CN101951948B - 与针对葡萄球菌性肺部疾病和病症进行免疫相关的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的实施方案包括可用于疫苗接种策略的方法和组合物，所述疫苗接种策略能够中和Hla以提供针对金黄色葡萄球菌性肺炎的免疫保护。在某些方面中，本发明包括以重组突变体形式Hla(HlaH35L，其中35位组氨酸变为亮氨酸)为代表的毒性降低的Hla，其可用于阻止该毒素的生产性组装并为受试者提供针对葡萄球菌性肺炎的保护。

Description

与针对葡萄球菌性肺部疾病和病症进行免疫相关的方法和组合物

本申请要求2007年8月31日提交的序列号为60/969,514的美国临时申请的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。

本发明在政府资助(由美国国立卫生研究院给予的AI38897和AI52474，以及由美国国立儿童健康及人类发展研究院给予的HD00850)下完成。政府享有本发明的某些权益。

发明背景

I.技术领域

本发明总体而言涉及免疫学、微生物学、传染病学和医学领域。在一个更具体的实施方案中，它涉及含有外毒素蛋白(如α-溶血素)的用于产生针对细菌之免疫应答的方法和组合物。

II.背景技术

治疗金黄色葡萄球菌(S.aureus)性肺炎的现有方法依赖于抗微生物药物，生物有获得针对所述药物之抗性的明显倾向。葡萄球菌感染的发病机制依赖于多种不同的毒力因子如分泌的外毒素。以前的研究表明，缺失编码这些因子的单基因未导致缺陷，或者仅导致轻度的毒力降低。但是，本发明人在鼠模型系统中进行的金黄色葡萄球菌性肺炎研究意外地将α-溶血素(也称作α毒素)确定为该疾病发病机制中的关键毒力因子，因为缺乏这种外毒素的突变菌株是无毒的。α-溶血素是由金黄色葡萄球菌所分泌的细菌细胞毒素家族的成员，它能够插入到大量真核细胞的细胞膜中。该蛋白质以单体形式分泌，但它在真核细胞表面上组装成七聚体环状结构。组装后的毒素插入宿主细胞膜，形成由于破坏膜的完整性而导致细胞损伤或死亡的孔洞。一些生物化学研究已经确定了α-溶血素单体中促进与宿主细胞结合、七聚体形成和宿主细胞裂解的氨基酸残基。

葡萄球菌侵染策略的多样性阻碍了葡萄球菌疫苗的开发。公认的是，活的减毒微生物是高效的疫苗，向受试者的免疫系统呈递多种抗原。与非复制型或多组分免疫原产生的免疫应答相比，由这些疫苗引发的免疫应答常常程度更高且持续时间更长。对该现象的一种解释可能是，活的减毒菌株造成宿主中的局限性感染，模拟天然感染的早期阶段，并且向免疫系统呈递多种抗原。

大量参考文献描述了在疫苗中包合α-溶血素(Hla)组分，其中一些文献描述了化学减毒或热减毒的Hla类毒素。参见例如美国专利4,327,082。另一些参考文献描述了用多组分类毒素疫苗免疫人体以及分离Hla中和抗体用于被动免疫。参见美国专利4,027,010。Adlam等(1977)测试了纯化的Hla对避免乳房感染的有效性。Adlam等观察到乳腺炎的“蓝胸形式”(“bluebreastform”)减少，但是未观察到针对局部慢性溃疡形式葡萄球菌病的保护作用。Adlam等将这一观察结果归因于仅有Hla不足以提供针对多因素疾病状态(如葡萄球菌感染的局部慢性溃疡形式)的保护。

Bhakdi等(1994)描述了具有第35位残基突变之Hla的毒性降低，而且描述了向兔施用该突变体未导致兔死亡。Menzies和Kernode(1996)描述了相似的Hla突变体H35L及其用于在兔中产生抗体的用途，该抗体可进一步纯化用于被动免疫实验。Menzies和Kernode还描述了使用单一组分的疫苗产生保护作用的困难和预期的失败。他们说：“金黄色葡萄球菌作为病原体的巨大多样性及其产生的多种毒力因子，使得不太可能使单一免疫靶标如α毒素成为有效的候选疫苗。”本发明人注意到，这些参考文献都未指出任何组合物对预防或治疗葡萄球菌性肺炎的有效性。

本领域的现状使得本领域技术人员不会将单独的或基本上单独的重组Hla认为是预防葡萄球菌感染(特别是葡萄球菌呼吸系统感染或葡萄球菌呼吸系统感染的间接效应)的有效抗原。因此，在没有或者基本没有其他葡萄球菌抗原时，本领域的技术人员不会期望把Hla作为主要疫苗组分施用来引起足以预防或治疗受试者呼吸道感染或葡萄球菌相关肺炎的免疫应答。

本领域仍需要另外的组合物和方法来预防和/或治疗肺部的葡萄球菌感染，以及减弱或改善这种感染的继发效应。

发明概述

本发明基于这样的数据，其表明向人葡萄球菌性肺炎的动物模型施用来源于金黄色葡萄球菌的减毒α-溶血素(Hla)毒素可防止动物死亡，减少从动物肺中回收的细菌数量，而且将病理性损伤局限在感染的病灶部位。此外，本发明还基于这样的数据，其表明可对小鼠施用在兔中产生的针对α-溶血素(也称作α毒素)的抗体，以赋予其针对葡萄球菌性肺炎的保护效应。因此，本发明涉及在受试者中使用Hla毒素作为单一治疗进行针对葡萄球菌性肺炎之主动免疫的方法和组合物(其中特别排除了其他葡萄球菌蛋白质和抗体)，以及使用α-溶血素特异性抗体进行被动免疫的方法和组合物。

某些实施方案包括含有分离多肽的免疫原性组合物，所述多肽含有SEQIDNO：2的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸，包括其间的所有值和范围。在某些方面中，分离多肽包含SEQIDNO：2的至少、至多或约1-50位氨基酸。在另一方面中，分离多肽为融合蛋白。所述组合物可含有佐剂。在某些方面中，分离多肽为融合蛋白和/或脂肽。

在本发明的一些实施方案中，有对患者提供针对葡萄球菌性肺部疾病或病症(例如与葡萄球菌存在相关的疾病或病症，包括由葡萄球菌感染导致的疾病，或者葡萄球菌感染是之前疾病或病症的后遗症)之保护的方法，该方法包括对患者施用有效量的含有重组和减毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素的组合物，其中所述组合物包含不多于污染量的其他任何葡萄球菌蛋白质。污染量是指，除了含有Hla全部或片段的肽以外的蛋白质、多肽或肽的重量百分比低于10、5、1、0.1、0.05或更低。

本发明上下文中的短语“保护患者”是指预防、治疗、改善人类患者的葡萄球菌性肺部疾病或病症和/或降低其严重程度。除非另有说明，它还指防止或延迟由疾病或病症导致的死亡，减少从肺部回收的葡萄球菌数量，将病理性损伤局限在病灶部位，缩小疾病或病症导致的损伤程度，缩短疾病或病症的持续时间，和/或降低与疾病或病症相关的症状的数量、程度或持续时间。对人患者实施的本发明实施方案也可实施于任何哺乳动物受试者。在另一些方面中，可引导所述方法来引发对葡萄球菌的免疫应答。在另一方面中，患者患有或有风险发生与葡萄球菌相关的肺部疾病。

本发明的另一些实施方案涉及预防患者中葡萄球菌性肺部疾病或病症的方法，该方法包括对患者施用有效量的含有重组和减毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素的组合物，其中所述组合物不引发针对任何其他葡萄球菌蛋白质的可检测免疫应答。

本发明还涉及对患者提供针对葡萄球菌性肺部疾病或病症之保护的方法，该方法包括对患者施用有效量的基本由重组和减毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素组成的组合物。术语“基本由......组成”意思是所述组合物不含有可实质性影响本发明基本特性和新特性(即在组合物中使用重组减毒Hla毒素作为葡萄球菌抗原以在患者中引发针对葡萄球菌之免疫应答)的其他成分。

在本发明的另一些实施方案中，有对患者提供针对葡萄球菌性肺部疾病或病症之保护的方法，该方法包括对患者施用有效量的含有对金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)有免疫反应性之人源化抗体的组合物。

术语“人源化抗体”是指经遗传工程改造而使移植到人类抗体中的非人抗体量尽可能小的抗体。含有非人序列的抗体部分通常为抗体的可变部分，而非可变部分是人序列。通常地，人源化抗体具有90-95％的人序列和5-10％的非人序列。术语“有免疫反应性”意思是所述抗体特异性识别特定抗原并产生针对该抗原的免疫应答。

术语“葡萄球菌性肺部疾病或病症”是指葡萄球菌感染引发、促成、加重和/或帮助持续的肺部疾病或病症。在一些具体实施方案中，葡萄球菌性肺部疾病或病症为肺炎。

本发明的方法包括以有效实现预期目的(如本发明所指出的)的量来提供抗原、表位或抗体。更具体地，在一些实施方案中，有效量是指有效刺激或引发免疫应答、或提供对感染的抗性或改善感染的活性成分的量。在更具体的方面中，有效量预防、减轻或改善疾病或感染的症状，或延长被治疗受试者的存活期。有效量的测定完全在本领域技术人员的能力之内，特别是借助于本文提供的已详细公开的内容。对本发明方法中使用的任何制备物，有效量或剂量均可以首先从体外、细胞培养物、和/或动物模型测定中估算。例如，可以在动物模型中得出获得期望的免疫应答或循环抗体浓度或效价的剂量。这些信息可以用于更为准确地确定人体中的有用剂量。

在一些实施方案中，本发明方法中涉及的患者被认为有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症的风险。这些患者包括但不仅限于已住院或将住院的患者、已进入或将进入重症监护室的患者、将进行手术的患者、将被麻醉或处于全身麻醉中的患者、年龄超过65岁的患者，免疫系统受损的患者、儿童患者、佩戴或可能佩戴呼吸机或其他机械通气机的患者、即将或已经植入气管内导管的患者、已经或即将无法移动的患者，即将、正在或已经进行化学治疗或清髓治疗的患者，以及即将、正在或已经服用一种或多种免疫抑制剂特别是持续很长时间(长于一个月)的患者。此外，本发明涉及的是，所述患者还可表现为健康个体，或者可从本发明方法和组合物中获益的病人可以无已知或明显的肺炎风险因子。

在本发明的另一些实施方案中，方法还可包括鉴定具有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症之风险的患者。此外，方法还可包括评估患者罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症的风险因子，评估患者的葡萄球菌性肺部疾病或病症的症状，或诊断患者的葡萄球菌性肺部疾病或病症。在某些实施方案中，方法可包括所述葡萄球菌性肺部疾病或病症为肺炎的实施步骤。

在本发明的一些方面中，α-溶血素(Hla)毒素是减毒的，意思是通过改造使所述毒素比未改造毒素功能更弱或毒力更低。在本发明的某些实施方案中，通过一个或多个氨基酸改变产生Hla突变体，从而对所述毒素进行减毒。氨基酸改变可以是缺失、插入和/或替换1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282和283个氨基酸或其中可得出的任何范围。在一些实施方案中，所述改变涉及SEQIDNO：1或SEQIDNO：2。在具体实施方案中，所述改变位于SEQIDNO：2的第24、35、66、70、110和/或152位。在具体实施方案中，所述改变为D24C、H35C、H35K、R66C、E70C或K110C，或其任何组合(使用单字母代码指代氨基酸)。此外，在具体实施方案中，减毒的Hla毒素为H35L(文献中使用的名字)，它是指在多肽35位具有代替组氨酸之亮氨酸的毒素。可预期的是，35位可替换成位于该位置的其他任何氨基酸，包括其他19种天然氨基酸中的任一种。因此，在本发明的一些实施方案中，减毒的Hla毒素是重组的，意思是使用通过重组工程改造的DNA来产生所述毒素。

在某些实施方案中，Hla毒素具有与SEQIDNOs：1或2相同或相似的序列。在某些方面中，Hla毒素是成熟的Hla毒素(SEQIDNO：2)，其中去除了SEQIDNO：1的前26个氨基酸。在具体实施方案中，Hla毒素具有来源于金黄色葡萄球菌Hla毒素的蛋白质序列。相似性或同一性(优选同一性)为本领域所知，可使用许多不同程序来确定蛋白质(或核酸)是否具有相对于已知序列的序列同一性或相似性。序列同一性和/或相似性可使用本领域的标准方法来确定，包括但不仅限于Smith和Waterman(1981)的局部序列同一性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)的序列同一性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机工具(WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，Devereux等(1984)描述的BestFit序列程序，优选使用默认设置，或者通过观察。优选地，使用本领域技术人员已知的或可获得的比对工具来计算同一性百分比。

在本发明的某些实施方案中，减毒Hla毒素在膜结合、细胞裂解(可具体为红细胞的细胞裂解或溶血作用或抗原呈递细胞的裂解)和/或七聚体形成方面的活性降低或消失。在对这些活性的测定中(如以引用方式并入本文的Walker和Bailey(1995)等所描述的方法和本文的方法)，任一或所有这些活性相对于未减毒Hla毒素可降低约、至少约或至多约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。在某些实施方案中，减毒的Hla毒素缺少可检测的溶血活性或致死活性。

此外，本发明涉及的是，在一些实施方案中Hla毒素是变性或未变性的，如通过化学变性(如使用甲酰胺和甲醛)或热变性。术语“基本未变性”是指在毒素中可能检测到一定的变性，但免疫活性或者与构象特异性结合物(与多肽的三级或二级结构相关)的结合能力也是可检测的。在具体实施方案中，Hla毒素是纯化的，可采用或不采用轻度变性来获得。在本发明的一些方面中，Hla毒素是有活性的，意思是毒素保留一定的可检测水平的功能或活性，如前面所描述的那些，包括结合能力。本发明涉及的是，可将Hla毒素纯化到约、至少约或至多约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的纯度或均一性(相对于其他蛋白质分子和/或细胞大分子)，或其中可得出的任何范围。在另一些实施方案中，重组Hla毒素可以是分离的。术语“分离的”可指核酸或多肽，其基本不含其所来源的细胞材料、细菌材料、病毒材料或培养基(当用重组DNA技术生产时)或者化学前体或其他化学品(当化学合成时)。此外，分离的化合物是指能够以分离化合物的形式施用于受试者的化合物；也就是说，如果化合物被吸附于柱中或包埋于琼脂糖凝胶中，则不可简单地认为它是“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不以片段形式天然存在和/或通常不处于功能状态的核酸或蛋白质片段。

本发明的方法包括对患者施用Hla毒素来刺激患者中针对Hla的免疫应答。在某些实施方案中，方法包括对患者检测针对Hla毒素的抗体。这些方法为本领域技术人员所熟知，它们包括但不仅限于以下分析方法：Western印迹、ELISA、斑点印迹、夹心测定、免疫组织化学和流式细胞术如FACS。

本发明涉及的是，可单次或多次施用本发明组合物。在本发明某些实施方案中，将组合物施用1、2、3、4、5、6或更多次或其中可得出的任何范围。本发明涉及的是，预防或治疗方案可包含在1、2、3、4、5、6和/或7天或者1、2、3、4或5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或其中可得出的任何范围中多次施用。此外，任何这种方案均可在经过一定长度的时间之后、或当受试者重新表现出罹患葡萄球菌性疾病或病症的风险或罹患疾病或病症时重复实施。

可通过用于将疫苗或抗体引入患者的任何途径对患者施用本发明组合物。这些途径包括但不局限于粘膜或肌内递送。在具体实施方案中，通过鼻内或吸入对患者施用组合物。在另一些实施方案中，通过静脉或静脉注射施用组合物。在另外的实施方案中，组合物的施用方式包括但不局限于口服、肠胃外、皮下、肌肉、静脉施用，或它们的多种组合。

可将所述组合物配制成药学上可接受的组合物。在本发明的某些方面中，所述葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。

此外，在本发明实施方案中，方法可包括含有约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μg或mg蛋白质(或其中可引出的任何范围)的组合物。所述蛋白质可以在约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、10、11、12、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μl或ml(或其中可引出的任何范围)中。在某些方面中，可按照每kg体重0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000mg的剂量施用一种或多种抗Hla抗体。

