KR20150047640A - 스타필로코커스 폐 질환 및 상태에 대한 면역화와 관련된 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 양태는 에스.아우레우스(S. aureus) 폐렴에 대한 면역보호를 제공하기 위해 Hla를 중화시킬 수 있는 백신접종 전략에 유용한 방법 및 조성물을 포함한다. 특정 관점에서, 본 발명은 히스티딘 35가 류신으로 변환된 Hla의 재조합 돌연변이 형태(HlaH35L)로 표기되는, 독성이 감소된 Hla를 포함하고, 이는 독소의 생산적 조립을 없애고 스타필로코커스 폐렴으로부터 피검체를 보호하는데 사용될 수 있다.

Description

스타필로코커스 폐 질환 및 상태에 대한 면역화와 관련된 방법 및 조성물{Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions}

본 출원은 전문이 참고인용되는 2007년 8월 31일에 출원된 미국 임시 출원 일련번호 60/969,514를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 미국국립보건원이 수여한 AI38897 및 AI52474 하에, 미 국립아동보건 및 인간발육연구소가 수여한 HD00850 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리가 있다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 면역학, 미생물학, 감염 질환 및 의약 분야에 관한 것이다. 더 상세한 양태로, 본 발명은 세균에 대한 면역 반응을 수득하기 위해 외독소 단백질, 예컨대 α-헤모리신을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

에스.아우레우스(S. aureus) 폐렴을 치료하는 현행 방법은 내성을 획득하는 성향이 뛰어난 유기체에 대한 항미생물성 약물에 의존적이다. 스타필로코커스 감염의 발병기전은 분비된 외독소와 같은 많은 다른 독성 인자에 의존적이다. 종래 연구들은 상기 인자를 암호화하는 단일 유전자를 결실시키면 어떠한 결함도 일어나지 않거나 단지 독성의 적당한 감소를 초래한다는 것을 밝힌 바 있다. 하지만, 본 발명자들이 수행한 쥐 모델 시스템에서의 에스.아우레우스 폐렴 연구는 알파 독소라고도 알려진 α-헤모리신을, 이 외독소가 결여된 돌연변이 균주가 무독성이었는 바, 이 질환의 발병기전의 중요한 독성 인자로 예상치않게 밝혀냈다. 알파-헤모리신은 에스.아우레우스에 의해 분비되는 세균 세포독소 패밀리의 한 일원이고, 다수의 진핵생물 세포의 세포막에 삽입될 수 있다. 이 단백질은 단량체로 분비되지만, 진핵생물 세포의 표면에서 7량체성 고리 구조로 조립된다. 조립된 독소는 숙주 세포막에 삽입하여, 막 무결성을 파괴하여 세포 손상 및 사멸에 기여하는 기공을 형성한다. 몇몇 생화학 연구는 숙주 세포에 대한 결합, 7량체 형성 및 숙주 세포 용해를 촉진하는 α-헤모리신 단량체 내의 아미노산 잔기를 밝혀냈다.

스타필로코커스 백신의 개발에 방해가 되는 것은, 스타필로코커스 침입 전략의 다면성이다. 약독화된 살아있는 미생물은 피검체의 면역계에 다수의 항원을 제공하는 매우 효과적인 백신이라는 것은 분명하게 증명되어 있다. 이러한 백신에 의해 유도된 면역반응은 종종 비복제성 또는 다성분 면역원에 의해 생긴 면역반응보다 등급이 높고 지속 기간도 길다. 이에 대한 1가지 설명은 약독화된 살아있는 균주가 숙주에 제한된 감염을 수립하여 자연 감염의 초기 단계를 모방하는 것 외에 면역계에 다수의 항원을 제공하기 때문일 수 있다.

많은 참고문헌들은 백신에 α-헤모리신(Hla) 성분을 첨가하는 것에 대해 설명하고 있고, 상기 참고문헌들 중 일부는 화학적 또는 열에 의해 약독화된 Hla 톡소이드에 대해 설명하고 있다. 그 예로, 미국 특허 4,327,082를 참조한다. 다른 참조문헌들은 다성분 톡소이드 백신에 의한 사람의 면역화 및 수동 면역화에 사용하기 위한 Hla 중화 항체의 분리를 설명하고 있다. 예컨대, 미국 특허 4,027,010을 참조한다. 애들램(Adlam) 등(1977)은 유방 감염에 대해 방어하는 정제된 Hla의 효과를 검사했다. 애들램 등은 유방염의 "청색 유방형(blue breast form)"의 감소를 관찰했지만, 스타필로코커스 질환의 국소 만성 농양에 대한 예방법은 찾아내지 못했다. 애들램 등은 이러한 관찰이 스타필로코커스 감염의 국소 만성 농양 형태와 같은 다인자성 질환 상태에 대한 Hla 단독의 방어 능력의 부족 때문이라고 생각한다.

바크디(Bhakdi) 등(1994)은 잔기 35에 돌연변이가 있는 Hla의 감소된 독성을 기술했고, 토끼의 사망없이 토끼에 상기 돌연변이체의 투여에 대해 설명하고 있다. 멘지스(Menzies) 및 커노들(Kernodle)(1996)은 Hla의 유사한 H35L 돌연변이체 및 이를 토끼에서 항체 생산에 사용하는 용도에 대해 설명하고 있으며, 이 항체는 이후에 정제하여 수동 면역 실험에 사용할 수 있다. 멘지스 및 커노들은 또한 단일 성분 백신을 사용한 방어의 어려움과 예상된 실패를 설명하며, "병원체로서 에스.아우레우스의 엄청난 다양성과 이것이 생산하는 다수의 독성 인자가, 알파 독소와 같은 단일 면역학적 표적이 백신 후보로서 효과적일 수 없게 한다"라고 설명하고 있다. 본 발명자들은 상기 참조문헌들 중 어떠한 것도 스타필로코커스 폐렴에 대해 보호하거나 치료하는 임의의 조성물의 효과를 다룬 것은 없음을 알았다.

당해 기술 상태는 당업자가 스타필로코커스 감염, 특히 스타필로코커스 호흡기 감염의 간접 효과에 대해 보호하기 위한 효과적인 항원으로서 재조합 Hla를 단독으로 또는 거의 단독으로 고려할 수 없을 정도이다. 즉, 당업자는 다른 스타필로코커스 항원(들)의 부재 또는 실질적인 부재 하에 주요 백신 성분으로 투여되어, 호흡기 감염 또는 스타필로코커스 관련 폐렴으로부터 피검체를 보호하거나 그 감염이나 폐렴을 보유한 피검체를 치료하기에 충분한 면역 반응을 유발하는 Hla는 전혀 예상치 못했을 것이다.

이에, 당업계에서 여전히 필요로 하는 것은 폐의 스타필로코커스 감염을 예방 및/또는 치료하고, 뿐만 아니라 그러한 감염의 부차적인 효과를 약화 또는 개선시키기 위한 추가 조성물 및 방법이다.

발명의 요약

본 발명은 사람 스타필로코커스 폐렴의 동물 모델에 대한 스타필로코커스 아우레우스 유래의 약독화된 α-헤모리신(Hla)의 투여가 치사율로부터 동물을 보호하고, 동물 폐에서 회수할 수 있는 세균 수를 감소시키며, 감염의 국소 부위에 병리학적 병변을 제한한다는 것을 보여주는 데이터를 기반으로 한다. 더욱이, 본 발명은 스타필로코커스 폐렴에 대한 보호 효과를 부여하기 위해, 토끼에서 α-헤모리신(α 독소라고도 알려져 있다)에 대해 발생된 항체가 마우스에게 투여될 수 있음을 보여주는 데이터를 기반으로 한다. 따라서, 본 발명은 스타필로코커스 단백질 및 항체가 특별히 배제되는 단독요법으로서 Hla 독소를 이용하여 피검체의 스타필로코커스 폐렴에 대한 능동 면역화를 위한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 α-헤모리신에 특이적인 항체의 수동 면역화를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

특정 양태는 서열번호 2의 적어도 또는 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대 이 사이의 모든 값 및 범위를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 함유하는 면역원성 조성물을 포함한다. 특정 관점에서, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호 2의 적어도, 최대 또는 약 아미노산 1번 내지 50번을 포함한다. 또 다른 관점에서, 분리된 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 조성물은 보강제 (adjuvant)를 포함할 수 있다. 특정 관점에서, 분리된 폴리펩타이드는 융합 단백질 및/또는 리포펩타이드이다.

본 발명의 일부 양태에 따르면, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태(예, 스타필로코커스 감염에서 초래되는 질환 또는 스타필로코커스 감염이 제1 질환 또는 상태의 후유증인 질환을 비롯한 스타필로코커스 세균의 존재와 관련된 상태의 질환)으로부터 환자를 보호하는 방법으로, 재조합 약독화된 스타필로코커스 α-헤모리신(Hla) 독소를 포함하고 임의의 다른 스타필로코커스 단백질을 오염량 이하로 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 오염량은 Hla 전부 또는 분절을 포함하는 펩타이드 외에 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 10, 5, 1, 0.1, 0.05중량% 이하 또는 그 이하의 중량%를 의미한다.

본 발명의 상황에서, "환자를 보호하는"이란 어구는 사람 환자에서 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태를 예방, 치료, 그 중증도를 감소 및/또는 개선시키는 것을 의미한다. 별다른 표시가 없는 한, 또한 상기 질환 또는 상태로 인한 사망을 예방 또는 지연시키고, 폐로부터 회수할 수 있는 스타필로코커스 세균의 수를 감소시키며, 병리학적 병변을 병소 부위로 제한하며, 상기 질환 또는 상태로부터 손상의 정도를 감소시키며, 상기 질환 또는 상태의 기간을 감소시키고, 및/또는 상기 질환 또는 상태와 관련된 증상의 수, 정도 또는 기간을 감소시키는 것을 의미한다. 사람 환자의 상황에서 실행되는 본 발명의 양태는 또한 임의의 포유동물 피검체와 관련해서 실행될 수 있다. 다른 관점에서, 본 방법은 스타필로코커스 세균에 대한 면역반응을 유도하는 것에 관한 것일 수 있다. 또 다른 관점에서, 환자는 스타필로코커스 세균과 관련된 폐 질환이 있거나 폐 질환의 발생 위험이 있다.

본 발명의 다른 양태는 재조합 약독화된 스타필로코커스 α-헤모리신(Hla) 독소를 포함하지만, 임의의 다른 스타필로코커스 단백질에 대해 검출가능한 면역반응을 유도하지 않는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자의 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태를 예방하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 재조합 약독화된 스타필로코커스 α-헤모리신(Hla) 독소로 필수적으로 구성되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태로부터 환자를 보호하는 방법에 관한 것이다. "필수적으로 구성되는"이란 표현은 조성물이 본 발명의 기본 성질과 신규 성질, 즉 환자에서 스타필로코커스에 대한 면역반응을 유발하기 위한 조성물에 스타필로코커스 항원으로 사용되는 재조합 약독화된 Hla 독소의 용도에 실질적으로 영향을 미치는 다른 성분을 포함하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 추가 양태에 따르면, 스타필로코커스 아우레우스 α-헤모리신(Hla)에 대해 면역학적으로 반응성인 사람화된 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태로부터 환자를 보호하는 방법이 제공된다.

"사람화된 항체"란 용어는 사람 항체에 이식되는 비사람(non-human) 항체의 양을 최소화하도록 유전자조작된 항체를 의미한다. 비사람 서열을 함유하는 항체의 부분은 일반적으로 항체의 가변 부분이고, 반면 비가변 부분은 사람 서열이다. 일반적으로, 사람화된 항체는 90 내지 95%가 사람 서열이고 5 내지 10%가 비사람 서열이다. "면역학적으로 반응성"이란 용어는 항체가 특이적으로 특정 항원을 인식하여 항원에 대한 면역반응을 발생시키는 것을 의미한다.

"스타필로코커스 폐 질환 또는 상태"란 용어는 스타필로코커스 세균 유래의 감염이 일으키고, 기여하고, 악화시키고/거나 유지를 돕는 폐의 질환 또는 상태를 의미한다. 구체적 양태로, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태는 폐렴이다.

본 발명의 방법은 본 발명의 청구항에 제시된 바와 같이 의도한 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 항원, 에피토프(들) 또는 항체를 제공하는 것을 포함한다. 더 구체적으로, 일부 양태에 따르면, 유효량은 면역 반응을 자극하거나 유도하거나, 또는 감염에 대한 내성을 제공하거나 감염의 개선을 제공하는데 효과적인 활성 성분의 양을 의미한다. 더 구체적인 관점에서, 유효량은 질환 또는 감염의 증상을 예방하거나, 경감시키거나 또는 개선시키거나, 또는 치료받는 피검체의 생존을 연장시킨다. 유효량의 측정은 당업자의 능력 하에, 특히 여기에 제공된 상세한 설명에 비추어 충분히 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 제조물을 위한, 유효량 또는 용량은 먼저 시험관내, 세포 배양 및/또는 동물 모델 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 원하는 면역 반응 또는 순환하는 항체 농도 또는 역가를 달성하기 위한 용량은 동물 모델에서 체계적으로 나타낼 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명에 방법에 수반된 환자는 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태에 대한 위험이 있는 것으로 생각된다. 이러한 환자는 입원하고 있는 환자 또는 입원할 환자, 집중치료실에 있거나 들어갈 환자, 수술을 받을 환자, 마취할 환자 또는 전신 마취 하에 있을 환자, 연령이 65세 이상인 환자, 약화된 면역계를 보유한 환자, 소아 환자, 호흡기 또는 다른 기계적 호흡기를 착용하거나 착용할 수 있는 환자, 기관내관이 삽입되거나 삽입된 환자, 고정화되거나 고정화될 환자, 화학요법 또는 골수파괴성 요법을 받을, 받고 있는 또는 받았던 환자, 및 하나 이상의 면역억제제를 특히 상당한 시간 동안(1개월 이상) 투약하거나 투약하고 있거나 또는 투약한 환자를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물로부터 유익을 얻을 수 있는 환자와 관련하여, 환자는 건강한 개체인 것으로 보이는 환자 또는 폐렴의 위험 인자를 전혀 알 수 없거나 분명하게 나타나지 않을 수 있는 환자도 포함한다.

본 발명의 추가 양태에 따르면, 본 방법은 또한 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태의 위험이 있는 환자를 확인하는 방법을 수반할 수 있다. 또한, 본 방법은 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태의 위험 인자에 대해 환자를 평가하는 단계, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태의 증상에 대해 환자를 평가하는 단계, 또는 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태가 있는 환자를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 본 방법은 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태가 폐렴인 실행 단계를 수반할 수 있다.

본 발명의 일부 관점에서, α-헤모리신(Hla) 독소는 약독성이며, 이는 독소가 변경되지 않은 독소보다 독성이 적거나 기능적으로 약화되도록 변경된 것을 의미한다. 본 발명의 특정 양태에서, 독소는 Hla 변형체를 생성하기 위한 하나 이상의 아미노산 변화에 의해 약독화된다. 아미노산 변화는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282 및 283개 아미노산, 또는 이로부터 파생될 수 있는 임의의 범위의 결실, 삽입 및/또는 치환일 수 있다. 일부 양태에서, 변화는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 관한 변화이다. 특정 양태에서, 변경은 서열번호 2의 위치 24, 35, 66, 70, 110 및/또는 152에서의 변경이다. 특정 양태에서, 변화는 D24C, H35C, H35K, R66C, E70C 또는 K110C 또는 이의 임의의 조합이다(아미노산은 단문자 코드로 나타냈다). 더욱이, 특정 양태에 따르면, 약독화된 Hla 독소는 H35L(문헌에 사용된 명칭)로, 폴리펩타이드의 위치 35에 히스티딘 대신 류신을 보유하는 독소를 의미한다. 위치 35는 이 위치에서 임의의 다른 아미노산, 예컨대 자연발생의 19가지 다른 아미노산 중 임의의 아미노산으로 치환될 수 있는 것으로 생각된다. 결과적으로, 본 발명의 일부 양태에서, 약독화된 Hla 독소는 재조합 조작을 통해 변경된 DNA를 사용하여 독소가 생산된 것을 의미하는 재조합성이다.

특정 양태에서, Hla 독소는 서열번호 1 또는 2와 동일하거나 유사한 서열을 보유한다. 특정 관점에서, Hla 독소는 서열번호 1의 처음 26개 아미노산이 제거된 성숙 Hla 독소(서열번호 2)이다. 특정 양태에서, Hla 독소는 스타필로코커스 아우레우스 Hla 독소 유래의 단백질 서열을 보유한다. 유사성 또는 동일성(동일성이 바람직하다)은 당업계에 공지되어 있고, 공지된 서열과 서열 동일성 또는 유사성이 있는 단백질(또는 핵산)인지를 확인하는데 다수의 여러 프로그램이 사용될 수 있다. 서열 동일성 및/또는 유사성은 예컨대 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)(1981)의 국소 서열 동일성 알고리듬, 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch)(1970)의 서열 동일성 정렬 알고리듬, 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman)(1988)의 유사성 방법 조사, 이러한 알고리듬의 전산 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics, Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), 데버룩스(Devereux) 등(1984)에 의해 기술된 베스트 피트 서열 프로그램, 바람직하게는 디폴트 세팅 또는 정밀검사를 비롯한, 이에 국한되지 않는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 측정한다. 바람직하게는, 동일성 백분율은 당업자에게 공지되고 쉽게 확인할 수 있는 정렬 도구를 이용하여 계산한다.

본 발명의 특정 양태에서, 약독화된 Hla 독소의 활성은 막 결합, 세포 용해(구체적으로, 적혈구 세포의 세포 용해 또는 용혈, 또는 항원 제시 세포의 용해) 및/또는 7량체 형성과 관련해서 감소하거나 없어진다. 이러한 임의의 활성 또는 모든 활성은 본 발명에 참고인용된 워커(Walker) 및 베일리(Bailey)(1995) 및 본원에 기술된 것과 같은 상기 활성들의 분석법에서 약독화되지 않은 Hla 독소에 대하여 약, 적어도 약, 또는 최대 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% 감소할 수 있다. 특정 양태에서, 약독화된 Hla 독소는 검출할 수 있는 용혈 활성 또는 치사 활성이 없다.

