ES2270835T3 - Vacuna de celulas enteras con antigeno de staphylococcus aureus. - Google Patents

Abstract

Uso de una preparación de células enteras que comprende (I) células, lisados de células, o derivados de células de Staphylococcus aureus que llevan un antígeno que (i) comprende hexosamina a-ligada (ii) no contiene ningún grupo O-acetilo detectable por espectroscopía de resonancia magnética nuclear, y (iii) se une específicamente con anticuerpos de Staphylococcus aureus de tipo 336 depositados bajo ATCC 55804; (II) células, lisados de células, o derivados de células de Staphylococcus aureus que llevan el antígeno de tipo 5; y (III) células, lisados de células, o derivados de células de Staphylococcus aureus que llevan el antígeno de tipo 8; para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un animal no humano que tiene, o que está en riesgo de desarrollar mastitis.

Description

Vacuna de células enteras con antígeno para Staphylococcus aureus.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud es una continuación de solicitud, bajo el título 35, sección 120 del código de los Estados Unidos, de la solicitud con número de serie 09/102.214, presentada el 22 de junio de 1998, que es una continuación en parte de y reivindica prioridad sobre la solicitud con número de serie 08/712.438, que es ahora la patente estadounidense número 5.770.208.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un antígeno novedoso para Staphylococcus aureus, y a un procedimiento para obtener y usar el antígeno.

S. aureus ocasiona varias enfermedades en animales y en seres humanos mediante varios mecanismos patógenos. De estas enfermedades las más frecuentes y graves son la bacteriemia y sus complicaciones en pacientes hospitalizados. Específicamente, S. aureus puede ocasionar infecciones de heridas e infecciones asociadas con catéteres y dispositivos protésicos. Las infecciones graves asociadas con la bacteriemia de S. aureus incluyen osteomielitis, endocarditis invasiva y septicemia. El problema se agrava por resistencia múltiple a los antibióticos en cepas de hospitales, lo que limita seriamente las opciones de terapia. Además, S. aureus es una de las causas principales de mastitis en ganado vacuno y de productos lácteos, en los que la infección ocasiona una pérdida de ingresos
importante.

El documento WO 98/10788 describe el antígeno de S. aureus aislado, en lugar de células enteras, que se une específicamente con los anticuerpos de Staphylococcus aureus tipo 336 registrados en la ATCC bajo el número
55804.

En Am. J. Vet Research (Vol. 59, núm. 12, 12-1998, págs. 1537-1539) hay un estudio de qué serotipos de S. aureus están relacionados con la infección por S. aureus en las vacas. La conclusión del estudio es que los serotipos 5, 8 y 336 son responsables de una gran parte de los casos de mastitis investigados.

Una vacuna contra S. aureus podría proporcionar una solución al problema de la resistencia al antibiótico. Se han identificado al menos ocho serotipos diferentes de S. aureus usando anticuerpos monoclonales y policlonales contra polisacárido capsular (CPS). Karakawa y cols. J. Clin. Microbiol. 22:445 (1985).

Estudios han mostrado que aproximadamente un 85-90% de aislados clínicos humanos, y un porcentaje comparable, aunque ligeramente menor, de aislados clínicos animales son polisacáridos capsulares de tipo 5 o de tipo 8. Un individuo vacunado con una vacuna que contiene antígenos CPS de tipo 5 y de tipo 8 estaría protegido contra infecciones por un 85-90% de cepas de S. aureus clínicamente significativas, pero todavía existiría un riesgo significativo de infección. Una vacuna que contiene antígenos de otros seis serotipos podría teóricamente proporcionar un 100% de protección, pero requeriría la producción y purificación de seis componentes adicionales. Esto sería insostenible desde un punto de vista práctico. Por otro lado, un antígeno común a los aislados que no fuesen de tipo 5 ni de tipo 8 permitiría la producción de una vacuna que contuviese únicamente tres antígenos.

Sumario de la invención

Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna de células enteras con células que llevan un antígeno que es común a un gran número de cepas de S. aureus clínicamente significativas, especialmente uno que es común a las cepas asociadas con las infecciones en animales, especialmente ganado.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar una vacuna de células enteras para la prevención o el tratamiento de infecciones en animales, especialmente la mastitis en ganado.

Es otro objeto de la invención proporcionar una composición de globulina hiperinmune que contiene anticuerpos dirigidos contra las bacterias que llevan un anticuerpo que es común a un gran número de cepas de S. aureus clínicamente significativas, especialmente una que es común a cepas asociadas con infecciones en animales, especialmente ganado.

Es aún otro objeto de la invención proporcionar una composición de globulina hiperinmune que es efectiva en el tratamiento de infecciones en animales, especialmente de la mastitis.

De acuerdo con estos y otros objetos según la invención, se proporciona una vacuna de células enteras que comprende células de una cepa de Staphylococcus aureus que lleva un antígeno que comprende hexosamina \beta-ligada, que no contiene ningún grupo O-acetilo detectable mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear y que reacciona con anticuerpos contra el ATCC 55804. También se proporciona una composición que comprende la vacuna de células enteras, y un vehículo estéril y farmacéuticamente aceptable para la misma. La vacuna puede administrarse a un sujeto humano o animal para proporcionar protección contra infecciones por S. aureus. Es especialmente útil para prevenir la mastitis en animales.

Puede prepararse un agente inmunoterapeutico contra infección por S. aureus, especialmente contra la mastitis en animales, inmunizando a sujetos humanos o animales con una composición según la invención, recogiendo plasma de los sujetos inmunizados, y recogiendo del plasma recogido una globulina hiperinmune humana o veterinaria que contiene anticuerpos dirigidos contra S. aureus. La globulina hiperinmune contiene anticuerpos dirigidos contra el antígeno hexosamina \beta-unida. Un procedimiento inmunoterapeutico comprende una etapa de administrar esta globulina hiperinmune a un sujeto humano o animal, especialmente un animal con mastitis, para prevenir o tratar la
infección.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada a continuación. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a, 1b y 1c muestran los espectros de RMN para cada uno de los antígenos de S. aureus 336, tipo 8 y tipo 5, respectivamente.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la capacidad del IgG de conjugado de 336 para mediar la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336.

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra la capacidad del IgG de células enteras de 336 para mediar la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336.