在一些实施方案中，还给予患者一种或多种用于治疗金黄色葡萄球菌肺部感染的抗生素。所述抗生素可以被包括或不包括在含Hla毒素或Hla毒素特异性抗体的组合物之内。

在本发明的另一些实施方案中，组合物含有一种或多种佐剂。佐剂可共价地或非共价地连接到本发明多肽或肽上。在某些方面中，所述佐剂以化学方法缀合到蛋白质、多肽或肽上。

本发明的部分(如抗原或免疫原)可共价地或非共价地缀合或连接至其他部分如佐剂、蛋白质、肽、支持物、荧光部分或标记。术语“缀合”或“免疫缀合”用于宽泛地定义一部分与另一制剂的有效联合，而非意图单指任一类型的有效联合，特别是不局限于化学“缀合”。重组的融合蛋白是特别涉及的。基于其他污染物的量，核酸或多肽组合物可至少具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的纯度。

在另一些实施方案中，组合物含有编码Hla毒素的重组核酸分子。重组核酸分子通常包含异源的启动子。在某些方面中，本发明的重组核酸分子是载体，在另一些方面中，所述载体为质粒。在某些实施方案中，所述载体为病毒载体。通常向人受试者施用组合物，但也涉及向能够引发免疫应答的其他动物施用，特别是牛、马、山羊、绵羊和其他驯养的动物。在另一些方面中，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中，所述免疫应答为保护性免疫应答。在另一些方面中，本发明的方法和组合物可用于预防、减轻、降低或治疗肺部感染，特别是肺炎和其他肺部感染。其他方法包括但不局限于，预防性降低未表现出感染迹象之受试者体内的细菌含量，特别是疑似有目标细菌定殖的受试者或具有此风险的受试者，例如在住院、治疗和/或恢复期间有或会有感染风险和易受感染的患者。

本文使用的术语“抗原”是能够与抗体或T细胞受体结合的分子。抗原还能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞产生。引起生物学应答的抗原结构方面在本文中被称作“抗原决定簇”。B淋巴细胞通过产生抗体来应答外来抗原决定簇，而T淋巴细胞则是细胞免疫的介导者。除了作为细胞免疫的介导者，T淋巴细胞还可通过进一步刺激B淋巴细胞对抗原的应答来促进抗体产生。因此，抗原决定簇或表位是为抗体或T细胞受体(在MHC的情况下)所识别的抗原部分。抗原决定簇不需要是蛋白质的连续序列或片段，而是可包含不相互邻近的多个序列。

在本申请全文中还讨论了本发明的其他实施方案。与本发明某一方面相关的任一实施方案均适用于本发明的其他方面，反之亦然。在实施例章节中的实施方案应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施方案。

本发明特别涉及的是可在要保护的发明中具体纳入或排除列表中的各个成分或要素。

当在权利要求和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“降低”或“预防”或这些术语的任何变异词包括用于实现期望结果的任何可测量的降低或完全抑制。

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”、“包括”等联合使用时，无数量词修饰的词语可指“一个”，但也可与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。

本发明涉及的是，本文中所讨论的任一实施方案均可应用于本发明的任何方法或组合物，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。

在本申请全文中，使用术语“约”来指示数值，所述数值包含测定该值所用仪器或方法的标准误差。

权利要求中的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅表示选择，或者选择之间是互斥的，但本公开内容支持仅表示选择和“和/或”的定义。

本说明书和权利要求中所使用的词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包容性的或开放式的，而不排斥另外的未提及的要素或方法步骤。

通过下文的详细描述，本发明的其他目标、特征和优点将是很明显的。但是，应当理解的是，仅仅通过举例说明的方式给出了详细描述和具体实例(即本发明的具体实施方案)，因为通过这一详细描述，在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员而言将是很明显。

附图说明

以下附图是本说明书的一部分，并用于进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个图并结合本文给出的具体实施方案的详述，可以更好地理解本发明。

图1A-1Cα-溶血素(Hla)是CA-MRSA(社区型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，communityassociated-methicillinresistantS.aureus)肺部感染的毒力因子。(图1A)CA-MRSA菌株金黄色葡萄球菌LAC(野生型)与同基因型hla::erm突变体在鼠肺部感染模型中的毒力比较，通过测定感染后24、48和72小时的动物死亡率而得到。每组感染10只动物(p＜0.0007)。(图1B)在CA-MRSA菌株LAC或MW2中缺失编码Panton-Valentine杀白细胞素(Panton-Valentineleukocidin，PVL)毒素的lukS-PV和lukF-PV基因，不影响在葡萄球菌性肺炎鼠模型中的毒力。用2×10⁸CFU的金黄色葡萄球菌LAC野生型(wt)或同基因型lukS-PV和lukF-PV缺失突变体(Δpvl)(p＝0.22)和3-4×10⁸CFU的金黄色葡萄球菌MW2(wt)及其同基因型pvl缺失突变体(Δpvl)(p＝0.41)来感染小鼠。在感染后24、48和72小时测定每种菌株15只动物一组的死亡率。(图1C)通过苏木精-伊红染色，切片肺组织的组织病理学分析显示相似的肺部损伤模式，与PVL在LAC和MW2分离群中的表达无关。

图2A-2Bα-溶血素(Hla)是CA-MRSA(社区型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)肺部感染的毒力因子。(图2A)用2×10⁸CFU的金黄色葡萄球菌LAC野生型(wt)或同基因型lukS-PV和lukF-PV缺失突变体(Δpvl)(p＝0.22)和3-4×10⁸CFU的金黄色葡萄球菌MW2(wt)及其同基因型pvl缺失突变体(Δpvl)(p＝0.41)来感染小鼠。被葡萄球菌感染24小时后之动物右肺的细菌回收显示，缺失lukS-PV和lukF-PV不影响葡萄球菌在肺部组织中的复制(每种菌株10只动物一组)。采用Student’st检验的统计学分析得到，与LAC菌株比较为p＝0.46，MW2菌株为p＝0.23。(图2B)用针对LukS-PV和LukF-PV之抗体进行的免疫印迹证实，pvl突变体菌株中无相应毒素分泌，而α-溶血素(Hla)的分泌不受同基因型pvl缺失的影响。用星号(^＊)标记的交叉反应种类迁移略快于LukF-PV。

图3A-3E表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的φSa2mw噬菌体的溶原性不影响金黄色葡萄球菌Newman在葡萄球菌性肺炎鼠模型中的毒力。(图3A)图示金黄色葡萄球菌Newman的基因组、其复制起点(ori)和终点(ter)、以及四个原噬菌体插入位点(φNM1、φNM2、φNM3、φNM4)。标出了φSa2mw在金黄色葡萄球菌Newman中的插入位点。(图3B)菌株Newman的φSa2mw溶原性引起lukS-PV和lukF-PV的表达，因为通过培养物上清液样品中用兔抗血清进行的免疫印迹分析可检测到这两种PVL毒素组分(LukS-PV和LukF-PV)。用星号(^＊)标记的交叉反应种类迁移略快于LukF-PV。(图3C)用3-4×10⁸集落形成单位(CFU)的金黄色葡萄球菌Newman(wt)或由φSa2mw溶原化的同基因型变体(NewmanφSa2mw)鼻内接种24小时后之小鼠右肺的细菌回收，未显示葡萄球菌复制存在显著差异(Studentt检验p＝0.74，每组15只动物)。细菌回收的平均值用横线指示。(图3D)通过鼻内接种用金黄色葡萄球菌Newman(wt)或用φSa2mw溶原化的同基因型突变体(NewmanφSa2mw)感染的动物在观察24、48或72小时之后表现出相似的致死性(p＝0.58)。(图3E)将hla::erm等位基因转导入金黄色葡萄球菌NewmanφSa2mw消除了在鼠肺部感染模型中的毒力(p＜0.00004)。

图4A-4B表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的φSa2mw噬菌体的溶原性不影响金黄色葡萄球菌Newman在葡萄球菌性肺炎鼠模型中的毒力。(图4A)经由鼻内途径用3-4×10⁸CFU带有空载体或ppvl的金黄色葡萄球菌Newman感染的动物表明，质粒介导的PVL过表达不影响动物死亡率(p＝0.27)。α-溶血素缺陷型菌株(hla::erm)在肺部感染中无毒力，并分析了用空载体、ppvl或phla转化的hla::erm突变体在鼠肺部感染模型中毒力特征。每种菌株检测10到15只动物，记录感染后24、48和72小时的死亡率。用金黄色葡萄球菌hla突变体(phla)感染的动物的死亡率明显高于用带有空载体或ppvl的金黄色葡萄球菌hla突变体(phla)感染的动物的死亡率(p＝0.00004)。(图4B)来源于用质粒转化的金黄色葡萄球菌Newman及其同基因型hla::erm突变体的18小时培养物上清液的免疫印迹分析，所述质粒促进PVL(ppvl、lukS-PV和lukF-PV)、α-溶血素(phla)或空载体表达。特异性抗体指示LukS-PV、LukF-PV、α-溶血素(Hla)和核酸酶的存在和/或缺乏。用星号(^＊)标记的交叉反应种类迁移略快于LukF-PV。

图5A-5E用突变α-溶血素进行免疫提供了针对葡萄球菌性肺炎的保护。(图5A)将C57BL/6J小鼠用PBS或20μgHla_H35L(具有阻止毒素活性和孔洞形成之单氨基酸替换的突变α-溶血素)进行免疫，然后用金黄色葡萄球菌Newman攻击。记录感染后24、48和72小时的死亡率(p＜0.001)。(图5B)用Hla_H35L免疫小鼠减少了感染的鼠肺部组织中金黄色葡萄球菌Newman的生长。(图5C)来自用PBS或Hla_H35L免疫之小鼠的金黄色葡萄球菌Newman感染肺部组织的总体病理学。(图5D)来自用PBS或Hla_H35L免疫之小鼠的金黄色葡萄球菌Newman感染肺部组织的组织病理学。(图5E)将C57BL/6J小鼠用PBS或20μgHla_H35L进行免疫，然后用金黄色葡萄球菌CA-MRSA菌株LAC或MW2攻击。记录感染后24、48和72小时的死亡率。用金黄色葡萄球菌菌株LAC(p＝0.00001)或MW2(p＝0.018)攻击时，Hla_H35L免疫动物的死亡率明显低于假(PBS)免疫动物的死亡率。

图6A-6Cα-溶血素介导葡萄球菌性人肺泡细胞损伤。(图6A)用金黄色葡萄球菌(菌株LAC、MW2或Newman)感染人A549肺泡细胞。在37℃共培养4小时后，对每个孔进行裂解细胞的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)释放测定。一式三份进行感染，用Studentt检验评价统计学显著性。(图6B)未感染的或者用带有质粒载体或phla之α-溶血素突变体金黄色葡萄球菌菌株(hla::erm)感染的A549细胞的相差显微图像。感染3小时后采集图像。(图6C)通过用抗Hla兔血清处理或与纯化的Hla_H35L预孵育，降低了α-溶血素介导的葡萄球菌性人肺细胞损伤，而无反应性的兔血清(non-reactiverabbitserum，NRS)没有效果。

图7A-7F用抗Hla血清进行的小鼠被动免疫产生了针对葡萄球菌性肺部感染的保护作用。(图7A)通过腹膜内注射用无反应性(NRS)、或带有抗Hla抗体的兔血清对小鼠进行被动免疫，然后用金黄色葡萄球菌Newman攻击(p＜0.0007)。记录感染后24、48和72小时的死亡率。(图7B)用抗Hla进行的小鼠被动免疫降低了金黄色葡萄球菌Newman在鼠肺部组织中生长的能力(图7C)，还降低了感染后的总体病理学(图7D)和组织病理学损伤。(图7E)抗Hla抗血清还在通过鼻内接种用金黄色葡萄球菌菌株LAC(p＜0.025)或MW2(p＜0.009)攻击时保护动物。(图7F)根据感染后24、48和72小时的记录，抗PVL免疫球蛋白不能提供针对金黄色葡萄球菌LAC感染的保护作用(p＝0.55)。

图8用针对α-溶血素之抗体进行的被动免疫影响了葡萄球菌性肺部感染期间的细胞因子应答。将无反应性或带有抗Hla抗体的兔血清注射入小鼠的腹腔内。通过检测IL-1β和IFN-γ浓度的多元珠细胞因子测定(multiplexbead-basedcytokineassay)来测定血清细胞因子水平。用Studentt检验(每组9只动物)计算细胞因子水平差异的统计学显著性，并记录下来。

图9针对α-溶血素之小鼠单克隆抗体对A549细胞提供针对金黄色葡萄球菌所诱导裂解的保护。在无反应性(NRS)或带有抗Hla的兔血清存在下，将A549细胞与活的金黄色葡萄球菌共培养。将另外的A549细胞孔与活的金黄色葡萄球菌以及两种独立的抗Hla单克隆抗体(7B8.35和1A9)或其同种型匹配的对照抗体(分别是IgG2a和IgG2b)共培养，证实多克隆兔抗血清和小鼠单克隆抗体都能对A549细胞提供针对Hla所诱导损伤的保护。

图10在A549细胞LDH释放测定中的小鼠单克隆抗体滴定。在金黄色葡萄球菌Newman存在下，将同种型对照抗体(IgG2a或IgG2b)或抗α-溶血素的单克隆抗体7B8.35/1A9.4F9加入A549细胞共培养物中。按照以下浓度在测定中滴定单克隆抗体：从左至右为2.5mg/ml、2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml和0.001mg/ml。在共培养4小时之后测定LDH释放。

图11A-11B抗α-溶血素的单克隆抗体7B8.35和1A9.4F9对实验动物提供针对金黄色葡萄球菌性肺炎相关死亡的保护。用金黄色葡萄球菌Newman感染之前24小时，15只小鼠一组接受同种型对照抗体(IgG2a，图A或IgG2b，图B)或相应抗Hla单克隆抗体(7B8.35，图A或1A9.4F9，图B)的腹膜内注射。每种抗体以5mg/kg的剂量递送。经由鼻内途径的金黄色葡萄球菌感染后，观察动物的急性致死疾病，表现出由任一单克隆抗体处理所提供的显著保护作用。

图12抗Hla的单克隆抗体对实验动物提供针对USA300/LAC所致肺炎的保护。动物接受同种型对照抗体(IgG2a或IgG2b)或相应抗Hla单克隆抗体(7B8.35或1A9.4F9)的腹膜内给药。每种抗体以5mg/kg的剂量施用。经由鼻内途径的金黄色葡萄球菌菌株USA300/LAC感染后，观察动物的急性致死疾病，表现出由任一单克隆抗体处理所提供的显著保护作用。

图13HlaH35L截短产物的图示。全长HlaH35L和示于全长蛋白质下方的7个截短产物。

图14抗Hla单克隆抗体与成熟毒素的单个N端区域结合。用单克隆抗体7B8.35和1A9.4F9进行的HlaH35L截短产物的点印迹分析证实，为两种单克隆抗体所识别的表位位于所述蛋白质的前50个氨基酸之内。

发明详述

鼠模型系统中金黄色葡萄球菌性肺炎的研究将α-溶血素(Hla)确定为疾病致病过程的关键毒力因子，因为缺少这一外毒素的突变菌株是无毒力的。Hla是由金黄色葡萄球菌所分泌的细菌外毒素家族的成员，能够插入多种真核细胞的细胞膜。该蛋白质以单体的形式分泌，在真核细胞表面组装成七聚体环状结构。组装后的外毒素插入宿主细胞膜，形成通过破坏膜完整性而导致细胞损伤和死亡的孔洞。一些生物化学研究确定了Hla单体中促进与宿主细胞结合、七聚体形成和宿主细胞裂解的氨基酸残基。已知成熟毒素中35位的组氨酸残基是有效的七聚体形成和细胞裂解所需要的，但是对结合真核细胞靶标不是必要的。本发明人考虑到，能够中和Hla的疫苗接种策略应该提供针对金黄色葡萄球菌性肺炎的免疫保护。为此，本发明人制备了以将35位组氨酸转变为亮氨酸的Hla突变体或变体形式(HlaH35L)为代表的重组的减毒或毒力降低的Hla，因而阻止了该外毒素的有效组装。

用上述突变毒素免疫实验动物提供了针对金黄色葡萄球菌攻击后肺炎的保护作用。该保护作用表现为死亡率降低、从肺部回收的细菌更少以及将病理损伤局限在病灶区域中。相似地，使用以重组HlaH35L免疫的兔血清进行的被动免疫对小鼠提供针对金黄色葡萄球菌性肺炎的保护，证实了与主动免疫后所见相同的益处。