또한, 일부 양태에서, Hla 독소는 화학적 변성(예, 포름아미드 및 포르말린) 또는 열 변성 등을 통해 변성되거나 변성되지 않은 것으로 생각된다. "실질적으로 변성되지 않은"이란 용어는 약간의 변성이 검출될 수도 있지만, 폴리펩타이드의 3차 또는 2차 구조와 관련된 입체형태 특이적 결합제를 결합시키는 면역원성 활성 또는 능력은 검출할 수 있는 독소를 의미한다. 구체적 양태에서, Hla 독소는 정제되며, 이의 달성에 최소 변성이 있거나 없을 수 있다. 본 발명의 일부 관점에서, Hla 독소는 활성이며, 이는 독소가 결합능을 비롯한 전술한 바와 같은 기능 또는 활성의 약간의 검출가능한 수준을 보유하는 것을 의미한다. Hla 독소는 약, 적어도 약 또는 최대 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 순도 또는 동질성(다른 단백질성 분자 및/또는 세포 거대분자에 대하여) 또는 이로부터 파생될 수 있는 임의의 범위로 정제될 수 있다. 또 다른 양태에서, 재조합 Hla 독소는 분리될 수 있다. "분리된"이란 용어는 기원인 공급원의 세포물질, 세균, 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지(재조합 DNA 기법으로 생산 시), 또는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질(화학 합성 시)이 실질적으로 없는 핵산 또는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 더욱이, 분리된 화합물은 분리된 화합물로서 피검체에게 투여할 수 있는 것을 의미하며; 환언하면 칼럼에 부착되거나 아가로스 겔에 매립된다면 단순히 "분리된" 것으로 생각되지 않을 수도 있다. 또한, "분리된 핵산 단편" 또는 "분리된 펩타이드"는 단편으로 자연발생하지 않고/않거나 일반적으로 기능성 상태가 아닌 핵산 또는 단백질 단편이다.

본 발명의 방법은 Hla에 대하여 환자의 면역반응을 자극하기 위해 환자에게 Hla 독소를 투여하는 것을 수반한다. 특정 양태에서, 본 방법은 Hla 독소에 대한 항체에 대해 환자를 검사하는 것을 수반한다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 다음과 같은 분석법을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 웨스턴 블로팅, ELISA, 점 블롯, 샌드위치 분석법, 면역조직화학 및 흐름 세포측정법, 예컨대 FACS.

본 발명의 조성물은 1회 또는 수회 투여할 수 있을 것으로 생각한다. 본 발명의 특정 양태에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 이상, 또는 이로부터 파생될 수 있는 임의의 범위로 투여한다. 예방적 또는 치료 요법은 1, 2, 3, 4, 5, 6 및/또는 7일, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5주, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및/또는 12개월, 또는 이로부터 파생될 수 있는 임의의 범위 동안에 수회 투여를 수반할 수 있을 것으로 생각한다. 또한, 이러한 임의의 요법은 특정 시간이 경과한 후 또는 피검체가 다시 스타필로코커스 질환 또는 상태의 위험을 보이거나 그 질환 또는 상태에 걸렸을 때 반복할 수 있다.

본 발명의 조성물은 환자에게 백신 또는 항체를 도입하는데 사용되는 임의의 경로를 통해 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 경로로는, 점막 또는 근육내 전달이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 조성물은 비경구 또는 흡입에 의해 환자에게 투여된다. 다른 양태에서, 조성물은 정맥내 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 또 다른 양태에서, 조성물의 투여는 경구, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내 투여 또는 이의 다양한 조합을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물로 조제될 수 있다. 본 발명의 특정 관점에서, 스타필로코커스 세균은 에스.아우레우스 세균이다.

또한, 본 발명의 양태에서, 본 발명의 방법은 약, 적어도 약 또는 최대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0. 19.5, 20.0, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000㎍ 또는 mg의 단백질(또는 이로부터 파생될 수 있는 임의의 범위)을 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 단백질은 약, 적어도 약 또는 최대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7. 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 10, 11, 12, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1000㎕ 또는 ml(또는 이로부터 파생될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 특정 관점에서, 하나 이상의 항-Hla 항체는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0. 19.5, 20.0, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1000mg/kg(체중)의 용량으로 투여될 수 있다.

일부 양태에서, 환자는 또한 스타필로코커스 아우레우스 폐 감염을 치료하기 위한 하나 이상의 항생제도 제공받는다. 항생제는 Hla 독소 또는 Hla 독소에 특이적인 항체를 포함하는 조성물에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 조성물은 하나 이상의 보강제를 함유한다. 보강제는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 특정 관점에서, 보강제는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 화학적으로 접합될 수 있다.

본 발명의 부분, 예컨대 항원 또는 면역원은 보강제, 단백질, 펩타이드, 지지체, 형광 부분 또는 라벨과 같은 다른 부분에 공유적 또는 비공유적으로 접합 또는 결합될 수 있다. "접합체" 또는 "면역접합체"란 용어는 광범위하게는 다른 제제와 한 부분이 작동적 결합을 하는 것을 정의하는데 사용되는 것으로, 오로지 임의의 타입의 작동적 결합을 의미하려는 것이 아니며, 특히 화학적 "접합"에 제한되지 않는다. 재조합 융합 단백질이 특히 고려된다. 핵산 또는 폴리펩타이드 조성물은 다른 오염 물질의 양을 기반으로 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 100%의 순도일 수 있다.

또 다른 양태에서, 조성물은 Hla 독소를 암호화하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일반적으로, 재조합 핵산 분자는 이종 프로모터를 함유한다. 특정 관점에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 벡터이며, 또 다른 관점에서, 벡터는 플라스미드이다. 특정 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 조성물은 일반적으로 사람 피검체에 투여되지만, 면역 반응을 유도해낼 수 있는 다른 동물에 대한 투여, 특히 소, 말, 염소, 양 및 다른 가축 동물에 대한 투여도 생각된다. 또 다른 관점에서, 스타필로코커스 세균은 스타필로코커스 아우레우스이다. 또 다른 양태에서, 면역반응은 보호적 면역반응이다. 또 다른 관점에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 폐의 감염, 특히 폐렴 및 다른 폐 감염을 예방, 개선, 감소 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 방법으로는, 감염의 징후가 나타나지 않는 피검체, 특히 표적 세균이 집락을 형성하고 있는 것으로 의심되거나 위험이 있는 피검체, 예컨대 입원, 치료 및/또는 회복 동안 감염 위험이 있거나 감염에 민감한 환자, 또는 그러한 감염 위험이 있을 또는 민감할 환자의 세균 부담의 예방적 감소를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된, "항원"이란 용어는 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 또한 체액 면역반응 및/또는 세포 면역반응을 유도하여 B- 및/또는 T-림프구의 생산을 유도할 수 있다. 생물학적 반응을 유발하는 항원의 구조적 관점은 본 명세서에서 "항원 결정인자"라 부른다. B-림프구는 항체 생산을 통해 이종 항원 결정인자에 반응하는 반면, T 림프구는 세포 면역성의 매개인자이다. 세포 면역성에 매개인자인 것 외에, T 림프구는 항원에 대한 B 림프구의 반응을 추가로 자극하여 항체 생산을 촉진할 수 있다. 따라서, 항원 결정인자 또는 에피토프는 항체에 의해, 또는 MHC의 상황에서는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 부분이다. 항원 결정인자는 단백질의 인접 서열 또는 분절일 필요는 없고 서로 직접 인접하지 않는 다양한 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 본원 전반에 걸쳐 논의되고 있다. 본 발명의 한 관점과 관련하여 논의된 임의의 양태는 본 발명의 다른 관점에도 적용되고, 그 반대일 수도 있다. 실시예에 제시된 양태들은 본 발명의 모든 관점들에 적용할 수 있는 본 발명의 양태들인 것으로 이해한다.

특히, 리스트의 각 성분 또는 원소는 본 발명의 청구의 범위에 구체적으로 포함되거나 포함되지 않을 수 있는 것으로 생각한다.

"저해하는", "감소하는" 또는 "예방"이란 용어 또는 이러한 용어들의 모든 변형은 청구의 범위 및/또는 명세서에 사용되었을 때 원하는 결과를 달성하기 위한 임의의 측정가능한 감소 또는 완전한 저해를 포함한다.

청구의 범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용된 단일 용어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나보다 많은"의 의미와 일치하기도 한다.

본원에서 논의된 임의의 양태는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 또한, 본 발명의 조성물 및 키트는 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.

본 명세서를 통해 사용된 "약"이란 용어는 값을 측정하는데 이용된 장치 또는 방법의 표준편차 또는 오차를 포함하는 값을 나타낸다.

청구의 범위에 사용된 "또는"이란 용어의 사용은 명세서가 단지 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지원할지라도 대안이 상호 배타적이거나 대안만을 의미하는 표시가 분명하지 않은 한, "및/또는"을 의미한다.

본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하고"), "보유하는"(및 보유하는의 임의의 형태, "보유하고"), "함유하는"(및 "함유하고"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄식 또는 개방식 표현으로, 언급되지 않은 추가 인자 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 이하 상세한 설명으로부터 분명하게 나타날 것이다. 하지만, 상세한 설명과 특정 실시예는 본 발명의 특정 양태를 나타내지만, 단지 예시적 방식으로 제공된 것으로, 본 발명의 취지 및 범위에 속하는 다양한 변화 및 변형은 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명한 것일 것이다.

이하 도면의 설명은 본 명세서의 일부를 구성하고 본 발명의 특정 관점을 구체적으로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 특정 양태들의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 도면을 참조로 하면 더 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1A-1C. α-헤모리신(Hla)은 CA-MRSA(지역 연계 메티실린 내성 에스.아우레우스) 폐 감염의 독성 인자이다. (도 1A) CA-MRSA 균주 에스.아우레우스 LAC(wt)과 동질유전자계 hla :: erm 돌연변이체의, 감염후 24시간, 48시간 및 72시간째의 동물 치사율 평가에 의한 쥐 폐 감염 모델에서의 독성에 대한 비교. 그룹마다 동물 10마리를 감염시켰다(p<0.0007). (도 1B). CA-MRSA 균주 LAC 또는 MW2에서 팬턴-발렌타인(Panton-Valentine) 류코시딘(PVL) 독소를 암호화하는 lukS - PV 및 lukF - PV의 결실은 스타필로코커스 폐렴의 쥐 모델에서 독성에 영향을 미치지 않는다. 마우스는 2 × 10⁸ CFU 에스.아우레우스 LAC 야생형(wt) 또는 동질유전자계 lukS - PV 및 lukF-PV 결실 돌연변이체(△pvl)(p=0.22) 뿐만 아니라 3-4 × 10⁸ CFU 에스.아우레우스 MW2(wt) 및 이의 동질유전자계 pvl 결실 돌연변이체(△pvl)(p=0.41)로 감염시켰다. 균주 당 15마리 동물 그룹에서 감염후 24시간, 48시간 및 72시간째에 치사율을 평가했다. (도 1C) 얇게 절편화된 폐 조직의 헤마톡실린-에오신 염색을 통한 조직병리학적 분석은 LAC 및 MW2 분리물에서 PVL 발현에 상관없이 폐 손상의 유사한 패턴을 나타냈다.
도 2A-2B. α-헤모리신(Hla)은 CA-MRSA(지역 연계 메티실린 내성 에스.아우레우스) 폐 감염의 독성 인자이다. (도 2A) 마우스는 2 × 10⁸ CFU 에스.아우레우스 LAC 야생형(wt) 또는 동질유전자계 lukS - PV 및 lukF - PV 결실 돌연변이체(△pvl) 뿐만 아니라 3-4 × 10⁸ CFU 에스.아우레우스 MW2(wt) 및 이의 동질유전자계 pvl 결실 돌연변이체(△pvl)로 감염시켰다. 스타필로코커스로 24시간 동안 감염된 동물의 우측 폐로부터의 세균 회수율은 lukS - PV 및 lukF - PV의 결실이 폐 조직에서 스타필로코커스 복제에 영향을 미치지 않음을 나타냈다(균주당 10마리 동물인 그룹). 스튜던트 t 검정을 이용한 통계 분석은 LAC 균주 비교 시에는 p = 0.46, MW2 균주에 대해서는 p = 0.23을 산출했다. (도 2B) LukS-PV 및 LukF-PV에 대한 항체를 이용한 면역블로팅은 pvl 돌연변이 균주의 독소 분비의 상실을 증명했지만, 동질유전자계 pvl 결실에 의해서는 α-헤모리신(Hla)의 분비가 영향을 받지 않았다. 별표(*)가 표시된 교차반응성 종은 LukF-PV보다 약간 빠르게 이동한다.
도 3A-3E. 팬턴-발렌타인 류코시딘(PVL)을 발현하는 φSa2mw 파지에 의한 용원성은 스타필로코커스 폐렴의 쥐 모델에서 에스.아우레우스 뉴만 (Newman)의 독성에 영향을 미치지 않는다. (도 3A) 도면은 에스.아우레우스 뉴만의 게놈, 이의 복제 오리진(ori) 및 종료부위(ter)뿐만 아니라 4개의 프로파지(φNM1, φNM2, φNM3, φNM4)의 삽입 부위를 나타낸다. 에스.아우레우스 뉴만에서 φSa2mw의 삽입 부위가 표시되어 있다. (도 3B) 뉴만 균주의 φSa2mw 용원성은 lukS - PV 및 lukF - PV의 발현을 일으키며, 두 PVL 독소 성분(LukS-PV 및 LukF-PV)은 배양 상청액 샘플에서 토끼 항혈청으로 면역블롯 분석하여 검출할 수 있다. 별표(*)가 표시된 교차반응성 종은 LukF-PV보다 약간 빠르게 이동한다. (도 3C) 에스.아우레우스 뉴만(wt) 또는 φSa2mw로 용원화된 동질유전자계 변형체(뉴만 φSa2mw) 3-4 × 10⁸ 콜로니형성단위(CFU)를 비내 접종한 후 24시간째 마우스의 우측 폐로부터 수득되는 세균 회수율은 스타필로코커스 복제에 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(스튜던트 t 검정에 의해 p = 0.74, 그룹당 동물 15마리). 세균 회수율의 평균은 수평선으로 나타냈다. (도 3D) 에스.아우레우스 뉴만(wt) 또는 φSa2mw로 용원화된 동질유전자계 변형체(뉴만 φSa2mw)에 의해 감염된 동물은 24시간, 48시간 또는 72시간의 관찰 후 유사한 치사율을 나타낸다(p=0.58). (도 3E) 에스.아우레우스 뉴만 φSa2mw에 hla::erm 대립유전자의 형질도입은 쥐 폐 감염 모델에서 독성을 없앤다(p < 0.00004).
도 4A-4B. 팬턴-발렌타인 류코시딘(PVL)을 발현하는 φSa2mw 파지에 의한 용원성은 스타필로코커스 폐렴의 쥐 모델에서 에스.아우레우스 뉴만의 독성에 영향을 미치지 않는다. (도 4A) 단지 벡터를 운반하거나 ppvl을 운반하는 3-4 × 10⁸ CFU 에스.아우레우스 뉴만으로 비내 경로를 통해 감염된 동물은, 플라스미드 매개의 PVL 과발현이 동물 치사율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(p=0.27). α-헤모리신 결손성 균주(hla :: erm)는 폐 감염 동안 무독성이었고, 벡터만으로, ppvl 또는 phla로 형질전환된 hla :: erm 돌연변이체는 쥐 폐 감염 모델에서 독성의 속성에 대해 분석했다. 균주당 10 내지 15마리의 동물을 조사했고, 감염후 24시간, 48시간 및 72시간째 치사율을 기록했다. 에스.아우레우스 hla 돌연변이체(phla)로 감염된 동물의 치사율은 벡터 또는 ppvl을 수용하는 에스.아우레우스 hla 돌연변이로 감염된 동물의 치사율보다 훨씬 증가했다(p=0.00004). (도 4B) PVL(ppvl, lukS - PV 및 lukF-PV), α-헤모리신(phla)의 발현을 촉진하는 플라스미드 또는 벡터만으로 형질전환된 에스.아우레우스 뉴만 및 이의 동질유전자계 hla : erm 변형체 유래의 18시간 배양 상청액의 면역블롯 분석. 특정 항체들은 LukS-PV, LukF-PV, α-헤모리신(Hla) 및 뉴클레아제의 존재 및/또는 부재를 나타냈다. 별표(*)로 표시한 교차반응성 종은 LukF-PV보다 약간 빠르게 이동한다.
도 5A-5E. 돌연변이체 α-헤모리신으로의 면역화는 스타필로코커스 폐렴에 대해 방어한다. (도 5A) C57BL/6J 마우스는 PBS 또는 20 ㎍ Hla_H35L(독소 활성 및 기공 형성을 없애는 단일 아미노산 치환을 보유한 돌연변이 α-헤모리신)으로 면역화시키고, 그 후 에스.아우레우스 뉴만으로 항원공격했다. 치사율은 감염 후 24시간, 48시간 또는 72시간째 기록했다(p<0.001). (도 5B) Hla_H35L로의 마우스 면역화는 감염된 쥐 폐 조직에서 에스.아우레우스 뉴만의 증식을 감소시킨다. (도 5C) PBS 또는 Hla_H35L로 면역화된 마우스 유래의 에스.아우레우스 뉴만 감염된 폐 조직의 육안 병리소견. (도 5D) PBS 또는 Hla_35HL로 면역화된 마우스 유래의 에스.아우레우스 뉴만 감염된 폐 조직의 조직병리학. (도 5E) C57BL/6J 마우스는 PBS 또는 20㎍ Hla_H35L로 면역화시킨 후, 에스.아우레우스 CA-MRSA 균주 LAC 또는 MW2로 항원공격했다. 치사율은 감염 후 24시간, 48시간 또는 72시간째 기록했다. Hla_H35L 면역화된 동물의 치사율은 허위(PBS) 면역화되고 에스.아우레우스 균주 LAC(p=0.00001) 또는 MW2(p=0.018)로 항원공격된 동물의 치사율에 비해 약간 감소했다.
도 6A-6C. α-헤모리신은 사람 폐포 세포의 스타필로코커스 손상을 매개한다. (도 6A) 사람 A549 폐포 세포를 에스.아우레우스(균주 LAC, MW2 또는 뉴만)로 감염시켰다. 37℃에서 공동배양 4시간 후, 용해된 세포의 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출을 각 웰마다 평가했다. 감염은 3반복으로 수행하여 스튜던트 t 검정으로 통계적 유의성을 평가했다. (도 6B). 플라스미드 벡터 또는 phla를 운반하는 α-헤모리신 돌연변이 에스.아우레우스 균주(hla :: erm)로 감염된 또는 감염되지 않은 상태인 A549 세포의 위상차 현미경 이미지. 이미지는 감염후 3시간째에 기록하였다. (도 6C) 스타필로코커스에 의한 사람 폐 세포의 α-헤모리신 매개의 손상은 항-Hla 토끼 혈청에 의한 치료 또는 정제된 Hla_H35L와의 예비항온처리에 의해 감소되었고, 이에 반해 미반응성 토끼 혈청(NRS)은 어떠한 영향도 미치지 않았다.
도 7A-7F. 항-Hla 혈청으로의 마우스의 수동 면역화는 스타필로코커스 폐 감염에 대한 보호효과를 나타낸다. (도 7A) 마우스는 미반응성 토끼 혈청(NRS) 또는 항-Hla 항체를 보유한 토끼 혈청을 복강내 주사하여 수동 면역화시키고, 그 다음 에스.아우레우스 뉴만(p<0.0007)으로 항원공격했다. 치사율은 감염 후 24시간, 48시간 및 72시간째 기록했다. (도 7B) 항-Hla에 의한 마우스의 수동 면역화는 에스.아우레우스 뉴만이 쥐 폐 조직에서 증식하는 능력을 감소시키고(도 7C), 또한 감염후 명백한 육안 병리학적(도 7D) 및 조직병리학적 병변을 감소시킨다. (도 7E) 항-Hla 항혈청은 또한 에스.아우레우스 균주 LAC(p<0.025) 또는 MW2(p<0.009)의 비내 접종에 의한 항원공격 시에 동물을 보호한다. (도 7F) 항-PVL 면역글로불린은 감염 후 24시간, 48시간 및 72시간째 기록된 에스.아우레우스 LAC로의 감염에 대하여 보호 효과를 제공하지 못한다(p=0.55).
도 8. 스타필로코커스 폐 감염동안 사이토카인 반응은 α-헤모리신에 대한 항체로의 수동 면역화에 의해 영향을 받는다. 마우스에게 미반응성인 토끼 혈청 또는 항-Hla 항체를 보유한 토끼 혈청을 복강내 주사했다. 혈청 사이토카인 수준은 IL-1β뿐만 아니라 IFN-γ의 농도를 조사하는 복합 비드계 사이토카인 분석으로 측정했다. 사이토카인 수준 차이의 통계적 유의성은 스튜던트 t 검정(그룹당 동물 9마리)으로 계산하고 기록했다.
도 9. α-헤모리신에 대한 마우스 모노클로날 항체는 에스.아우레우스 유도 용해로부터 A549 세포를 보호한다. A549 세포는 미반응성(NRS) 또는 항-Hla를 수용한 토끼 혈청의 존재 하에 살아있는 에스.아우레우스와 공동배양했다. A549 세포의 다른 웰은 살아있는 에스.아우레우스 및 2가지 독립 항-Hla 모노클로날 항체(7B8.35 및 1A9) 또는 이들의 이소타입-정합성 대조 항체(각각 IgG2a 및 IgG2b)와 공동배양하여, 폴리클로날 토끼 항혈청과 마우스 모노클로날 항체가 모두 Hla 유도 손상으로부터 A549 세포를 보호할 수 있음을 증명했다.
도 10. A549 세포 LDH 방출 분석에서 마우스 모노클로날 항체의 적정. 이소타입 대조용 항체(IgG2a 또는 IgG2b) 또는 항-α-헤모리신 모노클로날 항체 7B8.35/1A9.4F9는 에스.아우레우스 뉴만의 존재 하에 A549 세포의 공동배양물에 첨가했다. 모노클로날 항체는 다음과 같이 분석법에서 적정되었다: 2.5mg/ml, 2mg.ml, 1.5mg/ml, 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.1mg/ml, 0.01mg/ml 및 0.001mg/ml(왼쪽에서 오른쪽으로). LDH 방출은 4시간 공동배양 후 평가했다.
도 11A-11B. 항-α-헤모리신 모노클로날 항체 7B8.35 및 1A9.4F9는 에스.아우레우스 폐렴과 관련된 치사율로부터 실험 동물을 보호한다. 에스.아우레우스 뉴만으로 감염되기 24시간 전에, 15마리의 마우스에게 이소타입 대조용 항체(IgG2a, 패널 A 또는 IgG2b, 패널 B) 또는 대응하는 항-Hla 모노클로날 항체(7B8.35, 패널 A 또는 1A9.4F9, 패널 B)를 복강내 주사했다. 비내 경로를 통해 에스.아우레우스를 감염시킨 후, 급성 치사 질환에 대해 동물을 관찰한 결과, 어떠한 모노클로날 항체에 의한 치료라도 현저한 보호 효과를 제공한 것으로 나타났다.
도 12. 항-Hla 모노클로날 항체는 USA300/LAC에 의해 유발된 폐렴으로부터 실험 동물을 보호한다. 동물에게는 이소타입 대조용 항체(IgG2a 또는 IgG2b) 또는 이에 대응하는 항-Hla 모노클로날 항체(7B8.35 또는 1A9.4F9)의 복강내 용량을 투여했다. 각 항체는 5mg/kg 용량으로 전달했다. 비내 경로를 통해 에스.아우레우스 균주 USA300/LAC로 감염 후, 동물의 급성 치사 질환을 관찰하고, 각 모노클로날 항체 치료에 의해 보호 효과가 제공되는 것으로 드러났다.
도 13. HlaH35L 절두 산물의 모식도. 전체 길이의 HlaH35L 및 전체 길이 단백질 아래에 도시된 7개의 절두 산물.
도 14. 항-Hla 모노클로날 항체는 성숙 독소의 단일 N-말단 영역에 결합한다. HlaH35L 절두 산물의 모노클로날 항체 7B8.35 및 1A9.4F9에 의한 점 블롯 분석은 상기 두 모노클로날에 의해 인식되는 에피토프가 단백질의 처음 50개 아미노산 내에 존재한다는 것을 증명한다.

