | 2006-05-11 |
JP4656728B2 (ja) | 2011-03-23 |
US6936258B1 (en) | 2005-08-30 |
MXPA01009476A (es) | 2003-08-19 |
CY1105500T1 (el) | 2010-04-28 |
JP2002539272A (ja) | 2002-11-19 |
NZ514455A (en) | 2003-11-28 |
AU3751300A (en) | 2000-10-09 |
AU773226B2 (en) | 2004-05-20 |
EP1162997B1 (en) | 2006-03-15 |
BR0009157B1 (pt) | 2013-12-24 |
CA2366433A1 (en) | 2000-09-28 |
ATE320265T1 (de) | 2006-04-15 |
WO2000056357A2 (en) | 2000-09-28 |
BR0009157A (pt) | 2002-04-16 |
DK1162997T3 (da) | 2006-07-17 |
WO2000056357A3 (en) | 2001-02-01 |
PT1162997E (pt) | 2006-07-31 |
US20050118190A1 (en) | 2005-06-02 |
DE60026691T2 (de) | 2006-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2261192T3 (es) | Antigeno de estafilococo y vacuna. | |
ES2317655T3 (es) | Antigeno de staphylococcus aureus. | |
ES2270835T3 (es) | Vacuna de celulas enteras con antigeno de staphylococcus aureus. | |
ES2308818T3 (es) | Vacunas y antigenos de enterococcus. | |
ES2198405T3 (es) | Antigenos de superficie de tipo i asociados a staphylococcus epidermis. | |
AU2006309274B2 (en) | Method of protecting against staphylococcal infection | |
MXPA00003674A (es) | Antigenos y vacunas de enterococcus |