本发明的实施方案涉及用于缓解或免除感染和/或预防或治疗葡萄球菌性肺炎的免疫原性蛋白质、多肽和肽(例如Hla和HlaH35L)及其片段。抗原性蛋白质、多肽或肽包括但不局限于来自葡萄球菌特别是金黄色葡萄球菌的Hla蛋白的全部或部分。这些菌株的非限制性实例包括属于Lindsay等(2006)鉴定的10个克隆类群(CC1、CC5、CC8、CC12、CC15、CC22、CC25、CC30、CC45和CC51)中之一的那些。更具体地，抗原性蛋白质、多肽或肽包括但不局限于来自金黄色葡萄球菌MRSA菌株以及与医院和社区获得性感染相关的分化体(clade)(包括但不局限于金黄色葡萄球菌菌株8325、Barnum、Berlin、BrazilianIberian、COL、EMRSA-15、EMRSA-16、Hanover、LAC、N315、MRSA252、MW2、Mu50、PediatricNY、Japan和归类于CDC分化体USA100、USA200、USA300、USA500、USA600和USA800中的金黄色葡萄球菌菌株)的Hla蛋白的全部或部分。

I.葡萄球菌HLA

葡萄球菌α-溶血素(Hla或α毒素)是细菌成孔β-桶毒素家族的基本成员(Bhakdi和Tranum-Jensen，1991；Song等，1996)。它的结构基因hla位于所有被检测到分泌293个残基水溶性单体的金黄色葡萄球菌菌株的染色体上(O′Reilly等，1990；O′Reilly等，1986)。Hla被认为与敏感性宿主细胞的表面受体结合，从而促进其自身聚合成七聚体孔洞前体、并将具有2nm孔径的β-桶结构插入质膜(Gouaux等，1997)。Hla孔洞形成于淋巴细胞、巨噬细胞、肺泡上皮细胞、肺内皮细胞和红细胞中，但是粒细胞和成纤维细胞看来对裂解有抗性(Bhakdi和Tranum-Jensen，1991；McElroy等，1999)。向兔或大鼠肺组织中滴注纯化的Hla，引发了血管渗漏和肺动脉高血压，其原因在于释放了几种信号分子，如磷脂酰肌醇、一氧化氮、前列腺素类(PGE2、PGI2)和血栓烷A2(McElroy等，1999；Seeger等，1984；Seeger等，1990；Rose等，2002；Suttorp和Habben，1988)。与Hla的生物化学特性一致，消除金黄色葡萄球菌Newman中Hla表达的突变体严重减弱了在鼠肺炎模型中的毒力(Bubeck-Wardenburg等，2007)。本文中本发明人以Hla作为靶标，用于开发针对金黄色葡萄球菌肺部感染之疫苗或免疫治疗的策略。

本发明的某些方面包括涉及Hla蛋白之蛋白质组合物(包含多肽、肽或编码它们的核酸)的方法和组合物。可以通过缺失、插入和/或替换来修饰这些蛋白质。在具体实施方案中，这些蛋白质的修饰能够在受试者中引发免疫应答。

Hla多肽包含来自葡萄球菌属中细菌的Hla蛋白质的氨基酸序列。Hla序列可以来自特定葡萄球菌物种如金黄色葡萄球菌，也可以来自特定菌株如Newman。在某些实施方案中，Hla序列可包含这样的序列，该序列具有金黄色葡萄球菌共有前体序列：

MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVANAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLV

TYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKS

GLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTG

DDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQ

NWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAA(E/D)NFLDPNKASSLLSSG

FSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDK

W(I/T)DRSSERYKIDWEKEEMTN(以SEQIDNO：1表示)

和成熟金黄色葡萄球菌共有序列：

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNK

KLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISD

YYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQ

PDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMK

TRNGSMKAA(E/D)NFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNID

VIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKW(I/T)DRSSERYKIDWEKEEMT

N(以SEQIDNO：2表示)

在某些方面中，Hla序列基本如Genbank登记号AAA26498(gi152953)、Mu50(NP_371687.1)(gi15924153)、COL(YP_186036.1)(gi57650272)、N315(NP_374279.1)(gi15926746)、JH9(YP_001246598.1)(gi148267655)、JH1(YP_001316387.1)(gi150393712)、USA300(YP_493756.1)(gi87160380)、NCTC8325(YP_499665.1)(gi88194865)、Newman(YP_001332107.1)(gi151221285)、MW2(NP_645861.1)(gi21282773)和MSSA476(YP_043222.1)(gi49486001)(在本申请的最早优先日期时通过引用并入本文)所示，或者为其变体。

在另一些实施方案中，可以使用其他Hla多肽，其序列可由本领域技术人员利用数据库和网络可访问资源来确定。

本文所用的“蛋白质”或“多肽”是指含有至少十个氨基酸残基的分子。在一些实施方案中使用蛋白质或多肽的野生型形式，但是在本发明的许多实施方案中，使用修饰的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可在本文中互换使用。“修饰的蛋白质”或“修饰的多肽”是指其化学结构特别是氨基酸序列与野生型蛋白质或多肽相比发生变化的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，修饰的蛋白质或多肽具有至少一种改变的活性或功能(认为蛋白质或多肽可能具有多种活性或功能)。本发明特别涉及的是，可针对某一活性或功能来改变修饰的蛋白质或多肽，而在其他方面保留野生型活性或功能，如免疫原性。

在某些实施方案中，蛋白质或多肽(野生型或修饰的)的大小可以包括但不局限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个氨基分子或更多、以及其中可得出的任何范围，或其衍生物。本发明还涉及的是，可通过截短(使其短于相应的野生型形式)来突变多肽，也可通过融合或缀合具有特定功能(例如用于靶向或定位、用于增强免疫原性、用于纯化目的等等)的异源蛋白质序列来改变多肽。

在此“氨基分子”是指本领域所知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白性分子的残基是连续的，没有任何非氨基分子中断氨基酸残基的序列。在另一些实施方案中，所述序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在具体实施方案中，蛋白性分子的残基序列可以为一个或多个非氨基分子部分所中断。

因此，术语“蛋白性组合物”包括氨基分子序列，所述序列含有至少一种天然合成蛋白质中的20种常见氨基酸或者至少一种修饰的或非常见氨基酸。

可采用本领域技术人员所知的任何技术来制造蛋白性组合物，所述技术包括(i)通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，(ii)从天然或重组来源(例如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母等)中分离蛋白性化合物，或(iii)化学合成蛋白性材料。以前已经公开了多种基因的核苷酸及蛋白质、多肽和肽的序列，还可以在公认的计算机管理数据库中找到上述序列。其中一个数据库是国立生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(万维网网址为ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文公开的或为本领域普通技术人员所知的技术来扩增和/或表达这些基因的编码区。

考虑了Hla的氨基酸序列变体，所述变体可以为替换、插入、或缺失的变体。与野生型相比，对本发明多肽的修饰可影响多肽中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293个或更多个非连续的或连续的氨基酸。来源于任何葡萄球菌物种和菌株的Hla多肽均考虑用于本发明的方法中。

变体通常缺少天然或野生型蛋白质中的一个或多个残基。可以缺失单个残基，或者可以缺失许多连续的氨基酸。可将终止密码子(通过替换或插入)引入编码的核酸序列中，以产生截短的蛋白质。插入突变通常包括在多肽非末端位点处加入材料。这可包括插入一个或多个残基。还可产生末端添加，称作融合蛋白。

替换变体通常包含在蛋白质一个或多个位点处将一个氨基酸替换为另一个，并可被设计成调节多肽的一个或多个特性，同时丢失或不丢失其他功能或特性。替换可以是保守的，即将一个氨基酸替换成形状和电荷相似的氨基酸。保守性替换为本领域所熟知，包括如以下改变：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守性变化通常包括将残基替换成化学不相似的，如极性或带电氨基酸代替非极性或不带电氨基酸，反之亦然。

本发明的蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者，可以从细菌中分离非重组或重组的蛋白质。还考虑可将含有上述变体的细菌应用于本发明的组合物和方法中。因此，不需要分离蛋白质。

术语“功能等价密码子”在本文中用于指代编码相同氨基酸的密码子(如精氨酸或丝氨酸的六个密码子)，也指编码生物学上等价的氨基酸的密码子(见下面的表1)。

表1密码子表

氨基酸	密码子
		丙氨酸 Ala A 半胱氨酸 Cys C 天冬氨酸 Asp D 谷氨酸 Glu E 苯丙氨酸 Phe F 甘氨酸 Gly G 组氨酸 His H 异亮氨酸 Ile I 赖氨酸 Lys K 亮氨酸 Leu L 甲硫氨酸 Met M 天冬酰胺 Asn N 脯氨酸 Pro P 谷氨酰胺 Gln Q 精氨酸 Arg R 丝氨酸 Ser S 苏氨酸 Thr T 缬氨酸 Val V 色氨酸 Trp W 酪氨酸 Tyr Y	GCA GCC GCG GCU UGC UGU GAC GAU GAA GAG UUC UUU GGA GGC GGG GGU CAC CAU AUA AUC AUU AAA AAG UUA UUG CUA CUC CUG CUU AUG AAC AAU CCA CCC CCG CCU CAA CAG AGA AGG CGA CGC CGG CGU AGC AGU UCA UCC UCG UCU ACA ACC ACG ACU GUA GUC GUG GUU UGG UAC UAU

还应当理解的是，氨基酸和核酸序列可包含额外的残基，如分别为额外的N端或C端氨基酸、或5′或3′序列，但仍然基本如本文公开的序列所示，只要该序列满足上文设定的标准(包括保持与蛋白质表达相关的蛋白质生物活性)。末端序列的添加特别适用于核酸序列(例如可包含位于编码区5′或3′部分之侧翼的多种非编码序列)。

下文是基于改变蛋白质的氨基酸来产生等价或改进的第二代分子的讨论。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可以替换为其他氨基酸，而没有相互结合能力(同例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点之结构结合)的可感知损失。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定了蛋白质的生物学功能活性，因此可在氨基酸序列(及其背后的DNA编码序列)中进行某些氨基酸替换，而仍产生具有相似特性的蛋白质。因而，本发明人考虑可在基因或核酸的DNA序列中进行多种变化，而不导致其生物学应用和活性的可感知缺失。

进行这种变化时，应考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性为本领域所广泛了解(Kyte和Doolittle、1982)。为人们所接受的是，氨基酸的相对亲水性决定了产物蛋白质的二级结构，其二级结构进而决定了该蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

还为本领域所了解的是，可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的替换。通过引用并入本文的美国专利4,554,101陈述了蛋白质的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸亲水性决定)与蛋白质的生物学特性相关。应理解的是，氨基酸可以被替换为具有相似亲水值的其他氨基酸，而仍产生生物学等价或免疫学等价的蛋白质。

如上所述，氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。将多种前述性质考虑在内的示例性替换是众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸，谷酰胺和天冬酰胺，丝氨酸和苏氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

本发明涉及的是，在每ml本发明组合物中有约0.001mg到约10mg的总蛋白质。因此，组合物中的蛋白质浓度可以是约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0μg/ml、mg/ml或者更多(或其中可得出的任何范围)。在这当中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％可为Hla蛋白。

本发明涉及施用Hla多肽或肽来改变针对与葡萄球菌病原菌感染相关的疾病或病症(在特定方面为肺炎)发展之预防性疗法。本发明还涉及施用针对Hla多肽或肽而产生的抗体，用来预防或治疗与葡萄球菌病原菌感染相关的疾病或病症(在特定方面为肺炎)。

此外，通过引用并入本文的美国专利4,554,101(Hopp)教导根据亲水性从一级氨基酸序列中鉴定和制备表位。通过在Hopp中公开的方法，本领域技术人员将能够鉴定来自氨基酸序列中的可能表位，并确认它们的免疫原性。大量科学文献也致力于从氨基酸序列分析中预测二级结构和鉴定表位(Chou和Fasman，1974a，b、1978a，b、1979)。如果需要，可以使用这些当中的任一个来补充美国专利4,554,101中Hopp的教导。

本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、肽和蛋白质。例如，对特定多肽测定了其引发免疫应答的能力。在具体实施方案中，也可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成本发明蛋白质的全部或一部分。多种自动合成仪是可买到的，且可以根据已知的方案加以使用。参见例如Stewart和Young(1984)、Tam等(1983)、Merrifield(1986)、Barany和Merrifield(1979)，均通过引用并入本文。或者，可使用重组DNA技术，其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染入合适的宿主细胞并在适于表达的条件下培养细胞。

本发明的一个实施方案包括利用转移至细胞(包括微生物)中的基因来产生和/或呈递蛋白质。可将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中，接着在合适条件下培养细胞。基本上编码任何本文所述多肽的核酸均可使用。本文讨论了重组表达载体的产生及其包含的元件。或者，要生产的蛋白质可以是由用于蛋白质生产的细胞所正常合成的内源蛋白质。

本发明的另一实施方案使用了自体B淋巴细胞细胞系，所述细胞系转染有表达免疫原产物(更具体地为具有免疫原活性的蛋白质)的病毒载体。哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括但不局限于Vero和Hela细胞、其他B和T细胞系(如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji)、以及中国仓鼠卵巢、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞的细胞系。此外，可选择调节插入序列表达的或以需要方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如剪切)可能对蛋白质的功能是重要的。不同宿主细胞对蛋白质的翻译后加工和修饰具有特征性的和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统来保证所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。

可使用多种选择系统，包括但不局限于分别位于tk、hgprt或aprt细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外，还可使用抗代谢物抗性作为选择基础：dhfr，赋予对甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性；gpt，赋予对霉酚酸的抗性；neo，赋予对氨基糖苷G418的抗性；hygro，赋予对潮霉素的抗性。

可以两种方式在体外繁殖动物细胞：在整个培养物体积中悬浮生长的非锚着依赖性细胞，或者需要附着在固体基底上进行生长的锚着依赖性细胞(即单层类型的细胞生长)。

来源于连续的已建立细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养物是大规模生产细胞和细胞产物的最常用方法。但是，悬浮培养的细胞具有局限性，例如致癌潜力和低于附着细胞的蛋白质产量。

A.宿主细胞

本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括其任何或所有后续世代的后代。应当了解的是，由于故意的或偶然的突变，所有后代未必相同。在表达异源核酸序列的语境中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，它包括任何能够复制载体或表达由载体编码之异源基因的可转化生物。宿主细胞可以(并已经)用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这是指将外源核酸(如重组蛋白编码序列)转到或引入宿主细胞的过程。转化细胞包括原代受体细胞及其后代。

宿主细胞可来源于原核生物或真核生物，包括用于复制载体或表达部分或全部核酸序列的细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳细胞。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，它们可以通过美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)获得，ATCC是作为活培养物和遗传材料的存档中心的组织(www.atcc.org)。本领域的技术人员可根据载体骨架和期望的结果来确定合适的宿主。例如，可将质粒或粘粒引入原核宿主细胞，以复制许多载体或表达编码的蛋白质。用作宿主细胞(用于载体复制和/或表达)的细菌细胞包括葡萄球菌菌株、DH5α、JM109和KC8，以及许多可买到的细菌宿主如感受态细胞和SOLOPACK^TMGold细胞(LaJolla、CA)。或者，细菌细胞如大肠杆菌LE392可以用作噬菌体病毒的宿主细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomycespombe)和毕赤酵母(Pichiapastoris)。

用于载体或多肽复制和/或表达的真核宿主细胞的实例包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自多种细胞类型和生物的许多宿主细胞是可用的，且为本领域技术人员所知。类似地，病毒载体可与真核或者原核宿主细胞(特别是允许复制或表达该载体的细胞)结合使用。

一些载体可使用控制序列，所述控制序列能使所述载体同时在原核和真核细胞中复制和/或表达。本领域技术人员还会了解培养所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复制的条件。能够大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其相应多肽、蛋白质或肽的技术和条件也是已了解和已知的。

B.表达系统

已有许多表达系统包含至少部分的或全部上述组合物。可将基于原核和/或真核的系统与本发明一起使用，以产生核酸序列或其相应多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是商品化并易于获得的。

昆虫细胞/杆状病毒系统可产生异源核酸片段的高水平蛋白表达，如通过引用并入本文的美国专利5,871,986和4,879,236中所描述，可以购买这些系统，例如，来自的名为2.0和来自的名为BACPACK^TM杆状病毒表达系统。