쥐 모델 시스템에서 에스.아우레우스 폐렴의 연구는 α-헤모리신(Hla)을, 이 외독소가 결여된 돌연변이 균주가 무독성이었는 바, 질병의 발병기전에 중요한 독성 인자로 규명했다. Hla는 에스.아우레우스에 의해 분비되는 세균 세포독소 패밀리의 일원으로, 다수의 진핵생물 세포의 세포막에 삽입될 수 있다. 이 단백질은 단량체로 분비되어 진핵생물 세포의 표면에서 7량체 고리 구조로 조립된다. 조립된 독소는 숙주 세포막 내로 삽입되어 막의 무결성을 파괴시켜 세포 손상 및 사멸에 기여하는 기공을 형성한다. 몇몇 생화학 연구들은 숙주 세포에 대한 결합, 7량체 형성 및 숙주 세포 용해를 촉진하는 Hla 단량체 내의 아미노산 잔기를 밝혀냈다. 성숙 독소의 위치 35에서 히스티딘 잔기는 효과적인 7량체 형성 및 세포 용해에 필요한 것으로 알려져 있으나, 진핵생물 세포 표적에 결합하는데 반드시 필요한 것은 아니다. 본 발명자들은 Hla를 중화시킬 수 있는 백신접종 전략이 에스.아우레우스 폐렴에 대한 면역보호를 제공해야만 한다고 생각한다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자들은 히스티딘 35를 류신으로 변환시켜 독소의 생산적인 조립을 중단시킨 Hla의 돌연변이 또는 변형 형태(HlaH35L)로 표시되는 재조합 약독화 또는 독성 감소된 Hla를 생산했다.

이 돌연변이 독소를 이용한 실험 동물의 면역화는 에스.아우레우스를 이용한 항원공격 시에 폐렴에 대한 보호 효과를 부여했다. 이러한 보호 효과는 치사율 감소, 폐에서 회수된 세균 수의 감소 및 병소 부위에 병리학적 병변의 제한으로 명백히 나타났다. 이와 마찬가지로, 재조합 HlaH35L로 면역화된 토끼 유래의 혈청에 의한 수동 면역화는 또한 에스.아우레우스 폐렴으로부터 마우스를 보호했고, 능동 면역화 후에 관찰되는 유익과 동일한 유익으로 증명되었다.

본 발명의 양태는 감염에 대한 완화 또는 면역화에 사용하고/하거나 스타필로코커스 폐렴을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한 Hla, HlaH35L 및 이의 단편으로 예시되는 면역원성 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드에 관한 것이다. 항원성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 스타필로코커스, 특히 에스.아우레우스 유래의 Hla 단백질 전부 또는 일부를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 균주의 비제한적 예는 린드세이(Lindsay) 등(2006)에 의해 확인된 10가지 클론 클러스터(CC1, CC5, CC8, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45 및 CC51) 중 하나에 속하는 것을 포함한다. 더 구체적으로, 항원성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 병원 및 지역에서 획득한 감염과 관련이 있는 에스.아우레우스 MRSA 균주 및 클레이드, 예컨대 비제한적으로 에스.아우레우스 균주 8325, 바넘(Barnum), 베를린(Berlin), 브라질리언 이베리안(Brazilian Iberian), COL, EMRSA-15, EMRSA-16, 하노버(Hanover), LAC, N315, MRSA 252, MW2, Mu50, Pediatric NY, 저팬, 뿐만 아니라 CDC 클레이드 USA 100, USA 200, USA 300, USA 500, USA 600 및 USA 800으로 분류된 에스.아우레우스 균주 유래의 Hla 단백질 전부 또는 일부를 포함한다.

I. 스타필로코커스 HLA

스타필로코커스 α-헤모리신(Hla 또는 α-독소)은 세균 기공 형성 β-배럴(barrel) 독소 패밀리의 최초 일원이다(Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991; Song et al., 1996). 이 구조 유전자 hla 는 293 잔기 수용성 단량체를 분비하는 것으로 조사된 모든 에스.아우레우스 균주의 염색체에 위치한다(O'Reilly et al., 1990; O'Reilly et al., 1986). Hla는 민감성 숙주 세포의 표면 수용체에 체결하여, 7량체성 예비기공으로의 Hla 올리고머화 및 원형질막에 2nm 기공 직경의 β-배럴 구조의 삽입을 촉진한다(Gouaux et al., 1997). Hla 기공은 림프구, 대식세포, 폐포 상피 세포, 폐 상피 및 적혈구에서 형성되지만, 과립세포 및 섬유아세포는 용해 내성인 것으로 보인다(Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991; McElroy et al., 1999). 토끼 또는 래트 폐 조직에 정제된 Hla의 점적은 여러 시그널링 분자, 예컨대 포스파티딜 이노시톨, 산화질소, 프로스타노이드(PGE2, PGI2) 및 트롬복산 A2의 방출 때문인 혈관 누설 및 폐 고혈압을 유발한다(McElroy et al., 1999; Seeger et al., 1984; Seeger et al., 1990; Rose et al., 2002; Suttorp and Habben, 1988). Hla의 생화학 속성과 일치하게, 에스.아우레우스 뉴만에서 Hla 발현을 중단시키는 돌연변이는 쥐 폐렴 모델에서 세균의 독성을 상당히 약화시킨다(Bubeck-Wardenburg et al., 2007). 이에, 본 발명자는 Hla를 에스.아우레우스 폐 감염에 대항하는 백신 또는 면역요법 전략의 개발을 위한 표적으로서 조사했다.

본 발명의 특정 관점은 Hla 단백질의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 단백질성 조성물에 관한 방법 및 조성물을 포함한다. 이러한 단백질들은 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 단백질들의 변형은 피검체에서 면역반응을 유도해낼 수 있다.

Hla 폴리펩타이드는 스타필로코커스 속의 세균에서 유래하는 Hla 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. Hla 서열은 특별한 스타필로코커스 종, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스 유래일 수 있고, 뉴만과 같은 특정 균에서 유래할 수 있다. 특정 양태에서, Hla 서열은 이하 서열번호 1로 표시되는 컨센서스 (consensus) 에스.아우레우스 전구체 서열 및 이하 서열번호 2로 표시되는 성숙 에스.아우레우스 컨센서스 서열을 보유하는 서열을 포함할 수 있다:

특정 관점에서, Hla 서열은 진뱅크 등록번호 AAA26498 (gi152953), Mu50 (NP_371687.1) (gi15924153), COL (YP_186036.1) (gi57650272), N315 (NP_374279.1) (gi15926746), JH9 (YP_001246598.1) (gi148267655), JH1 (YP_001316387.1) (gi150393712), USA300 (YP_493756.1) (gi87160380), NCTC8325 (YP_499665.1) (gi88194865), Newman (YP_001332107.1) (gi151221285), MW2 (NP_645861.1) (gi21282773) 및 MSSA476 (YP_043222.1) (gi49486001)에 대부분 제시된 것이거나(본 출원의 최초 우선일자로 참고인용됨), 또는 이의 변형체이다.

다른 양태에서는 당업자가 데이터베이스 및 인터넷 접속 자원을 사용하여 서열을 확인할 수 있는 다른 Hla 폴리펩타이드가 사용될 수도 있다.

본 명세서에 사용된, "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 함유하는 분자를 의미한다. 일부 양태에서, 야생형 버전의 단백질 또는 폴리펩타이드가 이용되지만, 본 발명의 많은 양태에서는 면역반응을 발생시키기 위해 변형 단백질 또는 폴리펩타이드가 이용된다. 전술한 용어들은 본 명세서에서 호환해서 사용되기도 한다. "변형 단백질" 또는 "변형 폴리펩타이드"는 화학적 구조, 특히 아미노산 서열이 야생형 단백질 또는 폴리펩타이드에 비하여 변경된 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 양태에서, 변형 단백질 또는 폴리펩타이드는 적어도 하나의 변형된 활성 또는 기능을 보유한다(단백질이나 폴리펩타이드는 다수의 활성 또는 기능을 보유할 수 있음을 상기한다). 특히, 변형 단백질 또는 폴리펩타이드는 하나의 활성 또는 기능에 대해 변경될 수 있고, 면역원성과 같은 다른 관점에서는 야생형 활성 또는 기능을 유지할 수 있는 것으로 생각한다.

특정 양태에서, 단백질 또는 폴리펩타이드(야생형 또는 변형)의 크기는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500개의 아미노 분자 또는 그 이상, 및 여기에서 파생될 수 있는 모든 범위, 또는 이의 유도 개수를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 절두에 의해 변이되어, 이의 대응하는 야생형보다 더 짧아질 수 있고, 뿐만 아니라 특정 기능(예컨대, 표적화 또는 국재화, 면역원성 증강 또는 정제 목적 등)을 가진 이종 단백질 서열을 융합 또는 접합시켜 변경시켜도 좋다.

본 명세서에 사용된, "아미노 분자"는 당업계에 공지된 임의의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 아미노산 모방체를 의미한다. 특정 양태에서, 단백질성 분자의 잔기는 임의의 비아미노 분자가 아미노 분자 잔기의 서열을 방해함이 없이 연속성이다. 다른 양태에서, 서열은 하나 이상의 비아미노 분자 부분을 포함할 수도 있다. 특정 양태에서, 단백질성 분자의 잔기들의 서열에는 하나 이상의 비아미노 분자 부분이 개재될 수 있다.

따라서, "단백질성 조성물"이란 용어는 자연 합성된 단백질의 공통 아미노산 20개 중 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형 또는 독특한 아미노산을 포함하는 아미노 분자 서열을 포함한다.

단백질성 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 (i) 표준 분자생물학 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, (ii) 천연 또는 재조합 근원(예, 이.콜라이, 곤충 세포, 효모 등) 유래의 단백질성 화합물의 분리, 또는 (iii) 단백질성 물질의 화학적 합성 등으로 제조할 수 있다. 다양한 유전자의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 이미 개시되어 있고, 공인된 전산 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 이러한 1가지 데이터베이스는 미국립 생물정보센터의 진뱅크 및 진펩트(GenPept) 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/)이다. 이 유전자들의 암호화 영역은 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 기술을 이용하여 증폭 및/또는 발현시킬 수 있다.

Hla의 아미노산 서열 변형체는 고찰되며, 치환성, 삽입성 또는 결실 변형체일 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 변형은 야생형 대비 폴리펩타이드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293개 이상의 비인접 또는 인접 아미노산에 영향을 미칠 수 있다. 임의의 스타필로코커스 종 및 균주 유래의 Hla 폴리펩타이드가 본 발명의 방법에 사용될 것으로 생각된다.

변형체는 일반적으로 천연 또는 야생형 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있다. 각 잔기가 결실될 수 있고, 또는 다수의 인접 아미노산이 결실될 수 있다. 절두 단백질의 생산을 위해서는 암호화 핵산 서열에 종결 코돈을 도입시킬 수 있다(치환 또는 삽입에 의해). 삽입 돌연변이체는 일반적으로 폴리펩타이드의 비말단점에 물질의 첨가를 수반한다. 이것은 하나 이상의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 또한, 융합 단백질로도 불리는 말단 첨가가 생산될 수도 있다.

치환 변형체는 일반적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 포함하고, 폴리펩타이드의 하나 이상의 성질을 다른 기능 또는 성질의 상실과 함께 또는 상실 없이 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 한 아미노산이 유사한 형태 및 하전의 아미노산으로 교체되는 보존성일 수 있다. 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 알라닌에서 세린으로의 변화, 아르기닌에서 리신으로의 변화; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로의 변화; 아스파르테이트에서 글루타메이트로의 변화; 시스테인에서 세린으로의 변화; 글루타민에서 아스파라긴으로의 변화; 글루타메이트에서 아스파르테이트로의 변화; 글리신에서 프롤린으로의 변화; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로의 변화; 이소류신에서 류신 또는 발린으로의 변화; 류신에서 발린 또는 이소류신으로의 변화; 리신에서 아르기닌으로의 변화; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로의 변화; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로의 변화; 세린에서 트레오닌으로의 변화; 트레오닌에서 세린으로의 변화; 트립토판에서 티로신으로의 변화; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로의 변화; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다. 대안적으로, 치환은 폴리펩타이드의 기능 또는 활성이 영향을 받도록 비보존성일 수 있다. 비보존성 변화는 일반적으로 한 잔기의 화학적으로 상이한 잔기로의 치환, 예컨대 극성 또는 하전성 아미노산의 비극성 또는 비하전성 아미노산으로의 치환 및 그 반대를 수반한다.

본 발명의 단백질은 시험관내에서 합성되거나 재조합성일 수 있다. 대안적으로, 비재조합성 또는 재조합성 단백질이 세균에서 분리될 수 있다. 또한, 이러한 변형체를 함유하는 세균은 본 발명의 조성물 및 방법에 이용될 수 있는 것으로 생각한다. 결과적으로, 단백질은 분리될 필요가 없다.

본 명세서에 사용된 "기능적 등가 코돈"이란 용어는 아르기닌 또는 세린에 대한 6개 코돈과 같이 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 의미하고, 또한 생물학적 등가 아미노산을 암호화하는 코돈을 의미하기도 한다(이하 표 1 참조).

또한, 아미노산 및 핵산 서열은 추가 잔기, 예컨대 추가 N-말단 또는 C-말단 아미노산, 또는 5' 또는 3' 서열을 각각 포함할 수 있지만, 서열이 전술한 기준, 예컨대 단백질 발현이 관여하는 생물학적 단백질 활성의 유지를 충족시키는 한, 본질적으로 본 명세서에 개시된 서열 중 하나에 제시된 것으로 이해될 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히 예컨대 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나에 인접한 다양한 비암호성 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.

다음은 등가 또는 심지어 향상된 제2 세대 분자를 생산하기 위한 단백질의 아미노산 변화를 기반으로 한 논의이다. 예를 들어, 특정 아미노산은 기질 분자 상의 결합 부위 또는 항체의 항원 결합 영역과 같은 구조들과 상호작용 결합능의 인지가능한 상실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질은 이의 생물학적 기능 활성을 정의하는 단백질의 상호작용 능력 및 본성이 있는 바, 특정 아미노산 치환이 아미노산 서열 및 이의 기본 DNA 암호화 서열에서 이루어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 성질이 유사한 단백질을 생산한다. 본 발명자들은 생물학적 유용성 또는 활성의 인지가능한 상실없이 유전자 또는 핵산의 DNA 서열에 다양한 변화가 이루어질 수 있을 것으로 생각한다.

이러한 변화를 제조하는데 있어서, 아미노산의 친수도 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 아미노산 친수도 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에 인식되어 있다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적 친수도 특성은 최종 단백질의 2차 구조에 기여하고, 결국 단백질과 다른 분자, 예컨대 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 및 기타 유사물과의 상호작용을 한정한다는 인정을 받고 있다.