La figura 4 es un gráfico de barras que muestra el efecto de la absorción con el antígeno T5 CPS o el antígeno 336 sobre la capacidad del IgG de células enteras de 336 para mediar la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336.

Descripción de las realizaciones preferidas

Se ha descubierto que prácticamente todas las cepas de S. aureus que no se pueden clasificar como de tipo 5 o de tipo 8 tienen en común un antígeno, denominado aquí "antígeno 336". Cuando se combina con antígenos de tipo 5 y de tipo 8, el antígeno 336 representa la base para una vacuna que proporciona una protección casi completa contra la infección por aislados de S. aureus clínicamente significativos. En este aspecto, un aislado "clínicamente significativo" es un aislado que es patogénico, tanto en humanos como en animales.

Más particularmente, el clasificación en tipos de los aislados obtenidos de varias fuentes ha mostrado que aproximadamente un 60% de aislados humanos son de tipo 8, aproximadamente un 30% son de tipo 5 y que casi todo el 10% de aislados restantes son de tipo 336, tal como se muestra en la tabla 1. Menos de un 1% de los aislados no se pueden clasificar como uno de estos tres tipos.

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TABLA 1 Tipado de aislados clínicos humanos

Fuente	Total	Tipo 5	Tipo 8	Tipo 336*	No tipable
Canadiense	350	109 (31,5%)	206 (58,8%)	34 (9,7%)	1 (0,3%)
Fibrosis quística	147	29 (19,7%)	92 (62,6%)	19 (12,2%)	-
* \begin{minipage}[t]{158mm} Una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336 se ha depositado bajo el Tratado de Budapest en la Colección de Cultivos Tipo Americana y se le ha otorgado el Número de Registro 55804.\end{minipage}

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De manera notable, los presentes inventores obtuvieron 27 aislados clínicos humanos que no eran tipables como cepas de S. aureus de tipo 5 ni de tipo 8, y que se caracterizaban por ser cepas resistentes a la meticilina. Todas las 27 cepas reaccionaron muy fuertemente con suero de anticuerpos del conjugado de antígeno 336, y así eran tipables como cepas que contienen el antígeno 336.

El tipado de los aislados de mastitis bovina obtenidos a partir de varias fuentes ha mostrado que aproximadamente un 23% de los aislados humanos son de tipo 8, aproximadamente un 22% son de tipo 5 y que un 54% de aislados son de tipo 336, tal como se muestra en la tabla 2. Por tanto, un 97,5% de los aislados que anteriormente no eran tipables son tipables como tipo 336. Menos de un 2% de los aislados no son tipables como uno de estos tres tipos. Por tanto, una vacuna de células enteras trivalente de tipo 5, tipo 8 y 336 está especialmente indicada para el tratamiento y la prevención de infecciones veterinarias por S. aureus.

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TABLA 2 Tipado de aislados de mastitis bovina

Fuente	Total	Tipo 5	Tipo 8	Tipo 336*	No tipable
Europa	102	35 (34,3%)	33 (32,4%)	29 (28,4%)	5 (4,9%)
Estados Unidos	336	59 (17,6%)	68 (20,2%)	207 (61,6%)	2 (0,6%)
Total	438	94 (21,5%)	101 (23%)	236 (53,9%)	7 (1,6%)

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Los anticuerpos del antígeno 336 no reaccionan junto con los polisacáridos aislados a partir de cualquiera de entre S. aureus tipo 5, tipo 8, tipo 4, K73 (una cepa variante de la tipo 5) o S. epidermis. El antígeno 336 es, por tanto, específico para el tipo, es decir, produce una única banda sólo con el antisuero de tipo homólogo.

El antígeno 336 puede obtenerse en una cantidad recuperable, a partir de determinados aislados de S. aureus cultivados según los protocolos descritos en el presente documento, en forma sustancialmente pura. Particularmente, el antígeno purificado contiene menos de un 1% de proteína y menos de un 1% de ácidos nucleicos. Una cantidad "recuperable" en este aspecto significa que la cantidad aislada del antígeno se puede detectar mediante una metodología menos sensible que el marcado con isótopos radioactivos, tal como el inmunoanálisis, y puede estar sujeta a manipulaciones adicionales que implican la transferencia del antígeno en sí a una solución.

Para obtener el antígeno 336, primero se cultiva un aislado 336 según la invención sobre una placa de agar con caldo Columbia complementada con MgCl_{2}/CaCl_{2} y luego se transfiere a un matraz de partida de NaCl/Columbia al 2%. Se inocula con el matraz de partida un fermentador de 50 litros que contiene el mismo medio. Se fermentan las células durante 16-24 horas. Tras la fermentación, se matan las células con una concentración final de fenol a etanol (1:1) al 2% y entonces se centrifuga para separar las células del sobrenadante. Se extrae el antígeno de la pasta de células. Hay cierta cantidad de antígeno 336 en el sobrenadante, pero la cantidad es insignificante comparada con la cantidad encontrada en la pasta de células. Dado el bajo rendimiento y el riesgo de contaminación por hexosa del medio, no se prefiere la extracción desde el sobrenadante.

Tratamientos enzimáticos de la pasta de células con lisostafina, DNasa, RNasa y proteasa, seguido de una precipitación secuencial con etanol/CaCl_{2} frío al 25-75%, da como resultado una extracción de antígeno bruto. El material bruto se disuelve de nuevo en agua, se dializa y se liofiliza. El material liofilizado se disuelve en tampón y se carga en una columna de separación equilibrada con el mismo tampón. La columna se lava con tampón de carga NaCl 0,15 M y entonces se eluye con un gradiente de NaCl 0,15-0,4 M. La mayor parte del antígeno según la invención se eluye a NaCl desde 0,32 hasta 0,35 M. Las fracciones que contienen el antígeno se combinan, se dializan, se concentran y se liofilizan. Puede repetirse la separación para obtener una mejor purificación. El antígeno bruto se trata con lisozima y se purifica por tamaño en una columna adecuada, y entonces se combinan, se concentran y se liofilizan las fracciones positivas de 336.