除了本发明公开的表达系统，表达系统的其他实例包括的COMPLETECONTROL^TM诱导型哺乳动物表达系统(该系统含有合成的蜕皮激素诱导型受体)，或其pET表达系统(一种大肠杆菌表达系统)。诱导型表达系统的另一实例是可购自的使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统，其带有T-REX^TM(四环素调节的表达)系统。还提供了称作毕赤酵母表达系统(PichiamethanolicaExpressionSystem)的酵母表达系统，该系统被设计用于在甲醇营养酵母毕赤酵母Pichiamethanolica中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员会理解如何表达载体(如表达构建体)来产生核酸序列或其相应多肽、蛋白质或肽。

II.核酸

本发明涉及编码本发明蛋白质、多肽、肽的重组多核苷酸。包括野生型Hla或其任何其他多肽变体的核酸序列，所有序列都通过引用并入本文。

在本申请中，术语“多核苷酸”是指重组的或者分离成不含基因组总核酸的核酸分子。包含在术语“多核苷酸”中的有寡核苷酸(长度为100个或更少残基的核酸)、重组载体(包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等)。在某些方面中，多核苷酸包括从其天然基因或蛋白质编码序列中基本分离出来的调节序列。多核苷酸可以是RNA、DNA、它们的类似物或它们的组合。

在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括正确转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。应为本领域技术人员所理解的是，这一术语包含表达或适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白或突变体的基因组序列、表达盒、cDNA序列和小的工程化核酸片段。编码全部或一部分多肽的核酸可含有编码该多肽全部或一部分的连续核酸序列，所述核酸序列长度如下：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000个或更多个核苷酸、核苷或碱基对。还涉及的是，来自给定物种的特定多肽可以由含有天然变异的核酸所编码，所述核酸具有略微不同的核酸序列但是仍编码相同或基本相似的蛋白质(见上文表1)。

在具体实施方案中，本发明涉及整合了编码Hla或其任何突变体或片段之核酸序列的分离核酸片段和重组载体。因此，含有核酸片段的分离核酸片段或载体可编码例如具有免疫原性的Hla或Hla(H35L)蛋白。可将术语“重组”与多肽或特定多肽的名称连起来使用，这一般是指由体外操作的核酸分子或该分子的复制产物所产生的多肽。

在另一些实施方案中，本发明涉及整合了编码Hla或Hla变体多肽或肽之核酸序列的分离核酸片段和重组载体，所述多肽或肽可用于在受试者中产生免疫应答。在多个实施方案中，本发明的核酸可用于基因疫苗中。

不论编码序列本身多长，本发明中所用的核酸片段均可与其他核酸序列(如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等)组合，使得它们的总长度可能变化非常大。因此，本发明还涉及的是，可以使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选受限于预期使用的重组核酸方法中制备和使用的便利程度。在一些情况下，核酸序列可编码具有额外异源编码序列的多肽序列，例如允许进行多肽纯化、运输、分泌、翻译后修饰，或用于治疗益处，如靶向或效力。如上文所讨论的，可将标签或其他异源多肽加到经修饰的多肽编码序列上，其中“异源”是指与所修饰多肽不相同的多肽。

本发明中所用的核酸编码Hla或任何Hla变体或片段。该序列可以是密码子冗余和功能等价的结果，密码子冗余和功能等价已知在核酸序列及其编码蛋白质中天然存在。或者，可通过应用重组DNA技术制造功能等价的蛋白质或肽，其中可基于所改变氨基酸性质的考虑来设计蛋白质结构的改变。可通过应用定点突变技术引入人为设计的改变，例如引入蛋白质抗原性的改进。

在另一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，在其序列中包含来自SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或上述通过引用并入的其他氨基酸序列的相应核酸序列。

用于递送核酸以实现本发明组合物表达的合适方法被认为包括几乎任何可将核酸(例如DNA，包括病毒和非病毒载体)引入细胞、组织或生物体的方法，如本文所述或为本领域普通技术人员所知。这些方法包括但不局限于直接递送DNA如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，均通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；通过引用并入本文的美国专利5,789,215)；通过电穿孔(通过引用并入本文的美国专利5,384,253)；通过磷酸钙沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE葡聚糖之后用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接超声载荷(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)；通过微射弹轰击(PCT申请号WO94/09699和95/06128；美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，均通过引用并入本文)；通过碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，均通过引用并入本文)；通过农杆菌介导转化(美国专利5,591,616和5,563,055，均通过引用并入本文)；通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993；美国专利4,684,611和4,952,500，均通过引用并入本文)；或通过干燥/抑制介导的DNA吸入(Potrykus等，1985)。通过应用诸如此类的技术，可以稳定或暂时转化器官、细胞、组织或生物体。

III.免疫应答和治疗

如上文所讨论的，本发明涉及引发受试者中针对Hla或其变体或片段之免疫应答。在一个实施方案中，所述免疫应答可保护或治疗患有、疑似患有或有风险发生感染或相关疾病(特别是那些与葡萄球菌性肺炎相关的)的受试者。

A.保护性免疫

在本发明的一些实施方案中，蛋白性组合物赋予受试者保护性免疫。保护性免疫是指身体发动保护受试者免于发生特定疾病或病症的特异性免疫应答的能力，所述疾病或病症与免疫应答所针对的物质相关。免疫原性有效量能够赋予受试者保护性免疫。

如本文的说明书和后续的权利要求书部分中所用的，术语“多肽”是指通过肽键或其类似物共价相连的一段氨基酸。根据本发明，不同多肽具有不同的功能。根据一个方面，多肽来源于设计成在受者中诱导主动免疫应答的免疫原；而根据本发明的另一方面，多肽来源于在例如动物中引发主动免疫应答后产生的抗体，所述抗体能在受者中诱导被动免疫应答。但在两种情况下都可由根据任何可能密码子使用的多核苷酸编码所述多肽。

本文所用的术语“免疫应答”或其等价的“免疫学应答”是指在受试患者中发生直接针对本发明蛋白质、肽或多肽的体液应答(抗体介导的)、细胞应答(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)或者体液及细胞的应答。这种应答可以是通过施用免疫原诱导的主动应答，或通过施用抗体、含抗体的材料或已触发T细胞而诱导的被动应答。呈递与I类或II类MHC分子结合的多肽表位引发细胞免疫应答，以活化抗原特异性CD4(+)T辅助细胞和/或CD8(+)细胞毒T细胞。所述应答还可包括活化单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞或先天免疫的其他组分。

本文所用的“主动免疫”是指通过施用抗原而赋予受试者的任何免疫。

本文所用的“被动免疫”是指不向受试者施用抗原而赋予受试者的任何免疫。因此，“被动免疫”包括但不局限于施用已活化的免疫效应因子，包括免疫应答的细胞介质或蛋白质介质(例如单克隆和/或多克隆抗体)。可在被动免疫中使用单克隆或多克隆抗体组合物，来预防或治疗由带有该抗体所识别抗原之生物体所引发的感染。抗体组合物可包含结合多种抗原的抗体，所述抗原又可与多种生物相关。抗体组合物可以是多克隆抗血清。在某些方面中，抗体是从经抗原攻击的动物或第二受试者中亲和纯化的。或者，可使用抗体混合物，其为针对在相同、相关或不同微生物或生物体(如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，包括但不局限于葡萄球菌)中所存在抗原的单克隆和/或多克隆抗体的混合物。

可通过对患者施用得自已知有免疫反应性之供体或其他非患者来源的免疫球蛋白(Ig)和/或其他免疫因子，向患者或受试者传递被动免疫。在另一些方面中，本发明的抗原性组合物可施用于受试者，之后所述受试者可作为应答于该组合物攻击而产生的球蛋白(“超免疫球蛋白”)的来源或供体，其包括针对Hla或其任何变体或片段的抗体。经此处理的受试者可捐献血浆，其后通过常规血浆分级法从所述血浆中可获得超免疫球蛋白，并将其施用于其他受试者，以传递对葡萄球菌感染的抗性或治疗葡萄球菌感染。本发明的超免疫球蛋白对免疫力受损的个体、正经受侵入性治疗或时间不允许其产生应答于疫苗的自身抗体的个体特别有用。与被动免疫相关的示例性方法和组合物参见美国专利6,936,258、6,770,278、6,756,361、5,548,066、5,512,282、4,338,298和4,748,018，均通过引用以其整体并入本文。

对本说明书及所附权利要求书而言，术语“表位”和“抗原决定簇”可互换使用，是指抗原上被B细胞和/或T细胞应答或识别的位点。B细胞表位可由连续氨基酸形成，或由通过蛋白质三级折叠而接近的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后可被保留，而通过三级折叠形成的表位用变性溶剂处理时一般会丢失。表位通常包括至少3个、更通常为至少5或8-10个处于独特空间构象的氨基酸。测定表位空间构象的方法包括例如X射线晶体学和2维核磁共振。参见例如EpitopeMappingProtocols，1996。识别相同表位的抗体可用简单的免疫测定加以鉴定，所述测定能够显示一种抗体阻碍另一种抗体结合目标抗原的能力。T细胞识别含连续表位，对CD8细胞而言约为9个氨基酸，对CD4细胞而言约为13-15个氨基酸。识别表位的T细胞可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定加以鉴定，这通过由应答表位的已触发T细胞中的³H-胸苷掺入(Burke等1994)、通过抗原依赖性杀伤(细胞毒T淋巴细胞测定，Tigges等1996)或通过细胞因子分泌来测定。

可通过增殖测定(CD4(+)T细胞)或CTL(细胞毒T淋巴细胞)测定来鉴定细胞介导的免疫应答。可通过从被免疫的同基因动物中分别分离IgG和T细胞并在另一受试者中测量预防或治疗效果，从而区分体液和细胞应答对免疫原的预防或治疗效果的相对贡献。

本文和权利要求中所用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，是指几类结构相关的蛋白质中的任一种，所述蛋白质作为动物或受试者的免疫应答的一部分来发挥功能，所述蛋白包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白。

本发明还涉及“人源化”抗体，如带有人的恒定区和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠、兔或其他物种的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程化抗体及其片段。“人源化”技术通常包括使用重组DNA技术来操作编码抗体分子多肽链的DNA序列。使单克隆抗体(MAb)人源化的早期方法包括产生嵌合抗体，在该方法中将含有某一抗体完整可变结构域的抗原结合位点连接到来自另一抗体的恒定结构域上。进行这种嵌合过程的方法描述于EP0120694(CelltechLimited)、EP0125023(GenentechInc.和CityofHope)、EP-A-0171496(Rev.Dev.Corp.Japan)、EP-A-0173494(StanfordUniversity)和WO86/01533(CelltechLimited)中，每篇文献都通过引用整体并入本文。这些申请一般公开了制备具有小鼠MAb可变结构域和人免疫球蛋白恒定结构域的抗体分子的方法。

替代方法描述于EP-A-0239400(Winter)，其中通过使用长寡核苷酸的定点突变，将小鼠MAb的互补性决定区(CDR)嫁接到人免疫球蛋白可变结构域的构架区上。这种方法的实例参见美国专利7,262,050，所述专利通过引用整体并入本文。

还可从转基因动物中得到人源化抗体。例如，文献(参见例如Jakobovits等，1993；Jakobovits等，1993；Bruggermann等，1993，至少对其人类抗体制备的通过引用并入本文)中已描述了能应答于免疫而产生完整的人类抗体库的转基因突变小鼠。特别地，在这些嵌合的种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失导致对内源抗体产生的完全抑制，而且向该种系突变小鼠中成功转入人类种系抗体基因阵列导致在抗原攻击时产生人类抗体。

在正常生理条件下，抗体可见于血浆和其他体液中以及某些细胞的膜上，通常由称为B细胞的淋巴细胞类型或其功能等价物产生。IgG类抗体由通过二硫键相连的4条多肽链组成。完整IgG分子的4条链是被称为H链的两条相同的重链和被称为L链的两条相同的轻链。

为了产生多克隆抗体，用抗原或抗原片段(一般和佐剂一起，如有必要则结合载体)免疫宿主如兔或山羊。其后从宿主的血清中收集针对抗原的抗体。可针对抗原亲和纯化多克隆抗体，使其具有单一特异性。

为了产生单克隆抗体，用抗原对合适的供体(一般为小鼠)进行超免疫。然后分离产生抗体的脾细胞。将这些细胞与有永生特性的细胞(如骨髓瘤细胞)融合，产生能够被持续培养且分泌所需单克隆抗体的融合细胞杂交物(杂交瘤)。其后大量培养上述细胞，并且从细胞培养物中收获单克隆抗体以供使用。按照定义，单克隆抗体对单个表位具有特异性。由于这种原因，针对相似抗原，单克隆抗体通常具有比多克隆抗体更低的亲和常数。

也可通过使用脾细胞或来自脾的细胞系的原代培养物来体外产生单克隆抗体(Anavi，1998)。为了产生重组抗体(一般参见Huston等，1991；Johnson等，1991；Mernaugh等，1995)，将来自生产抗体的动物B淋巴细胞或杂交瘤细胞的信使RNA反转录以获得互补DNA(cDNA)。扩增抗体cDNA(可为全长的或部分长度的)，并克隆到噬菌体或质粒上。cDNA可以是分开的或通过接头连接的部分长度的重链和轻链cDNA。使用合适的表达系统表达抗体、抗体片段或者抗体的免疫性部分或片段，以获得重组抗体。还可通过筛选合适的表达文库来获得抗体cDNA。

如上文所讨论，本发明方法中所用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体或它们的片段。但是，就某些治疗目的而言，将所述抗体人源化，从而使它们不会引起针对所施用抗体的显著免疫应答。还可根据本发明使用这种人源化抗体，产生这些抗体的方法为本领域技术人员所熟知(Jones等，1986；Riechmann等，1988；Verhoeyen等，1988)。

如本领域所熟知的，抗体可与固体支持基质结合，或者与可检测部分缀合，或者结合并缀合。对缀合荧光或酶部分的总体讨论参见Johnstone等(1982)。抗体与固体支持底物的结合也为本领域所熟知(Harlow等，1988；Borrebaeck，1992)。

本文和权利要求中所用的短语“抗体的免疫性部分”包括抗体Fab片段、抗体Fv片段、抗体重链、抗体轻链、抗体重链与轻链的未关联的混合物、抗体重链和轻链组成的异二聚体、抗体重链的催化结构域、抗体轻链的催化结构域、抗体轻链的可变片段、抗体重链的可变片段和抗体的单链变体(也称作scFv)。此外，该术语包括嵌合免疫球蛋白，它是来源于不同物种的融合基因的表达产物，所述物种之一可以是人，在这种情况下称嵌合免疫球蛋白为人源化的。

任选地，抗体(或优选抗体的免疫性部分)可以与其他蛋白质化学缀合，或表达为融合蛋白。就本说明书和所附权利要求书而言，所有这些融合蛋白质都包含在抗体或抗体免疫性部分的定义中。

本文所用的术语“免疫原性物质”或“免疫原”或“抗原”可互换使用，用于描述在单独、与佐剂结合、或在展示载体上呈递后施用于受试者时能够诱导针对其自身的免疫应答的分子。

单链抗体(SCA)一般为遗传工程化的蛋白质，其设计用于扩展采用单克隆抗体的可能的治疗和诊断应用。SCA具有单克隆抗体的结合特异性和亲和力，在天然状态下约为单克隆抗体大小的五分之一到六分之一，一般导致其半衰期很短。与大多数单克隆抗体相比，SCA提供了一些益处，包括它们能直接与可用于检测的多肽(例如萤光素酶或荧光蛋白)融合。除了这些益处之外，可直接从人SCA文库中直接分离全人SCA，而不需要昂贵又费时的“人源化”过程。

单链重组抗体(scFv)由通过设计的柔性肽链连接的抗体VL和VH结构域组成(Atwell等，1999)。与完整IgG相比，在有相当的抗原结合亲和力时，scFv具有体积更小和结构简单的优点，而且它们可以比类似的双链Fab片段更为稳定(Colcher等，1998；Adams和Schier，1999)。