또한, 유사 아미노산의 치환은 친수성을 기준으로 효과적으로 제조될 수 있는 것으로 인식되어 있다. 여기에 참고 인용된 미국 특허 4,554,101은 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 단백질의 생물학적 성질과 상관성이 있다고 설명한다. 아미노산은 친수성 값이 유사한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 그래도 생물학적 등가 및 면역학적 등가인 단백질을 생산할 수 있는 것으로 인식되어 있다.

앞에서 개략한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 이들의 소수성, 친수성, 하전, 크기 등을 기초로 한다. 전술한 다양한 특징들을 고려한 치환의 예는 공지되어 있으며 다음을 포함한다: 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신.

본 발명의 조성물에서 단백질은 1ml당 총 단백질 약 0.001mg 내지 약 10mg 사이인 것이 고려된다. 따라서, 조성물 중의 단백질 농도는 약, 적어도 약, 또는 최대 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 ㎍/ml, mg/ml, 또는 그 이상(또는 이로부터 유도될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 이 중에서, 약, 적어도 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%가 Hla 단백질일 수 있다.

본 발명은 스타필로코커스 병원체와 관련된 질환 또는 상태, 특정 관점에서 폐렴의 발생에 대하여 예방적 요법에 영향을 미치기 위한 Hla 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 투여를 고려한다. 또한, 본 발명은 스타필로코커스 병원체에 의한 감염과 관련된 질환 또는 상태, 특정 관점에서 폐렴을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한 Hla 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대해 유발된 항체의 투여를 고려한다.

또한, 미국 특허 4,554,101(Hopp)(참고인용됨)은 친수성 기준으로 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인 및 제조하는 것에 대해 교시한다. 홉(Hopp)에 의해 개시된 방법을 통해, 당업자는 아미노산 서열로부터 가능한 에피토프를 확인하고 이들의 면역원성을 확인할 수 있을 것이다. 또한, 다수의 과학 간행물들은 아미노산 서열의 분석으로부터 2차 구조의 예측 및 에피토프의 확인에 전념했다(Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b, 1979). 이들 모두는 원한다면 미국 특허 4,554,101의 홉의 교시를 보충하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 다양한 양태들에 사용되는 폴리펩타이드, 펩타이드 및 단백질을 설명한다. 예를 들어, 특정 폴리펩타이드는 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 분석된다. 또한, 특정 양태에서 본 발명의 단백질 전부 또는 일부는 종래 교시에 따라 용액에서 또는 고상 지지체에서 합성될 수 있다. 각종 자동합성기는 시판되고 있고, 공지의 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각 참고인용되는 문헌[Stewart and Young, (1984); Tam et al ., (1983); Merrifield, (1986); 및 Barany and Merrifield (1979)]을 참고한다. 대안적으로, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킨 뒤, 발현에 적당한 조건 하에서 배양하는 재조합 DNA 기술을 이용할 수도 있다.

본 발명의 한 양태는 단백질의 생산 및/또는 제시를 위한, 미생물을 비롯한 세포로의 유전자 전이의 사용을 포함한다. 당해 단백질의 유전자는 적당한 숙주 세포로 전이될 수 있고, 그 다음 적당한 조건 하에 세포 배양될 수 있다. 본 명세서에 기술된 사실상 모든 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 작제 및 여기에 포함되는 구성요소들은 본 명세서에서 논의된다. 대안적으로, 생산될 단백질은 일반적으로 단백질 생산에 사용되는 세포에 의해 합성된 내인성 단백질일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 면역원 산물, 더 상세하게는 면역원성 활성을 가진 단백질을 발현하는 바이러스 벡터에 의해 형질감염된 자기유래의 B 림프구 세포주를 이용한다. 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 베로 및 헬라 세포, 다른 B- 및 T- 세포주, 예컨대, CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji 뿐만 아니라 중국 햄스터 난소의 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 숙주 세포주는 삽입 서열의 발현을 조정하거나, 또는 유전자 산물을 원하는 방식으로 변형 및 프로세싱하는 것을 선택할 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형(예, 글리코실화) 및 프로세싱(예, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 다른 숙주 세포는 단백질의 해독후 프로세싱 및 변형에 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 적당한 세포주 또는 숙주계는 발현된 이종 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하는 것으로 선택할 수 있다.

다수의 선택 시스템이 사용될 수 있으며, 그 예로는 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 각각 사용되는 HSV 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 항-대사산물 내성이 선택 기준으로 사용될 수 있으며, 그 예는 다음과 같다: 트리메토프림 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr, 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt; 아미노글리코사이드 G418에 대한 내성을 부여하는 neo; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro.

동물 세포는 2가지 방식으로 시험관내에서 증식될 수 있다: 배양물 용적을 통해 현탁 상태로 성장하는 고착 비의존적 세포로서, 또는 증식을 위해 고체 기재에 대한 부착을 필요로 하는 고착 의존적 세포(즉, 단층형 세포 성장)로서.

연속적인 확립 세포주의 고착 비의존적 또는 현탁 배양이 세포 및 세포 산물의 대량 생산에 가장 널리 사용되는 수단이다. 하지만, 현탁 배양된 세포는 부착 세포보다 낮은 단백질 생산 및 발암 잠재능과 같은 단점이 있다.

A. 숙주 세포

본 명세서에 사용된, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 용어는 호환 사용된다. 또한, 이 용어들은 모두 이들의 자손, 즉 임의의 모든 후속 세대를 포함한다. 모든 자손은 고의적 또는 비의도적 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있다. 이종 핵산 서열을 발현하는 상황에서, "숙주 세포"는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포를 의미하며, 벡터를 복제하거나 벡터에 의해 암호화된 이종 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질전환성 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터 또는 바이러스의 수용체로 사용될 수 있고 사용되고 있다. 숙주 세포는 외인성 핵산, 예컨대 재조합 단백질 암호화 서열이 숙주 세포로 전이되거나 도입되는 과정을 의미하는 "형질감염" 또는 "형질전환"될 수 있다. 형질전환된 세포는 1차 피검 세포 및 이의 자손을 포함한다.

숙주 세포는 벡터의 복제 또는 핵산 서열(들)의 일부 또는 전체의 발현을 위해 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 세균, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포에서 유래될 수 있다. 수많은 세포주 및 배양물은 숙주 세포용으로 이용할 수 있고, 살아있는 배양물 및 유전자 물질의 보관소로 역할을 하는 기구인 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC)에서 수득할 수 있다(www.atcc.org). 적당한 숙주는 벡터 골격과 원하는 결과를 바탕으로 해서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드는 예컨대 많은 벡터의 복제 또는 암호화된 단백질의 발현을 위한 원핵생물 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현의 숙주 세포로 사용된 세균 세포로는 스타필로코커스 균주, DH5α, JM109 및 KC8, 뿐만 아니라 다수의 시판용 세균 숙주, 예를 들어 SURE® 컴피턴트 세포 및 SOLOPACK™ 골드 세포(STRATAGENE®, La Jolla, CA)를 포함한다. 대안으로, 이.콜라이 LE392와 같은 세균 세포가 파지 바이러스를 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 적당한 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지에, 사카로마이세스 폼베 및 피치아 파스토리스를 포함한다.

벡터 또는 폴리펩타이드의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵생물 숙주 세포의 예로는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos 및 PC12를 포함한다. 다양한 세포 종류 및 유기체 유래의 많은 숙주 세포가 이용될 수 있고, 당업자에게 공지되어 있다. 이와 마찬가지로, 바이러스 벡터가 진핵생물 세포 또는 원핵생물 숙주 세포, 특히 상기 벡터의 복제 또는 발현에 허용성인 것과 함께 사용될 수 있다.

일부 벡터는 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 복제 및/또는 발현되도록 하는 조절 서열을 이용할 수 있다. 또한, 당업자는 전술한 모든 숙주 세포를 유지하기 위해 배양하고 벡터의 복제를 허용하는 조건을 이해하고 있을 것이다. 또한, 벡터의 대량 생산, 뿐만 아니라 이 벡터에 의해 암호화된 핵산 및 이들의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 생산을 허용할 수 있는 기술 및 조건은 인식되고 잘 알려져 있다.

B. 발현계

위에서 논한 조성물의 적어도 일부 또는 전체를 포함하는 다수의 발현계가 존재한다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 기반의 발현계는 핵산 서열의 생산 또는 이의 동족 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드의 생산을 위해 본 발명에 이용될 수 있다. 이러한 다수의 발현계는 상업적으로 널리 이용되고 있다.

곤충 세포/배큘로바이러스계는 본 발명에 참고인용된 미국 특허 5,871,986 및 4,879,236에 설명된 바와 같이 이종 핵산 분절의 단백질을 다량으로 발현할 수 있고, 그 예로 상표명 MAXBAC® 2.0(INVITROGEN®) 및 BACPACK™ BACULOVIRUS EXTRESSION SYSTEM FROM CLONTECH®의 제품을 구입할 수 있다.

본 발명의 개시된 발현계 외에, 다른 발현계로는 합성 액디손 유도성 수용체를 수반하는 STRATAGENE®의 COMPLETE CONTROL™ Inducible Mammalian Expression System 또는 이의 pET 발현계(이.콜라이 발현계)를 포함한다. 유도성 발현계의 다른 예로는 전체 길이의 CMV 프로모터를 이용하는 유도성 포유동물 발현계인 T-REX™(테트라사이클린 조절 발현) 시스템을 운반하는 INVITROGEN®에서 이용할 수 있는 것이 있다. INVITROGEN®은 또한 메틸로트로픽 효모인 피치아 메타놀리카에서 재조합 단백질의 다량 생산을 위해 설계된 피치아 메타놀리카 발현계라 불리는 효모 발현계를 제공한다. 당업자는 핵산 서열 또는 이의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위해 발현 작제물과 같은 벡터를 발현시키는 방식을 잘 알고 있을 것이다.

II . 핵산

본 발명은 본 발명의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 야생형 Hla 또는 이의 임의의 다른 폴리펩타이드 변형체의 핵산 서열이 포함되며, 이들 전부는 참고인용된다.

본 출원에 사용된, "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 재조합체이거나, 전체 게놈 핵산에서 자유로이 분리된 핵산 분자를 의미한다. "폴리뉴클레오타이드"란 용어에는 올리고뉴클레오타이드(잔기 길이가 100개 이하인 핵산), 재조합 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 특정 관점에서 자연 발생의 유전자에서 실질적으로 분리된 조절 서열 또는 단백질 암호화 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA, DNA, 이의 유사체 또는 이의 조합물일 수 있다.

이러한 관점에서, "유전자", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 언급하는데 사용된다(적당한 전사, 해독후 변형 또는 국재화에 필요한 임의의 서열을 포함한다). 당업자라면 이해하고 있는 것처럼, 이 용어는 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 펩타이드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나, 발현하도록 개조될 수 있는 게놈 서열, 발현 카세트, cDNA 서열 및 더 작은 유전자조작된 핵산 분절을 포함한다. 폴리펩타이드 전체 또는 일부를 암호화하는 핵산은 상기 폴리펩타이드의 전체 또는 일부를 암호화하는 다음과 같은 길이의 인접 핵산 서열을 함유할 수 있다: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 염기쌍. 또한, 주어진 종 유래의 특정 폴리펩타이드는, 핵산 서열은 약간 다르지만, 그럼에도 불구하고 동일하거나 실질적으로 유사한 단백질을 암호화하는 천연 변형을 함유하는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 것도 고려된다(표 1 참조).

특정 양태에서, 본 발명은 Hla 또는 이의 임의의 변형체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 따라서, 핵산 분절을 함유하는 분리된 핵산 분절 또는 벡터는 예컨대 면역원성인 Hla 또는 Hla(H35L) 단백질을 암호화할 수 있다. "재조합체"란 용어는 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드의 명칭과 함께 사용될 수 있고, 이것은 일반적으로 시험관내에서 조작된 핵산 분자 또는 이러한 분자의 복제 산물로부터 생산되는 폴리펩타이드의 의미한다.

다른 양태에서, 본 발명은 피검체에서 면역 반응을 일으키는데 사용될 수 있는 Hla 또는 Hla 변형체 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 다양한 양태에서, 본 발명의 핵산은 유전자 백신에 사용될 수 있다.

본 발명에 사용된 핵산 분절은, 암호화 서열 자체의 길이에 관계없이, 다른 핵산 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아세닐화 시그널, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 분절 등과 조합될 수 있어, 그 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 대부분 임의의 길이의 핵산 분절이 이용될 수 있고, 총 길이는 의도한 재조합 핵산 프로토콜에서 제조 및 사용 용이성에 의해 제한되는 것이 바라직하다. 일부 경우에, 핵산 서열은 추가 이종 암호화 서열을 보유한 폴리펩타이드 서열을 암호화하여, 예컨대 폴리펩타이드의 정제, 수송, 분비, 해독후 변형을 허용하거나, 또는 표적화 또는 효능과 같은 치료 이점을 허용할 수 있다. 위에서 논한 바와 같이, 태그 또는 다른 이종 폴리펩타이드는 변형된 폴리펩타이드 암호화 서열에 첨가될 수 있고, 여기서 "이종"은 변형된 폴리펩타이드와 같지 않은 폴리펩타이드를 의미한다.

본 발명에 사용된 핵산은 Hla 또는 임의의 Hla 변형체 또는 단편을 암호화한다. 이러한 서열들은 핵산 서열 및 이로부터 암호화된 단백질 내에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 코돈 반복성 및 기능적 등가성의 결과로 나타날 수 있다. 대안적으로, 기능적 등가 단백질 또는 펩타이드는 교환되는 아미노산의 성질을 고려하여 단백질 구조의 변화가 유전자조작될 수 있는 재조합 DNA 기술의 적용을 통해 생성될 수 있다. 사람에 의해 설계된 변화는 단백질 항원성의 개량 도입 등을 위해 부위 지시된 돌연변이유발 기술을 적용하여 도입시킬 수 있다.

특정 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 인접 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분절 및 재조합 벡터, 또는 위에서 참고로 포함된 다른 아미노산 서열에 관한 것이다.

본 발명의 조성물을 발현시키기 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 본 명세서에 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같이 세포, 조직 또는 유기체에 핵산(예, DNA, 예컨대 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터)을 도입시킬 수 있는 거의 모든 방법을 포함한다고 생각한다. 이러한 방법은 주입(미국 특허 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 각 문헌은 참고인용됨), 예컨대 마이크로주입(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 5,789,215, 참고인용됨); 일렉트로포레이션(미국 특허 5,384,253, 참고인용됨); 인산칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al ., 1990); DEAE 덱스트란 및 이어서 폴리에틸렌 글리콜의 사용(Gopal, 1985); 직접 음파 부하(Fechheimer et al ., 1987); 리포좀 매개의 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al ., 1979; Nicolau et al ., 1987; Wong et al ., 1980; Kaneda et al ., 1989; Kato et al ., 1991); 마이크로프로젝타일 충격(microprojectile bombardment)(PCT 출원번호 WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880, 각 문헌은 참고인용됨); 탄화규소 섬유와의 진탕(Kaeppler et al ., 1990; 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765, 각 문헌은 참고인용됨); 아그로박테리움 매개의 형질전환(미국 특허 5,591,616 및 5,563,055, 각 문헌은 참고인용됨); 원형질의 PEG 매개 형질전환(Omirulleh et al ., 1993; 미국 특허 4,684,611 및 4,952,500, 각 문헌은 참고인용됨); 또는 건조/저해 매개의 DNA 흡수(Potrykus et al ., 1985)와 같은 DNA의 직접 전달을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 기술의 적용을 통해 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.

III . 면역 반응 및 치료법

위에서 논한 바와 같이, 본 발명은 Hla 또는 이의 변형체 또는 단편에 대한 면역 반응을 피검체 내에서 자극하는 것에 관한 것이다. 한 양태에서, 면역 반응은 감염 또는 관련 질환, 특히 스타필로코커스 뉴모니아와 관련된 질환을 보유하거나 보유한 것으로 의심되거나 또는 발생 위험이 있는 피검체를 보호하거나 치료할 수 있다.

A. 보호 면역성

본 발명의 일부 양태에서, 단백질성 조성물은 피검체에 보호 면역성을 부여한다. 보호 면역성은 면역 반응이 존재하는 인자를 수반하는 특정 질환 또는 상태가 발달하지 않도록 피검체를 보호하는 특정 면역 반응을 일으키는 신체 능력을 의미한다. 면역원성 유효량은 피검체에 보호 면역성을 부여할 수 있다.

본 명세서 및 후속 특허청구범위 섹션에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"란 용어는 펩타이드 결합을 통해 공유 결합된 아미노산 스트레치 또는 이의 모방체를 의미한다. 다른 폴리펩타이드는 본 발명에 따라 다른 기능성을 보유한다. 한 관점에 따르면 폴리펩타이드는 수용체에서 능동 면역반응을 유도하도록 설계된 면역원으로부터 유도되지만, 본 발명의 다른 관점에 따르면 폴리펩타이드는 예컨대 동물에서 능동 면역반응의 유인 후에 나타나고 수용체에서 수동 면역반응을 유도하는 작용을 할 수 있는 항체로부터 유도된다. 하지만, 두 경우 모두 폴리펩타이드는 임의의 가능한 코돈 용법에 따라 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다.

본 명세서에 사용된, "면역반응" 또는 이의 등가형인 "면역학적 반응"이란 어구는 수용체 환자 내에서 본 발명의 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대하여 유도되는 체액성(항체 매개), 세포성(항원 특이적 T 세포 또는 이의 분비 산물에 의해 매개) 또는 체액성과 세포성 반응의 발생을 의미한다. 이러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도된 능동 반응 또는 항체, 항체 함유 물질 또는 초회항원자극된 T 세포의 투여에 의해 유도된 수동 반응일 수 있다. 세포성 면역반응은 항원 특이적 CD4(+) T 헬퍼 세포 및/또는 CD8(+) 세포독성 T 세포를 활성화시키는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 관련 있는 폴리펩타이드 에피토프들의 제시에 의해 유도된다. 이 반응은 또한 단핵구, 대식세포, NK 세포, 호염기구, 수지상 세포, 성상세포, 미세아교세포, 호산구 또는 선천면역의 여타 성분들의 활성화를 수반할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "능동 면역성"은 항원의 투여에 의해 피검체에 부여된 임의의 면역성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "수동 면역성"은 피검체에 항원 투여없이 피검체에 부여되는 임의의 면역성을 의미한다. 따라서, "수동 면역성"은 면역반응의 세포성 매개인자 또는 단백질 매개인자(예, 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체)를 비롯한 활성화된 면역 작동자(effector)의 투여를 포함할 수 있고, 이에 국한되는 것은 아니다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 조성물은 항체에 의해 인식되는 항원을 운반하는 유기체에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 수동 면역화에 사용될 수 있다. 항체 조성물은 결국에 다양한 유기체와 결합할 수 있는 다양한 항원에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 항체 성분은 폴리클로날 항혈청일 수 있다. 특정 관점에서, 항체 또는 항체들은 항원(들)에 의해 공격된 동물 또는 제2의 피검체로부터 친화도 정제될 수 있다. 대안적으로, 항체 혼합물은 스타필로코커스 세균을 비롯한, 이에 국한되지 않는 그람양성 세균, 그람음성 세균과 같이, 동일하거나, 관련되거나 또는 다른 미생물 또는 유기체에 존재하는 항원에 대한 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체의 혼합물로서 사용될 수 있다.