Un análisis del antígeno 336 purificado mediante cromatografía de gas líquido (CGL) muestra la presencia de glucosamina como un componente mayoritario de glicosil. Esto se confirma mediante análisis de azúcar en un sistema Dionex. Una espectroscopia de 1H-RMN del antígeno 336 indica la presencia de hexosamina \beta-ligada como un componente mayoritario de los hidratos de carbono. El antígeno comprende adicionalmente un componente que es responsable por una carga negativa mostrada por el antígeno 336.

Una comparación de los espectros RMN para cada uno de los antígenos de S. aureus 336, de tipo 5 y de tipo 8, tal como se muestra en las figuras 1a, 1b y 1c, confirma que el antígeno 336 se diferencia químicamente de ambos antígenos de S. aureus de tipo 5 y de tipo 8. Las estructuras de los antígenos de polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 han sido aclaradas por Moreau y cols. Carbohydr. Res. 201:285 (1990); y Fournier y cols, Infect. Imm. 45:87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición así como ManNAcA, que puede usarse para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras son como sigue:

1

Por el contrario, el principal componente de hidrato de carbono del antígeno 336 es la hexosamina \beta-ligada.

La inducción de bacteriemia en animales de laboratorio requiere números extremadamente elevados de organismos o alguna maniobra previa para reducir la resistencia de los anfitriones. Sin embargo, puede estudiarse la fagocitosos in vitro como una correlación de la inmunidad protectora in vivo. En este modelo, la capacidad de los anticuerpos monoclonales y policlonales específicos al antígeno 336 para opsonizar el S. aureus in vitro se mide por fagocitosis, según el procedimiento descrito en Kojima y cols. Infect. Dis. Immun. 58:2367-2374 (1990).

Los anticuerpos inducidos por una vacuna de antígeno 336 facilitan una fagocitosis específica de tipo. Los ensayos de fagocitosis in vitro indican por tanto que los anticuerpos del antígeno 336 son protectores contra la infección por cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336. Se ha demostrado previamente que las vacunas basadas en antígenos de tipo 5 y de tipo 8 son protectoras contra infección por cepas de S. aureus de tipo 5 y de tipo 8, respectivamente. Fattom y cols. Inf. and Imm. 58:2367-2374 (1990) y obra citada 64:1659-1665 (1996). Puede usarse una vacuna basada en una combinación de antígenos de tipo 5, de tipo 8 y 336 para proteger contra la infección por la mayoría de las cepas clínicas de S. aureus.

Preferiblemente, una composición del antígeno 336 o de células enteras que contienen el antígeno 336 según la presente invención "consiste esencialmente en" el antígeno 336, o en células que contienen el antígeno 336. En este contexto, la frase "consiste esencialmente en" significa que la composición no contiene ningún material que interfiera con la provocación de una respuesta inmune al antígeno 336 (y de otros antígenos, si los hubiera presentes) cuando se administra la composición a un sujeto como una vacuna, o con la característica de acoplamiento antígeno-anticuerpo de un ensayo de diagnóstico cuando se usa el antígeno en diagnósticos. En una realización, la composición contiene antígenos de S. aureus de tipo 336, de tipo 5 y de tipo 8.

Los antígenos según la invención son útiles en la producción de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de antígenos 336 de S. aureus y/o anticuerpos anti-S. aureus en una muestra. El antígeno 336 de S. aureus, o un anticuerpo específico al antígeno de S. aureus, sólo o en combinación con antígeno o anticuerpo para uno o ambos de los antígenos de S. aureus de tipo 5 o de tipo 8, se mezcla con una muestra que se sospecha que contiene antígeno o anticuerpo de S. aureus y se monitoriza para uniones antígeno-anticuerpo. El antígeno o anticuerpo se marca con un marcador radioactivo o enzimático. En una realización preferida, se inmoviliza antígeno o anticuerpo sobre una matriz sólida de modo que el antígeno o el anticuerpo sea accesible a anticuerpos o antígenos que entren en contacto con una superficie de la matriz. Entonces se hace que la muestra entre en contacto con la superficie de la matriz, y se monitoriza la superficie para uniones antígeno-anticuerpo.

Por ejemplo, puede usarse el antígeno o el anticuerpo en un ensayo de inmunoabsorbencia enzimática (ELISA), en el que el antígeno o el anticuerpo se une a una fase sólida y se usa un conjugado enzima-anticuerpo o enzima-antígeno para detectar y/o cuantificar el anticuerpo o el antígeno presente en una muestra. Alternativamente puede usarse un ensayo de inmunotransferencia en el que el(los) antígeno(s) solubilizado(s) y separado(s) se unen a papel de nitrocelulosa. Entonces se detecta el anticuerpo mediante una enzima o una antiinmunoglobulina (Ig) conjugada con un marcador, tal como un conjugado de Ig de peroxidasa del rábano, incubando el papel de filtro en presencia de un sustrato precipitable o detectable. Los ensayos de inmunotransferencia tienen la ventaja de no requerir una pureza mayor de un 50% para el(los) antígeno(s) deseado(s). Las descripciones de las técnicas de ELISA y de inmunotransferencia se encuentran en los capítulos 10 y 11 de Ausubel y cols. (editores) Current Protocols In Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular), John Wiley and Sons (1988), el contenido completo del cual se incorpora al presente documento por referencia.

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Para su uso en una vacuna, o para estimular la síntesis de anticuerpos específicos al tipo 336 en sujetos inmunizados, es preferible conjugar el antígeno 336 purificado a un vehículo inmunológico, normalmente un polipéptido o una proteína, para mejorar la interacción entre células T y B para la inducción de una respuesta inmune contra el antígeno. Esto es especialmente importante para las vacunas que se pretenden para su uso en pacientes con resistencia reducida. Un vehículo inmunológico potencia la inmunogenicidad tanto para la inmunización activa como para preparar antisueros de titulación elevada en voluntarios para inmunización pasiva. Los vehículos inmunológicos adecuados según la presente invención incluyen toxoide tetánico, toxoide diftérico, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa o sus derivados, cepas mutantes no tóxicas de la exotoxina A producidas de manera recombinante, tal como se describe, por ejemplo, en Fattom y cols., Inf. and Imm. 61:1023-1032 (1993), así como otras proteínas usadas normalmente como vehículos inmunológicos.