来自重链和轻链(VH和VL)的可变区的长度均为约110个氨基酸。它们可以通过15个氨基酸的接头或更长的序列(例如，具有足够柔性而使两个结构域组装成有功能的抗原结合口袋的序列)连接。在具体实施方案中，加入不同的信号序列能使scFv被靶向到细胞内部的不同细胞器或者被分泌。加入轻链恒定区(Ck)允许经由二硫键发生二聚化，获得提高的稳定性和亲和力。因此，对单链Fv(scFv)SCA而言，尽管Fv片段的两个结构域由独立的基因编码，但已经证实可通过重组方法制造能使他们成为单一蛋白链scFv的人工接头(Bird等，1988；Huston等，1988)。此外，它们由于容易从噬菌体展示文库中分离且能够识别保守的抗原而经常被使用(综述参见Adams和Schier，1999)。因此，在本发明的一些方面中，抗体可为从噬菌体展示文库中分离的SCA，而不是如上所述的更为传统的生产技术所产生的。

B.治疗和预防方法

本发明的方法包括治疗由葡萄球菌病原体引起的疾病或病症，以及预防或减轻感染，以使病原体的感染程度被组织或尽可能小。可在被葡萄球菌感染的、疑似接触葡萄球菌的或有接触葡萄球菌风险的人中给予本发明的免疫原性多肽，以诱导免疫应答。此外，可施用对本发明免疫原性多肽或肽有特异性的抗体，以对被葡萄球菌感染的、疑似接触葡萄球菌的或有接触葡萄球菌风险的人进行被动免疫。可对葡萄球菌感染检测为阳性的或由于可能接触而被认为具有感染风险的个体使用方法。

本发明涉及的是，可在患者被诊断为患有葡萄球菌性疾病或病症、被诊断为患有葡萄球菌感染、被鉴定为有葡萄球菌感染或葡萄球菌性疾病或病症的症状、处于葡萄球菌感染的风险中、处于葡萄球菌性疾病或病症的风险中、或处于重症特别护理和/或住院后约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月之内施用本发明组合物。

可施用组合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次，和/或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、或1、2、3、4、5、6、7天、或1、2、3、4、5周、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或其中的任何范围或组合来施用所述组合物。

在一些实施方案中，在存在佐剂或载体而不存在或基本不存在其他葡萄球菌抗原和/或蛋白质的条件下实施治疗。此外，在一些实例中，治疗包括施用针对细菌感染所常用的其他制剂，如一种或更多抗生素。

使用肽进行疫苗接种一般需要将肽缀合至免疫原性载体蛋白，如乙肝表面抗原、匙孔槭血蓝蛋白或牛血清白蛋白。进行这种缀合的方法为本领域所熟知。

IV.疫苗和药物组合物

A.疫苗

本发明包括预防或减轻葡萄球菌感染的方法。本发明的实施方案包括预防或减轻葡萄球菌性肺炎。这样，本发明涉及在主动和被动免疫的实施方案中使用的疫苗。被认为适合用作疫苗的免疫原性组合物可非常容易地直接从以本文公开的方法制备的Hla肽或蛋白质中制备。优选地，将抗原性材料充分透析，以去除不需要的小分子量分子，和/或冻干以更容易配制成想要的剂型。本发明包括组合物，所述组合物可用于诱导针对来源于Hla肽或蛋白质之多肽或肽的免疫应答，从而预防葡萄球菌引发的感染及其引起的病症或疾病的发生。在某些方面中，将组合物配制成施用于粘膜表面的剂型，例如气雾剂剂型。

或者，对基于蛋白质/肽的疫苗而言其他可行且重要的选项包括引入编码抗原的核酸作为DNA疫苗。就这一点而言，近期的报导描述了构建重组痘苗病毒，并成功使用这些构建体免疫小鼠，以引发保护性免疫应答，所述重组痘苗病毒表达10个连续最小CTL表位(Thomson，1996)或者来自几种微生物的B细胞、CTL和TH表位的组合(An，1997)。因此，对成功利用肽、肽脉冲刺激APC和肽编码构建体在体内有效引发保护性免疫在文献中有充分的证据。美国专利5,958,895和5,620,896中示范了使用核酸序列作为疫苗。

包含多肽或肽序列作为活性成分的疫苗的制备一般为本领域所充分理解，如美国专利4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792和4,578,770所示例，所述专利都通过引用并入本文。这种疫苗通常以注射剂如液体溶液或悬浮液的形式制备；还可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。活性免疫原性成分通常与可药用并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐溶液、葡聚糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。此外，如有需要，疫苗可含有一定量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或者增强疫苗效力的佐剂。在具体实施方案中，用多种物质的组合来配制疫苗，如通过引用并入本文的美国专利6,793,923和6,733,754中所描述。

疫苗可常规地肠胃外、经粘膜、经鼻、通过吸入和/或注射(例如皮下注射或肌内注射)施用。适用于其他施用方式的附加制剂包括栓剂，在某些情况下为口服制剂。对于栓剂，传统粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇(polyalkaleneglycol)或甘油三脂；这些栓剂可由含有活性成分(范围为约0.5％到约10％，优选约1％到约2％)的混合物形成。口服制剂包含常用的赋形剂，例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物表现为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放剂或散剂的形式，包含约10％到约95％的活性成分，优选约25％到约70％。

多肽和编码多肽的DNA构建体可以中性或盐形式配制成疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由肽的游离氨基形成)和与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等)形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。

疫苗一般以与药剂剂型相匹配的方式、以能够有效治疗和产生免疫的用量来施用。施用量取决于受治疗的对象，包括个体免疫系统合成抗体的能力和所需要的保护程度。要施用的活性成分的精确剂量取决于医生的判断。但是，合适的剂量范围为每份疫苗中几百微克活性成分的级别。首次施用和加强注射的合适方案也是可变的，但一般为首次施用之后再后续接种或其他施用。

应用的方式可以是多种多样的。任何的常规疫苗施用方法都是可应用的。这些方法应包括通过生理学可接受的固体基质口服应用，或者作为生理学可接受的分散剂以肠胃外、经粘膜、经鼻、通过吸入、通过注射等施用。疫苗的剂量取决于给药途径，且根据受试者的体形和健康状况而变化。

在许多实例中，期望多次施用疫苗，通常不超过六次疫苗接种，更通常不超过四次疫苗接种，优选一次或多次，通常至少大概三次疫苗接种。疫苗接种一般间隔2到12周，更通常为间隔3到5周。间隔1-5年(通常为3年)的定期加强注射可满足保持保护性抗体水平的要求。在免疫接种过程之后，如例如美国专利3,791,932、4,174,384和3,949,064(通过引用并入本文)所述测定针对该抗原的抗体。

1.载体

给定组合物其免疫原性可能不同。因此通常必需增强宿主的免疫系统，这可通过将肽或多肽偶联到载体上来实现。示例性及优选的载体为匙孔槭血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。将多肽缀合到载体蛋白的方法为本领域所熟知，包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮联苯胺。

2.佐剂

可通过使用免疫应答的非特异性刺激剂(称为佐剂)来增强多肽或肽组合物的免疫原性。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，如细胞因子、毒素或合成组合物。

可使用许多佐剂来增强抗体针对Hla肽或蛋白的应答。佐剂可(1)滞留体内的抗原而引起其缓慢释放；(2)把涉及免疫应答的细胞吸引到施用部位；(3)诱导免疫系统细胞的增殖或活化；或(4)促进抗原在受试者整个身体的传播。

佐剂包括但不局限于水包油乳剂、油包水乳剂、矿物盐、多核苷酸和天然物质。可使用的具体佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝或其他铝化合物、MDP化合物(如thur-MDP和nor-MDP)、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。其他可使用的佐剂包括RIBI，它包含在2％角鲨烯/吐温80乳剂中的三种从细菌中提取的组分，MPL、海藻糖二分枝酸酯(trehalosedimycolate，TDM)和细胞壁骨架(cellwallskeleton，CWS)。还可使用MHC抗原。其他佐剂或方法示例于美国专利6,814,971、5,084,269、6,656,462，均通过引用并入本文。

对疫苗实现佐剂效应的多种方法包括使用制剂如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)，通常以磷酸盐缓冲液中约0.05％到约0.1％的溶液使用，与以约0.25％溶解的人造多聚糖混合，分别通过以约70℃到约101℃的温度热处理30秒到2分钟来聚集疫苗中的蛋白质。还可采用以下方法来产生佐剂效应：通过用胃蛋白酶处理的(Fab)白蛋白抗体的重激活进行聚集；与革兰氏阴性菌的细菌细胞(例如短小棒状杆菌(C.parvum))、外毒素或脂多糖成分的混合物；在生理学可接受的油介质(例如二缩甘露醇一油酸(AracelA))中的乳剂；或用作为模块代用品的20％全氟化碳乳剂。

例如，通常优选的佐剂包括弗氏完全佐剂(包含灭活的结核分枝杆菌的免疫应答非特异性刺激物)、弗氏不完全佐剂和氢氧化铝。

除了佐剂之外，还可能期望共施用生物应答调节剂(biologicresponsemodifier，BRM)来增强免疫应答。BRM已显示能够上调T细胞免疫或下调抑制细胞的活性。这些BRM包括但不局限于西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)、低剂量的环磷酰胺(CYP；300mg/m²)(Johnson/Mead，NJ)和细胞因子如γ-干扰素、IL-2或IL-12，或编码涉及免疫帮助功能的蛋白质(如B-7)的基因。

B.脂质组分和部分

在某些实施方案中，本发明涉及包含一种或多种与核酸或多肽/肽相关联的脂质的组合物。脂质是不溶于水而能用有机溶剂提取的物质。除本文具体描述那些以外的化合物为本领域技术人员理解为脂质，并包括在本发明组合物和方法中。脂质组分和非脂质可共价地或者非共价地互相附着。

脂质可以是天然脂质或人工脂质。但是，脂质通常为生物物质。生物脂质为本领域所熟知，包括例如中性脂肪、磷脂、甘油磷脂、类固醇、萜烯、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫脂、含有醚基和酯基连接的脂肪酸的脂质和多聚脂质，以及它们的组合。

与脂质相关联的核酸分子或多肽/肽可分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价键合、作为悬液包含于脂质中或以其他方式与脂质相关联。本发明的脂质或脂质-Hla关联组合物不局限于任何特定结构。例如，它们还可简单地分散于溶液中，可以形成大小或形状不一的聚集体。在另一实例中，它们可以双层结构存在(如胶束)或具有“塌陷”结构。在另一非限制性实例中，还涉及lipofectamine(GibcoBRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-痘病毒复合体。

在某些实施方案中，组合物可包含约1％、约2％、约3％、约4％约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或其间任何范围的特定脂质、脂质类型或非脂质成分，如佐剂、抗原、肽、多肽、糖、核酸或本文所公开的或为本领域技术人员所知的其他材料。在非限制性实例中，组合物可含有约10％到约20％的中性脂质、约33％到约34％的脑苷脂和约1％的胆固醇。在另一非限制性实例中，脂质体可包含约4％到约12％的萜烯(其中胶束中约1％具体为番茄红素，脂质体的其余约3％到约11％含有其他萜烯)、约10％到约35％的卵磷脂和约1％的非脂质成分。因此本发明涉及的是，本发明组合物可含有以任何组合或百分比范围的任何脂质、脂质类型或其他组分。

C.组合疗法

本发明的组合物和相关方法(特别是对患者/受试者施用Hla蛋白和/或抗Hla抗体)也可与施用传统疗法组合使用。这些疗法包括但不局限于施用抗生素，如链霉素、环丙沙星、强力霉素、庆大霉素、氯霉素、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑、氨苄青霉素、四环素、苯唑西林、万古霉素或多种抗生素的组合。此外，对患者/受试者施用Hla蛋白或抗Hla抗体也可与施用抗病毒剂(如RIP)组合使用。

在一方面，本发明涉及的是，多肽疫苗和/或疗法与抗菌和/或抗病毒治疗联合使用。或者，所述疗法可在其他制剂治疗之前或之后，间隔数分钟至数周。在分别施用其他制剂和/或蛋白质或多核苷酸的实施方案中，一般应确保每次递送之间的时间不会过长，以便本发明的制剂和组合物仍能对受试者发挥有利的组合疗效。在这些例子中，本发明涉及的是，可在约12-24小时之内(优选在约6-12小时之内)施用两种疗法。然而，在一些情况下，期望显著延长施用的时限，这时在各次施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可采用不同组合，例如抗生素疗法为“A”，分别作为免疫或被动免疫疗法一部分的给定免疫原性分子或抗体(如Hla抗体)为“B”：

A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B

B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A

B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A

对患者/或受试者施用本发明组合物应遵从施用这些化合物的一般方案，其中考虑Hla多肽或抗Hla抗体组合物的毒性(如果有的话)。预计可根据需要重复治疗周期。还涉及的是，多种标准疗法如水疗(hydration)可与所述疗法组合应用。

D.一般药物组合物

在一些实施方案中，对受试者施用药物组合物。本发明的不同方面包含向受试者施用有效量的组合物。在本发明的一些实施方案中，可对患者施用Hla多肽或肽，来保护其免受一种或多种葡萄球菌病原体的感染。在本发明的另一些实施方案中，可对患者施用针对Hla多肽或肽的特异性抗体，来治疗或预防一种或多种葡萄球菌病原菌的感染。或者，可将编码一种或多种这种多肽或肽的表达载体给予患者，作为预防性处理。此外，这些化合物可与抗生素和/或抗病毒剂组合施用。这些组合物一般可溶解或分散在药学上可接受的载体或含水介质中。

短语“药学上可接受的”或“药物上可接受的”是指，分子实体和组合物在施用于动物或人时不产生有害的、过敏的或其他不想要的反应。本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和制剂用于药物活性物质的用途为本领域所熟知。考虑在免疫原性和治疗性组合物中使用任何常规介质或制剂，除非其与活性成分不相容。还可将补充性活性成分(如抗病毒剂或抗感染剂)掺入组合物中。

除了配制成肠胃外施用的化合物(如用于静脉注射或肌内注射的那些)，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其他固体；缓释胶囊；以及目前所用的其他任何形式，包括吸入剂等。

可将本发明的活性化合物配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于静脉内、肌内、皮下甚至腹膜内途径的注射。根据本公开内容，含有本发明组合物的水性组合物的制备方法会为本领域技术人员所知。通常可将这些组合物制备成注射剂(液体溶液或悬液)；还可制备适于在注射前加入液体后制备成溶液或悬液的固体剂型；还可以将制剂乳化。

可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中，制备以游离碱或药学上可接受盐的形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散剂。在普通的储藏和使用条件下，这些制备物含有防止微生物生长的防腐剂。

适于注射使用的药物剂型包括无菌水溶液或分散系；包括芝麻油、花生油或水溶丙二醇的制剂；用于即时制备无菌注射溶液或分散系的无菌散剂。在所有情况下，剂型必须是无菌的，而且必须达到容易被注射的流动程度。它还应当在加工和储藏条件下是稳定的，而且应当免受微生物(如细菌和真菌)的污染作用。

可将蛋白性组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)和由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物以及植物油。可通过例如使用包衣(如卵磷脂)、通过维持所需的粒径(对于分散系的情况)以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，可优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现对注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的活性化合物掺入具有上面所列举的多种其他成分的合适溶剂中，来制备无菌注射液，其后根据需要进行过滤除菌。一般地，通过将多种无菌活性成分混合入无菌载体(含有基本分散介质和所需的其他上面所列举的成分)来制备分散系。对用于制备无菌注射液的无菌散剂而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，由预先经过滤除菌的溶液产生活性成分和所有其他所需成分的散剂。

本发明组合物的施用通常可以经由任何常见的途径。这包括但不局限于口服、鼻内或含服施用。或者，可通过正位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内、粘膜或静脉内注射来施用。在某些实施方案中，可吸入疫苗组合物(例如美国专利6,651,655，特别通过引用并入)。这些组合物通常作为药学上可接受的组合物(含有生理学上可接受的载体、缓冲剂或其他赋形剂)施用。药学上可接受的材料、组合物或介质可包括但不局限于涉及携带或运送化学制剂的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。

就水溶液的肠胃外施用而言，例如，必要时可适当地缓冲溶液，而且液体稀释剂应首先用足够的盐或葡萄糖进行等渗处理。这些特殊的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，根据本公开内容，可采用的无菌水介质可为本领域技术人员所知。例如，可将一剂药物溶于等渗NaCl溶液中，并且加入到皮下输液中或注射到建议的输注位点(参见例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，1990)。根据受试者的身体状况，必然会导致一些用量改变。无论如何，负责施用的人会决定个体受试者的合适剂量。