수동 면역성은 공지된 면역반응성을 보유한 공여체 또는 다른 비환자 공급원으로부터 수득된 면역글로불린(Ig) 및/또는 다른 면역인자를 환자에게 투여함으로써 환자 또는 피검체에 부여될 수 있다. 다른 관점에서, 본 발명의 항원 조성물은 Hla 또는 이의 임의의 변형체 또는 단편에 대해 유도되는 항체를 함유하는 조성물로부터 공격에 대한 반응으로 생산된 글로불린("과면역화 글로불린")의 공급원 또는 공여체로서 작용하는 피검체에게 투여할 수 있다. 이와 같이 치료된 피검체는 이후 과면역화 글로불린이 통상의 혈장 분획화 방법론을 통해 수득될 수 있고, 스타필로코커스 감염을 치료하거나 이에 대한 내성을 부여하기 위해 다른 피검체에게 투여될 수 있는 혈장을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 과면역화 글로불린은 특히 면역약화된 개체, 침습성 절차를 겪은 개체 또는 백신접종에 대한 반응으로 자신의 항체를 생산할 시간이 허용되지 않는 개체에게 특히 유용하다. 수동 면역성에 관한 방법 및 조성물의 예에 대해서는, 전부 참고인용되는 미국 특허 6,936,258, 6,770,278, 6,756,361, 5,548,066, 5,512,282, 4,338,298 및 4,748,018을 참조한다.

본 명세서 및 후속 특허청구범위의 목적 상, "에피토프" 및 "항원결정인자"란 용어들은 호환해서 사용되고 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하거나 인식하는 항원 상의 부위를 언급한다. B 세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프들은 일반적으로 변성 용매에 대한 노출에도 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프들은 일반적으로 변성 용매 처리 시에 상실된다. 에피토프는 일반적으로 고유 공간 입체형태에 적어도 3개, 더욱 일반적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체형태를 측정하는 방법은 예컨대 x선 결정학 및 2차원 핵자기공명 등을 포함한다. 예컨대, Epitope Mapping Protocols(1996) 참조. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대하여 한 항체가 다른 항체의 결합을 차단하는 능력을 보유하는 단순 면역분석법으로 확인할 수 있다. T 세포는 CD8 세포에 대해 약 9개 아미노산의 연속 에피토프를 인식하거나 CD4 세포에 대해 약 13 내지 15개 아미노산의 연속 에피토프를 인식한다. 에피토프를 인식하는 T 세포는 에피토프에 대한 반응으로 초회항원자극된 T 세포에 의한 ³H-티미딘 혼입(Burke et al., 1994), 항원 의존적 사멸(세포독성 T 림프구 분석, Tigges et al., 1996) 또는 사이토카인 분비에 의해 확인될 수 있다.

세포 매개의 면역학적 반응의 존재는 증식 분석법(CD4(+) T 세포) 또는 CTL(세포독성 T 림프구) 분석법에 의해 측정될 수 있다. 면역원의 보호 또는 치료 효과에 대한 체액 반응 및 세포 반응의 상대적 기여는 면역화된 동계 동물로부터 IgG 및 T-세포를 각각 분리하고, 제2 피검체에서 보호 또는 치료 효과를 측정하여 구별할 수 있다.

본 명세서에 및 청구의 범위에 사용된, "항체" 또는 "면역글로불린"이란 용어는 호환해서 사용되고, 동물 또는 수용체의 면역 반응 중 일부로 작용하고 IgG, IgD, IgE, IgA, IgM 및 관련 단백질을 포함하는 임의의 여러 클래스의 구조적 관련 단백질을 의미한다.

"사람화된" 항체는 또한 사람 불변 및/또는 가변 영역 도메인, 이중특이적 항체, 재조합 및 유전자조작된 항체 또는 이의 단편을 보유하는 마우스, 래트 또는 다른 종 유래의 키메릭 항체인 것도 고려된다. "사람화" 기술은 일반적으로 항체 분자의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 DNA 서열을 조작하는 재조합 DNA 기술의 사용을 수반한다. 모노클로날 항체(MAb)를 사람화하는 초기 방법은 한 항체의 완전한 가변 도메인을 함유하는 항원 결합 부위가 다른 항체 유래의 불변 도메인에 결합되어 있는 키메릭 항체의 생산을 수반한다. 이러한 키메라화 절차를 수행하는 방법은 EP0120694(Celltech Limited), EP0125023(Genentech Inc. 및 City of Hope), EP-A-0 171496(Rev. Dev. Corp. Japan), EP-A-0 173 494(Stanford University) 및 WO 86/01533(Celltech Limited) (각 문헌은 전문이 참고인용됨)에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 출원들은 마우스 Mab 유래의 가변 도메인과 사람 면역글로불린 유래의 불변 도메인을 보유하는 항체 분자를 제조하는 방법을 개시한다.

대안적 시도는 EP-A-0239400(Winter)에 기술된 것으로, 여기서 마우스 Mab의 상보성 결정 영역(CDR)은 장쇄의 올리고뉴클레오타이드를 이용한 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 사람 면역글로불린의 가변 도메인의 프레임워크 영역에 이식되었다. 이러한 방법의 한 예로, 본 발명에 참고인용된 미국 특허 7,262,050을 참조한다.

사람화된 항체는 또한 돌연변이 동물로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 면역화에 대응하여 사람 항체의 전체 목록을 생산할 수 있는 돌연변이 마우스는 기술되어 있다(예컨대, 적어도 사람 항체 제조의 교시에 대해 본 발명에 참고인용된 Jakobovits, et al ., 1993; Jakobovits et al ., 1993; Bruggermann, et al ., 1993을 참고한다). 구체적으로, 이러한 키메릭 및 배선(germ-line) 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 접합 영역(J(H)) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 완전히 저해하고, 이러한 배선 돌연변이 마우스에 사람 배선 항체 유전자 배열의 성공적인 전이는 항원 공격 후에 사람 항체의 생산을 초래한다.

정상적인 생리적 조건 하에서, 항체는 혈장과 다른 체액에서, 그리고 특정 세포의 막에서 발견되고, B 세포로 지칭되는 타입의 림프구 또는 이의 기능적 등가물에 의해 생산된다. IgG 클래스의 항체는 이황화 결합에 의해 함께 결합된 4개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어져 있다. 순수 IgG 분자의 4개의 쇄는 H쇄라 부르는 2개의 동일한 중쇄와 L쇄라 부르는 2개의 동일한 경쇄이다.

폴리클로날 항체를 생산하기 위해서는 토끼 또는 염소와 같은 숙주를 일반적으로 보강제와 같이, 필요한 경우 운반체에 커플링된 항원 또는 항원 단편으로 면역화시킨다. 이어서, 항원에 대한 항체는 숙주의 혈청으로부터 수집한다. 폴리클로날 항체는 일특이성으로 만드는 항원에 대하여 친화도 정제될 수 있다.

모노클로날 항체를 생산하기 위해서는 적당한 공여체, 일반적으로 마우스를 항원으로 과면역화시킨다. 그 다음, 비장의 항체 생산 세포의 분리를 수행한다. 이 세포를 골수종 세포와 같이 무한증식성을 특징으로 하는 세포와 융합시켜, 배양물에 유지될 수 있고 필요한 모노클로날 항체를 분비하는 융합 세포 하이브리드(하이브리도마)를 제공한다. 그 다음, 이 세포를 대량으로 배양하고, 이 배양 배지에서 모노클로날 항체를 수거하여 사용한다. 정의상, 모노클로날 항체는 단일 에피토프에 특이적이다. 이러한 이유로 인해, 모노클로날 항체는 유사한 항원에 대해 유발된 폴리클로날 항체보다 종종 낮은 친화도 상수를 나타낸다.

모노클로날 항체는 또한 비장 세포 또는 비장 유래 세포의 1차 배양물을 사용하여 생체외에서 생산할 수도 있다(Anavi, 1998). 재조합 항체를 생산하기 위해서는(일반적으로 Huston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mernaugh et al., 1995), 동물 또는 하이브리도마의 항체 생산성 B 림프구 유래의 전령 RNA를 역전사하여 상보성 DNA(cDNA)를 수득한다. 전체 길이이거나 부분 길이일 수 있는 항체 cDNA는 파지 또는 플라스미드에서 증폭시켜 클로닝한다. cDNA는 중쇄 및 경쇄 cDNA의 부분 길이일 수 있고, 분리되거나 또는 링커에 연결될 수 있다. 항체, 항체 단편 또는 항체의 면역학적 부분 또는 분절은 적당한 발현계를 이용해 발현시켜 재조합 항체를 수득한다. 항체 cDNA는 또한 적절한 발현 라이브러리를 선별해서 수득할 수도 있다.

앞에서 논한 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 하지만, 특정 치료 목적을 위해, 항체는 투여된 항체에 대해 실질적인 면역 반응을 유발하지 않도록 사람화한다. 이와 같이 사람화된 항체는 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 이러한 항체의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있다(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988).

항체는 당업계에 공지된 바와 같이 고형 지지체 기질에 결합되거나 검출가능한 부분과 접합될 수 있고, 또는 두 모두와 결합 및 접합할 수도 있다. 형광 또는 효소 부분의 접합에 관한 전반적인 논의는 Johnstone et al.(1982)을 참조한다. 고형 지지체 기질에 대한 항체의 결합도 역시 당업계에 공지되어 있다(Harlow et al., 1988; Borrebaeck, 1992).

본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 "항체의 면역학적 부분"이란 어구는 항체의 Fab 단편, 항체의 Fv 단편, 항체의 중쇄, 항체의 경쇄 및 항체의 중쇄 및 경쇄의 미연합 혼합물, 항체의 중쇄와 경쇄로 이루어진 이종이량체, 항체 중쇄의 촉매성 도메인, 항체 경쇄의 촉매성 도메인, 항체 경쇄의 가변 단편, 항체 중쇄의 가변 단편 및 항체의 단일쇄 변형체(scFv라고도 알려져 있음)를 포함한다. 또한, 이 용어는 다른 종 유래의 융합 유전자의 발현 산물인 키메릭 면역글로불린을 포함하며, 상기 다른 종 중 하나는 사람일 수 있으며, 이러한 경우 키메릭 면역글로불린은 사람화된 것이라 한다. 일반적으로, 항체의 면역학적 부분은 이것이 유래된 순수 항체와 항원에 대한 특이적 결합을 경쟁한다.

선택적으로, 항체 또는 바람직하게는 항체의 면역학적 부분은 다른 단백질에 화학적으로 접합되거나, 또는 다른 단백질과 융합 단백질로 발현될 수 있다. 본 명세서 및 후속 특허청구범위에서, 이와 같이 융합된 모든 단백질은 항체 또는 항체의 면역학적 부분의 정의에 포함된다.

본 명세서에 사용된 "면역원성 인자" 또는 "면역원" 또는 "항원"이란 용어들은 수용체에 보강제와 함께 단독으로 또는 제시 비히클 상에 제공된 상태로 투여 시에 면역학적 반응을 유도할 수 있는 분자를 나타내는 것으로 호환 사용된다.

단일쇄 항체(SCA)는 모노클로날 항체에 의해 가능한 치료적 및 진단적 용도를 확대시키기 위해 설계된 유전자 조작된 단백질이다. SCA는 모노클로날 항체의 결합 특이성 및 친화도를 나타내고, 천연 형태일 때 모노클로날 항체 크기의 약 1/5 내지 1/6 크기여서, 일반적으로 반감기가 매우 짧다. SCA는 대부분의 모노클로날 항체에 비해 약간의 장점, 예컨대 검출용으로 사용될 수 있는 폴리펩타이드(예, 루시퍼라제 또는 형광 단백질)와 직접 융합하는 능력 등을 제공한다. 이러한 장점 외에, 완전 사람 SCA는 고가의 시간 소모적인 "사람화" 절차를 필요로 함이 없이 사람 SCA 라이브러리로부터 직접 분리할 수 있다.

단일쇄 재조합 항체(scFv)는 설계된 가요성 펩타이드 테터(tether)에 의해 결합된 항체 VL 및 VH 도메인으로 이루어진다(Atwell et al., 1999). 순수 IgG와 비교했을 때, scFv는 항원 결합 친화도는 비슷하지만 크기가 작고 구조적 단순함이 있다는 장점이 있고, 유사한 2쇄 Fab 단편보다 더 안정할 수 있다(Colcher et al., 1998; Adams and Schier, 1999).

중쇄 및 경쇄(VH 및 VL) 유래의 가변 영역은 둘 모두 약 110개의 아미노산 길이이다. 이들은 15개 또는 그 이상의 아미노산 링커에 의해, 예를 들어 두 도메인이 기능적 항원 결합 포켓을 조립하도록 하기에 충분한 가요성을 가진 서열과 연결될 수 있다. 구체적 양태에서, 다양한 시그널 서열의 부가는 scFv가 세포 내의 여러 소기관을 표적화하게 하거나, 분비되게 한다. 경쇄 불변 영역(Ck)의 부가는 이황화 결합을 통한 이량체화를 허용하여 안정성 및 항원항체결합성(avidity)의 증가를 제공한다. 따라서, 단일쇄 Fv(scFv) SCA의 경우, Fv 단편의 두 도메인이 다른 유전자에 의해 암호화될지라도, 단일 단백질 쇄 scFv로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커를 재조합 방법에 의해 제조하는 것이 가능한 것임이 입증되어 있다(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988). 또한, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리 용이성 및 보존성 항원을 인식하는 능력 때문에 종종 사용된다(Adams and Schier, 1999 참조). 따라서, 본 발명의 일부 관점에서, 항체는 전술한 더욱 전형적인 항체 생산 기술에 의해 생산된 것보다 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리되는 SCA일 수 있다.

B. 치료 및 예방 방법

본 발명의 방법은 스타필로코커스 병원체에 유발된 질환 또는 상태의 치료, 뿐만 아니라 상기 병원체에 노출 정도를 최소화하거나 차단하기 위한 감염 예방 또는 감소를 포함한다. 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드는 스타필로코커스에 감염된 사람, 스타필로코커스에 노출된 것이 의심되는 사람 또는 스타필로코커스에 노출 위험이 있는 사람에서 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 특이적인 항체는 스타필로코커스에 감염된 사람, 스타필로코커스에 노출된 것으로 의심되는 사람 또는 스타필로코커스에 노출 위험이 있는 사람의 수동 면역화를 위해 투여될 수 있다. 스타필로코커스에 노출 양성으로 검사된 개체 또는 노출 가능성을 기반으로 감염이 의심되는 것으로 생각되는 개체에 관한 방법이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 스타필로코커스 질환 또는 상태로 진단을 받고 있거나, 스타필로코커스 감염으로 진단을 받았거나, 스타필로코커스 감염 또는 스타필로코커스 질환 또는 상태의 증상이 있는 것으로 확인되었거나, 스타필로코커스 감염의 위험에 놓였거나, 스타필로코커스 질환 또는 상태의 위험에 놓였거나, 또는 집중치료를 받고 있거나, 및/또는 입원된 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 1, 2, 3, 4, 5주, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 내에 환자에게 투여될 수 있는 것으로 생각된다.

조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상 투여될 수 있고/있거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 1, 2, 3, 4, 5주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월마다, 또는 여기에서 유도될 수 있는 임의의 범위 또는 조합으로 투여될 수 있다.

일부 양태에서, 치료는 보강제 또는 운반체의 존재 하에, 다른 스타필로코커스 항원 및/또는 단백질의 부재 또는 실질적인 부재 하에 처치된다. 또한, 일부 예에서, 치료는 하나 이상의 항생제와 같은 세균 감염에 대해 통용되는 다른 제제의 투여를 포함한다.

백신접종을 위한 펩타이드의 사용은 일반적으로 B형 간염 표면 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌, 또는 소혈청 알부민과 같은 면역원성 운반체 단백질에 대한 펩타이드의 접합을 필요로 한다. 이러한 접합을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

IV . 백신 및 약제학적 조성물

A. 백신

본 발명은 스타필로코커스 감염을 예방하거나 개선하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 양태들은 스타필로코커스 폐렴의 예방 또는 개선을 포함한다. 이러한 것으로, 본 발명은 능동 및 수동 면역화 양태 모두에 사용되는 백신을 포함한다. 백신으로 사용하기에 적합한 것으로 제안된 면역원성 조성물은 대부분 본 명세서에 개시된 방식으로 제조된 면역원성 Hla 펩타이드 또는 단백질로부터 직접 쉽게 제조될 수 있다. 항원성 물질은 충분히 투석해서 불필요한 소분자량 분자를 제거하고/하거나 바람직한 비히클에 더욱 준비된 조제를 위해 동결건조하는 것이 바람직하다. 본 발명은 스타필로코커스에 의한 감염에 대하여, 그리고 이로써 유발되는 상태 또는 질환의 발생에 대하여 보호하기 위해 Hla 펩타이드 또는 단백질 유래의 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용할 수 있는 조성물을 포함한다. 특정 관점에서, 조성물은 점막 표면 투여용으로 조제될 수 있고, 그 예로는 에어로졸 제형이다.

대안적으로, 단백질/펩타이드 기반의 백신에 가능하고 중요한 다른 옵션은 항원(들)을 암호화하는 핵산을 DNA 백신으로 도입시키는 것을 수반한다. 이와 관련하여, 최근 보고서들은 10개의 인접 최소 CTL 에피토프(Thomson, 1996) 또는 여러 미생물 유래의 B 세포, CTL 및 TH 에피토프들의 조합(An, 1997)을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스의 작제, 및 초회항원자극성 보호 면역 반응을 위한 마우스의 면역화에 상기 작제물의 성공적인 사용을 기술했다. 즉, 보호 면역 반응의 효과적인 생체내 초회항원자극을 위한 펩타이드, 펩타이드 펄스를 받은 APC 및 펩타이드 암호화 작제물의 성공적인 이용에 대해서는 문헌에 충분한 증거가 제시되어 있다. 백신으로서 핵산 서열의 사용은 미국 특허 5,958,895 및 5,620,896에 예시되어 있다.

활성 성분으로 폴리펩타이드 또는 펩타이드 서열(들)을 함유하는 백신의 제조는 미국 특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 및 4,578,770(모두 전문이 참고인용됨)에 예시된 것처럼 당업계에 일반적으로 잘 인식되어 있다. 일반적으로, 이러한 백신들은 액체 용액 또는 현탁액으로의 주사제로 제조되고, 또한 주사 전에 액체에 용액 또는 현탁액으로 만들기에 적합한 고체 형태로도 제조할 수 있다. 또한, 이 제조물은 유화성일 수도 있다. 활성 면역원성 성분은 종종 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 융화성인 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는, 예컨대 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 유사물 및 이의 조합물이다. 또한, 필요하다면, 백신은 습윤제, 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효과를 증강시키는 보강제와 같은 보조 물질의 양을 함유할 수 있다. 특정 양태에서, 백신은 참고인용된 미국 특허 6,793,923 및 6,733,754에 기술된 바와 같은 물질의 조합물과 배합된다.