Preferiblemente, se administra el antígeno o el conjugado de antígenos sin un adyuvante para evitar la toxicidad inducida por adyuvantes. Si se usa un adyuvante, se prefiere usar uno que fomente los anticuerpos protectores IgG de subtipo 2. Adyuvantes normales incluyen el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA). Se ha demostrado que el sulfato de dextrano es un estimulador potente del anticuerpo IgG_{2} contra antígenos de superficies de células de estafilococos, y es también adecuada como adyuvante.

La presente invención también se refiere al uso del antígeno 336 para producir anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales (de ratón o humanos) que se unen a o neutralizan las cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336. Los protocolos para producir estos anticuerpos se describen en Ausubel y cols., (editores), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY), Capítulo 11; en Methods of Hybridoma Formation (Procedimientos de formación de hibridomas) 257-271, Bartal & Hirshaut (editores), Humana Press, Clifton, NJ (1988); en Vitetta y cols., Immunol. Rev. (62:159-83) (1982); y en Raso, Immunol. Rev. (62:93-117) (1982).

El inóculo para la producción de anticuerpos policlonales se prepara normalmente dispersando el vehículo inmunológico en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como una solución salina, para formar una composición acuosa. Se administra a un mamífero una cantidad inmunoestimuladora de inóculo, con o sin adyuvante, y el mamífero inoculado se mantiene entonces durante un período de tiempo suficiente para que el antígeno induzca anticuerpos protectores contra el antígeno 336. En individuos que no estén ya preparados para responder al antígeno pueden usarse dosis de recuerdo.

Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de anticuerpos de una variedad de animales usados normalmente, por ejemplo, cabras, primates, burros, cerdos, conejos, caballos, gallinas, cobayas, ratas y ratones, e incluso anticuerpos humanos tras su adecuada selección, fraccionamiento y purificación. Puede también producirse antisuero animal inoculando a los animales mediante métodos convencionales con cepas 336 de S. aureus destruidas con formalina, sangrándolos y recuperando suero o plasma para un procesado adicional.

Los anticuerpos inducidos de este modo pueden cultivarse y aislarse tanto como se desee mediante técnicas bien conocidas, tal como mediante el fraccionamiento con alcohol y la cromatografía de columna, o mediante cromatografía de inmunoafinidad; es decir, uniendo antígeno a un empaquetamiento de columna cromatográfica similar a Sephadex^{TM}, pasando el antisuero a través de la columna, reteniendo así anticuerpos específicos y eliminando por separación otras inmunoglobulinas (IgGs) y contaminantes, y recuperando entonces anticuerpos purificados mediante elución con un agente caotrópico, seguido opcionalmente de una purificación adicional, por ejemplo, pasándolo por una columna de antígenos de grupo sanguíneo unidos u otras especies no patógenas. Puede preferirse este procedimiento cuando se aíslan los anticuerpos deseados del suero o plasma de humanos que han desarrollado un título de anticuerpos contra el patógeno en cuestión, asegurando así la retención de anticuerpos que son capaces de unirse al antígeno. Estos pueden usarse entonces en preparaciones para la inmunización pasiva contra cepas 336 de
S. aureus.

Una composición de antígeno monoclonal contiene, dentro de límites detectables, sólo una especie de sitio de combinación con un anticuerpo capaz de unirse de manera efectiva al antígeno 336. Pueden prepararse anticuerpos adecuados en forma monoclonal usando una tecnología del hibridoma convencional.

Para formar hibridomas a partir de los cuales se produce una composición de anticuerpos monoclonales de la presente invención, se fusiona un mieloma u otra línea celular autoperpetuante con linfocitos obtenidos de sangre periférica, nodos linfáticos o el bazo de un animal hiperinmunizado con el antígeno 336. Se prefiere que la línea celular del mieloma sea de la misma especie que los linfocitos. Los esplenocitos se fusionan normalmente con células de mieloma usando polietilenglicol 1500. Los híbridos fusionados se seleccionan por su sensibilidad a las HAT. Los hibridomas que secretan las moléculas de anticuerpos de esta invención pueden identificarse usando una ELISA.

Los materiales preferidos para su uso en la preparación de hibridomas murinos o humanos son un bazo de ratón Balb/C, sangre periférica humana, nodos linfáticos o esplenocitos. Los mielomas de ratón adecuados para su uso en la presente invención incluyen las líneas celulares sensibles a la hipoxantina aminopterina y timidina (HAT), siendo un mieloma preferido el P3X63-Ag8.653. El compañero de fusión preferido para la producción de anticuerpos monoclonales humanos es el SHM-D33, un heteromieloma disponible de ATCC, Rockville, Md. bajo la referencia CRL 1668.

Puede producirse una composición de anticuerpos monoclonales de la presente invención iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpos de la especificidad adecuada. Se mantiene el cultivo bajo condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpos en el medio. Entonces se recoge el medio que contiene los anticuerpos. Las moléculas de anticuerpos pueden entonces aislarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas.

Medios útiles para la preparación de estas composiciones se conocen bien en la técnica y están comercialmente disponibles, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones endogámicos y similares. Un medio sintético ejemplar es el medio mínimo esencial de Dulbecco complementado con un 20% de suero fetal bovino. Una cepa ejemplar de ratón endogámico es la cepa Balb/c.

También se contemplan otros métodos para preparar composiciones de anticuerpos monoclonales, tales como fusiones entre especies, ya que es principalmente la especificidad para los antígenos de los anticuerpos lo que afecta a su utilidad en la presente invención. Los linfocitos humanos obtenidos de individuos infectados pueden fusionarse con una línea celular de mieloma humano para producir hibridomas que pueden seleccionarse según su producción de anticuerpos que reconocen el antígeno 336. Sin embargo, es más preferible en este aspecto un proceso que no implica el uso de una muestra biológica de un sujeto humano infectado. Por ejemplo, dentro de la presente invención un sujeto inmunizado con una vacuna tal como se describe en el presente documento puede servir como fuente para anticuerpos usados adecuadamente en una composición de anticuerpos dentro de la presente invención.

En una realización particularmente preferida, se producen anticuerpos monoclonales para el antígeno 336 usando procedimientos similares a los descritos para anticuerpos específicos a S. aureus de tipo 5 y de tipo 8. Los anticuerpos monoclonales purificados se caracterizan mediante ensayos de aglutinación bacteriana usando una colección de aislados clínicos.