治疗或预防组合物的有效量基于预期目标来确定。术语“单位用药”或“剂量”是指适于用于受试者的物理分离的单位，每个单位包含为产生上面所讨论的与其施用(即适当途径和方案)相关的预期应答而计算得到的预定量组合物。所要施用的量(治疗次数和单位剂量)取决于预期得到的保护作用。

组合物的精确剂量也取决于医生的判断，且为每个个体所特有的。影响用药的因素包括受试者的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(减轻症状还是治愈)以及特定组合物的效价、稳定性和毒性。

制备后，会以与给药剂型相匹配的方式、以有效治疗或预防的剂量来施用溶液。可容易地以多种剂型(如上文所描述的注射液的类型)来施用制剂。

E.体外、离体或体内施用

本文所用的术语体外施用是指对从动物中取出的或在动物体外的细胞(包括但不局限于培养的细胞)进行操作。术语离体施用是指将已在体外进行了操作的细胞随后施用于活的动物。术语体内施用包括在动物体内进行的所有操作。

在本发明的某些方面中，可通过体外、离体或体内施用组合物。在某些体外实施方案中，通常将自体B淋巴细胞细胞系与本发明的病毒载体孵育24至48小时，或与Hla多肽孵育2小时。转导的细胞接着可用于体外分析，或用于离体施用。

通过引用并入本文的美国专利4,690,915和5,199,942公开了离体操作血液单核细胞和骨髓细胞用于治疗应用的方法。

V.实施例

给出以下实施例来阐明本发明的多种实施方案，并非以任何方式限制本发明。本领域技术人员很容易领会到，本发明非常适于完成目标并获得所提及的结果和优点，以及本文固有的那些目标、结果和优点。本文的实施例和本文所描述的方法是现有优选实施方案的代表，是示例性的，并非意图限制本发明的范围。本领域技术人员会想到其中的改变以及权利要求范围所定义的本发明精神所涵盖的其他用途。

实施例1

疫苗介导的针对金黄色葡萄球菌的保护

A.方法

细菌菌株和培养物。在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)或胰蛋白大豆琼脂培养基(TSA)中繁殖金黄色葡萄球菌Newman、LAC和MW2。为获得PVL转化噬菌体，用1μg/ml丝裂霉素C诱导φSa2mw在金黄色葡萄球菌MW2培养物中的裂解性复制。用0.22μm膜过滤溶菌产物，滤液用于在金黄色葡萄球菌RN4220上的噬菌斑形成(Bae等2006)。将噬菌体悬液与1ml菌株RN4220的对数中期培养物(生长于添加了5mMCaCl₂的心浸液肉汤(HIBCa5)中)混合，然后通过37℃过夜孵育来进行扩增。通过酚/氯仿提取法从扩增的噬菌体颗粒中纯化DNA。使用引物cctcctgttgatggaccact(SEQIDNO：3)和ggcgctgaggtagtcaaaag(SEQIDNO：4)，通过lukS-PVDNA的PCR扩增来检测φSa2mw。将φSa2mw噬菌体溶液与生长于HIBCa5中的菌株Newman的对数中期培养物混合，37℃振荡(150rpm)孵育过夜，然后涂板在TSA上。在TSA上繁殖菌落以除掉污染的噬菌体颗粒。在5mlTSB中37℃过夜培养φSa2mw溶素原，纯化染色体DNA，并扩增lukS-PVDNA。通过转导来自菌株ΦNΞ11568的bursaaurealis插入突变产生突变体NewmanφSa2mwhla::erm、Newmanhla::erm和LAChla::erm，然后通过PCR和DNA测序进行筛选以确定hla位点的破坏(Bae等2004)。在含有10μg/ml红霉素的TSA上维持转导子，除了LAChla::erm(在100μg/ml红霉素培养基上繁殖)。为进行回补研究，将葡萄球菌用质粒pOS1(载体)、phla或ppvl进行转化，并在含有10μg/ml氯霉素的TSA上进行培养。为了实现小鼠肺部感染，将细菌的过夜培养物以1∶100稀释到新鲜TSB中，并37℃旋转培养至OD₆₆₀为0.5。将50ml培养物等分试样中的葡萄球菌通过离心进行沉淀，用PBS洗涤，并用750μlPBS重悬以进行致死率研究(每30μl含3-4×10⁸CFU)、或用1250μlPBS重悬(每30μl含2×10⁸CFU)以进行细菌载荷和组织病理学实验。为进行细胞毒性研究，培养葡萄球菌菌株至OD₆₆₀0.5。将每份5ml培养基中的葡萄球菌通过离心进行沉淀，用PBS洗涤，并用10mlF12培养基(Gibco)重悬。

质粒。用引物gcgggatcccccctttcttgaattaaca(SEQIDNO：5)和gcggaattcacattaatttgtcatttcttc(SEQIDNO：6)，以金黄色葡萄球菌NewmanDNA作为模板对hla基因和启动子进行PCR扩增。用引物gcgggatccgtatatgatgaatcttaggca(SEQIDNO：7)和gcggaattctgtttagctcataggatttttttc(SEQIDNO：8)对pvl基因座和启动子进行PCR扩增。将PCR产物用BamHI和EcoRI消化，并克隆入pOS1的相应位点。

兔抗血清的制备。使用pOS1-Hla_H35L模板DNA和引物gccggatccgcagattctgatattaatattaaaacc(SEQIDNO：9)和gcggaattcacattaatttgtcatttcttc(SEQIDNO：10)产生编码成熟Hla_H35L的PCR产物。使用USA300基因组模板DNA及引物gccggatccgctcaacatatcacacctgtaagtgag(SEQIDNO：11)和gcggaattctgtttagctcataggatttttttc(SEQIDNO：12)(LukF-PV)以及gccggatccgataacaatattgagaatattggtgat(SEQIDNO：13)和gccgaattctcaattatgtcctttcactttaatttc(SEQIDNO：14)(LukS-PV)产生编码成熟LukS-PV和LukF-PV的PCR产物。将PCR产物用BamHI和EcoRI消化，并克隆入pGEX-6P-1(AmershamBiosciences)的相应位点，转化入大肠杆菌。通过亲和层析纯化GST-Hla_H35L、GST-LukF-PV和GST-LukS-PV融合蛋白。将纯化的蛋白质(0.5mg)用弗氏完全佐剂(CFA)或者弗氏不完全佐剂(IFA)乳化，并肩胛下(subscapularly)注射入雌性新西兰白兔进行初次免疫，接下来进行两次间隔为21天的加强免疫。

主动和被动免疫研究。对主动免疫，根据厂商说明书(AmershamBiosciences)对GST-Hla_H35L融合蛋白进行Precission蛋白酶切割。在通过TritonX-114提取去除了污染的内毒素之后，将Hla_H35L蛋白在CFA或IFA中乳化。4周大的C57Bl/6J小鼠(JacksonLaboratories)在第0天接受20μg在CFA中的Hla_H35L蛋白，之后在第10天用20μg在IFA中的Hla_H35L蛋白进行加强。然后在第21天用金黄色葡萄球菌对动物进行攻击。从在第0天免疫前和在第20天的动物中获得血清以评估特异性血清抗体的产生。

对被动免疫研究，在用金黄色葡萄球菌攻击之前24小时，7周大的C57Bl/6J小鼠通过腹膜下(IP)注射接受100μl正常兔血清(NRS，Sigma)或抗Hla兔抗血清。用LukF-PV和LukS-PV被动免疫的动物接受在总IP注射体积200μl中1∶1混合的每种特异性抗血清100μl。用于LukF/S-PV免疫研究的对照组动物接受200μlNRS。在在进行攻击时收集血清以评估特异性兔抗体效价。

小鼠感染模型。感染前在芝加哥大学动物中心饲养六周大的雌性C57Bl/6J小鼠(JacksonLaboratories)一周。用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉动物。证实已正确麻醉后，向左鼻孔中接种30μl葡萄球菌悬液。将动物接种后直立一分钟，然后以仰卧位放入笼中以利于恢复。向所有动物提供自由采食的食物和水，并继续观察72小时。一小部分动物常规性地死于接种后六小时内，很可能由于呼吸和麻醉的共同作用。这些动物不纳入后续分析中。

细菌载荷和组织病理学。按照芝加哥大学动物关怀和使用协会(UniversityofChicagoInstituteofAnimalCare和UseCommittee)指导方针，通过强制性二氧化碳吸入处死感染的动物，然后摘除双侧肺。将右肺置于1ml无菌PBS中并匀浆，之后在琼脂糖平板上进行连续稀释和菌落形成。为进行组织病理学研究，将左肺解剖并置于1％的甲醛中。将甲醛固定的组织进行包埋和切片，之后用苏木精和伊红染色，并于光学显微镜下观察。

ELISA。使用包被有1μg/ml重组Hla_H35L、LukF-PV或LukS-PV的NuncMaxiSorpImmuno平板进行小鼠血清抗体效价的分析。将血清稀释液在相应平板中孵育，并用HRP缀合的二抗和Opti-EIA(BDBiosciences)在TecanGENios分光光度计上显色。

蛋白质分析。将在TSB中培养的葡萄球菌培养物调整到相等的光密度，将培养物上清液中的蛋白质用三氯乙酸沉淀，用丙酮洗涤并溶解在上样缓冲液中。通过采用特异性抗血清(α-LukS-PV、α-LukF-PV或α-核酸酶)和具有加强化学发光检测的HRP缀合山羊抗兔二抗的免疫印记，来分析在15％SDS-PAGE上分离的蛋白质。从ToxinTechnology公司(Sarasota，FL)购买辣根过氧化物酶缀合的抗Hla抗体。

细胞毒性测定。在添加了10％胎牛血清和normocin(100μg/ml，InvivoGen，SanDiego，CA)的F12培养基中维持A549细胞。洗涤A549细胞，并在96孔板上将其以每孔1.5×10⁴个细胞的密度置于F12完全培养基中。用无添加物的F12培养基洗涤A549细胞一遍，之后每孔加入100μl葡萄球菌悬液。在加湿的37℃温箱中孵育4小时后，一式三份测定LDH活性(RocheAppliedScience，Mannheim，Germany)。为进行细胞损伤的显微镜评价，使用NikonEclipseTE2000U显微镜获取感染后3个小时的细胞图像。

细胞因子测定。将感染24小时后从实验动物收集的血清以1∶4的比例稀释，并使用BioplexMouse8-PlexAassay(Bio-Rad)测定细胞因子的含量。在带有Bio-Plex管理软件的Bio-Plex工作站上定量细胞因子的浓度。

统计学分析。使用Fisher精确检验进行死亡率研究的统计学显著性分析。使用双尾Studentt检验计算细菌回收研究和A549LDH释放的统计学显著性。

B.结果

葡萄球菌α-溶血素(Hla或α毒素)是细菌成孔β-桶毒素(Bhakdi和Tranum-Jensen，1991；Song等，1996)的初始成员。它的结构基因hla位于所有被检测到分泌293个残基的水溶单体的金黄色葡萄球菌菌株的染色体上(O′Reilly等，1990；O′Reilly等，1986)。Hla被认为与敏感性宿主细胞的表面载体结合，从而促进其自身寡聚成七聚体孔洞前体，并将具有2nm孔径的β-桶结构插入质膜(Gouaux等，1997)。Hla孔洞形成于淋巴细胞、巨噬细胞、肺泡上皮细胞、肺内皮细胞和红细胞，但是粒细胞和成纤维细胞表现出裂解抗性(Bhakdi和Tranum-Jensen，1991；McElroy等，1999)。向兔或大鼠肺部组织中滴入纯化的Hla引发了血管渗漏和肺动脉高血压，其原因在于释放了几种信号分子，如磷脂酰肌醇、一氧化氮、前列腺素类(PGE2、PGI2)和血栓烷A2(McElroy等，1999；Seeger等，1984；Seeger等，1990；Rose等，2002；Suttorp和Habben，1988)。与Hla的生物化学特性一致，消除金黄色葡萄球菌Newman中Hla表达的突变严重减弱了在鼠肺炎模型中的毒力(Bubeck-Wardenburg等，2007)。本文中，本发明人研究了以α-溶血素作为靶标开发针对金黄色葡萄球菌肺部感染之疫苗或免疫治疗的策略。

为检测在近期临床金黄色葡萄球菌分离群中hla是否作为一个毒力因子发挥功能，本发明人选择了社区型MRSA菌株LAC(LosAngelesClone，CDCcladeUSA300)(Voyich等，2006；Miller等，2005)。用hla::erm等位基因取代hla，完全消除了金黄色葡萄球菌LAC引起肺部感染的能力(图1A)。近期报道描述了分泌编码Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)之噬菌体的金黄色葡萄球菌分离群的出现(Miller等，2005；Chambers，2005；Vandenesch等，2003；Fridkin等，2005)。PVL是另一七聚体β-桶毒素，该毒素由两个插入选择性靶细胞膜的亚基(LukS-PV和LukF-PV)组成(Panton和Valentine，1932；Menestrina等，2001)。利用实验室菌株金黄色葡萄球菌RN6390及其PVL+衍生物，Labandeira-Rey和同事指出，PVL可能作为鼠肺炎发病过程中必要的毒力因子而发挥功能(Labandeira-Rey等，2007)。当在菌株RN6390中从多拷贝质粒上表达PVL时，观察到肺炎的显著动物致死率和组织病理学迹象(Labandeira-Rey等，2007)。与之相反，使用败血症和皮肤感染的鼠科动物模型，Voyich等发现PVL在葡萄球菌毒力中没有直接作用(Voyich等，2006)。在美国流行的CA-MRSA分离群的同基因lukS-PV和lukF-PV突变衍生物、菌株LAC(USA300)和MW2(USA400)，同样未显示PVL在嗜中性粒细胞裂解、溃疡形成、表皮坏死或败血病诱导死亡中发挥作用(Voyich等，2006)。

PVL及其对肺部感染发病机制的贡献。为测试在目前临床分离群中表达的PVL是否对肺部感染的发病机制有所贡献，在鼠肺炎模型中分析了金黄色葡萄球菌菌株LAC和MW2及其缺少PVL基因的同基因突变株。在对由野生型和同基因Δpvl突变体菌株引发的感染进行配对分析后发现，两者之间在患有金黄色葡萄球菌性肺炎的动物总体死亡率上无显著差异(图1B)。在两种CA-MRSA菌株的任一种中缺失lukS/F-PV(Δpvl)均不影响细菌在小鼠肺中的生长。来自感染动物的苏木精-伊红染色的切片样品显示了肺炎的病理学证据，其表现为免疫细胞浸润、肺泡结构缺失以及肺实质固结和细菌渗入；这些特征在用分泌或不分泌PVL的菌株感染的动物中无法区分(图1C)。

发明者考虑到，PVL对葡萄球菌性肺炎的贡献是否被在肺部感染发病机制中发挥重要作用的α-溶血素所掩盖。用噬菌体φSa2mw(从金黄色葡萄球菌MW2中分离)来产生金黄色葡萄球菌Newman的lukS/F-PV溶素原(Baba等，2002)(图3A)。将φSa2mw插入到金黄色葡萄球菌Newman染色体的1565379位核苷酸处，导致LukS-PV和LukF-PV的分泌(Kaneko等，1998)(图3B)。对C57B1/6J小鼠进行攻击之后，φSa2mw溶素原以相同效率在肺部组织中复制，这通过右肺匀浆组织中的菌落形成单位(CFU)来判断(图3C)。患由金黄色葡萄球菌Newman野生型或NewmanφSa2mw诱导的肺炎的小鼠的整体死亡率未观察到显著差异(图3D)，表明通过噬菌体溶原性而分泌的PVL未增加金黄色葡萄球菌在鼠肺部感染过程中的毒力。尽管存在PVL噬菌体，但hla的插入破坏导致金黄色葡萄球菌NewmanφSa2mw(hla::erm)对鼠肺部感染失去毒力(图3E).