백신은 통상적으로 비경구, 점막, 비내, 흡입 및/또는 주사에 의해, 예컨대 피하 주사 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 제형으로는 좌제 및 일부 경우에 경구 제형이 포함된다. 좌제인 경우, 통상의 결합제 및 운반체는 예컨대 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있고; 이러한 좌제는 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10% 범위, 바람직하게는 약 1% 내지 약 2% 범위로 함유하는 혼합물로 제조될 수 있다. 경구 제형은 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 및 이의 유사물과 같은 일반적으로 이용되는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지속 방식 제형 또는 분말 형태일 수 있고, 약 10% 내지 약 95%의 활성 성분, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 함유한다.

폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 암호화 DNA 작제물은 중성 형태 또는 염 형태의 백신으로 조제될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(펩타이드의 유리 아미노 기에 의해 형성됨) 및 염산이나 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성되는 산부가염을 포함한다. 또한, 유리 카르복시 기에 의해 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

일반적으로, 백신은 투약 제형과 융화성인 방식 및 치료적으로 효과적이고 면역원성인 양으로 투여한다. 투여해야 하는 양은 치료받는 피검체, 예컨대 항체를 합성하는 개개인의 면역계의 능력 및 원하는 보호 정도 등에 따라 달라진다. 투여해야 하는 활성 성분의 정확한 양은 처치의의 판단에 따라 달라진다. 하지만, 적당한 투약량 범위는 백신접종당 활성성분 수백 마이크로그램 정도이다. 적당한 초회 투여 및 추가접종의 요법도 역시 다양하지만, 초회 투여하고, 이어서 후속 접종 또는 다른 투여를 실시하는 것이 전형적이다.

적용 방식은 광범위하게 변동될 수 있다. 백신의 통상적인 임의의 투여 방법을 적용할 수 있다. 이 방법은 생리학적으로 허용되는 고체 기제 상에서의 경구 적용, 또는 생리학적으로 허용되는 분산액에서의 경구 적용, 비경구, 점막, 비내, 흡입, 주사 등에 의한 적용을 포함할 것으로 여겨진다. 백신의 투약량은 투여 경로에 따라 달라질 것이고, 피검체의 체구 및 건강에 따라 달라질 것이다.

많은 경우에, 백신은 수회 투여하는 것이 바람직하며, 일반적으로 6회 이하의 백신접종, 더욱 일반적으로 4회 이하의 백신접종, 바람직하게는 1회 또는 그 이상, 보통 적어도 약 3회의 백신접종이 좋다. 백신접종은 보통 2주 내지 12주 간격, 더욱 일반적으로 3 내지 5주 간격이다. 1 내지 5년 간격, 보통 3년 간격의 주기적 추가접종은 항체의 보호 수준을 유지하는데 바람직할 것이다. 면역화 과정 이후에는 항원에 대한 항체의 분석이 뒤따를 수 있고, 이에 대해서는 참고인용된 미국 특허 3,791,932; 4,174,384; 및 3,949,064에 기술되어 있다.

1. 운반체

주어진 조성물은 면역원성이 다양할 수 있다. 따라서, 운반체에 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 커플링시켜 달성할 수 있는 것처럼 숙주 면역계를 추가 자극하는 것이 종종 필요하다. 운반체의 예 및 바람직한 예는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소혈청알부민(BSA)이다. 오브알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 다른 알부민도 운반체로 사용될 수 있다. 운반체 단백질에 폴리펩타이드를 접합시키는 수단은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카르보디이미드, 및 비스-디아조화된 벤지딘이 포함된다.

2. 보강제

폴리펩타이드 또는 펩타이드 조성물의 면역원성은 보강제로 알려진, 면역반응의 비특이적 자극인자의 사용에 의해 증강될 수 있다. 적당한 보강제로는 모든 허용되는 면역자극성 화합물, 예컨대 사이토카인, 독소 또는 합성 조성물이 포함된다.

Hla 펩타이드 또는 단백질에 대해 항체 반응을 증강시키기 위해 다수의 보강제를 사용할 수 있다. 보강제는 (1) 지연 방출을 유발하기 위해 체내의 항원을 잡아둘 수 있거나; (2) 면역반응에 관여하는 세포를 투여 부위로 유인할 수 있거나; (3) 면역계 세포의 증식 또는 활성화를 유도할 수 있거나; (4) 피검체를 통한 항원의 확산을 향상시킬 수 있다.

보강제는 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 무기 염, 폴리뉴클레오타이드 및 천연 물질을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 구체적인 보강제로는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, GMCSP, BCG, 수산화알루미늄 또는 다른 알루미늄 화합물, MDP 화합물, 예컨대 thur-MDP 및 nor-MDP, CGP(MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 보강제로는 세균에서 추출된 3가지 성분, MPL, 트레할로스 디마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)을 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼에 함유하는 RIBI를 포함한다. MHC 항원도 사용될 수 있다. 다른 보강제 또는 방법에 대해서는 미국 특허 6,814,971, 5,084,269, 6,656,462(모두 참고인용됨)에 예시되어 있다.

백신에 보강제 효과를 달성하기 위한 다양한 방법으로는, 인산염 완충 식염수에 약 0.05 내지 약 0.1% 용액으로 일반적으로 사용되는 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄(명반), 약 0.25% 용액으로 사용되는 당의 합성 중합체(Carbopol®)와의 혼합물, 약 70℃ 내지 약 101℃ 사이의 온도로 각각 30초 내지 2분간 열처리함에 의한 백신 내의 단백질 응집물과 같은 제제의 사용을 포함한다. 또한, 알부민에 대한 펩신-처리된(Fab) 항체로의 재활성화에 의한 응집; 세균 세포(예, 씨.파르붐(C. parvum)), 내독소 또는 그람음성 세균의 지질다당류 성분과의 혼합물; 생리학적으로 허용되는 오일 비히클(예, 만나이드 모노올레이트(Aracel A)) 내의 에멀젼; 또는 블록 치환체로 사용된 퍼플루오로카본의 20% 용액과의 에멀젼(Fluosol-DA®)도 보강제 효과를 생산하기 위해 이용될 수 있다.

예시적이며, 종종 바람직한 보강제로는, 완전 프로인트 보강제(사멸된 마이코박테리움 튜버쿨로시스를 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극인자), 불완전 프로인트 보강제 및 수산화알루미늄이 포함된다.

보강제 외에, 면역 반응을 증강시키기 위해 생물학적 반응 조절제(BRM)를공동투여하는 것이 바람직할 수 있다. BRM은 T 세포 면역성을 상향조절하거나 억제인자 세포 활성을 하향조절하는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 BRM은 시메티딘(CIM; 1200mg/d)(Smith/Kline, PA); 저용량 사이클로포스파미드(CYP; 300mg/㎡)(Johnson/Mead, NJ) 및 사이토카인, 예컨대 γ-인터페론, IL-2 또는 IL-12 또는 면역 헬퍼 기능에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자, 예컨대 B-7을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

B. 지질 성분 및 부분

특정 양태에서, 본 발명은 핵산 또는 폴리펩타이드/펩타이드와 결합된 하나 이상의 지질을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 지질은 물에 불용성이고 유기 용매에 의해 추출될 수 있는 물질이다. 본 명세서에 구체적으로 기술된 것 외에 다른 화합물은 당업자에 의해 지질로 인식되면, 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다. 지질 성분 및 지질외 성분은 서로 공유 또는 비공유적으로 부착될 수 있다.

지질은 자연발생의 지질 또는 합성 지질일 수 있다. 하지만, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소리피드(lysolipid), 글리코스핑고리피드, 글루코리피드, 설파티드, 에테르 결합 및 에스테르 결합된 지방산 보유 지질 및 중합성 지질, 및 이의 배합물을 포함한다.

지질과 결합된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드/펩타이드는 지질 함유 용액에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질에 공유 결합하거나, 지질에 현탁 상태로 함유되거나 또는 다른 방식으로 지질과 관련되어 있을 수 있다. 본 발명의 지질 또는 지질-Hla 결합 조성물은 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 단순히 용액에 산재되어 있을 수 있고, 이로써 크기 또는 형태가 균일하지 않은 응집물을 형성하는 것이 가능하다. 다른 예로, 이중층 구조, 마이셀 또는 "콜랩스드(collapsed)" 구조로 존재할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 리포펙타민(Gibco BRL)-폭스바이러스 또는 Superfect(Qiagen)-폭스바이러스 복합체도 고려된다.

특정 양태에서, 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 이 사이의 임의의 범위의 특정 지질, 지질 타입 또는 지질외 성분, 예컨대 보강제, 항원, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당, 핵산 또는 명세서에 개시된 다른 물질 또는 당업자에게 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 비제한적 예로, 조성물은 약 10% 내지 약 20% 중성 지질, 약 33% 내지 약 34% 세레브로사이드 및 약 1% 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 리포좀은 마이셀의 약 1%는 특이적으로 리코펜이고, 리포좀의 약 3% 내지 약 11%는 다른 테르펜을 함유하는 것으로 남겨둔 약 4% 내지 약 12% 테르펜, 약 10% 내지 약 35%의 포스파티딜 콜린 및 약 1%의 지질외 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 임의의 지질, 지질 타입 또는 다른 성분을 임의의 배합 또는 백분율 범위로 포함할 수 있는 것으로 생각된다.

C. 병용 요법

본 발명의 조성물 및 관련 방법, 특히 환자/피검체에게 Hla 단백질 및/또는 항-Hla 항체의 투여는 통상의 치료법의 처치와 함께 사용될 수 있다. 이러한 치료법의 예로는 스트렙토마이신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 젠타마이신, 클로람페니콜, 트리메토프림, 설파메톡사졸, 앰피실린, 테트라시이클린, 옥사실린, 반코마이신과 같은 항생제 또는 다양한 조합의 항생제의 투여를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 환자/피검체에게 Hla 단백질 또는 항-Hla 항체의 투여는 항독성제, 예컨대 RIP의 투여와 함께 사용될 수 있다.

1가지 관점에서, 폴리펩타이드 백신 및/또는 치료법은 항세균 및/또는 항독성 치료와 함께 사용된다. 대안적으로, 상기 치료법은 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 제제 치료보다 선행하거나 후속될 수 있다. 다른 제제 및/또는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드가 각각 투여되는 양태에서는 각 전달 사이에 상당한 시간 기간이 끝나지 않도록 하여 본 발명의 조성물과 제제가 피검체에 유익한 병용 효과를 발휘할 수 있게 할 수 있다. 이러한 경우, 두 기법을 서로 약 12 내지 24시간 내에, 더욱 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 내에 투여할 수 있는 것이 고려된다. 하지만, 일부 상황에서는 투여 시간 기간을 유의적으로 연장시켜, 각 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 것이 바람직할 수 있다.

항생제 요법이 "A"이고, 각각 면역요법 또는 수동 면역요법의 일부로 제공된 면역원성 분자 또는 항체, 예컨대 Hla 항원이 "B"인 다양한 배합이 이용될 수 있다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

환자/피검체에게 본 발명의 조성물의 투여는 Hla 폴리펩타이드 또는 항-Hla 항체 조성물의 독성이 존재한다면 이를 고려하여 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적 프로토콜을 따른다. 치료 사이클은 필요한 만큼 반복할 수 있을 것으로 생각한다. 또한, 수화와 같은 다양한 표준 치료법이 상기 기술된 치료법과 함께 적용될 수 있다는 것도 고려된다.

D. 일반 약제학적 조성물

일부 양태에서, 약제학적 조성물은 피검체에게 투여된다. 본 발명의 여러 관점은 피검체에게 조성물의 유효량을 투여하는 것을 수반한다. 본 발명의 일부 양태에서, Hla 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 하나 이상의 스타필로코커스 병원체에 의한 감염에 대하여 보호하기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, Hla 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 특이적인 항체는 하나 이상의 스타필로코커스 병원체에 의한 감염을 치료하거나 예방하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 예방 치료로서 환자에게 제공할 수도 있다. 또한, 상기 화합물은 항생제 및/또는 항독성제와 함께 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 운반체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산될 것이다.

"약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"이란 어구는 동물 또는 사람에게 투여했을 때 부작용, 알러지 반응 또는 다른 부적당한 반응을 생산하지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된, "약제학적으로 허용되는 운반체"는 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제, 및 이의 유사물을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 융화성인 한, 이의 면역원성 조성물 및 치료 조성물에의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분, 예컨대 다른 항독성 또는 항감염제도 조성물에 포함될 수 있다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구 투여용으로 조제된 화합물 외에, 다른 약제학적으로 허용되는 형태, 예컨대 경구 투여용 정제 또는 다른 고체; 시간 방출 캡슐; 및 통용되는 다른 형태, 예컨대 흡입제 등을 포함한다.

본 발명의 활성 화합물은 비경구 투여용으로 조제될 수 있고, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 조제될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 조성물들을 함유하는 수성 조성물의 제법은 본 명세서에 비추어 당업자라면 알게 될 것이다. 일반적으로, 이러한 조성물은 주사제, 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있고; 또한 주사 전에 액체를 첨가하여 용액이나 현탁액을 제조하여 사용하기에 적합한 고체 형태도 제조할 수 있고; 또한, 이 제조물은 유화될 수 있다.

유리 염기로서 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제가 적당히 혼합된 물에 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물에, 그리고 오일에 제조될 수 있다. 보관 및 사용에 일반적인 조건 하에, 이 제조물들은 미생물의 성장 방지를 위해 보존제를 함유한다.

주사용으로 적당한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨유, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 제형은 멸균성이어야 하고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유체여야 한다. 또한, 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고 세균 및 진균과 같은 오염 미생물의 작용에 대하여 보존적이어야 한다.

단백질성 조성물은 중성 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성된)을 포함하며, 이는 염산 또는 인산과 같은 무기산에 의해 형성되거나, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성된다. 또한, 유리 카르복시 기에 의해 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

또한, 운반체는 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물, 및 식물성 오일 등을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액인 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에, 당 또는 염화나트륨 등의 등장제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 연속 흡수는 흡수지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 유도될 수 있다.

멸균 주사성 용액은 적당한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을, 필요한 경우 앞에서 열거한 다양한 다른 성분과 혼합한 후, 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 앞에서 열거한 다른 필요 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 전술한 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 바람직한 추가 성분과 함께 활성 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

본 발명에 따른 조성물의 투여는 일반적으로 임의의 공통 경로를 통해 이루어질 것이다. 투여는 경구, 비측 또는 협측 투여를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 대안적으로, 투여는 동소이식, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 비내, 점막 또는 정맥내 주사에 의한 투여일 수 있다. 특정 양태에서, 백신 조성물은 흡입될 수 있다(예컨대, 참고인용된 미국 특허 6,651,655). 이러한 조성물은 보통 생리학적으로 허용되는 운반체, 완충액 또는 다른 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물로 투여될 것이다. 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클은 화학 물질의 운반 또는 수송에 관여하는, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지는 않는다.

수용액의 비경구 투여 시, 예컨대 용액은 필요하다면 적당히 완충화되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성으로 만든다. 이러한 특별한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세서에 비추어 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 한 투약량은 등장성 NaCl 용액에 용해해서, 대량피하주사 유체에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 침조). 약간의 투약량 변동은 피검체의 상태에 따라 반드시 일어날 것이다. 투여 책임자는 어떠한 경우든지 각 피검체에 적당한 용량을 결정할 것이다.

치료적 또는 예방적 조성물의 유효량은 의도한 목표를 기준으로 해서 결정한다. "단위 용량" 또는 "투약량"이란 용어는 피검체에 사용하기에 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 투여, 즉 적당한 경로 및 요법과 관련하여 앞에서 논한 목적 반응을 생산하도록 계산된 소정의 조성물 함량을 함유한다. 치료 횟수 및 단위 용량에 따른 투여할 양은 원하는 보호 효과에 따라 달라진다.

또한, 조성물의 정확한 양은 처치의의 판단에 따라 달라지고, 각 개개인마다 특이적이다. 용량에 영향을 미치는 요인은 피검체의 물리적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도한 치료 목표(증상의 경감 대 치료) 및 특정 조성물의 효능, 안정성 및 독성을 포함한다.

조제 후, 용액은 투약량 제형에 융화성인 방식으로, 치료적 또는 예방적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형들은 전술한 주사성 용액의 종류와 같이 다양한 투약형으로 쉽게 투여된다.

E. 시험관내 , 생체외 또는 생체내 투여

본 명세서에 사용된, 시험관내 투여란 용어는 배양물 중의 세포를 비롯한, 이에 국한되지 않는 동물에서 분리되거나 동물 외측에 있는 세포에 수행되는 조작을 의미한다. 생체외 투여란 용어는 시험관내에서 조작되고, 이어서 살아있는 동물에게 투여되는 세포를 의미한다. 생체내 투여란 용어는 동물 내에서 수행되는 모든 조작을 포함한다.

본 발명의 특정 관점에서, 조성물은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 투여될 수 있다. 시험관내 특정 양태에서, 자가 B-림프구 세포주는 일반적으로 본 발명의 바이러스 벡터와 24 내지 48시간 동안 또는 Hla 폴리펩타이드와 2시간 동안 항온처리된다. 형질도입된 세포는 그 다음 시험관내 분석에 사용할 수 있고, 또는 생체외 투여에 사용할 수도 있다.

본 발명에 참고인용된 미국 특허 4,690,915 및 5,199,942는 치료 용도에 사용하기 위한 혈액 단핵 세포 및 골수 세포의 생체외 조작 방법을 개시한다.

V. 실시예

다음 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 어떠한 방식으로 제한하려는 것이 아니다. 당업자는 본 발명이 목표를 수행하고 언급된 목적 및 장점을 수득할 뿐만 아니라 본 발명에 내재된 목표, 목적 및 장점을 수득하도록 잘 개조되어 있음을 쉽게 이해할 것이다. 본 실시예는 여기에 기술된 방법과 함께 현재 바람직한 양태를 나타내고, 예시한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 특허청구범위에 의해 한정된 본 발명의 취지에 속하는 본 발명의 변화 및 기타 용도는 당업자라면 분명히 알 수 있을 것이다.

실시예 1

스타필로코커스 아우레우스에 대한 백신 매개 보호

A. 방법

세균 균주 및 배양물. 에스.아우레우스 뉴만, LAC 및 MW2는 트립신 대두 브로쓰(TSB) 또는 트립신 대두 한천(TSA)에서 증식시켰다. PVL 변환 파지를 수득하기 위해 에스.아우레우스 MW2 배양물에서의 φSa2mw 용균 복제를 1㎍/ml 미토마이신 C로 유도했다. 용균물을 0.22㎛ 막을 통해 여과하고, 여과액을 에스.아우레우스 RN4200에서 플라크 형성시켰다(Bae et al., 2006). 파지 현탁액은, 5mM CaCl₂(HIBCa5)이 보충된 심장 주입 브로쓰에서 증식된 균주 RN4200의 대수기중기 배양물 1ml와 혼합한 뒤, 37℃에서 하룻밤 동안 항온배양했다. 증폭된 파지 입자로부터 페놀/클로로포름 추출에 의해 DNA를 정제했다. φSa2mw는 프라이머 cctcctgttgatggaccact(서열번호 3) 및 ggcgctgaggtagtcaaaag(서열번호 4)를 이용한 lukS-PV DNA의 PCR 증폭에 의해 검출했다. φSa2mw 파지 용액은 HIBCa5에서 증식된 뉴만 균주의 대수기중기 배양물과 혼합하고, 37℃에서 하룻밤 동안 진탕(150 rpm) 배양한 뒤, TSA 상에 평판배양했다. 콜로니는 오염 파지 입자를 제거하기 위해 TSA 상에서 증식시켰다. φSa2mw 용원은 TSB 5ml에서 37℃ 하에 밤새 증식시켰고, 염색체 DNA를 정제한 뒤, lukS-PV DNA를 증폭시켰다. 변형 뉴만 φSa2mw hla :: erm, 뉴만 hla :: erm 및 LAC hla :: erm은 균주 ΦNΞ 11568 유래의 버사 아우레알리스(bursa aurealis) 삽입 돌연변이의 형질도입으로 작제하고, PCR 및 DNA 서열분석으로 선별하여 hla 유전자좌의 붕괴를 확인했다(Bae et al., 2004). 형질도입체는 10㎍/ml 에리트로마이신을 보유하는 TSA에서 유지시켰고, 단 LAC hla :: erm은 100㎍/ml 에리트로마이신 하에 증식시켰다. 상보 연구를 위해, 스타필로코커스는 플라스미드 pOS1(벡터), phla 또는 ppvl로 형질전환시키고 10㎍/ml 클로람페니콜을 보유하는 TSA에서 증식시켰다. 쥐 폐 감염을 확립시키기 위해, 세균의 밤새 배양물을 새 TSB로 1:100으로 희석하고, 37℃에서 OD₆₆₀ 0.5까지 회전 증식시켰다. 50ml 배양물 분취액 중의 스타필로코커스는 원심분리로 침전시키고, PBS로 세척한 뒤, 치사율 연구를 위해 PBS 750㎕에 현탁시키고(3 내지 4 x 10⁸ CFU/30㎕ 용량) 또는 세균 부하 및 조직병리학 실험을 위해 1250㎕(2 x 10⁸ CFU/30㎕ 용량)에 현탁시켰다. 세포독성 연구를 위해, 스타필로코커스 균주는 OD₆₆₀을 0.5까지 증식시켰다. 5ml 배양물 분취액 중의 스타필로코커스를 원심분리하고, PBS로 세척한 뒤, F12 배지(Gibco) 10ml에 현탁시켰다.

플라스미드. hla 유전자 및 프로모터는 주형으로서 에스.아우레우스 뉴만 DNA를 이용하여 프라이머 gcgggatcccccctttcttgaattaaca(서열번호 5) 및 gcggaattcacattaatttgtcatttcttc(서열번호 6)로 PCR 증폭시켰다. pvl 유전자좌 및 프로모터는 프라이머 gcgggatccgtatatgatgaatcttaggca(서열번호 7) 및 gcggaattctgtttagctcataggatttttttc(서열번호 8)로 PCR 증폭시켰다. PCR 산물은 BamHI 및 EcoRI로 분해하고, pOS1의 대응 부위에 클로닝했다.

토끼 항혈청의 생산. 성숙 Hla_H35L을 암호화하는 PCR 산물은 pOS1-Hla_H35L 주형 DNA 및 프라이머 gccggatccgcagattctgatattaatattaaaacc(서열번호 9) 및 gcggaattcacattaatttgtcatttcttc(서열번호 10)를 이용해서 생산했다. 성숙 LukS-PV 및 LukF-PV를 암호화하는 PCR 산물은 USA300 게놈 주형 DNA 및 프라이머 gccggatccgctcaacatatcacacctgtaagtgag(서열번호 11) 및 gcggaattctgtttagctcataggatttttttc(서열번호 12)(LukF-PV) 뿐만 아니라 gccggatccgataacaatattgagaatattggtgat(서열번호 13) 및 gccgaattctcaattatgtcctttcactttaatttc(서열번호 14)(LukS-PV)로 생산했다. PCR 산물은 BamHI 및 EcoRI로 분해하고, pGEX-6P-1(Amersham Biosciences)의 대응 부위에 클로닝 한 뒤, 이.콜라이를 형질전환시켰다. GST-Hla_H35L, GST-LukF-PV 및 GST-LukS-PV 융합 단백질은 친화도 크로마토그래피로 정제했다. 정제된 단백질(0.5mg)은 완전 프로인트 보강제(CFA) 또는 불완전 프로인트 보강제(IFA)로 유화시키고, 1차 면역화를 위해 뉴질랜드 화이트 래빗 암컷에게 어깨밑으로 주사한 뒤, 21일 간격을 두고 추가 2회 면역화를 실시했다.

능동 및 수동 면역화 연구. 능동 면역화를 위해, GST-Hla_H35L 융합 단백질은 제조자의 지시에 따라(Amersham Biosciences) 프레시션(Precission) 프로테아제 절단으로 처리했다. 트리톤 X-114 추출로 오염 내독소를 제거한 후, Hla_H35L 단백질을 CFA 또는 IFA에 유화시켰다. 4주령의 C57B1/6J 마우스(Jackson Laboratories)에게는 0일째 CFA 중의 20㎍ Hla_H35L 단백질을 투여하고, 그 후 10일째 IFA 중의 20㎍ Hla_H35L 단백질을 추가 접종했다. 그 다음, 21일째 동물을 에스.아우레우스로 항원공격했다. 면역화 전 0일째 및 추가로 20일째에 동물로부터 혈청을 수집해서 특이적인 혈청 항체 생산을 평가했다.

수동 면역화 연구를 위해, 7주령의 C57B1/6J 마우스에게 100㎕의 정상 토끼 혈청(NRS, Sigma) 또는 항-Hla 토끼 항혈청을, 에스.아우레우스 항원공격하기 24시간 전에 복강내(IP) 주사로 투여했다. LukF-PV 및 LukS-PV로 수동 면역화된 동물에게 각 특이적 항혈청 100㎕를 1:1 혼합물로 총 200㎕의 IP 주사 용량으로 투여했다. LukF/S-PV 면역화 연구의 대조용 동물에게는 200㎕ NRS를 투여했다. 항원공격 시에 혈청을 수거하여 특이적 토끼 항체 역가를 평가했다.

마우스 감염 모델. 6주령의 C57Bl/6J 마우스(Jackson Laboratories)는 감염 1주 전에 유니버시티 오브 시카고 동물 사육장에 수용했다. 동물은 케타민과 자일라진으로 마취시켰다. 적당한 마취가 기록되었을 때, 30㎕ 스타필로코커스 현탁액을 왼쪽 콧구멍으로 접종했다. 동물은 접종 후 1분 동안 직립으로 유지시킨 뒤, 회복을 위해 바로누운 위치로 우리에 넣어두었다. 모든 동물에게 음식과 물은 원하는대로 제공했고, 72시간 동안 연속 관찰했다. 통상, 소량(백분율)의 동물은 접종 후 6시간 내에 아마도 흡인과 마취의 복합 효과로 인해 사망했다. 이 동물들은 후속 분석에서 배제했다.

세균 부하 및 조직병리학. 감염 동물은 유니버시티 오브 시카고 동물 관리 및 사용 협회의 지침에 따라 강제 CO₂ 흡입을 통해 사망시킨 후 양쪽 폐를 분리했다. 우측 폐는 1ml 멸균 PBS에 넣고, 파쇄한 뒤, 연속 희석하고 한천 평판에서 콜로니를 형성시켰다. 조직병리학 연구를 위해, 왼쪽 폐는 절개하여 1% 포르말린에 넣었다. 포르말린 고정된 조직을 포매시키고 박편화한 뒤, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 광학현미경으로 조사했다.

ELISA . 마우스 혈청 항체 역가의 분석은 1㎍/ml 재조합 Hla_H35L, LukF-PV 또는 LukS-PV로 코팅된 Nunc MaxiSorp Immuno 평판을 이용하여 수행했다. 혈청 희석물을 적당한 평판에서 항온배양하고, Tecan GENios 분광광도계에서 HRP 접합된 2차 항체 및 Opti-EIA(BD Biosciences)로 발색시켰다.

단백질 분석. TBS에서 증식된 스타필로코커스 배양물은 동일한 광학 밀도로 조정하고, 배양 상청액 중의 단백질은 트리클로로아세트산으로 침전시키고, 아세톤으로 세척한 뒤, 샘플 완충액에 용해시켰다. 15% SDS-PAGE에서 분리된 단백질은 특이적 항혈청(α-LukS-PV, α-LukF-PV 또는 α-뉴클레아제) 및 증강된 화학발광 검출을 위한 HRP 접합된 염소 항-토끼 2차 항체로 면역블로팅하여 분석했다. 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-Hla 항체는 톡신 테크놀로지, 인크.(Sarasota, FL)에서 구입했다.

세포독성 분석. A549 세포는 10% 소 태아 혈청 및 노르모신(100㎍/ml, InvivoGen, SanDiego, CA)이 보충된 F12 배지에서 배양 유지시켰다. A549 세포는 세척하고, 96웰 평판에서 완전 F12 배지에 웰당 1.5 x 10⁴ 세포의 밀도로 평판배양했다. A549 세포는 보충물이 없는 F12 배지로 1회 세척한 뒤, 웰마다 100㎕ 스타필로코커스 현탁액을 첨가했다. 37℃ 가습 항온배양기에서 4시간 항온배양 후, LDH 활성을 3반복(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)으로 측정했다. 현미경으로 세포 손상을 평가하기 위해, 감염 3시간 후에 니콘 이클립스 TE2000U 현미경으로 세포 이미지를 관찰했다.

사이토카인 분석. 실험 동물로부터 감염 24시간 후 수거한 혈청을 1:4 비율로 희석하고, Bioplex Mouse 8-Plex A 분석(Bio-Rad)을 이용해서 사이토카인 함량을 분석했다. 사이토카인 농도는 Bio-Plex Manage 소프트웨어를 이용해 Bio-Plex Workstation에서 정량분석했다.

통계 분석. 치사율 연구의 통계적 유의성 분석은 피셔 정확 검정으로 수행했다. 세균 회수율 연구 및 A549 LDH 방출의 통계적 유의성은 양측 검정 스튜던트 t-검정으로 계산했다.

B. 결과

스타필로코커스 α-헤모리신(Hla 또는 α-독소)은 세균 기공 형성 β-배럴(barrel) 독소 패밀리의 최초 일원이다(Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991; Song et al., 1996). 이 구조 유전자 hla 는 293 잔기 수용성 단량체를 분비하는 것으로 조사된 모든 에스.아우레우스 균주의 염색체에 위치한다(O'Reilly et al., 1990; O'Reilly et al., 1986). Hla는 민감성 숙주 세포의 표면 수용체에 체결하여, 7량체성 예비기공으로의 Hla 올리고머화 및 원형질막에 2nm 기공 직경의 β-배럴 구조의 삽입을 촉진한다(Gouaux et al., 1997). Hla 기공은 림프구, 대식세포, 폐포 상피 세포, 폐 상피 및 적혈구에서 형성되지만, 과립세포 및 섬유아세포는 용해 내성인 것으로 보인다(Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991; McElroy et al., 1999). 토끼 또는 래트 폐 조직에 정제된 Hla의 점적은 여러 시그널링 분자, 예컨대 포스파티딜 이노시톨, 산화질소, 프로스타노이드(PGE2, PGI2) 및 트롬복산 A2의 방출 때문인 혈관 누설 및 폐 고혈압을 유발한다(McElroy et al., 1999; Seeger et al., 1984; Seeger et al., 1990; Rose et al., 2002; Suttorp and Habben, 1988). Hla의 생화학 속성과 일치하게, 에스.아우레우스 뉴만에서 Hla 발현을 중단시키는 돌연변이는 쥐 폐렴 모델에서 세균의 독성을 상당히 약화시킨다(Bubeck-Wardenburg et al., 2007). 이에, 본 발명자는 α-헤모리신을 에스.아우레우스 폐 감염에 대항하는 백신 또는 면역요법 전략의 개발을 위한 표적으로서 조사했다.

최근 임상 에스.아우레우스 분리물에서 hla가 독성 인자로 작용하는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 지역 관련 MRSA 균주 LAC(로스앤젤레스 클론, CDC 클레이드 USA300)를 선택했다(Voyich et al., 2006; Miller et al., 2005). hla의 hla::erm 대립유전자로의 대체는 폐 감염을 유발하는 에스.아우레우스 LAC의 능력을 완전히 중단시켰다(도 1A). 최근 보고서들은 박테리오파지 암호화된 팬턴-발렌타인 류코시딘(PVL)을 분비하는 에스.아우레우스 분리물의 출현을 기술했다(Miller et al., 2005; Chambers, 2005; Vandenesch et al., 2003; Fridkin et al., 2005). PVL은 선택 표적 세포의 막에 삽입되는 2개의 서브유닛(LukS-PV 및 LukF-PV)로 형성된 다른 7량체성 β-배럴 독소이다(Panton and Valentine, 1932; Menestrina et al., 2001). 실험실 균주 에스.아우레우스 RN6390 및 이의 PVL+ 유도체를 이용하여 라반데이라-레이 및 동료들은 PVL이 쥐 폐렴의 발병기전의 주요 독성 인자로 작용할 수 있음을 시사했다(Labandeira-Rey et al., 2007). 폐렴의 유의적인 동물 치사율 및 조직병리학적 증거는 PVL이 균주 RN6390에서 멀티카피 플라스미드로부터 발현되었을 때 관찰되었다(Labandeira-Rey et al., 2007). 이에 반해, 보이크(Voyich) 등은 패혈증 및 피부 감염의 쥐 모델을 이용한 스타필로코커스 독성에서는 PVL의 직접적인 역할이 없는 것을 발견했다(Voyich et al., 2006). 또한, 주요 아메리칸 CA-MRSA 분리물의 동질유전자계 lukS - PV 및 lukF - PV 돌연변이 유도체인 균주 LAC(USA300) 및 MW2(USA400)는 호중구 용해, 농양 형성, 피부괴사 또는 패혈증에 의한 치사율에서 PVL의 역할을 밝혀내지 못했다(Voyich et al., 2006).

PVL 및 폐 감염의 발병기전에 대한 PVL 의 기여.

현 임상 분리물에 의해 발현된 PVL이 폐 감염의 발병기전에 기여인자인지를 시험하기 위해, 에스.아우레우스 균주 LAC 및 MW2 뿐만 아니라 PVL 유전자가 결여된 이들의 동종유전자 변형체를 쥐 폐렴 모델에서 분석했다. 스타필로코커스 폐렴을 보유한 동물의 총 치사율은 야생형에 의해 유발된 감염과 동종유전자 △pvl 돌연변이균주에 의해 유발된 감염을 쌍분석한 결과, 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(도 1B). 각 CA-MRSA 균주에서 lukS /F- PV(△pvl)의 결실은 쥐 폐에서 세균 증식에 영향을 미치지 않았다. 감염된 동물의 폐 샘플은 박편화하여 헤마톡실린-에오신 염색하여, 면역세포 침윤, 폐 실질의 경화 및 세균 침윤물에 의한 폐포 구조의 상실에 의해 증명되는 것과 같은 폐렴의 병리적 증거를 나타냈고; 이러한 특징들은 PVL을 분비하거나 분비하지 않는 균주에 의해 감염된 동물에서 구별할 수 없었다(도 1C).

본 발명자들은 스타필로코커스 폐렴에 대한 PVL의 임의의 기여가, 폐 감염의 발병기전에 주요 역할을 하는 것으로 보이는 α-헤모리신에 의해 은폐될 수 있는지를 고려했다. 에스.아우레우스 뉴만의 lukS /F- PV 용원은 박테리오파지 φSa2mw(에스.아우레우스 MW2로부터 분리됨)에 의해 생산되었다(Baba et al., 2002)(도 3A). 에스.아우레우스 뉴만의 뉴클레오타이드 1565379에서 염색체에 φSa2mw의 삽입은 LukS-PV 및 LukF-PV 분비를 초래했다(Kaneko et al., 1998)(도 3B). C57Bl/6J 마우스의 항원공격 후, φSa2mw 용원은 우측 폐의 파쇄 조직에서 콜로니 형성 단위(CFU)로 측정 시, 동일한 효율로 폐 조직에서 복제되었다(도 3C). 에스.아우레우스 뉴만 야생형 또는 뉴만 φSa2mw 유도성 폐렴을 앓고 있는 마우스의 총 치사율에는 유의적 차이가 관찰되지 않았고(도 3D), 이는 파지 용원성을 통한 PVL 분비가 쥐 폐 감염 동안 스타필로코커스 독성을 증가시키지 않는다는 것을 시사한다. PVL 박테리오파지의 존재에도 불구하고, hla의 삽입 붕괴는 에스.아우레우스 뉴만 φSa2mw(hla::erm)를 쥐 폐 감염 시에 무독성이게 만들었다(도 3E).

에스.아우레우스 뉴만은 다량의 PVL 발현을 촉진하는 lukS /F- PV(ppvl)를 암호화하는 플라스미드에 의해 형질전환되었다(도 4B). 그럼에도 불구하고, 실험 동물의 폐렴 관련 치사율은 벡터만을 보유하거나 또는 ppvl를 보유한 에스.아우레우스 뉴만 감염들에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(도 4A). 이와 마찬가지로, 감염 동물의 폐에서 스타필로코커스의 회수 또는 질환의 조직병리학적 증거도 PVL의 발현에 의해 변경되지 않았다(데이터는 미제시). 종래 보고된 것처럼, 에스.아우레우스 뉴만(hla::erm)에서 hla 발현의 상실은, ppvl로의 형질감염에 의해 되돌릴 수 없는 결함인 폐 감염 모델에서의 스타필로코커스 독성 및 치사율을 완전히 없앴다(Bubeck-Wardenburg et al., 2007). 이에 반해, Hla의 발현을 촉진하는 플라스미드인 phla로의 형질전환은 독성 표현형을 완전히 과도하게 복원시켜, 동물 100%가 24시간 시점에 폐렴으로 사망했다(도 4A). 면역블롯 분석은 이들 각 균주에 존재하는 LukS-PV, LukF-PV 및 α-헤모리신의 수준을 보여주었고, 동시에 언급된 유전자 결함은 이에 대응하는 당해 단백질의 부재를 초래했다(도 4B). 따라서, PVL이 아닌 Hla는 마우스의 스타필로코커스 폐 질환의 확립에 필수적인 독성 인자이다.

Hla 특이적 면역 반응. Hla 특이적 면역 반응이 스타필로코커스 폐렴의 발병기전에 영향을 주는지를 시험하기 위해, 마우스에게 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 숙주 표적 세포에 대한 독소의 결합에 영향을 미침이 없이 기공 형성을 방해하는 단일 아미노산 치환을 보유한 α-헤모리신의 변형체인 20㎍ 정제된 Hla_H35L을 근육내 주사하여 면역화시켰다(Gouaux et al., 1997). 면역화에 의해 1:5,601(±2,789)의 평균 Hla_H35L 특이적 항체 역가가 유발되었다. 에스.아우레우스 뉴만으로 항원공격 후, Hla_H35L 면역화된 동물에서는 동물 치사율의 상당한 감소가 관찰되었다(도 5A). 이러한 감소는 감염 후 24시간째 폐에서 회수된 에스.아우레우스 콜로니 형성 단위의 감소와 상관성이 있었다(도 5B). 감염된 폐 조직의 병리상태의 육안 분석은 거짓 면역화된 동물에서 관찰되는 광범위 경화와 반대로, Hla_H35L 면역화된 동물에서는 단지 국소성 경화 부위만을 나타냈다(도 5C). α-헤모리신 면역화된 동물에서 질환의 국소성은 또한 감염된 폐 조직의 조직병리학적 구역에서도 입증되었다. Hla_H35L 면역화된 동물에서 병변은 분산되어 있었고, 중요한 것으로 폐의 미감염 영역에 의해 둘러싸여 있었다(도 5D). 반대로, 거짓 면역화된 동물에서는 대부분의 폐포 공간이 없어졌다. 임상적 관련이 있는 에스.아우레우스 분리물에 의해 유발된 폐 감염의 발병기전에 미치는 α-헤모리신 백신접종의 효과를 조사하기 위해, Hla_H35L 면역화된 동물을 에스.아우레우스 LAC 또는 에스.아우레우스 MW2로 감염시켰다. 이러한 균주들에 의한 절대 치사율은 서로 달랐지만, 치사율로부터의 유의적인 보호는 Hla_H35L 로 면역화된 모든 동물 그룹에서 달성되었다(도 5E).

본 발명자들은 쥐 폐의 스타필로코커스 감염이 사람의 감염과 다를 수 있다는 가능성을 알고 있다. 실제로, 두 에스.아우레우스 파지 암호화된 단백질인 CHIPS 및 SCIN은 종 특이적 방식으로 사람 면역계를 조절하는 것으로 나타난다(Rooijakkers et al., 2005; Rooijakkers et al., 2006). 사람 폐 조직의 손상에 대해 PVL의 기여 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 종래 정제된 스타필로코커스 α-헤모리신 또는 그룹 B 스트렙토코커스 β-헤모리신이 사람 폐 상피에 미치는 효과를 조사하는데 이용했던 사람 A549 폐포 상피 세포에 대한 에스.아우레우스 임상 분리물의 세포독성 효과를 분석했다(Rooijakkers et al., 2005; Rooijakkers et al., 2006)(도 6). 에스.아우레우스 LAC 및 MW2로 감염 시, A549 손상은 락테이트 데하이드로게나제의 방출에 의해 쉽게 검출되었다(도 6A). pvl 유전자좌의 붕괴는 과립세포와 단핵 식세포에서 보고된 PVL의 특이성과 일치하는 발견인, 상기 각 분리물에서 에스.아우레우스의 세포독성 효과를 감소시키지 못했다(Woodin, 1970; Meunier et al., 1995). 이에 반해, α-헤모리신 결여된 에스.아우레우스 뉴만 변형체는 phla에 의해 보충되고 감염 세포의 검경법에 의해 쉽게 가시화되는 결함인 A549 세포를 파괴할 수 없었다(도 6B). 직접 폐포 세포 손상에서 α-헤모리신의 주요 역할은 이 독소의 중화가 세포 손상을 방지함을 시사한다. 에스.아우레우스에 의해 동시에 감염된 A549 세포에 Hla 항혈청의 첨가는 독소 손상에 대한 보호(도 6C)를 제공한 반면, 대조용 혈청은 어떠한 영향도 나타내지 않았다(도 6C). 또한, 정제된 Hla_H35L로의 치료는, Hla_H35L이 폐 세포의 표면에서 α-헤모리신 결합 부위를 차지한다는 가설에 따라서 A549 세포를 보호했다(도 6C). 사람 A549 세포의 생사 영상은 감염 4시간 후 미감염 상태로 남아 있는 A549 세포 또는 인산염 완충 식염수(PBS, 1:1000), 정상 토끼 혈청(NRS, 1:1000), 항-Hla 토끼 혈청(α-Hla, 1:1000) 또는 정제된 HlaH35L(10㎍/ml)로 처리된 배지에서 에스.아우레우스 뉴만과 공동배양된 A549 세포를 평가하는 형광검경법으로 포착했다. 또한, hla 유전자를 함유하는 플라스미드(phla) 또는 벡터에 의해 형질전환된 뉴만 동질유전자성 hla 삽입 돌연변이체, hla :: erm를 가지고 감염을 수행했다. 결과는 사람 폐포 상피 세포의 에스.아우레우스 손상이 α-헤모리신의 길항작용에 의해 감소된다는 것을 증명했다.

α- 헤모리신 특이적 항체는 스타필로코커스 폐 질환에 대해 보호할 수 있다. α-헤모리신 특이적 항체가 스타필로코커스 폐 질환에 대해 보호 효과를 나타낼 수 있는지를 시험하기 위해, 에스.아우레우스 뉴만으로 항원공격하기 24시간 전에 복강내 주사를 통해 정상 토끼 혈청 또는 항-Hla 혈청으로 수동 면역화시켰다[평균 Hla_H35L, 특이적 항체 역가 1:480(±179)](도 7). 폐렴 유도성 치사율 조사는 대조 혈청에 의해서는 아니지만 항-Hla 혈청에 의한 수동 면역화를 통해 보호 효과를 나타냈다(도 7A). 이러한 보호는 질환의 육안적 특징(도 7C) 및 조직병리학적 특징(도 7D)의 향상과 상관성이 있었다. 또한, 항-Hla 면역화된 동물의 폐에서 회수된 콜로니 형성 단위는 상당한 감소가 관찰되었다(도 7B). 수동 면역보호는 에스.아우레우스 뉴만으로 공격받은 동물뿐 아니라, 에스.아우레우스 LAC 또는 MW2로 감염된 동물에 효과적이었다(도 7E). 이에 반해, 항-PVL 혈청[평균 특이적 항체 역가 LukS-PV=1:894(±80) 및 LukF-PV=1:3,689(±186)으로의 수동 면역화는 스타필로코커스 폐렴의 결과에 영향을 미치지 않았다(도 7F).

다양한 감염성 또는 비감염성 자극에 의해 유도된 폐 염증은 IL-1β 분비를 증강시키고, 이는 감염 부위에 면역 세포의 동원을 촉진할 뿐만 아니라 전신 염증 반응 및 급성 폐 손상을 가속화시킨다(Goodman et al., 2003). 과도하게 일어날 때, IL-1β 분비는 확실하게 숙주에게 유해하다(Goodman et al., 2003). 스타필로코커스 폐 감염이 있는 동물의 혈청에서 사이토카인 프로필은 항-Hla로의 수동 면역화가 혈청 IL-1β의 유의적인 감소를 초래한다는 것을 나타냈다(도 8). 또한, 항-Hla 면역화된 동물은 대식세포 및 호중구와 같은 순수 면역 세포에 의한 스타필로코커스의 사멸 및 식세포 흡수를 촉진하는 사이토카인(Zhao et al., 1998)인 IFN-γ의 방출을 나타냈다(도 8).

에스.아우레우스 α-헤모리신에 대해 생산된 항체가, 쥐 모델계의 침습성 질환뿐만 아니라 배양된 사람 폐포 상피 세포에 대한 세포용해 손상에 대하여 보호하는 능력은 이 독소에 대한 모노클로날 항체가 유용한 치료제일 수 있음을 시사했다. 이러한 계통의 연구를 용이하게 하기 위해, 본 발명자들은 마우스를 재조합 Hla_H35L 단백질로 면역화시키고, 일련의 항-Hla 분비성 골수종 세포를 생성시켰다. Hla_H35L 면역화에 대한 반응으로 생성된 6개의 하이브리도마는 ELISA계 선별에서 양성으로 검사되었고; 이 중 2개는 증량시켜 Hla 활성의 기능적 차단을 제공하는 것으로 증명되었다(도 9). 종래 관찰과 마찬가지로, 비면역 토끼 혈청(NRS)의 존재 하에 A549 세포와 에스.아우레우스의 공동배양물은 세포 보호를 유도하지 못했고; 이에 반해 토끼 항-Hla로의 공동배양물 처리는 용해로부터 보호 효과를 제공했다. 이와 유사하게, 클론 7B8.35 및 1A9.4F9 유래의 정제된 모노클로날 항체는 Hla 유도된 A549 손상에 대하여 통계적으로 유의적인 정도의 보호 효과를 부여했다. 이에 반해, 이소타입 대조용 마우스 항체는 보호 효과를 부여하지 못했다. 이러한 결과는 또한 미감염되거나, 항-Hla 모노클로날 항체 또는 이의 이소타입 매치된 대조군 각각으로 처리된 A549 세포의 생사(LIVE-DEAD) 염색으로 가시화했다. 두 모노클로날 항체 각각에 의해 제공되는 상대적 보호 효과를 조사하기 위해, 2.5mg/ml 내지 0.001mg/ml의 항체 농도 범위를 LDH 방출 분석에서 에스.아우레우스 뉴만과 공동배양한 후 A549 세포를 보호하는 능력에 대해 평가했다(도 10). 모노클로날 1A9.4F9는 세포 손상에 대한 보호 효과를 제공하지만, 이 항체 유래의 보호 효과는 7B8.35 모노클로날에 의해 제공된 효과만큼 강력하지 않으며, 이것은 아마도 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프 또는 이들의 α-헤모리신에 대한 친화도는 상이하다는 것을 시사한다. 이러한 시험관내 보호 연구의 결과는 Hla에 특이적인 모노클로날 항체가 에스.아우레우스 폐렴 과정 동안 생체내 Hla의 세포용해 효과로부터 보호 효과를 제공할 수 있음을 증명한다.

이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 정제된 마우스 모노클로날 항체를 에스.아우레우스 폐렴에 대해 마우스를 보호하는 능력에 대해 조사했다. 15마리 마우스 그룹들에게 100㎕ 총 용적 중에 각각 정제된 모노클로날 항체 7B8.35(도 11A) 또는 1A9.4F9(도 11B)의 5mg/kg 용량을 감염 24시간 전에 복강내 경로를 통해 투여했다. 거짓 처리 마우스에게는 PBS 100㎕를 투여했다. 동물은 전술한 실험에 이용된 프로토콜에 따라 에스.아우레우스 뉴만으로 감염시켰고, 치사율은 감염 후 72시간 동안 기록했다. 각 모노클로날 항체로의 수동 면역화는 이 분석에서 치사율로부터 통계적으로 유의적인 정도의 보호 효과를 부여했고, 이는 감염 후 동물의 전체 임상적 외관의 개선과 상관성이 있었다. 이와 유사하게, 7B8.35 및 1A9.4F9는 현재 미국에서 가장 우세한 메티실린-내성 에스.아우레우스 분리물인 USA300/LAC에 의해 유발된 폐렴 관련 치사율로부터 동물을 보호할 수 있었다(도 12). A549 분석에서 본 발명자들이 관찰한 결과와 마찬가지로, 모노클로날 7B8.35는 1A9.4F9보다 실험 동물을 보호하는데 있어서 더욱 효과적이며, 후자는 감염 후 24시간 시점에서 단지 통계적으로 유의적인 정도의 보호 효과만을 제공했다. 종래 연구들은 USA300/LAC 분리물이 이 동물 모델에서 고도로 독성이며, 뉴만 분리물보다 훨씬 많은 Hla를 분비하여 에스.아우레우스 뉴만에 의한 감염 후 관찰되는 것보다 훨씬 높은 치사율을 실험 동물에 유발한다는 것을 증명했다. 상기 시험관내 데이터 및 생체내 데이터를 연결시키면, 상기 두 마우스 모노클로날 항체는 Hla 기능을 표적으로 하여 독소와 길항작용하여 질환으로부터 보호한다.

모노클로날 항체가 폐 손상의 세포 배양물 모델에서 시험관내 보호 효과를 입증하고, 또한 에스.아우레우스 폐렴에 대해 동물을 보호하는바, 본 발명자들은 항생제가 표적으로 하는 Hla 분자의 영역을 결정하는데 관심이 있었다. 본 발명자들은 이러한 에피토프들의 인식이 어떻게 독소의 저해가 구조적 견지에서 일어날 수 있는지를 이해하는데 있어서 유익함을 증명할 수 있고, 나아가 향후 치료 화합물, 다른 모노클로날 항체의 설계에도 유익할 수 있으며, 또는 아마도 능동 면역화 시도에서 투여하기 위한 백신 제조물에 첨가될 수 있는 독소의 분리된 영역을 밝혀냈음을 고려한다. 모노클로날 항체가 생체내에서 Hla의 활성을 차단할 수 있는 기전에는 다수의 기전이 있다. 첫째, 항체는 진핵생물의 수용체 결합 부위(현재는 알려져 있지 않음)를 가리는 단백질 영역에 결합할 수 있어, 숙주 세포와 단량체의 기능적 상호작용을 방지한다. 둘째, 항체는 분자간 상호작용이 일어나지 못하게 하여 세포 표면 상에 7량체 형태로 결합된 단량체의 조립을 방해할 수 있다. 셋째, 항체는 조립된 7량체가 진핵생물 지질 이중층에 줄기를 삽입하고 안정한 기공을 형성하는데 필요한 입체형태 변화가 일어날 수 없게 할 수 있다. Hla의 명쾌한 생화학적 및 구조적 분석은 숙주 세포 결합, 7량체 형성 및 세포 용해에 기여하는 아미노산 잔기를 통찰할 수 있게 했다. 따라서, 각 모노클로날 항체의 정확한 항체 결합 부위의 규명은 이것이 독소와 길항작용하는 기전을 통찰할 수 있게 할 가능성이 높다. 또한, 이러한 맵핑은 궁극적으로 수동 면역치료제에 각각 다른 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체의 효과적인 조합의 어셈블리를 유도할 수 있다. Hla 분절에 각각 사람화된 모노클로날 항체의 에피토프 특이성에 빠르게 초점을 맞추기 위해, 7가지 일련의 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질을, 각각 아미노산 길이가 약 50개인 독소의 중첩 분절을 나타내도록 만들었다.

각각 절두된 단백질은 이전 단백질 단편 및 후속 단백질 단편과 10개 아미노산 중첩을 공유한다(도 13). 이러한 융합 단백질은 점블롯 분석 기술에서 7B8 및 1A9 모노클로날 항체와의 반응성에 대해 조사했다. 간략히 설명하면, 각 융합 단백질 1㎕를 니트로셀룰로스 막에 점적하고, 건조시켰다. 두 모노클로날 항체 각각에 대해 하나의 막 패널을 준비했다. 막은 그 다음 차단시키고, 0.2㎍/ml의 농도로 각 모노클로날 항체를 사용하는 표준 프로토콜에 따라 수행했다. 블롯을 세척하고, 2차 항체와 항온배양한 뒤, 융합 단백질에 대한 모노클로날 결합을 화학발광 발색 기술로 평가했다. 흥미롭게도, 7B8 및 1A9가 모두 전체 길이의 융합 단백질(HlaH35L)뿐만 아니라, 완전 처리된 독소의 아미노산 1번 내지 50번을 함유하는 융합 단백질(HlaA1-K50)에도 독점적으로 결합한다(도 14). 7B8 및 1A9에 대해 이소타입 매치된 대조용 항체(각각 IgG2a 및 IgG2b)는 임의의 융합 단백질에 대한 결합을 입증하지 못했고, 반면 독소(α-Hla)에 대해 생성된 폴리클로날 토끼 혈청은 단백질의 각 분절뿐만 아니라 GST만도 인식한다(토끼 항혈청은 전체 길이의 GST-HlaH35L 융합체에 대해 유발되었다). 2가지 별도로 발생된 보호성 항-Hla 모노클로날 항체가 성숙한 프로세싱된 독소의 처음 50개 아미노산 내에 함유된 에피토프를 인식한다는 관찰은 이 항체가 안정한 7량체 기공의 조립을 저해하여 독소 기능을 붕괴할 능력을 나타낼 수 있음을 강하게 시사한다.

종합해보면, Hla_H35L 백신으로의 능동 면역뿐만 아니라 Hla-특이적 항체로의 수동 면역화는 관련 동물 모델에서 스타필로코커스 폐 감염에 대하여 상당한 보호 효과를 나타냈다. 따라서, 모든 에스.아우레우스 균주에 의해 분비되는 독성 인자인 α-헤모리신에 대한 항체는 또한 사람의 스타필로코커스 폐 질환에 대한 보호 효과를 제공할 것이다.

참고문헌

다음 참고문헌들은 본 명세서에 제시된 것에 예시적 절차 또는 보충적인 여타 세부사항을 제공하는 정도로 본 발명에 구체적으로 참고인용된 것이다.

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Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr 115 120 125 Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr 130 135 140 Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly 145 150 155 160 Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His Thr Leu Lys Tyr Val Gln 165 170 175 Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly 180 185 190 Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr 195 200 205 Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys 210 215 220 Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Xaa Asn Phe Leu Asp Pro Asn 225 230 235 240 Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr 245 250 255 Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp 260 265 270 Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser 275 280 285 Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp Lys Trp Xaa Asp Arg Ser 290 295 300 Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met Thr Asn 305 310 315 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <222> (208)..(208) <223> Xaa can be Glu or Asp <220> <221> misc_feature <222> (275)..(275) <223> Xaa can be Ile or Thr <400> 2 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr 100 105 110 Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp 115 120 125 Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His 130 135 140 Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val 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aatttc 36 50

Claims (16)

1. 스타필로코커스 아우레우스 α-헤모리신(Hla)에 대해 면역학적으로 반응성인 항체의 유효량을 포함하는, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태로부터 환자를 보호하기 위한 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 사람화된 항체인, 약제학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 사람 항체인, 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체이거나 항체의 면역학적 부분인, 약제학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 환자가 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태의 위험에 있는, 약제학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 환자가 입원 환자이거나 입원할 환자인, 약제학적 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 환자가 수술을 받을 환자인, 약제학적 조성물.
8. 제5항에 있어서, 상기 환자가 마취될 환자인, 약제학적 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 환자가 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태의 증상이 있거나, 또는 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태로 진단받은 환자인, 약제학적 조성물.
10. 제9항에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 폐 감염을 치료하기 위한 항생제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
11. 제1항에 있어서, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태의 위험이 있는 환자를 확인함을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
12. 제1항에 있어서, 정맥내 투여되는 약제학적 조성물.
13. 제1항에 있어서, 환자에게 수회 투여되는 약제학적 조성물.
14. 제1항에 있어서, 스타필로코커스 폐 질환 또는 상태가 폐렴인, 약제학적 조성물.
15. 성숙 Hla 독소의 아미노산 1번 내지 50번에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
16. 제15항에 있어서, 상기 성숙 Hla 독소가 서열번호 2의 아미노산 서열을 보유하는, 분리된 항체.

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