Las composiciones de anticuerpos monoclonales y policlonales producidas según la presente memoria pueden usarse mediante inmunización pasiva para inducir una respuesta inmune para la prevención o el tratamiento de infecciones por cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336. En este aspecto, la preparación de anticuerpos puede ser una composición policlonal. Tal composición policlonal incluye anticuerpos que se unen al antígeno 336, y adicionalmente puede incluir anticuerpos que se unen a los antígenos que caracterizan a cepas de S. aureus de tipo 5 y de tipo 8. El componente de anticuerpo policlonal puede ser un antisuero policlonal, preferiblemente purificado por afinidad, a partir de un animal que se ha expuesto al antígeno 336, y preferiblemente también con antígenos de tipo 5 y de tipo 8. De manera alternativa, puede usarse una mezcla "oligoclonal de ingeniería", que es una mezcla de anticuerpos monoclonales para el antígeno 336, y anticuerpos monoclonales para antítenos de tipo 5 y/o de tipo 8.

En ambos tipos de mezclas, puede ser ventajoso el unir los anticuerpos químicamente para formar una única molécula poliespecífica capaz de unirse al antígeno 336 y a uno o ambos antígenos tipo 5 y tipo 8. Una manera de efectuar dicha unión es haciendo fragmentos híbridos F(ab')_{2} bivalentes mezclando dos fragmentos F(ab')_{2} diferentes producidos, por ejemplo, mediante digestión de pepsina de dos anticuerpos diferentes, segmentación reductora para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguida de reformación oxidativa de las uniones disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')_{2} incluyendo fragmentos híbridos que contienen una parte Fab' específica para cada uno de los antígenos originales. Los procedimientos para preparar tales fragmentos de anticuerpos híbridos se describen en Feteanu, Labeled Antibodies in Biology and Medicine (Anticuerpos marcados en biología y en medicina) 321-23, McGraw-Hill International Book Co. (1978); Nisonoff y cols., Arch. Biochem. Biophys. 93:470 (1961); y Hammerling, y cols., J. Exp. Med. 128:1461 (1968); y en la patente estadounidense número 4.331.647.

Se conocen en la técnica otros procedimientos para hacer fragmentos bivalentes que son completamente heteroespecíficos, por ejemplo, el uso de enlazadores bifuncionales para unir fragmentos segmentados. Se conocen moléculas recombinantes que incorporan las cadenas ligeras y pesadas de un antígeno, por ejemplo, según el procedimiento de Boss y cols., patente estadounidense número 4.816.397. En la presente invención se incluyen procedimientos análogos para producir moléculas enlazadoras recombinantes o sintéticas que tienen características de anticuerpos. Pueden unirse más de dos anticuerpos monoespecíficos o fragmentos de anticuerpos usando varios enlazadores conocidos en la técnica.

Un componente de anticuerpo producido según la presente invención puede incluir anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpos, o subfragmentos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulina entera de cualquier clase, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especifidades para epítopos o antígenos duales o múltiples, o fragmentos, por ejemplo, F(ab')_{2}, Fab', Fab y similares, incluyendo fragmentos híbridos, e incluyendo adicionalmente cualquier inmunoglobulina o cualquier proteína natural, sintética o producida por ingeniería genética que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo. Especialmente, las moléculas Fab pueden expresarse y ensamblarse como un anfitrión transformado genéticamente como E. coli. Por tanto hay un sistema de vectores lambda disponible para expresar una población de Fab con una diversidad potencial igual a o mayor que la del sujeto que genera el anticuerpo predecesor. Véase Huse, W.D., y cols., Science 246:1275-81 (1989).

El antígeno 336 según la presente invención puede ser el principio activo en una composición, comprendiendo además un vehículo farmacéuticamente aceptable para el principio activo, que puede usarse como una vacuna para inducir una respuesta celular inmune y/o la producción in vivo de anticuerpos que combaten la infección por S. aureus. En este aspecto, un vehículo farmacéuticamente aceptable es un material que puede usarse como un vehículo para administrar un medicamento porque el material es inerte o de otro modo médicamente aceptable, así como compatible con el principio activo, en el contexto de la administración de vacunas. Además de un excipiente adecuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos de vacunas convencionales tales como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y agentes solubilizantes.

En una realización alternativa, las células que transportan el antígeno 336 se usan en una vacuna de células enteras. En este aspecto, una "vacuna de células enteras" incluye vacunas realizadas usando bacterias enteras destruidas, lisados bacterianos o derivados de bacterias enteras. Las células que llevan el antígeno 336 para su uso en la vacuna de células enteras pueden identificarse y seleccionarse usando anticuerpos para una cepa que se sabe que lleva el antígeno 336, y más preferiblemente usando anticuerpos monoclonales para un antígeno aislado tal como se describe en el presente documento. En este aspecto, puede usarse un sencillo experimento de aglutinación en portaobjetos en el que los anticuerpos para el antígeno 336 se mezclan con células.

La cepa depositada en la ATCC con el número 55804 es una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336, y puede usarse para producir anticuerpos útiles en la identificación de otras cepas que llevan el antígeno 336. Sin embargo, no es necesario usar la cepa depositada para producir la vacuna de células enteras o anticuerpos útiles en el tratamiento o en la prevención de infecciones por S. aureus o en la identificación de otras células que llevan el antígeno 336. La ATCC 55804 simplemente proporciona un medio inmunológico de identificar tales células.

Tal como se describió anteriormente para la vacuna de antígeno purificado, la vacuna de células enteras también comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna de células enteras también puede contener opcionalmente aditivos de vacuna convencionales tales como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y agentes solubilizantes. En una realización preferida, la vacuna de células enteras contiene células o derivados de células que llevan el antígeno 336, además de células o derivados de células que llevan antígenos de tipo 5 o de tipo 8.

Las vacunas según la invención pueden administrarse a un sujeto que no esté aún infectado por S. aureus, para así inducir una respuesta inmune protectora (humoral o celular) contra S. aureus, especialmente una respuesta protectora contra mastitis, en ese sujeto. De manera alternativa, las vacunas dentro de la presente invención pueden administrarse a un sujeto en el que la infección de S. aureus ya haya ocurrido pero esté en una etapa lo suficientemente temprana como para que la respuesta inmune producida contra la vacuna inhiba una mayor propagación de la infección de manera efectiva.