用编码lukS/F-PV(ppvl)的质粒转化金黄色葡萄球菌Newman，促进了高水平的PVL表达(图4B)。然而，在用带有空载体或ppvl的金黄色葡萄球菌Newman进行的感染中，没有观察到实验动物的肺炎相关死亡率的改变(图4A)。相似地，PVL表达未改变感染动物肺部的金黄色葡萄球菌回收或者疾病的组织病理学迹象(数据未显示)。如以前所报道，金黄色葡萄球菌Newman(hla::erm)中hla表达的缺失使金黄色葡萄球菌在肺部感染模型中的毒力和致死性完全丧失(Bubeck-Wardenburg等，2007)，该缺陷不能为ppvl转化所回复。与之相反，使用促进Hla表达的质粒phla进行的转化导致毒力表型的完全和过度恢复，100％的动物在24小时的时间点时死于肺炎(图4A)。免疫印迹分析提供了在每一这些菌株中LukS-PV、LukF-PV和α-溶血素的存在水平，同时证明所示的遗传缺陷导致相应目的蛋白的缺失(图4B)。因此，Hla是在小鼠中建立葡萄球菌性肺部疾病的关键毒力因子，而非PVL。

Hla特异性免疫应答。为测试Hla特异性免疫应答是否影响葡萄球菌性肺炎的发病机制，通过使用磷酸盐缓冲液(PBS)或20μg纯化Hla_H35L的肌内注射来免疫小鼠，所述Hla_H35L为具有单个氨基酸替换的α-溶血素变体，可阻止孔洞而不影响毒素结合宿主靶细胞(Gouaux等，1997)。通过免疫获得平均Hla_H35L特异性抗体效价为1∶5601(±2789)。在金黄色葡萄球菌Nesman攻击后，在经Hla_H35L免疫的动物中观察到动物死亡率的显著下降(图5A)。这种下降与感染24小时后从肺部回收的金黄色葡萄球菌菌落形成单位减少相关(图5B)。被感染肺部组织的总体病理学分析显示，在经Hla_H35L免疫的动物中只有局灶性区域固结，与在模拟免疫的动物中的弥散性固结相反(图5C)。在α-溶血素免疫的动物中疾病的局灶性质在感染肺部组织的组织病理学切片中也很明显。在Hla_H35L免疫的动物中病变是不连续的，更重要的是，为肺部的正常区域所包围(图5D)。相反地，在模拟免疫的动物中肺泡腔的大部分被栓塞。为检验接种α-溶血素疫苗在由临床相关金黄色葡萄球菌分离群所致肺部感染发病机制中的作用，用金黄色葡萄球菌LAC或金黄色葡萄球菌MW2感染经Hla_H35L免疫的动物。尽管由这些菌株引起的绝对死亡率各不相同，但是用Hla_H35L免疫的所有组别的动物都获得了显著的死亡保护(图5E)。

本发明人认识到鼠肺部葡萄球菌感染与人不同的可能性。事实上，两种金黄色葡萄球菌噬菌体编码的蛋白质CHIPS和SCIN看来以物种特异性的方式调节人类免疫系统(Rooijakkers等，2005；Rooijakkers等，2006)。为阐明PVL在人类肺部组织损伤中的可能作用，本发明人分析了金黄色葡萄球菌临床分离群对人A549肺泡上皮细胞的细胞毒效应，所述A549细胞以前曾被用来检测纯化的葡萄球菌α-溶血素或B族链球菌β-溶血素对人肺部上皮的作用(Rooijakkers等，2005；Rooijakkers等，2006)(图6)。用金黄色葡萄球菌LAC和MW2感染后，A549细胞的损伤可容易地通过乳酸脱氢酶的释放来进行检测(图6A)。破坏pvl位点并未减弱任一这些分离群中金黄色葡萄球菌的细胞毒效应，这一发现与已报导的PVL对于粒细胞和单核细胞的特异性相一致(Woodin，1970；Meunier等，1995)。与之相反，缺乏α-溶血素的金黄色葡萄球菌Newman变体不能破坏A549细胞，该缺陷能通过phla进行回补，并可容易地通过感染细胞的显微镜检查来观察(图6B)。α-溶血素在直接肺泡细胞损伤中的重要作用提示，中和该毒素能阻止细胞损伤。向同时被金黄色葡萄球菌感染的A549细胞中加入Hla抗血清提供了防止毒素损伤的保护作用(图6C)，而对照组血清没有效果(图6C)。用纯化的Hla_H35L处理也能保护A549细胞，这与Hla_H35L占据肺细胞表面的α-溶血素结合位点的假说一致(图6C)。感染后4小时通过荧光显微术采集人A549细胞的活动/静止影像，评估未感染或与金黄色葡萄球菌Newman在培养基中共培养的A549细胞，所述培养基用磷酸盐缓冲液(PBS，1∶1000)、正常兔血清(NRS，1∶1000)、抗Hla兔血清(α-Hla，1∶1000)或纯化的Hla_H35L(10g/ml)进行了处理。还用转化有含有hla基因的载体或质粒(phla)的Newman同基因hla插入突变体hla::erm进行了感染。结果表明α-溶血素拮抗作用能够减少金黄色葡萄球菌对人肺泡表皮细胞的损伤。

α-溶血素特异性抗体可提供针对葡萄球菌性肺部疾病的保护。为了测试α-溶血素特异性抗体是否能够提供针对葡萄球菌性肺部疾病的保护，在用金黄色葡萄球菌Newman攻击前24小时，通过腹膜内注射用正常兔血清或抗Hla血清被动免疫实验动物[平均Hla_H35L特异性抗体效价1∶480(±179)](图7)。肺炎引发的死亡率检测显示了用抗Hla血清被动免疫的保护作用，对照血清则不然(图7A)。该保护作用与疾病的总体(图7C)和组织病理学(图7D)特征的改善相关。此外，观察到从抗Hla免疫的动物肺部回收的菌落形成单位显著减少(图7B)。不仅在用金黄色葡萄球菌Newman攻击的动物中，而且在用金黄色葡萄球菌LAC或MW2感染的动物中被动免疫保护都是有效的(图7E)。与之相反，用抗PVL血清[特异性抗体平均效价LukS-PV＝1∶894(±80)和LukF-PV＝1∶3689(±186)]进行的被动免疫对葡萄球菌性肺炎的结局没有影响(图7F)。

多种感染性或非感染性刺激诱发的肺炎会导致IL-1β分泌的增加，这不仅促进免疫细胞募集至感染位点，而且参与全身性炎性应答和急性肺损伤(Goodman等，2003)。在过量发生时，IL-1β分泌必定对宿主是有害的(Goodman等，2003)。肺部感染葡萄球菌的动物血清中的细胞因子谱揭示，使用抗Hla被动免疫导致血清IL-1β的显著减少(图8)。此外，经抗Hla免疫的动物释放促进先天免疫细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)吞噬并杀死葡萄球菌的细胞因子IFN-γ(图8)(Zhao等，1998)。

针对金黄色葡萄球菌α-溶血素产生的抗体能够对培养的人肺泡表皮细胞提供针对细胞裂解损伤的保护，并在鼠模型系统中提供对侵袭性疾病的保护能力，这提示，针对这种毒素的单克隆抗体可以是有效的治疗手段。为促成对该系列的研究，本发明人用重组Hla_H35L蛋白免疫小鼠，产生了一系列分泌抗Hla的骨髓瘤细胞。在基于ELISA的筛选中，有6个应答于Hla_H35L免疫而产生的杂交瘤细胞系检测为阳性；将其中两个扩大培养，并经证实能够功能性阻断Hla的活性(图9)。与之前的观察一致，在未免疫兔血清(NRS)存在下金黄色葡萄球菌与A549细胞的共培养并未产生细胞保护；与之相反，用兔抗Hla的共培养能提供针对裂解的保护。相似地，从克隆7B8.35和1A9.4F9中纯化的单克隆抗体提供了统计学显著程度的针对Hla诱导A549损伤的保护作用。与之相反，同种型对照小鼠抗体未提供保护。还通过A549细胞的LIVE-DEAD染色的显示出了这些结果，所述A549细胞是未感染的，或者用抗Hla单克隆抗体或其同种型匹配对照进行了处理。为检测这两种单克隆抗体所提供的相对保护，在LDH释放测定中对从2.5mg/ml到0.001mg/ml的一系列抗体浓度进行了保护A549细胞(与金黄色葡萄球菌Newman共培养)能力的评估(图10)。单克隆抗体1A9.4F9明显地提供了针对细胞损伤的保护，但该抗体产生的保护作用不如7B8.35单克隆抗体所提供的显著，可能提示这些单克隆抗体所识别的表位或其对α-溶血素的亲和能力不同。这些体外保护研究的结果表明，Hla特异性单克隆抗体可在金黄色葡萄球菌性肺炎的病程中在体内提供对Hla溶胞效应的保护。

为对此进行研究，本发明人检测了这些纯化的小鼠单克隆抗体对小鼠提供针对金黄色葡萄球菌性肺炎之保护的能力。每组15只小鼠在感染前24小时通过腹膜内途径接受总体积100μl中5mg/kg剂量的纯化单克隆抗体7B8.35(图11A)或1A9.4F9(图11B)。假处理小鼠接受100μlPBS。根据上文实验中所用的方案，用金黄色葡萄球菌Newman感染动物，并记录感染后72小时的死亡率。在该测定中，用每种单克隆抗体进行的被动免疫均提供了统计学显著程度的死亡保护，这与感染后动物的总体临床表现改善相关。相似地，7B8.35和1A9.4F9都能对动物提供针对USA300/LAC所引发的肺炎相关性死亡的保护，USA300/LAC是目前美国最流行的甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌分离群(图12)。与本发明人在A549测定中观察到的结果相一致，单克隆抗体7B8.35在保护实验动物方面比1A9.4F9更为有效，因为后者仅提供在感染后第24小时提供统计学显著程度的保护作用。以前的研究已经证明，USA300/LAC分离群在动物模型中有很高的毒力，它比Newman分离群分泌多得多的Hla，因此导致比用金黄色葡萄球菌Newman感染表现出更高的实验动物死亡率。结合上述体外和体内的数据，这两种小鼠单克隆抗体以Hla功能为靶标，来拮抗该毒素从而提供针对该疾病的保护。

由于单克隆抗体在体外肺部损伤细胞培养模型中表现出保护作用，并对动物提供针对金黄色葡萄球菌性肺炎的保护，因此本发明人有志于确定Hla分子中被抗体靶向的区域。本发明人考虑到，对这些表位的了解可有助于从结构角度理解可如何抑制该毒素，还可有益于未来对治疗性化合物、其他单克隆抗体的设计，还可为该毒素中可掺入主动免疫方法所用疫苗制剂的独立区域提供启示。单克隆抗体在体内阻断Hla活性可能有许多机制。第一，抗体可结合到蛋白质上遮掩真核受体结合位点的区域(这个目前尚不清楚)，因此阻止单体与宿主细胞的功能性相互作用。第二，抗体可通过削弱分子间相互作用的发生来阻止已结合单体在细胞表面装配成七聚体形式。第三，抗体可使装配的七聚体不能发生为将茎干插入真核脂双分子层并形成稳定孔洞所必需的构象变化。对Hla细致的生化和结构分析已提供了对宿主细胞结合、七聚体形成和细胞裂解有贡献之氨基酸残基的认识。因此，确定每种单克隆抗体的精确结合位点很可能会加深对拮抗毒素之机制的理解。此外，这种定位可最终指导将单克隆抗体的有效组合(其中每种抗体结合不同的表位)组装成被动免疫治疗剂。为了能够快速确定每种人源化单克隆抗体对Hla片段的表位特异性，制备了一系列七种谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白，其中每一个代表毒素中约50个氨基酸长度的重叠片段。

每种截短蛋白与前一个和后一个蛋白片段都有10个氨基酸重叠(图13)。用点印迹分析技术检测这些融合蛋白与7B8和1A9单克隆抗体的反应性。简单地说，将1μg每种融合蛋白点至硝酸纤维素膜上并晾干。为两种单克隆抗体分别准备一张膜。其后将膜封闭，并按照标准方案使用浓度0.2μg/ml的每种单克隆抗体分别进行Western印迹。洗涤印迹，并将其与二抗孵育，通过化学荧光显色技术检测与融合蛋白结合的单克隆抗体。有趣的是，7B8和1A9均不仅结合全长融合蛋白(Hla_H35L)，而且专门结合含有充分加工后之毒素中1-50位氨基酸的融合蛋白(HlaA1-K50)(图14)。7B8和1A9的同种型匹配对照抗体(分别为IgG2a和IgG2b)未表现出与任一融合蛋白结合，而针对毒素(α-Hla)所产生的多克隆兔血清识别所述蛋白质的每个片段以及单独的GST(兔抗血清针对全长GST-HlaH35L融合蛋白产生)。两个独立产生的保护性抗Hla单克隆抗体识别包含在成熟的已加工毒素的前50个氨基酸中的表位，这一发现强烈提示，这些抗体可具有通过阻止稳定七聚体孔洞的装配来破坏毒素功能的能力。

总之，采用Hla_H35L疫苗进行的主动免疫以及采用Hla特异抗体进行的被动免疫都在相关动物模型中产生了针对葡萄球菌肺部感染的显著保护。因此，针对α-溶血素(所有金黄色葡萄球菌菌株分泌的毒力因子)的抗体应该在人中也能够提供针对葡萄球菌性肺部疾病的保护作用。

参考文献

下面的文献明确地以引用方式并入本文，其程度为它们提供作为本文所述方法之补充的示例性方法或其他细节。

美国专利3,791,932

美国专利3,949,064

美国专利4,027,010

美国专利4,174,384

美国专利4,327,082

美国专利4,338,298

美国专利4,554,101

美国专利4,578,770

美国专利4,596,792

美国专利4,599,230

美国专利4,599,231

美国专利4,601,903

美国专利4,608,251

美国专利4,684,611

美国专利4,690,915

美国专利4,748,018

美国专利4,879,236

美国专利4,952,500

美国专利5,084,269

美国专利5,199,942

美国专利5,302,523

美国专利5,322,783

美国专利5,384,253

美国专利5,464,765

美国专利5,512,282

美国专利5,538,877

美国专利5,538,880

美国专利5,548,066

美国专利5,550,318

美国专利5,563,055

美国专利5,580,859

美国专利5,589,466

美国专利5,591,616

美国专利5,610,042

美国专利5,620,896

美国专利5,656,610

美国专利5,702,932

美国专利5,736,524

美国专利5,780,448

美国专利5,789,215

美国专利5,871,986

美国专利5,945,100

美国专利5,958,895

美国专利5,981,274

美国专利5,994,624

美国专利6,651,655

美国专利6,656,462

美国专利6,733,754

美国专利6,756,361

美国专利6,770,278

美国专利6,793,923

美国专利6,814,971

美国专利6,936,258

美国专利7,262,050

Adams和Schier，J.Immunol.Methods，231：249-260，1999.

Adlam等，Infect.Immun.，17(2)：250-6，1977.

An，J.Virol.，71(3)2292-2302，1997.

Anavi，M.Sc.thesisfromtheDepartmentofMolecularMicrobiologyandBiotechnologyoftheTel-AvivUniversity1998.

Atwell等，ProteinEng.，12：597-604，1999.

Baba等，Lancet.，359：1819-1827，2002.

Bae等，Mol.Microbiol.，62：1035-47，2006.

Bae等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：12312-12317，2004.

Barany和Merrifield，In：ThePeptides，Gross和Meienhofer(Eds.)，AcademicPress，NY，1-284，1979.

Bhakdi和Tranum-Jensen，Microbiol.Rev.，55：733-751，1991.

Bhakdi等，BehringInst.Mitt.，95)：80-4，1994.

Bird等，Science，242：423-426，1988.

Borrebaeck，In：AntibodyEngineering--APracticalGuide，W.H.Freeman和Co.，1992.

Bruggermann，等，Immunol.，7：33，1993.

Bubeck-Wardenburg和Schneewind，JExpMed；205(2)；287-294，2008.

Bubeck-Wardenburg等，NatureMedicine，13(12)：1405-1406，2007.

Bubeck-Wardenburg等，Infect.Immun.，74：1040-1044，2007.

Burke等，J.Inf.Dis.，170：1110-1119，1994.

Chambers，N.Engl.J.Med.，352：1485-1487，2005.

Chen和Okayama，Mol.CellBiol.，7(8)：2745-2752，1987.

Chou和Fasman，Adv.Enzymol.，47：45-148，1978a.

Chou和Fasman，Annu.Rev.Biochem.，47：251-276，1978b.

Chou和Fasman，Biochemistry，13(2)：211-222，1974a.

Chou和Fasman，Biochemistry，13(2)：222-245，1974b.

Chou和Fasman，Biophys.J.，26(3)：385-399，1979.

Colcher等，J.Nucl.Med.，42：225-241，1998.

Devereux等，Nucl.AcidRes.，12(1)：387-395，1984.

EP0120694

EP0125023

EP-A-0171496

EP-A-0173494

EP-A-0239400

EpitopeMappingProtocols，1996

Fechheimer，等，ProcNatl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987.

Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979.

Fridkin等，N.Engl.J.Med.，352：1436-1444，2005.

Goodman等，CytokineGrowthFactorRev.，14：523-535，2003.

Gopal，Mol.CellBiol，5：1188-1190，1985.

Gouaux等，ProteinSci.，6：2631-2635，1997.

Graham和VanDerEb，Virology，52：456-467，1973.

Harland和Weintraub，J.CellBiol.，101(3)：1094-1099，1985.

Harlow和Lane，In：Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988.

Huston等，Biochemistry，27(25)：8945-8952，1988.

Huston等，In：MethodsinEnzymology，Langone(Ed.)，AcademicPress，NY，203：46-88，1991.

Jakobovits等，Nature，362：255-8，1993.

Jakobovits，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-5，1993.

Johnson等，MethodsinEnzymol.，203：88-99，1991.

Johnstone等，In：ImmunochemistryinPractice，BlackwellScientificPublications，Oxford，1982.

Jones等，Nature，321：522-525，1986.

Kaeppler等，PlantCellReports，9：415-418，1990.

Kaneda等，Science，243：375-378，1989.

Kaneko等，Gene，215：57-67，1998.

Kato等，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991.

Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157(1)：105-132，1982.

Labandeira-Rey等，Science，315：1130-1133，2007.

Lindsay等，J.Bacteriol.，188：669-676，2006.

McElroy等，Infect.Immun.，67：5541-5544，1999.

Menestrina等，Toxicon.，39：1661-1672，2001.

Menzies和Kernodle，Infect.Immun.，64(5)：1839-41，1996.

Mernaugh等，In：MolecularMethodsinPlantPathology，Singh等，(Eds.)，CRCPressInc.，BocaRaton，FL，359-365，1995.

Merrifield，Science，232(4748)：341-347，1986.

Meunier等，Cytometry21：241-247，1995.

Miller等，N.Engl.J.Med.，352：1445-53，2005.

Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443，1970.

Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982.

Nicolau等，MethodsEnzymol.，149：157-176，1987.

Omirulleh等，PlantMol.Biol.，21(3)：415-428，1993.

O′Reilly等，Microb.Pathog.，1：125-138，1986.

O′Reilly等，Mol.Microbiol.，4：1947-1955，1990.

Panton和Valentine，Lancet，222：506-508，1932.

PCTAppln.WO86/01533

PCTAppln.WO94/09699

PCTAppln.WO95/06128

Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(8)：2444-2448，1988.

Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199：183-188，1985.

Remington′sPharmaceuticalSciences，18thEd.MackPrintingCompany，pp.1289-1329，1990.

Riechmann等，Nature，332(6162)：323-327，1988.

Rippe，等，Mol.CellBiol.，10：689-695，1990.

Rooijakkers等，Cell.Microbiol.，8：1282-1293，2006.

Rooijakkers等，Nat.Immunol.，6，920-927，2005.

Rose等，Am.J.Physiol.LungCellMol.Physiol.，282：L207-L214，2002.

Seeger等，J.Clin.Invest.，74，849-858，1984.

Seeger等，Lab.Invest.，63：341-349，1990.

Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482，1981.

Song等，Science，274：1859-1866，1996.

Stewart和Young，In：SolidPhasePeptideSynthesis，2d.ed.，PierceChemicalCo.，1984.

Suttorp和Habben，Infect.Immun.，56：2228-34，1988.

Tam等，J.Am.Chem.Soc.，105：6442，1983.

Thomson，J.Immunol.157822-61996)

Tigges等，J.Immunol.，156(10)：3901-3910，1996.

Vandenesch等，Emerg.Infect.Dis.，9：978-984，2003.

Verhoeyen等，Science，239(4847)：1534-1536，1988.

Voyich等，J.Infect.Dis.，194：1761-1770，2006.

Walker和Bailey，JBC，270：23065-23071，1995.

Wong等，Gene，10：87-94，1980.

WoodinIn：MicrobialToxins，Montje等，(Eds.)，327，AcademicPressInc.，NY，1970.

Zhao等，Immunology，93：80-85，1998.

序列表

<110>BUBEK-WARDENBURG，JULIANE

SCHNEEWIND，OLAF

<120>与针对葡萄球菌性肺部疾病和病症进行免疫相关的方法和组合物

<130>ARCD：458WO

<140>未知

<141>2008-08-29

<150>60/969,514

<151>2007-08-31

<160>14

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>321

<212>PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>1

MetLysThrArgIleValSerSerValThrThrThrLeuLeuLeuGly

151015

SerIleLeuMetAsnProValAlaAsnAlaAlaAspSerAspIleAsn

202530

IleLysThrGlyThrThrAspIleGlySerAsnThrThrValLysThr

354045

GlyAspLeuValThrTyrAspLysGluAsnGlyMetHisLysLysVal

505560

PheTyrSerPheIleAspAspLysAsnHisAsnLysLysLeuLeuVal

65707580

IleArgThrLysGlyThrIleAlaGlyGlnTyrArgValTyrSerGlu

859095

GluGlyAlaAsnLysSerGlyLeuAlaTrpProSerAlaPheLysVal

100105110

GlnLeuGlnLeuProAspAsnGluValAlaGlnIleSerAspTyrTyr

115120125

ProArgAsnSerIleAspThrLysGluTyrMetSerThrLeuThrTyr

130135140

GlyPheAsnGlyAsnValThrGlyAspAspThrGlyLysIleGlyGly

145150155160

LeuIleGlyAlaAsnValSerIleGlyHisThrLeuLysTyrValGln

165170175

ProAspPheLysThrIleLeuGluSerProThrAspLysLysValGly

180185190

TrpLysValIlePheAsnAsnMetValAsnGlnAsnTrpGlyProTyr

195200205

AspArgAspSerTrpAsnProValTyrGlyAsnGlnLeuPheMetLys

210215220

ThrArgAsnGlySerMetLysAlaAlaGluAspAsnPheLeuAspPro

225230235240

AsnLysAlaSerSerLeuLeuSerSerGlyPheSerProAspPheAla

245250255

ThrValIleThrMetAspArgLysAlaSerLysGlnGlnThrAsnIle

260265270

AspValIleTyrGluArgValArgAspAspTyrGlnLeuHisTrpThr

275280285

SerThrAsnTrpLysGlyThrAsnThrLysAspLysTrpIleThrAsp

290295300

ArgSerSerGluArgTyrLysIleAspTrpGluLysGluGluMetThr

305310315320

Asn

<210>2

<211>295

<212>PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>2

AlaAspSerAspIleAsnIleLysThrGlyThrThrAspIleGlySer

151015

AsnThrThrValLysThrGlyAspLeuValThrTyrAspLysGluAsn

202530

GlyMetHisLysLysValPheTyrSerPheIleAspAspLysAsnHis

354045

AsnLysLysLeuLeuValIleArgThrLysGlyThrIleAlaGlyGln

505560

TyrArgValTyrSerGluGluGlyAlaAsnLysSerGlyLeuAlaTrp

65707580

ProSerAlaPheLysValGlnLeuGlnLeuProAspAsnGluValAla

859095

GlnIleSerAspTyrTyrProArgAsnSerIleAspThrLysGluTyr

100105110

MetSerThrLeuThrTyrGlyPheAsnGlyAsnValThrGlyAspAsp

115120125

ThrGlyLysIleGlyGlyLeuIleGlyAlaAsnValSerIleGlyHis

130135140

ThrLeuLysTyrValGlnProAspPheLysThrIleLeuGluSerPro

145150155160

ThrAspLysLysValGlyTrpLysValIlePheAsnAsnMetValAsn

165170175

GlnAsnTrpGlyProTyrAspArgAspSerTrpAsnProValTyrGly

180185190

AsnGlnLeuPheMetLysThrArgAsnGlySerMetLysAlaAlaGlu

195200205

AspAsnPheLeuAspProAsnLysAlaSerSerLeuLeuSerSerGly

210215220

PheSerProAspPheAlaThrValIleThrMetAspArgLysAlaSer

225230235240

LysGlnGlnThrAsnIleAspValIleTyrGluArgValArgAspAsp

245250255

TyrGlnLeuHisTrpThrSerThrAsnTrpLysGlyThrAsnThrLys

260265270

AspLysTrpIleThrAspArgSerSerGluArgTyrLysIleAspTrp

275280285

GluLysGluGluMetThrAsn

290295

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>3

cctcctgttgatggaccact20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>4

ggcgctgaggtagtcaaaag20

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>5

gcgggatcccccctttcttgaattaaca28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>6

gcggaattcacattaatttgtcatttcttc30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>7

gcgggatccgtatatgatgaatcttaggca30

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>8

gcggaattctgtttagctcataggatttttttc33

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>9

gccggatccgcagattctgatattaatattaaaacc36

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>10

gcggaattcacattaatttgtcatttcttc30

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>11

gccggatccgctcaacatatcacacctgtaagtgag36

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>12

gcggaattctgtttagctcataggatttttttc33

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>13

gccggatccgataacaatattgagaatattggtgat36

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>14

gccgaattctcaattatgtcctttcactttaatttc36

Claims (76)

1.有效量的含有纯化的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素的组合物在制备为患者提供针对金黄色葡萄球菌性肺部疾病或病症之保护的药物中的用途，其中所述Hla毒素在对应于第35位氨基酸的位置具有氨基酸替换，包含SEQIDNO：2的第1-50位氨基酸，并且是所述组合物中唯一的有效抗原。

2.权利要求1的用途，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症的风险。

3.权利要求2的用途，其中所述患者已住院或即将住院。

4.权利要求2的用途，其中所述患者将进行手术和/或将被麻醉。

5.权利要求1的用途，还包括鉴定有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症之风险的患者。

6.权利要求1的用途，其中所述减毒Hla毒素缺乏可检测的溶血活性。

7.权利要求1的用途，其中所述减毒Hla毒素缺乏可检测的致死活性。

8.权利要求1的用途，其中所述Hla毒素在35位氨基酸处具有用于替代组氨酸的亮氨酸。

9.权利要求1的用途，其中所述Hla毒素基本未变性。

10.权利要求1的用途，其中所述Hla毒素是或分离的。

11.权利要求1的用途，其中所述Hla毒素包含成熟Hla毒素中的至少1-50位氨基酸。

12.权利要求1的用途，还包括对所述患者测试针对Hla毒素的抗体。

13.权利要求1的用途，其中对所述患者多次施用所述组合物。

14.权利要求1的用途，其中所述组合物还包含至少一种佐剂。

15.权利要求14的用途，其中所述佐剂与所述Hla毒素缀合。

16.权利要求1的用途，其中所述组合物经粘膜或肌内施用。

17.权利要求1的用途，其中所述组合物经鼻内施用或被吸入。

18.权利要求1的用途，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病症为肺炎。

19.有效量的含有重组和减毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素的组合物在制备用于在患者中预防金黄色葡萄球菌性肺部疾病或病症的药物中的用途，其中所述组合物不引发针对任何其他葡萄球菌抗原的可检测免疫应答，其中Hla是所述组合物中唯一的有效抗原。

20.权利要求19的用途，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症的风险。

21.权利要求20的用途，其中所述患者已住院或即将住院。

22.权利要求20的用途，其中所述患者将进行手术和/或将被麻醉。

23.权利要求19的用途，还包括鉴定有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症之风险的患者。

24.权利要求19的用途，其中所述减毒Hla毒素缺乏可检测的溶血活性。

25.权利要求19的用途，其中所述减毒Hla毒素缺乏可检测的致死活性。

26.权利要求19的用途，其中所述Hla毒素在35位氨基酸处具有用于替代组氨酸的亮氨酸。

27.权利要求19的用途，其中所述Hla毒素包含成熟Hla毒素中的至少1-50位氨基酸。

28.权利要求19的用途，其中所述Hla毒素基本未变性。

29.权利要求19的用途，其中所述Hla毒素是纯化的或分离的。

30.权利要求19的用途，其中对所述患者多次施用所述组合物。

31.权利要求19的用途，其中所述组合物还包含至少一种佐剂。

32.权利要求31的用途，其中所述佐剂与所述Hla毒素缀合。

33.权利要求19的用途，还包括对所述患者检测针对Hla毒素的抗体。

34.权利要求19的用途，其中所述组合物经粘膜或肌内施用。

35.权利要求19的用途，其中所述组合物经鼻内施用或被吸入。

36.权利要求19的用途，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病症为肺炎。

37.有效量的由重组和减毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素组成的组合物在制备为患者提供针对金黄色葡萄球菌性肺部疾病或病症之保护的药物中的用途。

38.权利要求37的用途，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症的风险。

39.权利要求38的用途，其中所述患者已住院或即将住院。

40.权利要求38的用途，其中所述患者将进行手术和/或将被麻醉。

41.权利要求37的用途，还包括鉴定具有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症之风险的患者。

42.权利要求37的用途，其中所述减毒Hla毒素缺乏可检测的溶血活性。

43.权利要求37的用途，其中所述减毒Hla毒素缺乏可检测的致死活性。

44.权利要求37的用途，其中所述Hla毒素在35位氨基酸处具有用于替代组氨酸的亮氨酸。

45.权利要求37的用途，其中所述Hla毒素包含成熟Hla毒素中的至少1-50位氨基酸。

46.权利要求37的用途，其中所述Hla毒素是基本未变性。

47.权利要求37的用途，其中所述Hla毒素为纯化的或分离的。

48.权利要求37的用途，还包括对所述患者检测针对Hla毒素的抗体。

49.权利要求37的用途，其中对所述患者多次施用所述组合物。

50.权利要求37的用途，其中所述组合物还包含至少一种佐剂。

51.权利要求50的用途，其中所述佐剂与所述Hla毒素缀合。

52.权利要求37的用途，其中所述组合物经粘膜或肌内施用。

53.权利要求37的用途，其中所述组合物经鼻内施用或被吸入。

54.权利要求37的用途，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病症为肺炎。

55.有效量的包含对金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)有免疫反应性之抗体的组合物在制备为患者提供针对金黄色葡萄球菌性肺部疾病或病症之保护的药物中的用途，其中特别排除了其他葡萄球菌抗体。

56.权利要求55的用途，其中所述抗体为人源化抗体。

57.权利要求55的用途，其中所述抗体为人抗体。

58.权利要求55的用途，其中所述抗体为单克隆抗体或为抗体的免疫性部分。

59.权利要求55的用途，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症的风险。

60.权利要求59的用途，其中所述患者已住院或即将住院。

61.权利要求59的用途，其中所述患者将进行手术和/或将被麻醉。

62.权利要求55的用途，其中所述患者有葡萄球菌性肺部疾病或病症的症状，或已被诊断为患有葡萄球菌性肺部疾病或病症。

63.权利要求62的用途，还包括对患者施用用于治疗金黄色葡萄球菌肺部感染的抗生素。

64.权利要求55的用途，还包括鉴定有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病症之风险的患者。

65.权利要求55的用途，其中所述组合物经静脉内施用。

66.权利要求55的用途，其中对所述患者多次施用所述组合物。

67.权利要求55的用途，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病症为肺炎。

68.含有分离多肽的免疫原性组合物，所述分离多肽包含SEQIDNO：2的1-50位氨基酸，其中所述多肽在对应于SEQIDNO：2第35位氨基酸的位置具有氨基酸替换，并且所述组合物不引发针对任何其他葡萄球菌抗原的可检测免疫应答。

69.权利要求68的组合物，其中所述分离多肽包含SEQIDNO：2的至少1-40位氨基酸并包含SEQIDNO：2的至多1-50位氨基酸。

70.权利要求69的组合物，其中所述分离多肽为融合蛋白。

71.权利要求68的组合物，还含有佐剂。

72.权利要求68的组合物，其中所述分离多肽为融合蛋白。

73.权利要求68的组合物，其中所述分离多肽为脂多肽。

74.权利要求68的组合物，其中所述组合物包含于药学上可接受的制剂中。

75.权利要求68的组合物，其由包含SEQIDNO：2的1-50位氨基酸的分离的多肽组成。

76.权利要求74的组合物，其中所述组合物处于气雾剂制剂中。