En una realización preferida, se administra la vacuna de células enteras a una hembra de un animal para prevenir o tratar la incidencia de mastitis. En este aspecto se administra a animales hembra que se consideran en riesgo de desarrollo de mastitis, es decir, a animales usados en un programa de cría, y más específicamente a aquellos animales con una historia previa de mastitis. La vacuna de células enteras es especialmente útil en la prevención de mastitis en un animal de granja, tal como una vaca o una cerda, aunque también está indicado para uso en animales de compañía, tales como perros y gatos.

Con otro enfoque, una vacuna de la presente invención puede administrarse a un sujeto quien entonces actúa como fuente para inmunoglobulina, producida en respuesta a la inducción de la vacuna específica ("globulina hiperinmune"), que contiene anticuerpos dirigidos contra S. aureus. Un sujeto tratado de este modo donaría plasma a partir del cual se obtendría entonces globulina hiperinmune, mediante la metodología convencional de fraccionamiento de plasma, y se administraría a otro sujeto para conferir resistencia contra o para tratar la infección por S. aureus. Las globulinas hiperinmunes según la invención son especialmente útiles para individuos inmunocomprometidos, para individuos sometidos a procedimientos invasivos o en los que el tiempo no permite al individuo producir sus propios anticuerpos como respuesta a la vacunación. Las inmunoglobulinas hiperinmunes producidas para la vacuna de células enteras son especialmente útiles en el tratamiento de infecciones por S. aureus.

De modo similar, los anticuerpos anti S. aureus monoclonales o policlonales producidos según la presente invención pueden conjugarse con una inmunotoxina, y administrarse a un sujeto en el que la infección por S. aureus ya haya ocurrido pero no se haya extendido mucho. Para ello, se administraría material de anticuerpos producido según la presente memoria en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se define en el presente documento.

La presente invención se describe adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Fermentación de S. aureus

Una cepa de S. aureus que lleva el antígeno 336 se cultivó en caldo Columbia complementado con NaCl al 2% en un fermentador de 80 litros que contiene 60 litros de medio de cultivo a 37º. Esta fermentación se comenzó con un litro de un cultivo inoculado 16 horas antes. Las células se cultivaron con agitación a 200 rpm durante 24 horas, a una A_{650\ nm} de 20,0.

Las células que se iban a usar como vacuna para preparar el antisuero de células enteras se fijaron con formalina toda la noche a temperatura ambiente. Las células para la purificación del antígeno se mataron añadiendo fenol-etanol (1:1, vol/vol) al fermentador hasta una concentración final de un 2%, y mezclando lentamente durante 2 horas a 15-20ºC. No se detectó ninguna célula viable después de este tratamiento. Entonces se cosecharon las células mediante centrifugado a 14.500 x g y se almacenaron a -70ºC hasta su uso. Se obtuvieron aproximadamente 800-900 gramos (peso neto) de pasta celular de una fermentación de 60 litros.

Para la preparación de células que se iban a usar en la preparación de una vacuna de células enteras, se cultivaron por separado cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336, el antígeno tipo 5 y el antígeno tipo 8 en caldo Columbia complementado con MgCl_{2}/CaCl_{2} a 37º durante 18-20 horas, con agitación (200 rpm). Se probaron las células por aglutinación en portaobjetos para reactividad negativa con antisuero de la cepa Wood de S. aureus, y entonces se incubaron con formalina al 3% durante 24 horas. Las células se lavaron 3 veces con PBS, se tiparon con anticuerpos específicos para S. aureus (T5, T8 o 336) y antisuero de la cepa Wood y se ajustaron a la DO adecuada a 540 nm.

Ejemplo 2 Preparación de vacunas de células enteras y antisuero

Se ajustaron células fijadas con formalina del ejemplo 1 a DO_{540\ nm} = 1 y se combinaron con solución salina fisiológica para producir una vacuna. No se usó ningún adyuvante. La vacuna se inyectó en conejos por vía intravenosa. Los conejos se sangraron en intervalos semanales y se recogió y se combinó suero positivo de células enteras. Se purificó IgG del suero de células enteras mediante una columna de afinidad a la proteína G. El material purificado contenía 23 mg/mL de IgG total (escaneo a 280 UV) y sustancialmente menos IgG específico para el antígeno 336.

Ejemplo 3 Purificación del antígeno 336

La pasta celular se suspendió a 0,5 g (peso húmedo) por mL en Tris 0,05 M-MgSo_{4} 2 mM, a pH 7,5. Se añadió lisostafina (100 a 150 \mug/mL) y se incubó a 37ºC durante 3 horas con agitación. Después, se añadió DNasa y RNasa a concentraciones finales de 50 \mug/mL cada uno, y se continuó la incubación durante 4 horas más. La mezcla de reacción se precipitó secuencialmente con etanol al 25 y al 75% en presencia de CaCl_{2} 10 mM.

El precipitado de etanol al 75% se granuló por centrifugado a 12.000 x g durante 30 minutos, o a menos rpm durante más tiempo. Se transfirió el sobrenadante a un entubado de diálisis. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 \mum y se precipitó secuencialmente con etanol al 25 y al 75% en presencia de CaCl_{2} 10 mM. El precipitado de etanol al 75% se dializó extensivamente contra agua a de 3 a 8ºC y se liofilizó. Se disolvió el polvo en NaCl 0,2 M/Tris HCl 0.05 M, a pH 7,0. Se cargó el material bruto resultante en una columna Q Sepharose en NaCl 0,2 M/Tris HCl 0,05 M, a pH 7,0, y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0,2-0,4 M. Las fracciones que contenían antígeno, tal como se detectaron mediante precipitación capilar con antisuero del ejemplo 2, se combinaron, dializaron y liofilizaron. La mayoría del antígeno se eluyó a NaCl 0,32-0,35 M/Tris HCl 0,05 M.

El antígeno bruto así obtenido se trató con 1 mg de lisozima por 10 mg de antígeno bruto en CaCl_{2} 10 mM, para digerir la contaminación residual por peptidoglicano. El antígeno bruto tratado con lisozima se purificó entonces adicionalmente en una columna de filtración Sephacryl S-300 en NaCl 0,2 M/PBS 1x para obtener un antígeno sustancialmente puro. Todos los materiales reactivos se examinaron usando antisuero entero.

Ejemplo 4 Caracterización del antígeno

El análisis del antígeno 336 purificado mediante cromatografía de gas líquido (GLC) muestra la presencia de glucosamina como un componente principal de glicosilo. Esto se confirma mediante análisis de azúcar en el sistema Dionex. La espectroscopia 1H-RMN del antígeno 336 muestra un protón anomérico a 4,751 ppm, que corresponde a la hexosamina \beta-ligada. Además, el espectro de RMN muestra señales bien separadas a 4,229 ppm (2H), 3,649 ppm (1H), 3,571 ppm (2H), 2,19 ppm (3H). No se encuentran señales que corresponden a los grupos O-acetilo. Esto indica la ausencia de O-acetilación, y se distingue claramente de la O-acetilación al 20-80% que se encuentra en otros aislados de tipo S. aureus, tales como el tipo 5 y el tipo 8. El espectro 13C-RMN muestra una señal en la región anomérica a 102,396 ppm. Esto confirma la presencia de monosacárido como un componente principal. Otras señales del espectro 13C-RMN aparecen a los 81,865, 76,641, 74,950, 71,841, 71,051, 70,775, 67,665, 67,142, 61,716, 56,552, 50,355, 43,408 y 23,246 ppm, respectivamente.

La movilidad del antígeno purificado en inmunoelectroforesis (IEF) indica la presencia de grupos cargados negativamente. El antígeno purificado no contiene azúcares neutrales tal como se detectan mediante el ensayo de fenol-sulfúrico. La K_{d} del antígeno purificado era de 0,3 en una columna Superose 12 HR, que es un material de tamaño molecular más pequeño en comparación con el tipo 5 (K_{d} de 0,017), tipo 8 (K_{d} de 0,061) y ácido teicoico (K_{d} de 0,18).

Ejemplo 5 Conjugados de antígeno-vehículo inmunológico

El antígeno purificado se derivatizó con dihidrazida de ácido adípico (ADH) usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) 100 mM a pH 5,6. Se consiguió la derivatización porcentual en el intervalo del 2 al 7% (p/p). El antígeno purificado derivatizado se conjugó con una cepa mutante no tóxica, producida de manera recombinante, de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa usando EDAC 50 mM a 1:1 (antígeno:proteína), tal como se describe en Fattom y cols., Inf. and Imm. 60:584-589 (1992). El rendimiento de la conjugación fue de un 50-70%, determinado mediante la medición de la proteína. El K_{d} del conjugado fue de 0,2 en la columna de Superose 12 HR.

El conjugado se inyectó en conejos con adyuvante (CFA seguido de IFA) a una razón de 1:1. Los sangrados positivos se combinaron y los IgGs se purificaron en una columna de proteína G. El IgG de los conjugados mostraba identidad con los anticuerpos inducidos por IgG de células enteras contra el antígeno en un ensayo de inmunodifusión. Se demostró que el IgG de suero de conjugado purificado contenía 12,2 mg/mL de IgG total mediante un escaneo UV a 280 nm y 0,7 mg/mL de IgG específico para el antígeno mediante ELISA. El suero de células enteras, el IgG de células enteras y el IgG conjugado se usaron en ensayos de opsonofagocitosis y en modelos animales.

Ejemplo 6 Ensayos de opsonofagocitosis in vitro con la vacuna de anticuerpos para antígeno/conjugado

Se obtuvieron leucocitos polimorfonucleares (PMNs) a partir de células HL-60 ajustadas a una concentración de 1,0 por 10^{7} células por mL en MEM complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%. Se cultivó S. aureus durante una noche en caldo Columbia complementado con MgCl_{2}/CaCl_{2}. Se ajustó la concentración de bacterias espectrofotométricamente hasta una DO de 0,02 a 540 nm (4 por 10^{6} células/mL), entonces se ajustó a 1 por 10^{6} células/mL en MEM complementado con FBS al 10%. Se añadieron IgGs específicos para el antígeno o IgGs no reactivos como control para facilitar la opsonización por PMNS. Se usó como control negativo complemento de crías de conejo, diluido 1:8 en MEM complementado con FBS al 10%.

La mezcla de reacción contenía 25 \muL de S. aureus (concentración 1 x 10^{6} células/mL), 25 \muL de PMNs (concentración 1 x 10^{7} células/mL), 5 \muL de complemento, 100 \muL de suero o anticuerpos, y MEM/FBS al 10% suficiente para llevar el volumen de reacción total a 250 \muL. A las 0 horas, 1 hora y 2 horas, se diluyeron en serie 25 \muL de muestra. 25 \muL de las diluciones a 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}, y 10^{-5} se sembraron en placa sobre placas de agar TSA, y se incubaron toda la noche a 37ºC.

Los resultados se muestran en la figura 2, y muestran que el anticuerpo para el conjugado media la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336. Los resultados se muestran como porcentaje de destrucción por cantidades de IgG específico para el antígeno 336 en un intervalo desde 300 \mug hasta 128 \mug. Como comparación, se muestra también el porcentaje de destrucción por una cantidad equivalente de IgG no reactivo. Se usó PNMs más complemento como control.

Ejemplo 7 Ensayos de opsonofagocitosis in vitro con la vacuna de anticuerpos para células enteras

Para evaluar la eficacia de la vacuna de células enteras para S. aureus 336, se probaron los IgGs para la célula entera de S. aureus 336 para su rol para mediar la destrucción por opsonofagocitosis de cepas de S. aureus 336 en un ensayo de opsonofagocitosis de sangre completa. Se cultivaron células de S. aureus 336 y se ajustaron a 2 x 10^{6} ufc/mL, tal como se describe en el ejemplo 1. Se añadieron una suspensión bacteriana (100 \muL), una solución salina (100 \muL) y una solución de anticuerpos (100 \muL) a 700 \muL de sangre humana citrada. Después de mezclar, se tomó una alícuota de 25 \muL y se sembró en placa para obtener recuentos bacterianos a tiempo cero. Entonces la mezcla se incubó con agitación a 37ºC durante una hora y se sembró en placa. Los resultados están trazados en la figura 3, y se muestra una reducción en log 2 de unidades formadoras de colonias en presencia de IgGs inmunes en sangre completa citrada, en comparación con IgGs no inmunes. La actividad de los IgGs inmunes era igual incluso a una dilución de 1:4, indicando que la complementación de sangre completa de conejo con anticuerpos generados contra el aislado de S. aureus 336 produjo un fuerte efecto de opsonofagocitosis contra las cepas de S. aureus 336.

Ejemplo 8 Destrucción por opsonofagocitosis in vitro mediada por un antisuero hiperinmune de células enteras

La importancia de anticuerpos específicos contra S. aureus 336 en antisuero de conejo hiperinmune derivado de células enteras de S. aureus 336 para mediar la destrucción por opsonofagocitosis de bacterias de S. aureus 336 se probó mediante la absorción de anticuerpos específicos para 336 de S. aureus de antisuero de conejo hiperinmune de células enteras de S. aureus 336 con antígeno 336 y antígeno T5 CPS. Se usó suero de conejo no inmune como
control.

Se inocularon perlas congeladas de una cepa de S. aureus 336 (91-14) a 5 mL de caldo Columbia Mg/CaCl_{2} y se incubó durante 16 horas a 37ºC con agitación a 200 rpm. Para el ensayo, las células se ajustaron entonces con solución salina hasta una concentración aproximada de 2x10^{6} ufc/mL (DO_{540}=0,02). Los PMNs (células HL-60) se usaron a una concentración de 1x10^{7} células/mL en medio de opsonización MEM 1x (Medio Mínimo Esencial, con sal de Earle, sin glutamato, GIBCO-BRL), complementado con gelatina al 0,1% (Sigma Chemicals). Se usó suero de conejo diluido a 1:100 con un medio de opsonización como fuente de complementos.

La absorción de antisueros de S. aureus 336 de células completas (inactivados por calor durante 30 minutos a 56ºC) con antígeno de S. aureus 336 y antígeno T5 CPS se realizó de la manera siguiente. Se disolvieron los antígenos en dH_{2}O a concentraciones en un intervalo desde 250 \mug/mL hasta 15,6 \mug/mL. Se mezclaron soluciones de antígenos (250 \muL) con diferentes concentraciones de los antígenos con 250 \muL de antisueros de células enteras de S. aureus 336 diluidos a 1:250. La mezcla de reacción se incubó primero durante 2 horas a 37ºC y entonces durante la noche a 4ºC. Las muestras se centrifugaron entonces a 14.000 rpm en una centrifugadora Eppendorf 5415 a temperatura ambiente. Se usaron entonces los sobrenadantes en el ensayo de opsonización.

Para iniciar el ensayo, 50 \muL de bacterias, 50 \muL de complemento diluido, 50 \muL de células HL-60 ajustadas y 50 \muL de antisueros se añadieron por pocillo en placas de microtitulación de fondo redondo de poliestireno (Corning Glass Works). Después del mezclado, se tomó una alícuota de 25 \muL para la determinación del recuento de bacterias a tiempo 0. La placa se centrifugó durante 5 minutos a 1200 rpm a 37ºC y se incubó durante una hora en CO_{2} al 5%, en una incubadora. Se tomó una alícuota de 25 \muL para la determinación de las ufc/mL de bacterias a la hora (T_{1}).

Se diluyeron suspensiones bacterianas a 1:10, 1:100, 1:500, 1:1000 y 1:2000 en agua destilada, y 20 \muL de las últimas 4 diluciones se sembraron en placa sobre placas de agar TSA. Se usaron colonias que emergieron sobre estas placas xa cuantificar el porcentaje de supervivencia siguiendo la fórmula:

%\ destrucción = \frac{ufc/mL\ a\ T_{1}}{ufc/mL\ a\ T_{0}}\ x\ 100%

Los resultados se resumen en la figura 4 y muestran que los sueros hiperinmunes a S. aureus 336 redujeron el crecimiento bacteriano en más de un 90%, mientras que los antisueros de conejos no inmunes no mediaron la destrucción por opsonofagocitosis tal como se compara con un control que no contiene antisueros (complemento, PMNs y bacterias, denominado C+P+B). La preincubación de los sueros con cantidades diferentes de antígeno de S. aureus 336 y antígeno de T5 CPS mostraron que la destrucción por opsonofagocitosis de sueros de S. aureus 336 de células enteras está mediada principalmente por anticuerpos específicos para 336PS. La absorción con antígeno T5 CPS no cambió la destrucción por opsonofagocitosis de los antisueros de 336 de células enteras. Por el contrario, hubo una reducción en la destrucción por opsonofagocitosis después de la absorción con antígeno 336, con el grado de reducción en correlación con la cantidad de antígeno 336 usada en la absorción. La inhibición se eliminó por titulación a bajas cantidades de antígeno 336 añadido. La inmunización por S. aureus 336 de células enteras no indujo la formación de anticuerpos específicos para T5 CPS ni de anticuerpos de reacción cruzada tal como muestra el hecho de que el T5 CPS no pudo absorber la destrucción por opsonofagocitosis, aún cuando se usaron 62,5 \mug de T5 CPS para la absorción.

Claims (8)

1. Uso de una preparación de células enteras que comprende

(I) células, lisados de células, o derivados de células de Staphylococcus aureus que llevan un antígeno que

(i)

comprende hexosamina \beta-ligada

(ii)

no contiene ningún grupo O-acetilo detectable por espectroscopía de resonancia magnética nuclear, y

(iii)

se une específicamente con anticuerpos de Staphylococcus aureus de tipo 336 depositados bajo ATCC 55804;

(II) células, lisados de células, o derivados de células de Staphylococcus aureus que llevan el antígeno de tipo 5; y

(III) células, lisados de células, o derivados de células de Staphylococcus aureus que llevan el antígeno de tipo 8;

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un animal no humano que tiene, o que está en riesgo de desarrollar mastitis.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho animal es una hembra animal.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho animal es una vaca o una cerda.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho animal es una vaca.

5. Uso según la reivindicación 2, en el que dicha hembra es un gato hembra o un perro hembra.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho animal tiene mastitis.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho animal está en riesgo de desarrollar mastitis.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho preparado contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable.